CN107921086A - MrkA多肽、抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了结合至MrkA并诱导克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)的调理吞噬杀伤的MrkA结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段。本披露还提供了在受试者中减少克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)或治疗或预防克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)感染的方法，该方法包括向该受试者给予MrkA结合蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA或其免疫原性片段的多核苷酸。

Description

MrkA多肽、抗体及其用途
对以电子方式提交的序列表的引用
与本申请一起提交的ASCII文本文件MRKA-100-WO-PCT_SeqListing.txt(大小：42,157字节；以及创建日期：2016年8月16日)的以电子方式提交的序列表的内容通过引用以其全文并入本文。
背景技术
技术领域
本发明的领域总体上涉及用于预防或治疗克雷伯氏菌属感染的MrkA多肽、编码MrkA的多核苷酸和抗MrkA抗体。
背景技术
克雷伯氏菌属是革兰氏阴性细菌，其作为乐观感染和医院感染(包括肺炎、尿路感染、新生儿败血症和手术伤口感染)的病原体迅速在临床上变得越来越重要。此外，存在与克雷伯氏菌属感染相关联的新兴综合征，如化脓性肝脓肿(PLA)、眼内炎、脑膜炎和坏死性脑膜炎。
在过去二十年里，抗生素耐药性已经成为抗击细菌感染的主要挑战之一。虽然针对耐药性金黄色葡萄球菌取得了一些进展，但是多重耐药(MDR)革兰氏阴性菌机会性感染是最成问题的并且需要新型抗微生物药物(参见例如，Xu等人,Expert opinion oninvestigational drugs[对研究药物的专家观点]2014；23:163-82)。在这些中，肺炎克雷伯氏菌(机会性感染和医院感染的一种病原体(Broberg等人,F1000Prime Rep[F1000Prime报告]2014；6:64))已经变得以广泛流传的多重耐药株而尤其具挑战性。克雷伯氏菌属感染如超广谱β-内酰胺酶(ESBL)、肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)和新德里金属-β-内酰胺酶1(NDM-1)已经在世界范围内传播，并使得目前的抗生素类别在很大程度上不足。这种现实加上日益缩小的抗生素管道使得临床医生具有很少的治疗替代方案(Munoz-Price等人,Lancet Infect Dis[柳叶刀感染病学]2013；13:785-96)。一些最近的高姿态爆发突出了与肺炎克雷伯氏菌抗生素耐药性相关联的紧迫性。参见McKenna,Nature[自然]2013；499:394-6；或Snitkin等人,Sci Transl Med[科学转化医学]2012；4:148ra16。另外，耐药性的交叉物种传播指示需要可替代的病原体特异性策略，如抗体和疫苗，以补充或保存抗生素。针对细菌感染的物种特异性保护性抗体不会受到迅速演化的抗生素耐药性机制的影响，并且临床前数据已经证实它们在辅助使用中还可以为患者提供额外的益处。参见例如DiGiandomenico等人,J Exp Med[实验医学杂志]2012；209:1273-87；DiGiandomenico等人,Sci Transl Med[科学转化医学]2014；6:262ra155。
肺炎克雷伯氏菌发病机理中涉及多种毒力因子(Podschun等人,Clin MicrobiolRev[临床微生物学评论]1998；11:589-603)。最佳表征的是荚膜多糖(CPS)和脂多糖(LPS)。针对LPS和CPS的多克隆抗体在致命性肺炎克雷伯氏菌感染的临床前模型中是保护性的(Ahmad等人,Vaccine[疫苗]2012；30:2411-20；Rukavina等人,Infect Immun[感染与免疫]1997；65:1754-60；Donta等人,J Infect Dis[感染性疾病杂志]1996；174:537-43)。然而，用抗体靶向这两种抗原或将它们用作疫苗候选物中的免疫原在菌株覆盖度方面面临重大挑战。存在超过七十七种已知的荚膜血清型和八种O-抗原血清型，并且尚不清楚哪些最为普遍和/或与发病机制相关联。虽然血清型特异性单克隆抗体可以针对具有所限定LPS和荚膜血清型的肺炎克雷伯氏菌赋予保护(Mandine等人,Infect Immun[感染与免疫]1990；58:2828-33)，但对于广泛菌株覆盖度和保护需要多价抗原和/或抗体组合(Campbell等人,Clin Infect Dis[临床感染性疾病]1996；23:179-81)。鉴定血清型非依赖性的交叉保护性抗原仍然极具挑战性。例如，在动物模型中，靶向跨血清型存在的保守核心LPS表位的单克隆抗体几乎不提供保护(Brade等人2001,J Endotoxin Res[内毒素研究杂志],7(2):119-24)。
已经努力使用多种策略以鉴定肺炎克雷伯氏菌的交叉保护性靶标，包括基因组学和蛋白质组学途径(Lundberg等人,Hum Vaccin Immunother[人类疫苗和免疫疗法]2012；9:497-505；Meinke等人,Vaccine[疫苗]2005；23:2035-41；Maroncle等人,Infection andimmunity[感染与免疫]2002；70:4729-34)。尽管已经从这些研究中提出许多靶标，但很少已经通过后续的研究得到验证。值得注意的是，通过此类途径鉴定的大多数潜在靶标是代谢途径中涉及的蛋白质，由于不可接近性，其可能不适合作为抗体靶标。抗原组学策略代表直接鉴定能够引发抗体应答的抗原的新型途径(Meinke等人2005,Vaccine[疫苗],23(17-18):2035-41)。它对肺炎克雷伯氏菌研究的影响仍然可见。因此，对鉴定和开发对肺炎克雷伯氏菌感染具有保护作用的抗体和/或免疫原性多肽/疫苗存在很大的需求。
发明内容
抗生素耐药性肺炎克雷伯氏菌感染的出现和日益增多的病例使得用于预防和治疗的可替代途径如抗体疗法和/或疫苗的开发有了正当理由。然而，缺少由一系列不同的临床菌株所共有的验证靶标，这是一个重大挑战。采用功能性、靶标不可知的筛选途径鉴定针对新型靶标的保护性抗体。从噬菌体展示和杂交瘤平台经由全细菌结合和筛选调理吞噬杀伤(OPK)鉴定了若干种单克隆抗体。用具有这些活性的抗体对肺炎克雷伯氏菌细胞裂解物进行免疫沉淀，随后进行质谱分析，鉴定了它们的靶抗原为MrkA，III型菌毛复合物中的主要蛋白质。III型菌毛介导生物和非生物表面上的生物膜形成，并且是成熟生物膜发育所需要的。3型菌毛的各种组分由mrkABCDF操纵子编码，该操纵子产生菌毛蛋白大亚基MrkA、分子伴侣MrkB、外膜引领蛋白MrkC、粘附素MrkD和MrkF。参见Yang等人PLoS One.[公共科学图书馆·综合]2013年11月14日；8(11):e79038。克雷伯氏菌属的宿主细胞粘附和生物膜形成是由此类MrkA菌毛蛋白介导。参见Chan等人,Langmuir[朗缪尔]28:7428-7435(2012)。这些血清型非依赖性的MrkA抗体还减少了生物膜形成，并在小鼠肺炎模型中赋予保护。重要的是，用纯化的MrkA蛋白免疫的小鼠在肺炎克雷伯氏菌感染时示出降低的器官负荷。相应地，本披露提供了结合至MrkA并诱导克雷伯氏菌属的调理吞噬杀伤(OPK)的MrkA结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段。本披露还提供了使用MrkA结合蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、和编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸来治疗克雷伯氏菌属感染的方法。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白a)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)血清型；b)诱导肺炎克雷伯氏菌的调理吞噬杀伤(OPK)或c)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型并诱导肺炎克雷伯氏菌的OPK。在一个例子中，该抗原结合蛋白结合到至少两种选自下组的肺炎克雷伯氏菌血清型，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一个例子中，该抗原结合蛋白在至少一种或两种选自下组的肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一个例子中，该抗原结合蛋白在肺炎克雷伯氏菌菌株9148(O2a:K28)、9178(O3:K58)、和9135(O4:K15)中诱导100％的OPK；和/或在肺炎克雷伯氏菌菌株29011(O1:K2)中诱导80％的OPK，如使用生物发光OPK测定测量的。在一个例子中，该抗原结合蛋白在暴露于选自下组的肺炎克雷伯氏菌菌株的动物中赋予存活益处，该组由以下各项组成：Kp29011、Kp9178、和Kp43816。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白抑制生物膜形成。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白抑制细胞附着。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合MrkA的分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白包含一组互补决定区(CDR)：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中：HCDR1具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列；HCDR2具有SEQ.ID.NO:2的氨基酸序列；HCDR3具有SEQ.ID.NO:3的氨基酸序列；LCDR1具有SEQ.ID.NO:7的氨基酸序列；LCDR2具有SEQ.ID.NO:8的氨基酸序列；并且LCDR3具有SEQ.ID.NO:9的氨基酸序列。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少95％、96％、97％、98％或99％一致的重链可变区(VH)和/或与SEQ ID NO:15至少95％、96％、97％、98％或99％一致的轻链可变区(VL)。在一个例子中，该抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:13的VH和含有SEQ ID NO:15的VL。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:13的VH。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:15的VL。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合MrkA的分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白包含一组互补决定区(CDR)：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中：HCDR1具有SEQ.ID.NO:4的氨基酸序列；HCDR2具有SEQ.ID.NO:5的氨基酸序列；HCDR3具有SEQ.ID.NO:6的氨基酸序列；LCDR1具有SEQ.ID.NO:10的氨基酸序列；LCDR2具有SEQ.ID.NO:11的氨基酸序列；并且LCDR3具有SEQ.ID.NO:12的氨基酸序列。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:14至少95％、96％、97％、98％或99％一致的重链可变区(VH)和/或与SEQ ID NO:16至少95％、96％、97％、98％或99％一致的轻链可变区(VL)。在一个例子中，该抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:14的VH和含有SEQ ID NO:16的VL。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:14的VH。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:16的VL。
在一个例子中，该抗原结合蛋白结合至在SEQ ID NO:17的氨基酸1-40和171-202中的表位。在一个例子中，该抗原结合蛋白特异性地结合至MrkA(SEQ ID NO:17)，但不结合至SEQ ID NO:26(缺少SEQ ID NO:17的氨基酸1-40的MrkA)或SEQ ID NO:27(缺少SEQ IDNO:17的氨基酸171-202的MrkA)。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合至在SEQ ID NO:17的氨基酸1-40和171-202中的表位。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA(SEQ ID NO:17)但不结合至SEQID NO:26和/或SEQ ID NO:27的分离的抗原结合蛋白。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白包含选自下组的一组互补决定区(CDR)：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3，该组由以下各项组成：(i)分别为SEQ ID NO:29-31和41-43；(ii)分别为SEQ ID NO:32-34和44-46；(iii)分别为SEQ ID NO:35-37和47-49；以及(iv)分别为SEQ IDNO:38-40和50-52。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:53、54、55、或56至少95％、96％、97％、98％或99％一致的重链可变区(VH)和/或与SEQ ID NO:57、58、59、或60至少95％、96％、97％、98％或99％一致的轻链可变区(VL)。在一个例子中，该抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:53、54、55、或56的VH和含有SEQ ID NO:57、58、59、或60的VL。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:53、54、55、或56的VH。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:57、58、59、或60的VL。在一个例子中，本文提供了特异性地结合至与选自下组的抗体或其抗原结合片段所结合表位相同的MrkA表位的分离的抗原结合蛋白，该组由以下各项组成：(a)包含含有SEQ ID NO:13的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；(b)包含含有SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:16的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；(c)包含含有SEQ ID NO:53的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:57的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；(d)包含含有SEQ ID NO:54的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:58的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；(e)包含含有SEQ ID NO:55的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:59的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；以及(f)包含含有SEQ IDNO:56的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:60的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段。在一个例子中，本文提供了竞争性地抑制参考抗体与MrkA结合的分离的抗原结合蛋白，其中所述参考抗体选自下组，该组由以下各项组成：(a)包含含有SEQ ID NO:13的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；(b)包含含有SEQID NO:14的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:16的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；(c)包含含有SEQ ID NO:53的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:57的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；(d)包含含有SEQ ID NO:54的重链可变区(VH)和含有SEQID NO:58的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；(e)包含含有SEQ ID NO:55的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:59的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；以及(f)包含含有SEQ ID NO:56的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:60的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段。
在一个例子中，该抗原结合蛋白或其抗原结合片段结合寡聚体MrkA。
在一个例子中，本文提供了特异性地结合至寡聚体MrkA但不结合至单体MrkA的分离的抗原结合蛋白。
在一个例子中，该抗原结合蛋白是鼠类的、非人类的、人源化的、嵌合的、表面重建的或人类的。
在一个例子中，该抗原结合蛋白是抗体。在一些实施例中，该抗原结合蛋白是单克隆抗体、重组抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、或其抗原结合片段。
在一些实施例中，该抗原结合蛋白是抗体的抗原结合片段。在一个例子中，该抗原结合蛋白包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、迷你抗体、F(ab')3、四体抗体、三体抗体、双体抗体、单一结构域抗体、DVD-Ig、mAb2、(scFv)2、或scFv-Fc。在一个例子中，该抗原结合蛋白包括Fab、Fab'、F(ab')2、单链Fv或scFv、二硫化物连接的Fv、胞内抗体、IgGΔCH2、迷你抗体、F(ab')3、四体抗体、三体抗体、双体抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2、或scFv-Fc。
在一个例子中，该抗原结合蛋白以约1.0nM至约10nM的Kd结合至MrkA。在一个例子中，该抗原结合蛋白以1.0nM或更小的Kd结合至MrkA。在一个例子中，该结合亲和力是通过流式细胞术、Biacore、KinExa、放射免疫测定或生物层干涉测量法(BLI)测量。
在一个例子中，该抗原结合蛋白a)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)血清型；b)诱导肺炎克雷伯氏菌的调理吞噬杀伤(OPK)或c)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型并诱导肺炎克雷伯氏菌的OPK。
在一个例子中，该抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些方面，该抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)抑制或减少Kp43816生物膜形成。
在一个例子中，该抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)抑制或减少克雷伯氏菌属细胞附着。在一些方面，该抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)抑制或减少克雷伯氏菌属(包括例如Kp43816)细胞附着至人类细胞。在一些方面，该抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)抑制或减少克雷伯氏菌属(包括例如Kp43816)细胞附着至人类上皮细胞。在一些方面，该抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)抑制或减少克雷伯氏菌属(包括例如Kp43816)细胞附着至肺上皮细胞。在一些方面，该抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)抑制或减少克雷伯氏菌属(包括例如Kp43816)细胞附着至A549细胞。
在一个例子中，该抗原结合蛋白包含选自下组的重链免疫球蛋白恒定结构域，该组由以下各项组成：(a)IgA恒定结构域；(b)IgD恒定结构域；(c)IgE恒定结构域；(d)IgG1恒定结构域；(e)IgG2恒定结构域；(f)IgG3恒定结构域；(g)IgG4恒定结构域；以及(h)IgM恒定结构域。在一个例子中，该抗原结合蛋白包含选自下组的轻链免疫球蛋白恒定结构域，该组由以下各项组成：(a)Igκ恒定结构域；以及(b)Igλ恒定结构域。在一个例子中，该抗原结合蛋白包含人类IgG1恒定结构域和人类λ恒定结构域。
在一个例子中，该抗原结合蛋白包含IgG1恒定结构域。
在一个例子中，该抗原结合蛋白包含IgG1/IgG3嵌合恒定结构域。
在一个例子中，本文提供了产生该抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)的杂交瘤。
在一个例子中，本文提供了产生该抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)的分离的宿主细胞。
在一个例子中，本文提供了制备抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)的方法，该方法包括(a)培养表达所述抗原结合蛋白的宿主细胞；并且(b)从所述培养的宿主细胞中分离所述抗原结合蛋白。在一个例子中，本文提供了使用该方法产生的抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)。
本披露还提供了药物组合物，该药物组合物包含该抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)和药学上可接受的赋形剂。在一个例子中，该药学上可接受的赋形剂是防腐剂、稳定剂或抗氧化剂。在一个例子中，该药物组合物用于用作药剂。
在一个例子中，该抗原结合蛋白或该药物组合物还包含标记基团或效应物基团。在一个例子中，该标记基团选自下组，该组由以下各项组成：同位素标记，磁标记，氧化还原活性部分，光学染料，生物素化的基团，荧光部分诸如生物素信号传导肽、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)，以及通过次级报告物识别的多肽表位诸如组氨酸肽(his)、血球凝集素(HA)、金结合肽和Flag。在一个例子中，该效应物基团选自下组，该组由以下各项组成：放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂和化疗剂。
在一个例子中，本文提供了本文提供的抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)或药物组合物用于治疗或预防与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的用途。
本披露还提供了用于在有需要的受试者中治疗、预防或改善与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的方法，该方法包括向该受试者给予有效量的本文提供的抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)或药物组合物。
在一个例子中，本文提供了用于在受试者中抑制克雷伯氏菌属生长的方法，该方法包括向有需要的受试者给予本文提供的抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)或药物组合物。
在一个例子中，本文提供了用于在有需要的受试者中治疗、预防或改善与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的方法，该方法包括向所述受试者给予有效量的抗MrkA抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，该病症选自下组，该组由以下各项组成：肺炎、尿路感染、败血症、新生儿败血症、腹泻、软组织感染、器官移植后感染、手术感染、伤口感染、肺部感染、化脓性肝脓肿(PLA)、眼内炎、脑膜炎、坏死性脑膜炎、强直性脊柱炎和脊柱关节病。在一个例子中，该病症是医院感染。在一个例子中，该克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一个例子中，该克雷伯氏菌属对头孢菌素、氨基糖苷、喹诺酮和/或碳青霉烯具有耐药性。在一个例子中，该方法还包括给予抗生素。在一个例子中，该抗生素是碳青霉烯或粘菌素。
在一个例子中，本文提供了用于在受试者中抑制克雷伯氏菌属生长的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的抗MrkA抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，该抗MrkA抗体或其抗原结合片段特异性地结合至肺炎克雷伯氏菌MrkA、产酸克雷伯氏菌MrkA、植生克雷伯氏菌MrkA和/或肉芽肿克雷伯氏菌MrkA。在一个例子中，该抗MrkA抗体或其抗原结合片段特异性地结合至肺炎克雷伯氏菌MrkA。
本披露还提供了编码本文提供的抗原结合蛋白的分离的核酸分子。
在一个例子中，本文提供了分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码选自下组的重链可变区(VH)序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:13、14、53、54、55、和56。在一个例子中，本文提供了分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码选自下组的轻链可变区(VL)序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:15、16、57、58、59、和60。
在一个例子中，该核酸分子可操作地连接至控制序列。在一个例子中，本文提供了包含本文提供的核酸分子的载体。在一个例子中，本文提供了用本文提供的核酸分子或本文提供的载体转化的宿主细胞。
在一个例子中，本文提供了用编码重链可变区(VH)序列(该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:13、14、53、54、55、和56)的核酸和编码VL序列(该序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:15、16、57、58、59、和60)的核酸分子转化的宿主细胞。
在一个例子中，该宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在一个例子中，该宿主细胞是NS0鼠类骨髓瘤细胞、人类细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本披露还提供了药物组合物，该药物组合物包含MrkA、其免疫原性片段、或者编码MrkA或其免疫原性片段的多核苷酸。在一个例子中，本披露提供了疫苗，该疫苗包含MrkA、其免疫原性片段、或者编码MrkA或其免疫原性片段的多核苷酸。在一些实施例中，该药物组合物或疫苗包含免疫有效量的MrkA、其免疫原性片段、或者编码MrkA或其免疫原性片段的多核苷酸。在一个例子中，该药物组合物或疫苗包含佐剂。在一个例子中，该药物组合物或疫苗的MrkA或其免疫原性片段是单体的。在一个例子中，该药物组合物或疫苗的MrkA或其免疫原性片段是寡聚体的。在一个例子中，该MrkA是肺炎克雷伯氏菌MrkA。
在一些实施例中，该MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:17中列出的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的序列，或其中编码MrkA或其免疫原性片段的该多核苷酸编码与SEQ ID NO:17中列出的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的序列。在一个例子中，该MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17中列出的序列，或其中编码MrkA或其免疫原性片段的该多核苷酸编码SEQ ID NO:17中列出的序列。
本披露还提供了在受试者中诱导针对克雷伯氏菌属的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者给予本文提供的药物组合物、MrkA或其免疫原性片段、或疫苗。在一个例子中，该免疫应答包括抗体应答。在一个例子中，该免疫应答包括细胞介导的免疫应答。在一个例子中，该免疫应答包括细胞介导的免疫应答和抗体应答。在一个例子中，该免疫应答是粘膜免疫应答。在一个例子中，该免疫应答是保护性免疫应答。
此外，本文提供了针对克雷伯氏菌属对受试者进行疫苗接种的方法，该方法包括向受试者给予本文提供的药物组合物、MrkA或其免疫原性片段、或疫苗。在一个例子中，本文提供了用于在有需要的受试者中治疗、预防与克雷伯氏菌属感染相关联的病症或减少该病症发生的方法，该方法包括向所述受试者给予MrkA、其免疫原性片段、或者编码MrkA或其免疫原性片段的多核苷酸。在一个例子中，本文提供了用于在受试者中抑制克雷伯氏菌属生长的方法，该方法包括向有需要的受试者给予MrkA、其免疫原性片段、或者编码MrkA或其免疫原性片段的多核苷酸。在本文提供的方法的一个例子中，该克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一个例子中，该克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌。在本文提供的方法的一个例子中，该MrkA或其免疫原性片段是单体的。在本文提供的方法的一个例子中，该MrkA或其免疫原性片段是寡聚体的。在本文提供的方法的一个例子中，该MrkA是肺炎克雷伯氏菌MrkA。
附图说明
图1A-F描绘了通过噬菌体和杂交瘤平台分离的单克隆抗体(mAb)的肺炎克雷伯氏菌结合和有力的OPK活性。A：在全细胞ELISA测定中抗体结合至Kp29011：如实例2中所述，在ELISA测定中，两种杂交瘤克隆(88D10和89E10)和两种噬菌体抗体(Kp3和Kp16)结合至肺炎克雷伯氏菌菌株29011。正如所料，对照抗体hIgG对照不结合至肺炎克雷伯氏菌菌株29011。B：抗体诱导肺炎克雷伯氏菌的调理吞噬杀伤(OPK)。将噬菌体(Kp3和Kp16)和杂交瘤(88D10和89E10)衍生的抗体与幼兔血清HL60和肺炎克雷伯氏菌菌株29011.lux一起孵育。与缺少抗体的对照相比来计算细菌杀伤。C：噬菌体抗体(Kp3和Kp16)竞争与肺炎克雷伯氏菌的结合。将1μg/ml生物素标记的Kp3与递增量的未标记噬菌体和所指示的对照抗体混合，并测试其与肺炎克雷伯氏菌菌株29011的结合。链霉亲和素-HRP用作检测试剂。Kp3和Kp16二者均阻止生物素标记的Kp3与肺炎克雷伯氏菌菌株29011的结合。D：噬菌体(Kp3和Kp16)和杂交瘤抗体(88D10)竞争结合至肺炎克雷伯氏菌。将1μg/ml杂交瘤克隆88D10与递增量的噬菌体和对照抗体(hIgG)混合，并测试其与肺炎克雷伯氏菌菌株29011的结合。抗小鼠IgG-HRP用作检测试剂。ELISA信号的减少表示为抑制百分比。Kp3和Kp16二者均阻止88D10与肺炎克雷伯氏菌菌株2901的结合。E.噬菌体(Kp3和Kp16)和杂交瘤(21G10、22B12、88D10和89E10)抗体结合至具有各种血清型的肺炎克雷伯氏菌菌株。“+”指示结合。F.抗MrkA mAb Kp3对不同血清型的肺炎克雷伯氏菌显示有力的OPK活性。
图2A-D描绘了将MrkA鉴定为由本文产生的肺炎克雷伯氏菌特异性抗体结合的抗原的实验的结果。A：示出Kp3抗体与肺炎克雷伯氏菌表面结合的共聚焦显微术图像。B：Kp3、88D10、和同种型对照抗体对来自非反应性(1899)和反应性(43816DM)肺炎克雷伯氏菌菌株的细胞裂解物的免疫沉淀。将对应于免疫沉淀的多肽的编号条带(1至4)进行LC-MS分析。C：免疫沉淀产物的Western印迹分析。图2B和2C中的泳道如下：泳道1-预染色的分子量标记物；泳道2-来自Kp3非反应性菌株1899的细胞裂解物；泳道3-来自Kp3反应性菌株43816DM的细胞裂解物；泳道4-经受由同种型对照进行免疫沉淀的1899裂解物；泳道5-经受由Kp3进行免疫沉淀的1899裂解物；泳道6-经受由88D10进行免疫沉淀的1899裂解物；泳道7-经受由同种型对照进行免疫沉淀的43816DM裂解物；泳道8-经受由Kp3进行免疫沉淀的43816DM裂解物；和泳道9-经受由88D10进行免疫沉淀的43816DM裂解物。D：来自图2B的凝胶条带3号的LC-MS结果。在肺炎克雷伯氏菌菌株MGH78578MrkA序列(SEQ ID NO:17)的背景中以粗体和下划线表示通过质谱鉴定的肽。
图3A-B示出MrkA是由本文产生的肺炎克雷伯氏菌特异性抗体结合的共同抗原。A：通过使用抗his标签(左图)和Kp3(右图)抗体进行Western印迹分析的MrkA的重组表达。泳道1：仅宿主细胞；泳道2：用空载体转化的宿主细胞；泳道3：用携带his标记的MrkA ORF的表达载体转化的宿主细胞；和泳道4：从菌株43816DM制备的裂解物。这些结果显示Kp3结合至重组MrkA。B：MrkA的体外转录和翻译以及使用Kp3(左图)抗Myc标签(右图)抗体的Western印迹分析。样品1：阳性细菌细胞裂解物；2：阴性细胞裂解物；3：体外表达的MrkA，无信号肽/具有二硫键增强物；4：具有信号肽/具有二硫键增强物；5：无信号肽或二硫键增强物；6：具有信号肽但不含二硫键增强物；和7：不具有MrkA ORF的体外表达系统阴性对照。这些结果显示Kp3结合至体外翻译的MrkA。图3A和3B二图左侧的数字是以kDa为单位的蛋白质分子量。
图4A-D描绘了在各种体内模型中Kp3mAb的保护活性。A和B：Kp3在鼻内肺部感染模型中分别针对Kp29011(O1:K2)和Kp9178(O3:K38)降低了器官负荷。将不相关的人类IgG1抗体(hIgG1)和针对Kp43816的兔多克隆抗体(Rab IgG)用作对照。所有抗体均以15mg/kg的剂量使用。这些结果显示抗MrkA抗体Kp3在细菌激发之前给予时降低器官负荷。C：Kp3在使用Kp43816(O1:K2)的致命性细菌性肺炎模型中增强存活。使用不相关的人类IgG1(hIgG1)抗体作为对照。两种抗体均以15mg/kg的剂量使用。D：Kp3显著增强了使用Kp985048(一种多重耐药(MDR)株)的致命性细菌性肺炎模型中的存活。使用不相关的人类IgG1(hIgG1)抗体作为对照。两种抗体均以5mg/kg的剂量使用。这些结果显示抗MrkA抗体Kp3在细菌激发前24小时给予时增强存活。
图5描绘了肠杆菌科成员中的MrkA保守性。保守残基显示在顶部，并且相异的残基用框标记。MrkA在大部分肠杆菌科成员中是保守的。
图6描绘了MrkA结合测定的结果。全长MrkA(“MrkA-WT”；SEQ ID NO:17)、具有40个氨基酸的N末端缺失的MrkA(“MrkA-N-dlt”；即SEQ ID NO:17的氨基酸41-202(即SEQ IDNO:26))、具有32个氨基酸的C末端缺失的MrkA(“MrkA-C-dlt”；即SEQ ID NO:17的氨基酸1-170(即SEQ ID NO:27))、具有N和C末端缺失的MrkA(“MrkA-N/C-dlt”；即SEQ ID NO:17的氨基酸41-170(即SEQ ID NO:28))、以及空载体(“Top10cont”)在细胞中表达。将细胞裂解物直接包被在ELISA板上，并分析与Kp3和对照MrkA抗体的结合。人类IgG1也充当对照。Kp3仅检测到全长MrkA，而对照抗体检测到全长MrkA以及具有N末端缺失的MrkA。这些结果显示Kp3识别构象表位。
