CN102015754A

CN102015754A - 克雷伯菌（Klebsiella）抗原

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Publication number: CN102015754A
Application number: CN2008800222372A
Authority: CN
Inventors: S·巴克施; T·希普斯; M·哈内; J·皮卡洛; C·萨特格; E·纳吉; U·伦德伯格; D·齐勒; A·迈因克; B·诺伊杰斯; U·斯特施内德; A·范格贝恩
Original assignee: Intercell Austria AG
Current assignee: Valneva Austria GmbH
Priority date: 2007-05-02
Filing date: 2008-04-29
Publication date: 2011-04-13
Also published as: US8236326B2; EP2360177A1; EP2152731A2; EP2489673A3; EP2489673A2; AU2008248755A1; US20130230526A9; CA2685805A1; US20130011403A1; US20110236410A1; JP2010532657A; EP2338902A1; EP2338902A8; EP2497779A1; US20140212448A1; US8637052B2; WO2008135446A2; WO2008135446A3

Abstract

本发明涉及编码抗原的分离的核酸分子、包括此类核酸分子的载体和包括此类载体的宿主细胞。此外，本发明提供来自来自克雷伯菌(Klebsiella)物种的抗原、以及其片段和变体、用于生产此类抗原的方法和用于生产表达此类抗原的细胞的方法。此外，本发明提供与此类抗原结合的抗体、生产此类抗体的杂交瘤细胞、用于生产此类抗体的方法、包括此类核酸分子、抗原、载体或抗体的药物组合物、此类核酸分子、抗原、载体或抗体在制备药物组合物上的用途、用于鉴定能够结合此类抗原或降低或抑制此类抗原的相互作用活性的拮抗剂的方法、用于诊断感染的方法和用于治疗或预防感染的方法。更具体地此类抗原由引起医院感染的细菌病原体或由肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)引起的细菌感染产生或与由引起医院感染的细菌病原体或由肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)引起的细菌感染相关。

Description

克雷伯菌(Klebsiella)抗原

本发明涉及编码抗原的分离的核酸分子，包括此类核酸分子的载体和包括此类载体的宿主细胞。此外，本发明提供来自克雷伯菌(Klebsiella)物种的抗原、以及其片段和变体、用于生产此类抗原的方法和用于生产表达此类抗原的细胞的方法。此外，本发明提供与此类抗原结合的抗体、生产此类抗体的杂交瘤细胞、用于生产此类抗体的方法、包括此类核酸分子、抗原、载体或抗体的药物组合物、此类核酸分子、抗原、载体或抗体在制备药物组合物上的用途、用于鉴定能够结合此类抗原或降低或抑制此类抗原的相互作用活性的拮抗剂的方法、用于诊断感染的方法和用于治疗或预防感染的方法。更具体地此类抗原由引起医院感染的细菌病原体或由肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)引起的细菌感染产生或与由引起医院感染的细菌病原体或由肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)引起的细菌感染相关。

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(K.pneumoniae)为革兰氏阴性的兼性厌氧细菌。肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的菌株通过荚膜多糖的存在区别。其中存在77种抗原型。该荚膜包住整个细胞表面，是关于革兰氏染色有机体的大量出现的原因，并且提供针对许多宿主防御机制的抗性。克隆是大量和高度粘液样的。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)具有固氮能力，即将大气的氮气转化成铵。

克雷伯菌(Klebsiella)具有两种常见的生境，一种为环境，其中它们在表面水、污水和土壤中被发现，另一种为哺乳动物例如人类、马或猪的粘膜表面，其中它们克隆。在人类中，肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)在呼吸道、肠道和泌尿生殖道中中以腐生菌存在。当克雷伯菌(Klebsiella)吞食入内脏时，严重的感染可能发生。

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)为常见的医院获得性病原体，引起尿道感染、医院性肺炎、腹腔感染、外科伤口感染和血液感染。如果不以攻击性方式早期治疗，所有这些感染可能发展成休克和死亡。肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)也是潜在的社区获得性病原体。据估计克雷伯菌(Klebsiella spp)占地方性医院感染的8％以及流行暴发的3％(Stamm E.et al，1981)。

克雷伯菌的致病性可归因于其产生热稳定的肠毒素。迄今鉴定出的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的毒性因子包括荚膜多糖(CPS)、脂多糖、粘附素(1和3型菌毛，KPF-28、CF29K纤毛和聚集的粘附素)和铁获得系统(Podschun R et al.，1998)。

肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染在医院中是常见的，其中它们引起肺炎(特征在于血痰的排放(emission))和置管患者中的尿道感染。事实上，作为尿道病原体肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)仅次于大肠杆菌(E.coli)。其占所有医院尿道感染(UTI)的6至17个百分点。克雷伯菌(Klebsiella)感染目前比过去更常遭遇到。这可能是由于细菌的抗生素抗性。克雷伯菌(Klebsiella)物种可以包括抗性质粒(R-质粒)，其赋予对抗生素如氨苄青霉素和羧苄青霉素的抗性(Wu et al.，2005)。更糟的是，R-质粒可以转移至不必是相同物种的其它肠细菌。多药-抗性克雷伯菌(Klebsiella spp.)的医院爆发通常由新型菌株，ESBL生产者(超广谱β-内酰胺酶)引起。临床克雷伯菌(Klebsiella)分离株中的ESBL-产生菌株的发生率在过去几年已经稳定地增加。已经报道在特定区域达40％的频率。为了治疗肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染，仅可获得少量抗生素如头孢吡肟、多粘菌素B(Parchuri et al.，2005)、碳青霉烯(美罗培南(Meropenem)和亚胺培南(Imipenem))(Ueda Y.et al.，2005)。

存在开发针对克雷伯菌(Klebsiella)的疫苗的尝试。在不同的细菌组成中，主要讨论两种表面成分作为候选物以用于抗克雷伯菌疫苗：LPS和CPS(Yadav et al.，2005)。使用含-LPS疫苗活性免疫的极大缺点在于诱导不利的毒性反应，其由内毒素内含物引起。已经证明CPS为高度免疫原性和无毒。然而，克雷伯菌(Klebsiella)CPS疫苗的严重缺点在于大量不同的K抗原(迄今77种)。存在随后证明为安全和免疫原性的6-价克雷伯菌(Klebsiella)CPS疫苗(Cryz et al.，1986)，但是仅占克雷伯菌(Klebsiella)血液分离株的30％，而25-价疫苗将占不超过75％。此外，此类多价疫苗的产生是困难和昂贵的。为了克服该情况，必须开发针对克雷伯菌(Klebsiella)基于蛋白质的疫苗。Kurupati等(2006)已经从肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)鉴定出许多免疫原性抗原，和两种候选基因，即OmpA和FepA，已经在体内小鼠模型中进一步表征。然而，目前在市场上或根据公共信息，在活性临床前或临床开发中没有预防性克雷伯菌(Klebsiella)疫苗。在Berna Biotech克雷伯菌(Klebsiella)疫苗开发计划(Klebgen

)已经停止。

疫苗可以包含各种不同的抗原。抗原的实例为完整-杀死的或减毒的有机体、这些有机体/组织的亚组分(subfraction)、蛋白质或以它们的最简单形式，肽。抗原还可以被免疫系统以糖基化蛋白或肽的形式识别，并且还可以为或包含多肽或脂类。可以使用短肽，因为例如细胞毒性T细胞(CTL)识别与主要组织相容性复合物(MHC)连接的以短的，通常8-11个氨基酸长的肽的形式的抗原。B细胞可以识别短至4-5个氨基酸的线性表位，以及三维结构(构象表位)。为了获得持续的、抗原特异性的免疫应答，佐剂需要触发参与免疫系统所有细胞的免疫级联。首先，佐剂作用在所谓的抗原呈递细胞(APCs)上，但不限于其作用模式。这些细胞通常首先遭遇抗原，然后呈递针对免疫效应子细胞的加工或未修饰的抗原。还可以包括中间细胞类型。仅具有合适特异性的效应子细胞在产生的免疫应答中激活。佐剂还可以局部地保留抗原和共注射的其它因子。此外，佐剂还可以充当用于其它免疫细胞的化学引诱物或可以局部地和/或全身地充当用于免疫系统的刺激剂。

由于可能诱导针对人类抗原的交叉反应抗体的潜在风险，已经关心开发用于人类的失活的全细胞疫苗。因此，认为亚单位疫苗在预防由肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)引起的感染上具有最大的潜力。

以本发明为基础的课题在于提供用于开发针对由克雷伯菌(Klebsiella)引起的医院感染的药物组合物例如疫苗的方法。更具体地，该课题在于提供来自克雷伯菌(Klebsiella)的核酸分子或抗原，或其片段或变体的有效、相关和综合的组，其可用于制备所述药物组合物。另一课题在于提供用于生产抗原，其片段或变体的方法和手段。另一课题在于提供包括所述核酸或所述抗原的药物组合物。本发明的另一课题在于提供抗体、包括所述抗体的药物组合物、用于生产所述抗体的方法和所述抗体在制备药物制剂上的用途。此外，本发明的目的在于提供用于鉴定能够结合抗原，或其片段或变体的拮抗剂的方法，以及在于提供用于鉴定能够降低或抑制此类抗原与其相互作用伴侣的相互作用活性的拮抗剂的方法。本发明的另一课题在于提供用于诊断克雷伯菌(Klebsiella)有机体感染的方法。以本发明为基础的另一课题在于提供治疗克雷伯菌(Klebsiella)感染的方法，和提供用于免疫动物或人类的方法。

以本发明为基础的课题在一个方面通过编码抗原或其片段的分离的核酸分子而解决，包括选自以下的核酸序列：

a)与具有选自Seq ID Nos 1至187和Seq ID No 375的核苷酸序列的核酸分子具有至少70％序列同一性的核酸分子，

b)与a)的核酸分子互补的核酸分子，

c)包括a)或b)的核酸分子的至少15个连续碱基的核酸分子，

d)在严紧杂交条件下与a)、b)或c)的核酸分子退火的核酸分子，和

e)要不是遗传密码的简并性，将与a)、b)、c)或d)中定义的核酸分子杂交的核酸分子。

在本发明的一个实施方式中，与Seq ID Nos 1至187或Seq IDNo 375的序列同一性为至少80％，更优选至少90％，仍更优选至少95％，96％，97％，98％，或99％，或最优选100％。

在一个实施方式中所述核酸为DNA。

在另一实施方式中所述核酸为RNA。

在另一实施方式中所述核酸分子分离自基因组DNA，所述基因组DNA优选来自以下物种：克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。克雷伯菌(Klebsiella)的命名或分类在本文根据

I.(1984)使用。

在本发明的实施方式中片段为其活性片段或活性变体。

在实施方式中所述核酸编码抗原或其片段，其包括或由来自以下的多肽或肽片段组成：克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

以本发明为基础的课题还通过包括如上所述的核酸分子的载体来解决。

在实施方式中，所述载体适合于由如上定义的核酸分子编码的抗原或其片段的重组表达。

本发明还涉及包括如上定义的载体的宿主细胞。

在另一方面以本发明为基础的课题还通过免疫学上与血清反应的抗原来解决，所述血清来自患有克雷伯菌(Klebsiella)感染的人类或之前被克雷伯菌(Klebsiella)感染的未感染的健康人类，其中所述抗原包括来自以下的分离的多肽或其活性片段或活性变体：克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

如本文所用的术语“未感染的健康人类”包括具有多次遭遇病原体的那些个体，其可能导致定殖(colonization)，但其不会导致任何症状，或其导致轻度疾病。所述术语和就抗原鉴定选择未感染的健康人类的血清的基本原理进一步定义于Nagy，E.等(2003)。

本发明的另一方面涉及包括或由选自Seq ID Nos 188至374和Seq ID No 376的分离多肽组成的抗原，或其活性片段或活性变体。

在本发明的实施方式中所述多肽由如上定义的核酸分子编码。

在另一实施方式中，所述抗原的活性片段由所述多肽，特别是由Seq ID Nos 188至374或Seq ID No 376中任一个所定义的多肽的至少50％，特别是至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，96％，97％或98％，最优选99％组成。

在另一实施方式中，所述抗原的活性变体与所述多肽，特别是由Seq ID Nos 188至374或Seq ID No 376中任一个所定义的多肽具有至少50％，特别是至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，96％，97％或98％，最优选99％的序列同一性。

在本发明的一个实施方式中，所述抗原的活性片段包括或由SeqID No 205的氨基酸2-130；Seq ID No 216的氨基酸26-356；Seq IDNo 223的氨基酸2-180；Seq ID No 224的氨基酸1-168；Seq ID No235的氨基酸23-397；Seq ID No 240的氨基酸2-420和414-847；Seq ID No 241的氨基酸582-1099；Seq ID No 242的氨基酸1-245；Seq ID No 247的氨基酸24-703；Seq ID No 252的氨基酸23-328；Seq ID No 263的氨基酸23-248；Seq ID No 267的氨基酸2-335；Seq ID No 268的氨基酸38-633；Seq ID No 269的氨基酸26-742；Seq ID No 281的氨基酸26-429；或Seq ID No 285的氨基酸1-632组成。如上列出的片段进一步在Seq ID Nos 188至203和376中定义(还参见表16)。

在另一实施方式中，所述抗原的活性变体与Seq ID No 205的氨基酸2-130；Seq ID No 216的氨基酸26-356；Seq ID No 223的氨基酸2-180；Seq ID No 224的氨基酸1-168；Seq ID No 235的氨基酸23-397；Seq ID No 240的氨基酸2-420和414-847；Seq ID No241的氨基酸582-1099；Seq ID No 242的氨基酸1-245；Seq ID No247的氨基酸24-703；Seq ID No 252的氨基酸23-328；Seq ID No263的氨基酸23-248；Seq ID No 267的氨基酸2-335；Seq ID No 268的氨基酸38-633；Seq ID No 269的氨基酸26-742；Seq ID No 281的氨基酸26-429；或Seq ID No 285的氨基酸1-632具有至少50％，特别是至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，96％，97％或98％，最优选99％的序列同一性。

在还另一实施方式中，如上定义的抗原的活性变体衍生自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的不同菌株和/或血清型的同源序列，特别是其中血清型为K1，K2，K3，K10，K21，K22，K30，K55，K64，01，02a，03，04，05，或012，或所述K和所述O血清型的任何组合。

KPORF-13(SEQ ID No 216)的变体的实例在表8和SEQ ID Nos413-451中给出。KPORF-21(SEQ ID No 224)的变体的实例在表9和SEQ ID Nos 452-500中给出。KPORF-32(SEQ ID No 235)的变体的实例在表10和SEQ ID Nos 501-540中给出。KPORF-37(SEQ ID No 240)的变体的实例在表11和SEQ ID Nos 541-579中给出。KPORF-38(SEQID No 241)的变体的实例在表12和SEQ ID Nos 580-617中给出。KPORF-39(SEQ ID No 242)的变体的实例在表13和SEQ ID Nos 618-667中给出。KPORF-60(SEQ ID No 263)的变体的实例在表14和SEQ ID Nos668-717中给出。KPORF-65(SEQ ID No 268)的变体的实例在表15和SEQ ID Nos 718-765中给出。

因此，在本发明的另一实施方式中，如上定义的抗原的活性变体选自SEQ ID No 413至765。

在另一实施方式中，所述抗原进一步由以下定义：

a)1至400个另外的氨基酸残基，优选1至350，1至300，1至250，或1至200，更优选1至150，更优选最多1至100，仍更优选最多1至50，最优选1，2，3，4，5，10，20，30或40个另外的氨基酸残基至包括或由Seq ID No 240的氨基酸2-420或414-847组成的抗原的活性片段，或至衍生自Seq ID No 240的氨基酸2-420或414-847的抗原的活性变体；或

b)1至1100个另外的氨基酸残基，优选1至1000，1至900，1至800，1至700，1至600，1至500，1至400，或1至300，更优选1至200，更优选最多1至100，仍更优选最多1至50，最优选1，2，3，4，5，10，20，30或40个另外的氨基酸残基至包括或由Seq ID No 241的氨基酸582-1099组成的抗原的活性片段，或至衍生自Seq ID No 241的氨基酸582-1099的抗原的活性变体。

另外的氨基酸残基可以与如上定义的抗原是同源的。同源是指与片段衍生自其的克雷伯菌(Klebsiella)抗原的氨基酸序列有同一性的任何氨基酸残基。

作为选择或另外，多肽可以包括或由抗原、任选地如上定义的另外的序列和与抗原同源的至少一个氨基酸残基组成。

在本发明的实施方式中，所述抗原进一步包括或由与所述抗原同源的至少一个氨基酸残基、优选标记蛋白的氨基酸序列组成。

如上定义的另外的序列或氨基酸残基由氨基酸残基组成，其可为任何氨基酸，其可以为L-和/或D-氨基酸，无论天然发生的或其它。优选地所述氨基酸为任何天然发生的氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。

然而，该氨基酸还可以为修饰的或为非天然氨基酸。这些的实例为2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、锁链素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸或鸟氨酸。此外，氨基酸可以进行修饰例如翻译后修饰。修饰的实例包括乙酰化、酰胺化、阻断、甲酰化、γ-羧基谷氨酸羟基化、糖基化、甲基化、磷酸化和硫酸化。如果超过一种另外的或异源氨基酸残基存在于肽中，氨基酸残基可以相互相同或不同。

在一种实施方式中本发明的肽进一步包括与所述抗原异源的至少一个氨基酸残基。特征“异源氨基酸”或“与抗原异源的氨基酸”是指任何氨基酸，其不同于位置与在克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)的任何天然发生的蛋白中的抗原相邻的氨基酸。因此，包括至少一种异源氨基酸的本发明的蛋白质是指这样的蛋白质，其不同于克雷伯菌(Klebsiella)或其片段，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)的任何天然发生的蛋白质。

在一种实施方式中，另外的氨基酸残基侧翼于抗原N-末端、C-末端或N-和C-末端。

在另一实施方式中，本发明涉及如上所述的抗原，由此所述另外的氨基酸残基侧翼于由以下定义的抗原：

a)Seq ID No 240的氨基酸2-420或其C-末端衍生的变体，

b)Seq ID No 240的氨基酸414-847或其N-末端衍生的变体，或

c)Seq ID No 241的氨基酸582-1099或其N-末端和/或C-末端衍生的变体。

在另一种实施方式中，抗原进一步包括或者由前导序列或分泌序列、用于纯化的序列，或者前蛋白序列组成。

本发明的另一方面涉及这样的抗原，其包括如在表1的“预测的免疫原性aa”或“鉴定的免疫原性区域(aa)的位置”栏中所指出的，或由表4的“从aa”和“至aa”栏中所定义的，或如表5的“蛋白质(aa)中的位置”栏中所指出的至少一个核心氨基酸序列，由此更优选核心氨基酸序列选自以下：

