CN110540595A

CN110540595A - 一种肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的制备方法

Info

Publication number: CN110540595A
Application number: CN201811565660.9A
Authority: CN
Inventors: 杨波; 宋慧茹; 胡征; 王毅
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN110540595B

Abstract

本发明涉及一种肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的制备方法。该试纸由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC板组成。结合垫上喷涂有彩色乳胶微球偶联的鼠抗人IgG单克隆抗体，硝酸纤维素膜上包被有肺炎克雷伯菌融合抗原的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。当加入的样品中含有肺炎克雷伯菌抗体时，肺炎克雷伯菌抗体首先与乳胶‑鼠抗人IgG单克隆抗体形成复合物，在毛细作用下迁移至包被有肺炎克雷伯菌融合抗原的检测线时被捕捉，检测线呈相应的彩色，因而可检测样品中是否含有肺炎克雷伯菌抗体。该试纸条具有快速、简捷、灵敏度高，特异性好，假阳性低的优点，能在十分钟之内得到明确的结果，有效用于肺炎克雷伯菌感染的辅助诊断。

Description

一种肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程和免疫学领域，具体涉及一种基于肺炎克雷伯菌融合抗原的肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸条及其制备方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，又称肺炎杆菌或Friedlander杆菌，是最早被认识可引起肺炎的革兰阴性杆菌。半个世纪以前，革兰阴性杆菌肺炎(gram-negative bacillary pneumonia，GNBP)曾被认为是一种非常少见的疾病，很少受到临床关注。除克雷白杆菌外，几乎没有关于革兰阴性杆菌(gram-negative bacterium，GNB)引起肺炎的报道。近二、三十年来，随着易感人群的改变、抗菌药物广泛应用与耐药菌的变迁以及各种微生物检测技术的提高与普及，GNBP已成为进入抗生素时代的现代医学的一种重要疾病。肺炎克雷伯菌常存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，是肠杆菌科克雷伯菌属中对人致病性较强的重要条件致病菌和医源性感染菌。据北京协和医院的统计，肺炎克雷伯杆菌肺炎的发病率为40.9％。世界范围的统计，肺炎克雷伯杆菌肺炎占全部肺炎1％～8％，仅次于铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌肺炎。社会获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)的实际调查受到诸多因素的限制，缺乏统一的报告。肺炎克雷伯杆菌肺炎占CAP中革兰阴性杆菌肺炎发病率的16％～64％，现认为肺炎克雷白杆菌是CAP常见的病原菌之一。

鉴于近年肺炎克雷伯菌的耐药率有进一步上升的趋势，这应当引起临床医师及微生物界的高度重视。临床医师应重视获得性肺炎克雷伯菌感染，与临床微生物实验室密切协作，加强感染的监测，有效预防和控制感染。

目前检测呼吸道中该病原体的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定法，该方法所需时间长，一般要2-3天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，而增菌液中往往还有PCR抑制剂，从而影响扩增的效果，假阳性也是该法的一个突出缺点。同时，该技术还需要专业的检测设备，不适合进行床旁检测。以抗体为诊断标的的免疫学检测已成为人体病原微生物感染检测不可或缺的重要技术手段。目前已发展了多种特异性免疫检测技术，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CIA)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中免疫乳胶试纸条等多种以抗原抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点已成为病原微生物检测不可或缺的重要手段。因而，研究开发具有自主知识产权的病原微生物的标志性抗原，是开发拥有自主知识产权的ELISA、乳胶微球免疫层析等进行病原体抗体检测的方法的基础。

抗原的制备是抗体检测特异性的关键。肺炎克雷伯菌fepA、GlpQ、及mltD蛋白均是位于细胞表面的重要结构蛋白，其保守性高，特异性强，免疫原性强，表面暴露性高，是较为理想的抗原标志物。本研究选用具有种间特异性的表面蛋白fepA、GlpQ及mltD等作为抗原标的，制备特异性良好的融合抗原，并将其应用于制备肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸条。

发明内容

本发明的目的是以融合抗原为基础，通过免疫乳胶标记技术研制一种操作简单、成本低廉、快捷迅速的检测人血清中肺炎克雷伯菌抗体的乳胶微球免疫层析检测试纸条。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的制备方法包括以下步骤：

