MX2015002485A - Polipeptidos de clostridium difficile como vacuna. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos, proteínas, ácidos nucleicos y anticuerpos para evitar o tratar una infección por C. difficile en un mamífero.

Description

POLIPÉPTIDOS DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE COMO VACUNA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con polipéptidos derivados de Clostridium difficile (C. difficile , particularmente métodos para tratar y evitar infección por . difficile utilizando los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN lostridium difficile es una bacteria formadora de esporas, anaeróbica, en forma de bastón grampositiva. Por primera vez se publicó el genoma secuenciado completo de C. difficile en el año de 2006 [1] y se identificaron 3776 secuencias codificantes predichas. C. difficile es un componente normal de la flora intestinal, se calcula que está presente en 3% de la población general sin signos de enfermedad. En situaciones en donde el equilibrio natural de la flora intestinal está alterado, entonces C. difficile se puede volver más prevalente. Este crecimiento excesivo provoca que la bacteria comience a producir toxinas bajo el control de un regulador de señalización de quorum. La causa más frecuente de una ruptura del equilibrio natural de la flora intestinal es la administración de antibióticos los cuales son dañinos para algunas bacterias del intestino, pero que no afectan a C. difficile . C. difficile es la causa principal de diarrea asociada a antibióticos (AAD, por sus Ref . 254416 siglas en inglés), aunque los síntomas se pueden extender a colitis pseudomembranosa que pone en peligro la vida. La prevalencia más alta de infección es en pacientes hospitalizados viejos, aunque las infecciones se encuentran cada vez en mayor cantidad en grupos atípicos, tales como adolescentes y embarazadas [2]. Se ha observado que entre 12% y 35% de aquellos infectados con . presentan recaídas en los siguientes 2 meses [3]. . c e se identifica únicamente como el agente causal de AAD en la década de los 70s. Desde entonces se han intentado numerosas estrategias para combatir la infección. Inicialmente se utilizaron antibióticos específicos tales como vancomicina, metronidazol, nitazoxanamida, bacitracina o ácido fusídico para el tratamiento de infección por . c e y continúa utilizándose hoy en día (véanse las referencias 4, 5 y 6). El tratamiento ampliamente diseminado con estos antibióticos no está favorecido, aunque debido al riesgo de . c e también de otras bacterias del intestino de que se vuelvan resistentes con el tiempo. Recientemente, el tratamiento con vacunas basados en los toxoides secretados por la bacteria y el direccionamiento de inmunoterapia pasiva tales toxinas han sido adaptadas (referencias 7 y 8). Una vacuna de toxoide con y sin adyuvante se encuentra en ensayos en fase II en pacientes de 18 a 85 años de edad para determinar la eficacia para evitarse de irrecurrente en un período de nueve semanas después de la tercera dosis de esta vacuna. Las vacunas de toxoide típicamente requieren administraciones repetidas y un adyuvante con el fin de inducir una respuesta inmunitaria. Además, su administración se asocia frecuentemente con reacciones inmunitarias en el sitio de inyección. No obstante, las vacunas basadas en toxina únicamente evitan la unión de toxina, neutralizando los efectos inflamatorios; tales vacunas generalmente no son capaces de evitar colonización completamente o depurar el patógeno existente del cuerpo. Por ejemplo, pueden permanecer esporas lo que significa que es probable infección adicional o recurrencia de infección con síntomas asociados.

Así, existe la necesidad de composiciones mejoradas y métodos para tratar o evitar infección por . i ficile . En particular, existe la necesidad de polipéptidos que serán útiles como componentes de vacuna y que se puedan utilizar para limitar o eliminar la colonización —incluyendo esporas— en sujetos vacunados, evitando adicionalmente transmisión de . i icile. Un objetivo de la invención es proporcionar polipéptidos y composiciones que sean eficaces para generar respuestas inmunitarias contra C. c para uso en el desarrollo de vacunas para evitar y/o tratar enfermedades asociadas con C. i ic e.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 proporciona información de resumen sobre cada uno de los polipéptidos seleccionados incluyendo nombre interno, identificador de gen (GI, por sus siglas en inglés), etiqueta de locus, longitud de secuencia de aminoácidos (AA), identidad de cepa a partir de la cual de aíslo originalmente el polipéptido, las SEC ID NOS: que corresponden a cada polipéptido, las SEC ID NOS: de los polipéptidos clonados y diversos cebadores.

La figura 2 resume los resultados de experimentos Secretóme, RMN y microscopía confocal.

La figura 3 proporciona un esquema del proceso utilizado en el análisis por RMN.

La figura 4 muestra los espectros 15N-HSCQ para Diff44.

La figura 5 demuestra los resultados de estudios de exposición de superficie por Western blot.

La figura 6 proporciona datos FACS representativos para Dif232.

La figura 7 proporciona un resumen de datos en relación a experimentos de unión celular. Los análisis de unión de polipéptidos recombinantes sobre células vero humanas por análisis FACS y sobre células Vero y Caco-2 por microscopía confocal.

La figura 8 muestra análisis de Western blot de extractos de células totales de cepas de referencia de C. i ici e (630, R20291 y M120) y aislados clínicos que representan diferentes ribotipos por PCR utilizando anticuerpos anti-Difl92 y anti-Dif44. La forma madura Difl92 tiene 647 aminoácidos y 71.1 kDa. La forma madura de Dif44 es de 286 aminoácidos y 31 kDa.

La figura 9 proporciona un resumen de los resultados en relación a análisis de unión a ELISA.

Las figuras 10A y 10B muestran reconocimiento de polipéptidos recombinantes de . i ici e (100 ng) (fig. 10A) por sueros de hámsteres mediante Western blot por sueros de hámster vacunados con combinación de toxina A y B y exposición con . ifficile cepa 630 o cepa Bl, (fig.10B) por suero de hámster no infectado.

La figura 11 muestra reconocimiento de polipéptidos recombinantes de C. i ici e por anticuerpos séricos humanos.

Las figuras 12A y 11B muestran reconocimiento de polipéptidos recombinantes de . i ici e por anticuerpos séricos humanos.

Las figuras 13A y 13B muestran reconocimiento de polipéptidos recombinantes de . i fici e por anticuerpos séricos humanos.

La figura 14 muestra reconocimiento de polipéptidos recombinantes de . i ic e por anticuerpos de suero de ratón. La inmunotransferencia o proteínas recombinantes utilizando suero de ratones inmunizados con sobrenadantes concentrados (5) Difl83 (CD3669).

La figura 15 muestra la alineación entre Difl53 y la parte C-terminal del factor mortal de carbunco (residuos 589 a 810); Difl53 es homólogo a la parte C-terminal del factor mortal de carbunco; dominio N-terminal, necesario para interacción con PA se ha perdido; se conserva el sitio catalítico (HEXXH).

La figura 16 muestra un análisis fluoriétrico que muestra actividad débil de gelatinasa/colagenasa para Difl53 en presencia de zinc.

La figura 17 muestra cantidades cada vez menores de Difl53 recombinante que se incuban con la misma cantidad del sustrato deseado (colágeno I-VI, fibronectina). La reacción se lleva a cabo a 37°C durante 16 h en presencia de ZnCl2 0.5 mM. Los productos de reacción se cargan sobre geles para SDS-PAGE y después se tiñen con plata o con Comassie.

La figura 18 muestra que Difl83 contiene un dominio GerMN.

Las figuras 19A y 19B: (fig. 19A) muestra el análisis de Western blot sobre fracciones de células de la cepa 630 utilizando suero anti-Dif183; (fig.19B) muestra el análisis de inmunofluorescencia sobre células vegetativas de la cepa 630.

La figura 20 muestra el análisis de la presencia de Difl83 en fracciones de sobrenadante de cultivo por Western blot.

Las figuras 21A-21D muestran un mutante por supresión de Difl83 que tiene el fenotipo de esporulación/germinación.

La figura 22 muestra una representación esquemática de los fragmentos de toxina recombinantes de C. difficile preferidos. ED = dominio enzimático; GT = dominio de glucosil-transferasa; CP = dominio de cistenina proteasa; T = dominio de translocación; B = dominio de unión. Todos los dominios son solubles con la excepción de los dominios T4 y PTA2 de TcdA, los cuales son insolubles.

La figura 23 muestra fluctuaciones en temperatura de animales vacunados después de la administración de los antígenos de fragmento de toxina con Dif44 o Dif208, y subsecuente exposición a C. i i i 630.

La figura 24 muestra el número de C. i ici e (UPC/100 mg) observadas en pellas fecales recolectadas después de exposición a C. en animales vacunados con antígenos de fragmento de toxina en combinación con Dif44 o Dif208.

La figura 25 muestra las cantidades de C. i ici e en el lumen del ciego (Cae-LA), el lumen del colon (Col-LA), el tejido del ciego (Cae-TA) y el tejido del colon (Col-TA) en los criterios de valoración experimentales para animales vacunados con antígenos para fragmento de toxina en combinación con Dif44 o Dif208 y sometidos a exposición subsecuente a C. difficile 630.

La figura 26 muestra el número total de . difficile aislado en el criterio de valoración experimental (día 14 después de la exposición) de todos los grupos vacunados.

La figura 27 muestra el título de toxina de muestras de intestino en el criterio de valoración experimental.

La figura 28 muestra el reconocimiento de los sueros recombinantes ToxAp5_6, ToxB_GT y Dif44 por suero o colon y lavados de ciego de hámsteres 1 a 5 del ejemplo 15.

La figura 29 muestra el reconocimiento de las formas recombinantes de ToxAp5_6, ToxB_GT y Dif208 por suero o colon y lavados de ciego de hámsteres 6-10 del ejemplo 15.

La figura 30 muestra el reconocimiento de diversas proteínas de pared celular (cwps, por sus siglas en inglés) por suero de hámster 1 a 5 del ejemplo 15.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 y 465. Los polipéptidos han sido identificados a partir de . i i i . Particularmente, los polipéptidos de la invención son inmunogénicos y adecuados para uso en composiciones inmunogénicas, por ejemplo, composiciones de vacun .

En una modalidad, los polipéptidos de la invención se resumen a continuación y también en la figura 1.

Dif44: Esta proteína también se conoce como "CD0844" y está anotada como proteína de superficie celular cwp25 de . i ici e . Las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos del polipéptido corresponden con las secuencias presentadas en la SEC ID NO: 78 y 138 y SEC ID NO: 79 y 139 respectivamente.

Dif51: Esta proteína también se conoce como "CD0999" y está anotada como lipoproteína de una proteína de unión de sustrato transportador ABC de . ifficile. Las secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos del polipéptido corresponden con las secuencias presentadas en la SEC ID NO: 80 y 140 y SEC ID NO: 81 y 141 respectivamente. La secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos del polipéptido en donde la cisteína N-terminal ha sido suprimida corresponde con las secuencias presentadas en la SEC ID NO: 356 y 357 respectivamente.

Difl30: Esta proteína también se conoce como "CD2645" y se ha anotado como proteína de unión a soluto extracelular putativa de iffici e. Las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos del polipéptido se presentan en la SEC ID NO: 92 y 152, y en las SEC ID NOS: 93 y 153 respectivamente. La secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos del polipéptido en donde la cisteína N-terminal ha sido suprimida corresponde con las secuencias que se presentaron en las SEC ID NOS: 358 y 359 respectivamente.

Difl53: Esta proteína también se conoce como CD2830 y se ha anotado como proteína hipotética de 220 aminoácidos. El análisis BLAST muestra homología con proteínas del factor mortal de carbunco, una familia de metalopept idasas de zinc. En particular, Difl53 muestra homología con el dominio C-terminal del factor mortal de carbunco. El dominio N-terminal de carbunco, necesario para interacción con el antígeno protector se ha perdido. El sitio catalítico (HEXXH) está conservado (Figura 17). La secuencia de ácido nucleico y/o secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las secuencias presentadas en las SEC ID NOS: 299, 321 y 434 y en la SEC ID NO: 300, 322 y 435 respectivamente. El análisis BLAST muestra homología con proteínas del factor mortal de carbunco, una familia de metalopeptidasas de zinc. En particular, Difl53 presenta homología con el dominio C-terminal del factor mortal de carbunco. El dominio N-terminal de carbunco, necesario para interacción con el antígeno protector se ha perdido. El sitio catalítico (HEXXH) está conservado (Figura 15). Se puede obtener destoxificación de Difl53 por mutación de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de ácido nucleico codificante de este polipéptido que incluye una supresión de la totalidad o una porción del dominio de metaloproteasa de zincina y una mutación puntual del dominio de metaloproteasa de zincina el cual reduce la actividad de proteasa. Los ejemplos de mutantes únicos de Difl53 (CD2830) son H142A, E143A, E143R, H146A, D149A, H150A, Y178F y C208S. Los ejemplos de mutantes dobles de Difl53 (CD2830) son H142A/H146A; H142A/Y178F; H142A/E143R; H142A/E143A; E142A/Y178F en relación a la secuencia del polipéptido CT153 (CD2830) de tipo silvestre de la SEC ID NO: 300 y 435. La invención también proporciona otros mutantes para el polipéptido CT153 (CD2830) solo o en combinación: H142A/H150A y E143A/D149A. Los siguientes polipéptidos inmunogénicos destoxif icados preferiblemente retienen por lo menos un epítopo del fragmento inmunogénico de la SEC ID NO: 300 y 435. Las secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos relacionadas con estos mutantes se resumen en la tabla 1.

Difl83: Esta proteína también se conoce como "CD3699" y se ha anotado como una proteína hipotética de C. difficile. La parte C-terminal contiene una copia del dominio GerMN que ha sido relacionada con la esporulación y germinación de Bacillus subtilis (Figura 20) Las secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos del polipéptido se presentan en las SEC ID NOS: 186, 188, 187 y 189 respectivamente. La secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos del polipéptido en donde se ha suprimido la cisteína N-terminal corresponde con las secuencias presentadas en las SEC ID NOS: 359 y 360 respectivamente.

Difl92: Esta proteína también se conoce como "CD1035" y está anotada como proteína de superficie celular (N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa putativa) cwpl6 de C. i ici e. Las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos del polipéptido se presentan en las SEC ID NOS: 104 y 164 y las SEC ID NOS: 105 y 165 respectivamente.

Dif208: Esta proteína también se conoce como "CD2831 " y está anotada como sustrato de sortasa de proteína que une colágeno de C. difficile . Las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos del polipéptido se presentan en la SEC ID NO: 132 y 432 y en la SEC ID NO: 133 y 433 respectivamente. El fragmento Dif208A corresponde a los aminoácidos 32 a 480 de Dif208. Las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos del polipéptido Dif208A se presentan en las SEC ID NOS: 110 y 170 y en las SEC ID NOS: 111 y 171 respectivamente. El fragmento Dif208B corresponde a los aminoácidos 481 a 938 de Dif208. Las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos del polipéptido Dif208B se presentan en la SEC ID NOS: 112 y 172 y en la SEC ID NOS: 113 y 173 respectivamente.

Dif232: Esta proteína también se conoce como "CD1031" y está anotada como proteína anclada a pared celular de C. difficile. Las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos del polipéptido se presentan en las SEC ID NOS: 124 y 184 y en las SEC ID NOS: 125 y 185 respectivamente.

Los polipéptidos preferidos particularmente de la invención son Dif44 y Dif208. Se ha demostrado que estos polipéptidos reducen la colonización del intestino por C. difficile in vivo, y son de uso particular en composiciones inmunoterapéuticas.

Generalmente, los polipéptidos de la invención son polipéptidos para uso en medicina y en terapia, particularmente en relación con el campo de C. difficile , por ejemplo en inmunización pasiva contra enfermedad asociada a Clostridium difficile (CDAD, por sus siglas en inglés). La invención también proporciona el uso de estos polipéptidos en la elaboración de un medicamento.

En una modalidad particular, los polipéptidos de la invención son polipéptidos para uso en la prevención, tratamiento o reducción de la gravedad de una infección por C. difficile en un mamífero. En algunas modalidades, la invención también proporciona el uso de estas composiciones en la elaboración de un medicamento.

Los polipéptidos de la invención y los mencionados en lo anterior, particularmente Dif44 y Dif208 se ha mostrado sorprendentemente que reducen la colonización del intestino por C. difficile, cuando se prueban en un modelo in vivo (Ejemplo 15) . Esto es particularmente relevante a la prevención de una recaída de enfermedad inducida por esporas, la cual es una de las preocupaciones clínicas más significativas en infección por C. difficile . Las vacunas experimentales las cuales proporcionan un efecto protector contra C. difficile no se ha demostrado previamente que reduzca la colonización del intestino por C. difficile en la misma medida que las combinaciones de antígenos los cuales incluyen los polipéptidos de la invención y a los que se hace referencia en lo anterior, particularmente Dif44 y Dif208.

Los inventores han demostrado que se observa colonización reducida del intestino cuando a los sujetos se les administra una combinación de antígenos que inducen un efecto protector contra C. difficile en combinación con ya sea Dif44 o Dif208 y posteriormente se exponen a C. difficile. Este efecto se observa en términos de la cantidad de . difficile que se disemina en heces en diversos puntos de tiempo después de la exposición o la cantidad de C. difficile que se recupera de los lavados de intestino o tejido en el criterio de valoración experimental.

La colonización de intestino se reduce en sujetos a los que se administra una combinación de antígenos que inducen un efecto protector contra . difficile en combinación con ya sea Dif44 o Dif208 y subsecuentemente se exponen con . i icile, en comparación con sujetos en los que se administra una combinación de antígenos que inducen un efecto protector contra . y subsecuentemente son expuestos a . ifficile .

Los polipéptidos de la invención y a los que se hace referencia en lo anterior, particularmente Dif44 y Dif208 de esta manera son de uso particular en el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de . i ici e, o en el tratamiento, prevención o reducción de colonización del intestino por C. ifficile. "Reducir" significa provocar una disminución, preferiblemente una disminución estadísticamente significativa en un parámetro. La reducción de colonización del intestino por . difficile de esta manera se refiere a provocar una disminución en el número de bacterias de C. i ici e presentes en el intestino de un sujeto en un punto de tiempo particular después de exposición del sujeto a . , por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días, semanas o meses después de exposición del sujeto a . ifficile . La reducción es, por ejemplo, en comparación con un sujeto a quien no se le ha administrado con los polipéptidos, composiciones o vacunas de la invención en comparación en un sujeto en quien se ha administrado una composición que induce un efecto protector contra . difficile (la cual preferiblemente no contiene uno o más de Dif44, Dif51, Dif130, Dif153, Dif183, Difl92, Dif208, Dif208A, y Dif232, particularmente la cual no contiene Dif44 o Dif208), y/o en comparación con un sujeto en quien no se ha administrado con alguna composición que induzca un efecto protector contra C. ifficile . La reducción puede ser de por lo menos 10, 20, 30, 4050, 60, 70, 80, 90 ó 100%.

Los polipéptidos de la invención de esta manera se pueden utilizar, por ejemplo, en composiciones inmunogénicas, vacunas y métodos médicos como se hace referencia en la presente, pero que son particularmente útiles cuando se utilizan en combinación con uno o más antígenos adicionales, preferiblemente los cuales proporcionan un efecto protector contra . i ici e o contra CDAD.

Se observa un efecto protector contra C. i ici e o CDAD cuando la administración del compuesto relevante (por ejemplo, un antígeno o una combinación de antígenos) evita y/o disminuye la probabilidad, duración o gravedad de una infección subsecuente de o la enfermedad. Esto se puede probar para utilizar métodos los cuales son bien conocidos en el ámbito, por ejemplo aquellos en los cuales el compuesto relevante se administra a un sujeto y el sujeto se expone a C. difficile. El efecto de la exposición se observa, por ejemplo, en términos del porcentaje de animales los cales sobreviven a la exposición y este valor se puede comparar con el valor obtenido utilizando un control apropiado, por ejemplo, en ausencia de administración de compuesto alguno o compuesto alguno que proporcione un efecto protector.

Los ejemplos de antígenos de C. difficile los cuales proporcionan un efecto protector contra C. difficile o CDAD son, por ejemplo, aquellos descritos en W02013/084071, el contenido de los cuales se incorpora en la presente como referencia. Los análisis tales como los descritos en W02013/084071 de esta manera se pueden utilizar para determinar si un control dado tiene este efecto protector. En particular, la longitud completa del antígeno de Tox A de C. difficile (o TcdA), en combinación con el antígeno Tox B de C. difficile de longitud completa se afirma que es la norma dorada y por lo tanto puede servir como un control positivo para un efecto protector. Un antígeno que proporciona un efecto protector es por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100% tan efectivo como el estándar dorado.

Los antígenos de C. difficile preferidos y las combinaciones de los mismos los cuales proporcionan un efecto protector contra C. difficile o contra CDAD se describen en W02013/084071. Estos antígenos se denominan también como antígenos de toxina de C. ddiiffffiicciillee .. La composición inmunogénica de la invención preferiblemente comprende de manera adicional uno o más antígenos adicionales, preferiblemente los cuales proporcionan un efecto protector contra C. difficile o contra CDAD. De manera más preferible, los antígenos adicionales son antígenos de toxina de . difficile . La composición inmunogénica de la invención preferiblemente comprende además: (a) por lo menos un antígeno ToxB-GT y (b) por lo menos un antígeno TcdA. Preferiblemente, el antígeno ToxB-GT y/o el antígeno TcdA están destoxificados.

De esta manera, las composiciones inmunogénicas preferidas de la invención comprenden una combinación de antígenos de C. i i i e la combinación comprende: (a) uno o más polipéptidos que se seleccionan del grupo de Dif44, Dif51, Dif130, Dif153, Difl83, Difl92, Dif208, Dif208A, y Dif232; (b) por lo menos un antígeno ToxB-GT y (c) por lo menos un antígeno TcdA y que preferiblemente comprende una combinación de antígenos de C. i ici e, la combinación comprende: (a) por lo menos un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de Dif44 y Dif208; (b) por lo menos un antígeno ToxB-GT y (c) por lo menos un antígeno TcdA. Como se utiliza en la presente, el término "combinación" significa una combinación divalente, trivalente o multivalente de antígenos. Una combinación preferiblemente es capaz de inducir una respuesta protectora y/o tratar, evitar o reducir colonización del intestino por C. ifficile. Cuando se utilizan combinaciones, los componentes individuales pueden ser administrados de manera secuencia, simultánea o separada.

En algunas modalidades, el antígeno ToxB-GT es un polipéptido que comprende, que consiste esencialmente o que consiste de una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 80% o mas de identidad con la SEC ID NO: 18 o la SEC ID NO: 60; y/o (b) que es un fragmento de por lo menos 7 aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 18 o la SEC ID NO: 60, o de un polipéptido que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 18 o la SEC ID NO: 60 y que comprende un epítopo de la SEC ID NO: 18 o la SEC ID NO: 60. Preferiblemente, el antígeno ToxB-GT comprende, consiste esencialmente o consiste de la SEC ID NO: 18.

En algunas modalidades, el antígeno TcdA es un polipéptido que comprende, que consiste de una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 80% o mas de identidad con la SEC ID NO: 1; y/o (b) que es un fragmento de por lo menos 7 aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 1, o de un polipéptido que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 1 y que comprende un epítopo de la SEC ID NO: 1.

