CN110540599A

CN110540599A - 基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN110540599A
Application number: CN201811577672.3A
Authority: CN
Inventors: 杨波; 程雨洁; 胡征; 王毅
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2019-12-06
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: CN110540599B

Abstract

本发明涉及一种快速检测肺炎克雷伯菌的Elisa检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包含有：包被抗肺炎克雷伯菌ABC transporter substrate‑binding protein receptor及GlpQ蛋白多克隆抗体的酶标板、抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体、肺炎克雷伯菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物和终止液。本发明的试剂盒对肺炎克雷伯菌四种特异性表面蛋白进行联合检测，大大提高了肺炎克雷伯菌检测的灵敏度、特异性和可重复性，可用于对肺炎克雷伯菌非诊断性检测及研究工作。

Description

基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术及传染病诊断研究领域，涉及一种Elisa检测试剂盒，尤其涉及一种基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒及制备方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，又称肺炎杆菌或Friedlander杆菌，是最早被认识可引起肺炎的革兰阴性杆菌。半个世纪以前，革兰阴性杆菌肺炎(gram-negative bacillary pneumonia，GNBP)曾被认为是一种非常少见的疾病，很少受到临床关注。除克雷白杆菌外，几乎没有关于革兰阴性杆菌(gram-negative bacterium，GNB)引起肺炎的报道。近二、三十年来，随着易感人群的改变、抗菌药物广泛应用与耐药菌的变迁以及各种微生物检测技术的提高与普及，GNBP已成为进入抗生素时代的现代医学的一种重要疾病。肺炎克雷伯菌常存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，是肠杆菌科克雷伯菌属中对人致病性较强的重要条件致病菌和医源性感染菌。据北京协和医院的统计，肺炎克雷伯杆菌肺炎的发病率为40.9％。世界范围的统计，肺炎克雷伯杆菌肺炎占全部肺炎1％～8％，仅次于铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌肺炎。社会获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)的实际调查受到诸多因素的限制，缺乏统一的报告。肺炎克雷伯杆菌肺炎占CAP中革兰阴性杆菌肺炎发病率的16％～64％，现认为肺炎克雷白杆菌是CAP常见的病原菌之一。

目前检测呼吸道中该病原体的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定法，该方法所需时间长，一般要2-3天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，而增菌液中往往还有PCR抑制剂，从而影响扩增的效果。同时，该技术还需要专业的检测设备，不适合进行床旁检测。此外，该项技术由于过于灵敏，经常会出现假阳性。以抗体为基础的免疫学检测已成为人体病原微生物检测不可或缺的重要技术手段。目前已发展了多种特异性免疫检测技术，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CIA)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中ELISA等多种以抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点已成为病原微生物检测不可或缺的重要手段。因而，研究开发具有自主知识产权的病原微生物的抗体，是开发拥有自主知识产权的ELISA检测方法的基础。

抗原成分的选择是检测特异性的关键。肺炎克雷伯菌ABC transportersubstrate-binding protein receptor、FepA、GlpQ及MltD蛋白均是位于细胞表面的重要分子，本研究选用具有种间特异性的表面蛋白ABC transporter substrate-bindingprotein receptor、FepA、GlpQ及MltD等作为检测标的物，通过基因重组的方式制备重组抗原，进而制备特异性良好的多克隆抗体，并将其应用于制Elisa检测试剂盒。

发明内容

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种可提高肺炎克雷伯菌检测的灵敏度、特异性及可重复性强、操作简单、成本低廉以及快捷迅速地对肺炎克雷伯菌进行检测的基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒及制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒，其特征在于：所述基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒包括包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板、抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)多克隆抗体、肺炎克雷伯菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液；所述肺炎克雷伯菌阳性对照是灭活的肺炎克雷伯菌菌液；所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液；所述洗涤液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L，Tween-20 0.5mL/L，所述洗涤液的pH＝7.4；所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG；所述酶显色底物是TMB显色液；所述终止液是1M HCL溶液。

一种基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒包括包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板、抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)多克隆抗体、肺炎克雷伯菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液；所述肺炎克雷伯菌阳性对照是灭活的肺炎克雷伯菌菌液；所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液；所述洗涤液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L，Tween-20 0.5mL/L，所述洗涤液的pH＝7.4；所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG；所述酶显色底物是TMB显色液；所述终止液是1M HCL溶液；

所述包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-bindingprotein receptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板的制备方法是：

1)抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ)多克隆抗体的制备：

1.1)分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-bindingprotein receptor及表面蛋白GlpQ胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transportersubstrate-binding protein receptor及表面蛋白GlpQ在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_009653190及WP_004214637；所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Abcglp；

所述Abcglp的基因全序列是：

CATATGGAAATCGAAAAAAGCGGTACTCTGAAAGTTGCAACCGAGGACGACTATGCACCGTTCAACTTCATGAACAACGGCCAAGCTGACGGCTTCAACAAAGACATGCTGGAAGAACTGCGTAAGTATGCGAAATTCCATGTGGACCAAAGCATCCTGCCGTGGACTGGCCTGCTGGCAGCCGTATCTACTGGCCAGTACGACATGGCACTGACCGGCGCAGTTATCACCGACGAACGTCTGAAAGTTTTCGACTTCACTCCGCCGTGGGCATCCGCTCAGCATTACTTCGTTAAACGTGCAGGCGACACCTCTCTGAACACTATTGCAGACTTGTCCGGTAAGAAAGTTGGCGTACAGGCAGGTAGCGCTCTGCTGGCACGTCTGCCGGAACTGAAAGCAATGCTGGAGAAAACTGGCGGTAAATTAGGCCCGGTGGTTGAATATCCGTCTTACCCGGAAGCATACGCTGACCTGGCTAACAAACGTCTGGATTATGTTATCAACGTTGTTATCTCCGTTAACGACCTGGCAAAAGCTAAACCGAAGGTTTTCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGACCGTCTGGTTGTACTGCACGATCATTACTTGGACCGTGTTACTGACGTTGCTCAGCGCTTCCCTCAGCGTGCGCGCAAAGACGGTCGTTTTTACGCTATCGACTTTACCCTGGATGAAATCAAATCTCTCAAATTCACTGAAGGTTTCGAGCCTAAAAACGGCAAAAACGTTCAAACCTATCCTGGTCGTTTCCCGATGGGTAAAAGCGATTTTCGCATCCACACTTTCGAAGAGGAAATCGAATTCGTACAGGGTCTCAACCACTCTACTGGTAAAAACATCGGTATCTACCCGGAAATCAAAGCACCGTGGTTCCACCACCAGGAAGGTAAAGACATCGCTGCTTCCACCCTCAAAGTTCTGAAAGAATACGGTTACACCTCTAAGCAGGATAAAGTGTACCTGCAGTGCTTCGACGCTAATGAACTGAAGCGTATCAAAAACGAACTGGAGCCGAAAATGGGCATGGACCTGAACCTGGTACAGCTGTAAGGATCC；