Seq ID No 204的氨基酸11-27，35-47，68-107，113-122，124-136，140-146，152-164，168-174，183-201，211-218，228-243，246-253和180-226；Seq ID No 205的氨基酸13-31，48-59，69-91，109-115，121-127和46-105；Seq ID No 206的氨基酸12-44，49-95，102-145，148-178，184-229，233-244，249-273，292-299，304-329，334-348，354-365，367-385，394-426，428-440，444-487，503-527，531-539，546-554，556-584和273-286；Seq ID No 207的氨基酸7-17，22-32，34-41，55-77，79-86，93-111，118-126，131-148，152-162，165-177，183-197，213-220，234-250，253-262，267-294和211-269；Seq IDNo 208的氨基酸22-29，41-56，58-66，79-88，94-121，124-131，134-157，162-171，173-180，189-197，201-214，216-224，242-254，257-270，282-287，290-302，309-315，320-325，341-355，362-368，372-378和1-48；Seq ID No 209的氨基酸5-15，18-35，48-61，65-71，112-119，138-154，157-169，179-208，214-223，226-232，243-250，256-262，277-286，289-296，338-348，352-363，370-376，385-408，420-436，443-454，462-483，498-561，563-592，600-642，661-671，673-709，714-733，748-754，771-776，798-806，808-821，823-839和31-83；Seq ID No 210的氨基酸5-14，21-26，31-41，59-77，101-115，132-145，147-156，180-185，188-197和97-158；Seq ID No 211的氨基酸6-18，23-43，45-56，69-80，87-97，112-123，135-151，164-171，178-193，200-227，249-258，262-274，279-291，302-308，322-327，329-336，351-363，366-373，384-399，403-411，415-434，440-446，461-482，488-506，510-516，518-551，574-589，607-629，634-665，667-687，694-712，725-739，743-751，753-768和521-583；Seq ID No 212的氨基酸4-13，19-44，55-63，71-82，89-110，120-130，132-138，145-161，168-182，189-258，261-272，278-288，290-301和11-76；Seq ID No 213的氨基酸4-22，43-56，63-68，81-90，93-99，139-148，155-160，170-176，189-195，207-218，227-232，241-249，251-258，260-266，277-295，300-327，329-336，340-356，384-390，418-423，427-433，438-444和383-428；Seq IDNo 214的氨基酸10-18，32-37，45-55，60-69，77-83，89-95，120-125，133-170，172-185，193-211，214-223，232-249，255-275，277-303，305-310，320-328，334-341，347-353，355-369，380-386，389-395和71-85；Seq ID No 215的氨基酸4-23，27-35，67-73，80-103，117-126，132-138，140-159，162-171，180-194，198-208，211-218，228-234，239-253，262-270，272-291，296-305和39-110；Seq IDNo 216的氨基酸13-24，27-34，37-66，69-88，99-104，149-155，164-175，184-193，199-209，227-235，264-273，276-285，288-315，323-335，346-353，56-111和199-261；Seq ID No 217的氨基酸11-22，25-48，51-60，64-72，80-96，108-122，132-137，142-150，152-167，175-199，214-229，237-244，252-258，260-266，279-287，301-340，345-350和109-153；Seq ID No 218的氨基酸37-43，50-57，65-82，87-109，123-129，141-150，152-157，166-172，179-203，209-241，249-284，290-300，308-326，329-335，345-357，359-368，379-386，390-417，420-425，438-444，461-466，473-490，497-505，524-534，541-550，586-597，608-614，622-632，660-666，679-694，696-706，708-722，725-731，737-763，784-789，810-825，837-854，857-880，882-895，901-907，911-928，14-76和176-220；Seq IDNo 219的氨基酸9-16，38-52，61-86，93-100，110-117，123-132，138-145，151-169，172-181，186-202，208-225，227-253，264-275，289-295，320-329，335-342和113-193；Seq ID No 220的氨基酸11-18，24-30，42-49，53-63，69-80，87-93，95-103，144-171，173-185，193-200，202-208，215-221，242-261，266-273，277-286，290-299，322-328，338-351，354-377，391-409，441-451，461-466，499-515，521-527，562-569，621-629，647-663，676-682，694-701，703-713，725-731，735-744，755-764，793-800和490-547；Seq IDNo 221的氨基酸4-11，14-22，38-70，81-90，97-114，118-132，147-171，173-181，187-202，244-250，252-298，301-311，313-331，342-368，410-418，446-451，456-462，468-474，476-492，499-507，519-528，552-565，568-575，584-613，618-624，626-649和417-489；Seq ID No 222的氨基酸4-9，32-53，66-72，74-90，97-104，110-130，133-139，144-152，166-177，203-213，215-241，256-275，291-304，307-316，321-326，334-345，352-367和201-255；Seq ID No 223的氨基酸13-19，26-43，66-72，80-85，95-101，109-125，131-137和25-107；Seq ID No 224的氨基酸13-24，35-43，50-56，58-68，77-83，104-110，117-125，132-138，140-153和19-66；Seq ID No225的氨基酸15-31，37-42，47-54，68-87，89-96，107-117，121-127，131-137，145-151，176-182，220-226，232-246，250-257，291-300，317-325，328-333，337-359，368-393，403-428，460-478，480-493，500-506，511-516，519-526，528-559，565-572，584-595，597-605，608-613，626-648，679-684，687-693，703-714，718-735，742-750，757-765，768-788，793-799，813-819，823-829，839-850和576-623；Seq ID No 226的氨基酸10-35，37-60，63-76，79-86，88-97，108-113，118-126，128-134，138-145，153-159，168-188，194-208，211-243，255-260，270-276，285-301，307-346，348-367和275-339；Seq IDNo 227的氨基酸4-17，21-33，35-42，47-64，72-80，85-92，98-103，125-147，151-161，165-177，183-230，232-246，256-262，284-306，310-328，331-367，369-383，392-399和32-85；Seq ID No 228的氨基酸5-11，18-27，42-52，60-65，75-84，90-102，107-116，125-178，184-206，221-233，235-242，249-257，264-277，288-317和267-313；Seq ID No 229的氨基酸5-11，14-42，50-75，79-86，89-98，120-125，152-160，166-181，185-193，200-207和85-114；Seq ID No 230的氨基酸4-30，36-43，46-55，63-111，144-152，159-168，179-189，191-200，205-213和37-109；Seq ID No 231的氨基酸20-45，57-77，80-100，119-126，131-137，143-169，179-185，195-203，207-231，235-264，282-302，320-329，341-347，353-359，361-373和266-296；Seq ID No 232的氨基酸5-22，24-37，41-55，57-65，72-78，90-103，105-116，119-130，164-170，190-202，209-231，244-254，260-276，300-339，344-350，355-376，389-397，399-406，408-421，429-437和103-152；Seq ID No 233的氨基酸8-16，18-25，31-47，71-82，87-102，104-114，126-156，176-183，190-200，205-212，218-228，231-243，256-279，287-301，303-312，324-332，335-348，351-357，365-380，395-412，422-451，456-464，467-483，501-507和405-468；Seq ID No 234的氨基酸4-18，21-39，46-56，63-69，72-86，116-130，132-160，162-190，196-201，209-231，233-241，251-265，269-282，292-298，309-324，333-369，391-415，417-427，436-454，471-480，482-499，510-518，521-533，537-543，545-561，571-581，585-597，599-607，609-635，638-643，650-665，671-685，687-695，701-707，710-720，724-736，747-757，764-769，772-784，791-796，808-820和317-401；Seq ID No 235的氨基酸4-12，15-33，58-77，82-89，98-106，108-118，120-135，141-147，152-160，168-215，225-233，235-247，250-264，284-312，314-321，336-343，359-374，386-394和159-218；Seq ID No 236的氨基酸4-16，24-36，40-47，49-56，61-81，84-143，148-156，158-164，170-175，194-206，208-214和126-203；Seq ID No 237的氨基酸28-45，50-61，94-111，113-124，137-142，147-173，180-188，190-196，202-223，229-235，239-249，262-270，280-288，290-321，325-332，347-355，359-368，389-407，415-427，429-453，458-465，477-485，499-505，516-527，531-549，569-592，594-602，605-615，628-635，647-659，662-683，727-735，760-765，771-780，788-809，811-818和549-630；Seq ID No 238的氨基酸21-28，33-40，48-100，104-111，113-134和1-46；SeqID No 239的氨基酸12-24，31-41，53-61，73-87，112-128，133-140，151-156和26-98；Seq ID No 240的氨基酸4-9，19-26，32-56，58-67，71-81，90-95，97-105，112-118，124-132，138-144，147-167，169-177，199-207，212-217，231-241，250-260，266-272，274-282，289-296，299-310，316-331，344-350，352-363，368-377，381-394，399-406，412-450，459-473，486-503，508-514，518-548，564-570，579-587，602-608，616-623，628-635，638-654，678-688，691-696，703-709，716-723，761-772，784-793，819-826，835-844和790-834；Seq ID No 241的氨基酸4-10，18-36，43-50，63-71，75-105，109-117，134-140，145-157，176-182，184-201，203-211，215-225，240-250，262-284，294-309，313-319，327-337，350-356，361-367，372-393，411-421，428-451，453-466，487-492，501-528，535-553，564-574，592-605，612-629，631-640，646-653，658-666，673-681，713-718，720-730，739-749，784-792，821-826，833-844，853-863，871-876，885-894，900-918，937-950，952-957，972-990，995-1001，1024-1036，1039-1044，1049-1055，1062-1089，1091-1103，1110-1121，1123-1129，1131-1151，1157-1179，1181-1201，1204-1223，1233-1244，1269-1276，1279-1286，1294-1301，1303-1309，1315-1338，1350-1362，1373-1381，1398-1406，1412-1423，1440-1446，1458-1466，1481-1487，1492-1508，1511-1518，1528-1534，1536-1547，1553-1565，1606-1617，1619-1644和761-781；Seq ID No 242的氨基酸6-13，31-38，47-60，71-102，107-123，128-155，173-179，185-194，210-220和161-232；Seq IDNo 243的氨基酸11-34，36-43，49-67，74-79，84-92，94-100，103-112，120-129，134-155，162-173，177-185，189-202，206-211和130-185；Seq ID No 244的氨基酸4-10，20-35，37-46，48-55，60-66，75-82，87-98，133-150，166-172，178-189，208-214，230-235，245-251，271-308，319-333，335-355，373-380和117-201；Seq ID No 245的氨基酸4-30，54-65，91-105，107-131，135-154，163-192，199-208，210-224，229-239，248-257，263-279，281-294，328-354，373-379，382-405，426-453，462-487和249-323；Seq ID No 246的氨基酸4-10，12-24，45-55，75-88和24-40；Seq ID No 247的氨基酸4-14，20-37，47-53，55-61，75-81，97-103，107-124，129-135，139-147，160-166，169-175，181-190，202-221，247-255，272-285，300-310，318-332，351-361，384-397，406-427，442-449，458-482，494-503，512-524，531-539，552-562，577-588，590-596，600-608，613-624，637-668，692-700和232-278；Seq ID No 248的氨基酸33-39，49-55，68-84，90-96，104-120，126-143，150-159，168-191，197-208，219-225，227-233，241-247，63-115和200-250；Seq ID No 249的氨基酸4-22，24-34，36-55，57-76，83-97，99-117，135-143，145-157，163-174，178-198，200-207，209-270，276-290，321-335，338-347，367-374，393-402，404-411，416-422，443-460，467-473和117-183；Seq ID No 250的氨基酸26-37，44-52，57-96，104-111，118-124，155-177，179-197，201-214，223-233，243-250，257-262，291-297，303-314，319-363和47-105；Seq ID No 251的氨基酸36-43，45-60，76-97，107-125，131-156，158-164和118-163；Seq ID No 252的氨基酸5-32，40-50，52-60，70-88，92-101，106-126，138-150，152-161，175-193，201-234，237-248，270-285，297-303，312-318和209-255；Seq ID No 253的氨基酸4-12，23-34，49-55，59-65，70-81，83-130和62-113；Seq ID No 254的氨基酸4-26，38-49，69-76，82-96，103-119，126-140，143-190，194-209，212-218和100-167；Seq ID No 255的氨基酸7-29，35-47，56-66，80-94，97-123，125-148，150-160，166-173，175-191，193-200，207-225和75-176；Seq ID No 256的氨基酸14-36，39-45，51-59，66-71，76-88，106-117，121-126，140-157，164-187，198-206，210-252和202-256；Seq ID No 257的氨基酸4-19，27-35，90-107，120-134，144-150，166-175，192-198，221-243，249-255，263-278，283-288，305-321，324-334，342-349，355-366，377-390，413-425，442-448和130-178；Seq ID No 258的氨基酸17-26，41-51，54-61，64-72，78-105，117-125，127-137，147-155，175-213，230-236，238-261，271-277，282-297，309-318，329-347，355-372，377-390和69-126；Seq ID No 259的氨基酸4-48，54-60，62-69，73-81，88-115，124-137，139-154，156-169，171-190，194-231，240-273，288-303，336-363，367-395，405-411，434-442，449-454，466-483，491-507和226-282；Seq ID No 260的氨基酸26-34，39-47，50-80，82-88，97-105，108-127，131-137，162-180，185-191，198-203，209-214，226-247，256-288，296-305和149-239；Seq ID No 261的氨基酸5-28，30-54，73-84，89-98，109-116，122-128，137-142，163-189，207-236，245-280，288-390，404-423，426-433，450-474，487-504，506-513，524-530，532-595，605-614，620-626，631-638，644-657，667-683，686-693，695-702，707-733，739-747和6-62；Seq ID No 262的氨基酸23-31，39-50，55-67，76-100，117-130，149-171，173-185，218-238，242-288，291-298，334-346，355-369，382-399，413-420，431-438，442-449，455-466，486-493，498-508，524-531，540-546，551-558，562-570，575-582，585-596，598-604，621-630，632-650，670-677，682-701，736-749，755-761和612-626；Seq ID No 263的氨基酸4-21，24-39，44-68，74-81，85-91，109-116，129-138，142-148，173-188，195-201，207-212，223-228和126-148；Seq ID No 264的氨基酸4-17，24-42，61-67，84-93，96-102，116-121，135-143，155-165，177-186，210-224，253-259，272-297，299-331，337-351，359-367，369-385和1-49；Seq ID No 265的氨基酸4-25，28-54，67-81，85-136，138-143，157-170，180-190，197-203，205-214，219-243，246-270，277-283，290-299，305-311和127-182；Seq ID No 266的氨基酸11-20，25-33，75-80，85-91，113-124，143-155，161-170，172-184和128-176；Seq ID No 267的氨基酸4-9，16-26，28-34，55-80，120-143，150-156，158-164，167-178，185-190，192-213，221-237，242-255，257-272，281-290，325-332和48-106；Seq ID No 268的氨基酸13-48，59-70，78-88，95-112，129-151，153-161，163-182，214-221，235-245，248-277，281-291，293-301，303-311，315-320，323-346，377-383，390-398，447-454，474-487，491-512，531-544，547-553，582-590，597-603，605-611，623-629和410-466；Seq ID No 269的氨基酸6-26，39-46，48-58，69-75，109-121，139-144，148-155，166-172，215-221，261-267，313-319，363-386，423-433，447-458，465-471，483-494，497-517，558-565，578-586，589-597，619-626，636-645，659-665，671-680，682-693，733-739和152-206；Seq ID No 270的氨基酸4-19，23-35，40-50，52-58，65-73，78-103，112-125，146-160，163-192，194-200和29-90；Seq ID No 271的氨基酸4-13，17-32，40-50，57-67，76-81，88-95，107-119，131-142，144-157，171-178，185-193，197-207，212-227，231-238，248-253，263-310和90-170；Seq ID No 272的氨基酸9-28，57-82，84-93，126-135，143-166，173-194，196-201，212-220，228-254，269-277，289-298，305-316，320-327，330-337，350-359，373-378，386-392，403-411，421-428，435-441，443-458，465-470和80-141；Seq ID No 273的氨基酸11-48，54-67，69-75，89-95，101-122，124-131，134-157，159-175，202-208，214-228，258-270，272-280，287-295，298-310，331-338，340-417，427-500，502-509，534-552，556-561，564-577，585-592，594-608，621-627，632-641，643-652，671-681，683-709，712-743，758-764，776-783，789-820，835-851，864-883，885-910，913-940，948-953，967-976，994-1020和775-825；Seq ID No 274的氨基酸14-24，32-54，58-63，70-80，93-100，108-125，127-135，142-153，155-160，180-191，201-208，210-216，222-235，242-264，267-273，276-282，284-308和10-59；Seq ID No 275的氨基酸16-28，44-68，70-77，83-90，99-129，131-137，145-154，161-175，183-190，196-203，205-220，238-245，321-328，330-338，366-379，383-397，399-405，412-418，442-458，471-483，486-505，536-544，562-568，583-602，610-618，629-635，641-655，672-682，697-705，714-729，744-751，755-762，766-771，783-807和555-621；Seq ID No 276的氨基酸4-9，20-34，45-54，60-77，79-89，91-100，102-149，162-170，177-189，193-208，210-222，238-244，252-264，267-276，302-307和100-140；Seq ID No 277的氨基酸11-27，30-49，56-62，69-74，76-85，94-108，116-125，129-147，153-161，165-171，177-208，217-223，225-231，237-255，260-284，293-300和73-137；Seq IDNo 278的氨基酸4-38，40-51，84-97，99-106，109-115，119-129，131-145，148-160，180-186，188-202，230-243，246-267，274-288，290-299，302-312，317-327，332-344，353-377，381-388，407-419，423-437，447-470，474-482，486-494，501-523，531-546，551-556和727-740；Seq ID No 279的氨基酸23-52，62-76，87-104，109-115，117-123，129-139，143-149，152-170，172-191，199-205，212-218，220-240，249-256，263-275，297-303，308-342，349-380，382-394，414-420，430-441，446-452，460-475，488-505，514-531，533-539，546-568，570-577，579-588，613-625，632-670，672-716，718-745，759-769，785-798，801-807和272-324；Seq ID No 280的氨基酸4-34，36-43，56-73，80-87，101-134，148-159，161-170，178-185，195-206，211-221，223-248，259-271，276-295，297-308和241-296；Seq ID No 281的氨基酸5-31，44-50，64-74，86-94，132-147，154-167，196-203，209-219，253-260，284-289，300-312，319-327，335-340，358-364，376-383和166-202；Seq ID No 282的氨基酸4-9，12-27，29-71，77-84，90-108，114-142，147-164，180-213，217-227，229-282，291-309，322-329，336-353，365-370和317-364；Seq ID No 283的氨基酸36-41，52-66，71-83，89-95，116-127，154-174，176-184，200-206，230-237，248-259，269-284，307-316，376-383，399-418，424-442，445-451，454-462和1-50；Seq ID No 284的氨基酸9-14，33-49，64-72，87-92，103-109，123-128，130-141，143-154，160-166，182-214，237-247，251-260，292-300，327-332，337-350，357-365，388-398，405-411，422-428，451-459，478-488，520-531，534-540，558-564，580-586，591-600，605-615，629-635，641-653，658-672，212-244和533-611；Seq ID No 285的氨基酸4-10，17-27，30-37，44-62，80-85，94-114，118-131，134-141，148-161，171-212，218-241，248-261，274-313，325-336，342-348，359-373，391-397，424-431，454-474，489-495，497-503，505-515，548-553，560-580，591-610和277-324；Seq ID No 286的氨基酸7-16，18-24，30-47，49-70，83-99，103-117，126-141，146-153，159-165，177-194，198-221，236-246，255-262，273-279，283-296，301-332，338-411，422-428，434-440，452-458，463-469，494-509，511-517，524-531，548-554，564-572和335-389；Seq ID No 287的氨基酸9-15，33-54，56-80，102-108和1-42；Seq ID No 288的氨基酸15-36，42-55，58-68和54-77；Seq ID No 289的氨基酸55-75，89-96，98-110和14-36；Seq ID No 290的氨基酸8-14，29-51，73-101，110-117和70-114；Seq ID No 291的氨基酸20-25，29-34，41-52，60-67，69-85，90-100，114-122，136-142，160-170，174-181和21-58；Seq ID No 292的氨基酸14-22和4-13；Seq ID No 293的氨基酸22-40，54-66，88-105，109-118和31-74；Seq ID No 294的氨基酸5-11，18-32，47-60，66-73，83-92，113-120，126-141，151-164，167-174，201-211和118-129；Seq ID No 295的氨基酸5-11，18-24，32-40，47-53和25-54；Seq ID No 296的氨基酸18-24，31-48和5-55；Seq ID No297的氨基酸10-16，26-32，47-56，85-95和10-62；Seq ID No 298的氨基酸4-12，16-26和25-34；Seq ID No 299的氨基酸19-29，45-51，63-68，76-92，103-110，114-120，123-133，135-141和14-78；Seq ID No 300的氨基酸4-18，47-61和57-93；Seq ID No 301的氨基酸17-29，44-50和26-38；Seq ID No 302的氨基酸5-19，55-64，78-85，95-101，104-112和24-33；Seq ID No 303的氨基酸4-10和12-31；Seq ID No 304的氨基酸4-12，27-41，43-58，60-67，76-86和13-65；Seq ID No 305的氨基酸30-38，57-67和5-32；Seq IDNo 306的氨基酸30-43和2-21；Seq ID No 307的氨基酸14-20，23-36，41-48和1-52；Seq ID No 308的氨基酸18-33，51-58，76-82和32-46；Seq ID No 309的氨基酸25-31和2-16；Seq ID No 310的氨基酸14-23，50-58和9-49；Seq ID No 311的氨基酸4-10，22-31，35-45，48-68，71-80和17-66；Seq ID No 312的氨基酸4-24，28-42，46-56，63-69，87-94，112-131和2-46；Seq ID No 313的氨基酸4-15，19-28，34-41，52-62，78-86和2-20；Seq ID No 314的氨基酸4-11，16-30，32-42和7-38；Seq ID No 315的氨基酸4-20，22-31和22-38；Seq ID No 316的氨基酸4-19和17-32；Seq ID No317的氨基酸7-13，17-22，27-33，80-100和26-40；Seq ID No 318的氨基酸10-18，22-48和32-44；Seq ID No 319的氨基酸15-24，43-49，73-83和45-93；Seq ID No 320的氨基酸22-29，46-55，57-63和5-17；Seq ID No 321的氨基酸10-33和21-35；Seq ID No322的氨基酸16-24和22-49；Seq ID No 323的氨基酸4-16，37-73，76-110，117-125，127-132和2-30；Seq ID No 324的氨基酸4-12，23-35，44-56，59-88和22-76；Seq ID No 325的氨基酸15-26和23-35；Seq ID No 326的氨基酸12-22，31-40和17-44；Seq ID No327的氨基酸4-9，13-18，29-35和57-64；Seq ID No 328的氨基酸31-55，67-81和25-70；Seq ID No 329的氨基酸13-24，51-58和13-26；Seq ID No 330的氨基酸6-20，29-40，57-79和46-88；Seq ID No 331的氨基酸8-14，41-54，68-76，83-93，106-126，130-139和12-72；Seq ID No 332的氨基酸5-13，17-24，41-55，64-69，80-85，94-107，109-115和53-88；Seq ID No 333的氨基酸5-12，32-54，57-64和20-33；Seq ID No 334的氨基酸4-16，40-48，50-58，62-68，75-85，92-104，108-116，124-134和68-128；Seq ID No 335的氨基酸7-13，19-29，34-40，54-71，76-81，91-144，147-155，157-188和11-83；Seq ID No 336的氨基酸17-24，32-41和6-43；Seq ID No 337的氨基酸14-31，38-59，69-87，95-102，126-146，157-162，177-193，201-227，238-251和63-78；Seq ID No 338的氨基酸10-16，18-25，27-41，43-52，59-86，94-101，134-140和38-100；Seq ID No 339的氨基酸4-19，23-35，43-72，78-92和37-93；Seq ID No 340的氨基酸15-20，27-32，41-65，69-82，93-105，107-115，120-147，170-178，184-201，214-257，272-281，293-314，332-339，358-364，374-381，390-397，399-414，428-460和317-375；Seq IDNo 341的氨基酸11-28，47-55，59-68，76-105，108-116，120-144，146-160，167-175，180-187，209-233和144-158；Seq ID No 342的氨基酸4-13，58-78和14-77；Seq ID No 343的氨基酸26-31，44-49，57-64，67-74，107-112，116-152，154-181，202-212，241-255和57-101；Seq ID No 344的氨基酸10-41，53-70，81-93，100-111，137-147，164-169，183-190，199-210，216-221，226-240和84-95；Seq I D No 345的氨基酸12-45，48-56，73-79，91-103，106-112，117-125，132-143，154-160，178-201，208-214，216-225，260-266，276-283和98-115；Seq ID No 346的氨基酸4-15，30-42和29-39；Seq ID No 347的氨基酸22-53，55-73，80-88和33-66；Seq ID No348的氨基酸6-23，44-54和56-67；Seq ID No 349的氨基酸8-21，35-44，66-75，82-87，94-101和32-94；Seq ID No 350的氨基酸8-20，23-32，36-50，53-69和15-69；Seq ID No 351的氨基酸8-22；SeqID No 352的氨基酸31-37和2-31；Seq ID No 353的氨基酸4-20，23-39，58-63，71-78，97-102和22-82；Seq ID No 354的氨基酸23-44，135-152，168-184和57-116；Seq ID No 355的氨基酸24-31，42-50，52-62，93-117和43-94；Seq ID No 356的氨基酸20-29和24-43；Seq ID No 357的氨基酸12-57，59-74和22-40；Seq ID No358的氨基酸7-16，18-26，39-45，68-78，86-92和65-82；Seq IDNo 359的氨基酸5-17，19-34，42-48，56-71，102-113，118-129和67-111；Seq ID No 360的氨基酸4-33，50-71和13-55；Seq ID No361的氨基酸9-17，23-30，37-54，69-88，96-102，114-123，130-140，143-163和5-70；Seq ID No 362的氨基酸4-23，27-52，71-80和9-94；Seq ID No 363的氨基酸13-19和2-21；Seq ID No 364的氨基酸18-26，28-52，63-74，94-107，123-134和18-84；Seq IDNo 365的氨基酸19-33，57-68和26-48；Seq ID No 366的氨基酸4-26，31-37，42-59和12-65；Seq ID No 367的氨基酸4-25和20-39；Seq ID No 368的氨基酸40-51，54-62，67-75，83-89，126-146，148-156和31-42；Seq ID No 369的氨基酸4-15，23-33，38-49，82-98和7-91；Seq ID No 370的氨基酸6-26，36-57和40-64；Seq ID No 371的氨基酸6-15，21-28，32-38，57-65，78-103，114-134，138-144，154-163和41-95；Seq ID No 372的氨基酸13-30，47-57，71-76和25-71；Seq ID No 373的氨基酸4-31，43-51，55-63，67-72，76-83，88-95，99-118，125-132，134-159和82-118；Seq ID No 374的氨基酸4-17，26-32，34-40，45-61，67-92和41-97；Seq ID No204的氨基酸179-208和198-227；Seq ID No 205的氨基酸45-69，65-89和83-106；Seq ID No 206的氨基酸269-290；Seq ID No 207的氨基酸209-230，226-249和245-269；Seq ID No 208的氨基酸-9-15，10-33和28-52；Seq ID No 209的氨基酸29-50，45-67和62-85；Seq ID No 210的氨基酸96-120，115-139和134-158；SeqID No 211的氨基酸519-543，539-563和559-584；Seq ID No 212的氨基酸10-35，31-56和52-77；Seq ID No 213的氨基酸382-407和403-428；Seq ID No 214的氨基酸66-90；Seq ID No 215的氨基酸38-65和61-88；Seq ID No 216的氨基酸56-85，198-221，217-240和236-261；Seq ID No 217的氨基酸108-132和128-153；Seq ID No 218的氨基酸13-37，33-56，52-76，175-200和196-220；Seq ID No 219的氨基酸132-156，152-176和172-195；Seq ID No220的氨基酸489-512，508-531和526-549；Seq ID No 221的氨基酸416-442，438-465和461-489；Seq ID No 222的氨基酸199-222，217-240和235-257；Seq ID No 223的氨基酸25-55，51-81和77-107；Seq ID No 224的氨基酸18-46和42-66；Seq ID No 225的氨基酸575-601和597-623；Seq ID No 226的氨基酸274-299，295-320和316-339；Seq ID No 227的氨基酸32-61和57-85；SeqID No 228的氨基酸266-291和287-313；Seq ID No 229的氨基酸85-114；Seq ID No 230的氨基酸36-64和83-109；Seq ID No 231的氨基酸264-285和280-300；Seq ID No 232的氨基酸102-128和124-152；Seq ID No 233的氨基酸404-429和445-468；Seq ID No234的氨基酸343-374和370-401；Seq ID No 235的氨基酸158-182和178-202；Seq ID No 236的氨基酸151-180；Seq ID No 237的氨基酸549-579，575-605和601-630；Seq ID No 238的氨基酸-7-23和19-46；Seq ID No 239的氨基酸48-75和71-98；Seq ID No 240的氨基酸789-813和809-834；Seq ID No 241的氨基酸759-783；Seq ID No 242的氨基酸160-188，184-211和207-232；Seq ID No243的氨基酸130-159；Seq ID No 244的氨基酸117-147，143-173和169-201；Seq ID No 245的氨基酸248-276，272-300和296-323；Seq ID No 246的氨基酸21-43；Seq ID No 247的氨基酸231-256和252-278；Seq ID No 248的氨基酸62-91，87-115和199-227；SeqID No 249的氨基酸116-141，137-162和158-183；Seq ID No 250的氨基酸46-69，65-87和82-105；Seq ID No 251的氨基酸117-142和138-163；Seq ID No 252的氨基酸208-233和229-255；Seq IDNo 253的氨基酸61-88；Seq ID No 254的氨基酸99-124，120-145和141-167；Seq ID No 255的氨基酸74-103，99-128，124-152和148-176；Seq ID No 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291的氨基酸19-42和37-60；Seq ID No 292的氨基酸1-25；Seq ID No 293的氨基酸30-54和50-75；Seq ID No294的氨基酸111-135；Seq ID No 295的氨基酸25-54；Seq ID No334的氨基酸67-98和94-126；Seq ID No 335的氨基酸9-32，27-51，46-70和65-86；Seq ID No 336的氨基酸1-24和20-44；Seq ID No 337的氨基酸58-82；Seq ID No 338的氨基酸37-62，58-82和77-101；Seq ID No 339的氨基酸37-68和64-93；Seq IDNo 340的氨基酸317-347和343-375；Seq ID No 341的氨基酸140-164；Seq ID No 342的氨基酸13-40，36-60和55-79；Seq IDNo 343的氨基酸56-79和75-101；Seq ID No 344的氨基酸77-101；Seq ID No 345的氨基酸94-118；Seq ID No 205的氨基酸46-105；Seq ID No 216的氨基酸56-111；Seq ID No 223的氨基酸25-107；Seq ID No 224的氨基酸19-66；Seq ID No 229的氨基酸85-114；Seq ID No 230的氨基酸37-109；Seq ID No 231的氨基酸266-296；Seq ID No 232的氨基酸103-152；Seq ID No 235的氨基酸167-218；Seq ID No 240的氨基酸790-834；Seq ID No 241的氨基酸761-781；Seq ID No 242的氨基酸176-232；Seq ID No 244的氨基酸117-201；Seq ID No 245的氨基酸249-323；Seq ID No 247的氨基酸232-278；Seq ID No 252的氨基酸209-255；Seq ID No 255的氨基酸75-176；Seq ID No 256的氨基酸202-256；Seq ID No 257的氨基酸130-178；Seq ID No 258的氨基酸69-126；Seq ID No 263的氨基酸126-148；Seq ID No 264的氨基酸1-49；Seq ID No 265的氨基酸127-182；Seq ID No 267的氨基酸48-106；Seq ID No 268的氨基酸410-466；Seq ID No 269的氨基酸152-206；Seq ID No 275的氨基酸555-621；Seq ID No 281的氨基酸166-202；Seq ID No 282的氨基酸317-364；Seq ID No 283的氨基酸1-50；Seq ID No 285的氨基酸277-324；Seq ID No 289的氨基酸14-36；Seq ID No 336的氨基酸6-43；SeqID No 343的氨基酸57-101；Seq ID No 344的氨基酸84-95；Seq IDNo 345的氨基酸98-115。

在一种实施方式中，抗原进一步由以下组成：

a)1至50个另外的氨基酸残基，优选1至40，更优选1至30，更优选最多1至25，更优选最多1至10，最优选1，2，3，4或5个另外的氨基酸残基；和/或

b)与核心氨基酸序列同源的至少一个氨基酸残基。

所述另外的氨基酸残基进一步如上定义。

在另一实施方式中，所述氨基酸残基侧翼于核心氨基酸序列N-末端、C-末端或N-末端和C-末端。

在本发明的实施方式中，所述抗原包括如上定义的至少2，至少3，至少4，至少5或至少6个核心氨基酸序列。

以本发明为基础的课题在另一方面通过用于生产如本发明中定义的抗原，或其活性片段或活性变体的方法解决，包括表达如上定义的核酸分子。

本发明还涉及用于生产表达如上定义的抗原，或其活性片段或活性变体的细胞的方法，包括将合适的宿主细胞用如上定义的载体转化或转染。

在实施方式中，所述抗原或其活性片段或活性变体，分离自克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

以本发明为基础的课题在另一方面通过药物组合物，优选疫苗来解决，包括如上定义的抗原或活性片段或活性变体；或如上定义的核酸分子；或如上定义的载体。

本发明的另一方面提供药物组合物，优选疫苗，包括如上定义的抗原，或其活性片段或活性变体；或如上定义的核酸分子；或如上定义的载体，以用于治疗或预防克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染。

在优选的实施方式中本发明的药物组合物还包括免疫刺激物质，优选选自聚阳离子聚合物(polycationic polymer)，特别是聚阳离子肽，免疫刺激寡脱氧核苷酸(ODNs)，特别是Oligo(dIdC)₁₃，包含至少两个LysLeuLys基序的肽，特别是KLKLLLLLKLK，神经活性化合物，特别是人类生长激素，alum，弗罗因德(Freund)完全或不完全佐剂，或其组合。

在本发明药物组合物的更优选的实施方式中，免疫刺激物质为聚阳离子聚合物和免疫刺激脱氧核苷酸，或包含至少两个LysLeuLys基序的肽和免疫刺激脱氧核苷酸的组合，优选KLKLLLLLKLK和Oligo(dIdC)₁₃的组合。

在本发明药物组合物的更优选的实施方式中，聚阳离子聚合物为聚阳离子肽，特别是聚精氨酸。

本发明的另一方面还提供如上定义的抗原或其活性片段或活性变体，或如上定义的核酸分子，或如上定义的载体，以用于用于治疗或预防克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染。

本发明的另一优选实施方式涉及如上定义的核酸分子，如上定义的抗原或其活性片段或活性变体，在用于制备治疗或预防克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染的药物组合物，特别是制备疫苗上的用途。

以本发明为基础的课题在另一方面通过抗体，或至少其有效部分来解决，其结合至如上定义的抗原或其片段，优选其活性片段，或其变体，优选其活性变体的至少选择性部分。

在优选的实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。

在另一优选的实施方式中所述有效部分包括Fab片段，F(ab)片段，F(ab)N片段，F(ab)₂片段或F_v片段。

在本发明另一实施方式中所述抗体为嵌合抗体。

在另一实施方式中所述抗体为人源化抗体。

本发明的另一方面涉及杂交瘤细胞系，其产生如上定义的抗体。

以本发明为基础的课题还通过产生如上定义的抗体的方法来解决，其特征在于以下步骤：

a)在非人动物中通过给药如上定义的抗原，或其活性片段或活性变体给所述动物来引发免疫应答，

b)从所述动物中除去包含抗体的体液，和

c)通过将所述包含抗体的体液进行进一步的纯化步骤来产生抗体。

本发明还涉及生产如上定义的抗体的方法，其特征在于以下步骤：

a)在非人动物中通过给药如上定义的抗原或其活性片段或活性变体给所述动物来引发免疫应答，

b)从所述动物中除去脾或脾细胞，和

c)产生所述脾或脾细胞的杂交瘤细胞，

d)选择和克隆对所述抗原或对所述活性片段或对其所述活性变体特异的杂交瘤细胞，

e)通过培养所述克隆的杂交瘤细胞产生抗体，和

f)任选地进行进一步纯化步骤。

本发明的另一方面涉及包括如上指出的抗体的药物组合物。

另一方面还涉及如上定义的抗体或包括如上定义的抗体的药物组合物，以用于治疗或预防克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染。

以本发明为基础的课题在另一方面通过如上定义的抗体在制备治疗或预防克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染的药物组合物上的用途来解决。

根据另一方面本发明提供拮抗剂，其结合或能够结合在本发明中所公开的抗原、或其活性片段或活性变体。根据另一方面，根据本发明的拮抗剂为能够降低或抑制根据本发明的抗原或其活性片段或其活性变体与其相互作用伴侣的相互作用活性的拮抗剂。在优选的实施方式中，此类相互作用伴侣为所述抗原或其活性片段或其活性变体的抗体或受体，优选生理学上的受体。

根据另一方面本发明提供用于鉴定能够结合如上定义的抗原或其活性片段或活性变体的拮抗剂的方法，包括：

a)使分离或固定的如上定义的抗原或其活性片段或活性变体与候选拮抗剂在允许所述候选拮抗剂与所述抗原或其活性片段或活性变体结合的条件下，在能够提供应答于所述候选拮抗剂与所述抗原或其活性片段或活性变体的结合的可检测信号的组分的存在下接触；和

b)检测应答于所述拮抗剂与所述抗原或其活性片段或活性变体的结合产生的信号的存在或不存在。

以本发明为基础的课题还通过用于鉴定能够降低或抑制如上定义的抗原或其活性片段或活性变体与其相互作用伴侣的相互作用活性的拮抗剂的方法来解决，包括：

a)提供如上定义的抗原，或其活性片段或活性变体，

b)提供所述抗原，或其活性片段或活性变体的相互作用伴侣，特别是如上定义的抗体，

c)使所述抗原，或其所述活性片段或活性变体与所述相互作用伴侣相互作用以形成相互作用复合物，

d)提供候选拮抗剂，

e)使所述候选拮抗剂和所述相互作用复合物之间出现竞争反应，

f)确定所述候选拮抗剂是否抑制或降低所述抗原或其活性片段或活性变体与所述相互作用伴侣的相互作用活性。

本发明还涉及任何如上定义的抗原或其活性片段或活性变体在分离和/或纯化和/或鉴定所述抗原或其所述活性片段或活性变体的相互作用伴侣上的用途。

本发明的另一方面涉及用于诊断克雷伯菌(Klebsiella)有机体感染的方法，包括以下步骤：

a)使获自受试者的样品与如上定义的抗原或其活性片段或活性变体接触；和

b)检测样品中针对所述克雷伯菌(Klebsiella)有机体的抗体的存在。

在另一方面本发明提供用于诊断克雷伯菌(Klebsiella)有机体感染的方法，包括以下步骤：

a)使获自受试者的样品与如上定义的抗体接触；和

b)检测样品中所述克雷伯菌(Klebsiella)有机体的抗原的存在。

在所述方法的实施方式中所述克雷伯菌(Klebsiella)有机体的抗原为如上定义的抗原或其活性片段或活性变体。

另一方面还涉及用于诊断克雷伯菌(Klebsiella)有机体感染的方法，包括以下步骤：

a)使获自受试者的样品与对如上定义的核酸分子，或其片段特异的引物或探针接触；和

b)检测样品中此类核酸分子或其片段的存在。

本发明还提供用于体外诊断与根据本发明的抗原或其片段的表达有关的疾病的方法，包括确定编码根据本发明的所述抗原或其片段的核酸序列的存在，或确定根据本发明的抗原或其片段的存在。

在用于诊断克雷伯菌(Klebsiella)有机体感染的任何上述方法的实施方式中，克雷伯菌(Klebsiella)有机体为致病性克雷伯菌(Klebsiella)有机体，更优选选自以下的克雷伯菌(Klebsiella)有机体：包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

此外，本发明提供如本发明中定义的抗原，或其片段或变体在产生与所述抗原，或其片段或其变体结合的肽上的用途，其中所述肽为抗促成素(anticalines)。

此外，本发明提供如上定义的抗原，或其活性片段或活性变体在制备功能性核酸上的用途，其中所述功能性核酸选自适配子和镜像异构体(spiegelmer)。

在另一方面，本发明提供如上定义的核酸分子在制备功能性核糖核酸上的用途，其中所述功能性核糖核酸选自核酶、反义核酸和siRNA。

以本发明为基础的课题还通过用于在优选需要其的动物或人类中治疗克雷伯菌(Klebsiella)感染的方法来解决，包括给药给所述动物或人类以治疗有效量的如任何之前方面所定义的抗原，或其活性片段或活性变体、或核酸分子、或载体，或抗体，或药物组合物的步骤。

在实施方式中所述克雷伯菌(Klebsiella)感染为包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染。

以本发明为基础的课题在另一方面通过用于使动物或人类免疫克雷伯菌(Klebsiella)有机体感染的方法来解决，包括给予所述动物或人类以有效量的如上定义的抗原，或其活性片段或活性变体、或如上定义的核酸分子、或如上定义的载体，或如上定义的抗体，或如上定义的药物组合物的步骤，其中所述有效量适合在所述动物或人类中引起免疫应答。

在用于使动物或人类免疫克雷伯菌(Klebsiella)有机体感染的所述方法的实施方式中，所述克雷伯菌(Klebsiella)有机体选自包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

以本发明为基础的课题在另一方面通过用于针对克雷伯菌(Klebsiella)有机体在动物或人类中刺激免疫应答的方法来解决，包括给予所述动物或人类以有效量的如上定义的抗原，或其活性片段或活性变体、或如上定义的核酸分子、或如上定义的载体，或如上定义的抗体，或如上定义的药物组合物的步骤，其中所述有效量适合在所述动物或人类中刺激免疫应答。

在用于针对克雷伯菌(Klebsiella)有机体在动物或人类中刺激免疫应答的所述方法的实施方式中，所述克雷伯菌(Klebsiella)有机体选自包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

其中使用如在本发明中所定义的抗原的各种方法和用途，分别还可以使用此类抗原的片段，优选其活性片段，或此类抗原的变体，优选其活性变体(每一个都优选如本文所述)来进行或实施，这在本发明内。与根据本发明的抗原相互作用或靶向其的本文公开的各种化合物，可以另外地或备选地与所述抗原的活性片段或活性变体相互作用或靶向其，这也在本发明内。

在其中使用抗体的实践的每一方法和任何方法，原则上也可以当使用本文定义的抗促成素或功能性核酸代替抗体时实施，这也在本发明内，由此优选此类功能性核酸选自适配子或镜像异构体。这等效地适用于本申请的各种用途。

在优选的实施方式中本文公开的抗原的片段为显示此类抗原的至少一种特征的此类抗原的部分。优选此类特征为选自以下的特征：用于治疗感染的适合性、使包括人类的动物的免疫、和/或在包括人类的动物中刺激免疫应答。

与克雷伯菌(Klebsiella)、特别是肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)有关本文造成的任何公开还同样地适用于任何克雷伯菌(Klebsiellae)和克雷伯菌(Klebsiella)物种，这也在本发明内，由此克雷伯菌(Klebsiella)物种优选选自包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(Kpneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

术语“多肽”、“肽”、“蛋白质”或“抗原”在整个本说明书中可相互替换地使用，并且以综合的方式指根据本发明的抗原，包括每一个或任何其变体、片段、类似物或衍生物，特别本文所述的那些。在这个范围，无论何时术语多肽、肽、蛋白质或抗原在本文中使用，并且如果不明确地另外指出，各公开还涉及或关于根据本发明的任何抗原，包括每一个或任何其变体、片段、类似物或衍生物，特别本文所述的那些。还应该理解被根据本发明的术语多肽、肽、蛋白质或抗原覆盖的，与任何上述化合物相关描述的任何用途或方面应该还适用于被根据本发明的术语多肽、肽、蛋白质或抗原覆盖的，每一个和任何其它上述化合物。