En ciertas modalidades, la composición inmunogénica comprenderá o comprende de manera adicional un antígeno ToxB-GT y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más antígenos TcdA, por ejemplo l a lO, l a 5, l a 4, l a 3, l a 2, 2 a 9, 3 a 8, 4 a 7, 5 a 6 antigenos TcdA. Preferiblemente, uno o más antígenos TcdA se seleccionan de (1) un antígeno ToxA-ED (SEC ID NO: 3), (2) un antígeno ToxA-GT (SEC ID NO: 4), (3) un antígeno ToxA-CP (SEC ID NO: 5), (4) un antígeno ToxA-T (SEC ID NO: 6), (5) un antígeno TOCA-T4 (SEC ID NO: 7), (6) un antígeno ToxA-B (SEC ID NO: 8), (7) un antígeno ToxA-PTA2 (SEC ID NO: 9), (8) un antígeno ToxA-P5-7 (SEC ID NO: 10), (9) un antígeno ToxA-P5-6 (SEC ID NO: 11), (10) un antígeno ToxA-P9-10 (SEC ID NO: 12), (11) un antígeno ToxA-B2 (SEC ID NO: 13), (12) un antígeno ToxA-B3 (SEC ID NO: 14), (13) un antígeno ToxA-B5 (SEC ID NO: 15), (14) un antígeno ToxA-B6 (SEC ID NO: 16) o un antígeno TcdA de longitud completa (SEC ID NO: 1). De manera más preferible, el antígeno TcdA es un antígeno ToxA-P5-6 el cual comprende consiste esencialmente o consiste de la SEC ID NO: 11. Como se describe en otra parte en este documento, uno o más antígenos TcdA preferiblemente: (a) tienen 80% o más de identidad con estas secuencias, y/o (b) es un fragmento de por lo menos 7 aminoácidos consecutivos de una o más de estas secuencias o de un polipéptido que tiene 80% o más de identidad con una o más de estas secuencias y que comprende un epítopo de la secuencia relevante.

En ciertas modalidades, la composición inmunogénica comprende o comprende adicionalmente un antígeno ToxA-GT y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más antígenos TcdB, por ejemplo 1-10, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-9, 3-8, 4-7, 5-6 antígenos TcdA que opcionalmente se seleccionan de (1) un antígeno ToxB-ED (SEC ID NO: 17), (2) un antígeno ToxB-GT (SEC ID NO: 18), (3) un antígeno ToxB-CP (SEC ID NO:19) (4) un antígeno ToxB-T (SEC ID NO: 20), (5) un antígeno ToxB-B (SEC ID NO: 21), (6) un antígeno ToxB-B2 (SEC ID NO: 22), (7) un antígeno ToxB-B7 (SEC ID NO: 23) u (8) un antígeno TcdB de longitud completa (SEC ID NO: 2). Preferiblemente uno o más antígenos TcdB es un antígeno ToxB-GT, particularmente un antígeno el cual comprende, consiste o consiste esencialmente de la SEC ID NO: 18.

En modalidades particulares, la composición inmunogénica comprende o comprende adicionalmente un antígeno ToxB-GT y un antígeno TcdA, en donde el antígeno TcdA se selecciona del grupo que consiste de ToxA-P5-6 y ToxA-B2. Más particularmente, el antígeno TcdA es ToxA-P5-6. De manera aún más particular, el antígeno ToxA-P5-6 comprenderá, consistirá esencialmente o consiste de una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 11; y/o b) que es un fragmento de por lo menos 7 aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 11, o de un polipéptido que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 11 y que comprende un epítopo de la SEC ID NO: 11. Antígenos ToxB-GT El antígeno TcdB de longitud completa (también denominado en la presente como ToxB y Toxina B) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 (codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 31). El antígeno TcdB destoxificado se denomina en la presente como toxoide B. La abreviatura "ToxB-GT" se refiere al dominio glucosiltransferasa de TcdB, el cual se localiza dentro de la región N-terminal del dominio enzimático (ED) y representado en la figura 22). El dominio ToxB-GT (SEC ID NO: 18, codificado por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 47) es un fragmento de TcdB que corresponde a los aminoácidos 1 a 543 de la SEC ID NO: 2.

En antígeno ToxB-GT incluido en las composiciones de la invención es un polipéptido que comprende o que consiste de una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9% o más) con la SEC ID NO: 18; y/o (b) que es un fragmento de por lo menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 18, o de un polipéptido que tiene 50% o más de identidad con la SEC ID NO:18, en donde "n" es 7 o mayor (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 540, o mayor). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEC ID NO: 18. Otros fragmentos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde la parte C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde la parte N-terminal de la SEC ID NO: 18 mientras se retiene por lo menos un epítopo de la SEC ID NO:18. Los fragmentos de aminoácidos de ToxB-GT de esta manera pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, o hasta 540 residuos aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 18.

El antígeno ToxB-GT incluido en las composiciones de la invención puede ser destoxificado. La destoxificación se puede obtener al hacer mutar la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico codificante del antígeno ToxB-GT de tipo silvestre utilizando cualquier método apropiado conocido en el ámbito, por ejemplo mutagénesis dirigida a sitio. Preferiblemente, el antígeno ToxB-GT comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, o más mutaciones), en relación a la secuencia del antígeno ToxB-GT de tipo silvestre de la SEC ID NO: 18. Por ejemplo, el antígeno ToxB-GT comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o más mutaciones), por ejemplo en las posiciones de aminoácidos 17, 102, 139, 269, 270, 273, 284, 286, 288, 384, 449, 444, 445, 448, 449, 450, 451, 452, 455, 461, 463, 472, 515, 518, y/o 520, en relación a la secuencia de antígeno ToxB-GT de tipo silvestre de la SEC ID NO:18. Por ejemplo, el antígeno ToxB-GT puede comprender sustituciones en 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones que corresponden a los aminoácidos 270, 273, 284, 286 y/o 288 de la secuencia de antígeno Tox-GT de la SEC ID NO: 18. En particular, 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en las posiciones que corresponden a los aminoácidos 270, 273, 284, 286 y/o 288 de la secuencia de antígeno ToxB-GT de la SEC ID NO:18 pueden estar sustituidos, preferiblemente por residuos alanina. La secuencia de aminoácidos de un antígeno ToxB-GT destoxificado que tiene sustituciones alanina en estas posiciones se proporciona en la SEC ID NO: 60.

Cuando el ToxB-GT comprende dos sustituciones de aminoácidos, las sustituciones preferiblemente no son en las posiciones aminoácidos 102 y 278, o las posiciones de aminoácidos 102 y 288, de la secuencia de antígeno ToxB-GT de la SEC ID NO:18. El antígeno ToxB-GT destoxificado incluido en las composiciones de la invención de esta manera puede ser un polipéptido que comprende o que consiste de una secuencia aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9%, o mayor) con la SEC ID NO: 60; y/o (b) que es un fragmento de por lo menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 60, o de un polipéptido que tiene 50% o más de identidad con la SEC ID NO: 60, en donde "n" es 7 o mayor (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 540 o mayor). Los fragmentos de aminoácidos de ToxB-GT destoxificados de esta manera pueden comprender una secuencia de aminoácidos de por ejemplo hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, o hasta 540, residuos aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 60. Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEC ID NO: 60. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde la parte C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde la parte N-terminal de la SEC ID NO: 60 mientras se retiene por lo menos un epítopo de la SEC ID NO 60. Antígenos ToxA-GT El antígeno TcdA de longitud completa (también denominado en la presente como ToxA y toxina A) comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1 (codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 30).

El antígeno TcdA destoxificado se denomina en la presente como toxoide A. La abreviatura "ToxA-GT" se refiere al dominio glucosil-transferasa de TcdA, el cual se localiza dentro de la región N-terminal del dominio enzimático (ED). El dominio ToxA-GT (SEC ID NO: 4, codificado por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 33) es un fragmento de TcdA que corresponde a los aminoácidos 1 a 541 de la SEC ID NO: 1.

El antígeno ToxA-GT incluido en las composiciones de la invención es un polipéptido que comprende o que consiste de la secuencia de aminoácidos:(a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9%, o másT respecto a la SEC ID NO: 4; y/o (b) que es un fragmento de por lo menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 4, o de un polipéptido que tiene 50% o más de identidad con la SEC ID NO: 4, en donde "n" es 7 o mayor (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90,100, 150, 250, 300, 400, 500, 540, o mayor). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEC ID NO: 4. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde la parte C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde la parte N-terminal de la SEC ID NO: 4 mientras se retiene por lo menos un epítopo de la SEC ID NO:4.

Los fragmentos de aminoácidos de ToxA-GT de esta manera pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, o hasta 540, residuos aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 4.

El antígeno ToxA-GT incluido en las composiciones de la invención puede ser destoxificado. La destoxificación se puede obtener al hacer mutar la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico codificante del antígeno ToxA GT de tipo silvestre utilizando cualquier método apropiado conocido en el ámbito, por ejemplo mutagénesis dirigida a sitio. Preferiblemente, el antígeno ToxA-GT comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, o más mutaciones), en relación a la secuencia del antígeno ToxA-GT de tipo silvestre de la SEC ID NO:4. Por ejemplo, el antígeno ToxA-GT puede comprender sustituciones en 1, 2 o 3 posiciones que corresponden a los aminoácidos 283, 285 y 287 de la secuencia de antígeno ToxA-GT de la SEC ID N0:4. En particular, 1, 2 o 3 aminoácidos en las posiciones que corresponden a los aminoácidos 283, 285 y 287 de la secuencia de antígeno ToxA-GT de la SEC ID NO: 4 pueden estar sustituidos, preferiblemente por residuos alanina. La secuencia de aminoácidos de un antígeno ToxA-GT destoxificado que tiene sustituciones alanina en estas posiciones se proporciona en la SEC ID NO: 56.

Cuando el antígeno ToxA-GT comprende una sustitución de aminoácido, la sustitución preferiblemente no es en la posición de aminoácido 278 de la secuencia de antígeno ToxA-GT de la SEC ID NO: 4. Cuando el antígeno ToxA-GT comprende dos sustituciones de aminoácidos, las sustituciones preferiblemente no son en las posiciones de aminoácidos 101 y 278, de la secuencia de antígeno ToxA-GT de SEC ID N0:4. Cuando el antígeno ToxA-GT comprende tres sustituciones de aminoácidos, las sustituciones preferiblemente no son en las posiciones de aminoácidos 101, 278 y 519 o las posiciones de aminoácidos 101, 287 y 519, de la secuencia de antígeno ToxA-GT de la SEC ID NO:4.

El antígeno ToxA-GT destoxificado incluido en las composiciones de la invención de esta manera puede ser un polipéptido que comprende o que consiste de una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, 99.8%, 99.9%, o más) con la SEC ID NO: 56; y/o (b) que es un fragmento de por lo menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 56, o de un polipéptido que tiene 50% o más de identidad con la SEC ID NO: 56, en donde "n" es 7 o mayor (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 540, o mayor). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEC ID NO: 56. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde la parte C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde la parte N-terminal de la SEC ID NO: 56 mientras se retiene por lo menos un epítopo de la SEC ID NO: 56. Los fragmentos de aminoácidos de ToxB-GT destoxificados de esta manera pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, o hasta 540, residuos de aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 56.

Antígeno TcdA: El antíeno TcdA es un polipéptido que comprende o que consiste de una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 1; y/o b) que es un fragmento de por lo menos 7 aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 1, o de un polipéptido que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 1 y que comprende un epítopo de la SEC ID NO: 1. Los antígenos TcdA adicionales incluyen: (1) un antígeno ToxA-ED (SEC ID NO: 3), (2) un antígeno ToxA-GT (SEC ID NO: 4), (3) un antígeno ToxA-CP (SEC ID NO: 5), (4) un antígeno ToxA-T (SEC ID NO: 6), (5) un antígeno ToxA-T4 (SEC ID NO: 7), (6) un antígeno ToxA-B (SEC ID NO: 8), (7) un antígeno ToxA-PTA2 (SEC ID NO: 9), (8) un antígeno ToxA-P5-7 (SEC ID NO: 10), (9) un antígeno ToxA-P5-6 (SEC ID NO: 11), (10) un antígeno ToxA-P9- 10 (SEC ID NO: 12), (11) un antígeno ToxA-B2 (SEC ID NO: 13), (12) un antígeno ToxA-B3 (SEC ID NO: 14), (13) un antígeno ToxA-B5 (SEC ID NO: 15), (14) un antígeno ToxA-B6 (SEC ID NO: 16) o un antígeno TcdA de longitud completa (SEC ID NO: 1), representado en la figura 22.

Los polipéptidos preferidos para uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) con las SEC ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 o 465, por ejemplo 90% de identidad o más, o 95% de identidad o más o 99% de identidad o más; y/o (b) que comprende un fragmento de por lo menos 'h' aminoácidos consecutivos de las SEC ID NOS: en donde 'h' es 7 o mayor (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más; por ejemplo 20 o más; o por ejemplo 50 o más; o por ejemplo 80 o más). Estos polipéptidos incluyen variantes de las SEC ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 54,56, 58, 60, 62, 64, 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 o 465. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de las SEC ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 o 465. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde la parte C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde la parte N-terminal de las SEC ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 o 465 mientras retienen por lo menos un epítopo de la SEC ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165,171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 o 465. Los fragmentos de aminoácidos de los polipéptidos de la invención de esta manera pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 650, hasta 700, residuos aminoácidos consecutivos de las SEC ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 o 465. Otros fragmentos omiten uno o más dominios polipeptídicos. Por ejemplo, un péptido líder natural y/o una secuencia de reconocimiento de sortasa se puede omitir. Como se describe en otras partes, los polipéptidos preferidos que inhiben la colonización del intestino por C. di ici e son Dif44 y Dif208 (es decir, las SEC ID NOS: 79, 139, 133 y 433, así como las SEC ID NOS 111, 171, 113 y 173 en relación a los fragmentos 208A y 208B). Los antígenos de toxina de C. ci e preferidos son ToxB_GT (SEC ID NOS 18 y 60) y ToxA_P5-6 (SEC ID NO 11).

El término "polipéptido" o "proteína" se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, puede estar interrumpido por sustancias que no son aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que ha sido modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación tal como conjugación con un componente de marcado. También se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.) así como otras modificaciones conocidas en el ámbito. Los polipéptidos pueden presentarse como cadenas sencillas o cadenas asociadas.

Los polipéptidos de la invención pueden adquirir diversas formas (por ejemplo, nativa, fusiones, glucosilados, no glucosilados, lipidados, no lipidados, fosforilados, no fosforilados, miristoilados, no miristoilados, monoméricos, multiméricos, particulados, desnaturalizados, etc.). Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede no tener una cisteína N-terminal. La invención también proporciona un polipéptido en donde la cisteína N-terminal ha sido suprimida (por ejemplo, Dif51 (SEC ID NO: 357), Difl30 (SEC ID NO: 359) y Difl83 (SEC ID NO: 361)). Un polipéptido de la invención puede no tener un dominio de ancla (por ejemplo, Dif208 (SEC ID NO: 433), Dif208B (SEC ID NO: 173) y Dif232 (SEC ID NO: 185)).

En algunas modalidades, el grado de identidad de secuencia es mayor de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mayor (por ejemplo, con las secuencias a las que se hace referencia en la presente y que se encuentran en los listados de secuencias). Estos polipéptidos incluyen homólogos, ortólogos, variantes alélicas y mutantes funcionales. Típicamente, 50% de identidad o más entre dos polipéptidos se considera que es una indicación de equivalencia funcional. La identidad entre proteínas se puede determinar por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman, como se ha implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), utilizando una búsqueda de separación a fin con parámetros de castigo de apertura de separación = 12 y castigo por extensión de separación = 1.

En otra modalidad los fragmentos de los polipéptidos de la invención se pueden utilizar. Los fragmentos deben comprender por lo menos n aminoácidos consecutivos de las secuencias y, dependiendo de la secuencia particular, n es 10 o mayor (por ejemplo, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más). De esta manera los fragmentos comprenden una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, hasta 640 o hasta 1105 residuos aminoácidos consecutivos. Los fragmentos de esta manera pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, menos de 30, menos de 40, menos de 50, menos de 60, menos de 70, menos de 80, menos de 90, menos de 100, menos de 125, menos de 150, menos de 175, menos de 200, menos de 250, menos de 300, menos de 350, menos de 400, menos de 450, menos de 500, menos de 640, o menos de 1105 residuos aminoácidos consecutivos. En ciertas modalidades los fragmentos de aminoácidos pueden incluir polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de no más de 50, no más de 60, no más de 75, no más de 100, no más de 150, no más de 200, no más de 250, no más de 300, no más de 350, no más de 400 residuos aminoácidos.

Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo o son fragmentos inmunogénicos. Particularmente, los fragmentos pueden comprender uno o más epítopos de la secuencia. Otros fragmentos son: (a) los péptidos de señal N-terminal del polipéptido de la invención, (b) el polipéptido de la invención, pero no sus péptidos de señal N-terminales, y (c) el polipéptido de la invención, pero no su residuo aminoácido N-terminal. En particular, la invención proporciona los fragmentos Dif208A (CD2831) y Dif208B (CD2831). Las secuencias amino para estos fragmentos se resumen en la figura 1.

Como se utiliza en la presente, el término "fragmento" se refiere a una secuencia que es un subconjunto de otra secuencia. Cuando se utiliza en el contexto de una secuencia de ácido nucleico o de aminoácido los términos "fragmento" y "subsecuencia" se utilizan de manera intercambiable. Estos términos se utilizan para referirse a una parte o porción de un polipéptido de tipo silvestre intacto o completo pero el cual comprende menos residuos aminoácidos que un polipéptido de tipo silvestre intacto o completo. De esta manera, el término se refiere a secuencias de aminoácidos truncadas o más cortas que corresponden a una o más regiones de un polipéptido de tipo silvestre o de referencia. Un ejemplo de un fragmento es una secuencia de epítopos. Un fragmento o subsecuencia de una secuencia de aminoácidos puede ser cualquier número de residuos que sea menor que el encontrado en un polipéptido como se encuentra de modo natural o de referencia. Cuando la invención se relaciona con un "epítopo" este epítopo puede ser un epítopo de linfocitos B y/o un epítopo de linfocitos T. Estos epítopos se pueden identificar empíricamente (por ejemplo, utilizando PEPSCAN [9, 10] o métodos similares), o se pueden predecir (por ejemplo, utilizando el índice antigénico Jameson-Wolf [11], enfoques basados en matriz [12], MAPITOPE [13], TEPITOPE [14, 15], redes neurales [16], OptiMer & EpiMer [17, 18], ADEPT [19], Tsites [20], hidrofilicidad [21], índice antigénico [22] o los métodos descritos en [23-27, etc.]. Los epítopos son partes de un antígeno que son reconocidos por y que se unen a los sitios de los anticuerpos que se unen a los antígenos o receptores de linfocitos T y también se les puede denominar como "determinantes antigénicos ".

Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que aunque estos fragmentos están truncados o son fragmentos más cortos de una secuencia de referencia, estos fragmentos se pueden modificar para comprender secuencias adicionales que no se encuentran en el polipéptido de referencia, por ejemplo, para formar polipéptidos de fusión que incluyen secuencias de "etiqueta" tales como etiquetas His o etiquetas Glutation S-transferasa (GST, por sus siglas en inglés), secuencias enlazantes y similares. De esta manera, en estos fragmentos modificados el grupo amino del aminoácido N-terminal del fragmento no está unido a un enlace peptídico con el grupo carboxilo de un aminoácido al cual está unido en el polipéptido de referencia y/o el grupo carboxilo del aminoácido C-terminal del fragmento no está unido por un enlace peptídico al grupo amino de un aminoácido al cual está unido en el polipéptido de referencia.

El por ciento de identidad de un primer polipéptido y un segundo polipéptido generalmente se determina al contar el número de posiciones pareadas entre el primero y segundo polipéptidos y al dividir ese número entre la longitud total del polipéptido más corto, seguido por multiplicación del valor resultante por 100. Para fragmentos de polipéptidos este valor habitualmente es de aproximadamente 100% y por lo tanto tiene poco significado. Por lo tanto, en el contexto de fragmentos de la presente invención, se utiliza el término "proporción del polipéptido de referencia" (expresado como un porcentaje). La proporción del polipéptido de referencia se calcula al contar el número de posiciones pareadas entre el fragmento y los polipéptidos de referencia y al dividir ese número entre la longitud total del polipéptido de referencia seguido por multiplicación del valor resultante por 100. Particularmente, los fragmentos comprenderán menos de 90, 80, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25 o menos de 20% de la secuencia del polipéptido de referencia.

Los polipéptidos de uso, por ejemplo, en las composiciones, vacunas y métodos de la invención de esta manera pueden tener las secuencias mencionadas en el listado de secuencias o pueden ser variantes y/o fragmentos de las mismas, como se describe en otra parte. En la medida en que estas variantes y/o fragmentos se utilizan, comparten las propiedades funcionales de las secuencias mencionadas en el listado de secuencias. Por ejemplo, las variantes y/o fragmentos de las secuencias de toxina de . i ici e a los que se hace referencia en el listado de secuencias preferiblemente comparten la capacidad de los polipéptidos que tienen las secuencias mencionadas para proporcionar un efecto protector contra . if ici e (por ejemplo, proporcionar un efecto protector el cual es por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100% al mostrado por la secuencia de toxina de C. i ici e relevante o correspondiente a la que se hace referencia en el listado de secuencias). Las variantes y/o fragmentos de los polipéptidos de . difficile Dif44, Dif51, Dif130, Difl53, Difl83, Difl92, Dif208 y Dif232 a los que se hace referencia en el listado de secuencias preferiblemente comparten la capacidad de los polipéptidos que tienen las secuencias mencionadas para reducir la colonización del intestino por C. i ici (por ejemplo, proporcionar una reducción en la colonización del intestino por C. ifficile lo cual es por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100% de lo mostrado por el polipéptido de relevante o correspondiente Dif 44, Dif 51, Dif130, Dif153, Dif183, Dif192, Dif208 y Dif232 al que se hace referencia en el listado de secuencias).

Los polipéptidos utilizados en la invención se pueden preparar por diversos medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación a partir de cultivo celular, síntesis química, etc.). Generalmente, los polipéptidos de la invención se proporcionan en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libre de otros polipéptidos (por ejemplo, libre de polipéptidos como se encuentran de modo natural), particularmente de otros polipéptidos de C. i ici e o de la célula hospedadora, y generalmente son por lo menos aproximadamente 50% puros (en peso) y habitualmente por lo menos aproximadamente 90% puros, es decir, menos de aproximadamente 50%, y de modo más típico menos de aproximadamente 10% (por ejemplo, 5%) de una composición está constituida de otros polipéptidos expresados. De esta manera, los polipéptidos en las composiciones se separan de un organismo completo con el cual se expresa la molécula.

En una modalidad preferida, la invención proporciona un polipéptido que comprende, que consiste esencialmente o que consiste de una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133,139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 y 465 que es inmunogénica.

El término "inmunogénico" en el contexto de un polipéptido o proteína descrito en la presente se utiliza para indicar que el antígeno o el polipéptido son capaces de inducir una respuesta inmunitaria tal como una respuesta inmunitaria humoral o celular y preferiblemente ambas contra proteína . i ici e de tipo silvestre a partir de la cual se deriva, por ejemplo, cuando se utiliza para inmunizar a un sujeto (preferiblemente un mamífero, de manera más preferible un humano o un ratón) . Un polipéptido inmunogénico generalmente se le denomina como antigénico. Una molécula es "antigénica" cuando es capaz de interactuar específicamente con una molécula de reconocimiento de antígeno del sistema inmunitario tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o receptor de antígeno de linfocitos T. Un polipéptido antigénico contiene un epítopo de por lo menos aproximadamente 5 y particularmente por lo menos aproximadamente 10, por lo menos 15, por lo menos 20 o por lo menos 50 aminoácidos. Una porción antigénica de un polipéptido, también denominada como un epítopo, puede ser una porción que es inmunodominante para un reconocimiento de receptor de anticuerpo o linfocito T o puede ser una porción utilizada para generar un anticuerpo para la molécula al conjugar la porción antigénica a un polipéptido portador para inmunización. Una persona experta reconocerá que una molécula que es antigénica en si misma no necesita ser inmunogénica, por ejemplo, algunos antígenos requieren la presencia de un adyuvante o portador para volverlos capaces de inducir una respuesta inmunitaria.