所述Abcglp基因编码的蛋白质序列是：

MEIEKSGTLKVATEDDYAPFNFMNNGQADGFNKDMLEELRKYAKFHVDQSILPWTGLLAAVSTGQYDMALTGAVITDERLKVFDFTPPWASAQHYFVKRAGDTSLNTIADLSGKKVGVQAGSALLARLPELKAMLEKTGGKLGPVVEYPSYPEAYADLANKRLDYVINVVISVNDLAKAKPKVFGGSGGSGGSGGSDRLVVLHDHYLDRVTDVAQRFPQRARKDGRFYAIDFTLDEIKSLKFTEGFEPKNGKNVQTYPGRFPMGKSDFRIHTFEEEIEFVQGLNHSTGKNIGIYPEIKAPWFHHQEGKDIAASTLKVLKEYGYTSKQDKVYLQCFDANELKRIKNELEPKMGMDLNLVQL；

所述Abcglp基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transportersubstrate-binding protein receptor的29-211aa及表面蛋白GlpQ的69-232aa；两段蛋白序列中间以柔性连接肽ggsggsggsggs进行连接；

1.2)将Abcglp的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，转入E.coli BL21(DE3)菌中，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni²⁺亲和层析法纯化重组His-Abcglp蛋白；将该重组蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)多克隆抗体；

2)抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ)多克隆抗体的包被：

用PBS缓冲液将步骤1)制备得到的抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transportersubstrate-binding protein receptor及GlpQ)多克隆抗体稀释至浓度为10μg/mL，按100μL/孔的量包被96孔EIA高效结合酶标板，37℃2小时；取出后用250μL洗涤液洗板三次，甩干；用含有1％BSA的洗涤液作为封闭液，按250μL/孔的量加入酶标板，37℃封闭1小时；取出后用250μL洗涤液洗板3次，每次一分钟，甩干，干燥后密封保存；

其中，所述PBS缓冲液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L；所述PBS缓冲液的pH是7.4；

所述洗涤液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L，Tween-20 0.5mL/L，所述洗涤液的pH是7.4；

所述封闭液是含1％BSA的洗涤液的水溶液，所述封闭液的pH是7.4。

上述抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)多克隆抗体的制备方法是：

1)分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA及表面蛋白MltD胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用刚性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA及表面蛋白MltD在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_012068422及WP_004210407；所述刚性连接肽的序列是eaaakeaaak；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Fepmlt；

所述Fepmlt的基因全序列是：

CATATGAACGATTACCGTAACAAAATCGAAGCAGGTTACGCTCCGGTTTACCAGAACAACAAAGGTACCGACCTGTACCAGTGGGAGAACGTTCCGAAAGCGGTAGTAGAAGGCCTGGAAGGCACTCTGAACGTCCCAGTTTCCGAGACCGTAAACTGGACCAACAACATCACTTACATGCTGCAGAGCAAGAACAAGGAAACAGGCGACCGCCTGTCTATCATCCCGGAATATACCCTGAACTCTACTCTGAGCTGGCAGGTACGTGATGACGTATCCCTGCAGTCTACCTTCACCTGGTACGGCAAACAGGAACCGAAGAAATACAACTACAAAGGCCAGCCGGTTACCGGTTCTGAAAAAAACGAAGTATCCCCGTACTCTATCCTGGGTCTGTCCGCAACATGGGACGTTACTAAGTATGTCTCTCTGACCGGTGGCGTAGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAACTGGACTCTCCGGTAGACATCTCCCAGCTGGCAGACATGGCTGGTATGCCGGTATCCAAACTGAAGACCTTCAACGCAGGTGTTAAGGGCTCCACTCTGGGCGCATCTGGTCCGAAATACGTAATGGTACCGCAGAAACACGCAGCTCAGCTGCGTGAATCCCTGGCATCTGGCGATATCGCAGCTGTACAGCCGACCCAGCTGGCTGACAACACTCCCCTGACCTCTCGTTCCTACAAAGTACGCAGCGGCGATACTATCTCTGGTATTGCTTCCCGCCTGGGCGTGACTACTCGTGACCTCCAGCAGTGGAACAACCTGCGTGGCTCTGGTCTGAAAGTTGGCCAGAACCTGGTGATCGGTGCTGGCTCCAGCGCACAGCGTCTGGCCAACAACTCTGATTCTATCACATACCGCGTACGTAAGGGTGACTCTCTGTCCTCTATCGCTTAAGGATCC；

所述Fepmlt基因编码的蛋白质序列是：

MNDYRNKIEAGYAPVYQNNKGTDLYQWENVPKAVVEGLEGTLNVPVSETVNWTNNITYMLQSKNKETGDRLSIIPEYTLNSTLSWQVRDDVSLQSTFTWYGKQEPKKYNYKGQPVTGSEKNEVSPYSILGLSATWDVTKYVSLTGGVEAAAAKEAAAAKLDSPVDISQLADMAGMPVSKLKTFNAGVKGSTLGASGPKYVMVPQKHAAQLRESLASGDIAAVQPTQLADNTPLTSRSYKVRSGDTISGIASRLGVTTRDLQQWNNLRGSGLKVGQNLVIGAGSSAQRLANNSDSITYRVRKGDSLSSIA；