1)肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)的制备：

分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA、表面蛋白GlpQ及表面蛋白mltD的胞外结构域中抗原表位及免疫原性最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，并优化该肽段基因编码序列，并将此三段基因序列用两段柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；

所述肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA、表面蛋白GlpQ及表面蛋白mltD在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_012068422、WP_004214637及WP_004210407；

所述柔性连接肽的氨基酸序列是ggsggsggsggs；

同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Fepglpmlt；

所述Fepglpmlt的基因全序列是：

所述Fepglpmlt的编码氨基酸序列是：

MNDYRNKIEAGYAPVYQNNKGTDLYQWENVPKAVVEGLEGTLNVPVSETVNWTNNITYMLQSKNKETGDRLSIIPEYTLNSTLSWQVRDDVSLQSTFGGSGGSGGSGGSDRLVVLHDHYLDRVTDVAQRFPQRARKDGRFYAIDFTLDEIKSLKFTEGFEPKNGKNVQTYPGRFPMGKSDFRIHTFEEEIEGGSGGSGGSGGSLDSPVDISQLADMAGMPVSKLKTFNAGVKGSTLGASGPKYVMVPQKHAAQLRESLASGDIAAVQPTQLADNTPLTSRSYKVRSGDTISGIASRLGVTTRD；

所述Fepglpmlt基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA的550-645aa、表面蛋白GlpQ的69-150aa及表面蛋白MltD的268-367aa；三段蛋白序列以两段柔性连接肽进行连接；将此基因片段按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni²⁺亲和层析法纯化重组His-Fepglpmlt融合蛋白，冻干后保存备用；所述柔性连接肽的氨基酸序列是ggsggsggsggs；

2)制备鼠抗人IgG单克隆抗体的乳胶微球标记物：

2.1)乳胶微球的活化

取浓度为10％的彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球溶液1mL，加入9mL MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)缓冲液后混匀，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)以及EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，至二者的终浓度均为1mg/mL，在室温下缓慢混匀30分钟，孵育结束后19000g离心20分钟，去上清，沉淀用10mL硼砂缓冲液重悬，振荡，超声处理后即成活化后的乳胶微球；所述MES缓冲液中组分及含量是：0.1mol/L MES，所述MES缓冲液的pH＝8.5；所述彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的粒径是100nm；所述所述硼砂缓冲液的组分及含量是：0.1mol/L Na₂B₄O₇，所述硼砂缓冲液的pH＝8.5；

2.2)乳胶微球标记物的制备

用硼砂缓冲液将鼠抗人IgG单克隆抗体配制成1mg/mL；取10mL鼠抗人IgG单克隆抗体加入10mL活化乳胶微球，缓慢混匀30分钟后19000g离心10分钟，去上清；沉淀用10mL含有1％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，经超声粉碎后重复离心1次，去上清；沉淀同法重悬，经超声粉碎后重复离心1次，去上清；沉淀用10mL含有1％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，即为鼠抗人IgG单克隆抗体的乳胶微球标记物；所述硼砂缓冲液的组分及含量是：0.1mol/L Na₂B₄O₇，所述硼砂缓冲液的pH＝8.5；

3)结合垫的制备：

向聚酯纤维材质的结合垫上喷涂鼠抗人IgG单克隆抗体的乳胶微球标记物，每平方厘米聚酯纤维膜的喷涂量为20μL乳胶微球标记物；喷涂完后在相对湿度不超过30％的环境中在37℃下烘干，剪裁成所需的规格，25℃密封干燥保存；

4)抗原固相硝酸纤维素膜的制备：

用硼砂缓冲液将步骤1)所得的肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)稀释成2mg/mL后用喷膜仪包被到硝酸纤维素膜上的检测线位置作为检测线捕获抗原，包被参数为1μL/cm；将羊抗鼠IgG多克隆抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控线位置作为控制线捕获抗体，浓度为1mg/mL，包被参数为1μL/cm；其中，所述的检测线与所述的质控线的距离为0.7cm，所述检测线与所述质控线与硝酸纤维素膜的边距分别均为0.8cm；包被完后将该硝酸纤维素膜放在相对湿度不超过30％的环境中，于37℃下烘干，剪裁成所需的规格，25℃密封干燥保存；所述硼砂缓冲液的组分及含量是0.1mol/L Na₂B₄O₇，所述硼砂缓冲液的pH＝8.5；