本发明使用来自多个人类血浆池的抗体制剂以及衍生自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的基因组的表面表达文库，有利地提供了有效、相关和综合的分离的核酸分子以及由其编码的抗原(包括其活性片段和活性变体)的组。这样，本发明满足了对于肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原、疫苗、诊断和产品的广泛迫切的需要，所述肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原、疫苗、诊断和产品用于制备抗体和用于鉴定针对由以下引起的感染有效的化合物的方法中是有用的：致病性克雷伯菌(Klebsiella)，更优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，最优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

有效的疫苗应该由蛋白质或多肽组成，其能够被所有菌株表达并且能够诱导高亲和力的、丰富的针对以下的细胞表面组分的抗体：所述致病性克雷伯菌(Klebsiella)，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。抗体应该为用于调理作用(opsonization)的IgG1和/或IgG3，用于中和粘附或毒素作用的任何IgG亚型。化学上定义的疫苗与全细胞疫苗(减毒的或杀死的)相比必须明确地较好，因为与人类组织交叉反应或抑制调理作用(opsonization)的所述致病性克雷伯菌(Klebsiella)，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)的组分，可以被消除，并且可以选择诱导保护性抗体和/或保护性免疫应答的个体多肽。

在本发明的优选实施方式中，核酸分子在其全长上与Seq ID Nos1至187和Seq ID No 375中提出的核苷酸序列显示70％的同一性。更优选的是包括在其全长上与Seq ID Nos 1至187和Seq ID No 375中提出的核酸分子有至少80％或至少85％同一性的区域的核酸。在这点上，在其全长上与同样的具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，或96％同一性的核酸分子特别优选。此外，高度优选具有至少97％的那些，特别高度优选具有至少98％和至少99％的那些，更优选具有至少99％或99.5％的，特别优选具有100％同一性的。此外，在该方面优选的实施方式为核酸，其编码抗原或其片段(多肽)，其基本上保留与在Seq ID Nos 188至374和Seq ID No 376中提出的成熟多肽相同的生物功能或活性。根据本发明的核酸分子编码优选为抗原的蛋白质，这也在本发明内。由Seq ID Nos 188至374和SeqID No 376定义的分子为优选为抗原的蛋白质，这还在本发明内。

本领域所知和本文所用的同一性，为通过比较序列确定的两种或多种多肽序列或两种或多种多核苷酸序列之间的关系。在本领域，同一性还意味着多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性的程度，因为该情形可以通过在此类序列的串之间匹配来确定。同一性可以容易地计算。由于存在许多方法测定两个多核苷酸或两个多肽序列之间的同一性，该术语对本领域技术人员是已知的(例如Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987)。确定同一性的优选方法被设计成给出测试的序列之间的最大匹配。确定同一性的方法还在计算机程序中编码。确定两个序列之间的同一性的优选计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包(Devereux，J.等，1984)，BLASTP，BLASTN，and FASTA(Altschul，S.等，1990)。

作为通过参考Seq ID Nos 1-187和Seq ID No 375的本文所述的核酸分子(其描述在本文中称为第一备选方案)的第二备选方案，根据本发明的核酸分子还可以为这样的核酸分子，其与符合本文的第一备选方案所述的核酸至少基本上互补。本领域技术人员将知道个体核酸分子与另一个体核酸分子至少基本上互补。如本文所用，互补是指核酸链与第二核酸链通过Watson-Crick碱基配对原则而碱基配对。如本文所用的基本上互补是指碱基配对不对于各链的所有碱基而发生，而是留下特定数量或百分比的碱基不配对或错误地配对。正确配对碱基的百分比优选为至少70％，更优选80％，更优选90％和最优选比90％更高的任何百分比。此类更高的百分比包括91，92，93，94，95，96，97，98，99和100％，由此此类限定适用于其中使用此类术语的本申请的各方面。应该注意认为70％百分比匹配的碱基为同源的，并且认为具有此种程度匹配碱基的杂交为严紧的。用于此类严紧杂交的杂交条件可以获自Current Protocols in Molecular Biology(John Wileyand Sons，Inc.，1987)。更具体地，杂交条件如下：

-例如在5x SSPE，5x Denhardt′s试剂(Denhardt′s reagent)，0.1％SDS，100g/mL剪切的DNA中在68℃下进行杂交

-在0.2x SSC，0.1％SDS在42℃下中等严紧洗涤

-在0.1x SSC，0.1％SDS在68℃下高严紧洗涤。

具有50％GC含量的基因组DNA具有约96℃的T_M。对于1％错配，T_M降低约1℃。

此外，本文所述的任何其它杂交条件原则上也是适用的。

当然，编码与本发明鉴定出的那些相同的多肽分子的所有核酸序列分子被任何公开的给定的编码序列包括，因为遗传密码的简并性直接适用于明确地确定编码给定多肽分子的所有可能核酸分子，即使此类简并的核酸分子的数目可能高。这还适用于给定抗原的活性片段或活性变体，只要所述片段或变体编码适合使用的抗原，以能够获得如同使用全长抗原的相同效果。优选地，此类抗原或其活性片段或活性变体可以用于接种应用，例如作为活性或被动疫苗。

作为第三备选方案，根据本发明的核酸分子还可以为这样的核酸，其包括根据如上所述依照本发明的第一或第二备选方案的核酸分子的核酸分子的至少15个碱基的伸长。优选地，所述碱基形成碱基的相邻伸长。然而，该伸长由两个或更多个通过许多碱基分开的部分组成，这也在本发明的范围内。

根据本发明的核酸分子优选由来自本文公开的序列的20，更优选至少30，特别至少50个相邻碱基组成。由于使用的指定领域(例如作为(PCR)引物，探针，捕获分子(例如在(DNA)芯片上)，等)，合适的长度易于优化。优选的核酸分子包含至少表1和4中列出的一种或多种免疫原性氨基酸序列的至少相邻的15个碱基部分。特别优选的是这样的核酸，其包含在本申请的序列策略中包含的任何序列的DNA序列的相邻部分，其与可获得的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)MGH78578和Kp 342，以及如下通过其登录号指出的质粒的未完成基因组序列相比显示1个以上，优选超过2个，特别优选超过5个非同一性核酸残基(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi，或http://pedant.gsf.de/，和http://cmr.tigr.org/)：肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)质粒pJHCMW1，NC_003486，肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)质粒pIP843，NC_005015，肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)质粒pK2044，NC_006625，肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)质粒pKlebB-k17-80，NC_002610，肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)质粒pKPN2，NC_005018，肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)质粒pLVPK，NC_005249，克雷伯菌(Klebsiella sp.)KCL-2质粒pMGD2，NC_003789。然而，上述提及的未完成的基因组序列进行连续的再测序、校正、修改和添加。例如，到2007年4月为止在http://cmr.tigr.org/ 可获得的序列为9个状态编码中的7个，这意味着为缺口封闭(gapclosure)产生的另外的序列已经组装并添加至数据发布(http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbinprogress.html)。特别优选的非同一性核酸残基为导致非同一性氨基酸残基的残基。优选地，核酸序列编码具有与上述出版或列出的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)配对物(counterpart)相比至少1，优选至少2，优选至少3个不同氨基酸残基的多肽、蛋白质或抗原。优选地，此类多肽、蛋白质或抗原仍具有至少一种本文公开的具有相同氨基酸残基的分子的特性。还优选的是此类分离的多肽，其为例如在序列表中本文公开的蛋白质或抗原的片段，具有至少6，7，或8个氨基酸残基并被本文所述的核酸编码。

作为第四备选方案，根据本发明的核酸分子，还可以为在严紧杂交条件下与根据本文公开的第一、第二或第三备选方案的本发明的任何核酸退火的核酸分子。严紧杂交条件典型地为本文所述的那些。

最后，作为第五备选方案，根据本发明的核酸分子还可以为要不是遗传密码的简并性，将与根据本文所述的第一、第二、第三或第四备选方案的本发明的任何核酸分子杂交的核酸分子。此类核酸分子是指以下事实：优选根据本发明的核酸编码根据本发明的抗原，或其片段或变体。此类核酸分子特别有用之处在于检测根据本发明的核酸分子并且从而诊断各微生物例如肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或任何致病性克雷伯菌(Klebsiella)物种，特别是本文公开的那些致病性克雷伯菌(Klebsiella)物种，以及其中涉及这些类微生物的任何疾病或疾病条件。优选地此类微生物，特别是机会主义的微生物，直接或间接引起此类疾病。优选地，杂交将在与本文所述第四备选方案有关所述的严紧条件下进行。

本文所述的核酸分子通常是指任何核糖核酸分子或脱氧核糖核酸分子，其可以为未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。这样，例如，除了别的以外，本文所用的核酸分子是指单链和双链DNA、为单链和双链RNA的混合物的DNA，以及为单链和双链区域的混合物的RNA，包括DNA和RNA的杂交分子，所述DNA和RNA可以为单链，或更典型地，双链，或三链，或单和双链区域的混合物。此外，本文所用的核酸分子是指包括RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区域。在此类区域中的链可以来自相同的分子或来自不同的分子。所述区域可以衍生自一种或多种分子，但更典型地仅包括某些分子的区域。三螺旋区域的分子之一通常为寡核苷酸。如本文所用，术语核酸分子包括如上所述包含一种或多种修饰碱基的DNA或RNA。这样，具有为了稳定性或为了其它原因修饰的主链的DNA或RNA为按照该术语在本文中所规定的核酸分子。此外，包括非常见碱基，例如肌苷(inosine)，或修饰的碱基，例如三苯甲基化碱基(仅列举两个实例)的DNA或RNA为按照该术语在本文中所规定的核酸分子。将意识到各种修饰可以对DNA和RNA进行，其对本领域技术人员已知的许多有用目的起作用。本文所用的术语核酸分子包括核酸分子的此类化学上、酶促地或代谢上修饰的形式，以及特征在于病毒和细胞的DNA和RNA的化学形式，包括简单或复杂的细胞等。术语核酸分子还包括通常被称为寡核苷酸的短核酸分子。本文“多核苷酸”和“核酸”或“核酸分子”通常可相互替换地使用。

在本发明中提供的核酸分子还包括许多独特的片段，其比本申请的序列表中提出的核酸分子序列，更具体地肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)编码区域更长或更短，其可以通过标准克隆方法产生。为了独特起见，片段必须具有足够的大小以将其与其它已知核酸序列区分开，最容易通过将任何所选的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)片段与生物序列数据库例如GenBank中的核苷酸序列比较来确定。本领域技术人员将意识到在关于肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的任何方面本文所述的将同样地适合于任何其它本文所述的克雷伯菌(Klebsiella)物种，更优选任何本文所述的任何致病性克雷伯菌(Klebsiella)物种。

此外，修饰可以对本发明包括的核酸分子和多肽进行。例如，核酸还可以包括遗传密码的简并性的结果的序列。存在20种天然氨基酸，大多数被多于一种的密码指定。这样可以进行不影响由核酸编码的多肽的核苷酸取代。因此，本发明包括编码抗原或其片段的任何核酸分子。

此外，编码本发明提供的抗原或其片段的任何核酸分子可以使用标准技术例如标准克隆技术，功能上连接至任何所需的调控序列，无论是肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)调控序列或异源调控序列、异源前导序列、异源标记序列或异源编码序列，以形成融合蛋白。

本发明的核酸分子还可以为RNA的形式，例如mRNA或cRNA，或以DNA的形式，包括例如，通过克隆获得或通过化学合成技术产生或其组合的cDNA和基因组DNA。DNA可以为三链、双链或单链的。单链DNA可以为编码链，也称为正义链，或其可以为非编码链，也称为反义链。

本发明还涉及本文所述核酸分子的变体，其编码序列表中提出的具有扣除(deducted)的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)氨基酸序列的抗原的片段、类似物及其衍生物或其片段。核酸分子的变体可以为天然发生的变体例如天然发生的等位变体，或其可为已知不是天然发生的变体。核酸分子的此类非天然发生的变体可以通过突变形成技术，包括应用到核酸分子、细胞或有机体的那些来进行。

在这点上的变体中为通过核苷酸取代、缺失或添加与前述核酸分子不同的变体。取代、缺失或添加可以包括一种或多种核苷酸。变体可以在编码或非编码区或二者都改变。在编码区的改变可能产生保守或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。优选地为编码变体、类似物、衍生物或片段，或片段的变体、类似物或衍生物的核酸分子，其具有序列表中提出的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)序列，其中几个、少数、5至10、1至5、1至4、3、2、1或没有氨基酸以任何组合被取代、缺失或添加。这些中特别优选的是沉默取代(silent substitution)、添加和缺失，其不改变序列表中提出的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)多肽的性质和活性。在这点上还特别优选的是保守性取代。

本发明的核酸分子还可以用作用于例如RNA，cDNA和基因组DNA的杂交探针以分离编码本发明多肽的全长cDNA和基因组克隆，和以分离与本发明核酸分子具有高度序列相似性的其它基因的cDNA和基因组克隆。此类探针通常将包括至少15个碱基。优选地，此类探针将具有至少20，至少25或至少30个碱基，和可以具有至少50个碱基。特别优选的探针将具有至少30个碱基，以及将具有50个碱基或更少，例如30，35，40，45，或50个碱基。

例如，本发明核酸分子的编码区可以使用已知的DNA序列，通过筛选相关文库来分离，以合成寡核苷酸探针。具有与本发明基因的序列互补的序列的标记的寡核苷酸然后用于筛选cDNA、基因组DNA或mRNA的文库，来确定该探针与文库的哪种成员杂交。

本发明的核酸分子和多肽将用作用于开发或制备药物组合物和/或诊断本文进一步讨论的疾病，特别是人类疾病的试剂和材料。

为寡核苷酸的本发明的核酸分子可用于本文所述的方法，但优选用于PCR，以确定本文鉴定的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)基因是否以全部或部分在感染组织例如皮肤、滑液或血液中存在和/或转录。意识到此类序列还将在诊断病原体导致的感染的阶段和感染的类型上具有用途。为这种和其它目的，可以使用阵列，所述阵列为在本领域已知的并且包括至少根据本文所述的本发明的核酸或多肽的至少一种。

根据本发明的核酸分子可用于检测核酸分子和包含这些核酸的有机体或样品。优选地，此类检测用于诊断，更优选用于诊断与克雷伯菌(Klebsiellae)或克雷伯菌属(Klebsiella)的任何其它病原体物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)的存在或丰度相关或有关的疾病的诊断。

被克雷伯菌(Klebsiellae)或克雷伯菌属(Klebsiella)的任何其它病原体物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染的真核生物(本文也称为“个体”)，特别是哺乳动物，以及特别是人类，可以通过检测通过各种技术在DNA水平检测的根据本发明的任何核酸分子来鉴定。可以获得用于将克雷伯菌(Klebsiellae)或所述其它致病性克雷伯菌(Klebsiella)从其它有机体区分开的优选的核酸分子候选物。

本发明提供用于诊断由克雷伯菌(Klebsiellae)或克雷伯菌属(Klebsiella)的任何其它病原体物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染引起的疾病的方法，包括从分离的样品或源自个体的样品确定具有本文公开的，更优选序列表中提出的核酸分子的序列的核酸分子表达的增加水平。核酸分子的表达可以使用本领域已知方法的任何一种测定以用于定量核酸分子，例如，比如，PCR、RT-PCR、核糖核酸酶保护、Northern印迹、其它杂交方法以及本文所述的阵列。

本文所用的分离是指“借助于人工”从其天然状态分离，即，如果其在自然中出现，其已经从其起始环境改变或除去，或二者。例如，如本文所用，以其天然状态天然地存在于活的有机体中的天然发生的核酸分子或多肽为未“分离”的，但是从其天然状态的共存材料中分离的相同核酸分子或多肽为“分离”的。作为分离的部分或分离后，此类核酸分子可以连接至其它核酸分子，例如DNA，用于突变形成，以形成融合基因，并且例如用于在宿主中增殖或表达。可以将分离的核酸分子，单独或与其它核酸分子例如载体连接，引入培养或完整有机体的宿主细胞。如本文所用的术语，引入培养或完整有机体的宿主细胞，此类DNA仍将是分离的，因为他们将不以其天然发生的形式或环境。类似地，核酸分子和多肽可以出现在组合物，例如用于将核酸分子或多肽引入细胞的培养基制剂、溶液；用于化学或酶促反应的组合物或溶液，例如，其不是天然发生的组合物，但其中仍保留如本文所用的该术语的意义内的分离的核酸分子或多肽。

本发明的核酸分子可以最初在体外形成，例如通过化学合成，或最初在细胞培养物中形成以及随后分离或纯化。通常，核酸可以借助于内切核酸酶和/或外切核酸酶和/或聚合酶和/或连接酶和/或重组酶通过核酸的操作或熟练从业者已知的其它方法来获得以产生核酸。

Seq ID Nos 1至187和Seq ID No 375所定义的核酸序列以要插入载体的片段所包括的第一完整密码子起始，并且编码Seq ID Nos188至374和Seq ID No 376所定义的第一氨基酸。然而，对于重组产物另外的核酸可能是有用的或需要的，以促进克隆和表达。

优选地，该核酸可以例如通过本领域技术人员已知的方法从以下分离：克雷伯菌(Klebsiellae)或克雷伯菌属(Klebsiella)的任何其它病原体物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。同样地还适用于根据本发明的多肽。

本发明还涉及载体，其包括核酸分子或本发明的核酸分子。载体可以另外地包括允许其在宿主细胞复制的核酸序列，例如复制的原点(origin)、一种或多种治疗性基因和/或选择标记基因和其它本领域已知的基因元件，例如指导编码蛋白的转录、翻译和/或分泌的调控元件。载体可以用于转导、转化或感染细胞，从而引起细胞表达除对细胞是天然的那些之外的核酸和/或蛋白质。载体任选地包括有助于实现核酸进入细胞的材料，例如病毒颗粒，脂质体、蛋白涂层等。

本发明还涉及被本发明载体遗传上操纵的宿主细胞，以及通过重组技术产生根据本发明的多肽。

各种表达载体可用于表达根据本发明的多肽。通常，在这点上，在宿主中适合保持、增殖或表达核酸以表达多肽的任何载体可以用于表达。根据本发明的这方面，载体可以为例如质粒载体，单链或双链噬菌体载体，单链或双链RNA或DNA病毒载体。本文公开的起始质粒可商业上获得、公开获得或可以从获得的质粒通过已知的出版的方法的常规应用构建。在某些方面，载体中优选的为用于表达根据本发明的核酸分子和多肽的那些。在宿主细胞中的核酸构建体可以以传统的方式用于生产由重组序列编码的基因产物。作为选择，根据本发明的多肽可以通过传统的肽合成仪合成地生产。成熟蛋白可以在合适的启动子的控制下在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达。无细胞翻译系统也可用于使用从本发明的DNA构建体衍生的RNA生产此类蛋白。

宿主细胞可以被遗传上操作以引入核酸分子和表达本发明的核酸分子。合适宿主的代表性实例包括细菌细胞，例如链球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、大肠杆菌(E.coli)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)细胞；真菌细胞例如酵母细胞和曲霉菌(Aspergillus)细胞；昆虫细胞例如果蝇(Drosophila)S2和草地贪夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞例如CHO，COS，HeLa，C127，3T3，BHK，293，和人黑色素瘤(Bowes melanoma)细胞；以及植物细胞。

宿主细胞可以被转染，例如通过传统的方法例如用至少一种包含在转录调控序列的控制下的本发明核酸的表达载体电穿孔。

根据本发明的另一方面，提供综合性的新多肽的组。本文之前所述的此类多肽，为本文公开的抗原或其片段，优选其活性片段，及其变体，优选其活性变体。优选地，根据本发明的多肽为抗原或其片段。在本发明的优选实施方式中，提供包括氨基酸序列的抗原，所述氨基酸序列优选由本文公开的任何一种核酸分子及其片段编码。在本发明另一优选的实施方式中，提供新的蛋白质和抗原和其活性片段以及活性变体的组，其包括选自Seq ID Nos 188至374和Seq ID No 376的氨基酸序列。

由本发明提供的根据本发明的多肽，即抗原，优选包括在序列表中提出的任何多肽或分子，以及以下多肽：其与根据本发明的此类多肽具有至少70％同一性，优选与根据本发明的此类多肽具有至少80％或85％同一性，更优选与根据本发明，更优选如在序列表中提出的此类多肽有至少90％相似性(更优选至少90％同一性)，仍更优选与根据本发明的此类多肽具有至少95％，96％，97％，98％，99％ or 99.5％相似性(仍更优选至少95％，96％，97％，98％，99％，或99.5％同一性)，并且还包括此类多肽的部分，所述该多肽的此类部分通常包含至少4个氨基酸，更优选至少8，更优选至少30，更优选最多50个氨基酸，例如4，8，10，20，30，35，40，45或50个氨基酸。在优选的实施方式中此类部分为根据本发明的多肽的活性片段。

本发明还涉及根据本发明多肽的片段、类似物及衍生物。当指其氨基酸序列优选在序列表中提出的此类多肽时，术语“片段”，“衍生物”和“类似物”是指这样的多肽，其基本上保持与此类多肽相同或相似的生物活性。本领域技术人员将承认本文所用的术语“相似的生物活性”依赖于考虑中的多肽，以及更具体地其功能。本文所用的术语“生物活性”进一步如下定义。更优选地，相似的生物功能和活性在活性、亲和力、免疫原性、稳定性和/或特异性的程度方面不同于非片段或非衍生物的功能。在优选的实施方式中差异低于50％，低于75％或低于90％。

在实施方式中根据本发明的多肽的片段、衍生物、变体或类似物为1)其中一种或多种氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)取代并且此类取代的氨基酸残基可以或可以不为由遗传密码编码的氨基酸残基的一种，或2)其中一种或多种氨基酸残基包括取代基的一种，或3)其中根据本发明的多肽或其片段与另一化合物，例如增加根据本发明的多肽或其片段的半衰期的化合物，例如比如聚乙二醇融合的一种，或4)其中另外的氨基酸融合到根据本发明的多肽或其片段，例如前导或分泌序列，或用于纯化根据本发明的多肽或其片段的序列，或前蛋白序列的一种。相信此类片段、衍生物、变体和类似物从本文教导下在本领域技术人员的范围内。

本发明还涉及不同克雷伯菌(Klebsiella)物种，优选致病性克雷伯菌(Klebsiella)物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)的蛋白质或抗原，其优选是同源的。此类同源物可以易于基于本文公开的核酸和氨基酸序列分离。迄今为止对于每一病原体存在多种可区分的血清型或临床菌株，并且分型基于血清型特异的抗血清或分子方法。因此任何抗原的存在可以就每一血清型来确定。各种血清型对不同克雷伯菌(Klebsiella)感染的贡献在不同年龄组特别是地理区域中变化。克雷伯菌(Klebsiella)特别相关的血清型为，例如K1，K2，K3，K10，K21，K22，K30，K55，K64，01，02a，03，04，05，或012，或所述K和所述O血清型的任何组合。最有价值的保护性抗原在各种临床菌株中需要是保守的，这是重要的方面。

此外，包括此类抗原、变体、类似物、衍生物或其片段，或片段的变体、类似物或衍生物的融合多肽，也被本发明包括。此类融合多肽和蛋白，以及编码其的核酸分子，可以使用标准技术，包括用于生产和表达编码融合蛋白的重组多核酸的标准重组技术易于获得。

其中优选的变体为不同于保守性氨基酸取代的参考的那些。此类取代为将在根据本发明的多肽中的给定氨基酸用类似性质的另一氨基酸取代的那些。典型看作保守性取代的是脂肪性氨基酸Ala，Val，Leu和Ile中一个对另一个的置换；羟基残基Ser和Thr的相互交换；酸性残基Asp和Glu的交换，酰胺残基Asn和Gln之间的取代，碱性残基Lys和Arg的交换，以及芳香性残基Phe和Tyr中的置换。

在本发明在另一实施方式中，如上定义的肽可以通过各种化学技术修饰来产生具有与修饰的肽基本上相同活性(如上定义对于片段和变体)，以及任选地具有其它所需性质的衍生物。例如，蛋白质的羧酸基团，无论C末端或侧链，可以以药学上可接受的阳离子的盐或酯化以形成酯，或转换成酰胺的形式提供。肽的氨基，无论氨基末端或侧链，可以为药学上可接受的酸加成盐，例如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、酒石酸和其它有机盐的形式，或可以转换成酰胺。肽侧链的羟基可以使用公知的技术转换成烷氧基或酯。肽侧链的苯基或酚环(phenoli crings)可以被一种或多种卤素原子，例如氟、氯、溴或碘取代，或被烷基、烷氧基、羧酸或其酯，或此类羧酸的酰胺取代。巯基可以用许多公知的保护基团的任何一种，例如乙酰胺基团保护。

在这点上还特别优选的是变体、类似物、衍生物和片段，以及片段的变体、类似物和衍生物，其具有本文所公开，优选在序列表中提出的根据本发明的任何多肽的氨基酸序列，其中几个、少数、5至10、1至5、1至3、2、1或没有氨基酸残基以任何组合被取代、缺失或添加。这些中特别优选的是沉默取代、添加和缺失，其不改变本发明肽的性质和活性。在这点上还特别优选的是保守性取代。最高度优选的是具有序列表中提出的没有取代的氨基酸序列的肽。

在本文公开的其各种实施方式中任何抗原的变体，特别是Seq IDNos 188至374和Seq ID No 376规定的抗原和肽，可以典型地借助于生物信息学来表征。各工具例如NCBI Basic Local AlignmentSearch Tool(BLAST)(Altschul等，1990)可以从几种来源获得，包括国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(NCBI，Bethesda，MD)和在因特网上，以连同序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx一起使用。使用NCBI Blast 2.0，空位的blastp设定为默认参数。使用设定为默认参数的默认的BLOSUM62基质(matrix)，(空位存在成本(gapexistence cost)11，以及每残基空位成本(per residue gap cost)为1)，使用Blast2序列功能。当比对短肽(低于约35个氨基酸)时，将使用Blast2序列功能，使用设定成默认参数(开放的空位(open gap)9，延伸空位(extension gap)1罚分)的PAM30基质，进行比对。用于在此类短窗口例如15个氨基酸或更少上确定序列同一性的方法描述于由在马里兰的贝塞斯达(Bethesda)的国家生物技术信息中心维护的网址(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。

抗原的活性变体通过在抗原上的序列改变而获得，如果不明确地指出相反，包括其每一和任何变体、片段、类似物或衍生物，其中具有序列改变的根据本发明的多肽保持未改变的根据本发明的多肽的功能，例如具有与完整抗原所展示的相似的生物活性，包括例如在败血症和/或致死性模型(lethality model)中诱导免疫应答和/或显示保护免受克雷伯菌(Klebsiella)有机体的能力。保留未改变的根据本发明的多肽的功能的另一实例为抗原的活性变体与多肽特异性抗体特异性结合，所述抗体结合根据本发明的多肽的未改变形式。提到“生物功能”或“生物活性”优选指细胞或有机体中的多肽的功能，其中其天然地发生，即使该功能对于细胞和有机体的生长或存活分别是不需要的。例如，孔蛋白的生物功能允许在细胞外基质中存在的化合物进入细胞。该生物功能不同于抗原性功能。根据本发明的多肽可以具有超过一种生物功能。

此类变体的序列改变可以包括，但不限于，保守性取代、缺失、突变或插入。优选地，活性变体显示与败血病患者的人类血清的反应性，更优选介导血清转化，最优选显示杀菌活性。活性变体的这些特性可以例如按照实施例中具体地评估。在本发明的上下文中，变体特异性结合特异性抗体(优选针对动物例如小鼠、兔中的重组蛋白产生的多克隆抗体或在小鼠中产生的单克隆抗体)，显示与来自患有败血病的患者的人类血清的反应性，介导血清转化或显示杀菌活性，如果变体的活性总计为没有序列改变的抗原的活性的至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，更优选至少70％，更优选至少80％，特别是至少90％，特别是至少95％，最优选至少99％。

所述活性变体包括天然发生的等位变体，以及突变体或任何其它非天然发生的变体。在本领域已知，等位变体为(多)肽的改变形式，如上所述，其特征在于具有基本上不改变多肽的生物功能的一种或多种氨基酸的取代、缺失或添加。

在生活世界的任何物种内，等位变体为常规的。例如，任何细菌物种，例如肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，通常由相互不同之处在于微小的等位变化的各种菌株(特征在于克隆繁殖)代表。实际上，在不同菌株中履行相同生物功能的多肽可以具有在每一菌株中不相同的氨基酸序列。此类等位变化同样地反映在核苷酸水平。

等位变化对于A类β-内酰胺酶K2在所述的克雷伯菌(Klebsiella)物种内非常常见(Haeggman，S.et al.，1997)。

在优选的实施方式中，通过氨基酸交换、缺失或插入衍生自根据本发明的多肽的活性变体或活性片段还可以保持，或更优选改进活性(如本文定义的反应性、血清转化和/或杀菌活性)。此外，这些多肽还可以包括表位，其触发相同或优选改进的T细胞应答。如本文进一步定义，这些表位称为”异变的(heteroclitic)”。它们对MHC/HLA分子具有类似的或优选更高的亲和力，以及以类似或优选更强的方式刺激针对起始表位的T细胞受体(TCR)。异变表位可以通过合理设计获得，即例如Rammensee等(1999)所述，考虑单独残基对结合MHC/HLA的贡献，结合可能与TCR相互作用的残基的系统交换，用具有针对起始表位的T细胞测试所得的序列。此类设计对于本领域技术人员无需过度预期即是可行的。

其与任何所述Seq ID Nos 188至374和Seq ID No 376的多肽具有至少50％的序列同一性，特别与任何所述Seq ID Nos 188至374和Seq ID No 376的多肽具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，96％，97％，98％，最优选99％的序列同一性，和/或通过保守性取代衍生自Seq ID Nos 188至374和Seq ID No 376的任何序列的所述多肽。保守性取代为发生在与其侧链和化学性质相关的氨基酸家族内的那些。此类家族的实例为具有碱性侧链、具有酸性侧链，具有非极性脂肪性侧链、具有非极性芳香性侧链、具有不带电的极性侧链、具有小侧链、具有大侧链等的氨基酸。在一种实施方式中，一种保守性取代包括在肽中。在另一种实施方式中，两种保守性取代或更少包括在肽中。在另一实施方式中，三种保守性取代或更少包括在肽中。

保守性氨基酸取代的实例包括，但不限于，以下列举的这些：

根据本发明的多肽、其片段或变体还包括或由修饰的表位(modified epitope)以及编码此类修饰表位的核酸序列组成，所述修饰的表位中优选给定表位的一种或两种氨基酸根据在例如，Tourdot，S.等，(2000)中公开的规则修饰或取代。由根据本发明多肽呈现的表位本文还称为呈递表位。

通过氨基酸交换衍生自的呈递表位的，改进、保持或至少不显著地阻碍表位的T细胞激活能力的表位，也包含在根据本发明的表位中，这是明显的。因此，呈递表位还包括这样的表位，其不包含衍生自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的起始序列，但是触发相同或优选改进的T细胞应答。这些表位还称为″异变的″，它们需要具有类似的或优选更高的与MHC/HLA分子的亲和力，并且需要以类似或优选更强的方式刺激针对起始表位的T细胞应答(TCR)。

用于鉴定表位特别是异变的表位的另一种可能包括用针对一种或几种呈递表位的T细胞筛选肽文库。优选方式为合成肽文库的位置扫描。此类方法已经例如由Hemmer，B.等，(1999)和其中给出的参考文献具体地描述。