所述Fepmlt基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA的550-695aa及表面蛋白MltD的268-417aa；两段蛋白序列中间以刚性连接肽eaaakeaaak进行连接；

2)将Fepmlt的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，转入E.coli BL21(DE3)菌中，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni²⁺亲和层析法纯化重组His-Fepmlt蛋白；将该重组蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体，用封闭液稀释至终浓度为20μg/mL；

所述封闭液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L，牛血清白蛋白10g/L，所述封闭液的pH是7.4。

本发明相对于现有技术具有如下优点：

(1)本发明采用结构分析，基因优化等方式，构建了两个全新的融合基因，通过可溶性过量表达，首次成功获得了可溶性的重组ABC transporter substrate-bindingprotein receptor/GlpQ融合蛋白及FepA/MltD融合蛋白。该两种融合蛋白表达量高，制备成本低廉，蛋白可溶性好，抗原性强，用其制备抗体效价高，成本低。

(2)本发明首次利用肺炎克雷伯菌表面上的四个蛋白暴露区制备的抗体效价高，抗原结合位点多，捕获力强，不存在位点竞争问题，试剂盒检测灵敏度高。其对肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC700603的检测灵敏度达到1×10³CFU/mL，明显高于微生物传统检测方法，并且具有快速、高效等优点。

(3)该Elisa试剂盒特异性好，用6株肺炎克雷伯菌菌株和17株非肺炎克雷伯菌标准菌株(包含绝大部分呼吸道常见病原体)进行的特异性实验，结果显示本发明的试纸条具有良好的特异性和稳定性，其可检出所有所试的肺炎克雷伯菌，而与所有非肺炎克雷伯菌标准菌株均无交叉反应，十分适合临床非诊断性应用。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1

抗肺炎克雷伯菌ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ蛋白多克隆抗体的制备：

1.1)肺炎克雷伯菌Abcglp融合基因的克隆

获取肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ(其NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_009653190及WP_004214637)其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到其基因编码序列，优化其基因编码序列，并将此二序列用柔性连接肽(ggsggsggsggs)的编码序列进行连接，形成融合基因。同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Abcglp。其基因全序列及编码的氨基酸序列如序列表所示。具体的说，Abcglp基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transportersubstrate-binding protein receptor的29-211aa及表面蛋白GlpQ的69-232aa，两个蛋白序列中间以柔性连接肽(ggsggsggsggs)进行连接。将此基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因化学合成，交货时该人工合成的基因片段连于载体pUC57上。将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI及BamHI进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用。同时采用NdeI及BamHI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规分子生物学方法将经双酶切后获得的Abcglp基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET-Abcglp表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组Abcglp融合蛋白。

1.2)肺炎克雷伯菌Abcglp融合蛋白的表达与纯化

将上述鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coliBL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株。挑取pET-Abcglp转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培养基中，于37℃培养过夜。取出菌液后，按1：100接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于30℃培养至OD600＝0.6时，加入1mol/L IPTG至终浓度为0.5mmol/L，于18℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导12h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用50mLBuffer A(50mM Na₃PO₄，0.5M NaCl；pH7.4)洗涤3次并用50mL上样缓冲液(50mM Na₃PO₄，0.5M NaCl；5mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超声破碎，操作条件为：功率50W，工作时间2s，间隔时间3s，报警温度60℃，总时间30min。超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组Abcglp融合蛋白以部分溶解形式存在于菌体中(另一部分以包涵体形式存在)。薄层扫描显示，该重组蛋白占细菌总蛋白的30％以上，说明基因优化后融合蛋白获得了较高的表达量。而将未经优化的野生型Abcglp基因按上述同样方式进行克隆表达，其表达产物仅占细胞总蛋白的3％左右，表达量微弱，纯化困难。将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns(GE healthcare公司产品)，按照说明书的方法进行重组Abcglp蛋白的纯化。具体方法如下：

1.2.1)连接层析系统，该系统包括进样管、蠕动泵(上海沪西分析仪器厂，型号DHL-A)、层析柱(GE healthcare公司产品，商品名His Trap affinity columns)及紫外检测器(上海沪西分析仪器厂，型号HD1)，柱体积为2ml，预热紫外检测仪30min左右至读数稳定；

1.2.2)校对T％：调节光亮旋钮至显示100％；

1.2.3)旋转灵敏度至合适位置，一般用0.2A；

1.2.4)以上样缓冲液平衡层析系统，至读数稳定后旋转“调零”至显示“000”；

1.2.5)上蛋白样品，流速控制在5ml/min以内，收集穿透液；

1.2.6)用上样缓冲液洗去未结合的蛋白，此过程中记录读数，直到读数不再变化为止，收集洗脱液；

1.2.7)用Buffer A+10mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；

1.2.8)用Buffer A+20mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；

1.2.9)用Buffer A+40mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

1.2.10)用Buffer A+100mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

1.2.11)用Buffer A+150mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

1.2.12)取各洗脱峰样品100ul进行SDS-PAGE电泳；

1.2.13)结果发现，目标蛋白在100mM咪唑时被洗脱下来，纯度在90％以上，经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL，备用。至此制得肺炎克雷伯菌Abcglp融合蛋白。

1.3)抗肺炎克雷伯菌ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ蛋白多克隆抗体的制备

1.3.1)将步骤(1.2)所制肺炎克雷伯菌Abcglp融合蛋白与福氏完全佐剂混合，乳化后作为免疫原免疫雄性新西兰兔2只，每只兔子皮下注射总量为2ml，抗原总量为2mg/只。后每隔两周用Abcglp融合蛋白与福氏不完全佐剂形成的乳化液免疫一次，共免疫5次，抗原用量与初次免疫相同。五免后3-5天进行心脏大量取血，置37℃1小时，然后放冰箱4℃过夜，隔天取血清。

