CN113651884A - 人源化抗SARS-CoV-2单克隆抗体及其应用 - Google Patents
人源化抗SARS-CoV-2单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种人源化抗SARS‑CoV‑2单克隆抗体HUR58及其应用。HUR58人源化抗体包含如SEQ ID NO：1所示重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO：3所示轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCR3，还包含SEQ ID NO：17所示的重链FR1，SEQ ID NO：18所示的重链FR2，SEQ ID NO：19所示的重链FR3，SEQ ID NO：20所示的重链FR4，SEQ ID NO：21所示的轻链FR1，SEQ ID NO：22所示的轻链FR2，SEQ ID NO：23所示的轻链FR3和SEQ ID NO：24所示的轻链FR4，对SARS‑CoV‑2活病毒具有高中和活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和病毒学领域，涉及SARS-CoV-2病毒单克隆抗体及其应用。
背景技术
中和抗体是指与病毒结合后可消除病毒感染能力的抗体。除可用于感 染诊断或开发抗原检测试剂盒外，人源化中和抗体还可用于SARS-CoV-2 感染病人的临床治疗或预防。本发明的HUR58抗体具有高中和活性(IC50值为0.08μg/ml)，具有巨大的临床开发潜力。
发明内容
使用mRNA疫苗免疫原免疫小鼠，利用10×Genomics单细胞测序技术，对疫苗免疫小鼠的记忆B细胞分选建库，并测定每个记忆B细胞完整的BCR序列，即抗体的可变区序列，筛选获得一株抗SARS-CoV-2的鼠源强中和抗体R58(IC50值为0.02μg/ml)。
在本发明中，对R58鼠源单克隆抗体进行了人源化，获得HUR58人源化抗体。HUR58人源化抗体的中和活性和对RBD的亲和力跟R58鼠源抗体相当。同时，阻断实验表明，HUR58人源化抗体不阻断人ACE2与 RBD的结合，表明HUR58人源化抗体在RBD的结合区域与人ACE2不重叠，因此，HUR58人源化抗体可以与能阻断人ACE2与RBD结合的抗体配对，组成cocktail，用于SARS-CoV-2感染病人的临床治疗或预防。
具体地，本发明涉及以下方面：
1.抗SARS-Cov-2抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：1 所示重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO：3 所示轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCR3，还包含SEQ ID NO：17 所示的重链FR1，SEQ ID NO：18所示的重链FR2，SEQ ID NO：19所示的重链FR3，SEQ ID NO：20所示的重链FR4，SEQ ID NO：21所示的轻链FR1， SEQ ID NO：22所示的轻链FR2，SEQ ID NO：23所示的轻链FR3和SEQ ID NO：24所示的轻链FR4；
优选地，按照IMGT编号系统，所述抗体包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO：3所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％， 92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
HCDR2，其包含SEQ ID NO：4所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％， 92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
HCDR3，其包含SEQ ID NO：5所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％， 92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，并且所述抗体还包含：
LCDR1，其包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸，或与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％， 90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3 个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
LCDR2，其包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％， 90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3 个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO：8所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％， 92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
2.项目1所述的抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括：
重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：9所示的序列具有至少85％，优选86％，87％，88％， 89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：10所示的序列具有至少85％，优选86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
3.项目1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含人IgG1的重链恒定区和轻链恒定区，优选地，所述重链氨基酸序列如 SEQ ID NO：11所示，所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，更优选地，重链核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。
4.项目1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、双价抗体或结构域抗体。
5.多核苷酸分子，其包含编码项目1-4任一项所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列。
6.载体，其包含项目5所述的多核苷酸分子。
7.宿主细胞，其包含项目5所述的多核苷酸分子，或者项目6所述的载体。
8.制备项目1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的条件下培养项目7的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段的步骤。
9.抗体偶联物，其包括项目1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段偶联的偶联部分，所述偶联部分为纯化标签(如His标签)、细胞毒性剂，或可检测的标记。优选地，所述偶联部分为放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或聚乙二醇。
10.多特异性抗体，优选双特异性抗体，其包括项目1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段。
