CN110540600B

CN110540600B - 基于肺炎克雷伯菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法

Info

Publication number: CN110540600B
Application number: CN201811577961.3A
Authority: CN
Inventors: 杨波; 王猛; 胡征; 王毅
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN110540600A

Abstract

本发明涉及一种快速检测肺炎克雷伯菌的乳胶免疫层析试纸条的制备方法，该试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC板组成，结合垫上喷涂有彩色乳胶微球偶联的抗肺炎克雷伯菌表面蛋白多克隆抗体，硝酸纤维素膜包被有抗肺炎克雷伯菌表面蛋白多克隆抗体的检测线和羊抗兔IgG抗体的质控线。当加入的样品中含有肺炎克雷伯菌时，肺炎克雷伯菌首先与乳胶‑兔抗肺炎克雷伯菌表面蛋白多克隆抗体形成复合物，在毛细作用下迁移至包被有肺炎克雷伯菌表面蛋白多克隆抗体的检测线时被捕捉，检测线呈相应的彩色，因而可检测样品中是否含有肺炎克雷伯菌。该试纸条具有快速、简捷、灵敏度高，特异性好的优点。

Description

基于肺炎克雷伯菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于肺炎克雷伯菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，又称肺炎杆菌或Friedlander杆菌，是最早被认识可引起肺炎的革兰阴性杆菌。半个世纪以前，革兰阴性杆菌肺炎(gram-negative bacillary pneumonia，GNBP)曾被认为是一种非常少见的疾病，很少受到临床关注。除克雷白杆菌外，几乎没有关于革兰阴性杆菌(gram-negative bacterium，GNB)引起肺炎的报道。近二、三十年来，随着易感人群的改变、抗菌药物广泛应用与耐药菌的变迁以及各种微生物检测技术的提高与普及，GNBP已成为进入抗生素时代的现代医学的一种重要疾病。肺炎克雷伯菌常存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，是肠杆菌科克雷伯菌属中对人致病性较强的重要条件致病菌和医源性感染菌。据北京协和医院的统计，肺炎克雷伯杆菌肺炎的发病率为40.9％。世界范围的统计，肺炎克雷伯杆菌肺炎占全部肺炎1％～8％，仅次于铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌肺炎。社会获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)的实际调查受到诸多因素的限制，缺乏统一的报告。肺炎克雷伯杆菌肺炎占CAP中革兰阴性杆菌肺炎发病率的16％～64％，现认为肺炎克雷白杆菌是CAP常见的病原菌之一。

目前检测呼吸道中该病原体的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定法，该方法所需时间长，一般要2-3天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，而增菌液中往往还有PCR抑制剂，从而影响扩增的效果。同时，该技术还需要专业的检测设备，不适合进行床旁检测。以抗体为基础的免疫学检测已成为人体病原微生物检测不可或缺的重要技术手段。目前已发展了多种特异性免疫检测技术，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CIA)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中免疫乳胶试纸条等多种以抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点已成为病原微生物检测不可或缺的重要手段。因而，研究开发具有自主知识产权的病原微生物的抗体，是开发拥有自主知识产权的ELISA检测方法、乳胶微球标记检测法等的基础。

抗原成分的选择是检测特异性的关键。肺炎克雷伯菌ABC transportersubstrate-binding protein receptor、FepA、GlpQ及MltD蛋白均是位于细胞表面的重要分子，其保守性高，特异性强，抗原性强，表面暴露性高，是较为理想的检测标的物。本研究选用具有种间特异性的表面蛋白ABC transporter substrate-binding proteinreceptor、FepA、GlpQ及MltD等作为抗原，制备特异性良好的多克隆抗体，并将其应用于制备肺炎克雷伯菌乳胶微球免疫层析检测试纸条。

发明内容

本发明的目的是以多克隆抗体为基础，通过免疫乳胶标记技术研制一种操作简单、成本低廉、快捷迅速的检测肺炎克雷伯菌的乳胶微球免疫层析检测试纸条。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种基于肺炎克雷伯菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体制备：

分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-binding protein及表面蛋白FepA胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-bindingprotein及表面蛋白FepA在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_009653190及WP_012068422；所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Abcfep；

所述Abcfep的基因全序列是：

所述Abcfep基因编码的蛋白质序列是：

MEIEKSGTLKVATEDDYAPFNFMNNGQADGFNKDMLEELRKYAKFHVDQSILPWTGLLAAVSTGQYDMALTGAVITDERLKVFDFTPPWASAQHYFVKRAGDTSLNTIADLSGKKVGVQAGSALLARLPELKAMLEKTGGKLGPVVEYPSYPEAYADLANKRLDYVINVVISVNDLAKAKPKVFGGSGGSGGSGGSNDYRNKIEAGYAPVYQNNKGTDLYQWENVPKAVVEGLEGTLNVPVSETVNWTNNITYMLQSKNKETGDRLSIIPEYTLNSTLSWQVRDDVSLQSTFTWYGKQEPKKYNYKGQPVTGSEKNEVSPYSILGLSATWDVTKYVSLTGGV；

所述Abcfep基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transportersubstrate-binding protein的29-211aa及表面蛋白FepA的550-695aa；两段蛋白序列中间以柔性连接肽进行连接；将此基因片段按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni²⁺亲和层析法纯化重组His-Abcfep蛋白；将该重组蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体；

2)肺炎克雷伯菌表面蛋白(glpQ+mltD)抗体的制备：

分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白GlpQ及表面蛋白mltD胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化该肽段基因编码序列，并将此二段序列用刚性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述肺炎克雷伯菌表面蛋白GlpQ及表面蛋白mltD在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_004214637及WP_004210407；所述刚性连接肽的序列是eaaakeaaak；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Glpmlt；

所述Glpmlt基因全序列是：

所述Glpmlt编码的蛋白质序列是：

MDRLVVLHDHYLDRVTDVAQRFPQRARKDGRFYAIDFTLDEIKSLKFTEGFEPKNGKNVQTYPGRFPMGKSDFRIHTFEEEIEFVQGLNHSTGKNIGIYPEIKAPWFHHQEGKDIAASTLKVLKEYGYTSKQDKVYLQCFDANELKRIKNELEPKMGMDLNLVQLEAAAAKEAAAAKLDSPVDISQLADMAGMPVSKLKTFNAGVKGSTLGASGPKYVMVPQKHAAQLRESLASGDIAAVQPTQLADNTPLTSRSYKVRSGDTISGIASRLGVTTRDLQQWNNLRGSGLKVGQNLVIGAGSSAQRLANNSDSITYRVRKGDSLSSIA；

所述Glpmlt基因编码的蛋白质序列是肺炎克雷伯菌表面蛋白GlpQ的69-232aa及表面蛋白mltD的268-417aa，两个蛋白序列中间以刚性连接肽进行连接；将此基因片段按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni2+亲和层析法纯化重组His-Glpmlt蛋白；将该重组蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得肺炎克雷伯菌表面蛋白(glpQ+mltD)抗体；