El término "antígeno" se refiere a una molécula contra la cual un sujeto puede iniciar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral y/o celular. Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el hospedador de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpo a una composición de vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T cooperadores (helper) y/o linfocitos T citotóxicos, dirigidos específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el sujeto mostrará ya sea una respuesta inmunológica terapéutica o protectora tal como resistencia a una infección nueva que se incrementará y/o una reducción en la gravedad clínica de la enfermedad. Esta protección se demostrará ya sea por una reducción o por carencia de síntomas normalmente mostrados por un sujeto infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o una carga de patógeno o bacteriana disminuida en un hospedador infectado. El término proteína o polipéptido "inmunogénico" como se utiliza en la presente, también se refiere a una secuencia de aminoácidos la cual induce una respuesta inmunológica como se describe en lo anterior.

Polipeptidos híbridos de C. difficile Los polipéptidos utilizados en la invención pueden estar presentes en una composición como polipéptidos separados individuales. Cuando se utiliza más de un polipéptido, no obstante, no necesitan estar presentes como polipéptidos separados. En vez de esto, por lo menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) polipéptidos se pueden expresar como una cadena polipeptídica única (un polipéptido "híbrido"). Los polipéptidos híbridos ofrecen dos ventajas principales. En primer lugar, un polipéptido que puede ser inestable o que se exprese pobremente por si mismo se le puede ayudar al agregarle un asociado híbrido adecuado que supere el problema; en segundo lugar, se simplifica la manufactura comercial dado que únicamente necesita utilizarse una expresión y purificación con el fin de producir dos polipéptidos los cuales son ambos antigénicamente útiles. Un polipéptido híbrido de por lo menos dos polipéptido también puede ser más inmunogénico que uno o más de por lo menos dos polipéptidos solos o en una mezcla sencilla.

El polipéptido híbrido puede comprender dos o más secuencias polipeptídicas de cada uno de los polipéptidos de la invención, o dos o más variantes del mismo polipéptido en los casos en los cuales la secuencia tiene variabilidad parcial a través de cepas. Son útiles híbridos que consisten de secuencias de aminoácidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez polipéptidos. En algunas modalidades, se utilizan híbridos que consisten de secuencias de aminoácidos de dos, tres, cuatro o cinco polipéptidos tales como dos o tres polipéptidos. Polipéptidos híbridos diferentes se pueden mezclar juntos en una formulación única. Los híbridos se pueden combinar con polipéptidos no híbridos. Dentro de estas combinaciones, un polipéptido puede estar presente en más de un polipéptido híbrido y/o como un polipéptido no híbrido. No obstante, es típico que un polipéptido esté presente ya sea como un híbrido o como un no híbrido pero no como ambos. Los polipéptidos híbridos también se pueden combinar con conjugados de polipéptidos que no son de . i icile, como se describe más adelante.

Los polipéptidos híbridos se pueden representar por la fórmula NH2-A-{-X-L-}nB-C00H, en donde: X es una secuencia de aminoácidos de un polipéptido C. difficile, como se describe en lo anterior; L es una secuencia de aminoácidos enlazante opcional; A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional; B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional; n es un número entero de 2 o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, etc.). Habitualmente, n es 2 ó 3. Si una porción -X- tiene una secuencia de péptido líder en su forma de tipo silvestre, esta se puede incluir u omitir en el polipéptido híbrido. En algunas modalidades, los péptidos líder se suprimirán excepto para aquellos de la porción -X-localizados en la parte N-terminal del polipéptido híbrido, es decir, el polipéptido líder de Xi se retendrá pero los polipéptidos líder de X2...X11 se omitirán. Esto es equivalente a suprimir todos los péptidos líder y utilizar el péptido líder de Xi como porción -A-. Para cada n instancias de {-X-L-}, la secuencia de aminoácidos enlazantes -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n = 2 , el híbrido puede ser NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH, etc. Una o varias secuencias de aminoácidos enlazantes -L- típicamente serán cortas (por ejemplo, 20 o menos aminoácidos, es decir 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias de péptidos cortas la cuales facilitan la clonación, enlazantes de poli-glicina (es decir, que comprenden Glyn, en donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), y etiquetas histidina (es decir, Hisn en donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10o más). Otras secuencias de aminoácidos enlazantes adecuadas serán evidentes para aquellos expertos en el ámbito. El enlazante útil es GSGGGG (SEC ID NO: 351) o GSGSGGGG (SEC ID NO: 352), en donde el dipéptido Gly-Ser se forma a partir de un sitio de restricción BamHl, y de esta manera se ayuda en la clonación y manipulación y el tetrapéptido (Gly)4 es un enlazante poliglicina ttííppiiccoo.. Otros eennllaazzaanntteess adecuados, particularmente para uso como Ln final son ASGGGS (SEC ID NO: 353) o un dipéptido Leu-Glu. -A- es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional. Esta típicamente será corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos es decir, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tráfico de proteínas, o secuencias de péptidos cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, etiquetas histidina, es decir, Hisn en donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mayor). Otras secuencias de aminoácidos N-terminal adecuadas serán evidentes para aquellos expertos en el ámbito. Si Xi carece de su propia metionina N-terminal, -A- habitualmente es un oligopéptido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 aminoácidos) la cual proporciona una metionina N-terminal, por ejemplo Met-Ala-Ser, o un residuo Met único. -B- es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional. Esta típicamente será corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias de péptidos cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprende etiquetas histidina, es decir, Hisn en donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mayor), o secuencias las cuales mejoran la estabilidad de las proteínas. Otras secuencias de aminoácidos C-terminal adecuadas serán evidentes para aquellos expertos en el ámbito. Cuando se utilizan polipéptidos híbridos, los polipéptidos individuales dentro del híbrido (es decir, porciones -X- individuales) pueden ser de una o más cepas. Cuando n = 2, por e emplo, X2puede ser de la misma cepa que Xi o de una cepa diferente de C. ifficile. Cuando n = 3, las cepas pueden ser: (i) Xi=x2=x3 (ii) Xi=X2¹X3 (iii) Xi¹X2=X3 (iv) Xi¹X2¹X3 o (v) X1=X3¹X2, etc.

Dentro del grupo (c) las supresiones o sustituciones pueden estar en la parte N-terminal y/o C-terminal o pueden estar entre los dos términos. Así, un corte es un ejemplo de una supresión. Los cortes pueden involucrar supresión de hasta 40 (o más) aminoácidos en la parte N-terminal y/o C-terminal. Un corte N-terminal puede remover péptidos líder, por ejemplo, para facilitar la expresión recombinante en un hospedador heterólogo. Un corte C-terminal puede remover secuencias de ancla, por ejemplo, para facilitar la expresión recombinante en un hospedador heterólogo. De acuerdo con la invención, Xn puede comprender las secuencias de aminoácidos de dos o más antígenos que se seleccionan del grupo que consiste de: Dif44, Dif51, Difl30, Dif153, Dif183, Difl92, Dif208, Dif208A, Dif232, un antígeno ToxB-GT y un antígeno TcdA. Cada Xn puede ser una secuencia de aminoácidos de un antígeno de una combinación de antígenos de la invención (como se describe en lo anterior). En ciertas modalidades, n es 2. Cuando n es 2, Xi habitualmente es un antígeno ToxB-GT y X-2 habitualmente es un antígeno TcdA, pero cualquier otra combinación de dos de los antígenos como se describen en lo anterior tambien se puede utilizar de acuerdo con la invención. Cuando n es 3, por ejemplo, cualquier combinación de tres antígenos como se describen en lo anterior se puede utilizar. Cuando n es 4, por ejemplo, se puede utilizar cualquier combinación de cuatro antígenos descrita en lo anterior. Generalmente, dos o más de Xn pueden ser los mismos antígenos o, cuando n es 2, 3, o 4, cada Xn puede ser un antígeno diferente. Cuando dos o más de los Xn son secuencias del mismo antígeno, dos o más de Xn pueden tener la misma secuencia polipeptídica o una secuencia polipeptídica diferente, por ejemplo, pueden ser variantes diferentes o fragmentos de un antígeno dado, como se describe en lo anterior. Cuando estos antígenos se definen en términos de: (a) tener 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70Í 75! 80! 85? 90? 91? 92? 93< 94< 95! 96! 97 * 98%, 99%, 99.5% o más) para una secuencia dada; y/o (b) que comprende un fragmento de por lo menos "n" aminoácidos consecutivos de una secuencia dada, en donde "n" es 7 o mayor (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o mayor), el nivel de identidad en (a) y el valor de "n" en (b) puede ser el mismo para cada X.

Los polipéptidos utilizados con la invención pueden comprender una secuencia -P-Q- o -Q-P-, en donde: -P- es una secuencia de aminoácidos como se define en lo anterior y -Q-no es una secuencia como se define en lo anterior, es decir, se puede proporcionar como proteínas de fusión. Cuando el codón de la parte N-terminal de -P- no es ATG, pero este codón no está presente en la parte N-terminal de un polipéptido, se traducirá como el aminoácido estándar para ese codón en vez de como un Met. Cuando este codón está en la parte N-terminal de un polipéptido, no obstante, se traducirá como Met. Los ejemplos de porciones -Q- incluyen, pero no se limitan a etiquetas histidina (es decir, Hisn, en donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), proteínas con unión a maltosa o glutation-S-transíerasa (GST, por sus siglas en inglés). La expresión de los polipéptidos utilizados con la invención puede llevarse a cabo en un hospedador heterólogo para expresión (expresión recombinante) tal como E. coli . El hospedador heterólogo puede ser procariótico (por ejemplo, una bacteria) o eucariótico. A modo de un ejemplo no limitante, otros hospedadores incluyen Bacillus subtilis , Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cin rea, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis) , levaduras, etc. Una persona experta en el ámbito entenderá que puede ser útil cambiar los codones para optimizar la eficiencia de expresión en estos hospedadores sin por esto alterar los aminoácidos codificados. Ácidos nucleicos En otra modalidad, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 y 465. Se prefieren las SEC ID NOS 79, 139, 133, 433, 111, 171, 113 y 173. Las secuencias de ácido nucleico particulares son las SEC ID NOS: 78, 80, 92, 104, 110, 112, 124, 132, 138, 140, 152, 164, 170, 172, 184, 186, 188, 356, 358, 360, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462 y 464. Se prefieren las SEC ID NOS: 78, 132, 138, 432, 110, 170, 112 y 172.

Las secuencias de nucleótidos que codifican para péptidos de las combinaciones de antígeno se pueden diseñar de acuerdo con el código genético. Así, una secuencia nucleotídica puede codificar para una o más de las SEC ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 54, 56, 58, 60, 62, 64 (por ejemplo, que codifican para moléculas ToxB y TcdA), o pueden comprender una o más de las SEC ID NOS: 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 66, 67, 68, 69.

Estos ácidos nucleicos son adecuados para uso en composiciones, por ejemplo en vacunas u otras composiciones inmunogénicas. Los ácidos nucleicos (por ejemplo, combinaciones de ácidos nucleicos, vectores o combinaciones de vectores) codifican para polipéptidos utilizados con la invención, combinaciones de polipéptidos o polipéptidos híbridos utilizados con la invención. Se pueden utilizar ácidos nucleicos que comprendan una secuencia nucleotídica que codifique para uno o más (por ejemplo, 2, 3 ó 4) polipéptidos o polipéptidos híbridos de las combinaciones de antígeno de la invención. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un vector (por ejemplo, un vector de clonación o de expresión). Los ácidos nucleicos (típicamente, ADN) que codifican para los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para proporcionar composiciones, métodos y usos en base en la inmunización de ácido nucleico. La inmunización de ácido nucleico es ahora un campo desarrollado véanse, por ejemplo, las referencias 28 a 35, etc).

Los ácidos nucleicos de la invención que se pueden utilizar en composiciones de la invención son las SEC ID NOS: 78, 80, 92, 104, 110, 112, 124, 132, 138, 140, 152, 164, 170, 172, 184, 186, 188, 356, 358, 360, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462 y 464, y las SEC ID NOS: 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 66, 67, 68, 69. Además, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que tienen identidad de secuencia con las secuencias nucleotídicas también se pueden utilizar en composiciones de la invención. La identidad entre secuencias se determina preferiblemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se describe en lo anterior. Estos ácidos nucleicos incluyen aquellos que utilizan codones alternativos para codificar para el mismo aminoácido. El uso de codones alternativos puede ayudar en la expresión en el mamífero después de vacunación.

Los ácidos nucleicos que comprenden secuencias nucleotídicas que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más, por ejemplo 90% de identidad o más, o 95% de identidad o más o 99% de identidad o más, con cualquiera de los ácidos nucleicos a los que se hace referencia por lo tanto se pueden utilizar. Los ácidos nucleicos los cuales pueden hibridizar con los ácidos nucleicos que se seleccionan del grupo que comprende las SEC ID NOS: 78, 80, 92, 104, 110, 112, 124, 132, 138, 140, 152, 164, 170, 172, 184, 186, 188, 356, 358, 360, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462 y 464, y las SEC ID NOS: 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 66, 67, 68, 69 también se pueden utilizar en una composición de la invención. Las reacciones de hibridación se pueden realizar bajo condiciones de "rigurosidad" diferentes. Las condiciones que incrementan la rigurosidad de una reacción de hibridación se conocen ampliamente y se han publicado en el ámbito. Los ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad cada vez mayor): temperaturas de incubación de 25°C, 37°C, 50°C, 55°C y 68°C; concentraciones de amortiguador de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC (en donde SSC es NaCl 0.15 M y amortiguador citrato 15 mM) y sus equivalentes utilizando otros sistemas amortiguadores; concentraciones de formamida de 0%, 25%, 50%, y 75%; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1, 2 o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0.1 x SSC, o agua desionizada. Las téenicas de hibridación y su optimización son bien conocidas en el ámbito (véanse, por ejemplo, las referencias 36, 37, etc.). En algunas modalidades, el ácido nucleico de la invención hibridiza con un objetivo bajo condiciones de baja rigurosidad; en otras modalidades, hibridiza bajo condiciones de rigurosidad intermedia; en algunas modalidades hibridiza bajo condiciones de alta rigurosidad. Un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación de baja rigurosidad es 50°C y 10 x SSC. Un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación de rigurosidad intermedia es 55°C y 1 x SSC. Un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación de alta rigurosidad es 68°C y 0.1 x SSC.

En algunas composiciones, los fragmentos de las secuencias de ácido nucleico descritas en lo anterior (por ejemplo, fragmentos de moléculas con las secuencias específicas a las que se hace referencia en el listado de secuencias o fragmentos de las variantes definidas en lo anterior con referencia a su capacidad para hibridizar con, o por identidad de secuencia de porcentaje con las secuencias específicas a las que se hace referencia en el listado de secuencias se pueden utilizar. Para ciertas modalidades de la invención, los ácidos nucleicos son de una longitud de por lo menos 7 nucleótidos (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300 nucleótidos o más grandes). Para ciertas modalidades de la invención, los ácidos nucleicos con como máximo de una longitud de 500 nucleótidos (por ejemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 nucleótidos o más cortos). Los fragmentos de ácido nucleico preferiblemente codifican para epítopos de las secuencias específicas a las que se hace referencia en el listado de secuencias.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden adquirir diversas formas (por ejemplo, de cadena sencilla, de cadena doble, vectores, cebadores, sondas, marcados, etc.). Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser circulares o ramificados, pero generalmente serán lineales. A menos que se especifique o se requiere en otro sentido, cualquier modalidad de la invención que utilice un ácido nucleico puede utilizar tanto la forma de cadena doble como cada una de las dos formas complementarias de cadena sencilla las cuales constituyen la forma de cadena doble. Los cebadores y sondas generalmente son de una cadena sencilla así como también son ácidos nucleicos autosentido. El término "complemento" o "complementario", cuando se utiliza en relación a ácidos nucleicos se refiere al pareamiento de bases atson-Crick . De esta manera, el complemento de C es G, el complemento de G es C, el complemento de A es T (o U) y el complemento de T (o U) es A. También es posible utilizar bases tales como I (la purina inosina) por ejemplo para complementar pirimidinas (C o T).

Los ácidos nucleicos que codifican para antígenos descritos en la presente se pueden utilizar, por ejemplo: para producir polipéptidos; como sondas de hibridación para la detección de ácido nucleico en muestras biológicas; para generar copias adicionales de los ácidos nucleicos; para generar ribozimas u oligonucleótidos antisentido; como cebadores o sondas de ADN de cadena sencilla; o como oligonucleótidos formadores de cadena triple. La invención proporciona un proceso para producir ácido nucleico que codifica para antígenos descritos en la presente, en donde el ácido nucleico se sintetiza en parte o en su totalidad utilizando medios químicos. La invención proporciona vectores que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican para antígenos que se describen en la presente (por ejemplo, vectores de clonación o de expresión) y células hospedadoras transformadas con estos vectores Inmunización de ácido nucleico El ácido nucleico que codifica para el polipéptido se puede expresar in vivo después de suministro a un mamífero y el polipéptido expresado después estimula el sistema inmunitario. El ingrediente activo típicamente adquirirá la forma de un vector de ácido nucleico que comprende (i) un promotor; (ii) una secuencia que codifica para el polipéptido, unida operablemente al promotor; y opcionalmente (iii) un marcador seleccionable; en algunas modalidades, los vectores pueden comprender además (iv) un origen de replicación; y (v) un terminador de transcripción corriente abajo del, y unido operablemente a (ii). En general, (i) y (v) serán eucarióticos, y (iii) y (iv) serán procarióticos. Los promotores típicos son promotores virales, por ejemplo de citomegalovirus (CMV). El vector también puede incluir secuencias reguladoras transcripcionales (por ejemplo, mejoradores) además del promotor y las cuales interactúan funcionalmente con el promotor. Los vectores pueden incluir mejoradores/promotores CMV intermedios-tempranos y también pueden incluir el intrón A de CMV. El promotor está unido operablemente a una secuencia hacia el extremo 3' que se encuentra bajo el control de los promotores. Cuando se utiliza el marcador, típicamente funciona en un hospedador microbiano (por ejemplo, en una procariota en una bacteria, en una levadura). El marcador con frecuencia es un marcador seleccionable procariótico (por ejemplo, transcrito bajo el control de un promotor procariótico). Por conveniencia, los marcadores típicos son genes de resistencia a antibióticos. El vector típicamente es un vector episómico o extracromosómico que se replica de manera autónoma tal como un plásmido. El vector habitualmente comprende un origen de replicación. Con frecuencia el origen de replicación es activo en procariotas pero no en eucariotas. Los vectores de esta manera pueden incluir un marcador procariótico para selección del vector, un origen de replicación procariótico, pero un promotor eucariótico para impulsar la transcripción de la secuencia que codifica para el polipéptido. Los vectores por lo tanto (a) se amplificarán y seleccionarán en hospedadores procarióticos sin expresión polipeptídica, pero (b) se expresarán en hospedadores eucarióticos sin que sean amplificados. Esta distribución es ideal para vectores de inmunización de ácido nucleico. El vector puede comprender una secuencia terminadora transcripcional eucariótica corriente abajo de la secuencia codificante. Esto puede mejorar los niveles de transcripción. Cuando la secuencia codificante no tiene por si misma, el vector puede comprender una secuencia de poliadenilación, por ejemplo la secuencia de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina. El vector puede comprender un sitio de clonación múltiple. Además de las secuencias que codifican para el polipéptido y un marcador, el vector puede comprender una segunda secuencia codificante eucariótica. El vector también puede comprender un IRES (siglas en inglés para sitio de entrada de ribosoma interno) hacia el extremo 3' de la segunda secuencia con el fin de permitir la traducción de un segundo polipéptido eucariótico a partir del mismo transcrito como el polipéptido. De manera alternativa, la secuencia que codifica para el polipéptido puede estar hacia el extremo 3' de un IRES. El vector puede comprender motivos CpG no metilados, por ejemplo secuencias de ADN no metiladas las cuales tienen en común una citocina que precede una guanosina flanqueada por dos purinas 5' y dos pirimidinas 31. En su forma no metilada, estos motivos de ADN se ha demostrado que son potentes estimuladores de varios tipos de células inmunitarias. Los vectores se pueden suministrar de una manera dirigida. Las téenicas de suministro de ADN mediadas por receptor se describen, por ejemplo, en las referencias 38 a 43. Las composiciones terapéuticas que contienen un ácido nucleico se administran en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para administración local en un protocolo de genoterapia. Las concentraciones varían de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2 mg, aproximadamente 5 pg a aproximadamente 500 pg y aproximadamente 20 pg a aproximadamente 100 pg de ADN también se pueden utilizar durante un protocolo de genoterapia. Los factores tales como método de acción (por ejemplo, para mejorar o inhibir niveles del producto de gen codificado) y la eficacia de transformación y expresión son consideraciones las cuales afectarán la dosificación requerida para la eficacia final. Cuando se desea una mayor expresión sobre un área de tejido más grande, se requerirán cantidades más grandes de vector o las mismas cantidades readministradas en un protocolo de administración es sucesivo, o varias administraciones a diferentes porciones de tejido adyacentes o cercanas para llevar a cabo un resultado terapéutico positivo. En todos los casos, la experimentación sistemática en ensayos clínicos determinará los intervalos específicos para un efecto terapéutico óptimo. Los vectores se pueden suministrar utilizando vehículos de suministro de genes. El vehículo de suministro de genes puede ser de origen viral o no viral (véanse de modo general las referencias 44 a 47). Los vectores basados en virus para el suministro de ácido nucleico deseado y expresión en una célula deseada son bien conocidos en el ámbito. Los vehículos basados en virus ejemplares incluyen, pero no se limitan a retrovirus recombinante (por ejemplo, referencias 48 a 58), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores de virus sindbis, virus de bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus de rio Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de encefalitis equina Venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249;: ATCC VR-532); híbridos o quimeras de estos virus también se pueden utilizar), los vectores de poxvirus (por ejemplo, variolovacuna, viruela aviar, viruela de aves canoras, variolovacuna Ankara modificada, etc.), vectores de adenovirus y vectores de virus adenoasociados (AAV), (por ejemplo, véanse las referencias 59 a 64). La administración de ADN unido a adenovirus muerto [65] también se ha utilizado.

Los vehículos y métodos de suministro no virales también se han utilizado que incluyen, pero que no se limitan a ADN condensado policatiónico unido o no unido a adenovirus muerto solo [por ejemplo, 65], ADN unido a ligando [66], células de vehículo de suministro de células eucarióticas [por ejemplo, referencias 67 a 71] y neutralización de carga nucleica o fusión con membranas celulares. El ADN desnudo también se puede utilizar. Los métodos de introducción de ADN desnudo ejemplares se describen en las referencias 72 y 73. Los liposomas (por ejemplo, inmunoliposomas) que pueden actuar como vehículos de suministro de genes se describen en las referencias 74 a 78. Los enfoques adicionales se describen en las referencias 79 y 80. Además, el suministro no viral adecuado para uso incluye sistemas de suministro mecánico tales como el enfoque descrito en la referencia 80. Además, la secuencia codificante y el producto de expresión de esta se puede suministrar a través de deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizados o uso de radiación ionizante [por ejemplo, referencias 81 y 82]. Otros métodos convencionales para el suministro de genes que se pueden utilizar para el suministro de la secuencia codificante incluyen, por ejemplo, el uso de la pistola de partículas de transferencia de genes portátil [83] o el uso de radiación ionizante para activar genes transferidos [81 y 82].

El suministro de ADN utilizando micropartículas de PLG {siglas en inglés para poli(lactida-co-glicolida) es un método particularmente preferido, por ejemplo, por adsorción a las micropartículas, las cuales opcionalmente son tratadas para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, tratada con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, tratada con un detergente catiónico, tal como CTAB).