5)样品垫的制备

取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成所需的规格，25℃密封干燥保存；至此制得样品垫；所述样品垫处理液中各组分及含量是：0.01mol/L Na₂B₄O₇，2g/L氯化钠，20g/L酪蛋白，10ml/L吐温-20，10ml/L消泡剂S-17；所述样品垫处理液的pH＝8.5；

6)试纸条的组装

分别将吸水滤纸材质的吸水垫、抗原固相硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、依次粘贴在PVC底板上，硝酸纤维素膜上所述的质控线靠近吸水垫端，所述的检测线靠近样品垫端，再切割成一定宽度的试纸条，密封包装，干燥低温保存；至此制得肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸条。

本发明的优点是：

1)本发明采用抗原表位及免疫原性分析，表面结构分析，基因优化等方式，构建了一个全新的融合抗原基因，通过可溶性过量表达，首次成功获得了可溶性的重组FepA/GlpQ/mltD融合蛋白。该基因工程融合蛋白表达量高，蛋白可溶性好，抗原性强，制备成本低廉。

2)本发明首次利用肺炎克雷伯菌表面上的三个结构蛋白的胞外暴露表位制备的重组抗原，对血清抗体的识别力高，捕获力强，极大的降低了漏检的可能性，试纸条灵敏度高，并且具有快速、高效等优点。

3)该试纸条特异性好，用80位经病原学鉴定确认的肺炎克雷伯菌感染者的血清样本和100位非肺炎克雷伯菌感染者的的血清样本进行的特异性实验，结果显示本发明的试纸条具有良好的特异性和灵敏度，其可检出所有所试的肺炎克雷伯菌感染者的血清，而与非肺炎克雷伯菌感染者的血清样本无交叉反应，十分适合临床非诊断性应用。

4)该试纸条在常温下可保质两年，有效延长保质期并降低保存条件；非专业人士用该检测试纸即可完成全程检测，操作简单，有利于该法的推广和普及；整个检测过程最快可以在10min内完成，更适合于床旁检测。

附图说明

图1是本发明所提供的肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的爆炸结构示意图；

图2是本发明所提供的肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的组装结构示意图；

其中：

1-样品垫；2-结合垫；3-NC膜；4-吸水垫；5-PVC板。

具体实施方式

本发明通过以下实施例作进一步具体描述。

本发明使用或采用的各种材料的来源

1、乳胶微球：本发明中所用乳胶微球为羧基化修饰的聚苯乙烯乳胶微球，为上海甄准生物科技有限公司产品，粒径为100nm，颜色为红色，产品的平均直径公差在10％以内，形式为10％固体水悬液，产品货号MSI-CAR100NM。

2、玻璃纤维素膜：厚度为0.45-0.55mm，吸水量为600-800mg/m²，玻璃纤维直径为0.6-3μm，具有良好的亲水性，购买于上海金标生物科技有限公司(型号为BT50)。

3、聚酯纤维膜：厚度为0.25-0.35mm，爬速为15-40mm/60s，具有极好的亲水性，用于结合垫的制备，购买于上海金标生物科技有限公司(型号为VL98)。

4、硝酸纤维素膜：型号为Millipore Corp SHF135，有衬板，购买于Millipore公司。

5、吸水滤纸：厚度为0.95mm，吸水速度为60s/4cm，吸水量为700mg/cm²，具有良好的吸水性，作为制作吸水垫的材料。购买于上海金标生物科技有限公司(型号为CH37K)。

6、底板：为高白度PVC材质，表面涂布单层高聚合物压敏胶SM31，购买于上海金标生物科技有限公司。

7、本发明所用到的微生物样品均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

8、pET28a(+)：大肠杆菌表达载体，从美国Novagen公司引进。

9、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)：购自上海北诺生物科技有限公司。

10、羊抗鼠IgG多克隆抗体：为博士德生物工程有限公司产品，产品货号BA1038。

11、鼠抗人IgG单克隆抗体：为美国Abcam公司产品，货号为ab771，其是由杂交瘤细胞【4A11】分泌的抗人IgG Fab区段的单克隆抗体。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+MltD)的制备：

