JP2015529677A - ワクチンとしてのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、哺乳動物におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を防止または処置するための方法、タンパク質、核酸および抗体を提供する。ポリペプチドは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから同定された。本発明は、配列番号７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３および４６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。

Description

本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に由来するポリペプチドに関し、特に、これを使用してＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を処置および防止するための方法に関する。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、グラム陽性細菌、桿状細菌、嫌気性の胞子形成細菌である。初めて完全に配列決定されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅゲノムは、２００６年に発表され［１］、３７７６個の予測されるコード配列が同定された。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、疾患の徴候を生じることなく母集団の３％で存在することが推定される、腸管内菌叢の正常な構成成分である。腸管内菌叢の自然な均衡が撹乱される状況において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、より蔓延することができる。この異常繁殖は、細菌に、クオラムシグナル伝達調節因子の制御下における毒素の産生を開始させる。腸管内菌叢の自然な均衡に対する破壊の最多原因は、一部の腸内細菌に有害であるがＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに影響を与えない抗生物質の投与である。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、抗生物質関連下痢（ＡＡＤ）の主因であるが、その症状は生命に関わる偽膜性結腸炎に及び得る。感染の最高罹患率は、高齢入院患者において見られるが、感染は、青年期や妊婦等の非典型群において増加している［２］。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染したもののうち１２％〜３５％の間が、２ヶ月以内に再発することが観察された［３］。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、１９７０年代に単にＡＡＤの原因病原体として同定された。それ以来、感染に対抗するための多数の戦略が試みられてきた。バンコマイシン、メトロニダゾール、ニタゾキサニド（ｎｉｔａｚｏｘａｎａｍｉｄｅ）、バシトラシンまたはフシジン酸などの特異的な抗生物質は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の処置に最初に使用され、今日まで利用され続けている（参考文献４、５および６を参照）。ただし、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよび同様に他の腸内細菌が時間と共に抵抗性となるリスクのため、これらの抗生物質による広範な処置は支持されていない。近年、細菌によって分泌されるトキソイドに基づくワクチンによる処置およびかかる毒素を標的とする受動免疫療法が適応された（参考文献７および８）。アジュバントありおよびなしのトキソイドワクチンは、このワクチンの第３の用量後の９週間の期間における反復性ＣＤＩの防止における有効性を決定するために、１８〜８５歳の患者において第ＩＩ相治験が行われている。トキソイドワクチンは、典型的に、免疫応答を誘発するために反復投与およびアジュバントを必要とする。さらに、それらの投与は、高頻度で注射部位免疫反応を伴う。しかし、毒素に基づくワクチンは、毒素結合を防止し、炎症効果を中和することしかできない。かかるワクチンは一般に、完全にコロニー形成を防止することができない、または現存する病原体を身体から除くことができない。例えば、胞子は残存する可能性があり、関連症状を伴うさらなる感染または感染の再発性の可能性が高いことを意味する。

Ｓｅｂａｉｈｉａ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３８：７７９−７８６． Ｒｕｐｎｉｋ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７：５２６−５３６． Ｂａｒｂｕｔ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３８：２３８６−２３８８． Ｄｚｉｎｋ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ （１９８０） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １７：６９５−６９８． Ｍｕｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５９：７０５−７１０． Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ａｒｃｈ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． １４６：１１０１−１１０４． Ｋｉｎｋ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ （１９９８） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６６：２０１８−２０２５． Ａｂｏｕｄｏｌａ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７１：１６０８−１６１０．

よって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を処置または防止するための改善された組成物および方法の必要がある。特に、ワクチン構成成分として有用であり、ワクチン接種した対象におけるコロニー形成（胞子を含む）の限定または排除に使用することができ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ伝播をさらに防止するポリペプチドの必要がある。本発明の目的は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患を防止および／または処置するためのワクチンの開発における使用のための、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する免疫応答の発生において有効なポリペプチドおよび組成物を提供することである。

本発明は、配列番号７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３および４６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅから同定された。特に、本発明のポリペプチドは、免疫原性であり、免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物における使用に適している。

図１は、内部名、遺伝子識別子（ＧＩ）、遺伝子座タグ、アミノ酸配列長（ＡＡ）、ポリペプチドが本来単離された株の同一性、各ポリペプチドに相当する配列番号、クローニングされたポリペプチドおよび様々なプライマーの配列番号を含む、選択されたポリペプチドのそれぞれに関する概要情報を提示する図である。

図２は、セクレトーム、ＮＭＲおよび共焦点顕微鏡実験の結果を要約する図である。

図３は、ＮＭＲ解析において使用したプロセスの模式図を提示する図である。

図４は、Ｄｉｆｆ４４の１５Ｎ−ＨＳＣＱスペクトルを示す図である。

図５は、ウエスタンブロットによる表面露出試験の結果を実証する図である。

図６は、Ｄｉｆ２３２の代表的なＦＡＣＳデータを提示する図である。

図７は、細胞結合実験に関するデータの概要を提示する図である。ＦＡＣＳ解析によるヒトベロ細胞におけるならびに共焦点顕微鏡によるヒトベロ細胞およびＣａｃｏ−２細胞における、組換えポリペプチドの結合アッセイ。

図８は、抗Ｄｉｆ１９２および抗Ｄｉｆ４４抗体を使用した、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ参照株（６３０、Ｒ２０２９１およびＭ１２０）および異なるＰＣＲリボタイプを表す臨床単離株の総細胞抽出物のウエスタンブロット解析を示す図である。Ｄｉｆ１９２成熟型は、６４７ａａおよび７１．１ｋＤａである。Ｄｉｆ４４成熟型は、２８６ａａおよび３１ｋＤａである。

図９は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイに関する結果の概要を提示する図である。

図１０は、（Ａ）毒素ＡおよびＢの組合せをワクチン接種しＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６３０株またはＢ１株を負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）したハムスター由来の血清による、（Ｂ）感染していないハムスター由来の血清による、ウエスタンブロットによるハムスター由来の血清によるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ組換えポリペプチド（１００ｎｇ）の認識を示す図である。

図１１は、ヒト血清抗体によるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ組換えポリペプチドの認識を示す図である。

図１２は、ヒト血清抗体によるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ組換えポリペプチドの認識を示す図である。 図１２は、ヒト血清抗体によるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ組換えポリペプチドの認識を示す図である。

図１３は、ヒト血清抗体によるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ組換えポリペプチドの認識を示す図である。 図１３は、ヒト血清抗体によるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ組換えポリペプチドの認識を示す図である。

図１４は、マウス血清抗体によるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ組換えポリペプチドの認識を示す図である。濃縮上清（５）Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）で免疫化したマウスの血清を使用した、組換えタンパク質におけるイムノブロッティング。

図１５は、Ｄｉｆ１５３と炭疽菌致死因子のＣ末端（残基５８９〜８１０）との間のアライメントを示す図である。Ｄｉｆ１５３は、炭疽菌致死因子のＣ末端と相同である。ＰＡとの相互作用に必要なＮ末端ドメインは失われている。触媒部位（ＨＥＸＸＨ）は保存されている。

図１６は、亜鉛の存在下におけるＤｉｆ１５３の弱いゼラチナーゼ／コラゲナーゼ活性を示す蛍光定量的アッセイを示す図である。

図１７は、減少量の組換えＤｉｆ１５３を同量の所望の基質（コラーゲンＩ〜ＶＩ、フィブロネクチン）と共にインキュベートしたことを示す図である。０．５ｍＭ ＺｎＣｌ２の存在下、３７℃で１６時間反応を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためにゲルに反応産物をロードし、続いて銀またはクーマシーで染色した。

図１８は、Ｄｉｆ１８３がＧｅｒＭＮドメインを含有することを示す図である。

図１９は、（Ａ）抗Ｄｉｆ１８３血清を使用した株６３０細胞画分におけるウエスタンブロット解析；（Ｂ）株６３０栄養細胞における免疫蛍光解析を示す図である。 図１９は、（Ａ）抗Ｄｉｆ１８３血清を使用した株６３０細胞画分におけるウエスタンブロット解析；（Ｂ）株６３０栄養細胞における免疫蛍光解析を示す図である。

図２０は、ウエスタンブロッティングによる培養上清画分におけるＤｉｆ１８３の存在の解析を示す図である。

図２１は、Ｄｉｆ１８３欠失突然変異体が胞子形成／発芽表現型を有することを示す図である。

図２２は、好ましいＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ組換え毒素断片の略図である。ＥＤ＝酵素ドメイン；ＧＴ＝グルコシルトランスフェラーゼドメイン；ＣＰ＝システイン（ｃｙｓｔｅｎｉｎｅ）プロテアーゼドメイン；Ｔ＝転座ドメイン；Ｂ＝結合ドメイン。不溶性であるＴｃｄＡのＴ４およびＰＴＡ２ドメインを除いて、全ドメインは可溶性である。

図２３は、Ｄｉｆ４４またはＤｉｆ２０８による毒素断片抗原の投与と、その後のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６３０負荷後の、ワクチン接種した動物の体温変動を示す図である。

図２４は、Ｄｉｆ４４またはＤｉｆ２０８と組み合わせた毒素断片抗原をワクチン接種した動物における、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ負荷後に収集した糞便ペレットにおいて観察されるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの数（ＣＰＵ／１００ｍｇ）を示す図である。

図２５は、Ｄｉｆ４４またはＤｉｆ２０８と組み合わせた毒素断片抗原をワクチン接種し、その後Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６３０負荷に供した動物の実験エンドポイントにおける、盲腸の内腔（Ｃａｅ−ＬＡ）、結腸の内腔（Ｃｏｌ−ＬＡ）、盲腸の組織（Ｃａｅ−ＴＡ）および結腸の組織（Ｃｏｌ−ＴＡ）におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの数を示す図である。

図２６は、全ワクチン接種群の実験エンドポイント（負荷後１４日目）において単離したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの総数を示す図である。

図２７は、実験エンドポイントにおける腸管試料における毒素力価を示す図である。

図２８は、実施例１５のハムスター１〜５由来の（Ａ）血清または（Ｂ）結腸および盲腸（ｃａｅｕｍ）洗浄液による組換えＴｏｘＡｐ５＿６、ＴｏｘＢ＿ＧＴおよびＤｉｆ４４の認識を示す図である。

図２９は、実施例１５のハムスター６〜１０由来の（Ａ）血清または（Ｂ）結腸および盲腸洗浄液による組換えＴｏｘＡｐ５＿６、ＴｏｘＢ＿ＧＴおよびＤｉｆ２０８の認識を示す図である。

図３０は、実施例１５のハムスター１〜５由来の血清による様々な細胞壁タンパク質（ｃｗｐ）の認識を示す図である。

一実施形態において、本発明のポリペプチドは、後述と共に図１に要約されている。

Ｄｉｆ４４：このタンパク質は、「ＣＤ０８４４」としても公知であり、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の細胞表面タンパク質ｃｗｐ２５としてアノテートされる。ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７８および１３８ならびに配列番号７９および１３９に提示されている配列に相当する。

Ｄｉｆ５１：このタンパク質は、「ＣＤ０９９９」としても公知であり、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質リポタンパク質としてアノテートされる。ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号８０および１４０ならびに配列番号８１および１４１に提示されている配列に相当する。Ｎ末端システインが欠失されたポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３５６および３５７に提示されている配列に相当する。

Ｄｉｆ１３０：このタンパク質は、「ＣＤ２６４５」としても公知であり、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の推定細胞外溶質結合タンパク質としてアノテートされる。ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９２および１５２ならびに配列番号９３および１５３に提示されている。Ｎ末端システインが欠失されたポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３５８および３５９に提示されている配列に相当する。

Ｄｉｆ１５３：このタンパク質は、ＣＤ２８３０としても公知であり、２２０アミノ酸の仮定上のタンパク質としてアノテートされる。ＢＬＡＳＴ解析は、亜鉛メタロペプチダーゼのファミリーである炭疽菌致死因子タンパク質に対し相同性を示した。特に、Ｄｉｆ１５３は、炭疽菌致死因子のＣ末端ドメインに対し相同性を示す。防御抗原との相互作用に必要な炭疽菌のＮ末端ドメインは失われている。触媒部位（ＨＥＸＸＨ）は保存されている（図１７）。ポリペプチドの核酸配列および／またはアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２９９、３２１および４３４ならびに配列番号３００、３２２および４３５に提示されている配列を含む。ＢＬＡＳＴ解析は、亜鉛メタロペプチダーゼのファミリーである炭疽菌致死因子タンパク質に対し相同性を示した。特に、Ｄｉｆ１５３は、炭疽菌致死因子のＣ末端ドメインに対し相同性を示す。防御抗原との相互作用に必要な炭疽菌のＮ末端ドメインは、失われている。触媒部位（ＨＥＸＸＨ）は保存されている（図１５）。Ｄｉｆ１５３の解毒は、このポリペプチドのアミノ酸配列またはコード核酸配列に変異導入することにより達成することができ、プロテアーゼ活性を低下させるジンチン（ｚｉｎｃｉｎ）メタロプロテアーゼドメインの全体または一部の欠失およびジンチンメタロプロテアーゼドメインにおける点突然変異を含む。Ｄｉｆ１５３（ＣＤ２８３０）の単一突然変異の例は、Ｈ１４２Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｅ１４３Ｒ、Ｈ１４６Ａ、Ｄ１４９Ａ、Ｈ１５０Ａ、Ｙ１７８ＦおよびＣ２０８Ｓである。Ｄｉｆ１５３（ＣＤ２８３０）の二重突然変異体の例は、配列番号３００および４３５の野生型ＣＴ１５３（ＣＤ２８３０）ポリペプチド配列に対する、Ｈ１４２Ａ／Ｈ１４６Ａ；Ｈ１４２Ａ／Ｙ１７８Ｆ；Ｈ１４２Ａ／Ｅ１４３Ｒ；Ｈ１４２Ａ／Ｅ１４３Ａ；Ｅ１４２Ａ／Ｙ１７８Ｆである。本発明は、また、ＣＴ１５３（ＣＤ２８３０）ポリペプチドの他の突然変異体を単独で、または組み合わせて提供する：Ｈ１４２Ａ／Ｈ１５０ＡおよびＥ１４３Ａ／Ｄ１４９Ａ。前述の解毒された免疫原性ポリペプチドは、好ましくは、配列番号３００および４３５の少なくとも１種のエピトープまたは免疫原性断片を保持する。これらの突然変異体に関する核酸配列およびアミノ酸配列は、表１に要約されている。

Ｄｉｆ１８３：このタンパク質は、「ＣＤ３６６９」としても公知であり、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の仮定上のタンパク質としてアノテートされる。Ｃ末端は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて胞子形成および発芽の両方に関係付けられたＧｅｒＭＮドメインを１コピー含有する（図２０）。ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８６、１８８、１８７および１８９に提示されている。Ｎ末端システインが欠失されたポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３５９および３６０に提示されている配列に相当する。

Ｄｉｆ１９２：このタンパク質は、「ＣＤ１０３５」としても公知であり、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の細胞表面タンパク質（推定Ｎアセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）ｃｗｐ１６としてアノテートされる。ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０４および１６４ならびに配列番号１０５および１６５に提示されている。

Ｄｉｆ２０８：このタンパク質は、「ＣＤ２８３１」としても公知であり、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のコラーゲン結合タンパク質ソルターゼ基質としてアノテートされる。ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３２および４３２ならびに配列番号１３３および４３３に提示されている。断片Ｄｉｆ２０８Ａは、Ｄｉｆ２０８のアミノ酸３２〜４８０に相当する。ポリペプチドＤｉｆ２０８Ａの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１０および１７０ならびに配列番号１１１および１７１に提示されている。断片Ｄｉｆ２０８Ｂは、Ｄｉｆ２０８のアミノ酸４８１〜９３８に相当する。ポリペプチドＤｉｆ２０８Ｂの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１２および１７２ならびに配列番号１１３および１７３に提示されている。

Ｄｉｆ２３２：このタンパク質は、「ＣＤ１０３１」としても公知であり、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の細胞壁アンカータンパク質としてアノテートされる。ポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２４および１８４ならびに配列番号１２５および１８５に提示されている。

本発明の特に好ましいポリペプチドは、Ｄｉｆ４４およびＤｉｆ２０８である。これらのポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成を低下させることが示されており、免疫療法組成物において特に使用される。

一般に、本発明のポリペプチドは、特に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの分野に関する薬および治療法、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患（ＣＤＡＤ）に対する受動免疫化における使用のためのポリペプチドである。本発明は、また、医薬の製造におけるかかるポリペプチドの使用を提供する。

特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、哺乳動物におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の防止、処置または重症度低下における使用のためのポリペプチドである。一部の実施形態において、本発明は、また、医薬の製造におけるかかる組成物の使用を提供する。

本発明および上述のポリペプチド、特に、Ｄｉｆ４４およびＤｉｆ２０８は、驚くべきことに、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて検査した際に（実施例１５）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成を低下させることが示された。これは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染における最も顕著な臨床的問題の１つである、胞子誘導疾患再発の防止に特に関連する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する保護効果をもたらす実験ワクチンが、本発明および上述のポリペプチド、特に、Ｄｉｆ４４およびＤｉｆ２０８を含む抗原の組合せと同じ程度まで、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成を低下させると以前に示されたことはない。

本発明者らは、Ｄｉｆ４４またはＤｉｆ２０８のいずれかと組み合わせた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対し保護効果を誘発する抗原の組合せを対象に投与し、その後にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを負荷した場合、腸管コロニー形成の低下が観察されることを示した。この効果は、負荷後の様々な時点において糞便に排出するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの量、または実験エンドポイントにおける腸管洗浄液もしくは組織から回収されるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの量の観点から考慮される。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する保護効果を誘発する抗原の組合せを投与し、その後にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを負荷した対象と比較して、腸管コロニー形成は、Ｄｉｆ４４またはＤｉｆ２０８のいずれかと組み合わせた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対し保護効果を誘発する抗原の組合せを投与され、その後にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを負荷した対象において低下する。

よって、本発明および上述のポリペプチド、特に、Ｄｉｆ４４およびＤｉｆ２０８は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止または重症度低下において、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下において特に使用される。「低下」は、パラメータの減少、好ましくは、統計的に有意な減少を引き起こすことを意味する。よって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の低下は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対象を曝露した後の特定の時点における、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対象を曝露した１、２、３、４、５、６、７日後、数週間後または数月後に、対象の腸管に存在するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌の数の減少を引き起こすことを指す。低下は、例えば、本発明のポリペプチド、組成物またはワクチンを投与されていない対象と比較した、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対し保護効果を誘発する組成物（好ましくは、Ｄｉｆ４４、Ｄｉｆ５１、Ｄｉｆ１３０、Ｄｉｆ１５３、Ｄｉｆ１８３、Ｄｉｆ１９２、Ｄｉｆ２０８、Ｄｉｆ２０８ＡおよびＤｉｆ２３２のうち１種または複数を含有しない、特に、ＤＩＦ４４またはＤＩＦ２０８を含有しない）を投与された対象と比較した、および／またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対し保護効果を誘発するいかなる組成物も投与されていない対象と比較したものである。低下は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％となり得る。

よって、本発明のポリペプチドは、例えば、本明細書に言及されている免疫原性組成物、ワクチンおよび医学的方法において使用することができるが、好ましくはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対し、またはＣＤＡＤに対し保護効果をもたらす、１種または複数の追加的な抗原と組み合わせて使用される場合に特に有用である。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅまたはＣＤＡＤに対する保護効果は、関連する化合物（例えば、抗原または抗原の組合せ）の投与が、その後の感染または疾患の見込み、持続時間または重症度を防止および／または減少させる場合に観察される。これは、当該技術分野において周知の方法、例えば、関連する化合物を対象に投与し、対象にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを負荷する方法の使用に関して検査することができる。負荷の効果は、例えば、負荷を生き延びる動物のパーセンテージの観点から観察され、この値は、適切な対照、例えば、いずれかの化合物または保護効果を生じるいずれかの化合物の投与の非存在下において使用して得られる値と比較することができる。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅまたはＣＤＡＤに対し保護効果をもたらすＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原の例は、例えば、ＷＯ２０１３／０８４０７１に開示されているものであり、その内容は、本明細書中に参照として組み込まれる。よって、ＷＯ２０１３／０８４０７１に記載されているアッセイなどのアッセイを使用して、所定の化合物がかかる保護効果を有するか決定することができる。特に、全長Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＴｏｘＢ抗原と組み合わせた全長Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＴｏｘＡ（またはＴｃｄＡ）抗原は、ゴールドスタンダードであると考えられ、よって、保護効果の陽性対照として機能することができる。よって、保護効果をもたらす抗原は、このゴールドスタンダードの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５または１００％と同じほどに有効である。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅまたはＣＤＡＤに対し保護効果をもたらす好ましいＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原およびこれらの組合せは、ＷＯ２０１３／０８４０７１に開示されている。これらの抗原は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素抗原とも称される。本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、１種または複数の追加的な抗原、好ましくは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅまたはＣＤＡＤに対し保護効果をもたらす抗原をさらに含む。より好ましくは、追加的な抗原は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素抗原である。本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、（ａ）少なくとも１種のＴｏｘＢ−ＧＴ抗原および（ｂ）少なくとも１種のＴｃｄＡ抗原をさらに含む。好ましくは、ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原および／またはＴｃｄＡ抗原は、解毒されている。

よって、本発明の好ましい免疫原性組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原の組合せを含み、前記組合せは、（ａ）Ｄｉｆ４４、Ｄｉｆ５１、Ｄｉｆ１３０、Ｄｉｆ１５３、Ｄｉｆ１８３、Ｄｉｆ１９２、Ｄｉｆ２０８、Ｄｉｆ２０８ＡおよびＤｉｆ２３２からなる群から選択される１種または複数のポリペプチド、（ｂ）少なくとも１種のＴｏｘＢ−ＧＴ抗原および（ｃ）少なくとも１種のＴｃｄＡ抗原を含み、好ましくは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原の組合せを含み、前記組合せは、（ａ）Ｄｉｆ４４およびＤｉｆ２０８からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチド、（ｂ）少なくとも１種のＴｏｘＢ−ＧＴ抗原および（ｃ）少なくとも１種のＴｃｄＡ抗原を含む。本明細書に使用されている「組合せ」は、抗原の二価、三価または多価の組合せを意味する。組合せは、好ましくは、防御応答を誘発、および／またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成を処置、防止もしくは低下させることができる。組合せが使用される場合、個々の構成成分は、順次、同時にまたは個別に投与することができる。

一部の実施形態において、ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原は、（ａ）配列番号１８もしくは配列番号６０に対し８０％以上の同一性を有する、および／またはｂ）配列番号１８もしくは配列番号６０の、または配列番号１８もしくは配列番号６０に対し８０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片であり、配列番号１８もしくは配列番号６０のエピトープを含むアミノ酸配列を含む、これから本質的になるまたはこれからなるポリペプチドである。好ましくは、ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原は、配列番号１８を含む、これから本質的になるまたはこれからなる。

一部の実施形態において、ＴｃｄＡ抗原は、（ａ）配列番号１に対し８０％以上の同一性を有する、および／またはｂ）配列番号１の、または配列番号１に対し８０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片であり、配列番号１のエピトープを含むアミノ酸配列を含むまたはこれからなるポリペプチドである。

ある特定の実施形態において、免疫原性組成物は、ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５種以上のＴｃｄＡ抗原、例えば、１〜１０、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜９、３〜８、４〜７、５〜６種のＴｃｄＡ抗原とを含むまたはこれをさらに含むであろう。好ましくは、１種または複数のＴｃｄＡ抗原は、（１）ＴｏｘＡ−ＥＤ抗原（配列番号３）、（２）ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原（配列番号４）、（３）ＴｏｘＡ−ＣＰ抗原（配列番号５）、（４）ＴｏｘＡ−Ｔ抗原（配列番号６）、（５）ＴｏｘＡ−Ｔ４抗原（配列番号７）、（６）ＴｏｘＡ−Ｂ抗原（配列番号８）、（７）ＴｏｘＡ−ＰＴＡ２抗原（配列番号９）、（８）ＴｏｘＡ−Ｐ５−７抗原（配列番号１０）、（９）ＴｏｘＡ−Ｐ５−６抗原（配列番号１１）、（１０）ＴｏｘＡ−Ｐ９−１０抗原（配列番号１２）、（１１）ＴｏｘＡ−Ｂ２抗原（配列番号１３）、（１２）ＴｏｘＡ−Ｂ３抗原（配列番号１４）、（１３）ＴｏｘＡ−Ｂ５抗原（配列番号１５）、（１４）ＴｏｘＡ−Ｂ６抗原（配列番号１６）または全長ＴｃｄＡ抗原（配列番号１）から選択される。より好ましくは、ＴｃｄＡ抗原は、配列番号１１を含む、これから本質的になるまたはこれからなるＴｏｘＡ−Ｐ５−６抗原である。本明細書の他の箇所で考察している通り、１種または複数のＴｃｄＡ抗原は、好ましくは、（ａ）これらの配列に対し８０％以上の同一性を有する、および／または（ｂ）これらの配列のうち１種もしくは複数の、またはこれらの配列のうち１種または複数に対し８０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片であり、関連する配列のエピトープを含む。