11.融合蛋白，其包括项目1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
12.试剂盒，其包括项目1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或者包括项目9所述的抗体偶联物、项目10所述的多特异性抗体或项目 11所述的融合蛋白。
13.项目12所述的试剂盒，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或聚乙二醇。
14.项目1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，项目9所述的抗体偶联物、项目10所述的多特异性抗体或项目11所述的融合蛋白检测 SARS-CoV-2在样品中的存在或其水平，或在制备检测人SARS-CoV-2在样品中的存在或其水平的试剂盒中的用途。
15.药物组合物，其包含项目1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，项目9所述的抗体偶联物、项目10所述的多特异性抗体或项目11所述的融合蛋白；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
16.项目1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，项目9所述的抗体偶联物、项目10所述的多特异性抗体或项目11所述的融合蛋白，用于治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病，或在制备用于治疗SARS-CoV-2引起的疾病的药物中的应用。
17.项目16所述的应用，其中所述药物为适于注射的形式，优选是适于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射或病灶内注射施用的形式。
18.治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的包含项目1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段、项目 9所述的抗体偶联物、项目10所述的多特异性抗体或项目11所述的融合蛋白的细胞的步骤。
定义：
应注意非明确数量的实体限定应指一或多个(种)该实体；例如，“双特异性抗体”应理解为表示一或多个(种)双特异性抗体。同样地，非明确数量限定的、术语“一个或多个”和“至少一个”本文中可互换使用。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽链分子之间或两个核酸分子之间的序列相似程度。同源性可通过比较每个序列中的位置来测定，可通过比对来进行比较。当在被比较的序列中的位置上有相同的碱基或氨基酸时，在该位置上的分子为同源的。多个序列之间的同源度为这些序列共有的配对或同源位点数量的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本申请的序列之一之间具有少于40％的同源性，但优选小于25％的同源性。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列具有一定的百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指，在比对时，在这两个序列比较时该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。此种比对和百分比同源性或序列同一性，可使用本领域中已知的软件程序测定，例如，通过Ausubel等人编的(2007)Current Protocols in Molecular Biology描述的那些软件。优选地，使用默认参数用于比对。BLAST是一种比对程序，使用默认参数。具体地，程序为BLASTN和BLASTP，使用如下默认参数：Genetic code＝standard； filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62； Descriptions＝50sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝ non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息，可于以下互联网地址获得：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，2008年 5月21日最后一次访问。生物学等效的多核苷酸是具有上面提到的特定百分比的同源性，并编码具有相同或相似的生物活性多肽的多核苷酸。
术语“编码”在其应用于多核苷酸时指被认为“编码”某一多肽的多核苷酸，以其天然的状态或由本领域技术人员熟知的方法操作时，它可以被转录和/或翻译以产生该多肽的mRNA和/或其片段。反义链是此种核酸的互补物，该编码序列可以由其推导出。
本文使用的术语“抗体片段”或“抗原结合片段”为抗体的一部分，该抗体例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区(CDR)片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、单链抗体(例如，scFv)、双价抗体或结构域抗体等。术语“抗体片段”也包括任何合成的或基因改造的蛋白，它们与抗体一样可结合至特定的抗原以形成复合体。
“单链可变片段”或“scFv”指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区域的融合蛋白。在某些方面，这些区域用10至约25个氨基酸的短接头肽连接。该接头可富含甘氨酸以具有柔性，也含有丝氨酸或苏氨酸以具有可溶性，且能将VH的N-末端连接至VL的C末端，反过来也一样。该蛋白质保留了原始的免疫球蛋白的特性，只是去除了恒定区并引入了接头。ScFv分子为本领域已知的，且描述于美国专利5，892，019中。
本申请的抗体、抗原结合多肽、它们的变体或衍生物包括但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化的抗体、灵长类化的(primatized)抗体、或嵌合抗体、单链抗体、抗原表位结合片段，例如，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL结构域或VH结构域的片段、由Fab表达库产生的片段、和抗独特型(idiotypic)(抗-Id)抗体。本申请的免疫球蛋白分子或抗体分子可为任何类型的(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、免疫球蛋白分子的任何类(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。
本领域技术人员可针对任何给定的重链或轻链可变区容易地识别 CDR和框架区的氨基酸，因为它们已经被明确定义(参见，“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，”Kabat，E.，等，美国卫生和公共服务部 (U.S.Department of Health andHuman Services，)，(1983)；Chothia和Lesk，J. MoI.Biol.，196：901-917(1987)，其在此通过引用以全文形式结合至本文)。
在本技术领域内使用和/或可接受的情况下，一个术语有两个或两个以上定义时，本文使用的术语的定义用于包括所有的含义，除非明确说明与此相反。一个具体的例子为，使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区中都存在的非连续的抗原结合位点。这种具体区域由Kabat等描述于美国卫生和公共服务部，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”(1983)和由Chothia等描述与 J.MoI.Biol.196：901-917(1987)中，其通过全文引用结合至本文。根据Kabat 和Chothia的定义，CDR包括相互比较时重叠的氨基酸残基，或氨基酸亚结构。然而，每种关于抗体或其变体的CDR的定义的应用都将在本文定义和使用的术语的范围内。包含如以上引用的每一篇参考文献定义的CDR 的合适的氨基酸残基列于下表中作为比较。包含特定CDR的精确残基数将随该CDR的序列和大小变化。如果给定该抗体的可变区氨基酸序列，则本领域技术人员通常可确定哪些残基包含特定CDR。