作为由本文公开的当前衍生的氨基酸序列或异变表位代表的表位的备选方案，模拟这些表位的本文也称为″拟肽(peptidemimetica)″或″反向释放肽(retro-inverse-peptides)″的物质或化合物也可使用并且从而在本发明内。

改进表位的设计的另一方面为其用增加其刺激T细胞的能力的物质的配制或修饰。这些包括T辅助细胞表位、脂质或脂质体或优选如在WO 01/78767中公开的修饰。

增加表位的T细胞刺激能力的另一方式为其用免疫刺激物质的配制，所述免疫刺激物质例如细胞因子或趋化因子如白介素-2，-7，-12，-18，I和II类干扰素(IFN)，特别是IFN-γ，GM-CSF，TNF-α，flt3-配体和其它。

根据本发明的多肽优选以分离的形式提供，优选纯化成同质的。

在本发明的另一实施方式中变体为片段。片段的特征在于通过一种或多种氨基酸缺失衍生自如上定义的抗原。缺失可以为C-末端、N-末端和/或内部的。优选片段通过最多10，20，30，40，50，60，80，100，150或200，更优选最多10，20，30，40或50，更优选最多5，10或15，更优选最多5或10，最优选1，2，3，4或5个缺失来获得。本发明的活性片段的特征在于具有与完整抗原显示的类似的生物活性，包括例如在败血症和/或致死性模型(lethality model)中诱导免疫应答和/或显示保护免受克雷伯菌(Klebsiella)的能力。如果片段的活性总计为没有序列改变的抗原的活性的至少10％，优选至少25％，更优选至少50％，更优选至少70％，更优选至少80％，特别是至少90％，特别是至少95％，最优选至少99％，抗原的片段在本发明的上下文中是活性的。这些片段可以以任何所需的长度设计或获得，包括长度上小至约50至80个氨基酸。

在进一步的实施方式中，根据本发明的多肽的片段，更优选活性片段的特征在于结构或功能属性，即包括根据本发明的多肽的α-螺旋或α-螺旋形成区域、β-折叠和β-折叠形成区域、转角和转角-形成区域、卷曲(coil)或卷曲-形成区域、亲水性区域、疏水性区域、α-两性区域、β-两性区域、柔性区域(flexible regions)、表面-形成区域、底物结合区域、以及高抗原性指示区域的片段，以及此类片段的组合。优选的区域为介导根据本发明的多肽的抗原性和抗体结合活性的那些。在这点上最高度优选的为具有本发明的抗原及其片段的化学、生物或其它活性的片段，包括具有类似或改进活性的那些，由此此类改进活性为免疫原性和稳定性，或具有降低的不期望的活性，由此此类降低的不期望的活性为酶促和毒性功能，并且产生人类交叉反应抗体。特别优选的是包含酶的受体或结构域的片段，其赋予对于克雷伯菌(Klebsiella)或其它任何致病性克雷伯菌(Klebsiella)物种的存活关键的功能，或在人类中引起疾病的功能。根据本发明的多肽的进一步优选的片段为包括或包含在动物，特别是人类中的抗原性或免疫原性决定子的那些。此类片段还称为抗原性片段。

抗原性片段还优选定义为其自身为抗原性或当以半抗原提供时可以获得抗原性的片段。因此，显示一个，特别对于更长的片段，显示仅几个氨基酸交换的抗原或抗原性片段，也能够通过本发明实现，条件是具有氨基酸交换的此类片段的抗原性或抗原性能力在交换上不严重地恶化，即适合在用此抗原接种的个体中引发合适的免疫应答并且通过来自个体血清的个体抗体制备来鉴定。

根据本发明的多肽的此类片段的优选实例为在表16中列出的那些(SED ID NOs 188-203和376)。

根据本发明的多肽的此类片段的优选实例为在表1的“预测的免疫原性aa”或“鉴定的免疫原性区域(aa)的位置”栏中所指出的，或由表4的“从aa”和“至aa”栏中所定义的，或如表5的“蛋白质(aa)中的位置”栏中所示的核心氨基酸序列。

表1、4和5中列出的所有这些片段单独地和独立地每一个形成本发明的优选方面。

将意识到，除了其它，本发明还涉及编码前述片段、变体、活性变体和活性片段的核酸分子，与编码片段、变体、活性变体和活性片段的核酸分子杂交的核酸分子，特别是在严紧条件下杂交的那些，以及用于扩增编码片段的核酸分子的核酸分子，例如PCR引物。在这些方面，优选的核酸分子为符合如上讨论的优选片段的那些。

根据本发明的多肽可以以修饰的形式表达，例如融合蛋白，并且可以不仅包括分泌信号还包括另外的异源功能区域。这样，例如，另外的氨基酸的区域，特别是带电的氨基酸，可以添加至多肽的N-或C-末端以改进在纯化期间或在随后的处理和贮存期间在宿主细胞中的稳定性和持续性。同样地，区域可以添加至多肽以促进纯化或以增强表达。此类区域还可以在最终制备多肽之前除去。将肽部分添加至多肽以引起分泌或排泄，以改进稳定性，以增强表达或以促进纯化等，在本领域是熟悉和例行的技术。优选的融合蛋白包括来自免疫球蛋白的异源区域，其用于使多肽溶解或纯化。例如，EP 0464533公开了包括免疫球蛋白分子的恒定区的各种部分以及另一蛋白或其部分的融合蛋白。在药物发现中，例如，蛋白质已经与抗体Fc部分融合，以旨在高通量筛选检测，从而鉴定拮抗剂。参见例如，(Bennett，D.等，1995)和(Johanson，K.等，1995)。融合还可以包括融合或偶合至除了氨基酸的部分(包括脂质和碳水化合物)的根据本发明的多肽。此外，本发明的抗原还可以与现有技术描述的其它疫苗试剂，以及与衍生自其它微生物的其它物种疫苗试剂组合使用。此类蛋白可用于预防、治疗和诊断由广谱克雷伯菌(Klebsiella)分离株引起的疾病。

在进一步的实施方式中本发明的肽融合至表位标记，其提供抗-标记物质可以选择性结合至其的表位。表位标记通常位于肽的氨基-或羧基-末端，但是只要生物活性允许就可以引入作为内部插入物或取代物。肽的此类表位-标记的形式的存在可以使用例如针对标记的肽的抗体的物质来检测。同样地，表位标记的提供允许肽通过使用抗标记(anti-tag)抗体或与表位标记结合的其它类型的亲和基质的亲和纯化来容易地纯化。各种标记多肽及其各抗体在本领域是已知的。实例包括聚组氨酸(poly-his)、聚组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标记、HA标记多肽、c-myc标记、Strep标记和FLAG标记。

本发明的多肽可以通过许多传统技术中的任一制备。例如，它们可以通过化学合成以及通过生物技术手段生产。后者包括用包含根据本发明的核酸转染或转化宿主细胞。在优选的实施方式中，载体为根据本发明的载体。根据本发明的多肽的生物技术生产进一步包括在允许蛋白质表达并且对本领域技术人员而言是已知的条件下，转染或转化的宿主细胞的培养。将表达的蛋白质通过对本领域技术人员已知的合适手段从细胞(或从培养基，如果细胞外地表达)回收、分离和任选地纯化。例如，蛋白质使用已知的技术，例如在盐酸胍中在细胞裂解或提取后以溶液的形式分离。包括本发明多肽和抗原的分子可以使用各种传统方法中的任何进一步纯化，所述传统方法包括但不限于：硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、液相色谱例如正相或反相，使用HPLC，FPLC等；亲和色谱(例如使用无机配体或单克隆抗体)，尺寸排阻色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、凝集素色谱、固定金属螯合物色谱、凝胶电泳等。本领域技术人员可以选择最合适的分离和纯化技术而无需背离本发明的范围。此类纯化提供基本上不含微生物的其它蛋白质和非蛋白质材料的形式的抗原。

制备根据本发明的多肽的备选方案涉及通过酶促消化已知肽的片段产生，例如通过用已知在由特定氨基酸残基限定的位点处裂解蛋白质的酶处理，或通过用合适的限制性酶消化DNA，表达消化的DNA和分离所需片段。另一合适的技术涉及通过聚合酶链反应(PCR)分离和扩增编码所需肽片段的DNA片段。限定DNA片段的所需末端(termini)的寡核苷酸在PCR中用作5′和3′引物。在具有已知序列的DNA中，并从而在蛋白质中的预定位点处，用于形成突变，例如缺失、插入和取代的技术是已知的。使用传统技术，例如PCR，本领域技术人员可以容易地使用本文提供的抗原和肽，来鉴定和分离其它类似的蛋白。此类方法是常规的，并且认为如果根据本文提供的信息，不需要过度的试验。例如，使用寡核苷酸介导的位点-指导的突变形成(Carter，P.等，1985；Zoller，M.J.等，1987)、盒式突变形成(cassettemutagenesis)(Wells等，1985)、限制性选择突变形成(Wells，J.A.等，1986)、PCR突变形成或其它已知的技术，可以形成变化，以在克隆的DNA上进行，从而产生本发明的肽。

根据本发明的多肽可以用于检测有机体或在包含这些有机体或蛋白质或抗原(包括其片段)的样品中的有机体。优选此类检测用于诊断，更优选用于诊断疾病，最优选用于诊断与革兰氏阴性细菌，特别是选自以下的细菌的存在或丰度有关或相关的疾病：致病性克雷伯菌(Klebsiella)物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

根据本发明的核酸还可用于诊断或检测样品中的有机体，由此有机体优选分别为与在根据本发明的多肽和根据本发明的抗体的使用方面公开的相同的有机体。基本上，按照本公开内容分别设计和实施此类诊断和检测检验和方法，这在本领域技术人员的技能内。更优选此类诊断或检测使用引物或探针以特异地与根据本发明的核酸分子相互作用。此类引物和探针的长度和设计分别依赖于具体方法或实施的诊断而变化。在优选的实施方式中，使用用于例如基于PCR的检测或诊断系统，即方法或检验的引物，引物的长度将从约10个核苷酸至约30个核苷酸，更优选约16至25个核苷酸。在基于探针的检测或诊断系统的情况下，探针的长度优选约与基于引物的系统所规定的相同。此外，在基于探针的系统的情况下，探针将包括允许其直接或间接检测的部分。用于直接检测的此类部分可以为本领域技术人员已知的放射性标记或荧光标记。用于间接检测的此类部分可以为生物素或任何其它部分，其介导与其它化合物的相互作用，所述其它化合物又被标记以允许其检测。

本发明还涉及诊断检验，例如用于检测在细胞和组织中的根据本发明的多肽，更优选本发明的抗原及其片段的水平(包括确定正常和异常水平)的定量诊断检验。这样，例如，用于检测根据本发明的多肽相对于正常对照组织样品的过度表达的根据本发明的诊断检验可以用于检测感染的存在，例如，鉴定感染的有机体。可用于确定在衍生自宿主的样品中的此类多肽水平的检验技术对本领域技术人员是已知的。此类检验方法包括放射性免疫检验、竞争结合检验、Western印迹分析和ELISA检验。其中，经常优选ELISA和Western印迹分析。ELISA检验最初包括制备对根据本发明的多肽之一特异的抗体，优选单克隆抗体。此外，通常制备与单克隆抗体结合的报道抗体。报道抗体连接至可检测试剂例如放射性、荧光或酶试剂，例如辣根过氧化物酶。根据本发明的多肽的一种或几种，更优选根据本发明的抗原及其片段可以固定在ELISA平板上以用于检测要测试的患者或受试者中的反应性抗体。

Western印迹分析最初通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳个体地或组合地分离根据本发明的多肽，并且其随后转移并固定到固相载体基质上，例如硝基纤维素、尼龙或其组合。与报道抗体一起反应性抗体可以被检测。报道抗体连接至可检测试剂例如放射性、荧光或酶试剂，例如辣根过氧化物酶上。

还可以使用如本文所述的根据本发明的多肽或根据本发明的核酸分子或针对其的引物或探针，以用于阵列目的或与其一起使用。在根据本发明的核酸分子和针对其的引物或探针的情况下，探针和引物的长度可优选为约25至约75个核苷酸，更优选从约35至约50个核苷酸。更具体地，根据本发明的多肽的至少一种可以固定在载体上。所述载体典型地包括各种根据本发明的多肽和/或其抗原和片段，从而通过使用根据本发明的抗原及其片段，和/或不同的抗原及其片段的一种或几种可以形成变化。此类阵列以及通常的任何阵列的特性化特征在于以下事实：在所述载体或其表面上的独特或预定义区域或位置，独特的多肽被固定。因为这个在阵列的独特位置或区域的任何活性可以与特定多肽有关。在载体上固定的不同多肽，更优选不同抗原及其片段的数量可以分别从少至10个至几千不同的多肽和抗原及其片段。每

所述分子的密度在优选的实施方式中可以少至10每

至少400个不同的此类多肽每

，更特别是至少1,000个不同的此类多肽，更优选不同的抗原及其片段每。本文关于固定根据本发明的多肽及其用途所述的，还适用于核酸分子和本领域技术人员已知的分别针对其的引物和探针。

此类阵列的制造对于本领域技术人员是已知的，并且，例如，描述于美国专利5,744,309。阵列优选包括具有至少第一表面的平坦的、多孔或非多孔的固相载体。根据本发明的多肽固定在所述表面上。其中，优选的载体材料为玻璃或纤维素。阵列用于本文所述诊断应用任一项，这也在本发明内。除了根据本发明的多肽之外，根据本发明的核酸分子也可以用于产生如上所述阵列，其原则上可用于任何公开的目的，以用于包含多肽的阵列。其中，这也应用到由本文所述的抗体，优选单克隆抗体组成的阵列。

在另一方面，本发明涉及针对根据本发明的多肽、根据本发明的其衍生物、片段、变体、活性片段和活性变体的任何的抗体。本发明包括，例如，单克隆和多克隆抗体、嵌合、单链和人源化抗体、以及Fab片段或Fab表达文库的产物。抗体可以是嵌合的，即其不同部分源于不同物种或至少各序列取自不同物种，这在本发明内。

通常和特别针对符合本发明序列的抗原及其片段的此类抗体可以通过将根据本发明的多肽直接注射入动物或通过给药所述多肽给动物，优选非人类来获得。如此获得的抗体然后结合所述多肽自身。以此方式，甚至仅编码所述多肽片段的序列可以用于产生结合根据本发明的完整天然多肽的抗体。此类抗体然后可以用于从表达抗原及其片段的组织分离根据本发明的多肽。本领域技术人员将理解该方法还适用于所述多肽的片段、变体、其活性片段和活性变体。

为了制备单克隆抗体，可以使用提供通过连续细胞系培养产生的抗体的本领域已知的任何技术(如最初在Kohler，G.等，1975中描述)。

可以使为了生产单链抗体描述的技术(美国专利No.4,946,778)适合在根据本发明的各种实施方式中生产针对免疫原性抗原及其片段的单链抗体。同样地，转基因小鼠，或其它有机体例如其它哺乳动物，可以用于表达针对根据本发明多肽的人源化抗体。

本发明的另一方面还涉及生产本发明抗体的杂交瘤细胞系。

表达所需单克隆抗体的杂交瘤细胞系通过已知的传统技术产生。杂交瘤细胞可以通过将正常激活的，抗体-产生B细胞与骨髓瘤细胞融合来产生。在本发明的上下文中，杂交瘤细胞能够产生特异性结合本发明抗原的抗体。

类似地，所需高滴度抗体可以通过将已知的重组技术应用到为这些抗原开发的单克隆或多克隆抗体来产生(参见，例如，PCT专利申请No.PCT/GB85/00392；英国专利申请公开No.GB2188638A；Amit，A.G.等，1986；Queen，C.等，1989；PCT专利申请No.WO90/07861；Riechmann，L.等，1988；Huse，W.D.等，1988)。

作为选择，可以使用噬菌体展示技术或核糖体展示来选择具有针对根据本发明多肽的结合活性的抗体基因，所述多肽来自源于人类的筛选以具有各靶抗原的淋巴细胞的PCR扩增v-基因的库或来自天然文库(McCafferty，J.等，1990)；(Marks，J.等，1992)。这些抗体的亲和性还可以通过链改组(chain shuffling)来改进(Clackson，T.等，1991)。

如果存在两种抗原结合结构域，每一结构域可以针对不同的表位-称为‘双特异’抗体。

上述抗体可以用于通过将抗体连接到固相载体上来分离或鉴定表达根据本发明的多肽的克隆以用于通过亲和色谱分离和/或纯化。

这样，其中，针对根据本发明的多肽的抗体可以用于抑制和/或治疗感染，特别是细菌感染，更特别是由以下引起的感染：致病性克雷伯菌(Klebsiella)物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

在其各种实施方式中根据本发明的多肽，更具体地抗原及其片段包括抗原学上、表位学上或免疫学上的等效衍生物，其形成本发明的特别方面。如本文所用的术语“抗原学上的等效衍生物”包括根据本发明的此类多肽或其等效物(equivalent)，其将被特定抗体特异性地识别，所述特定抗体当针对所述多肽产生时，干扰病原体与哺乳动物宿主之间的相互作用。如本文所用的术语“免疫学上的等效衍生物”包括这样的肽或其等效物，当在合适的制剂中使用以在脊椎动物中产生抗体时，抗体起作用以干扰病原体与哺乳动物宿主之间的相互作用。

在其各种实施方式中根据本发明的多肽，更具体地抗原及其片段，例如其抗原学上或免疫学上的等效衍生物或其融合蛋白可用作抗原以使小鼠或其它动物例如大鼠或鸡免疫。融合蛋白可以提供稳定性给根据本发明的多肽。此类多肽可以例如通过与免疫原性载体蛋白，例如胎牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)缀合而连接。作为选择，包括根据本发明的多肽，更优选抗原及其片段，或抗原学上或免疫学上的等效抗原及其片段的多拷贝的抗原性肽，可以为充分抗原性的，以改进免疫原性从而避免使用载体。

优选地将抗体或其衍生物修饰以使其在个体中较少免疫原性。例如，如果个体为人类，抗体可以最优选为“人源化的”，其中杂交瘤衍生的抗体的互补决定区已经移植到人类单克隆抗体，例如如在(Jones，P.等，1986)或(Tempest，P.等，1991)中所述。

在遗传免疫中根据本发明的核酸分子的使用将优选使用合适的递送方法，例如将质粒DNA直接注射入肌肉，递送与特异蛋白载体复合的DNA，使DNA与磷酸钙共沉淀，以脂质体的各种形式封装DNA，粒子轰击(particle bombardment)(Tang，D.等，1992；Eisenbraun，M.等，1993)和使用克隆的逆转录病毒载体体内感染(Seeger，C.等，1984)。

在另一方面本发明涉及与任何根据本发明的多肽结合的肽，以及用于制备此类肽的方法，由此该方法特征在于使用所述多肽和本领域技术人员已知的基本步骤。

此类肽可以通过使用根据现有技术的方法例如噬菌体展示或核糖体展示来产生。在噬菌体展示的情况下，基本上以噬菌体的形式产生肽的文库，并且将此类文库与靶分子在根据本发明多肽的存在下接触。与靶分子结合的这些肽随后优选作为具有靶分子的复合物从各反应中除去。本领域技术人员已知结合特性，至少在某种程度上，依赖于具体实行的试验构建例如盐浓度等。从文库的未结合成员中分离具有更高亲和力或更强力的与靶分子结合的这些肽后，并且任选地还在从靶分子和肽的复合物除去靶分子之后，各肽可以随后表征。在表征之前，任选地实行扩增步骤，例如通过使编码肽的噬菌体增殖。表征优选包括靶结合肽的测序。基本上，肽不在其长度上受限，然而优选具有约8至20个氨基酸长度的肽优选在各方法中获得。文库的大小可为约10²至10¹⁸，优选10⁸至10¹⁵个不同的肽，然而不限于此。在优选的实施方式中此类肽为高亲和力的结合肽。在更优选的实施方式中，肽为肽适配子。

如上所述的靶结合肽的特别形式为所谓的“抗促成素”，其中，其描述于德国专利申请DE 19742706。迄今为止，本发明还涉及与根据本发明的多肽特异性结合的肽，以及其用于本文所述治疗性和诊断性应用的任何之一，优选用于抗体的用途。

在另一方面，本发明涉及与任何根据本发明的多肽相互作用的功能性核酸，以及用于制备此类功能性核酸的方法，由此该方法特征在于使用根据本发明的多肽，并且基本步骤对本领域技术人员而言是已知的。功能性核酸优选为核酸适配子和镜像异构体。迄今为止，本发明还涉及与根据本发明的多肽特异性结合的核酸适配子和镜像异构体，以及其用于本文所述治疗性和诊断性应用的任何之一，优选用于抗体的用途。

适配子为D-核酸，其为单链或双链的并且其与靶分子特异性地相互作用。适配子的制备或选择例如描述于欧洲专利EP 0533838。基本上实行以下步骤。首先，提供核酸的混合物，即潜在的适配子，由此各核酸典型地包括几个，优选至少8个连续的(subsequent)随机核苷酸的片段。将该混合物随后与靶分子接触，由此核酸例如基于与候选混合物相比，增加的针对靶的亲和力或具有至其的更大的力，与靶分子结合。结合核酸然后从剩下的混合物分离。任选地，将这样获得的核酸使用例如聚合酶链反应扩增。这些步骤可以重复几次，最后给出具有与靶特异性结合的核酸的比率增加的混合物，从其最终的结合核酸然后任选地选择。这些特异性结合核酸被称为适配子。显然可以采用用于产生或鉴定个体核酸的混合物的适配子样品的方法的任何阶段以使用标准技术确定其序列。适配子可以被例如通过引入预定义的化学基团来稳定化，所述化学基团对于产生适配子领域的技术人员而言是已知的。此类修饰可以例如在于在核苷酸的糖部分的2’-位置处引入氨基。适配子目前用作治疗剂。然而，这样选择或产生的适配子可以用于靶验证和/或用作前导物质，以用于开发药物组合物，优选基于小分子的药物组合物，这也在本发明内。这实际上通过竞争检验来完成，由此靶分子和适配子之间的特异性相互作用被候选药物抑制，从而当从靶和适配子的复合物置换为适配子时，可以假定各药物候选物允许特异性抑制靶和适配子之间的相互作用，并且如果该相互作用是特异的，所述候选药物将至少原则上适合阻断靶，从而降低其在包括此类靶的各系统上的生物利用度或活性。这样获得的小分子可以然后进行进一步的衍生化和修饰以优化其物理、化学、生物和/或医学性质例如毒性、特异性、生物降解性和生物利用度。

镜像异构体及其产生或制备基于类似的原理。镜像异构体的制备描述于国际专利申请WO 98/08856。镜像异构体为L-核酸，其是指它们由L-核苷酸组成而不是如适配子那样由D-核苷酸组成。镜像异构体的特征在于以下事实：它们在生物系统中具有非常高的稳定性，并且与适配子相比，特异性地与它们针对的靶分子相互作用。在产生镜像异构体的过程中，形成D-核酸的异源群体，并且使该群体与靶分子的光学对映体接触，在本案中例如与根据本发明的抗原或其片段的天然发生的L-对映异构体的D-对映异构体接触。随后，分离不与靶分子的光学对映体相互作用的那些D-核酸。但是将与靶分子的光学对映体相互作用的那些D-核酸分离、任选地鉴定和/或测序，并且随后基于从D-核酸获得的核酸序列信息合成相应的L-核酸。这些L-核酸，其和上述与靶分子的光学对映体相互作用的那些D-核酸在序列方面相同，将特异性地与天然发生的靶分子而不是与其光学对映体相互作用。与用于产生适配子的方法类似，还可以重复各种步骤几次，从而富集与靶分子的光学对映体特异性地相互作用的那些核酸。

在另一方面，本发明涉及与根据本发明的任何核酸分子相互作用的功能性核酸，和用于制备此类功能性核酸的方法，由此该方法的特征在于使用根据本发明的核酸分子及其各序列，并且基本步骤对本领域技术人员而言是已知的。功能性核酸优选为核酶、反义寡核苷酸和siRNA。迄今为止，本发明还涉及与根据本发明的多肽特异性结合的此类功能性核酸，以及其用于本文所述的任何治疗性和诊断性应用，优选用于抗体的用途。

核酶为催化活性的核酸，其优选由RNA组成，其基本上包括两部分。第一部分显示催化活性而第二部分负责与靶核酸特异性地相互作用，在本案中所述核酸编码根据本发明的多肽。当靶核酸与核酶的第二部分之间相互作用时，典型地通过杂交和与在两条杂交链上的碱基的基本上互补的延伸的Watson-Crick碱基配对，催化活性部分可以变得有活性，这意味着在核酶的催化活性为磷酸二酯酶活性的情况下，其分子内或分子间地催化靶核酸。随后可以存在靶核酸的进一步降解，其最终导致靶核酸以及从所述靶核酸衍生的蛋白质的降解。核酶、其用途和设计原则对于本领域技术人员而言是已知的，并且例如描述于(Doherty，E.等，2001)和(Lewin，A.等，2001)。

分别用于制备药物组合物和作为诊断试剂的反义寡核苷酸的活性和设计，基于作用的类似模式。基本上，反义寡核苷酸基于碱基互补性与靶RNA，优选与mRNA杂交，由此激活核糖核酸酶H。核糖核酸酶H被磷酸二酯和硫代磷酸酯偶合的DNA激活。然而磷酸二酯偶合的DNA被细胞核酸酶迅速地降解，除了硫代磷酸酯偶合的DNA之外。当与RNA杂交时，这些有抗性的、非天然发生的DNA衍生物不抑制核糖核酸酶H。换句话说，反义多肽仅作为DNA RNA杂交复合物有效。其中此类反义寡核苷酸的实例描述于美国专利US 5,849,902和US 5,989,912。换句话说，基于靶分子(其在本案中为用于根据本发明的抗原及其片段的核酸分子，所述抗原及其片段来自从其原则上可以推断出各核酸序列的靶蛋白)的核酸序列，或通过知道核酸序列等，特别是mRNA，合适的反义寡核苷酸可以基于碱基互补的原理而设计。

特别优选的为反义寡核苷酸，其具有短延伸的硫代磷酸酯DNA(3至9个碱基)。最少3个DNA的碱基需要细菌核糖核酸酶H的激活，而最少5个DNA的碱基需要哺乳动物核糖核酸酶H的激活。在这些嵌合寡核苷酸中，存在形成核糖核酸酶H的底物的中心区域，其侧翼于由修饰的核苷酸组成的不形成核糖核酸酶H的底物的杂交“臂”。嵌合寡核苷酸的杂交臂可以被例如2′-O-甲基或2′-氟修饰。备选方法在所述臂中使用甲基磷酸酯或氨基磷酸酯键。用于实施本发明的反义寡核苷酸的进一步实施方式为P-甲氧基寡核苷酸，部分P-甲氧基寡脱氧核糖核苷酸或P-甲氧基寡脱氧-核糖核苷酸。

对于本发明特别相关和有用的为作为更具体地描述于上述两篇提到的美国专利中的那些反义寡核苷酸。这些寡核苷酸不包含天然发生的5’′＝＞3’′-连接的核苷酸。而是该寡核苷酸具有两种类型的核苷酸：激活核糖核酸酶H的2’-脱氧硫代磷酸酯(deoxyphosphorothioate)，以及不激活的2’-修饰核苷酸。2’-修饰核苷酸之间的键可以为磷酸二酯、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸二酯。核糖核酸酶H的激活通过相邻的核糖核酸酶H-激活区域实现，其在3和5之间包含2’′-脱氧硫代磷酸酯核苷酸以激活细菌核糖核酸酶H，以及在5和10之间包含2’-脱氧硫代磷酸酯核苷酸以激活真核，特别是哺乳动物核糖核酸酶H。保护免受降解通过使5’和3’′末端碱基高度核酸酶抗性，并且任选地通过在3’末端放置阻断基团来实现。

更具体地，反义寡核苷酸包括5’末端和3’末端；并且从位置11至595’′＝＞3’′-连接的核苷酸独立地选自2’′-修饰的磷酸二酯核苷酸和2’′-修饰的P-烷氧基磷酸三酯核苷酸；并且其中所述5’′-末端核苷酸连接至三和十邻近的硫代磷酸酯-连接的脱氧核糖核苷酸之间的核糖核酸酶H-激活区域，并且其中所述核苷酸的3′’末端选自倒置的(inverted)脱氧核糖核苷酸、1至3个硫代磷酸酯2′’-修饰的核糖核苷酸的相邻延伸、生物素基团和P-烷氧基磷酸三酯核苷酸。

同样地还可以使用这样的反义寡核苷酸，其中不是5′’末端核苷酸连接到核糖核酸酶H-激活区域，而是如上指出的3′’末端核苷酸。同样地，5′’末端选自特定的组而不是所述核苷酸的3′’末端。

在各种实施方式中根据本发明的核酸和多肽可用作或用于制备药物组合物，特别是疫苗。优选地此类药物组合物，优选疫苗用于预防或治疗由以下相关或有关引起的疾病：克雷伯菌(Klebsiella)物种，优选致病性克雷伯菌(Klebsiella)，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。迄今为止本发明的另一方面涉及用于在个体，特别在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，其包括用在其各种实施方式中的根据本发明的多肽，或其片段或变体接种个体，所述多肽，或其片段或变体足以产生抗体或保护所述个体免受上述微生物的感染。

本发明的另一方面还涉及在个体中诱导免疫应答的方法，其包括，通过基因治疗或其它，递送根据本发明的核酸分子，优选在其各种实施方式中的功能性编码抗原或其片段，以用于在体内表达根据本发明的多肽，从而诱导免疫应答以产生抗体或细胞介导的T细胞应答(细胞因子-产生T细胞或细胞毒性T细胞)，以保护所述个体免受疾病，无论该疾病已经在个体中确立或尚未。单因素给药(One-way ofadministering)该基因通过促进其进入所需细胞作为颗粒或其它上的涂层。

本发明的另一方面涉及免疫组合物，当引入能够在其内诱导免疫应答的宿主时，所述免疫组合物在此类宿主中诱导免疫应答，其中所述组合物包括重组DNA，所述重组DNA在其各种实施方式中编码和表达根据本发明的多肽的至少一种。免疫应答可以治疗学上或预防学上地使用，并且可以采用抗体免疫性或细胞免疫性的形式例如由CTL或CD4+T细胞产生的那些。

在其各种实施方式中根据本发明的多肽可以与辅蛋白(co-protein)融合，该辅蛋白自身不能产生抗体，但是能够稳定第一蛋白并且产生具有免疫原性和保护性质的融合蛋白。该融合重组蛋白优选进一步包括抗原性辅蛋白，例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或β-半乳糖苷酶；相对大的辅蛋白，其使蛋白溶解并促进其生产和纯化。此外，辅蛋白在提供免疫系统的普遍刺激的意义上可以充当佐剂。辅蛋白可以与第一蛋白的氨基或羧基末端连接。

通过本发明还提供这样的方法，其在其各种实施方式中在具有任何以下感染的动物模型中的此类基因免疫试验中使用根据本发明的核酸分子：本文所述的克雷伯菌(Klebsiella)物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。此类分子将特别地用于鉴定能够激起预防性或治疗性免疫应答的蛋白表位。该方法能够允许随后从成功地抵抗或清除感染的动物的必要器官中制备特定价值的单克隆抗体，以用于开发在哺乳动物中，特别在人类中以下感染的预防性试剂或治疗性治疗：本文所述的克雷伯菌(Klebsiella)物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