ある特定の実施形態において、免疫原性組成物は、ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原と、（１）ＴｏｘＢ−ＥＤ抗原（配列番号１７）、（２）ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原（配列番号１８）、（３）ＴｏｘＢ−ＣＰ抗原（配列番号１９）、（４）ＴｏｘＢ−Ｔ抗原（配列番号２０）、（５）ＴｏｘＢ−Ｂ抗原（配列番号２１）、（６）ＴｏｘＢ−Ｂ２抗原（配列番号２２）、（７）ＴｏｘＢ−Ｂ７（配列番号２３）または（８）全長ＴｃｄＢ抗原（配列番号２）から必要に応じて選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９種以上のＴｃｄＢ抗原、例えば、１〜１０、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜９、３〜８、４〜７、５〜６種のＴｃｄＡ抗原とを含むまたはこれをさらに含むであろう。好ましくは、１種または複数のＴｃｄＢ抗原は、ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原、特に、配列番号１８を含む、これから本質的になるまたはこれからなる抗原である。

特定の実施形態において、免疫原性組成物は、ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原およびＴｃｄＡ抗原を含むまたはこれをさらに含み、ＴｃｄＡ抗原は、ＴｏｘＡ−Ｐ５−６およびＴｏｘＡ−Ｂ２からなる群から選択される。より具体的には、ＴｃｄＡ抗原は、ＴｏｘＡ−Ｐ５−６である。さらにより具体的には、ＴｏｘＡ−Ｐ５−６抗原は、（ａ）配列番号１１に対し８０％以上の同一性を有する、および／またはｂ）配列番号１１の、または配列番号１１に対し８０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片であり、配列番号１１のエピトープを含むアミノ酸配列を含む、これから本質的になるまたはこれからなるであろう。

ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原
全長ＴｃｄＢ抗原（本明細書においてＴｏｘＢおよび毒素Ｂとも称される）は、配列番号２のアミノ酸配列（配列番号３１の核酸配列にコードされる）を含む。解毒されたＴｃｄＢ抗原は、本明細書においてトキソイドＢと称される。略語「ＴｏｘＢ−ＧＴ」は、酵素ドメイン（ＥＤ）のＮ末端領域内に位置する（図２２に表されている）ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインを指す。ＴｏｘＢ−ＧＴドメイン（配列番号１８、配列番号４７の核酸配列にコードされる）は、配列番号２のアミノ酸１〜５４３に相当するＴｃｄＢの断片である。

本発明の組成物に含まれるＴｏｘＢ−ＧＴ抗原は、（ａ）配列番号１８に対し５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％以上）を有する、および／または（ｂ）配列番号１８の、または配列番号１８に対し５０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも「ｎ」個の連続的なアミノ酸の断片であり、「ｎ」が、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２５０、３００、４００、５００、５４０以上）であるアミノ酸配列を含むまたはこれからなるポリペプチドである。好ましい断片は、配列番号１８のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号１８の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号１８のＣ末端から１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個以上）を、および／またはＮ末端から１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個以上）を欠く。よって、ＴｏｘＢ−ＧＴのアミノ酸断片は、配列番号１８の、例えば、最大３０、最大４０、最大５０、最大６０、最大７０、最大８０、最大９０、最大１００、最大１２５、最大１５０、最大１７５、最大２００、最大２５０、最大３００、最大３５０、最大４００、最大４５０、最大５００または最大５４０個の連続的なアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むことができる。

本発明の組成物に含まれるＴｏｘＢ−ＧＴ抗原は解毒されていてよい。解毒は、当該技術分野において公知のいずれかの適切な方法、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用して、野生型ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原のアミノ酸配列またはコード核酸配列に変異導入することにより達成することができる。好ましくは、ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原は、配列番号１８の野生型ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原配列と比べて、１個または複数のアミノ酸置換（即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０個以上の突然変異）を含む。例えば、ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原は、配列番号１８の野生型ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原配列と比べて、例えば、アミノ酸位置１７、１０２、１３９、２６９、２７０、２７３、２８４、２８６、２８８、３８４、４４９、４４４、４４５、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５５、４６１、４６３、４７２、５１５、５１８および／または５２０に、１個または複数のアミノ酸置換（即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個以上の突然変異）を含む。例えば、ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原は、配列番号１８のＴｏｘ−ＧＴ抗原配列のアミノ酸２７０、２７３、２８４、２８６および／または２８８に相当する１、２、３、４または５個の位置に置換を含むことができる。特に、配列番号１８のＴｏｘＢ−ＧＴ抗原配列のアミノ酸２７０、２７３、２８４、２８６および／または２８８に相当する位置における１、２、３、４または５個のアミノ酸は、好ましくは、アラニン残基により置換することができる。これらの位置にアラニン置換を有する解毒されたＴｏｘＢ−ＧＴ抗原のアミノ酸配列は、配列番号６０に提示されている。

ＴｏｘＢ−ＧＴが、２個のアミノ酸置換を含む場合、置換は、好ましくは、配列番号１８のＴｏｘＢ−ＧＴ抗原配列のアミノ酸位置１０２および２７８またはアミノ酸位置１０２および２８８におけるものではない。よって、本発明の組成物に含まれている解毒されたＴｏｘＢ−ＧＴ抗原は、（ａ）配列番号６０に対し５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％以上）を有する、および／または（ｂ）配列番号６０の、または配列番号６０に対し５０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも「ｎ」個の連続的なアミノ酸の断片であり、「ｎ」が、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２５０、３００、４００、５００、５４０以上）であるアミノ酸配列を含むまたはこれからなるポリペプチドとなり得る。よって、解毒されたＴｏｘＢ−ＧＴのアミノ酸断片は、配列番号６０の、例えば、最大３０、最大４０、最大５０、最大６０、最大７０、最大８０、最大９０、最大１００、最大１２５、最大１５０、最大１７５、最大２００、最大２５０、最大３００、最大３５０、最大４００、最大４５０、最大５００または最大５４０個の連続的なアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むことができる。好ましい断片は、配列番号６０のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号６０の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号６０のＣ末端から１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個以上）を、および／またはＮ末端から１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個以上）を欠く。

ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原
全長ＴｃｄＡ抗原（本明細書においてＴｏｘＡおよび毒素Ａとも称される）は、配列番号１のアミノ酸配列（配列番号３０の核酸配列にコードされる）を含む。解毒されたＴｃｄＡ抗原は、本明細書においてトキソイドＡと称される。略語「ＴｏｘＡ−ＧＴ」は、酵素ドメイン（ＥＤ）のＮ末端領域内に位置するＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインを指す。ＴｏｘＡ−ＧＴドメイン（配列番号４、配列番号３３の核酸配列にコードされる）は、配列番号１のアミノ酸１〜５４１に相当するＴｃｄＡの断片である。

本発明の組成物に含まれるＴｏｘＡ−ＧＴ抗原は、（ａ）配列番号４に対し５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％以上）を有する、および／または（ｂ）配列番号４の、または配列番号４に対し５０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも「ｎ」個の連続的なアミノ酸の断片であり、「ｎ」が、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２５０、３００、４００、５００、５４０以上）であるアミノ酸配列を含むまたはこれからなるポリペプチドである。好ましい断片は、配列番号４のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号４の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号４のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個以上）を、および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個以上）を欠く。

よって、ＴｏｘＡ−ＧＴのアミノ酸断片は、配列番号４の、例えば、最大３０、最大４０、最大５０、最大６０、最大７０、最大８０、最大９０、最大１００、最大１２５、最大１５０、最大１７５、最大２００、最大２５０、最大３００、最大３５０、最大４００、最大４５０、最大５００または最大５４０個の連続的なアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むことができる。

本発明の組成物に含まれているＴｏｘＡ−ＧＴ抗原は、解毒されていてよい。解毒は、当該技術分野において公知のいずれかの適切な方法、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用して、野生型ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原のアミノ酸配列またはコード核酸配列に変異導入することにより達成することができる。好ましくは、ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原は、配列番号４の野生型ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原配列と比べて、１個または複数のアミノ酸置換（即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０個以上の突然変異）を含む。例えば、ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原は、配列番号４のＴｏｘＡ−ＧＴ抗原配列のアミノ酸２８３、２８５および２８７に相当する、１、２または３個の位置に置換を含むことができる。特に、配列番号４のＴｏｘＡ−ＧＴ抗原配列のアミノ酸２８３、２８５および２８７に相当する位置における１、２または３個のアミノ酸は、好ましくは、アラニン残基により置換することができる。これらの位置にアラニン置換を有する解毒されたＴｏｘＡ−ＧＴ抗原のアミノ酸配列は、配列番号５６に提示されている。

ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原が、１個のアミノ酸置換を含む場合、置換は、好ましくは、配列番号４のＴｏｘＡ−ＧＴ抗原配列のアミノ酸位置２７８におけるものではない。ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原が、２個のアミノ酸置換を含む場合、置換は、好ましくは、配列番号４のＴｏｘＡ−ＧＴ抗原配列のアミノ酸位置１０１および２７８におけるものではない。ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原が、３個のアミノ酸置換を含む場合、置換は、好ましくは、配列番号４のＴｏｘＡ−ＧＴ抗原配列のアミノ酸位置１０１、２７８および５１９またはアミノ酸位置１０１、２８７および５１９におけるものではない。

よって、本発明の組成物に含まれる解毒されたＴｏｘＡ−ＧＴ抗原は、（ａ）配列番号５６に対し５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％以上）を有する、および／または（ｂ）配列番号５６の、または配列番号５６に対し５０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも「ｎ」個の連続的なアミノ酸の断片であり、「ｎ」が、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２５０、３００、４００、５００、５４０以上）であるアミノ酸配列を含むまたはこれからなるポリペプチドとなり得る。好ましい断片は、配列番号５６のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号５６の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号５６のＣ末端から１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個以上）を、および／またはＮ末端から１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個以上）を欠く。よって、解毒されたＴｏｘＢ−ＧＴのアミノ酸断片は、配列番号５６の、例えば、最大３０、最大４０、最大５０、最大６０、最大７０、最大８０、最大９０、最大１００、最大１２５、最大１５０、最大１７５、最大２００、最大２５０、最大３００、最大３５０、最大４００、最大４５０、最大５００または最大５４０個の連続的なアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むことができる。

ＴｃｄＡ抗原：ＴｃｄＡ抗原は、（ａ）配列番号１に対し８０％以上の同一性を有する、および／またはｂ）配列番号１の、または配列番号１に対し８０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片であり、配列番号１のエピトープを含むアミノ酸配列を含むまたはこれからなるポリペプチドである。さらに、ＴｃｄＡ抗原は、図２２に表されている、（１）ＴｏｘＡ−ＥＤ抗原（配列番号３）、（２）ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原（配列番号４）、（３）ＴｏｘＡ−ＣＰ抗原（配列番号５）、（４）ＴｏｘＡ−Ｔ抗原（配列番号６）、（５）ＴｏｘＡ−Ｔ４抗原（配列番号７）、（６）ＴｏｘＡ−Ｂ抗原（配列番号８）、（７）ＴｏｘＡ−ＰＴＡ２抗原（配列番号９）、（８）ＴｏｘＡ−Ｐ５−７抗原（配列番号１０）、（９）ＴｏｘＡ−Ｐ５−６抗原（配列番号１１）、（１０）ＴｏｘＡ−Ｐ９−１０抗原（配列番号１２）、（１１）ＴｏｘＡ−Ｂ２抗原（配列番号１３）、（１２）ＴｏｘＡ−Ｂ３抗原（配列番号１４）、（１３）ＴｏｘＡ−Ｂ５抗原（配列番号１５）、（１４）ＴｏｘＡ−Ｂ６抗原（配列番号１６）または全長ＴｃｄＡ抗原（配列番号１）を含む。

本発明による使用に好ましいポリペプチドは、（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３もしくは４６５に対し５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）、例えば、９０％同一性以上もしくは９５％同一性以上もしくは９９％同一性以上を有する、および／または（ｂ）配列番号の少なくとも「ｎ」個の連続的なアミノ酸の断片を含み、「ｎ」が、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上、例えば、２０以上または例えば、５０以上または例えば、８０以上）であるアミノ酸配列を含む。これらのポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３または４６５のバリアントを含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３または４６５由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３もしくは４６５の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３もしくは４６５のＣ末端から１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個以上）を、および／またはＮ末端から１個もしくは複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個以上）を欠く。よって、本発明のポリペプチドのアミノ酸断片は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３または４６５の、例えば、最大３０、最大４０、最大５０、最大６０、最大７０、最大８０、最大９０、最大１００、最大１２５、最大１５０、最大１７５、最大２００、最大２５０、最大３００、最大３５０、最大４００、最大４５０、最大５００、最大５５０、最大６００、最大６５０、最大７００個の連続的なアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むことができる。他の断片は、１個または複数のポリペプチドドメインを省略する。例えば、天然リーダーペプチドおよび／またはソルターゼ認識配列を省略することができる。他の箇所で考察している通り、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管コロニー形成を阻害する好ましいポリペプチドは、Ｄｉｆ４４およびＤｉｆ２０８（即ち、配列番号７９、１３９、１３３および４３３ならびに２０８Ａおよび２０８Ｂ断片に関しては配列番号１１１、１７１、１１３および１７３）である。好ましいＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素抗原は、ＴｏｘＢ＿ＧＴ（配列番号１８および６０）およびＴｏｘＡ＿ｐ５−６（配列番号１１）である。

用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語は、天然にまたは介入により修飾されたアミノ酸ポリマーも包含し、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化または標識構成成分によるコンジュゲーション等、他のいずれかの操作もしくは修飾がある。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１種または複数のアナログおよび当該技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、単鎖または付随鎖（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｉｎ）として存在し得る。

本発明のポリペプチドは、様々な形態（例えば、未変性、融合体、グリコシル化型、非グリコシル化型、脂質付加型、非脂質付加型、リン酸化型、非リン酸化型、ミリストイル化型、非ミリストイル化型、単量体、多量体、粒子状、変性型等）を採ることができる。例えば、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端システインを持たなくてよい。本発明は、Ｎ末端システインが欠失されたポリペプチドも提供する（例えば、Ｄｉｆ５１（配列番号３５７）、Ｄｉｆ１３０（配列番号３５９）およびＤｉｆ１８３（配列番号３６１））。本発明のポリペプチドは、アンカードメインを持たなくてよい（例えば、Ｄｉｆ２０８（配列番号４３３）、ＤＩｆ２０８Ｂ（配列番号１７３）およびＤｉｆ２３２（配列番号１８５））。

一部の実施形態において、配列同一性の程度は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上を超える（例えば、本明細書に言及され、配列表に提示されている配列に対する）。これらのポリペプチドは、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子バリアントおよび機能的突然変異体を含む。典型的に、２種のポリペプチド間の５０％同一性以上は、機能的均等性の指標であるとみなされる。タンパク質間の同一性は、パラメータ、ギャップオープンペナルティ＝１２およびギャップ伸長ペナルティ＝１によるアフィンギャップ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるスミス−ウォーターマン相同性検索アルゴリズムによって決定することができる。

別の実施形態において、本発明のポリペプチドの断片を使用することができる。断片は、配列由来の少なくともｎ個の連続的なアミノ酸を含む必要があり、特定の配列に応じて、ｎは、１０以上（例えば、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）である。よって、断片は、例えば、最大３０、最大４０、最大５０、最大６０、最大７０、最大８０、最大９０、最大１００、最大１２５、最大１５０、最大１７５、最大２００、最大２５０、最大３００、最大３５０、最大４００、最大４５０、最大５００、最大６４０または最大１１０５個の連続的なアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むことができる。よって、断片は、例えば、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、７０未満、８０未満、９０未満、１００未満、１２５未満、１５０未満、１７５未満、２００未満、２５０未満、３００未満、３５０未満、４００未満、４５０未満、５００未満、６４０未満または１１０５個未満の連続的なアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むことができる。ある特定の実施形態において、アミノ酸断片は、５０以下、６０以下、７５以下、１００以下、１５０以下、２００以下、２５０以下、３００以下、３５０以下、４００個以下のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことができる。

好ましい断片は、エピトープを含む、または免疫原性断片である。特に、断片は、配列由来の１個または複数のエピトープを含むことができる。他の断片は、（ａ）本発明のポリペプチドのＮ末端シグナルペプチドである、（ｂ）本発明のポリペプチドであるが、そのＮ末端シグナルペプチドを持たない、および（ｃ）本発明のポリペプチドであるが、そのＮ末端アミノ酸残基を持たない。特に、本発明は、断片、Ｄｉｆ２０８Ａ（ＣＤ２８３１）およびＤｉｆ２０８Ｂ（ＣＤ２８３１）を提供する。これらの断片のアミノ酸（ａｍｉｎｏ）配列は、図１に要約されている。

本明細書において使用される場合、用語「断片」は、別の配列のサブセットである配列を指す。核酸またはアミノ酸配列の文脈において使用される場合、用語「断片」および「サブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、互換的に使用される。これらの用語は、インタクトまたは完全な野生型ポリペプチドの部分または一部であるが、インタクトまたは完全な野生型ポリペプチドよりも少ないアミノ酸残基を含む部分または一部を指すように使用される。よって、この用語は、野生型または参照ポリペプチドの１個または複数の領域に相当する、トランケートされたまたはより短いアミノ酸配列を指す。断片の一例は、エピトープ配列である。アミノ酸配列の断片またはサブ配列は、天然起源または参照ポリペプチドに見られる数に満たないいかなる数の残基であってもよい。本発明が、「エピトープ」に関する場合、このエピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープとなり得る。かかるエピトープは、経験的に同定することができる（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［９、１０］または同様の方法を使用する）、または予測することができる（例えば、ジェームソン−ウォルフ抗原指数［１１］、マトリックスに基づくアプローチ［１２］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［１３］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［１４、１５］、ニューラル・ネットワーク［１６］、ＯｐｔｉＭｅｒ ＆ ＥｐｉＭｅｒ［１７、１８］、ＡＤＥＰＴ［１９］、Ｔｓｉｔｅｓ［２０］、親水性［２１］、抗原指数［２２］または［２３〜２７等］に開示されている方法を使用して）。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位によって認識され、これに結合する抗原の部分であり、「抗原決定基」と称することもできる。

かかる断片は、参照配列のトランケートされたまたはより短い断片であるが、かかる断片が、参照ポリペプチドには見られない追加的な配列を含むように、例えば、ＨｉｓタグまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグなどの「タグ」配列、リンカー配列等を含む融合ポリペプチドを形成するように修飾されていてよいことは、当業者であれば明らかであろう。よって、かかる修飾断片において、断片のＮ末端アミノ酸のアミノ基は、アミノ酸のカルボキシル基へとペプチド結合により連結されていない（参照ポリペプチドにおいては連結されている）、および／または断片のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基は、アミノ酸のアミノ基へとペプチド結合によって連結されていない（参照ポリペプチドにおいては連結されている）。

第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのパーセント同一性は一般に、第１および第２のポリペプチドの間で一致した位置の数を計数し、この数を最短ポリペプチドの全長で割り、続いて得られた値に１００を掛けることにより決定される。ポリペプチドの断片に関して、この値は通常１００％前後であり、したがって、殆ど意味がない。したがって、本発明の断片の文脈において、用語「参照ポリペプチドの割合」（パーセンテージとして表す）が使用される。参照ポリペプチドの割合は、断片および参照ポリペプチドの間で一致した位置の数を計数し、この数を参照ポリペプチドの全長で割り、続いて得られた値に１００を掛けることにより計算される。特に、断片は、参照ポリペプチドの配列の９０、８０、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５未満または２０％未満を含むであろう。

よって、例えば、本発明の組成物、ワクチンおよび方法に有用なポリペプチドは、他の箇所で考察している通り、配列表に列挙されている配列を有することができる、またはそのバリアントおよび／もしくは断片となり得る。かかるバリアントおよび／または断片が使用される範囲まで、これらは、配列表に列挙されている配列の機能的特性を共有する。例えば、配列表において言及されているＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素配列のバリアントおよび／または断片は、好ましくは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する保護効果をもたらす（例えば、配列表において言及されている関連するまたは相当するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素配列によって示される保護効果の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５または１００％の保護効果をもたらす）列挙されている配列を有するポリペプチドの能力を共有する。配列表において言及されているＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチドＤｉｆ４４、Ｄｉｆ５１、Ｄｉｆ１３０、Ｄｉｆ１５３、Ｄｉｆ１８３、Ｄｉｆ１９２、Ｄｉｆ２０８およびＤｉｆ２３２のバリアントおよび／または断片は、好ましくは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成を低下させる（例えば、配列表において言及されている関連するまたは相当するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチドＤｉｆ４４、Ｄｉｆ５１、Ｄｉｆ１３０、Ｄｉｆ１５３、Ｄｉｆ１８３、Ｄｉｆ１９２、Ｄｉｆ２０８およびＤｉｆ２３２によって示される腸管のコロニー形成の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５または１００％である、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の低下をもたらす）列挙されている配列を有するポリペプチドの能力を共有する。

本発明により使用されるポリペプチドは、様々な手段（例えば、組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成等）によって調製することができる。一般に、本発明のポリペプチドは、精製された形態または実質的に精製された形態で提供される、即ち、特に、他のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅまたは宿主細胞のポリペプチド由来の他のポリペプチドを実質的に含まず（例えば、天然起源のポリペプチドを含まない）、一般に、少なくとも約５０％純粋（重量で）であり、通常、少なくとも約９０％純粋である、即ち、組成物の約５０％未満、より典型的には、約１０％（例えば、５％）未満が、他の発現ポリペプチドで構成される。よって、組成物中のポリペプチドは、分子が発現された生物全体から分離されている。

好ましい実施形態において、本発明は、免疫原性である、配列番号７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３および４６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、これから本質的になるまたはこれからなるポリペプチドを提供する。

本明細書に記載されているポリペプチドまたはタンパク質の文脈における用語「免疫原性」とは、例えば、対象（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトまたはマウス）を免疫化するために使用される場合、抗原またはポリペプチドが、これが由来する野生型Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅタンパク質に対する体液性または細胞性免疫応答、好ましくはその両方などの免疫応答を誘発することができることを意味するように使用される。免疫原性ポリペプチドは、一般に、抗原性と称される。分子は、免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができる場合、「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約５、特に、少なくとも約１０、少なくとも１５、少なくとも２０または少なくとも５０アミノ酸のエピトープを含有する。エピトープとも称されるポリペプチドの抗原性部分は、抗体もしくはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性部分となり得る、または免疫化のために抗原性部分を担体ポリペプチドにコンジュゲートすることにより、分子に対する抗体の作製に使用される部分となり得る。当業者は、抗原性の分子それ自体が免疫原性である必要はなく、例えば、一部の抗原は、免疫応答の誘発を可能にするアジュバントまたは担体の存在を必要とすることを認識するであろう。

用語「抗原」は、対象がそれに対する免疫応答、例えば、体液性および／または細胞性免疫応答を惹起することができる分子を指す。組成物またはワクチンに対する「免疫学的応答」は、対象とする組成物またはワクチンに対する細胞性および／または抗体媒介性免疫応答の宿主における発達である。通常、「免疫学的応答」として、次の効果のうち１種または複数が挙げられるがこれらに限定されない：対象とする組成物またはワクチンに含まれる抗原（複数可）へと特異的に方向づけられた、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生。好ましくは、対象は、新たな感染に対する抵抗性が増強される、および／または疾患の臨床重症度が低下するような、治療的または保護的な免疫学的応答のいずれかを呈するであろう。かかる保護は、感染した対象によって正常に呈される症状の低下もしくはその欠如、より迅速な回復時間、および／または感染した宿主における病原体もしくは細菌の負荷の低下のいずれかにより実証されるであろう。用語「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドは、本明細書において使用される場合、上述の免疫学的応答を誘発するアミノ酸配列も指す。

ハイブリッドＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチド
本発明において使用されるポリペプチドは、個々の別々のポリペプチドとして組成物中に存在することができる。しかし、２種以上のポリペプチドが使用される場合、別々のポリペプチドとして存在していなくてもよい。その代わりに、少なくとも２種の（例えば、２、３、４、５種以上の）ポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」ポリペプチド）として発現させることができる。ハイブリッドポリペプチドは、２つの主要な利点をもたらす：第１に、それだけでは不安定または不十分に発現され得るポリペプチドが、この問題を克服する適したハイブリッドパートナーの付加により補助され得る；第２に、両者共に抗原として有用な２種のポリペプチドを産生するために１回のみの発現および精製の使用が必要とされるため、商業的製造が単純化される。少なくとも２種のポリペプチドのハイブリッドポリペプチドは、単独または単純な混合物における少なくとも２種のポリペプチドのうち１種または複数よりも免疫原性となることもできる。ハイブリッドポリペプチドは、本発明のポリペプチドのそれぞれに由来する２種以上のポリペプチド配列、または配列が株にわたって部分的可変性を有する場合は同じポリペプチドの２種以上のバリアントを含むことができる。２、３、４、５、６、７、８、９または１０種のポリペプチド由来のアミノ酸配列からなるハイブリッドが有用である。一部の実施形態において、２もしくは３種のポリペプチドなどの２、３、４または５種のポリペプチド由来のアミノ酸配列からなるハイブリッドが使用される。異なるハイブリッドポリペプチドは、単一の製剤において一体に混合することができる。ハイブリッドは、非ハイブリッドポリペプチドと組み合わせることができる。かかる組合せの範囲内で、ポリペプチドは、２種以上のハイブリッドポリペプチドにおいておよび／または非ハイブリッドポリペプチドとして存在することができる。しかし、ポリペプチドは、ハイブリッドまたは非ハイブリッドのいずれかとして存在することが典型的であり、その両方としては存在しない。ハイブリッドポリペプチドは、後述するコンジュゲートまたは非Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチドと組み合わせることもできる。

