CN116550311B - 一种水热合成法合成彩色微球的方法及应用 - Google Patents
一种水热合成法合成彩色微球的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及免疫微球技术领域，尤其是一种水热合成法合成彩色微球的方法及应用，其合成方法包括以下步骤：1）空白聚苯乙烯乳胶微球的制备：通过乳液聚合法制备单分散的聚苯乙烯乳胶微球，微球表面进行羧基修饰；2）彩色乳胶微球的制备：将油溶性染料与空白聚苯乙烯乳胶微球混合，采用水热合成法高温高压一步合成彩色乳胶微球。本发明该方法操作简单，不使用乳化剂，制备出来的彩色微球粒径均一、分散性好、染料负载率高且不易泄露；在免疫层析实验中，具有非常好的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及免疫微球技术领域，具体领域为一种水热合成法合成彩色微球的方法及应用。
背景技术
免疫微球技术是近年来发展迅速的免疫新技术，在生物医学领域中具有非常广泛的应用。胶乳凝集试验是利用抗原间的特异性结合及胶体粒子的凝集进行检测，具有简单、快速、便宜的特点。然而，在一些病毒类的诊断以及癌症的早期诊断中，由于抗体含量较低，无色的微球与背景较难区分，胶乳凝集效果难以观察。因此，人们提出将微球染色并均匀的分散在介质中，加入待测样品后，若有凝集发生，则微球凝集成较大的肉眼可见的彩色“云团”。
彩色微球是一种以特定方式将染料与聚合物微球相结合的新型功能性复合材料，具有比表面积大、粒径均一、表面可修饰等优点。彩色聚苯乙烯微球表面由羧基或者氨基修饰，可通过共价结合的方式与抗原、抗体等进行偶联，广泛应用于生物凝集试验和侧向层析等领域。
常见的合成彩色微球的方法有聚合包覆法、单体功能共聚法以及染色法。聚合包覆法是指在单体的聚合过程中，添加进染料，使其包覆于聚合物球形粒子中而形成彩色聚合物微球。单体共聚法是指通过单体与染料分子共聚合作用，得到两者以共共价键结合的聚合物微球。这两种方法操作比较复杂，微球粒径分布宽，染料负载率低等缺点。目前，研究较多的是染色法，染色法是将聚合物微球制备后，将染料包埋在微球内部而成。这种方法具有操作简单、粒径均一、染料负载率高等优点。
但是，目前现有的染色法中仍存在以下缺陷和不足：（1）乳化剂难以去除；（2） 染料负载率低；（3）染料易泄露；（4）使用毒性较大的有机溶剂，造成身体伤害及环境污染。因此，本领域亟需开发一种全新的合成彩色微球的方法。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供了一种水热合成法合成彩色微球的方法及应用。水热合成法属于液相化学的范畴，是指在特制的密闭反应器（水热合成反应釜）中，采用水溶液作为反应体系，通过对反应体系加热加压（或自生蒸气压），创造一个相对高温、高压的反应环境，从而进行无机合成与材料处理。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种水热合成法合成彩色微球的方法，包括以下步骤：
（1）空白聚苯乙烯乳胶微球的制备：通过乳液聚合法制备单分散的聚苯乙烯乳胶微球，微球表面进行羧基修饰；
（2）彩色乳胶微球的制备：将油溶性染料与空白聚苯乙烯乳胶微球混合，采用水热合成法高温高压一步合成彩色乳胶微球。
其中，所述步骤（1）具体为，选用苯乙烯为单体，甲基丙烯酸为功能性单体，过硫酸钾为引发剂，十二烷基硫酸钠为乳化剂，将苯乙烯与甲基丙烯酸与溶有乳化剂的水溶液混合形成的混合物置于反应容器内，通氮气置换空气，在60 ℃条件下加入溶有引发剂的水溶液，75-85 ℃进行10-16 h的聚合反应，制得单分散的聚苯乙烯乳胶微球。
其中，所述聚苯乙烯乳胶微球的粒径为100-400 nm，PDI<0.05。
其中，所述步骤（2）具体为，将无水乙醇、水、油溶性染料及步骤（1）制得的单分散的聚苯乙烯乳胶微球按一定比例加入至水热合成反应釜的内衬中，超声充分混匀30 min，封闭后放入恒温烘箱中，80-100 ℃反应2-6 h。