Los ácidos nucleicos típicamente se proporcionan en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos (por ejemplo, libres de ácidos nucleicos que se encuentran de manera natural), particularmente de otros ácidos nucleicos de . c e o de la célula hospedadora, generalmente están por lo menos aproximadamente 50% (en peso) puros y habitualmente por lo menos aproximadamente 90% puros. Los ácidos nucleicos para uso en la invención se pueden preparar de muchas maneras, por ejemplo mediante síntesis química (por ejemplo, síntesis de ADN de fosforoamidita) en su totalidad o en parte, por digestión de ácidos nucleicos más grandes utilizando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), por unión de ácidos nucleicos o nucleótidos más cortos (por ejemplo, utilizando ligasas o polimerasas) a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc, etc. El término "ácido nucleico" en general significa una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, la cual contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Incluye ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN. También incluye análogos de ADN o ARN tales como aquellos que contienen estructuras principales modificadas (por ejemplo, ácidos peptidonucleicos (PNA, por sus siglas en inglés) o fosforotioatos) o bases modificadas. De esta manera, la invención incluye ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADN, ADNc, ácidos nucleicos recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plásmidos, vectores, sondas, cebadores, etc. Cuando el ácido nucleico de la invención toma la forma de ARN, puede o no tener un remate 51.

Los ácidos nucleicos pueden ser parte de un vector, es decir, parte de una construcción de ácido nucleico diseñada para transducción/transfección de uno o más tipos de células. Los vectores pueden ser, por ejemplo, "vectores de clonación" los cuales se diseñan para aislamiento, propagación y replicación de los nucleótidos insertados, los "vectores de expresión" los cuales se diseñan para expresión de una secuencia nucleotídica en una célula hospedadora, "vectores virales" los cuales se diseñan para que resulten en la producción de un virus recombinante o partícula similar a virus, o "vectores lanzadera" los cuales comprenden los atributos de más de un tipo de vector. Los vectores típicos son plásmidos. Una "célula hospedadora" incluye una célula individual o un cultivo celular el cual puede ser o ha sido un receptor de ácido nucleico exógeno. Las células hospedadoras incluyen descendencia de una célula hospedadora única y la descendencia no necesariamente puede ser completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) con respecto a la célula original debido a mutaciones y/o cambios naturales, accidentales o deliberados. Las células hospedadoras incluyen células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con ácido nucleico de la invención.

Cuando el ácido nucleico es ADN, se apreciará que "U" en una secuencia de ARN se sustituirá por "T" en el ADN. De manera similar, cuando un ácido nucleico es ARN, se apreciará que "T" en una secuencia de ADN estará sustituido por "U" en el ARN. El término "complemento" o "complementariedad", cuando se utiliza en relación a ácidos nucleicos se refiere a pareamiento de bases del tipo de Watson-Crick. De esta manera, el complemento de C es G, el complemento de G es C, el complemento de A es T (o U) y el complemento de T (o U) es A. También es posible utilizar bases tales como I (la purina inosina), por ejemplo para complementar pirimidinas (C o T).

Anticuerpos En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido codificado por una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 o 465. De manera más preferible, el grupo consiste de las SEC ID NOS: 79, 139, 133, 433, 111, 171, 113 y 173.

Los anticuerpos a los que se hace referencia en la presente son capaces de unirse a un polipéptido útil en la invención y por lo tanto incluye anticuerpos que se unen a polipéptidos los cuales son variantes y/o fragmentos de las secuencias mencionadas en lo anterior, como se describe en otra parte. Particularmente, un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de la invención es un anticuerpo neutralizante. El término "anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que puede unirse a una proteína, polipéptido o cuerpo infeccioso particular para de esta manera negar o reducir el efecto de la proteína, polipéptido o cuerpo infeccioso. De manera más particular, un anticuerpo neutralizante es cualquier anticuerpo que puede neutralizar o reducir la capacidad de ese patógeno para iniciar y/o perpetuar una infección en un hospedador, por ejemplo al reducir o limitar el crecimiento, unión a tejido, diseminación, daño a tejido y similar.

Los anticuerpos contra los polipéptidos de . i ic e de la invención se pueden utilizar para inmunización pasiva en los métodos descritos en lo anterior. Así, la invención proporciona una composición que comprende por lo menos un anticuerpo el cual es capaz de unirse a un polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos que se describen en la presente. Las combinaciones de anticuerpos de acuerdo con la invención se proporcionan para administración simultánea, separada o secuencial. La invención también proporciona composiciones inmunogénicas y farmacéuticas que comprenden a los anticuerpos. En la presente, en el contexto de la invención, el término "anticuerpo" o "anticuerpos" comprende las combinaciones de anticuerpo de la invención. En particular, la invención proporciona una combinación de anticuerpos que comprenden: (a) uno o más anticuerpos que se seleccionan del grupo que consiste de un anticuerpo el cual reconoce un antígeno Dif44, un antígeno Dif51, un antígeno Difl30, un antígeno Difl53, un antígeno Difl83, un antígeno Difl92, un antígeno Dif208, un antígeno Dif208A y un antígeno Dif232, preferiblemente un antígeno Diff44 o Dif208; (b) un anticuerpo el cual reconoce un antígeno ToxB-GT; y (c) un anticuerpo el cual reconoce un antígeno TcdA (preferiblemente ToxA_p5_6). La combinación puede estar presente en una composición.

Las composiciones, que comprenden anticuerpos se pueden utilizar en tratamientos. La invención también proporciona el uso de anticuerpos de la invención en medicina y en el tratamiento, por ejemplo, por inmunización pasiva contra CDAD. La invención también proporciona el uso de estos anticuerpos en la elaboración de un medicamento. La invención también proporciona un método para tratar a un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención. Como se describe en lo anterior para las composiciones, estos métodos y los usos permiten a un mamífero que esté protegido contra una infección por C. iffici e. En particular, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar en métodos para tratar o evitar infecciones por . i ici e, que comprende la etapa de administrar al mamífero una cantidad eficaz de una combinación de anticuerpos como se describen en la presente o una composición que comprende a esta combinación. En estos métodos, por lo menos dos (por ejemplo, 2, 3 ó 4) anticuerpos de la invención se pueden administrar de manera simultánea, separada o secuencial.

Los anticuerpos de la invención típicamente se unirán específicamente a un polipéptido de C. difficile , por ejemplo con una afinidad de 1 mM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM o más firmemente. El término "anticuerpo" incluye moléculas de in unoglobulina intactas así como fragmentos de las mismas las cuales son capaces de unirse a un polipéptido. Estas incluyen moléculas de anticuerpo híbridas (quiméricas) [84. 85]; fragmentos F(ab')2 y F(ab) y moléculas Fv; heterodímeros no covalentes [86, 87]; moléculas Fv de cadena sencilla (sFv, por sus siglas en inglés) [88]; construcciones de fragmentos de anticuerpos quiméricos y triméricos; minicuerpos [89, 90]; moléculas de anticuerpo humanizadas [91 a 93]; y cualquiera de los fragmentos funcionales obtenidos de estas moléculas así como anticuerpos obtenidos a través de procesos no convencionales tales como presentación de fagos. En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Los métodos de obtención de anticuerpos monoclonales son bien conocidos en el ámbito. En algunas modalidades, los anticuerpos son anticuerpos humanizados o completamente humanos.

La invención también proporciona composiciones que comprenden combinaciones de anticuerpos de la invención. Por ejemplo, se proporcionan composiciones que comprenden una combinación de anticuerpos diferentes los cuales son específicos para al menos tres (es decir, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12) antígenos de C. c e de acuerdo con las combinaciones de antígeno de la invención, que incluyen variantes y fragmentos inmunogénicos de cualquiera de los antígenos, así como procesos para preparar una mezcla de una combinación de anticuerpos de la invención, el proceso comprende una etapa de mezclar anticuerpos de cualquiera de las combinaciones de anticuerpos como se definen en lo anterior. Por ejemplo, la invención proporciona un proceso que comprende una etapa de mezclar por lo menos dos (es decir, 2, 3 ó 4) anticuerpos que se seleccionan de anticuerpos los cuales reconocen los polipéptidos de C. difficile de la invención y/o un epítopo del mismo. Un proceso de acuerdo con la invención para preparar una mezcla de anticuerpos puede comprender una etapa adicional de formular la mezcla como un medicamento. Estos procesos pueden comprender además una etapa de empacado de la formulación para almacenamiento o distribución como un medicamento. ntibióticos En ciertas situaciones, por ejemplo durante o después del tratamiento con, o la administración de antibióticos, se altera el equilibrio natural de la flora del intestino. Como un resultado, C. difficile se puede volver más prevalente lo que genera síntomas de infección. De esta manera, las composiciones de la invención se pueden utilizar junto con antibióticos para tratar una condición subyacente y simultáneamente evitar o tratar cualquier infección por C. difficile.

En una modalidad, los métodos comprenden administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención seguido por administración de antibióticos. En una alternativa, el método comprende administrar antibióticos seguidos por administración de una composición de la invención. En una alternativa adicional, el método comprende administrar antibióticos de manera concurrente con la administración de una composición de la invención. De esta manera, el antibiótico y la cantidad eficaz de uno o más polipéptidos se pueden administrar de manera secuencial o por separado. Típicamente, el antibiótico utilizado en estos métodos será uno el cual sea adecuado para tratar la infección subyacente, pero el cual se conoce que está asociado con AAD de C. difficile. Aunque cualquier antibiótico puede provocar diarrea asociada a antibiótico, o una de las condiciones asociadas de infección por C. difficile más graves, los agentes causales más comunes son ampicilina, clindamicina, cefalosporinas tales como cefpodoxima y todas las fluoroquinolonas. Así, estos métodos son particularmente adecuados para tratar regímenes que incorporan un antibiótico conocido en el ámbito que se relaciona frecuentemente con AAD por C. difficile . En algunas modalidades, por lo tanto, una composición de la invención puede comprender además un antibiótico, tal como un antibiótico enumerado en lo anterior.

Composiciones y medicamentos En otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende: (a) uno o más polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 71, 73, 75, 77, 79 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 190, 191, 193, 195, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 331, 357, 359, 361, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457; y/o (b) uno o más ácidos nucleicos os cuales codifican para una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo mencionado en el inciso (a) o una o más secuencias de ácido nucleico en donde la secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 70, 72 74, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 192, 194, 259, 261, 263, 275, 267, 269, 271, 273, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 356, 358, 360, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458 , 460, 462 Y 464 y/o (c) uno o más anticuerpos capaces de unión a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo mencionado en el inciso (a) o uno o más anticuerpos capaces de unirse a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo mencionado en el inciso (a) en donde el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante.

En todos los casos, las moléculas con las secuencias de las SEC ID NOS: 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 y 465 o que codifican o que se unen a moléculas con estas secuencias son las que se prefieren, y particularmente preferidas son las moléculas con las secuencias de las SEC ID NOS: 79, 139, 133, 433, 111, 171, 113 y 173, o que codifican o que se unen a moléculas con estas secuencias.

En una modalidad adicional, la composición de la invención comprende por lo menos uno o varios portadores y/o excipientes farmacéuticos. Particularmente, la composición de la invención es una composición farmacéutica o vacuna.

En otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende una combinación de polipéptidos que comprenden, que consisten esencialmente de o que consisten de por lo menos uno de los polipéptidos que se seleccionan del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 190, 191, 193, 195, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 331, 357, 359, 361, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 y 465. Particularmente, estas composiciones comprenden una combinación de polipéptidos que comprenden, que consisten esencialmente de o que consisten de dos o más (es decir, 2, 3 ó más) secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo mencionado en lo anterior. Las composiciones particularmente preferidas pueden comprender una combinación de polipéptidos que comprenden, que consisten esencialmente de o que consisten de por lo menos un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133,139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 y 465, o el grupo que consiste de las SEC ID NOS: 79, 139, 133, 433, 111, 171, 113 y 173.

Particularmente, la composición preferida puede comprender una combinación de polipéptidos que comprenden, que consisten esencialmente de o que consisten de dos o más (es decir, 2, 3 ó más) secuencias de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435,437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 y 465 o el grupo que consiste de las SEC ID NOS: 79, 139, 133, 433, 111, 171, 113 y 173.

Las composiciones preferidas de la invención pueden comprender, consistir esencialmente de o consistir de una combinación de por lo menos una de las secuencias de aminoácidos que codifican para al menos un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de Dif44 (CD0844), Dif51 (CD0999), Dif130 (CD2645), Difl92 (CD1035), DÍÍ183 (CD3669), DIF153 (CD2830), Dif232 (CD1031), Dif208 (CD2831) y Dif208A. Particularmente, las composiciones preferidas comprenden una combinación de polipéptidos de . i ici e de manera más particular comprenden, consisten esencialmente de o consisten de dos o más (es decir, 2, 3, 4) polipéptidos que se seleccionan del grupo que consiste de Dif44 (CD0844), Dif51 (CD0999), Dif130 (CD2645), Difl92 (CD1035), Difl83 (CD3669), DIF153 (CD2830), Dif232 (CD1031), Dif208 (CD2831) y DÍf208A. Se prefieren especialmente Dif44 (CD0844) y Dif208 (CD2831).

Las composiciones particulares de la invención puede comprender, consistir esencialmente de o consistir de una combinación de: polipéptido DIF44 (CD0844) y polipéptido DIF192 (CD1035); y/o polipéptido DIF51 (CD0999) y polipéptido DIF130 (CD2645); y/o polipéptido DIF232 (CD1031) y polipéptido DIF208 (CD2831); y/o polipéptido Difl83 (CD3669) y polipéptido DIF225 (CD0438); y/o polipéptido DIF44 (CD0844) y polipéptido DIF51 (CD0999); y/o polipéptido DIF130 (CD2645) y polipéptido DIF192 (CD1035); y/o polipéptido Difl83 (CD3669) y polipéptido DIF153 (CD2830); y/o polipéptido DIF232 (CD1031) y polipéptido DIF208A (CD2831). Polipéptidos Dif44 (CD0844), Dif51 (CD0999), Difl30 (CD2645) y/o Difl92 (CD1035); y/o polipéptidos Difl83 (CD3669), DIF153 (CD2830), Dif232 (CD1031), y/o Dif208 (CD2831); y/o polipéptidos Difl83 (CD3669), DIF153 (CD2830), Dif232 (CD1031), y/o Dif208A (CD2831); y/o polipéptidos DIF44; (CD0844), DIF153 (CD2830), y/o Dif208 (CD2831); y/o polipéptidos DIF44 (CD0844), DIF153 (CD2830), y/o Dif208A (CD2831); y/o polipéptidos Dif51 (CD0999), Dif130 (CD2645), Difl83 (CD3669), DIF192 (CD1035), y/o DIF232 (CD1031); y/o polipéptido DIF44 (CD0844) y uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7) o por lo menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de los polipéptidos DIF51 (CD0999), DIG130 (CD2645), DIF153 (CD2830), DIF192 (CD1035), DIF208 (CD2831), Difl83 (CD3669) y DIF232 (CD1031), por ejemplo, el polipéptido DIF44 y uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4) o por lo menos 1, 2 o 3 de los polipéptidos DIF153, DIF192, DIF208, Difl83 y Dif232, por ejemplo DIF44 y DIF153, DIF44 y DIF192, DIF44 y DIF208, DIF44 y Dif183, DIF44 y DIF232; y/o el polipéptido DIF208 (CD2831) y uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7) o por lo menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de los polipéptidos DIF44 (CD0844), DIF51 (CD0999), DIF130 (CD2645), DIF153 (CD2830), DIF192 (CD1035), Dif183 (CD3669) y DIF232 (CD1031), por ejemplo, el polipéptido DIF208 y uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4) o por lo menos 1, 2 o 3 de los polipéptidos DIF44, DIF153, DIF192, Dif183 y Dif232, por ejemplo DIF208 y DIF153, DIF208 y DIF192, DIF208 y Difl83, DIF208 y DIF232; y/o polipéptidos DIF44 (CD0844), Dif208 (CD2831), y uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6) o por lo menos 1, 2, 3, 4 o 5 de DIF51 (CD0999), DIF130 (CD2645), DIF153 (CD2830), DIF192 (CD1035), Difl83 (CD3669) y DIF232 (CD1031), por ejemplo polipéptidos DIF44 (CD0844), Dif208 (CD2831), y uno o más (por ejemplo, 2 o 3 o 4) o por lo menos 1 o 2 o 3 de los polipéptidos DIF153, DIF192, Dif183 y Dif232.

Se pueden elaborar combinaciones o composiciones equivalentes utilizando moléculas de ácido nucleico codificantes y/o anticuerpos para las moléculas mencionadas de manera tal que se puede utilizar una combinación de moléculas de ácido nucleico que codifican para la combinación peptídica a la que se hace referencia, y también puede ser una combinación de anticuerpos para las moléculas mencionadas en la composición de la invención. Particularmente, las composiciones de la invención son composiciones inmunogénicas.

La totalidad de las composiciones anteriores y combinaciones de la invención, como se describe en lo anterior adicionalmente pueden comprender uno o más antígenos adicionales, por ejemplo los cuales proporcionan un efecto protector contra . ifficile o contra CDAD, moléculas las cuales codifican para estos antígenos o moléculas (por ejemplo, anticuerpos) que se unen a estos antígenos. Las moléculas relevantes así como las secuencias para estas moléculas se proporcionan en otra parte en este documento.

De este modo, una composición preferida de la invención puede comprender, consistir esencialmente o consistir de una combinación de: ToxB-GT y TdcA y por lo menos un polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de Dif44 (CD0844), Dif51 (CD0999), Difl30 (CD2645), Difl92 (CD1035), Dif183 (CD3669), DIF153 (CD2830), Dif232 (CD1031) y Dif208 (CD2831), por ejemplo dos o más (es decir, 2, 3 ó 4) polipéptidos que se seleccionan del grupo que consiste de Dif44 (CD0844), Dif51 (CD0999), Difl30 (CD2645), DÍÍ192 (CD1035), Dif183 (CD3669), DIF153 (CD2830), Dif232 (CD1031) y Dif208 (CD2831).

La totalidad de las combinaciones mencionadas en lo anterior de polipéptidos DIF44, DIF51, DIF130, DIF153, DIF192, DIF208, Difl83 y/o DIF232 también se puede elaborar en combinación adicionalmente con ToxB-GT y TcdA, como se describe y se define en lo anterior. TcdA se selecciona de ToxA-B, ToxA-PTA2, ToxA-P5-7, ToxA-P5-6, ToxA-P9-10, ToxA-B2, ToxA-B3, ToxA-B5, ToxA-B6 y/o ToxA-B7, y las combinaciones preferidas con combinaciones en donde TcdA es ToxA-P5-6. Las combinaciones más preferibles son : (i) ToxB-GT, ToxA-P5-6 y DIF44, (ii) ToxB-GT, ToxA-P5-6 y DIF208, (iii) ToxB-GT, ToxA-P5-6, DIF44 y DIF208.

Los ejemplos de estas combinaciones incluyen las siguientes combinaciones de antígenos: Tox-GT + TdcA + Dif208; Tox-GT + TdcA + Dif208A; Tox-GT + TdcA + Dif51; Tox-GT + TdcA + Dif44; Tox-GT + TdcA + Dif130; Tox-GT + TdcA + Difl92; Tox-GT + TdcA + Dif 183; Tox-GT + TdcA + Dif153; Tox-GT + TdcA + Dif232.

De esta manera, la invención también proporciona las siguientes combinaciones de antígenos o de anticuerpos que incluyen anticuerpos que reconocen cualquiera de las siguientes combinaciones de antígenos: Tox-GT + TdcA + polipéptido DIF44 (CD0844) y polipéptido DIF192 (CD1035); y/o Tox-GT + TdcA + polipéptido DIF51 (CD0999) y polipéptido DIF130 (CD2645); y/o Tox-GT + TdcA + polipéptido DIF232 (CD1031) y polipéptido DIF208 (CD2831); y/o Tox-GT + TdcA + polipéptido Difl83 (CD3669) y polipéptido DIF225 (CD0438); y/o Tox-GT + TdcA + polipéptido DIF44 (CD0844) y polipéptido DIF51 (CD0999); y/o Tox-GT + TdcA + polipéptido DIF130 (CD2645) y polipéptido DIF192 (CD1035); y/o Tox-GT + TdcA + polipéptido Dif183 (CD3669) y polipéptido DIF153 (CD2830); y/o Tox-GT + TdcA + polipéptido DIF232 (CD1031) y polipéptido DIF208A (CD2831); y/o Tox-GT + TdcA + polipéptidos Dif44 (CD0844), Dif51 (CD0999), Difl30 (CD2645) y/o Difl92 (CD1035); y/o Tox-GT + TdcA + polipéptidos Difl83 (CD3669), DIF153 (CD2830), Dif232 (CD1031), y/o Dif208 (CD2831); y/o Tox-GT+TdcA+polipéptidos Difl83 (CD3669), DIF153 (CD2830) Dif232 (CD1031), y/o Dif208A (CD2831); y/o Tox-GT + TdcA + polipéptidos DIF44 (CD0844), DIF153 (CD2830), y/o Dif208 (CD2831); y/o Tox-GT + TdcA +polipéptidos DIF44 (CD0844), DIF153 (CD2830), y/o Dif208A (CD2831); Tox-GT + TdcA +polipéptidos Dif51 (CD0999), Difl30 (CD2645), Difl83 (CD3669), DIF192 (CD1035), y/o DIF232 (CD1031).

TdcA se selecciona de ToxA-B, ToxA-PTA2, ToxA-P5-7 ToxA-P5-6, ToxA-P9-10, ToxA-B2, ToxA-B3, ToxA-B5, ToxA-B6 y/o ToxA-B7. Por ejemplo, la invención también proporciona las siguientes combinaciones de antígenos o de anticuerpos que incluyen anticuerpos que reconocen cualquiera de las siguientes combinaciones de antígenos: Tox-GT + ToxA-P5-6+ polipéptido DIF44 (CD0844) y polipéptido DIF192 (CD1035); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6 + polipéptido DIF51 (CD0999) y polipéptido DIF130 (CD2645); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6+ polipéptido DIF232 (CD1031) y polipéptido DIF208 (CD2831); y/o Tox-GT + ToxA-P5- 6+ polipéptido Difl83 (CD3669) y polipéptido DIF225 (CD0438); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6+ polipéptido DIF44 (CD0844) y polipéptido DIF51 (CD0999); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6+ polipéptido DIF130 (CD2645) y polipéptido DIF192 (CD1035); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6+polipéptido Difl83 (CD3669) y polipéptido DIF153 (CD2830); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6+polipéptido DIF232 (CD1031) y polipéptido DIF208A (CD2831); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6+ polipéptidos Dif44 (CD0844), Dif51 (CD0999), Dif130 (CD2645) y/o Difl92 (CD1035); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6+polipéptidos Difl83 (CD3669), DIF153 (CD2830), Dif232 (CD1031), y/o Dif208 (CD2831); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6+polipéptidos Difl83 (CD3669), DIF153 (CD2830), Dif232 (CD1031), y/o Dif208A (CD2831); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6+ polipéptidos DIF44 (CD0844), DIF153 (CD2830), y/o Dif208 (CD2831); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6+polipéptidos DIF44 (CD0844), DIF153 (CD2830), y/o Dif208A (CD2831); y/o Tox-GT + ToxA-P5-6+polipéptidos Dif51 (CD0999), Difl30 (CD2645), Difl83 (CD3669), DIF192 (CD1035), y/o DIF232 (CD1031).