3)制备肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体的乳胶微球标记物：

3.1)乳胶微球的活化

取浓度为10％的彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球溶液1mL，加入9mL MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)缓冲液后混匀，加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)以及EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，至二者的终浓度均为1mg/mL，在室温下缓慢混匀30分钟，孵育结束后19000g离心20分钟，去上清，沉淀用10mL硼砂缓冲液重悬，振荡，超声处理后即成活化后的乳胶微球；所述MES缓冲液中组分及含量是：0.1mol/L MES，所述MES缓冲液的pH＝8.5；所述彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的大小是100nm；所述硼砂缓冲液中组分含量为0.1mol/LNa₂B₄O₇，所述硼砂缓冲液的pH＝8.5；

3.2)乳胶微球标记物的制备

用硼砂缓冲液将步骤1)所得的肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体稀释成1mg/mL；取10mL肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体加入10mL活化乳胶微球，缓慢混匀30分钟后19000g离心10分钟，去上清；沉淀用10mL含有1％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，经超声粉碎后重复离心1次，去上清；沉淀同法重悬，经超声粉碎、振荡后重复离心1次，去上清；沉淀用10mL含有1％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，即为肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体的乳胶微球标记物；所述硼砂缓冲液中组分含量为0.1mol/L Na₂B₄O₇，所述硼砂缓冲液的pH＝8.5；

4)结合垫的制备：

向聚酯纤维材质的结合垫上喷涂步骤3)所得到的肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体的乳胶微球标记物，每平方厘米聚酯纤维膜的喷涂量为10μL乳胶微球标记物；喷涂完后在相对湿度不超过30％的环境中在37℃下烘干，25℃密封干燥保存；

5)抗体固相硝酸纤维素膜的制备：

用硼砂缓冲液将步骤2)所得的肺炎克雷伯菌表面蛋白(glpQ+mltD)抗体稀释成1.5mg/mL后用喷膜仪包被到硝酸纤维素膜上的检测线位置作为检测线捕获抗体，包被参数为1μL/cm；将羊抗兔IgG喷涂到硝酸纤维素膜上的质控线位置作为控制线捕获抗体，浓度为1mg/mL，包被参数为1μL/cm；包被完后将该硝酸纤维素膜放在相对湿度不超过30％的环境中，于37℃下烘干，25℃密封干燥保存；所述硼砂缓冲液中组分含量为0.1mol/L Na₂B₄O₇，所述硼砂缓冲液的pH＝8.5；

6)样品垫的制备

取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成所需的规格，25℃密封干燥保存；至此制得样品垫；

所述样品垫处理液中各组分含量分别是：0.01mol/L Na₂B₄O₇、2g/L氯化钠、20g/L酪蛋白、10ml/L吐温-20以及10ml/L消泡剂S-17；所述样品垫处理液的pH＝8.5；

7)试纸条的组装

分别将吸水滤纸材质的吸水垫、抗体固相硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、依次粘贴在PVC底板上，硝酸纤维素膜上所述质控线靠近吸水垫端，所述检测线靠近样品垫端，再切割成一定宽度的试纸条，密封包装，干燥低温保存；至此制得肺炎克雷伯菌乳胶微球免疫层析检测试纸条。

本发明的优点是：

(1)本发明采用表面结构分析，基因优化等方式，构建了两个全新的融合基因，通过可溶性过量表达，首次成功获得了可溶性的重组ABC transporter substrate-bindingprotein/FepA融合蛋白及GlpQ/mltD融合蛋白。该两种融合蛋白表达量高，制备成本低廉，蛋白可溶性好，抗原性强，用其制备抗体效价高，成本低。

(2)本发明首次利用肺炎克雷伯菌表面上的四个蛋白暴露区制备的抗体效价高，针对的抗原位点多，捕获力强，不存在位点竞争问题，试纸条灵敏度高。其对肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC700603的检测灵敏度达到2×10⁴CFU/mL，明显高于微生物传统检测方法，并且具有快速、高效等优点。

(3)该试纸条特异性好，用6株肺炎克雷伯菌菌株和18株非肺炎克雷伯菌标准菌株(包含绝大部分呼吸道常见病原体)进行的特异性实验，结果显示本发明的试纸条具有良好的特异性和稳定性，其可检出所有所试的肺炎克雷伯菌，而与所有非肺炎克雷伯菌标准菌株均无交叉反应，十分适合临床非诊断性应用。

(4)该试纸条在常温下可保质两年，有效延长保质期并降低保存条件；非专业人士用该检测试纸即可完成全程检测，操作简单，有利于该法的推广和普及；整个检测过程最快可以在10min内完成，更适合于床旁检测。

附图说明

图1是本发明所提供的基于肺炎克雷伯菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的爆炸结构示意图；

图2是本发明所提供的基于肺炎克雷伯菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的结构示意图；

其中：

1-样品垫；2-结合垫；3-NC膜；4-吸水垫；5-PVC板。

具体实施方式

本发明通过以下实施例作进一步具体描述。

本发明使用或采用的各种材料的来源

1、乳胶微球：本发明中所用乳胶微球为羧基化修饰的聚苯乙烯乳胶微球，为上海甄准生物科技有限公司产品，粒径为100nm，颜色为红色，产品的平均直径公差在10％以内，形式为10％固体水悬液，产品货号MSI-CAR100NM。

2、玻璃纤维素膜：厚度为0.45-0.55mm，吸水量为600-800mg/m²，玻璃纤维直径为0.6-3μm，具有良好的亲水性，购买于上海金标生物科技有限公司(型号为BT50)。

3、聚酯纤维膜：厚度为0.25-0.35mm，爬速为15-40mm/60s，具有极好的亲水性，用于结合垫的制备，购买于上海金标生物科技有限公司(型号为VL98)。

4、硝酸纤维素膜：型号为Millipore Corp SHF135，有衬板，购买于Millipore公司。

5、吸水滤纸：厚度为0.95mm，吸水速度为60s/4cm，吸水量为700mg/cm²，具有良好的吸水性，作为制作吸水垫的材料。购买于上海金标生物科技有限公司(型号为CH37K)。

6、底板：为高白度PVC材质，表面涂布单层高聚合物压敏胶SM31，购买于上海金标生物科技有限公司。

7、本发明所用到的微生物样品均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

8、pET28a(+)：大肠杆菌表达载体，从美国Novagen公司引进。

9、大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)：购自上海北诺生物科技有限公司。

10、羊抗兔IgG：为博士德生物工程有限公司产品，产品货号BA1039，浓度为1mg/ml。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1

肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体的制备：

1.1)肺炎克雷伯菌Abcfep融合基因的克隆

获取肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-binding protein及FepA(其NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_009653190及WP_012068422)胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到其基因编码序列，优化其基因编码序列，并将此二序列用柔性连接肽(ggsggsggsggs)的编码序列进行连接，形成融合基因。同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Abcfep。其基因全序列及编码的氨基酸序列如序列表所示。具体的说，Abcfep基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-bindingprotein的29-211aa及表面蛋白FepA的550-695aa，两个蛋白序列中间以柔性连接肽(ggsggsggsggs)进行连接。将此基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因化学合成，交货时该人工合成的基因片段连于载体pUC57上。将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI及BamHI进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用。同时采用NdeI及BamHI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规分子生物学方法将经双酶切后获得的Abcfep基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET-Abcfep表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组Abcfep融合蛋白。

1.2)肺炎克雷伯菌Abcfep融合蛋白的表达与纯化

将上述鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coliBL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株。挑取pET-Abcfep转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培养基中，于37℃培养过夜。取出菌液后，按1：100接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于30℃培养至OD600＝0.6时，加入1mol/L IPTG至终浓度为0.5mmol/L，于18℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导12h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用50mLBuffer A(50mM Na₃PO₄，0.5M NaCl；pH7.4)洗涤3次并用50mL上样缓冲液(50mMNa₃PO₄，0.5M NaCl；5mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超声破碎，操作条件为：功率50W，工作时间2s，间隔时间3s，报警温度60℃，总时间30min。超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组Abcfep融合蛋白以部分溶解形式存在于菌体中(另一部分以包涵体形式存在)。薄层扫描显示，该重组蛋白占细菌总蛋白的30％以上。而将未经优化的野生型Abcfep基因按上述方式进行表达，则未检测到表达产物，说明基因优化效果突出。将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用His Trap affinitycolumns(GEhealthcare公司产品)，按照说明书的方法进行重组Abcfep蛋白的纯化。具体方法如下：

1.2.1)连接层析系统，该系统包括进样管、蠕动泵(上海沪西分析仪器厂，型号DHL-A)、层析柱(GE healthcare公司产品,商品名His Trap affinity columns)及紫外检测器(上海沪西分析仪器厂，型号HD1)，柱体积为2ml，预热紫外检测仪30min左右至读数稳定；

1.2.2)校对T％：调节光亮旋钮至显示100％；

1.2.3)旋转灵敏度至合适位置，一般用0.2A；

1.2.4)以上样缓冲液平衡层析系统，至读数稳定后旋转“调零”至显示“000”；

1.2.5)上蛋白样品，流速控制在5ml/min以内，收集穿透液；

1.2.6)用上样缓冲液洗去未结合的蛋白，此过程中记录读数，直到读数不再变化为止，收集洗脱液；

1.2.7)用Buffer A+10mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；

1.2.8)用Buffer A+20mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；

1.2.9)用Buffer A+40mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

1.2.10)用Buffer A+100mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

1.2.11)用Buffer A+150mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

1.2.12)取各洗脱峰样品100ul进行SDS-PAGE电泳；

1.2.13)结果发现，目标蛋白在100mM咪唑时被洗脱下来，纯度在90％以上，经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL，备用。至此制得肺炎克雷伯菌Abcfep融合蛋白。

1.3)肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体的制备

1.3.1)将步骤(1.2)所制肺炎克雷伯菌Abcfep融合蛋白与福氏完全佐剂混合，乳化后作为免疫原免疫雄性新西兰兔2只，每只兔子皮下注射总量为2ml，抗原总量为2mg/只。后每隔两周用Abcfep融合蛋白与福氏不完全佐剂形成的乳化液免疫一次，共免疫5次，抗原用量与初次免疫相同。五免后3-5天进行心脏大量取血，置37℃1小时，然后放冰箱4℃过夜，隔天取血清。

1.3.2)多克隆抗体效价的测定

以Abcfep融合蛋白为包被抗原，包被浓度为5μg/ml，每孔包被100μl，利用间接ELISA法检测血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为：1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400、1：204800；

ELISA板包被牛血清白蛋白作为阴性对照，用酶联检测仪测定OD450，满足P/N值＞2.1为阳性。结果显示2只兔子的血清抗体效价均达到1：102400，说明免疫效果较好。

1.3.3)多克隆抗体的提取

用GE-HiTrap Protein A HP预装柱，按说明书纯化抗体，具体操作如下：

1.3.3.1)取5mL抗血清，加入0.5mL 1M Tris(pH8.0)调节到pH8.0，20，000g离心20min除去沉淀。

1.3.3.2)上柱后用10倍柱体积buffer A(100mM Tris-Cl，pH 8.0)洗涤后，再用10倍柱体积buffer B(10mM Tris-Cl，pH 8.0)洗涤。

1.3.3.3)用大约三倍柱体积的IgG洗脱缓冲液(100mM glycine，pH 3.0)洗脱IgG。(收集管内先预装0.1mL IgG-中和缓冲液(1M Tris-Cl，pH 8.0)，每管装0.9mL洗脱液)

1.3.3.4)用50倍体积Tris(10mM Tris-Cl，pH 8.0)对洗脱液进行透析。

1.3.3.5)超滤浓缩后，调整浓度为5mg/ml，-70℃保存备用。至此制得肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体。

实施例2

肺炎克雷伯菌表面蛋白(glpQ+mltD)抗体的制备：

2.1)肺炎克雷伯菌Glpmlt融合基因的克隆

获取肺炎克雷伯菌表面蛋白GlpQ及mltD(其NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为WP_004214637及WP_004210407)其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到其基因编码序列，优化其基因编码序列，并将此二序列用刚性连接肽(eaaakeaaak)的编码序列进行连接，形成融合基因。同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Glpmlt。其基因全序列及编码的氨基酸序列如序列表所示。具体的说，Glpmlt基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白GlpQ的69-232aa及表面蛋白mltD的268-417aa，两个蛋白序列中间以刚性连接肽(eaaakeaaak)进行连接。将此基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因化学合成，交货时该人工合成的基因片段连于载体pUC57上。将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI及BamHI进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用。同时采用NdeI及BamHI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规分子生物学方法将经双酶切后获得的Glpmlt基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET-Glpmlt表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组Glpmlt融合蛋白。

2.2)肺炎克雷伯菌Glpmlt融合蛋白的表达与纯化

将上述鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coliBL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株。挑取pET-Glpmlt转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培养基中，于37℃培养过夜。取出菌液后，按1：100接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于30℃培养至OD600＝0.6时，加入1mol/L IPTG至终浓度为0.5mmol/L，于37℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用50mLBuffer A(50mM Na₃PO₄，0.5M NaCl；pH7.4)洗涤3次并用50mL上样缓冲液(50mM Na₃PO₄，0.5M NaCl；5mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超声破碎，操作条件为：功率50W，工作时间2s，间隔时间3s，报警温度60℃，总时间30min。超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组Glpmlt融合蛋白以溶解形式存在于菌体中。薄层扫描显示，该重组蛋白占细菌总蛋白的20％以上。而将未经优化的野生型Glpmlt基因按上述方式进行表达，则未检测到表达产物，说明基因优化效果突出。说明基因优化后融合蛋白获得了较高的表达量。将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用His Trap affinitycolumns(GE healthcare公司产品)，按照说明书的方法进行重组Glpmlt蛋白的纯化。具体方法如下：

