JP2022516848A - Ｂｔｎ３ａ結合タンパク質及びその使用 - Google Patents

Abstract

ＢＴＮ３Ａと特異的に結合し、Ｖγ９／Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞溶解機能を活性化させる抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体断片が開示される。本開示は、より詳細には、そのような活性化抗体断片を含む特定の抗ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、及び、癌障害、特に、活性化γδ Ｔ細胞を用いた処置に感受性のある癌の処置における使用のための新規薬物の製造におけるその使用に関する。【選択図】 なし

Description

現在までに、Ｔ細胞の調節に頼る様々な治療戦略及びワクチン戦略が提案されており、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＰＤ－Ｌ１に対するいくつかの免疫調節性抗体が、世界中の複数の規制機関によって臨床的使用のために既に認可されている。これらの薬物は癌治療における大きな進歩を表しているが、現在利用可能な処置に応答しない癌患者集団の大部分に対して、満たされていない医学的なニーズが依然として存在する。

ＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２、及びＢＴＮ３Ａ３アイソフォームは、リンパ球細胞及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）上で発現される。さらに、文献及びデータベース分析は、ＢＴＮ３Ａメンバーが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液学的起源の様々な腫瘍において、並びに乳房、結腸、卵巣などの固形腫瘍において、胃癌及び膵管腺癌（ＰＤＡＣ）において広く発現されていることを示している。ＰＤＡＣ組織の免疫組織化学的分析により、すべての試験した腫瘍試料においてＢＴＮ３Ａ発現が確認された一方で、対照の膵臓正常組織においては不在又はほぼ検出不可能のどちらかであった。さらに、免疫組織化学により、上皮ＢＴＮ３Ａ発現は、高悪性度重篤上皮卵巣癌患者においてより良好な予後診断と有意に関連しており、より高密度の浸潤性Ｔ細胞と相関していたことが示されている。

さらに、３９個の悪性腫瘍にわたる全生存期間の治療成績を含む、約１８，０００個のヒト腫瘍からの発現シグネチャの分析により、腫瘍浸潤性γδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）が、最も有意で有益な癌全体での予後シグネチャとして同定された（Ｇｅｎｔｌｅｓら、２０１５年）。これらのデータは、腫瘍浸潤性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球が豊富に存在することが、結腸直腸若しくは前立腺腺癌又は血液学的悪性腫瘍を有する患者のコホートにおける有益な治療成績と関連していることを示す、最近の研究によって確認されている（Ｔｏｓｏｌｉｎｉら、２０１７年）。

研究により、標的細胞と結合した抗ＢＴＮ３Ａ抗体が、固形腫瘍に由来するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を始動させることが示されている（総説にはＢｌａｚｑｕｅｚら、２０１８年を参照）。抗腫瘍応答に対するγδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）の強力な潜在性を考慮すると、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞による死滅に対する、ＢＴＮ３Ａ抗体媒介性の腫瘍細胞の予備刺激及び感作は、固形及び血液学的悪性腫瘍の両方の癌を処置するための、魅力的かつ新規の治療機会となる。

特許公開国際公開第２０１２０８０３５１号、欧州特許第２６５１４４１号、欧州特許第２９４６７９１号、米国特許第２０１４０３２２２３５号、国際公開第２０１２０８０７６９号は、細胞溶解機能、サイトカイン産生、及びＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞増殖を活性化又は阻害する能力を有する、ＣＤ２７７に対する様々な抗体に言及している。

特に、国際公開第２０１２０８０７６９号は、細胞溶解機能、サイトカイン産生、及びＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞増殖を活性化させる能力を有するｍＡｂ２０．１及び７．２などの、言及した特定のモノクローナルマウス抗体、並びに癌及び感染障害の処置における使用を記載している。さらに、国際公開第２０１２０８０７６９号は、細胞溶解機能、産生、及びＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞増殖を阻害する、逆の活性を有するｍＡｂ１０３．２と呼ばれる特定のマウスモノクローナル抗体を記載している。その結果、そのようなマウス抗体ｍＡｂ１０３．２並びに対応するキメラ及びヒト化バージョンは、炎症性障害の処置において有用であることが示唆された。

Ｐａｌａｋｏｄｅｔｉら、２０１２年は、ｍＡｂ１０３．２のｓｃＦｖ断片を記載している（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８７（３９）、頁３２７８０～３２７９０）。

本発明者らは今回、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２断片などのｍＡｂ１０３．２の一部の断片が、ＢＴＮ３Ａに関して活性化特性を示し、細胞溶解機能、サイトカイン産生、及び／又はＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞増殖を活性化させることができることを、驚くべきことに見出した。

したがって、本開示は、ｍＡｂ１０３．２のそのような活性化抗体断片を含むＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、及び、癌障害、特に、活性化γδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）を用いた処置に感受性のある癌の処置における使用のための新規薬物の製造におけるその使用に関する。

本開示は、
ｉ．配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ－２、及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
ｉｉ．配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５又は配列番号１７のＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を有する少なくともＢＴＮ３Ａ抗体断片を含む、単離されたＢＴＮ３Ａ結合タンパク質であって、以下の特性：
ｉ．バイオ層干渉法（ＢＬＩ）技術によって測定される場合、１０ｎＭ以下のＫ_Ｄ、好ましくは５ｎＭ以下のＫ_ＤでヒトＢＴＮ３Ａ１と結合すること、並びに／又は、
ｉｉ．ダウディ（Ｄａｕｄｉ）若しくはＳＫＯＶ－３細胞などの癌細胞との共培養物中におけるγδ Ｔ細胞（Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞など）の活性化を、ＣＤ１０７脱顆粒アッセイにおいて測定される場合、１０ｎＭ以下、好ましくは１ｎＭ以下のＥＣ_５０で誘導すること、並びに／又は
ｉｉｉ．ＰＢＭＣ内のγδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）の活性化及び増殖を誘導すること
を有する、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質に関する。

具体的な実施形態では、前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片は、
（ｉ）配列番号１８の重鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号１９の軽鎖可変領域と
を含む。

以前の実施形態と組み合わせてもよい具体的な実施形態では、前記抗ＢＴＮ３Ａ抗体断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又は（Ｆａｂ）’_２断片から選択される。

以前の実施形態と組み合わせてもよい具体的な実施形態では、本開示の前記ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質は、ＢＴＮ３Ａとの結合について一価又は二価である。

以前の実施形態と組み合わせてもよい具体的な実施形態では、本開示の前記ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ）’_２断片から選択される前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片から本質的になる、たとえば、配列番号１８のＶＨドメインと配列番号１９のＶＬドメインとを含むｓｃＦｖからなる。

以前の実施形態と組み合わせてもよい具体的な実施形態では、前記ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質は、１つ又は複数の追加のタンパク質ドメインと融合した前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片を含む融合タンパク質である。

前記ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質は、たとえば、癌、典型的には、γδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）を用いた処置に感受性のある癌の処置において、医薬品として使用してもよい。

以前の実施形態と組み合わせてもよい具体的な実施形態では、前記ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質は、（ｉ）固形腫瘍及び／又は（ｉｉ）血液癌の処置において使用してもよい。

したがって、本開示は、上記定義したＢＴＮ３Ａ結合タンパク質を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含み、任意選択で他の活性成分を含む、医薬組成物にも関する。

本開示は、前記抗ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質をコードしている１つ又は複数の核酸を含む、宿主細胞中における上記定義したＢＴＮ３Ａ結合タンパク質の組換え産生のための発現ベクターをさらに提供する。

具体的な実施形態では、前記抗ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質をコードしている前記核酸は、上記定義した前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片の重鎖及び軽鎖のコード配列、典型的には配列番号１８及び１９を含む。

本開示はまた、上記定義した発現ベクターを含む宿主細胞にも関する。

また、本開示の一部は、上記定義したＢＴＮ３Ａ結合タンパク質を産生する方法であって、（ｉ）上記定義した宿主細胞を培養して、前記宿主細胞により前記タンパク質を発現させるステップと、任意選択で、（ｉｉ）前記タンパク質を精製し、前記タンパク質を製剤化するステップとを含む方法である。

本開示の別の態様は、γδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）の増殖及び／又は活性化をｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで誘導する方法であって、効率的な量の上記定義したＢＴＮ３Ａ結合タンパク質を、前記γδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）と、任意選択でＢＴＮ３Ａ発現腫瘍細胞などの他のＢＴＮ３Ａ発現細胞の存在下で接触させるステップを含む方法に関する。

定義
本開示をより容易に理解することができるように、特定の用語をまず定義する。追加の定義が詳細な説明の全体にわたって記載されている。

本明細書中で使用する用語「ＢＴＮ３Ａ」は、当分野における一般的な意味を有しており、配列番号２３のＢＴＮ３Ａ１、配列番号２４のＢＴＮ３Ａ２、又は配列番号２５のＢＴＮ３Ａ３のいずれかを含むヒトＢＴＮ３Ａポリペプチドをいう。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」とは、互換的に使用され、修飾（たとえばリン酸化又はグリコシル化）にかかわらず、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを広くいう。この用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の類似体又は模倣体であるアミノ酸ポリマー、及び天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。この用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドは、たとえば、炭水化物残基を付加して糖タンパク質を形成させることによって、修飾することができる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、糖タンパク質及び非糖タンパク質を明白に含む。具体的な実施形態では、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」とは、遺伝子によってコードされており、哺乳動物宿主細胞などの細胞発現系を使用して、組換え手段によって翻訳することができる任意のポリペプチド又はタンパク質をいう。

本明細書中で使用する用語「組換えタンパク質」とは、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック若しくはトランス染色体である動物（たとえばマウス）から単離された抗体、又はそれから調製したハイブリドーマ調製（以下にさらに記載する）、（ｂ）対応するタンパク質を発現するように形質転換させた宿主細胞から、たとえばトランスフェクトーマなどから単離されたタンパク質などの、組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されたタンパク質を含む。

本明細書中で使用する用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原と特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子をいう。

げっ歯動物及び霊長類の天然抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結されており、それぞれの重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。２種類の軽鎖、すなわちラムダ（１）及びカッパ（ｋ）が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（又はアイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。それぞれの鎖は、明白に異なる配列ドメインを含有する。典型的なＩｇＧ抗体では、軽鎖は２つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は４つのドメイン、すなわち１つの可変ドメイン（ＶＨ）並びに３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、ＣＨと総称する）を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）のどちらの可変領域も、結合認識及び抗原に対する特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）との結合などの重要な生物学的特性を与える。

Ｆｖ断片は免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１本の軽鎖及び１本の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からのものである残基から構成されている。時折、非超可変又はフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基が、抗体結合部位に参加する、又は全体的なドメイン構造、それ故に結合部位に影響を与える場合がある。相補性決定領域又はＣＤＲとは、一緒になってネイティブ免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を定義するアミノ酸配列をいう。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖はそれぞれ３つのＣＤＲを有しており、それぞれＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、及びＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と命名されている。したがって、抗原結合部位は、典型的には、重鎖及び軽鎖のＶ領域のそれぞれからのＣＤＲ組を含む、６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）とは、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列をいう。したがって、軽鎖及び重鎖の可変領域は、典型的には、４つのフレームワーク領域及び以下の配列の３つのＣＤＲを含む：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。

抗体可変ドメイン中の残基は、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って慣習的に付番されている。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７年、免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ、米国（Ｋａｂａｔら、１９９２年、本明細書中以降「Ｋａｂａｔら」）に記載されている。この付番システムを本明細書中において使用する。Ｋａｂａｔ残基の命名は、配列番号の配列中のアミノ酸残基の直線的付番に必ずしも直接対応していない。実際の直線的アミノ酸配列は、基本的可変ドメイン構造のフレームワークであるか相補性決定領域（ＣＤＲ）であるかにかかわらず、構造的構成要素の短縮又はそれ内への挿入に対応する、厳密なＫａｂａｔ付番中におけるものもよりも少ない又は追加のアミノ酸を含有することがある。抗体の配列中における相同性の残基を、「標準の」Ｋａｂａｔ付番した配列とアラインメントすることによって、残基の正しいＫａｂａｔ付番を所定の抗体について決定することができる。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番システムに従って残基３１～３５（Ｈ－ＣＤＲ１）、残基５０～６５（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び残基９５～１０２（Ｈ－ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番システムに従って残基２４～３４（Ｌ－ＣＤＲ１）、残基５０～５６（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び残基８９～９７（Ｌ－ＣＤＲ３）に位置する。

本明細書中で使用する用語「抗体断片」とは、より詳細には本明細書中に開示する抗体の抗原結合ドメインをいう。抗体断片としては、それだけには限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）_２、及びダイアボディ、ＶＨＨなどが挙げられる。本明細書中で使用する用語「Ｋ_会合」又は「Ｋ_ａ」とは、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度をいうことを意図する一方で、本明細書中で使用する用語「Ｋ_解離」又は「Ｋ_ｄ」とは、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度をいうことを意図する。

本明細書中で使用する用語「Ｋ_Ｄ」とは、Ｋ_ｄ対Ｋ_ａの比（すなわちＫ_ｄ／Ｋ_ａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数をいうことを意図する。抗体のＫ_Ｄ値は、当分野において十分に確立されている方法を使用して決定することができる。タンパク質又は抗体のＫ_Ｄを決定する方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによる、たとえば、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるものである。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による単純な結合相互作用分析は、リガンドをセンサーチップ表面上に固定すること、次いで、目的の分析物を、リガンド表面上を流れる緩衝液に加えることを必要とする。リガンドと分析物との相互作用を、ＳＰＲ装置（典型的にはビアコア（登録商標）システム）によって、経時的な屈折率の変化として測定する。これから、会合（Ｋ_ａ）又は解離（Ｋ_ｄ）及び平衡解離（Ｋ_Ｄ）の定数を導くことができる。親和性、特にＫ_Ｄは、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）（登録商標）システムによっても評価することができる。オクテット（登録商標）プラットフォームはバイオ層干渉法（ＢＬＩ）技術に基づいている。ＢＬＩ技術の原理は、２つの表面、すなわち固定したタンパク質の層及び内部参照層から反射された白色光の光学干渉パターンに基づいている。バイオセンサー先端表面上に固定したリガンドと溶液中の分析物との間の結合が、バイオセンサー先端での光学的厚さの増加を生じ、これが、ナノメートルで測定される干渉パターンのシフトをもたらす。波長シフト（Δλ）は、生物学的層の光学的厚さの変化の直接測度であり、このシフトを一定期間にわたって測定し、その規模を時間の関数としてプロットした場合、古典的な会合／解離曲線が得られる。この相互作用をリアルタイムで測定し、結合特異性、会合速度、及び解離速度、並びに濃度のモニタリングが可能となる。（Ａｂｄｉｃｈｅら、２００８年を参照するが、詳細は結果中にもある）。親和性測定は典型的には２５℃で行う。