图7描绘了单体和寡聚体MrkA的纯化。表达、纯化并在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE凝胶分析单体和寡聚体MrkA的级分，并用蓝染色来可视化。M：分子量标记物。泳道1和4包含来自1号池的单体MrkA。泳道2和5包含来自2号池的单体MrkA。泳道3和6包含寡聚体MrkA。
图8A-B显示MrkA疫苗接种降低了肺负荷。将用单体或寡聚体MrkA进行免疫的C57/bl6小鼠用Kp29011(O1:K2)进行鼻内激发。在感染后24小时分析肺和肝中细菌的存在。单体MrkA显著减少肺中的细菌(图8A)，并且寡聚体MrkA显著减少肺和肝中的细菌(图8B)。(*)指示学生t检验p值<.05。
图9显示Kp3抑制克雷伯氏菌属生物膜形成。在抗MrkA抗体Kp3(实心三角形)或hIgG1(同种型对照抗体，空心三角形，“R347”)的存在下，将Kp43816添加至Falcon塑料板中。绘制生物膜形成的抑制图。(**)指示Kp3值相对于同种型对照而言学生t检验p值<0.01。
图10显示Kp3抑制克雷伯氏菌属与上皮细胞的结合。在抗MrkA抗体Kp3(实心三角形)或hIgG1(空心三角形，“R347”)的存在下，将Kp43816添加至A549细胞(2x105/孔)中。样品一式两份运行；图表代表3个独立实验。(*)指示Kp3值相对于同种型对照而言学生t检验p值<.05。在不能看到误差条时，它们比符号宽度更小。
图11显示实例10中所述的噬菌体淘选输出筛选级联。在噬菌体淘选、scFv.Fc转换和转化后，挑选超过4000个菌落用于高通量筛选。选择四个克隆，包括克隆1、4、5和6，以用于进一步表征。
图12显示了用于筛选MrkA结合物的四组分均相时间分辨FRET(HTRF)的示意图。组分A是链霉亲和素-Eu(K)穴状化合物并用作能量供体，使其通过组分B和C之间的相互作用紧密靠近作为抗huFc-alexa fluor647并充当能量受体的组分D。B是生物素标记的MrkA，并且C是MrkA特异性的scFv-Fc。
图13显示了使用抗MrkA抗体的结合测定。MrkA蛋白直接包被在ELISA板上(右图)或在生物素化后用链霉亲和素捕获(左图)。在这些不同的抗原呈递形式中，MrkA蛋白被抗MrkA抗体相异地识别。
图14显示，在Western印迹分析中，与在大肠杆菌中表达的重组MrkA(E)相比，抗MrkA抗体优选地结合至直接从KP菌株制备的寡聚体MrkA(K)。克隆1是能够检测来自KP的单体MrkA的唯一抗体(由箭头指示)。
图15显示了表位结合测定的结果。针对三个测试物：KP3、克隆4和克隆5，进行表位分类(binning)。
图16证实OPK活性对于体内保护活性是重要的。产生KP3-TM突变，并在体外OPK测定(上图)和体内激发测定(下图)两者中进行测试。在OPK测定中观察到显著的降低，并且在体内激发测定中观察到了趋向显著性的趋势。
图17显示抗MrkA抗体与KP菌株的血清型非依赖性结合。使用流式细胞术实验来测量四种抗MrkA抗体针对不同血清型的三种WT KP菌株的结合。R347是人类IgG同种型对照。
图18显示抗MrkA抗体的血清型非依赖性OPK活性。在OPK测定中使用具有LPS血清型O1和O2的两种菌株。抗MrkA抗体克隆1、克隆4、克隆5和克隆6显示与KP3可比的OPK活性。R347是人类IgG同种型对照。
图19显示预防性体内激发模型的结果。在KP激发前24小时给予抗体。
图20显示治疗性体内激发模型的结果。在KP激发后一小时给予抗体。
图21显示在治疗模型中单个抗体与抗体组合一样有效。将KP3以与指示的相等的量与克隆1或克隆5组合，并且在治疗模型中测试。
具体实施方式
本披露提供了结合至MrkA的分离的结合蛋白，包括抗体或其抗原结合片段。还提供了相关的多核苷酸、载体、宿主细胞以及包含MrkA结合蛋白(包括抗体或其抗原结合片段)的药物组合物。还提供了制备和使用本文披露的MrkA结合蛋白(包括抗体或抗原结合片段)的方法。本披露还提供了通过给予本文披露的MrkA结合蛋白(包括抗体或抗原结合片段)来预防和/或治疗与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的方法。
为了更容易地理解本披露，首先定义某些术语。另外的定义贯穿具体实施方式而阐述。
I.定义
术语“一个/一种(a/an)”以及“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确指明。例如，“一种抗原结合蛋白”应理解为表示一种或多种抗原结合蛋白。术语“一个”(或“一种”)、以及术语“一个或多个/一种或多种(one or more)”和“至少一个/至少一种(atleast one)”可以在本文中互换使用。此外，在本文中使用“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下，两个指定的特征或组分中的每一者的特定披露。因此，如在本文在短语如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、以及“B”(单独)。同样，如在短语如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在包括以下方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
术语“包含”通常在包括的意义上使用，也就是说允许存在一个或多个特征或组分。当用语言“包含”来描述方面时，还提供了关于“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的其他类似方面。
在说明书和随附权利要求书通篇中与数值结合使用的术语“约”表示本领域技术人员熟知并可接受的精确度的区间。一般，这种精确度的区间是±10％。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有如本披露所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology[生物医学与分子生物学简明词典],Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC出版社；The Dictionary of Cell and Molecular Biology[细胞与分子生物学词典],第3版,1999,Academic Press[学术出版社]；以及Oxford Dictionary OfBiochemistry AndMolecular Biology[生物化学和分子生物学牛津词典],修订版,2000,Oxford UniversityPress[牛津大学出版社]为技术人员提供在本披露中使用的许多术语的通用词典注释。
单位、前缀、和符号是以其国际单位系统(Système International de Unites)(SI)接受形式表示。数值范围包括限定该范围的数字。除非另外说明，否则氨基酸序列以氨基至羧基取向从左向右书写。本文提供的小标题不是本披露的不同方面或各方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。
术语“抗原结合蛋白”是指由识别并特异性地结合至靶标例如MrkA的一种或多种多肽构成的分子，如抗MrkA抗体或其抗原结合片段。
术语“抗体”意指通过位于免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合靶标如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质、或上述物质的组合的免疫球蛋白分子。如本文所用的，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体，完整单克隆抗体，产生自至少两个完整抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、包含抗体的融合蛋白、以及任何其他修饰的免疫球蛋白分子的多特异性抗体(如双特异性抗体)，只要这些抗体展现出所希望的生物活性。抗体可以是基于其分别称为α、δ、ε、γ和μ的重链恒定结构域的一致性的以下免疫球蛋白的五个主要类别中的任何一个：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同的且熟知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸的或缀合至其他分子如毒素、放射性同位素等等。
术语“抗体片段”或“其抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”或“其抗原结合片段”是指与抗原结合的完整抗体的一部分。抗原结合片段可包含完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段、线性抗体、scFv、和单链抗体。
可以采用单克隆和其他抗体或其片段并且使用重组DNA技术的技术来产生保留了原始抗体或片段的特异性的其他抗体或嵌合分子或其片段。此类技术可以涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区(CDR)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区中。参见例如EP-A-184187、GB 2188638A、或EP-A-239400，以及大量的后续文献。杂交瘤细胞或产生抗体的其他细胞可经受基因突变或其他变化，这些基因突变或其他变化可以或不可以改变所产生的抗体或其片段的结合特异性。
可在抗体工程化领域中获得的其他技术已经使得有可能分离人类抗体和人源化抗体或其片段。例如，可以如Kontermann和Sefan在Antibody Engineering[抗体工程化],Springer Laboratory Manuals[施普林格实验室手册](2001)中所述的制备人类杂交瘤。噬菌体展示，为另一种用于产生抗原结合蛋白的既定技术，已经在许多公开物中详细描述，如Kontermann和Sefan.Antibody Engineering[抗体工程化],Springer LaboratoryManuals[施普林格实验室手册](2001)和WO 92/01047。其中小鼠抗体基因经过失活并且在功能上被人类抗体基因替换而保留小鼠免疫系统的其他完整组分的转基因小鼠可用于分离人类抗原的人类抗体。
合成抗体分子或其片段可通过从基因表达来产生，这些基因是借助于在合适表达载体内合成并且组装的寡核苷酸来产生，例如如以下所描述：Knappik等人J.Mol.Biol.[分子生物学杂志](2000)296,57-86或Krebs等人Journal ofImmunological Methods[免疫学方法杂志]254200167-84。
已经显示完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例是(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward,E.S.等人,Nature[自然]341,544-546(1989)，McCafferty等人(1990)Nature[自然],348,552-554)；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域缔合形成抗原结合位点的肽接头连接(Bird等人,Science[自然],242,423-426,1988；Huston等人，PNAS USA[美国国家科学院院刊],85,5879-5883,1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US 92/09965)和(ix)“双体抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO 94/13804；P.Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]906444-6448,1993)。Fv、scFv或双体抗体分子可以通过并入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定(Y.Reiter等人,Nature Biotech[自然生物技术],14,1239-1245,1996)。也可以制造包含连接到CH3结构域的scFv的迷你抗体(S.Hu等人,CancerRes.[癌症研究],56,3055-3061,1996)。
当使用双特异性抗体时，这些抗体可以是能以各种方式来制造的常规双特异性抗体(Holliger,P.和Winter G.Current Opinion Biotechnol.[当前生物技术观点]4,446-449(1993))，例如以化学方法来制备或来自杂种杂交瘤，或可以是以上提到的任何双特异性抗体片段。双特异性抗体的实例包括BiTETM技术的那些抗体，其中具有不同特异性的两个抗体的结合结构域可使用并且经由短柔性肽来直接连接。这将两个抗体组合于短单一多肽链上。可以仅使用可变结构域来构建没有Fc区的双体抗体和scFv，从而潜在地减少抗独特型反应的影响。与双特异性完整抗体形成对照，双特异性双体抗体也可以是尤其有用的，因为这些双特异性双体抗体可容易地构建并且表达于大肠杆菌中。可使用噬菌体展示(WO94/13804)来从文库中容易地选择具有合适结合特异性的双体抗体(和许多其他多肽，例如抗体片段)。如果使双体抗体的一个臂保持恒定，例如具有针对MrkA的特异性，则可以制备其中另一个臂变化的文库，并选择具有适当特异性的抗体。双特异性完整抗体可以通过旋钮入孔(knobs-into-holes)工程来制备(J.B.B.Ridgeway等人,Protein Eng.[蛋白质工程],9,616-621,1996)。已经产生多特异性和/或多价分子的基于免疫球蛋白样结构域的技术包括dAb、TandAb、纳米抗体、BiTE、SMIP、DNL、亲和体、Fynomer、Kunitz结构域、Albu-dab、DART、DVD-IG、Covx体、肽体(peptibody)、scFv-Ig、SVD-Ig、dAb-Ig、旋钮入孔、DuoBodiesTM和triomAb。双特异性二价抗体及其制造方法描述于例如美国专利号5,731,168；5,807,706；5,821,333；和美国专利申请公开号2003/020734和2002/0155537中，将所有这些的披露通过引用并入本文中。双特异性四价抗体及其制造方法描述于例如WO 02/096948和WO00/44788中，将两者的披露通过引用并入本文中。总体上参见PCT公开案WO 93/17715；WO92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人,J.Immunol.[免疫学杂志]147:60-69(1991)；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等人,J.Immunol.[免疫学杂志]148:1547-1553(1992)。
短语“效应物功能”是指由其Fc组分与Fc受体或补体组分相互作用而产生的抗体的活性。这些活性包括例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。因此，具有改变的效应物功能的抗原结合蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)是指在Fc区中含有变更(例如氨基酸取代、缺失或添加或者寡糖中的改变)的抗原结合蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)，该变更改变了至少一种效应物功能的活性(例如，ADCC、CDC和/或ADCP)。具有改进的效应物功能的抗原结合蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)是指在Fc区中含有变更(例如氨基酸取代、缺失或添加或者寡糖中的改变)的抗原结合蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)，该变更增加了至少一种效应物功能的活性(例如，ADCC、CDC和/或ADCP)。
术语“特异性的”可以用于指特定结合对的一个成员不会显示出与其一个或多个特异性结合配偶体以外的分子的任何显著结合的情况。该术语在例如抗原结合结构域对许多抗原携带的特定表位具有特异性的情况下也是适用的，在这种情况下携带抗原结合结构域的抗原结合蛋白将能够结合至携带该表位的各种抗原。
“特异性结合”一般意为抗原结合蛋白(包括抗体或其抗原结合片段)经由其抗原结合结构域结合至表位，并且该结合需要抗原结合结构域与表位之间有某种互补性。根据此定义，当与抗体将结合至随机、不相关的表位相比，该抗体更容易地经由其抗原结合结构域来结合至表位时，该抗体被认为是“特异性地结合”至该表位。
“亲和力”是配体结合反应的固有结合强度的量度。例如，抗体(Ab)-抗原(Ag)相互作用的强度的量度通过结合亲和力来测量，其可以通过解离常数kd来量化。解离常数是结合亲和常数并且由下式给出：
亲和力可以例如使用KinExA亲和力测定、流式细胞术和/或放射免疫测定来测量。
“效力”是以产生给定强度的作用所需的量表示的化合物药理学活性的量度。它是指实现所限定的生物效应所需的化合物的量；所需剂量越小，药物越有效。结合MrkA的抗原结合蛋白的效力可以例如使用OPK测定来测定，如本文所述。
“调理吞噬杀伤”或“OPK”是指由于免疫细胞的吞噬而发生的细胞(例如克雷伯氏菌属)的死亡。可以用于证实OPK活性的测定包括在实例中使用的生物发光OPK活性或通过对琼脂板上的细菌菌落进行计数。提供了另外的测定，例如在DiGiandomenico等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]209:1273-87(2012)中，将其通过引用并入本文。
如果抗原结合蛋白(包括抗体或其抗原结合片段)在一定程度上阻断参考抗体或抗原结合片段与表位的结合，则认为该抗原结合蛋白竞争性地抑制参考抗体或其抗原结合片段与给定表位的结合，或者与参考抗体或抗原结合片段“竞争”。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法例如竞争ELISA测定来确定。可认为结合分子竞争性地抑制参考抗体或抗原结合片段与给定表位的结合，或者与参考抗体或其抗原结合片段竞争至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、或至少50％。
当在抗原结合蛋白(例如中和性抗原结合蛋白或中和性抗体)的背景下使用时，术语“竞争”意为在抗原结合蛋白之间的竞争，如通过以下测定所确定的，在该测定中在测试下的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫功能片段)防止或抑制参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如MrkA蛋白或其片段)的特异性结合。可以使用众多类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心竞争测定(参见例如Stahli等人,1983,Methods in Enzymology[酶学方法]92:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Kirkland等人,1986,J.Immunol.[免疫学杂志]137:3614-3619)固相直接标记的测定，固相直接标记的夹心测定(参见例如Harlow和Lane,1988,Antibodies[抗体],A Laboratory Manual[实验室手册],ColdSpring Harbor Press[冷泉港出版社])；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见例如Morel等人,1988,Molec.Immunol.[分子免疫学]25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Cheung等人,1990,Virology[病毒学]176:546-552)；以及直接标记的RIA(Moldenhauer等人，1990,Scand.J.Immunol.[斯堪的纳维亚免疫学杂志]32:77-82)。典型地，这种测定涉及使用与载有以下任一个的固体表面或细胞结合的纯化抗原：未标记的测试抗原结合蛋白以及标记的参考抗原结合蛋白。
竞争性抑制可以通过在测试抗原结合蛋白的存在下测定与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。通常测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定鉴定的抗原结合蛋白(竞争性抗原结合蛋白)包括结合至与参考抗原结合蛋白所结合表位相同的表位的抗原结合蛋白，以及与足够靠近由参考抗原结合蛋白所结合表位以致发生空间位阻的邻近表位结合的抗原结合蛋白。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，它将以至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％抑制参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在一些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。
本文披露的抗原结合蛋白、抗体或其抗原结合片段可以根据它们识别或特异性结合的抗原(例如靶多肽)的一个或多个表位或一个或多个部分来描述或指定。例如，与本文披露的抗原结合多肽或其片段的抗原结合结构域特异性地相互作用的MrkA的部分是“表位”。表位可以由连续氨基酸形成，也可以由通过蛋白质三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。构象表位可以由抗原的氨基酸序列的不连续区段构成。线性表位是由来自该抗原的氨基酸的连续序列形成。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位通常包括处于独特空间构象中的至少3、4、5、6、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35个氨基酸。表位可以使用本领域已知的方法来确定。
氨基酸在本文中通过其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。
如本文所用的，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不是指产物的具体长度。如本文所用的，术语“蛋白质”旨在涵盖包含一个或多个多肽的分子，在一些情况下所述多肽可以通过酰胺键以外的键缔合。在另一方面，蛋白质也可以是单一多肽链。在后一种情况下，单一多肽链在一些情况下可以包含两个或更多个融合在一起以形成蛋白质的多肽亚基。术语“多肽”和“蛋白质”还指代表达后修饰的产物，这些表达后修饰包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。多肽或蛋白质可以衍生自天然生物来源或通过重组技术来产生，但不是必然从指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式(包括通过化学合成)来产生。
术语“分离的”是指本披露的抗原结合蛋白或编码此类结合蛋白的核酸通常符合本披露的状态。分离的蛋白质和分离的核酸不含或基本上不含在天然状态下与其相关联的材料，例如在其天然环境下，或在此制备是通过在体外或在体内实施的重组DNA技术时在其制备环境(例如细胞培养物)中与其一起存在的其他多肽或核酸。蛋白质和核酸可以用稀释剂或佐剂配制，并且仍然为了实用目的可以被分离-例如如果该蛋白质用于包被微量滴定板用于免疫测定，则该蛋白质通常与明胶或其他载体混合，或者当用于诊断或治疗时将与药学上可接受的载体或稀释剂混合。抗原结合蛋白可在天然状态下或通过异源真核细胞系统(例如CHO或NS0(ECACC85110503)细胞)来糖基化，或它们可以是(例如如果通过在原核细胞中表达来产生)未糖基化的。
“分离的”多肽、抗原结合蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈自然界中未发现形式的多肽、抗原结合蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗原结合蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至它们不再呈自然界中发现形式的程度的那些。在一些实施例中，分离的抗原结合蛋白、抗体、多核苷酸、载体、细胞、或组合物是基本上纯的。
“重组”多肽、蛋白质或抗体是指经由重组DNA技术产生的多肽或蛋白质或抗体。如同已经通过任何合适的技术分离、分级或部分纯化或基本上纯化的天然或重组多肽一样，出于本披露的目的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽、蛋白质和抗体也被视为分离的。
本披露还包括多肽的片段、变体、或衍生物，及其任何组合。当提及本披露的多肽和蛋白质时，术语“片段”包括保留参考多肽或蛋白质的至少一些特性的任何多肽或蛋白质。多肽的片段包括蛋白水解片段、以及缺失片段。
如本文所用的术语“变体”是指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本抗体或多肽序列的抗体或多肽序列。本披露的抗体或多肽的变体包括片段，以及还有由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的抗体或多肽。变体可以是天然或非天然存在的。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可以包括保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。
如应用于抗体或多肽的术语“衍生物”是指已经改变以展现在天然多肽或蛋白质上未发现的附加特征的抗体或多肽。“衍生物”抗体的实例是与第二多肽或另一种分子(例如聚合物如PEG、发色团或荧光团)或原子(例如放射性同位素)的融合物或缀合物。
如本文所用的术语“多核苷酸”或“核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)或质粒DNA(pDNA)。在某些方面，多核苷酸包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，如在肽核酸(PNA)中所发现的)。
术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA、cDNA或RNA片段。当应用于核酸或多核苷酸时，术语“分离的”是指已经从其天然环境中去除的核酸分子(DNA或RNA)，例如出于本披露的目的，认为对包含在载体中的抗原结合蛋白进行编码的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的另外实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或在溶液中从其他多核苷酸纯化(部分地或基本上)的重组多核苷酸。分离的RNA分子包括本披露的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本披露的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的这类分子。此外，多核苷酸或核酸可以包括调节元件，例如启动子、增强子、核糖体结合位点或转录终止信号。
如本文所用的，术语“宿主细胞”是指含有或能够含有重组核酸的细胞或细胞群。宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，或者可替代地，宿主细胞可以是真核细胞例如真菌细胞(例如酵母细胞，如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或粟酒裂殖酵母)，以及各种动物细胞如昆虫细胞(例如Sf-9)或哺乳动物细胞(例如HEK293F、CHO、COS-7、NIH-3T3、NS0鼠类骨髓瘤细胞、人类细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或杂交瘤)。
术语“氨基酸取代”是指用另一个氨基酸残基替代存在于亲本序列中的氨基酸残基。亲本序列中的氨基酸可以是例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法来取代。因此，提及“在位置X的取代”是指用替代性氨基酸残基取代存在于位置X的氨基酸。在一些实施例中，取代类型可以根据模式AXY描述，其中A是对应于天然存在于位置X的氨基酸的单个字母代码，并且Y是取代氨基酸残基。在其他方面，取代类型可以根据模式XY描述，其中Y是对应于取代天然存在于位置X的氨基酸的氨基酸残基的单个字母代码。
“保守性氨基酸取代”是其中用具有类似侧链的氨基酸残基替代该氨基酸残基的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在现有技术中定义，所述侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被来自相同侧链家族的另一个氨基酸替代，该取代被认为是保守性的。在另一个方面，氨基酸串可以被保守地替代为在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的结构上类似的串。
非保守性取代包括如下那些，其中(i)具有阳电性侧链的残基(例如，Arg、His或Lys)取代为或被阴电性残基(例如，Glu或Asp)取代，(ii)亲水残基(例如，Ser或Thr)取代为或被疏水残基(例如，Ala、Leu、Ile、Phe或Val)取代，(iii)半胱氨酸或脯氨酸取代为或被任何其他残基取代，或(iv)具有大的疏水或芳族侧链的残基(例如，Val、His、Ile或Trp)取代为或被具有更小的侧链的残基(例如，Ala、Ser)或无侧链的残基(例如，Gly)取代。
本领域普通技术人员可以容易地鉴定其他取代。例如，对于氨基酸丙氨酸，取代可以从D-丙氨酸、甘氨酸、β-丙氨酸、L-半胱氨酸以及D-半胱氨酸中任一项进行。针对赖氨酸，替代可以是D-赖氨酸、精氨酸、D-精氨酸、高精氨酸、甲硫氨酸、D-甲硫氨酸、鸟氨酸、或D-鸟氨酸中任一项。通常，可以预期诱导分离的多肽的特性上的改变的在功能上重要的区域中的取代是如下那些，其中(i)极性残基例如丝氨酸或苏氨酸取代为疏水残基例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、或丙氨酸(或被其取代)；(ii)半胱氨酸残基取代为任何其他残基(或被其取代)；(iii)具有阳电性侧链的残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代为具有阴电性侧链的残基例如谷氨酸或天冬氨酸(或被其取代)；或(iv)具有大的侧链的残基例如苯丙氨酸取代为不具有这样的侧链的残基例如甘氨酸(或被其取代)。前述的非保守性取代之一可改变蛋白质的功能特性的可能性也与关于该蛋白质的在功能上重要的区域的取代位置相关：一些非保守性取代因此可对生物特性具很少或没有影响。
术语“氨基酸插入”是指在存在于亲本序列中的两个氨基酸残基之间引入新的氨基酸残基。氨基酸可以例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法来插入在亲本序列之中。因此如本文所用的，短语“在位置X和Y之间的插入”或“在卡巴特位置X和Y之间的插入”(其中X和Y对应于氨基酸位置(例如，在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入))是指在X与Y位置之间的氨基酸插入，并且还是指在编码位置X和Y的氨基酸的密码子之间的编码氨基酸的密码子的核酸序列中的插入。插入类型可以根据模式AXin描述，其中A是对应于被插入的氨基酸的单个字母代码，并且X是该插入之前的位置。
术语两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列一致性百分比”或“一致性百分比”是指考虑到为了最佳比对两个序列而必须引入的添加或缺失(即，空隙)，在比较窗口上由这些序列共用的相同匹配位置的数目。匹配位置是其中相同核苷酸或氨基酸呈现在靶序列与参考序列两者中的任何位置。呈现在靶序列中的空隙未计数，因为空隙并非核苷酸或氨基酸。同样地，呈现在参考序列中的空隙未计数，因为对靶序列核苷酸或氨基酸进行计数，而不对来自参考序列的核苷酸或氨基酸进行计数。序列一致性百分比的计算是通过确定相同氨基酸残基或核酸碱基出现在两个序列中的位置的数目以便产生匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗口中的位置总数并且将结果乘以100，从而产生序列一致性百分比。序列比较和两个序列之间序列一致性百分比的测定可以使用容易获得的软件程序完成。合适的软件程序可从不同来源获得，并且用于比对蛋白质与核苷酸序列。用于确定序列一致性百分比的一种合适程序是bl2seq，该程序是可从美国政府的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列之间执行比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适程序是例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，它们是EMBOSS生物信息学程序套件的一部分并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上从欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute；EBI)获得。
“特异性结合成员”描述了一对彼此具有结合特异性的分子的成员。特异性结合对的成员可天然地衍生或者全部或部分地合成产生。分子对的一个成员在其表面上具有这样一个区域、或腔穴，该区域或腔穴特异性地结合至分子对的另一个成员的特定空间和极性组织并且由此与其互补。因此，该对的成员具有特异性地相互结合的特性。特异性结合对的类型的实例是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本披露涉及抗原-抗体类型反应。
如本文所用的，术语“IgG”是指属于基本上由公认的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别的多肽。在人类中，此类别包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，此类别包括IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。
术语“抗原结合结构域”描述了抗体分子的部分，该部分包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。当抗原较大时，抗体可以仅结合至抗原的特定部分，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域(例如由VH结构域组成的所谓的Fd抗体片段)提供。抗原结合结构域可以包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“抗原结合蛋白片段”或“抗体片段”是指完整抗原结合蛋白或抗体的一部分，并且是指完整抗原结合蛋白或抗体的抗原决定可变区。本领域已知，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、以及Fv片段、线性抗体、单链抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“单克隆抗体”是指参与单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同源抗体群。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以任何数目的方式制备的此类抗体，包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
术语“人类抗体”是指由人类产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的由人类产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人类抗体的这种定义包括完整或全长抗体、其片段、和/或包含至少一个人类重链和/或轻链多肽的抗体，像例如包含鼠类轻链和人类重链多肽的抗体。术语“人源化抗体”是指衍生自非人类(例如鼠类)免疫球蛋白的抗体，其被工程化成包含最小的非人类(例如鼠类)序列。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来自两种或更多种物种的抗体。典型地，轻链和重链的可变区对应于衍生自具有所需特异性、亲和力、和能力的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，而恒定区同源于衍生自另一种(通常为人类)的抗体中的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。
术语“抗体结合位点”是指互补抗体特异性地结合的包括连续或不连续位点(即表位)的抗原(例如，MrkA)中的区域。因此，抗体结合位点可包含抗原中表位外的另外区域，并且所述另外区域可确定如结合亲和力和/或稳定性的特性或影响如抗原酶活性或二聚作用的特性。因此，即使两种抗体结合至抗原内的相同表位，如果该抗体分子建立与该表位外的氨基酸的不同分子间接触，此类抗体被认为结合至不同抗体结合位点。