ハイブリッドポリペプチドは、式ＮＨ_２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは、上述のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチドのアミノ酸配列であり、Ｌは、任意選択のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２以上（例えば、２、３、４、５、６等）の整数である）によって表すことができる。通常、ｎは、２または３である。−Ｘ−部分が、その野生型形態のリーダーペプチド配列を有する場合、これは、ハイブリッドポリペプチドにおいて含まれていても省略されていてもよい。一部の実施形態において、ハイブリッドポリペプチドのＮ末端に位置する−Ｘ−部分の場合を除き、リーダーペプチドは欠失され得る、即ち、Ｘ_１のリーダーペプチドは保持されるであろうが、Ｘ_２…Ｘ_ｎのリーダーペプチドは省略されるであろう。これは、全リーダーペプチドの欠失および部分−Ａ−としてのＸ_１のリーダーペプチドの使用と均等である。｛−Ｘ−Ｌ−｝の各ｎの場合に対して、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在しても存在しなくてもよい。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドは、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ等となり得る。リンカーアミノ酸配列（複数可）−Ｌ−は、典型的に短くなるであろう（例えば、２０個以下のアミノ酸、即ち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）。例として、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（即ち、Ｇｌｙ_ｎ（式中、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）を含む）およびヒスチジンタグ（即ち、Ｈｉｓ_ｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上））が挙げられる。他の適したリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかであろう。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号３５１）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号３５２）であり、Ｇｌｙ−Ｓｅｒジペプチドは、ＢａｍＨＩ制限部位から形成され、これによりクローニングおよび操作を助け、（Ｇｌｙ）_４テトラペプチドは、典型的なポリグリシンリンカーである。特に、最後のＬ_ｎとしての使用のための他の適したリンカーは、ＡＳＧＧＧＳ（配列番号３５３）またはＬｅｕ−Ｇｌｕジペプチドである。−Ａ−は、任意選択のＮ末端アミノ酸配列である。これは、典型的に短くなるであろう（例えば、４０個以下のアミノ酸、即ち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）。例として、タンパク質輸送を方向づけるためのリーダー配列またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、即ち、Ｈｉｓ_ｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上））が挙げられる。他の適したＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかであろう。Ｘ_１が、それ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、通常、Ｎ末端メチオニン、例えば、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒまたは単一Ｍｅｔ残基をもたらすオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸を有する）である。−Ｂ−は、任意選択のＣ末端アミノ酸配列である。これは、典型的に短くなるであろう（例えば、４０個以下のアミノ酸、即ち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）。例として、タンパク質輸送を方向づけるための配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、即ち、Ｈｉｓ_ｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上）を含む）またはタンパク質安定性を増強する配列が挙げられる。他の適したＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかであろう。ハイブリッドポリペプチドが使用される場合、ハイブリッド内の個々のポリペプチド（即ち、個々の−Ｘ−部分）は、１種または複数の株に由来し得る。例えばｎ＝２の場合、Ｘ_２は、Ｘ_１と同じ株に由来しても、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの異なる株に由来してもよい。ｎ＝３の場合、株は、（ｉ）Ｘ_１＝Ｘ_２＝Ｘ_３、（ｉｉ）Ｘ_１＝Ｘ_２≠Ｘ_３、（ｉｉｉ）Ｘ_１≠Ｘ_２＝Ｘ_３、（ｉｖ）Ｘ_１≠Ｘ_２≠Ｘ_３または（ｖ）Ｘ_１＝Ｘ_３≠Ｘ_２等となり得る。

群（ｃ）内において、欠失または置換は、Ｎ末端および／またはＣ末端において生じても、両末端間に生じてもよい。よって、トランケーションは、欠失の例である。トランケーションは、Ｎ末端および／またはＣ末端における最大４０個（以上）のアミノ酸の欠失に関与し得る。Ｎ末端トランケーションは、例えば、異種性宿主における組換え発現を容易にするためにリーダーペプチドを除去することができる。Ｃ末端トランケーションは、例えば、異種性宿主における組換え発現を容易にするためにアンカー配列を除去することができる。本発明によれば、Ｘｎは、Ｄｉｆ４４、Ｄｉｆ５１、Ｄｉｆ１３０、Ｄｉｆ１５３、Ｄｉｆ１８３、Ｄｉｆ１９２、Ｄｉｆ２０８、Ｄｉｆ２０８Ａ、Ｄｉｆ２３２、ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原およびＴｃｄＡ抗原からなる群から選択される２種以上の抗原のアミノ酸配列を含むことができる。各Ｘｎは、本発明の抗原の組合せ（上述の）の抗原のアミノ酸配列となり得る。ある特定の実施形態において、ｎは２である。ｎが２である場合、Ｘ１は通常ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原であり、Ｘ２は通常ＴｃｄＡ抗原であるが、本発明に従って上述の抗原のうち２種の他のいかなる組合せを使用してもよい。ｎが３である場合、例えば、上述の３種の抗原のいかなる組合せを使用してもよい。ｎが４である場合、例えば、上述の４種の抗原のいかなる組合せを使用してもよい。一般に、Ｘｎの２種以上は、同じ抗原であっても、またはｎが２、３もしくは４である場合、各Ｘｎは、異なる抗原であってもよい。Ｘｎの２種以上が同じ抗原の配列である場合、前記２種以上のＸｎは、同じポリペプチド配列または異なるポリペプチド配列を有することができ、例えば、上述の所定の抗原の異なるバリアントまたは断片となることができる。これらの抗原が、（ａ）所定の配列に対し５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を有する、および／または（ｂ）所定の配列の少なくとも「ｎ」個の連続的なアミノ酸の断片を含み、「ｎ」が、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）であるという観点から定義される場合、（ａ）における同一性のレベルおよび（ｂ）における「ｎ」の値は、各Ｘについて同じであり得る。

本発明により使用されるポリペプチドは、配列−Ｐ−Ｑ−または−Ｑ−Ｐ−（式中、−Ｐ−が、上に定義されるアミノ酸配列であり、−Ｑ−は、上に定義される配列ではない、即ち、融合タンパク質として提供することができる）を含むことができる。−Ｐ−のＮ末端コドンがＡＴＧではなく、このコドンがポリペプチドのＮ末端に存在しない場合、これは、Ｍｅｔとしてではなく、該コドンの標準アミノ酸として翻訳されるであろう。しかし、このコドンが、ポリペプチドのＮ末端に存在する場合、これは、Ｍｅｔとして翻訳されるであろう。−Ｑ−部分の例として、ヒスチジンタグ（即ち、Ｈｉｓ_ｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上））、マルトース結合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明により使用されるポリペプチドの発現は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの発現（組換え発現）のための異種性宿主において行うことができる。異種性宿主は、原核生物（例えば、細菌）であっても真核生物であってもよい。非限定例として、他の適した宿主は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母等を含む。当業者であれば、コードされるアミノ酸に影響を与えずに、かかる宿主における発現効率を最適化するためにコドンを変化させることが役立ち得ることを理解するであろう。

核酸
別の実施形態において、本発明は、配列番号７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３および４６５からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。配列番号７９、１３９、１３３、４３３、１１１、１７１、１１３および１７３が好ましい。特定の核酸配列は、配列番号７８、８０、９２、１０４、１１０、１１２、１２４、１３２、１３８、１４０、１５２、１６４、１７０、１７２、１８４、１８６、１８８、３５６、３５８、３６０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２および４６４である。配列番号７８、１３２、１３８、４３２、１１０、１７０、１１２および１７２が好ましい。

抗原の組合せのペプチドをコードするヌクレオチド配列は、遺伝コードに従って設計することができる。よって、かかるヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、５４、５６、５８、６０、６２、６４（例えば、ＴｏｘＢおよびＴｃｄＡ分子をコード）のうち１種もしくは複数をコードすることができる、または配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６６、６７、６８、６９のうち１種または複数を含むことができる。

これらの核酸は、組成物、例えば、ワクチンまたは他の免疫原性組成物における使用に適している。核酸（例えば、核酸の組合せ、ベクターまたはベクターの組合せ）は、本発明により使用されるポリペプチド、本発明により使用されるポリペプチドの組合せまたはハイブリッドポリペプチドをコードする。本発明の抗原の組合せの１種または複数（例えば、２、３または４種）のポリペプチドまたはハイブリッドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を使用することができる。核酸は、例えば、ベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）であり得る。本発明のポリペプチドをコードする核酸（典型的に、ＤＮＡ）を使用して、核酸免疫化に基づく組成物、方法および使用を得ることができる。現在、核酸免疫化は、発展した分野である（例えば、参考文献２８〜３５等を参照）。

本発明の組成物において使用することのできる本発明の核酸は、配列番号７８、８０、９２、１０４、１１０、１１２、１２４、１３２、１３８、１４０、１５２、１６４、１７０、１７２、１８４、１８６、１８８、３５６、３５８、３６０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２および４６４ならびに配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６６、６７、６８、６９である。加えて、かかるヌクレオチド配列に対し配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を、本発明の組成物において使用することもできる。配列間の同一性は、好ましくは、上述のスミス−ウォーターマン相同性検索アルゴリズムによって決定される。かかる核酸は、同じアミノ酸をコードする代替的なコドンを使用する核酸を含む。代替的なコドンの使用は、ワクチン接種後の哺乳動物における発現を助けることができる。

よって、言及されている核酸のいずれかに対し５０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上、例えば、９０％同一性以上または９５％同一性以上または９９％同一性以上）を有するヌクレオチド配列を含む核酸を使用することができる。配列番号７８、８０、９２、１０４、１１０、１１２、１２４、１３２、１３８、１４０、１５２、１６４、１７０、１７２、１８４、１８６、１８８、３５６、３５８、３６０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２および４６４ならびに配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６６、６７、６８、６９を含む群から選択される核酸にハイブリダイズすることができる核酸を、本発明の組成物において使用することもできる。ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行うことができる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる条件は、当該技術分野において広く公知であり公表されている。関連する条件の例として、次の条件が挙げられる（ストリンジェンシーが増加する順に）：インキュベーション温度、２５℃、３７℃、５０℃、５５℃および６８℃；バッファー濃度、１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸塩バッファー）および他の緩衝系を使用したその均等物；ホルムアミド濃度、０％、２５％、５０％および７５％；インキュベーション時間、５分間から２４時間；１、２回以上の洗浄ステップ；洗浄インキュベーション時間、１、２または１５分間；ならびに洗浄溶液、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水。ハイブリダイゼーション技法およびその最適化は、当該技術分野において周知のものである（例えば、参考文献３６、３７等を参照）。一部の実施形態において、本発明の核酸は、低ストリンジェンシー条件下で標的にハイブリダイズする。他の実施形態において、これは、中等度ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。一部の実施形態において、これは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、５０℃および１０×ＳＳＣである。中等度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、５５℃および１×ＳＳＣである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例示的なセットは、６８℃および０．１×ＳＳＣである。

一部の組成物において、上述の核酸配列の断片（例えば、配列表において言及されている特定の配列を有する分子の断片、または配列表において言及されている特定の配列とハイブリダイズするその能力の参照による、もしくはそれとのパーセンテージ配列同一性による上に定義されているバリアントの断片）を用いることができる。本発明のある特定の実施形態に関して、核酸は、少なくとも７ヌクレオチドの長さ（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００ヌクレオチド以上の長さ）である。本発明のある特定の実施形態に関して、核酸は、最大で５００ヌクレオチドの長さ（例えば、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５ヌクレオチド以下の長さ）である。核酸断片は、好ましくは、配列表において言及されている特定の配列のエピトープをコードする。

本発明による核酸は、様々な形態（例えば、一本鎖型、二本鎖型、ベクター、プライマー、プローブ、標識型等）を採ることができる。本発明の核酸は、環状または分枝状となることができるが、一般に、直鎖状となるであろう。他に指定または要求がなければ、核酸を利用する本発明のいずれかの実施形態は、二本鎖型および二本鎖型を構成する２本の相補的な一本鎖型のそれぞれの両方を利用することができる。プライマーおよびプローブは一般に、アンチセンス核酸のように一本鎖型である。用語「補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」または「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」は、核酸に関して使用される場合、ワトソン−クリック塩基対形成を指す。よって、Ｃの補体はＧであり、Ｇの補体はＣであり、Ａの補体はＴ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の補体はＡである。例えば、ピリミジン（ＣまたはＴ）の補体とするために、Ｉ（プリンイノシン）などの塩基を使用することも可能である。

本明細書に記載されている抗原をコードする核酸を使用して、例えば、生物学的試料における核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとしてポリペプチドを産生すること；核酸の追加的なコピーを作製すること；一本鎖ＤＮＡプライマーもしくはプローブまたは三本鎖形成オリゴヌクレオチドとしてリボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製することができる。本発明は、本明細書に記載されている抗原をコードする核酸を産生するためのプロセスを提供し、核酸は、化学的手段を使用して部分的にまたは全体的に合成される。本発明は、本明細書に記載されている抗原をコードするヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）と、かかるベクターで形質転換された宿主細胞とを提供する。

核酸免疫化
ポリペプチドをコードする核酸は、哺乳動物への送達後にｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができ、次に、発現されたポリペプチドは、免疫系を刺激する。活性成分は、典型的に、（ｉ）プロモーターと、（ｉｉ）該プロモーターに作動可能に連結した、ポリペプチドをコードする配列と、必要に応じて（ｉｉｉ）選択可能マーカーとを含む核酸ベクターの形態を採るであろう。一部の実施形態において、ベクターは、（ｉｖ）複製起点と、（ｖ）（ｉｉ）の下流にあり、これに作動可能に連結した転写ターミネーターとをさらに含むことができる。一般に、（ｉ）および（ｖ）は、真核性であり、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、原核性である。典型的なプロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のウイルスプロモーターである。ベクターは、プロモーターに加えて、プロモーターと機能的に相互作用する転写調節配列（例えば、エンハンサー）を含むこともできる。ベクターは、最初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含むことができ、ＣＭＶイントロンＡを含むこともできる。ポリペプチドコード配列の発現がプロモーターの制御下にあるように、プロモーターは、ポリペプチドをコードする下流配列に作動可能に連結される。マーカーが使用される場合、これは、典型的に、微生物宿主（例えば、原核生物、細菌、酵母）において機能する。マーカーは多くの場合、原核生物の選択可能マーカー（例えば、原核生物プロモーターの制御下において転写される）である。便宜上、典型的なマーカーは、抗生物質抵抗性遺伝子である。ベクターは、典型的に、プラスミドなどの自己複製するエピソームまたは染色体外ベクターである。ベクターは、通常、複製起点を含む。多くの場合、複製起点は、原核生物において活性であるが、真核生物においては活性でない。よって、ベクターは、ベクターの選択のための原核性マーカー、原核性複製起点を含むが、ポリペプチドコード配列の転写を駆動するための真核性プロモーターを含むことができる。したがって、ベクターは、（ａ）原核性宿主においてポリペプチドを発現することなく増幅され選択されるが、（ｂ）真核性宿主において増幅されることなく発現されるであろう。この構成は、核酸免疫化ベクターに理想的である。ベクターは、コード配列の下流に真核性転写ターミネーター配列を含むことができる。これは、転写レベルを増強することができる。コード配列自体にない場合、ベクターは、ポリアデニル化配列、例えば、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化配列を含むことができる。ベクターは、多重クローニング部位を含むことができる。

ポリペプチドおよびマーカーをコードする配列に加えて、ベクターは、第２の真核性コード配列を含むことができる。ベクターは、ポリペプチドと同じ転写物からの第２の真核性ポリペプチドの翻訳を可能にするために、前記第２の配列の上流にＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を含むこともできる。あるいは、ポリペプチドコード配列は、ＩＲＥＳの下流となり得る。ベクターは、非メチル化ＣｐＧモチーフ、例えば、２個の５’プリンおよび２個の３’ピリミジンに隣接する、グアノシンに先行するシトシンを共通して有する非メチル化ＤＮＡ配列を含むことができる。その非メチル化型において、これらのＤＮＡモチーフは、数種類の免疫細胞の強力な刺激因子であることが実証された。ベクターは、標的化された仕方で送達することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技法は、例えば、参考文献３８〜４３に記載されている。核酸を含有する治療組成物は、遺伝子療法プロトコールにおける局所的投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇおよび約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲を、遺伝子療法プロトコールの間使用することもできる。作用の方法（例えば、コードされる遺伝子産物のレベルを増強または阻害するための）ならびに形質転換および発現の有効性などの因子は、究極的な有効性に要求される投薬量に影響を与えると思われる検討事項である。より広い範囲の組織にわたってより多い発現が望まれる場合、逐次的投与プロトコールにおいてより大量のベクターまたは同じ量が再投与される、または良好な治療成績をもたらすために異なる近接または付近の組織部分への数回の投与が必要とされ得る。あらゆる事例において、臨床試験における慣例的な実験法は、最適治療効果のための特定の範囲を決定するであろう。ベクターは、遺伝子送達媒体を使用して送達することができる。遺伝子送達媒体は、ウイルスまたは非ウイルス起源のものであり得る（一般に、参考文献４４〜４７を参照）。所望の核酸の送達および所望の細胞における発現のためのウイルスに基づくベクターは、当該技術分野において周知である。例示的なウイルスに基づく媒体として、組換えレトロウイルス（例えば、参考文献４８〜５８）、アルファウイルスに基づくベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）；これらのウイルスのハイブリッドまたはキメラを使用することもできる）、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニア、鶏痘、カナリアポックス、修飾ワクシニアＡｎｋａｒａ等）、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献５９〜６４を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。死滅アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与［６５］を用いることもできる。

死滅したアデノウイルス単独に連結されたまたは連結されていないポリカチオン性凝縮ＤＮＡ［例えば、６５］、リガンド連結ＤＮＡ［６６］、真核細胞送達媒体細胞［例えば、参考文献６７〜７１］および核電荷中和（ｎｕｃｌｅｉｃ ｃｈａｒｇｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）または細胞膜との融合を挙げることができるがこれらに限定されない、非ウイルス送達媒体および方法を用いることもできる。ネイキッドＤＮＡを用いることもできる。例示的なネイキッドＤＮＡ導入方法は、参考文献７２および７３に記載されている。遺伝子送達媒体として作用することのできるリポソーム（例えば、免疫リポソーム）は、参考文献７４〜７８に記載されている。追加的なアプローチは、参考文献７９および８０に記載されている。使用に適したさらなる非ウイルス送達は、参考文献８０に記載されているアプローチなどの機械的送達系を含む。さらに、コード配列およびその発現産物は、光重合したハイドロゲル材料の沈着または電離放射線の使用により送達することができる［例えば、参考文献８１および８２］。コード配列の送達に使用することのできる遺伝子送達のための他の従来方法は、例えば、ハンドヘルド遺伝子移入粒子銃の使用［８３］または移入した遺伝子を活性化するための電離放射線の使用［８１および８２］を含む。ＰＬＧ｛ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）｝微粒子を使用したＤＮＡの送達は、例えば、負に荷電した表面（例えば、ＳＤＳで処理）または正に荷電した表面（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性洗剤で処理）を有するよう必要に応じて処理された微粒子への吸着による、特に好ましい方法である。

核酸は、典型的に、精製または実質的に精製された形態で提供される、即ち、特に、他のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ核酸または宿主細胞核酸由来の他の核酸を実質的に含まず（例えば、天然起源の核酸を含まず）、一般に、少なくとも約５０％純粋（重量で）であり、通常、少なくとも約９０％純粋である。本発明における使用のための核酸は、例えば、全体的または部分的な化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホラミダイト合成）により、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用してより長い核酸を消化することにより、より短い核酸またはヌクレオチドを連接することにより（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用して）、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから等、多くの仕方で調製することができる。用語「核酸」は、広義には、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらのアナログを含有する任意の長さのポリマー型のヌクレオチドを含む。これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。これは、修飾骨格（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオエート）または修飾塩基を含有するものなどのＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログも含む。よって、本発明は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分枝状核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマー等を含む。本発明の核酸は、ＲＮＡの形態を採る場合、５’キャップを有していても有していなくてもよい。

核酸は、ベクターの部分、即ち、１種または複数の細胞型の形質導入／トランスフェクションのために設計された核酸構築物の部分となり得る。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離、増殖および複製のために設計された「クローニングベクター」、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現のために設計された「発現ベクター」、組換えウイルスもしくはウイルス様粒子の産生をもたらすように設計された「ウイルスベクター」または２種類以上のベクターの特質を含む「シャトルベクター」であり得る。典型的なベクターはプラスミドである。「宿主細胞」は、外来性核酸のレシピエントであり得るまたはであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含み、後代は、天然、偶発的または計画的突然変異および／もしくは変化により、本来の親細胞と必ずしも完全に同一でなくてよい（形態においてまたは全ＤＮＡ補体において）。宿主細胞は、本発明の核酸をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトまたは感染された細胞を含む。

核酸がＤＮＡである場合、ＲＮＡ配列における「Ｕ」が、ＤＮＡにおける「Ｔ」に置き換えられるであろうことが認められよう。同様に、核酸がＲＮＡである場合、ＤＮＡ配列における「Ｔ」が、ＲＮＡにおける「Ｕ」に置き換えられるであろうことが認められよう。用語「補体」または「相補的」は、核酸に関して使用される場合、ワトソン−クリック塩基対形成を指す。よって、Ｃの補体はＧであり、Ｇの補体はＣであり、Ａの補体はＴ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の補体はＡである。例えば、ピリミジン（ＣまたはＴ）の補体とするために、Ｉ（プリンイノシン）などの塩基を使用することも可能である。

抗体
別の実施形態において、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、５４、５６、５８、６０、６２、６４、７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３および４６５からなる群から選択されるアミノ酸配列にコードされるポリペプチドに結合することができる抗体が提供される。より好ましくは、群は配列番号７９、１３９、１３３、４３３、１１１、１７１、１１３および１７３からなる。

本明細書に言及されている抗体は、本発明において有用なポリペプチドに結合することができ、よって、他の箇所で考察している通り、上に列挙する配列のバリアントおよび／または断片であるポリペプチドに結合する抗体を含む。特に、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体は、中和抗体である。用語、中和抗体は、特定のタンパク質、ポリペプチドまたは感染体（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｄｙ）に結合し、これにより前記タンパク質、ポリペプチドまたは感染体の効果を無効化または低下させることができる抗体を指す。より具体的には、中和抗体は、例えば、成長、組織付着、伝播、組織損傷等を低下または限定することにより、宿主における感染を惹起および／または永続化する病原体の能力を中和または低下させることができるいずれかの抗体である。

本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチドに対する抗体は、上で考察した方法における受動免疫化のために使用することができる。よって、本発明は、本明細書に開示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる少なくとも１種の抗体を含む組成物を提供する。本発明による抗体の組合せは、同時投与、個別投与のまたは連続的投与のために提供される。本発明は、また、かかる抗体を含む免疫原性の医薬組成物を提供する。本明細書において、本発明の文脈において、用語「抗体（単数または複数）」は、本発明の抗体の組合せを含む。特に、本発明は、（ａ）Ｄｉｆ４４抗原、Ｄｉｆ５１抗原、Ｄｉｆ１３０抗原、Ｄｉｆ１５３抗原、Ｄｉｆ１８３抗原、Ｄｉｆ１９２抗原、Ｄｉｆ２０８抗原、Ｄｉｆ２０８Ａ抗原およびＤｉｆ２３２抗原、好ましくは、Ｄｉｆｆ４４またはＤｉｆ２０８抗原を認識する抗体からなる群から選択される１種または複数の抗体、（ｂ）ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原を認識する抗体ならびに（ｃ）ＴｃｄＡ抗原（好ましくは、ＴｏｘＡ＿ｐ５＿６）を認識する抗体を含む抗体の組合せを提供する。組合せは、組成物中に存在し得る。

抗体を含む組成物は、治療において使用することができる。本発明は、また、例えばＣＤＡＤに対する受動免疫化のための、薬および治療における本発明の抗体の使用を提供する。本発明は、また、医薬の製造におけるかかる抗体の使用を提供する。本発明は、また、有効量の本発明の抗体を投与するステップを含む、哺乳動物を処置するための方法を提供する。組成物に関して上述の通り、これらの方法および使用は、哺乳動物がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染から保護されることを可能にする。特に、本発明の抗体は、哺乳動物に、有効量の本明細書に記載されている抗体の組合せまたはかかる組合せを含む組成物を投与するステップを含む、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染を処置または防止する方法において使用することができる。これらの方法において、本発明の少なくとも２種（例えば、２、３または４種）の抗体は、同時に、個別にまたは順次投与することができる。

本発明の抗体は、典型的に、例えば、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭまたはより緊密な親和性で、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のポリペプチドに特異的に結合するであろう。用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子およびポリペプチドに結合することができるその断片を含む。これらは、ハイブリッド（キメラ）抗体分子［８４、８５］；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）断片ならびにＦｖ分子；非共有結合ヘテロ二量体［８６、８７］；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）［８８］；二量体および三量体抗体断片構築物；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）［８９、９０］；ヒト化抗体分子［９１〜９３］；ならびにかかる分子から得られるいずれかの機能的断片、およびファージディスプレイなどの非従来プロセスにより得られる抗体を含む。一部の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を得る方法は、当該技術分野において周知である。一部の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体または完全なヒト抗体である。

本発明は、また、本発明の抗体の組合せを含む組成物を提供する。例えば、本発明の抗原の組合せに従った少なくとも３種（即ち、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種）のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原（前記抗原のいずれかのバリアントおよび免疫原性断片を含む）に特異的な異なる抗体の組合せを含む組成物ならびに、本発明の抗体の組合せの混合物を調製するためのプロセスであって、上に定義されている抗体の組合せのいずれかの抗体を混合するステップを含むプロセスが提供される。例えば、本発明は、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチドおよび／またはそのエピトープを認識する抗体から選択される少なくとも２種（即ち、２、３または４種）の抗体を混合するステップを含むプロセスを提供する。抗体の混合物を調製するための本発明によるプロセスは、混合物を医薬として製剤化するさらなるステップを含むことができる。かかるプロセスは、医薬としての貯蔵または流通のために製剤を包装するステップをさらに含むことができる。