本明細書中で使用する用語「結合特異性」とは、たとえば実施例（表１、２、４、５、及び６を参照）において決定されるように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定によって測定される場合、又はバイオ層干渉法（ＢＬＩ）技術によって測定される場合、組換えＢＴＮ３Ａ１ポリペプチドなどの抗原組換えポリペプチドと、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下のＫ_Ｄで検出可能に結合する抗体の能力をいう。一部の実施形態では、ＳＰＲによって測定される場合、抗体は、ＢＴＮ３Ａ１と、１０^－３ｐＭ～１００ｎＭを含む、特に１０ｐＭ～１００ｎＭ、特に１０ｐＭ～１００ｎＭ、又は１０^－３ｐＭ～１０ｎＭ、特に１ｐＭ～１０ｎＭ、特に１０ｐＭ～１０ｎＭ、又は１ｐＭ～５ｎＭ、特に１０ｐＭ～５ｎＭ又は１００ｐＭ～５ｎＭを含むＫ_Ｄで結合する。他の実施形態では、バイオ層干渉法（ＢＬＩ）技術によって測定される場合、抗体は、ＢＴＮ３Ａ１と、１０^－３ｐＭ～１００ｎＭを含む、特に１０ｐＭ～１００ｎＭ、特に１０ｐＭ～１００ｎＭ、又は１０^－３ｐＭ～１０ｎＭ、特に１ｐＭ～１０ｎＭ、特に１０ｐＭ～１０ｎＭ、又は１ｐＭ～５ｎＭ、特に１０ｐＭ～５ｎＭ又は１００ｐＭ～５ｎＭを含むＫ_Ｄで結合する。

「ＢＴＮ３Ａ以外の抗原と交差反応する」抗体とは、ＢＴＮ３Ａ以外の前記抗原と、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は１００ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する抗体をいうことを意図する。「特定の抗原と交差反応しない」抗体とは、前記抗原と、１００ｎＭ以上のＫ_Ｄ、又は１μＭ以上のＫ_Ｄ、又は１０μＭ以上のＫ_Ｄで結合する抗体をいうことを意図し、前記親和性は、たとえば、実施例中に開示するものと同様の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を使用して、又はバイオ層干渉法（ＢＬＩ）技術を使用して測定する。特定の実施形態では、抗原と交差反応しない抗体は、標準の結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して本質的に検出不可能な結合を示す。

本開示による単離されたＢＴＮ３Ａ結合タンパク質とは、ＢＴＮ３Ａに対して結合特異性を有するタンパク質をいう。ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質は、他の種からの関連ＢＴＮ３Ａ分子などの他の抗原に対して交差反応性を有していてもよい。さらに、単離されたＢＴＮ３Ａタンパク質は、他の細胞物質及び／又は化学薬品を実質的に含まなくてもよい。

語句「抗原を認識する抗体」及び「抗原に対して特異性を有する抗体」は、用語「抗原と特異的に結合する抗体」と、本明細書中で互換的に使用される。

特異性は、たとえば、特異的抗原との結合対他の無関連の分子との非特異的結合（この事例では、特異的抗原はＢＴＮ３Ａポリペプチドである）において、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０．０００：１、又はより高い比の親和性／結合力によってさらに示すことができる。本明細書中で使用する用語「親和性」とは、抗体とエピトープとの結合の強度を意味する。親和性は、典型的にはＢＴＮ３Ａ１に対する抗体のＫ_Ｄ値によって評価する。

本開示は、ＢＴＮ３Ａに対する阻害特性が以前に知られている、ＢＴＮ３Ａ結合抗体（ｍＡｂ１０３．２に由来）の特定の断片が活性化特性を示すという予想外の発見に関する。活性化特性を有するそのような断片としては、ｍＡｂ１０３．２のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片が挙げられる。本開示は、同様の活性化特性を示す、そのようなｍＡｂ１０３．２抗体断片のヒト化バージョンをさらに提供する。

本明細書中で使用する「ヒト化抗体」とは、ヒト細胞によって作製されるであろう抗体にさらによく似るように変更された可変及び定常領域を有する、非ヒト細胞によって作製された抗体を含むように広くいう。たとえば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列中に見つかるアミノ酸を取り込むように非ヒト抗体アミノ酸配列を変更することによる。本発明のヒト化抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発によって、又はｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を、たとえばＣＤＲ中に含んでいてもよい。

本明細書中で使用する具体的な実施形態では、用語「ヒト化抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体も含む。他の具体的な実施形態では、本明細書中で使用する用語「ヒト化抗体」は、配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ２、配列番号３のＨ－ＣＤＲ３、配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５又は１７のＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体も含む。

本明細書中で使用する用語「活性化抗体」とは、エフェクター細胞の免疫機能を直接又は間接的に誘導する、たとえば、炎症誘発性、細胞溶解性、及び／又は免疫応答を誘導することができる抗体をいう。特に、本明細書中で使用する活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片は、たとえば以下の実施例に記載のように、少なくとも、癌細胞（ダウディ細胞及び／又はＳＫＯＶ－３細胞など）との共培養物中におけるγδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）の活性化を、ＣＤ１０７脱顆粒アッセイにおいて測定される場合、１０ｎＭ以下、好ましくは１ｎＭ以下、たとえば０．１ｎＭ以下のＥＣ_５０で誘導する能力を有する。したがって、本出願に従って、ＥＣ_５０（最大半量有効濃度）は用量応答曲線において確立され、最大効果（すなわち、活性化されたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の最大割合）の５０％が観察される活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片の濃度を表す。実施例中に示すように、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞毒性の評価は、膜表面のＣＤ１０７受容体をフローサイトメトリーによって評価することによって行う。用量応答曲線は、典型的には、ダウディ又はＳＫＯＶ－３細胞と共に、抗体断片の存在下、３７℃で４時間、共培養した後に、ＣＤ１０７陽性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を定量することによって確立する。一部の実施形態では、ＥＣ_５０は、１０^－４ｎＭ～１０ｎＭ、特に１０^－４ｎＭ～１ｎＭ、特に１０^－４ｎＭ～０．１ｎＭ、又は１０^－３ｎＭ～１０ｎＭ、１０^－３ｎＭ～１ｎＭ又は１０^－３ｎＭ～０．１ｎＭを含む。

本明細書中で使用する用語「対象」としては、任意のヒト又は非ヒト動物が挙げられる。用語「非ヒト動物」としては、すべての脊椎動物、たとえば哺乳動物及び非哺乳動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが挙げられる。

増殖及び／又は活性化に対する本出願に従った抗体断片の効果は、典型的には、ＰＢＭＣを前記抗体断片と共にインキュベーションすることによっても試験することができる。その後、免疫細胞の増殖及び活性化を、典型的にはフローサイトメトリーによって続いて行うことができる。たとえば、数世代の細胞を、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ標識に使用されるセルトレース（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ）バイオレット（ｖｉｏｌｅｔ）色素（商標）の色素希釈を使用して、追跡することができる。抗体断片を６０ｎＭ（±２０％）の濃度、３７℃で、ＰＢＭＣと共に５日間インキュベーションすることで、典型的には、有意なＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞増殖をもたらす（たとえば、全Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞集団の少なくとも２０％、特に少なくとも３０又は３５％の増加をもたらす）ことができる。

γδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）の活性化は、活性化マーカーＣＤ２５を発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の割合を評価することによって行うことができる。典型的には、活性化マーカーＣＤ２５を発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の割合の有意な増加が観察される。

本明細書中で使用する用語「最適化された」とは、産生細胞又は生物、一般には真核細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変更された、ヌクレオチド配列を意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、開始ヌクレオチド配列によって元々コードされているアミノ酸配列を完全に又は可能な限り保持するように操作される。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされているアミノ酸配列も最適化されたといわれる。

本明細書中で使用する２つの配列間のパーセント同一性とは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及びそれぞれのギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、以下に記載するように数学アルゴリズムを使用して達成することができる。

２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（ＮＥＥＤＬＥＭＡＮ及びＷｕｎｓｃｈ）を使用して決定することができる。

２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のパーセント同一性は、たとえば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（対のアラインメント、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋから利用可能）などのアルゴリズムを使用して決定してもよい。たとえば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて、「ギャップオープンペナルティ」が１０、「ギャップ伸長ペナルティ」が０．５、偽「エンドギャップペナルティ」、「エンドキャップオープンペナルティ」が１０、及び「エンドギャップ伸長ペナルティ」が０．５を使用してもよい。一般に、「パーセント同一性」は、一致する位置の数を比較した位置の数で除算し、１００を乗算した関数である。たとえば、アラインメント後に１０個のうちの６個の配列位置が２つの比較した配列間で同一である場合、同一性は６０％である。％同一性は、典型的には、分析を行うクエリ配列に全長にわたって決定する。同じ一次アミノ酸配列又は核酸配列を有する２つの分子は、任意の化学的及び／又は生物学的修飾にかかわらず同一である。

ＢＴＮ３Ａ抗体断片
具体的な一実施形態では、本開示のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ－２、及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５のＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を有する少なくともＢＴＮ３Ａ抗体断片を含む。

別の具体的な実施形態では、本開示のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ－２、及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号１７のＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を有する少なくともＢＴＮ３Ａ抗体断片を含む。

具体的な実施形態では、そのようなＢＴＮ３Ａ抗体断片は、抗体のＦｃ領域を本質的に欠く、たとえば、抗体のＣＨ２及びＣＨ３領域に対応するＦｃ断片を含まない、典型的には、位置２３８～位置２４３のアミノ酸（Ｋａｂａｔ付番を使用）によって区切られる断片を含まない。

本開示のＢＴＮ３Ａ抗体断片ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ付番（Ｋａｂａｔら、１９９２年、本明細書中以降「Ｋａｂａｔら」）を使用して描写する。読みやすさのために、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３はＶＨ領域の３つのＣＤＲをいい、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３はＶＬ領域の３つのＣＤＲをいう。典型的には、前記抗ＢＴＮ３Ａ抗体断片は、国際公開第２０１２／０８０３５１号に開示されているｍＡｂ１０３．２のＶＨ及びＶＬを有する抗体断片、又は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ－２、配列番号３のＨ－ＣＤＲ３、配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５若しくは配列番号１７のＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を有するキメラ若しくはヒト化抗体断片である。

マウスｍＡｂ１０３．２は、ＣＮＣＭ受託番号Ｉ－４４０３の下でアクセス可能なハイブリドーマから得ることができる。

好ましい実施形態では、前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片は、
（ｉ）配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ－２、及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、たとえば配列番号７のＶＨと、
（ｉｉ）配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５のＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、たとえば配列番号８のＶＬと
を含むｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又は（Ｆａｂ’）_２断片である。

好ましい実施形態では、前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片は、
（ｉ）配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ－２、及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、たとえば配列番号１８のＶＨと、
（ｉｉ）配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号１７のＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、たとえば配列番号１９のＶＬと
を含むｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又は（Ｆａｂ’）_２断片である。

したがって、本開示は、活性化特性を有する、すなわち以下の有利な特性を有する、そのようなＢＴＮ３Ａ抗体断片自体に関する：
（ｉ）バイオ層干渉法（ＢＬＩ）技術によって若しくは表面プラズモン共鳴によって測定される場合、１０ｎＭ以下のＫ_Ｄ、好ましくは５ｎＭ以下のＫ_ＤでヒトＢＴＮ３Ａ１と結合すること、
（ｉｉ）癌細胞（ダウディ及び／若しくはＳＫＯＶ－３細胞など）との共培養物中におけるγδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）の活性化を、ＣＤ１０７脱顆粒アッセイにおいて測定される場合、１０ｎＭ以下、好ましくは１ｎＭ以下のＥＣ_５０で誘導すること、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＰＢＭＣ内のγδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）の活性化及び増殖を誘導すること。

そのような活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片の例としては、それだけには限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ユニボディ、及びｓｃＦｖ断片、ダイアボディ、単一ドメイン、ＶＨＨ、又はナノボディ、並びに、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２断片の有利な活性化特性を維持する他の機能的断片が挙げられる。

具体的な実施形態では、活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片はＦａｂ又はＦａｂ’などの一価抗体断片である。

他の具体的な実施形態では、活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片は（Ｆａｂ’）_２などの二価抗体断片である。

他の具体的な実施形態では、活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片はｓｃＦｖ抗体断片である。

用語「ダイアボディ」とは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片をいう。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を許容するには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合して２つの抗原結合部位を作らされる。

単一ドメイン抗体又はＶＨＨとは、可溶性となるようにＶＨ抗体断片と比較して突然変異させた重鎖可変ドメインの全体又は一部分を含む抗体断片である。

抗体断片は、それだけには限定されないが、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化、及び本明細書中に記載の組換え宿主細胞による産生を含めた、様々な技法によって作製することができる。

好ましくは、本開示のＢＴＮ３Ａ抗体断片はキメラ又はヒト化抗体断片である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低下させる一方で、非ヒト親抗体と少なくとも同じ若しくは同様の親和性（又はより優れた親和性）を有するように、ヒト化する。一部の実施形態では、本開示の抗体は、国際公開第２０１２／０８０３５１号中に開示されているように、親抗体ｍＡｂ１０３．２のヒト化抗体断片である。

一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部分）が、免疫原性を低下させるために１つのＣＤＲ中、特に、マウスＬ－ＣＤＲ２のイソロイシンがアラニンによって置き換えられている配列番号１７のＬ－ＣＤＲ２などのＬ－ＣＤＲ２中の１つのアミノ酸置換を任意選択で有する、非ヒト抗体、たとえばマウスｍＡｂ１０３．２に由来し、ＦＲ（又はその一部分）が、免疫原性を低下させるために突然変異を有するマウス抗体配列に由来する、１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部分も任意選択で含む。