1.3.2)多克隆抗体效价的测定

以Abcglp融合蛋白为包被抗原，包被浓度为5μg/ml，每孔包被100μl，利用间接ELISA法检测血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为：1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400、1：204800；ELISA板包被牛血清白蛋白作为阴性对照，用酶联检测仪测定OD450，满足P/N值＞2.1为阳性。结果显示2只兔子的血清抗体效价均达到1：102400，说明免疫效果较好。

1.3.3)多克隆抗体的提取，用GE-HiTrap Protein A HP预装柱，按说明书纯化抗体，具体操作如下：

1.3.3.1)取5mL抗血清，加入0.5mL 1M Tris(pH8.0)调节到pH8.0，20，000g离心20min除去沉淀。

1.3.3.2)上柱后用10倍柱体积buffer A(100mM Tris-Cl，pH 8.0)洗涤后，再用10倍柱体积buffer B(10mM Tris-Cl，pH 8.0)洗涤。

1.3.3.3)用大约三倍柱体积的IgG洗脱缓冲液(100mM glycine，pH 3.0)洗脱IgG。(收集管内先预装0.1mL IgG-中和缓冲液(1M Tris-Cl，pH 8.0)，每管装0.9mL洗脱液)

1.3.3.4)用50倍体积Tris(10mM Tris-Cl，pH 8.0)对洗脱液进行透析。

1.3.3.5)超滤浓缩后，调整浓度为5mg/ml，-70℃保存备用。至此制得抗肺炎克雷伯菌ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ蛋白多克隆抗体。

实施例2

抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体的制备：

1.1)肺炎克雷伯菌Fepmlt融合基因的克隆

获取肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA及MltD(其NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber分别为WP_012068422及WP_004210407)其胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到其基因编码序列，优化其基因编码序列，并将此二序列用刚性连接肽(eaaakeaaak)的编码序列进行连接，形成融合基因。同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Fepmlt。其基因全序列及编码的氨基酸序列如序列表所示。具体的说，Fepmlt基因编码的蛋白质序列为肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA的550-695aa及表面蛋白MltD的268-417aa，两个蛋白序列中间以刚性连接肽(eaaakeaaak)进行连接。将此基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因化学合成，交货时该人工合成的基因片段连于载体pUC57上。将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI及BamHI进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用。同时采用NdeI及BamHI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规分子生物学方法将经双酶切后获得的Fepmlt基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌TOP10，构建pET-Fepmlt表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组Fepmlt融合蛋白。

1.2)肺炎克雷伯菌Fepmlt融合蛋白的表达与纯化

将上述鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coliBL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株。挑取pET-Fepmlt转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培养基中，于37℃培养过夜。取出菌液后，按1：100接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于30℃培养至OD600＝0.6时，加入1mol/L IPTG至终浓度为0.5mmol/L，于18℃摇菌培养，诱导融合蛋白表达。诱导12h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用50mLBuffer A(50mM Na₃PO₄，0.5M NaCl；pH7.4)洗涤3次并用50mL上样缓冲液(50mM Na₃PO₄，0.5M NaCl；5mM咪唑，pH7.4)重悬后进行超声破碎，操作条件为：功率50W，工作时间2s，间隔时间3s，报警温度60℃，总时间30min。超声完成后，12000g离心15min分别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组Fepmlt融合蛋白以溶解形式存在于菌体中。薄层扫描显示，该重组蛋白占细菌总蛋白的30％以上。而将未经优化的野生型Fepmlt基因按上述同样方式进行克隆表达，其并未检测到有表达产物，说明基因优化后融合蛋白获得了较高的表达量。将上述获得的超声破碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns(GEhealthcare公司产品)，按照说明书的方法进行重组Fepmlt蛋白的纯化，具体方法如下：

1.2.2)校对T％：调节光亮旋钮至显示100％；

1.2.3)旋转灵敏度至合适位置，一般用0.2A；

1.2.5)上蛋白样品，流速控制在5ml/min以内，收集穿透液；

1.2.7)用Buffer A+10mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；

1.2.8)用Buffer A+20mM咪唑进行洗脱，收集洗脱峰；

1.2.9)用Buffer A+40mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

1.2.10)用Buffer A+100mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

1.2.11)用Buffer A+150mM咪唑洗脱，收集洗脱峰；

1.2.12)取各洗脱峰样品100ul进行SDS-PAGE电泳；

1.2.13)结果发现，目标蛋白在40mM咪唑时被洗脱下来，纯度在90％以上，经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后，调整浓度为0.2mg/mL，备用。至此制得肺炎克雷伯菌Fepmlt融合蛋白。

1.3)抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体的制备

1.3.1)将步骤(1.2)所制肺炎克雷伯菌Fepmlt融合蛋白与福氏完全佐剂混合，乳化后作为免疫原免疫雄性新西兰兔2只，每只兔子皮下注射总量为2ml，抗原总量为2mg/只。后每隔两周用Fepmlt融合蛋白与福氏不完全佐剂形成的乳化液免疫一次，共免疫5次，抗原用量与初次免疫相同。五免后3-5天进行心脏大量取血，置37℃1小时，然后放冰箱4℃过夜，隔天取血清。

1.3.2)多克隆抗体效价的测定：以Fepmlt融合蛋白为包被抗原，包被浓度为5μg/ml，每孔包被100μl，利用间接ELISA法检测血清抗体水平。实验组血清稀释倍数依次为：1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600、1：51200、1：102400、1：204800；ELISA板包被牛血清白蛋白作为阴性对照，用酶联检测仪测定OD450，满足P/N值＞2.1为阳性。结果显示2只兔子的血清抗体效价均达到1：102400，说明免疫效果较好。

1.3.3)多克隆抗体的提取：用GE-HiTrap Protein A HP预装柱，按说明书纯化抗体，具体操作如下：

1.3.3.4)用50倍体积Tris(10mM Tris-Cl，pH 8.0)对洗脱液进行透析。

1.3.3.5)超滤浓缩后，调整浓度为5mg/ml，-70℃保存备用。至此制得抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体。

实施例3

肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒

1.肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒组成

包被抗肺炎克雷伯菌ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ蛋白多克隆抗体的酶标板、抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体、肺炎克雷伯菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物和终止液共同组成肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒。