(1)连接层析系统，该系统包括进样管、蠕动泵(上海沪西分析仪器厂，型号DHL-A)、层析柱(GE healthcare公司产品,商品名His Trap affinity columns)及紫外检测器(上海沪西分析仪器厂，型号HD1)，柱体积为2ml，预热紫外检测仪30min左右至读数稳定；

(2)校对T％：调节光亮旋钮至显示100％；

(3)旋转灵敏度至合适位置，一般用0.2A；

(4)以上样缓冲液平衡层析系统，至读数稳定后旋转“调零”至显示“000”；

(5)上蛋白样品，流速控制在5ml/min以内，收集穿透液；

(6)用上样缓冲液洗去未结合的蛋白，此过程中记录读数，直到读数不再变化为止，收集洗脱液；

(7)用Buffer A+10mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；

(8)用Buffer A+20mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；

(9)用Buffer A+40mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

(10)用Buffer A+60mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

(11)用Buffer A+100mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

(12)用Buffer A+150mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

(13)取各洗脱峰样品100ul进行SDS-PAGE电泳；

(14)结果发现，目标蛋白在60mM咪唑时被洗脱下来，纯度在90％以上，经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL，备用。至此制得肺炎克雷伯菌Glpmlt融合蛋白。

2.3)肺炎克雷伯菌表面蛋白(glpQ+mltD)抗体的制备

2.3.1)将步骤2.2)所制肺炎克雷伯菌Glpmlt融合蛋白与福氏完全佐剂混合，乳化后作为免疫原免疫雄性新西兰兔2只，每只兔子皮下注射总量为2ml，抗原总量为2mg/只。后每隔两周用Glpmlt融合蛋白与福氏不完全佐剂形成的乳化液免疫一次，共免疫5次，抗原用量与初次免疫相同。五免后3-5天进行心脏大量取血，置37℃1小时，然后放冰箱4℃过夜，隔天取血清。

2.3.2)多克隆抗体效价的测定

以Glpmlt融合蛋白为包被抗原，包被浓度为5μg/ml，每孔包被100μl，利用间接ELISA法检测血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为：1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400、1：204800；

2.3.3)多克隆抗体的提取

2.3.3.1)取5mL抗血清，加入0.5mL 1M Tris(pH8.0)调节到pH8.0，20，000g离心20min除去沉淀。

2.3.3.2)上柱后用10倍柱体积buffer A(100mM Tris-Cl，pH 8.0)洗涤后，再用10倍柱体积buffer B(10mM Tris-Cl，pH 8.0)洗涤。

2.3.3.3)用大约三倍柱体积的IgG洗脱缓冲液(100mM glycine，pH 3.0)洗脱IgG。(收集管内先预装0.1mL IgG-中和缓冲液(1M Tris-Cl，pH 8.0)，每管装0.9mL洗脱液)

2.3.3.4)用50倍体积Tris(10mM Tris-Cl，pH 8.0)对洗脱液进行透析。

2.3.3.5)超滤浓缩后，调整浓度为5mg/ml，-70℃保存备用。至此制得肺炎克雷伯菌表面蛋白(glpQ+mltD)抗体。

实施例3

制备肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体的乳胶微球标记物：

3.1)乳胶微球的活化

取浓度为10％的红色羧基化聚苯乙烯乳胶微球(100nm)溶液1mL，加入9mL 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)缓冲液(0.1mol/L MES，pH8.5)后混匀；用MES缓冲液配制10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液；

将1mL NHS溶液以及1mLEDC溶液依次加入聚苯乙烯乳胶微球(100nm)溶液中，在室温下缓慢混匀30分钟，孵育结束后19000g离心20分钟，去上清，沉淀用10mL硼砂缓冲液(0.1mol/L Na₂B₄O₇，pH8.5)重悬，振荡，超声处理(超声破碎仪产品型号：YJ92-IIDN，功率50W，工作时间2s，间隔时间3s，报警温度60℃，总时间30min)后即成活化后的乳胶微球。

3.2)乳胶微球标记物的制备

用硼砂缓冲液(0.1mol/L Na₂B₄O₇，pH8.5)将步骤1所得的肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体稀释成1mg/mL。取10mL肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体加入10mL活化乳胶微球，缓慢混匀30分钟后19000g离心10分钟，去上清。沉淀用10mL含有1％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，经超声粉碎(超声破碎仪产品型号：YJ92-IIDN，功率50W，工作时间2s，间隔时间3s，报警温度60℃，总时间30min)后19000g重复离心1次(10分钟)，去上清。沉淀同法重悬，经超声粉碎后再19000g重复离心1次(10分钟)，去上清。沉淀用10mL含有1％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，即为肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC+fepA)抗体的乳胶微球标记物。

实施例4

结合垫的制备：

将聚酯纤维膜裁成后规格为4cm×0.8cm/条，向剪裁好的膜上滴加实施例3中制备好的乳胶微球标记物32μL。喷涂完后在相对湿度为20％的环境中在37℃下烘干12h。25℃密封干燥保存。

实施例5

抗体固相硝酸纤维素膜的制备：

将硝酸纤维素膜剪成4cm×2.3cm大小。将用硼砂缓冲液(0.1mol/L Na₂B₄O₇，pH8.5)将实施例2所得的肺炎克雷伯菌表面蛋白(glpQ+mltD)抗体及羊抗兔IgG分别稀释成1.5mg/mL及1mg/mL；将稀释好的肺炎克雷伯菌表面蛋白(glpQ+mltD)抗体装入BIODOT划膜仪喷头1中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线，其与硝酸纤维素膜的边距为0.8cm；将稀释好的羊抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头2中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，其与检测线间距为0.7cm。包被完后将该硝酸纤维素膜放在相对湿度为20％的环境中，于37℃下烘干12h，25℃密封干燥保存。

实施例6

样品垫的制备：

配制不同配方的样品垫处理液，观察乳胶微球标记抗体的释放效果，通过多次正交试验优化，得到最优的样品垫处理液配方(0.01mol/L Na₂B₄O₇，2g/L氯化钠，20g/L酪蛋白，10ml/L吐温-20，10ml/L消泡剂S-17，pH 8.5)。取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液中浸泡3h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥12h后，剪裁成规格为4cm×3cm/条，25℃密封干燥保存，即制得样品垫。至此制得样品垫。经试验证实该样品垫的使用，大大提高了结合垫上乳胶微球标记抗体的释放率，达到了较好的应用效果。