当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用卡巴特(Kabat)编号系统(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest[免疫学目的的序列],第5版,Public Health Service[公共卫生服务],NationalInstitutes ofHealth[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州(1991))。
短语“如卡巴特中的氨基酸位置编号”、“卡巴特位置”、及其语法变体是指在Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学目的的蛋白质的序列],第5版,Public Health Service[公共卫生服务],National Institutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州(1991)中用于抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含更少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的FW或CDR的截短或插入。例如，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据卡巴特的残基52a)和在重链FW残基82之后的插入残基(例如，根据卡巴特的残基82a、82b和82c等)。
可以通过在抗体序列与“标准”卡巴特编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的卡巴特编号。相反，乔西亚(Chothia)是指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987))。乔西亚CDR-H1环的末端在利用卡巴特编号惯例编号时在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为卡巴特编号方案将插入放在H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，那么环端点在32；如果只存在35A，那么环端点在33；如果35A和35B都存在，那么环端点在34)。AbM高变区代表卡巴特CDR和乔西亚结构环之间的折衷，并且被牛津分子(Oxford Molecular)AbM抗体建模软件使用。还可以使用CDR的IMGT(Lefranc,M.-P.等人Dev.Comp.Immunol.[发育和比较免疫学]27:55-77(2003))分类。
术语“如在卡巴特中的EU索引”是指在Kabat等人,Sequences of ImmunologicalInterest[免疫学目的的序列],第5版,Public Health Service[公共卫生服务],NationalInstitutes of Health[国立卫生研究院],贝塞斯达,马里兰州(1991)中描述的人类IgG1EU抗体的编号系统。本申请引用的所有氨基酸位置均指EU索引位置。例如，“L234”和“EU L234”二者均指在根据如卡巴特提出的EU索引的位置234的氨基酸亮氨酸。
如本文所用的术语“Fc结构域”、“Fc区”和“IgG Fc结构域”是指与通过木瓜蛋白酶消化IgG分子而获得的可结晶片段相关的免疫球蛋白(例如IgG分子)的部分。Fc区包含IgG分子的通过二硫键连接的两条重链的C末端的那一半。它不具有抗原结合活性，但含有碳水化合物部分和针对补体和Fc受体(包括FcRn受体)的结合位点。例如，Fc结构域包含完整的第二恒定结构域CH2(人类IgG1的EU位置231-340的残基)和第三恒定结构域CH3(人类IgG1的EU位置341-447的残基)。
Fc可以指分离的这个区域，或在抗体、抗体片段、或Fc融合蛋白的背景下的这个区域。已经在Fc结构域中的许多位置观察到多态性，包括但不限于EU位置270、272、312、315、356和358。因此，“野生型IgG Fc结构域”或“WT IgG Fc结构域”是指任何天然存在的IgG Fc区(即，任何等位基因)。许多Fc突变体、Fc片段、Fc变体、和Fc衍生物描述于例如美国专利号5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,528,624；6,194,551；6,737,056；7,122,637；7,183,387；7,332,581；7,335,742；7,371,826；6,821,505；6,180,377；7,317,091；7,355,008；美国专利公开案-2004/0002587；和PCT公开号WO 99/058572、WO 2011/069164和WO 2012/006635中。
人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链序列可以在许多序列数据库中找到，例如Uniprot数据库(www.uniprot.org)中分别在登录号P01857(IGHG1_HUMAN)、P01859(IGHG2_HUMAN)、P01860(IGHG3_HUMAN)、和P01861(IGHG1_HUMAN)下。
术语“YTE”或“YTE突变体”是指IgG1Fc结构域中的一组突变，这导致与人类FcRn的结合增加，且提高具有突变的抗体的血清半衰期。YTE突变体包括下述三种“YTE突变”的组合：M252Y、S254T和T256E，其中根据在卡巴特中的EU索引进行编号，被引入IgG的重链。参见美国专利号7,658,921，将其通过引用并入本文。与相同抗体的野生型相比，YTE突变体显示出增加了抗体的血清半衰期。参见例如Dall'Acqua等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]281:23514-24(2006)以及美国专利号7,083,784，将其通过引用以其全文特此并入。“Y”突变体仅包含M256Y突变；类似地，“YT”突变仅包含M252Y和S254T；并且“YE”突变仅包含M252Y和T256E。特别考虑到其他突变可存在于EU位置252和/或256。在某些方面，在EU位置252的突变可以是M252F、M252S、M252W或M252T和/或在EU位置256的突变可以是T256S、T256R、T256Q或T256D。
术语“天然存在的MrkA”通常是指MrkA蛋白或其片段可以存在的状态。天然存在的MrkA意指在没有先前使用重组技术引入编码核酸的情况下，由细胞天然产生的MrkA蛋白。因此，天然存在的MrkA可以由例如肺炎克雷伯氏菌天然产生和/或从克雷伯氏菌属的不同成员分离。
术语“重组MrkA”是指MrkA蛋白或其片段可以存在的状态。重组MrkA意指例如在异源宿主中由重组DNA产生的MrkA蛋白或其片段。通过糖基化，重组MrkA可不同于天然存在的MrkA。
在原核细菌表达系统中表达的重组蛋白没有被糖基化，而在真核系统如哺乳动物或昆虫细胞中表达的那些被糖基化。然而在昆虫细胞中表达的蛋白质与哺乳动物细胞中表达的蛋白质在糖基化方面是不同的。
如本文所用的术语“半衰期”或“体内半衰期”是指本披露的具体类型的抗体、抗原结合蛋白、或多肽在给定动物的循环中的生物半衰期，并且表示为动物中的给药量的一半从循环和/或动物中的其他组织中清除所需要的时间。
如本文所用的术语“受试者”是指有待成为特定治疗的接受者的任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物、啮齿类、绵羊、狗、猫、马、牛、熊、鸡、两栖动物、爬行动物等等。如本文所用的术语“受试者”和“患者”是指任何受试者，特别是哺乳动物受试者，对其与克雷伯氏菌属感染相关联的病症进行诊断、预后或治疗。如本文所用的，如“患有与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的患者”等短语包括将受益于针对与克雷伯氏菌属感染相关联的该病症的治疗、成像或其他诊断程序的给予和/或预防性治疗的受试者，例如哺乳动物受试者。
“克雷伯氏菌属”是指肠杆菌科中革兰氏阴性的兼性厌氧杆状细菌的属。克雷伯氏菌属包括例如肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和肉芽肿克雷伯氏菌。
克雷伯氏菌属的成员通常在其细胞表面上表达2种类型的抗原：O抗原和K抗原。O抗原是脂多糖，而K抗原是荚膜多糖。这些抗原的结构可变性形成了用于将它们分类成克雷伯氏菌属“血清型”的基础。因此，MrkA结合蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)结合多种血清型的能力是指其与具有不同的O和/或K抗原的克雷伯氏菌属结合的能力。
如本文所用的术语“药物组合物”是指如下制剂，该制剂处于允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含有另外的、对其将要给予的受试者具有不可接受的毒性的组分。这样的组合物可以是无菌的。
如本文披露的多肽，例如抗原结合蛋白(包括抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的“有效量”，是足以执行特定阐述目的的量。关于阐述的目的，“有效量”可以经验为主地并且以常规方式来确定。如本文所用的术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的多肽(例如，抗原结合蛋白，包括抗体)或其他药物的量，并为患有克雷伯氏菌属介导的疾病或病症的受试者提供一定的改进或益处。因此，“治疗有效”量是提供克雷伯氏菌属介导的疾病或病症的至少一种临床症状的一些减轻、缓和、和/或减少的量。与克雷伯氏菌属介导的疾病或病症相关联的临床症状可以通过本披露的方法和系统进行治疗，这些临床症状对本领域技术人员是熟知的。此外，本领域技术人员将理解治疗效果不需要是完全的或治愈的，只要向受试者提供一些益处。在一些实施例中，术语“治疗有效的”是指治疗剂的能够在有需要的患者中降低MrkA活性的量。给予的实际量以及给予的速率和时程将取决于正治疗的疾病的性质和严重度。治疗处方(例如剂量等的确定)属于全科医生和其他医生的职责。适当剂量的抗体及其抗原结合片段在本领域是熟知的；参见Ledermann J.A.等人(1991)Int.J.Cancer[国际癌症杂志]47:659-664；Bagshawe K.D.等人(1991)Antibody[抗体],Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals[免疫缀合物和放射性药物]4:915-922。
如本文所用的，““足够的量”或“量足以”在患有克雷伯氏菌属介导的疾病或病症的患者中实现具体结果，是指治疗剂(例如，如本文披露的抗原结合蛋白，包括抗体)的有效产生所希望的作用的量，该所希望的作用任选地是治疗有效的(即，通过给予治疗有效量)。在一些实施例中，这种具体结果在有需要的患者中是MrkA活性的降低。
当在本文使用时，术语“标记”是指直接或间接缀合至多肽(例如抗原结合蛋白，包括抗体)以便产生“标记的”多肽或抗体的可检测化合物或组合物。该标记可以是本身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下可以催化可检测底物化合物或组合物的化学改变。
术语如“治疗(treating或treatment或to treat)”或“减轻(alleviating或toalleviate)”或者“改善”或“或改善”是指治愈、减慢已诊断的病理病症或障碍，减轻已诊断的病理病症或障碍的症状，和/或停止已诊断的病理病症或障碍的进展的治疗性措施。术语如“预防”是指预防和/或减缓靶标病理病症或障碍发展的防御性或预防性措施。因此，需要治疗的那些包括已患有疾病或病症的那些。需要预防的那些包括容易患上疾病或病症的那些以及有待预防疾病或病症的那些。例如，短语“治疗患有克雷伯氏菌属介导的疾病或病症的患者”是指降低克雷伯氏菌属介导的疾病或病症的严重程度，优选降低到受试者不再感到因该疾病或病症而不适和/或功能发生改变的程度(例如，与未治疗的患者相比时，哮喘恶化相对减少)。短语“预防克雷伯氏菌属介导的疾病或病症”是指降低克雷伯氏菌属介导的疾病或病症的可能性和/或减少克雷伯氏菌属介导的疾病或病症的发生。
MrkA多肽、其免疫原性片段或编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的“免疫有效量”是足以增强受试者自身针对克雷伯氏菌属的免疫应答的量。例如通过测量中和性分泌和/或血清抗体的量，例如通过补体结合、酶联免疫吸附、血清杀菌测定、调理吞噬杀伤测定或生物膜形成抑制测定，可监测诱导的免疫水平。
术语“免疫原性片段”意指当单独或任选地与合适的佐剂一起给予至受试者时产生免疫应答(即，具有免疫原性活性)的片段。
根据本发明的“疫苗”组合物是包含免疫原性有效量的MrkA(包括具有免疫原性活性的截短物、其部分、片段和区段)或编码MrkA的多核苷酸(包括具有免疫原性活性的截短物、其部分、片段和区段)以及其任何和全部活性组合的疫苗组合物，其中所述多肽或活性片段或片段或多核苷酸悬浮于药理学上可接受的载体(包括所有适合的稀释剂或赋形剂)中。
如本文所用的，“免疫应答”是指在受试者中对引入MrkA多肽、其免疫原性片段、或编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的应答，其通常表征为但不限于产生抗体和/或T细胞。通常，免疫应答可以是细胞应答(例如诱导或激活对克雷伯氏菌属具有特异性的CD4+T细胞或CD8+T细胞或两者)，产生增加的抗克雷伯氏菌属抗体的体液应答，或细胞应答和体液应答两者。免疫应答还可以包括粘膜应答，例如粘膜抗体应答(例如S-IgA产生)或粘膜细胞介导的应答(例如T细胞应答)。
“保护性免疫应答”是指受试者暴露于克雷伯氏菌属时由受试者展现出的保护性的免疫应答。在一些情况下，克雷伯氏菌属能仍然导致感染，但它不能导致严重感染。通常，保护性免疫应答导致宿主生成的可检测水平的血清和能够在体外和体内中和克雷伯氏菌属的抗体。
术语“佐剂”是指具有(1)改变或增加对特定抗原的免疫应答或(2)增加或辅助药理学药剂作用的能力的任何物质。如本文所用的，可以增加本文提供的MrkA多肽或其免疫原性片段的表达、抗原性或免疫原性的任何化合物是潜在的佐剂。
如本文所用的，术语“与克雷伯氏菌属感染相关联的病症”是指在患有该疾病或病症的受试者中，由克雷伯氏菌属感染(例如肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌的感染)(单独或与其他介导物相关联)引起的、加重的、与其相关联的、或由其延长的任何病理学。与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的非限制性实例包括肺炎、尿路感染、败血症、新生儿败血症、腹泻、软组织感染、器官移植后感染、手术感染、伤口感染、肺部感染、化脓性肝脓肿、眼内炎、脑膜炎、坏死性脑膜炎、强直性脊柱炎和脊柱关节病。在一些实施例中，克雷伯氏菌属感染是医院感染。在一些实施例中，克雷伯氏菌属感染是机会性感染。在一些实施例中，克雷伯氏菌属感染是在器官移植之后。在一些实施例中，受试者暴露于克雷伯氏菌属污染的医疗装置，包括例如呼吸机、导管或静脉内导管。
携带CDR或一组CDR的结构通常具有抗体重链或轻链序列或其实质部分，其中CDR或CDR组位于对应于由重排的免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组的位置。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可通过参考以下来确定：Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学目的的蛋白质的序列].第4版.US Department ofHealth and Human Services[美国卫生与公众服务部].1987，及其在因特网上可获得的更新(http://immuno.bme.nwu.edu或使用任何搜索引擎查找“卡巴特”)，将其通过引用并入本文。CDR还可以由其他支架携带，例如纤连蛋白或细胞色素B。
基本上如本文阐明的CDR氨基酸序列可以作为人类可变结构域或其实质部分中的CDR携带。基本上如本文阐明的HCDR3序列代表本披露的实施例并且这些序列中的每一个可以作为人类重链可变结构域或其实质部分中的HCDR3携带。
本披露中采用的可变结构域可以从任何种系或重排的人类可变结构域获得，或可以是基于已知人类可变结构域的共有序列的合成可变结构域。可以使用重组DNA技术将CDR序列(例如CDR3)引入缺少CDR(例如CDR3)的可变结构域的谱系中。
例如，Marks等人(Bio/Technology[生物/技术],1992,10:779-783；将其通过引用并入本文)提供了产生抗体可变结构域的谱系的方法，其中指向或邻近可变结构域区域的5'末端的共有引物与指向人类VH基因的第三框架区的共有引物结合使用，以提供缺少CDR3的VH可变结构域的谱系。Marks等人进一步描述了这个谱系能如何与特定抗体的CDR3组合。使用类似技术，本披露的CDR3衍生序列能与缺少CDR3的VH或VL结构域的谱系进行改组，并且改组的完整VH或VL结构域与同源VL或VH结构域组合以提供抗原结合蛋白。然后，谱系能展示于合适宿主系统中，例如WO 92/01047或任何后续大量文献(包括Kay,B.K.,Winter,J.,和McCafferty,J.(1996)Phage Display ofPeptides and Proteins:A LaboratoryManual[肽和蛋白质的噬菌体展示：实验室手册],San Diego:Academic Press[圣地亚哥：学术出版社])的噬菌体展示系统，以使得可选择合适的抗原结合蛋白。谱系可由超过104个单独成员的任何成员组成，例如从106至108或110个成员。其他合适的宿主系统包括酵母展示、细菌展示、T7展示、核糖体展示等等。关于核糖体展示的综述，参见Lowe D和JermutusL,2004,Curr.Pharm[当前药物],Biotech[生物技术],517-27，还有WO 92/01047，将其通过引用并入本文。
Stemmer(Nature[自然],1994,370:389-391，将其通过引用并入本文)也披露了类似的改组或组合技术，描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术但观察到该方法可用于产生抗体。
另外的替代方案是使用一个或多个选定VH和/或VL基因的随机诱变以产生整个可变结构域内的突变，产生携带本披露的CDR衍生序列的新颖VH或VL区域。这种技术由Gram等人(1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA[美国国家科学院院刊],89:3576-3580)描述，他们使用易错PCR。在一些实施例中，一个或两个氨基酸取代是在一组HCDR和/或LCDR中产生。
可使用的另一种方法是将诱变引导至VH或VL基因的CDR区域。此类技术由Barbas等人(1994,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA[美国国家科学院院刊],91:3809-3813)和Schier等人(1996,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]263:551-567)披露。
本披露的方法和技术通常是根据本领域中熟知的常规方法和贯穿本说明书中引用且论述的各种通用和更特定的参考文献中所述来进行，除非另外指明。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor[冷泉港],N.Y.[纽约州](2001)和Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学实验指南],Greene Publishing Associates[格林出版联合公司](1992)，以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],ColdSpring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],Cold Spring Harbor[冷泉港],N.Y.[纽约州](1990)，将所有这些通过引用并入本文。
本领域技术人员将能够使用上述此类技术来使用本领域的常规方法提供本披露的抗原结合蛋白、MrkA多肽和其免疫原性片段。
II.MrkA结合分子
本披露提供了特异性地结合MrkA(例如克雷伯氏菌属MrkA)的MrkA结合分子，例如抗体、抗原结合蛋白及其抗原结合片段。在一些实施例中，MrkA结合分子，例如抗体、抗原结合蛋白及其抗原结合片段，特异性地结合至肺炎克雷伯氏菌MrkA。MrkA结合分子在本文中可互换地称为“MrkA结合分子”、“MrkA结合蛋白”或“MrkA结合剂”。
MrkA的全长氨基酸和核苷酸序列在本领域是已知的(参见例如，针对肺炎克雷伯氏菌MrkA的UniProt登录号B6S767，或针对大肠杆菌MrkA的UniProt登录号B0ZDW4；将二者通过引用以其全部内容并入本文)。如本文所用的，术语“肺炎克雷伯氏菌MrkA”是指图2D中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。肺炎克雷伯氏菌分离株通常表达两种菌毛粘附素：1型和3型菌毛。1型菌毛参与促进肺炎克雷伯氏菌定殖和生物膜形成，而3型菌毛介导在生物表面和非生物表面上的生物膜形成并且是成熟生物膜发育所需要的。3型菌毛的各种组分由mrkABCDF操纵子编码，该操纵子产生菌毛蛋白大亚基MrkA、分子伴侣MrkB、外膜引领蛋白MrkC、粘附素MrkD和MrkF。参见Yang等人PLoS One.[公共科学图书馆·综合]2013年11月14日；8(11):e79038。肺炎克雷伯氏菌3型菌毛主要由组装成螺旋状丝状体的MrkA菌毛蛋白构成。3型菌毛使用MrkD粘附素介导与靶组织的结合，该MrkD粘附素与由MrkA蛋白构成的菌毛轴相关联。参见Langstraat等人,Infect Immun.[感染与免疫]2001年9月；69(9):5805-5812。克雷伯氏菌属的宿主细胞粘附和生物膜形成是由此类MrkA菌毛蛋白介导。参见Chan等人,Langmuir[朗缪尔]28:7428-7435(2012)，将其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，其为特异性地结合至MrkA的抗体或多肽。在一些实施例中，该抗原结合蛋白是抗体的特异性地结合至MrkA的抗原结合片段。
在某些实施例中，MrkA结合分子是抗体或多肽。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，其是特异性地结合至MrkA的鼠类的、非人类的、人源化的、嵌合的、表面重建的或人类的抗原结合蛋白。在一些实施例中，MrkA结合分子是人源化抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，MrkA结合分子是人类抗体或其抗原结合片段。
本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段：a)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)血清型；b)诱导肺炎克雷伯氏菌的调理吞噬杀伤(OPK)或c)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型并诱导肺炎克雷伯氏菌的OPK。
在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白结合至选自下组的至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2:K28、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白结合至选自下组的至少三种肺炎克雷伯氏菌血清型，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2:K28、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白结合至选自下组的至少四种肺炎克雷伯氏菌血清型，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2:K28、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白结合至选自下组的至少五种肺炎克雷伯氏菌血清型，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2:K28、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白结合至选自下组的至少六种肺炎克雷伯氏菌血清型，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2:K28、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白结合至选自下组的至少七种肺炎克雷伯氏菌血清型，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2:K28、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白结合至选自下组的至少八种肺炎克雷伯氏菌血清型，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2:K28、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白结合至选自下组的至少九种肺炎克雷伯氏菌血清型，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2:K28、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白结合至选自下组的至少十种肺炎克雷伯氏菌血清型，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2:K28、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了结合至表5中列出的肺炎克雷伯氏菌血清型中的至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、或十种的分离的抗原结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)。
在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白结合至肺炎克雷伯氏菌血清型O1:K2、O1:K79、O2:K28、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。
本披露提供了分离的抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其诱导克雷伯氏菌属(包括例如肺炎克雷伯氏菌)的OPK。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白在选自下组的至少一种肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白在选自下组的至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白在选自下组的至少三种肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白在选自下组的至少四种肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白在选自下组的至少五种肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白在选自下组的至少六种肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白在选自下组的至少七种肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白在选自下组的至少八种肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白在选自下组的至少九种肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白，该分离的抗原结合蛋白在选自下组的至少十种肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。
在一些实施例中，本披露提供了分离的抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其在肺炎克雷伯氏菌血清型O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80中诱导OPK。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白具有选自下组的至少一种特征，该组由以下各项组成：a)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型；b)体外诱导至少一种或两种肺炎克雷伯氏菌血清型的OPK；c)降低小鼠克雷伯氏菌属感染模型中的细菌负荷；以及d)在小鼠克雷伯氏菌属感染模型中赋予存活益处。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白具有选自下组的至少两种特征，该组由以下各项组成：a)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型；b)体外诱导至少一种或两种肺炎克雷伯氏菌血清型的OPK；c)降低小鼠克雷伯氏菌属感染模型中的细菌负荷；以及d)在小鼠克雷伯氏菌属感染模型中赋予存活益处。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白具有选自下组的至少三种特征，该组由以下各项组成：a)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型；b)体外诱导至少一种或两种肺炎克雷伯氏菌血清型的OPK；c)降低小鼠克雷伯氏菌属感染模型中的细菌负荷；以及d)在小鼠克雷伯氏菌属感染模型中赋予存活益处。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白：a)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型；b)体外诱导至少一种或两种肺炎克雷伯氏菌血清型的OPK；c)降低小鼠克雷伯氏菌属感染模型中的细菌负荷；并且d)在小鼠克雷伯氏菌属感染模型中赋予存活益处。
本文披露的MrkA结合蛋白包括MrkA抗体Kp3和Kp16及其抗原结合片段。本文披露的MrkA结合蛋白还包括MrkA抗体克隆1、克隆4、克隆5和克隆6及其抗原结合片段。本披露的MrkA结合蛋白还包括特异性地结合至与Kp3或Kp16所结合表位相同的MrkA表位的MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)。本披露的MrkA结合蛋白还包括特异性地结合至与克隆1、克隆4、克隆5或克隆6所结合表位相同的MrkA表位的MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)。在一些实施例中，本披露提供了结合寡聚体MrkA的分离的抗原结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)。在一些实施例中，抗原结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)不结合至单体MrkA。在一些实施例中，抗原结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)结合至单体MrkA(例如克隆1，包含克隆1的六个CDR或VH和VL的抗体或其抗原结合片段，或者结合与克隆1所结合表位相同的表位的或竞争性地抑制克隆1与MrkA结合的抗体或其抗原结合片段)。
在一些实施例中，抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)结合至SEQ ID NO:17的氨基酸1-40和171-202内的表位。
在一些实施例中，抗原结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)结合至SEQ ID NO:17中列出的MrkA序列，但不结合至缺少SEQ ID NO:17的氨基酸1-40的MrkA(即SEQ ID NO:26)。在一些实施例中，抗原结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)结合至SEQ ID NO:17中列出的MrkA序列，但不结合至缺少SEQ ID NO:17的氨基酸171-202的MrkA(即SEQ ID NO:27)。在一些实施例中，抗原结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)结合至SEQ ID NO:17中列出的MrkA序列，但不结合至缺少SEQ ID NO:17的氨基酸1-40和171-202的MrkA(即SEQ ID NO:28)。
在一些实施例中，抗原结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)特异性地结合至MrkA(SEQ ID NO:17)，但不结合至SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27。在一些实施例中，抗原结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)特异性地结合至MrkA(SEQ ID NO:17)，但不结合至SEQ ID NO:26-28。
MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)还包括竞争性地抑制Kp3或Kp16与MrkA结合的MrkA结合蛋白。MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)还包括竞争性地抑制克隆1、克隆4、克隆5、或克隆6与MrkA结合的MrkA结合蛋白。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，抗MrkA抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制Kp3或Kp16与MrkA的结合。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，抗MrkA抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制克隆1、克隆4、克隆5、或克隆6与MrkA的结合。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，抗MrkA抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制Kp3或Kp16与肺炎克雷伯氏菌的结合。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，抗MrkA抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制克隆1、克隆4、克隆5、或克隆6与肺炎克雷伯氏菌的结合。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，抗MrkA抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制Kp3或Kp16与肺炎克雷伯氏菌菌株29011的结合。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，抗MrkA抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制克隆1、克隆4、克隆5、或克隆6与肺炎克雷伯氏菌菌株29011的结合。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，抗MrkA抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制Kp3、Kp16、克隆1、克隆4、克隆5、或克隆6与肺炎克雷伯氏菌菌株961842的结合。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，抗MrkA抗体或其抗原结合片段竞争性地抑制Kp3、Kp16、克隆1、克隆4、克隆5、或克隆6与肺炎克雷伯氏菌菌株985048的结合。
在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，过量102倍的抗MrkA抗体或其抗原结合片段使1μg Kp3与MrkA的结合降低至少20％。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，过量102倍的抗MrkA抗体或其抗原结合片段使1μg Kp3与MrkA的结合降低至少25％。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，过量102倍的抗MrkA抗体或其抗原结合片段使1μg Kp3与MrkA的结合降低至少30％。