(1)包被抗肺炎克雷伯菌ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ蛋白多克隆抗体的酶标板

用PBS缓冲液将抗肺炎克雷伯菌ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ蛋白多克隆抗体(实施例1制备所得)稀释至浓度为10μg/mL，按100μL/孔的量包被96孔EIA高效结合酶标板(型号：康宁costar 2592)，37℃包被2小时。取出后用250μL洗涤液洗板三次，甩干。用含有1％BSA的洗涤液作为封闭液，250μL/孔加入酶标板，37℃封闭1小时。取出后用250μL洗涤液洗板3次，每次一分钟，甩干，干燥后密封保存。

其中，PBS缓冲液配方：磷酸氢二钠1.4g，磷酸二氢钠0.2g，氯化钠8.5g，pH7.4加去离子水至1000mL；洗涤液：含0.01％Tween-20的PBS水溶液，pH为7.4；封闭液：含1％BSA的洗涤液水溶液，pH为7.4。

(2)抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体

将如实施例2所述抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体用上述封闭液配制成20μg/mL的溶液，按每个试剂盒5mL的量封装。

(3)酶标二抗：酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，本实施例中其购自北京赛驰生物科技有限公司，产品编号030005-G，浓度为1mg/mL，使用时用PBS缓冲液稀释3000倍。按每个试剂盒0.1mL的量封装。

(4)酶显色底物：酶显色底物配置过程如下：

A液：(配置量1L)

1.称柠檬酸(含1分子结晶水，分子量210.14g)3.14g，醋酸钠(含3分子结晶水，分子量136.0)11.56g溶于970mL双蒸水，制成pH5.0的醋酸钠水溶液。

2.称非那西汀0.08g加入30mL双蒸水加热至100℃，溶解完全后加入第一步的溶液中。

3.再加入0.5g过氧化脲，混匀即可。

B液：(配置量1L)

往2L烧杯加入500mL甲醇，再加入1.27g 3，3，5，5-四甲基联苯胺TMB(SIGMA)，60℃加热溶解后，再加入500mL丙三醇即可。

使用前将A、B液1：1混合，配制成酶显色底物。将A液及B液按每个试剂盒各5mL的量封装。

(5)阳性和阴性对照

阳性对照为甲醛灭活的肺炎克雷伯菌(ATCC700603)，其制备方法如下：取巧克力液体培养基培养的肺炎克雷伯菌菌液，平板计数后离心收集菌体，用生理盐水重悬菌体并调整菌体浓度至1×10⁹CFU/mL。取5mL菌液，加入分析纯甲醛至终浓度为1％，4℃灭活过夜。12000g离心10分钟后弃去上清液，沉淀加入2mL PBS缓冲液重悬后即为阳性对照。

阴性对照：阴性对照为甲醛灭活的大肠埃希菌(ATCC 25922)，其制备方法如下：取LB液体培养基培养的大肠埃希菌菌体，平板计数后后离心收集菌体，用生理盐水重悬菌体并调整菌体浓度至1×10⁹CFU/mL。取5mL菌液，加入分析纯甲醛至终浓度为1％，4℃灭活过夜。12000g离心10分钟后弃去上清液，沉淀加入2mL PBS缓冲液重悬后即为阴性对照。

(6)洗涤液：为PBST液，具体配置方法如(1)内所述。按每个试剂盒200mL的量封装。

(7)终止液：用双蒸水配制的1M HCL溶液。按每个试剂盒10mL的量封装。

实施例4

肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒的使用方法

1)待检样本的处理

按常规方法获得待检者的咽拭子，将其插入装有500μL的洗涤液(PBST)的软质塑料管中，挤压塑料管壁，使拭子上的样品充分溶解。

2)加入对照和待检样本

取待检样本100μL加入相应的酶标孔，同时设阳性对照(100μL/孔)1孔，阴性对照(100μL/孔)3孔，37℃孵育1小时，后用250μL洗涤液洗板3次，甩干。

3)加入抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体

加入试剂盒中的抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体工作液，50μL/孔，37℃孵育1小时，后用250μL PBST洗涤液洗板3次，甩干。

4)加入酶标二抗：将实施例3所述试剂盒中的酶标二抗用PBS缓冲液做1:3000稀释，配制成工作液，按50μL/孔的量加入相应的酶标孔，37℃孵育1小时，后用250μL PBST洗涤液洗板3次，甩干。

5)加入酶显色底物：加入试剂盒中新鲜配制的酶显色底物，50μL/孔，显色15分钟。

6)加入终止液：每孔加入50μL终止液，终止反应。

7)测OD450nm值：酶标板置于酶标仪中测定OD450nm值。

8)结果判定：分别读取3孔阴性质控品及1孔阳性质控品样品的OD450nm值；3孔阴性质控品样品的OD450nm读数的平均值与3倍标准差之和即为CUT-OFF值；若上述人咽拭子样本的检测OD450nm值若大于CUT-OFF值即判断为此份临床咽拭子中肺炎克雷伯菌抗原为阳性，反之则判断为此份人咽拭子样本中肺炎克雷伯菌抗原为阴性；若阳性质控品样品的OD450nm值小于CUT-OFF值，则表明试剂盒失效。

实施例5

肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒的特异性和敏感性测定

1)特异性测定

为了验证本发明的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒的特异性，按照实施例3及实施例4所述试剂盒组成和方法对浓度均为2×10⁵CFU/mL的6株肺炎克雷伯菌菌株及17株非肺炎克雷伯菌标准菌株进行了检测，见表1。结果表明，本发明试剂盒对所有6株肺炎克雷伯菌菌株的检测结果均为阳性，而对其他17株呼吸道常见病原微生物的检测结果均为阴性。该试剂盒显示出良好的特异性。

表1

同时，对浓度为2×10⁵CFU/mL的120株肺炎克雷伯菌临床分离株用本检测试剂盒进行检测，结果均显示阳性，显示出该试检测试剂盒对临床分离的人肺炎克雷伯菌的高度检测覆盖性。