[表1]抗体可变区的定义
| Kabat | Chothia | |
| CDR-H1 | 31-35 | 26-32 |
| CDR-H2 | 50-65 | 52-58 |
| CDR-H3 | 95-102 | 95-102 |
| CDR-L1 | 24-34 | 26-32 |
| CDR-L2 | 50-56 | 50-52 |
| CDR-L3 | 89-97 | 91-96 |
Kabat等也定义了用于可变结构域序列的编号系统，该系统适用于任一种抗体。本领域技术人员可毫无疑义地将该“Kabat编号”系统用于任何可变结构域序列，而不依赖于该序列自身之外的任何实验数据。本文使用的“Kabat编号”是指Kabat等描述的编号系统，其内容记载于美国卫生和公共服务部，“Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest”(1983)。
除了上表，Kabat编号系统描述的CDR区如下：CDR-H1在大约31 号氨基酸处开始(即，第一半胱氨酸残基后约9个残基)，包括约5-7个氨基酸，并在下一个色氨酸残基处终止。CDR-H2在CDR-H1的末端后第15 个残基处开始，包括约16-19个氨基酸，并在下一个精氨酸或赖氨酸残基处终止。CDR-H3在CDR-H2的末端后约第33个氨基酸残基处开始；包括3-25个氨基酸；并在序列W-G-X-G处终止，其中X为任意氨基酸。 CDR-L1在约残基24处开始(即，在半胱氨酸残基之后)；包括大约10-17 个残基；并终止于下一个色氨酸残基。CDR-L2在CDR-L1的末端后约16 个残基后开始，并包括约7个残基。CDR-L3在CDR-L2的末端后约第33个残基处开始(即，在半胱氨酸残基之后)；包括约7-11个残基，并在序列 F或W-G-X-G处终止，其中X为任意氨基酸。
本文使用的术语“重链恒定区”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽至少包含以下一种：CH1结构域，铰链(例如，上部铰链区、中间铰链区，和/或下部铰链区)结构域，CH2结构域，CH3 结构域，或其变体或片段。例如，本申请中使用的抗原结合多肽可包含具有CH1结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分的铰链结构域和CH2结构域的多肽；具有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；具有CH1 结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链，或者具有CH1 结构域，至少一部分铰链结构，CH2结构域，和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方案中，本申请的多肽包括具有CH3结构域的多肽链。另外，在本申请中使用的抗体可能缺少至少一部分CH2结构域(例如，所有的或一部分的CH2结构域)。如上文所述，但本技术领域的普通技术人员应理解，重链恒定区可能会被修改，使得它们在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
“轻链-重链对”是指轻链和重链的集合，它们可通过轻链的CL结构域和CH1结构域之间的二硫键形成二聚体。
本文使用的术语“嵌合的抗体”将用于指以下任何抗体：其中其免疫反应区或位点得自或来自第一物种且其恒定区(该恒定区可以是完整的，部分的或根据本申请修改过的)得自第二物种。在某些实施方案中靶结合区或位点将来自非人类来源(例如小鼠或灵长类)且恒定区来自人。
本文使用的“百分比人源化”通过以下方式计算：测定人源化的结构域和种系结构域之间的框架氨基酸差值的数量(即，非CDR差)，用氨基酸总数减去该数量，然后除以氨基酸总数，再乘以100。
本文使用的术语“治疗”(“treat”或“treatment”)是指治疗性治疗和预防或防治措施，其中对于受试者进行防止或减慢(减轻)不良的生理变化或疾病，如癌症的发展。有益的或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状，降低疾病的程度、稳定(例如使其不恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病发展，改善或缓和疾病状态，并缓解(无论是部分或全部)，无论可否被检测到。“治疗”也可指与不接受治疗时的预计生存期相比能延长生存期。那些需要治疗的状况包括那些已经具有病症或症状以及那些容易具有病症或症状或那些将对病症或症状进行预防的情况。
任何上述的抗体或多肽还可包括额外的多肽，形成缀合物或融合蛋白，例如，如本文所述的编码的多肽，抗体N端的信号肽，该信号肽用于指导分泌，或如本文所述的其他异源多肽。
本技术领域的普通技术人员还应当理解，本文所述的抗体可被修改，以使得它们的氨基酸序列与天然存在的结合多肽不同，它们得自这些天然存在的结合多肽。例如，来自于指定的蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列类似，例如，与起始序列具有一定百分比的同一性，例如，其可与起始序列有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。
此外，也可进行核苷酸或氨基酸替换，缺失，或插入以在“非必需”氨基酸区域进行保守替换或改变。例如，来自指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列可与启动顺序相同，除了一个或多个独立的氨基酸的替换，插入，或缺失，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10 个、15个、20个或更多独立的氨基酸替换，插入，或缺失。在某些实施方案中，来自指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列相对于起始序列有1至5 个、1至10个、1至15个或1至20个独立的氨基酸的替换，插入，或缺失。
在其它实施方案中，本申请的抗原结合多肽可包含保守的氨基酸替换。
“保守氨基酸替换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，其包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换。在另一实施方案中，一串氨基酸可被结构上类似的氨基酸串替换，后者在顺序上和/或侧链家族的组成上不同。
在下表中提供了的保守性氨基酸替换的非限制性实例，其中相似性得分为0或更高表示在这两个氨基酸之间有保守替换。
[表2]保守型氨基酸替换的非限制性列表
可以用于产生单链Fvs(scFvs)和抗体的技术实例包括描述在美国专利第4,946,778号和5,258,498号；Huston等的Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu等的Proc.Natl.Sci.USA 90：1995-1999(1993)；和Skerra等的Science 240：1038-1040(1988)。对于某些应用，包括在人体内使用抗体和体外检测分析，可优选使用嵌合的、人源化的或人抗体。嵌合抗体为抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如含有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。嵌合抗体的制造方法是本领域已知的。见，例如，Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等的BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等的J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利第5,807,715；4,816,567和4,816397号，其全部内容通过引用的方式并入本文。