特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬ配列を有する本開示による活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片を使用して、それぞれＶＨ及び／若しくはＶＬ配列、又はＶＨ及び／若しくはＶＬ配列に付着している定常領域を修飾することによって、新しい活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片を作製することができる。したがって、本発明の少なくとも一部の実施形態による別の態様では、活性化抗ＢＴＮ３Ａ抗体断片の構造的特徴を使用して、少なくとも活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片の活性化特性を保持する、構造的に関連性のある活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片を作製する。たとえば、ｍＡｂ１０３．２の６つのＣＤＲ領域、又は配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ－２、及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３、配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５又は配列番号１７のＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を有するその突然変異させたバージョンを、既知のフレームワーク領域と組換えによって組み合わせて、上述のように本発明の少なくとも一部の実施形態による追加の組換え操作した活性化抗ＢＴＮ３Ａ抗体断片を作製することができる。操作方法の出発物質は、配列番号７及び配列番号８を有する、ｍＡｂ１０３．２のＶＨ及び／若しくはＶＬ配列のうちの１つ若しくは複数、又は配列番号１８及び配列番号１９を有するそのヒト化バージョンである。

変更した抗体の機能的特性は、当分野において利用可能な及び／又は本明細書中に記載の標準のアッセイを使用して評価することができる。本発明の少なくとも一部の実施形態による、抗体を操作する方法の特定の実施形態では、突然変異を、活性化抗ＢＴＮ３Ａ抗体断片コード配列の全体又は一部に沿ってランダムに又は選択的に導入することができ、生じた改変された活性化抗ＢＴＮ３Ａ抗体断片を、結合活性及び／又は活性化特性などの他の所望の機能的特性についてスクリーニングすることができる。

突然変異の方法は当分野において記載されている。たとえば、ＳｈｏｒｔのＰＣＴ公報国際公開第０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリ、又はその組合せを使用して抗体突然変異体を作製及びスクリーニングする方法を記載している。或いは、ＬａｚａｒらのＰＣＴ公開国際公開第０３／０７４６７９号は、抗体の生理化学的特性を最適化するためにコンピュータスクリーニング方法を使用する方法を記載している。

好ましくは、前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片は、
（ｉ）配列番号１８の重鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号１９の軽鎖可変領域と
を含むヒト化ＢＴＮ３Ａ抗体断片である。

より詳細には、本開示は、
（ｉ）配列番号１８の重鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号１９の軽鎖可変領域と
を含むｓｃＦｖ断片であるヒト化ＢＴＮ３Ａ結合抗体断片に関する。

上記開示したＢＴＮ３Ａ抗体断片は、癌及び感染性障害の処置における使用のための医薬品を調製する方法において特に有用である。

そのような医薬品としては、特に、ＢＴＮ３Ａに対する結合及び活性化ドメインとして上記開示した活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片を含む、組換えＢＴＮ３Ａ結合タンパク質又は二重特異性分子が挙げられる。

そのようなＢＴＮ３Ａ結合タンパク質のさらなる詳細を本明細書中以降に記載する。

ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質
本開示のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ－２、及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５又は配列番号１７のＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
を有する少なくともＢＴＮ３Ａ結合抗体断片を含む。

前記ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質は、有利には、以下の特性を有する：
（ｉ）表面プラズモン共鳴によって若しくはバイオ層干渉法（ＢＬＩ）技術によって測定される場合、１０ｎＭ以下のＫ_Ｄ、好ましくは５ｎＭ以下のＫ_ＤでヒトＢＴＮ３Ａ１と結合すること、並びに／又は、
（ｉｉ）癌細胞（ダウディ若しくはＳＫＯＶ－３細胞など）との共培養物中におけるγδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）の活性化を、ＣＤ１０７脱顆粒アッセイにおいて測定される場合、１０ｎＭ以下、好ましくは１ｎＭ以下、たとえば０．１ｎＭ以下のＥＣ_５０で誘導すること、並びに／又は
（ｉｉｉ）ＰＢＭＣ内のγδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）の活性化及び増殖を誘導すること。

具体的な実施形態では、ＢＴＮ３Ａとの結合特異性及びＢＴＮ３Ａに関する活性化特性は、そのようなＢＴＮ３Ａ結合タンパク質中に含まれる前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片によって本質的にもたらされる。

特に、具体的な実施形態では、前記ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質は以下の式（Ｉ）の融合タンパク質である：
Ａｂ１０３．２－Ｌ－Ｘ （Ｉ）
［式中、
Ａｂ１０３．２は、以前のセクション中に開示した活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、たとえば、ｓｃＦｖ又はＦａｂ断片であり、
Ｌは、共有結合又はリンカー、典型的にはペプチドリンカーであり、
Ｘはポリペプチド鎖である］。

－Ｘ又は－Ｌ－Ｘは、少なくともＡｂ１０３．２のポリペプチド鎖のＮ末端又はＣ末端と融合していてもよい。

－Ｘ又は－Ｌ－Ｘは、ジスルフィド橋又は他の共有結合によって他のポリペプチドとも結合していてもよい。

具体的な実施形態では、Ｘは、Ｆｃ断片若しくは他の免疫グロブリン由来断片、又は血清アルブミンなどの、血中におけるタンパク質の半減期又は安定性を増加させるために使用されるポリペプチドの中から選択されてもよい。

本明細書中で使用する用語「融合タンパク質」とは、遺伝子融合によって、たとえば、明白に異なるタンパク質の別々の機能的ドメインをコードしている少なくとも２つの遺伝子断片の遺伝子融合によって得ることができる組換えタンパク質をいう。たとえば、本開示の活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片の少なくとも重鎖可変領域（ＶＨ）のコード領域は、ポリペプチドＸのコード領域と遺伝子融合しており、前記活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片の対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）は、別のコード領域によって別個に提供されて、ポリペプチドＸと融合したＦａｂを含む融合タンパク質が得られる。

或いは、本開示の活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片のｓｃＦｖのコード領域は、ポリペプチドＸのコード領域と遺伝子融合している。

本開示によれば、－Ｘ又はＬ－Ｘは、Ａｂ１０３．２抗体断片と連結した抗体のＦｃ領域ではない。特に、本開示中において、天然のＦｃ領域がＮ末端で対応するＦａｂと連結している完全長ｍＡｂ１０３．２抗体が、ＢＴＮ３Ａ活性化特性を示す対応するＦａｂ領域に反して、ＢＴＮ３Ａに関して阻害性特性を有することが示されている。

具体的な実施形態では、前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片は、天然の完全長抗体構造と同様に、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端と共有結合していない。

典型的には、Ａｂ１０３．２が、ｓｃＦｖ断片、たとえば、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ又は配列番号１８のＶＨ及び配列番号１９のＶＬを含むｓｃＦｖ断片である場合、Ｘは、ｓｃＦｖ断片のＮ末端と融合した別のポリペプチド鎖であってもよい。

二重特異性又は多特異性分子
別の態様では、以前のセクション中に開示したＢＴＮ３Ａ結合タンパク質及び／又は活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片を含む二重特異性又は多特異性分子を、本明細書中にさらに開示する。

ＢＴＮ３Ａ結合抗体断片を誘導体化して、又は別の機能的分子、たとえば、別のペプチド若しくはタンパク質（たとえば別の抗体若しくは受容体リガンド）と連結させて、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子と結合する二重特異性分子を作製することができる。実際、抗体断片を誘導体化又は複数の他の機能的分子と連結させて、２つより多くの異なる結合部位及び／又は標的分子と結合する多特異性分子を作製してもよい。そのような多特異性分子も、本明細書中で使用する用語「二重特異性分子」によって包含されることを意図する。

二重特異性分子を作製するために、上記開示したＢＴＮ３Ａ結合抗体断片又はＢＴＮ３Ａ結合融合タンパク質を、二重特異性分子が生じるように別の抗体、抗体断片、ペプチド又は結合模倣体などの１つ又は複数の他の結合分子と機能的に連結させる（たとえば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有的会合、又は他のものによる）ことができる。

したがって、本開示は、ＢＴＮ３Ａに対する少なくとも１つの第１の結合特異性及び第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。

二重特異性分子の様式の例としては、ＢｉＴＥ、二重親和性再標的化抗体、ホモ二量体「ノブインホール」抗体、及び三重機能的抗体が挙げられる。第１の結合特異性の少なくとも１つの抗体断片を含む一般的な二重特異性抗体の様式の様々な構造の総説には、たとえばＳｅｄｙｋｈら、２０１８年（Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９５～２０８、特に図３を参照）の総説を参照されたい。

さらに、二重特異性分子が多特異性である実施形態では、分子は、第１及び第２の標的エピトープに加えてさらなる結合特異性をさらに含むことができる。

一実施形態では、本明細書中に開示した二重特異性分子は、ＢＴＮ３Ａ標的エピトープに対する第１の結合特異性について、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ユニボディ、又は単鎖Ｆｖを含めた少なくとも本明細書中に開示したＢＴＮ３Ａ結合抗体断片を含む。また、抗体は、軽鎖若しくは重鎖二量体、又は、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号に記載のＦｖ若しくは単鎖若しくはＶＨＨ構築体などのその任意の最小限の断片であってもよい。

本明細書中に開示した二重特異性分子中に用いることができる他の抗体は、マウス、キメラ、ヒト化、又は組換えヒトモノクローナル抗体である。

本開示の二重特異性分子は、当分野で知られている方法を使用して、構成する結合特異性をコンジュゲートさせることによって調製することができる。たとえば、二重特異性分子のそれぞれの結合特異性を別々に作製し、その後、互いにコンジュゲートさせることができる。結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合、様々なカップリング又は架橋結合剤を共有的コンジュゲーションのために使用することができる。架橋結合剤の例としては、タンパク質Ａ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロハキサン（ｃｙｃｌｏｈａｘａｎｅ）－ｌ－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら、１９８４年、Ｌｉｕら、１９８５年）が挙げられる。他の方法としては、Ｂｒｅｎｎａｎら、１９８５年、Ｇｌｅｎｎｉｅら、１９８７年、Ｐａｕｌｕｓ、１９８５年中に記載されているものが挙げられる。

或いは、両方の結合特異性を同じベクター中にコードさせ、同じ宿主細胞中で発現及びアセンブルさせることができる。

他の実施形態では、二重特異性分子は、Ｘが別の結合特異性に対する別の抗体断片を含む、式Ｉの融合タンパク質である。

本開示の二重特異性分子は、１つの単鎖抗体及び１つの結合決定要因を含む単鎖分子、又は２つの結合決定要因を含む単鎖二重特異性分子であることができる。

二重特異性分子の、その特異的標的との結合は、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（たとえば成長阻害及びアポトーシス）、オクテット（商標）システム、若しくはウエスタンブロットアッセイ、又はＳＰＲ測定によって確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは、一般に、目的の複合体に特異的な標識試薬（たとえば抗体）を用いることによって、特定の目的のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。

当然、二重特異性（又は多特異性）分子は元のＢＴＮ３Ａ抗体断片の活性化特性を維持するように設計される。

本開示のＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子をコードしている核酸分子
本開示のＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子をコードしている核酸分子も本明細書中に開示する。

核酸分子の例は、遺伝暗号を使用し、任意選択で宿主細胞種に応じてコドンバイアスを考慮して、以前のセクション中に開示したＢＴＮ３Ａ抗体断片の可変軽鎖及び重鎖アミノ酸配列をコードしているものである。

典型的には、配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬをコードしている核酸分子並びに配列番号１８のＶＨ及び配列番号１９のＶＬをコードしている核酸分子が、本開示の一部である。具体的な実施形態では、核酸分子はキメラ及びヒト化Ｆａｂ又はＢＴＮ３Ａ結合抗体断片をコードしており、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、配列番号１１のＨＣＤＲ３をそれぞれ有するＶＨコード配列、並びに配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３又は２０のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３をそれぞれ有するＶＬコード配列を含む。

具体的な実施形態では、核酸分子は、キメラＦａｂ又はｓｃＦｖ ＢＴＮ３Ａ抗体断片をコードしており、配列番号１５のＶＨコード配列及び配列番号１６のＶＬコード配列を含む。

具体的な実施形態では、核酸分子は、ヒト化Ｆａｂ又はｓｃＦｖ ＢＴＮ３Ａ抗体断片をコードしており、配列番号２１のＶＨコード配列及び配列番号２２のＶＬコード配列を含む。

本開示は、後者の配列に由来し、哺乳動物細胞、たとえばＣＨＯ又はＨＥＫ細胞株中におけるタンパク質発現のために最適化されている核酸分子にも関する。

核酸は全細胞中、細胞溶解液中に存在してもよいか、又は、核酸は部分精製した若しくは実質的に純粋な形態であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当分野で周知の他の技法（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８年）を含めた標準の技法によって、他の細胞成分又は他の汚染物質、たとえば他の細胞性の核酸又はタンパク質から精製した場合に、「単離されている」又は「実質的に純粋となる」。本開示の核酸は、たとえばＤＮＡ又はＲＮＡであることができ、イントロン配列を含有していても含有していなくてもよい。一実施形態では、核酸は、ファージディスプレイベクターなどのベクター中、又は組換えプラスミドベクター中に存在していてもよい。

本開示の核酸は、標準の分子生物学的技法を使用して得ることができる。たとえばＶＨ及びＶＬセグメントをコードしているＤＮＡ断片が得られた後、これらのＤＮＡ断片を、たとえば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、又はｓｃＦｖ遺伝子へと変換するための、標準の組換えＤＮＡ技法によってさらに操作することができる。

これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードしているＤＮＡ断片（たとえば、それぞれ配列番号１５及び１６のＶＨ及びＶＬ、又はそれぞれ配列番号２１及び２２のＶＨ及びＶＬ）は、別のＤＮＡ分子、又は抗体定常領域若しくは柔軟なリンカーなどの別のタンパク質をコードしている断片と作動可能に連結している。本コンテキストにおいて使用する用語「作動可能に連結している」とは、２つのＤＮＡ断片が機能的な様式で、たとえば、２つのＤＮＡ断片によってコードされているアミノ酸配列がインフレームに保たれるように、又はタンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように結合されていることを意味することを意図する。

ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬをコードしているＤＮＡ断片は、ＶＨ及びＶＬ配列が連続的な単鎖タンパク質として発現されることができ、ＶＬ及びＶＨ領域が柔軟なリンカーによって結合されるように、柔軟なリンカーをコードしている、たとえば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）_３又は（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）_４をコードしている別の断片と作動可能に連結している（Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年）。

ＢＴＮ３Ａ結合抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子を産生するトランスフェクトーマの作製
本開示のＢＴＮ３Ａ結合抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子は、たとえば、当分野で周知のように組換えＤＮＡ技法及び遺伝子形質移入方法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生させることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５年）。

たとえば、結合タンパク質を発現させるために、前記結合タンパク質をコードしているＤＮＡを、標準の分子生物学又は生化学的技法（たとえば、ＤＮＡ化学合成、ＰＣＲ増幅、又は目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用したｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、ＤＮＡを、遺伝子が転写及び翻訳制御配列と作動可能に連結しているように発現ベクター内に挿入することができる。本コンテキストにおいて、用語「作動可能に連結している」とは、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するというその意図される機能を果たすように、遺伝子がベクター内にライゲーションされていることを意味することを意図する。発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合性があるように選択される。結合タンパク質が明白に異なるポリペプチドを含む、たとえば、１つの配列がＦａｂのＶＬ遺伝子をＢＴＮ３Ａ結合抗体断片としてコードしており、別の配列がＦａｂのＶＨ遺伝子をＢＴＮ３Ａ結合抗体断片としてコードしている場合、ＶＨ及びＶＬをコードしている遺伝子を別々のベクター内に挿入することができるか、又は、より典型的には、両方の遺伝子が同じ発現ベクター内に挿入される。遺伝子は、標準の方法（たとえば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクター内に挿入する。本明細書中に記載の活性化ＢＴＮ３Ａ結合抗体断片のＶＨ、ＶＬ、又はｓｃＦｖ配列を使用して、上記開示した式（Ｉ）の融合タンパク質を作製することができ、これは、ＶＨ、ＶＬ、又はｓｃＦｖセグメントが、ベクター内でＸ又はＬ－Ｘポリペプチドのコード配列と作動可能に連結しているように、そのようなＶＨ、ＶＬ、又はｓｃＦｖ配列を、対応するＸ又はＬ－Ｘポリペプチドを既にコードしている発現ベクター内に挿入することによって行う。それに加えて又はその代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からのそれぞれの結合タンパク質の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードすることができる。

シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であることができる。

さらに、本明細書中に開示した組換え発現ベクターは、宿主細胞中における結合タンパク質の発現を制御する調節配列を保有する。用語「調節配列」とは、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（たとえばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。そのような調節配列は、たとえばＧｏｅｄｄｅｌの刊行物中に記載されている（Ｇｏｅｄｄｅｌ、１９９０年）。当業者には、調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計が、形質転換させる宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの要因に依存することがあることが理解されよう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列としては、哺乳動物細胞中において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、たとえば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（たとえばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーが挙げられる。或いは、ユビキチンプロモーター又はＰ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用してもよい。さらに、異なる供給源からの配列から構成される調節要素、たとえば、ＳＶ４０初期プロモーターからの配列及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の末端反復配列を含有するＳＲａプロモーターシステム（Ｔａｋｅｂｅら、１９８８年）。

さらに、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞中におけるベクターの複製を調節する配列（たとえば複製起点）及び選択マーカー遺伝子などの付加配列を保有していてもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（たとえば、すべてＡｘｅｌらの米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、及び第５，１７９，０１７号を参照）。たとえば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ－宿主細胞中においてメトトレキサート選択／増幅を用いて使用する用）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。

結合タンパク質の発現のために、発現ベクターを標準の技法によって宿主細胞内に形質移入する。用語「形質移入」の様々な形態は、外因性ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞内に導入するために一般的に使用されている幅広い技法、たとえば、電気穿孔、カルシウム－リン酸沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン形質移入などを包含することを意図する。本開示の結合タンパク質を原核又は真核のどちらの宿主細胞においても発現させることが、理論的に可能である。真核細胞、たとえば、哺乳動物宿主細胞、酵母、又は糸状菌中における組換えタンパク質の発現が記述されており、これは、そのような真核細胞、特に哺乳動物細胞は、適切に折り畳まれて免疫学的に活性のある抗体をアセンブル及び分泌する可能性が原核細胞よりも高いためである。

具体的な一実施形態では、本開示によるクローニング又は発現ベクターは、適切なプロモーター配列と作動可能に連結している、それぞれ少なくとも配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬをコードしている核酸又はそれぞれ少なくとも配列番号１８のＶＨ及び配列番号１９のＶＬをコードしている核酸を含む。

本開示の組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞としては、ＤＨＦＲ選択マーカー（Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ、１９８２年に記載）と共に使用するｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含めたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、１９８０年に記載）、ＣＨＯＫ１ ｄｈｆｒ＋細胞株、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞、たとえば、ＧＳ Ｘｃｅｅｄ（商標）遺伝子発現系（Ｌｏｎｚａ）と共に使用するＧＳ ＣＨＯ細胞株、又はＨＥＫ細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードしている組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入した際、抗体は、抗体を宿主細胞中で発現させるために十分な期間、宿主細胞を培養し、任意選択で、宿主細胞を成長させている培養培地内に抗体を分泌させることによって、産生される。抗体は、たとえば培養培地から、その分泌後に、標準のタンパク質精製方法を使用して、回収及び精製することができる（Ｓｈｕｋｌａら、２００７年）。

具体的な一実施形態では、本開示の宿主細胞は、ｓｃＦｖ断片、たとえば、適切なプロモーター配列と作動可能に連結している、少なくとも配列番号７のＶＨ及び配列番号８のＶＬ、又は、配列番号１８のＶＨ及び配列番号１９のＶＬを含むｓｃＦｖ断片のコード配列を有する発現ベクターを用いて形質移入した宿主細胞である。典型的には、そのような発現ベクターは、配列番号１５のＶＨコード配列及び配列番号１６のＶＬコード配列、又は、配列番号２１のＶＨコード配列及び配列番号２２のＶＬコード配列を含むｓｃＦｖをコードしている。

その後、後者の宿主細胞を適切な条件下でさらに培養して、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質を発現及び産生させてもよい。

或いは、無細胞発現系を使用してそのようなＢＴＮ３Ａ結合タンパク質を産生させてもよい。典型的には、タンパク質又は抗体の無細胞発現の方法は既に記載されている（Ｓｔｅｃｈら、２０１７年）。

医薬組成物
別の態様では、本開示は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された、上記開示した活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片及び／又はＢＴＮ３Ａ結合タンパク質又は二重特異性分子を含有する組成物、たとえば医薬組成物を提供する。そのような組成物は、上述の抗体断片、又は結合タンパク質、又は二重特異性分子のうちの１つ又は（たとえば２つ以上の異なるものの）組合せを含んでいてもよい。

本明細書中に開示した医薬組成物は、組合せ療法において、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。たとえば、組合せ療法は、少なくとも１つの抗ウイルス剤、抗炎症剤、又は別の抗増殖剤と組み合わせた、本開示の活性化ＢＴＮ３Ａ結合抗体断片及び／又はＢＴＮ３Ａ結合タンパク質又は二重特異性分子を含むことができる。組合せ療法において使用することができる治療剤の例は、次のセクションにおいて以下により詳細に記載されている。

本明細書中で使用する「薬学的に許容される担体」としては、生理的に適合性のある、任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（たとえば、注射又は輸液によるもの）に適切であるべきである。一実施形態では、担体は、皮下経路に適切であるべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子は、化合物を失活させることがある酸及び他の天然の条件の作用から化合物を保護するための材料でコーティングされていてもよい。

無菌的リン酸緩衝生理食塩水は薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は当分野の者に周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ及びＧｅｎｎａｒｏ、１９９５年）。製剤は、１つ又は複数の賦形剤、保存料、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質損失を防ぐためのアルブミンなどをさらに含んでいてもよい。

医薬組成物の形態、投与経路、用量、及びレジメンは、当然、処置する状態、病気の重篤度、患者の年齢、重量、及び性別などに依存する。

本開示の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、又は眼内投与などのために製剤化することができる。

好ましくは、医薬組成物は、注射することができる製剤にとって薬学的に許容される、ビヒクルを含有する。これらは特に、等張で無菌的な生理食塩水（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム、若しくはマグネシウムなど、又はそのような塩の混合物）、或いは、事例に応じて滅菌した水又は生理食塩水を加えた際に注射用液剤の構成を可能にする、乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であってもよい。

投与に使用する用量は、様々なパラメータの関数として、及び特に、使用する投与様式、関連する病理学、又は所望の処置期間の関数として適応させることができる。

医薬組成物を調製するために、有効量の抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子を、薬学的に許容される担体又は水性媒体中に溶かす又は分散させてもよい。

注射用の使用に適切な医薬形態としては、無菌的な水溶液又は分散体、ゴマ油、ピーナッツ油、又はプロピレングリコール水溶液を含む製剤、及び無菌的な注射用の液剤又は分散体の即時調製のための無菌的な粉末又は凍結乾燥物が挙げられる。すべての事例において、形態は無菌的でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度まで流体でなければならない。形態は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。

遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、水中で、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合して調製することができる。また、分散体を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物並びに油中で調製することができる。貯蔵及び使用の通常の条件下では、これらの調製物は微生物の成長を防止するために保存料を含有する。

製剤中において使用してもよい薬学的許容できる塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成されたもの）、及び、たとえば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成された塩が挙げられる。また、遊離カルボキシル基を用いて形成された塩は、たとえば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来することができる。

担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、並びに植物油を含有する溶媒又は分散媒であることもできる。適切な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合は必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロ－ブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合は、等張化剤、たとえば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらすことができる。

無菌的注射用液剤は、所要量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要に応じて上に列挙した他の構成成分のうちの様々なものと共に取り込ませ、次いで滅菌濾過することによって、調製する。一般に、分散体は、様々な滅菌した活性成分を、基本分散媒及び上に列挙したものから必要な他の構成成分を含有する無菌的ビヒクル内に取り込ませることによって、調製する。無菌的注射用液剤を調製するための無菌的粉末の場合は、好ましい調製方法は、活性成分の粉末と事前に無菌濾過したその溶液からの任意の追加の所望の構成成分とを与える、真空乾燥及び凍結乾燥技法である。

直接注射のための、より濃縮された又はより高濃度の溶液の調製も企図され、これには、非常に迅速な貫通をもたらし高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍領域に送達する、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が想定される。

製剤化した後、液剤は、剤形に適合性がある様式で、治療上有効な量で投与する。製剤は、上述の注射用液剤の種類などの様々な剤形で容易に投与するが、薬物放出カプセルなども用いることができる。

水溶液中での非経口投与には、たとえば、液剤は、必要な場合は適切に緩衝されているべきであり、液体希釈剤は、まず十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされているべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、用いることができる無菌的水性媒体は、本開示に鑑みて当業者に知られることとなるであろう。たとえば、１回用量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶かし、１０００ｍｌの皮下注入療法液に加えるか、又は提案された輸液部位に注入することができる（たとえば「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１５版、頁１０３５～１０３８及び１５７０～１５８０を参照）。用量のある程度の変動が、処置する対象の条件に応じて必ず起こるであろう。いずれにしても、投与の責任者が個々の対象に適切な用量を決定するであろう。

本開示の活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、組換えＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子は、約０．０００１～１．０ミリグラム、又は約０．００１～０．１ミリグラム、又は約０．１～１．０若しくはさらには１．０～約１０ミリグラム／用量が含まれるように、治療用混合物内に配合してもよい。複数の用量を投与することもできる。

本開示のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質の使用及び方法
本開示の活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、及び二重特異性分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの診断的及び治療的な有用性を有する。

特に、本開示の活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子は、ダウディ細胞及び／又はＳＫＯＶ－３などの癌細胞の存在下におけるＣＤ１０７脱顆粒アッセイにおいて示されるように、細胞溶解機能、サイトカイン産生、及び／又はγδ Ｔ細胞（たとえばＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）の増殖を活性化させることができる。より詳細には、本開示の活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子は、典型的には癌細胞（ダウディ細胞及び／若しくはＳＫＯＶ－３など）の存在下における細胞毒性の改善によって評価される（たとえばＣＤ１０７脱顆粒アッセイによって測定）、Ｖγ９Ｖδ２の活性化を誘導することができる、並びに／又は、ＰＢＭＣ内の増殖アッセイ（セルトレースバイオレット（商標）希釈アッセイを参照）及び本明細書中に例示する活性化アッセイ（ＣＤ２５活性化マーカーを追跡することによる）において示されるように、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進することができる。

したがって、これらの活性化断片は、癌患者において、及び慢性感染症中に観察される免疫抑制機構に打ち勝つために使用してもよい、又は、患者のγδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）を、患者に再投与するためにｅｘ ｖｉｖｏで活性化させるために使用してもよい。

特に、本開示の活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、及び二重特異性分子は、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏでγδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）の増殖及び／又は活性化を誘導する方法において有用な場合がある。たとえば、前記方法は、有効量の、以前のセクション中に開示した前記活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子を、前記γδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）と、任意選択でＢＴＮ３Ａ発現腫瘍細胞などの他のＢＴＮ３Ａ発現細胞の存在下で接触させるステップを含む。

より詳細には、これらの分子は、培養中の細胞に、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏで、又は対象に、たとえばｉｎ ｖｉｖｏで、癌又は感染障害を含めた様々な障害を処置、防止、又は診断するために投与することができる。

本明細書中で使用する用語「癌」、「過剰増殖性」、及び「新生物性」とは、自律的成長、すなわち、迅速に増殖する細胞成長によって特徴づけられた異常な状態又は状況の能力を有する細胞をいう。過剰増殖及び新生物疾患の状態は、病理的、すなわち病状を特徴づける若しくは構成するとして分類されてもよく、又は、非病理的、すなわち正常からは逸脱しているが病状とは関連していないとして分類されてもよい。この用語は、病理組織学的な型又は侵襲の段階にかかわらず、すべての種類の癌性成長若しくは発癌性プロセス、転移性組織、又は悪性形質転換した細胞、組織、若しくは臓器を含むことを意味する。