1.1)肺炎克雷伯菌Fepglpmlt融合基因的克隆

获取肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA、GlpQ及MltD(其NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_012068422、WP_004214637及WP_004210407)胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到其基因编码序列，优化其基因编码序列，并将此三段基因序列用两段柔性连接肽(ggsggsggsggs)的编码序列进行连接，形成融合基因。同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Fepglpmlt。其基因全序列及编码的氨基酸序列如序列表所示。具体的说，Fepglpmlt基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA的550-645aa、表面蛋白GlpQ的69-150aa及表面蛋白MltD的268-367aa。三段蛋白序列以两段柔性连接肽(ggsggsggsggs)进行两两连接。将此基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因化学合成，交货时该人工合成的基因片段连于载体pUC57上。将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI及BamHI进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用。同时采用NdeI及BamHI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规分子生物学方法将经双酶切后获得的Fepglpmlt基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET-Fepglpmlt表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组Fepglpmlt融合蛋白。

1.2)肺炎克雷伯菌Fepglpmlt融合蛋白的表达

将上述鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coliBL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株。挑取pET-Fepglpmlt转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mLLB培养基中，于37℃培养过夜。取出菌液后，按1：100接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养至OD600＝0.6时，加入1mol/L IPTG至终浓度为0.5mmol/L，于37℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导3h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用50mL Buffer A(50mM Na₃PO₄，0.5M NaCl；pH7.4)洗涤3次并用50mL上样缓冲液(50mMNa₃PO₄，0.5M NaCl；5mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超声破碎，操作条件为：功率50W，工作时间2s，间隔时间3s，报警温度60℃，总时间30min。超声完成后，19000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组Fepglpmlt融合蛋白以部分溶解形式存在于菌体中。薄层扫描显示，该重组蛋白占细菌总蛋白的20％以上，说明基因优化后融合蛋白获得了较高的表达量。将未经基因优化的野生型Fepglpmlt基因按上述同样方式进行表达，结果未发现表达产物，说明基因优化效果突出。将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns(GE healthcare公司产品)，按照说明书的方法进行重组Fepglpmlt融合蛋白的纯化。具体方法如下：

(1)连接层析系统，该系统包括进样管、蠕动泵(上海沪西分析仪器厂，型号DHL-A)、层析柱(GE healthcare公司产品,商品名His Trap affinity columns)及紫外检测器(上海沪西分析仪器厂，型号HD1)，柱体积为2ml，预热紫外检测仪30min左右至读数稳定；

(2)校对T％：调节光亮旋钮至显示100％；

(3)旋转灵敏度至合适位置，一般用0.2A；

(4)以上样缓冲液平衡层析系统，至读数稳定后旋转“调零”至显示“000”；

(5)上蛋白样品，流速控制在5ml/min以内，收集穿透液；

(6)用上样缓冲液洗去未结合的蛋白，此过程中记录读数，直到读数不再变化为止，收集洗脱液；

(7)用Buffer A+10mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；

(8)用Buffer A+20mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；

(9)用Buffer A+40mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

(10)用Buffer A+100mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

(11)用Buffer A+150mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

(12)取各洗脱峰样品100ul进行SDS-PAGE电泳；

(13)结果发现，目标蛋白(33KD)在100mM咪唑时被洗脱下来，纯度在90％以上，经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为5mg/mL，备用。至此制得肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)。

实施例2制备鼠抗人IgG单克隆抗体的乳胶微球标记物

2.1)乳胶微球的活化

取浓度为10％的红色羧基化聚苯乙烯乳胶微球(100nm)溶液1mL，加入9mL 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(0.1mol/L MES，pH8.5)后混匀；用MES缓冲液分别配制10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液；