人源化的抗体为来自于非人类物种的抗体分子，并且该抗体分子结合所需的抗原，该抗体分子具有一个或多个来自非人类物种的互补决定区 (CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。通常，在人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的对应残基替换所改变，优选提高抗原结合能力。这些框架替换通过本领域已知的方法识别，例如，通过建立CDR和框架残基的相互作用模型，以鉴定对于抗原结合和序列比较重要的框架残基，以找出在特定位置的异常的框架残基。(见，例如，Queen等的美国专利第 5,585,089号；Riechmann等的Nature332：323(1988)，其全部内容通过引用并入本文)。可使用多种本领域已知的技术对抗体进行人源化，这些技术包括，例如，CDR-移植(EP 239,400；PCT公开号WO 9I/09967；美国专利第5,225,539；5,530,101和5,585,089号)，饰面(veneering)或表面置换(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等的，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等的Proc.Natl.Sci.USA 91：969-973(1994))，和链改组(shuffling)(美国专利号US 5,565,332，其全部内容通过引用结合至本文)。
使用常规的重组DNA技术，本申请的抗原结合多肽的一个或多个CDR，可插入框架区内，例如，插入至人框架区以使非人类抗体人源化。该框架区可以是天然存在的或共有的框架区，且优选为人的框架区(见，例如， Chothia等的J.Mol.Biol.278：457-479(1998)，人的框架区的列表)。优选地，该框架区和CDR的组合所产生的多核苷酸编码多肽，该多肽特异性地结合至所需多肽的至少一个抗原表位，例如，LIGHT。优选地，可在框架区内进行一个或多个氨基酸替换，并且，优选地，该氨基酸替换提高该抗体对抗原结合能力。此外，这种方法可用于获得一个或多个可变区半胱氨酸残基(该半胱氨酸残基参与链内二硫键形成)的氨基酸替换或缺失，这样产生缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。其他对于该多核苷酸进行的改变都包含在本申请的范围内，并在现有技术范围内。
此外，可使用用于通过对来自小鼠抗体分子的基因剪接生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：851-855(1984)； Neuberger等的Nature 372：604-608(1984)；Takeda等的Nature 314：452-454(1985))，将具有合适的抗原特异性，与具有合适生物活性的人抗体分子基因一起。如本文使用的，嵌合抗体为其中不同部分来自不同动物种类的分子，例如含有来自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。
然而，另一种用于产生重组抗体的高效方法公开于Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)。具体地，该技术导致产生含有猴可变结构域和人恒定序列的灵长类化的抗体。该文件通过引用全文结合至本文中。此外，这种技术也被描述在共同转让的美国专利号5,658,570、 5,693,780和5,756,096，其中每一篇通过引用并入本文。
或者，产生抗体的细胞系可使用本领域技术人员熟知的技术选择和培养。这样的技术描述在多种实验室手册和主要出版物中。在这方面，本文中适合使用的技术例如如下所述描述于Current Protocols in Immunology，Coligan等编，Green PublishingAssociates and Wiley-Interscience，John Wiley和Sons，New York(1991)，其通过引用以全文并入本文中，包括补充参考。
此外，本领域技术人员公知的标准技术可用于在编码本申请抗体的核苷酸序列中引入突变，包括，但不限于，定点诱变和PCR介导的突变，这产生氨基酸替换。优选地，所述变体(包括衍生物)，相对于参考可变重链区，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、轻链可变区、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3，编码少于50个氨基酸替换、少于40个氨基酸替换、少于30个氨基酸替换、少于25个氨基酸替换、少于20个氨基酸替换、少于15个氨基酸替换、少于10个氨基酸替换、少于5个氨基酸替换、少于4个氨基酸替换、少于3个氨基酸替换、或少于2个氨基酸替换。或者，可沿着全部或部分的编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，可对所得到的突变体针对生物活性筛选，以确定保留有活性的突变。
附图说明
图1.pHRNT载体图谱。
图2.克隆了RBD的mRNA转录模板质粒pHRNT-RBD图谱。
图3.RBDmRNA疫苗免疫诱导高水平的SARS-CoV-2病毒特异性抗体。
图4.真病毒中和抗体滴度测定
图5.RBD组小鼠记忆B细胞分选
图6.R58抗体对SARS-CoV-2RBD的亲和力
图7.HUR58抗体对人ACE2结合SARS-CoV-2RBD的阻断活性检验
图8.HUR58抗体对SARS-CoV-2RBD的亲和力
图9.阴性对照抗体(无关同型IgG抗体)的中和活性。
图10.HUR58抗体的中和活性。
图11.阳性对照抗体CB6的中和活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的分子克隆实验指南(科学出版社出版的第三版)或按照制造商所建议的条件。实验所用到的试剂，如无特殊说明，均可商购。
实施例1：mRNA疫苗制备
(1)目的基因获取：SARS-CoV-2受体结合结构域RBD氨基酸序列来源于GenebankMN908947，其氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示，经密码子优化后，其核苷酸序列如SEQ IDNO：30，由北京擎科新业生物技术有限公司合成后分别克隆至mRNA转录模板pHRNT载体(例如购自北京擎科新业生物技术有限公司)(图1)后，获得mRNA转录模板质粒 pHRNT-RBD(图2)。
(2)mRNA转录
使用限制性内切酶BamHI对mRNA转录模板pHRNT-RBD进行酶切线性化，进行琼脂糖凝胶电泳，以确认线性化是否完全，然后用胶回收试剂盒回收线性化转录模板。
按下表配制mRNA体外转录反应体系(所用酶和试剂购自美国NEB 公司)：
无RNase水与DNA模板总体积合计7.5ul。
37℃，反应4小时后，加入1μl无RNase的DNase I，37℃，反应15 分钟。
然后进行RNA的分离纯化。有多种方法可进行RNA的分离纯化，如醋酸铵沉淀法、LiCl沉淀法、有机溶剂抽提-醋酸铵沉淀法和RNA结合柱纯化等。以LiCl沉淀法为例说明：
a)RNA溶液中加入7.5M LiCl，使LiCl终浓度为2.5M；
b)-20℃过夜；
c)12000rpm/min离心15分钟，弃溶液；
d)向沉淀中加入-20℃预冷75％乙醇，清洗沉淀，然后12000rpm/min 离心1分钟，弃乙醇溶液，重复清洗三次；
e)室温晾干RNA沉淀，然后用无RNase水溶解RNA。使用Nanodrop 测定RNA浓度后，-80℃保存。
(2)mRNA加帽