用語「癌」又は「新生物」としては、様々な臓器系の悪性腫瘍、たとえば、肺、乳房、甲状腺、リンパ系、胃腸管系、及び尿生殖路に罹患するもの、並びにほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、及び／又は精巣腫瘍、非小細胞肺癌、小腸癌、並びに食道癌などの悪性腫瘍を含む腺癌が挙げられる。

好ましい癌は、活性化γδ Ｔ細胞による処置に感受性のあるものである。

癌の例としては、それだけには限定されないが、Ｂ細胞リンパ系新生物、Ｔ細胞リンパ系新生物、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ－ＮＨＬ、Ｔ－ＮＨＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ＮＫ－細胞リンパ系新生物、及び骨髄細胞株新生物などの血液癌が挙げられる。

非血液癌の例としては、それだけには限定されないが、結腸癌、乳癌、肺癌、脳癌、前立腺癌、頭頸部癌、膵癌、膀胱癌、結腸直腸癌、骨癌、子宮頸癌、肝臓癌、口腔癌、食道癌、甲状腺癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、及び皮膚癌が挙げられる。

感染障害の例としては、それだけには限定されないが、慢性肝炎、肺感染症、下気道感染症、気管支炎、インフルエンザ、肺炎、及び性行為感染症などの、ウイルス、細菌、寄生生物、又は真菌の感染症が挙げられる。

ウイルス感染症の例としては、それだけには限定されないが、肝炎（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、単純ヘルペス（ＨＳＶ）、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ（Ｆｌｕ）、ＡＩＤＳ及びＡＩＤＳ関連の合併症、水疱瘡（水痘）、感冒、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症、天然痘（痘瘡）、コロラドダニ熱、デング発熱、エボラ出血熱、口蹄疫、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、感染性単核球症、流行性耳下腺炎、ノロウイルス、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症（ｌｅｕｋｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）（ＰＭＬ）、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、ウエストナイル病、及び黄熱が挙げられる。細菌感染症の例としては、それだけには限定されないが、肺炎、細菌性髄膜炎、コレラ、ジフテリア、結核、炭疽、ボツリヌス中毒、ブルセラ症、カンピロバクター症、チフス、淋病、リステリア症、ライム病、リウマチ熱、百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｗｈｏｏｐｉｎｇ Ｃｏｕｇｈ）、疫病、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、野兎病、腸チフス、及び尿道感染症が挙げられる。例としては、コクシエラ・バーネッティイ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、トロフェリマ・ウィッペリ（Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｌｅｉ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、及びマイコバクテリウム・カネッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｅｔｔｉｉ）によって引き起こされる細菌感染症も挙げられる。

寄生生物感染症の例としては、それだけには限定されないが、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、シャガス病、クリプトスポリジウム症、肝蛭症、糸状虫症、アメーバ感染症、ジアルジア症、蟯虫感染症、住血吸虫症、条虫症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、及びトリパノソーマ症が挙げられる。真菌感染症の例としては、それだけには限定されないが、カンジダ症、アスペルギルス症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラズマ症、及び足白癬が挙げられる。

したがって、本開示は、処置を必要としている対象において上記開示した障害のうちの１つを処置する方法であって、治療上有効な量の上記開示した活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子を含む、典型的には、配列番号１８のＶＨ及び配列番号１９のＶＬを有するｓｃＦｖ又はＦａｂを含む方法に関する。

上記開示した使用のための、活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子は、唯一の活性成分として、或いは、他の薬物、たとえば、インターロイキン、抗ウイルス、抗炎症剤、又は細胞毒性、抗増殖性、化学療法、若しくは抗腫瘍剤と併せて、たとえば、そのアジュバントとして又はそれと組み合わせて、たとえば上述の疾患の処置又は防止のために、投与してもよい。

たとえば、上記開示した使用のための、活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子は、化学療法、抗新生物剤、又は免疫治療剤と組み合わせて使用してもよい。

適切な抗新生物剤としては、それだけには限定されないが、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔａｍｉｎｅ）、クロラムブシル、メルファラン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、テモゾマイドなど）、アントラサイクリン（ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシンなど）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセルなど）、エポチロン、トポイソメラーゼＩの阻害剤（イリノテカン又はトポテカンなど）、トポイソメラーゼＩＩの阻害剤（エトポシド、テニポシド、又はタフルポシドなど）、ヌクレオチド類似体及び前駆体類似体（アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、又はチオグアニンなど）、ペプチド抗生物質（カルボプラチン、シスプラチン、及びオキサリプラチンなど）、レチノイド（トレチノイン、アリトレチノイン、ベキサロテンなど）、ビンカアルカロイド及び誘導体（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンなど）、キナーゼ阻害剤（イブルチニブ、イデラリシブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブなど）等の標的化療法、プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ、カルフィルゾミブなど）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ボリノスタット又はロミデプシンなど）を挙げてもよい。

インターロイキンの例としては、それだけには限定されないがＩＬ－２又はＩＬ－１５が挙げられる。

用語「ＩＬ－２」はその一般的な意味を有しており、ヒトインターロイキン－２をいう。

用語「ＩＬ－１５」はその一般的な意味を有しており、ヒトインターロイキン－１５をいう。

免疫治療剤の例としては、それだけには限定されないが、ホスホ抗原（たとえばゾレドロン酸又は他のビスホスホネート）、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、及び抗ＣＴＬＡ－４抗体が挙げられる。

用語「ＰＤ－１」は、当分野における一般的な意味を有しており、プログラム細胞死－１受容体をいう。用語「ＰＤ－１」は、ＣＤ２８、細胞毒性Ｔ－リンパ球関連タンパク質抗原４（ＣＴＬＡ－４）、誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）、並びにＢ－及びＴ－リンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）を含むＣＤ２８－Ｂ７シグナル伝達受容体ファミリーに属するＩ型膜貫通タンパク質もいう（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２００５年、Ｒｉｌｅｙ及びＪｕｎｅ、２００５年）。

用語「ＢＴＬＡ」は、当分野における一般的な意味を有しており、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子をいう。用語「ＢＴＬＡ」は、ＣＤ２８、細胞毒性Ｔ－リンパ球関連タンパク質抗原４（ＣＴＬＡ－４）、誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）、及びプログラム細胞死－１受容体（ＰＤ－１）を含むＣＤ２８－Ｂ７シグナル伝達受容体ファミリーのメンバーであるＣＤ２７２もいう（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２００５年、Ｒｉｌｅｙ及びＪｕｎｅ、２００５年）。

用語「ＰＤ－Ｌ１」はその一般的な意味を有しており、ＣＤ２７４又はＢ７－Ｈ１としても知られるプログラム細胞死－リガンド１をいう（Ｃｈｅｍｎｉｔｚら、２００４年）。

用語「ＣＴＬＡ－４」はその一般的な意味を有しており、ＣＤ１５２としても知られる細胞毒性Ｔ－リンパ球関連タンパク質４をいう（Ｂｒｕｎｅｔら、１９８７年）。

用語「抗ＰＤ－１抗体」は、当分野における一般的な意味を有しており、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対する結合親和性及びＰＤ－１に対する拮抗活性を有する抗体をいう、すなわち、抗体は、ＰＤ－１に関連するシグナル伝達カスケードを阻害し、ＰＤ－１リガンド結合（ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２）を阻害する。そのような抗ＰＤ－１抗体は、ＣＤ２８－Ｂ７シグナル伝達受容体ファミリーの他の亜型又はアイソフォーム（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ）との相互作用よりも、それぞれ高い親和性及び効力で、ＰＤ－１を優先的に失活させる。化合物がＰＤ－１拮抗剤であるかどうかを決定するための試験及びアッセイは、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２００５年、Ｒｉｌｅｙ及びＪｕｎｅ、２００５によって記載されているものなど、当分野の技術者によって周知である。

そのような抗ＰＤ－１抗体の例としては、それだけには限定されないが、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、又はアテゾリズマブが挙げられる。

用語「抗ＢＴＬＡ抗体」は、当分野における一般的な意味を有しており、ＢＴＬＡに対して結合親和性及び拮抗活性を有する抗体をいう、すなわち、抗体は、ＢＴＬＡに関連するシグナル伝達カスケードを阻害することができる。化合物がＢＴＬＡ拮抗剤であるかどうかを決定するための試験及びアッセイは、（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２００５年、Ｒｉｌｅｙ及びＪｕｎｅ、２００５年）によって記載されているものなど、当分野の技術者によって周知である。

一部の実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体は、国際特許出願の国際公開第２０１０／１０６０５１号、国際公開第２０１１／０１４４３８号、国際公開第２０１７／１４４６６８号中に記載されているものから選択される。

一部の実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体は、国際公開第２０１０／１０６０５１号に開示されているものなどのＣＮＣＭ受託番号Ｉ－４１２３の下でアクセス可能なハイブリドーマから得ることができるＢＴＬＡ抗体（ＢＴＬＡ８．２）、又はＢＴＬＡ８．２の６つのＣＤＲを含む他の抗ＢＴＬＡ抗体である。

一部の実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体は、国際公開第２０１１／０１４４３８号に開示されているｍＡｂ ４Ｃ７である。

一部の実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体は、国際公開第２０１７／１４４６６８号に開示されているｍＡｂ ６２９．３、又はそのヒト化バージョン若しくはそのバリアントである。

前述のものに従って、本開示はさらなる態様を提供する：
治療上有効な量の本開示のＢＴＮ３Ａ抗体断片又は結合タンパク質又は二重特異性分子と、たとえば上述した抗ウイルス剤若しくは抗増殖剤又は免疫治療剤（抗ＰＤ－１若しくは抗ＢＴＬＡ抗体など）である、少なくとも１つの第２の原薬、前記第２の原薬との、共投与、たとえば同時投与又は連続投与を含む、上記定義した方法。

また、組成物（たとえば、本明細書中に開示した活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子）及び使用説明書からなるキットも、本開示の範囲内にある。キットは、少なくとも１つの追加の試薬、又は１つ若しくは複数の追加の抗体若しくはタンパク質をさらに含有することができる。キットは、典型的には、キットの内容物の意図する使用を示すラベルを含む。用語ラベルとしては、キット上若しくはキットと共に供給される、又は他の様式でキットに付随する、任意の記述、又は記録された材料が挙げられる。キットは、上記定義したように、患者がＢＴＮ３Ａ結合タンパク質処置に応答する群に属するかどうかを診断するためのツールをさらに含んでいてもよい。

別の治療戦略は、ヒト対象から単離されたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を含めたγδ Ｔ細胞（典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）を選択的に増大及び／又は活性化させる薬剤としての、本明細書中に開示した活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子の使用に基づく。

したがって、本開示は、処置を必要としている対象を処置する方法であって、
（ａ）対象の血液試料から、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を含めたγδ Ｔ細胞（たとえばＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）を含む血液細胞、たとえば、ＰＢＭＣを単離すること、
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、前記γδ Ｔ細胞を、本明細書中に開示した活性化ＢＴＮ３Ａ抗体断片、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質、又は二重特異性分子のうちの任意の１つの存在下で、腫瘍、典型的にはＢＴＮ３Ａ発現腫瘍細胞又は補助細胞の少なくともいずれかと増大させることと、
（ｃ）増大させたγδ Ｔ細胞を収集することと、
（ｄ）任意選択で、増大させたγδ Ｔ細胞を製剤化し、治療上効率的な量の前記γδ Ｔ細胞（したがって、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞）を対象に投与することと
を含む方法に関する。

完全に記載した本発明を以下に、例示的のみであり、さらに限定することを意味しない、以下の実施例によってさらに例示する。

材料及び方法
Ｉ．様々な様式（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）の１０３．２抗体のキメラバージョンを用いて行った実験
１．Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の調製
ａ．Ｆ（ａｂ’）_２作製のためのペプシン消化
５０％スラリー中の固定ペプシン（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）キット、カタログ番号４４９８８）を、スラリーを５０００ｇで２分間遠沈させることによって、消化緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．４）へと緩衝液交換した。上清を廃棄し、スラリーを１ｍＬの消化緩衝液に再懸濁させ、次いで、５０００ｇで２分間さらに遠心した。このステップをさらに４回繰り返した（合計５回の樹脂洗浄）。その後、樹脂を元のスラリー体積まで消化緩衝液に再懸濁させた。

１０３．２キメラ抗体を、５又は１０ｍＬのゼバスピンカラム（Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ）（スケール依存的）を使用して消化緩衝液へと緩衝液交換し、ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）濃縮器（１０，０００ＭＷＣＯ）を使用して、製造者のプロトコルに従って３ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。その後、抗体を樹脂上に固定したペプシンと混合し、回転させながら３７℃で１．５～２時間インキュベートした。

消化混合物を５０００ｇで２分間遠沈させた。上清を除去し、適切なシリンジ及び０．２２μｍの小フィルター（メルクミリポア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マイレクス（Ｍｉｌｌｅｘ）カタログ番号ＳＬＧＶ００４ＳＬ）を使用して新しいチューブ内に濾過した。樹脂を１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、５０００ｇで１分間遠心した。上清を除去し、濾過し、以前の上清と共にプールした。洗浄ステップを繰り返した。

消化及び濾過した上清を、ハイロード（ＨｉＬｏａｄ）１６／６００ ２００ｐｇサイズ排除カラムを使用して、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を移動相として使用して精製した。溶出されたＦ（ａｂ’）_２断片に対応する画分をプールし、濃縮し、無菌濾過する。

Ｆ（ａｂ’）_２断片をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、分析用ＳＥＣ、及びＯＤ_{２８０ｎｍ}の読取りによって分析した（データ示さず）。

ｂ．Ｆａｂ作製のためのパパイン消化
５０％スラリー中の固定パパイン（サーモサイエンティフィックキット、カタログ番号２０３４１）を、スラリーを５０００ｇで２分間遠沈させることによって、消化緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのシステイン、ｐＨ７．０）へと緩衝液交換した。上清を廃棄し、スラリーをより大きな体積の消化緩衝液に再懸濁させ、次いで、５０００ｇで２分間さらに遠心した。このステップをさらに４回繰り返した（合計５回の樹脂洗浄）。その後、樹脂を元のスラリー体積まで消化緩衝液に再懸濁させた。