在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，过量102倍的抗MrkA抗体或其抗原结合片段使1μg Kp3与肺炎克雷伯氏菌的结合降低至少20％。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，过量102倍的抗MrkA抗体或其抗原结合片段使1μg Kp3与肺炎克雷伯氏菌的结合降低至少25％。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，过量102倍的抗MrkA抗体或其抗原结合片段使1μgKp3与肺炎克雷伯氏菌的结合降低至少30％。
在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，过量102倍的抗MrkA抗体或其抗原结合片段使1μg Kp3与肺炎克雷伯氏菌菌株29011的结合降低至少20％。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，过量102倍的抗MrkA抗体或其抗原结合片段使1μg Kp3与肺炎克雷伯氏菌菌株29011的结合降低至少25％。在一些实施例中，在竞争性ELISA测定中，过量102倍的抗MrkA抗体或其抗原结合片段使1μg Kp3与肺炎克雷伯氏菌菌株29011的结合降低至少30％。
在一些实施例中，MrkA结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。
在一些实施例中，MrkA结合蛋白(包括例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以至少25％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以至少30％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以至少40％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以至少50％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以至少55％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以至少60％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以约25％至约65％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以约50％至约60％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。
在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约3μg/ml的浓度下以至少25％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约4μg/ml的浓度下以至少25％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约5μg/ml的浓度下以至少25％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。
在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约10μg/ml的浓度下以至少50％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约10μg/ml的浓度下以至少60％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。
在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约10μg/ml的浓度下以约25％至约65％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约10μg/ml的浓度下以约50％至约60％抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。
在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)抑制或减少克雷伯氏菌属细胞粘附(例如克雷伯氏菌属上皮细胞粘附)。
在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以至少20％抑制或减少克雷伯氏菌属细胞粘附(例如克雷伯氏菌属上皮细胞粘附)。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以至少30％抑制或减少克雷伯氏菌属细胞粘附(例如克雷伯氏菌属上皮细胞粘附)。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以至少40％抑制或减少克雷伯氏菌属细胞粘附(例如克雷伯氏菌属上皮细胞粘附)。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以约20％至约50％抑制或减少克雷伯氏菌属细胞粘附(例如克雷伯氏菌属上皮细胞粘附)。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)以约40％至约50％抑制或减少克雷伯氏菌属细胞粘附(例如克雷伯氏菌属上皮细胞粘附)。
在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约10μg/ml的浓度下以至少20％抑制或减少克雷伯氏菌属细胞粘附(例如克雷伯氏菌属上皮细胞粘附)。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约10μg/ml的浓度下以至少30％抑制或减少克雷伯氏菌属细胞粘附(例如克雷伯氏菌属上皮细胞粘附)。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约10μg/ml的浓度下以至少40％抑制或减少克雷伯氏菌属细胞粘附(例如克雷伯氏菌属上皮细胞粘附)。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约10μg/ml的浓度下以约20％至约50％抑制或减少克雷伯氏菌属细胞粘附(例如克雷伯氏菌属上皮细胞粘附)。在一些实施例中，MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)在约10μg/ml的浓度下以约40％至约50％抑制或减少克雷伯氏菌属细胞粘附(例如上皮细胞粘附)。
MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)还包括包含Kp3、Kp16、克隆1、克隆4、克隆5、或克隆6的重链和轻链互补决定区(CDR)序列的MrkA结合蛋白。下表1和表2中描述了Kp3、Kp16、克隆1、克隆4、克隆5和克隆6的CDR序列。
表1.可变重链CDR氨基酸序列
表2.可变轻链CDR氨基酸序列
本文描述的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)可以包含本文描述的单独的可变轻链或可变重链之一。本文描述的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)还可以包含可变轻链和可变重链两者。抗MrkA Kp3、Kp16、克隆1、克隆4、克隆5、和克隆6抗体的可变轻链和可变重链序列提供于下表3和表4中。
表3：可变重链氨基酸序列
表4：可变轻链氨基酸序列
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13-14或53-56至少95％、96％、97％、98％、或99％一致的重链可变区(VH)以及与SEQ ID NO:15-16或57-60至少95％、96％、97％、98％、或99％一致的轻链可变区(VL)。在一些实施例中，特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:13-14或53-56的序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15-16或57-60的序列的轻链可变区。在一些实施例中，与SEQ IDNO:13-16或53-60具有一定序列一致性百分比的多肽仅由于保守性氨基酸取代而不同于SEQ ID NO:13-16或53-60。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少95％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少95％一致的VL，其中该抗原结合蛋白结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少95％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少95％一致的VL，其中该抗原结合蛋白体外诱导至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型的OPK。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少95％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少95％一致的VL，其中该抗原结合蛋白降低受试者中的细菌负荷。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少95％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少95％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少95％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少95％一致的VL，其中该抗原结合蛋白在受试者中赋予存活益处。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少96％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少96％一致的VL，其中该抗原结合蛋白结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少96％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少96％一致的VL，其中该抗原结合蛋白体外诱导至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型的OPK。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少96％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少96％一致的VL，其中该抗原结合蛋白降低受试者中的细菌负荷。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少96％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少96％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少96％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少96％一致的VL，其中该抗原结合蛋白在受试者中赋予存活益处。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少97％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少97％一致的VL，其中该抗原结合蛋白结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少97％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少97％一致的VL，其中该抗原结合蛋白体外诱导至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型的OPK。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少97％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少97％一致的VL，其中该抗原结合蛋白降低受试者中的细菌负荷。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少97％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少97％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少97％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少97％一致的VL，其中该抗原结合蛋白在受试者中赋予存活益处。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少98％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少98％一致的VL，其中该抗原结合蛋白结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少98％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少98％一致的VL，其中该抗原结合蛋白体外诱导至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型的OPK。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少98％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少98％一致的VL，其中该抗原结合蛋白降低受试者中的细菌负荷。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少98％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少98％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少98％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少98％一致的VL，其中该抗原结合蛋白在受试者中赋予存活益处。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少99％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少99％一致的VL，其中该抗原结合蛋白结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少99％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少99％一致的VL，其中该抗原结合蛋白体外诱导至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型的OPK。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少99％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少99％一致的VL，其中该抗原结合蛋白降低受试者中的细菌负荷。
在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:13至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:15至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:14至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:16至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:53至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:57至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:54至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:58至少99％一致的VL，与SEQ ID NO:55至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:59至少99％一致的VL，或与SEQ ID NO:56至少99％一致的VH以及与SEQ ID NO:60至少99％一致的VL，其中该抗原结合蛋白在受试者中赋予存活益处。
单克隆抗体可使用杂交瘤方法制备，如由Kohler和Milstein(1975)Nature[自然]256:495所描述的那些。使用杂交瘤方法，小鼠、仓鼠、或其他适当的宿主动物如上所述进行免疫，以引发淋巴细胞产生将特异性地结合至免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以在体外免疫。免疫后，分离淋巴细胞，并利用例如聚乙二醇与合适骨髓瘤细胞系融合，以形成可随后从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞选择出的杂交瘤细胞。然后产生特异性地针对选定的抗原的单克隆抗体的杂交瘤(如通过免疫沉淀法、免疫印迹法或通过体外结合测定(例如放射免疫测定(RIA)；酶联免疫吸附测定(ELISA))确定的)可在体外培养物中利用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice[单克隆抗体：原理和实践],Academic Press[学术出版社],1986)或在体内在动物中增殖。然后可以将单克隆抗体从培养基或腹水进行纯化。
可替代地，单克隆抗体还可以使用如在美国专利4,816,567中所述的重组DNA方法制备。编码单克隆抗体的多核苷酸是从成熟B细胞或杂交瘤细胞，如通过RT-PCR，使用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物分离，且它们的序列是利用常规程序测定。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到适合的表达载体中，这些载体在转染进入不产生免疫球蛋白的宿主细胞，如大肠杆菌细胞、类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中时，通过这些宿主细胞产生单克隆抗体。还有，所期望物种的重组单克隆抗体或其片段可从表达如所述的期望物种的CDR的噬菌体展示文库分离(McCafferty等人,1990,Nature[自然],348:552-554；Clackson等人,1991,Nature[自然],352:624-628；以及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],222:581-597)。
编码单克隆抗体的一种或多种多核苷酸可进一步以多种不同的方式使用重组DNA技术修饰以产生可替代的抗体。在一些实施例中，例如，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以被1)例如人类抗体的那些区域取代以便产生嵌合抗体或被2)非免疫球蛋白多肽取代以便产生融合抗体。在一些实施例中，截断或去除这些恒定区以产生所希望的单克隆抗体的抗体片段。定点诱变或高密度诱变可变区可以用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。
在一些实施例中，针对MrkA的单克隆抗体是人源化抗体。在某些实施例中，当给予至人类受试者时，此类抗体在治疗上用于降低抗原性和HAMA(人类抗小鼠抗体)应答。人源化抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生。在某些可替代的实施例中，针对MrkA的抗体是人类抗体。
可以使用本领域已知的不同技术来直接制备人类抗体。可以产生在体外免疫的或从产生针对靶抗原的抗体的免疫个体分离的永生化人B淋巴细胞(参见例如，Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法],Alan R.Liss,第77页(1985)；Boemer等人,1991,J.Immunol.[免疫学杂志],147(1):86-95；以及美国专利5,750,373)。还有，人类抗体可以选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人类抗体，如例如在Vaughan等人,1996,Nat.Biotech.[自然生物技术],14:309-314，Sheets等人,1998,Proc.Nat’l.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊],95:6157-6162，Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],227:381，以及Marks等人,1991,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],222:581中所述的。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还描述在美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484；和7,264,963；和Rothe等人,2007,J.Mol.Bio.[分子生物学杂志],doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018中(将其中每一个通过引用以其全文并入)。亲和力成熟策略和链改组策略(Marks等人,1992,Bio/Technology[生物/技术]10:779-783，通过引用以其全文并入)在本领域是已知的，并且可用于产生高亲和力人类抗体。
人源化抗体也可以在含有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制造，这些基因座在免疫时能够在内源性免疫球蛋白产生不存在时产生全套人类抗体。这种途径描述于美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016中。
根据本披露，技术可经改编以产生对MrkA具有特异性的单链抗体(参见美国专利号4,946,778)。此外，方法可经改编以构建Fab表达文库(Huse等人,Science[科学]246:1275-1281(1989))，以允许快速且有效地鉴定具有针对MrkA或其片段的期望特异性的单克隆Fab片段。抗体片段可通过本领域的技术来产生，包括但不限于：(a)通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab')2片段；(b)通过减少F(ab')2片段的二硫键产生的Fab片段，(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段，和(d)Fv片段。
尤其是在抗体片段的情况下，可以进一步期望修饰抗体以增加其血清半衰期。这可以例如通过将补救受体结合表位并入抗体片段，通过使抗体片段中的适当的区域突变，或通过将表位并入随后融合在抗体片段的末端或中部的肽标签(例如，通过DNA或肽合成)来实现。
本披露的抗原结合蛋白可进一步包含抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可在其C末端连接至抗体轻链恒定结构域，包括人类Cκ或Cγ链。类似地，基于VH结构域的抗原结合蛋白可在其C末端附接至衍生自任何抗体同种型(例如IgG、IgA、IgE和IgM)和任何同种型亚类(尤其是IgG1和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或一部分(例如CH1结构域)。例如，免疫球蛋白重链可以衍生自抗体同种型亚类IgG1。具有这些特性并且使可变区稳定的任何合成或其他恒定区变体也被考虑用于在本披露的实施例中使用。抗体恒定区可以是具有YTE突变的Fc区，使得Fc区包含以下氨基酸取代：M252Y/S254T/T256E。此残基编号基于卡巴特编号。Fc区中的YTE突变增加抗原结合蛋白的血清持久性(参见Dall’Acqua,W.F.等人(2006)The Journal ofBiological Chemistry[生物化学杂志],281,23514-23524)。
在本文的一些实施例中，修饰抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段，以改进效应物功能，例如以增强抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过进行一个或多个氨基酸取代或通过在Fc区中引入半胱氨酸来实现。可以增强或减弱抗体的效应物功能和/或改变抗体的药代动力学特性(例如半衰期)的Fc区的变体(例如，氨基酸取代和/或添加和/或缺失)例如披露于美国专利号6,737,056B1、美国专利申请公开号2004/0132101 A1、美国专利号6,194,551和美国专利号5,624,821和5,648,260中。一个特定取代组，三重突变L234F/L235E/P331S(“TM”)使人类IgG1分子与人类C1q、CD64、CD32A和CD16的结合活性大幅降低。参见例如，Oganesyan等人,Acta Crystallogr DBiol Crystallogr.[晶体学报D卷生物晶体学]64:700-704(2008)。在其他情况下，恒定区修饰增加了血清半衰期。可通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来增加包含Fc区的蛋白质的血清半衰期。
当抗原结合蛋白是抗体或其抗原结合片段时，其还可以包含选自下组的重链免疫球蛋白恒定结构域，该组由以下各项组成：(a)IgA恒定结构域；(b)IgD恒定结构域；(c)IgE恒定结构域；(d)IgG1恒定结构域；(e)IgG2恒定结构域；(f)IgG3恒定结构域；(g)IgG4恒定结构域；和(h)IgM恒定结构域。在一些实施例中，抗原结合蛋白是包含IgG1重链免疫球蛋白恒定结构域的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗原结合蛋白是包含IgG1/IgG3嵌合重链免疫球蛋白恒定结构域的抗体或其抗原结合片段。
本披露的抗原结合蛋白还可以包含选自下组的轻链免疫球蛋白恒定结构域，该组由以下各项组成：(a)Igκ恒定结构域；以及(b)Igλ恒定结构域。
本披露的抗原结合蛋白还可以包含人类IgG1恒定结构域和人类λ恒定结构域。
本披露的抗原结合蛋白可以包含IgG Fc结构域，该IgG Fc结构域在位置252、254和256包含突变，其中位置编号是根据如卡巴特中的EU索引。例如，IgG1Fc结构域可以包含M252Y、S254T、和T256E的突变，其中位置编号是根据如卡巴特中的EU索引。
本披露还涉及本披露的抗原结合蛋白的分离的VH结构域和/或本披露的抗原结合蛋白的分离的VL结构域。
本披露的抗原结合蛋白(包括抗MrkA抗体或其抗原结合片段)可用可检测标记或功能标记来标记。可检测标记包括放射性标记，如131I或99Tc，可使用在抗体成像领域中已知的常规化学来将它们附接至本发明的抗体。标记还包括酶标记，如辣根过氧化物酶。标记进一步包括化学部分，如生物素，其可经由结合至特定同源可检测部分(例如标记的抗生物素蛋白)来检测。可以附接至本披露的抗原结合蛋白(包括抗体或其抗原结合片段)的其他可检测标记或功能标记的非限制性实例包括：同位素标记，磁标记，氧化还原活性部分，光学染料，生物素化的基团，荧光部分如生物素信号传导肽、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)，以及通过次级报告物识别的多肽表位如组氨酸肽(his)、血球凝集素(HA)、金结合肽、Flag；放射性同位素，放射性核素，毒素，治疗剂和化疗剂。
III.药物组合物和疫苗
本披露还提供了药物组合物，该药物组合物包含本文所述的MrkA结合剂(包括例如抗MrkA抗体或抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸中的一种或多种。在某些实施例中，药物组合物还包含药学上可接受的运载体或药学上可接受的赋形剂。在某些实施例中，这些药物组合物可用于治疗、预防或改善人类患者中与克雷伯氏菌属感染相关联的病症。在某些实施例中，这些药物组合物可用于抑制克雷伯氏菌属的生长。
在某些实施例中，通过将本文所述的抗体或抗MrkA结合剂、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸与药学上可接受的运载体(例如载体、赋形剂)组合来制备配制品以便储存和使用(参见例如，Remington,The Science andPractice ofPharmacy[药学科学与实践]第20版,Mack Publishing[麦克出版社],2000，通过引用并入本文)。在一些实施例中，该配制品包含防腐剂。
本披露的药物组合物可以以任何数目的用于局部或全身治疗的方式给予。
在一些实施例中，包含本文所述的MrkA结合剂(包括例如抗MrkA抗体或抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸中的一种或多种的药物组合物用于治疗肺炎、尿路感染、败血症、新生儿败血症、腹泻、软组织感染、器官移植后感染、手术感染、伤口感染、肺部感染、化脓性肝脓肿(PLA)、眼内炎、脑膜炎、坏死性脑膜炎、强直性脊柱炎或脊柱关节病。在一些实施例中，包含本文所述的MrkA结合剂(包括例如抗MrkA抗体或抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸中的一种或多种的药物组合物可用于医院感染、机会性感染、器官移植后感染以及与克雷伯氏菌属感染(例如，肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌感染)相关联的其他病症。在一些实施例中，包含本文所述的MrkA结合剂(包括例如抗MrkA抗体或抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸中的一种或多种的药物组合物在暴露于克雷伯氏菌属污染的装置(包括例如呼吸机、导管或静脉内导管)的受试者中是有用的。
在一些实施例中，该药物组合物包含有效抑制受试者中克雷伯氏菌属生长的量的MrkA结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌。
在一些实施例中，该药物组合物包含在受试者中有效引发针对克雷伯氏菌属的免疫应答(例如产生抗体)的量的MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌。
在一些实施例中，治疗、预防和/或改善与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的方法包括使感染克雷伯氏菌属的受试者在体内接触包含MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物。在一些实施例中，包含MrkA结合蛋白、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物是在受试者已经暴露于细菌的同时或不久之后给予以预防感染。在一些实施例中，包含MrkA结合蛋白的药物组合物是在感染后作为治疗剂给予。
在某些实施例中，治疗、预防和/或改善克雷伯氏菌属感染的方法包括向受试者给予包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物。在某些实施例中，该受试者是人。在一些实施例中，包含MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物是在受试者感染克雷伯氏菌属之前给予的。在一些实施例中，包含MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物是在受试者感染克雷伯氏菌属之后给予的。
在某些实施例中，将包含MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物给予至带呼吸机的受试者。在某些实施例中，受试者具有导管(例如，导尿管或静脉内导管)。在某些实施例中，受试者正在接受抗生素。
在某些实施例中，包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物用于治疗或预防医院的克雷伯氏菌属感染。在某些实施例中，包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物用于治疗或预防机会性克雷伯氏菌属感染。在某些实施例中，包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物用于治疗或预防器官移植后的克雷伯氏菌属感染。
在某些实施例中，包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物用于治疗或预防对头孢菌素具有耐药性的克雷伯氏菌属的感染。在某些实施例中，包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物用于治疗或预防对氨基糖苷具有耐药性的克雷伯氏菌属的感染。在某些实施例中，包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物用于治疗或预防对喹诺酮具有耐药性的克雷伯氏菌属的感染。在某些实施例中，包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物用于治疗或预防对碳青霉烯具有耐药性的克雷伯氏菌属的感染。在某些实施例中，包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物用于治疗或预防对头孢菌素、氨基糖苷、喹诺酮和碳青霉烯具有耐药性的克雷伯氏菌属的感染。在某些实施例中，包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物用于治疗或预防产生超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的克雷伯氏菌属的感染。在某些实施例中，包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物用于治疗或预防对头孢菌素、氨基糖苷和喹诺酮具有耐药性的克雷伯氏菌属的感染。在某些实施例中，包含MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物用于治疗或预防产生碳青霉烯酶的克雷伯氏菌属的感染。
为了治疗、预防和/或改善与克雷伯氏菌属感染相关联的病症，本文所述的药物组合物、抗体、抗MrkA结合剂、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的适当剂量取决于病症的类型，病症的严重程度和历程，病症的反应性，给予药物组合物、抗体、抗MrkA结合剂、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸是出于治疗目的还是预防目的，之前的治疗，患者的临床病史等等，所有这些都由治疗医师裁量。可以将药物组合物、抗体、抗MrkA结合剂、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸给予一次或进行一系列持续数天至数月的治疗，或直到实现治愈或实现病症的降低。最佳给药方案可以从患者体内药物积累的测量来计算，并且将根据单独抗体或药剂的相对效价而变化。给药医师可以很容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。
如本文所提供的，可将MrkA、其免疫原性片段、或编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸给予受试者以防止克雷伯氏菌属感染，例如通过引发针对保护性MrkA抗原的抗体。在另外的方面，包含MrkA、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的免疫原性组合物可用于产生诊断克雷伯氏菌属感染的抗体，或产生用于预防和/或治疗此类克雷伯氏菌属感染的疫苗以及用以维持针对该免疫原性组合物的一种或多种免疫原的抗体的高滴度的加强疫苗。