将1mL NHS溶液以及1mL EDC溶液依次加入聚苯乙烯乳胶微球(100nm)溶液中，在室温下缓慢混匀30分钟，孵育结束后19000g离心20分钟，去上清，沉淀用10mL硼砂缓冲液(0.1mol/L Na₂B₄O₇，pH8.5)重悬，振荡，超声处理(超声破碎仪产品型号：YJ92-IIDN，功率50W，工作时间2s，间隔时间3s，报警温度60℃，总时间30min)后即成活化后的乳胶微球。

2.2)乳胶微球标记物的制备

用硼砂缓冲液(0.1mol/L Na₂B₄O₇，pH8.5)将鼠抗人IgG单克隆抗体稀释成1mg/mL。取10mL鼠抗人IgG单克隆抗体加入10mL活化乳胶微球，缓慢混匀30分钟后19000g离心10分钟，去上清。沉淀用10mL含有1％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，经超声粉碎(超声破碎仪产品型号：YJ92-IIDN，功率50W，工作时间2s，间隔时间3s，报警温度60℃，总时间30min)后19000g重复离心1次(10分钟)，去上清。沉淀同法重悬，经超声粉碎后再19000g重复离心1次(10分钟)，去上清。沉淀用10mL含有1％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，即为鼠抗人IgG单克隆抗体的乳胶微球标记物。

实施例3结合垫的制备：

将聚酯纤维膜裁成后规格为4cm×0.8cm/条，向剪裁好的膜上滴加实施例2中制备好的乳胶微球标记物64μL。喷涂完后在相对湿度为20％的环境中在37℃下烘干12h。25℃密封干燥保存。

实施例4抗原固相硝酸纤维素膜的制备：

将硝酸纤维素膜剪成4cm×2.3cm大小。将用硼砂缓冲液(0.1mol/L Na₂B₄O₇，pH8.5)将步骤1所得的肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)及羊抗鼠IgG多克隆抗体分别稀释成1.5mg/mL及1mg/mL；将稀释好的肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)装入BIODOT划膜仪喷头1中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线，其与硝酸纤维素膜的边距为0.8cm；将稀释好的羊抗鼠IgG多克隆抗体装入BIODOT划膜仪喷头2中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，其与检测线间距为0.7cm。包被完后将该硝酸纤维素膜放在相对湿度为20％的环境中，于37℃下烘干12h，25℃密封干燥保存。

实施例5样品垫的制备

配制不同配方的样品垫处理液，观察乳胶微球标记抗体的释放效果，通过多次正交试验优化，得到最优的样品垫处理液配方(0.01mol/L Na₂B₄O₇，2g/L氯化钠，20g/L酪蛋白，10ml/L吐温-20，10ml/L消泡剂S-17，pH 8.5)。取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液中浸泡3h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥12h后，剪裁成规格为4cm×3cm/条，25℃密封干燥保存，即制得样品垫。至此制得样品垫。经试验证实该样品垫的使用，大大提高了结合垫上乳胶微球标记抗体的释放率，达到了较好的应用效果。

实施例6吸水垫的裁剪

将购买于上海金标生物科技有限公司型号为CH37K的吸水滤纸剪裁成规格为4cm×3cm/条，备用。

实施例7PVC板的裁剪

将购买于上海金标生物科技有限公司型号为SM31的高白度PVC板剪裁成规格为4cm×8.5cm/条，备用。

实施例8试纸条的组装

如图1以及图2，将NC膜3、结合垫2、吸水垫4和样品垫1依次粘在单面PVC板5上，其中结合垫2、吸水垫4均层叠在NC膜3上，分别与NC膜3重叠约2mm，样品垫1层叠于结合2上，二者重叠约2mm。NC膜3上划有检测线T和质控线C。用斩切机将粘贴好的试纸板切成宽为4mm试纸条，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。

实施例9试纸条的使用方法

9.1)待检样本的处理

按常规方法获得待检者的血清100μL，加入样品稀释液(0.01mol/L Na₂B₄O₇，2g/L氯化钠，20ml/L吐温-20)400μL后，取出100μL作为待检样品。

9.2)加入待检样本，判定结果

取100μL样品加入随机抽取组装的试纸条中，样品液中的肺炎克雷伯菌抗体与结合垫上的乳胶微球标记的抗体结合并在层析作用下与检测线(T线)抗体结合，室温下作用10min，阳性结果出现两条红色线，即检测线T线和质控线C线；若检测样品中不含肺炎克雷伯菌抗体，阴性结果只在质控线C线出现一条红色线，显示该样品中没有肺炎克雷伯菌抗体。