１０３．２キメラ抗体を、５又は１０ｍＬのゼバスピンカラム（スケール依存的）を使用して消化緩衝液へと緩衝液交換し、ビバスピン濃縮器（１０，０００ＭＷＣＯ）を使用して、製造者のプロトコルに従って３ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。その後、抗体を樹脂上に固定したパパインと混合し、回転させながら３７℃で４２時間インキュベートした。

消化混合物を５０００ｇで２分間遠沈させた。上清を除去し、適切なシリンジ及び０．２２μｍの小フィルター（メルクミリポア、マイレクス カタログ番号ＳＬＧＶ００４ＳＬ）を使用して新しいチューブ内に濾過した。樹脂をＰＢＳで３回洗浄し、５０００ｇで１分間遠心し、各サイクルで上清を収集及びプールした。その後、プールした画分を、適切なシリンジ及び０．２２μｍの小フィルターを使用して新しいチューブ内に濾過した。

消化及び濾過した上清をまず１×ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４へと緩衝液交換し、その後、最初にタンパク質Ａカラムを使用して精製してＦｃ及び未消化のｍＡｂを除去し、次いで、サイズ排除（ＳＥＣ）カラムを使用して、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を移動相として用いた洗練ステップを行った。溶出されたＦａｂ断片に対応する画分をプールし、濃縮し、無菌濾過した。

Ｆａｂ断片をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、分析用ＳＥＣ、及びＯＤ_{２８０ｎｍ}の読取りによって分析した（データ示さず）。

２．ビアコアを使用したキメラ１０３．２ Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の親和性測定
ヒトＢＴＮ３Ａ１と結合するキメラ１０３．２ Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２の親和性を評価するために、単一サイクル動力学的分析を、ビアコアＴ２００制御ソフトウェアＶ２．０．１及び評価ソフトウェアＶ３．０（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、スウェーデン、ウプサラ）を実行中のビアコアＴ２００（シリアル番号１９０９９１３）装置を使用して行った。すべての単一サイクル動力学的実験は、２５℃で、０．１％のＢＳＡ（ＧＥヘルスケア、英国、リトルチャルフォント）を含有するＨＢＳ－Ｐ＋ランニング緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて実行した。

ヒトＢＴＮ３Ａ１ Ｈｉｓタグ抗原（シノバイオロジカル（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、中国、北京）を、ランニング緩衝液中で、０．４μｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。各サイクルの開始時に、ＢＴＮ３Ａ１－Ｈｉｓを、Ｈｉｓ捕捉キット（ＧＥヘルスケア、英国リトルチャルフォント）を使用して、標準のアミン化学を用いて１０μＬ／分の流速で事前にカップリングさせたＣＭ５センサーチップのＦｃ２上に捕捉させた。約２５ＲＵのＲ_Ｍａｘを得るための様々な理論値である、約１７ＲＵ又は８ＲＵの固定レベル（ＲＬ）を、分析物Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２のそれぞれに使用した。その後、表面を安定化させた。単一サイクル動力学的データは、すべての潜在的な物質輸送効果を最小限にするために、精製した試料（Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２））を用いて４０μＬ／分の流速で得た。参照表面に対する非特異的結合の相違について補正するために、参照チャネルＦｃ１（抗原捕捉なし）からのシグナルをＦｃ２からのシグナルから減算した。すべての試料について０．６１７ｎＭ～５０ｎＭの５点の３倍希釈範囲を、それぞれの濃度間で再生させずに使用した。表面安定性の相違について補正するために、ＢＴＮ３Ａ１－Ｈｉｓブランクラン（分析物なし）のシグナルを減算した。漸増濃度の５回の注入の会合相を各回２４０秒間モニタリングし、単一の解離相を分析物の最後の注入後に２０００秒間測定した。チップ表面の再生は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣＬ、ｐＨ１．５の２回の注入、次いで２４０秒間の安定化期間を使用して実施した。

生センサーグラムを、分析物の様々な原子価に一致して、Ｆａｂ試料については１：１モデルを用いて、Ｆ（ａｂ’）_２試料については二価分析物モデルを用いて当てはめた。得られた動力学的定数を表１及び表２に詳述する。

３．Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒アッセイにおけるキメラ１０３．２（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）の有効性
本アッセイは、キメラ抗体１０３．２並びにそのＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２様式の、ダウディバーキットリンパ腫細胞株に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒に対する活性化又は阻害効果を測定することからなる（Ｈａｒｌｙら、２０１２年）。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞は、健康なドナーのＰＢＭＣから、ゾレドロン酸（１μＭ）及びＩＬ－２（２００ＵＩ／ｍＬ）と共に１１～１３日間培養することによって増大させた。ＩＬ－２を５日目、８日目、及びそれ以降は２日毎に加える。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の百分率は、フローサイトメトリーによって、培養開始時に決定し、培養の間、少なくとも８０％に到達するまで評価した。このステップで、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を凍結して保存した。その後、凍結Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞をダウディ細胞株に対する脱顆粒アッセイ（１：１のＥ：Ｔ比）において使用し、ここで、細胞は、４時間、３７℃で、１０μｇ／ｍＬの１０３．２キメラ抗体及びその様々な様式の存在下で共培養する。ＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋イオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）による活性化がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒の陽性対照として役割を果たし、培地単独が陰性対照として役割を果たした。４時間の共インキュベーションの終わりに、細胞をフローサイトメトリーによって分析して、ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ－１、リソソームの関連タンパク質膜タンパク質－１）＋ＣＤ１０７ｂ（ＬＡＭＰ－２）に対して陽性であるＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の百分率を評価した。ＣＤ１０７は、活性化誘導性の顆粒開口分泌後に細胞表面に固定し、したがって、表面ＣＤ１０７の測定は、最近脱顆粒した細胞溶解性Ｔ細胞を同定するための感受性マーカーである。

得られた結果を表３に記載する。

ＩＩ．１０３．２抗体のヒト化
１．様々なヒト化バリアントの設計及び構築
ａ．ヒト化可変領域配列の設計
マウス１０３．２抗体Ｖ領域の構造的モデルをＳｗｉｓｓ ＰＤＢを使用して生成し、抗体の結合特性にとって必要不可欠である可能性が高い、Ｖ領域中の重要な「束縛」アミノ酸を同定するために分析した。ＣＤＲ内に含有されるほとんどの残基（Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義をどちらも使用）が、いくつかのフレームワーク残基と一緒に重要であると考えられた。マウス１０３．２のＶＨ及びＶκ配列は典型的なフレームワーク残基を含有し、ＣＤＲ１、２、及び３モチーフは多くのマウス抗体と比較可能である。

上記分析から、１０３．２のヒト化配列は、ＣＤＲ外の幅広い代替残基を用いて作製することができるが、ＣＤＲ配列内の可能な残基は狭い選択肢しかないと考えられた。予備分析により、いくつかのヒト抗体からの対応する配列セグメントを組み合わせて、マウス配列中のものと同様又は同一であるＣＤＲを作製することができることが示された。ＣＤＲの外及び隣接する領域には、ヒト配列セグメントの幅広い選択肢が新規ヒト化Ｖ領域の可能な構成要素として同定された。

ｂ．ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ回避
構造解析に基づいて、１０３．２ヒト化バリアントを作製するために使用することができる配列セグメントの大きな予備組を選択し、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子とのペプチド結合のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析のためのｉＴｏｐｅ（商標）技術を使用して（Ｐｅｒｒｙら、２００８年）、及び既知の抗体配列関連Ｔ細胞エピトープのＴＣＥＤ（商標）を使用して（Ｂｒｙｓｏｎら、２０１０年）、分析した。ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する有意な非ヒト生殖系列結合剤であると同定された配列セグメント、又はＴＣＥＤ（商標）に対して有意なヒットをスコアした配列セグメントは廃棄した。これによりセグメントの縮小された組がもたらされ、これらの組合せを上述のように再度分析して、セグメント間の接続部が潜在的なＴ細胞エピトープを含有しないことを確実にした。選択された配列セグメントを、有意なＴ細胞エピトープを欠く完全なＶ領域配列へとアセンブルした。その後、５つの重鎖（ＶＨ１～ＶＨ５）及び４つの軽鎖（Ｖκ１～Ｖκ４）の配列を遺伝子合成及び哺乳動物細胞中での発現のために選択した。

ｃ．１０３．２ヒト化バリアントの構築
１０３．２ヒト化バリアントは、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅ）重鎖及びカッパ軽鎖のための発現ベクターシステム内にクローニングするために、隣接する制限酵素部位を有するように合成した。ＶＨ領域はＭｌｕ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位の間にクローニングし、Ｖκ領域はＢｓｓＨ ＩＩとＢａｍＨ Ｉ制限部位の間にクローニングした。すべての構築体はシーケンシングによって確認した。

２．抗体の発現
キメラ１０３．２（ＶＨ０／Ｖκ０）、２つの対照の組合せ（ＶＨ０／Ｖκ１、ＶＨ１／Ｖκ０）、並びにヒト化重鎖及び軽鎖の組合せ（合計２３対）を、フリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ）（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞（サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、英国、ラフバラ）内に、対応する内毒素無含有ＤＮＡからのマックスサイト（ＭａｘＣｙｔｅ）ＳＴＸ（登録商標）電気穿孔システム（マックスサイト（ＭａｘＣｙｔｅ Ｉｎｃ．）、米国、ゲイザースバーグ）を使用して、一過的に形質移入した。ＯＣ－４００プロセッシングアセンブリを使用して、それぞれの抗体について形質移入を行った。細胞の回収後、細胞を３×１０^６個の細胞／ｍＬまで、８ｍＭのＬ－グルタミン（サーモフィッシャー、英国ラフバラ）及び１×ヒポキサンチン－チミジン（サーモフィッシャー、英国、ラフバラ）を含有するＣＤ Ｏｐｔｉ－ＣＨＯ培地（サーモフィッシャー、英国、ラフバラ）へと希釈した。形質移入の２４時間後、培養温度を３２℃まで下げ、１ｍＭの酪酸ナトリウム（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、英国、ドーセット）を加えた。（開始体積の）３．６％のフィード（２．５％のＣＨＯ ＣＤエフィシェントフィードＡ（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ａ）（サーモフィッシャー、英国、ラフバラ）、０．５％のイーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、英国、オックスフォード）、０．２５ｍＭのグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）（サーモフィッシャー、英国、ラフバラ）、及び２ｇ／Ｌのグルコース（シグマ、英国、ドーセット）を添加することによって、培養物に毎日供給した。ＩｇＧ上清濃度をＩｇＧ ＥＬＩＳＡによってモニタリングし、形質移入を、上清を収穫する１４日前まで培養した。

３．予備選択：ヒトＢＴＮ３Ａ１に対する１０３．２ヒト化バリアントの結合の単一サイクル動力学的分析
すべての１０３．２ヒト化バリアントの結合を評価し、ヒトＢＴＮ３Ａ１に対して最も高い親和性を有する抗体を選択するために、単一サイクル動力学的分析を、形質移入した細胞培養物からの上清に対して、ビアコアＴ２００評価ソフトウェアＶ２．０．１（スウェーデン、ウプサラ）を実行中のビアコアＴ２００（シリアル番号１９０９９１３）を使用して行った。

抗体を、ＥＬＩＳＡによる上清の滴定から得られた濃度に基づいて、２％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で２μｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。各サイクルの開始時に、抗体をタンパク質Ａチップ（ＧＥヘルスケア、英国、リトルチャルフォント）のＦｃ２、Ｆｃ３、及びＦｃ４上に載せた。ＩｇＧは１０μＬ／分の流速で捕捉して、約５０ＲＵのＲ_Ｍａｘを得るための理論値である、約１４６．５ＲＵの固定レベル（ＲＬ）を得た。その後、表面を安定化させた。単一サイクル動力学的データは、すべての潜在的な物質輸送効果を最小限にするために、ＢＴＮ３Ａ１－Ｈｉｓを分析物（シノバイオロジカル カタログ番号１５９７３－Ｈ０８Ｈ）として用いて３０μＬ／分の流速で、及びＨＢＳ－Ｐ＋（ＧＥヘルスケア、英国、リトルチャルフォント）をランニング緩衝液として使用して得た。動力学的サイクルにわたる表面及び分析物の安定性を確認するために、キメラ抗体を用いた複数回の反復を行った。参照表面に対する非特異的結合の相違について補正するために、参照チャネルＦｃ１（抗体なし）からのシグナルをＦｃ２、Ｆｃ３、及びＦｃ４からのシグナルから減算した。１．５６ｎＭ～２５ｎＭのＢＴＮ３Ａ１の３点の４倍希釈範囲を、それぞれの濃度間で再生させずに使用した。ＢＴＮ３Ａ１の漸増濃度の３回の注入の会合相を各回２４０秒間モニタリングし、単一の解離相をＢＴＮ３Ａ１の最後の注入後に２０００秒間測定した。タンパク質Ａ表面の再生は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣＬ、ｐＨ１．５の２回の注入、次いで２４０秒間の安定化期間を使用して実施した。

表面安定性の相違について補正するために、それぞれの抗体ブランクラン（ＢＴＮ３Ａ１なし）からのシグナルを減算した。

４．選択された抗体の精製
最良の親和性及び最良のｉＴｏｐｅ（商標）スコアを有する６つの１０３．２ヒト化バリアントをさらなる分析のために選択した。

等電点（ｐＩ）も、６つの１０３．２ヒト化バリアントのそれぞれについて、その対応するアミノ酸配列に基づいて計算した。

さらなるアッセイ試験のために、６つの１０３．２の選択されたヒト化バリアント（ＶＨ４／Ｖκ２、ＶＨ４／Ｖκ３、ＶＨ４／Ｖκ４、ＶＨ５／Ｖκ２、ＶＨ５／Ｖκ３、ＶＨ５／Ｖκ４）を、ＶＨ０／Ｖκ０キメラ及び最も保存的にヒト化されたバリアント（ＶＨ１／Ｖκ１）と共に精製に供した。抗体を、細胞培養上清から、タンパク質Ａセファロースカラム、次いでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ＧＥヘルスケア、英国、リトルチャルフォント）で、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を移動相及び最終配合緩衝液として使用して、精製した。試料は、予測されたアミノ酸配列に基づいた消光係数（Ｅｃ_{（０．１％）}）を使用して、ＯＤ_{２８０ｎｍ}によって定量した。