通过下面方法mRNA可加帽子m7Gppp(m2′-O)N1，具体方法如下：
a)体外转录的mRNA(50-60μg)用无RNase水稀释至67μl；
b)65℃孵育5-10分钟，之后置于冰上冷却；
c)按下表配制反应体系混合液(所用酶和试剂购自美国NEB公司)；
d)反应开始前将b)中冷却的mRNA加入至c)混合液中，再加入4μl 加帽酶，37℃反应半小时。
然后对加帽后的mRNA进行分离纯化。具体方法如上所述，最后获得mRNA-RBD。
(3)mRNA纳米颗粒包装
通过微流控技术对mRNA进行纳米颗粒包装。水相为mRNA溶液(50 mM醋酸钠缓冲溶液，pH 4.0)，乙醇相为脂质混合液，由二亚油基-甲基-4- 二甲氨基丁酸酯、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG2K-DMPE按摩尔比50∶10∶38.5∶1.5比例配制。包装时水相和乙醇相的总流速为12ml/min，水相和乙醇相体积比为3∶1。包装完成的mRNA疫苗使用透析袋将缓冲液置换成PBS后，获得mRNA疫苗RBD。然后使用RiboGreen试剂测定包封的mRNA浓度后，置于4℃保存待用。
实施例2：疫苗诱导的抗体水平评价
将10只雌性6-8周龄BALB/c小鼠分成2组，每组5只，分别肌肉注射安慰(包装方法与疫苗组相同但包裹了聚胞苷酸的脂质纳米颗粒，其中聚胞苷酸购自Sigma)和RBD(15μg)mRNA疫苗。在免疫后的第4周加强免疫。分别在初次免疫后的第4周和第8周取血，4℃分离血清并56℃灭活30分钟后保存于-80℃待用。
(1)抗原特异性抗体滴度测定
将SARS-CoV-2RBD蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司)用 ELISA包被液稀释至2μg/ml，ELISA板每孔加入100μl，4℃放置过夜。第二天封闭ELISA板1小时后，小鼠血清按照2倍梯度稀释，加入到ELISA 板中37℃孵育1小时，之后用含0.05％吐温20的PBS(PBST)清洗三次后，加入羊抗鼠HRP二抗(购自北京中杉金桥生物技术公司)，37℃孵育 1小时后，PBST清洗五次，加入TMB显色液显示，并用2M盐酸终止，在酶标仪上用OD450读值。ELISA结果表明，一针免疫后，RBDmRNA 疫苗可诱导高水平的SARS-CoV-2病毒特异性抗体(图3)，加强免疫后，抗体水平进一步提升170倍(图3)。
(2)真病毒中和抗体滴度测定
将小鼠血清按2倍比进行梯度稀释，与100TCID50野生型 SARS-CoV-2真病毒(HB01株，来源于中国科学院微生物研究所P3实验室)等体积混合，37℃孵育1小时后，向100μl混合液中加入100μl密度为1.5×105/mL的Vero E6细胞。37℃孵育72小时后，显微镜下观察细胞的病变情况。最后通过Karber法计算保护50％的细胞免受病毒感染时的血清稀释倍数，即为真病毒中和抗体滴度NT50值。结果表明，初次接种 RBD mRNA疫苗所产生的中和抗体滴度NT50为263，加强免疫后中和抗体滴度NT50提高了222倍(图4)。
实施例3：免疫后小鼠记忆B细胞的筛选
(1)淋巴细胞的获得
在初次免疫8周后，麻醉并处死小鼠，解剖以取出淋巴细胞。每只鼠均取8份淋巴结(腮腺浅淋巴结，腋下淋巴结，髂下淋巴结和胭淋巴结，左右各一份)。取出淋巴结后放在含有1％胎牛血清的1640培养基中，研磨并使用0.45μm滤网过滤。
(2)淋巴细胞染色
使用冷冻离心机离心过滤后的淋巴细胞，4℃400g离心10分钟，去除上清，用1ml含0.04％BSA的PBS溶液(即染色缓冲液)重悬，转移入1.5ml EP管中。再次离心10min，去除上清，用管底残留的染色缓冲液重悬细胞。取出4μl细胞，加入400μl染色缓冲液，混匀后均分入8个 EP管，每管50μl。其中7管用做单阳管(分别染色FITC抗鼠GL7抗原，PE抗鼠CD138，PE/Cyanine7抗鼠CD38，APC抗鼠CD93，Brilliant Violet 421抗鼠CD45R/B220，BrilliantViolet 510抗鼠IgD或strep-BV711 抗体，以上抗体均购自Biolegend公司)，1管用作阴性对照管(不染任何一种抗体)。加入250μl染色缓冲液重悬剩余的细胞并混匀，用作样品管。向样品管和strep-BV711单染管中加入生物素标记的SARS-CoV-2 RBD蛋白(终浓度为400nM，蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司)，4℃避光孵育30分钟。用染色缓冲液洗细胞2次，向细胞中加入相应抗体(使用浓度参考说明书)，4℃避光孵育30分钟。再用染色缓冲液洗细胞2次，加入2ml染色缓冲液重悬细胞并用0.45μm的滤网过滤，转入流式管中，准备上机。
(3)抗原特异性记忆B细胞的分选
通过流式细胞仪(BD Biosciences)画门分选出同时满足FITC-GL7 阳性，PE-CD138阴性，PE/Cy7-CD38阴性或弱阳性，APC-CD93阴性， BV421-B220强阳性，BV510-IgD阴性及strep-BV711阳性的细胞，即为抗原特异性记忆B细胞。
结果表明，RBD mRNA疫苗组分选得到约20000个目标细胞(图5)，最终上机检测到活力达标的细胞数目分别约为9000。
实施例4：高通量测序及抗体序列的获得
根据美国10×Genomics公司Chromium单细胞5′文库构建操作手册，进行单克隆记忆B细胞BCR测序样品处理。记忆B细胞经过流式细胞仪分选出来后，将细胞离心，重悬于含有3％胎牛血清(购自 Sigma-Aldrich公司)的PBS缓冲溶液中，随后利用细胞计数器进行细胞数量和质量控制。处理后的B细胞需要细胞活力大于70％。在确定细胞密度和质量后，将细胞加样到三个通道中，以保证每个通道约有1000-3000 个细胞。在10×Chromium机器中，芯片每一通道的凝胶珠与单个细胞形成的油滴(GEMs)，收集后进行GEM逆转录反应。在GEMs破乳化后， GEM-RT产物经过循环PCR扩增，利用SPRIselect beads(购自Beckman Coulter公司)纯化。
单细胞BCR V(D)J文库根据10×Genomics用户指南准备。随后利用 BioanalyzerHigh Sensitivity DNA kit(购自Agilent Technologies公司)进行下一步操作。然后利用kapa Library Quantification Kit(购自Kapa Biosystems公司)进行定量操作。最后制备好的文库在Illumina NovaSeq 上利用成对末端测序进行测序。使用Illumina bcl2fastq2.20将BCL数据转换为FASTQ文件。
我们保留了前26个碱基用于读取一个包含16nt细胞条形码和10nt 唯一分子标识符(UMI)。随后分析了FASTQ文件。利用Cell Ranger Single-Cell Software Suite(3.1.0版本)进行条形码处理与单细胞V(D)J 序列分析。随后利用Cell Ranger V(D)J pipeline进行FASTQ文件处理。首先，针对有效的细胞条形码和UMIs进行reads过滤，经过过滤的reads通过与GRCm38 V(D)J参考基因组比对，拼接为contigs，然后定义V、D和 J片段为1个contig，并鉴别出CDR3序列，并根据这些数据确定contigs 能否读通，这意味着它可能对应于功能性B细胞受体。最后，如果满足以下三个要求，条形码被确定为目标细胞。1)必须能够读通、确信的contig，如果只有一个这样的contig，必须有一个以上的UMI支持其J区域。2)必须至少有三个已过滤的UMIs，每个UMI至少有两个read pairs。3)计算所有条形码中每个UMI的读read pairs数量的N50值。如果对于给定的条形码，经过过滤的UMIs的最大readpairs数量小于N50的3％，则不要将条形码称为单个细胞。通过精确核苷酸匹配，相同的能够读通的CDR3 序列的细胞集合被定义为克隆型。利用LoupTem V(D)J浏览器对 10×Chromium产生的单细胞5′数据中的V(D)J序列和克隆型进行分析、搜索和可视化，并使用IgBLAST v1.6.1对序列进行进一步注释和分析，以识别可变区基因片段和体细胞突变。