在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段是肺炎克雷伯氏菌MrkA或其免疫原性片段。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段是肺炎克雷伯氏菌MrkA。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17中列出的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段是单体的。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段是寡聚体的。
在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:17中列出的序列至少75％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:17中列出的序列至少80％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:17中列出的序列至少85％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQID NO:17中列出的序列至少90％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:17中列出的序列至少95％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:17中列出的序列至少96％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:17中列出的序列至少97％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:17中列出的序列至少98％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:17中列出的序列至少99％一致的序列。
在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-40，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-50，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-100，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-150，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-175，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。
在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17的氨基酸171-202，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17的氨基酸150-202，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17的氨基酸100-202，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17的氨基酸50-202，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。
在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-40和171-202，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。
在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:19中列出的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:19中列出的序列至少75％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:19中列出的序列至少80％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:19中列出的序列至少85％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:19中列出的序列至少90％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ IDNO:19中列出的序列至少95％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:19中列出的序列至少96％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:19中列出的序列至少97％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:19中列出的序列至少98％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:19中列出的序列至少99％一致的序列。
在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的氨基酸1-42，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的氨基酸1-50，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的氨基酸1-100，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的氨基酸1-150，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的氨基酸1-175，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。
在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的氨基酸173-204，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的氨基酸150-204，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的氨基酸100-204，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施例中，MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:19的氨基酸50-204，或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。
疫苗可以制备成注射剂，作为液体溶液或是悬浮液。油基疫苗也是熟知的，例如用于吸入。也可以配制在使用前溶解或悬浮的固体形式。通常添加药物载体、稀释剂和赋形剂，它们与活性成分相容且是药用上可接受的。此类载体的实例包括但不限于水、盐水溶液、右旋糖或甘油。也可以使用载体的组合。疫苗组合物可以包含稳定pH、或作为佐剂、润湿剂或乳化剂的物质，这些物质可以用来提高疫苗的效力。在一些实施例中，疫苗包含一种或多种佐剂。
通常通过常规途径给予疫苗，例如静脉内、皮下、腹膜内或粘膜途径。可以通过肠胃外注射给药，例如皮下或肌内注射。
疫苗可以按单剂量方案给予，或者任选地以多剂量方案给予。足以赋予针对克雷伯氏菌属的免疫力的疫苗的量由本领域技术人员熟知的方法确定。此量值将基于疫苗接受者的特征来确定，包括年龄、性别和总体身体状况的考虑以及所需免疫水平。
IV.使用方法
本文所述的MrkA结合剂(包括例如抗MrkA抗体及其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、以及编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸可用于各种应用，这些应用包括但不限于肺炎、尿路感染、败血症、新生儿败血症、腹泻、软组织感染、器官移植后感染、手术感染、伤口感染、肺部感染、化脓性肝脓肿(PLA)、眼内炎、脑膜炎、坏死性脑膜炎、强直性脊柱炎和脊柱关节病。在一些实施例中，本文所述的MrkA结合剂(包括抗体及其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、以及编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸可用于医院感染、机会性感染、器官移植后感染以及与克雷伯氏菌属感染(例如，肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌感染)相关联的其他病症。在一些实施例中，MrkA结合剂、MrkA多肽、其免疫原性片段、以及编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸在暴露于克雷伯氏菌属污染的装置(包括例如呼吸机、导管或静脉内导管)的受试者中是有用的。
在一些实施例中，本披露提供了治疗、预防和/或改善与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的方法，这些方法包括向受试者给予有效量的MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸。在一些实施例中，该量有效地抑制受试者中克雷伯氏菌属的生长。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌。在一些实施例中，受试者已经暴露于克雷伯氏菌属。在一些实施例中，已经在受试者中检测到克雷伯氏菌属。在一些实施例中，例如基于症状，受试者疑似感染克雷伯氏菌属。
在一些实施例中，本披露提供了治疗、预防和/或改善与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的方法，这些方法包括向受试者给予一定量的MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸，其中该量有效地在受试者中产生针对克雷伯氏菌属的免疫应答(例如产生抗体)。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌。在一些实施例中，受试者已经暴露于克雷伯氏菌属。在一些实施例中，已经在受试者中检测到克雷伯氏菌属。在一些实施例中，例如基于症状，受试者疑似感染克雷伯氏菌属。
在一些实施例中，本披露进一步提供了抑制克雷伯氏菌属生长的方法，这些方法包括向受试者给予MrkA结合剂(例如，抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。在一些实施例中，克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌。在一些实施例中，受试者已经暴露于克雷伯氏菌属。在一些实施例中，已经在受试者中检测到克雷伯氏菌属。在一些实施例中，例如基于症状，受试者疑似感染克雷伯氏菌属。
在一些实施例中，治疗、预防和/或改善与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的方法包括使感染克雷伯氏菌属的受试者在体内接触MrkA结合剂(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸。在某些实施例中，使细胞与MrkA结合剂、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸接触是在受试者中进行。例如，可以将MrkA结合剂、MrkA多肽、其免疫原性片段、以及编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸给予至小鼠克雷伯氏菌属感染模型以降低细菌负荷。在一些实施例中，在将细菌引入受试者之前，给予MrkA结合剂、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸以预防感染。在一些实施例中，MrkA结合剂、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸是在受试者已经暴露于细菌的同时或不久之后给予以预防感染。在一些实施例中，MrkA结合剂、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸是在感染后作为治疗剂给予受试者。
在某些实施例中，治疗、预防和/或改善克雷伯氏菌属感染的方法包括向受试者给予有效量的MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸。在某些实施例中，该受试者是人。在一些实施例中，有效量的MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸是在受试者或患者感染克雷伯氏菌属之前给予的。在一些实施例中，有效量的MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸是在受试者或患者感染克雷伯氏菌属之后给予的。
在某些实施例中，受试者正带有呼吸机。在某些实施例中，受试者具有导管(例如，导尿管或静脉内导管)。在某些实施例中，受试者正在接受抗生素。
在某些实施例中，克雷伯氏菌属感染是医院感染。在某些实施例中，克雷伯氏菌属感染是机会性感染。在某些实施例中，克雷伯氏菌属感染是在器官移植之后。
在某些实施例中，克雷伯氏菌属对头孢菌素具有耐药性。在某些实施例中，克雷伯氏菌属对氨基糖苷具有耐药性。在某些实施例中，克雷伯氏菌属对喹诺酮具有耐药性。在某些实施例中，克雷伯氏菌属对碳青霉烯具有耐药性。在某些实施例中，克雷伯氏菌属对头孢菌素、氨基糖苷、喹诺酮和碳青霉烯具有耐药性。在某些实施例中，克雷伯氏菌属产生超广谱β-内酰胺酶(ESBL)。在某些实施例中，克雷伯氏菌属对头孢菌素、氨基糖苷、和喹诺酮具有耐药性。在某些实施例中，克雷伯氏菌属产生碳青霉烯酶。
在某些实施例中，治疗、预防和/或改善克雷伯氏菌属感染的方法包括向受试者给予有效量的MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸、以及抗生素。MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸、以及抗生素可以同时或顺序给予。MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸、以及抗生素可以在相同的药物组合物中给予。MrkA结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸、以及抗生素可以在分开的药物组合物中同时或顺序给予。抗生素可以是例如碳青霉烯或粘菌素。
本披露还提供了检测MrkA(例如MrkA寡聚体)的方法。在一些实施例中，检测MrkA或MrkA寡聚体的方法包括使样品与本文提供的MrkA抗体或其抗原结合片段接触，并测定抗体或其抗原结合片段与样品的结合。评估结合的方法在本领域是熟知的。
V.试剂盒
还提供了包含根据本披露的任何方面或实施例的分离的抗原结合蛋白(例如抗MrkA抗体分子或其抗原结合片段)、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸的试剂盒，作为本披露的方面。在试剂盒中，可以将抗原结合蛋白或抗MrkA抗体、MrkA多肽、其免疫原性片段、或者编码MrkA多肽或其免疫原性片段的多核苷酸进行标记，以允许测定其在样品中的反应性，例如如下文进一步所述。试剂盒的组分通常为无菌的并且处于密封小瓶或其他容器中。试剂盒可用于诊断分析或抗体分子适用的其他方法中。试剂盒可含有在方法(例如根据本披露的方法)中使用组分的说明书。帮助或实现执行这种方法的辅助材料可包括于本披露的试剂盒中。
样品中抗体或其抗原结合片段的反应性可以通过任何适当的手段来测定。放射免疫测定(RIA)为一个可能。将放射性标记的抗原与未标记的抗原(测试样品)混合并且允许结合至抗体。将结合的抗原与未结合的抗原在物理上分离并且确定结合至抗体的放射性抗原的量。测试样品中的抗原越多，结合至抗体的放射性抗原越少。竞争性结合测定还可用于非放射性的抗原，使用连接至报道分子的抗原或类似物。报道分子可为具有光谱分离吸收或发射特性的荧光色素、磷光体或激光染料。合适的荧光色素包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和德克萨斯红。合适的发色染料包括二氨基联苯胺。
其他报道物包括大分子胶状颗粒或颗粒材料，例如有色、磁性或顺磁性的乳胶珠粒，以及可直接或间接地导致在视觉上观察、以电子方式检测或以其他方式记录可检测信号的生物学或化学活性剂。这些分子可以是催化反应的酶，这些反应使颜色显现或改变或引起例如电性质变化。其可为分子可激发的，这样使得能量状态之间的电子跃迁产生特有光谱吸收或发射。其可包括结合生物传感器使用的化学实体。可使用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉亲和素以及碱性磷酸酶检测系统。
单独抗体-报道物缀合物所产生的信号可用于得出样品(正常和测试)中的相关抗体结合的可定量的绝对或相对数据。
本披露还提供了在竞争测定中如上所述的抗原结合蛋白用于测量抗原水平的用途，该用途包括在竞争测定中通过使用由本披露提供的抗原结合蛋白测量样品中MrkA水平的方法。在一些实施例中，不需要结合的与未结合的抗原的物理分离。在一些实施例中，将报道分子与抗原结合蛋白连接以使得在结合时发生物理或光学变化。报道分子可以直接或间接产生可检测的，且优选可测量的信号。在一些实施例中，报道分子的连接是直接或间接的、或共价的，例如通过肽键或非共价相互作用。经由肽键的连接可以作为编码抗体和报道分子的基因融合物的重组表达的结果。
本披露还提供了采用根据本披露的抗原结合蛋白直接测量MrkA水平的方法。在一些实施例中，这些方法利用生物传感器系统。
VI.多核苷酸和宿主细胞
在另外的方面，本披露提供了分离的核酸，该分离的核酸包含编码根据本披露的抗原结合蛋白、VH结构域和/或VL结构域、MrkA多肽或其免疫原性片段的核酸序列。在一些方面，本披露提供了制造或制备本文所述的抗原结合蛋白、VH结构域和/或VL结构域、MrkA多肽或其免疫原性片段的方法，这些方法包括在导致产生所述抗原结合蛋白、VH结构域和/或VL结构域、MrkA多肽或其免疫原性片段的条件下表达所述核酸，并且任选地回收该抗原结合蛋白、VH结构域和/或VL结构域、MrkA多肽或其免疫原性片段。
由本披露提供的核酸包括DNA和/或RNA。在一个方面，该核酸是cDNA。在一个方面，本披露提供了编码如上所述的CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点或抗体分子(例如scFv或IgG1)的核酸。
本披露的一个方面提供了编码本文所述的VH CDR或VL CDR序列的核酸，该核酸通常为分离的，任选地为cDNA。在一些实施例中，VH CDR选自SEQ ID NO:1-6或29-40。在一些实施例中，VL CDR选自SEQ ID NO:7-12或41-52。还提供了编码Kp3、Kp16、克隆1、克隆4、克隆5或克隆6的CDR组的核酸，编码Kp3、Kp16、克隆1、克隆4、克隆5或克隆6的HCDR组的核酸，以及编码Kp3、Kp16、克隆1、克隆4、克隆5或克隆6的LCDR组的核酸，也提供了编码单独的CDR、HCDR、LCDR以及CDR、HCDR、LCDR组的核酸，如表1和表2所述。在一些实施例中，本披露的核酸编码如表3和表4中所述的Kp3、Kp16、克隆1、克隆4、克隆5或克隆6的VH和/或VL结构域。
在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:17中列出的序列至少75％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:17中列出的序列至少80％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:17中列出的序列至少85％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:17中列出的序列至少90％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:17中列出的序列至少95％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:17中列出的序列至少96％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:17中列出的序列至少97％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:17中列出的序列至少98％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:17中列出的序列至少99％一致的序列。
在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:17的氨基酸1-40或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:17的氨基酸1-50或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:17的氨基酸1-100或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:17的氨基酸1-150或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:17的氨基酸1-175或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。
在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:17的氨基酸171-202或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:17的氨基酸150-202或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:17的氨基酸100-202或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:17的氨基酸50-202或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。
在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:17的氨基酸1-40和171-202或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。
在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:19中列出的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:19中列出的序列至少75％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:19中列出的序列至少80％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:19中列出的序列至少85％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:19中列出的序列至少90％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:19中列出的序列至少95％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:19中列出的序列至少96％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:19中列出的序列至少97％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:19中列出的序列至少98％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO:19中列出的序列至少99％一致的序列。
在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:19的氨基酸1-42或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:19的氨基酸1-50或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:19的氨基酸1-100或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:19的氨基酸1-150或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:19的氨基酸1-175或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。
在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:19的氨基酸173-204或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:19的氨基酸150-204或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:19的氨基酸100-204或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。在一些实施例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO:19的氨基酸50-204或与其至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％一致的序列。
本披露提供了足以用作杂交探针、PCR引物或测序引物的分离的多核苷酸或cDNA分子，其是本文披露的核酸分子的片段或其互补物。该核酸分子可以例如任选地连接至控制序列。
本披露还提供了呈包含如上所述的至少一种多核苷酸的质粒、载体、转录盒或表达盒形式的构建体。
本披露还提供了包含一种或多种核酸、质粒、载体或如上所述物的重组宿主细胞。编码任何CDR或任何CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体抗原结合位点、抗体分子(例如如所提供的scFv或IgG1)(参见例如表1-4)、MrkA多肽、或其免疫原性片段的核酸自身形成了本披露的方面，产生所编码产物的方法也是一方面，该方法包括从编码该产物(例如本文披露的抗原结合蛋白)的核酸进行表达。表达可以便利地通过在适当的条件下培养包含本文所述的核酸的重组宿主细胞来实现。在通过表达产生之后，可以使用任何适合的技术分离和/或纯化CDR、CDR组、VH或VL结构域、抗原结合蛋白、MrkA多肽、或其免疫原性片段。
在一些情况下，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，如NS0鼠类骨髓瘤细胞、人类细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
抗原结合蛋白、VH和/或VL结构域、MrkA多肽、其免疫原性片段、以及编码核酸分子和载体可以例如从它们的天然环境中以基本上纯的或均质的形式分离和/或纯化，或者在核酸的情况下，不含或基本上不含具有除编码具有所需功能的多肽的序列以外的来源的核酸或基因。根据本披露的核酸可以包含DNA或RNA并且可以是全部或部分合成的。提及如本文阐明的核苷酸序列涵盖具有指定序列的DNA分子，并且涵盖具有指定序列的RNA分子，其中U取代T，除非上下文另外要求。
在各种不同的宿主细胞中克隆并且表达多肽的系统为熟知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、酵母和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。可在本领域中用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚胎肾细胞、人胚胎视网膜细胞和许多其他细胞。常见的细菌宿主为大肠杆菌。
在原核细胞例如大肠杆菌中表达抗体和抗体片段在本领域为沿用已久的。关于综述，参见例如Plückthun,A.Bio/Technology[生物/技术]9:545-551(1991)。在培养物中的真核细胞中的表达也可由本领域技术人员用作产生抗原结合蛋白的选择方案，例如ChaddHE和Chamow SM(2001)110 Current Opinion in Biotechnology[生物技术新见]12:188-194，Andersen DC和Krummen L(2002)Current Opinion in Biotechnology[生物技术新见]13:117，Larrick JW和Thomas DW(2001)Current opinion in Biotechnology[生物技术新见]12:411-418。
可以选择或构建含有适当调节序列的合适载体，这些调节序列包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及视情况而定的其他序列。载体可以是质粒、病毒，例如噬菌体或噬菌粒，视情况而定。关于进一步的细节，参见例如Molecular Cloning:a Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]:第3版,Sambrook和Russell,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]。许多已知的用于操作核酸的技术和方案，例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入到细胞中和基因表达以及蛋白质分析中，详细描述于Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南],第二版,Ausubel等人编,John Wiley&Sons[约翰威利父子出版公司],1988，Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethodsfrom CurrentProtocols in Molecular Biology[精编分子生物学实验指南：分子生物学实验指南的概要],Ausubel等人编,John Wiley&Sons[约翰威利父子出版公司],第4版1999中。Sambrook等人和Ausubel等人(二者)的披露均通过引用并入本文。
因此本披露的另一个方面提供含有如本文披露的核酸的宿主细胞。例如，本披露提供了用核酸转化的宿主细胞，该核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码本披露的抗原结合蛋白，或本披露的抗原结合蛋白的抗体CDR、CDR组、VH和/或VL结构域，MrkA多肽或其免疫原性片段。在一些实施例中，宿主细胞包含本披露的所表达的抗原结合蛋白，或本披露的抗原结合蛋白的抗体CDR、CDR组、VH和/或VL结构域，MrkA多肽或其免疫原性片段。
这种宿主细胞可以是在体外并且可在培养物中。这种宿主细胞可以是分离的宿主细胞。这种宿主细胞可以是在体内。
本文提供的又另一个方面是包括将这种核酸引入宿主细胞中的方法。引入可使用任何可获得的技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、使用逆转录病毒或其他病毒例如牛痘或(对于昆虫细胞)杆状病毒的脂质体介导转染和转导。将核酸引入宿主细胞(尤其是真核细胞)中可使用病毒或基于质粒的系统。质粒系统可保持游离或可并入宿主细胞或人工染色体中。并入可通过将一个或多个副本随机或靶向整合至单一或多个基因座来完成。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体来转染。
在引入之后可例如通过在表达基因的条件下培养宿主细胞来导致或允许从核酸中表达。
在一个实施例中，将本披露的核酸整合至宿主细胞的基因组(例如染色体组)中。整合可根据标准技术通过将促进与基因组重组的序列包含在内来促成。
本披露还提供了一种方法，该方法包括在表达系统中使用构建体(例如如上所述的质粒、载体等)以表达如上所述的抗原结合蛋白或多肽。
在另一方面，本披露提供了产生本披露的抗原结合蛋白(例如抗MrkA抗体或其抗原结合片段)的杂交瘤。
本披露的又另一个方面提供了产生本披露的抗体结合蛋白、MrkA多肽或其免疫原性片段的方法，该方法包括从编码核酸引起表达。这种方法可以包括在适于产生所述抗原结合蛋白、MrkA多肽或其免疫原性片段的条件下培养宿主细胞。
在一些实施例中，产生方法还包括分离和/或纯化由宿主细胞或杂交瘤产生的抗原结合蛋白(包括抗体或其抗原结合片段)、MrkA多肽或其免疫原性片段。
实例
鉴于需要鉴定对克雷伯氏菌属感染有保护作用的药剂，使用新型的基于功能的筛选测定来鉴定革兰氏阴性细菌肺炎克雷伯氏菌的交叉保护性靶标。此新型测定鉴定了能够诱导调理吞噬杀伤(OPK)的抗体，并且在开始就不聚焦于任何特定的靶抗原。
材料与方法
肺炎克雷伯氏菌菌株信息
所有肺炎克雷伯氏菌分离株均获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC，马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州(VA))或Eurofin保藏中心。通过用含有CpsB和WaaL ORF的质粒进行等位基因替换来构建荚膜和O-抗原缺陷型肺炎克雷伯氏菌43816菌株(43816ΔcpsBΔWaaL或43816DM)，并在庆大霉素的存在下进行选择。挑选庆大霉素耐药性菌落并扩增。通过PCR分析确认了CpsB和WaaL基因的缺失。为了构建表达荧光素酶的肺炎克雷伯氏菌菌株(Lux菌株)，用含有荧光素酶报道基因的质粒转化各种肺炎克雷伯氏菌临床分离株，并选择庆大霉素耐药性菌落。除非另有说明，否则所有肺炎克雷伯氏菌培养物是在37℃下保持在2xYT培养基中，适当时补充抗生素。
噬菌体淘选和筛选
使用从健康供体构建的ScFv噬菌体展示文库进行选择，如在Vaughan等人,NatureBiotechnology[自然生物技术]14:309-14(1996)中所述。对于选择，将来自43816ΔcpsBΔWaaL的9x109个肺炎克雷伯氏菌细胞用作第一轮的淘选抗原，随后对野生型菌株1901(ATCCBAA-1901)和1899(ATCC BAA-1899)的等比混合物进行又两轮的淘选。对于每一轮，将细菌细胞在对数中期收获，并封闭(2×YT+3％干乳)，随后添加1x1012个封闭的噬菌体粒子。然后将细胞通过重复的重悬浮于PBS中来洗涤七次。将结合的噬菌体粒子用0.1N HCl洗脱，用1MTris-HCl(pH 8.0)中和，并用于感染TG1以便噬菌体粒子扩增和随后多轮的淘选。使用用第三轮噬菌体淘选输出感染的TG1细胞制备噬菌粒。将ScFv片段从纯化的噬菌粒池制备，并亚克隆到scFv-Fc表达载体中以用于近产物形式的表达和筛选。将与1900、3556、和MGH78578分离株具有交叉反应性的克隆在OPK测定中进一步表征。
肺炎克雷伯氏菌特异性杂交瘤的分离
用43816ΔcpsBΔWaaL经由腹膜内(I.P.)途径，每周对Balb/c小鼠进行免疫，持续四周，随后用野生型肺炎克雷伯氏菌临床分离株(Kp1901和1899)的混合物进行最终加强。在免疫结束时，将淋巴结淋巴细胞和脾细胞收获并与P3X骨髓瘤融合并在1x HAT培养基中进行选择。然后通过全细菌ELISA，将来自所得杂交瘤的上清液针对与43816ΔcpsBΔWaaL的结合进行筛选。将阳性结合物进行高通量OPK测定以针对对抗肺炎克雷伯氏菌的潜在保护性杂交瘤进行选择。
抗肺炎克雷伯氏菌全细菌ELISA
通过如在DiGiandomenico等人,J Exp Med[实验医学杂志],209:1273-87(2012)(将其通过引用并入本文)中描述的ELISA评估抗肺炎克雷伯氏菌抗体和多个菌株的结合。简而言之，将肺炎克雷伯氏菌的单个菌落接种到2xYT培养基中，直到培养物达到对数期。将细菌包被在384孔板(Nunc MaxiSorp)上，在4℃过夜。对一组板进行包被，用类似制备的皮蒂不动杆菌(Acinetobactor pitti)19004(ATCC19004)培养物作为阴性对照。在用补充有4％BSA的PBS(PBS-B)封闭后，将包被的板与抗肺炎克雷伯氏菌抗体一起孵育1h。然后将板用PBS-T(PBS+0.1％吐温20)进行洗涤，之后添加HRP缀合的二级抗体持续1小时，随后进行洗涤并添加TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)底物。通过添加0.1N HCL使显色终止，并通过酶标仪(分子仪器公司(Molecular Devices))测量450nm处的吸光度。将数据用Prism软件绘制。
高通量调理吞噬杀伤(OPK)测定