Tox-GT + TcdA (preferiblemente ToxA-P5-6) también se pueden combinar con: polipéptido DIF44 (CD0844) y uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7) o por lo menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de polipéptidos DIF51 (CD0999), DIF130 (CD2645), DIF153 (CD2830), DIF192 (CD1035), DIF208 (CD2831), Difl83 (CD3669) y DIF232 (CD1031), por ejemplo el polipéptido DIF44 y uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4) o por lo menos 1, 2 o 3 de los polipéptidos DIF153, DIF192, DIF208, Difl83, DIF232 por ejemplo, DIF44 y DIF153, DIF44 y DIF192, DIF 44 y DIF208, DIF 44 y Dif183, DIF 44 y DIF232; y/o polipéptido DIF208 (CD2831) y uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7) o por lo menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de los polipéptidos DIF44 (CD0844), DIF51 (CD0999), DIF130 (CD2645), DIF153 (CD2830), DIF192 (CD1035), Dif183 (CD3669) y DIF232 (CD1031), por ejemplo, el polipéptido DIF208 y uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4) o por lo menos 1, 2 o 3 de los polipéptidos DIF44, DIF153, DIF192, Dif183, por ejemplo DIF208 y DIF153, DIF208 y DIF192, DIF208 y Difl83, DIF208 y DIF232; y/o los polipéptidos DIF44 (CD0844), Dif208 (CD2831), y uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6) o por lo menos 1, 2, 3, 4 o 5 de DIF51 (CD0999), DIF130 (CD2645), DIF153 (CD2830), DIF192 (CD1035), Difl83 (CD3669) y DIF232 (CD1031), por ejemplo los polipéptidos DIF44 (CD0844), Dif208 (CD2831) y uno o más (por ejemplo, 2, 3 ó 4) o por lo menos 1 ó 2 ó 3 de polipéptidos DIF153, DIF192, Dif183, DIF232.

Se pueden realizar combinaciones o composiciones equivalentes utilizando moléculas de ácido nucleico codificantes y/o anticuerpos que se unen a las moléculas mencionadas (por ejemplo, que reconocen cualquiera de las combinaciones de antígenos), de manera que una combinación de moléculas de ácido nucleico que codifican para la combinación peptídica a la que se hace referencia se pueden utilizar, así como una combinación de anticuerpos que se unen a las moléculas mencionadas (por ejemplo, que reconocen cualquiera de las combinaciones de antígenos). En general, las composiciones inmunogénicas comprenderán por lo menos una proteína antigénica o antígeno. Cuando se hace referencia a DIF208, este puede sustituirse con DIF208A o DIF208B en estas combinaciones.

Las composiciones de la invención se pueden utilizar en métodos para evitar o tratar una infección por C. i ici e. La invención de esta manera proporciona un método para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención que comprende uno o más de los polipéptidos descritos en lo anterior. La respuesta inmunitaria típicamente es protectora e involucra anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. La invención también proporciona un método para evitar o tratar una infección por C. iffici e en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención. Los métodos pueden generar una respuesta de refuerzo.

Una de las causas principales de infección por C. difficile es el uso de antibióticos que alteran la flora intestinal. Por lo tanto, las composiciones de la invención se pueden utilizar en regímenes de tratamiento con antibióticos para tratar tanto la condición subyacente y también para tratar o evitar cualquier invención por . if ici e. Mediante el uso de estas composiciones y métodos, al mamífero se le puede proteger contra infección por . ici e, particularmente una infección nosocomial. En algunas modalidades, la infección por . difficile resulta en uno o más de diarrea, diarrea asociada a antibióticos (AAD, por sus siglas en inglés), dolor abdominal, fiebre, leucocitosis, colitis pseudomembranosa o megacolon tóxico y el tratamiento puede evitar, reducir o eliminar uno o más de estos padecimientos.

En algunas modalidades, las composiciones de la invención son composiciones para uso en medicina y en tratamiento, por ejemplo, para inmunización pasiva contra CDAD. La invención también proporciona el uso de estos anticuerpos o composiciones en la elaboración de un medicamento, preferiblemente para cualquiera de los tipos de tratamientos a los que se hace referencia en la presente.

En una modalidad adicional, las composiciones de la invención son composiciones para uso en la prevención o tratamiento de infección por . difficile en un mamífero.

En algunas modalidades, la invención también proporciona el uso de polipéptidos, ácidos nucleicos y anticuerpos de la invención en la elaboración de un medicamento, preferiblemente para cualquiera de los tipos de tratamientos a los que se hace referencia en la presente.

Cuando las composiciones inmunogénicas evitan, disminuyen, palian o eliminan la enfermedad de un animal, entonces la composición inmunogénica opcionalmente se puede denominar como una vacuna. El término "vacuna", como se utiliza en la presente, se refiere a una composición de vacuna que comprende ya sea determinantes antigénicos purificados, ácidos nucleicos que codifican para los determinantes antigénicos purificados o fragmentos de los mismos, en ausencia del organismo que provoca enfermedad. Estas vacunas se pueden denominar como una "vacuna de subunidad". Los términos no se pretende que abarquen "vacunas de células completas", por ejemplo, aquellas derivadas de células bacterianas completas que han sido destruidas y las cuales pueden contener los determinantes antigénicos en forma no purificada como parte de un complejo y una composición no caracterizada. Así, en modalidades particulares las vacunas de células completas se pueden excluir o no se reivindican. Como se utiliza en la presente, el término "multivalente" significa que la vacuna contiene determinantes antigénicos estructuralmente similares o "relacionados" de por lo menos dos cepas o aislados, los determinantes antigénicos son homólogos y tienen diferencias menores entre sus secuencias de aminoácidos.

De esta manera, las composiciones de la invención pueden ser útiles como vacunas. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, evitar la infección) o terapéuticas (es decir, tratar la infección), pero típicamente serán profilácticas. El término "protegido contra infección" significa que el sistema inmunitario de un sujeto ha sido cebado (por ejemplo, mediante vacunación) para activar una respuesta inmunitaria y repeler la infección. Será evidente para aquellos expertos en el ámbito que un sujeto vacunado de esta manera puede ser infectado, pero estará en mejores condiciones para repeler la infección en comparación con un sujeto control. El término "tratar" incluye tanto tratamiento terapéutico como tratamiento profiláctico o preventivo, en donde el objetivo es evitar o eliminar la infección. Por ejemplo, tratar puede incluir alterar directamente o curar, suprimir, inhibir, evitar, reducir la gravedad de, retrasar el inicio de, reducir los síntomas asociados con, por ejemplo, infección o una combinación de los mismos. "Evitar" puede hacer referencia, por ejemplo, a suprimir el inicio de los síntomas, evitar recaída de una enfermedad y similares. Tratar también puede incluir "suprimir" o "inhibir" una infección o enfermedad, por ejemplo reducir la gravedad, número, incidencia o latencia de síntomas, aminorar síntomas, reducir síntomas secundarios, reducir infecciones secundarias, prolongar la supervivencia del paciente o combinaciones de los mismos.

El término "antígeno" se refiere a una molécula contra la cual un sujeto puede iniciar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular. Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el hospedador de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpo a una composición o vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye pero no se limita a uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T cooperadores y/o linfocitos T citotóxicos, dirigidos específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el sujeto mostrará ya sea una respuesta inmunológica terapéutica o protectora tal como resistencia a infección nueva que se mejorará y/o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Esta protección se demostrará ya sea por reducción o carencia de síntomas normalmente presentados por un sujeto infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral disminuido en el hospedador infectado. El término proteína o polipéptido "inmunogénico", como se utiliza en la presente, también se refiere a una secuencia de aminoácidos la cual induce una respuesta inmunológica como se describe en lo anterior.

Las composiciones de esta manera pueden ser farmacéuticamente aceptables. Habitualmente incluirán componentes, además de los antígenos, por ejemplo, típicamente incluyen uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticos. Una discusión pormenorizada de estos componentes está disponible en [94]. Las composiciones se pueden administrar a un mamífero en forma acuosa. No obstante, antes de la administración, la composición puede haber estado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se fabrican en forma acuosa, después se suministran como relleno y se distribuyen y administran también en forma acuosa, otras vacunas son liofilizadas durante la manufactura y son reconstituidas en una forma acuosa en el momento de su uso. Así, una composición de la invención puede estar seca, tal como una formulación liofilizada.

La composición puede incluir conservadores tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. No obstante, se prefiere que la vacuna sea una forma sustancialmente libre (es decir, menor de 5 mg/ml) de material mercurial, por ejemplo libre de tiomersal. Las vacunas que no contienen mercurio son las que se prefieren más. Se prefieren particularmente vacunas libres de conservadores. Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector de temperatura. Los detalles adicionales de estos agentes se proporcionan más adelante. Para controlar tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl) el cual puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 10 + 2 mg/ml de NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, fosfato diácido de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc. Las composiciones generalmente tendrán una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, de manera preferible entre 240 y 360 mOsm/kg y de manera más preferible se encontrarán dentro del intervalo de 290 a 310 mOsm/kg. Las composiciones pueden incluir uno o más amortiguadores. Los amortiguadores típicos incluyen: un amortiguador de fosfato; un amortiguador Tris, un amortiguador de borato, un amortiguador de succinato, un amortiguador de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un amortiguador de citrato. Los amortiguadores típicamente se incluirán en un intervalo de 5 a 20 mM. El pH de la composición generalmente estará entre 5.0 y 8.1 y de manera más habitual entre 6.0 y 8.0, por ejemplo 6.5 y 7.5 o entre 7.0 y 7.8. La composición preferiblemente es estéril. La composición preferiblemente es no pirogénica, por ejemplo, contiene <1 EU (siglas en inglés para unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis y preferiblemente <0.1 EU por dosis. Preferiblemente la composición está libre de gluten.

La composición puede incluir material para una inmunización únicamente o puede incluir material para inmunizaciones múltiples (es decir, un kit de "dosis múltiples"). Se prefiere la inclusión de un conservador en distribuciones de dosis múltiples. Como una alternativa (o de modo adicional) para incluir un conservador en composiciones de dosis múltiples, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tenga un adaptador aséptico para extracción de material. Las vacunas para humanos habitualmente se administran en un volumen de dosificación de aproximadamente 0.5 mi, aunque se pueden administrar a niños dosis a la mitad (es decir, de aproximadamente 0.25 mi).

Las composiciones de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferiblemente uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2. Los adyuvantes los cuales se pueden utilizar en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a: • sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio, que incluyen hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos) y sulfatos, etc., (por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la referencia 95]; • emulsiones aceite en agua, tales como emulsiones escualeno-agua, que incluyen MF59 (escualeno 5%, Tween 80 0.5% y Span 85 0.5% formulados en partículas de submicrómetros utilizando un microfluidizador) [capítulo 10 de la referencia 95, véase también las referencias 96 a 99, capítulo 10 de la referencia 100 y capítulo 12 de la referencia 101], adyuvante completo de Freund (CFA, por sus siglas en inglés) y adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés); • formulaciones de saponina [capítulo 22 de la referencia 95], tal como QS21 [102] y los ISCOM [capítulo 23 de la referencia 95]; • virosomas y partículas similares a virus (VLP, por sus siglas en inglés) [103-109]; • derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido (LPS, por sus siglas en inglés) enterobacteriano, derivados de lípido A [110, 111], oligonucleótidos inmunoestimuladores [112 a 117] tal como IC-31MR [118] (desoxinucleótido que comprende una secuencia de 26 unidades 5'-(IC)i3-3' (SEC ID NO: 354) y polipéptido de polímero policatiónico que comprende una secuencia de aminoácidos de 11 unidades KLKLLLLLKLK (SEC ID NO: 355)) y toxinas ribosilantes de ADP y derivados destoxificados de la misma [119-128]; • inmunomoduladores humanos, que incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [129-130], interferones (por ejemplo, interferón-g), factor estimulador de colonia de macrófagos y factor de necrosis tumoral; • bioadhesivos y mucoadhesivos tales como quitosana y derivados de los mismos, microesferas de ácido hialurónico esterificado [131] o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de poli (ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa [132]; • micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a -150 mm de diámetro, de manera más preferible -200 nm a 30 mm de diámetro y de manera más preferible -500 nm a -10 mp\ de diámetro) formada a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.); • liposomas [capítulos 13 y 14 de [95, 133- 135]]; • éteres de polioxietileno y ásteres de polioxietileno [136]; • formulaciones de PCPP [137 y 138]; • polipéptidos de muramilo, que incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP, por sus siglas en inglés), N-acetil-normuramil-1-alanil-d-isoglutamina (nor-MDP, por sus siglas en inglés), y N-acetilmuramil-l-alanil-d-isoglutaminil-l-alanina-2-(11,2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)etilamina, MTP-PE, por sus siglas en inglés); y • compuestos de imidazoquinolona, que incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo, "Resiquimod 3M") [139 y 140].

Las composiciones y vacunas de la invención también pueden comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados en lo anterior. Por ejemplo, las siguientes composiciones adyuvantes se pueden utilizar en la invención: (1) una saponina y una emulsión aceite en agua [141]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) [142]; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, edMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [143]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones aceite en agua [144]; (6) SAP, que contiene escualano 10%, Tween 80MR 0.4%, pluronic 5%-polímero de bloque L121 y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a remolino para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) sistema de adyuvante RibiMR (RAS, por sus siglas en inglés) (Ribi Inmunochem) que contiene escualeno 2%, Tween 800.2% y uno o más componentes de pared de célula bacteriana del grupo que consiste de monofosforilipido A (MPL, por sus siglas en inglés), dimicolato de trehalosa (TDM, por sus siglas en inglés), y esqueleto de pared celular (CWS, por sus siglas en inglés), preferiblemente MPL + CWS (DetoxMR); y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se describen en el capítulo 7 de [95]. El uso de un hidróxido de aluminio y/o un adyuvante de fosfato de aluminio se prefiere particularmente y los antígenos generalmente se adsorben en estas sales. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferido. Otras combinaciones de adyuvantes preferidas incluyen combinaciones de adyuvantes Thl y Th2 tales como CpG y alumbre o resiquimod y alumbre. Una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL se puede utilizar (esto se ha reportado que es tan eficaz como la inmunización neumocócica [145]).

Las composiciones de la invención pueden inducir tanto una respuesta inmunitaria mediada por células así como una respuesta inmunitaria humoral. Esta respuesta inmunitaria preferiblemente inducirá anticuerpos de larga duración (por ejemplo, neutralizantes) y una inmunidad mediada por células que puede responder rápidamente ante exposición a . i ici e. Dos tipos de linfocitos T, los linfocitos CD4 y CD8 generalmente se consideran necesarios para iniciar y/o mejorar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral. Los linfocitos T CD8 pueden expresar un correceptor CD8 y se les denomina comúnmente como linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés). Los linfocitos T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con antígenos presentados sobre moléculas CPH clase I. Los linfocitos T CD4 pueden expresar un correceptor CD4 y comúnmente se les denomina como linfocitos T cooperadores (helper). Los linfocitos T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas CPH clase II. Ante interacción con una molécula CPH clase II, las células CD4 pueden secretar factores tales como citocinas. Estas citocinas secretadas pueden activar linfocitos B, linfocitos T citotóxicos, macrófagos y otras células que participan en una respuesta inmunitaria. Los linfocitos T cooperadores o células CD4+ se pueden dividir adicionalmente en dos subconjuntos funcionalmente distintos: fenotipo TH1 y fenotipo TH2 los cuales difieren en sus funciones de citocina y efectoras. Las células TH1 activadas incrementan la inmunidad celular (que incluye un incremento en la producción de CTL específica de antígeno) y por lo tanto son de valor particular en responder a interacciones intracelulares. Las células TH1 activadas pueden secretar uno o más de IL-2, INF-g y TNF-b. Una respuesta inmunitaria TH1 puede resultar en reacciones inflamatorias locales al activar macrófagos, células NK (citolíticas naturales) y linfocitos T citotóxicos CD8 (CTL). Una respuesta inmunitaria TH1 también puede actuar para expandir la respuesta inmunitaria al estimular el crecimiento de linfocitos B y T con IL-12. Los linfocitos B estimulados TH1 pueden secretar IgG2a. Las células TH2 activadas incrementan la producción de anticuerpos y por lo tanto son útiles en responder a infecciones extracelulares. Las células TH2 activadas pueden secretar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Una respuesta inmunitaria TH2 puede resultar en la producción de IgGl, IgE, IgA y linfocitos B de memoria para protección futura. Una respuesta inmunitaria mejorada puede incluir uno o más de una respuesta inmunitaria TH1 mejorada y una respuesta inmunitaria TH2. Una respuesta inmunitaria TH1 puede incluir uno o más de un incremento en los CTL, un incremento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH1 (tal como IL-2, IFN-g y TNF-b), un incremento en macrófagos activados, un incremento en actividad NK o un incremento en la producción de IgG2a. En algunas modalidades, la respuesta inmunitaria TH1 aumentada incluirá un incremento en la producción de IgG2a. Una respuesta inmunitaria TH1 puede ser inducida utilizando un adyuvante TH1. Un adyuvante TH1 generalmente inducirá niveles aumentados de producción de IgG2a en relación a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH1 adecuados para uso en la invención pueden incluir, por ejemplo, formulaciones de saponina, virosomas y partículas similares a virus, derivados no tóxicos de lipopolisacáridos (LPS) enterobacterianos, oligonucleótidos inmunoestimuladores. Oligonucleótidos inmunoestimuladores tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG, son adyuvantes TH1 típicos para uso en la invención. Una respuesta inmunitaria TH2 puede incluir uno o más de un incremento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH2 (tales como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) o un incremento en la producción de IgGl, IgE, IgA y linfocitos B de memoria. En algunas modalidades, la respuesta inmunitaria TH2 mejorada incluirá un incremento en la producción de IgGl. Se puede inducir una respuesta inmunitaria TH2 utilizando un adyuvante de TH2. Un adyuvante de TH2 generalmente inducirá niveles aumentados de producción de IgGl en relación a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 adecuados para uso en la invención incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite y toxinas ribosilantes de ADP así como derivados destoxificados de los mismos. Las composiciones que contienen minerales tales como sales de aluminio son adyuvantes TH2 típicos para uso en la invención.

En algunas modalidades, la invención incluye una composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y un adyuvante de TH2. Con frecuencia, tal composición induce una respuesta TH1 mejorada y una respuesta TH2 mejorada, es decir, un incremento en la producción tanto de IgGl como en la producción de IgG2a en relación a la inmunización sin adyuvante. Generalmente, la composición comprende una combinación de un adyuvante TH1 y uno TH2 que induce una respuesta inmunitaria aumentada TH1 y/o aumentada TH2 en relación a la inmunización con un adyuvante único (es decir, en relación a la inmunización con un adyuvante TH1 solo o inmunización con un adyuvante TH2 solo). La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria TH1 y una respuesta TH2. La respuesta inmunitaria puede proporcionar uno o ambos de una respuesta TH1 mejorada y una respuesta TH2 mejorada. La respuesta inmunitaria mejorada puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica y de mucosa. La respuesta inmunitaria puede proporcionar uno o ambos de una respuesta inmunitaria sistémica mejorada y una mucosal mejorada. Típicamente, la respuesta inmunitaria mucosal es una respuesta inmunitaria TH2. Típicamente, la respuesta inmunitaria mucosal incluye un incremento en la producción de IgA.

Las infecciones por C. difficile pueden alterar diversas áreas del cuerpo y de esta manera las composiciones de la invención se pueden preparar en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección también se pueden preparar (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición rociada-liofilizada). La composición se puede preparar para administración tópica, por ejemplo como un ungüento, crema o polvo. La composición se puede preparar para administración oral, por ejemplo como una tableta o cápsula, como una aspersión o como un jarabe (opcionalmente, con sabor). La composición se puede preparar para administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, utilizando un polvo fino o una aspersión. La composición se puede preparar como un supositorio o pesario. La composición se puede preparar para administración nasal, ótica u ocular, por ejemplo como gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñada de manera que la composición combinada se reconstituya justo antes de su administración a un mamífero. Estos kit pueden comprender uno o más antí enos en forma líquida y uno o más antígenos liofilizados.

Cuando una composición se va a preparar de manera extemporánea antes de su uso (por ejemplo, cuando un componente se presenta en forma liofilizada) y está presente como un kit, el kit puede comprender dos frascos o puede comprender una jeringa rellenada de antemano y un frasco, con el contenido de la jeringa que se utiliza para reactivar el contenido del frasco antes de la inyección.

Las composiciones utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de uno o varios antígenos así como cualquier otro componente, según se necesite. Mediante el término "cantidad inmunológicamente eficaz" se quiere indicar que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo que se va a tratar, edad, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, un primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la determinación de la situación médica del doctor que realiza el tratamiento y otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad se encontrará en un intervalo relativamente amplio el cual puede ser determinado mediante ensayos sistemáticos. Cuando se incluye más de un antígeno en una composición, entonces dos antígenos pueden estar presentes en la misma dosis o cada uno en dosis diferentes.

Como se menciona en lo anterior, una composición puede incluir un agente protector de temperatura, y este componente puede ser particularmente útil en composiciones con adyuvante (particularmente aquellas que contienen un adyuvante mineral tal como una sal de aluminio). Como se describe en la referencia 146, un agente protector de temperatura líquido se puede agregar a una composición de vacuna acuosa para disminuir su punto de congelamiento, por ejemplo, para reducir el punto de congelamiento por debajo de 0°C. De este modo, la composición se puede almacenar por debajo de 0°C, pero por encima de su punto de congelamiento para evitar descomposición térmica. El agente protector de temperatura también permite el congelamiento de la composición mientras que protege a los adyuvantes de sal mineral evitando la aglomeración o sedimentación después de congelamiento y recalentamiento y también puede proteger a la composición a temperaturas elevadas, por ejemplo superiores a 40°C. La vacuna acuosa inicial y el agente protector de temperatura líquido se pueden mezclar de manera que el agente protector de temperatura líquido forme 1-80% en volumen de la mezcla final. Los agentes protectores de temperatura adecuados deben ser seguros para administración a humanos, miscibles/solubles en agua con facilidad y no deben dañar otros componentes (por ejemplo, antígeno y adyuvante) en la composición. Los ejemplos incluyen glicerina, propilenglicol y/o polietilenglicol (PEG). Los PEG adecuados pueden tener un promedio en peso molecular que varía de 200 a 20,000 Da. En una modalidad, el polietilenglicol puede tener un promedio de peso molecular de aproximadamente 300 Da ("PEG-300").

La invención proporciona una composición que comprende: (i) uno o más antígenos como se describe en lo anterior; y (ii) un agente protector de temperatura. Esta composición se puede formar al mezclar: (i) una composición acuosa que comprende uno o más antígenos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 de los antígenos de la combinación de antígenos), con (ii) un agente protector de temperatura. La mezcla después se puede almacenar, por ejemplo, debajo de 0°C, de 0 a 20°C, de 20 a 35°C, de 35 a 55°C o a una temperatura superior. Se puede almacenar en forma líquida o congelada. La mezcla puede estar liofilizada. La composición de manera alternativa se puede formar al mezclar: (i) una composición seca que comprende uno o más antígenos, con (ii) una composición líquida que comprende el agente protector de temperatura. De esta manera, el componente (ii) se puede utilizar para reconstituir el componente (i).

Combinación de conjugados de sacárido de C. difficile Los polipéptidos de la invención se pueden utilizar en combinación con, o conjugados con polipéptidos sacáridos. Así, la invención proporciona una composición que comprende una combinación de: (1) uno o más polipéptidos y/o anticuerpos, y (2) uno o más conjugados de un sacárido de C. difficile y una proteína portadora; uno o más de los polipéptidos y/ó anticuerpos conjugados a un sacárido de C. difficile y opcionalmente una proteína portadora. La combinación se puede utilizar en un método para tratar o evitar infección por C. i fici e o en un método de generación de una respuesta inmunitaria, como se describe en lo anterior.

Un conjugado utilizado en el componente (2) de esta combinación incluye una porción sacárida y una porción portadora. La porción sacárida es de C. ifficile . El sacárido de C. i en particular se puede seleccionar de los sacáridos PS-I, PS-II y PS-III descritos en la referencia 147. PS-I comprende unidades pentasacáridas repetidas de fórmula A: en donde Rha es ramnosa, P es fosfato de glucosilo y Glc es glucosa.