抗生物質
抗生物質による処置またはその投与の間またはその後などのある特定の状況において、腸管内菌叢の自然な均衡が撹乱される。その結果、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、より蔓延するようになり、感染の症状をもたらし得る。よって、抗生物質と併せて本発明の組成物を使用して、根底にある状態を処置し、いずれかのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を同時に防止または処置することができる。

一実施形態において、方法は、有効量の本発明の組成物を投与し、続いて抗生物質を投与するステップを含む。代替法において、方法は、抗生物質を投与し、続いて本発明の組成物を投与するステップを含む。さらなる代替法において、方法は、本発明の組成物の投与と同時に抗生物質を投与するステップを含む。よって、抗生物質および有効量の１種または複数のポリペプチドは、順次または個別に投与することができる。典型的には、これらの方法において使用される抗生物質は、根底にある感染の処置に適しているが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＡＡＤに関連することが公知の抗生物質である。いずれの抗生物質も、抗生物質関連下痢またはより重度のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染関連状態の１種を引き起こし得るが、最も一般的な原因物質は、アンピシリン、クリンダマイシン、セフポドキシムなどのセファロスポリンおよび全フルオロキノロンである。よって、これらの方法は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＡＡＤに高頻度で関連付けられることが当該技術分野において公知の抗生物質を取り込む処置レジメ（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｇｉｍｅ）に特に適する。したがって、一部の実施形態において、本発明の組成物は、上に示す抗生物質などの抗生物質をさらに含むことができる。

組成物および医薬
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３１、３５７、３５９、３６１、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１種もしくは複数のポリペプチド、ならびに／または
（ｂ）（ａ）に列挙されている群から選択されるアミノ酸配列をコードする１種もしくは複数の核酸、または配列番号７０、７２、７４、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９２、１９４、２５９、２６１、２６３、２７５、２６７、２６９、２７１、２７３、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３５６、３５８、３６０、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２および４６４からなる群から選択される１種もしくは複数の核酸配列、ならびに／または
（ｃ）（ａ）に列挙されている群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる１種もしくは複数の抗体、または中和抗体である、（ａ）に列挙されている群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合することができる１種もしくは複数の抗体
を含む組成物を提供する。

あらゆる事例において、配列番号７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３および４６５の配列を有する分子、またはこれらの配列を有する分子をコードするもしくはこの分子に結合する分子が好ましく、配列番号７９、１３９、１３３、４３３、１１１、１７１、１１３および１７３の配列を有する分子、またはこれらの配列を有する分子をコードするもしくはこの分子に結合する分子が特に好ましい。

さらなる実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１種の医薬品担体（複数可）および／または賦形剤を含む。特に、本発明の組成物は、医薬品またはワクチン組成物である。

別の実施形態において、本発明は、配列番号７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３１、３５７、３５９、３６１、４２７、４２９、４３１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３および４６５からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを含む、これから本質的になるまたはこれからなるポリペプチドの組合せを含む組成物を提供する。特に、かかる組成物は、上に列挙されている群から選択される２種以上（即ち、２、３種以上）のアミノ酸配列を含む、これから本質的になるまたはこれからなるポリペプチドの組合せを含む。特に好ましい組成物は、配列番号７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３および４６５からなる群、または配列番号７９、１３９、１３３、４３３、１１１、１７１、１１３および１７３からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドを含む、これから本質的になるまたはこれからなるポリペプチドの組合せを含むことができる。特に、かかる好ましい組成物は、配列番号７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３および４６５からなる群、または配列番号７９、１３９、１３３、４３３、１１１、１７１、１１３および１７３からなる群から選択される２種以上（即ち、２、３種以上）のアミノ酸配列を含む、これから本質的になるまたはこれからなるポリペプチドの組合せを含むことができる。

本発明の好ましい組成物は、Ｄｉｆ４４（ＣＤ０８４４）、Ｄｉｆ５１（ＣＤ０９９９）、Ｄｉｆ１３０（ＣＤ２６４５）、Ｄｉｆ１９２（ＣＤ１０３５）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、Ｄｉｆ２３２（ＣＤ１０３１）、Ｄｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）およびＤｉｆ２０８Ａからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドをコードする少なくとも１種のアミノ酸配列の組合せを含む、これから本質的になるまたはこれからなることができる。特に、かかる好ましい組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチドの組合せを含み、より具体的には、これは、Ｄｉｆ４４（ＣＤ０８４４）、Ｄｉｆ５１（ＣＤ０９９９）、Ｄｉｆ１３０（ＣＤ２６４５）、Ｄｉｆ１９２（ＣＤ１０３５）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、Ｄｉｆ２３２（ＣＤ１０３１）、Ｄｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）およびＤｉｆ２０８Ａからなる群から選択される２種以上（即ち、２、３、４種）のポリペプチドを含む、これから本質的になるまたはこれからなる。Ｄｉｆ４４（ＣＤ０８４４）およびＤｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）が特に好ましい。

本発明の特定の組成物は、ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）およびポリペプチドＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）；および／またはポリペプチドＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）およびポリペプチドＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）；および／またはポリペプチドＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）およびポリペプチドＤＩＦ２０８（ＣＤ２８３１）；および／またはポリペプチドＤｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）およびポリペプチドＤＩＦ２２５（ＣＤ０４３８）；および／またはポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）およびポリペプチドＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）；および／またはポリペプチドＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）およびポリペプチドＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）；および／またはポリペプチドＤｉＦ１８３（ＣＤ３６６９）およびポリペプチドＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）；および／またはポリペプチドＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）およびポリペプチドＤＩＦ２０８Ａ（ＣＤ２８３１）；ポリペプチドＤｉｆ４４（ＣＤ０８４４）、Ｄｉｆ５１（ＣＤ０９９９）、Ｄｉｆ１３０（ＣＤ２６４５）および／またはＤｉｆ１９２（ＣＤ１０３５）；および／またはポリペプチドＤｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、Ｄｉｆ２３２（ＣＤ１０３１）および／またはＤｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）；および／またはポリペプチドＤｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、Ｄｉｆ２３２（ＣＤ１０３１）および／またはＤｉｆ２０８Ａ（ＣＤ２８３１）；および／またはポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）および／またはＤｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）；および／またはポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、および／またはＤｉｆ２０８Ａ（ＣＤ２８３１）；および／またはポリペプチドＤｉｆ５１（ＣＤ０９９９）、Ｄｉｆ１３０（ＣＤ２６４５）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）、および／またはＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）；および／またはポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）と、ポリペプチドＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）、ＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、ＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）、ＤＩＦ２０８（ＣＤ２８３１）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）およびＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）のうち１種もしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、７種）または少なくとも１、２、３、４、５もしくは６種、例えば、ポリペプチドＤＩＦ４４と、ポリペプチドＤＩＦ１５３、ＤＩＦ１９２、ＤＩＦ２０８、Ｄｉｆ１８３およびＤｉｆ２３２のうち１種もしくは複数（例えば、２、３、４種）または少なくとも１、２もしくは３種、例えば、ＤＩＦ４４と、ＤＩＦ１５３、ＤＩＦ４４およびＤＩＦ１９２、ＤＩＦ４４とＤＩＦ２０８、ＤＩＦ４４とＤｉｆ１８３、ＤＩＦ４４とＤＩＦ２３２；および／またはポリペプチドＤＩＦ２０８（ＣＤ２８３１）と、ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、ＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）、ＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、ＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）およびＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）のうち１種もしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、７種）または少なくとも１、２、３、４、５もしくは６種、例えば、ポリペプチドＤＩＦ２０８と、ポリペプチドＤＩＦ４４、ＤＩＦ１５３、ＤＩＦ１９２、Ｄｉｆ１８３およびＤｉｆ２３２のうち１種もしくは複数（例えば、２、３、４種）または少なくとも１、２もしくは３種、例えば、ＤＩＦ２０８とＤＩＦ１５３、ＤＩＦ２０８とＤＩＦ１９２、ＤＩＦ２０８とＤｉｆ１８３、ＤＩＦ２０８とＤＩＦ２３２；および／またはポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、Ｄｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）と、ＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）、ＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、ＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）およびＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）のうち１種もしくは複数（例えば、２、３、４、５、６種）または少なくとも１、２、３、４もしくは５種、例えば、ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、Ｄｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）と、ポリペプチドＤＩＦ１５３、ＤＩＦ１９２、Ｄｉｆ１８３およびＤｉｆ２３２のうち１種もしくは複数（例えば、２または３または４種）または少なくとも１もしくは２もしくは３種の組合せを含む、これから本質的になるまたはこれからなることができる。

本発明の組成物中の列挙されている分子に対する抗体の組合せと同様に、言及されているペプチドの組合せをコードする核酸分子の組合せを使用することができるように、均等な組合せまたは組成物は、コード核酸分子および／または列挙されている分子に対する抗体を使用して作製することができる。特に、本発明の組成物は、免疫原性組成物である。

上で考察する通り、本発明の上述の組成物および組合せの全ては、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅまたはＣＤＡＤに対し保護効果をもたらす１種または複数の追加的な抗原、かかる抗原をコードする分子またはかかる抗原に結合する分子（例えば、抗体）を追加的に含むことができる。関連する分子およびこれらの分子の配列は、本明細書の他の箇所に提示されている。

そのようなものとして、本発明の好ましい組成物は、ＴｏｘＢ−ＧＴおよびＴｄｃＡ、ならびにＤｉｆ４４（ＣＤ０８４４）、Ｄｉｆ５１（ＣＤ０９９９）、Ｄｉｆ１３０（ＣＤ２６４５）、Ｄｉｆ１９２（ＣＤ１０３５）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、Ｄｉｆ２３２（ＣＤ１０３１）およびＤｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチド、例えば、Ｄｉｆ４４（ＣＤ０８４４）、Ｄｉｆ５１（ＣＤ０９９９）、Ｄｉｆ１３０（ＣＤ２６４５）、Ｄｉｆ１９２（ＣＤ１０３５）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、Ｄｉｆ２３２（ＣＤ１０３１）およびＤｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）からなる群から選択される２種以上（即ち、２、３、４種）のポリペプチドの組合せを含む、これから本質的になるまたはこれからなることができる。

ＤＩＦ４４、ＤＩＦ５１、ＤＩＦ１３０、ＤＩＦ１５３、ＤＩＦ１９２、ＤＩＦ２０８、Ｄｉｆ１８３および／またはＤＩＦ２３２ポリペプチドの上に列挙されている組合せの全ては、上で考察し定義されている通り、ＴｏｘＢ−ＧＴおよびＴｃｄＡと追加的に組み合わせて作製することもできる。ＴｃｄＡは、ＴｏｘＡ−Ｂ、ＴｏｘＡ−ＰＴＡ２、ＴｏｘＡ−Ｐ５−７、ＴｏｘＡ−Ｐ５−６、ＴｏｘＡ−Ｐ９−１０、ＴｏｘＡ−Ｂ２、ＴｏｘＡ−Ｂ３、ＴｏｘＡ−Ｂ５、ＴｏｘＡ−Ｂ６および／またはＴｏｘＡ−Ｂ７から選択され、好ましい組合せは、ＴｃｄＡがＴｏｘＡ−Ｐ５−６である組合せである。最も好ましい組合せは、（ｉ）ＴｏｘＢ−ＧＴ、ＴｏｘＡ−Ｐ５−６およびＤＩＦ４４、（ｉｉ）ＴｏｘＢ−ＧＴ、ＴｏｘＡ−Ｐ５−６およびＤＩＦ２０８、（ｉｉｉ）ＴｏｘＢ−ＧＴ、ＴｏｘＡ−Ｐ５−６、ＤＩＦ４４およびＤＩＦ２０８である。

かかる組合せの例として、次の抗原の組合せが挙げられる：
Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋Ｄｉｆ２０８；Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋Ｄｉｆ２０８Ａ；Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋Ｄｉｆ５１；Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋Ｄｉｆ４４；Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋Ｄｉｆ１３０；Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋Ｄｉｆ１９２；Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋Ｄｉｆ１８３；Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋Ｄｉｆ１５３；Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋Ｄｉｆ２３２。

よって、本発明は、また、次の抗原の組合せまたは次の抗原の組合せのいずれかを認識する抗体を含む抗体の組合せを提供する：Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）およびポリペプチドＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）およびポリペプチドＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）およびポリペプチドＤＩＦ２０８（ＣＤ２８３１）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤｉＦ１８３（ＣＤ３６６９）およびポリペプチドＤＩＦ２２５（ＣＤ０４３８）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）およびポリペプチドＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）およびポリペプチドＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤｉＦ１８３（ＣＤ３６６９）およびポリペプチドＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）およびポリペプチドＤＩＦ２０８Ａ（ＣＤ２８３１）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤｉｆ４４（ＣＤ０８４４）、Ｄｉｆ５１（ＣＤ０９９９）、Ｄｉｆ１３０（ＣＤ２６４５）および／またはＤｉｆ１９２（ＣＤ１０３５）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、Ｄｉｆ２３２（ＣＤ１０３１）および／またはＤｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、Ｄｉｆ２３２（ＣＤ１０３１）および／またはＤｉｆ２０８Ａ（ＣＤ２８３１）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）および／またはＤｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）および／またはＤｉｆ２０８Ａ（ＣＤ２８３１）；Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｄｃＡ＋ポリペプチドＤｉｆ５１（ＣＤ０９９９）、Ｄｉｆ１３０（ＣＤ２６４５）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）および／またはＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）。

ＴｄｃＡは、ＴｏｘＡ−Ｂ、ＴｏｘＡ−ＰＴＡ２、ＴｏｘＡ−Ｐ５−７、ＴｏｘＡ−Ｐ５−６、ＴｏｘＡ−Ｐ９−１０、ＴｏｘＡ−Ｂ２、ＴｏｘＡ−Ｂ３、ＴｏｘＡ−Ｂ５、ＴｏｘＡ−Ｂ６および／またはＴｏｘＡ−Ｂ７から選択される。例えば、本発明は、また、次の抗原の組合せまたは次の抗原の組合せのいずれかを認識する抗体を含む抗体の組合せを提供する：Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）およびポリペプチドＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）およびポリペプチドＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）およびポリペプチドＤＩＦ２０８（ＣＤ２８３１）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）およびポリペプチドＤＩＦ２２５（ＣＤ０４３８）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）およびポリペプチドＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）およびポリペプチドＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）およびポリペプチドＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）およびポリペプチドＤＩＦ２０８Ａ（ＣＤ２８３１）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤｉｆ４４（ＣＤ０８４４）、Ｄｉｆ５１（ＣＤ０９９９）、Ｄｉｆ１３０（ＣＤ２６４５）および／またはＤｉｆ１９２（ＣＤ１０３５）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、Ｄｉｆ２３２（ＣＤ１０３１）および／またはＤｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、Ｄｉｆ２３２（ＣＤ１０３１）および／またはＤｉｆ２０８Ａ（ＣＤ２８３１）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）および／またはＤｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）および／またはＤｉｆ２０８Ａ（ＣＤ２８３１）；および／またはＴｏｘ−ＧＴ＋ＴｏｘＡ−Ｐ５−６＋ポリペプチドＤｉｆ５１（ＣＤ０９９９）、Ｄｉｆ１３０（ＣＤ２６４５）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）、ＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）および／またはＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）。

Ｔｏｘ−ＧＴ＋ＴｃｄＡ（好ましくは、ＴｏｘＡ−Ｐ５−６）はまた、ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）と、ポリペプチドＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）、ＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、ＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）、ＤＩＦ２０８（ＣＤ２８３１）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）およびＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）のうち１種もしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、７種）または少なくとも１、２、３、４、５もしくは６種、例えば、ポリペプチドＤＩＦ４４と、ポリペプチドＤＩＦ１５３、ＤＩＦ１９２、ＤＩＦ２０８、Ｄｉｆ１８３、ＤＩＦ２３２のうち１種もしくは複数（例えば、２、３、４種）または少なくとも１、２もしくは３種、例えば、ＤＩＦ４４とＤＩＦ１５３、ＤＩＦ４４とＤＩＦ１９２、ＤＩＦ４４とＤＩＦ２０８、ＤＩＦ４４とＤｉｆ１８３、ＤＩＦ４４とＤＩＦ２３２；および／またはポリペプチドＤＩＦ２０８（ＣＤ２８３１）と、ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、ＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）、ＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、ＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）およびＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）のうち１種もしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、７種）または少なくとも１、２、３、４、５もしくは６種、例えば、ポリペプチドＤＩＦ２０８と、ポリペプチドＤＩＦ４４、ＤＩＦ１５３、ＤＩＦ１９２、Ｄｉｆ１８３のうち１種もしくは複数（例えば、２、３、４種）または少なくとも１、２もしくは３種、例えば、ＤＩＦ２０８とＤＩＦ１５３、ＤＩＦ２０８とＤＩＦ１９２、ＤＩＦ２０８とＤｉｆ１８３、ＤＩＦ２０８とＤＩＦ２３２；および／またはポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、Ｄｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）と、ＤＩＦ５１（ＣＤ０９９９）、ＤＩＦ１３０（ＣＤ２６４５）、ＤＩＦ１５３（ＣＤ２８３０）、ＤＩＦ１９２（ＣＤ１０３５）、Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）およびＤＩＦ２３２（ＣＤ１０３１）のうち１種もしくは複数（例えば、２、３、４、５、６種）または少なくとも１、２、３、４もしくは５種、例えば、ポリペプチドＤＩＦ４４（ＣＤ０８４４）、Ｄｉｆ２０８（ＣＤ２８３１）と、ポリペプチドＤＩＦ１５３、ＤＩＦ１９２、Ｄｉｆ１８３、ＤＩＦ２３２のうち１種もしくは複数（例えば、２または３または４種）または少なくとも１もしくは２もしくは３種と組み合わせることができる。

列挙されている分子に結合する抗体の組合せ（例えば、抗原の組合せのいずれかを認識する）と同様に、言及されているペプチドの組合せをコードする核酸分子の組合せを使用することができるように、均等な組合せまたは組成物は、コード核酸分子および／または列挙されている分子に結合する抗体（例えば、抗原の組合せのいずれかを認識する）を使用して作製することができる。免疫原性組成物は、一般に、少なくとも１種の抗原性タンパク質または抗原を含むであろう。ＤＩＦ２０８が言及されている場合、これは、これらの組合せにおいてＤＩＦ２０８ＡまたはＤＩＦ２０８Ｂと置換することができる。

本発明の組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を防止または処置するための方法において使用することができる。よって、本発明は、上述のポリペプチドのうち１種または複数を含む有効量の本発明の組成物を投与するステップを含む、哺乳動物において免疫応答を発生させるための方法を提供する。免疫応答は、典型的に、保護的であり、抗体および／または細胞媒介性免疫に関与する。本発明は、また、本発明の有効量の組成物を投与するステップを含む、哺乳動物におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を防止または処置するための方法を提供する。方法は、追加免疫応答を発生させることができる。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の主な原因の１つは、腸管内菌叢を撹乱する抗生物質の使用である。したがって、本発明の組成物は、根底にある状態を処置し、また、いずれかのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染も共に処置または防止するための抗生物質による処置レジメにおいて使用することができる。これらの組成物および方法の使用により、哺乳動物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染、特に、院内感染から保護することができる。一部の実施形態において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染は、下痢、抗生物質関連下痢（ＡＡＤ）、腹痛、発熱、白血球増多症、偽膜性結腸炎または中毒性巨大結腸症のうち１種または複数をもたらし、前記処置は、これらのうち１種または複数を防止、低下または排除することができる。

一部の実施形態において、本発明の組成物は、例えばＣＤＡＤに対する受動免疫化のための、薬および治療法における使用のための組成物である。本発明は、また、好ましくは本明細書に言及されている処置の種類のいずれかのための、医薬の製造におけるかかる抗体または組成物の使用を提供する。

さらなる実施形態において、本発明の組成物は、哺乳動物におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の防止または処置における使用のための組成物である。

一部の実施形態において、本発明は、また、好ましくは、本明細書に言及されている処置の種類のいずれかのための、医薬の製造における本発明のポリペプチド、核酸および抗体の使用を提供する。

前記免疫原性組成物が、動物から疾患を防止、寛解、緩和または排除する場合、免疫原性組成物は、必要に応じてワクチンと称することができる。用語「ワクチン」は、本明細書において使用される場合、疾患を引き起こす生物の非存在下における、精製された抗原性決定基、精製された抗原決定基をコードする核酸またはこれらの断片のいずれかを含むワクチン組成物を指す。かかるワクチンは、「サブユニットワクチン」と称することもできる。この用語は、「全細胞ワクチン」、例えば、死滅した細菌細胞全体に由来し、複合的で特徴付けられていない組成物の部分として未精製型の抗原性決定基を含有し得るワクチンを包含することを意図しない。よって、特定の実施形態において、全細胞ワクチンは、除外することができる、または拒否される。本明細書において使用される場合、用語「多価」は、ワクチンが、少なくとも２種の株または単離株に由来する構造的に類似または「関係した」抗原性決定基を含有し、抗原性決定基が、そのアミノ酸配列の間に僅かな差を有するホモログであることを意味する。

よって、本発明の組成物は、ワクチンとして有用となり得る。本発明によるワクチンは、予防的（即ち、感染を防止する）または治療的（即ち、感染を処置する）のいずれかとなり得るが、典型的には、予防的となるであろう。用語「感染から保護される」は、対象の免疫系が予備刺激されて（例えば、ワクチン接種により）、免疫応答を誘発し、感染を撃退することを意味する。当業者であれば、ワクチン接種された対象が、これにより感染し得るが、対照対象よりも良く感染を撃退できることが明らかであろう。用語「処置」は、治療的処置および予防的または防止的処置の両方を含み、その目的は、感染を防止または減らすことである。例えば、処置は、直接的な影響もしくは治癒、抑制、阻害、防止、重症度低下、発病遅延、例えば感染関連症状の低下またはこれらの組合せを含むことができる。「防止」は、とりわけ、症状の発病遅延、疾患再発防止等を指すことができる。処置は、感染または疾病の「抑制」または「阻害」、例えば、症状の重症度、数、発生率もしくは潜伏期の低下、症状の寛解、二次症状の低下、二次感染の低下、患者生存期間の延長またはこれらの組合せを含むこともできる。

用語「抗原」は、対象が体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を惹起することができる分子を指す。組成物またはワクチンに対する「免疫学的応答」は、対象とする組成物またはワクチンに対する細胞性および／または抗体媒介性免疫応答の宿主における発達である。通常、「免疫学的応答」として、次の効果のうち１種または複数が挙げられるがこれらに限定されない：対象とする組成物またはワクチンに含まれる抗原（単数または複数）へと特異的に方向づけられた、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生。好ましくは、対象は、新たな感染に対する抵抗性が増強されるおよび／または疾患の臨床重症度が低下するように、治療的または保護的免疫学的応答のいずれかを呈するであろう。かかる保護は、感染した対象によって正常に呈される症状の低下または欠如、感染した宿主におけるより迅速な回復時間および／またはより低いウイルス力価のいずれかにより実証されるであろう。用語「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドは、本明細書において使用される場合、上述の通り免疫学的応答を誘発するアミノ酸配列も指す。

よって、組成物は、薬学的に許容され得る。組成物は、通常、抗原に加えて構成成分を含むであろう、例えば、典型的には、１種または複数の医薬品担体（複数可）および／または賦形剤（複数可）を含む。かかる構成成分の徹底的な考察は、［９４］において得ることができる。組成物は、水性形態で哺乳動物に投与することができる。しかし、組成物は、投与前は非水性形態であってもよい。例えば、一部のワクチンは、水性形態で製造され、続いて同様に水性形態で充填され、流通され、投与されるが、他のワクチンは、製造の間に凍結乾燥され、使用時に水性形態へと再構成される。よって、本発明の組成物は、凍結乾燥製剤のように乾燥されていてよい。

組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存料を含むことができる。しかし、ワクチンは、水銀材料を実質的に含むべきではなく（即ち、５μｇ／ｍｌ未満）、例えば、チオメルサールを含まないことが好ましい。水銀を含有しないワクチンがより好ましい。保存料を含まないワクチンが特に好ましい。熱安定性を改善するために、組成物は、温度保護剤を含むことができる。かかる薬剤のさらなる詳細を下に提示する。浸透圧を制御するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことが好ましい。１〜２０ｍｇ／ｍｌの間、例えば、約１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌで存在し得る塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましい。存在し得る他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム・無水物（ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等を含む。組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に収まるであろう。組成物は、１種または複数のバッファーを含むことができる。典型的なバッファーは、リン酸バッファー；Ｔｒｉｓバッファー；ホウ酸バッファー；コハク酸バッファー；ヒスチジンバッファー（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを含有する）；またはクエン酸塩バッファーを含む。バッファーは、典型的に、５〜２０ｍＭ範囲内で含まれるであろう。組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より典型的には、６．０〜８．０の間、例えば、６．５〜７．５の間または７．０〜７．８の間となるであろう。組成物は、好ましくは、無菌である。組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、用量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準尺度）、好ましくは、用量当たり＜０．１ＥＵを含有する。組成物は、好ましくはグルテンを含まない。