OPK测定是基于DiGiandomenico等人,J Exp Med[实验医学杂志],209:1273-87(2012)中描述的程序加以修改进行。简而言之，将携带荧光素酶的肺炎克雷伯氏菌菌株(Lux)的对数期培养物稀释至约2x106个细胞/ml。将四种组分在384孔板中混合在一起用于OPK测定：细菌、稀释的幼兔血清(Cedarlane公司，1:10)、分化的HL-60细胞、和抗体。将混合物在振荡(250rpm)下在37℃孵育两小时。然后使用Envision多标记酶标仪(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))测量相对光单位(RLU)。通过比较来自用抗肺炎克雷伯氏菌mAb和阴性对照mAb的测定的RLU来确定杀伤百分比。
共聚焦显微术
使肺炎克雷伯氏菌43816在2xYT培养基中于37℃生长过夜。通过将细菌与MrkA特异性单克隆抗体Kp3孵育，然后与Alexa 488标记的抗人类IgG二级抗体(英杰公司(Invitrogen))孵育，来实现荧光标记。然后将细菌用4％中性缓冲液福尔马林固定，并装在盖玻片上。共聚焦显微术是使用由徕卡DMI6000B倒置显微镜(徕卡显微系统公司(LeicaMicrosystems))组成的徕卡TCS SP5共聚焦系统进行。使用LAS AF 2.2.1版徕卡应用软件套装(徕卡显微系统公司)分析图像。
从肺炎克雷伯氏菌裂解物中免疫沉淀
通过离心收集肺炎克雷伯氏菌过夜培养物，并将细胞沉淀重悬于3ml补充有蛋白酶抑制剂混合物和DNaseI(2μl/ml，200U/μl)的B-PER(赛默科技公司(ThermoScientific))缓冲液中。在室温下孵育40min后，通过在桌面Eppendorf离心机中以最高速度(14,000rpm/min)在4℃下离心20min来收集上清液。将澄清的裂解物与40μl蛋白A/G珠粒(皮尔斯公司(Pierce)，#20422)混合并在4℃下孵育2小时。通过在4℃下以最高速度(14,000rpm/min)再次离心15min来收集裂解物。将澄清的裂解物移至含有15μl蛋白A/G珠粒(用B-PER预洗涤)、6μg免疫沉淀抗体的新Eppendorf管中，在4℃下在旋转器上孵育3小时。然后通过在4℃下以10,000rpm旋转1分钟，随后用冰冷的B-PER缓冲液洗涤三次来收集珠粒。然后将免疫沉淀的样品重悬浮在SDS-PAGE缓冲液中，并直接加载到SDS-PAGE凝胶(4％-12％梯度凝胶Novex)上。将一半样品加载在一个凝胶上，以用于蓝色染色(英杰公司)和随后的质谱样品制备；将另一半加载到第二个凝胶上，以用于Western印迹分析。
免疫沉淀产物的LC-MS鉴定
将感兴趣的条带切下，脱色，并洗涤，随后用二硫苏糖醇(DTT)进行胶内还原，并在黑暗中用碘乙酰胺进行烷基化。将蛋白质在37℃用胰蛋白酶在胶内消化，随后提取消化的肽。使用与Aboulaich等人,Biotechnol.Prog.[生物技术进展]30:1114-1124(2014)中提供的方案类似的方法，将胰蛋白酶消化的样品通过在线nano-LC-MS分析。肽的LC分离是在nano-ACQUITY (沃特斯公司(Waters))系统上进行的，该系统配备有180μmi.d.x20mm长C18对称捕获柱和100μm x 100mm C18(沃特斯公司)反相柱，运行流速为400nL/min(缓冲液-A：0.1％甲酸；缓冲液-B：0.1％甲酸于乙腈中)(参见HeidbrinkThomspon等人,Rapid Communications in Mass Spectometry[质谱快速通讯]28:855-60(2014))。使用1％缓冲液B将每个样品注射到捕获柱上。经60分钟洗脱肽。在LC分离之后，使用LTQ-Orbitrap(前六MS/MS方法)质谱仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))以数据依赖性模式使用MS/MS的碰撞诱导解离(CID)对洗脱的肽进行在线分析。每个蛋白质的身份是通过蛋白质组发现者(Proteome Discoverer)v.1.3软件通过搜索针对肺炎克雷伯氏菌蛋白序列数据库(Uniprot)的质谱数据来确定，该软件配备有Sequest和Mascot节点(Aboulaich等人,Biotechnol.Prog.[生物技术进展]30:1114-1124(2014))。该数据库还包含人类IgG1蛋白序列。每个蛋白质至少需要两个中等或高置信度(在蛋白质组发现者软件的肽验证器节点中确定)肽，以阳性地鉴定每个蛋白质。
重组MrkA蛋白的表达
合成MrkA-his标签的开放阅读框(ORF)，将其克隆到表达载体pACYC-duet-1(EMD密理博公司(EMD Millipore))中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。挑取氯霉素耐药性菌落，并在含有150μg/ml氯霉素的LB培养基中进行扩增。一旦OD(600nm)达到0.4，便向培养物中添加1mM IPTG以在37℃下诱导MrkA-his的表达持续4小时。将细菌用B-PER裂解，并使用抗his或如本文所述的MrkA特异性mAb，通过Western印迹检查MrkA-his的存在。
MrkA蛋白的体外转录和翻译
通过PCR扩增用于体外表达的MrkA的DNA模板。模板包括在MrkA ORF的5'端的T7启动子、c-Myc标签以及3’端的T7终止子。在25μl的反应混合物中，将250ng DNA模板添加到具有或不具有二硫键增强子(NEB E6820S)的PURExpress体外蛋白质系统(NEB E6800)中，并将反应混合物在37℃下孵育2小时。使用如本文所述的抗c-Myc和MrkA特异性mAb通过Western印迹来分析合成的蛋白质。
细菌感染模型
C56/BL6小鼠接收自杰克逊(Jackson)实验室并保存在无特殊病原体的设施中。所有动物实验均按照IACUC方案和指南进行。使肺炎克雷伯氏菌菌株在琼脂板上生长过夜，并在适当浓度下稀释于盐水中。在激发之前和之后，通过将细菌的连续稀释物铺板于琼脂板上来测定接种物滴度。抗体和对照是在细菌感染前24小时给予。对于器官负荷模型，对C57/bl6小鼠鼻内接种50μl盐水中的1e7CFU细菌以诱导肺炎。通过将肺匀浆铺板于琼脂板上以测定感染后24小时的CFU来测量肺细菌负荷。在急性肺炎模型中，对C57/bl6小鼠鼻内分别接种5e3CFU或1e8 CFU的肺炎克雷伯氏菌43816菌株(O1:K2)或肺炎克雷伯氏菌985048菌株。在细菌激发前一天给予Kp3和人类IgG1对照抗体。每天监测小鼠存活，直到第8天。在Prism中绘制三个实验的组合存活数据。
统计学分析
所有统计学分析均是在GraphPad Prism 6版中进行。为了比较细菌负荷，通过非配对t检验将Kp3处理的动物与人类同种型对照抗体处理的动物进行比较。存活结果绘制为卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)曲线，并以对数秩(Mental-Cox)检验进行分析。
实例1：针对活肺炎克雷伯氏菌的噬菌体淘选
使用来自健康供体的人类scFv文库(Vaughan等人,Nature Biotechnology[自然生物技术]14:309-14(1996))以针对肺炎克雷伯氏菌特异性抗体进行选择。此过程被设计为针对功能相关靶标来选择，而不使用特定的抗原。由于肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖和O-抗原的高度可变结构，产生荚膜和O-抗原缺失的突变菌株43816DM(43816ΔcpsBΔWaaL)，以驱动朝向更保守的表面抗原的选择过程。对43816DM进行第一轮的亲和力选择淘选，随后对野生型分离株(1901和1899)的混合物进行又两轮的淘选。经三轮淘选，从输出滴度观察到多于一百倍的富集。
本研究中使用的噬菌体文库是单链片段可变(scFv)文库。虽然scFv形式足够用于基于特异性结合的初步筛选，但因为OPK依赖于通过Fc片段介导的效应物功能，该scFv形式不适合于功能性筛选形式如OPK。因此，第三轮淘选输出被批量转换成scFv-Fc形式。此平台允许scFv-Fc在细菌和哺乳动物两种宿主中表达，这适合于高通量和功能性筛选需要。在细菌中表达scFV-Fc克隆，并且对所得上清液针对与三种活肺炎克雷伯氏菌野生型菌株的结合进行测试。总共筛选了3520个scFv-Fc克隆，并且超过400个克隆显示出与所有三种肺炎克雷伯氏菌分离株的特异性结合。在ELISA筛选过程中，通过使用不相关的细菌作为对照排除了非特异性结合物。测序揭示了两个主要的噬菌体衍生的克隆Kp3和Kp16。这些在哺乳动物细胞中以scFv-Fc形式表达，并针对OPK活性进行测试。在重改形式为IgG1后，它们在全细菌ELISA中保持与Kp29011的强结合(图1A)，显示有力的OPK活性(图1B)，并证实与具有不同荚膜和O-抗原血清型的大多数分离株结合(图1E)。Kp3和Kp16还显示出针对一组不同血清型的肺炎克雷伯氏菌的OPK活性(图1F)。进一步用扩大范围的七百种当今肺炎克雷伯氏菌临床分离株进行测试，Kp3结合至超过62％的菌株，这些菌株大部分是多重耐药性分离株。表5中显示了由Kp3识别的代表性肺炎克雷伯氏菌临床分离株的列表。
表5：Kp3结合至多重耐药性肺炎克雷伯氏菌临床分离株
实例2：针对肺炎克雷伯氏菌产生杂交瘤
使用43816DM(43816ΔcpsBΔWaaL)菌株免疫小鼠，目标是引发针对与荚膜或LPSO-抗原不同的抗原的抗体。在用突变菌株免疫的初始阶段后，用野生型菌株(1901和1899)的组合进行最终的加强，之后收集脾脏和淋巴结以用于杂交瘤的产生。通过结合进行全细胞细菌筛选最初是在产生杂交瘤中应用，其类似于上述噬菌体淘选途径以鉴定交叉反应性抗体。在测试的大约9000个杂交瘤中，四个杂交瘤(21G10、22B12、88D10、和89E10)显示与所测试的肺炎克雷伯氏菌菌株的血清型非依赖性结合(图1A和1E)。
实例3：证明血清型非依赖性的调理吞噬杀伤(OPK)活性
已报道具有OPK活性的抗体与体内保护功能相关。参见例如DiGiandomenico等人,J Exp Med[实验医学杂志],209:1273-87(2012)，将其通过引用并入本文。对用以协助表型筛选的高通量OPK测定进行改编。将大约1000个杂交瘤保持在无抗生素的培养基中，并且针对OPK活性进行测试。然后将OPK阳性杂交瘤克隆并扩增以用于抗体纯化。其中，两种杂交瘤衍生的抗体(88D10、89E10)显示增强的OPK活性(图1B)，并且通过全细菌ELISA测定显示与肺炎克雷伯氏菌菌株的强结合(图1A)。
还通过ELISA对OPK阳性噬菌体和杂交瘤衍生的抗体针对与一组选择性的具有不同的荚膜和O-抗原血清型的肺炎克雷伯氏菌菌株的结合进行测试(图1E)。噬菌体和杂交瘤衍生的抗体显示出类似的结合模式，并且都与多种荚膜和O-抗原血清型结合。
还测试了噬菌体衍生的Kp3抗体结合至离体生长的克雷伯氏菌属的能力。在这些实验中，将克雷伯氏菌属菌株在2xYT培养液中在37℃、250rpm下培养过夜。然后将培养物以1:200稀释，并使其生长至对数期。通过腹膜内(离体IP)或鼻内(离体IN)途径向小鼠注射5e8CFU细菌。两小时后，处死小鼠，并将细菌从肺匀浆、腹膜冲洗液或血液中分离。使在这些条件下分离的细菌经受使用Kp3进行的FACS结合测定。如下表6中所示，Kp3还与离体生长的多种克雷伯氏菌属血清型结合(“+或++或+++”指示结合水平；“-”指示无结合)。
表6：Kp3结合至离体生长的克雷伯氏菌属
实例4：MrkA抗原的鉴定
两种噬菌体克隆(Kp3和Kp16)和四种杂交瘤克隆(88D10、89E10、21G10和22B12)的类似结合模式(参见图1E)提示研究它们识别相同抗原的可能性。在这些竞争ELISA实验中，将1μg/ml生物素标记的抗体(图1C中的Kp3或图1D中的88D10)与递增量的Kp3或Kp16(如图1所指示)混合，并测试所述抗体与肺炎克雷伯氏菌的结合。抗小鼠IgG-HRP用作检测试剂。ELISA信号的减少表示为抑制百分比。竞争ELISA显示它们均在结合所测试的肺炎克雷伯氏菌分离株方面相互竞争，指示它们与相同抗原上的重叠表位结合(图1C和图1D)。
结合分析之前的全细胞蛋白酶处理消除了mAb KP3和88D10的反应性。这指示这些抗体的靶标很可能是一种蛋白质。还通过使用Kp3染色的共聚焦显微术确认了抗原靶标位于肺炎克雷伯氏菌的表面上，因为可以看到类似于菌毛的突出的纤维状细胞表面结构(图2A)。
然后使用免疫沉淀来分离mAb结合性抗原靶标。在这些实验中，细胞裂解物是从非反应性(1899)和反应性(43816DM)菌株制备，并经受由Kp3、88D10和同种型抗体对照进行的免疫沉淀。将免疫沉淀产物分成两半，并在还原条件下在两个4％-12％SDS-PAGE凝胶上分离。一个凝胶通过蓝色染色进行分析。将另一相同的凝胶转移到PVDF膜上，并使用生物素化的88D10.1和Kp3的混合物作为检测抗体进行Western分析。
与对照抗体相比，Kp3和88D10捕获四个主要的蛋白条带，其中条带1来自阴性对照分离株1899(图2B)。其中，在Western印迹分析中，3号条带对Kp3具有反应性(图2C)。切下所有四个条带并进行LC-MS分析。最显著的蛋白条带(图2B，3号条带)被鉴定为MrkA，因为涵盖超过完整MrkA序列的50％的肽被回收。通过质谱鉴定的MrkA肽在图2D中用粗体和下划线示出。另一个显著条带(图2B，2号条带)被鉴定为MrkB，它是促进MrkA菌毛亚基折叠和通过周质空间运输的伴侣蛋白。(Chan等人,Langmuir[朗缪尔]28:7428-35(2012)；Burmolle等人,Microbiology[微生物学]154:187-95(2008).)最小的显著条带(图2B，4号条带)以及来自阴性对照分离物的条带(图2B，1号条带)不能鉴定任何特定的细胞表面定位蛋白。
实例5：确认MrkA为抗原
虽然MrkA是通过LC-MS从图2B的3号条带鉴定的单一蛋白质种类，但MrkA的预测MW(约20kDa)与通过SDS-PAGE的表观MW(60-200kDa)之间存在明显不符(图2B和2C)。之前已经报道了细菌表面蛋白的梯状外观，包括B族链球菌中的α蛋白C和MrkA。参见Chan等人,Langmuir[朗缪尔]28:7428-35(2012)和Langstraat等人,Infect.Immun.[感染与免疫]69:5805-12(2001)。为了进一步确认抗原的身份，基于已公开的肺炎克雷伯氏菌MGH78578的MrkA序列，在大肠杆菌中表达重组MrkA。具体而言，将来自UniProt数据库的菌株MGH78578的MrkA ORF克隆到表达载体中并在BL21细胞中表达。然后使用B-PER制备裂解物，并使用抗his标签或Kp3进行Western印迹分析。与内源性MrkA类似，重组MrkA显示包括从60kDa至超过200kDa范围的表观大小的条带的梯状图谱(图3A)。有趣的是，尽管抗his抗体识别单体和寡聚体MrkA，但Kp3仅识别寡聚体形式。MrkA mAb靶标身份也与共聚焦实验中显示的菌毛结构一致(图2A)。在不同的实验条件下，重组MrkA在体外转录和翻译系统中还与c-Myc标签一起表达，并且对产物进行Western印迹分析。如通过抗Myc检测所指示的，体外表达系统主要产生MrkA单体蛋白(图3B)。尽管Kp3识别细菌细胞裂解液中存在的较高分子量的条带(图3B，样品1)，但它不能检测MrkA单体。这表明Kp3与III型菌毛中的高阶MrkA结构结合，并且MrkA组装可能需要其他细胞组分或本研究中使用的体外表达系统所缺少的条件的促成。
实例6：抗MrkA抗体在体内保护小鼠对抗肺炎克雷伯氏菌
鉴于本文披露的抗MrkA抗体的优异血清型非依赖性OPK活性和生物膜预防，在两种主要的O-血清型菌株的肺炎克雷伯氏菌感染的鼠类模型中评价Kp3。不同的临床肺炎克雷伯氏菌分离株的毒力在免疫活性小鼠中变化很大。在急性肺炎模型中，即使在高接种剂量(1e9CFU/小鼠)下，所评价的大多数分离株也不具有毒性，极少例外。因此，采用器官负荷模型来证明抗MrkA抗体针对多种分离株的功效。在这些实验中，小鼠通过IP给药接受单剂量的抗体，24小时后用1e7CFU的细菌进行鼻内感染。然后处死小鼠，并且对感染的肺中的细菌计数进行评估。Kp3在15mg/kg(mpk)下显著降低了被Kp29011(O1:K2)和Kp9178(O3:K58)感染的小鼠中的肺负荷(图4A和图4B)。使用针对Kp43816的人类IgG1兔多克隆抗体作为对照。抗体剂量滴定显示15mpk给出最好的保护，更高的剂量并不产生额外的益处。
还在使用Kp43816(毒性O1:K2菌株)(图4C)或Kp985048(新近分离的临床多重耐药性菌株)(图4D)的致命性肺炎模型中对Kp3进行测试。在此模型中，抗体给予后24小时，鼻内给予5e3CFU(Kp43816)或1e8 CFU(Kp985048)的细菌。在感染后长达8天监测小鼠。mAb Kp3在这些模型中证实显著的保护益处(图4C和图4D)。
这些数据指示，抗MrkA抗体的OPK活性可促成其能降低感染多种肺炎克雷伯氏菌血清型的小鼠的细菌负荷并增强存活。
实例7：MrkA表位的鉴定
为了产生MrkA缺失，将具有40个氨基酸的N末端缺失(“MrkA-N-dlt”)、32个氨基酸的C末端缺失(“MrkA-C-dlt”)以及N和C末端缺失的组合(“MrkA-N/C-dlt”)的MrkA基因序列克隆到在C末端添加有His标签的pCABNTAB6(GE医疗集团(GE Healthcare))细菌表达载体中。挑取单个菌落并接种到补充有100个单位的羧苄青霉素的LB中。将细菌在37℃、250rpm下培养。当OD600达到04-0.6时，加入IPTG至最终浓度为1mM，并且将细菌再培养3小时。然后收集细菌细胞，并使用B-PER细菌蛋白提取试剂(赛默科技公司)进行裂解。将透明的细胞裂解物直接用于包被ELISA板，并使用标准ELISA程序测量Kp3的结合。人类IgG1和不相关的抗MrkA抗体用作对照。如图6中所示，Kp3仅检测到全长MrkA，并且不结合至：MrkA-N-dlt；即SEQ ID NO:17的氨基酸41-202(即SEQ ID NO:26)；MrkA-C-dlt；即SEQ ID NO:17的氨基酸1-170(即SEQ ID NO:27)或MrkA-N/C-dlt；即SEQ ID NO:17的氨基酸41-170(即SEQ ID NO:28)。相比之下，对照抗MrkA抗体检测到全长MrkA以及具有N末端缺失的MrkA(数据未显示)。这些结果显示Kp3识别构象表位。
实例8：在细菌激发模型中单体和聚合体MrkA降低器官负荷
鉴于抗MrkA mAb在预防性处理中的血清型非依赖性保护性活性，测试了纯化的MrkA作为疫苗抗原赋予保护的能力。重组MrkA蛋白以单体和聚合体两种形式存在(图3A)。为了评估单体和寡聚体MrkA蛋白在诱导保护性免疫中的作用，通过柱分级纯化单体和聚合体两种物质。简而言之，为了大规模表达MrkA，将MrkA(SEQ ID NO:17)的成熟形式与N末端6X his标签同框克隆到pET28(Novagen公司)中。蛋白质由宿主BL21-DE3大肠杆菌菌株表达。使转化的细胞在Terrific Broth(康宁公司(Corning))+卡那霉素(50μg/ml)中在37℃下在250RPM振荡下生长，直至OD600达到0.6。将IPTG(1M)(英杰公司)添加至培养物，终浓度为1mM，并将培养物再孵育4小时。通过离心(12,000×g，持续10分钟)收获细胞，并将细胞沉淀储存在-80℃直至纯化。对于MrkA纯化，将细胞沉淀在冰上解冻，使用B-PER裂解，并且将不溶性包涵体部分通过离心收集，并重悬于溶解缓冲液(10mM Tris(pH 8)，100mM磷酸钠，8M尿素，1mM DTT)中。将溶解的包涵体通过在10℃以27,000xg离心15分钟来澄清，然后加载到用溶解缓冲液平衡的5ml HisTrap HP柱(GE医疗集团)上。收集流经物和洗脱级分，并根据所述方案进行重折叠。将重折叠的混合物加载到HisTrap柱上，并用在具有500mM NaCl的25mM磷酸钠(pH 7.4)中的高至500mM咪唑的线性梯度进行洗脱。早期在梯度(大约150mM咪唑)中收集单体MrkA，并在后期在梯度(约250mM咪唑)中收集寡聚体种类。将每个池用Vivaspin5K MWCO装置(Vivascience)浓缩并透析到具有100mM NaCl的10mM Tris(pH 7.5)中。
为了通过透析进行重折叠，将样品用3倍体积的稀释缓冲液[10mM Tris，100mM磷酸钠，1mM EDTA，5mM半胱胺，0.5mM胱胺，pH 8]稀释。让它们在4℃下混合过夜。将它们在4℃下透析到重折叠缓冲液(不含EDTA的稀释缓冲液)中(两次交换)，然后透析到1X PBS(pH7.2)中。使用HisTrap纯化经透析的样品(用至具有500mM NaCl的25mM磷酸钠(pH 7.4)中的500mM咪唑线性梯度进行洗脱)。
在第一个加载步骤期间保持在柱中的MrkA主要含有寡聚体MrkA。其在柱上重折叠，经洗脱并浓缩，如上所述。从包涵体中纯化得到高纯度的单体和寡聚体MrkA(图7)，将它们用于随后的免疫实验。
纯化和浓缩的单体和寡聚体MrkA用于对小鼠进行疫苗接种。将六至八周龄的C57/bl6小鼠通过皮下注射15微克的含有弗氏佐剂的单体或聚合体MrkA进行三次疫苗接种。第三次感染后，检测到针对MrkA的强血清滴度。然后在第三次免疫(第4周)之后用1.4e7CFUKp29011(O1:K2)经鼻内激发小鼠。在感染后24小时，将肺和肝脏在1mL PBS中匀浆化并铺板于LB琼脂板上以计算CFU/mL匀浆。
结果如图8所示，证实了与佐剂对照组(PBS-CFA/IFA)相比，在细菌激发后单体和寡聚体MrkA疫苗接种降低了器官负荷，表明MrkA可以赋予作为疫苗抗原的保护作用。单体MrkA显著减少肺中的细菌，并且寡聚体MrkA显著减少肺和肝中的细菌(图8A-图8B)。因此，这些结果证实用单体和/或寡聚体MrkA进行的疫苗接种降低了克雷伯氏菌属的器官负荷。
实例9：抗MrkA抗体抑制生物膜形成和细胞附着
为了确定抗MrkA抗体是否抑制生物膜形成，根据Wilksch等人(PLos Pathogens[科学公共图书馆·病原体]7(8):e1002204(2011))作出修改进行生物膜测定。使肺炎克雷伯氏菌43816生长为对数期培养物，并稀释到最低培养基(RPMI-1％BSA)中使OD650等于0.1。一式三份地，将细菌在平底96孔微量滴定板(Falcon；BD生物科学公司(BD Biosciences))中孵育，这些微量滴定板中具有Kp3或hIgG1(同种型对照)抗体的连续稀释物。在37℃、120rpm下孵育2h后，洗出浮游细菌，并用蒸馏水洗涤孔。将附着到孔表面的生物膜在室温下用150μL的0.1％(wt/vol)结晶紫溶液染色15min。倾去结晶紫溶液，并随后洗涤孔以彻底除去未结合的染料。将结合的染料用200μl 95％乙醇溶解，并通过测量595nm处的吸光度来定量。将一起的包含生长培养基的孔用作阴性对照来计算抑制百分比。细菌在宿主组织或非生物表面定殖、形成微菌落、群落或生物膜的能力在致病机制和细菌感染的持续中发挥着重要作用。Gupta等人,“Biofilm,pathogenesis and prevention-a journey to breakthe wall:a review.[生物膜、发病机制和预防-打破壁的旅行：评论]”Arch Microbiol.[微生物学文献集]2015年9月16日。肺炎克雷伯氏菌中的III型菌毛是介导附着于真核细胞和非生物表面的丝状附属物。MrkA(为一种菌毛大亚基)但不是粘附素(MrkD)先前显示可促进生物膜形成(Langstraat等人,Infect Immun[感染与免疫]2001；69:5805-12)。为确定抗MrkA抗体是否结合至细菌表面上的MrkA并随后阻断生物膜形成，在抗MrkA mAb Kp3或人类IgG1对照抗体的存在下测量细菌与非生物板的附着。Kp3以剂量依赖性方式显著阻断了克雷伯氏菌属43816菌株的生物膜形成(图9)。因此，显示在图9中的结果证实抗MrkA Kp3抗体抑制克雷伯氏菌属生物膜形成。
III型菌毛的另一个重要特征是促进宿主组织的克雷伯氏菌属定殖，导致感染的建立。为了测试抗MrkA mAb Kp3是否防止克雷伯氏菌属与肺上皮细胞的关联，还进行了细胞附着测定。简而言之，在这些实验中，将Kp3或hIgG1(同种型对照)抗体添加至生长于不透明的96孔板(Nunc Nunclon Delta)中的汇合的A549细胞中。以感染复数(MOI)为50添加对数期的发光肺炎克雷伯氏菌43816。在37℃孵育90min后，洗涤细胞，随后添加0.05ml的2xYT+0.5％葡萄糖。在37℃下15-min孵育之后，使用Envision多标记酶标仪(珀金埃尔默公司)定量细菌RLU。如图10所示，Kp3显著减少肺炎克雷伯氏菌对A549人类肺上皮细胞的附着，从而证实抗MrkA Kp3抗体抑制克雷伯氏菌属与上皮细胞的结合。
讨论
应用靶标不可知的策略来鉴定用于治疗肺炎克雷伯氏菌感染的交叉保护性抗体。尽管已经做出巨大努力来鉴定靶向肺炎克雷伯氏菌的交叉反应性抗体，但主要在开发此类治疗剂方面存在障碍。经过良好验证的抗体靶标(包括CPS和LPS)具有血清型特异性，因此需要多种抗体用于广泛的菌株覆盖。通过构建CPS和LPS O-抗原缺失突变体以聚焦于更保守的表面抗原，克服了这一挑战。通过利用完整的细菌结合和更高通量的OPK测定，鉴定了来自杂交瘤和噬菌体展示平台二者的、证实了针对克雷伯氏菌属的显著体外和体内功效的抗MrkA抗体。
MrkA是III型菌毛复合体的主要蛋白质，并且已涉及宿主细胞附着和生物膜形成(参见Murphy等人,Future Microbiol[未来微生物学]2012；7:991-1002)-细菌病原体用于建立感染的策略(Burmolle等人,Microbiology[微生物学]2008；154:187-95)。在一项概念验证实验中，用纯化的III型菌毛免疫的小鼠显示出对随后的肺炎克雷伯氏菌激发的抗性，尽管仅针对相对低的激发剂量(Lavender等人,International journal of medicalmicrobiology[国际医疗微生物学杂志]2005；295:153-9)。虽然体液免疫牵涉作为保护机制，但未阐明引发保护的抗原组分。本文披露的抗MrkA单克隆抗体有助于通过多种机制进行免疫保护。首先，抗MrkA mAb减少了肺细胞系的细菌附着和生物膜的形成，这可以随后减少细菌定殖到宿主组织并促进细菌清除。第二，抗MrkA mAb显示出OPK活性独立于血清型的强的增强。OPK活性可以有助于降低感染多种肺炎克雷伯氏菌血清型的小鼠中的细菌负荷并增强存活。有趣的是，针对III型菌毛粘附素蛋白MrkD的抗体显示出类似于抗MrkA mAb的与多种肺炎克雷伯氏菌菌株的交叉反应性，但不诱导OPK并且在体内不赋予保护作用(数据未显示)。这进一步证实了OPK活性对于这些抗体的体内保护可能是必需的。
MrkA作为抗体治疗靶标的有希望的特征是其在不同分离株之间的高度序列保守性和作为细胞外靶标的总体可及性。来自两种最主要的致病性分离株肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌的MrkA具有95％的同源性，并且除了阴沟肠杆菌(与其余相异)之外，肠杆菌科的代表性成员之间的同源性超过90％(图5)。需要进一步的工作来广泛调查来自其他成员的MrkA序列。尽管如此，这提供了开发基于MrkA的抗肺炎克雷伯氏菌并淘选革兰氏阴性策略的潜在机会。
值得注意的是，从两个不同平台分离的抗MrkA抗体在靶向类似的表位方面趋于会合。这与最近的报道形成了鲜明的对比，该报道显示由杂交瘤和噬菌体运动(campaign)产生的抗体靶向相异的表位(Rossant等人,mAbs 2014；6:1425-38)。表位似乎是天然有构象性的。这与发现鉴定的本文披露的功能性抗体识别主要存在于寡聚体MrkA上的表位相一致。用纯化的单体和多聚体MrkA抗原进行的疫苗接种研究表明两种形式的抗原均可诱导保护性免疫。这些观察结果对基于MrkA的疗法和疫苗开发可以具有重要影响。
综上所述，这些研究进一步证实，抗体的功能筛选是针对肺炎克雷伯氏菌的治疗开发和新靶标发现的有力工具。本研究产生的围绕MrkA和抗MrkA抗体的大量信息对肺炎克雷伯氏菌发病机制的领域应该是有用的，并且加入到对抗肺炎克雷伯氏菌和其他严重细菌感染的宝库中。
实例10：针对重组MrkA蛋白的噬菌体文库淘选
通过针对纯化的重组MrkA蛋白淘选天然人类单链可变片段(scFv)抗体噬菌体文库来鉴定另外的抗MrkA抗体。
为了制备重组MrkA蛋白，按照在材料与方法部分中所述的并有所修改，将his标记的重组MrkA进行表达并纯化。MrkA在大肠杆菌宿主菌株BL21(DE3)中表达，大部分保留在包涵体中。使用含有八摩尔尿素的缓冲液来溶解MrkA，并且如先前所述使用HisTrap HP柱(GE医疗集团)纯化his标记的MrkA(参见Wang,Q.等人,2016.Target AgnosticIdentification of Functional Monoclonal Antibodies Against Klebsiellapneumoniae Multimeric MrkA Fimbrial Subunit[针对肺炎克雷伯氏菌多聚体MrkA菌毛亚基的功能性单克隆抗体的靶标不可知鉴定].Journal of Infectious Diseases[感染性疾病杂志],213(11):1800-1808，将其通过引用并入本文)，不同之处在于将变性的MrkA直接加载到亲和柱上并在变性条件下纯化而不用先进行重折叠。将单体和寡聚体MrkA一起洗脱而不进行进一步分离。将洗脱的MrkA级分收集并用PBS缓冲液透析，并且然后准备用于生物素标记和淘选。对于生物素标记，使用来自皮尔斯公司的标记试剂盒，并遵循制造商的方案。
淘选选择是使用Kingfisher自动化系统以溶液形式进行的，如Lillo,A.M.等人(“Development ofphage-based single chain Fv antibody reagents for detectionofYersinia pestis[用于检测鼠疫耶尔森菌的基于噬菌体的单链Fv抗体试剂的开发],”PLoS One[公共科学图书馆·综合]6:e27756(2011))所述并有所修改。此研究中使用的天然scFv噬菌体展示文库在先前描述于Vaughan T.J.等人(“Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage displaylibrary[从大的非免疫噬菌体展示文库分离的具有次纳摩尔亲和力的人类抗体],”NatBiotechnol[自然生物技术]14:309-314(1996))中。淘选抗原MrkA被生物素化，并且在前两轮淘选的每一轮中使用0.3μg。对于需要第三轮的选择，生物素化MrkA减少到0.1μg。与第一轮相比，当噬菌体输出提高至超过100倍时，停止淘选选择，并开始高通量筛选。
第一轮筛选是基于与MrkA的特异性结合。通过pSplice.V5载体在大肠杆菌菌株Top 10(英杰公司)中表达的scFv.Fc用于基于均相时间分辨FRET(HTRF)的测定，以针对特异性结合物进行筛选。(Xiao X等人,“A Novel Dual Expression Platform for HighThroughput Functional Screening of Phage Libraries in Product like Format[用于以类产物形式进行噬菌体文库的高通量功能性筛选的新型双表达平台],”PLoS One[公共科学图书馆·综合]10:e0140691(2015)；Newton P.等人,“Development ofahomogeneous high-throughput screening assay for biological inhibitors ofhuman rhinovirus infection[用于对人类鼻病毒感染的生物抑制剂的均匀高通量筛选测定的开发].”J Biomol Screen[生物分子筛选杂志]18:237-246(2013)。)合并所得的MrkA特异性结合物并测序。如前所述，使用独特的克隆来制备用于哺乳动物细胞转染、scFv.Fc表达和OPK分析的质粒。(参见Xiao X等人,“A Novel Dual Expression Platform forHigh Throughput Functional Screening of Phage Libraries in Product likeFormat[用于以类产物形式进行噬菌体文库的高通量功能性筛选的新型双表达平台],”PLoS One[公共科学图书馆·综合]10:e0140691(2015))。
出于淘选目的，未将单体MrkA与寡聚体MrkA分离。第二轮或第三轮选择后，淘选输出比第一轮提高了100多倍。将淘选输出在pSplice.V5中转化为scFv.Fc，并如上所述进行高通量筛选，并总结于图11中，其中在图12中进一步展示均相时间分辨FRET(HTRF)方法。以多于4000个菌落开始，鉴定出结合至不同表位的四种不同的具有MrkA特异性的OPK阳性抗体。将这四种抗体转化为人类IgG1形式，并进行如下所述的进一步表征。将它们命名为抗MrkA克隆1、4、5和6。
实例11：抗MrkA克隆1、4、5和6的表征
基于生物层干涉测量法(BLI)测定将那些示出阳性OPK活性的scFv.Fc克隆分类，以评估它们的表观亲和力以及相关结合表位。
对于亲和力测量，使用了两种不同的形式。第一种使用针对单体和寡聚体MrkA的混合物的IgG。第二种使用针对单体MrkA的Fab。使用ForteBio Octet QK384仪器研究抗MrkA mAb的动力学。所有分析均以200μL/孔在ForteBio 10x动力学缓冲液中在30℃下进行。将0.3μg/ml的生物素化的MrkA加载到链霉亲和素生物传感器(SA)的表面上持续400秒，达到1.0和1.5nm之间的水平，然后进行300秒的生物传感器洗涤步骤。对在生物传感器上的MrkA与溶液(0.274-200nM)中单独的mAb的缔合进行分析持续600秒。探测相互作用的解离持续600秒。通过减去加载有配体但不和分析物一起孵育的传感器所记录的移动，来校正任何系统基线漂移。使用Octet数据分析软件8.0版进行曲线拟合，其具有1:1相互作用模型可用的结合方程式。使用非线性最小二乘拟合进行全局分析。通过产生的残差图、R2和χ2值评估数据的拟合优度。
将四种克隆1、4、5、和6在293自由式细胞(英杰公司)中表达为人类IgG1，并纯化。虽然它们保持了稳固的结合活性，但是ELISA形式显著地影响了结合。如以IgG形式通过BLI途径测量的，它们的表观亲和力在3-10nM之间(图13和表7)。Western印迹数据显示，只有克隆1能够检测到单体MrkA，而没有其他能够如此(图14)。
表7：针对单体和多聚体MrkA的混合物的IgG形式的KD测量。
IgG KD Kon(x1041/Ms) Koff(x10-41/s) R2
克隆1 3.25nM 5.3 1.7x10-4 0.989
克隆4 3.61nM 4.06 1.46x10-4 0.985
克隆5 3.54nM 2.6 9.2x10-5 0.996
克隆6 8.80nM 2.2 2.0x10-4 0.996
KP3 0.15nM 7.6 1.2x10-5 0.993
MrkA尤其不耐受突变，并且亚克隆和来自MrkA的片段的表达常导致没有表达。因此，突变分析不是用于表位分析的适合方法。反而，使用基于BLI的途径来研究mAb的表位的相对位置。表位分类是在ForteBio Octet QK384上进行。将生物素化的MrkA捕获到链霉亲和素生物传感器上，并用饱和浓度为200nM的测试mAb包被600秒。通过测定测试mAb包被的生物传感器，探测与测试mAb相关的其他mAb的表位，所述其他mAb中的每一个为100nm，均与相等浓度的测试mAb一起。所有图形都在基线处重叠且对齐。
在分类实验中，IgG克隆1似乎与不同于所有其他表位的表位结合，而IgG克隆4、5、6和KP3与重叠到有限程度的表位结合，如通过不同的分类设置揭示的(图15)。在肽扫描实验中，没有一种抗体识别覆盖MrkA全长的重叠肽阵列。
当单体MrkA用于针对四种克隆的Fab形式的BLI测定中时，出人意料地发现仅克隆1和5保持不同水平的结合活性，而克隆4和KP3完全失去结合(表8)。
表8：针对单体MrkA的Fab形式的KD测量。ND，不可检测；N/A，不适用。
Fab KD Kon(x1061/Ms) Koff(x10-31/s) R2
克隆1 2.76nM 0.15 0.34 0.998
克隆4 ND ND N/A --
克隆5 1520nM 0.05 78.2 0.997
KP3 ND ND N/A --
这些数据证实，克隆4、5和6以及KP3结合至寡聚体MrkA上的重叠表位，而克隆1结合至MrkA的非重叠表位以及单体MrkA。
实例12：OPK活性对于体内保护是重要的
为了理解OPK活性在体内保护中的作用，产生KP3IgG。它含有TM突变以消除其效应物功能。(Oganesyan V.等人,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr[晶体学报D部分：生物晶体学]64:700-704(2008)。)OPK活性显著降低(图16，上图)，并且OPK活性的降低对应于体内预防保护激发模型中的降低。然而，OPK活性和体内保护均未完全消除(图16，下图)。这些数据指示OPK对于抗MrkA抗体KP3的保护机制是重要的。
实例13：如通过流式细胞术例证的，抗体结合至活细菌
为了确定克隆是否结合至肺炎克雷伯氏菌“KP”，针对不同血清型的活细菌进行流式细胞术分析。在这些测定中，将细菌在2xYT培养液中培养过夜，并且然后稀释于FACS缓冲液(具有0.5％的牛血清白蛋白的PBS)中达到大约2e7CFU/mL的浓度。将细菌(1e6)与抗MrkA抗体或与阴性对照抗体一起在4℃在轻轻振荡下孵育1小时。将板用FACS缓冲液洗涤并离心(3500rpm，5min)，随后与Alexa Fluor 647山羊抗人类IgG二级抗体(生命技术公司(LifeTechnologies))一起孵育。将板在黑暗中在4℃在轻轻振荡下孵育1小时，并且用FACS缓冲液洗涤两次。将样品在BD LSR II(BD生物科学公司)中测量并且使用FlowJo进行分析。