En particular, el sacárido PS-I utilizado en la presente invención puede ser de fórmula A': — en donde n es un número entero de 1 a 1000, Rha es ramnosa, P es fosfato de glucosilo y Glc es glucosa PS-II comprende unidades hexasacáridas repetidas de fórmula B: en donde Glc es glucosa, GalNAc es N-acetil-galactosamina, P es fosfato de glucosilo y Man es mañosa.

En particular, el sacárido PS-II utilizado en la presente invención puede ser de la fórmula B': en donde n es un número entero de 1 a 1000, Glc es glucosa, GalNAc es N-acetil-galactosamina, P es fosfato de glucosilo y Man es mañosa.

PS-III comprende glicerol, fosfato de alditol, glucosa y N-acetil-glucosamina dentro de su estructura química covalente. En las fórmulas anteriores (A') y (B') el valor del entero N típicamente está entre 1 y 100, por ejemplo entre 2 y 100, entre 10 y 100 o entre 25 y 100. La porción portadora en los conjugados utilizados en el componente (2) habitualmente será una proteína y puede o no ser uno de los polipéptidos de (1). Las proteínas portadoras típicas son toxinas bacterianas tales como toxinas de difteria o de tétanos, o toxoides o mutantes o fragmentos de los mismos. El muíante de toxina de difteria CRM197 [148] es útil. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen el complejo de proteína de membrana exterior de N. meningitidis [149], péptidos sintéticos [150, 151], proteínas de choque térmico [152, 153], proteínas de pertussis [154, 155], citocinas [156], linfocinas [156], hormonas [156], factores de crecimiento [156], proteínas artificiales que comprenden epítopos múltiples para linfocitos T CD4+ humanos de diversos polipéptidos derivados de patógenos [157] tales como N19 [158], proteína D de H. influenzae [159-161], neu olisina [162] o sus derivados no tóxicos [163], proteína de superficie neumocócica PspA [164], proteínas de captación de hierro [165], toxina A o B de C. difficile [166], exoproteína A de P. aeruginosa recombinante [rEPA, por sus siglas en inglés] [167], etc. En algunas modalidades, la proteína portadora es una proteína de S. aureus . En otras modalidades, el portador es un polipéptido de C. difficile de la invención.

Cuando una composición incluye más de un conjugado, cada conjugado puede utilizar la misma proteína portadora o una proteína portadora diferente. Los conjugados pueden tener portador en exceso (p/p) o sacárido en exceso (p/p)· En algunas modalidades el conjugado puede incluir pesos sustancialmente iguales de cada uno. La molécula portadora puede estar conjugada covalentemente al portador directamente o por medio de un enlazante. Los enlaces directos a la proteína se pueden obtener, por ejemplo, mediante aminación reductiva entre el sacárido y el portador, como se describe, por ejemplo, en la referencia 168. Los enlaces por medio de un grupo enlazante pueden realizarse utilizando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo los procedimientos descritos en las referencias 169 y 170. Un tipo de enlace es un enlazante de ácido adípico el cual se puede formar por acoplamiento de un grupo -NH2 libre (por ejemplo, introducido en el sacárido por aminación) con ácido adípico (utilizando, por ejemplo, activación diimida) y después acoplamiento de una proteína al intermediario resultante sacárido-ácido adípico [171, 172]. Otro tipo de enlace es un enlazante carbonilo el cual se puede formar por reacción de un grupo hidroxilo libre de un sacárido CDI [173, 174] seguido por reacción con una proteína para formar un enlace carbamato. Otros enlazantes incluyen b-propionamido [175], nitrofenil-etilamina [176], haluros de haloacilo [177], enlaces glucosídicos [178], ácido 6-aminocaproico [179], ADH [180], porciones de 4 a 12 átomos de carbono [181], etc. También se puede utilizar condensación con carbodiimida [182].

Los conjugados de polipéptido de sacárido de . if icile se pueden preparar de diversas maneras, por ejemplo por un proceso que comprende: a) activar el sacárido de . difficile al agregar un enlazante que comprende un grupo maleimida para formar un sacárido de . difficile activado; b) activar la proteína portadora al agregar un enlazante que comprende un grupo sulfhidrilo para formar una proteína portadora activada; y c) hacer reaccionar el sacárido de . i ici e activado y la proteína portadora activada para formar un conjugado de sacárido de . i i i e-proteína portadora; o por un procedimiento que comprende: a) activar el sacárido de . i icile al agregar un enlazante que comprende un grupo sulfhidrilo para formar un sacárido de . difficile activado; b) activar la proteína portadora al agregar un enlazante que comprende un grupo maleimida para formar una proteína portadora activada; y c) hacer reaccionar el sacárido de . i ici e activado y la proteína portadora activada para formar un conjugado de sacárido de . ifficile-proteína portadora; o por un proceso que comprende: a) activar el sacárido de . c e al agregar un enlazante que comprende un grupo sulfhidrilo para formar un sacárido de . activado; b) activar la proteína portadora al agregar un enlazante que comprende un grupo sulfhidrilo para formar una proteína portadora activada; y c) hacer reaccionar el sacárido de . i ici e activado y la proteína portadora activada para formar un conjugado de sacárido de C. difficile-proteína portadora. Estos conjugados se pueden combinar con cualquiera de los polipéptidos que aquí se describen.

Antigenos adicionales Con frecuencia se puede utilizar una composición única para proporcionar inmunidad a una gama de agentes infecciosos. En consecuencia, la composición puede comprender antígenos no solo de C. difficile, sino también de otras bacterias, virus, · etc. La invención de esta manera proporciona una composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención y uno o más de los siguientes antígenos: un antígeno proteínico de Helicobac ter pylori, tal como VacA, CagA, NAP, HopX, HopY [183] y/o ureasa; un antígeno proteínico de N. meningitidis, serogrupo B [184] con proteína '287' y derivados que son particularmente útiles; una preparación de vesícula de membrana exterior (OMV, por sus siglas en inglés) de N. meningitidis, serogrupo B, tal como la descrita en 185; un antígeno sacárido de N. meningitidis, serogrupo A, C, W135 y/o Y, tal como el oligosacárido descrito en 186 del serogrupo C [véase también 187] ; un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae [188]; un antígeno del virus de hepatitis A, tal como virus inactivado [189]; un antígeno de virus de hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o de núcleo [por ejemplo, 190]; un antígeno de virus de hepatitis C [por ejemplo, 191]; un antígeno de Bordatella pertussis tal como la holotoxina pertussis (PT, por sus siglas en inglés) y hemaglutinina filamentosa (FHA, por sus siglas en inglés) de B. pertussis , opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, 192]; un antígeno de difteria tal como el toxoide de difteria [por ejemplo, 193], por ejemplo el mutante CRM197 [por ejemplo 194]; un antígeno de tétanos, tal como el toxoide de tétanos [por ejemplo, 195]; un antígeno sacárido del polipéptido de Haemophilus influenzae B; un antígeno de N, gonorrhoeae [por ejemplo, 196]; un antígeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo, 197]; un antígeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo, 198]; un antígeno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo, 199]; uno o varios antígenos de la polio [por ejemplo, 200] tal como IPV u OPV; uno o varios antígenos de la rabia [por ejemplo, 201] tal como virus inactivado y liofilizado [por ejemplo 202; RabAvertMR]; antígenos de sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo 203]; uno o varios antígenos de influenza [por ejemplo, 204] tal como las proteínas de superficie de hemaglutinina y/o neuraminidasa; un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 205]; un antígeno de Staphilococcus aureus [por ejemplo, 206]; un antígeno proteínico de Streptococcus agalactiae (estreptococus grupo B) [por ejemplo, 207, 208]; un antígeno sacárido de Streptoccus agalactiae (estreptococus grupo B). Particularmente, la invención proporciona una composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención y uno o más antígenos de Staphilococcus aureus [por ejemplo, 209].

Método de tratamiento y administración de la vacuna La invención proporciona polipéptidos, ácidos nucleicos, anticuerpos o composiciones para uso en la prevención o tratamiento de infección por C. difficile o para el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de C. difficile, o para el tratamiento, prevención o la reducción de colonización del intestino por C. difficile en un sujeto. El sujeto puede ser un animal, particularmente un mamífero, de manera más particular un humano, pero, a modo de ejemplo no limitante, también puede ser un animal de importancia comercial tal como una vaca, un cerdo, un borrego, un caballo o un animal doméstico o mascota tal como un gato, perro, ratón, rata, conejo, gerbo o hámster. En ciertas modalidades, el sujeto puede ser un sujeto aviar tal como, por ejemplo, un pollo, ganso, pavo y similares.

En otra modalidad, la invención proporciona polipéptidos, ácidos nucleicos, anticuerpo o composición para uso en la prevención o tratamiento de infección por C. difficile o para el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de . i ci o para el tratamiento, prevención o la reducción de colonización del intestino por . i en un sujeto para administración secuencial, simultánea o concomitante con un compuesto antibiótico. Particularmente, el sujeto es un animal, de manera más particular un mamífero y de manera aún más particular un humano, por ejemplo un adulto o un niño. Particularmente, el humano es una mujer embarazada o un niño, particularmente un niño menor de diez años de edad. El sujeto también puede ser un paciente que reciba tratamiento con antibiótico de amplio espectro con, por ejemplo, vancomicina.

En otra modalidad, la invención proporciona polipéptidos, ácidos nucleicos, anticuerpos o composiciones para uso en la prevención o tratamiento de infección por . ifficile o para el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de . i ici o para el tratamiento, prevención o reducción de colonización del intestino por C. i ici e en un humano, en donde el humano es mayor de 50 años de edad y/o quien padece de una infección nosocomial por . i ici e .

Particularmente, la invención proporciona polipéptidos, ácidos nucleicos, anticuerpos o composiciones para uso en la prevención o tratamiento de diarrea, diarrea asociada con antibióticos (AAD, por sus siglas en inglés), dolor abdominal, retortijones abdominales, deshidratación, fiebre, leucocitosis, colitis pseudomembranosa o megacolon tóxico asociado con infección por . if icile.

En una modalidad adicional, la invención proporciona polipéptidos, ácidos nucleicos, anticuerpos o composiciones para uso en la prevención o tratamiento de diarrea, diarrea asociada con antibióticos (AAD), dolor abdominal, fiebre, leucocitosis, colitis pseudomembranosa o megacolon tóxico asociado con infección por . c e para administración secuencial, simultánea o concomitante con un compuesto antibiótico.

En una modalidad, la invención proporciona el uso de un polipéptido, ácido nucleico, anticuerpo o composición de la invención en la elaboración de un medicamento para evitar o tratar una infección por C. i ici e o para el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de . i icile, o para el tratamiento, prevención o reducción de colonización del intestino por . i i i en un sujeto.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para evitar o tratar una infección por . i ficile en un mamífero o para el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de . , o en el tratamiento, prevención o reducción de la colonización del intestino por C. ifficile que comprende la etapa de administrar: (a) por lo menos un polipéptido que comprende, que consiste esencialmente o que consiste de una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de la SEC ID NOS: 79, 81, 93, 105, 111, 113, 125, 133, 139, 141, 153, 165, 171, 173, 185, 187, 189, 300, 322, 357, 359, 361, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463 y 465, de manera más preferible que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 79, 139, 133, 433, 111, 171, 113 y 173 (b) por lo menos un ácido nucleico el cual codifica para una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo mencionado en el inciso (a), y/o (c) por lo menos un anticuerpo capaz de unirse a una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo mencionado en el inciso (a) al sujeto.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para evitar o tratar una infección por . c e o para el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de . c e o para el tratamiento, prevención o reducción de colonización del intestino por . c e en un sujeto, que comprende la etapa de administrar por lo menos un ácido nucleico que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 78, 80, 92, 104, 110, 112, 124, 132, 138, 140, 152, 164, 170, 172, 184, 186, 188, 356, 358, 360, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462 y 464 al sujeto, que preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 78, 132, 138, 432, 110, 170, 112 y 172.

En un método para evitar o tratar infección por . difficile o para el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de . c e o para el tratamiento, prevención o la reducción de colonización del intestino por C. ifficile en un sujeto que comprende la etapa de administrar por lo menos un anticuerpo, el anticuerpo preferiblemente es un anticuerpo neutralizante.

Como se describe en lo anterior, las combinaciones de los antígenos a los que se hace referencia en lo anterior con uno o más antígenos adicionales los cuales proporcionan un efecto protector contra C. difficile o contra CDAD son los que se prefieren. Las combinaciones y composiciones que comprenden estas combinaciones se describen en otra parte en este documento y por lo tanto se pueden utilizar igualmente en los métodos anteriores. Las combinaciones de los antígenos a los que se hace referencia en lo anterior preferiblemente se elaboran con antígenos ToxB_GT y TcdA, incluso de manera más preferible antígenos ToxB-GT y ToxAp5_6. Los métodos de la invención de esta manera incluyen métodos en los cuales uno o más antígenos adicionales los cuales proporcionan un efecto protector contra . i ici e o contra CDAD también se administran, prefiriéndose aquellos antígenos que son ToxB-GT y ToxAp5_6. Las moléculas de nucleótidos que codifican para estos antígenos también se pueden utilizar así como los anticuerpos los cuales se unen a estos antígenos, como se describe en otra parte. En todos los casos en donde se utiliza más de un antígeno (o molécula nucleotídica o anticuerpo), los antígenos (o moléculas nucleotídicas o anticuerpos) se pueden administrar secuencialmente, de manera simultánea o por separado.

En otra modalidad la invención proporciona un método para evitar o tratar una infección por C. iffici e o para el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de C. ifficile , o para el tratamiento, prevención o la reducción de colonización del intestino por . ifficile en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una composición de la invención al sujeto.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para evitar o tratar una infección por . i ici e o para el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de . i i e, o para el tratamiento, prevención o la reducción de la colonización del intestino por . i icile en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una composición de la invención al sujeto en donde la composición comprende por lo menos uno o varios portadores y/o excipientes farmacéuticos.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para evitar o tratar una infección por . i fici e o para el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de . ifficile, o para el tratamiento, prevención o la reducción de la colonización del intestino por C. ifficile en un sujeto, que comprende la etapa de administrar una composición de la invención al sujeto en donde la composición es una composición farmacéutica de vacuna. El método se puede utilizar para generar una respuesta inmunitaria, o para evitar o tratar una infección por C. i ici e o para el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de . i ici e o para el tratamiento, prevención o la reducción de colonización del intestino por C. i i i en un sujeto. Los métodos de la invención también pueden comprender adicionalmente administración de un antibiótico. . i ici e también se sabe que infecta una gama de mamíferos, tanto salvajes como domésticos. La enfermedad es muy similar a la observada en humanos, pero la heterogeneidad de aislados que se han observado es menor [2]. Las composiciones y métodos de la invención de esta manera se pueden utilizar para tratar mamíferos tales como caballos, cerdos y vacas, por ejemplo en donde se ha demostrado infección por . iffici e .

En algunas modalidades, el mamífero recientemente ha recibido antibióticos, está recibiendo actualmente antibióticos o se encuentra en vías de recibir antibióticos. Los mamíferos particularmente preferidos son primates, de manera más preferible humanos. El humano puede ser un niño (por ejemplo, un bebé o lactante), un adolescente o un adulto. Una composición destinada para niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para determinar seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc. El humano puede estar experimentando tratamiento en hospital.

Las vacunas preparadas de acuerdo con la invención se pueden utilizar para tratar a niños y adultos humanos. De esta manera, un humano puede tener menos de un año de edad, de 1 a 5 años de edad, de 5 a 15 años de edad, de 15 a 55 años de edad o por lo menos 55 años de edad. Los humanos que reciben las vacunas pueden ser ancianos (por ejemplo, >50 años de edad, _> 60 años de edad y preferiblemente >65 años de edad), jóvenes (por ejemplo, 5 años de edad), pacientes hospitalizados, trabajadores relacionados con la higiene y la salud, personal de servicio armado y militares, mujeres embarazadas, pacientes enfermos de manera crónica o inmunodeficientes. Las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos, no obstante, se pueden utilizar de manera más general en una población.

Las vacunas producidas por la invención se pueden administrar a humanos sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional del cuidado de la salud o un centro de vacunación) con otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna de influenza, una vacuna del sarampión, una vacuna de paperas, una vacuna de rubéola, una vacuna de MMR, una vacuna de varicela, una vacuna de MMRV, una vacuna de difteria, una vacuna de S, aureus, una vacuna de tétanos, una vacuna de pertussis, una vacuna DTP, una vacuna de H, influenzae tipo B conjugada, una vacuna de poliovirus inactivada, una vacuna de virus de hepatitis B, una vacuna de conjugado meningocócico (tal como la vacuna tetravalente A-C-W135-Y), una vacuna del virus sincicial respiratorio, etc.

La invención también proporciona un kit que comprende una composición de la invención. El kit puede comprender además uno o más de lo siguiente: instrucciones, jeringa u otro dispositivo de suministro, adyuvante, antibiótico o una solución de formulación farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona un dispositivo de suministro llenado previamente con una composición de la invención.

Una manera de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico involucra monitorear la infección de C. difficile después de la administración de las composiciones de la invención al mamífero. Una manera de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico involucra monitorear respuestas inmunitarias, de manera sistemática (por ejemplo, al monitorear el nivel de producción de IgGl e IgG2a) y/o mucosamente (por ejemplo, al monitorear el nivel de producción de IgA) contra los polipéptidos en las composiciones de la invención después de administración de la composición. Típicamente, las respuestas de anticuerpo séricos específicas para polipéptidos se determinan posterior a la inmunización pero antes de la exposición mientras que las respuestas de anticuerpo mucosal específicos de polipéptidos se determinan después de la inmunización y antes de la exposición. Otra manera de determinar la inmunogenicidad de las composiciones de la presente invención es expresar las proteínas recombinantemente para cribado de suero de mamífero o secreciones de mucosa por inmunotransferencia y/o microarreglos. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra de mamífero indica que el mamífero ha generado una respuesta inmunitaria a la proteína en cuestión. Este método también se puede utilizar para identificar polipéptidos inmunodominantes y/o epítopos dentro de los polipéptidos. La eficacia de las composiciones de vacuna también se puede determinar in vivo al exponer modelos animales a infección por C. difficile, por ejemplo, cobayos o ratones, con las composiciones de vacuna.

Las composiciones de la invención generalmente se administrarán directamente a un mamífero. El suministro directo se puede llevar a cabo por inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o en el espacio intersticial de un tejido) o por vía mucosal, por ejemplo, por vía rectal, oral (por ejemplo, tableta, aspersión), vaginal, tópico, transdérmico o transcutáneo, intranasal, ocular, ótico, pulmonar u otra administración mucosal.

La invención se puede utilizar para inducir inmunidad sistémica y/o mucosal, por ejemplo, para inducir una inmunidad mejorada sistémica y/o mucosal. Típicamente la inmunidad mejorada sistémica y/o mucosal se refleja en una respuesta inmunitaria TH1 y/o TH2 mejoradas. Con frecuencia, la respuesta inmunitaria mejorada induce un incremento en la producción de IgGl y/o IgG2a y/o IgA.

La dosificación puede ser por un protocolo de dosis única o un protocolo de dosis múltiple. Se pueden utilizar dosis múltiples en un protocolo de inmunización primario y/o en un protocolo de inmunización de refuerzo. En un protocolo de dosis múltiple, las diversas dosis se pueden suministrar por la misma vía o por vías diferentes, por ejemplo, un cebado parenteral y un refuerzo mucosal, un cebado mucosal y un refuerzo parenteral, etc. Dosis múltiples típicamente se administrará por lo menos con una diferencia de 1 semana (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

Cepas y variantes Los polipéptidos de la invención originalmente se derivaron de C. difficile, cepa 630. De esta manera, se les puede denominar como antígenos de C. difficile. No obstante, será evidente para una persona experta en el ámbito que los polipéptidos de la invención son útiles para inmunización contra CDAD causada por cepas diferentes múltiples de C. difficile . De esta manera, la invención no se limita a composiciones que comprenden polipéptidos y/o fragmentos derivados únicamente de la cepa 630 y la cepa SM. Están disponibles secuencias de diversas cepas de C. difficile que incluyen aquellas de C. difficile cepas M20291(SM), C. difficile, cepa 196, C. difficile, cepa BI1, C. difficile cepa BI/NAP1/027 (ribotipo 027), C. difficile cepa E120 y C. difficile cepa M68, cepa 855, cepa QCD-63q42, cepa ATCC43255.

Las téenicas estándar de búsqueda y alineación se pueden utilizar para identificar en cualquier secuencia de genoma adicional el homólogo de cualquier secuencia particular a partir de la cepa de C. difficile, por ejemplo en la cepa ATCC 43255, la cepa CIP107932, la cepa QCD-23m63, la cepa QCD-32g58, la cepa QCD-37x79, la cepa 855, la cepa QCD-63q42, la cepa QCD-66c26, la cepa QCD-76w55, la cepa QCD-97b34, la cepa CD196, la cepa CDBI1, la cepa CDCF5, la cepa CDSM, la cepa CDN68, la cepa CDM120 o la cepa R20291. Además, las secuencias disponibles de la presente cepa de . i i i se pueden utilizar para diseñar cebadores para amplificación de secuencias homologas de otras cepas. De esta manera, la invención no se limita a polipéptidos de esta cepa sino más bien abarca a estas variantes y homólogos de otras cepas de . i i i así como variantes no naturales. En general, las variantes adecuadas de una SEC ID NO: particular incluye sus variantes alélicas, sus formas polimórficas, sus homólogos, sus ortólogos, sus parálogos, sus mutantes, etc.

De esta manera, por ejemplo, polipéptidos utilizados con la invención se pueden comparar con las SEC ID NOS: que en la presente incluyen una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) sustituciones de aminoácidos tales como sustituciones conservadoras (es decir, sustituciones de un aminoácido con otro el cual tiene una cadena lateral relacionada). Los aminoácidos codificados genéticamente generalmente se dividen en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptofano; y (4) polares sin carga, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina, fenilalanina, triptofano y tirosina algunas veces se clasifican de manera conjunta como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos únicos dentro de estas familias no tienen un efecto mayor sobre la actividad biológica. Los polipéptidos también pueden incluir uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) supresiones de aminoácidos únicos en relación con las secuencias SEC ID NO. Los polipéptidos también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) inserciones (por ejemplo, cada uno de 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos) en relación a las secuencias SEC ID NO.

De manera similar, un polipéptido utilizado con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que: (a) sea idéntica (es decir, 100% idéntica) a una secuencia descrita en el listado de secuencias; (b) comparta identidad de secuencia (por ejemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o mayor) con una secuencia descrita en el listado de secuencias; (c) tenga 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones (supresiones, inserciones, sustituciones) de un solo aminoácido las cuales pueden estar en ubicaciones separadas o ser contiguas, en comparación con las secuencias de los incisos (a) o (b); e implementados en la herramienta needle en el paquete EMBOSS [210] cuando se alinean con una secuencia particular a partir del listado de secuencias utilizando un algoritmo de alineación pareado, cada intervalo de movimiento de x aminoácidos desde la parte N-terminal a la C-terminal (tal como para una alineación que se extiende a p aminoácidos en donde p>x, en donde existen p-x+1 de tales intervalos) tiene por lo menos x.y aminoácidos alineados idénticos en donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200: y se selecciona de 0.50, 0.60, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 0.99; y si x.y no es un número entero, entonces se redondea hacia arriba, al número entero más cercano. El algoritmo de alineación de pareamiento preferido es el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch [211], utilizando parámetros implícitos (por ejemplo, con castigo por apertura de separación = 10.0, y con un castigo por extensión de separación = 0.5, utilizando la matriz de calificación EBLOSUM62).