结果表明，细胞上机后，RBD疫苗组测到4060个细胞，其中重链序列3615条，轻链序列4163条，轻重链序列可配对的细胞3048个，轻重链CDR3区域完全相同的细胞定义为一种克隆型，共1611种克隆。
实施例5：抗体的构建、表达及活性测定
(1)抗体重链、轻链质粒的构建
在RBD疫苗抗体库中选取频率最高的前100种克隆(对应的抗体命名为R1，R2，...，至R100)，委托南京金斯瑞公司将单克隆抗体可变区氨基酸序列进行密码子优化，之后在基因5’和3’端分别添加信号肽序列和小鼠IgG2a抗体恒定区后进行全基因合成。其中，信号肽氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示，小鼠IgG2a 轻链恒定区氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示，小鼠IgG2a重链恒定区氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示，抗体轻重链全基因合成后分别构建至 pCAGGS载体(例如，可购自丰晖生物)，最后获得单克隆抗体完整的轻重链表达质粒。
(2)细胞表达上清中抗体浓度的测定
将同一抗体配对的重链、轻链质粒以2：3的比例共转染293T细胞，转染4-6小时后，PBS洗涤细胞2次，换成无血清DMEM培养基培养。于转染后3天收取细胞上清，离心去除细胞碎片，获得抗体上清。
使用Mouse IgG2a Elisa Kit(购自Multi Sciences公司)测定上清中的抗体浓度。首先，向试剂盒中预包被有抗小鼠IgG2a单克隆抗体的商业化 Elisa板上加入试剂盒中的鼠抗IgG2a标准品或待测定的细胞上清，室温孵育2小时。PBST清洗6次，加入HRP偶联检测抗体，室温孵育1小时。 PBST清洗6次之后即可加入TMB显色，并用2M硫酸终止，在酶标仪上用OD450读值。根据标准品的浓度与读值计算出标准曲线，并根据标准曲线与样品的吸光值计算出细胞上清中抗体的浓度。
(3)抗体表达上清的中和活性评价
根据上述细胞上清中的抗体浓度定量结果，将抗体稀释至不同浓度范围(＞6μg/ml，1-6μg/ml，0.1-0.6μg/ml和＜0.1μg/ml)，每个样品每个浓度梯度做4个重复，每个重复50μl，与50μl100TCID50的野生型 SARS-CoV-2真病毒(HB01株)等体积混合，37℃孵育1小时。再向混合液中加入100μl密度为1.5×105/mL的Vero E6细胞。37℃孵育72小时，显微镜下观察细胞的病变情况。定义抗体的IC50-100％值为抑制50％及以上细胞(即2个重复)发生病变所需的最小抗体浓度范围，若抗体在＞6μg/ml 的浓度下，细胞病变率仍在50％以上，则定义该抗体无中和活性。最后筛选到具有强中和活性的R58抗体，其IC50-100％小于＜0.1μg/ml。中和抗体轻重链可变区氨基酸和核苷酸序列，CDR区氨基酸序列如SEQ ID NO：1 至SEQ IDNO：10所示。
实施例7：R58抗体的表达和分离纯化
在转染前的14-16h将细胞密度较大的细胞分盘(如一盘100％铺满 293T细胞的10cm培养皿以1∶3进行传代)，14-16h后，细胞密度达到 70％以上即可进行转染。
将实施例5(1)中R58抗体的重链、轻链表达质粒以2∶3的比例共转染293T细胞，转染4-6小时后，PBS洗涤细胞2次，换成无血清DMEM 培养基培养。分别于转染后第3天和7天收取细胞上清，离心去除细胞碎片，将两次获得的抗体上清混合，用于后续的目的蛋白纯化。
将Protein G(5ml)HP亲和柱(GE公司)连接于AKTA Purifier/Explorer/FPLC/START(GE公司)上，在机器上的操作过程如下：先用水将柱中的20％乙醇冲出，再用20mMNa3PO4，pH7.0的缓冲液平衡柱子，待仪器上电导显示为4.5％并平稳后将上述抗体上清通过10ml loop 环上样的方式注入与Protein G结合，流速2ml/min，待UV平稳后，在随后的收集管中加入1M Tris pH9.0缓冲液约0.8ml(收集体积约3.2ml)，然后在程序上改为100％的0.1M Gly pH3.0洗脱挂在柱子上的抗体，收集洗脱的样品，然后采用浓缩换液的方法，将抗体缓冲液置换成PBS，直接使用或分装保存于-80℃冰箱。
实施例9：R58抗体亲和力测定
采用SPR(表面等离子共振)技术测定R58抗体亲和力，选用Biacore 8k完成样品检测(购自于美国GE公司)。以10μl/min流速的HBS-EP缓冲液平衡芯片表面5分钟，随后以10μl/min的流速注射“NHS+EDC”的1∶1 混合液100秒来活化芯片，将稀释在10mM醋酸钠缓冲液中的anti-mouse IgG Fc(购自于美国GE公司)以10μl/min流速注射约180秒进行偶联，最后以10μl/min的流速注射乙醇胺200秒进行表面封闭。以HBS-EP缓冲液作为样品进行三个预循环来平衡芯片使基线稳定。以30μl/min流速注射R58抗体(20μg/mL)120秒进行捕获抗体，之后30μl/min流速注射 100nM的SARS-CoV-2 RBD-his蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司)240秒进行结合，之后30μl/min流速注射缓冲液300秒进行解离，30 μl/min流速注射10mM Gly-HCl，pH1.7共三次，每次30秒进行再生，一次循环结束。改变抗体浓度进行下一个梯度浓度的循环测定直到所有梯度浓度(6.125nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM)。实验数据经过双扣减(对照通道及零浓度)后，在Biacore 8K evaluation软件(GE公司)中进行“1∶1结合”模型的拟合，分析结合动力学参数和计算亲和力常数(kD)。结果表明，R58抗体对SARS-CoV-2 RBD的亲和力kD值为9.74×10-10 M (图6)。
实施例10：R58鼠源抗体的人源化
根据R58抗体的序列同源性，本发明在保留抗体的CDR区基础上，通过替换人源抗体骨架，获得人源化抗体HUR58。委托北京擎科新业生物技术有限公司全基因合成HUR58抗体轻重链基因，克隆构建至哺乳动物表达载体pCAGGS(例如，购自丰晖生物)上，通过瞬时转染293T细胞表达人源化抗体HUR58。
SEQ ID No.1：R58鼠源抗体重链可变区氨基酸序列
SEQ ID No.2：R58鼠源抗体轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID No.3：R58鼠源抗体重链可变区CDR1氨基酸序列
SEQ ID No.4：R58鼠源抗体重链可变区CDR2氨基酸序列
SEQ ID No.5：R58鼠源抗体重链可变区CDR3氨基酸序列
SEQ ID No.6：R58鼠源抗体轻链可变区CDR1氨基酸序列
SEQ ID No.7：R58鼠源抗体轻链可变区CDR2氨基酸序列
SEQ ID No.8：R58鼠源抗体轻链可变区CDR3氨基酸序列
SEQ ID No.9：HUR58人源化源抗体重链可变区氨基酸序列
SEQ ID No.10：HUR58人源化源抗体轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID No.11：HUR58人源化源抗体重链氨基酸序列
SEQ ID No.12：HUR58人源化源抗体轻链氨基酸序列
SEQ ID No.13：HUR58人源化源抗体重链核苷酸序列
SEQ ID No.14：HUR58人源化源抗体轻链核苷酸序列
SEQ ID No.15：HUR58人源化源抗体轻重链信号肽氨基酸序列
SEQ ID No.16：HUR58人源化源抗体轻重链信号肽核苷酸序列
SEQ ID NO.17：HUR58人源化源抗体重链FR1氨基酸序列
SEQ ID NO.18：HUR58人源化源抗体重链FR2氨基酸序列
SEQ ID NO.19：HUR58人源化源抗体重链FR3氨基酸序列
SEQ ID NO.20：HUR58人源化源抗体重链FR4氨基酸序列