实施例7吸水垫的裁剪

将购买于上海金标生物科技有限公司型号为CH37K的吸水滤纸剪裁成规格为4cm×3cm/条，备用。

实施例8 PVC板的裁剪

将购买于上海金标生物科技有限公司型号为SM31的高白度PVC板剪裁成规格为4cm×8.5cm/条，备用。

实施例9试纸条的组装

如图1以及图2，将NC膜3、结合垫2、吸水垫4和样品垫1依次粘在单面PVC板5上，其中结合垫2、吸水垫4均层叠在NC膜3上，分别与NC膜3重叠约2mm，样品垫1层叠于结合2上，二者重叠约2mm。NC膜3上划有检测线T和质控线C。用斩切机将粘贴好的试纸板切成宽为4mm试纸条，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。

实施例10

试纸条的使用方法：

10.1)待检样本的处理

按常规方法获得待检者的咽拭子，将其插入装有500μL的样品处理液(0.01mol/LNa₂B₄O₇，2g/L氯化钠，20ml/L吐温-20)的软质塑料管中，挤压塑料管壁，使拭子上的样品充分溶解。

10.2)加入待检样本，判定结果

取100μL样品加入随机抽取组装的试纸条中，样品液中的肺炎克雷伯菌与结合垫上的乳胶微球标记的抗体结合并在层析作用下与检测线(T线)抗体结合，室温下作用10min，阳性结果出现两条红色线，即检测线T线和质控线C线；若检测样品中不含肺炎克雷伯菌，阴性结果只在质控线C线出现一条红色线，显示该样品中没有肺炎克雷伯菌。

实施例11

试纸条的性能测定：

11.1)特异性分析

为了验证本发明的检测肺炎克雷伯菌的乳胶微球免疫层析检测试纸条的特异性，按照实施例9及实施例10所述的试纸条的组成和使用方法对浓度均为2×10⁵CFU/mL的6株肺炎克雷伯菌菌株及17株非肺炎克雷伯菌标准菌株进行了检测，见表1。结果表明，本发明试纸条对所有6株肺炎克雷伯菌菌株的检测结果均为阳性，而对其他17株呼吸道常见病原微生物的检测结果均为阴性。该试纸条显示出良好的特异性。

表1

同时，对浓度为2×10⁵CFU/mL的120株肺炎克雷伯菌临床分离株用本试纸条进行检测，结果均显示阳性，显示出该试纸条对临床分离的人肺炎克雷伯菌的高度检测覆盖性。

11.2)敏感性测定

将肺炎克雷伯菌ATCC700603菌株接种于羊血巧克力培养基，35℃培养36小时后，生理盐水10倍梯度稀释，同时平板计数，得到菌体浓度为10⁸-10³CFU/mL的菌体溶液，然后将100μL菌体溶液滴加于样品垫上，按照实施例7及实施例8所述的试纸条组成和使用方法将进行检测。结果表明本发明试剂盒的检测敏感性为2×10⁴CFU/mL。

11.3)稳定性试验

将试纸条干燥密封后分别置于4℃、25℃、37℃，并分别在6个月，12个月，18个月，21个月，24个月后用其检测肺炎克雷伯菌ATCC700603的生理盐水稀释液，并观察结果。

将试纸条干燥密封后，分别在4℃和25℃放置6-24个月，仍能检测到强阳性结果；在37℃放置6-18个月，也能检测到阳性结果，但当放置21-24个月后，检测到的阳性结果减弱。表明该试纸条至少可在4℃或25℃保存2年。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110> 湖北工业大学

<120> 基于肺炎克雷伯菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> Abcfep基因序列(Abcfep)

<400> 1

catatggaaa tcgaaaaaag cggtactctg aaagttgcaa ccgaggacga ctatgcaccg 60

ttcaacttca tgaacaacgg ccaagctgac ggcttcaaca aagacatgct ggaagaactg 120

cgtaagtatg cgaaattcca tgtggaccaa agcatcctgc cgtggactgg cctgctggca 180

gccgtatcta ctggccagta cgacatggca ctgaccggcg cagttatcac cgacgaacgt 240

ctgaaagttt tcgacttcac tccgccgtgg gcatccgctc agcattactt cgttaaacgt 300

gcaggcgaca cctctctgaa cactattgca gacttgtccg gtaagaaagt tggcgtacag 360

gcaggtagcg ctctgctggc acgtctgccg gaactgaaag caatgctgga gaaaactggc 420

ggtaaattag gcccggtggt tgaatatccg tcttacccgg aagcatacgc tgacctggct 480

aacaaacgtc tggattatgt tatcaacgtt gttatctccg ttaacgacct ggcaaaagct 540

aaaccgaagg ttttcggtgg ttctggtggt tctggtggtt ctggtggttc taacgattac 600

cgtaacaaaa tcgaagcagg ttacgctccg gtttaccaga acaacaaagg taccgacctg 660

taccagtggg agaacgttcc gaaagcggta gtagaaggcc tggaaggcac tctgaacgtc 720

ccagtttccg agaccgtaaa ctggaccaac aacatcactt acatgctgca gagcaagaac 780

aaggaaacag gcgaccgcct gtctatcatc ccggaatata ccctgaactc tactctgagc 840

tggcaggtac gtgatgacgt atccctgcag tctaccttca cctggtacgg caaacaggaa 900

ccgaagaaat acaactacaa aggccagccg gttaccggtt ctgaaaaaaa cgaagtatcc 960

ccgtactcta tcctgggtct gtccgcaaca tgggacgtta ctaagtatgt ctctctgacc 1020

ggtggcgtat aaggatcc 1038

<210> 2

<211> 342

<212> PRT

<213> Abcfep蛋白序列(Abcfep)

<400> 2

Met Glu Ile Glu Lys Ser Gly Thr Leu Lys Val Ala Thr Glu Asp Asp

1 5 10 15

Tyr Ala Pro Phe Asn Phe Met Asn Asn Gly Gln Ala Asp Gly Phe Asn

20 25 30

Lys Asp Met Leu Glu Glu Leu Arg Lys Tyr Ala Lys Phe His Val Asp

35 40 45

Gln Ser Ile Leu Pro Trp Thr Gly Leu Leu Ala Ala Val Ser Thr Gly

50 55 60

Gln Tyr Asp Met Ala Leu Thr Gly Ala Val Ile Thr Asp Glu Arg Leu

65 70 75 80

Lys Val Phe Asp Phe Thr Pro Pro Trp Ala Ser Ala Gln His Tyr Phe

85 90 95

Val Lys Arg Ala Gly Asp Thr Ser Leu Asn Thr Ile Ala Asp Leu Ser

100 105 110

Gly Lys Lys Val Gly Val Gln Ala Gly Ser Ala Leu Leu Ala Arg Leu

115 120 125

Pro Glu Leu Lys Ala Met Leu Glu Lys Thr Gly Gly Lys Leu Gly Pro

130 135 140

Val Val Glu Tyr Pro Ser Tyr Pro Glu Ala Tyr Ala Asp Leu Ala Asn

145 150 155 160

Lys Arg Leu Asp Tyr Val Ile Asn Val Val Ile Ser Val Asn Asp Leu

165 170 175

Ala Lys Ala Lys Pro Lys Val Phe Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