实施例10试纸条的性能测定

10.1)特异性和敏感性分析

为了验证本发明的检测肺炎克雷伯菌抗体的乳胶微球免疫层析检测试纸条的特异性和敏感性，按照实施例8及实施例9所述的试纸条的组成和方法对80份经病原体分析及WB实验确证的肺炎克雷伯菌感染者阳性血清样本、100份非肺炎克雷伯菌感染者血清样本(WB实验确证阴性)进行检测(其中非肺炎克雷伯菌感染者血清样本包括：流感嗜血杆菌抗体阳性血清、肺炎支原体抗体阳性血清、肺炎链球菌抗体阳性血清、嗜肺军团菌抗体阳性血清及肺炎衣原体抗体阳性血清)；

用本发明检测试纸条检测结果如下：80份肺炎克雷伯菌感染者血清抗体均为阳性；100份非肺炎克雷伯菌感染者血清样本均为阴性，由此可得，特异性为100％，敏感性为100％。

10.2)稳定性试验

将试纸条干燥密封后分别置于4℃、25℃、37℃，并分别在6个月，12个月，18个月，21个月，24个月后用其检测肺炎克雷伯菌抗体阳性(WB确证)的血清稀释液，并观察结果。

将试纸条干燥密封后，分别在4℃和25℃放置6-24个月，仍能检测到强阳性结果；在37℃放置6-18个月，也能检测到阳性结果，但当放置21-24个月后，检测到的阳性结果减弱。表明该试纸条至少可在4℃或25℃保存2年。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110> 湖北工业大学

<120> 一种肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 921

<212> DNA

<213> Fepglpmlt基因序列(Fepglpmlt)

<400> 1

catatgaacg attaccgtaa caaaatcgaa gcaggttacg ctccggttta ccagaacaac 60

aaaggtaccg acctgtacca gtgggagaac gttccgaaag cggtagtaga aggcctggaa 120

ggcactctga acgtcccagt ttccgagacc gtaaactgga ccaacaacat cacttacatg 180

ctgcagagca agaacaagga aacaggcgac cgcctgtcta tcatcccgga atataccctg 240

aactctactc tgagctggca ggtacgtgat gacgtatccc tgcagtctac cttcggtggt 300

tctggtggtt ctggtggttc tggtggttct gaccgtctgg ttgtactgca cgatcattac 360

ttggaccgtg ttactgacgt tgctcagcgc ttccctcagc gtgcgcgcaa agacggtcgt 420

ttttacgcta tcgactttac cctggatgaa atcaaatctc tcaaattcac tgaaggtttc 480

gagcctaaaa acggcaaaaa cgttcaaacc tatcctggtc gtttcccgat gggtaaaagc 540

gattttcgca tccacacttt cgaagaggaa atcgaaggtg gttctggtgg ttctggtggt 600

tctggtggtt ctctggactc tccggtagac atctcccagc tggcagacat ggctggtatg 660

ccggtatcca aactgaagac cttcaacgca ggtgttaagg gctccactct gggcgcatct 720

ggtccgaaat acgtaatggt accgcagaaa cacgcagctc agctgcgtga atccctggca 780

tctggcgata tcgcagctgt acagccgacc cagctggctg acaacactcc cctgacctct 840

cgttcctaca aagtacgcag cggcgatact atctctggta ttgcttcccg cctgggcgtg 900

actactcgtg actaaggatc c 921

<210> 2

<211> 303

<212> PRT

<213> Fepglpmlt蛋白序列(Fepglpmlt)

<400> 2

Met Asn Asp Tyr Arg Asn Lys Ile Glu Ala Gly Tyr Ala Pro Val Tyr

1 5 10 15

Gln Asn Asn Lys Gly Thr Asp Leu Tyr Gln Trp Glu Asn Val Pro Lys

20 25 30

Ala Val Val Glu Gly Leu Glu Gly Thr Leu Asn Val Pro Val Ser Glu

35 40 45

Thr Val Asn Trp Thr Asn Asn Ile Thr Tyr Met Leu Gln Ser Lys Asn

50 55 60

Lys Glu Thr Gly Asp Arg Leu Ser Ile Ile Pro Glu Tyr Thr Leu Asn

65 70 75 80

Ser Thr Leu Ser Trp Gln Val Arg Asp Asp Val Ser Leu Gln Ser Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Arg Leu