所有四种克隆1、4、5、和6识别测试的三种分离株。即使在每种抗体对不同分离株的结合模式上存在明显的区别，但在抗体之间不存在显著差异(图17)。另外，通过鼻内途径接种所选择的分离株，并且感染后3小时收集支气管肺泡灌洗液。然后分析抗MrkA抗体与这些体内传代的细菌的结合。结果确认以与体外培养生长的细菌类似的方式，抗MrkA mAb结合至体内生长的细菌。总而言之，抗MrkA抗体阳性地结合至KP分离株的广泛收集物。
实例14：通过OPK测定表征抗体
为了表征OPK活性，将来自每个分类组的代表性克隆(包括克隆1、4、5和6)转化为IgG1，进行表达、纯化，并如先前所述在OPK测定中进行分析。简而言之，将发光KP菌株(Lux)的对数期培养物稀释至约2x106个细胞/ml。将细菌、提供补体的稀释的幼兔血清(Cedarlane公司，1:10)、二甲基甲酰胺(DMF)、分化的HL-60细胞或新鲜分离的多形核白细胞(PMN)、抗MrkA IgG混合于96孔板中，并且在37℃在振荡下(250rpm)孵育两小时。然后使用Envision多标记酶标仪(珀金埃尔默公司)测量相对光单位(RLU)。通过比较来自无抗体的测定的RLU与从抗KP mAb和阴性对照mAb获得的RLU，确定杀伤百分比。
选择克隆1、4、5和6用于进一步分析，因为它们在筛选过程中以scFv-Fc形式具有不同的表位和它们的阳性OPK活性。OPK分析是用它们的IgG1对应物进行的，并且它们针对不同血清型的KP都表现出与KP3可比的有力OPK活性。(图18。)因此，抗MrkA抗体对多种KP血清型具有有力的OPK活性。
实例15：体内激发模型中的抗体保护作用
为了评价抗MrkA抗体的体内保护活性，使用急性肺炎模型。将C57BL/6小鼠鼻内接种1-2e8CFU的多重耐药性分离株。在细菌激发前24小时(用于预防)或者在细菌激发后一小时(用于治疗)，经由腹膜内(IP)途径给予KP3、人类IgG1对照抗体R347、和克隆1、4、5和6抗体。每天监测小鼠存活，持续最少五天直至第8天。在Prism中绘制代表性实验的存活数据。
在预防模型中，克隆1、4、5和6抗体全部反映出其可比的细菌结合和OPK活性，显示出类似有力的体内保护活性(图19)。在1mg/kg剂量下，克隆1、4、5和6抗体全部赋予接近完全的保护作用。在治疗模型中，在5mg/kg的剂量下观察到适度的保护作用(图20)。在任一模型中，在靶向不同表位的抗体之间在其活性方面未显现有显著的差异。
出人意料地，在体内保护模型中，剂量反应对于所有的抗MrkA抗体不总是真实的，并且在抗MrkA抗体和细菌的结合强度与其体内保护作用之间缺少正相关。然而，抗MrkA抗体确实在体内显示出保护活性。
实例16：单一抗体与抗体组合一样具有保护性
在抗细菌领域中抗体组合已经实现了一些非常有前景的结果。因此，研究了抗MrkA抗体的组合。当将KP3与克隆1或克隆5组合时，未观察到显著的加和效应或协同效应(图21)。与多达三种mAb的更复杂的组合也没有显示出任何额外的益处。因此，单一抗MrkA抗体与抗MrkA抗体组合一样具有保护性。
* * *
具体实施例的以上描述将充分地揭示本披露的总体性质，使得在不脱离本披露的一般概念的情况下，其他人可以无需过多的实验通过应用本领域的技术内的知识，容易地针对此类具体实施例的各种应用进行修改和/或改编。因此，基于本文提出的传授内容和指导，此类改编和修改旨在处于所披露的实施例的含义和等效范围内。应当理解本文的短语或术语是出于描述而非限制的目的，这样使得本说明书的术语或短语可根据这些传授内容和指导为技术人员所理解。
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在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请、和/或其他参考文献出于所有目的通过引用以其全部内容而并入，在程度上就像每个单独的出版物、专利、专利申请、和/其他文件被单独地指出以出于所有目的通过引用而并入一般。
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<130> MRKA-100-WO-PCT
<160> 60
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp3的VH-CDR1
<400> 1
Ser Asn Ser Asn Thr Tyr Tyr Trp Gly
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp3的VH-CDR2
<400> 2
Thr Ile His Ser Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp3的VH-CDR3
<400> 3
Asp Leu Ser Gly Ala Ser Leu Ala Pro Arg Arg Pro Phe Asn Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Tyr Asn Met Asp Val
20
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp16的VH-CDR1
<400> 4
Thr Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp16的VH-CDR2
<400> 5
Met Ile Asn Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Gln Pro Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp16的VH-CDR3
<400> 6
Gly Asn Tyr Gly Ser Ser Phe Gly Tyr
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp3的VL-CDR1
<400> 7
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp3的VL-CDR2
<400> 8
Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp3的VL-CDR3
<400> 9
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Pro Ile Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp16的VL-CDR1
<400> 10
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp16的VL-CDR2
<400> 11
Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp16的VL-CDR3
<400> 12
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Val Val
1 5 10
<210> 13
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp3的VH氨基酸序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Met Asn Ser Asn
20 25 30
Ser Asn Thr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile His Ser Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn
50 55 60
Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Met Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Asn Leu Thr Ser Ala Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Ser Gly Ala Ser Leu Ala Pro Arg Arg
100 105 110
Pro Phe Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Met Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp16的VH氨基酸序列
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met
35 40 45
Gly Met Ile Asn Pro Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Ala Gln Pro Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ser Gly Thr Val Phe
65 70 75 80
Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asn Tyr Gly Ser Ser Phe Gly Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp3的VL氨基酸序列
<400> 15
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 16
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Kp16的VL氨基酸序列
<400> 16
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 17
<211> 202
<212> PRT
<213> 肺炎克雷伯氏菌
<400> 17
Met Lys Lys Val Leu Leu Ser Ala Ala Met Ala Thr Ala Phe Phe Gly
1 5 10 15
Met Thr Ala Ala His Ala Ala Asp Thr Thr Val Gly Gly Gly Gln Val
20 25 30
Asn Phe Phe Gly Lys Val Thr Asp Val Ser Cys Thr Val Ser Val Asn
35 40 45
Gly Gln Gly Ser Asp Ala Asn Val Tyr Leu Ser Pro Val Thr Leu Thr
50 55 60
Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Asp Thr Tyr Leu Lys Pro Lys Ser Phe
65 70 75 80
Thr Ile Asp Val Ser Asn Cys Gln Ala Ala Asp Gly Thr Lys Gln Asp
85 90 95
Asp Val Ser Lys Leu Gly Val Asn Trp Thr Gly Gly Asn Leu Leu Ala
100 105 110
Gly Ala Thr Ser Lys Gln Gln Gly Tyr Leu Ala Asn Thr Glu Ala Ser
115 120 125
Gly Ala Gln Asn Ile Gln Leu Val Leu Ser Thr Asp Asn Ala Thr Ala
130 135 140
Leu Thr Asn Lys Ile Ile Pro Gly Asp Ser Thr Gln Pro Lys Ala Lys
145 150 155 160
Gly Asp Ala Ser Ala Val Ala Asp Gly Ala Arg Phe Thr Tyr Tyr Val
165 170 175
Gly Tyr Ala Thr Ser Ala Pro Thr Thr Val Thr Thr Gly Val Val Asn
180 185 190
Ser Tyr Ala Thr Tyr Glu Ile Thr Tyr Gln
195 200
<210> 18
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有序列19-25的来自所有类型革兰氏阴性细菌的MrkA蛋白的共有系列
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (118)..(118)
<223> Xaa可以是Ser或Ala或无氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (169)..(169)
<223> Xaa可以是Ala、Gln、或Thr
<400> 18
Met Ala Met Lys Lys Val Leu Leu Ser Ala Ala Met Ala Thr Ala Phe
1 5 10 15
Phe Gly Met Ala Ala Ala Asn Ala Ala Asp Thr Asn Val Gly Gly Gly
20 25 30
Gln Val Asn Phe Phe Gly Lys Val Thr Asp Val Ser Cys Thr Val Ser
35 40 45
Val Asn Gly Gln Gly Ser Asp Ala Asn Val Tyr Leu Ser Pro Val Thr
50 55 60
Leu Thr Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Asp Thr Tyr Leu Lys Pro Lys
65 70 75 80
Ser Phe Thr Ile Asp Val Ser Asp Cys Gln Ala Ala Asp Gly Thr Lys
85 90 95
Gln Asp Asp Val Ser Lys Leu Gly Val Asn Trp Thr Gly Gly Asn Leu
100 105 110
Leu Ala Gly Ala Thr Xaa Lys Gln Gln Gly Tyr Leu Ala Asn Thr Glu
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Gln Asn Ile Gln Leu Val Leu Ser Thr Asp Asn Ala
130 135 140
Thr Ala Leu Thr Asn Lys Ile Ile Pro Gly Asp Ser Thr Gln Pro Lys
145 150 155 160
Ala Lys Gly Asp Ala Ser Ala Val Xaa Asp Gly Ala Arg Phe Thr Tyr
165 170 175
Tyr Val Gly Tyr Ala Thr Ser Thr Pro Thr Thr Val Thr Thr Gly Val
180 185 190
Val Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Glu Ile Thr Tyr Gln
195 200
<210> 19
<211> 204
<212> PRT
<213> 肺炎克雷伯氏菌
<400> 19
Met Ala Met Lys Lys Val Leu Leu Ser Ala Ala Met Ala Thr Ala Phe
1 5 10 15
Phe Gly Met Thr Ala Ala His Ala Ala Asp Thr Asn Val Gly Gly Gly
20 25 30
Gln Val Asn Phe Phe Gly Lys Val Thr Asp Val Ser Cys Thr Val Ser
35 40 45
Val Asn Gly Gln Gly Ser Asp Ala Asn Val Tyr Leu Ser Pro Val Thr
50 55 60
Leu Thr Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Asp Thr Tyr Leu Lys Pro Lys
65 70 75 80
Ser Phe Thr Ile Asp Val Ser Asn Cys Gln Ala Ala Asp Gly Thr Lys
85 90 95
Gln Asp Asp Val Ser Lys Leu Gly Val Asn Trp Thr Gly Gly Asn Leu
100 105 110
Leu Ala Gly Ala Thr Ser Lys Gln Gln Gly Tyr Leu Ala Asn Thr Glu
115 120 125
Ala Ser Gly Ala Gln Asn Ile Gln Leu Val Leu Ser Thr Asp Asn Ala
130 135 140
Thr Ala Leu Thr Asn Lys Ile Ile Pro Gly Asp Ser Thr Gln Pro Lys
145 150 155 160
Ala Lys Gly Asp Ala Ser Ala Val Ala Asp Gly Ala Arg Phe Thr Tyr
165 170 175
Tyr Val Gly Tyr Ala Thr Ser Ala Pro Thr Thr Val Thr Thr Gly Val
180 185 190
Val Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Glu Ile Thr Tyr Gln
195 200
<210> 20
<211> 204
<212> PRT
<213> 产酸克雷伯氏菌
<400> 20
Met Ala Met Lys Lys Val Leu Leu Ser Ala Ala Met Ala Thr Ala Phe
1 5 10 15
Phe Gly Met Ala Ala Ala Asn Ala Ala Asp Thr Asn Val Gly Gly Gly
20 25 30
Gln Val Asn Phe Phe Gly Lys Val Thr Asp Val Ser Cys Thr Val Ser
35 40 45
Val Asn Gly Gln Gly Ser Asp Ala Asn Val Tyr Leu Ser Pro Val Thr
50 55 60
Leu Thr Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Asp Thr Tyr Leu Lys Pro Lys
65 70 75 80
Ser Phe Thr Ile Asp Val Ser Asp Cys Gln Ala Ala Asp Gly Thr Lys
85 90 95
Gln Asp Asp Val Ser Lys Leu Gly Val Asn Trp Thr Gly Gly Asn Leu
100 105 110
Leu Ala Gly Ala Thr Ala Lys Gln Gln Gly Tyr Leu Ala Asn Thr Glu
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Gln Asn Ile Gln Leu Val Leu Ser Thr Asp Asn Ala
130 135 140
Thr Ala Leu Thr Asn Lys Ile Ile Pro Gly Asp Ala Thr Gln Pro Lys
145 150 155 160
Ala Thr Gly Asp Ala Ser Ala Val Gln Asp Gly Ala Arg Phe Thr Tyr
165 170 175
Tyr Val Gly Tyr Ala Thr Ser Thr Pro Thr Thr Val Thr Thr Gly Val
180 185 190
Val Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Glu Ile Thr Tyr Gln
195 200
<210> 21
<211> 202
<212> PRT
<213> 蒙得维的亚沙门氏菌
<400> 21
Met Lys Lys Val Leu Leu Ser Ala Ala Met Ala Thr Ala Phe Phe Gly
1 5 10 15
Met Ala Ala Ala Asn Ala Ala Asp Thr Asn Val Gly Gly Gly Gln Val
20 25 30
Asn Phe Phe Gly Lys Val Thr Asp Val Ser Cys Thr Val Ser Val Asn
35 40 45
Gly Gln Gly Ser Asp Ala Asn Val Tyr Leu Ser Pro Val Thr Leu Thr
50 55 60
Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Asp Thr Tyr Leu Lys Pro Lys Ser Phe
65 70 75 80
Thr Ile Asp Val Ser Asp Cys Gln Ala Ala Asp Gly Thr Lys Gln Asp
85 90 95
Asp Val Ser Lys Leu Gly Val Asn Trp Thr Gly Gly Asn Leu Leu Ser
100 105 110
Gly Ala Thr Ala Lys Gln Gln Gly Tyr Leu Ala Asn Thr Glu Ala Ala
115 120 125
Gly Ala Gln Asn Ile Gln Leu Val Leu Ser Thr Asp Asn Ala Thr Ala
130 135 140
Leu Thr Asn Lys Ile Ile Pro Gly Asp Ser Thr Gln Pro Lys Ala Ala
145 150 155 160
Gly Asp Ala Ser Ala Val Gln Asp Gly Ala Arg Phe Thr Tyr Tyr Val
165 170 175
Gly Tyr Ala Thr Ser Thr Pro Thr Thr Val Thr Thr Gly Val Val Asn
180 185 190
Ser Tyr Ala Thr Tyr Glu Ile Thr Tyr Gln
195 200
<210> 22
<211> 204
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 22
Met Ala Met Lys Lys Val Leu Leu Ser Ala Ala Met Ala Thr Ala Phe
1 5 10 15
Phe Gly Met Ala Ala Ala Asn Ala Ala Asp Thr Asn Val Gly Gly Gly
20 25 30
Gln Val Asn Phe Phe Gly Lys Val Thr Asp Val Ser Cys Thr Val Ser
35 40 45
Val Asn Gly Gln Gly Ser Asp Ala Asn Val Tyr Leu Ser Pro Val Thr
50 55 60
Leu Thr Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Asp Thr Tyr Leu Lys Pro Lys
65 70 75 80
Ser Phe Thr Ile Asp Val Ser Asp Cys Gln Ala Ala Asp Gly Thr Lys
85 90 95
Gln Asp Asp Val Ser Lys Leu Gly Val Asn Trp Thr Gly Gly Asn Leu
100 105 110
Leu Ser Gly Ala Thr Ala Lys Gln Gln Gly Tyr Leu Ala Asn Thr Glu
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Gln Asn Ile Gln Leu Val Leu Ser Thr Asp Asn Ala
130 135 140
Thr Ala Leu Thr Asn Lys Ile Ile Pro Gly Asp Ser Thr Gln Pro Lys
145 150 155 160
Ala Ala Gly Asp Ala Ser Ala Val Gln Asp Gly Ala Arg Phe Thr Tyr
165 170 175
Tyr Val Gly Tyr Ala Thr Ser Thr Pro Thr Thr Val Thr Thr Gly Val
180 185 190
Val Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Glu Ile Thr Tyr Gln
195 200
<210> 23
<211> 202
<212> PRT
<213> 志贺氏菌属LN126
<400> 23
Met Lys Lys Val Leu Leu Ser Ala Ala Met Ala Thr Ala Phe Phe Gly
1 5 10 15
Met Thr Ala Ala His Ala Ala Asp Thr Thr Val Gly Gly Gly Gln Val
20 25 30
Asn Phe Phe Gly Lys Val Thr Asp Val Ser Cys Thr Val Ser Val Asn
35 40 45
Gly Gln Gly Ser Asp Ala Asn Val Tyr Leu Ser Pro Val Thr Leu Thr
50 55 60
Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Asp Thr Tyr Leu Lys Pro Lys Ser Phe
65 70 75 80
Thr Ile Asp Val Ser Asn Cys Gln Ala Ala Asp Gly Thr Lys Gln Asp
85 90 95
Asp Val Ser Lys Leu Gly Val Asn Trp Thr Gly Gly Asn Leu Leu Ala
100 105 110
Gly Ala Thr Ser Lys Gln Gln Gly Tyr Leu Ala Asn Thr Glu Ala Ser
115 120 125
Gly Ala Gln Asn Ile Gln Leu Val Leu Ser Thr Asp Asn Ala Thr Ala
130 135 140
Leu Thr Asn Lys Ile Ile Pro Gly Asp Ser Thr Gln Pro Lys Ala Lys
145 150 155 160
Gly Asp Ala Ser Ala Val Ala Asp Gly Ala Arg Phe Thr Tyr Tyr Val
165 170 175
Gly Tyr Ala Thr Ser Ala Pro Thr Thr Val Thr Thr Gly Val Val Asn
180 185 190
Ser Tyr Ala Thr Tyr Glu Ile Thr Tyr Gln
195 200
<210> 24
<211> 186
<212> PRT
<213> 阴沟肠杆菌
<400> 24
Met Phe Asn Lys Thr Leu Ile Ala Ala Ala Ile Met Phe Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ala Met Ala Ala Glu Ser Thr Gly Val Ala Gly Gly Thr Ile Thr Phe
20 25 30
Asn Gly Ser Val Ser Asp Thr Thr Cys Asp Val Thr Thr Asn Asn Gly
35 40 45
Ser Asp Phe Thr Val Asn Leu Ser Pro Ile Thr Leu Thr Asp Met Gly
50 55 60
Lys Thr Ala Gly Ile Val Thr Ala Asn Glu Lys Asp Phe Thr Met Ser
65 70 75 80
Leu Lys Asn Cys Thr Ala Ala Asp Glu Gly Thr Lys Thr Leu Lys Ile
85 90 95
Thr Phe Thr Ser Ser Asn Leu Ser Asp Asp Gly Lys Tyr Leu Lys Asn
100 105 110
Tyr Ser Glu Gly Gly Ala Glu Gly Val Gly Ile Thr Leu Thr Ser Asp
115 120 125
Gly Lys Thr Ala Val Pro Phe Asp Thr Ala Phe Asn Thr Gly Leu Thr
130 135 140
Ser Asp Asp Val Ser Ser Thr Asp Gly Ile Thr Leu Thr Met His Ala
145 150 155 160
Asn Tyr Tyr Asn Phe Gly Gly Ala Ser Val Thr Thr Gly Lys Val Val
165 170 175
Thr Asp Ala Thr Tyr Ser Phe Ser Tyr Asp
180 185
<210> 25
<211> 205
<212> PRT
<213> 弗氏柠檬酸杆菌
<400> 25
Met Ala Met Lys Lys Val Leu Leu Ser Ala Ala Ile Ala Thr Ala Phe
1 5 10 15
Phe Gly Met Ala Ala Ala Asn Ala Ala Asp Thr Asn Val Gly Gly Gly
20 25 30
Gln Val Asn Phe Phe Gly Lys Val Thr Asp Val Ser Cys Thr Val Ser
35 40 45
Val Asn Gly Gln Gly Ser Asn Ala Asp Val Tyr Leu Ala Pro Val Thr
50 55 60
Leu Thr Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Asp Thr Tyr Leu Lys Pro Lys
65 70 75 80
Ser Phe Thr Ile Asp Val Ser Asp Cys Gln Ala Ala Asp Lys Thr Ala
85 90 95
Gln Asp Asp Val Ser Lys Leu Gly Val Asn Trp Thr Gly Gly Asn Leu
100 105 110
Leu Ala Gly Ala Thr Ser Lys Gln Gln Gly Tyr Leu Ala Asn Thr Glu
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Gln Asp Ile Gln Leu Val Leu Ser Thr Asp Thr Asp
130 135 140
Thr Ala Leu Thr Asn Lys Ile Ile Pro Asn Gly Ser Ser Ala Gln Pro
145 150 155 160
Lys Ala Lys Val Asp Thr Asn Ala Val Ala Asn Gly Ala Arg Phe Thr
165 170 175
Tyr Tyr Val Gly Tyr Val Thr Ser Lys Pro Glu Thr Val Thr Ala Gly
180 185 190
Val Val Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Glu Ile Thr Tyr Gln
195 200 205
<210> 26
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MrkA片段
<400> 26
Val Ser Cys Thr Val Ser Val Asn Gly Gln Gly Ser Asp Ala Asn Val
1 5 10 15
Tyr Leu Ser Pro Val Thr Leu Thr Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Tyr Leu Lys Pro Lys Ser Phe Thr Ile Asp Val Ser Asn Cys Gln
35 40 45
Ala Ala Asp Gly Thr Lys Gln Asp Asp Val Ser Lys Leu Gly Val Asn
50 55 60
Trp Thr Gly Gly Asn Leu Leu Ala Gly Ala Thr Ser Lys Gln Gln Gly
65 70 75 80
Tyr Leu Ala Asn Thr Glu Ala Ser Gly Ala Gln Asn Ile Gln Leu Val
85 90 95
Leu Ser Thr Asp Asn Ala Thr Ala Leu Thr Asn Lys Ile Ile Pro Gly
100 105 110
Asp Ser Thr Gln Pro Lys Ala Lys Gly Asp Ala Ser Ala Val Ala Asp
115 120 125
Gly Ala Arg Phe Thr Tyr Tyr Val Gly Tyr Ala Thr Ser Ala Pro Thr
130 135 140
Thr Val Thr Thr Gly Val Val Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Glu Ile Thr
145 150 155 160
Tyr Gln
<210> 27
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MrkA片段
<400> 27
Met Lys Lys Val Leu Leu Ser Ala Ala Met Ala Thr Ala Phe Phe Gly
1 5 10 15
Met Thr Ala Ala His Ala Ala Asp Thr Thr Val Gly Gly Gly Gln Val
20 25 30
Asn Phe Phe Gly Lys Val Thr Asp Val Ser Cys Thr Val Ser Val Asn
35 40 45
Gly Gln Gly Ser Asp Ala Asn Val Tyr Leu Ser Pro Val Thr Leu Thr
50 55 60
Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Asp Thr Tyr Leu Lys Pro Lys Ser Phe
65 70 75 80
Thr Ile Asp Val Ser Asn Cys Gln Ala Ala Asp Gly Thr Lys Gln Asp
85 90 95
Asp Val Ser Lys Leu Gly Val Asn Trp Thr Gly Gly Asn Leu Leu Ala
100 105 110
Gly Ala Thr Ser Lys Gln Gln Gly Tyr Leu Ala Asn Thr Glu Ala Ser
115 120 125
Gly Ala Gln Asn Ile Gln Leu Val Leu Ser Thr Asp Asn Ala Thr Ala
130 135 140
Leu Thr Asn Lys Ile Ile Pro Gly Asp Ser Thr Gln Pro Lys Ala Lys
145 150 155 160
Gly Asp Ala Ser Ala Val Ala Asp Gly Ala
165 170
<210> 28
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MrkA片段
<400> 28
Val Ser Cys Thr Val Ser Val Asn Gly Gln Gly Ser Asp Ala Asn Val
1 5 10 15
Tyr Leu Ser Pro Val Thr Leu Thr Glu Val Lys Ala Ala Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Tyr Leu Lys Pro Lys Ser Phe Thr Ile Asp Val Ser Asn Cys Gln
35 40 45
Ala Ala Asp Gly Thr Lys Gln Asp Asp Val Ser Lys Leu Gly Val Asn
50 55 60
Trp Thr Gly Gly Asn Leu Leu Ala Gly Ala Thr Ser Lys Gln Gln Gly
65 70 75 80
Tyr Leu Ala Asn Thr Glu Ala Ser Gly Ala Gln Asn Ile Gln Leu Val
85 90 95
Leu Ser Thr Asp Asn Ala Thr Ala Leu Thr Asn Lys Ile Ile Pro Gly
100 105 110
Asp Ser Thr Gln Pro Lys Ala Lys Gly Asp Ala Ser Ala Val Ala Asp
115 120 125
Gly Ala
130
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st1_c1 "克隆1" VH-CDR1
<400> 29
Ser Tyr Ala Val His
1 5