180 185 190

Ser Gly Gly Ser Asn Asp Tyr Arg Asn Lys Ile Glu Ala Gly Tyr Ala

195 200 205

Pro Val Tyr Gln Asn Asn Lys Gly Thr Asp Leu Tyr Gln Trp Glu Asn

210 215 220

Val Pro Lys Ala Val Val Glu Gly Leu Glu Gly Thr Leu Asn Val Pro

225 230 235 240

Val Ser Glu Thr Val Asn Trp Thr Asn Asn Ile Thr Tyr Met Leu Gln

245 250 255

Ser Lys Asn Lys Glu Thr Gly Asp Arg Leu Ser Ile Ile Pro Glu Tyr

260 265 270

Thr Leu Asn Ser Thr Leu Ser Trp Gln Val Arg Asp Asp Val Ser Leu

275 280 285

Gln Ser Thr Phe Thr Trp Tyr Gly Lys Gln Glu Pro Lys Lys Tyr Asn

290 295 300

Tyr Lys Gly Gln Pro Val Thr Gly Ser Glu Lys Asn Glu Val Ser Pro

305 310 315 320

Tyr Ser Ile Leu Gly Leu Ser Ala Thr Trp Asp Val Thr Lys Tyr Val

325 330 335

Ser Leu Thr Gly Gly Val

340

<210> 3

<211> 993

<212> DNA

<213> Glpmlt基因序列(Glpmlt)

<400> 3

catatggacc gtctggttgt actgcacgat cattacttgg accgtgttac tgacgttgct 60

cagcgcttcc ctcagcgtgc gcgcaaagac ggtcgttttt acgctatcga ctttaccctg 120

gatgaaatca aatctctcaa attcactgaa ggtttcgagc ctaaaaacgg caaaaacgtt 180

caaacctatc ctggtcgttt cccgatgggt aaaagcgatt ttcgcatcca cactttcgaa 240

gaggaaatcg aattcgtaca gggtctcaac cactctactg gtaaaaacat cggtatctac 300

ccggaaatca aagcaccgtg gttccaccac caggaaggta aagacatcgc tgcttccacc 360

ctcaaagttc tgaaagaata cggttacacc tctaagcagg ataaagtgta cctgcagtgc 420

ttcgacgcta atgaactgaa gcgtatcaaa aacgaactgg agccgaaaat gggcatggac 480

ctgaacctgg tacagctgga agctgctgct gctaaagaag ctgctgctgc taaactggac 540

tctccggtag acatctccca gctggcagac atggctggta tgccggtatc caaactgaag 600

accttcaacg caggtgttaa gggctccact ctgggcgcat ctggtccgaa atacgtaatg 660

gtaccgcaga aacacgcagc tcagctgcgt gaatccctgg catctggcga tatcgcagct 720

gtacagccga cccagctggc tgacaacact cccctgacct ctcgttccta caaagtacgc 780

agcggcgata ctatctctgg tattgcttcc cgcctgggcg tgactactcg tgacctccag 840

cagtggaaca acctgcgtgg ctctggtctg aaagttggcc agaacctggt gatcggtgct 900

ggctccagcg cacagcgtct ggccaacaac tctgattcta tcacataccg cgtacgtaag 960

ggtgactctc tgtcctctat cgcttaagga tcc 993

<210> 4

<211> 327

<212> PRT

<213> Glpmlt蛋白序列(Glpmlt)

<400> 4

Met Asp Arg Leu Val Val Leu His Asp His Tyr Leu Asp Arg Val Thr

1 5 10 15

Asp Val Ala Gln Arg Phe Pro Gln Arg Ala Arg Lys Asp Gly Arg Phe

20 25 30

Tyr Ala Ile Asp Phe Thr Leu Asp Glu Ile Lys Ser Leu Lys Phe Thr

35 40 45

Glu Gly Phe Glu Pro Lys Asn Gly Lys Asn Val Gln Thr Tyr Pro Gly

50 55 60

Arg Phe Pro Met Gly Lys Ser Asp Phe Arg Ile His Thr Phe Glu Glu

65 70 75 80

Glu Ile Glu Phe Val Gln Gly Leu Asn His Ser Thr Gly Lys Asn Ile

85 90 95

Gly Ile Tyr Pro Glu Ile Lys Ala Pro Trp Phe His His Gln Glu Gly

100 105 110

Lys Asp Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys Val Leu Lys Glu Tyr Gly Tyr

115 120 125

Thr Ser Lys Gln Asp Lys Val Tyr Leu Gln Cys Phe Asp Ala Asn Glu

130 135 140

Leu Lys Arg Ile Lys Asn Glu Leu Glu Pro Lys Met Gly Met Asp Leu

145 150 155 160

Asn Leu Val Gln Leu Glu Ala Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala

165 170 175

Lys Leu Asp Ser Pro Val Asp Ile Ser Gln Leu Ala Asp Met Ala Gly

180 185 190

Met Pro Val Ser Lys Leu Lys Thr Phe Asn Ala Gly Val Lys Gly Ser

195 200 205

Thr Leu Gly Ala Ser Gly Pro Lys Tyr Val Met Val Pro Gln Lys His

210 215 220

Ala Ala Gln Leu Arg Glu Ser Leu Ala Ser Gly Asp Ile Ala Ala Val

225 230 235 240

Gln Pro Thr Gln Leu Ala Asp Asn Thr Pro Leu Thr Ser Arg Ser Tyr

245 250 255

Lys Val Arg Ser Gly Asp Thr Ile Ser Gly Ile Ala Ser Arg Leu Gly

260 265 270

Val Thr Thr Arg Asp Leu Gln Gln Trp Asn Asn Leu Arg Gly Ser Gly

275 280 285

Leu Lys Val Gly Gln Asn Leu Val Ile Gly Ala Gly Ser Ser Ala Gln

290 295 300

Arg Leu Ala Asn Asn Ser Asp Ser Ile Thr Tyr Arg Val Arg Lys Gly

305 310 315 320

Asp Ser Leu Ser Ser Ile Ala

325

Claims

1.一种肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA的蛋白质序列是：

用于编码肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA的蛋白质的基因全序列是：

CATATGGAAATCGAAAAAAGCGGTACTCTGAAAGTTGCAACCGAGGACGACTATGCACCGTTCAACTTCATGAACAACGGCCAAGCTGACGGCTTCAACAAAGACATGCTGGAAGAACTGCGTAAGTATGCGAAATTCCATGTGGACCAAAGCATCCTGCCGTGGACTGGCCTGCTGGCAGCCGTATCTACTGGCCAGTACGACATGGCACTGACCGGCGCAGTTATCACCGACGAACGTCTGAAAGTTTTCGACTTCACTCCGCCGTGGGCATCCGCTCAGCATTACTTCGTTAAACGTGCAGGCGACACCTCTCTGAACACTATTGCAGACTTGTCCGGTAAGAAAGTTGGCGTACAGGCAGGTAGCGCTCTGCTGGCACGTCTGCCGGAACTGAAAGCAATGCTGGAGAAAACTGGCGGTAAATTAGGCCCGGTGGTTGAATATCCGTCTTACCCGGAAGCATACGCTGACCTGGCTAACAAACGTCTGGATTATGTTATCAACGTTGTTATCTCCGTTAACGACCTGGCAAAAGCTAAACCGAAGGTTTTCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTAACGATTACCGTAACAAAATCGAAGCAGGTTACGCTCCGGTTTACCAGAACAACAAAGGTACCGACCTGTACCAGTGGGAGAACGTTCCGAAAGCGGTAGTAGAAGGCCTGGAAGGCACTCTGAACGTCCCAGTTTCCGAGACCGTAAACTGGACCAACAACATCACTTACATGCTGCAGAGCAAGAACAAGGAAACAGGCGACCGCCTGTCTATCATCCCGGAATATACCCTGAACTCTACTCTGAGCTGGCAGGTACGTGATGACGTATCCCTGCAGTCTACCTTCACCTGGTACGGCAAACAGGAACCGAAGAAATACAACTACAAAGGCCAGCCGGTTACCGGTTCTGAAAAAAACGAAGTATCCCCGTACTCTATCCTGGGTCTGTCCGCAACATGGGACGTTACTAAGTATGTCTCTCTGACCGGTGGCGTATAAGGATCC。

2.一种肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA的制备方法，其特征在于：所述方法是：分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-binding protein及表面蛋白FepA胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；

所述肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-binding protein及表面蛋白FepA在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_009653190及WP_012068422；

所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs；

同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Abcfep；

所述Abcfep的基因全序列是：

CATATGGAAATCGAAAAAAGCGGTACTCTGAAAGTTGCAACCGAGGACGACTATGCACCGTTCAACTTCATGAACAACGGCCAAGCTGACGGCTTCAACAAAGACATGCTGGAAGAACTGCGTAAGTATGCGAAATTCCATGTGGACCAAAGCATCCTGCCGTGGACTGGCCTGCTGGCAGCCGTATCTACTGGCCAGTACGACATGGCACTGACCGGCGCAGTTATCACCGACGAACGTCTGAAAGTTTTCGACTTCACTCCGCCGTGGGCATCCGCTCAGCATTACTTCGTTAAACGTGCAGGCGACACCTCTCTGAACACTATTGCAGACTTGTCCGGTAAGAAAGTTGGCGTACAGGCAGGTAGCGCTCTGCTGGCACGTCTGCCGGAACTGAAAGCAATGCTGGAGAAAACTGGCGGTAAATTAGGCCCGGTGGTTGAATATCCGTCTTACCCGGAAGCATACGCTGACCTGGCTAACAAACGTCTGGATTATGTTATCAACGTTGTTATCTCCGTTAACGACCTGGCAAAAGCTAAACCGAAGGTTTTCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTAACGATTACCGTAACAAAATCGAAGCAGGTTACGCTCCGGTTTACCAGAACAACAAAGGTACCGACCTGTACCAGTGGGAGAACGTTCCGAAAGCGGTAGTAGAAGGCCTGGAAGGCACTCTGAACGTCCCAGTTTCCGAGACCGTAAACTGGACCAACAACATCACTTACATGCTGCAGAGCAAGAACAAGGAAACAGGCGACCGCCTGTCTATCATCCCGGAATATACCCTGAACTCTACTCTGAGCTGGCAGGTACGTGATGACGTATCCCTGCAGTCTACCTTCACCTGGTACGGCAAACAGGAACCGAAGAAATACAACTACAAAGGCCAGCCGGTTACCGGTTCTGAAAAAAACGAAGTATCCCCGTACTCTATCCTGGGTCTGTCCGCAACATGGGACGTTACTAAGTATGTCTCTCTGACCGGTGGCGTATAAGGATCC；

所述Abcfep基因编码的蛋白质序列是：

所述Abcfep基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transportersubstrate-binding protein的29-211aa及表面蛋白FepA的550-695aa；两段蛋白序列中间以柔性连接肽进行连接；将此基因片段按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni²⁺亲和层析法纯化重组Abcfep蛋白。

3.一种用于制备肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA抗体的方法，其特征在于：所述方法是将如权利要求2所述的重组Abcfep蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA抗体。

4.一种肺炎克雷伯菌表面蛋白glpQ+mltD，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌表面蛋白glpQ+mltD的蛋白质序列是：

用于编码肺炎克雷伯菌表面蛋白glpQ+mltD的蛋白质的基因全序列是：

CATATGGACCGTCTGGTTGTACTGCACGATCATTACTTGGACCGTGTTACTGACGTTGCTCAGCGCTTCCCTCAGCGTGCGCGCAAAGACGGTCGTTTTTACGCTATCGACTTTACCCTGGATGAAATCAAATCTCTCAAATTCACTGAAGGTTTCGAGCCTAAAAACGGCAAAAACGTTCAAACCTATCCTGGTCGTTTCCCGATGGGTAAAAGCGATTTTCGCATCCACACTTTCGAAGAGGAAATCGAATTCGTACAGGGTCTCAACCACTCTACTGGTAAAAACATCGGTATCTACCCGGAAATCAAAGCACCGTGGTTCCACCACCAGGAAGGTAAAGACATCGCTGCTTCCACCCTCAAAGTTCTGAAAGAATACGGTTACACCTCTAAGCAGGATAAAGTGTACCTGCAGTGCTTCGACGCTAATGAACTGAAGCGTATCAAAAACGAACTGGAGCCGAAAATGGGCATGGACCTGAACCTGGTACAGCTGGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAACTGGACTCTCCGGTAGACATCTCCCAGCTGGCAGACATGGCTGGTATGCCGGTATCCAAACTGAAGACCTTCAACGCAGGTGTTAAGGGCTCCACTCTGGGCGCATCTGGTCCGAAATACGTAATGGTACCGCAGAAACACGCAGCTCAGCTGCGTGAATCCCTGGCATCTGGCGATATCGCAGCTGTACAGCCGACCCAGCTGGCTGACAACACTCCCCTGACCTCTCGTTCCTACAAAGTACGCAGCGGCGATACTATCTCTGGTATTGCTTCCCGCCTGGGCGTGACTACTCGTGACCTCCAGCAGTGGAACAACCTGCGTGGCTCTGGTCTGAAAGTTGGCCAGAACCTGGTGATCGGTGCTGGCTCCAGCGCACAGCGTCTGGCCAACAACTCTGATTCTATCACATACCGCGTACGTAAGGGTGACTCTCTGTCCTCTATCGCTTAAGGATCC。