組成物は、単回免疫化のための材料を含むことができる、または複数回免疫化のための材料を含むことができる（即ち、「複数用量」キット）。複数用量構成では、保存料の包含が好ましい。複数用量組成物中に保存料を含むことに代えて（またはそれに加えて）、組成物は、材料除去のための無菌アダプタを有する容器に含有され得る。ヒトワクチンは、典型的に、約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、半分の用量（即ち、約０．２５ｍｌ）を小児に投与することができる。

本発明の組成物は、１種または複数の免疫調節剤を含むこともできる。好ましくは、免疫調節剤のうち１種または複数は、１種または複数のアジュバントを含む。アジュバントは、ＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントを含むことができる。本発明の組成物において使用することができるアジュバントとして、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：
・水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）および硫酸塩等を含む、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩［例えば、参考文献９５の第８および９章を参照］；
・ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化）［参考文献９５の第１０章、参考文献９６〜９９、参考文献１００の第１０章および参考文献１０１の第１２章も参照］、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む、スクアレン−水エマルションなどの水中油型エマルション；
・ＱＳ２１［１０２］およびＩＳＣＯＭ［参考文献９５の第２３章］などのサポニン製剤［参考文献９５の第２２章］；
・ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）［１０３〜１０９］；
・腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体［１１０、１１１］などの細菌誘導体または微生物誘導体、ＩＣ−３１（商標）［１１８］（２６−ｍｅｒ配列５’−（ＩＣ）_１３−３’（配列番号３５４）を含むデオキシヌクレオチドおよび１１−ｍｅｒアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号３５５）を含むポリカチオン性ポリマーポリペプチド）などの免疫賦活性オリゴヌクレオチド［１１２〜１１７］ならびにＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒型誘導体［１１９〜１２８］；
・インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１２９、１３０］）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子などのサイトカインを含むヒト免疫調節物質；
・ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ）、多糖およびカルボキシメチルセルロース［１３２］の架橋誘導体などのキトサンおよびその誘導体、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［１３１］または粘膜接着剤などの生体接着剤および粘膜接着剤；
・生分解性かつ無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトン等）から形成された微粒子（即ち、ほぼ１００ｎｍ〜ほぼ１５０μｍの直径、より好ましくは、ほぼ２００ｎｍ〜ほぼ３０μｍの直径、最も好ましくは、ほぼ５００ｎｍ〜ほぼ１０μｍの直径の粒子）；
・リポソーム［９５の第１３および１４章、１３３〜１３５］；
・ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［１３６］；
・ＰＣＰＰ製剤［１３７および１３８］；
・Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン ＭＴＰ−ＰＥ）を含むムラミルポリペプチド；ならびに
・Ｉｍｉｑｕａｍｏｄおよびそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」）を含むイミダゾキノロン（ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）化合物［１３９および１４０］。

本発明の組成物およびワクチンは、上に同定されているアジュバントのうち１種または複数の態様の組合せを含むこともできる。例えば、次のアジュバント組成物を本発明において使用することができる：（１）サポニンおよび水中油型エマルション［１４１］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１４２］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［１４３］；（５）３ｄＭＰＬと例えばＱＳ２１および／もしくは水中油型エマルションとの組合せ［１４４］；（６）サブミクロンエマルションとなるようマイクロフルイダイズされた、またはより大きい粒径エマルションを生成するためにボルテックスされた、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ；（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０ならびにモノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群に由来する１種または複数の細菌細胞壁構成成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１種または複数の無機塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（３ｄＭＰＬなど）。

免疫賦活剤として作用する他の物質は、［９５］の第７章に開示されている。水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が特に好ましく、抗原は一般に、これらの塩に吸着される。リン酸カルシウムは、別の好ましいアジュバントである。他の好ましいアジュバントの組合せは、ＣｐＧおよびアラムまたはレシキモドおよびアラムなどのＴｈ１およびＴｈ２アジュバントの組合せを含む。リン酸アルミニウムおよび３ｄＭＰＬの組合せを使用してもよい（これは、肺炎球菌免疫化において有効であると報告されている［１４５］）。

本発明の組成物は、細胞媒介性免疫応答と体液性免疫応答の両方を誘発することができる。この免疫応答は、好ましくは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ曝露の際に迅速に応答することができる、長続きする（例えば、中和）抗体および細胞媒介性免疫を誘導するであろう。２種類のＴ細胞、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞は、一般に、細胞媒介性免疫および体液性免疫の惹起および／または増強に必要であると考えられる。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現することができ、一般に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と称される。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子に提示される抗原を認識またはこれと相互作用することができる。ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現することができ、一般に、Ｔヘルパー細胞と称される。ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原性ペプチドを認識することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用すると、ＣＤ４細胞は、サイトカインなどの因子を分泌することができる。このような分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージおよび免疫応答に関与する他の細胞を活性化することができる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、２種の機能的に別個のサブセットへとさらに分けることができる：そのサイトカインおよびエフェクター機能が異なるＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型。活性化されたＴＨ１細胞は、細胞性免疫を増強し（抗原特異的ＣＴＬ産生の増加を含む）、したがって、細胞内感染に対する応答に特に価値がある。活性化したＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βのうち１種または複数を分泌することができる。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することにより局所的炎症反応をもたらすことができる。ＴＨ１免疫応答は、ＩＬ−１２によりＢ細胞およびＴ細胞の成長を刺激することにより免疫応答を増やすように作用することもできる。ＴＨ１刺激されたＢ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌することができる。活性化されたＴＨ２細胞は、抗体産生を増強し、したがって、細胞外感染に対する応答に価値がある。活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０のうち１種または複数を分泌することができる。ＴＨ２免疫応答は、将来的な保護のためにＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびメモリーＢ細胞の産生をもたらし得る。増強された免疫応答は、増強されたＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答のうち１種または複数を含むことができる。ＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答に関連するサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βなど）のうち１種もしくは複数の増加、活性化されたマクロファージの増加、ＮＫ活性の増加またはＩｇＧ２ａの産生の増加のうち１種または複数を含むことができる。一部の実施形態において、増強されたＴＨ１免疫応答は、ＩｇＧ２ａ産生の増加を含むであろう。ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを使用して誘発することができる。ＴＨ１アジュバントは一般に、アジュバントなしの抗原の免疫化と比べて増加したレベルのＩｇＧ２ａ産生を誘発するであろう。本発明における使用に適したＴＨ１アジュバントは、例えば、サポニン製剤、ビロソームおよびウイルス様粒子、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含むことができる。ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、本発明における使用のための典型的なＴＨ１アジュバントである。ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答に関連するサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０など）のうち１種もしくは複数の増加、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびメモリーＢ細胞の産生の増加のうち１種または複数を含むことができる。一部の実施形態において、増強したＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１産生の増加を含むであろう。ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを使用して誘発することができる。ＴＨ２アジュバントは、一般に、アジュバントなしの抗原の免疫化と比べて増加したレベルのＩｇＧ１産生を誘発するであろう。本発明における使用に適したＴＨ２アジュバントは、例えば、ミネラル含有組成物、油エマルションならびにＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒型誘導体を含む。アルミニウム塩などのミネラル含有組成物は、本発明における使用のための典型的なＴＨ２アジュバントである。

一部の実施形態において、本発明は、ＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントの組合せを含む組成物を含む。多くの場合、かかる組成物は、アジュバントなしの免疫化と比べて、増強されたＴＨ１および増強されたＴＨ２応答、即ち、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生両方の産生の増加を誘発する。一般に、ＴＨ１およびＴＨ２アジュバントの組合せを含む組成物は、単一アジュバントによる免疫化と比べて（即ち、ＴＨ１アジュバント単独による免疫化またはＴＨ２アジュバント単独による免疫化と比べて）、増加されたＴＨ１免疫応答および／または増加されたＴＨ２免疫応答を誘発する。免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方となり得る。免疫応答は、増強されたＴＨ１応答および増強されたＴＨ２応答の一方または両方をもたらし得る。増強された免疫応答は、全身性免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方となり得る。免疫応答は、増強された全身性免疫応答および増強された粘膜免疫応答の一方または両方をもたらし得る。典型的には、粘膜免疫応答は、ＴＨ２免疫応答である。典型的には、粘膜免疫応答は、ＩｇＡの産生の増加を含む。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染は、身体の様々な区域に罹患し得るため、本発明の組成物は、様々な形態で調製することができる。例えば、組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製することができる。注射前に液体媒体へと溶解または懸濁するのに適した固形を調製することもできる（例えば、凍結乾燥組成物またはスプレーフリーズドライ組成物）。組成物は、局所投与のために、例えば、軟膏、クリームまたは粉末として調製することができる。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤もしくはカプセルとして、スプレーとしてまたはシロップとして（必要に応じて風味付けされた）調製することができる。組成物は、肺性投与のために、例えば、微粉末またはスプレーを使用して吸入剤として調製することができる。組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製することができる。組成物は、経鼻投与、経耳投与（ａｕｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）または眼性投与のために、例えば、点滴剤として調製することができる。組成物は、組み合わせた組成物が哺乳動物への投与直前に再構成されるように設計されたキットの形態となり得る。かかるキットは、液状の１種または複数の抗原と、１種または複数の凍結乾燥抗原とを含むことができる。

組成物が、使用前に即時に調製される必要があり（例えば、構成成分が凍結乾燥形態で提示される）、キットとして提示される場合、キットは、２本のバイアルを含むことができる、または１本の既に充填されたシリンジおよび１本のバイアルを含み、シリンジの内容物を使用して、注射前にバイアルの内容物を再活性化させることができる。

ワクチンとして使用される組成物は、免疫学的有効量の抗原（複数可）および必要に応じて他のいずれかの構成成分を含む。「免疫学的有効量」とは、個体へのこの量の投与が、単一用量であれ一連の用量の部分としてであれ、処置または防止に有効であることを意味する。この量は、処置しようとする個体の健康および体調、年齢、処置しようとする個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類等）、抗体を合成する個体の免疫系能力、所望の保護の程度、ワクチンの製剤、処置している医師による医学的状況の評価ならびに他の関連する因子に応じて変動する。この量が、慣例的な治験により決定することができる相対的に広範囲に収まるであろうことが予想される。２種以上の抗原が組成物に含まれる場合、２種の抗原は互いに同じ用量でまたは異なる用量で存在することができる。

上述の通り、組成物は、温度保護剤を含むことができ、この構成成分は、アジュバント化組成物（特に、アルミニウム塩などのミネラルアジュバントを含有する）において特に有用となり得る。参考文献１４６に記載されている通り、液体温度保護剤を水性ワクチン組成物に添加して、その凝固点を下げる、例えば、凝固点を０℃より下に低下させることができる。よって、組成物は、０℃を下回るがその凝固点を上回る温度で貯蔵して、熱による崩壊を阻害することができる。温度保護剤は、凍結し解凍した後の集塊または沈降から無機塩アジュバントを保護しつつ組成物の凍結を可能にすることもでき、温度上昇、例えば、４０℃を上回る温度において組成物を保護することもできる。液体温度保護剤が、容量で最終混合物の１〜８０％を形成するように、出発水性ワクチンおよび液体温度保護剤を混合することができる。適した温度保護剤は、ヒト投与に安全で、水に容易に混和性／可溶性であるべきであり、組成物中の他の構成成分（例えば、抗原およびアジュバント）を損傷するべきではない。例として、グリセリン、プロピレングリコールおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。適したＰＥＧは、２００〜２０，０００Ｄａに及ぶ平均分子量を有することができる。一実施形態において、ポリエチレングリコールは、約３００Ｄａの平均分子量を有することができる（「ＰＥＧ−３００」）。

本発明は、（ｉ）上に開示されている１種または複数の抗原と、（ｉｉ）温度保護剤とを含む組成物を提供する。この組成物は、（ｉ）１種または複数の抗原（例えば、抗原の組合せの抗原のうち２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２種）を含む水性組成物と、（ｉｉ）温度保護剤とを混合することにより形成され得る。続いて、混合物は、例えば、０℃を下回る温度、０〜２０℃、２０〜３５℃、３５〜５５℃またはそれ以上で貯蔵することができる。これは、液体または凍結形態で貯蔵することができる。混合物は、凍結乾燥されていてよい。あるいは、組成物は、（ｉ）１種または複数の抗原を含む乾燥組成物と、（ｉｉ）温度保護剤を含む液体組成物とを混合することにより形成することができる。よって、構成成分（ｉｉ）は、構成成分（ｉ）を再構成するために使用することができる。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖コンジュゲートとの組合せ
本発明のポリペプチドは、糖ポリペプチドと組み合わせて、またはこれとコンジュゲートして使用することができる。よって、本発明は、（１）１種または複数のポリペプチドおよび／もしくは抗体と（２）Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖および担体タンパク質の１種または複数のコンジュゲートとの組合せ；またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖および必要に応じて担体タンパク質にコンジュゲートした１種または複数のポリペプチドおよび／もしくは抗体を含む組成物を提供する。上述の通り、組合せは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を処置もしくは防止する方法において、または免疫応答を生じさせる方法において使用することができる。

この組合せの構成成分（２）において使用されるコンジュゲートは、糖部分および担体部分を含む。糖部分は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに由来する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖は、特に、参考文献１４７に記載されているＰＳ−Ｉ、ＰＳ−ＩＩおよびＰＳ−ＩＩＩ糖から選択することができる。ＰＳ−Ｉは、式Ａの反復五糖単位を含む：

（式中、Ｒｈａはラムノースであり、Ｐはグリコシルホスフェートであり、Ｇｌｃはグルコースである）。

特に、本発明において使用されるＰＳ−Ｉ糖は、式Ａ’のものであり得る：

（式中、ｎは１〜１０００の整数であり、Ｒｈａはラムノースであり、Ｐはグリコシルホスフェートであり、Ｇｌｃはグルコースである）。

ＰＳ−ＩＩは、式Ｂの反復六糖単位を含む：

（式中、Ｇｌｃはグルコースであり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチル−ガラクトサミンであり、Ｐはグリコシルホスフェートであり、Ｍａｎはマンノースである）。

特に、本発明において使用されるＰＳ−ＩＩ糖は、式Ｂ’のものであり得る：

（式中、ｎは１〜１０００の整数であり、Ｇｌｃはグルコースであり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチル−ガラクトサミンであり、Ｐはグリコシルホスフェートであり、Ｍａｎはマンノースである）。

ＰＳ−ＩＩＩは、その共有結合化学構造内にグリセロール、アルジトールホスフェート、グルコースおよびＮ−アセチル−グルコサミンを含む。上述の式（Ａ’）および（Ｂ’）において、整数ｎの値は、典型的に、１〜１００の間、例えば、２〜１００の間、１０〜１００の間または２５〜１００の間である。構成成分（２）において使用されるコンジュゲートにおける担体部分は通常、タンパク質であり、（１）のポリペプチドの１種であってもそうでなくてもよい。典型的な担体タンパク質は、ジフテリアもしくは破傷風毒素などの細菌毒素またはトキソイドあるいはこれらの突然変異体もしくは断片である。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素突然変異体［１４８］が有用である。他の適した担体タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［１４９］、合成ペプチド［１５０、１５１］、熱ショックタンパク質［１５２、１５３］、百日咳タンパク質［１５４、１５５］、サイトカイン［１５６］、リンホカイン［１５６］、ホルモン［１５６］、増殖因子［１５６］、Ｎ１９［１５８］などの様々な病原体由来ポリペプチド由来の複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［１５７］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［１５９〜１６１］、ニューモリシン［１６２］またはその無毒性誘導体［１６３］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［１６４］、鉄取り込みタンパク質［１６５］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ［１６６］、組換えＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエキソプロテインＡ（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）（ｒＥＰＡ）［１６７］等を含む。一部の実施形態において、担体タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質である。他の実施形態において、担体は、本発明のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチドである。

組成物が、２種以上のコンジュゲートを含む場合、各コンジュゲートは、同じ担体タンパク質または異なる担体タンパク質を使用することができる。コンジュゲートは、過剰な担体（ｗ／ｗ）または過剰な糖（ｗ／ｗ）を有することができる。一部の実施形態において、コンジュゲートは、実質的に等しい重量のそれぞれを含むことができる。担体分子は、直接的にまたはリンカーを介して担体に共有結合によりコンジュゲートされ得る。タンパク質への直接的な連結は、例えば、参考文献１６８に記載されている通り、例えば、糖および担体の間の還元的アミノ化により達成することができる。リンカー基を介した連結は、いずれかの公知の手順、例えば、参考文献１６９および１７０に記載されている手順を使用して為すことができる。連結の１種類はアジピン酸リンカーであり、これは、遊離−ＮＨ_２基（例えば、アミノ化により糖に導入される）をアジピン酸と結合させ（例えば、ジイミド活性化を使用）、続いて得られた糖−アジピン酸中間体にタンパク質を結合させることにより形成され得る［１７１、１７２］。連結の別の種類はカルボニルリンカーであり、これは、糖ＣＤＩの遊離ヒドロキシル基の反応［１７３、１７４］と、続くタンパク質との反応でカルバメート結合を形成することにより形成され得る。他のリンカーは、β−プロピオンアミド［１７５］、ニトロフェニル−エチルアミン［１７６］、ハロアシルハライド［１７７］、グリコシド結合［１７８］、６−アミノカプロン酸［１７９］、ＡＤＨ［１８０］、Ｃ_４〜Ｃ_１２部分［１８１］等を含む。カルボジイミド縮合を使用することもできる［１８２］。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖ポリペプチドコンジュゲートは、様々な仕方で、例えば、ａ）マレイミド基を含むリンカーを加えて、活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖を形成することによりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖を活性化するステップと、ｂ）スルフヒドリル基を含むリンカーを加えて、活性化担体タンパク質を形成することにより担体タンパク質を活性化するステップと、ｃ）活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖と活性化担体タンパク質を反応させて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖−担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップとを含むプロセスにより、またはａ）スルフヒドリル基を含むリンカーを加えて、活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖を形成することによりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖を活性化するステップと、ｂ）マレイミド基を含むリンカーを加えて、活性化担体タンパク質を形成することにより担体タンパク質を活性化するステップと、ｃ）活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖と活性化担体タンパク質を反応させて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖−担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップとを含むプロセスにより、またはａ）スルフヒドリル基を含むリンカーを加えて、活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖を形成することによりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖を活性化するステップと、ｂ）スルフヒドリル基を含むリンカーを加えて、活性化担体タンパク質を形成することにより担体タンパク質を活性化するステップと、ｃ）活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖と活性化担体タンパク質を反応させて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖−担体タンパク質コンジュゲートを形成するステップとを含むプロセスにより、調製することができる。これらのコンジュゲートは、本明細書に開示されているポリペプチドのいずれかと組み合わせることができる。

追加的な抗原
多くの場合、単一の組成物を使用して、種々の感染病原体に対する免疫をもたらすことができる。したがって、組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに由来する抗原のみならず、他の細菌、ウイルス等に由来する抗原を含むこともできる。よって、本発明は、本発明の１種または複数のポリペプチドと、次の抗原のうち１種または複数とを含む組成物を提供する：ＶａｃＡ、ＣａｇＡ、ＮＡＰ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹ［１８３］および／またはウレアーゼなどのＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質抗原；タンパク質「２８７」および特に有用な誘導体を有する、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来のタンパク質抗原［１８４］；１８５に開示されている調製物などのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物；血清群Ｃ由来の１８６に開示されているオリゴ糖などのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来の糖抗原［１８７も参照］；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原［１８８］；不活性化ウイルスなどのＡ型肝炎ウイルス由来の抗原［１８９］；表面抗原および／またはコア抗原などのＢ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、１９０］；Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、１９１］；必要に応じてパータクチンおよび／または凝集原２および３とも組み合わせた、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）などのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原［例えば、１９２］；ジフテリアトキソイド等、ジフテリア抗原［例えば、１９３］、例えば、ＣＲＭ_１９７突然変異体［例えば、１９４］；破傷風トキソイド等、破傷風抗原［例えば、１９５］；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来の糖抗原またはポリペプチド；Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、１９６］；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、１９７］；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、１９８］；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、１９９］；ＩＰＶまたはＯＰＶなどのポリオ抗原（複数可）［例えば、２００］；凍結乾燥した不活性化ウイルス［例えば、２０２；ＲａｂＡｖｅｒｔ（商標）］などの狂犬病抗原（複数可）［例えば、２０１］；麻疹、ムンプスおよび／または風疹抗原［例えば、２０３］；赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質などのインフルエンザ抗原（複数可）［例えば、２０４］；Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、２０５］；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば、２０６］；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来のタンパク質抗原［例えば、２０７、２０８］；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来の糖抗原。特に、本発明は、本発明の１種または複数のポリペプチドと、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の１種または複数の抗原［例えば、２０９］とを含む組成物を提供する。

処置の方法およびワクチンの投与
本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染の防止または処置における使用のため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下のため、または対象におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止または低下のためのポリペプチド、核酸、抗体または組成物を提供する。対象は、動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトであり得るが、非限定例として、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマもしくは家畜などの商業的に重要な動物、またはネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、スナネズミもしくはハムスターなどのペットであり得る。ある特定の実施形態において、対象は、例えば、ニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ等、鳥類対象であり得る。

別の実施形態において、本発明は、抗生物質化合物による連続的投与、同時投与もしくは随伴的投与のための、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染の防止または処置における使用のため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下のため、または対象におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下のためのポリペプチド、核酸、抗体もしくは組成物を提供する。特に、対象は、動物、より具体的には、哺乳動物、さらにより具体的には、ヒト、例えば、成人または小児である。特に、ヒトは、妊婦または小児、特に、１０歳未満の小児である。対象は、例えば、バンコマイシンによる広域抗生物質処置を受けている患者であってもよい。

別の実施形態において、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染の防止もしくは処置における使用のため、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下のため、または＞５０歳であるおよび／もしくは院内Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を患うヒトにおけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下のためのポリペプチド、核酸、抗体または組成物を提供する。

特に、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する下痢、抗生物質関連下痢（ＡＡＤ）、腹痛、腹部疝痛、脱水、発熱、白血球増多症、偽膜性結腸炎または中毒性巨大結腸症の防止または処置における使用のためのポリペプチド、核酸、抗体または組成物を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、抗生物質化合物による連続的投与、同時投与または随伴的投与のための、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染に関連する下痢、抗生物質関連下痢（ＡＡＤ）、腹痛、発熱、白血球増多症、偽膜性結腸炎または中毒性巨大結腸症の防止または処置における使用のためのポリペプチド、核酸、抗体または組成物を提供する。

別の実施形態において、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の防止もしくは処置のため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下のため、または対象におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下のための医薬の製造における、本発明のポリペプチド、核酸、抗体もしくは組成物の使用を提供する。

別の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号７９、８１、９３、１０５、１１１、１１３、１２５、１３３、１３９、１４１、１５３、１６５、１７１、１７３、１８５、１８７、１８９、３００、３２２、３５７、３５９、３６１、４３３、４３５、４３７、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７、４４９、４５１、４５３、４５５、４５７、４５９、４６１、４６３および４６５からなる群から選択される、より好ましくは、配列番号７９、１３９、１３３、４３３、１１１、１７１、１１３および１７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、これから本質的になるまたはこれからなる少なくとも１種のポリペプチド、（ｂ）（ａ）に列挙されている群から選択されるアミノ酸配列をコードする少なくとも１種の核酸、および／または（ｃ）（ａ）に列挙されている群から選択されるアミノ酸配列に結合することができる少なくとも１種の抗体を対象に投与するステップを含む、哺乳動物におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の防止もしくは処置のため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下のため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下における方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、７８、８０、９２、１０４、１１０、１１２、１２４、１３２、１３８、１４０、１５２、１６４、１７０、１７２、１８４、１８６、１８８、３５６、３５８、３６０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２および４６４からなる群から選択される、好ましくは、配列番号７８、１３２、１３８、４３２、１１０、１７０、１１２および１７２からなる群から選択される少なくとも１種の核酸を対象に投与するステップを含む、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の防止もしくは処置のため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下のため、または対象におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下のための方法を提供する。

少なくとも１種の抗体を投与するステップを含む、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の防止もしくは処置のため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下のため、または対象におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下のための方法において、抗体は、好ましくは、中和抗体である。

上で考察した通り、上述の抗原と、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅまたはＣＤＡＤに対し保護効果をもたらす１種または複数の追加的な抗原との組合せが好ましい。よって、本明細書の他の箇所に開示されている組合せおよびこれらの組合せを含む組成物は、上述の方法において等しく使用することができる。上述の抗原の組合せは、好ましくは、ＴｏｘＢ＿ＧＴおよびＴｃｄＡ抗原、さらにより好ましくは、ＴｏｘＢ−ＧＴおよびＴｏｘＡｐ５＿６抗原により作製される。よって、本発明の方法は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅまたはＣＤＡＤに対し保護効果をもたらす１種または複数の追加的な抗原も投与される方法を含み、好ましいかかる抗原は、ＴｏｘＢ−ＧＴおよびＴｏｘＡｐ ５＿６である。他の箇所で考察している通り、かかる抗原に結合する抗体と同様に、かかる抗原をコードするヌクレオチド分子を使用することもできる。２種以上の抗原（またはヌクレオチド分子もしくは抗体）が使用されるあらゆる事例において、抗原（またはヌクレオチド分子もしくは抗体）は、順次、同時にまたは個別に投与することができる。

別の実施形態において、本発明は、本発明の組成物を対象に投与するステップを含む、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の防止もしくは処置のため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下のため、または対象におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下のための方法を提供する。