在其各种实施方式中根据本发明的多肽可以用作用于接种宿主的抗原，以产生特异性抗体，所述抗体例如通过阻断细菌粘附到受损组织上来保护防止细菌的入侵。组织损伤和进而受损组织的实例包括例如由病毒感染(特别是呼吸性的，例如流感)、机械的、化学的或热损伤或由植入留置装置引起的皮肤或结缔组织和肌肉组织中的创伤，或在粘膜，例如口、乳腺、尿道或阴道中的创伤。

本发明还包括疫苗制剂，其包括在其各种实施方式中的根据本发明的一种或几种多肽以及一种或多种合适的载体和/或赋形剂。用于本发明的药学上可接受的载体和/或赋形剂是常规的，并且可以包括缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和增溶剂。E.W.Martin，Mack PublishingCo.，Easton，PA，15th Edition(1975)的Remington′s PharmaceuticalSciences，描述了适合药学上递送本文所述(多)肽的组合物和制剂。通常，载体或赋形剂的性质将依赖于所用的给药的具体模式。例如，胃肠外制剂通常包括注射液，其包括药学上和生理学上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡的盐溶液、水性右旋糖、甘油等作为载体。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，传统的非毒性固体载体可以包括，例如，医药级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上的中性载体之外，要给药的药物组合物可以包含少量的非毒性助剂物质，例如增湿或乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠或去水山梨糖醇月桂酸酯。

由于根据本发明的所述多肽可以在胃中分解，它们优选胃肠外地给药，包括，例如为以下的给药：皮下地、肌肉内的、静脉内的、皮内的、鼻内的或透皮的。适合胃肠外给药的制剂包括水性或非水性无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂与体液等渗性的溶质，优选个体的血液；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂或增稠剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器(container)，例如，密封的安瓿或小瓶(vials)中，并且可以在冷冻干燥条件下贮存，其在使用之前立即仅需要添加无菌液体载体。疫苗制剂还可以包括佐剂系统以增强制剂的免疫原性，例如水包油系统和其它本领域已知的其它系统。剂量将依赖于疫苗的比活性并且可以通过常规试验容易地确定。

根据另一方面，本发明涉及药物组合物，其包括在其各种实施方式中的一种或几种根据本发明的多肽以用于本文所述的各种克雷伯菌(Klebsiella)物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。此类药物组合物可以包括针对所述克雷伯菌(Klebsiella)物种的所述多肽的一种，优选至少两种或更多。任选地，在组合药物组合物中此类多肽还可以与针对另一病原体的抗原组合。优选地，所述药物组合物为用于预防或治疗由以下引起的感染的疫苗：克雷伯菌(Klebsiella)物种，更优选致病性克雷伯菌(Klebsiella)物种例如包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)和/或其它病原体，针对其抗原已经包含在疫苗中。

根据另一方面，本发明涉及包括根据本发明的核酸分子的药物组合物。此类药物组合物可以包括编码根据本发明的多肽的一种或多种根据本发明的核酸分子。任选地，在组合的药物组合物中使此类编码根据本发明的多肽的核酸分子与编码针对其它病原体的抗原的核酸分子组合。优选地，所述药物组合物为用于预防或治疗由以下引起的感染的疫苗：克雷伯菌(Klebsiella)物种，更优选本文公开的致病性克雷伯菌(Klebsiella)物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)和/或其它病原体，针对其抗原已经包含在疫苗中。

药物组合物可以包含任何合适的助剂物质(auxiliarysubstance)，例如缓冲物质、稳定剂或其它活性成分，特别是关于药物组合物和/或疫苗生产已知的成分。

在优选的实施方式中药物组合物还包括免疫刺激物质例如佐剂。佐剂可以基于给药方法选择，并可以包括聚阳离子物质，特别是聚阳离子肽，免疫刺激性核酸分子，优选免疫刺激性寡脱氧核苷酸(ODNs)，特别是Oligo(dIdC)₁₃，包含至少两个LysLeuLys基序的肽，特别是肽KLKLLLLLKLK，alum、无机油类佐剂例如弗罗因德(Freund)完全佐剂、弗罗因德(Freund)不完全佐剂，神经活性化合物，特别是人类生长激素，或一种或多种上述佐剂的任何组合。其它合适的佐剂可以从以下选择：Montanide不完全Seppic佐剂(incomplete Seppic adjuvant)例如ISA、水包油乳化佐剂例如Ribi佐剂系统、包含胞壁酰二肽的syntax佐剂制剂，或铝盐佐剂或其组合。优选地，所述佐剂为

(Intercell；如在WO 02/32451中所述的包括肽基序KLK的合成佐剂和如在WO 01/93905中所述的寡核苷酸)。

本发明中所用的术语“Oligo(dIdC)₁₃”是指包含13个脱氧(肌酐-胞嘧啶)基序的磷酸二酯主链的单链ODN分子，还定义为术语[oligo-d(IC)₁₃]。确切序列为5’-dIdCdIdCdIdCdIdCdIdCdIdCdIdCdIdCdIdCdIdCdIdCdIdCdIdC-3’。Oligo(dIdC)₁₃还可以定义为术语(oligo-dIC₂₆)；oligo-dIC_26-mer；oligo-deoxy IC，26-mer；或oligo-dIC，26-mer，例如在WO 01/93903和WO 01/93905中所指出。

药物组合物，特别是疫苗，包括除了在其各种实施方式中的一种或几种根据本发明的多肽和/或根据本发明的核酸分子之外，还包括生物学上或药学上活性的其它化合物，这也在本发明内。优选地，疫苗组合物包括至少一种聚阳离子肽。根据本发明要使用的聚阳离子化合物可以为任何聚阳离子化合物，其显示根据WO 97/30721的特性效果。优选的聚阳离子化合物选自：碱性多肽、有机聚阳离子、碱性聚氨基酸或其混合物。这些聚氨基酸应该具有至少4个氨基酸残基的链长(WO97/30721)。特别优选的为例如以下物质：聚赖氨酸、聚精氨酸和包含在多于8个，特别多于20个氨基酸残基中碱性氨基酸超过20％，特别超过50％的多肽，或其混合物。其它优选的聚阳离子及其药物组合物描述于WO 97/30721(例如聚乙烯亚胺)和WO 99/38528。优选地这些多肽包含20至500个氨基酸残基，特别是30至200个残基。

这些聚阳离子化合物可以化学地或重组地生产，或可以来自天然来源。

阳离子(多)肽还可以为具有在(Ganz，T.，1999)中所述性质的抗菌剂。这些(多)肽可以为原核或动物或植物来源，或可以化学地或重组地生产(WO 02/13857)。肽还可以属于防御素类(WO 02/13857)。此类肽的序列可以例如在以下网址的抗菌序列数据库(AntimicrobialSequences Database)中发现：http://www.bbcm.univ.trieste.it/～ tossi/pag2.html。

此类宿主防御肽或防御剂(defensives)还为根据本发明的聚阳离子聚合物的优选形式。通常，将允许适应性免疫系统的激活(或下调)(优选通过APC(包括树突细胞)介导的)作为最终产物的化合物用作聚阳离子聚合物。

用作在本发明中聚阳离子物质的特别优选的为导管素(cathelicidin)衍生的抗菌肽或其衍生物(国际专利申请WO02/13857，在此通过参考引入)，特别是衍生自哺乳动物导管素，优选来自人类、牛或小鼠的抗菌肽。

来自天然来源的聚阳离子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的阳离子肽、触角足(antennapedia)肽、壳聚糖或几丁质的其它衍生物)或衍生自这些肽的其它肽或通过生化或重组生产的蛋白质。其它优选的聚阳离子化合物为凯萨林(cathelin)或与凯萨林相关或衍生的物质。例如，小鼠凯萨林为肽，其具有氨基酸序列NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH。相关或衍生的凯萨林物质包含具有至少15-20个氨基酸残基的凯萨林序列的全部或部分。衍生可以包括天然氨基酸被不在20种标准氨基酸中的氨基酸的取代或修饰。此外，其它阳离子残基可以引入此类凯萨林分子。这些凯萨林分子优选与抗原组合。这些凯萨林分子令人惊奇地被证明作为用于抗原的佐剂而无需添加其它佐剂也是有效的。因此可以使用此类凯萨林分子作为在具有或不具有其它免疫激活物质的疫苗制剂中的有效佐剂。

根据本发明使用的另一优选的聚阳离子物质为包含被3至7个疏水性氨基酸分开的至少2个KLK-基序的合成肽(国际专利申请WO02/32451，在此通过参考引入)。

本发明的药物组合物还可以包括免疫刺激性核酸。免疫刺激性核酸为例如中性或人工的CpG，其包含核酸、衍生自非脊椎动物的核酸的短延伸(stretches)；或以短的寡核苷酸(ODNs)的形式，所述寡核苷酸(ODNs)在特定的碱基背景(base context)中包含未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)(例如描述于WO 96/02555)。作为选择，例如描述于WO 01/93903的基于肌苷和胞苷的核酸，或包含脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核酸(描述于WO 01/93905和WO02/095027，在此通过参考引入)可以优选用作与本发明相关的免疫刺激性核酸。优选地，不同免疫刺激性核酸的混合物可以根据本发明使用。

任何上述聚阳离子化合物与任何上述免疫刺激性核酸组合，这也在本发明内。优选地，此类组合根据描述于以下的那些：WO 01/93905，WO 02/32451，WO 01/54720，WO 01/93903，WO 02/13857和WO02/095027和WO 03/047602，在此通过参考引入。

此外或作为选择，除了根据本发明的多肽和根据本发明的核酸分子(优选根据本发明的编码核酸分子)之外，此类疫苗组合物可以包括优选神经活性化合物。优选地，神经活性化合物为如例如描述于WO01/24822的人类生长因子。同样优选地，神经活性化合物与上述的任何聚阳离子化合物和/或免疫刺激性核酸组合。

同样地，根据本发明的药物组合物为这样的药物组合物，其包括至少任何以下化合物或其组合：在其各种实施方式中的根据本发明的核酸分子、根据本发明的多肽、根据本发明的载体、根据本发明的细胞、根据本发明的抗体、根据本发明的功能性核酸和分别根据本发明的结合肽例如抗促成素和高亲和力结合肽和肽适配子、优选按照本文所述筛选的根据本发明的激动剂和拮抗剂。与其相关的任何这些化合物可以与用于细胞、组织或有机体的未灭菌或灭菌的载体，例如适用于给药给受试者的药学上的载体组合使用。此类组合物包括，例如介质添加剂或治疗有效量的本发明的抗原及其片段，和药学上可接受的载体或赋形剂。此类载体可以包括，但不限于，生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。制剂应该适合给药模式。

所述组合物可以例如用于免疫或治疗受试者。所述药物组合物包括至少一种本发明的肽；然而，其还可以包括鸡尾酒(即，简单的混合物)，所述鸡尾酒包含本发明的不同肽(包括片段和其它变体)，任选地与其它病原体的不同的抗原性蛋白质或肽混合。这些肽、多肽、蛋白质或其片段或变体的此类混合物例如用于产生针对广谱克雷伯菌(Klebsiella)分离株的所需抗体。本发明的肽还可以以药学上可接受的盐的形式使用。能够与本发明的肽形成盐的合适的酸和碱对于本领域技术人员而言是已知的，并且包括无机和有机酸和碱。

本发明的另一方面为包含选自以下的核酸的药物组合物：

(i)本发明的核酸和/或与其互补的核酸，和

(ii)任选地药学上可接受的载体或赋形剂。

单独或与其它核酸序列组合的核酸序列可以进一步用作药物组合物的成分，所述其它核酸序列编码抗原或抗体或针对其它致病性微生物。所述组合物可以用于免疫或治疗患有以下感染引起的疾病的人类和/或动物：克雷伯菌(Klebsiella)，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。药学上可接受的载体或赋形剂可以如上定义。

在另一种实施方式中，单独或与编码来自其它致病性微生物的其它抗原或抗体的其它核酸序列组合的本发明的核酸序列，可以进一步用于组合物，所述组合物指导积极地诱导针对受试者中的病原体的保护性免疫应答。本发明的这些组分在用于诱导针对患有以下感染的人类和/或动物中的保护性免疫应答的方法中是有用的：克雷伯菌(Klebsiella)，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

为了用于制备治疗剂或疫苗组合物，核酸递送组合物和方法是有用的，其对于本领域技术人员而言是已知的。本发明的核酸还可用于本发明的方法或用于本文所述的组合物作为DNA序列，其或者作为裸DNA给药，或与药学上可接受的载体一起给药，并且提供了抗原、肽或多肽的体内表达。所谓的“裸DNA”可以用于在患者中在体内表达本发明的抗原、肽或多肽(参见，例如，Cohen，J.，1993，其描述了“裸DNA”的类似用途)。例如，与调控序列相关的“裸DNA”可以治疗学上地或作为疫苗组合物的部分例如通过注射给药。

作为选择，编码本发明的抗原或肽的核酸或与其互补的核酸可以用于药物组合物内，例如以在体内表达本发明的抗原或肽或多肽，例如以诱导抗体。

本发明的优选实施方式涉及药物组合物，其中根据本发明的核酸包括在载体和/或细胞内。适合本发明上下文的载体和/或细胞如上所述。载体特别地用于DNA疫苗。用于递送的合适的载体可以由本领域技术人员容易地选择。用于体内基因递送的示例性载体容易地获自各种学院和商业来源，并且包括，例如腺相关病毒(国际专利申请No.PCT/US91/03440)、腺病毒载体(Kay，M.等，1994；Ishibashi，S.等，1993)或其它病毒载体，例如各种痘病毒、牛痘等。重组病毒载体，例如逆转录病毒或腺病毒，优选用于将外源DNA整合入细胞的染色体。

本发明的药物组合物可以任何有效传统的方式给药，包括例如，通过局部、口服、肛门、阴道、静脉内、腹膜内、皮下、鼻内、气管内或皮内途径等给药。

在治疗中或作为预防剂，本发明的药物组合物的活性剂可以作为注射组合物，例如作为优选等渗的无菌水分散液给药给个体。

作为选择，所述组合物，优选药物组合物可以例如以软膏剂、霜剂、洗剂、眼膏、滴眼剂、滴耳剂、嗽口水、浸渍敷料(impregnateddressing)和缝合以及气溶胶的形式配制以用于局部应用，并且可以包含合适的常规添加剂，包括，例如防腐剂，帮助药物渗透的溶剂和在软膏剂和霜剂中的润肤剂。此类局部制剂还可以包含相容的常规载体，例如软膏剂和霜剂基质，和用于洗剂的乙醇或油醇。此类载体可以占制剂重量的约1％至约98％，更通常它们占制剂质量的达约80％。

除本文所述的治疗之外，本发明的组合物还通常用作伤口处理剂以防止细菌粘附到在伤口组织中暴露的基质蛋白，并且以用于预防性应用，所述预防性应用在牙科治疗中作为抗生素预防的替代方案或与其联合使用。

在优选的实施方式中药物组合物为疫苗组合物。优选地，此类疫苗组合物方便地以注射形式。常规佐剂可用于增强免疫应答。用于使用蛋白质抗原接种的合适的单位剂量对于成人为约0.02至3μg抗原/每kg体重，对于儿童为约0.2至10μg抗原/每kg体重，并且此类剂量优选以2至24个周的间隔给药1-3次。

本发明的抗原、核酸、载体、抗体或药物组合物的“有效量”或“治疗有效量”可以按照能够显示体内效应的量计算，例如预防或改善以下感染的迹象或症状：克雷伯菌(Klebsiella)，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。此类量可以由本领域技术人员确定。

使用指出的剂量范围，期望使用本发明的化合物没有不利地毒理学效应，其将排除它们给药给合适的个体。

在进一步的实施方式中本发明涉及诊断和药物包和试剂盒，其包括填充有本发明的上述组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。成分可以以有用的量、剂量、制剂或组合存在。与此类容器相关的为以由政府机构规定形式的注意事项(notice)，其调节药物或生物产品的制备、使用或销售，反映由机构批准用于人类给药的产品的制备、使用或销售。

关于本发明，如本文所述的任何疾病相关的用途例如，比如，药物组合物或疫苗的用途，特别地为疾病或患病状况，其由以下引起，与以下相关或有关：克雷伯菌(Klebsiella)，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。根据本发明要预防和/或治疗的，与细菌感染相关、由其引起或有关的疾病，包括医院感染。常见位置包括上和下呼吸道、胆道和外科伤口位置。临床症状的范围包括肺炎、菌血症、血栓性静脉炎、尿道感染(UTI)、胆囊炎、腹泻、上呼吸道感染、伤口感染、骨髓炎和脑膜炎。

本文所述的每一和任何症状、疾病、障碍或综合症分别地和独立地为本发明意义上的适应症、疾病或障碍，这也在本发明的范围内，所述症状、疾病、障碍或综合症直接或间接与有机体的接触有关或由其引起，所述有机体例如患有以下的任何动物或人类：克雷伯菌(Klebsiella)物种，更优选致病性克雷伯菌(Klebsiella)物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。因此并且仅借助于举例，本发明意义上的疾病为败血病以及脑膜炎和骨髓炎。

本文所述各种化合物用于的疾病还可以为其中表达根据本发明的多肽的那些疾病或其中本文所述的化合物例如根据本发明的多肽、疫苗、抗体或任何适配子和镜像异构体分别适合治疗和/或诊断其的任何疾病，这也在本发明内。此类潜在应用可以分别由交叉反应性和同源性产生。本领域技术人员理解，与根据本发明的药物组合物相关描述的任何疾病可以进行使用本文所述的药物组合物，反之亦然。

本发明上下文的治疗是指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目的在于预防或降低(减轻)靶向的致病性状况或障碍。需要治疗的那些包括已经患有疾病的那些以及倾向于患有疾病的那些或在其中要预防疾病的那些。

在更进一步的实施方式中，本发明涉及使用任何根据本发明的多肽或任何根据本发明的核酸的筛选方法。像这样的筛选方法对于本领域技术人员而言是已知的，并且可以如此设计以筛选激动剂或拮抗剂。与此类筛选方法相关，优选地筛选这样的拮抗剂，其在本案中抑制或预防根据本发明的任何抗原或其片段与相互作用伴侣的结合。此类相互作用伴侣可以为天然发生的相互作用伴侣或非天然发生的相互作用伴侣。

本发明还提供用于筛选化合物以鉴定增强(激动剂)或阻断(拮抗剂)根据本发明的多肽或本发明的核酸分子的功能，例如其与结合分子的相互作用的那些。筛选方法可以包括高通量的。

例如，为了筛选激动剂或拮抗剂，根据本发明的多肽的相互作用伴侣，可能为合成反应混合、细胞区室(cellular compartment)，例如膜，细胞包膜或细胞壁，或其任何的制剂，可以从细胞制备，所述细胞表达与根据本发明的多肽结合的分子。将制剂与标记形式的此类多肽在候选分子的不存在或存在下一起孵育，所述候选分子可以为激动剂或拮抗剂。候选分子与结合分子结合的能力反映了标记的配体的降低的结合。无效地(gratuitously)结合，即不诱导所述多肽的功能效应的分子最可能是良好的拮抗剂。良好地结合并且引发与相对于根据本发明的多肽相同或紧密相关的功能效应的分子为良好的激动剂。

潜在激动剂和拮抗剂的功能效应可以例如通过以下测定：确定报道系统的活性，然后使候选分子与细胞或合适的细胞制剂相互作用，将该效应与根据本发明的多肽或与所述多肽引起相同效应的分子的效应比较。关于此点可以使用的报道系统包括但不限于转化成产品的比色标记的底物，对根据本发明的多肽的功能活性上的改变应答的报道基因和本领域已知的结合检验。

用于拮抗剂的检验的另一实例为竞争检验，其使根据本发明的多肽和潜在的拮抗剂与膜-结合结合分子、重组结合分子、天然底物或配体、或底物或配体模拟物在用于竞争抑制检验的合适条件下结合。根据本发明的多肽可以例如通过放射性或比色化合物标记，以使与结合分子结合的或转化成产品的根据本发明的多肽的分子数可以精确地确定以评估潜在拮抗剂的有效性。

潜在的拮抗剂包括小有机分子、肽、多肽和抗体，其与根据本发明的多肽结合并由此抑制其活性或使其活性消失。潜在的拮抗剂还可以为小有机分子、肽、多肽例如紧密相关的蛋白质或抗体，其与结合分子上的相同位点结合而不诱导根据本发明的多肽的功能活性。

潜在的拮抗剂包括小分子，其结合并占据根据本发明的多肽的结合位点，由此防止与细胞结合分子的结合，从而预防正常的生物活性。小分子的实例包括但不限于小有机分子、肽或类肽分子(peptide-likemolecules)。

其它潜在的拮抗剂包括反义分子(参见(Okano，H.等，1991)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENEEXPRESSION；CRC Press，Boca Raton，FL(1988)，用于这些分子的描述)。

优选的潜在的拮抗剂包括本发明的抗原及其片段的衍生物。

如本文所用，根据本发明的多肽的活性为其与任何其相互作用伴侣结合的能力或此类与其或任何相互作用伴侣结合的能力的程度。

在特别方面，本发明提供根据本发明的多肽、抗原及其片段、本发明的核酸分子或抑制剂在干扰病原体和哺乳动物宿主之间的起始物理相互作用上的用途，所述相互作用对感染的后遗症负责。具体地，本发明的分子可以用于：i)预防以下粘附至哺乳动物细胞外基质蛋白：本文公开的克雷伯菌(Klebsiella)物种，更优选其致病性物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)；ii)阻断哺乳动物细胞外基质蛋白和细菌蛋白之间的细菌粘附，所述细菌粘附介导组织反应；iii)或导致免疫防御的规避(evasion)；iv)例如通过抑制营养获得阻断感染中发病机理的正常进展，所述感染由除了植入留置装置(in-dwelling device)或通过其它外科技术之外的引起。

本文提供的各DNA编码序列可以用于发现、开发和/或制备抗菌化合物。当表达时编码的蛋白可以用作筛选抗菌药物的靶。此外，编码编码蛋白的氨基区域的DNA序列或Shine-Delgarno或各mRNA的其它翻译促进序列可用于构建反义序列以控制目的编码序列的表达。

拮抗剂或激动剂可以用于例如抑制由以下感染引起的疾病：克雷伯菌(Klebsiella)物种，特别是包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

在另一方面本发明涉及亲和装置。此类亲和装置包括至少载体材料和连接到载体材料的任何根据本发明的多肽。由于所述多肽对于其靶细胞或靶分子或其相互作用伴侣的特异性，所述多肽允许从应用到载体材料上的任何种类的样品中选择性地除去其相互作用伴侣，条件是满足结合的条件。样品可以是生物或医学样品，包括但不限于，发酵肉汤、细胞碎片、细胞制剂、组织制剂、器官制剂、血液、尿、淋巴液、酒(liquor)等。

根据本发明的多肽可以以共价或非共价方式连接到基质上。合适的载体材料对于本领域技术人员而言是已知的，并且可以选自：纤维素、硅、玻璃、铝、顺磁珠、淀粉和右旋糖。

本发明通过以下图、表、实施例和序列表进一步描述，从其可以获得进一步的特性、实施方式和优点。应该理解本实例仅以例举的方式而不是限制公开内容地给出。

关于本发明

图1显示作为病原体特异性抗体的来源的人类血清的表征。

图2显示文库的表征。

图3显示使用生物素化的人类IgGs通过MACS选择细菌细胞。

图4显示PCR分析以在各细菌病原体的临床分离株中确定所选抗原的基因分布。

图5显示使用在小鼠中产生的表位血清的表面染色的实例。

图6显示当CFA/IFA用作佐剂时，在小鼠致死性模型中由使用选择的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原的主动免疫赋予的保护。

图7显示当Alum用作佐剂时，在小鼠致死性模型中由使用选择的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原的主动免疫赋予的保护。

图8显示当

用作佐剂时，在小鼠致死性模型中由使用选择的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原的主动免疫赋予的保护。

图9显示在小鼠致死性模型中针对选择的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原产生的由使用多克隆兔血清的被动免疫赋予的保护。

表1显示使用基因组肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)文库和人类血清进行的所有筛选的总结。

表2显示用于基因分布分析的菌株。

表3显示对于所选数量的抗原在各细菌物种的各种菌株中的基因分布分析的总结。

表4显示使用人类血清的肽ELISA的总结。

表5使用在小鼠中产生的表位血清的表面染色。

表6显示用于扩增目的基因的独立的克雷伯菌(Klebsiella sp.)分离株。

表7显示用于扩增目的基因的寡核苷酸的序列。

表8KPORF-13的基因保守性(Gene conservation)。

表9KPORF-21的基因保守性。

表10KPORF-32的基因保守性。

表11KPORF-37的基因保守性。

表12KPORF-38的基因保守性。

表13KPORF-39的基因保守性。

表14KPORF-60的基因保守性。

表15KPORF-65的基因保守性。

表16用于保护试验的抗原片段。

说明书中可能引用的图和表在以下更详细地描述。

图1显示通过免疫检验通过测定对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)特异的抗体的人类血清的表征。总IgG抗体水平通过标准ELISA测定。(A)从肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株Mich 61及其各自的荚膜阴性突变体制备的总细菌裂解物。(B)从肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株708及其各自的荚膜阴性突变体制备的总细菌裂解物。来自健康个体和患有败血病的患者的血清样品以两种不同的血清稀释液(1∶1,000和1∶5,000)分析。P3536.2，P3495.2和P3533.2为获自从疾病恢复后的患者的恢复期血清(convalescent sera)。显示以1∶1,000的血清稀释就四种不同的池选择的血清的结果。

图2(A)显示肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)小片段基因组文库，pMAL4.31中的KPL50的片段大小分布。测序随机选择的克隆后，将序列修剪(trimmed)(476)以消除载体残基，绘制具有各种基因组片段大小的克隆的数量。(B)显示肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)大片段基因组文库，pMAL4.31中的KPF300的片段大小分布。将序随机选择的克隆的序列修剪(425)，绘制具有各种基因组片段大小的克隆的数量。

图3(A)显示使用生物素化的人类IgG池的MACS选择，血清来自患有败血病的患者。用10-20μg生物素化的IgG筛选pMAL9.1中的KPL50文库。作为阴性对照，不添加血清至用于筛选的文库细胞。显示洗脱后所选择的细胞的数量。(B)显示按照通过使用人类血清IgG池(PKp34-IgG)的免疫印迹分析分析的，通过细菌表面展示和Wt(无插入的pMAL9.1)选择的特定克隆(1-20)的反应性，所述人类血清IgG池(PKp34-IgG)用于通过MACS以1∶3,000的稀释选择。星号表示检测为阳性的克隆。作为内参照(loading control)，相同的印迹也使用针对以1∶5,000稀释的平台蛋白(platform protein)LamB的抗体分析(数据未示出)。(C)显示使用生物素化的人类IgG池的MACS筛选，血清来自具有在pHIE11中的败血病(PKp35-IgG)和KPF300文库的患者。(D)显示按照通过使用人类血清IgG池(PKp35-IgG)的免疫印迹分析分析的，通过细菌表面展示和Wt(无插入的pHIE11)选择的特定克隆(1-20)的反应性，所述人类血清IgG池(PKp35-IgG)用于通过MACS以1∶3,000的稀释选择。星号表示检测为阳性的克隆。

图4显示使用各寡核苷酸和46个肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株，对于一种基因的基因分布分析的PCR分析的实例。衍生自来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的抗原KPORF-54的PCR片段的预测大小为1040bp。1-46菌株或临床分离株如表2中所示；-，无基因组DNA；+，肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株MGH78578的基因组DNA。

图5显示使用在小鼠中产生的表位血清的表面染色的实例。显示在肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)A5054上的三个抗原的有效表面展示。KPORF-28，KPORF-82和KPORF-02为类别“+”，0-9％；“++”，10-35％和“+++”，＞36％的实例。百分比表示与不用免疫血清孵育的细胞相比，在FACS分析中显示移位(shift)的细胞的数量。

图6(A)，(B)，(C)，(D)和(E)显示在小鼠致死性模型中通过使用选择的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原的主动免疫实现的保护。CD-1小鼠(10只小鼠每组)用从肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株MHG78578克隆的重组抗原皮下地免疫，并且用肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)(01∶K2)菌株B5055激发(challenged)。监视存活激发后14天。小鼠用50μg佐有CFA/IFA或IFA的重组蛋白皮下地免疫。用组合有CFA/IFA或IFA的PBS免疫的小鼠用作阴性对照，而用肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055裂解物(5μg)免疫的小鼠充当阳性对照。小鼠用10³CFU肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055腹膜内地激发。存活小鼠的数量绘制成总小鼠的百分比。

Fig.7(A)和(B)显示在小鼠致死性模型中通过使用选择的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原的主动免疫赋予的保护。CD-1小鼠(10只小鼠每组)用从肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株MHG78578克隆的重组抗原皮下地免疫，并且用肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)(01∶K2)菌株B5055激发(chalienged)。监视存活激发后14天。小鼠用50μg佐有Alum的重组蛋白皮下地免疫。用组合有Alum的PBS免疫的小鼠用作阴性对照，而用组合有Alum的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055裂解物(5μg)免疫的小鼠充当阳性对照。小鼠用10³CFU肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055腹膜内地激发。存活小鼠的数量绘制成总小鼠的百分比。

Fig.8(A)和(B)显示在小鼠致死性模型中通过使用选择的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原的主动免疫赋予的保护。CD-1小鼠(10只小鼠每组)用从肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株MHG78578克隆的重组抗原皮下地免疫，并且用肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)(01∶K2)菌株B5055激发。监视存活激发后14天。小鼠用50μg佐有佐有的重组蛋白皮下地免疫。用组合有

的PBS免疫的小鼠用作阴性对照，而用组合有

的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055裂解物(5μg)免疫的小鼠充当阳性对照。小鼠用10³CFU肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055腹膜内地激发。存活小鼠的数量绘制成总小鼠的百分比。

图9(A)和(B)显示在小鼠致死性模型中通过使用针对选择的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原产生的多克隆兔血清的被动免疫赋予的保护。CD-1小鼠(10小鼠每组)用从肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株MHG78578克隆的重组抗原皮下地免疫，并且用肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)(01∶K2)菌株B5055激发。监视存活激发后14天。小鼠用50μg佐有佐有

的重组蛋白皮下地免疫。用PBS血清免疫的小鼠用作阴性对照，而用肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055裂解物血清(5μg)免疫的小鼠充当阳性对照。小鼠用10³CFU肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055腹膜内地激发。存活小鼠的数量绘制成总小鼠的百分比。

表1：通过细菌表面展示从肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)鉴定的免疫原性蛋白

A，在具有包含IC38，IC40，IC76和IC86的ICKp18-IgG池的lamB中的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的50bp文库(562个修剪后的克隆)；B，在具有包含IC88，IC89，IC92和IC93血清的ICKp19-IgG池的lamB中的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的50bp文库(444个修剪后的克隆)；C，在具有包含IC38，IC40，IC76和IC86血清的ICKp18-IgG池的fhuA中的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的300bp文库(455个修剪后的克隆)；D，在具有包含IC88，IC89，IC92和IC93血清的ICKp19-IgG池的fhuA中的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的300bp文库(591个修剪后的克隆)；E，在具有PKp34池(P3536.2，P3548，P3560，P3582和P3583血清)的lamB中的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的50bp文库(618个修剪后的克隆)；F，在具有PKp35池(P3495.2，P3533.2，P3567和P3576血清)的lamB中的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的50bp文库(562个修剪后的克隆)；G，在具有PKp34池(P3536.2，P3548，P3560，P3582和P3583血清)的fhuA中的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的300bp文库(562个修剪后的克隆)；H，在具有PKp35池(P3495.2，P3533.2，P3567和P3576血清)的fhuA中的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的300bp文库(593个修剪后的克隆)；P3536.2，P3495.2和P3533.2是获自从疾病恢复后的患者的恢复期血清；*，长于5个氨基酸的抗原性序列的预测使用程序ANTIGENIC(Kolaskar，A.等，1990)进行。所列出的为通过将确定的表位序列与肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)MGH78578的基因组序列BLAST鉴定的来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的基因(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi，http://peda nt.gsf.de/)。ORF的编号是任意的。注释/推定的功能主要通过与来自其它细菌物种，优选革兰氏阴性细菌的开放阅读框的同源性获得。