5.一种肺炎克雷伯菌表面蛋白glpQ+mltD的制备方法，其特征在于：所述方法是：

所述glpmlt基因全序列是：

CATATGGACCGTCTGGTTGTACTGCACGATCATTACTTGGACCGTGTTACTGACGTTGCTCAGCGCTTCCCTCAGCGTGCGCGCAAAGACGGTCGTTTTTACGCTATCGACTTTACCCTGGATGAAATCAAATCTCTCAAATTCACTGAAGGTTTCGAGCCTAAAAACGGCAAAAACGTTCAAACCTATCCTGGTCGTTTCCCGATGGGTAAAAGCGATTTTCGCATCCACACTTTCGAAGAGGAAATCGAATTCGTACAGGGTCTCAACCACTCTACTGGTAAAAACATCGGTATCTACCCGGAAATCAAAGCACCGTGGTTCCACCACCAGGAAGGTAAAGACATCGCTGCTTCCACCCTCAAAGTTCTGAAAGAATACGGTTACACCTCTAAGCAGGATAAAGTGTACCTGCAGTGCTTCGACGCTAATGAACTGAAGCGTATCAAAAACGAACTGGAGCCGAAAATGGGCATGGACCTGAACCTGGTACAGCTGGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAACTGGACTCTCCGGTAGACATCTCCCAGCTGGCAGACATGGCTGGTATGCCGGTATCCAAACTGAAGACCTTCAACGCAGGTGTTAAGGGCTCCACTCTGGGCGCATCTGGTCCGAAATACGTAATGGTACCGCAGAAACACGCAGCTCAGCTGCGTGAATCCCTGGCATCTGGCGATATCGCAGCTGTACAGCCGACCCAGCTGGCTGACAACACTCCCCTGACCTCTCGTTCCTACAAAGTACGCAGCGGCGATACTATCTCTGGTATTGCTTCCCGCCTGGGCGTGACTACTCGTGACCTCCAGCAGTGGAACAACCTGCGTGGCTCTGGTCTGAAAGTTGGCCAGAACCTGGTGATCGGTGCTGGCTCCAGCGCACAGCGTCTGGCCAACAACTCTGATTCTATCACATACCGCGTACGTAAGGGTGACTCTCTGTCCTCTATCGCTTAAGGATCC；

所述glpmlt编码的蛋白质序列是：

所述glpmlt基因编码的蛋白质序列是肺炎克雷伯菌表面蛋白glpQ的69-232aa及表面蛋白mltD的268-417aa，两个蛋白序列中间以刚性连接肽进行连接；将此基因片段按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni²⁺亲和层析法纯化重组glpmlt蛋白。

6.一种用于制备肺炎克雷伯菌表面蛋白glpQ+mltD抗体的方法，其特征在于：所述方法是：将如权利要求5所述的重组glpmlt蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得肺炎克雷伯菌表面蛋白glpQ+mltD抗体。

7.一种基于肺炎克雷伯菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸，其特征在于：所述基于肺炎克雷伯菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸包括根据权利要求3制备得到的包被有肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA抗体的乳胶微球标记物以及根据权利要求6制备得到的包被有肺炎克雷伯菌表面蛋白glpQ+mltD抗体硝酸纤维素膜。

8.一种用于制备如权利要求7所述的基于肺炎克雷伯菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的方法，其特征在于：所述制备方法包括：

1)制备肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA抗体以及肺炎克雷伯菌表面蛋白glpQ+mltD抗体；

2)制备肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA抗体的乳胶微球标记物：

2.1)乳胶微球的活化

取浓度为10％的彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球溶液1mL，加入9mLMES缓冲液后混匀，加入NHS以及EDC，至二者的终浓度均为1mg/mL，在室温下缓慢混匀30分钟，孵育结束后19000g离心20分钟，去上清，沉淀用10mL硼砂缓冲液重悬，振荡，超声处理后即成活化后的乳胶微球；所述MES缓冲液中组分及含量是：0.1mol/LMES，所述MES缓冲液的pH＝8.5；所述彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的粒径是100nm；所述硼砂缓冲液中组分含量为0.1mol/L Na₂B₄O₇，所述硼砂缓冲液的pH＝8.5；

2.2)乳胶微球标记物的制备

用硼砂缓冲液将步骤1)所得的肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA抗体稀释成1mg/mL；取10mL肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA抗体加入10mL活化乳胶微球，缓慢混匀30分钟后19000g离心10分钟，去上清；沉淀用10mL含有1％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，经超声粉碎后重复离心1次，去上清；沉淀同法重悬，经超声粉碎、振荡后重复离心1次，去上清；沉淀用10mL含有1％酪蛋白的硼砂缓冲液重悬，即为肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA抗体的乳胶微球标记物；所述硼砂缓冲液中组分含量为0.1mol/LNa₂B₄O₇，所述硼砂缓冲液的pH＝8.5；

3)结合垫的制备：

向聚酯纤维材质的结合垫上喷涂步骤2)所得到的肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC+fepA抗体的乳胶微球标记物，每平方厘米聚酯纤维膜的喷涂量为10μL乳胶微球标记物；喷涂完后在相对湿度不超过30％的环境中在37℃下烘干，25℃密封干燥保存；

4)抗体固相硝酸纤维素膜的制备：

用硼砂缓冲液将步骤1)所得的肺炎克雷伯菌表面蛋白glpQ+mltD抗体稀释成1.5mg/mL后用喷膜仪包被到硝酸纤维素膜上的检测线位置作为检测线捕获抗体，包被参数为1μL/cm；将羊抗兔IgG喷涂到硝酸纤维素膜上的质控线位置作为控制线捕获抗体，浓度为1mg/mL，包被参数为1μL/cm；包被完后将该硝酸纤维素膜放在相对湿度不超过30％的环境中，于37℃下烘干，25℃密封干燥保存；所述硼砂缓冲液中组分含量为0.1mol/LNa₂B₄O₇，所述硼砂缓冲液的pH＝8.5；

5)样品垫的制备

所述样品垫处理液中各组分含量分别是：0.01mol/LNa₂B₄O₇、2g/L氯化钠、20g/L酪蛋白、10ml/L吐温-20以及10ml/L消泡剂S-17；所述样品垫处理液的pH＝8.5；

6)试纸条的组装