2)敏感性测定

将肺炎克雷伯菌ATCC700603菌株接种于羊血巧克力培养基，35℃培养24小时后，生理盐水10倍梯度稀释，同时平板计数，得到菌体浓度为10⁸-10²CFU/mL的菌体溶液，然后将100μL菌液滴加于酶标板，按照实施例3及实施例4所述试剂盒组成和方法将进行检测。结果表明本发明试剂盒的检测敏感性为10³CFU/mL。

序列表

<110> 湖北工业大学

<120> 基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒及制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1092

<212> DNA

<213> Abcglp的基因全序列(Abcglp)

<400> 1

catatggaaa tcgaaaaaag cggtactctg aaagttgcaa ccgaggacga ctatgcaccg 60

ttcaacttca tgaacaacgg ccaagctgac ggcttcaaca aagacatgct ggaagaactg 120

cgtaagtatg cgaaattcca tgtggaccaa agcatcctgc cgtggactgg cctgctggca 180

gccgtatcta ctggccagta cgacatggca ctgaccggcg cagttatcac cgacgaacgt 240

ctgaaagttt tcgacttcac tccgccgtgg gcatccgctc agcattactt cgttaaacgt 300

gcaggcgaca cctctctgaa cactattgca gacttgtccg gtaagaaagt tggcgtacag 360

gcaggtagcg ctctgctggc acgtctgccg gaactgaaag caatgctgga gaaaactggc 420

ggtaaattag gcccggtggt tgaatatccg tcttacccgg aagcatacgc tgacctggct 480

aacaaacgtc tggattatgt tatcaacgtt gttatctccg ttaacgacct ggcaaaagct 540

aaaccgaagg ttttcggtgg ttctggtggt tctggtggtt ctggtggttc tgaccgtctg 600

gttgtactgc acgatcatta cttggaccgt gttactgacg ttgctcagcg cttccctcag 660

cgtgcgcgca aagacggtcg tttttacgct atcgacttta ccctggatga aatcaaatct 720

ctcaaattca ctgaaggttt cgagcctaaa aacggcaaaa acgttcaaac ctatcctggt 780

cgtttcccga tgggtaaaag cgattttcgc atccacactt tcgaagagga aatcgaattc 840

gtacagggtc tcaaccactc tactggtaaa aacatcggta tctacccgga aatcaaagca 900

ccgtggttcc accaccagga aggtaaagac atcgctgctt ccaccctcaa agttctgaaa 960

gaatacggtt acacctctaa gcaggataaa gtgtacctgc agtgcttcga cgctaatgaa 1020

ctgaagcgta tcaaaaacga actggagccg aaaatgggca tggacctgaa cctggtacag 1080

ctgtaaggat cc 1092

<210> 2

<211> 360

<212> PRT

<213> Abcglp的蛋白序列(Abcglp)

<400> 2

Met Glu Ile Glu Lys Ser Gly Thr Leu Lys Val Ala Thr Glu Asp Asp

1 5 10 15

Tyr Ala Pro Phe Asn Phe Met Asn Asn Gly Gln Ala Asp Gly Phe Asn

20 25 30

Lys Asp Met Leu Glu Glu Leu Arg Lys Tyr Ala Lys Phe His Val Asp

35 40 45

Gln Ser Ile Leu Pro Trp Thr Gly Leu Leu Ala Ala Val Ser Thr Gly

50 55 60

Gln Tyr Asp Met Ala Leu Thr Gly Ala Val Ile Thr Asp Glu Arg Leu

65 70 75 80

Lys Val Phe Asp Phe Thr Pro Pro Trp Ala Ser Ala Gln His Tyr Phe

85 90 95

Val Lys Arg Ala Gly Asp Thr Ser Leu Asn Thr Ile Ala Asp Leu Ser

100 105 110

Gly Lys Lys Val Gly Val Gln Ala Gly Ser Ala Leu Leu Ala Arg Leu

115 120 125

Pro Glu Leu Lys Ala Met Leu Glu Lys Thr Gly Gly Lys Leu Gly Pro

130 135 140

Val Val Glu Tyr Pro Ser Tyr Pro Glu Ala Tyr Ala Asp Leu Ala Asn

145 150 155 160

Lys Arg Leu Asp Tyr Val Ile Asn Val Val Ile Ser Val Asn Asp Leu

165 170 175

Ala Lys Ala Lys Pro Lys Val Phe Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

180 185 190

Ser Gly Gly Ser Asp Arg Leu Val Val Leu His Asp His Tyr Leu Asp

195 200 205

Arg Val Thr Asp Val Ala Gln Arg Phe Pro Gln Arg Ala Arg Lys Asp

210 215 220

Gly Arg Phe Tyr Ala Ile Asp Phe Thr Leu Asp Glu Ile Lys Ser Leu

225 230 235 240

Lys Phe Thr Glu Gly Phe Glu Pro Lys Asn Gly Lys Asn Val Gln Thr

245 250 255

Tyr Pro Gly Arg Phe Pro Met Gly Lys Ser Asp Phe Arg Ile His Thr

260 265 270

Phe Glu Glu Glu Ile Glu Phe Val Gln Gly Leu Asn His Ser Thr Gly

275 280 285

Lys Asn Ile Gly Ile Tyr Pro Glu Ile Lys Ala Pro Trp Phe His His

290 295 300

Gln Glu Gly Lys Asp Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys Val Leu Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Gly Tyr Thr Ser Lys Gln Asp Lys Val Tyr Leu Gln Cys Phe Asp

325 330 335

Ala Asn Glu Leu Lys Arg Ile Lys Asn Glu Leu Glu Pro Lys Met Gly

340 345 350

Met Asp Leu Asn Leu Val Gln Leu

355 360

<210> 3

<211> 939

<212> DNA

<213> Fepmlt的基因全序列(Fepmlt)