表2基因分布研究分析的菌株列表

表2显示就基因分布研究分析的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)分离株的不同菌株。给出物种和相关的K-和O-型。MGH78578用于产生基因组文库。nd，未确定。

表3.在各种克雷伯菌(Klebsiella)物种和肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株中的所选数量的抗原的基因分布分析

如表3中所示的作为阳性PCR对照的46个克雷伯菌(Klebsiella)菌株加上MGH78578，使用对编码相关抗原的基因特异的寡核苷酸通过PCR测试。基因分布表就各基因列出了来自46个菌株的阳性PCR结果的数量，并且为在克雷伯菌(Klebsiella)物种的不同分离株中基因的存在和保守的指示。

表4使用衍生自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原的肽ELISA

示出代表使用个体人类血清选择的表位的个体合成肽的免疫反应性。将反应性的程度用颜色编码：白色，＜0.05OD单位；浅灰色，0.05-0.2OD单位；深灰色，0.2-0.4OD单位；黑色，＞0.4OD单位。“总数”表示血清的数目，对于其OD_405nm测定为无涂层的空白(blankwithout coating)之上至少0.05OD单位。分数按照所有反应性的总数计算(白色＝0；浅灰色＝1；深灰色＝2；黑色＝3)。“从aa”和“至aa”表示肽相对于以各序列识别号(Seq ID No)列出的全长蛋白的位置。使用衍生自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原和22个高滴度人类血清(P3494.2，P3495.2，P3518.2，P3533.2，P3536.2，P3545，P3548，P3560，P3567，P3571，P3576，P3581，P3582，P3583，IC38，IC40，IC76，IC86，IC88，IC89，IC92和IC93)的肽进行ELISA试验。P3494.2，P3495.2，P3518.2，P3533.2和P3536.2为恢复期血清。

表5使用在小鼠中产生的表位血清的表面染色

在小鼠中产生的表位特异性抗体就与肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株A5054和

204细胞的表面的结合在FACS分析中测试。列出在FACS分析中显示显著移位(shift)的血清。移位的程度用“+”的数量表示；+，0-9％；++，10-35％，+++，＞36％。百分比表示与不用免疫血清孵育的细胞相比在FACS分析中显示移位的细胞的数目。

表6用于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)抗原的基因保守性分析的克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株

表7：用于序列保护分析的寡核苷酸。显示KPORFs和引物名称，SEQ ID N0s，引物相对于基因的取向，序列，和相对于基因的位置。寡核苷酸用于基因或基因片段的PCR扩增或随后的序列分析二者。

表8：KPORF-13的基因保守性。^{1，2，3，4}，在关于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)MGH78578的各克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株的任何测序的基因中的各位置处观察到的氨基酸。

表9：KPORF-21的基因保守性。^{1，2，3，4}，在关于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneunmoniae)MGH78578的各克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株的任何测序的基因中的各位置处观察到的氨基酸。

表10：KPORF-32的基因保守性。^1，2，3，在关于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的各克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株的任何测序的基因中的各位置处观察到的氨基酸。

表11：KPORF-37的基因保守性。^1，2，在关于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的各克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株的任何测序的基因中的各位置处观察到的氨基酸。

表12：通过将克雷伯菌(Klebsiella)基因KPORF-38测序获得的序列长度(以氨基酸计)，所述KPORF-38来自选择的克雷伯菌(Klebsiella)物种和菌株。从第一密码子(起点)至指定位置确定所有序列。

表13：KPORF-39的基因保守性。^1，2，在关于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的各克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株的任何测序的基因中的各位置处观察到的氨基酸。

表14：KPORF-60的基因保守性。^1，2，3，在关于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的各克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株的任何测序的基因中的各位置处观察到的氨基酸。

表15：KPORF-65的基因保守性。¹，在关于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的各克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株的任何测序的基因中的各位置处观察到的氨基酸。

表16：在用于保护试验(实施例8)的抗原片段上的综述

片段名称	片段DNA/蛋白质的Seq-ID	全长DNA/蛋白质的Seq-ID	在全长aa从-至-的位置
				KPORF-02.1	1/188	18/205	2-130
KPORF-13.1	2/189	29/216	26-356
				KPORF-20.1	3/190	36/223	2-180
KPORF-21.1	4/191	37/224	1-168
				KPORF-32.1	375/376	48/235	23-397
KPORF-37.1	5/192	53/240	2-420
				KPORF-37.2	6/193	53/240	414-847
KPORF-38.2	7/194	54/241	582-1099

KPORF-39.1	8/195	55/242	1-245
				KPORF-44.1	9/196	60/247	24-703
KPORF-49.1	10/197	65/252	23-328
				KPORF-60.1	11/198	76/263	23-248
KPORF-64.1	12/199	80/267	2-335
				KPORF-65.1	13/200	81/268	38-633
KPORF-66.1	14/201	82/269	26-742
				KPORF-78.1	15/202	94/281	26-429
KPORF-82.1	16/203	98/285	1-632

实施例

实施例1：用于鉴定根据本发明的肽的一般筛选过程

已经用于本发明的方法，基于由肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)编码的蛋白质或肽与在人类血清中存在的抗体的相互作用。由人类免疫系统针对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)产生并且存在于人类血清中的抗体，指示抗原性蛋白的体内表达及其免疫原性。此外，使用预选择的血清的池通过细菌表面展示表达文库鉴定的抗原性蛋白，通过个体选择或产生的血清在第2和3轮筛选中处理。这样，本发明提供有效、相关、综合的抗原的组作为药物组合物，特别是防止由肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)引起的感染的疫苗。

在用于鉴定根据本发明的综合的抗原的组的抗原鉴定程序中，用几种血清池或血浆片段(抗体池)筛选来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的至少两种不同的细菌表面表达文库。抗体池源自血清收集，其已经针对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的抗原性化合物，例如全细胞、总提取物测试。优选地，使用4个血清池(具有17个个体样品)。确定具有高ELISA滴度的血清必须与多种蛋白在免疫印迹中反应，以在用于本发明的筛选方法中被认为是超免疫并因此相关的。

本发明中所用的表达文库应该允许所有潜在的抗原的表达，所述抗原例如衍生自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的所有分泌和表面蛋白。细菌表面展示文库将由细菌宿主的重组文库代表，所述细菌宿主在细菌宿主膜处的两个所选择的外膜蛋白(LamB和FhuA)上展示肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的表达的肽序列的(全部)组(Georgiou，G.，1997)；(Etz，H.et al.，2001)。使用重组表达文库的优点之一在于鉴定的抗原可以立即通过筛选和选择的克隆的编码序列的表达产生而无需进一步的重组DNA技术或必需的克隆步骤，所述筛选和选择的克隆表达该抗原。

通过根据本发明所述的程序鉴定的综合的抗原的组可以进一步通过一轮或多轮另外的筛选来分析。因此，可以使用鉴定为免疫原性的个体抗体制剂或针对所选择的肽产生的抗体。根据优选实施方式，用于第二轮筛选的个体抗体制剂源自健康成人和/或人工感染的成人(challenged adult)，其显示在特定最低水平之上的抗体滴度，例如高于测试的人类(患者或健康个体)血清80个百分点，优选高于90个百分点，特别是高于95个百分点的抗体滴度。在第二轮筛选中使用此类高滴度个体抗体制剂允许高度选择性地鉴定来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的抗原及其片段。

综合筛选过程后，选择的抗原性蛋白，其表达为重组蛋白，或体外翻译产物(在它们不能在原核表达系统中表达的情况下)，或鉴定的抗原性肽(合成地产生)，可以通过一系列的ELISA和Western印迹检验测试，以用于使用大的人类血清收集(最小值-20个健康和患者血清)评估其免疫原性。

重要的是个体抗体制剂(其还可以为选择的血清)允许选择性地鉴定来自第一轮的所有有希望的候选物的所有抗原中的最有希望的候选物。因此，优选至少10个个体抗体制剂(即来自暴露到所选病原体的至少10个不同个体的抗体制剂(例如血清))应该用于在第二轮筛选中鉴定这些抗原。当然，还可以使用低于10个个体制剂，然而，使用低数量的个体抗体制剂该步骤的选择性可能不是最佳的。另一方面，如果给定的抗原(或其抗原性片段)被至少10个个体抗体制剂，优选至少30，特别是至少50个个体抗体制剂识别，抗原的鉴定对于合适的鉴定也是充分选择性的。当然可以使用尽可能多的个体制剂测试血清-反应性(例如使用超过100个，或甚至超过1,000个)。

因此，根据本发明方法的抗体制剂的相关部分应该优选至少10，更优选至少30，特别是至少50个体抗体制剂。作为选择(或组合)抗原还可以优选使用用于第二轮筛选的所有个体抗体制剂的至少20％，优选至少30％，特别是至少40％来鉴定。

根据本发明的优选实施方式，从其制备用于第二轮筛选的个体抗体制剂的血清(或其用作抗体制剂)，通过其针对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)(例如针对该病原体的制剂，例如裂解液、细胞壁组分或重组蛋白)的滴度来选择。优选地，当全有机体(总裂解液或全细胞)用作在ELISA中的抗原时，一些使用在1,000U之上，特别在5,000U(U＝单位，在给定稀释下从OD_405nm读数计算)之上的IgG滴度来选择。

通过人类免疫系统针对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)产生的并且存在于人类血清中的抗体指示抗原性蛋白的体内表达及其免疫原性。被血清抗体识别的线性表位的识别可以基于短至4-5个氨基酸的序列。当然，这不必然地意味着这些短肽能够在体内诱导给定的抗体。由于这个原因，定义的表位、多肽和蛋白质被进一步在动物中(主要在小鼠中)就其在体内诱导针对所选择的蛋白的抗体的能力进行测试。

优选抗原位于细胞表面或被分泌，并且因此为细胞外可及的。期望针对细胞壁蛋白的抗体用作多种目的：抑制粘附、干扰营养获得，抑制免疫逃避，和促进噬菌作用(Hornef，M.等，2002)。针对分泌蛋白的抗体的有益之处在于其作为毒素或毒性组分的中和作用。还已知细菌通过分泌蛋白相互通信。针对这些蛋白的中和抗体将干扰引起感染的病原体物种之间或内部的生长-促进交叉对话(cross-talk)。生物信息分析(信号序列、细胞壁定位信号、以及跨膜结构域)证明在评估细胞表面定位或分泌上非常有用。试验方法包括从人类血清中具有相应表位的抗体和蛋白的分离，在小鼠中针对(多)肽的免疫血清的产生，所述(多)肽通过细菌表面展示筛选选择。这些血清然后用于第三轮筛选作为在至少一种以下检验中的试剂：在不同条件下生长的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的细胞表面染色(FACS或显微镜检查)、中和能力的确定(毒性、粘附性)、和调理作用(opsonization)和噬菌作用的促进(体外噬菌作用检验)。

为此目的，将细菌大肠杆菌(E.coli)克隆直接注射入小鼠，并且取免疫血清并在相关的体外检验中测试。作为选择，特异抗体可以从人类或小鼠血清中使用肽或蛋白质作为底物来纯化。

根据本文使用的抗原鉴定方法，如本文所述，本发明可以令人惊奇地提供肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的综合的新核酸和抗原及其片段，等的组。编码抗原的根据本发明的核苷酸序列优选具有Seq IDNos 1至187和Seq ID No 375单独地所示的核苷酸序列，由此相应的编码氨基酸序列具有如Seq ID Nos 188至374和Seq ID No 376所示的氨基酸序列。

特定抗原的所有线性片段可以通过将肽的组与具有至少10个氨基酸长度的1个氨基酸重叠，通过分析蛋白质抗原的全序列来鉴定。随后，非线性表位可以通过使用超免疫血清使用表达的全长蛋白质或其结构域多肽分析抗原来鉴定。假定蛋白质的独特结构域足以形成独立于天然蛋白的3D结构，使用超免疫血清分析各重组或合成产生的结构域多肽将允许鉴定多结构域蛋白的各结构域内的构象表位。对于这些其中结构域拥有线性以及构象表位(conformational epitope)的抗原，使用符合线性表位的肽的竞争试验可以用于确认构象表位的存在。

实施例2：基于抗克雷伯菌抗体的人类血清样品的表征和选择以及抗体筛选试剂的制备

试验步骤

酶联免疫吸附检验(ELISA).ELISA平板(Maxisorb，Millipore)用在包被缓冲液(0.1M sodium carbonate pH 9.2)中稀释的5-10μg/ml总蛋白包被。血清的两种稀释液(1,000x和5,000x)在PBS-BSA中制备。根据制造商的推荐(稀释：1,000x)使用高特异性辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗-人IgG二抗(Southern Biotech)。抗原-抗体复合物通过自动ELISA读出器(TECAN SUNRISE)，基于OD_405nm读数，通过测定底物(ABTS)转化成有色的产物来定量。

总细菌提取物的制备。肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株Mich61(K-型15；O-型4)和708(K-型80；O-型12)和其荚膜阴性变体在营养肉汤(Difco 234000)中在37℃下生长过夜。细胞通过重复地冷冻-解冻循环来裂解，然后在干冰/乙醇-混合物上孵育直至冰冻1min和在37℃下解冻5min。裂解步骤重复3次，然后超声处理。在4℃下在4,000rpm下离心15min，上清液包含全细胞提取物并且收集上清液。丢弃球团(Pellet)，并且使用Bradford检验使用蛋白质检验染料试剂浓缩物(Bio-Rad Laboratories，Austria)测定蛋白质浓度。

用于基因组筛选的抗体的纯化.每抗体池4至5个血清主要基于它们在ELISA中针对荚膜阴性菌株比针对具有荚膜的菌株更强的反应来选择。针对大肠杆菌(E.coli) DH5α蛋白的抗体通过将热失活的血清与全细胞大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞(DH5α，用pHIE11转化，在与用于细菌表面展示相同的条件下生长)一起孵育来除去。来自合并的耗竭血清(depleted sera)的高度富集的IgG的制剂根据制造商说明书(UltraLink Immobilized Protein G，Pierce)，通过蛋白质

亲和色谱来产生。耗竭和纯化的有效性通过ELISA测定来检查。

结果

针对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)由人类免疫系统产生的并且存在于人类血清中的抗体指示抗原性蛋白的体外表达及其免疫原性。这些分子在本发明所述的方法中鉴定个体抗原是必需的，其基于特异性抗-细菌抗体和相应的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)肽或蛋白质的相互作用。为了可以使用相关的抗体库(antibody repertoires)，人类血清从患有败血病的患者和健康暴露的人收集。

50个急性阶段样品和100个恢复期血清样品从100个供体收集并且就抗肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗体表征，同时49个血清通过一系列的免疫检验取自健康个体。最初的表征通过ELISA使用肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株Mich 61和708和其各自的荚膜阴性突变体的总细菌裂解物来完成。测定抗体滴度，并且从在应答的线性范围中的血清稀释液计算ELISA单位。血清基于在ELISA中针对裂解物的不同反应来分级，所述裂解物从具有和不具有荚膜的菌株制备，其可用于要包括在抗体池中的血清的选择。针对来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的细菌裂解物的用于池的产生的血清的反应性示于图1A和B。

将选择的血清包括在4个不同的IgG池(每个池中4-5个血清)以用于通过细菌表面展示的抗原鉴定。IgG抗体从合并的血清中通过亲和色谱纯化，并且耗尽大肠杆菌((K.coli)DH5α-反应性抗

在选举表面展示筛选中的背景。代表健康个体的血清池为ICKp18(IC38，IC40，IC76和IC86)和ICKp19(IC88，IC89，IC92和IC93)，来自患有败血病的患者的为PKp34(P3536.2，P3548，P3560，P3582和P3583)和PKp35(P3495.2，P3533.2，P3567和P3576)。

实施例3：肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的高度随机、框架选择(frame-selected)、小片段的基因组DNA文库的产生

试验步骤

来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株MGH78578

的基因组DNA的制备。收获(5,000rpm，20min，室温)来自400ml细菌培养物的细胞，用80ml 50mM Tris pH 7.4洗涤并且再悬浮于10ml 50mM Tris pH 7.4/25％蔗糖/50mM EDTA。将该悬浮液转移至干净的玻璃管，并加入溶菌酶(终浓度：1.5mg/ml)和SDS(终浓度.：2％)。将管在冰上孵育以用于细胞裂解。添加蛋白酶K(终浓度：0.1mg/ml)，并在37℃下孵育10min，然后苯酚/氯仿(1∶1)提取，将其进行几次。最后的提取步骤使用氯仿/异戊醇(1∶24)进行以除去苯酚痕迹。将该样品用核糖核酸酶A(终浓度：10μg/ml)在室温下处理1h，并如上所述进行苯酚/氯仿和氯仿/异戊醇提取。在剩余上清液中的DNA通过添加1/10的起始体积的3M NaAc(pH 5.3)和2.5x体积的99.5％乙醇来沉淀。在-20℃下孵育1h后，将混合物离心(20,000rpm，15min)，用70％乙醇洗涤球团。最后，将球团溶解于TE-缓冲液。

小基因组DNA片段的制备。基因组DNA片段使用杯角(cup-horn)超声破碎器(Bandelin Sonoplus UV 2200 sonicator，配备有BB5杯角，10sec.脉冲，以100％功率输出)机械地剪切成大小为150至300bp的片段或通过温和的DNA酶I处理(Nova gen)剪切成大小50至70bp的片段。观察到当将DNA破碎成150-300bp大小范围的片段时，超声波处理产生紧密地多的片段大小分布。然而，尽管将DNA暴露到超声波-诱导的流体力学剪切力，随后片段大小的降低不能有效和可再现地实现。因此，50至70bp大小的片段将通过温和的DNA酶I处理使用Novagen′s鸟枪裂解试剂盒(shotgun cleavage kit)获得。制备试剂盒配备的DNA酶I的1∶20稀释液，并且在MnCl₂存在下以60μL的体积在20℃下进行消化5分钟，以确保通过酶的双链裂解。用2μL的0.5M EDTA停止反应，在2％TAE-琼脂糖凝胶上评价片段效率。该处理导致基因组DNA的总体片段化成近50-70bp的片段。片段然后使用T4DNA聚合酶在100μM各dNTP的存在下平末端化两次，以确保有效地清洗末端。片段在连接反应中立即使用或在-20℃下冷冻以用于随后的使用。

载体的描述。载体pMAL4.31在pASK-IBA主链(Skerra，A.，1994)上构建，所述pASK-IBA主链具有与卡那霉素抗性基因交换的β-内酰胺酶(bla)基因。此外，将bla基因克隆入多克隆位点。将编码成熟β-内酰胺酶的序列置于ompA的前导肽序列之前以允许穿过细胞膜有效地分泌。此外，编码成熟β-内酰胺酶的前12个氨基酸(间隔序列)的序列在ompA前导肽序列之后，以避免前导肽酶切割位点后序列立即融合，因为在该区域带正电的氨基酸的聚簇(cluster)将降低或禁止移动穿过细胞膜(Kajava，A.等，2000)。SmaI限制性位点用于文库插入。用于所选择片段的恢复(recovery)的上游FseI位点和下游NotI位点，侧翼于SmaI位点。这三个限制性位点在编码12个氨基酸间隔序列的序列之后以这样的方式插入，以使bla基因在-1阅读框中转录，导致在NotI位点之后15bp处的终止密码子。+1bp插入恢复(restores)bla ORF，以产生具有随后获得氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶蛋白。

载体pMAL9.1通过将lamB基因克隆入pEH1的多克隆位点来构建(Hashemzadeh-Bonehi，L.等，1998)。随后，将包含限制性位点FseI，SmaI和NotI的序列插入在氨基酸154之后的lamB中。用于此插入的阅读框以如此的方式构建，从而使通过使用FseI和NotI消化从质粒pMAL4.31切下的框架-选择的DNA片段的转移产生lamB和各插入的连续阅读框。

载体pHIE11通过将fhuA基因克隆入pEH1的多克隆位点来构建。其后，将包含限制性位点FseI，XbaI和NotI的序列插入在氨基酸405之后的fhuA中。用于此插入的阅读框以如此的方式选择，从而使通过使用FseI和NotI消化从质粒pMAL4.31切下的框架-选择的DNA片段的转移产生fhuA和各插入的连续阅读框。

用于框架选择(frame selection)的文库的克隆和评价。基因组肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)(菌株MGH78578)。将DNA片段连接到载体pMAL4.31的SmaI位点。重组DNA电穿孔到DH10B电感受态的大肠杆菌(E.coli)细胞(GIBCO BRL)，并使转化体在补充有卡那霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)的LB-琼脂上铺平板。平板在37℃下孵育过夜，并且收集克隆以用于大规模DNA提取。将代表性的平板贮存和保存以用于收集用于克隆PCR分析和大规模测序的克隆。简单的克隆PCR检验用于最初确定大致的片段大小分布以及插入效率。从测序数据计算精确的片段大小，插入位点处的接合完整性以及框架筛选精度(3n+1规律(rulle)。

用于细菌表面展示的文库的克隆和评价。将包含具有限制性酶FseI和NotI的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)文库的基因组DNA片段从pMAL4.31载体切下。全部群体的片段然后转移到质粒pMAL9.1(LamB)或pHIE11(FhuA)，其已经用FseI和NotI消化。使用这两种限制性酶，其识别8bp富GC序列(8bp GC rich sequence)，将在pMAL4.31载体中选择的阅读框保持在各平台载体中。质粒文库然后通过电穿孔转化入大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞。将细胞在补充有50μg/mL卡那霉素的大LB-琼脂平板上铺平板，并在37℃以产生清楚可见单个克隆的密度生长过夜。然后将细胞从这些平板的表面刮下，用新鲜LB培养基洗涤，并以用于文库筛选的等分试样形式贮存在-80℃。

结果

用于框架筛选(frame selection)的文库。对于在pMAL4.31载体中的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株MGH78578，产生两个文库，分别具有约70和300bp的大小。对于每一文库，约1μg pMAL4.31质粒DNA和50ng片段化的基因组肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)DNA的连接和随后转化在框架筛选后产生3x10⁵至2x10⁶个克隆。为了评估文库的随机性，对每个文库中的随机挑选的约500-600个克隆进行测序。两个文库(KPL50和KPF300)的代表性生物信息学分析显示符合这些文库的克隆中仅非常少的呈现多于一次。此外，显示对于KPL50文库平均插入大小为77bp，非常接近于预期的插入大小(图2A)。关于KPF300文库，平均插入大小为187bp，稍微短于预期的插入大学(图2B)。

细菌表面展示文库。在大肠杆菌(E.coli)表面上的肽的展示需要来自KPL50和KPF300文库的插入物从框架筛选载体pMAL4.31转移到展示质粒pMAL9.1(LamB)或pHIE11(FhuA)。将基因组DNA片段用FseI和NotI限制性酶切下并且将5ng插入物与0.1μg质粒DNA连接，随后转化入DH5α细胞，产生3x10⁵至2x10⁶个克隆。将克隆从LB平板上刮下，并冷冻而不进一步扩增。

实施例4：使用细菌表面展示的基因组文库和人类血清鉴定来自肺炎克雷伯菌(K.pneumonie)的高免疫原性肽序列

试验步骤

MACS筛选。约2.5x10⁸个来自给定文库的细胞在5mL补充有50μg/mL卡那霉素的LB-培养基中在37℃下生长2h。通过添加1mM IPTG30min诱导表达。将细胞用新鲜LB培养基洗涤两次，使约2x10⁷个细胞再悬浮于100μL LB培养基并转移到Eppendorf管。

将从血清纯化的10至20μg生物素化的、人类IgG添加至细胞，使悬浮液在4℃下轻微摇动过夜。添加900μL的LB培养基，使悬浮液混合并随后以6,000rpm在4℃下离心10min。细胞用1mL LB洗涤一次，然后再悬浮于100μL LB培养基。添加10μL与抗生蛋白链菌素偶合的MACS微珠(Miltenyi Biotech，Germany)，并且孵育在4℃下持续20min。其后添加900μL LB培养基，将MACS微珠细胞悬浮液加载到固定到磁体上的平衡的MS柱(Miltenyi Biotech，Germany)上。(MS柱通过用1mL 70％EtOH洗涤1次和用2mL LB培养基洗涤2次来平衡)。

然后用3mL LB培养基将柱洗涤3次。除去磁体后，细胞通过用2mL LB培养基洗涤来洗脱。用3mL LB培养基将柱洗涤后，在同一柱上第二次加载2mL洗脱液，并且重复洗涤和洗脱过程。第三次进行加载、洗涤和洗脱过程，产生2ml的终洗脱液。

将两轮筛选后选择的细胞在补充有50μg/mL卡那霉素的LB-琼脂平板上铺平板，并在37℃下生长过夜。

通过测序和Western印迹分析评价所选择的克隆。随机选择的克隆在3mL补充有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上在37℃下生长过夜，以使用标准方法制备质粒DNA。测序在MWG(德国)或Agowa(德国)上进行。

对于Western印迹分析，约10至20μg的总细胞蛋白通过10％SDS-PAGE分离并在印迹到HybondC膜(Amersham Pharmacia Biotech，England)上。LamB或FhuA融合蛋白使用以约1∶3,000至1∶5,000的稀释的人类血清作为一抗，以1∶5,000稀释的与HRP偶合的抗-人IgG抗体作为二抗。使用ECL检测试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech，England)进行检测。作为选择，兔抗-FhuA或兔抗-LamB多克隆免疫血清用作一抗与和HRP偶合的各二抗联合以用于检测融合蛋白。

结果

通过磁性激活细胞分选(MACS)使用生物素化的Igs筛选细菌表面展示文库。在pMAL9.1中的文库KPL50和在pHIE11中的KPF300用生物素化的人IgG的池筛选，所述人IgG从未感染的健康成人(IC38，IC40，IC76，IC86，IC88，IC89，IC92，和IC93)和患有急性肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染(败血病)(P3536.2，P3548，P3560，P3582，P3583，P3495.2，P3533.2，P3567和P3576)的血清制备(参见实施例1：来自人类血清的抗体的制备)。按照试验步骤下的描述进行选择步骤。图3A显示使用KPL50文库和PKp34-IgGs的筛选的代表性实例。从来自MACS筛选的第一次选择循环之后的克隆计数可以看出，最后恢复的细胞的总数从2.2x10⁷细胞显著地降低至约1.2x10⁴细胞，而不使用抗体的选择显示在细胞数量上的更显著地降低，显示选择选择依赖于肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)特异性抗体(图3A)。为了评价筛选的性能，随机挑选20个选择的克隆，并使用筛选PKp34-IgG池进行免疫印迹分析(图3B)。该分析揭示，多数选择的克隆显示与在相关血清中存在的抗体的反应性，而表达FhuA且没有肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)特异性插入物的对照菌株不与相同的血清反应(未示出)。通常，观察到反应率在15至85％的范围内。克隆PCR分析显示所有选择的克隆包含期望大小范围内的插入物(数据未示出)。类似的结果在使用来自其它血清池的文库的筛选中看到。作为第二实例，图3C和D现实使用大插入物KPF300和PKp35-IgG抗体池获得的数据。一轮MACS选择导致近在特异性IgG的存在下，但不是特异性IgG的缺失下细胞的富集(图3C)，表明选择对于应用的抗体是特异的。特异性选择然后在具有相同PKp35-IgG抗体池的个体细菌克隆的Western印迹分析中确认(图3D)。

随后较大数量的来自各筛选的随机挑选的克隆的测序(600至800)导致基因和相应的肽或蛋白质序列的鉴定，所述基因和相应的肽或蛋白质序列被用于筛选的人类血清抗体特异性识别。特异性克隆选择的频率至少部分反映用于筛选的血清中特异性抗体的丰度和/或亲和力，和识别通过此克隆呈递的表位。表1总结了就所有8次进行的筛选获得的数据。在表1中存在的所有克隆已经通过免疫印迹分析使用来自单个克隆的全细胞提取物证明，以显示与用于各筛选的人类血清的池的指出的反应性。从表1中可以看出，鉴定的0RF的不同区域鉴定为免疫原性，因为蛋白质可变大小的片段通过平台蛋白在表面上展示。

进一步还值得注意的是，通过细菌表面展示筛选鉴定的大量基因编码与细菌的表面连接的蛋白质。这在肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的毒性中符合表面连接的蛋白质的预期作用。

实施例5：从肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)鉴定的具有高免疫原性蛋白质的基因分布研究

试验步骤

通过PCR的抗原的基因分布。理想的疫苗抗原将为这样的抗原，其存在于疫苗针对的所有，或大多数靶有机体的菌株中。为了确定编码鉴定出的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原的基因是否在相关菌株中普遍存在地出现，在一系列独立细菌分离株上使用对目的基因特异的引物进行PCR。作为引物的寡核苷酸序列针对约1,000bp的所有鉴定的ORF产生产物而设计，如果可能覆盖所有鉴定的免疫原性表位。所有肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株的基因组DNA按照实施例2所述制备。使用Taq聚合酶(1U)，200nM dNTPs，10pMol各寡核苷酸和根据制造商说明书的试剂盒(Invitrogen，The Netherlands)，以25μl的反应体积进行PCR。作为标准，进行30个循环(1x：5min.95℃，30x：30sec.95℃，30sec.56℃，30s ec.72℃，1x 4min.72℃)，除非条件必须适合各引物对。

结果

鉴定的编码免疫原性蛋白的基因在46个不同肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株中通过PCR就其存在测试(表3)。同时分析95个基因。在＞90％的菌株(＞41/46)中检测到40％(38/95)，而在＞75％的菌株(＜35/46)中25％(24/95)丢失，因此分类为不充分保守的。作为实例，图4显示使用所有指定的46个菌株，对于肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)KPORF-54抗原的PCR反应。可以清楚地看出，该基因存在于所有分析的菌株中。使用选择的抗原的所有结果总结于表3。重要的是，80％鉴定的抗原在分析的肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)的菌株中良好地保守，至少在基因-特异性PCR产物的存在和大小上，因此选择以用于进一步的研究，从而评价其疫苗候选物潜力。

实施例6：通过肽ELISA对肽进行确认或验证

酶联免疫吸附检验(ELISA)。ELISA平板(Maxisorb，Millipore)用5-10μg/ml在包被缓冲液(0.1M碳酸钠pH 9.2)中稀释的总蛋白包被。两种血清的稀释液(400x和2,000x)在PBS-BSA中获得。根据制造商推荐使用高特异性辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗人IgG二抗(Southern Biotech)(稀释：1,000x)。抗原-抗体复合物通过自动ELISA读出器(TECAN SUNRISE)，基于OD_405nm读数，通过测定底物(ABTS)转化成有色的产物来定量。在400x稀释下的测定用于计算表4中所示的结果。