抗体は、２μｇのそれぞれの抗体をゲル上に載せることによって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分析した（データ示さず）。

５．選択されたヒト化バリアントの特徴づけ
ａ．競合ＥＬＩＳＡ分析
精製したバリアントを、対応するマウス抗体、１０３．２に対して競合しながら、組換えヒトＢＴＮ３Ａ１－Ｈｉｓ（シノバイオロジカル カタログ番号１５９７３－Ｈ０８Ｈ）と結合することについて試験した。比較のために、キメラ（ＶＨ０／Ｖκ０）及び無関係のヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅ）をそれぞれのプレート上で試験した。

ＢＴＮ３Ａ１を１×ＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌまで希釈し、１００μＬ／ウェルを終夜、４℃で、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。翌日、プレートを１×ＰＢＳ／０．０５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（ＰＢＳ－Ｔ）で３×洗浄し、２００μＬの２％の乳／ＰＢＳを用いて１時間、室温で遮断した。希釈９６ウェルプレート中において、固定濃度のマウス抗体１０３．２（０．１５μｇ／ｍＬの最終濃度）を等体積で、試験抗体の４倍滴定系列まで加えた（８０μｇ／ｍＬ（４０μｇ／ｍＬの最終濃度）から開始し、遮断緩衝液で希釈）。ヌンク（Ｎｕｎｃ）ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ－Ｔで３×洗浄した後、１００μＬのマウス／試験抗体の混合物をＥＬＩＳＡプレートに加えた。１時間、室温でのインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、遮断緩衝液で１：１０００に希釈した１００μＬの抗マウスＦｃ ＨＲＰ標識した二次抗体（シグマ、英国、ドーセット）を１時間、室温で施用して、結合したマウス抗体を検出した。プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、その後、１００μＬのＴＭＢ基質を加え、５分間、室温でインキュベートした。反応を１００μｌの３．０Ｍの塩酸で停止させ、吸光度をすぐにダイネックス（Ｄｙｎｅｘ）プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。

結果をプロットし、ＩＣ_５０値をそれぞれのバリアントについて計算し、相対的ＩＣ_５０値を、ヒト化バリアントＩＣ_５０を同じプレート上でアッセイしたキメラ抗体のＩＣ_５０によって除算することによって計算した（データ示さず）。

ｂ．熱安定性分析
６つの選択された１０３．２ヒト化バリアントの熱安定性を評価するために、蛍光に基づく熱シフトアッセイを使用して融解温度（タンパク質ドメインの５０％がアンフォールドされる温度）を決定した。

６つすべての精製した１０３．２ヒト化抗体を、キメラ（ＶＨ０／Ｖκ０）抗体及びヒト化バリアント（ＶＨ１／Ｖκ１）と共に、０．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで、１０００分の１希釈のシプロ（ＳＹＰＲＯ）（登録商標）オレンジ（Ｏｒａｎｇｅ）（サーモフィッシャー、英国、ラフバラ）を含有する配合緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）中で、ステップワンプラス（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ）リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャー、英国ラフバラ）で、５６分間の期間にわたる２５℃から９９℃の温度勾配に供した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５を陰性対照として使用した。タンパク質熱安定性ソフトウェア（バージョン１．２）を使用して融解曲線を分析した（データ示さず）。

ｃ．複数サイクル動力学的分析
複数サイクル動力学的分析を、６つの選択されたヒト化１０３．２バリアント（ＶＨ４／Ｖκ２、ＶＨ４／Ｖκ３、ＶＨ４／Ｖκ４、ＶＨ５／Ｖκ２、ＶＨ５／Ｖκ３、ＶＨ５／Ｖκ４）に対して、キメラ抗体及びヒト化バリアントＶＨ１／Ｖκ１と共に、ビアコアＴ２００評価ソフトウェアＶ２．０．１（スウェーデン、ウプサラ）を実行中のビアコアＴ２００（シリアル番号１９０９９１３）装置を使用して行った。

精製した抗体を２％のＢＳＡ／ＰＢＳで２μｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。各サイクルの開始時に、それぞれの抗体を約１４６．５ＲＵの密度（ＲＬ）（約５０ＲＵのＲ_Ｍａｘを得るための理論値）でタンパク質Ａ上に捕捉した。捕捉後、表面を安定化させた後に、ＢＴＮ３Ａ１抗原（シノバイオロジカル カタログ番号１５９７３－Ｈ０８Ｈ）を注入した。ＢＴＮ３Ａ１は、０．１％のＢＳＡ／ＨＢＳ－Ｐ＋（ランニング緩衝液）中において、１２～０．３７５ｎＭの２倍希釈範囲で滴定した。会合相を３６０秒間モニタリングし、解離相を４５分間（２７００秒間）モニタリングした。動力学的データは、すべての潜在的な物質輸送効果を最小限にするために４０μＬ／分の流速を使用して得た。タンパク質Ａ表面の再生は、それぞれのサイクルの終わりに１０ｍＭのグリシン－ＨＣＬ、ｐＨ１．５の２回の注入を使用して実施した。動力学的サイクルにわたる表面及び分析物の安定性を確認するために、２つのブランク（ＢＴＮ３Ａ１なし）及び単一濃度の分析物の反復を、それぞれの試験した抗体について行った。キメラ抗体は２回実行した。参照表面との非特異的結合の相違について補正するために、参照チャネルＦｃ１からのシグナルをＦｃ２、Ｆｃ３、及びＦｃ４からのシグナルから減算した。さらに、ドリフトなどの任意の抗原非依存性シグナルのばらつきについて補正するために、ブランクランをそれぞれのＦｃについて減算した。センサーグラムを、グローバルＲ_Ｍａｘパラメータを用いて、バルクシグナルなしで（一定ＲＩ＝０ＲＵ）、１対１の結合数学的モデルを使用して当てはめた。

１０３．２キメラ（ＶＨ０／Ｖκ０）と比較して相対Ｋ_Ｄは、１０３．２ヒト化バリアントのＫ_Ｄを同じチップ上のキメラのＫ_Ｄによって除算することによって計算した（データ示さず）。

ｄ．ヒトＰＢＭＣに対する結合アッセイ
ヒト化バリアントを、健康なドナーの血液から単離したヒトＰＢＭＣとの結合について特徴づけた。ＰＢＭＣを、リンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（アクシスシールド（Ａｘｉｓ－ｓｈｉｅｌｄ）、英国、ダンディー）密度遠心分離を使用してバフィーコートから単離した。その後、ＰＢＭＣを凍結し、－８０℃又は液体窒素中で必要時まで保存した。

１００μＬの１×１０^６個の細胞／ｍＬの細胞を新しいＵ字状底面の９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに移し、その後、プレートを遠心分離し、上清を廃棄した。

抗体の段階希釈、０．００１μｇ／ｍＬ～１５０μｇ／ｍＬをＰＢＳ ２ｍＭのＥＤＴＡ中で調製した。ヒトＰＢＭＣを５０μＬの調製した希釈試験抗体滴定系列中に再懸濁させた。

３０分間、４℃、暗所でインキュベーションした後、プレートを遠心分離し、ペレットを１５０μＬ／ウェルのＰＢＳ ２ｍＭのＥＤＴＡで２回洗浄し、続いてペレットを、５０μＬの、１／１００に希釈したヤギ抗ヒト抗体（ＰＥ標識）及びＰＢＳ ２ｍＭのＥＤＴＡで１／５００に希釈したライブ／デッド（Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ）ニート（ｎｅａｔ）ＩＲからなる混合物に再懸濁させた。

１５分間、４℃、暗所でインキュベーションした後、プレートを遠心分離し、ペレットをＰＢＳ ２ｍＭのＥＤＴＡを用いて１５０μＬ／ウェルで１回洗浄し、続いて、ペレットを２００μＬのＰＢＳ ２ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁させた。細胞をＢＤ ＬＳＲフォルテッサ（Ｆｏｒｔｅｓｓａ）血球計数器で分析した。データをフロージョー（ＦｌｏｗＪｏ）ソフトウェア（バージョン１０、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）、米国、アシュランド、データ示さず）を使用して分析した。

ｅ．Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒アッセイ
セクションＩ．３．に記載したものと同じプロトコルを使用した。

合わせると、結合アッセイ、熱安定性研究、及び機能的試験において得られた結果により、参照ヒト化候補：本明細書中でｈｕ１０３．２とも命名されたＣ末端のリシンが枯渇した１０３．２ ＶＨ４／Ｖｋ４ ＩｇＧ１ Ｌ２４７Ｆ Ｌ２４８Ｅ Ｐ３５０Ｓ（Ｋａｂａｔ命名法の下で付番）の選択が可能となった。

ＩＩＩ．様々な様式（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）の１０３．２抗体（ｈｕ１０３．２）のヒト化バージョンを用いて行った実験
すべての以下の実験は、ヒト化プロセス後に選択された、本明細書中でｈｕ１０３．２とも命名された１０３．２ ＶＨ４／Ｖｋ４ ＩｇＧ１ Ｌ２４７Ｆ Ｌ２４８Ｅ Ｐ３５０Ｓ ｄＫに対応する、参照ヒト化候補を使用して行った。

１．Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の調製
セクションＩ．１．に記載したものと同じプロトコルを使用した。

２．ビアコアを使用した１０３．２抗体（ｈｕ１０３．２）（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）のヒト化バージョンの親和性測定
様々な様式（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＩｇＧ）の参照ヒト化１０３．２抗体（ｈｕ１０３．２）のヒトＢＴＮ３Ａ１に対する親和性を評価するために、単一サイクル動力学的分析は、ビアコアＴ２００制御ソフトウェアＶ２．０．１及び評価ソフトウェアＶ３．０（ＧＥヘルスケア、スウェーデン、ウプサラ）を実行中のビアコアＴ２００（シリアル番号１９０９９１３）装置を使用して行った。すべての単一サイクル動力学的実験は、２５℃で、０．１％のＢＳＡ（ＧＥヘルスケア、英国、リトルチャルフォント）を含有するＨＢＳ－Ｐ＋ランニング緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて実行した。

ヒトＢＴＮ３Ａ１ Ｈｉｓタグ抗原（シノバイオロジカル、中国、北京）を、ランニング緩衝液中で、０．４μｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。各サイクルの開始時に、ヒトＢＴＮ３Ａ１－Ｈｉｓを、Ｈｉｓ捕捉キット（ＧＥヘルスケア、英国リトルチャルフォント）を使用して、標準のアミン化学を用いて１０μＬ／分の流速で事前にカップリングさせたＣＭ５センサーチップのＦｃ２上に捕捉させた。約５０ＲＵのＲ_Ｍａｘを得るための様々な理論値である、約３４ＲＵ、１６ＲＵ、又は１１ＲＵの固定レベル（ＲＬ）を、分析物Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＩｇＧのそれぞれに使用した。その後、表面を安定化させた。単一サイクル動力学的データは、すべての潜在的な物質輸送効果を最小限にするために、精製した試料（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＩｇＧ）を用いて４０μＬ／分の流速で得た。参照表面に対する非特異的結合の相違について補正するために、参照チャネルＦｃ１（抗原捕捉なし）からのシグナルをＦｃ２からのシグナルから減算した。表面安定性の相違について補正するために、ヒトＢＴＮ３Ａ１－Ｈｉｓブランクラン（分析物なし）のシグナルを減算した。漸増濃度の５回の注入の会合相を各回２４０秒間モニタリングし、単一の解離相を分析物の最後の注入後に１４００秒間測定した。チップ表面の再生は、１０ｍＭのグリシン－ＨＣＬ、ｐＨ１．５の２回の注入、次いで２４０秒間の安定化期間を使用して実施した。

生センサーグラムを、分析物の様々な原子価に一致して、Ｆａｂ試料については１：１モデルを用いて、Ｆ（ａｂ’）_２及びＩｇＧ試料については二価分析物モデルを用いて当てはめた。

得られた動力学的値は、表４、表５、及び表６に列挙する。

３．オクテット（商標）を使用した１０３．２抗体（ｈｕ１０３．２）（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）のヒト化バージョンの親和性測定
ヒトＢＴＮ３Ａ１に対する様々な様式（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＩｇＧ）のリードヒト化１０３．２抗体の親和性を評価するために、バイオ層干渉法技術を使用した。すべての実行（ローディング、平衡化、会合／分析物内へのセンサーの浸漬、解離、及び再生を含む）は、黒色９６ウェルプレート（グレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ））中、３０℃で、１０００ｒｐｍで振盪しながら、オクテットレッド（ＯｃｔｅｔＲｅｄ）９６（フォルテバイオ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ））を使用して行った。ＦＡＢ２Ｇセンサー（抗ヒトＣＨ１、フォルテバイオ）は、まず０．２ｍｌの動力学的緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％のツイーン２０、及び０．１％のＢＳＡ）を用いて１０分間水和させ、その後、１０３．２抗体のヒト化バージョン又は断片（２μｇ／ｍＬ）をローディングした。抗体又は断片と様々な濃度のヒトＢＴＮ３Ａ１（６０、３０、１５、７．５、３．７５、及び１．８７ｎＭ）との会合を３００秒間モニタリングし、解離が続いて典型的には５００秒間、動力学的緩衝液中起こった。データの当てはめ及び定数の測定は、オクテットレッドシステムソフトウェア（バージョン７．１）を用いて、１：１モデルを使用して行った。標的タンパク質の非特異的結合の非存在を評価するために、無関係の抗体を用いた対照を使用した。

得られた動力学的値は表７に列挙する。

４．活性化及び増殖アッセイ
ＰＢＭＣを３人の健康なドナーから単離し、セルトレースバイオレット色素で染色し、５日間、６７ｎＭの様々なヒト化１０３．２様式（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）と共に、３７℃、５％のＣＯ_２でインキュベートした。その後、様々な免疫部分組の活性化及び増殖をフローサイトメトリー分析によって観察した。