<400> 3

catatgaacg attaccgtaa caaaatcgaa gcaggttacg ctccggttta ccagaacaac 60

aaaggtaccg acctgtacca gtgggagaac gttccgaaag cggtagtaga aggcctggaa 120

ggcactctga acgtcccagt ttccgagacc gtaaactgga ccaacaacat cacttacatg 180

ctgcagagca agaacaagga aacaggcgac cgcctgtcta tcatcccgga atataccctg 240

aactctactc tgagctggca ggtacgtgat gacgtatccc tgcagtctac cttcacctgg 300

tacggcaaac aggaaccgaa gaaatacaac tacaaaggcc agccggttac cggttctgaa 360

aaaaacgaag tatccccgta ctctatcctg ggtctgtccg caacatggga cgttactaag 420

tatgtctctc tgaccggtgg cgtagaagct gctgctgcta aagaagctgc tgctgctaaa 480

ctggactctc cggtagacat ctcccagctg gcagacatgg ctggtatgcc ggtatccaaa 540

ctgaagacct tcaacgcagg tgttaagggc tccactctgg gcgcatctgg tccgaaatac 600

gtaatggtac cgcagaaaca cgcagctcag ctgcgtgaat ccctggcatc tggcgatatc 660

gcagctgtac agccgaccca gctggctgac aacactcccc tgacctctcg ttcctacaaa 720

gtacgcagcg gcgatactat ctctggtatt gcttcccgcc tgggcgtgac tactcgtgac 780

ctccagcagt ggaacaacct gcgtggctct ggtctgaaag ttggccagaa cctggtgatc 840

ggtgctggct ccagcgcaca gcgtctggcc aacaactctg attctatcac ataccgcgta 900

cgtaagggtg actctctgtc ctctatcgct taaggatcc 939

<210> 4

<211> 309

<212> PRT

<213> Fepmlt的蛋白序列(Fepmlt)

<400> 4

Met Asn Asp Tyr Arg Asn Lys Ile Glu Ala Gly Tyr Ala Pro Val Tyr

1 5 10 15

Gln Asn Asn Lys Gly Thr Asp Leu Tyr Gln Trp Glu Asn Val Pro Lys

20 25 30

Ala Val Val Glu Gly Leu Glu Gly Thr Leu Asn Val Pro Val Ser Glu

35 40 45

Thr Val Asn Trp Thr Asn Asn Ile Thr Tyr Met Leu Gln Ser Lys Asn

50 55 60

Lys Glu Thr Gly Asp Arg Leu Ser Ile Ile Pro Glu Tyr Thr Leu Asn

65 70 75 80

Ser Thr Leu Ser Trp Gln Val Arg Asp Asp Val Ser Leu Gln Ser Thr

85 90 95

Phe Thr Trp Tyr Gly Lys Gln Glu Pro Lys Lys Tyr Asn Tyr Lys Gly

100 105 110

Gln Pro Val Thr Gly Ser Glu Lys Asn Glu Val Ser Pro Tyr Ser Ile

115 120 125

Leu Gly Leu Ser Ala Thr Trp Asp Val Thr Lys Tyr Val Ser Leu Thr

130 135 140

Gly Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala Lys Leu

145 150 155 160

Asp Ser Pro Val Asp Ile Ser Gln Leu Ala Asp Met Ala Gly Met Pro

165 170 175

Val Ser Lys Leu Lys Thr Phe Asn Ala Gly Val Lys Gly Ser Thr Leu

180 185 190

Gly Ala Ser Gly Pro Lys Tyr Val Met Val Pro Gln Lys His Ala Ala

195 200 205

Gln Leu Arg Glu Ser Leu Ala Ser Gly Asp Ile Ala Ala Val Gln Pro

210 215 220

Thr Gln Leu Ala Asp Asn Thr Pro Leu Thr Ser Arg Ser Tyr Lys Val

225 230 235 240

Arg Ser Gly Asp Thr Ile Ser Gly Ile Ala Ser Arg Leu Gly Val Thr

245 250 255

Thr Arg Asp Leu Gln Gln Trp Asn Asn Leu Arg Gly Ser Gly Leu Lys

260 265 270

Val Gly Gln Asn Leu Val Ile Gly Ala Gly Ser Ser Ala Gln Arg Leu

275 280 285

Ala Asn Asn Ser Asp Ser Ile Thr Tyr Arg Val Arg Lys Gly Asp Ser

290 295 300

Leu Ser Ser Ile Ala

305

Claims

1.一种肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ)，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transportersubstrate-binding protein receptor及GlpQ)的蛋白质序列是：

用于编码肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ)的蛋白质的基因全序列是：

CATATGGAAATCGAAAAAAGCGGTACTCTGAAAGTTGCAACCGAGGACGACTATGCACCGTTCAACTTCATGAACAACGGCCAAGCTGACGGCTTCAACAAAGACATGCTGGAAGAACTGCGTAAGTATGCGAAATTCCATGTGGACCAAAGCATCCTGCCGTGGACTGGCCTGCTGGCAGCCGTATCTACTGGCCAGTACGACATGGCACTGACCGGCGCAGTTATCACCGACGAACGTCTGAAAGTTTTCGACTTCACTCCGCCGTGGGCATCCGCTCAGCATTACTTCGTTAAACGTGCAGGCGACACCTCTCTGAACACTATTGCAGACTTGTCCGGTAAGAAAGTTGGCGTACAGGCAGGTAGCGCTCTGCTGGCACGTCTGCCGGAACTGAAAGCAATGCTGGAGAAAACTGGCGGTAAATTAGGCCCGGTGGTTGAATATCCGTCTTACCCGGAAGCATACGCTGACCTGGCTAACAAACGTCTGGATTATGTTATCAACGTTGTTATCTCCGTTAACGACCTGGCAAAAGCTAAACCGAAGGTTTTCGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGACCGTCTGGTTGTACTGCACGATCATTACTTGGACCGTGTTACTGACGTTGCTCAGCGCTTCCCTCAGCGTGCGCGCAAAGACGGTCGTTTTTACGCTATCGACTTTACCCTGGATGAAATCAAATCTCTCAAATTCACTGAAGGTTTCGAGCCTAAAAACGGCAAAAACGTTCAAACCTATCCTGGTCGTTTCCCGATGGGTAAAAGCGATTTTCGCATCCACACTTTCGAAGAGGAAATCGAATTCGTACAGGGTCTCAACCACTCTACTGGTAAAAACATCGGTATCTACCCGGAAATCAAAGCACCGTGGTTCCACCACCAGGAAGGTAAAGACATCGCTGCTTCCACCCTCAAAGTTCTGAAAGAATACGGTTACACCTCTAAGCAGGATAAAGTGTACCTGCAGTGCTTCGACGCTAATGAACTGAAGCGTATCAAAAACGAACTGGAGCCGAAAATGGGCATGGACCTGAACCTGGTACAGCTGTAAGGATCC。