100 105 110

Val Val Leu His Asp His Tyr Leu Asp Arg Val Thr Asp Val Ala Gln

115 120 125

Arg Phe Pro Gln Arg Ala Arg Lys Asp Gly Arg Phe Tyr Ala Ile Asp

130 135 140

Phe Thr Leu Asp Glu Ile Lys Ser Leu Lys Phe Thr Glu Gly Phe Glu

145 150 155 160

Pro Lys Asn Gly Lys Asn Val Gln Thr Tyr Pro Gly Arg Phe Pro Met

165 170 175

Gly Lys Ser Asp Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Glu Glu Ile Glu Gly

180 185 190

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Asp Ser Pro Val

195 200 205

Asp Ile Ser Gln Leu Ala Asp Met Ala Gly Met Pro Val Ser Lys Leu

210 215 220

Lys Thr Phe Asn Ala Gly Val Lys Gly Ser Thr Leu Gly Ala Ser Gly

225 230 235 240

Pro Lys Tyr Val Met Val Pro Gln Lys His Ala Ala Gln Leu Arg Glu

245 250 255

Ser Leu Ala Ser Gly Asp Ile Ala Ala Val Gln Pro Thr Gln Leu Ala

260 265 270

Asp Asn Thr Pro Leu Thr Ser Arg Ser Tyr Lys Val Arg Ser Gly Asp

275 280 285

Thr Ile Ser Gly Ile Ala Ser Arg Leu Gly Val Thr Thr Arg Asp

290 295 300

Claims

1.一种肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)的编码氨基酸序列是：

用于编码所述肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)的基因全序列是：

2.一种用于制备如权利要求1所述的肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)的方法，其特征在于：所述方法包括：

分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA、表面蛋白GlpQ及表面蛋白mltD的胞外结构域中抗原表位及免疫原性最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化该肽段基因编码序列，并将此三段基因序列用两段柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；

所述柔性连接肽的氨基酸序列是ggsggsggsggs；

所述Fepglpmlt的基因全序列是：

所述Fepglpmlt的编码氨基酸序列是：

所述Fepglpmlt基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA的550-645aa、表面蛋白GlpQ的69-150aa及表面蛋白mltD的268-367aa；三段蛋白序列以两段柔性连接肽进行连接；将此基因片段按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni²⁺亲和层析法纯化重组His-Fepglpmlt融合蛋白，冻干后保存备用；所述柔性连接肽的氨基酸序列是ggsggsggsggs。

3.一种肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸包括包被有肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)硝酸纤维素膜以及鼠抗人IgG单克隆抗体的乳胶微球标记物。

4.一种用于制备如权利要求3所述的肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1)制备肺炎克雷伯菌融合抗原(FepA+GlpQ+mltD)；

2)制备鼠抗人IgG单克隆抗体的乳胶微球标记物：

2.1)乳胶微球的活化

取浓度为10％的彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球溶液1mL，加入9mL MES缓冲液后混匀，加入NHS以及EDC，至二者的终浓度均为1mg/mL，在室温下缓慢混匀30分钟，孵育结束后19000g离心20分钟，去上清，沉淀用10mL硼砂缓冲液(0.1mol/L Na₂B₄O₇，pH8.5)重悬，振荡，超声处理后即成活化后的乳胶微球；所述MES缓冲液中组分及含量是：0.1mol/L MES，所述MES缓冲液的pH＝8.5；所述彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的粒径是100nm；所述硼砂缓冲液的组分及含量是：0.1mol/L Na₂B₄O₇，所述硼砂缓冲液的pH＝8.5；

2.2)乳胶微球标记物的制备

3)结合垫的制备：

4)抗原固相硝酸纤维素膜的制备：

5)样品垫的制备

6)试纸条的组装