SEQ ID NO.21：HUR58人源化源抗体轻链FR1氨基酸序列
SEQ ID NO.22：HUR58人源化源抗体轻链FR2氨基酸序列
SEQ ID NO.23：HUR58人源化源抗体轻链FR3氨基酸序列
SEQ ID NO.24：HUR58人源化源抗体轻链FR4氨基酸序列
实施例11：人源化抗体HUR58的体外重组表达
将HUR58抗体的重链、轻链质粒以2：3的比例共转染293T细胞，转染4-6小时后，PBS洗涤细胞2次，换成无血清DMEM培养基培养。分别于转染后第3天和7天收取细胞上清，离心去除细胞碎片，将两次获得的抗体上清混合，用于后续的目的蛋白纯化。
通过ProteinA(5ml)HP亲和柱(GE公司)纯化抗体，直接使用或分装保存于-80℃冰箱。
实施例12：HUR58抗体阻断功能鉴定
委托金斯瑞生物科技股份有限公司全基因合成人ACE2(Genbank Accessionnumber BAJ21180)全长编码序列，通过5’端HindIII和3’端 BamHI两个酶切位点克隆入表达载体pEGFP-N1(来源于金斯瑞生物科技股份有限公司)，构建人ACE2蛋白的跨膜真核表达质粒pEGFP-hACE2。重组表达质粒pEGFP-hACE2转染HEK 293T细胞，24h后使用荧光显微镜可观察到人ACE2膜蛋白(与EGFP共表达)的表达。弃掉培养液，将 HEK 293T细胞用胰蛋白酶消化下来，离心后用PBS重悬。将5ul浓度为 50μg/ml SARS-CoV-2 RBD-his蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司)与10倍量抗体混合，37℃孵育30分钟，其中，阳性对照抗体为CB6(中国科学院微生物研究所，CB6轻重链氨基酸序列来源于GeneBank数据库，Aceessioncodes分别为MT470196和MT470197；CB6抗体对 SARS-CoV-2病毒的中和活性见文章Shi，R.，Shan，C.，Duan，X.et al.A human neutralizing antibody targets the receptor-binding site of SARS-CoV-2. Nature 584，120-124，2020)，阴性对照抗体为无关同型IgG抗体(中国科学院微生物研究所)。将上述表达人ACE2蛋白的293T细胞分到96孔板，离心后，弃掉上清，加入上述SARS-CoV-2 RBD-his蛋白与抗体混合液，4℃孵育30分钟。600g离心5分钟，甩去上清，加入200μL PBS洗涤细胞，600g离心5分钟，重复上述步骤2次。每孔加入100μL 1∶200稀释的 anti-his-APC mouse mAb(购自美天旎公司)，4℃避光孵育30分钟。600 g离心5分钟，甩去上清，加入200μL PBS洗涤细胞，600g离心5分钟，重复上述步骤2次，最后加入200μL PBS缓冲液重悬细胞并转移至流式管中，最终在BD FACSCalibur流式仪上完成样品检测。最终数据分析由 FlowJo软件完成。结果表明，无关同型IgG抗体不阻断人ACE2与 SARS-CoV-2RBD的结合，阳性对照CB6抗体可完全阻断人ACE2与RBD 的结合，而HUR58抗体不阻断人ACE2与RBD的结合，说明HUR58抗体在RBD的结合区域与人ACE2在RBD的结合区域不重叠(图7)。
实施例13：HUR58抗体亲和力测定
采用SPR(表面等离子共振)技术测定HUR58抗体亲和力，选用 Biacore 8k完成样品检测(购自于美国GE公司)。以10μl/min流速的 HBS-EP缓冲液平衡芯片表面5分钟，随后以10μl/min的流速注射“NHS+EDC”的1∶1混合液100秒来活化芯片，将稀释在10mM醋酸钠缓冲液中的anti-mouse IgG Fc(购自于美国GE公司)以10μl/min流速注射约180秒进行偶联，最后以10μl/min的流速注射乙醇胺200秒进行表面封闭。以HBS-EP缓冲液作为样品进行三个预循环来平衡芯片使基线稳定。以30μl/min流速注射R58抗体(20μg/mL)120秒进行捕获抗体，之后 30μl/min流速注射100nM的SARS-CoV-2RBD-his蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司)240秒进行结合，之后30μl/min流速注射缓冲液 300秒进行解离，30μl/min流速注射10mM Gly-HCl，pH1.7共三次，每次30秒进行再生，一次循环结束。改变抗体浓度进行下一个梯度浓度的循环测定直到所有梯度浓度(6.125nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM)。实验数据经过双扣减(对照通道及零浓度)后，在Biacore 8K evaluation软件中进行“1∶1结合”模型的拟合。使用Biacore 8K测定抗体针对SARS-CoV-2 RBD-his的亲和力。结果表明，HUR58抗体亲和力kD值为1.15×10-9M，与人源化前鼠源抗体R58亲和力(kD值为9.74×10- 10M)相当(图8)。
实施例14：HUR58抗体的中和活性
将抗体倍比系列稀释，每个样品每个浓度梯度做8个重复，每个重复 50μl，与50μl100TCID50的野生型SARS-CoV-2真病毒(HB01株，来源于中国科学院微生物研究所P3实验室)等体积混合，37℃孵育1小时。其中，阳性对照抗体为CB6，阴性对照抗体为无关同型IgG抗体(中国科学院微生物研究所)。再向混合液中加入100μl密度为1.5×105/mL的Vero E6细胞。37℃孵育72小时，显微镜下观察细胞的病变情况。将每个浓度的平行样品孔病变的数量进行统计，中和抑制率＝100％-病变孔数/总孔数*100％，根据中和抑制率结果，用生物统计学软件Graphpad拟合抗体浓度-抑制率曲线，计算出IC50值。结果表明，阴性对照抗体无中和活性(图 9)，HUR58抗体IC50值为0.08μg/ml(图10)，中和活性强于阳性对照抗体CB6(IC50值为0.2μg/ml)(图11)。
序列表
R58鼠源抗体重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：1
R58鼠源抗体轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO：2
R58鼠源抗体重链可变区CDR1氨基酸序列SEQ ID NO：3
R58鼠源抗体重链可变区CDR2氨基酸序列SEQ ID NO：4
R58鼠源抗体重链可变区CDR3氨基酸序列SEQ ID NO：5
R58鼠源抗体轻链可变区CDR1氨基酸序列SEQ ID NO：6
R58鼠源抗体轻链可变区CDR2氨基酸序列SEQ ID NO：7
R58鼠源抗体轻链可变区CDR3氨基酸序列SEQ ID NO：8
HUR58人源化抗体重链可变区氨基酸序列SEQ ID No.9：
HUR58人源化抗体轻链可变区氨基酸序列SEQ ID No.10：
HUR58人源化抗体重链氨基酸序列SEQ ID No.11：
HUR58人源化抗体轻链氨基酸序列SEQ ID No.12：
HUR58人源化抗体重链核苷酸序列SEQ ID No.13：
HUR58人源化抗体轻链核苷酸序列SEQ ID No.14：
HUR58人源化抗体轻重链信号肽氨基酸序列SEQ ID NO：15
HUR58人源化抗体轻重链信号肽核苷酸序列SEQ ID NO：16
HUR58人源化抗体重链可变区FR1氨基酸序列SEQ ID No.17：
HUR58人源化抗体重链可变区FR2氨基酸序列SEQ ID No.18：
HUR58人源化抗体重链可变区FR3氨基酸序列SEQ ID No.19：
HUR58人源化抗体重链可变区FR4氨基酸序列SEQ ID No.20：
HUR58人源化抗体轻链可变区FR1氨基酸序列SEQ ID No.21：
HUR58人源化抗体轻链可变区FR2氨基酸序列SEQ ID No.22：
HUR58人源化抗体轻链可变区FR3氨基酸序列SEQ ID No.23：
HUR58人源化抗体轻链可变区FR4氨基酸序列SEQ ID No.24：