得られた結果を表８に要約する。

５．Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒アッセイ
セクションＩ．１．に記載したものと同じプロトコルを使用した。３人の異なる健康なドナーから単離したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増大させ、２つの異なる細胞株、すなわち、ダウディ（リンパ腫細胞株）及びＳＫＯＶ－３（卵巣癌細胞株）と共に共インキュベートした。いくつかの用量の１０３．２の様々なヒト化バージョン（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）を本アッセイで試験した。

それぞれの様式について得られたＥＣ_５０値（最大効果の５０％を得るために必要な断片の濃度、すなわち、活性化されたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の最大割合の５０％に対応する）を、表９に列挙する。

結果
Ｉ．１０３．２ Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片のキメラバージョンを用いて行った実験
１．Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の調製
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片を、ＱＣ分析のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥ、分析用ＳＥＣ、及びＯＤ_{２８０ｎｍ}の読取りによって分析した。精製したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片について凝集は観察されなかった（データ示さず）。

２．ビアコアを使用したキメラ１０３．２ Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の親和性測定
ヒトＢＴＮ３Ａ１に対するキメラ１０３．２ Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の親和性を、ビアコアを使用して評価した。得られた動力学的定数は、Ｆ（ａｂ’）_２断片については表１に、Ｆａｂ断片については表２に列挙する。

一価様式の１０３．２キメラバージョンについて得られたＫ_Ｄ値はナノモーラー範囲内であった。

３．Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒アッセイにおけるキメラ１０３．２（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）の有効性
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞毒性を誘導するキメラ１０３．２断片の有効性を、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞をダウディ細胞と共インキュベートした脱顆粒アッセイにおいて評価した。その表面でＣＤ１０７を発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の割合を表３に詳述する。

予想どおり、完全長バージョンの１０３．２抗体は、脱顆粒しているＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の画分を、未刺激（標的なし、抗体なし）のＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞において観察されるレベルまで減少させることによって、強力な拮抗性効果を示した。

驚くべきことに、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦａｂ様式は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒を増強させることによって、逆の効果を示した。この効果は完全に予想外であった。

ＩＩ．１０３．２抗体のヒト化
１．ヒト化バリアントの予備選択
合計２３対のヒト化ＶＨ及びＶＬ領域を設計し、予備選択のために生成した。

ビアコアを使用して評価した抗体親和性、ｉＴｏｐｅ（商標）スコア、及びヒト化の百分率に基づいて、最良の親和性及び最良のｉＴｏｐｅ（商標）スコアを有する６つの１０３．２ヒト化バリアントをさらなる分析のために選択した（データ示さず）。

２．選択されたヒト化バリアントの発現及び精製
選択されたヒト化バリアントを生成し、精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。典型的な抗体のプロフィールに対応するバンドがＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で観察された。

３．選択されたヒト化バリアントの特徴づけ
まず、精製した１０３．２ヒト化バリアントを、マウスバージョンに対して競合しながら組換えヒトＢＴＮ３Ａ１と結合することについて試験した。すべての試験したヒト化バリアントはキメラの２倍以内の推定ＩＣ_５０を有していた（データ示さず）。

その後、６つの選択された１０３．２ヒト化バリアントの熱安定性を、蛍光に基づく熱シフトアッセイを使用して評価した。本アッセイでは、すべての抗体バリアントが２つの明白に異なるアンフォールド事象を示し、ヒト化度合が増加するにつれてより高いＴｍが増加した。

６つの選択された１０３．２ヒト化バリアントの親和性を、ビアコアを使用して試験した。本実験では、すべての１０３．２ヒト化バリアントが１０３．２キメラ抗体の２倍以内の親和性を実証した（データ示さず）。

それぞれのヒト化バリアントの結合を、健康なドナーから単離したヒトＰＢＭＣに対するフローサイトメトリーによって評価した。膜表示タンパク質と結合するそれぞれの抗体の能力を妥当性確認し、得られたＥＣ_５０値はそれぞれのバリアントについて比較可能であった（データ示さず）。

最後に、それぞれのヒト化バリアントの有効性を評価するために顆粒アッセイを行い、得られたＥＣ_５０値はそれぞれの抗体について同様であった（データ示さず）。

すべての作成されたデータに基づいて、ＶＨ４／Ｖｋ４に対応する１つのリードヒト化バリアントが免疫原性評価のために選択された。可変領域をＩｇＧ１ Ｆｃサイレント部分に移植した（突然変異Ｌ２４７Ｆ、Ｌ２４８Ｅ、Ｐ３５０Ｓ、ｄＫ（Ｃ末端リシンの枯渇）を含む）。作製された最終的なヒト化候補抗体断片をｈｕ１０３．２と命名した。

ＩＩＩ．様々な様式（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）の１０３．２抗体（ｈｕ１０３．２）のヒト化バージョンを用いて行った実験
１．Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の調製
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片を、ＱＣ分析のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥ、分析用ＳＥＣ、及びＯＤ_{２８０ｎｍ}の読取りによって分析した。精製したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片について凝集は観察されなかった（データ示さず）。

２．ビアコアを使用した様々な様式（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）の１０３．２抗体（ｈｕ１０３．２）のヒト化バージョンの親和性測定
様々な様式（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）のヒト化１０３．２抗体の、ヒトＢＴＮ３Ａ１に対する親和性をビアコアによって評価した。得られた動力学的値は、ＩｇＧ様式については表４に、Ｆ（ａｂ’）_２断片については表５に、Ｆａｂ様式については表６に列挙する。

一価様式のヒト化１０３．２（ｈｕ１０３．２）について得られたＫ_Ｄ値はほぼナノモーラー範囲内にあり、これは、ヒト化プロセス中に親和性の損失がなかったことを意味する。

３．オクテットを使用した様々な様式（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）の１０３．２抗体（ｈｕ１０３．２）のヒト化バージョンの親和性測定
様々な様式（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）のヒト化１０３．２抗体の、ヒトＢＴＮ３Ａ１に対する親和性も、オクテットレッド９６を使用して行った。得られた動力学的値は表７に列挙する。

ヒト化１０３．２断片について得られたＫ_Ｄ値は様々な様式（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）についてナノモーラー範囲内であった。

４．活性化及び増殖アッセイ
様々な様式（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）のヒト化１０３．２抗体（ｈｕ１０３．２）の、ＰＢＭＣ内の様々な免疫部分組活性化及び増殖に対する効果は、フローサイトメトリーを使用して様々な免疫細胞の表面で増殖及び活性化マーカーを検出することによって評価した。

任意の抗体断片について、Ｂ細胞、ＣＤ４、及びＣＤ８Ｔ細胞に対する効果は観察されなかった。しかし、増殖及び活性化がどちらもＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞に対して観察された。細胞分裂の分析及びその表面でＣＤ２５を発現する細胞の割合を反映するセルトレースバイオレット分裂値を、表８に要約する。

ヒト化１０３．２抗体（ｈｕ１０３．２）は完全長バージョンのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞に対して効果を有さなかったが、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片はその増殖（細胞分裂を反映するＣＴＶ希釈の増加によって示される）及びその活性化（活性化マーカーであるＣＤ２５受容体を発現するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増加によって反映される）を誘導した。

５．Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒アッセイ
様々な様式（ＩｇＧ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）_２）のヒト化１０３．２抗体（ｈｕ１０３．２）の有効性を脱顆粒アッセイにおいて評価した。様々な用量のそれぞれの様式を試験し、ＥＣ_５０値を決定し、表９に列挙する。

ｈｕ１０３．２ Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片はＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞に対して強力な作用性効果を示し、Ｆａｂ断片についてはナノモーラー以下の範囲のＥＣ_５０値及びＦ（ａｂ’）_２断片についてはピコモーラー以下の範囲であった。

ここでも、ｈｕ１０３．２が完全長抗体として強力な拮抗性効果を示し、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２バージョンで逆の効果を示したことは完全に驚くべきことであった。

配列表
表１０及び１１：本発明を実施するために有用なアミノ酸及びヌクレオチド配列の簡単な説明

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Ｒｉｌｅｙ， Ｊ．Ｌ．， ａｎｄ Ｊｕｎｅ， Ｃ．Ｈ． （２００５）． Ｔｈｅ ＣＤ２８ ｆａｍｉｌｙ： ａ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｈｅｏｓｔａｔ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ １０５， １３－２１．
Ｓｅｄｙｋｈ， Ｓ．Ｅ．， Ｐｒｉｎｚ， Ｖ．Ｖ．， Ｂｕｎｅｖａ， Ｖ．Ｎ．， ａｎｄ Ｎｅｖｉｎｓｋｙ， Ｇ．Ａ． （２０１８）． Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｄｅｓｉｇｎ， ｔｈｅｒａｐｙ， ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．
Ｓｈｕｋｌａ， Ａ．Ａ．， Ｈｕｂｂａｒｄ， Ｂ．， Ｔｒｅｓｓｅｌ， Ｔ．， Ｇｕｈａｎ， Ｓ．， ａｎｄ Ｌｏｗ， Ｄ． （２００７）． Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｆｏｒｍ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ ８４８， ２８－３９．
Ｓｔｅｃｈ， Ｍ．， Ｎｉｋｏｌａｅｖａ， Ｏ．， Ｔｈｏｒｉｎｇ， Ｌ．， Ｓｔｏｃｋｌｅｉｎ， Ｗ．Ｆ．Ｍ．， Ｗｕｓｔｅｎｈａｇｅｎ， Ｄ．Ａ．， Ｈｕｓｔ， Ｍ．， Ｄｕｂｅｌ， Ｓ．， ａｎｄ Ｋｕｂｉｃｋ， Ｓ． （２０１７）． Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｕｐｌｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７， １２０３０．
Ｔａｋｅｂｅ， Ｙ．， Ｓｅｉｋｉ， Ｍ．， Ｆｕｊｉｓａｗａ， Ｊ．， Ｈｏｙ， Ｐ．， Ｙｏｋｏｔａ， Ｋ．， Ａｒａｉ， Ｋ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｍ．， ａｎｄ Ａｒａｉ， Ｎ． （１９８８）． ＳＲ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ： ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒ－Ｕ５ ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８， ４６６－４７２．
Ｔｏｓｏｌｉｎｉ， Ｍ．， Ｐｏｎｔ， Ｆ．， Ｐｏｕｐｏｔ， Ｍ．， Ｖｅｒｇｅｚ， Ｆ．， Ｎｉｃｏｌａｕ－Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｍ．－Ｌ．， Ｖｅｒｍｉｊｌｅｎ， Ｄ．， Ｓａｒｒｙ， Ｊ．－Ｅ．， Ｄｉｅｌｉ， Ｆ．， ａｎｄ Ｆｏｕｒｎｉｅ， Ｊ．－Ｊ． （２０１７）． Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ＴＣＲＶγ９Ｖδ２ Ｖγ９Ｖδ２ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｂｙ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒｓ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ． ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６， ｅ１２８４７２３．
Ｕｒｌａｕｂ， Ｇ．， ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｌ．Ａ． （１９８０）． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｃｅｌｌ ｍｕｔａｎｔｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ７７， ４２１６－４２２０．

Claims (15)

1. （ｉ）配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ２、及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
   （ｉｉ）配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５又は配列番号１７のＬ－ＣＤＲ２、及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と
   を有するＢＴＮ３Ａ抗体断片を少なくとも含む、単離されたＢＴＮ３Ａ結合タンパク質であって、以下の特性：
   （ｉ）バイオ層干渉法（ＢＬＩ）技術によって測定される場合、１０ｎＭ以下のＫ_Ｄ、好ましくは５ｎＭ以下のＫ_ＤでヒトＢＴＮ３Ａ１と結合すること、並びに／又は、
   （ｉｉ）癌細胞、任意選択でダウディ及び／若しくはＳＫＯＶ－３細胞との共培養物中におけるγδ Ｔ細胞の活性化を、ＣＤ１０７脱顆粒アッセイにおいて測定される場合、１０ｎＭ以下、好ましくは１ｎＭ以下のＥＣ_５０で誘導すること、並びに／又は
   （ｉｉｉ）ＰＢＭＣ内のＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化及び増殖を誘導すること
   を有する、ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質。
2. 前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片が、
   （ｉ）配列番号１８の重鎖可変領域と、
   （ｉｉ）配列番号１９の軽鎖可変領域と
   を含む、請求項１に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質。
3. 前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又は（Ｆａｂ）’_２断片から選択される、請求項１又は２に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質。
4. ＢＴＮ３Ａとの結合について一価又は二価である、請求項１、２、又は３に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質。
5. 請求項３に記載のＢＴＮ３Ａ抗体断片から本質的になる、たとえば、配列番号１８のＶＨドメインと配列番号１９のＶＬドメインとを含むｓｃＦｖからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質。
6. １つ又は複数の追加のタンパク質ドメインと融合した前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片を含む融合タンパク質である、請求項１～５のいずれか一項に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質。
7. 医薬品としての使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質。
8. 癌、たとえば、γδ Ｔ細胞を用いた処置に感受性のある癌の処置における使用のための、請求項７に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質。
9. （ｉ）固形腫瘍及び／又は（ｉｉ）血液癌の処置における使用のための、請求項８に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質。
10. 請求項１～６のいずれか一項に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含み、任意選択で他の活性成分を含む、医薬組成物。
11. 前記ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質をコードしている１つ又は複数の核酸を含む、宿主細胞中における請求項１～６のいずれか一項に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質の組換え産生のための発現ベクター。
12. 前記核酸が、請求項２に記載の前記ＢＴＮ３Ａ抗体断片の重鎖及び軽鎖のコード配列、典型的には配列番号１５及び１６を含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
13. 請求項１１又は１２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
14. 請求項１～６のいずれか一項に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質を産生する方法であって、（ｉ）請求項１３に記載の宿主細胞を培養して、前記宿主細胞により前記ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質を発現させるステップと、任意選択で、（ｉｉ）前記ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質を精製し、前記ＢＴＮ３Ａ結合タンパク質を製剤化するステップとを含む方法。
15. γδ Ｔ細胞の増殖及び／又は活性化をｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで誘導する方法であって、効率的な量の請求項１～６のいずれか一項に記載のＢＴＮ３Ａ結合タンパク質を、前記γδ Ｔ細胞と、任意選択でＢＴＮ３Ａ発現腫瘍細胞などの他のＢＴＮ３Ａ発現細胞の存在下で接触させるステップを含む方法。