其中，所述油溶性染料包括偶氮类或者蒽醌类染料。进一步的，所述油溶性染料包括苏丹红、苏丹黑、溶剂红、甲基红或分散红等。
其中，所述聚苯乙烯乳胶微球与油溶性染料的重量比为1:0.5-1，纯水与乙醇的体积比为1：1-5。
本发明制得的彩色微球可用于免疫层析，具体包括以下步骤：
（1）彩色微球的稀释
取25 μL固含量为4%的彩色微球于离心管中，再加入975 μL标记缓冲液；
（2）彩色微球的活化
配制25 mg/mL NHS和EDC（现配现用）；取10 μL NHS，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取10 μL EDC加入到微球中，快速混匀；室温混匀孵育15 min；
（3）清洗去除残留EDC
将活化后的彩色微球在15000 rpm离心15 min，去掉上清，用1 mL标记缓冲液重悬微球；再15000 rpm离心15 min，去掉上清，用1 mL标记缓冲液重悬微球，备用；
（4）偶联抗体
取0.1 mg抗体于2 mL离心管中，加入活化后的微球，快速混匀后，室温混匀孵育2h；
（5）封闭
配制10%的BSA，即称取1 g BSA，用10 mL的去离子水溶解，备用；彩色微球标记抗体后，加入100 μL上述封闭液，室温混匀孵育30 min；
（6）去除未结合的抗体
通过高速离心的方法去除游离的未结合彩色微球的抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以乙醇为溶剂，纯水调节体系中染料的溶解度，装入水热反应釜中，借助高温高压将微球溶胀，从而将油溶性染料分子填入微球内部，一步合成彩色微球。该方法操作简单，不使用乳化剂，制备出来的彩色微球粒径均一、分散性好、染料负载率高且不易泄露；在免疫层析实验中，具有非常好的灵敏度。
附图说明
图1为实施例1、2中的单分散聚苯乙烯微球（左）和彩色微球（右）照片。
图2为实施例1中的300 nm单分散聚苯乙烯微球的粒径分析图。
图3为实施例2中的彩色微球的粒径分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 300 nm单分散聚苯乙烯微球的制备
三口烧瓶中加入2 L纯水，50 mg SDS，100mL提纯后苯乙烯及4mL甲基丙烯酸，通入氮气20 min，置换烧瓶中的空气。设置恒温水浴锅温度85 ℃，升温至60℃，加入800 mg过硫酸钾水溶液，搅拌均匀。随着搅拌时间和温度的增加，溶液颜色变为淡蓝色，最后变为乳白色，产品照片如图1所示。粒径分析图如图2所示。
实施例2 300 nm彩色微球的制备
称取300 mg油溶性染料甲基红于烧杯中，加入100 mL乙醇超声使其充分溶解，再将烧杯中加入实施例1中300 nm的聚苯乙烯微球500mg和纯水10 mL，超声10 min，使其充分混合均匀。再将烧杯中的混合物转移到水热合成反应釜中，放入恒温烘箱，100 ℃反应6 h。20%无水乙醇和去离子水各洗涤3次，得到粒径均一、分散性好的红色聚苯乙烯微球。产品照片如图1所示。粒径分析图如图3所示。
从粒径分析图中可以看出，本发明制备的彩色微球分布较窄，说明微球粒径比较均一；而且由于实验中染料的投料率高，为单体质量的50%-100%，因此微球染料负载率高。
另外，将制备的彩色微球放置一周，没有发生明显聚沉；离心后，上清没有明显红色，可见本发明制备的彩色微球分散性好，且染料不易泄露。
将制得的彩色微球与为度生物和辉质生物的彩色微球进行性能对比，结果见表1。
表1 彩色微球与市场产品性能对比
注释：a. 甲型流感病毒质控品稀释倍数；b. 信号数值由读卡仪获取，数值越高，代表显色越明显。
实施例3 实施例2制得的彩色微球的应用实例（以甲型流感病毒标记抗体为例）
（1）彩色微球的稀释
取25 μL固含量为4%的彩色微球于离心管中，再加入975 μL标记缓冲液；
（2）彩色微球的活化