En general, cuando un polipéptido de la invención comprende una secuencia que no es idéntica a una secuencia de C . difficile completa a partir del listado de secuencias (por ejemplo, cuando comprende un listado de secuencia con <100% de identidad de secuencia del mismo, o cuando comprende un fragmento del mismo), se prefiere que en cada instancia individual que el polipéptido pueda inducir un anticuerpo el cual reconozca la secuencia completa respectiva de . difficile. Cuando se utilizan polipéptidos híbridos, los antígenos individuales dentro del híbrido (es decir, las porciones -X-individuales) se pueden formar de una o más cepas. En donde n = 2, por ejemplo, X2 puede ser de la misma cepa que Xi o de una cepa diferente. En donde n = 3, las cepas pueden ser (i) Xi=X2=X3; (ii) Xi=X2¹X3; (iii) Xi¹X2=X3,· (iv) Xi¹X2¹X3 o (v) Xi=X3¹X , etc. Dentro del grupo (c), las supresiones o sustituciones pueden estar en la parte N-terminal y/o C-terminal o pueden estar entre las dos partes terminales. De esta manera, un corte es un ejemplo de una supresión. Los cortes pueden involucrar supresión de hasta 40 (o más) aminoácidos en la parte N-terminal y/o C-terminal.

En vista de lo anterior, los términos "antígeno de C. difficile" o "polipéptido de C. ifficile" incluye moléculas como se definen en lo anterior, por ejemplo, las cuales son variantes u homólogos de otras cepas de . difficile, o las cuales son variantes que no son naturales o que no se encuentran de modo natural de los polipéptidos o antígenos a los que se hace referencia en la presente y/o que se proporcionan en el listado de secuencias, y los cuales preferiblemente satisfacen los criterios de secuencia definidos en lo anterior.

La invención también proporciona polipéptidos que pertenecen a la familia de metalopeptidasas de zinc que tienen mutaciones que disminuyen la toxicidad de los polipéptidos. Los polipéptidos adecuados incluyen Difl53 (CD2830). Las mutaciones ejemplares que disminuyen la toxicidad incluyen una supresión de la totalidad o una porción del dominio de metaloproteasa de zincina y una mutación puntual en el dominio de metaloproteasa de zincina lo cual reduce la actividad de proteasa. La destoxificación se puede obtener por mutación de la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico codificante de estos polipéptidos utilizando cualquier método apropiado conocido en el ámbito, por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio. Preferiblemente, los polipéptidos pertenecen a la familia de metalopeptidasas de zinc comprende una o más sustituciones aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más mutaciones), en relación a la secuencia de polipéptidos de tipo silvestre que pertenecen a la familia de metalopeptidasas de zinc. Por ejemplo, el polipéptido Difl53 (CD2830) comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más mutaciones), por ejemplo, sustitución del número de aminoácido en las posiciones de aminoácidos 134, 142, 143, 146, 149, 150, 178, 184 y/o 208 en relación a la secuencia de polipéptidos de Difl53 (CD2830) de tipo silvestre de la SEC ID NO: 300 y 435. Por ejemplo, el polipéptido Difl53 (CD2830) puede comprender sustituciones en 1, 2, 3, 4 ó 5 posiciones que corresponden a los aminoácidos 134, 142, 143, 146, 149, 150, 178, 184 y/o 208 de la secuencia de polipéptidos de Difl53 (CD2830) de la SEC ID NO: 300 y 435. En particular, 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos en las posiciones que corresponden a los aminoácidos 134, 142, 143, 146, 149, 150, 178, 184 y/o 208 en relación a la secuencia de polipéptidos de Difl53 (CD2830) de tipo silvestre de la SEC ID NO: 300 y 435 puede estar sustituida, preferiblemente por residuos alanina (A), fenilalanina (F), arginina (R), serina (S). Los ejemplos de estos mutantes únicos de Difl53 (CD2830) son H142A, E143A, E143R, H146A, D149A, H150A, Y178F y C208S. Los ejemplos de mutantes dobles de Difl53 (CD2830) son H142A/H146A; H142A/Y178F, H142A/E143R; H142A/E143A; E142A/Y178F en relación a la secuencia de polipéptidos de CT153 (CD2830) de tipo silvestre de la SEC ID NO: 300 y 435. La invención proporciona también otros mutantes para el polipéptido de CT153 (CD2830), solo o en combinación: H142A/H150A y H143A/D149A. Los siguientes polipéptidos inmunogénicos destoxifidados preferiblemente retienen por lo menos un epítopo o fragmento inmunogénico de la SEC ID NO: 300 y 435.

La invención también proporciona bacteria C. c e que comprende mutaciones, particularmente bacteria de C. difficile en la cual uno o más de los polipéptidos detallados en los ejemplos han sido bloqueados en su expresión. Las téenicas para producir bacterias con expresión bloqueada son bien conocidas, y se ha reportado el bloqueo de expresión de cepas de C. difficile . Una mutación que bloquea expresión puede ser adecuada en la región codificante del gen o puede encontrarse dentro de las regiones de control de transcripción (por ejemplo, dentro de su promotor). Una mutación que bloquea la expresión reducirá el nivel de ARNm que codifica para el polipéptido a <1% del producido por la bacteria de tipo silvestre, de manera preferible <0.5%, de manera más preferible <0.1% y de manera mucho más preferible a 0%. La invención también proporciona una bacteria, tal como una bacteria de C. difficile que expresa de manera constitutiva un polipéptido de la invención. La invención también proporciona una bacteria Clostridium que comprende un gen que codifica para un polipéptido de la invención en donde el gen se encuentra bajo el control de un promotor inducible. Estas bacterias pueden ser útiles en pruebas y desarrollo o en la preparación de vacunas atenuadas.

Generalidades La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique en otro sentido, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la téenica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Véanse, por ejemplo [212 a 219, etc.]. En algunas implementaciones, el término "que comprende" se refiere a la inclusión del agente activo indicado, tal como los polipéptidos mencionados, así como la inclusión de otros agentes activos y portadores, excipientes, emolientes, estabilizantes, etc., farmacéuticamente aceptables, como se conocen en la industria farmacéutica. En algunas implementaciones, el término "consiste esencialmente de" se refiere a una composición cuyo único ingrediente activo es uno o varios de los ingredientes activos indicados, no obstante, se pueden incluir otros compuestos los cuales son para estabilización, conservación, etc., de la formulación pero que no están involucrados directamente en el efecto terapéutico del ingrediente activo indicado. El uso de la frase de transición "que consiste esencialmente de" significa que el alcance de una reivindicación debe interpretarse que abarca los materiales o etapas especificados que se mencionan en la reivindicación y que aquellos que no afecten materialmente una o varias de las características básicas y novedosas de la invención reivindicada. Véase al respecto Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (énfasis en el original); véase también MPEP § 2111.03. De este modo, el término "que consiste esencialmente de" cuando se utiliza en una reivindicación de esta invención no se pretende que sea interpretado a equivalente al término "que comprende". El término "que consiste de" y variaciones de los mismos incluye "que incluye" y "limitado a" a menos que se especifique de manera expresa en otro sentido. El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x significa, por ejemplo, x+10%; x+15%, x+4%, x+3%, x- 2%, x+1%.

Aunque algunas modalidades de la presente invención se han descrito y ejemplificado específicamente en lo anterior, no se pretende que la invención esté limitada a estas modalidades. Se pueden realizar diversas modificaciones en la misma sin por esto apartarse el alcance y espíritu de la presente invención como se establece en las siguientes reivindicaciones.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: IDENTIFICACIÓN DE POLIPÉPTIDOS DE C. difficile Con el fin de identificar polipéptidos para uso en el suministro de vacunas contra C. difficile, los inventores analizaron el ensamble completo de aproximadamente 3780 polipéptidos predichos codificados por C. difficile, 630 utilizando el programa PSORT (220). Esto identificó proteínas con una localización subcelular periférica predicha. En particular se identificaron los siguientes grupos: • Proteínas asociadas a pared celular, identificadas por la presencia del motivo típico similar a LPXTG el cual representa el sitio de unión a la proteína con el lado externo de la pared de la célula bacteriana.

• Proteínas extracelulares, identificadas por la presencia de un péptido líder N-terminal que típicamente dirige los productos proteínicos al medio extracelular por similitud de secuencia u otras proteínas bacterianas que se sabe son exportadas.

• Proteínas con una ubicación en la superficie bacteriana.

Otros polipéptidos se seleccionaron por su homología de secuencia con factores de virulencia conocidos y motivos polipeptídicos involucrados en la interacción con el hospedador. También se han identificado varios polipéptidos de función desconocida. Los polipéptidos después se probaron y cribaron utilizando la metodología descrita en los siguientes ejemplos: EJEMPLO 2; IDENTIFICACIÓN DE POLIPÉPTIDOS SECRETADOS DE C. di icile Se realizó preparación del secretoma de Clostridium difficile como sigue: Se hace crecer C. difficile (cepas 630 y Stoke Mandeville) tanto en infusión cerebro corazón (BHI, por sus siglas en inglés) o medio definido químicamente (CDM, por sus siglas en inglés), M.N. Mickelson, . of. Bact., 1964, 88:158-164). Las bacterias se colocaron en placas durante la noche sobre una placa de agar y después se hicieron crecer en 100 mi de medio apropiado bajo condiciones aeróbicas a 37°C hasta fase semilogarítmica (OD6oo de 0.5) o hasta que alcanzaron la fase estacionaria temprana (ODeoo de 0.9). Las bacterias se removieron por centrifugación a 3500 x g durante 10 min a 4°C y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de tamaño de poro de 0.22 mm (Millipore). Las proteínas presentes en el sobrenadante se precipitaron o/n con ácido tricloroacético 10%, p/v, desoxicolato de sodio 0.04% p/v. Las proteínas se resuspendieron en bicarbonato de amonio 50 mM que contiene ditiotreitol 5 mM, Rapigest® (Waters), 0.1%, calentado a 90°C durante 10 min y digerido o/n con 2 mg de tripsina (Promega). La digestión proteolítica se detuvo al agregar ácido fórmico 0.1%, v/v. Los péptidos resultantes se analizaron subsecuentemente por espectrometría de masas.

La identificación de proteínas por nano-CL/EM/EM se realizó como sigue: se separaron péptidos mediante nano-CL en un sistema NanoAcquity UPLC (Waters) conectado a un espectrómetro de masas de ionización por electroaspersión Q-ToF Premier (ESI) equipado con una fuente de nanoaspersión (Waters). Las muestras se cargaron en una columna NanoAcquity 1.7 pm BEH 130 Cis (75 pm X 25 cm, Waters) a través de una columna de trampa NanoAcquity 5 pm SymmetryMR Cíe (180 pm X 20 mm, Waters). Los péptidos se eluyeron en un gradiente de 120 min de 2 a 40% de una solución de acetonitrilo 98%, ácido fórmico 0.1% a un caudal de 250 nl/min.

Los péptidos eluidos se sometieron a una adquisición dependiente de datos automatizada utilizando el programa MassLynx, versión 4.1 (Waters), en el cual se utilizó la exploración de análisis EM para seleccionar automáticamente péptidos multicargados sobre el intervalo de relación m/z de 300-2,000 para fragmentación EM/EM adicional. Hasta cinco componentes diferentes se sometieron a fragmentación EM/EM al mismo tiempo. Después de la adquisición de datos, los espectros EM/EM individuales se combinaron, se alisaron y se sometieron a centroide utilizando ProteinLynx, versión 3.5 (Waters) para obtener el archivo de lista pico. Se utilizó la aplicación Mascot Daemon (MatrixScience Ltd., Londres, Reino Unido) para el envío automático de archivos de datos a una versión de MASCOT (versión 2.2.1) que corre en un servidor local.

La identificación de proteínas se obtiene al buscar en una base de datos curada localmente que combina datos de secuencia de proteína derivados de la sección de Clostridium difficile de la base de datos NCBInr, el número total de secuencias y residuos es de 71233 y 21677396, respectivamente. Los parámetros de búsqueda MASCOT se establecieron en: (i) 1 como número de escisiones perdidas permitidas para digestión por tripsina, (ii) oxidación de metionina y desamidación de glutamina y asparagina como modificaciones variables, (iii) 0.2 Da como tolerancia de péptido, y (iv) 0.2 Da de tolerancia EM/EM. Únicamente se consideraron los aciertos significativos, como se definen por la calificación de MASCOT y el sistema de probabilidad. Los umbrales de calificación para aceptación de la identificación de péptido fueron .>33 para digestión por tripsina.

Los inventores descubrieron que los polipéptidos Difl83, Difl92 y Difl53 se secretaron y están presentes en el sobrenadante derivado de la cepa 630. Además, los inventores descubrieron que las siguientes proteínas están presentes en el sobrenadante de la cepa 20291: Difl83, Difl92 y Difl53 y los fragmentos Dif208A y Dif208B. Estos resultados se resumen en la figura 2. Estas proteínas/polipéptidos secretados son objetivos de vacuna útiles particularmente para uso en la reducción o prevención de colonización bacteriana o para el uso en reducir daño a tejido tal como necrosis en el sitio de infección.

EJEMPLO 3: ANÁLISIS DEL LISADO DE CÉLULAS POR RMN Las células bacterianas que presentan vectores para expresión de proteína recombinante inicialmente se lavaron por resuspensión en 800 ml de amortiguador M9 IX, pH 7.4, centrifugado (51 a 3,000 rpm) y el sobrenadante se desechó. El sedimento bacteriano remanente después se resuspendió en 600 ml de amortiguador M9, las células se lisaron por medio de sonicado y después se centrifugaron a 4°C (20' @ 14,000 rpm). El sobrenadante después se aísla para análisis por RMN. Se agrega D2O 10% (en volumen) a la muestra para análisis por RMN. Se adquirieron los experimentos HSQC rápido y Trosy utilizando un RMN de 900 u 800 MHz y se procesó utilizando el programa topspin (figura 3).

A partir del análisis por RMN, los espectros HSQC para Dif44 mostraron una buena dispersión de las imágenes con intensidad aproximadamente igual en la figura 4 lo que indica que Dif44 está bien plegado. Los resultados para el análisis por RMN del lisado de células se resumen en la figura 2. Estos resultados identifican polipéptidos que tienen la susceptibilidad a mantener de modo estable su estructura tridimensional particularmente cuando se expresan en un ambiente heterólogo tal como el citoplasma de Escherichia coli - un rasgo útil para el suministro de un componente de vacuna de subunidad recombinante.

EJEMPLO 4: CLONACIÓN, EXPRESIÓN, PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES Y FRAGMENTOS Para preparar proteínas recombinantes aisladas, los ORF de Clostridium difficile se amplificaron por PCR utilizando oligonucleótidos específicos y ADN cromosómico de C. difficile como plantilla. Los cebadores utilizados para amplificaciones de genes se resumen en la figura 1. Los productos de PCR resultantes se clonaron en pET15b (Novagen) utilizando el método PIPE (Klock, H.E., et al . (2008), Proteins 71:982-994), que consiste en la amplificación por PCR del vector de clonación (V-PCR) y en la amplificación por PCR del inserto (I-PCR). Después se mezclan 1 ml de V-PCR y 1 ml de I-PCR y se transforman en células HK100 químicamente competentes (Klock, H. E., et al . (2005) J. Struct . Funct . Genomics 6, 89-94}. Las reacciones I-PCR se ajustan para que contengan 1 mM cada una de los cebadores directos e inversos, amortiguador de reacción de ADN polimerasa, Pfu clonado lx, 2.5 unidades de ADN polimerasa Turbo Pfu (Stratagene), 200 mM de cada dNTP (Invitrogen) y 50 ng de plantilla de ADN genómico. Las reacciones se llevaron a cabo como sigue: desnaturalización inicial durante 2 min a 95°C, después 25 ciclos de 95°C durante 30 s, 55°C durante 45 s y 68°C durante 3 minutos, seguido por un enfriamiento final a 4°C. Las reacciones de V-PCR fueron idénticas a las reacciones de I-PCR pero las etapas a 68°C duraron 14 min y 2 ng del plásmido pET15b se utilizaron como plantilla de ADN. Los transformantes correctos se seleccionaron por cribado de PCR y secuenciado del ADN plasmídico de las uniones vector-inserto. El plásmido correcto después se prepara a partir de clones HK100 seleccionados y se utiliza para transformar células BL21 (DE3)Tlr (Sigma) con el fin de permitir la expresión de proteína.

Las proteínas clonadas que se expresan, los clones de BL21(DE3)Tlr que contienen las construcciones pET15b se hacen crecer en medio LB que contiene 100 mg/ml de ampicilina a 37°C hasta ?qboo = 0.5. La expresión de proteína después de induce al agregar IPTG 1 mM y al hacer crecer a la misma temperatura durante 3 h adicionales. Las extracciones de proteína convencional y SDS-PAGE se realizaron para verificar la expresión de proteína .

EJEMPLO 5; INMUNIZACIÓN DE RATONES CON PROTEÍNAS Y FRAGMENTOS RECOMBINANTES DE C. difficile Para cada polipéptido y fragmento descrito en la figura 1, se utilizaron dos grupos de 4 ratones CD1 hembra. Cada grupo se inmunizó con 10 mg de antígeno, se formuló en adyuvante de alumbre (grupo 1) o adyuvante MF59. Las inmunizaciones se realizaron intraperitonealmente los días 0, 21 y 35. La extracción final de sangre y el sacrificio se realizaron el día 49.

Se utilizaron sueros contra polipéptidos recombinantes en la caracterización de los polipéptidos de la invención por Western blot, microscopía confocal y análisis FACS descritos más adelante. Los sueros también se utilizaron en experimentos de protección pasiva para identificar cuales polipéptidos son más adecuados para uso en la preparación de anticuerpos neutralizantes.

EJEMPLO 6: ESTUDIOS DE EXPOSICIÓN DE SUPERFICIE MEDIANTE WESTERN BLOT Con el fin de demostrar que las proteínas seleccionadas se expresan en la superficie por células de C. i ici e, se utilizaron en diferentes cribados los sueros generados contra cada proteína recombinante. Se realizó análisis de Western blot sobre fracciones bacterianas para verificar la presencia de los polipéptidos de la invención en fracciones de S-capa (que contiene proteínas ancladas de modo no covalente de la pared celular) y en extractos de pared celular total (que contiene todas las proteínas de la pared celular); las proteínas purificadas se utilizaron como control positivo de especificidad de sueros. . difficile, cepa 630 se hace crecer durante la noche en medio BHI y se recolecta por centrifugación para preparación de S-capa y extractos de pared celular total. Los extractos de S-capa se preparan utilizando incubación en glicina con pH bajo; brevemente, se incuba el sedimento bacteriano con glicina 0.2 M, pH 2.2 e inhibidores de proteasa a temperatura ambiente durante 20 min. La suspensión bacteriana se centrifuga y el sobrenadante que contiene las proteínas de superficie se neutraliza por adición de base Tris 2 M.

Los extractos de pared celular total se prepararon por incubación de bacterias con 60 mg/ml de mutanolisina, 1 mg/ml de lisozima e inhibidores de proteasa a temperatura ambiente durante 2 horas. La suspensión bacteriana se centrifugó y el sobrenadante que contiene las proteínas de superficie se recolectó. Las proteínas en S-capa y los extractos de pared celular se sometieron a SDS-PAGE y Western blot. Todos los sueros de ratón se generaron contra cada proteína recombinante y se utilizaron en una dilución 1/1000, seguido por anti-HRP de ratón a una dilución de 1/2500.

Análisis de Difl83 y preparación de fracciones de células de C. i i i e Para preparar un "extracto de células totales", la cepa 630 se hace crecer en TYM hasta O?eoo, 1.3. Las células se recolectaron por centrifugación a 400 rpm durante 10 minutos y se lavaron una vez en PBS. El sedimento se resuspende en PBS. Con el fin de aislar la "fracción de pared celular" que contiene las proteínas de S-capa junto con otras proteínas que están presentes dentro de la pared celular, la cepa 630 se hace crecer en 20 mi de caldo TYM hasta OD6oo de 1.3. Las células se recolectaron por centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos a 4°C y se lavaron una vez en PBS y una vez en amortiguador Tris-sacarosa (Tris-HCl 10 mM, pH 6.9, MgCl210 mM, sacarosa 0.5 M) . El sedimento después se incuba en 2 mi de amortiguador de digestión (amortiguador Tris-sacarosa con 250 yg/ml de mutanolisina e inhibidores de proteasa) durante 2 h a 37°C con agitación giratoria ligera. El sobrenadante de reacción, que contiene la "fracción de pared celular" se separa por centrifugación del sedimento que contiene la "fracción de protoplastos ". Los protoplastos se resuspenden en PBS y se lleva a cabo la lisis mediante congelamiento-recalentamiento de la muestra 5 veces.

Para la preparación de la "fracción de S-capa" que contiene únicamente proteínas asociadas a la S-capa, la cepa 630 se hace crecer en 50 mi de caldo BHIS durante la noche. Las células se separan del medio por centrifugación a 3500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavan en PBS y se incuban en 0.5 mi de HCl 0.2 M, pH 2.2 durante 20 min a temperatura ambiente con agitación ligera, en presencia de inhibidores de proteasa. La suspensión bacteriana se centrifuga a velocidad máxima a 4°C durante 10 min. El sobrenadante, que contiene las proteínas S-capa se separa y el pH se neutraliza por adición de base Tris 2 M. Para el análisis de Western blot las fracciones se normalizan en base en el volumen de cultivo inicial.

Análisis de Western blot: Para análisis de proteína de lisados de células completas, fracciones de células, fracciones de sobrenadante y proteínas recombinantes purificadas, las muestras se mezclan con el amortiguador de muestra que contiene agente reductor y se calienta durante 10 min a 100°C antes del cargado. Las muestras se separan por SDS-PAGE utilizando el sistema de gel NuPAGE (Invitrogen) y se transfieren sobre membranas de nitrocelulosa para análisis de Western blot. Las membranas se bloquean 3 horas con PBS-polvo de leche 10% a 4°C. Los anticuerpos primarios utilizados son antisueros de ratón policlonales generados contra proteínas marcadas con His recombinante. La totalidad de los anticuerpos primarios se diluyen 1:1000 y se incuba en 1 h y 30 min a 37°C; el anticuerpo secundario es anticuerpo de chivo anti-suero de ratón conjugado con peroxidasa de rábano (1:5000; Dako) y se incuba a temperatura ambiente durante 45 min. La detección de anticuerpos unidos se lleva a cabo con el equipo Super Signal Chemiluminiscent Substrate (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los polipéptidos Dif44, Dig51 y Difl92, reconocidos por los sueros como se ha mostrado, están expuestos en la superficie de la célula y son accesibles al sistema inmunitario de un sujeto y estos antágenos por lo tanto también presentan objetivos de vacuna útiles, particularmente para la prevención de infección, reducir colonización o diseminación de infección (figura 5).

EJEMPLO 6A: DETERMINACIÓN DE EXPOSICIÓN DE SUPERFICIE POR MICROSCOPIA CONFOCAL Con el fin de determinar si las proteínas seleccionadas se expresan en la superficie por células de C. difficile, se utilizan en cribados adicionales sueros generados contra cada proteína recombinante. La microscopía confocal sobre bacterias fijas se desarrolló para evaluar la accesibilidad de anticuerpos específicos a cada proteína expuesta predicha. El ADN bacteriano se marcó con DAPI fluorescente azul; las proteínas de superficie se tiñeron con sueros específicos seguido por anticuerpos secundarios conjugados con un tinte tojo o verde.

Para verificar la exposición de superficie de cada polipéptido seleccionado, se hace crecer . e, cepa 630 en B1H hasta una O?boo de 0.5 y se lava en PBS. Los sedimentos bacterianos se fijan con PFA 2% durante 20 min a temperatura ambiente y se colocan por puntos sobre portaobjetos con cámara, recubiertos con polilisina. Las bacterias después se bloquean con BSA 2% durante 15 min y se incuban con suero generado contra cada proteína recombinante diluida 1/500 en BSA 2% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bacterias después se tiñen con anticuerpos conjugados de chivo anti-ratón Alexa Fluor 568 (Molecular Probes) durante 30 min a RT. El reactivo antiextinción de oro con DAPI (Molecular Probes) después se utiliza para montar los cubreobjetos.