结果

人类中的免疫原性。人类血清中特异性抗体的存在通过表4中总结的肽ELISA来确定。用于此分析的人类血清对应于在用于通过细菌表面展示筛选鉴定抗原的各种血清池中包括的那些。分析来自源自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)MGH78578的个体抗原的单一或多个肽，并且这些中许多在人类中显示为免疫原性。明显选择的肽的一些与调查的人类血清(例如ORF-26.01或ORF-81.01)中的许多或全部为高度反应性，而其它显示中间或低的反应性。对于选择的肽包括超过30氨基酸的那些抗原，设计具有5至6氨基酸的重叠的多种肽。对于某些抗原，观察到来自相同抗原的这些多种肽显示不同的反应性，进一步描述了各抗原(例如KPORF-27或KPORF-42)的免疫原性区域。这些试验确认许多鉴定的表位/蛋白在人类中是高度免疫原性的，表明它们在感染期间由病原体表达并且能够诱导强烈的免疫应答。

实施例7：与免疫血清的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的表面结合，所述免疫血清获自用来自在大肠杆菌表面上展示的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的高度免疫原性蛋白/肽免疫的小鼠。

试验步骤：FACS分析。将肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株A5054和

204从甘油原液中接种入5ml THB培养基，并在37℃下孵育过夜。过夜培养物通过添加200μl至10ml新鲜THB培养基来再次接种，并孵育直至达到约0.6的OD₆₀₀(-5x10⁸细胞/ml)。细菌通过在4,000rpm下离心5min成球团，并用2ml HBSS洗涤两次。最后的球团用0.5％BSA再悬浮于HBSS以给出5x10⁶细胞/ml的细胞密度。向100μl细菌添加5μl免疫血清并在冰上孵育45min。通过在1,000g下离心4min使细菌成球团并用具有0.5％BSA的1mlHBSS洗涤，再悬浮于100μl具有0.5％BSA的HBSS中。向调理的细菌，以根据制造商推荐的稀释(在100μl中稀释)添加缀合的抗-鼠抗体。在黑暗中在冰上进行二次染色45min。孵育最后，将样品在5,000rpm下离心3min，用1ml HBSS洗涤并再悬浮于1ml的HBSS-2％多聚甲醛。使样品旋转，固定过夜并通过流式细胞仪分析。

结果

与肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)细胞的表面结合。在FACS分析中测试识别在肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)A5054和

204上的表面蛋白的抗体的存在。由不同血清代表的103个抗原中，如表5中所总结的，与缓冲液对照相比在FACS分析中36个显示显著的移位。这些体外试验表明在体外培养的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)细胞中，这些36个抗原在表面上表达。作为实例，图5显示对于肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)KPORF-28，KPORF-82和KPORF-02抗原的FACS染色，其分别代表分类“+”，“++”和“+++”。

实施例8：抗原诱导针对由肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)诱导的致死性败血病的保护性免疫应答

实验步骤

重组肺炎克雷伯菌(Klebsiell apneumoniae)蛋白的表达和纯化。基因/DNA片段的克隆。目的基因/DNA片段使用基因特异性引物通过PCR从肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)MGH78578的基因组DNA来扩增。除了基因特异性部分之外，引物具有帮助扩增的PCR产物的定向克隆的限制性位点。引物的基因退火(特异性)部分在长度上范围为15-30碱基。获得的PCR产物用合适的限制性酶消化，并克隆入用于His-标记的蛋白的pET28b(+)载体(Novagen)。一旦确认重组质粒包含目的基因，转化充当表达宿主的大肠杆菌(E.coli)BL21-细胞(Stratagene)。将插入物测序。以各自的序列识别号(Seq ID NosDNA，蛋白质)列出基因特异性片段的核苷酸序列和氨基酸序列：KPORF-02.1：1，188；KPORF-13.1：2，189；KPORF-20.1：3，190；KPORF-21.1：4，191；KPORF-32.1：375，376；KPORF-37.1：5，192；KPORF-37.2：6，193；KPORF-38.2：7，194；KPORF-39.1：8，195；KPORF-44.1：9，196；KPORF-49.1：10，197；KPORF-60.1：11，198；KPORF-64.1：12，199；KPORF-65.1：13，200；KPORF-66.1：14，201；KPORF-78.1：15，202；KPORF-82.1：16，203(还参见表16)。

蛋白的表达和纯化。使包括选择重组质粒的大肠杆菌(E.coli)BL21-

细胞以所需的培养体积生长进入对数期。一旦OD_600nm达到0.6，培养物在37℃下用0.5mM IPTG诱导3小时。将细胞通过离心收获，通过冷冻-解冻法然后用‘Bug-

(Novagen)破坏细胞的组合使其裂解。裂解物通过离心成可溶(上清液)和不可溶(球团)部分来分离。依赖于蛋白质位置，使用不同的纯化策略。A)如果His-标记的蛋白在可溶部分中，通过将使上清液与Ni-Sepharose珠(Ni-Sepharose^TM 6 Fast Flow，GE Healthcare)结合来完成蛋白质纯化。由于在表达蛋白的C-末端处的6组氨酸(6xHIS)的存在，其结合至Ni-Sepharose，而其它污染蛋白通过洗涤缓冲液从柱中洗去。蛋白质通过pH7.4的在20mM NaH₂PO₄，0.5mM NaCl缓冲液的500mM咪唑来洗脱。将洗脱物浓缩，通过用于蛋白质浓缩的Bradford检验，并且通过SDS-PAGE和Western印迹检查。B)如果蛋白质存在于不可溶部分，使球团在包含8M尿素的合适缓冲液中溶解，并且在变性条件下(在包含8M尿素的缓冲液中)使用与上述相同的材料和步骤施涂到Ni-NTA柱上。污染蛋白通过无尿素的洗涤缓冲液从柱洗去。His-标记蛋白的再折叠在蛋白质固定在Ni-NTA基质期间进行。复性后，通过添加500mM咪唑洗脱蛋白质。将洗脱物透析以除去痕量的尿素，并且如果体积大，将其浓缩，通过SDS-PAGE检查和通过Bradford法测定。

动物保护研究

动物：使用CD-1雌性小鼠(6-8周)

主动免疫(皮下途径)：将50μg佐有完全弗罗因德佐剂(CFA)，Alum，或的表16中所列出的重组蛋白皮下地注射入CD-1小鼠。在第14和28天，小鼠用相同量的蛋白和佐剂(除了使用不完全弗罗因德佐剂(IFA)而不是CFA之外)增强。用肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055裂解物免疫的小鼠充当阳性对照，而用仅组合有佐剂的PBS免疫的小鼠充当阴性对照。抗体滴度在第35天通过

使用各重组蛋白测定。

被动免疫(腹膜内途径)：在IP细菌攻击之前1至3小时，将针对表16中列出的个体肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)重组蛋白抗原产生的150μl超免疫的兔血清腹膜内地(I P)注射入CD-1小鼠。用于免疫的血清的抗体滴度使用各重组蛋白测定。

细菌攻击：使用新生长的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株B5055。为了确定在细菌接种物中存在的存活的细胞数量，通过将接种物的稀释液铺平板到血液琼脂平板来确定CFU。腹膜内地使用10³CFU。由免疫赋予的保护使用菌血症/败血病模型测定，其中存活率在攻击后2个周后测定，并且存活表达为动物总数(10只小鼠/组)的百分比。

结果

主动免疫试验

由于在人类中用于预防性疫苗的主要目标指示之一为败血病，使用用于评价候选抗原的腹膜内攻击模型，并且在该小鼠败血病/致死性模型中就显示保护测试预选择的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)抗原。迄今为止已经在腹膜内攻击模型中对于两种不同的蛋白观察到保护。由于针对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)攻击的保护受抗体介导，使用CFA/IFA作为佐剂进行免疫以获得最高水平的抗体。在图6A和图6B/C描述的两个独立试验中可以看出，蛋白质KPORF-21.1和KPORF-60.1给出100％，KPORF-38.2和KPORF-39.1分别给出90％和60％的保护。这些抗原之前未显示保护免受肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染。

对于9个ORF观察到部分保护：KPORF-02.1(30％)，KPORF-13.1(40％)，KPORF-20.1(40％)，KPORF-37.1(20％)，KPORF-37.2(20％)，KPORF-44.1(30％)，KPORF-64.1(40％)，KPORF-65.1(50％)，和KPORF-66.1(40％)(图6A，B，和C)。

重组蛋白KPORF-13.1和KPORF-37.1在相同的模型中再测试。在单一的试验中，针对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)IP攻击，使用KPORF-13.1的免疫给出70％的保护，KPORF-37.1给出的50％的保护(图6D)。

此外，两个另外的重组蛋白，KPORF-32.1和KPORF-39.1-I B(蛋白质与KPORF-39.1相同，但作为包涵体免疫)，在相同的模型中测试并且分别给出50％和40％的保护水平(图6E)。使用阳性对照、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055裂解物的免疫，一致地在所有试验中给出100％的保护。

当佐有CFA/IFA时在之前所述试验的组中证明保护的8个肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)重组蛋白在使用Alum或

作为佐剂的主动免疫试验中再测试。在3个其中Alum用作佐剂的独立试验中，KPORF-13.1和KPORF-21.1分别给出60％(图7A)，50％，和40％的保护。KPORF-32.1分别给出80％(图7A)，75％，和70％的保护。在3个独立试验中，KPORF-39.1-IB给出100％的保护(图7B，单一试验示出)。在3个独立试验中(单一试验示出)一致地，KPORF-37.1给出40％的保护(图7A)，KPORF-38.2给出60％(图7B)，和KPORF-65.1给出50％(图7B)的保护。在3个独立试验中KPORF-60.1给出67％(图7B)，58％，和50％的保护。

在3个其中

用作佐剂的独立试验中，蛋白质KPORF-13.1分别给出40％(图8A)，35％，和30％的保护。KPORF-21.1给出60％(图8B)，55％，和50％的保护。使用KPORF-32.1的免疫导致仅22％(图8B)，16％，和10％的存活。KPORF-37.1在3个独立试验中给出30％(图8B，单一使用示出)的保护。KPORF-38.2在3个独立试验中给出60％(图8A)，55％，和50％的保护。KPORF-39.1-IB分别给出50％(图8A)，40％，和30％的保护。KPORF-60.1分别给出63％(图8A)，59％，和56％的保护。使用KPORF-65.1的免疫分别导致50％(图8B)，35％，和20％的存活。

被动免疫试验

超免疫兔血清单独地针对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055裂解物、PBS和8个在主动免疫试验中证明保护的个体肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)重组蛋白：KPORF-13.1，KPORF-21.1，KPORF-32.1，KPORF-37.1，KPORF-38.2，KPORF-39.1，KPORF-60.1，和KPORF-65.1产生。在单一试验中，使用KPORF-60.1血清的小鼠的被动免疫给出60％的保护(图9A)，使用KPORF-37.1血清的免疫给出针对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)攻击的40％的保护(图9B)。100％的保护在所有用肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)B5055裂解物血清免疫的小鼠中观察到。在用PBS血清免疫的小鼠中没有观察到存活(Fig.9A&B).在用KPORF-32.1血清免疫的小鼠中观察到20％的存活(图9B)。在用针对其它5种蛋白KPORF-13.1，KPORF-21.1，KPORF-38.2，KPORF-60.1(图9A)，KPORF-65.1(图9B)产生的血清免疫的小鼠中未观察到保护。

这些抗原之前未显示保护免受肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染。

实施例9：克雷伯菌(Klebsiella)抗原的基因保守性

克雷伯菌(Klebsiella sp.)基因组DNA的制备

7ml DIFC00001培养基用来自冷冻稳定(frozen stab)的克雷伯菌(Klebsiella sp.)的各菌株接种，并在37℃下不摇晃地生长过夜。2ml培养物然后通过在13,000rpm下在Biofuge fresco(Heraeus)中离心5min来收获，并除去上清液。将DNA按照

Genomic DNAPurification Kit(Promega)的策略从细菌细胞球团分离。DNA球团最后在空气中干燥，并溶解于70μl ddH₂O。

克雷伯菌(Klebsiella sp.)抗原的PCR扩增

使用对目的基因特异的引物，在一系列独立的克雷伯菌(Klebsiella sp.)分离株(表6)上进行PCR。作为引物的寡核苷酸序列针对8个抗原候选物使用公共程序引物3设计(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/Drimer3/primer3_www_slow.c gi)或手动地挑选。用于PCR作为引物的寡核苷酸序列针对所选择的抗原而设计以能够扩增全长基因。所有克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株的基因组DNA如上所述制备。使用Taq聚合酶(1U)、200nM dNTPs、10pMol各寡核苷酸，约10至20ng DNA和根据制造商说明书的试剂盒(Invitrogen，The Netherlands)以30μL的反应体积进行PCR。作为标准，进行30个循环(1x：5min.95℃，30x：30sec.95℃，30sec.52℃，90sec.72℃，1x：4min.72℃)，除非条件必须适合各引物对。PCR扩增在Biometra T3 Thermocycler中进行。在第一轮扩增中所有阴性PCR反应通过应用优化的条件重复。DNA片段随后通过在1％琼脂糖凝胶上电泳和用EtBr染色来可视化。

克雷伯菌(Klebsiella sp.)基因的序列分析

为了确定来自各种克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株的抗原的序列，按照如上所述使用对目的基因特异的引物进行PCR。用于这些分析的克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株示于表6。使用PCR产物作为模板使用专用引物进行测序。寡核苷酸的序列示于表7。所有克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株的基因组DNA按照如上所述制备。按照如上所述以30μl的反应体积进行PCR，除非条件必须适合各引物对。PCR样品使用如表7中所列的寡核苷酸测序。测序在Agowa(柏林，德国)处进行。

结果

选择的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)抗原是高度保守的

8个选择的基因的PCR和测序按照方法下所述进行。表6显示用于测序的菌株，而表7列出用于PCR和测序分析的寡核苷酸。8个基因中的7个在所有分析的菌株中显示序列同一性的水平大于约93％，除了KPORF-21之外，其至少至83％同一性的水平。个体基因的详细分析单独地描述于以下。

KPORF-13的序列分析

序列获自39个菌株。与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)MGH78578的KPORF-13的参考序列相比，氨基酸序列同一性的水平范围从95.8％至100％。表8列出所有的43个氨基酸的位置，其与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的KPORF-13相比显示独特的氨基酸。

KPORF-21的序列分析

序列获自49个菌株。与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)MGH78578的KPORF-21的序列相比，氨基酸序列同一性的水平范围从83.3％至100％。表9列出所有的43个氨基酸的位置，其与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的KPORF-21相比显示独特的氨基酸。

KPORF-32的序列分析

序列获自40个菌株。与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)MGH78578的KPORF-32的序列相比，氨基酸序列同一性的水平范围从92.7％至99.5％。表10列出所有的69个氨基酸的位置，其与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的KPORF-32相比显示独特的氨基酸。

KPORF-37的序列分析

序列获自39个菌株。与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)MGH78578的KPORF-37的序列相比，氨基酸序列同一性的水平范围从99.4％至100％。表11列出所有的20个氨基酸的位置，其与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的KPORF-37相比显示独特的氨基酸。

KPORF-38的序列分析

部分序列获自38个菌株，因为编码恰好C-末端的核苷酸序列迄今为止未成功地扩增(表12)。与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)MGH 78578的KPORF-38的序列相比，氨基酸序列同一性的水平范围从98.2％至99.9％。除了获自克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株i252/94和克雷伯菌(Klebsiella sp.)菌株708的部分KPORF-38序列之外，所有分析的序列包括相应的氨基酸序列，所述相应的氨基酸序列包括来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的KPORF-38的KPORF-38.2(氨基酸范围582-1099)片段。

KPORF-39的序列分析

序列获自50个菌株。与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)MGH78578的KPORF-39的序列相比，氨基酸序列同一性的水平范围从93.1％至100％。表13列出所有的29个氨基酸的位置，其与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的KPORF-39相比显示独特的氨基酸。

KPORF-60的序列分析

序列获自50个菌株。与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)MGH78578的KPORF-60的序列相比，氨基酸序列同一性的水平范围从94.4％至100％。表14列出所有的14个氨基酸的位置，其与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的KPORF-60相比显示独特的氨基酸。

KPORF-65的序列分析

序列获自48个菌株。与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)MGH78578的KPORF-65的序列相比，氨基酸序列同一性的水平范围从98.3％至100％。表15列出所有的27个氨基酸的位置，其与来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)MGH78578的KPORF-65相比显示独特的氨基酸。

参考文献

以下在本说明书中以节略形式已经引用的参考文献在此通过参考将其全文引入

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在说明书、权利要求和/或附图中描述的本发明的特性可以单独地或组合地成为用于以其各种形式实现本发明的材料。

Claims

1.编码抗原或其片段的分离的核酸分子，包括选自以下的核酸序列：

a)与具有选自Seq ID Nos：1至187和Seq ID No 375的核苷酸序列的核酸分子具有至少70％序列同一性的核酸分子，

b)与a)的核酸分子互补的核酸分子，

c)包括a)或b)的核酸分子的至少15个连续碱基的核酸分子，

2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中与Seq ID Nos：1至187或Seq ID No 375的序列同一性为至少80％，更优选至少90％，仍更优选至少95％，96％，97％，98％，或99％，或最优选100％。

3.根据权利要求1或2任一项所述的核酸分子，其中所述核酸为DNA。

4.根据权利要求1至2任一项所述的核酸分子，其中所述核酸为RNA。

5.根据权利要求1至3任一项所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分离自基因组DNA，所述基因组DNA优选来自克雷伯菌(Klebsiella)物种，更优选来自以下物种：包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

6.根据权利要求1至5任一项所述的核酸，其中所述片段为其活性片段或活性变体。

7.根据权利要求1至6任一项所述的核酸，其中所述抗原或其片段包括或由来自以下的多肽或肽片段组成：克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

8.载体，包括根据权利要求1至7任一项所述的核酸分子。

9.根据权利要求8所述的载体，其中所述载体适合于由在权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子编码的抗原或其片段的重组表达。

10.宿主细胞，包括根据权利要求8或9所定义的载体。

11.抗原，其与血清免疫学上反应，所述血清来自患有克雷伯菌(Klebsiella)感染的人类或来自之前被克雷伯菌(Klebsiella)感染的未感染的健康人类，其中所述抗原包括或由来自以下的分离的多肽或其活性片段或活性变体组成：克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

12.包括或由选自Seq ID Nos：188至374，Seq ID No 376的分离多肽或其活性片段或活性变体组成的抗原。

13.根据权利要求11或12所述的抗原，其中所述多肽由在权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子编码。

14.根据权利要求11至13任一项所述的抗原，其中所述其活性片段由所述多肽，特别是由Seq ID Nos：188至374或Seq ID No 376中任一个所定义的多肽的至少50％，特别是至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，96％，97％或98％，最优选99％组成。

15.根据权利要求11至14任一项所述的抗原，其中所述其活性变体与所述多肽，特别是由Seq ID Nos：188至374或Seq ID No 376中任一个所定义的多肽具有至少50％，特别是至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，96％，97％或98％，最优选99％的序列同一性。

16.根据权利要求14所述的抗原，其中所述其活性片段包括或由Seq ID No 205的氨基酸2-130；Seq ID No 216的氨基酸26-356；Seq ID No 223的氨基酸2-180；Seq ID No 224的氨基酸1-168；Seq ID No 235的氨基酸23-397；Seq ID No 240的氨基酸2-420和414-847；Seq ID No 241的氨基酸582-1099；Seq ID No 242的氨基酸1-245；Seq ID No 247的氨基酸24-703；Seq ID No 252的氨基酸23-328；Seq ID No 263的氨基酸23-248；Seq ID No 267的氨基酸2-335；Seq ID No 268的氨基酸38-633；Seq ID No 269的氨基酸26-742；Seq ID No 281的氨基酸26-429；或Seq ID No 285的氨基酸1-632组成。

17.根据权利要求15所述的抗原，其中所述其活性变体与Seq IDNo 205的氨基酸2-130；Seq ID No 216的氨基酸26-356；Seq ID No223的氨基酸2-180；Seq ID No 224的氨基酸1-168；Seq ID No 235的氨基酸23-397；Seq ID No 240的氨基酸2-420和414-847；SeqID No 241的氨基酸582-1099；Seq ID No 242的氨基酸1-245；SeqID No 247的氨基酸24-703；Seq ID No 252的氨基酸23-328；SeqID No 263的氨基酸23-248；Seq ID No 267的氨基酸2-335；

No 268的氨基酸38-633；Seq ID No 269的氨基酸26-742；Seq IDNo 281的氨基酸26-429；或Seq ID No 285的氨基酸1-632具有至少50％，特别是至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，96％，97％或98％，最优选99％的序列同一性。

18.根据权利要求11至17任一项所述的抗原，其中所述其活性变体衍生自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的不同血清型的同源序列，特别是其中所述血清型为K1，K2，K3，K10，K21，K22，K30，K55，K64，O1，O2a，O3，O4，O5或O12，或所述K和所述O血清型的组合。

19.根据权利要求11至18任一项所述的抗原，其中所述活性变体选自SEQ ID No 413至765。

20.根据权利要求16至19任一项所述的抗原，由此所述抗原进一步由以下定义：

21.根据权利要求11至20任一项所述的抗原，由此所述抗原进一步包括或由与所述抗原，优选标记蛋白异源的至少一个氨基酸残基组成。

22.根据权利要求20或21所述的抗原，其中所述另外的氨基残基侧翼于抗原N-末端、C-末端或N-和C-末端。

23.根据权利要求20至22任一项所述的抗原，由此所述另外的氨基酸残基侧翼于由以下定义的抗原：

a)Seq ID No 240的氨基酸2-420或其C-末端衍生的变体，

b)Seq ID No 240的氨基酸414-847或其N-末端衍生的变体，或

24.根据权利要求11至23任一项所述的抗原，由此所述抗原进一步包括或由前导序列或分泌序列、用于纯化的序列或前蛋白序列组成。

25.抗原，其包括如在表1的“预测的免疫原性aa”或“鉴定的免疫原性区域的位置”栏中所指出的，或由表4的“从aa”和“至aa”栏中所定义的，或如表5的“蛋白质(aa)中的位置”栏中所指出的至少一个核心氨基酸序列，由此更优选核心氨基酸序列选自以下：

Seq ID No 204的氨基酸11-27，35-47，68-107，113-122，124-136，140-146，152-164，168-174，183-201，211-218，228-243，246-253和180-226；Seq ID No 205的氨基酸13-31，48-59，69-91，109-115，121-127和46-105；Seq ID No 206的氨基酸12-44，49-95，102-145，148-178，184-229，233-244，249-273，292-299，304-329，334-348，354-365，367-385，394-426，428-440，444-487，503-527，531-539，546-554，556-584和273-286；Seq ID No 207的氨基酸7-17，22-32，34-41，55-77，79-86，93-111，118-126，131-148，152-162，165-177，183-197，213-220，234-250，253-262，267-294和211-269；Seq IDNo 208的氨基酸22-29，41-56，58-66，79-88，94-121，124-131，134-157，162-171，173-180，189-197，201-214，216-224，242-254，257-270，282-287，290-302，309-315，320-325，341-355，362-368，372-378和1-48；Seq ID No 209的氨基酸5-15，18-35，48-61，65-71，112-119，138-154，157-169，179-208，214-223，226-232，243-250，256-262，277-286，289-296，338-348，352-363，370-376，385-408，420-436，443-454，462-483，498-561，563-592，600-642，661-671，673-709，714-733，748-754，771-776，798-806，808-821，823-839和31-83；Seq ID No 210的氨基酸5-14，21-26，31-41，59-77，101-115，132-145，147-156，180-185，188-197和97-158；Seq ID No 211的氨基酸6-18，23-43，45-56，69-80，87-97，112-123，135-151，164-171，178-193，200-227，249-258，262-274，279-291，302-308，322-327，329-336，351-363，366-373，384-399，403-411，415-434，440-446，461-482，488-506，510-516，518-551，574-589，607-629，634-665，667-687，694-712，725-739，743-751，753-768和521-583；Seq ID No 212的氨基酸4-13，19-44，55-63，

89-110，120-130，132-138，145-161，168-182，189-258，261-272，278-288，290-301和11-76；Seq ID No 213的氨基酸4-22，43-56，63-68，81-90，93-99，139-148，155-160，170-176，189-195，207-218，227-232，241-249，251-258，260-266，277-295，300-327，329-336，340-356，384-390，418-423，427-433，438-444和383-428；Seq IDNo 214的氨基酸10-18，32-37，45-55，60-69，77-83，89-95，120-125，133-170，172-185，193-211，214-223，232-249，255-275，277-303，305-310，320-328，334-341，347-353，355-369，380-386，389-395和71-85；Seq ID No 215的氨基酸4-23，27-35，67-73，80-103，117-126，132-138，140-159，162-171，180-194，198-208，211-218，228-234，239-253，262-270，272-291，296-305和39-110；Seq IDNo 216的氨基酸13-24，27-34，37-66，69-88，99-104，149-155，164-175，184-193，199-209，227-235，264-273，276-285，288-315，323-335，346-353，56-111和199-261；Seq ID No 217的氨基酸11-22，25-48，51-60，64-72，80-96，108-122，132-137，142-150，152-167，175-199，214-229，237-244，252-258，260-266，279-287，301-340，345-350和109-153；Seq ID No 218的氨基酸37-43，50-57，65-82，87-109，123-129，141-150，152-157，166-172，179-203，209-241，249-284，290-300，308-326，329-335，345-357，

379-386，390-417，420-425，438-444，461-466，473-490，497-505，524-534，541-550，586-597，608-614，622-632，660-666，679-694，696-706，708-722，725-731，737-763，784-789，810-825，837-854，857-880，882-895，901-907，911-928，14-76和176-220；Seq IDNo 219的氨基酸9-16，38-52，61-86，93-100，110-117，123-132，138-145，151-169，172-181，186-202，208-225，227-253，264-275，289-295，320-329，335-342和113-193；Seq ID No 220的氨基酸11-18，24-30，42-49，53-63，69-80，87-93，95-103，144-171，173-185，193-200，202-208，215-221，242-261，266-273，277-286，290-299，322-328，338-351，354-377，391-409，441-451，461-466，499-515，521-527，562-569，621-629，647-663，676-682，694-701，703-713，725-731，735-744，755-764，793-800和490-547；Seq IDNo 221的氨基酸4-11，14-22，38-70，81-90，97-114，118-132，147-171，173-181，187-202，244-250，252-298，301-311，313-331，342-368，410-418，446-451，456-462，468-474，476-492，499-507，519-528，552-565，568-575，584-613，618-624，626-649和417-489；Seq ID No 222的氨基酸4-9，32-53，66-72，74-90，97-104，110-130，133-139，144-152，166-177，203-213，215-241，256-275，291-304，307-316，321-326，334-345，352-367和201-255；Seq ID No 223的氨基酸13-19，26-43，66-72，80-85，95-101，109-125，131-137和25-107；Seq I D No 224的氨基酸13-24，35-43，50-56，58-68，77-83，104-110，117-125，132-138，140-153和19-66；Seq ID No225的氨基酸15-31，37-42，47-54，68-87，89-96，107-117，121-127，131-137，145-151，176-182，220-226，232-246，250-257，291-300，317-325，328-333，337-359，368-393，403-428，460-478，480-493，500-506，511-516，519-526，528-559，565-572，584-595，597-605，608-613，626-648，679-684，687-693，703-714，718-735，742-750，757-765，768-788，793-799，813-819，823-829，839-850和576-623；Seq ID No 226的氨基酸10-35，37-60，63-76，79-86，88-97，108-113，118-126，128-134，138-145，153-159，168-188，194-208，211-243，255-260，270-276，285-301，307-346，348-367和275-339；Seq IDNo 227的氨基酸4-17，21-33，35-42，47-64，72-80，85-92，98-103，125-147，151-161，165-177，183-230，232-246，256-262，284-306，310-328，331-367，369-383，392-399和32-85；Seq ID No 228的氨基酸5-11，18-27，42-52，60-65，75-84，90-102，107-116，125-178，184-206，221-233，235-242，249-257，264-277，288-317和267-313；Seq ID No 229的氨基酸5-11，14-42，50-75，79-86，89-98，120-125，152-160，166-181，185-193，200-207和85-114；Seq ID No 230的氨基酸4-30，36-43，46-55，63-111，144-152，159-168，179-188191-200，205-213和37-109；Seq ID No 231的氨基酸20-45，57-77，80-100，119-126，131-137，143-169，179-185，195-203，207-231，235-264，282-302，320-329，341-347，353-359，361-373和266-296；Seq ID No 232的氨基酸5-22，24-37，41-55，57-65，72-78，90-103，105-116，119-130，164-170，190-202，209-231，244-254，260-276，300-339，344-350，355-376，389-397，399-406，408-421，429-437和103-152；Seq ID No 233的氨基酸8-16，18-25，31-47，71-82，87-102，104-114，126-156，176-183，190-200，205-212，218-228，231-243，256-279，287-301，303-312，324-332，335-348，351-357，365-380，395-412，422-451，456-464，467-483，501-507和405-468；Seq ID No 234的氨基酸4-18，21-39，46-56，63-69，72-86，116-130，132-160，162-190，196-201，209-231，233-241，251-265，269-282，292-298，309-324，333-369，391-415，417-427，436-454，471-480，482-499，510-518，521-533，537-543，545-561，571-581，585-597，599-607，609-635，638-643，650-665，671-685，687-695，701-707，710-720，724-736，747-757，764-769，772-784，791-796，808-820和317-401；Seq ID No 235的氨基酸4-12，15-33，58-77，82-89，98-106，108-118，120-135，141-147，152-160，168-215，225-233，235-247，250-264，284-312，314-321，336-343，359-374，386和159-218；Seq ID No 236的氨基酸4-16，24-36，40-47，49-56，61-81，84-143，148-156，158-164，170-175，194-206，208-214和126-203；Seq ID No 237的氨基酸28-45，50-61，94-111，113-124，137-142，147-173，180-188，190-196，202-223，229-235，239-249，262-270，280-288，290-321，325-332，347-355，359-368，389-407，415-427，429-453，458-465，477-485，499-505，516-527，531-549，569-592，594-602，605-615，628-635，647-659，662-683，727-735，760-765，771-780，788-809，811-818和549-630；Seq ID No 238的氨基酸21-28，33-40，48-100，104-111，113-134和1-46；SeqID No 239的氨基酸12-24，31-41，53-61，73-87，112-128，

151-156和26-98；Seq ID No 240的氨基酸4-9，19-26，32-56，58-67，71-81，90-95，97-105，112-118，124-132，138-144，147-167，169-177，199-207，212-217，231-241，250-260，266-272，274-282，289-296，299-310，316-331，344-350，352-363，368-377，381-394，399-406，412-450，459-473，486-503，508-514，518-548，564-570，579-587，602-608，616-623，628-635，638-654，678-688，691-696，703-709，716-723，761-772，784-793，819-826，835-844和790-834；Seq ID No 241的氨基酸4-10，18-36，43-50，63-71，75-105，109-117，134-140，145-157，176-182，184-201，203-211，215-225，240-250，262-284，294-309，313-319，327-337，350-356，361-367，372-393，411-421，428-451，453-466，487-492，501-528，535-553，564-574，592-605，612-629，631-640，646-653，658-666，673-681，713-718，720-730，739-749，784-792，821-826，833-844，853-863，871-876，885-894，900-918，937-950，952-957，972-990，995-1001，1024-1036，1039-1044，1049-1055，1062-1089，1091-1103，1110-1121，1123-1129，1131-1151，1157-1179，1181-1201，1204-1223，1233-1244，1269-1276，1279-1286，1294-1301，1303-1309，1315-1338，1350-1362，1373-1381，1398-1406，1412-1423，1440-1446，1458-1466，1481-1487，1492-1508，