配制25 mg/mL NHS和EDC（现配现用）；取10 μL NHS，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取10 μL EDC加入到微球中，快速混匀；室温混匀孵育15 min；
（3）清洗去除残留EDC
将活化后的彩色微球在15000 rpm离心15 min，去掉上清，用1 mL标记缓冲液重悬微球；再15000 rpm离心15 min，去掉上清，用1 mL标记缓冲液重悬微球，备用；
（4）偶联抗体
取0.1 mg抗体于2 mL离心管中，加入活化后的微球，快速混匀后，室温混匀孵育2h；
（5）封闭
配制10%的BSA，即称取1 g BSA，用10 mL的去离子水溶解，备用；彩色微球标记抗体后，加入100 μL上述封闭液，室温混匀孵育30 min；
（6）去除未结合的抗体
通过高速离心的方法去除游离的未结合彩色微球的抗体。具体流程如下：
1）15000 rpm，离心15 min，第一遍；
2）去掉上清，用 1mL 稀释液（50 mM PBS，pH 7.4 或50 mM Tris，pH 8.0）重悬微球；
3）15000 rpm，离心 15 min，第二遍；
4）去掉上清，用 1 mL 稀释液重悬微球，即为抗体-微球标记复合物，4 ℃放置备用，如长期保存需加入终浓度为 0.2% BSA 和 0.02% NaN3 溶液；
5）如有必要可以多洗几遍。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种水热合成法合成彩色微球的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）空白聚苯乙烯乳胶微球的制备：通过乳液聚合法制备单分散的聚苯乙烯乳胶微球，微球表面进行羧基修饰；选用苯乙烯为单体，甲基丙烯酸为功能性单体，过硫酸钾为引发剂，十二烷基硫酸钠为乳化剂，将苯乙烯与甲基丙烯酸与溶有乳化剂的水溶液混合形成的混合物置于反应容器内，通氮气置换空气，在60 ℃条件下加入溶有引发剂的水溶液，75-85℃进行10-16 h的聚合反应，制得单分散的聚苯乙烯乳胶微球；所述聚苯乙烯乳胶微球的粒径为100-400 nm，PDI < 0.05；（2）彩色乳胶微球的制备：将无水乙醇、水、油溶性染料及步骤（1）制得的单分散的聚苯乙烯乳胶微球按一定比例加入至水热合成反应釜的内衬中，超声充分混匀30 min，封闭后放入恒温烘箱中，80-100 ℃反应2-6 h；所述油溶性染料包括苏丹红、苏丹黑、溶剂红、甲基红和分散红；所述聚苯乙烯乳胶微球与油溶性染料的重量比为1:0.5-1，纯水与乙醇的体积比为1：1-5。
2.权利要求1所述水热合成法合成彩色微球的方法制得的彩色微球。
3.权利要求2所述的彩色微球在免疫层析中的应用。
4.根据权利要求3所述彩色微球在免疫层析中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）彩色微球的稀释
取25 μL固含量为4%的彩色微球于离心管中，再加入975 μL标记缓冲液；
（2）彩色微球的活化
配制25 mg/mL NHS和EDC，现配现用；取10 μL NHS，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取10 μL EDC加入到微球中，快速混匀；室温混匀孵育15 min；
（3）清洗去除残留EDC
将活化后的彩色微球在15000 rpm离心15 min，去掉上清，用1 mL标记缓冲液重悬微球；再15000 rpm离心15 min，去掉上清，用1 mL标记缓冲液重悬微球，备用；
（4）偶联抗体
取0.1 mg抗体于2 mL离心管中，加入活化后的微球，快速混匀后，室温混匀孵育2 h；
（5）封闭
配制10%的BSA，即称取1 g BSA，用10 mL的去离子水溶解，备用；彩色微球标记抗体后，加入100 μL上述封闭液，室温混匀孵育30 min；
（6）去除未结合的抗体通过高速离心的方法去除游离的未结合彩色微球的抗体。
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