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st1_c1 "克隆1" VH-CDR2
<400> 30
Gly Ile Asn Gly Gly Asn Gly Asn Thr Arg Ile Ser Gln Arg Phe Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st1_c1 "克隆1" VH-CDR3
<400> 31
Ala Asp Asp Cys Ser Gly Val Gly Cys His Pro Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st2_c4 "克隆4" VH-CDR1
<400> 32
Asn Ala Asn Trp Trp Ser
1 5
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st2_c4 "克隆4" VH-CDR2
<400> 33
Glu Ile Tyr His Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st2_c4 "克隆4" VH-CDR3
<400> 34
Asp Arg Asp Ile Thr Ser Arg Gly Thr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st3_c5 "克隆5" VH-CDR1
<400> 35
Ala Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st3_c5 "克隆5" VH-CDR2
<400> 36
Trp Ile Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Ser Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st3_c5 "克隆5" VH-CDR3
<400> 37
Gly Thr Ile Gly Ala Ala Gly Asn Tyr
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st4_c6 "克隆6" VH-CDR1
<400> 38
Ser Tyr Ala Val His
1 5
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st4_c6 "克隆6" VH-CDR2
<400> 39
Gly Val Asn Gly Gly Asn Gly Asn Thr Arg Phe Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st4_c6 "克隆6" VH-CDR3
<400> 40
Ala Asp Asp Cys Ser Gly Val Gly Cys His Pro Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st1_c1 "克隆1" VL-CDR1
<400> 41
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st1_c1 "克隆1" VL-CDR2
<400> 42
Lys Asp Thr Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st1_c1 "克隆1" VL-CDR3
<400> 43
Gln Ala Trp Asp Arg Ser Ile Met Ile
1 5
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st2_c4 "克隆4" VL-CDR1
<400> 44
Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st2_c4 "克隆4" VL-CDR2
<400> 45
Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st2_c4 "克隆4" VL-CDR3
<400> 46
Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 47
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st3_c5 "克隆5" VL-CDR1
<400> 47
Ser Gly Ser Arg Pro Asn Ile Gly Gly Asn Thr Val Asn
1 5 10
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st3_c5 "克隆5" VL-CDR2
<400> 48
Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st3_c5 "克隆5" VL-CDR3
<400> 49
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Thr Gly Pro Val
1 5 10
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st4_c6 "克隆6" VL-CDR1
<400> 50
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Thr Ser
1 5 10
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st4_c6 "克隆6" VL-CDR2
<400> 51
Gln Asp Thr Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st4_c6 "克隆6" VL-CDR3
<400> 52
Gln Ala Trp Asp Ser Asp Ser Gly Thr Ala Thr
1 5 10
<210> 53
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st1_c1 "克隆1" VH氨基酸序列
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Val Phe Cys Arg Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Gly Gly Asn Gly Asn Thr Arg Ile Ser Gln Arg Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Leu Met Ile Thr Arg Asp Arg Ser Ala Asn Thr Ala Ser
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Asp Asp Cys Ser Gly Val Gly Cys His Pro Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st2_c4 "克隆4" VH氨基酸序列
<400> 54
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Asp Asn Ala
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Ala Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Asp Ile Thr Ser Arg Gly Thr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 55
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st3_c5 "克隆5" VH氨基酸序列
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Ser Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Ala Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st4_c6 "克隆6" VH氨基酸序列
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Val Asn Gly Gly Asn Gly Asn Thr Arg Phe Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Leu Met Ile Val Arg Asp Arg Ser Ala Asn Thr Ala Ser
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Asp Asp Cys Ser Gly Val Gly Cys His Pro Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st1_c1 "克隆1" VL氨基酸序列
<400> 57
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly His
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr
35 40 45
Lys Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Ala Ile Ser Gly Thr Gln Ala Val
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ala Trp Asp Arg Ser Ile Met Ile
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st2_c4 "克隆4" VL氨基酸序列
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st3_c5 "克隆5" VL氨基酸序列
<400> 59
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Pro Asn Ile Gly Gly Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Thr Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Ile Leu
100 105 110
<210> 60
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> st4_c6 "克隆6" VL氨基酸序列
<400> 60
Ser Val Ile Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Asn Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Thr
20 25 30
Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Leu Ile Phe
35 40 45
Gln Asp Thr Lys Arg Pro Ser Asp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Val
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Ala Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

Claims (101)

1.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白a)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)血清型；b)诱导肺炎克雷伯氏菌的调理吞噬杀伤(OPK)或c)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型并诱导肺炎克雷伯氏菌的OPK。
2.如权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合至选自下组的至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。
3.如权利要求1或2所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在选自下组的至少一种或两种肺炎克雷伯氏菌血清型中诱导OPK，该组由以下各项组成：O1:K2、O1:K79、O2a:K28、O5:K57、O3:K58、O3:K11、O3:K25、O4:K15、O5:K61、O7:K67、和O12:K80。
4.如权利要求3所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在肺炎克雷伯氏菌菌株9148(O2a:K28)、9178(O3:K58)、和9135(O4:K15)中诱导100％的OPK；和/或在肺炎克雷伯氏菌菌株29011(O1:K2)中诱导80％的OPK，如使用生物发光OPK测定测量的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在暴露于选自下组的肺炎克雷伯氏菌菌株的动物中赋予存活益处，该组由以下各项组成：Kp29011、Kp9178、和Kp43816。
6.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白抑制或减少克雷伯氏菌生物膜形成。
7.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白抑制或减少克雷伯氏菌细胞附着。
8.一种特异性地结合MrkA的分离的抗原结合蛋白，包含一组互补决定区(CDR)：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中：
HCDR1具有SEQ.ID.NO:1的氨基酸序列；
HCDR2具有SEQ.ID.NO:2的氨基酸序列；
HCDR3具有SEQ.ID.NO:3的氨基酸序列；
LCDR1具有SEQ.ID.NO:7的氨基酸序列；
LCDR2具有SEQ.ID.NO:8的氨基酸序列；并且
LCDR3具有SEQ.ID.NO:9的氨基酸序列。
9.一种特异性地结合MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQID NO:13至少95％、96％、97％、98％或99％一致的重链可变区(VH)和/或与SEQ ID NO:15至少95％、96％、97％、98％或99％一致的轻链可变区(VL)。
10.如权利要求9所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:13的VH和含有SEQ ID NO:15的VL。
11.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，包含含有SEQ ID NO:13的VH。
12.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，包含含有SEQ ID NO:15的VL。
13.一种特异性地结合MrkA的分离的抗原结合蛋白，包含一组互补决定区(CDR)：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中：
HCDR1具有SEQ.ID.NO:4的氨基酸序列；
HCDR2具有SEQ.ID.NO:5的氨基酸序列；
HCDR3具有SEQ.ID.NO:6的氨基酸序列；
LCDR1具有SEQ.ID.NO:10的氨基酸序列；
LCDR2具有SEQ.ID.NO:11的氨基酸序列；并且
LCDR3具有SEQ.ID.NO:12的氨基酸序列。
14.一种特异性地结合MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQID NO:14至少95％、96％、97％、98％或99％一致的重链可变区(VH)和/或与SEQ ID NO:16至少95％、96％、97％、98％或99％一致的轻链可变区(VL)。
15.如权利要求14所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:14的VH和含有SEQ ID NO:16的VL。
16.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，包含含有SEQ ID NO:14的VH。
17.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，包含含有SEQ ID NO:16的VL。
18.如权利要求1-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合至在SEQ ID NO:17的氨基酸1-40和171-202中的表位。
19.如权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白特异性地结合至MrkA(SEQ ID NO:17)，但不结合至SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27。
20.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白结合至在SEQ ID NO:17的氨基酸1-40和171-202中的表位。
21.一种特异性地结合至MrkA(SEQ ID NO:17)但不结合至SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的分离的抗原结合蛋白。
22.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，包含选自下组的一组互补决定区(CDR)：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3，该组由以下各项组成：
(i)分别为SEQ ID NO:29-31和41-43；
(ii)分别为SEQ ID NO:32-34和44-46；
(iii)分别为SEQ ID NO:35-37和47-49；以及
(iv)分别为SEQ ID NO:38-40和50-52。
23.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含与SEQ ID NO:53、54、55、或56至少95％、96％、97％、98％或99％一致的重链可变区(VH)和/或与SEQ ID NO:57、58、59、或60至少95％、96％、97％、98％或99％一致的轻链可变区(VL)。
24.如权利要求23所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:53、54、55、或56的VH和含有SEQ ID NO:57、58、59、或60的VL。
25.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，包含含有SEQ ID NO:53、54、55、或56的VH。
26.一种特异性地结合至MrkA的分离的抗原结合蛋白，包含含有SEQ ID NO:57、58、59、或60的VL。
27.一种特异性地结合至与选自下组的抗体所结合表位相同的MrkA表位的分离的抗原结合蛋白，该组由以下各项组成：
(a)包含含有SEQ ID NO:13的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；
(b)包含含有SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:16的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；
(c)包含含有SEQ ID NO:53的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:57的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；
(d)包含含有SEQ ID NO:54的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:58的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；
(e)包含含有SEQ ID NO:55的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:59的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；以及
(f)包含含有SEQ ID NO:56的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:60的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段。
28.一种竞争性地抑制参考抗体与MrkA结合的分离的抗原结合蛋白，其中所述参考抗体选自下组，该组由以下各项组成：
(a)包含含有SEQ ID NO:13的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:15的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；
(b)包含含有SEQ ID NO:14的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:16的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；
(c)包含含有SEQ ID NO:53的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:57的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；
(d)包含含有SEQ ID NO:54的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:58的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；
(e)包含含有SEQ ID NO:55的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:59的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段；以及
(f)包含含有SEQ ID NO:56的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:60的轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段。
29.如权利要求1-28中任一项所述的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白或其抗原结合片段结合寡聚体MrkA。
30.一种特异性地结合至寡聚体MrkA但不结合至单体MrkA的分离的抗原结合蛋白。
31.如权利要求1-30中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是鼠类的、非人类的、人源化的、嵌合的、表面重建的或人类的。
32.如权利要求1-31中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是抗体。
33.如权利要求1-31中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是抗体的抗原结合片段。
34.如权利要求1-33中任一项所述的抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白是单克隆抗体、重组抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、或其抗原结合片段。
35.如权利要求1-34中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、迷你抗体、F(ab')3、四体抗体、三体抗体、双体抗体、单一结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2、或scFv-Fc。
36.如权利要求1-35中任一项所述的抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白以约1.0至约10nM的Kd结合至MrkA。
37.如权利要求1-35中任一项所述的抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白以1.0nM或更小的Kd结合至MrkA。
38.如权利要求36或37所述的抗原结合蛋白，其中该结合亲和力是通过流式细胞术、Biacore、KinExa、放射免疫测定或生物层干涉测量法(BLI)测量。
39.如权利要求6-38中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白
a)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)血清型；b)诱导肺炎克雷伯氏菌的调理吞噬杀伤(OPK)或c)结合到至少两种肺炎克雷伯氏菌血清型并诱导肺炎克雷伯氏菌的OPK。
40.如权利要求1-5和7-39中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体，其中该抗原结合蛋白抑制或减少克雷伯氏菌属生物膜形成。
41.如权利要求1-6和8-40中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体，其中该抗原结合蛋白抑制或减少克雷伯氏菌属细胞附着。
42.如权利要求1-41中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体，其中该抗原结合蛋白或抗体包含选自下组的重链免疫球蛋白恒定结构域，该组由以下各项组成：
(a)IgA恒定结构域；
(b)IgD恒定结构域；
(c)IgE恒定结构域；
(d)IgG1恒定结构域；
(e)IgG2恒定结构域；
(f)IgG3恒定结构域；
(g)IgG4恒定结构域；以及
(h)IgM恒定结构域。
43.如权利要求1-41中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体，其中该抗原结合蛋白包含选自下组的轻链免疫球蛋白恒定结构域，该组由以下各项组成：
(a)Igκ恒定结构域；以及
(b)Igλ恒定结构域。
44.如权利要求42或43所述的抗原结合蛋白或抗体，其中该抗原结合蛋白包含人类IgG1恒定结构域和人类λ恒定结构域。
45.如权利要求1-41中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体，其中该抗原结合蛋白包含IgG1恒定结构域。
46.如权利要求1-41中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体，其中该抗原结合蛋白包含IgG1/IgG3嵌合恒定结构域。
47.一种产生如权利要求1-46中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体的杂交瘤。
48.一种产生如权利要求1-46中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体的分离的宿主细胞。
49.一种制备如权利要求1-46中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体的方法，该方法包括(a)培养表达所述抗原结合蛋白或抗体的宿主细胞；并且(b)从所述培养的宿主细胞中分离所述抗原结合蛋白或抗体。
50.一种使用如权利要求49所述的方法产生的抗原结合蛋白或抗体。
51.一种药物组合物，包含根据权利要求1-46或50中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体以及药学上可接受的赋形剂。
52.如权利要求51所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂是防腐剂、稳定剂或抗氧化剂。
53.根据权利要求51所述的药物组合物，用于用作药剂。
54.如权利要求1-46或49中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体或者如权利要求51-53中任一项所述的药物组合物，还包含标记基团或效应物基团。
55.如权利要求54所述的抗原结合蛋白、抗体或药物组合物，其中该标记基团选自下组，该组由以下各项组成：同位素标记，磁标记，氧化还原活性部分，光学染料，生物素化的基团，荧光部分如生物素信号传导肽、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)，以及通过次级报告物识别的多肽表位如组氨酸肽(his)、血球凝集素(HA)、金结合肽和Flag。
56.如权利要求54所述的抗原结合蛋白、抗体或药物组合物，其中该效应物基团选自下组，该组由以下各项组成：放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂和化疗剂。
57.如权利要求1-46或50-56中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或药物组合物用于治疗或预防与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的用途。
58.一种用于在有需要的受试者中治疗、预防或改善与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的方法，该方法包括向所述受试者给予有效量的如权利要求1-46或50-56中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或药物组合物。
59.一种用于在受试者中抑制克雷伯氏菌属生长的方法，该方法包括向有需要的受试者给予如权利要求1-46或50-56中任一项所述的抗原结合蛋白、抗体或药物组合物。
60.一种用于在有需要的受试者中治疗、预防或改善与克雷伯氏菌属感染相关联的病症的方法，该方法包括向所述受试者给予有效量的抗MrkA抗体或其抗原结合片段。
61.一种用于在受试者中抑制克雷伯氏菌属生长的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的抗MrkA抗体或其抗原结合片段。
62.如权利要求61所述的方法，其中该抗MrkA抗体或其抗原结合片段特异性地结合至肺炎克雷伯氏菌MrkA、产酸克雷伯氏菌MrkA、植生克雷伯氏菌MrkA和/或肉芽肿克雷伯氏菌MrkA。
63.如权利要求62所述的方法，其中该抗MrkA抗体或其抗原结合片段特异性地结合至肺炎克雷伯氏菌MrkA。
64.如权利要求57、58和60中任一项所述的用途或方法，其中该病症选自下组，该组由以下各项组成：肺炎、尿路感染、败血症、新生儿败血症、腹泻、软组织感染、器官移植后感染、手术感染、伤口感染、肺部感染、化脓性肝脓肿(PLA)、眼内炎、脑膜炎、坏死性脑膜炎、强直性脊柱炎和脊柱关节病。
65.如权利要求57、58、60、和64中任一项所述的用途或方法，其中该病症是医院感染。
66.如权利要求57-65中任一项所述的用途或方法，其中该克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。
67.如权利要求57-66中任一项所述的用途或方法，其中该克雷伯氏菌属对头孢菌素、氨基糖苷、喹诺酮和/或碳青霉烯具有耐药性。
68.如权利要求58-67中任一项所述的方法，该方法进一步包括给予抗生素。
69.如权利要求68所述的方法，其中该抗生素是碳青霉烯或粘菌素。
70.一种编码根据权利要求1-46或50中任一项所述的抗原结合蛋白或抗体的分离的核酸分子。
71.一种编码选自下组的重链可变区(VH)序列的分离的核酸分子，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:13、14、53、54、55、和56。
72.一种编码选自下组的轻链可变区(VL)序列的分离的核酸分子，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:15、16、57、58、59、和60。
73.根据权利要求70-72中任一项所述的核酸分子，其中该核酸分子可操作地连接至控制序列。
74.一种包含根据权利要求70-73中任一项所述的核酸分子的载体。
75.一种用如权利要求70-73中任一项所述的核酸分子或如权利要求74所述的载体转化的宿主细胞。
76.一种用如权利要求71所述的核酸和编码选自下组的VL序列的核酸分子转化的宿主细胞，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:15、16、57、58、59、和60。
77.如权利要求75或76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
78.如权利要求77所述的哺乳动物宿主细胞，其中该宿主细胞是NS0鼠类骨髓瘤细胞、人类细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
79.一种包含MrkA、其免疫原性片段、或者编码MrkA或其免疫原性片段的多核苷酸的药物组合物。
80.一种包含MrkA、其免疫原性片段、或者编码MrkA或其免疫原性片段的多核苷酸的疫苗。
81.如权利要求79或80所述的药物组合物或疫苗，其中该药物组合物或疫苗包含免疫有效量的MrkA、其免疫原性片段、或者编码MrkA或其免疫原性片段的多核苷酸。
82.如权利要求79-81中任一项所述的药物组合物或疫苗，其中该药物组合物或疫苗包含佐剂。
83.如权利要求79-82中任一项所述的药物组合物或疫苗，其中该MrkA或其免疫原性片段是单体的。
84.如权利要求79-82中任一项所述的药物组合物或疫苗，其中该MrkA或其免疫原性片段是寡聚体的。
85.如权利要求79-84中任一项所述的药物组合物或疫苗，其中该MrkA是肺炎克雷伯氏菌MrkA。
86.如权利要求79-84中任一项所述的药物组合物或疫苗，其中该MrkA或其免疫原性片段包含与SEQ ID NO:17中列出的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的序列，或其中编码MrkA或其免疫原性片段的该多核苷酸编码与SEQ ID NO:17中列出的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的序列。
87.如权利要求79-84中任一项所述的药物组合物或疫苗，其中该MrkA或其免疫原性片段包含SEQ ID NO:17中列出的序列，或其中编码MrkA或其免疫原性片段的该多核苷酸编码SEQ ID NO:17中列出的序列。
88.一种在受试者中诱导针对克雷伯氏菌属的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求79-87中任一项所述的药物组合物或疫苗。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述免疫应答包括抗体应答。
90.如权利要求88所述的方法，其中所述免疫应答包括细胞介导的免疫应答。
91.如权利要求88所述的方法，其中所述免疫应答包括细胞介导的免疫应答和抗体应答。
92.要求88-91中任一项所述的方法，其中所述免疫应答是粘膜免疫应答。
93.如权利要求88所述的方法，其中该免疫应答是保护性免疫应答。
94.一种针对克雷伯氏菌属对受试者进行疫苗接种的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求79-87中任一项所述的药物组合物或疫苗。
95.一种用于在有需要的受试者中治疗、预防与克雷伯氏菌属感染相关联的病症或减少该病症发生的方法，该方法包括向所述受试者给予MrkA、其免疫原性片段、或者编码MrkA或其免疫原性片段的多核苷酸。
96.一种用于在受试者中抑制克雷伯氏菌属生长的方法，该方法包括向有需要的受试者给予MrkA、其免疫原性片段、或者编码MrkA或其免疫原性片段的多核苷酸。
97.如权利要求88-96中任一项所述的方法，其中该克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和/或肉芽肿克雷伯氏菌。
98.如权利要求97所述的方法，其中该克雷伯氏菌属是肺炎克雷伯氏菌。
99.如权利要求95-98中任一项所述的方法，其中该MrkA或其免疫原性片段是单体的。
100.如权利要求95-98中任一项所述的方法，其中该MrkA或其免疫原性片段是寡聚体的。
101.如权利要求95-100中任一项所述的方法，其中该MrkA是肺炎克雷伯氏菌MrkA。
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