小鼠IgG2a轻链恒定区氨基酸序列SEQ ID NO：25
小鼠IgG2a轻链恒定区核苷酸序列SEQ ID NO：26
小鼠IgG2a重链恒定区氨基酸序列SEQ ID NO：27
小鼠IgG2a重链恒定区核苷酸序列SEQ ID NO：28
SARS-CoV-2受体结合结构域RBD的氨基酸序列SEQ ID NO：29
SARS-CoV-2受体结合结构域RBD的核苷酸序列SEQ ID NO：30
Claims (18)
1.抗SARS-Cov-2抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：1所示重链可变区包含的HCDR1，HCDR2和HCDR3，以及如SEQ ID NO：3所示轻链可变区包含的LCDR1，LCDR2和LCR3，还包含SEQ ID NO：17所示的重链FR1，SEQ ID NO：18所示的重链FR2，SEQ ID NO：19所示的重链FR3，SEQ ID NO：20所示的重链FR4，SEQ ID NO：21所示的轻链FR1，SEQ ID NO：22所示的轻链FR2，SEQ ID NO：23所示的轻链FR3和SEQ ID NO：24所示的轻链FR4；
优选地，按照IMGT编号系统，所述抗体包含：
HCDR1，其包含SEQ ID NO：3所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
HCDR2，其包含SEQ ID NO：4所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
HCDR3，其包含SEQ ID NO：5所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，并且所述抗体还包含：
LCDR1，其包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸，或与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
LCDR2，其包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
LCDR3，其包含SEQ ID NO：8所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。
2.权利要求1所述的抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括：
重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：9所示的序列具有至少85％，优选86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和
轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：
SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，或
与SEQ ID NO：10所示的序列具有至少85％，优选86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％以上序列同一性的序列，或
与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。
3.权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含人IgG1的重链恒定区和轻链恒定区，优选地，所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，所述轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，更优选地，重链核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb、Fab/c、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、双价抗体或结构域抗体。
5.多核苷酸分子，其包含编码权利要求1-4任一项所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列。
6.载体，其包含权利要求5所述的多核苷酸分子。
7.宿主细胞，其包含权利要求5所述的多核苷酸分子，或者权利要求6所述的载体。
8.制备权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在合适的条件下培养权利要求7的宿主细胞，以及从细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段的步骤。
9.抗体偶联物，其包括权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段偶联的偶联部分，所述偶联部分为纯化标签(如His标签)、细胞毒性剂，或可检测的标记。优选地，所述偶联部分为放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或聚乙二醇。
10.多特异性抗体，优选双特异性抗体，其包括权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段。
11.融合蛋白，其包括权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
12.试剂盒，其包括权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或者包括权利要求9所述的抗体偶联物、权利要求10所述的多特异性抗体或权利要求11所述的融合蛋白。
13.权利要求12所述的试剂盒，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别所述抗体或其抗原结合片段；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如放射性同位素、发光物质、有色物质、酶或聚乙二醇。
14.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求9所述的抗体偶联物、权利要求10所述的多特异性抗体或权利要求11所述的融合蛋白检测SARS-CoV-2在样品中的存在或其水平，或在制备检测人SARS-CoV-2在样品中的存在或其水平的试剂盒中的用途。
15.药物组合物，其包含权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求9所述的抗体偶联物、权利要求10所述的多特异性抗体或权利要求11所述的融合蛋白；可选地，其还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
16.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，权利要求9所述的抗体偶联物、权利要求10所述的多特异性抗体或权利要求11所述的融合蛋白，用于治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病，或在制备用于治疗SARS-CoV-2引起的疾病的药物中的应用。
17.权利要求16所述的应用，其中所述药物为适于注射的形式，优选是适于通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射或病灶内注射施用的形式。
18.治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的包含权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9所述的抗体偶联物、权利要求10所述的多特异性抗体或权利要求11所述的融合蛋白的细胞的步骤。
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