1528-1534，1536-1547，1553-1565，1606-1617，1619-1644和761-781；Seq ID No 242的氨基酸6-13，31-38，47-60，71-102，107-123，128-155，173-179，185-194，210-220和161-232；Seq IDNo 243的氨基酸11-34，36-43，49-67，74-79，84-92，94-100，103-112，120-129，134-155，162-173，177-185，189-202，206-211和130-185；Seq ID No 244的氨基酸4-10，20-35，37-46，48-55，60-66，75-82，87-98，133-150，166-172，178-189，208-214，230-235，245-251，271-308，319-333，335-355，373-380和117-201；Seq ID No 245的氨基酸4-30，54-65，91-105，107-131，135-154，163-192，199-208，210-224，229-239，248-257，263-279，281-294，328-354，

382-405，426-453，462-487和249-323；Seq ID No 246的氨基酸4-10，12-24，45-55，75-88和24-40；Seq ID No 247的氨基酸4-14，20-37，47-53，55-61，75-81，97-103，107-124，129-135，139-147，160-166，169-175，181-190，202-221，247-255，272-285，300-310，318-332，351-361，384-397，406-427，442-449，458-482，494-503，512-524，531-539，552-562，577-588，590-596，600-608，613-624，637-668，692-700和232-278；Seq ID No 248的氨基酸33-39，49-55，68-84，90-96，104-120，126-143，150-159，168-191，197-208，219-225，227-233，241-247，63-115和200-250；Seq ID No 249的氨基酸4-22，24-34，36-55，57-76，83-97，99-117，135-143，145-157，163-174，178-198，200-207，209-270，276-290，321-335，338-347，367-374，393-402，404-411，416-422，443-460，467-473和117-183；Seq ID No 250的氨基酸26-37，44-52，57-96，104-111，118-124，155-177，179-197，201-214，223-233，243-250，257-262，291-297，303-314，319-363和47-105；Seq ID No 251的氨基酸36-43，45-60，76-97，107-125，131-156，158-164和118-163；Seq ID No 252的氨基酸5-32，40-50，52-60，70-88，92-101，106-126，138-150，152-161，175-193，201-234，237-248，270-285，297-303，312-318和209-255；Seq ID No 253的氨基酸4-12，23-34，

59-65，70-81，83-130和62-113；Seq ID No 254的氨基酸4-26，38-49，69-76，82-96，103-119，126-140，143-190，194-209，212-218和100-167；Seq ID No 255的氨基酸7-29，35-47，56-66，80-94，97-123，125-148，150-160，166-173，175-191，193-200，207-225和75-176；Seq ID No 256的氨基酸14-36，39-45，51-59，66-71，76-88，106-117，121-126，140-157，164-187，198-206，210-252和202-256；Seq ID No 257的氨基酸4-19，27-35，90-107，120-134，144-150，166-175，192-198，221-243，249-255，263-278，283-288，305-321，324-334，342-349，355-366，377-390，413-425，442-448和130-178；Seq ID No 258的氨基酸17-26，41-51，54-61，64-72，

78-105，117-125，127-137，147-155，175-213，230-236，238-261，271-277，282-297，309-318，329-347，355-372，377-390和69-126；Seq ID No 259的氨基酸4-48，54-60，62-69，73-81，88-115，124-137，139-154，156-169，171-190，194-231，240-273，288-303，336-363，367-395，405-411，434-442，449-454，466-483，491-507和226-282；Seq ID No 260的氨基酸26-34，39-47，50-80，82-88，97-105，108-127，131-137，162-180，185-191，198-203，209-214，226-247，256-288，296-305和149-239；Seq ID No 261的氨基酸5-28，30-54，73-84，89-98，109-116，122-128，137-142，163-189，207-236，245-280，288-390，404-423，426-433，450-474，487-504，506-513，524-530，532-595，605-614，620-626，631-638，644-657，667-683，686-693，695-702，707-733，739-747和6-62；Seq ID No 262的氨基酸23-31，39-50，55-67，76-100，117-130，149-171，173-185，218-238，242-288，291-298，334-346，355-369，382-399，413-420，431-438，442-449，455-466，486-493，498-508，524-531，540-546，551-558，562-570，575-582，585-596，598-604，621-630，632-650，670-677，682-701，736-749，755-761和612-626；Seq ID No 263的氨基酸4-21，24-39，44-68，74-81，85-91，109-116，129-138，142-148，173-188，195-201，207-212，223-228和126-148；Seq ID No 264的氨基酸4-17，24-42，61-67，84-93，96-102，116-121，135-143，155-165，177-186，210-224，253-259，272-297，299-331，337-351，359-367，369-385和1-49；Seq ID No 265的氨基酸4-25，28-54，67-81，85-136，138-143，157-170，180-190，197-203，205-214，219-243，246-270，277-283，290-299，305-311和127-182；Seq ID No 266的氨基酸11-20，25-33，75-80，85-91，113-124，143-155，161-170，172-184和128-176；Seq ID No 267的氨基酸4-9，16-26，28-34，55-80，120-143，150-156，158-164，167-178，185-190，192-213，221-237，242-255，257-272，281-290，325-332和48-106；Seq ID No 268的氨基酸13-48，59-70，78-88，95-112，129-151，153-161，163-182，214-221，235-245，248-277，281-291，293-301，303-311，315-320，323-346，377-383，390-398，447-454，474-487，491-512，531-544，547-553，582-590，597-603，605-611，623-629和410-466；Seq ID No 269的氨基酸6-26，39-46，48-58，69-75，109-121，139-144，148-155，166-172，215-221，261-267，313-319，363-386，423-433，447-458，465-471，483-494，497-517，558-565，578-586，589-597，619-626，636-645，659-665，671-680，682-693，733-739和152-206；Seq ID No 270的氨基酸4-19，23-35，40-50，52-58，65-73，78-103，112-125，146-160，163-192，194-200和29-90；Seq ID No 271的氨基酸4-13，17-32，40-50，57-67，76-81，88-95，107-119，131-142，144-157，171-178，185-193，197-207，212-227，231-238，248-253，263-310和90-170；Seq ID No 272的氨基酸9-28，57-82，84-93，126-135，143-166，173-194，196-201，212-220，228-254，269-277，289-298，305-316，320-327，330-337，350-359，373-378，386-392，403-411，421-428，435-441，443-458，465-470和80-141；Seq ID No 273的氨基酸11-48，54-67，69-75，89-95，101-122，124-131，134-157，159-175，202-208，214-228，258-270，272-280，287-295，298-310，331-338，340-417，427-500，502-509，534-552，556-561，564-577，585-592，594-608，621-627，632-641，643-652，671-681，683-709，712-743，758-764，776-783，789-820，835-851，864-883，885-910，913-940，948-953，967-976，994-1020和775-825；Seq ID No 274的氨基酸14-24，32-54，58-63，70-80，93-100，108-125，127-135，142-153，155-160，180-191，201-208，210-216，222-235，242-264，267-273，276-282，284-308和10-59；Seq ID No 275的氨基酸16-28，44-68，70-77，83-90，99-129，131-137，145-154，161-175，183-190，196-203，205-220，238-245，321-328，330-338，366-379，383-397，399-405，412-418，442-458，471-483，486-505，536-544，562-568，583-602，610-618，629-635，641-655，672-682，697-705，714-729，744-751，755-762，766-771，783-807和555-621；Seq ID No 276的氨基酸4-9，20-34，45-54，60-77，79-89，91-100，102-149，162-170，177-189，193-208，210-222，238-244，252-264，267-276，302-307和100-140；Seq ID No 277的氨基酸11-27，30-49，56-62，69-74，76-85，94-108，116-125，129-147，153-161，165-171，177-208，217-223，225-231，237-255，260-284，293-300和73-137；Seq IDNo 278的氨基酸4-38，40-51，84-97，99-106，109-115，119-129，131-145，148-160，180-186，188-202，230-243，246-267，274-288，290-299，302-312，317-327，332-344，353-377，381-388，407-419，423-437，447-470，474-482，486-494，501-523，531-546，551-556和727-740；Seq ID No 279的氨基酸23-52，62-76，87-104，109-115，117-123，129-139，143-149，152-170，172-191，199-205，212-218，220-240，249-256，263-275，297-303，308-342，349-380，382-394，414-420，430-441，446-452，460-475，488-505，514-531，533-539，546-568，570-577，579-588，613-625，632-670，672-716，718-745，759-769，785-798，801-807和272-324；Seq ID No 280的氨基酸4-34，36-43，56-73，80-87，101-134，148-159，161-170，178-185，195-206，211-221，223-248，259-271，276-295，297-308和241-296；Seq ID No 281的氨基酸5-31，44-50，64-74，86-94，132-147，154-167，196-203，209-219，253-260，284-289，300-312，319-327，335-340，358-364，376-383和166-202；Seq ID No 282的氨基酸4-9，12-27，29-71，77-84，90-108，114-142，147-164，180-213，217-227，229-282，291-309，322-329，336-353，365-370和317-364；Seq ID No 283的氨基酸36-41，52-66，71-83，89-95，116-127，154-174，176-184，200-206，230-237，248-259，269-284，307-316，376-383，399-418，424-442，445-451，454-462和1-50；Seq ID No 284的氨基酸9-14，33-49，64-72，87-92，103-109，123-128，130-141，143-154，160-166，182-214，237-247，251-260，292-300，327-332，337-350，357-365，388-398，405-411，422-428，451-459，478-488，520-531，534-540，558-564，580-586，591-600，605-615，629-635，641-653，658-672，212-244和533-611；Seq ID No 285的氨基酸4-10，17-27，30-37，44-62，80-85，94-114，118-131，134-141，148-161，171-212，218-241，248-261，274-313，325-336，342-348，359-373，391-397，424-431，454-474，489-495，497-503，505-515，548-553，560-580，591-610和277-324；Seq ID No 286的氨基酸7-16，18-24，30-47，49-70，83-99，103-117，126-141，146-153，159-165，177-194，198-221，236-246，255-262，273-279，283-296，301-332，338-411，422-428，434-440，452-458，463-469，494-509，511-517，524-531，548-554，564-572和335-389；Seq ID No 287的氨基酸9-15，33-54，56-80，102-108和1-42；Seq ID No 288的氨基酸15-36，42-55，58-68和54-77；Seq ID No 289的氨基酸55-75，89-96，98-110和14-36；Seq ID No 290的氨基酸8-14，29-51，73-101，110-117和70-114；Seq ID No 291的氨基酸20-25，29-34，41-52，60-67，69-85，90-100，114-122，136-142，160-170，174-181和21-58；Seq ID No 292的氨基酸14-22和4-13；Seq ID No 293的氨基酸22-40，54-66，88-105，109-118和31-74；Seq ID No 294的氨基酸5-11，18-32，47-60，66-73，83-92，113-120，126-141，151-164，167-174，201-211和118-129；Seq ID No 295的氨基酸5-11，18-24，32-40，47-53和25-54；Seq ID No 296的氨基酸18-24，31-48和5-55；Seq ID No297的氨基酸10-16，26-32，47-56，85-95和10-62；Seq ID No 298的氨基酸4-12，16-26和25-34；Seq ID No 299的氨基酸19-29，45-51，63-68，76-92，103-110，114-120，123-133，135-141和14-78；Seq ID No 300的氨基酸4-18，47-61和57-93；Seq ID No 301的氨基酸17-29，44-50和26-38；Seq ID No 302的氨基酸5-19，55-64，78-85，95-101，104-112和24-33；Seq ID No 303的氨基酸4-10和12-31；Seq ID No 304的氨基酸4-12，27-41，43-58，60-67，76-86和13-65；Seq ID No 305的氨基酸30-38，57-67和5-32；Seq IDNo 306的氨基酸30-43和2-21；Seq ID No 307的氨基酸14-20，23-36，41-48和1-52；Seq ID No 308的氨基酸18-33，51-58，76-82和32-46；Seq ID No 309的氨基酸25-31和2-16；Seq ID No 310的氨基酸14-23，50-58和9-49；Seq ID No 311的氨基酸4-10，22-31，35-45，48-68，71-80和17-66；Seq ID No 312的氨基酸4-24，28-42，46-56，63-69，87-94，112-131和2-46；Seq ID No 313的氨基酸4-15，19-28，34-41，52-62，78-86和2-20；Seq ID No 314的氨基酸4-11，16-30，32-42和7-38；Seq ID No 315的氨基酸4-20，22-31和22-38；Seq ID No 316的氨基酸4-19和17-32；Seq ID No317的氨基酸7-13，17-22，27-33，80-100和26-40；Seq ID No 318的氨基酸10-18，22-48和32-44；Seq ID No 319的氨基酸15-24，43-49，73-83和45-93；Seq ID No 320的氨基酸22-29，46-55，57-63和5-17；Seq ID No 321的氨基酸10-33和21-35；Seq ID No322的氨基酸16-24和22-49；Seq ID No 323的氨基酸4-16，37-73，76-110，117-125，127-132和2-30；Seq ID No 324的氨基酸4-12，23-35，44-56，59-88和22-76；Seq ID No 325的氨基酸15-26和23-35；Seq ID No 326的氨基酸12-22，31-40和17-44；Seq ID No327的氨基酸4-9，13-18，29-35和57-64；Seq ID No 328的氨基酸31-55，67-81和25-70；Seq ID No 329的氨基酸13-24，51-58和13-26；Seq ID No 330的氨基酸6-20，29-40，57-79和46-88；Seq ID No 331的氨基酸8-14，41-54，68-76，83-93，106-126，130-139和12-72；Seq ID No 332的氨基酸5-13，17-24，41-55，64-69，80-85，94-107，109-115和53-88；Seq ID No 333的氨基酸5-12，32-54，57-64和20-33；Seq ID No 334的氨基酸4-16，40-48，50-58，62-68，75-85，92-104，108-116，124-134和68-128；Seq ID No 335的氨基酸7-13，19-29，34-40，54-71，76-81，91-144，147-155，157-188和11-83；Seq ID No 336的氨基酸17-24，32-41和6-43；Seq ID No 337的氨基酸14-31，38-59，69-87，95-102，126-146，157-162，177-193，201-227，238-251和63-78；Seq ID No 338的氨基酸10-16，18-25，27-41，43-52，59-86，94-101，134-140和38-100；Seq ID No 339的氨基酸4-19，23-35，43-72，78-92和37-93；Seq ID No 340的氨基酸15-20，27-32，41-65，69-82，93-105，107-115，120-147，170-178，184-201，214-257，272-281，293-314，332-339，358-364，374-381，390-397，399-414，428-460和317-375；Seq IDNo 341的氨基酸11-28，47-55，59-68，76-105，108-116，120-144，146-160，167-175，180-187，209-233和144-158；Seq ID No 342的氨基酸4-13，58-78和14-77；Seq ID No 343的氨基酸26-31，44-49，57-64，67-74，107-112，116-152，154-181，202-212，241-255和57-101；Seq ID No 344的氨基酸10-41，53-70，81-93，100-111，137-147，164-169，183-190，199-210，216-221，226-240和84-95；Seq ID No 345的氨基酸12-45，48-56，73-79，91-103，106-112，117-125，132-143，154-160，178-201，208-214，216-225，260-266，276-283和98-115；Seq ID No 346的氨基酸4-15，30-42和29-39；Seq ID No 347的氨基酸22-53，55-73，80-88和33-66；Seq ID No348的氨基酸6-23，44-54和56-67；Seq ID No 349的氨基酸8-21，35-44，66-75，82-87，94-101和32-94；Seq ID No 350的氨基酸8-20，23-32，36-50，53-69和15-69；Seq ID No 351的氨基酸8-22；SeqID No 352的氨基酸31-37和2-31；Seq ID No 353的氨基酸4-20，23-39，58-63，71-78，97-102和22-82；Seq ID No 354的氨基酸23-44，135-152，168-184和57-116；Seq ID No 355的氨基酸24-31，42-50，52-62，93-117和43-94；Seq ID No 356的氨基酸20-29和24-43；Seq ID No 357的氨基酸12-57，59-74和22-40；Seq ID No358的氨基酸7-16，18-26，39-45，68-78，86-92和65-82；Seq IDNo 359的氨基酸5-17，19-34，42-48，56-71，102-113，118-129和67-111；Seq ID No 360的氨基酸4-33，50-71和13-55；Seq ID No361的氨基酸9-17，23-30，37-54，69-88，96-102，114-123，130-140，143-163和5-70；Seq ID No 362的氨基酸4-23，27-52，71-80和9-94；Seq ID No 363的氨基酸13-19和2-21；Seq ID No 364的氨基酸18-26，28-52，63-74，94-107，123-134和18-84；Seq IDNo 365的氨基酸19-33，57-68和26-48；Seq ID No 366的氨基酸4-26，31-37，42-59和12-65；Seq ID No 367的氨基酸4-25和20-39；Seq ID No 368的氨基酸40-51，54-62，67-75，83-89，126-146，148-156和31-42；Seq ID No 369的氨基酸4-15，23-33，38-49，82-98和7-91；SEQ ID No 370的氨基酸6-26，36-57和40-64；Seq ID No 371的氨基酸6-15，21-28，32-38，57-65，78-103，114-134，138-144，154-163和41-95；Seq ID No 372的氨基酸13-30，47-57，71-76和25-71；Seq ID No 373的氨基酸4-31，43-51，55-63，67-72，76-83，88-95，99-118，125-132，134-159和82-118；Seq ID No 374的氨基酸4-17，26-32，34-40，45-61，67-92和41-97；Seq ID No204的氨基酸179-208和198-227；Seq ID No 205的氨基酸45-69，65-89和83-106；Seq ID No 206的氨基酸269-290；Seq ID No 207的氨基酸209-230，226-249和245-269；Seq ID No 208的氨基酸-9-15，10-33和28-52；Seq ID No 209的氨基酸29-50，45-67和62-85；Seq ID No 210的氨基酸96-120，115-139和134-158；SeqID No 211的氨基酸519-543，539-563和559-584；Seq ID No 212的氨基酸10-35，31-56和52-77；Seq ID No 213的氨基酸382-407和403-428；Seq ID No 214的氨基酸66-90；Seq ID No 215的氨基酸38-65和61-88；Seq ID No 216的氨基酸56-85，198-221，217-240和236-261；Seq ID No 217的氨基酸108-132和128-153；Seq ID No 218的氨基酸13-37，33-56，52-76，175-200和196-220；Seq ID No 219的氨基酸132-156，152-176和172-195；Seq ID No220的氨基酸489-512，508-531和526-549；Seq ID No 221的氨基酸416-442，438-465和461-489；Seq ID No 222的氨基酸199-222，217-240和235-257；Seq ID No 223的氨基酸25-55，51-81和77-107；Seq ID No 224的氨基酸18-46和42-66；Seq ID No 225的氨基酸575-601和597-623；Seq ID No 226的氨基酸274-299，295-320和316-339；Seq ID No 227的氨基酸32-61和57-85；SeqID No 228的氨基酸266-291和287-313；Seq ID No 229的氨基酸85-114；Seq ID No 230的氨基酸36-64和83-109；Seq ID No 231的氨基酸264-285和280-300；Seq ID No 232的氨基酸102-128和124-152；Seq ID No 233的氨基酸404-429和445-468；Seq ID No234的氨基酸343-374和370-401；Seq ID No 235的氨基酸158-182和178-202；Seq ID No 236的氨基酸151-180；Seq ID No 237的氨基酸549-579，575-605和601-630；Seq ID No 238的氨基酸-7-23和19-46；Seq ID No 239的氨基酸48-75和71-98；Seq ID No 240的氨基酸789-813和809-834；Seq ID No 241的氨基酸759-783；Seq ID No 242的氨基酸160-188，184-211和207-232；Seq ID No243的氨基酸130-159；Seq ID No 244的氨基酸117-147，143-173和169-201；Seq ID No 245的氨基酸248-276，272-300和296-323；Seq ID No 246的氨基酸21-43；Seq ID No 247的氨基酸231-256和252-278；Seq ID No 248的氨基酸62-91，87-115和199-227；SeqID No 249的氨基酸116-141，137-162和158-183；Seq ID No 250的氨基酸46-69，65-87和82-105；Seq ID No 251的氨基酸117-142和138-163；Seq ID No 252的氨基酸208-233和229-255；Seq IDNo 253的氨基酸61-88；Seq ID No 254的氨基酸99-124，120-145和141-167；Seq ID No 255的氨基酸74-103，99-128，124-152和148-176；Seq ID No 256的氨基酸202-231和227-256；Seq ID No257的氨基酸129-154和150-178；Seq ID No 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293的氨基酸30-54和50-75；Seq ID No294的氨基酸111-135；Seq ID No 295的氨基酸25-54；Seq ID No334的氨基酸67-98和94-126；Seq ID No 335的氨基酸9-32，27-51，46-70和65-86；Seq ID No 336的氨基酸1-24和20-44；Seq ID No 337的氨基酸58-82；Seq ID No 338的氨基酸37-62，58-82和77-101；Seq ID No 339的氨基酸37-68和64-93；Seq IDNo 340的氨基酸317-347和343-375；Seq ID No 341的氨基酸140-164；Seq ID No 342的氨基酸13-40，36-60和55-79；Seq IDNo 343的氨基酸56-79和75-101；Seq ID No 344的氨基酸77-101；Seq ID No 345的氨基酸94-118；Seq ID No 205的氨基酸46-105；Seq ID No 216的氨基酸56-111；Seq ID No 223的氨基酸25-107；Seq ID No 224的氨基酸19-66；Seq ID No 229的氨基酸85-114；Seq ID No 230的氨基酸37-109；Seq ID No 231的氨基酸266-296；Seq ID No 232的氨基酸103-152；Seq ID No 235的氨基酸167-218；Seq ID No 240的氨基酸790-834；Seq ID No 241的氨基酸761-781；Seq ID No 242的氨基酸176-232；Seq ID No 244的氨基酸117-201；Seq ID No 245的氨基酸249-323；Seq ID No 247的氨基酸232-278；Seq ID No 252的氨基酸209-255；Seq ID No 255的氨基酸75-176；Seq ID No 256的氨基酸202-256；Seq ID No 257的氨基酸130-178；Seq ID No 258的氨基酸69-126；Seq ID No 263的氨基酸126-148；Seq ID No 264的氨基酸1-49；Seq ID No 265的氨基酸127-182；Seq ID No 267的氨基酸48-106；Seq ID No 268的氨基酸410-466；Seq ID No 269的氨基酸152-206；Seq ID No 275的氨基酸555-621；Seq ID No 281的氨基酸166-202；Seq ID No 282的氨基酸317-364；Seq ID No 283的氨基酸1-50；Seq ID No 285的氨基酸277-324；Seq ID No 289的氨基酸14-36；Seq ID No 336的氨基酸6-43；SeqID No 343的氨基酸57-101；Seq ID No 344的氨基酸84-95；Seq IDNo 345的氨基酸98-115。

26.根据权利要求25所述的抗原，由此所述抗原进一步由以下组成：

b)与核心氨基酸序列异源的至少一个氨基酸残基。

27.根据权利要求26所述的抗原，其中所述另外的氨基酸残基侧翼于核心氨基酸序列N-末端、C-末端或N-末端和C-末端。

28.根据权利要求25至27任一项所述的抗原，其中所述抗原包括在权利要求25中所定义的至少2，至少3，至少4，至少5或至少6个核心氨基酸序列。

29.用于生产权利要求11至28任一项中所定义的抗原，或其活性片段或活性变体的方法，包括表达权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子。

30.用于生产表达权利要求11至28任一项中所定义的抗原，或其活性片段或活性变体的细胞的方法，包括将合适的宿主细胞用权利要求8或9中所定义的载体转化或转染。

31.根据权利要求29或30任一项所述的方法，其中所述抗原或其活性片段或活性变体，分离自克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

32.药物组合物，优选疫苗，包括权利要求11至28任一项中所定义的抗原或其活性片段或活性变体；或权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子；或权利要求8至9任一项中所定义的载体。

33.药物组合物，优选疫苗，包括权利要求11至28任一项中所定义的抗原或其活性片段或活性变体；或权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子；或权利要求8至9任一项中所定义的载体，以用于治疗或预防克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选来自肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染。

34.根据权利要求32或33所述的药物组合物，其特征在于其还包括免疫刺激物质，优选聚阳离子聚合物，特别是聚阳离子肽，免疫刺激寡脱氧核苷酸(ODNs)，特别是Oligo(dIdC)₁₃，包含至少两个LysLeuLys基序的肽，特别是肽KLKLLLLLKLK，神经活性化合物，特别是人类生长激素，a l um，弗罗因德完全或不完全佐剂，或其组合

35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述免疫刺激物质为聚阳离子聚合物和免疫刺激脱氧核苷酸，或包含至少两个LysLeuLys基序的肽和免疫刺激脱氧核苷酸的组合，优选KLKLLLLLKLK和Oligo(dIdC)₁₃的组合。

36.根据权利要求34或35所述的药物组合物，其中所述聚阳离子肽为聚精氨酸。

37.权利要求11至28任一项中所定义的抗原或其活性片段或活性变体；或权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子；或权利要求8至9任一项中所定义的载体，以用于治疗或预防克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染。

38.权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子；或权利要求11至28任一项中所定义的抗原或其活性片段或活性在制备用于治疗或预防克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染的药物组合物，特别是用于制备疫苗上的用途。

39.抗体，或至少其有效部分，其与权利要求11至28任一项中所定义的抗原或其片段，优选其活性片段，或其变体，优选其活性变体的至少选择性部分结合。

40.根据权利要求39所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。

41.根据权利要求39或40所述的抗体，其中所述有效部分包括Fab片段，F(ab)片段，F(ab)N片段，F(ab)₂片段或F_v片段。

42.根据权利要求39至41任一项所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体。

43.根据权利要求39至42任一项所述的抗体，其中所述抗体为人源化抗体。

44.杂交瘤细胞系，其产生权利要求39至43任一项中所定义的抗体。

45.用于产生权利要求39至43任一项中所定义的抗体的方法，其特征在于以下步骤：

a)在非人动物中通过给药权利要求11至28任一项中所定义的抗原，或其活性片段或活性变体给所述动物来引发免疫应答，

b)从所述动物中除去包含抗体的体液，和

46.用于产生权利要求39至43任一项中所定义的抗体的方法，其特征在于以下步骤：

a)在非人动物中通过给药权利要求11至28任一项中所定义的抗原或其活性片段或活性变体给所述动物来引发免疫应答，

b)从所述动物中除去脾或脾细胞，和

c)产生所述脾或脾细胞的杂交瘤细胞，

e)通过培养所述克隆的杂交瘤细胞产生抗体，和

f)任选地进行进一步纯化步骤。

47.药物组合物，包括根据权利要求39至43任一项所述的抗体。

48.根据权利要求39至43任一项所述的抗体或包括根据权利要求39至43任一项所述的抗体的药物组合物，以用于治疗或预防克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染。

49.权利要求39至43任一项中所定义的抗体在制备用于治疗或预防克雷伯菌(Klebsiella)，优选包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)感染的药物组合物上的用途。

50.用于鉴定能够结合权利要求11至28任一项中所定义的抗原或其活性片段或活性变体的方法，包括：

a)使权利要求11至28任一项中所定义的分离或固定的抗原或其活性片段或活性变体与候选拮抗剂在允许所述候选拮抗剂与所述抗原或其活性片段或活性变体结合的条件下，在能够提供应答于所述候选拮抗剂与所述抗原或其活性片段或活性变体的结合的可检测信号的组分的存在下接触；和

51.用于鉴定拮抗剂的方法，所述拮抗剂能够降低或抑制权利要求11至28任一项中所定义的抗原或其活性片段或活性变体与其相互作用伴侣的相互作用活性，包括：

a)提供权利要求11至28任一项中所定义的抗原，或其活性片段或活性变体，

b)提供所述抗原，或其活性片段或活性变体的相互作用伴侣，特别根据权利要求39至43任一项的抗体，

c)使所述抗原，或其活性片段或活性变体与所述相互作用伴侣相互作用以形成相互作用复合物，

d)提供候选拮抗剂，

52.权利要求11至28任一项中所定义的抗原或其活性片段或活性变体在用于分离和/或纯化和/或鉴定所述抗原或其所述活性片段或活性变体的相互作用伴侣上的用途。

53.用于诊断克雷伯菌(Klebsiella)有机体感染的方法，包括以下步骤：

a)使获自受试者的样品与权利要求11至28任一项中所定义的抗原或其活性片段或活性变体接触，和

54.用于诊断克雷伯菌(Klebsiella)有机体感染的方法，包括以下步骤：

a)使获自受试者的样品与根据权利要求39至43任一项所述的抗体接触；和

b)检测样品中所述克雷伯菌(Klebsiella)有机体的抗原的存在。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述克雷伯菌(Klebsiella)有机体的抗原为权利要求11至28任一项所定义的抗原或其活性片段或活性变体。

56.用于诊断克雷伯菌(Klebsiella)有机体感染的方法，包括以下步骤：

a)使获自受试者的样品与对权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子，或其片段特异的引物或探针接触；和

b)检测样品中此类核酸分子或其片段的存在。

57.根据权利要求53至56任一项所述的方法，其中所述克雷伯菌(Klebsiella)有机体为致病性克雷伯菌(Klebsiella)有机体，更优选选自以下的克雷伯菌(Klebsiella)有机体：包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。

58.权利要求11至28任一项中所定义的抗原，或其活性片段或活性变体在制备功能性核酸上的用途，其中所述功能性核酸选自适配子和镜像异构体。

59.权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子在制备功能性核糖核酸上的用途，其中所述功能性核糖核酸选自核酶、反义核酸和siRNA。

60.用于在优选需要其的动物或人类中治疗克雷伯菌(Klebsiella)感染的方法，包括给药给所述动物或人类以治疗有效量的权利要求11至28任一项中所定义的抗原，或其活性片段或活性变体、或权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子、或权利要求8至9任一项中所定义的载体，或权利要求39至43任一项中所定义的抗体，或权利要求32至36、47或48任一项中所定义的的药物组合物的步骤。

61.用于使动物或人类免疫克雷伯菌(Klebsiella)有机体感染的方法，包括给药给所述动物或人类以治疗有效量的权利要求11至28一项中所定义的抗原，或其活性片段或活性变体、或权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子、或权利要求8至9任一项所定义的载体，或权利要求39至43任一项中所定义的抗体，或权利要求32至36、47或48任一项中所定义的的药物组合物的步骤，其中所述有效量适合在所述动物或人类中引起免疫应答。

62.用于在动物或人类中刺激针对克雷伯菌(Klebsiella)有机体的免疫应答的方法，包括给药给所述动物或人类以治疗有效量的权利要求11至28任一项中所定义的抗原，或其活性片段或活性变体、或权利要求1至7任一项中所定义的核酸分子、或权利要求8至9任一项中所定义的载体，或权利要求39至43任一项中所定义的抗体，或权利要求32至36、47或48任一项中所定义的的药物组合物的步骤，所述有效量适合在所述动物或人类中刺激免疫应答。

63.根据权利要求60至62任一项所述的方法，其中所述克雷伯菌(Klebsiella)有机体选自：包括三种亚种肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种的肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，植生克雷伯菌(K.planticola)，土生克雷伯菌(K.terrigena)和解鸟氨酸克雷伯菌(K.ornithinolytica)，更优选肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)或产酸克雷伯菌(K.oxytoca)。