さらなる実施形態において、本発明は、少なくとも１種の医薬品担体（複数可）および／または賦形剤を含む本発明の組成物を対象に投与するステップを含む、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の防止もしくは処置のため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下のため、または対象におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下のための方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、医薬組成物またはワクチン組成物である本発明の組成物を対象に投与するステップを含む、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の防止もしくは処置のため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下のため、または対象におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下のための方法を提供する。この方法は、対象において、免疫応答を発生させるため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染を防止もしくは処置するため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下のため、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下のために使用することができる。本発明の方法は、抗生物質の投与をさらに含むこともできる。

Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、野生および飼育両方における種々の哺乳動物に感染することも公知である。疾患は、ヒトにおいて観察される疾患と非常に類似しているが、単離株の不均一性がより低いことが観察された［２］。よって、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染が実証された場合、本発明の組成物および方法を使用して、とりわけウマ、ブタおよびウシなどの哺乳動物を処置することができる。

一部の実施形態において、哺乳動物は、近年抗生物質を受けたことがある、現在抗生物質を受けている、または抗生物質を受けようとしている。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、より好ましくは、ヒトである。ヒトは、小児（例えば、幼児または乳児）、十代または成人であり得る。小児を対象とする組成物は、例えば、安全性、投薬量、免疫原性等を評価するために、成人に投与することもできる。ヒトは、病院における処置下であってもよい。

本発明に従って調製されたワクチンを使用して、ヒト小児および成人の両方を処置することができる。よって、ヒトは、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であり得る。ワクチンを受けるヒトは、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは、≧６５歳）、若年（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍務関係者および兵士、妊婦、慢性的な病気または免疫不全患者となり得る。ワクチンは、単にこれらの群のみに適している訳ではなく、集団においてより広く使用することができる。

本発明により産生されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの同じ医学的診察または来診時に）、例えば、インフルエンザワクチン、麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、Ｓ．ａｕｒｅｕｓワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、コンジュゲート型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型ワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌コンジュゲートワクチン（四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、呼吸器多核体ウイルスワクチン等と実質的に同時に、ヒトに投与することができる。

本発明は、また、本発明の組成物を含むキットを提供する。キットは、次のうち１種または複数をさらに含むことができる：説明書、シリンジもしくは他の送達デバイス、アジュバント、抗生物質または薬学的に許容される製剤化溶液。本発明は、また、本発明の組成物を予め充填した送達デバイスを提供する。

治療的処置の有効性をチェックする仕方の１つは、哺乳動物に本発明の組成物を投与した後のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染のモニタリングを含む。予防的処置の有効性をチェックする仕方の１つは、組成物の投与後の、本発明の組成物中のポリペプチドに対する全身的な（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ産生のレベルのモニタリングなど）および／または粘膜による（ＩｇＡ産生のレベルのモニタリングなど）免疫応答のモニタリングを含む。典型的には、ポリペプチド特異的血清抗体応答は、免疫化後であるが負荷前に決定され、一方、ポリペプチド特異的粘膜抗体応答は、免疫化後かつ負荷後に決定される。本発明の組成物の免疫原性を評価する別の仕方は、イムノブロットおよび／またはマイクロアレイにより哺乳動物血清または粘膜分泌物をスクリーニングするために、組換えによりタンパク質を発現させることである。タンパク質および哺乳動物試料の間の陽性反応は、哺乳動物が、問題のタンパク質に対する免疫応答を開始したことを示す。この方法を使用して、免疫優性ポリペプチドおよび／またはポリペプチド内のエピトープを同定することもできる。ワクチン組成物の有効性は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染の動物モデル、例えば、モルモットまたはマウスにワクチン組成物を負荷することにより、ｉｎ ｖｉｖｏで決定することもできる。

本発明の組成物は、一般に、哺乳動物に直接的に投与されるであろう。直接的な送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内または組織の間質腔への）により、あるいは直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、腟、局所、経真皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮、鼻腔内、眼、経耳、肺または他の粘膜投与による等、粘膜により達成することができる。

本発明を使用して、全身性免疫および／または粘膜免疫を誘発、例えば、増強された全身性免疫および／または粘膜免疫を誘発することができる。典型的には、増強された全身性免疫および／または粘膜免疫は、増強されたＴＨ１および／またはＴＨ２免疫応答において反映される。多くの場合、増強された免疫応答は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの産生の増加を含む。

投薬量は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールによるものとなり得る。複数用量は、一次免疫化スケジュールおよび／または追加免疫化スケジュールにおいて使用することができる。複数用量スケジュールにおいて、同じまたは異なる経路により様々な用量を与えることができる、例えば、非経口予備刺激および粘膜追加免疫、粘膜予備刺激および非経口追加免疫等。複数用量は、典型的に、少なくとも１週間置いて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間等）投与されるであろう。

株およびバリアント
本発明のポリペプチドは、本来、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０に由来した。そのため、これは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原と称することができる。しかし、当業者であれば、本発明のポリペプチドが、複数の異なる株のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに起因するＣＤＡＤに対する免疫化に有用であることが明らかとなろう。よって、本発明は、株６３０および株ＳＭのみに由来するポリペプチドおよび／または断片を含む組成物に限定されない。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株Ｒ２０２９１（ＳＭ）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株１９６、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株ＢＩ１、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株ＢＩ／ＮＡＰ１／０２７（リボタイプ０２７）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株Ｍ１２０およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株Ｍ６８、株８５５、株ＱＣＤ−６３ｑ４２、株ＡＴＣＣ４３２５５の配列を含む、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの数種類の株の配列が利用できる。

標準検索およびアライメント技法を使用して、いずれかのさらなるゲノム配列において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株由来のいずれか特定の配列のホモログを同定することができ、例えば、株ＡＴＣＣ４３２５５、株ＣＩＰ１０７９３２、株ＱＣＤ−２３ｍ６３、株ＱＣＤ−３２ｇ５８、株ＱＣＤ−３７ｘ７９、株８５５、株ＱＣＤ−６３ｑ４２、株ＱＣＤ−６６ｃ２６、株ＱＣＤ−７６ｗ５５、株ＱＣＤ−９７ｂ３４、株ＣＤ１９６、株ＣＤＢＩ１、株ＣＤＣＦ５、株ＣＤＳＭ、株ＣＤＭ６８、株ＣＤＭ１２０または株Ｒ２０２９１において行うことができる。さらに、本Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株から利用できる配列を使用して、他の株から相同配列を増幅するためのプライマーを設計することができる。よって、本発明は、この株由来のポリペプチドに限定されず、むしろ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの他の株由来のかかるバリアントおよびホモログ、ならびに非天然バリアントを包含する。一般に、特定の配列番号の適したバリアントは、その対立遺伝子バリアント、その多型、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その突然変異体等を含む。

よって、例えば、本発明により使用されるポリペプチドは、本明細書における配列番号と比較して、保存的置換（即ち、あるアミノ酸の、関連する側鎖を有する別のアミノ酸による置換）などの１個または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個等）のアミノ酸置換を含むことができる。遺伝学的にコードされたアミノ酸は、一般に、４種のファミリーに分けられる：（１）酸性、即ち、アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、即ち、リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、即ち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性、即ち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸として共に分類される場合もある。一般に、これらのファミリー内の単一アミノ酸の置換は、生物学的活性に大きな効果を持たない。ポリペプチドは、配列番号の配列と比べて、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個等）の単一アミノ酸欠失を含むこともできる。ポリペプチドは、配列番号の配列と比べて、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個等）の挿入（例えば、それぞれ１、２、３、４または５個のアミノ酸の）を含むこともできる。

同様に、本発明により使用されるポリペプチドは、次のアミノ酸配列を含むことができる：（ａ）配列表に開示されている配列と同一（即ち、１００％同一）である；（ｂ）配列表に開示されている配列と配列同一性（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）を共有する；（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と比較して、別々の位置であっても近接していてもよい１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個（以上）の単一アミノ酸変更（欠失、挿入、置換）を有する；ならびにペアワイズアライメントアルゴリズムを使用して配列表由来の特定の配列とアライメントされる際、ＥＭＢＯＳＳパッケージ［２１０］におけるニードルツール（ｎｅｅｄｌｅ ｔｏｏｌ）において実行され、それぞれＮ末端からＣ末端へと移動するｘアミノ酸のウィンドウ（ｐアミノ酸（ｐ＞ｘ）へと伸長するアライメントのために、ｐ−ｘ＋１のかかるウィンドウが存在するように）は、少なくともｘ・ｙ個の同一のアライメントされたアミノ酸を有し、ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され；ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され；ｘ・ｙが整数でない場合、四捨五入して整数とする。好ましいペアワイズアライメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータ（例えば、ギャップオープニングペナルティ＝１０．０による、およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５による、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用）を使用したＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズム［２１１］である。

一般に、本発明のポリペプチドが、配列表由来の完全Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ配列と同一ではない配列を含む場合（例えば、それに対して＜１００％配列同一性を有する配列表を含む場合、またはその断片を含む場合）、個々の事例それぞれにおいて、ポリペプチドが、それぞれの完全Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ配列を認識する抗体を誘発することができることが好ましい。ハイブリッドポリペプチドが使用される場合、ハイブリッド内の個々の抗原（即ち、個々の−Ｘ−部分）は、１種または複数の株に由来し得る。例えば、ｎ＝２の場合、Ｘ_２は、Ｘ_１と同じ株に由来しても、異なる株に由来してもよい。ｎ＝３の場合、株は、（ｉ）Ｘ_１＝Ｘ_２＝Ｘ_３、（ｉｉ）Ｘ_１＝Ｘ_２≠Ｘ_３、（ｉｉｉ）Ｘ_１≠Ｘ_２＝Ｘ_３、（ｉｖ）Ｘ_１≠Ｘ_２≠Ｘ_３または（ｖ）Ｘ_１＝Ｘ_３≠Ｘ_２等となり得る。

群（ｃ）内において、欠失または置換は、Ｎ末端および／またはＣ末端に生じても、両末端間に生じてもよい。よって、トランケーションは、欠失の例である。トランケーションは、Ｎ末端および／またはＣ末端における最大４０個（以上）のアミノ酸の欠失を含み得る。

上述に鑑みて、用語、「Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原」または「Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチド」は、上に定義されている分子、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの他の株由来のバリアントもしくはホモログである、または本明細書に言及されているおよび／もしくは配列表に提示されているポリペプチドまたは抗原の非天然または非天然起源のバリアントであり、好ましくは、上に定義されている配列判断基準を満たす分子を含む。

本発明は、また、ポリペプチドの毒性を減少させる突然変異を有する亜鉛メタロペプチダーゼ（ｍｅｔｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）のファミリーに属するポリペプチドを提供する。適したポリペプチドは、Ｄｉｆ１５３（ＣＤ２８３０）を含む。毒性を減少させる例示的な突然変異は、プロテアーゼ活性を低下させるジンチンメタロプロテアーゼドメインの全体または一部の欠失およびジンチンメタロプロテアーゼドメインにおける点突然変異を含む。解毒は、当該技術分野において公知のいずれかの適切な方法、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用して、これらのポリペプチドのアミノ酸配列またはコード核酸配列に変異導入することにより達成することができる。好ましくは、亜鉛メタロペプチダーゼのファミリーに属するポリペプチドは、亜鉛メタロペプチダーゼのファミリーに属する野生型ポリペプチドの配列と比べて、１個または複数のアミノ酸置換（即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０個以上の突然変異）を含む。例えば、Ｄｉｆ１５３（ＣＤ２８３０）ポリペプチドは、配列番号３００および４３５の野生型Ｄｉｆ１５３（ＣＤ２８３０）ポリペプチド配列と比べて、１個または複数のアミノ酸置換（即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個以上の突然変異）、例えば、アミノ酸位置１３４、１４２、１４３、１４６、１４９、１５０、１７８、１８４および／または２０８におけるアミノ酸番号の置換を含む。例えば、Ｄｉｆ１５３（ＣＤ２８３０）ポリペプチドは、配列番号３００および４３５のＤｉｆ１５３（ＣＤ２８３０）ポリペプチド配列のアミノ酸１３４、１４２、１４３、１４６、１４９、１５０、１７８、１８４および／または２０８に相当する１、２、３、４または５個の位置に置換を含むことができる。特に、配列番号３００および４３５の野生型Ｄｉｆ１５３（ＣＤ２８３０）ポリペプチド配列と比べて、アミノ酸１３４、１４２、１４３、１４６、１４９、１５０、１７８、１８４および／または２０８に相当する位置における１、２、３、４または５個のアミノ酸は、好ましくは、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）残基により置換することができる。Ｄｉｆ１５３（ＣＤ２８３０）の単一突然変異の例は、Ｈ１４２Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｅ１４３Ｒ、Ｈ１４６Ａ、Ｄ１４９Ａ、Ｈ１５０Ａ、Ｙ１７８ＦおよびＣ２０８Ｓである。Ｄｉｆ１５３（ＣＤ２８３０）の二重突然変異体の例は、配列番号３００および４３５の野生型ＣＴ１５３（ＣＤ２８３０）ポリペプチド配列と比べて、Ｈ１４２Ａ／Ｈ１４６Ａ；Ｈ１４２Ａ／Ｙ１７８Ｆ；Ｈ１４２Ａ／Ｅ１４３Ｒ；Ｈ１４２Ａ／Ｅ１４３Ａ；Ｅ１４２Ａ／Ｙ１７８Ｆである。本発明は、単独または組み合わせたＣＴ１５３（ＣＤ２８３０）ポリペプチドの他の突然変異体も提供する：Ｈ１４２Ａ／Ｈ１５０ＡおよびＥ１４３Ａ／Ｄ１４９Ａ。前述の解毒免疫原性ポリペプチドは、好ましくは、配列番号３００および４３５の少なくとも１個のエピトープまたは免疫原性断片を保持する。

本発明は、また、突然変異を含むＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌、特に、実施例において詳述されるポリペプチドの１種または複数がノックアウトされたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌を提供する。ノックアウト細菌を産生するための技法は周知のものであり、ノックアウトＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株が報告されている。ノックアウト突然変異は、遺伝子のコード領域に位置することができる、またはその転写制御領域内（例えば、そのプロモーター内）に置くことができる。ノックアウト突然変異は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを、野生型細菌によって産生されるレベルの＜１％、好ましくは＜０．５％、より好ましくは＜０．１％、最も好ましくは０％まで低下させるであろう。本発明は、また、本発明のポリペプチドを構成的に発現するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌等の細菌を提供する。本発明は、また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子であって、誘導性プロモーターの制御下における遺伝子を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ細菌を提供する。かかる細菌は、検査および開発において、または弱毒化ワクチンの調製において有用となり得る。

一般
本発明の実施は、他に指示がなければ、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来方法を、当業者の技能範囲内で利用するであろう。かかる技法は、文献において十分に説明されている。例えば、［２１２〜２１９等］を参照されたい。一部の実施において、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、列挙されているポリペプチドなどの示された活性剤の包含ならびに医薬品業界において公知の他の活性剤および薬学的に許容される担体、賦形剤、皮膚軟化薬、安定剤等の包含を指す。一部の実施において、用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、その唯一の活性成分が、示された活性成分（複数可）であり、しかし製剤の安定化、保存等のための他の化合物が含まれていてもよいが、示された活性成分の治療効果に直接的に関与しない組成物を指す。移行句「から本質的になる」の使用は、特許請求の範囲が、請求項に列挙されている特定の材料またはステップと、請求項の発明の基本および新規の特徴（複数可）に実質的な影響を及ぼさない材料またはステップを包含すると解釈するべきであることを意味する。Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ， ５３７ Ｆ．２ｄ ５４９、５５１〜５２頁、１９０ ＵＳＰＱ ４６１、４６３（ＣＣＰＡ １９７６）（原本において強調）を参照されたい；ＭＰＥＰ§２１１１．０３も参照されたい。よって、用語「から本質的になる」は、本発明の特許請求の範囲において使用する場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と均等であると解釈されることを意図しない。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」およびその変化は、他に明確な規定がなければ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「に限定される（ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を含む。数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％、ｘ±５％、ｘ±４％、ｘ±３％、ｘ±２％、ｘ±１％を意味する。

本発明のある特定の実施形態を上に記載および具体的に例証してきたが、本発明がかかる実施形態に限定されることを意図するものではない。以下の特許請求の範囲に示されている本発明の範囲および精神から逸脱することなく、これらに対して様々な変更を行うことができる。

（実施例１）
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチドの同定
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するワクチンの提供における使用のためのポリペプチドを同定するために、本発明者らは、ＰＳＯＲＴプログラム（２２０）を使用して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６３０によってコードされる３７８０種前後の予測ポリペプチドの全アンサンブルを解析した。これは、末梢の亜細胞局在が予測されるタンパク質を同定した。特に、次の群が同定された：
・細菌細胞壁外側へのタンパク質の付着部位を表す典型的ＬＰＸＴＧ様モチーフの存在により同定される、細胞壁関連タンパク質。
・タンパク質産物を典型的に細胞外環境へと方向づけるＮ末端リーダーペプチドの存在により、および／または搬出されることが知られている他の細菌タンパク質との配列類似性により同定される、細胞外タンパク質。
・細菌表面位置のタンパク質。

公知のビルレンス因子との配列相同性および宿主との相互作用に関与するポリペプチドモチーフのために、他のポリペプチドを選択した。未知機能の数種類のポリペプチドも同定された。続いて、次の実施例に記載されている方法論を使用して、ポリペプチドを検査およびスクリーニングした：

（実施例２）
分泌Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチドの同定
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅセクレトーム調製を次の通りに行った：ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）または既知組成培地（ＣＤＭ、Ｍ．Ｎ． Ｍｉｃｋｅｌｓｏｎ、Ｊ． ｏｆ Ｂａｃｔ．、１９６４年、８８巻：１５８〜１６４頁）の両方においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（株６３０およびＳｔｏｋｅ Ｍａｎｄｅｖｉｌｌｅ）を増殖させた。寒天プレート上に一晩細菌を蒔き、次に、対数期の中間（０．５のＯＤ_６００）または初期定常期（０．９のＯＤ_６００）に達するまで、１００ｍＬの適切な培地において嫌気性条件下において３７℃で増殖させた。３，５００×ｇ、１０分間、４℃の遠心分離により細菌を除去し、０．２２μｍポアサイズフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して上清を濾過した。上清に存在するタンパク質を、１０％ｗ／ｖトリクロロ酢酸、０．０４％ｗ／ｖデオキシコール酸ナトリウムによりｏ／ｎで沈殿させた。５ｍＭジチオスレイトール、０．１％Ｒａｐｉｇｅｓｔ（登録商標）（Ｗａｔｅｒｓ）を含有する５０ｍＭ重炭酸アンモニウムにタンパク質を再懸濁し、９０℃で１０分間加熱し、２ｕｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりｏ／ｎで消化した。０．１％ｖ／ｖギ酸を添加してタンパク質分解性の（Ｐｒｏｔｅｏｌｉｔｉｃ）消化を停止させた。その後、得られたペプチドを質量分析により解析した。

ナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定を次の通りに行った：ナノスプレー源（Ｗａｔｅｒｓ）を備えるＱ−ＴｏＦ Ｐｒｅｍｉｅｒエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析計に接続されたＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）において、ナノ−ＬＣによりペプチドを分離した。ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ５μｍ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｃ_１８トラップカラム（１８０μｍ×２０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を通してＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ １．７μｍ ＢＥＨ１３０ Ｃ_１８カラム（７５μｍ×２５ｃｍ、Ｗａｔｅｒｓ）に試料をロードした。流速２５０ｎｌ／分において、９８％アセトニトリル、０．１％ギ酸溶液の２〜４０％の１２０分間勾配によりペプチドを溶出させた。

ＭＳサーベイスキャンを使用してさらなるＭＳ／ＭＳ断片化のために３００〜２，０００のｍ／ｚ比範囲にわたって多電荷（ｍｕｌｔｉｃｈａｒｇｅｄ）ペプチドを自動的に選択するＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア、バージョン４．１（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、溶出されたペプチドを自動データ依存的取得に供した。最大５種の異なる構成成分を同時にＭＳ／ＭＳ断片化に供した。データ取得後に、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ、バージョン３．５（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、個々のＭＳ／ＭＳスペクトルを組み合わせ、スムージングし、セントロイド処理して、ピークリストファイルを得た。ローカルサーバー上で実行するＭＡＳＣＯＴのバージョン（バージョン２．２．１）へのデータファイルの自動送信のために、Ｍａｓｃｏｔ Ｄａｅｍｏｎアプリケーション（ＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．、英国ロンドン）を使用した。

ＮＣＢＩｎｒデータベースのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅセクションに由来するタンパク質配列データを組み合わせるローカルに精選されたデータベースにおいて、それぞれ７１２３３個および２１６７７３９６個の配列および残基の総数を検索することにより、タンパク質同定を達成した。ＭＡＳＣＯＴ検索パラメータを次の通りに設定した；（ｉ）トリプシン消化の許容される切断できなかった数として１、（ｉｉ）可変性修飾としてメチオニン酸化ならびにグルタミンおよびアスパラギン脱アミド、（ｉｉｉ）ペプチドトレランスとして０．２Ｄａ、（ｉｖ）ＭＳ／ＭＳトレランスとして０．２Ｄａ。ＭＡＳＣＯＴスコアリングおよび確率システムにより定義される、有意なヒットのみを考慮した。ペプチド同定の許容性のためのスコア閾値は、トリプシン消化に関して≧３３であった。

本発明者らは、ポリペプチドＤｉｆ１８３、Ｄｉｆ１９２およびＤｉｆ１５３が分泌され、株６３０に由来する上清に存在したことを発見した。加えて、本発明者らは、次のタンパク質が２０２９１株の上清に存在したことを発見した：Ｄｉｆ１８３、Ｄｉｆ１９２およびＤｉｆ１５３ならびに断片Ｄｉｆ２０８Ａおよび断片Ｄｉｆ２０８Ｂ。これらの結果は、図２に要約されている。これらの分泌タンパク質／ポリペプチドは、特に、細菌コロニー形成の低下もしくは防止における使用のための、または感染部位における壊死などの組織損傷の低下における使用のための有用なワクチン標的である。

（実施例３）
ＮＭＲによる細胞ライセートの解析
組換えタンパク質発現のためのベクターを保有する細菌細胞を、最初に８００ｕＬのＭ９ １×バッファー、ｐＨ７．４における再懸濁により洗浄し、遠心分離し（５’、３，０００ｒｐｍ）、上清を廃棄した。次に、残った細菌ペレットを６００ｕＬのＭ９バッファーに再懸濁し、超音波処理によって細胞を溶解し、続いて４℃で遠心分離する（２０’＠１４，０００ｒｐｍ）。次に、ＮＭＲ解析のために上清を単離する。ＮＭＲ解析のために１０％Ｄ２Ｏ（容量で）を試料に添加する。９００または８００ＭＨｚ ＮＭＲを使用して高速ＨＳＱＣまたはＴＲＯＳＹ実験を取得し、ｔｏｐｓｐｉｎソフトウェアを使用して処理した（図３）。

ＮＭＲ解析から、Ｄｉｆ４４のＨＳＱＣスペクトルは、図４においてほぼ等しい強度を有するピクス（ｐｉｃｓ）の良好な分散を示し、Ｄｉｆ４４が十分にフォールドされていることを示した。細胞ライセートのＮＭＲ解析の結果は、図２に要約されている。これらの結果は、特に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞質などの異種性環境において発現される場合に、その三次元構造を安定的に維持する傾向を有するポリペプチドを同定した。これは、組換え、サブユニットワクチン構成成分の提供に有用な特色である。

（実施例４）
組換えタンパク質および断片のクローニング、発現、精製
単離された組換えタンパク質を調製するために、特異的オリゴヌクレオチドおよび鋳型としてのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ染色体ＤＮＡを使用して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＯＲＦをＰＣＲ増幅した。遺伝子増幅（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に使用したプライマーは、図１に要約されている。クローニングベクターのＰＣＲ増幅（Ｖ−ＰＣＲ）およびインサートのＰＣＲ増幅（Ｉ−ＰＣＲ）に存するＰＩＰＥ方法（Ｋｌｏｃｋ， Ｈ．Ｅ．ら（２００８年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７１巻：９８２〜９９４頁）を使用して、得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。次に、１μｌのＶ−ＰＣＲおよび１μｌのＩ−ＰＣＲを混合し、化学的コンピテントＨＫ１００細胞に形質転換する（Ｋｌｏｃｋ， Ｈ． Ｅ．ら（２００５年）Ｊ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｆｕｎｃｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６巻、８９〜９４頁｝。それぞれ１μＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、１×クローニングＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー、２．５ユニットのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびに５０ｎｇのゲノムＤＮＡ鋳型を含有するＩ−ＰＣＲ反応物をセットアップした。次の通りに反応を行った：最初の変性２分間９５℃、次に２５サイクルの９５℃３０秒間、５５℃４５秒間および６８℃３分間、続いて４℃に最後の冷却。Ｖ−ＰＣＲ反応は、Ｉ−ＰＣＲ反応と同一であったが、６８℃のステップが１４分間持続し、２ｎｇのｐＥＴ１５ｂプラスミドがＤＮＡ鋳型として使用された。ＰＣＲスクリーニングおよびベクター−インサート接合部のＤＮＡプラスミド配列決定により、正確な形質転換体を選択した。次に、選択されたＨＫ１００クローンから正確なプラスミドを調製し、タンパク質を発現させるためにＢＬ２１（ＤＥ３）Ｔ１^ｒ細胞（Ｓｉｇｍａ）の形質転換に使用した。