2.一种用于制备如权利要求1所述的肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transportersubstrate-binding protein receptor及GlpQ)的方法，其特征在于：所述制备方法是：

分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及表面蛋白GlpQ胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述肺炎克雷伯菌表面蛋白ABC transporter substrate-binding protein receptor及表面蛋白GlpQ在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_009653190及WP_004214637；所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Abcglp；

所述Abcglp的基因全序列是：

所述Abcglp基因编码的蛋白质序列是：

将Abcglp的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，转入E.coliBL21(DE3)菌中，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni²⁺亲和层析法纯化重组His-Abcglp蛋白。

3.一种用于制备抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-bindingprotein receptor及GlpQ)多克隆抗体的方法，其特征在于：所述方法是将如权利要求2所述的重组His-Abcglp蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)多克隆抗体。

4.一种肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)的蛋白质序列是：

用于编码所述肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)的蛋白质的基因全序列是：

CATATGAACGATTACCGTAACAAAATCGAAGCAGGTTACGCTCCGGTTTACCAGAACAACAAAGGTACCGACCTGTACCAGTGGGAGAACGTTCCGAAAGCGGTAGTAGAAGGCCTGGAAGGCACTCTGAACGTCCCAGTTTCCGAGACCGTAAACTGGACCAACAACATCACTTACATGCTGCAGAGCAAGAACAAGGAAACAGGCGACCGCCTGTCTATCATCCCGGAATATACCCTGAACTCTACTCTGAGCTGGCAGGTACGTGATGACGTATCCCTGCAGTCTACCTTCACCTGGTACGGCAAACAGGAACCGAAGAAATACAACTACAAAGGCCAGCCGGTTACCGGTTCTGAAAAAAACGAAGTATCCCCGTACTCTATCCTGGGTCTGTCCGCAACATGGGACGTTACTAAGTATGTCTCTCTGACCGGTGGCGTAGAAGCTGCTGCTGCTAAAGAAGCTGCTGCTGCTAAACTGGACTCTCCGGTAGACATCTCCCAGCTGGCAGACATGGCTGGTATGCCGGTATCCAAACTGAAGACCTTCAACGCAGGTGTTAAGGGCTCCACTCTGGGCGCATCTGGTCCGAAATACGTAATGGTACCGCAGAAACACGCAGCTCAGCTGCGTGAATCCCTGGCATCTGGCGATATCGCAGCTGTACAGCCGACCCAGCTGGCTGACAACACTCCCCTGACCTCTCGTTCCTACAAAGTACGCAGCGGCGATACTATCTCTGGTATTGCTTCCCGCCTGGGCGTGACTACTCGTGACCTCCAGCAGTGGAACAACCTGCGTGGCTCTGGTCTGAAAGTTGGCCAGAACCTGGTGATCGGTGCTGGCTCCAGCGCACAGCGTCTGGCCAACAACTCTGATTCTATCACATACCGCGTACGTAAGGGTGACTCTCTGTCCTCTATCGCTTAAGGATCC。

5.一种用于制备如权利要求4所述的肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)的方法，其特征在于：所述方法是：

分别获取肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA及表面蛋白MltD胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列，优化肽段基因编码序列，并将优化后的肽段基因编码序列用刚性连接肽的编码序列进行连接，形成融合基因；所述肺炎克雷伯菌表面蛋白FepA及表面蛋白MltD在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为WP_012068422及WP_004210407；所述刚性连接肽的序列是eaaakeaaak；同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列，记为Fepmlt；

所述Fepmlt的基因全序列是：

所述Fepmlt基因编码的蛋白质序列是：

将Fepmlt的基因全序列按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，转入E.coliBL21(DE3)菌中，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni²⁺亲和层析法纯化重组His-Fepmlt蛋白。

6.一种用于制备抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)多克隆抗体的方法，其特征在于：所述方法是将如权利要求5所述的重组His-Fepmlt蛋白作为免疫抗原，与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔，抽血进行效价测定，分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化，最终获得抗肺炎克雷伯菌FepA及MltD蛋白多克隆抗体，用封闭液稀释至终浓度为20μg/mL；所述封闭液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L，牛血清白蛋白10g/L，所述封闭液的pH是7.4。

7.一种基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒，其特征在于：所述基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒包括包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板、抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)多克隆抗体、肺炎克雷伯菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液；所述肺炎克雷伯菌阳性对照是灭活的肺炎克雷伯菌菌液；所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液；所述洗涤液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L，Tween-20 0.5mL/L，所述洗涤液的pH＝7.4；所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG；所述酶显色底物是TMB显色液；所述终止液是1M HCL溶液。

8.一种基于权利要求7所述的肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述基于肺炎克雷伯菌表面蛋白抗体的肺炎克雷伯菌Elisa检测试剂盒包括包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding protein receptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板、抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(FepA及MltD)多克隆抗体、肺炎克雷伯菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物以及终止液；所述肺炎克雷伯菌阳性对照是灭活的肺炎克雷伯菌菌液；所述阴性对照是灭活的大肠杆菌菌液；所述洗涤液的组分及含量是：磷酸氢二钠1.4g/L，磷酸二氢钠0.2g/L，氯化钠8.5g/L，Tween-200.5mL/L，所述洗涤液的pH＝7.4；所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG；所述酶显色底物是TMB显色液；所述终止液是1M HCL溶液；

所述包被抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ)的多克隆抗体的酶标板的制备方法是：

1)制备抗肺炎克雷伯菌表面蛋白(ABC transporter substrate-binding proteinreceptor及GlpQ)多克隆抗体；