クローニングされたタンパク質を発現させるために、ｐＥＴ１５ｂ構築物を含有するＢＬ２１（ＤＥ３）Ｔ１^ｒクローンを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培地においてＯＤ_６００＝０．５となるまで３７℃で増殖させた。次に、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、同じ温度でさらに３時間増殖させることにより、タンパク質発現を誘導した。従来のタンパク質抽出およびＳＤＳ−Ｐａｇｅを行って、タンパク質発現をチェックした。

（実施例５）
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ組換えタンパク質および断片によるマウスの免疫化
図１に記載されているポリペプチドおよび断片毎に、４匹の雌性ＣＤ１マウスの２群を使用した。アラムアジュバント（群１）またはＭＦ５９アジュバントにおいて製剤化した１０μｇの抗原により、各群を免疫化した。０、２１および３５日目に、腹腔内に免疫化を行った。４９日目に最終の放血および選別を行った。

後述するウエスタンブロット、共焦点顕微鏡およびＦＡＣＳ解析による本発明のポリペプチドの特徴付けにおいて、組換えポリペプチドに対する血清を使用した。血清は、いずれのポリペプチドが中和抗体の調製における使用に最も適するか同定するための受動的保護実験においても利用した。

（実施例６）
ウエスタンブロットによる表面露出試験
選択されたタンパク質が、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細胞により表面発現されることを実証するために、異なるスクリーニングにおいて各組換えタンパク質に対して生じる血清を使用した。細菌画分におけるウエスタンブロット解析を行って、Ｓ層画分（細胞壁の非共有結合によりアンカーされたタンパク質を含有）および総細胞壁抽出物（細胞壁の全タンパク質を含有）における本発明のポリペプチドの存在を検証した；血清特異性の陽性対照として精製タンパク質を使用した。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ６３０株をＢＨＩ培地において一晩増殖させ、Ｓ層および総細胞壁抽出物の調製のために遠心分離により収集した。低ｐＨのグリシンインキュベーションを使用して、Ｓ層抽出物を調製した；簡潔に説明すると、細菌ペレットを、０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．２およびプロテアーゼ阻害剤と共に室温で２０分間インキュベートした。細菌懸濁液を遠心分離し、表面タンパク質を含有する上清を２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基の添加により中和した。

細菌と６０μｇ／ｍｌムタノリシン、１ｍｇ／ｍｌリゾチームおよびプロテアーゼ阻害剤との室温２時間のインキュベーションにより、総細胞壁抽出物を調製した。細菌懸濁液を遠心分離し、表面タンパク質を含有する上清を収集した。Ｓ層および細胞壁抽出物におけるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングに供した。各組換えタンパク質に対して生じたマウス血清は全て１／１０００希釈で使用し、続いて１／２５００希釈の抗マウス−ＨＲＰを使用した。

Ｄｉｆ１８３の解析およびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細胞画分の調製：「総細胞抽出物」を調製するために、ＯＤ６００が１．３となるまでＴＹＭにおいて株６３０を増殖させた。４０００ｒｐｍにおける１０分間の遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳにおいて１回洗浄した。ペレットをＰＢＳに再懸濁した。細胞壁内に存在する他のタンパク質と共にＳ層タンパク質を含有する「細胞壁画分」を単離するために、ＯＤ６００が１．３となるまで２０ｍｌのＴＹＭブロスにおいて株６３０を増殖させた。４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃の遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳにおいて１回、Ｔｒｉｓ−スクロースバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．９、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５Ｍスクロース）において１回洗浄した。次に、穏やかに回転撹拌しつつ、２ｍｌの消化バッファー（２５０μｇ／ｍｌムタノリシンおよびプロテアーゼ阻害剤を含有するＴｒｉｓ−スクロースバッファー）において２時間３７℃でペレットをインキュベートした。遠心分離により、「プロトプラスト画分」を含有するペレットから、「細胞壁画分」を含有する反応上清を分離した。プロトプラストをＰＢＳに再懸濁し、試料を５回凍結融解することにより溶解を行った。

Ｓ層に関連するタンパク質のみを含有する「Ｓ層画分」の調製のために、５０ｍｌのＢＨＩＳブロスにおいて株６３０を一晩増殖させた。３５００ｇ、１０分間、室温における遠心分離により培地から細胞を分離し、ＰＢＳにおいて洗浄し、穏やかに撹拌しつつ、プロテアーゼ阻害剤の存在下における０．５ｍｌの０．２Ｍ ＨＣｌ、ｐＨ２．２において２０分間室温でインキュベートした。細菌懸濁液を最大スピードにて４℃で１０分間遠心分離した。Ｓ層タンパク質を含有する上清を取り出し、２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基の添加によりｐＨを中和した。

ウエスタンブロット解析のために、出発培養容量に基づき画分を正規化した。

ウエスタンブロット解析：細胞全体ライセート、細胞画分、上清画分および精製組換えタンパク質のタンパク質解析のために、還元剤を含有する試料バッファーと試料とを混合し、ロードに先立ち１０分間１００℃で加熱した。ＮｕＰＡＧＥゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試料を分離し、ウエスタンブロット解析のためにニトロセルロース膜に転写した。膜をＰＢＳ−１０％粉ミルクにより４℃で３時間ブロッキングした。使用されている一次抗体は、組換えｈｉｓタグ付きタンパク質に対して生じたポリクローナルマウス抗血清である。全一次抗体を１：１０００で希釈し、１時間３０分の間３７℃でインキュベートした；二次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヤギ抗マウス血清であり（１：５０００；Ｄａｋｏ）、室温で４５分間インキュベートした。結合した抗体の検出は、メーカーの説明書に従ってＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）により行った。

示されている血清により認識されるポリペプチドＤｉｆ４４、Ｄｉｆ５１およびＤｉｆ１９２は、細胞表面露出されており、対象の免疫系に到達可能であり、したがって、これらの抗原は、特に、感染の防止、コロニー形成または感染伝播の低下に有用なワクチン標的も表す（図５）。

（実施例６Ａ）
共焦点顕微鏡による表面露出決定
選択されたタンパク質がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細胞によって表面発現されるか決定するために、さらなるスクリーニングにおいて各組換えタンパク質に対して生じた血清を使用した。固定された細菌において共焦点顕微鏡観察を行って、予測される露出タンパク質それぞれへの特異的抗体の到達性を評価した。青色蛍光ＤＡＰＩで細菌ＤＮＡを標識した；特異的血清と、続いて赤色または緑色色素にコンジュゲートした二次抗体で表面タンパク質を染色した。

選択されたポリペプチドそれぞれの表面露出を検証するために、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６３０株をＢＨＩにおいてＯＤ_６０００．５となるまで増殖させ、ＰＢＳにおいて洗浄した。２％ＰＦＡで２０分間室温にて細菌ペレットを固定し、ポリ−リシンでコーティングしたチャンバースライド上にスポット（ｓｐｏｔ）した。次に、２％ＢＳＡで１５分間細菌をブロッキングし、２％ＢＳＡにおいて１／５００希釈した各組換えタンパク質に対して生じた血清と共に１時間室温でインキュベートした。次に、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲート抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で３０分間室温にて細菌を染色した。次に、ＤＡＰＩを含有するＧｏｌｄ退色防止試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、カバーガラスにマウントした。

本発明者らは、Ｄｉｆ４４、Ｄｉｆ５１、Ｄｉｆ１５３、Ｄｉｆ１８３、Ｄｉｆ１９２、Ｄｉｆ２０８およびＤｉｆ２３２に対して生じた血清が、６３０株の表面におけるこれらのタンパク質を認識することができたことを見出した。図２の共焦点顕微鏡と題する列は、表面露出され、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６３０株抽出物において検出されるタンパク質を示す。先と同様に、細胞表面露出され、免疫系に到達可能であり得るこれらの抗原は、有用なワクチン標的を表す。

（実施例７）
ヒト上皮細胞との相互作用
選択されたポリペプチドが、ヒト上皮細胞に結合することができたか評価するために、各組換えポリペプチドを２種の結合アッセイにおいて検査した：

１．ＦＡＣＳ解析：細胞解離溶液（ＣＤＳ、Ｓｉｇｍａ）を使用してベロ細胞を非酵素的に剥離し、収集し、１％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地に懸濁した。９６ウェルマイクロプレートにおよそ１０^５細胞を置き、細胞の付着を回避するために２０分毎に混合しつつ、５００〜０．２４ｍｇ／ｍＬにわたる異なる濃度の精製タンパク質または培地単独と１時間３７℃または４℃で混合した。ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、遠心分離することにより、過剰な非結合タンパク質を除去した。その後、細胞を各組換えポリペプチドに対して生じた血清と共に１時間４℃でインキュベートした。細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳにおいて２回洗浄し、Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に３０分間４℃でインキュベートした。その後、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳにおいて細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。本発明者らは、Ｄｉｆ２０８Ａ、Ｄｉｆ２０８Ｂ、Ｄｉｆ２３２およびＤｉｆ１９２が、ベロ細胞の表面に結合する能力を有することを見出した。例として、Ｄｉｆ２３２のＦＡＣＳ解析は、図６に示されており、ＦＡＣＳ解析の全結果は、図７に要約されている。ヒト細胞に結合するポリペプチドは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのコロニー形成を限定または防止するための優れた候補となり得る。

２．共焦点顕微鏡：チャンバースライド上において、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地にベロ細胞およびＣａｃｏ−２細胞を播種し、２４時間インキュベートした。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに希釈した２０ｍｇ／ｍＬの各ポリペプチドと共に細胞を１時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ＋２％ＢＳＡにおける２回の洗浄により過剰な非結合ポリペプチドを除去し、２％ＰＦＡで２０分間室温にて細胞を固定した。次に、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡで１５分間細胞をブロッキングし、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡにおいて１／５００希釈した各組換えタンパク質に対して生じた血清と共に１時間室温でインキュベートした。次に、抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲート抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でポリペプチドを染色し、ファロイジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８コンジュゲートで細胞のアクチンを染色した。次に、ＤＡＰＩを含有するＧｏｌｄ退色防止試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、カバーガラスにマウントした。

ＦＡＣＳ結果を確認するために、ベロ細胞における共焦点顕微鏡による結合アッセイにより、ＦＡＣＳが陽性であったポリペプチドを検査した。さらに、解析をヒト腸Ｃａｃｏ−２細胞に拡張した。ヒト細胞に結合するポリペプチドは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのコロニー形成を限定または防止するための優れた候補となり得る。本発明者らは、Ｄｉｆ２０８Ｂ、Ｄｉｆ５１およびＤｉｆ１９２が、細胞膜に明らかに結合しているが、一方、Ｄｉｆ２０８Ａは、細胞膜に会合している可能性があることを実証した（図７）。これらのポリペプチドは、ヒト細胞に結合することが実証され、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのコロニー形成を限定または防止するための優れた候補となり得る。

（実施例８）
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成成分への相互作用
プレートを１０μｇ／ｍｌの各ＥＣＭ構成成分でコーティングし、Ｏ／Ｎにて４℃でインキュベートした。次に、プレートを洗浄し、２．７％で２時間３７℃にてブロッキングした。洗浄後に、プレートを４℃で少なくとも１６時間貯蔵した。コーティングしたウェルに２０〜５０μｇ／ｍｌの組換えポリペプチドを添加し、２時間３７℃でインキュベートした。

ウェルを洗浄し、各組換えタンパク質に対して生じた血清と共に９０分間３７℃でインキュベートし、続いてＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共に９０分間３７℃でインキュベーションを行った。ＨＲＰ基質溶液をウェルに添加し、１２．５％Ｈ_２ＳＯ_４を添加することにより反応を停止した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより、４９０ｎｍにてプレートを読み取った。

細胞外構成成分に結合することができるポリペプチドは、腸組織のコロニー形成を限定または防止するための優れた候補となり得る。例えば、Ｄｉｆ２０８ポリペプチドは、細胞外マトリックス結合ドメインを含有する。これらのドメインが、特定のＥＣＭ構成成分への結合の媒介において機能的であるか検証するために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡ試験を行った。ＥＬＩＳＡプレートを精製ＥＣＭ構成成分でコーティングし、２ｕｇ〜３１．２５ｎｇ／ウェルにわたる系列希釈した組換えタンパク質と共にインキュベートした。この試験において、Ｄｉｆ２０８タンパク質の２種のサブドメイン（Ｄｉｆ２０８ＡおよびＤｉｆ２０８Ｂ）を解析した。本発明者らは、Ｄｉｆ２０８サブドメインが、全ＥＣＭ構成成分に結合することを発見した（図９）。これらのポリペプチドは、細胞外構成成分に結合することができ、腸組織のコロニー形成を限定または防止するための優れた候補となり得る。

（実施例９）
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ臨床単離株におけるＤｉｆ１９２およびＤｉｆ４４の保存
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０（リボタイプ０１２）、Ｒ２０２９１（リボタイプ０２７）およびＭ１２０（リボタイプ０７８）ならびにイタリアの異なる地域由来の優勢なＰＣＲリボタイプのうち６種（００１、０１４、０１８、０１２、０７８、１２６）を表すＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ臨床単離株の総細胞抽出物またはＳ層調製物のウエスタンブロット解析により、Ｄｉｆ１９２およびＤｉｆ４４の存在を試験した（図８）。ＦａｇａｎおよびＦａｉｒｗｅａｔｈｅｒ（Ｆａｇａｎ， Ｒ．およびＦａｉｒｗｅａｔｈｅｒ、Ｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８６巻（３１号）：２７４８３〜９３頁、２０１１年）により記載されている凍結融解手順に基づく方法により、細胞全体ライセートの調製物を得た。簡潔に説明すると、５，０００×ｇ、１０分間、４℃の遠心分離によりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの培養物を収集し、ペレットを−２０℃で凍結した。細菌を解凍し、ＰＢＳに再懸濁してＯＤ_{６００ｎｍ}を２０とし、３７℃で１０分間インキュベートした。一貫した再現性のある溶解を得るために、このような凍結融解サイクルを３回行った。Ｓ層の抽出は、以前に記載された方法に従って行った（Ｆａｇａｎ， Ｒ．およびＦａｉｒｗｅａｔｈｅｒ、Ｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６４６巻、１１７〜１３４頁、２０１０年）。

ＢＨＩブロスにおいて定常期（ＯＤ_{６００ｎｍ}≒１）まで増殖させた培養物から、細胞壁タンパク質を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより抽出物を分離し、続いてマウスにおいて生じた特異的抗体によりウエスタンブロッティングを行った。一次抗体は、１：２，０００希釈で使用し、１：２０，０００の西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗マウス抗体（Ｄａｋｏ）と、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を使用することにより検出した。タンパク質分子量推定のためにウエスタンブロットにおいて直接的に、標準バンドの直接的な可視化のためのマーカー（ＭａｇｉｃＭａｒｋ ＸＰ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を慣例的にに使用した。解析した全臨床単離株の総抽出物において、Ｄｉｆ１９２およびＤｉｆ４４の発現を検出し、これらのポリペプチドが保存されており、したがって、これらのポリペプチドも、特に、感染防止、コロニー形成または感染伝播の低下のために有用なワクチン標的を表すことを示した。

（実施例１０）
マウス抗体による組換えポリペプチドの認識
クロストリジウム病理発生において重要であり、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体応答を誘発することができるさらなる表面タンパク質および分泌タンパク質を同定するために、本発明者らは、６３０臨床株から再度調製された培養上清のさらなる解析を行った。検出可能な細胞溶解は存在しなかった（データは示さず）。

濃縮上清によるマウスの免疫化：「抗上清」血清を得るために、２種の系列希釈を行って、培地ＣＤＭＭ（Ｋａｒａｓａｗａら、１９９５年）においてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６３０を増殖させた。ＯＤ_６０００．５の最終培養物を得た。遠心分離により細菌から培地を分離し、続いて０．２２μｍフィルターを通して濾過し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濃縮器ＭＷＣＯ ５０００ Ｄａ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、これに含有されるタンパク質を濃縮した。得られたタンパク質濃度をビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、米国イリノイ州ロックフォード）により推定した。用量当たり２０μｇのタンパク質で８匹のマウスを免疫化し、得られた血清をウエスタン解析において使用するためにプールした。

ウエスタンブロット解析：５０ｎｇ量の各組換えタンパク質をＮｕＰＡＧＥゲルにロードし、一次抗体として濃縮上清で免疫化したマウスの血清を使用して、ウエスタンブロット解析を次の通りに行った。精製組換えタンパク質を含有する試料を、還元剤を含有する試料バッファーと混合し、ロードに先立ち１０分間１００℃で加熱した。ＮｕＰＡＧＥゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試料を分離し、ウエスタンブロット解析のためニトロセルロース膜に転写した。膜をＰＢＳ−１０％粉ミルクにより３時間４℃でブロッキングした。使用した一次抗体は、組換えｈｉｓタグ付きタンパク質に対して生じたポリクローナルマウス抗血清である。一次抗体は全て、１：１０００希釈し、１時間３０分３７℃でインキュベートした；二次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウス血清（１：５０００；Ｄａｋｏ）であり、室温で４５分間インキュベートした。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）により、メーカーの説明書に従って、結合した抗体の検出を行った。

選択された表面露出ポリペプチドが、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体応答を誘発することができることを立証するために、マウスから得た血清における特異的抗体の存在を解析した。濃縮上清で免疫化したマウスから得た血清を使用したウエスタンブロッティングにより、精製ポリペプチドを解析した。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌の上清で免疫化したマウス血清は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ組換えポリペプチドおよび断片を認識することができる抗体を含有する。Ｄｉｆ１８３の精製ポリペプチドおよび断片は、抗体により明らかに検出され、感染中のこれらのタンパク質の到達性およびワクチン標的としてのその適合性を確認した（図１４）。

（実施例１１）
ハムスター抗体による組換えポリペプチドの認識
１００ｎｇの各組換えタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングに供した。膜を１／２００希釈のハムスター血清、続いて１／１０，０００希釈の抗マウス−ＨＲＰと共にインキュベートした。ａ）ワクチン接種したハムスターから負荷１５日後に；ｂ）ワクチン未接種のハムスターから負荷３０〜５０時間後に血清を採取した。未感染のハムスターから得た血清は、陰性対照として使用した。選択された表面露出ポリペプチドが、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体応答を誘発することができることを立証するために、感染させたハムスターから得た血清における特異的抗体の存在を解析した。感染させたハムスターから得たならびにＡ毒素およびＢ毒素の組合せによるワクチン接種後に感染させたハムスターから得た血清を使用したウエスタンブロッティングにより、精製ポリペプチドを解析した。

感染させたハムスターから得た血清は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチドに対する抗体を殆ど含有しないことが判明した。これは、主として、感染させたハムスターが、感染３０〜５０時間後に死亡したためである。これは細菌に対する免疫応答を構築するには不十分な時間である。したがって、ポリペプチド（公知がこのポリペプチドに対してこれらの血清中に存在する）は、ワクチン組成物および中和抗体の調製物における使用に特に有用であると考えられる。

ワクチン接種しその後感染させたハムスターから得た血清は、精製ポリペプチドを認識することができる抗体を含有した。感染に先立つ毒素の組合せ（ｐ５／６＋ｔｏｘＢ＿ＧＴ）による免疫化は、死亡を防止するが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのコロニー形成を防止しない効率的な抗体応答をハムスターに発生させることができる。精製ポリペプチドおよび断片は、ワクチン接種し感染させたハムスターから得たハムスター血清に存在する抗体により検出され、感染中のこれらのタンパク質の表面到達性およびワクチン標的としてのその適合性を確認した。未感染のハムスターから得た血清は、陰性対照として使用した。例えば、ワクチン接種しその後感染させたハムスターから得た血清は、ワクチン接種し感染させたハムスターから得たハムスター血清におけるＤｉｆ４４、Ｄｉｆ５１、Ｄｉｆ１３０、Ｄｉｆ１５３、Ｄｉｆ１８３、Ｄｉｆ２０８およびＤｉｆ２３２を認識することができる抗体を含有し、感染中のこれらのタンパク質の表面到達性およびワクチン標的としてのその適合性を確認した（図１０）。

未感染のハムスターから得た血清は、陰性対照として使用した（図１０Ｂ）。組換えタンパク質調製物に存在するＥ．ｃｏｌｉ夾雑物に対する交差反応により、数本のバンドが観察された。

（実施例１２）
ヒト血清由来の抗体による認識（ＩｇＡおよびＩｇＧ）
ヒト抗体による組換えポリペプチドの認識を検査するために、本発明者らは、タンパク質チップアレイを調製し利用した。

１．タンパク質マイクロアレイ手順：１００を超えるノズルを有する圧電気インクジェットプリントヘッドを装着したインクジェットスポッタＡｒｒａｙｊｅｔ（Ａｒｒａｙｊｅｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用して、ニトロセルロースコーティングスライド（ＦＡＳＴスライド、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に精製組換えタンパク質（０．５ｍｇ／ｍｌ）を４回複製してスポットすることにより、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅタンパク質アレイを作製し、およそ９０〜１００μｍの直径のスポットを生じた。実験対照として、ビオチン化ＢＳＡ、マウスＩｇＧ（複数可）、ヒトＩｇＧ（複数可）およびヒトＩｇＭ（複数可）（０．００４〜０．５ｍｇ／ｍｌ）の４種の曲線複製をアレイにスポットした。タンパク質スポットの少なくとも２倍の数のＰＢＳバッファーをスポットし、スポッティングの間、相互汚染による非特異的シグナルの検出に使用した。５％よりも少ないＰＢＳスポットが、バックグラウンド値＋３標準偏差値よりも高いシグナル強度を示した。

３％Ｔｏｐ Ｂｌｏｃｋ（Ｆｌｕｋａ−ＢｉｏＣｈｅｍｉＫａ）−ＰＢＳバッファーにおける０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＰＢＳ）を含有するブロッキング溶液と共にアレイをプレインキュベートすることにより、非特異的結合を最小化した。ＴＰＢＳによる洗浄後に、３％Ｔｏｐ Ｂｌｏｃｋ−ＴＰＢＳにヒト血清を希釈し、２５℃で１時間アレイにオーバーレイした。ＴＰＢＳによる洗浄後に、抗ヒト−Ｃｙ５コンジュゲート二次抗体（１：８００）と共にアレイを２５℃で１時間インキュベートすることにより、アレイ上にプリントされた抗原への抗体の結合を検出した。全インキュベーションステップは、ＨＳ ４８００ハイブリダイゼーションステーション（ＴＥＣＡＮ）を使用して撹拌下で行った。ＰｏｗｅｒＳｃａｎｎｎｅｒ３．５スキャナ（ＴＥＣＡＮ）により画像蛍光シグナルを検出し、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（商標）ソフトウェアにより、ピクセル当たり１０ ｍの分解能において１６ビット画像を作成し、ＩｍａＧｅｎｅ６．０ソフトウェア（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｃ、米国カリフォルニア州）を使用して、スポット蛍光強度（ＦＩ）を決定した。社内開発ソフトウェアを使用して精緻化および解析を行った。タンパク質毎に、各スポット周囲のバックグラウンド値の減算後に、複製されたスポットの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。シグナルは、そのＭＦＩ値が、ＩｇＧによる実験に関しては２，０００よりも高く、ＩｇＡによる実験に関しては１０００よりも高い場合、陽性として考慮し、これは、抗ヒト−Ｃｙ５抗体単独による検出後のタンパク質スポットの平均蛍光強度（ＭＦＩ）、プラス３標準偏差値に相当する。２種の対照を加えた：空の発現ベクターを保有するＥ．ｃｏｌｉの細胞抽出物を有するスポットのＭＦＩ値に相当するＮＮ−Ｈｉｓと、バッファーのみを含有するスポットのＭＦＩ値に相当するＰＢＳ＿Ｇｌｙ（バックグラウンド値）。これらの値は、ソフトウェアにより、各試料スポットの値から自動的に減算される。

２．ウエスタンブロット解析：２００ｎｇの各精製組換えタンパク質を、１ｍｍ、１２ウェルの４〜１２％Ｎｏｖｅｘ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、２００Ｖで３５分間分離し、乾式ｉＢｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してニトロセルロース膜に転写した。ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）における１０％脱脂乳（Ｄｉｆｃｏ）で膜を飽和させ、１時間室温で穏やかに撹拌しつつインキュベートした。次に、ブロッキングした膜を、１％脱脂乳ＰＢＳ−Ｔにおいて１：５００希釈したヒト血清４７０５ＷＨと共にインキュベートし、インキュベートは３時間室温で行った。ＰＢＳ−Ｔにより１５分間１回、５分間２回、膜を洗浄した。

次に、二次抗ヒトＩｇＧ抗体、ＨＲＰ−コンジュゲートＳＩＧＭＡ Ａ−６０２９（１％脱脂乳ＰＢＳ−Ｔにおいて１：２，５００）または抗ヒトＩｇＡ、アルカリホスファターゼ−コンジュゲートＳＩＧＭＡ Ａ−９６６９（１％脱脂乳ＰＢＳ−Ｔにおいて１：３０００）を添加し、４０分間穏やかに撹拌しつつインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔにより１５分間１回洗浄し５分間３回洗浄した後、膜を基質ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＷｅｓｔＰｉｃｏ（Ｐｉｅｒｃｅ）溶液でオーバーレイし、５分間室温で穏やかに撹拌しつつインキュベートした。ペーパータオルで過剰な基質を除去し、膜をＸ線フィルムに露光した。

回復期ドナー（ドナーＡ、ドナーＢ、ドナーＣ、ドナーＤおよびドナーＥ）および健康なドナー（１０ＷＨ、３４５３ＷＨ、４０１６ＢＬ、４６９７ＷＨおよび４７０５ＷＨ）からヒト血清を得た。異なる血清のＥＬＩＳＡ力価を図１１に示す。ＦＧＦ２１は、陰性対照の無関係のタンパク質であり、ＴｏｘＡ／Ｂは、Ｉｎｖｅｒｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．製の毒素ＡおよびＢの組合せである。回復期ドナー、ドナーＡ、ドナーＣおよびドナーＤから得た血清は、ＦＧＦ２１のＩｇＧ力価と比較して、ＴｏｘＡおよびＴｏｘＢに対するＩｇＧを有し、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する免疫応答を開始したことを示す。さらに、健康ドナー、１０ＷＨおよび４７０５ＷＨから得た血清は、ＦＧＦ２１のＩｇＧ力価と比較して、ＴｏｘＡおよびＴｏｘＢに対する高いＩｇＧ力価を有し、過去に感染しており、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する免疫応答を以前に開始していたことを示す（図１１）。

血清における特異的ＩｇＧの存在は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するＩｇＧ全身性免疫応答に関連する。タンパク質アレイを使用して、ヒト血清における、ポリペプチドに対する特異的ＩｇＧの存在を同定した。例えば、タンパク質アレイを使用して、本発明者らは、上述のヒト血清における、Ｄｉｆ５１、Ｄｉｆ１３０、Ｄｉｆ２３２ポリペプチドに対する特異的ＩｇＧの存在を同定した。４７０５ＷＨと命名された血清において、Ｄｉｆ２３２ポリペプチドに対する高力価のＩｇＧ（ＭＦＩ＞５０００）が測定された（図１２Ａ）。４７０５ＷＨと命名された血清において、Ｄｉｆ２３２に対するＩｇＧの存在をウエスタンブロットにより確認した（図１２Ｂ）。

強い反応を示すポリペプチドは、特にヒトにおける使用のための、免疫原性組成物またはワクチン組成物において特に有用となり得る。さらに、血清における特異的ＩｇＡの検出は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する粘膜免疫応答に関連する。ヒト血清における本発明のポリペプチドに対する特異的ＩｇＡの存在を決定した。例えば、本発明者らは、ヒト血清におけるＤｉｆ５１、ポリペプチドに対する特異的ＩｇＡの存在を同定した（後述および図１３Ａに要約）。

ドナーＣと命名された血清において、Ｄｉｆ５１ポリペプチドに対するＩｇＡの力価（ＭＦＩ＞１０００）を測定した。ドナーＡ、ドナーＣ、ドナーＤ、３４５３ＷＨおよび４７０５ＷＨと命名された血清において、Ｄｉｆ１３０ポリペプチドに対するＩｇＡの力価（ＭＦＩ＞１０００）を測定した。強い反応を示すポリペプチドは、生物の様々な粘膜に方向づけられた保護をもたらす粘膜免疫応答を生じさせるための免疫原性組成物またはワクチン組成物において特に有用となり得る。これは特に、感染が結腸粘膜に限定され得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに当てはまる。血清４７０５ＷＨにおけるＤｉｆ１３０およびＤｉｆ２３２ポリペプチドに対するＩｇＡの存在をウエスタンブロットにより確認した（図１３Ｂ）。これらのポリペプチドは、生物の様々な粘膜に方向づけられた保護をもたらす粘膜免疫応答を生じさせるための免疫原性組成物またはワクチン組成物において特に有用となり得る。これは特に、感染が結腸粘膜に限定され得るＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに当てはまる。表２は、タンパク質チップおよびウエスタンブロット解析においてヒト血清（４７０５ＷＨ）により認識されたポリペプチドを要約する。

（実施例１３）
Ｄｉｆ１５３（ＣＤ２８３０）のさらなる解析
６３０およびＳｔｏｋｅ＿Ｍａｎｄｅｖｉｌｌｅ株の上清においてＤｉｆ１５３が検出された。Ｄｉｆ１５３は、２２０アミノ酸の仮定上のタンパク質としてアノテートされる。ＢＬＡＳＴ解析は、亜鉛メタロペプチダーゼのファミリーである炭疽菌致死因子タンパク質（ＬＦ）に対する相同性を示した。

特に、Ｄｉｆ１５３は、炭疽菌致死因子のＣ末端ドメイン（残基５８９〜８１０）に対する相同性を示す。防御抗原との相互作用に必要な炭疽菌のＮ末端ドメインは、失われている。触媒部位（ＨＥＸＸＨ）は、Ｄｉｆ１５３において保存されており、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅタンパク質が、亜鉛依存性メタロプロテアーゼであり得ることを示唆する（図１５）。このタンパク質が、亜鉛または他の二価カチオンに結合することができるか理解するために、組換えタンパク質を使用してＮＭＲ解析を行った。この解析は、亜鉛、ニッケルおよび銅に結合するが、カルシウムに結合しない組換えタンパク質の能力を明らかにした。

Ｄｉｆ１５３がタンパク質分解活性を有するか調査するために、蛍光定量的解析を行って、組換えタンパク質のゼラチン基質切断能力を検査した（図１８）。この解析は、組換えタンパク質が、亜鉛の存在下で弱いゼラチナーゼ／コラゲナーゼ活性を有するが、ニッケルおよび銅の存在下ではまたはアポ型では活性がないことを示した。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、細胞外マトリックス構成成分の消化の原因である数種類のメタロペプチダーゼを分泌することが報告されている。したがって、本発明者らは、数種類の細胞外マトリックス要素（コラーゲンＩ〜ＶＩおよびフィブロネクチン）における組換えタンパク質のタンパク質分解活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで検査した。予備的解析は、組換えタンパク質が、フィブロネクチンを切ることができることを示した（図１６）。

次の通り、Ｄｉｆ１５３のさらなる特徴付けを行った：他の細胞外マトリックス要素におけるタンパク質分解活性を評価し、フィブロネクチン断片の質量分析配列決定（ｍａｓｓ ｓｐｅｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により切断部位を同定する。Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行って、タンパク質が、ヒト細胞に対する毒性効果を有するか理解する。Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行って、タンパク質が、ヒト細胞のフィブロネクチンマトリックスの組織化に対する効果を有するか理解する。観察される酵素活性が、Ｄｉｆ１５３に特異的であることの確認は、触媒部位に変異導入された不活性組換えタンパク質の作製により達成される。フィブロネクチン分解活性を有する新たな亜鉛メタロペプチダーゼ（ｍｅｔｅｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）であるこのポリペプチドは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのコロニー形成を限定または防止するための優れた候補となり得る。

（実施例１４）
Ｄｉｆ１８３のさらなる解析
Ｄｉｆ１８３（ＣＤ３６６９）の機能を特徴付けるため、欠失突然変異体を作製した。栄養細胞における共焦点顕微鏡および細胞画分におけるウエスタンブロット解析により、Ｄｉｆ１８３の細胞下局在を調査した。方法は、実施例６に記載されている。これらの解析は、Ｄｉｆ１８３が細菌表面に会合することを示した（図１９）。

培養上清（指数増殖期と定常期４８時間後の両方に収集）におけるＤｉｆ１８３の存在をウエスタンブロッティングにより確認した。さらに、イムノブロッティング解析は、これが総上清のみならず、超遠心画分にも存在することを明らかにした。定常期４８時間後に、本発明者らは、超遠心上清および超遠心ペレットの両方においてタンパク質を検出した。この観察は、電子顕微鏡により上清とペレットにおいて以前に観察された高分子構造（鞭毛、小胞）とタンパク質との関連を示すことができる（図２０）。

Ｄｉｆ１８３の機能を調査するため、栄養豊富な培地における欠失突然変異体の増殖曲線を野生型と比較した。栄養細胞および胞子の両方の生体計数を行った（図２１）。指数増殖期において、突然変異体は、ｗｔに匹敵する増殖プロファイルを有するが（図２１Ａ）、突然変異体株の光学密度は、後期定常期の間より速く減少する（図２１Ｂ）。栄養細胞の生体数は、ｗｔおよび突然変異体の間で差を示さなかった（図２１Ｃ）。反対に、栄養細胞のＥＴＯＨ不活性化後の突然変異体胞子の生体数は、ｗｔの約１０倍少なかった（図２１Ｄ）。この表現型は、胞子の形成、エタノール処理に対する胞子の抵抗性または胞子の発芽などの１種または複数の生物学的プロセスの欠損に関連し得る。

Ｄｉｆ１８３のさらなる特徴付けを行う。Ｄｉｆ１８３補完株を作製して、観察された表現型の特異性を確認する。増殖の異なる時点および胞子抽出物においてタンパク質発現を検査する。表現型が、胞子形成または発芽欠損（胞子計数、発芽アッセイ）に関連するか決定される。野生型およびノックアウト上清の効果が、胞子発芽において検査される。栄養細胞および胞子において、ノックアウトおよび野生型における電子顕微鏡解析を行う。新たな胞子形成／発芽因子であるこのポリペプチドは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのコロニー形成を限定または防止するための優れた候補となり得る。

３７００種を超える可能性のある標的から、本発明者らは、技法の組合せを使用して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染において有意な有用性を有する可能性のある様々なポリペプチドを同定した。これらのポリペプチドそれぞれの配列番号およびＤＩＦ識別子を図１に示し、これらのポリペプチドの予測される局在を図２に要約する。

（実施例１５）
ポリペプチド抗原とｔｏｘＢ＿ＧＴおよびＴｃｄＡ断片との組合せ
ハムスター免疫化試験は、典型的に、ゴールデンシリアンハムスターに関与した。全身性免疫化（４回、２週間置く）により抗原を検査した。死亡までの時間、感染の徴候および細菌のコロニー形成の差を検査した。

Ｈａｒｌａｎ Ｏｌａｃ、英国から雌性ゴールデンシリアンハムスター（１００ｇ体重）を購入した。動物を個々に収容し、水および食物を適宜与えた。最初のワクチン接種の少なくとも３週間前に、遠隔測定チップ（Ｖｉｔａｌｖｉｅｗ Ｅｍｉｔｔｅｒ）を開腹手術によりｉ．ｐ．挿入した。傷が癒えたら、動物をレシーバーパッドに置き、体温および活動性をモニターした（Ｖｉｔａｌ Ｖｉｅｗソフトウェア）。動物を、１、１４、２８および３６日目に、ＭＦ５９アジュバントにおいて製剤化した４用量の抗原の組合せ（５０ｕｇｒのｐ５−６およびｔｏｘＢ＿ＧＴと、２０μｇの抗コロニー形成抗原Ｄｉｆ０４４またはＤＩＦ２０８のいずれか）により腹腔内（ｉ．ｐ．）で免疫化した。全構成成分を正しく貯蔵し、凍結／融解サイクルを最小にした。

コロニー形成に対する各動物の感受性を確実にするため、６０日目に、各動物を３０ｍｇ／ｋｇのクリンダマイシンホスフェートで処置した。続いて抗生物質投与の１２時間後に、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６３０のおよそ１０００個の胞子で各ハムスターを負荷した。

負荷後に、軟便（湿った尾）の発病および持続時間を含む、感染の徴候に関して動物を密接にモニターした。以前に報告された通り、２度を超える体温降下（３５℃）を示す動物を選別した。体温が３５℃より下に降下しなかったが、１０％を超える体重が失われた動物も選別した。負荷後２週間を超えて生存した動物は、感染から回復したものと考慮して、実験にエンドポイントをもたらすものとして選別した。

１．死亡までの時間：動物の負荷後に３５℃に達するまでに要する時間。

全動物は、９．４×１０^４胞子／用量による負荷を生き延び、動物は、下痢を含むいかなる臨床徴候も示さなかった。期間中、糞便ペレットを収集して、胞子の排出をチェックした。これは、抗コロニー形成抗原なしのＰ５／６＋ｔｏｘＢ＿ＧＴによる免疫化の観察（例えば、ＷＯ２０１３／０８４０７１）と合致する。

２．体温：実験期間中、遠隔測定により全動物の体温をモニターした。全動物は、正常な日周温度変動を示し、動物６〜９に関して最初の４８時間において影響は観察されなかった。Ｈ１０における遠隔測定チップは機能しておらず、したがって、この動物の温度データは利用できない。代表的な結果を図２３に示す。

３．ワクチン接種した動物の糞便におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子の排出：負荷後様々な日数で糞便ペレットを収集した。これらは、動物を新たな滅菌ケージに置くことにより、あるいは汚れた寝床を清潔な滅菌寝床に交換した後に収集した。ペレットを滅菌ＰＢＳに再懸濁し、エリスロマイシン含有Ｂｒａｚｉｅｒｓ ＣＣＥＹ寒天上に蒔くことにより、回収したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ生物の数を数え上げた。続いて、１００ｍｇ糞便材料当たりのコロニーの数を決定した。

結果は、抗コロニー形成因子抗原（ＤＩＦ０４４およびＤＩＦ２０８）をワクチン接種した動物におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの初期排出が、毒素断片単独をワクチン接種した動物における排出レベル（ｐ５／６＋ｔｏｘ ＧＴで免疫化した動物の歴史的データ）と類似していることを示す。抗コロニー形成因子ワクチンを接種した動物における排出のレベルは、負荷後３〜４日目の間に降下し、この時点は、毒素断片のみを免疫化した動物において細菌のレベルが増加することが典型的に観察されている。負荷後８日目まで、ワクチン接種した動物の全群における排出のレベルは類似している（図２４）。

４．エンドポイントにおける腸管におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅコロニー形成：盲腸（Ｃａｅ−ＬＡ）および結腸（Ｃｏｌ−ＬＡ）の内腔に局在化するならびにこれらの臓器の組織に関連する（Ｃａｅ−ＴＡおよびＣｏｌ−ＴＡ）Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの数を数え上げた。腸管を除去し、回収された細菌における細菌数を決定した。総細菌ロード（胞子および栄養細胞）を数え上げるために、各切片を長手方向に開放し、１０ｍｌ ＰＢＳを２回交換しつつ穏やかに洗浄することにより内容物を除去した。Ｓｔｏｍａｃｈｅｒを使用して、５ｍｌのＰＢＳにおいて１分間組織をホモジナイズし、ホモジネートにおける生存数を決定した。酵母増殖を抑制するための２０ｇ／ｍｌアンホテリシンＢを含有するＣＣＦＡ血液寒天プレートに、系列１０倍希釈を蒔いた。試料中に存在する胞子数を推定するため、試料を１０分間５６℃で加熱し、生存数決定方法により存在する胞子数を決定した。微生物学的解析は、Ｈ１、Ｈ４、Ｈ５およびＨ６が、実験エンドポイントにおいて検出可能なＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを持たなかったことを示した。Ｈ８およびＨ１０は、非常に少数のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを有し、エンドポイントにおいてごく僅かなコロニーが成長していただけだった（図２５）。エンドポイントにおける腸管の平均コロニー形成を、ｐ５／６＋ｔｏｘＢ＿ＧＴ単独をワクチン接種した動物による以前の実験の結果と比較した（図２６）。

単離されたＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの数は、結腸の内腔において全群で最も多かった。盲腸および結腸両方の内腔に関連する細菌の数は、全ワクチン接種群において同等であった。抗コロニー形成抗原をワクチン接種した群における細菌の数は、盲腸における組織関連においてより低かった。結腸における組織関連において、ＤＩＦ０４４をワクチン接種した群から細菌は単離されなかった。

５．腸管内容物における毒素推定：腸管における毒素内容物の評価も行った。０．２２μｍフィルターを通して腸管洗浄液を濾過して、細菌細胞を除去した。次に、濾過した洗浄液を、１０倍減少濃度（結腸は５倍）でコンフルエントベロ細胞上に２４時間置いた。インキュベーション後に、細胞を洗浄し、固定し、次にギムザ染色で着色した。毒素が存在する場合、細胞は丸くなって剥離を生じ、色がなくなる。毒素内容物データは、細胞が付着（染色）を維持する希釈を表す。図２７に示す通り、ＨＴ２９細胞（毒素Ａに感受性）またはベロ細胞（毒素Ｂに感受性）のいずれかの上への腸管内容物試料の添加により推定される通り、腸管試料のいずれかに存在する活性毒素はごく僅かまたは全くなかった。

６．抗体検出および腸管洗浄液、血清：抗毒素抗体、抗Ｄｉｆ４４抗体および抗Ｄｉｆ２０８抗体の測定値に関して、ウエスタンブロットにより、ハムスターから得た血清または腸管洗浄液を検査した。この解析のために、ＮｕＰＡＧＥゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２００ｎｇの各組換えタンパク質（ｐ５−６、ｔｏｘＢ＿ＧＴ、Ｄｉｆ４４およびＤｉｆ２０８）を分離し、ウエスタンブロット解析のためニトロセルロース膜に転写した。ＰＢＳ−１０％粉ミルクにより膜を室温で１時間ブロッキングした。次に、実施例１５のハムスターから得た血清（希釈１：２００）または腸管洗浄液（希釈１：１０）のいずれかと共に膜を９０分間３７℃でインキュベートした：特に、実施例１５のハムスター１〜５から得た血清または腸管洗浄液を用いて、抗Ｄｉ４４抗体を検出し、実施例１５のハムスター６〜１０から得た血清または腸管洗浄液を用いて、抗Ｄｉｆ４４抗体を検出した。抗ハムスター二次抗体（希釈１：１０，０００）との４５分間３７℃のインキュベーション後に、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）により、メーカーの説明書に従って、結合した抗体の検出を行った。

図２８および図２９から、抗Ｄｉｆ４４抗体および抗Ｄｉｆ２０８抗体が、血清および腸管洗浄液に存在することが分かり得る。

（実施例１６）
抗Ｄｉｆ４４抗体は、他のＣＷＰタンパク質を認識する。
抗Ｄｉｆ４４抗体が、他のｃｗｐタンパク質と交差反応することができるか決定するため、２００ｎｇの様々な試料をゲルにロードし、ウエスタンブロットに供した。ＮｕＰＡＧＥゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各組換えｃｗｐタンパク質（図３０に示す）を分離し、ウエスタンブロット解析のためニトロセルロース膜に転写した。

ＰＢＳ−１０％粉ミルクにより膜を室温で１時間ブロッキングした。次に、実施例１５のハムスター１〜５から得た血清（希釈１：２００）と共に膜を９０分間３７℃でインキュベートした。抗ハムスター二次抗体（希釈１：１０，０００）との４５分間３７℃のインキュベーション後に、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）により、メーカーの説明書に従って、結合した抗体の検出を行った。

図３０に示す通り、血清抗体は、ｃｗｐ１、ｃｗｐ３、ｃｗｐ６、ｃｗｐ７、ｃｗｐ１１、ｃｗｐ１４、ｃｗｐ２０、ｃｗｐ２１、ｃｗｐ２５、ｃｗｐ２６、ｃｗｐ２７およびｃｗｐ２９を認識した。同じ試料を、ｐ５＿６＋ＴｏｘＢ−ＧＴをワクチン接種したハムスターから得た血清ともインキュベートした。この血清に存在するｃｗｐタンパク質に対する可能性のある抗体は、ワクチン接種後に負荷された細菌に対する免疫応答によるものである。ｃｗｐ５、ｃｗｐ２５、ｃｗｐ２６、ｃｗｐ２９のみに対し弱い反応性が検出され、ワクチン接種にｄｉｆ４４を加えることが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する応答に利点を付与することを実証する。

（実施例１７）
ＤＩＦ４４およびＤＩＦ２０８ポリペプチド抗原とＴｏｘＢ−ＧＴおよびＰ５＿６断片との組合せ
上述の通りに免疫原性組成物を調製する。次の通り、３種の組成物を投与する：８匹のハムスターに、ＴｏｘＢ＿ＧＴ＋Ｐ５＿６＋ＤＩＦ２０８＋ＤＩＦ４４、４匹のハムスターに、ＴｏｘＢ＿ＧＴ＋Ｐ５＿６（陰性対照）、他の箇所に記載されている標準投与手順を使用。ＴｏｘＢ＿ＧＴ＋Ｐ５＿６＋ＤＩＦ２０８＋ＤＩＦ４４を投与した８匹のハムスターのうち６匹にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを負荷し、一方、２匹は負荷せずにおいた。死亡までの時間および細菌のコロニー形成の差をｉｎ ｖｉｖｏで検査した。例えば、免疫化し負荷したハムスターの血清において観察されたＤＩＦ４４に対する抗体が、感染またはワクチン接種に起因するか決定することは以前に可能でなかったため、ワクチン接種したが負荷してないハムスターから得た血清および腸管洗浄液に存在する抗体を観察するためのウエスタンブロットも行った。

（参考文献）

Claims (23)

1. ａ）Ｄｉｆ４４およびＤｉｆ２０８から選択されるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅポリペプチド、
   ｂ）前記ａ）のポリペプチドをコードする核酸分子、および／または
   ｃ）前記ａ）のポリペプチドに結合することができる抗体
   を含む免疫原性組成物。
2. 少なくとも１種のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原および少なくとも１種のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＴｃｄＡ抗原、該抗原をコードする核酸分子、ならびに／または該抗原に結合することができる抗体をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. 前記ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原および／または前記ＴｃｄＡ抗原が、解毒されている、請求項２に記載の免疫原性組成物。
4. 前記Ｄｉｆ４４ポリペプチドが、
   ａ）配列番号１３９もしくは配列番号７９に対し８０％以上の同一性を有する、および／または
   ｂ）配列番号１３９もしくは配列番号７９の、または配列番号１３９もしくは配列番号７９に対し８０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片であり、配列番号１３９または配列番号７９のエピトープを含む
   アミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
5. 前記Ｄｉｆ２０８ポリペプチドが、
   ａ）配列番号４３３もしくは配列番号１３３に対し８０％以上の同一性を有する、および／または
   ｂ）配列番号４３３もしくは配列番号１３３の、または配列番号４３３もしくは配列番号１３３に対し８０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片であり、配列番号４３３または配列番号１３３のエピトープを含む
   アミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれかに記載の免疫原性組成物。
6. 前記断片が、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１７１または配列番号１７３に対し８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の免疫原性組成物。
7. 前記ＴｏｘＢ−ＧＴ抗原が、
   ａ）配列番号１８もしくは配列番号６０に対し８０％以上の同一性を有する、および／または
   ｂ）配列番号１８もしくは配列番号６０の、または配列番号１８もしくは配列番号６０に対し８０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片であり、配列番号１８または配列番号６０のエピトープを含む
   アミノ酸配列を含むまたはこれからなるポリペプチドである、請求項２から６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
8. 前記ＴｃｄＡ抗原が、
   ａ）配列番号１１、１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５もしくは１６に対し８０％以上の同一性を有する、および／または
   ｂ）配列番号１１、１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５もしくは１６のいずれかの、または配列番号１１、１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５もしくは１６のいずれかに対し８０％以上の同一性を有するポリペプチドの少なくとも７個の連続的なアミノ酸の断片であり、配列番号１１、１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５または１６のいずれかのエピトープを含む
   アミノ酸配列を含むまたはこれからなるポリペプチドである、請求項２から７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
9. （１）ＴｏｘＡ−ＥＤ抗原（配列番号３）、（２）ＴｏｘＡ−ＧＴ抗原（配列番号４）、（３）ＴｏｘＡ−ＣＰ抗原（配列番号５）、（４）ＴｏｘＡ−Ｔ抗原（配列番号６）、（５）ＴｏｘＡ−Ｔ４抗原（配列番号７）、（６）ＴｏｘＡ−Ｂ抗原（配列番号８）、（７）ＴｏｘＡ−ＰＴＡ２抗原（配列番号９）、（８）ＴｏｘＡ−Ｐ５−７抗原（配列番号１０）、（９）ＴｏｘＡ−Ｐ５−６抗原（配列番号１１）、（１０）ＴｏｘＡ−Ｐ９−１０抗原（配列番号１２）、（１１）ＴｏｘＡ−Ｂ２抗原（配列番号１３）、（１２）ＴｏｘＡ−Ｂ３抗原（配列番号１４）、（１３）ＴｏｘＡ−Ｂ５抗原（配列番号１５）、（１４）ＴｏｘＡ−Ｂ６抗原（配列番号１６）または全長ＴｃｄＡ抗原（配列番号１）から必要に応じて選択される、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５種以上の追加的なＴｃｄＡ抗原をさらに含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
10. 前記ＴｃｄＡ抗原が、ＴｏｘＡ−Ｐ５−６である、請求項２から８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
11. ２種以上の抗原が存在する場合、前記組成物中の前記抗原のうち少なくとも２種が、ハイブリッドポリペプチドの形態である、前記請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
12. 前記抗原のいずれもハイブリッドポリペプチドの形態ではない、請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
13. Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａおよび毒素Ｂに対する中和力価を誘導する、前記請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
14. 少なくとも１種のさらなるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原を含み、必要に応じて、前記さらなるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原が糖抗原である、前記請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
15. ワクチン組成物である、前記請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
16. アジュバントをさらに含む、請求項１５に記載のワクチン組成物。
17. 医薬品としての使用のための、請求項１６に記載のワクチン組成物。
18. 哺乳動物における免疫応答の発生における使用のための、請求項１６から１７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
19. 好ましくは哺乳動物における、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患の処置または防止における使用のための、請求項１６から１７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
20. 好ましくは哺乳動物における、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ胞子誘導性疾患再発の処置、防止もしくは重症度低下における、またはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる腸管のコロニー形成の処置、防止もしくは低下における使用のための、請求項１６から１７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
21. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１６から２０のいずれか一項に記載のワクチン。
22. 哺乳動物において免疫応答を発生させるための方法であって、有効量の前記請求項のいずれか一項に記載の免疫原性組成物またはワクチンを前記哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
23. 前記哺乳動物がヒトである、請求項２２に記載の方法。

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