Los inventores encontraron que los sueros generados contra Dif44, Dig51, Difl53, Difl83, Difl92, Dif208 Y DIF232 son capaces de reconocer estas proteínas en la superficie de la cepa 630. La figura 2 en la columna intitulada microscopia confocal muestran las proteínas las cuales están expuestas en la superficie y detectadas en los extractos de C. c e, cepa 630. Nuevamente, estos antígenos, los cuales pueden estar expuestos en la superficie y accesibles al sistema inmunitario representan objetivos de vacuna útiles.

EJEMPLO 7: INTERACCIÓN CON CÉLULAS EPITELIALES HUMANAS Para evaluar si los polipéptidos seleccionados son capaces de unirse a células epiteliales humanas, cada uno de los polipéptidos recombinantes se prueba en dos análisis de unión: 1. Análisis FACS: Células Vero que se separan de manera no enzimática utilizando solución de disociación celular (CDS, Sigma), cosechadas y resuspendidas en medio RPMI suplementado con FBS 1%. Se colocan aproximadamente 105 células en microplacas de 96 pozos y se mezclan con diferentes concentraciones de proteínas purificadas que varían de 500 a 0.24 mg/ml o medio solo durante 1 h a 37°C o a 4°C, se mezclan cada 20 minutos para evitar la unión de las células. El exceso de proteínas no unidas se remueve por lavado dos veces con PBS + FBS 2% y centrifugación. Las células se incuban subsecuentemente durante 1 h a 4°C con sueros generados contra cada polipéptido recombinante. Las células se lavan dos veces en PBS + FBS 2% y se incuban durante 30 min a 4°C con anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con R-ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Las células se lavan subsecuentemente en PBS + FBS 2% y se resuspenden en PBS. Los inventores encontraron que Dif208A, Dif208B, Dif232 y Digl92 tienen la capacidad de unirse a la superficie de células Vero. Como ejemplo, el análisis FACS de Dif232 se muestra en la figura 6 y la totalidad de los resultados del análisis FACS se resumen en la figura 7. Los polipéptidos los cuales se unen a células humanas pueden ser buenos candidatos para limitar o evitar la colonización de C. i i i . 2. Microscopía confocal: Se siembran células Vero y Caco-2 en portaobjetos con cámara en medio DMEM suplementado con FCS 10% y se incuban durante 24 h. Las células se incuban con 20 mg/ml de cada polipéptido diluido en DMEM + FCS 10% durante 1 h a 37°C. El exceso de polipéptidos no unidos se remueve por dos lavados en PBS + BSA 2% y las células se fijan con PFA 2% durante 20 min a temperatura ambiente. Las células después se bloquean con PBS + BSA 2% durante 15 min y se incuban con sueros generados contra cada proteina recombinante diluida 1/500 en PBS + BSA 2% durante 1 hora a temperatura ambiente. Los polipéptidos después se tiñen con anticuerpos conjugados anti-ratón Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) y la actina celular se tiñe con conjugado de faloidina-Alexa Fluor 568. Un reactivo de antiextinción de oro con DAPI (Molecular Probes) después se utiliza para montar los cubreobjetos.

Con el fin de confirmar los resultados FACS, los polipéptidos los cuales son positivos para FACS se prueban mediante análisis de unión por microscopía confocal sobre células Vero. Además, el análisis se extendió a células Caco-2 intestinales humanas. Los polipéptidos los cuales se unen a células humanas pueden ser buenos candidatos para limitar o evitar la colonización de C. i ic e. Los inventores demostraron que Dif208A, Dif51 y Difl92 se unen claramente a la membrana celular mientras que Dif208A se asocia potencialmente a la membrana celular (figura 7). Estos polipéptidos han demostrado que se unen a células humanas y pueden ser buenos candidatos para limitar o evitar la colonización de C. difficile.

EJEMPLO 8; INTERACCIÓN DE LOS COMPONENTES DE MATRIZ EXTRACELULAR (ECM) Se recubren placas con 10 yg/ml de cada componente de ECM y se incuban O/N a 4°C. Las placas después se lavan y bloquean con 2.7% durante 2 horas a 37°C. Después del lavado, las placas se almacenan a 4°C durante por lo menos 16 horas. Se agregan a los pozos recubiertos 20 a 50 yg/ml de polipéptido recombinante y se incuban durante 2 horas a 37°C.

Los pozos se lavan y se incuban con sueros generados contra cada proteína recombinante durante 90 minutos a 37°C, seguido por incubación con el anticuerpo secundario conjugado a HRP durante 90 minutos a 37°C. La solución de sustrato HRP se agrega a los pozos y las reacciones se detienen al agregar H2SO412.5%. Las placas se leen a 490 nm por medio de un lector de placa ELISA.

Los polipéptidos los cuales son capaces de unirse a componentes extracelulares pueden ser buenos candidatos para limitar o evitar la colonización del tejido del intestino. Por ejemplo, el polipéptido Dif208 contiene un dominio que se une a matriz extracelular. Para verificar si estos dominios son funcionales en mediar la unión a componentes ECM específicos, los inventores han realizado estudios de ELISA. Placas de ELISA se recubren con componentes ECM purificados y se incuban con proteínas recombinantes diluidas de manera seriada que varían de 2 mg a 31.25 ng/pozo. Se analizan en este estudio dos subdominios de proteína Dif208 (Dif208A y Dif208B). Los inventores han descubierto que los subdominios Dif208 se unen a la totalidad de los componentes de ECM (figura 9). Estos polipéptidos son capaces de unirse a componentes extracelulares y pueden ser buenos candidatos para limitar o evitar la colonización del tejido del intestino.

EJEMPLO 9i CONSERVACIÓN DE Difl92 Y Difl44 EN AISLADOS CLÍNICOS DE C. d if i Se estudió la presencia de Difl92 y Dif44 mediante análisis de Western blot de extractos de células totales en preparaciones de S-capa de C. i ici e cepas 630 (ribotipo 012), R20291 (ribotipo 027) y M120 (ribotipo 078) y aislados clínicos de C. i ici e que representan seis de los ribotipos PCR prevalentes (001, 014, 018, 012, 078, 126) de diferentes regiones de Italia (figura 8). La preparación de lisados de célula completa se obtiene por un método basado en un procedimiento de congelamiento-recalentamiento descrito por Fagan y Fairweather (Fagan, R., y Fairweather, H. J. Biol Chem. 286(31):27483-93, 2011). Brevemente, los cultivos de C. difficile se recolectan por centrifugación a 5,000 x g durante 10 min a 4°C y los sedimentos se congelan a -20°C. Las bacterias se recalientan, se resuspenden en PBS hasta una O?eoonm de 20 y se incuban a 37°C durante 10 min. Se llevan a cabo tres ciclos de congelamiento-recalentamiento con el fin de obtener lisis consistente y reproducible. La extracción de la S-capa se realiza posterior al método descrito previamente (Fagan, R., y Fairweather, N. Methods Mol Biol 646, 117-134, 2010).

Las proteínas de pared celular se preparan a partir de cultivos que crecen en caldo BHI a fase estacionaria (O?eoonm ¾ 1). Los extractos se separan por SDS-PAGE, seguido por Western blot con anticuerpos específicos generados en ratones. Los anticuerpos primarios se utilizan a una dilución de 1:2,000 y se detectan mediante la utilización de anticuerpo de conejo anti-ratón conjugado a peroxidasa de rábano a 1:20,000 (Dako) y el sustrato quimioluminiscente SuperSigna West Pico (Thermo Scientific Pierce). Se utiliza un marcador para visualización directa de bandas estándar (MagicMark XP Western Protein Standard, Invitrogen) para cálculo del peso molecular de proteína directamente sobre las transferencias Western. La expresión de Difl92 y Dif44 se detectó en extractos totales de la totalidad de los aislados clínicos analizados e indica que estos polipéptidos están conservados y estos polipéptidos por lo tanto también representan objetivos de vacuna útiles, particularmente para la prevención de infección, reducir colonización o dispersión de infección.

EJEMPLO 10: RECONOCIMIENTO DE POLIPEPTIDOS RECOMBINANTES POR ANTICUERPOS DE RATÓN Para identificar adicionalmente proteínas de superficie y secretadas que sean importantes en la patogénesis clostridial y capaces de inducir una respuesta de anticuerpo in vivo, los inventores realizaron un análisis adicional de sobrenadantes de cultivo, nuevamente preparados a partir de la cepa clínica 630. No hay lisis celular detectable (datos no mostrados).

Inmunización de ratones con sobrenadante concentrado: Para obtener el suero "antisobrenadante" se hace crecer C. difficile 630 en medio CDMM (Karasawa et al . , 1995) realizando dos diluciones seriadas. Se obtiene un cultivo final con una O?boo de 0.5. El medio se separa de las bacterias por centrifugación seguido por filtración a través de filtros de 0.22 m y las proteínas contenidas en el mismo se concentran utilizando concentradores centrífugos de Vivaspin MWCO 5000 Da (Sigma). La concentración resultante de proteína se calculan por el análisis de ácido bicinconiníco (Pierce, Rockford, IL, USA). Se inmunizan ocho ratones con 20 mg de proteínas por dosis y los sueros resultantes se acumulan para ser utilizados en análisis Western.

Análisis de Western blot: Una cantidad de 50 ng de cada proteína recombinante se carga en un gel NuPAGE y se lleva a cabo análisis de Western blot como sigue, utilizando como un anticuerpo primario suero de ratones inmunizados con sobrenadante concentrado. Las muestras que contienen proteínas recombinantes purificadas se mezclan con amortiguador de muestra que contiene agente reductor y se calientan durante 10 min a 100°C antes del cargado. Las muestras se separan por SDS-PAGE utilizando el sistema de gel NuPAGE (Invitrogen) y se transfieren sobre membranas de nitrocelulosa para análisis de Western blot. Las membranas se bloquean 3 horas con PBS-polvo de leche 10% a 4°C. Los anticuerpos primarios utilizados son antisueros de ratón policlonales generados contra proteínas etiquetadas con His recombinantes. La totalidad de los anticuerpos primarios se diluyen 1:1000 y se incuban 1 h y 30 min a 37°C; el anticuerpo secundario es suero de chivo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano (1:5000; Dako) y se incuba a temperatura ambiente durante 45 min. La detección de anticuerpos unidos se lleva a cabo con Super Signal Chemiluminiscent Substrate (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para probar que los polipéptidos expuestos en superficies seleccionados son capaces de inducir una respuesta de anticuerpo in vivo, se analizó la presencia de anticuerpos específicos en los sueros de ratones. Los polipéptidos purificados se analizaron por Western blot utilizando sueros de ratones inmunizados con sobrenadantes concentrados. Los sueros de ratones inmunizados con sobrenadantes de bacterias C. difficile contienen anticuerpos contra, capaces de reconocer polipéptidos recombinantes de C. difficile y fragmentos. Los polipéptidos y fragmentos purificados de Difl83 claramente se detectan por anticuerpos confirmando la accesibilidad de estas proteínas durante la infección y el ser adecuadas como objetivos de vacuna (figura 4).

EJEMPLO 11: RECONOCIMIENTO DE POLIPÉPTIDOS RECOMBINANTES POR ANTICUERPOS DE HÁMSTER Una cantidad de 100 ng de cada proteína recombinante se somete a SDS-PAGE y Western blot. Las membranas se incuban con sueros de hámster a una dilución 1/200, seguido por HRP anti-ratón a una dilución 1/10,000. Se toman sueros en: a) 15 días después de la exposición de los hámsteres vacunados; b) 30 a 50 horas después de la exposición de hámsteres no vacunados. El suero de hámster no infectado se utiliza como control negativo. Para demostrar que los polipéptidos expuestos de superficie seleccionados son capaces de inducir una respuesta de anticuerpo in vivo se analizó la presencia de anticuerpos específicos en suero de hámster infectados. Los polipéptidos purificados se analizaron por Western blot utilizando sueros de hámster infectados y a partir de hámster infectados después de la vacunación con combinación de toxina A y B.

Los sueros de los hámsteres infectados se encontró que contienen algunos anticuerpos contra polipéptidos de C. difficile. Esto es principalmente debido a que los hámsteres infectados mueren 30 a 50 horas después de la infección - tiempo insuficiente para generar una respuesta inmunitaria contra la bacteria. Por lo tanto, los polipéptidos para los cuales están presentes los anticuerpos en estos sueros parecen ser particularmente útiles para uso en composiciones de vacuna y en la preparación de anticuerpos neutralizantes.

Los sueros de hámsteres que fueron vacunados y posteriormente infectados contienen anticuerpos capaces de reconocer polipéptidos purificados. La inmunización con una combinación de toxina (p5/6+toxB_GT) antes de la infección permite que los hámsteres generen una respuesta de anticuerpo eficiente evitando la muerte pero no evitan la colonización de C. difficile. Los polipéptidos purificados y los fragmentos se detectan por anticuerpos presentes en los sueros de hámster a partir de hámsteres vacunados e infectados, lo que confirma la accesibilidad de superficie de estas proteínas durante la infección y que son adecuadas como objetivos de vacuna. Los sueros de hámster no infectados se utilizan como control negativo. Por ejemplo, sueros de hámsteres vacunados y subsecuentemente infectados que contienen anticuerpos capaces de reconocer Dif44, Dif51, Dif130, Dif153, Difl83, Dif208 y Dif232 en los sueros de hámster de hámsteres vacunados e infectados, confirma la accesibilidad de superficie de estas proteínas durante la infección y que son adecuadas como objetivos de vacuna (figura 10).

Los sueros de hámster no infectado se utilizan como un control negativo (figura 10B). Algunas bandas se observan debido a reacciones cruzadas con contaminantes de E. coli presentes en las preparaciones de proteínas recombinantes.

EJEMPLO 12: RECONOCIMIENTO POR ANTICUERPOS A PARTIR DE SUEROS HUMANOS (IgA e IgG) Con el fin de probar el reconocimiento de polipéptidos recombinantes por anticuerpos humanos, los inventores prepararon y utilizaron un arreglo de chip de proteína. 1. Procedimientos de microarreglo de proteína: El arreglo de proteína de . ifficile se generan por puntos de proteína recombinante purificada (0.5 mg/ml) en 4 duplicados sobre portaobjetos recubiertos con nitrocelulosa (portaobjetos FAST, Schleider y Schuell) utilizando un equipo colocador de puntos de chorro de tinta Arrayjet (Arrayjet Limited), acoplado con una cabeza de impresión de chorro de tinta piezoeléctrica que transporta más de 100 boquillas, lo que resulta en puntos de un diámetro de aproximadamente 90-100 pm. Como controles experimentales se colocaron en puntos en los arreglos 4 duplicados de curva de BSA biotinado, IgG de ratón, IgG humano e IgM humano (desde 0.004 hasta 0.5 mg/ml). El amortiguador PBS se colocó por puntos en por lo menos dos veces el número de puntos de proteína y se utilizó para detectar señales no específicas debido a contaminación cruzada durante la colocación de los puntos. Menos de 5% de los puntos PBS mostró señal de intensidad mayor que el valor de fondo +3 valores de desviación estándar.

La unión no específica se minimizó por preincubación de arreglos con una solución de bloqueo que contiene Top Block 3% (Fluka-BioChemiKa)-Tween 20 0.1% en amortiguador PBS (TPBS, por sus siglas en inglés). Después de lavado con TPBS, los sueros humanos se diluyeron en 3% de Top Block TPBS y se superpusieron en los arreglos a 25°C durante 1 hora. Después del lavado con TPBS, la unión de anticuerpos a antígenos impresos en los arreglos se detectó por incubación de los arreglos con anticuerpos secundarios anti Cy5 humano conjugado (1:800) a 25°C durante 1 h. Todas las etapas de incubación se llevaron a cabo bajo agitación utilizando la estación de hibridación HS 4800 (TECAN). Las señales de fluorescencia de imagen se detectaron con un explorador PowerScanner3.5 (TECAN) y se generaron imágenes de 16 bitios con el programa ScanArrayMR a 10 mm por pixel de resolución y se determinaron las intensidades de fluorescencia de punto (FI) utilizando el programa ImaGene 6.0 (Biodiscovery Inc., CA, USA). La elaboración y el análisis se realizó utilizando un programa desarrollado en el laboratorio. Para cada proteína, se determinó la media de intensidad de fluorescencia (MFI, por sus siglas en inglés) de puntos por duplicado, después de la resta del valor de fondo que rodea a cada punto. Las señales se consideraron como positivas cuando su valor MFI es mayor de 2,000 para los experimentos con IgG y de 1000 para los experimentos con IgA, lo que corresponde a la media de intensidad de fluorescencia (MFI, por sus siglas en inglés) de puntos de proteína después de detección con anticuerpos anti-Cy5 humano solo, más 3 valores de desviación estándar. Se agregaron dos controles: NN-His que corresponde a valores de puntos MFI con extracto celular de E. coli que presenta un vector de expresión vacío y PBS_Gly que corresponde a valores MFI de puntos que contienen únicamente amortiguador (valores de fondo). Estos valores se restan automáticamente por el programa a partir del valor de cada punto de muestra. 2. Análisis de Western blot : Se cargaron doscientos ng (200 ng) de cada proteína recombinante purificada en 12 pozos de 1 mm con 4-12% de geles prevaciados NuPAGE Bis-Tris Novex (Invitrogen) separados a 200 V durante 35 min y se transfieren sobre membranas de nitrocelulosa utilizando el sistema seco iBlot (Invitrogen). Las membranas se saturaron con leche desnatada 10% (Difeo) en PBS-T (PBS que contiene Tween-20 0.05%) y se incuban durante 1 h a RT con agitación ligera. Las membranas bloqueadas después se incuban con el suero humano 4705WH diluido 1:500 en leche desnatada 1% PBS-T y se incuba durante 3 h a RT. Las membranas se lavan con PBS-T una vez durante 15 min y dos veces durante 5 min.

Los anticuerpos secundarios anti-IgG humana, conjugados con HRP Sigma A-6029 (1:2,500 en leche desnatada 1% PBS-T) o anti-IgA humana, conjugada a fosfatasa alcalina SIGMA A-9669 (1:3000 en leche desnatada 1% PBS-T) después se agregan y se incuban durante 40 min con agitación ligera. Después de un lavado de 15 min y 3 lavados de 5 min con PBS-T, las membranas se superponen con la solución de sustrato SuperSignal WestPico (Pierce) y se incuban durante 5 min a RT con agitación ligera. El sustrato en exceso se remueve con una toalla de papel y la membrana se expone a una película radiográfica.

Se obtiene suero humano de donadores convalecientes (donador A, donador B, donador C, donador D y donador E) y donadores sanos (10WH, 3453WH, 4016BL, 4697WH y 4705WH). Los títulos de ELISA de los diferentes sueros se muestran en la figura 11. FGF21 es una proteína no relacionada la cual es un control negativo y ToxA/B es una combinación de las toxinas A y B de Inverness Medical Inc. Los sueros de los donadores convalecientes, donador A, donador C y donador D presentan IgG contra ToxA y ToxB en comparación con el título de IgG para FGF21 lo que indican que han montado una respuesta inmunitaria contra C. di ici e. Además, los sueros de los donadores sanos 10WH y 4705WH tienen títulos altos de IgG contra ToxA y ToxB en comparación con el título de IgG para FGF21, lo que indica que se han infectado en el pasado y que previamente han montado una respuesta inmunitaria contra C. ci e (figura 11).

La presencia de IgG específica en los sueros se asocia con una respuesta inmunitaria sistémica de IgG contra C. c e . Utilizando el arreglo de proteína, la presencia de IgG específica contra los polipéptidos en los sueros humanos se ha identificado. Por ejemplo, utilizando el arreglo de proteínas, los inventores identificaron la presencia de IgG específica contra los polipéptidos Dif51, Difl30, Dif232 en los sueros humanos mencionados antes.

Títulos altos de IgG (MFI > 5000) contra el polipéptido Dif232 se han medido en el suero denominado 4705WH (figura 12A). La presencia en el suero denominado 4705WH de IgG contra Dif232 se confirmó por Western blot (figura 12B).

Los polipéptidos los cuales mostraron una fuerte reacción pueden ser particularmente útiles en una composición inmunogénica o de vacuna particularmente para uso en humanos. Además, la detección de IgA específica en los sueros asociados a las respuesta inmunitaria mucosal contra C. ifficile. La presencia de IgA específica contra los polipéptidos de la invención en los sueros humanos se determinó. Por ejemplo, los inventores identificaron la presencia de IgA específica contra Dif51, polipéptido en sueros humanos (que se resume a continuación y en la figura 13A).

Un título de IgA (MFI > 1000) contra el polipéptido Dif51 se midió en el suero denominado donador C. Un título de IgA (MFI > 1000) contra los polipéptidos Difl30 se midió en los sueros denominados donador A, donador C, donador D, 3453WH y 4705WH. Los polipéptidos los cuales muestran una fuerte reacción pueden ser particularmente útiles en una composición inmunogénica o de vacuna para generar una respuesta inmunitaria mucosal que proporcione protección dirigida a diversas membranas mucosas de un organismo. Este es particularmente el caso para C. difficile en donde la infección puede estar limitada a la mucosa colónica. La presencia de IgA contra el polipéptido Difl30 y Dif232 en el suero 4705WH se confirmó por Western blot (figura 13B). Estos polipéptidos pueden ser particularmente útiles en una composición inmunogénica o de vacuna para generar una respuesta inmunitaria mucosal que proporcione protección dirigida a las diversas membranas mucosas de un organismo. Este es particularmente el caso para . c e en donde la infección puede estar limitada a la mucosa del colon. La tabla 2 resume los polipéptidos que se reconocen por sueros humanos (4705WH) en chip de proteína y análisis de Western blot.

EJEMPLO 13; ANÁLISIS ADICIONAL DE Di£153 (CD2830) Se ha detectado Difl53 en el sobrenadante de las cepas 630 y Stoke_Mandeville. Se ha anotado a Difl53 como una proteína hipotética de 220 aminoácidos. El análisis BLAST muestra homología con proteínas del factor mortal de carbunco (LF), una familia de metalopeptidasas de zinc. En particular, Difl53 muestra homología con el dominio C-terminal (residuos 589-810) del factor mortal de carbunco. El dominio N-terminal de carbunco, necesario para interacción con el antígeno protector, se ha perdido. El sitio catalítico (HEXXH) está conservado en Difl53, lo que sugiere que la proteina de C. difficile puede ser una metaloproteasa dependiente de zinc (figura 15). Para entender si esta proteína es capaz de unir zinc u otros cationes divalentes, se realizó análisis por RMN utilizando una proteína recombinante. Este análisis mostró que la capacidad de la proteína recombinante para unir zinc, níquel y cobre, pero no calcio.

Para investigar si Difl53 tiene una actividad proteolítica, se llevó a cabo un análisis fluorimétrico para probar la capacidad de la proteína recombinante para escindir un sustrato de gelatina (figura 18). Este análisis mostró que la proteína recombinante presenta una actividad débil de gelatinasa/colagenasa en presencia de zinc, pero no en presencia de níquel y cobre o en la forma apo. Se ha reportado que Clostridia secreta varias metalopeptidasas que son responsables para la digestión de componentes de matriz extracelular. Por lo tanto, los inventores probaron in vitro la actividad proteolítica de la proteína recombinante sobre varios elementos de la matriz extracelular (colágeno I-IV y fibronectina). Un análisis preliminar muestra que la proteína recombinante es capaz de cortar fibronectina (figura 16).

La caracterización adicional de Difl53 se realizó como sigue: Se determinó la actividad proteolítica sobre otros elementos de matriz extracelular y el sitio de escisión se identificó por secuencia de espectros de masa de fragmentos de fibronectina. Se realizaron análisis in vitro para entender si la proteína tiene un efecto tóxico sobre células humanas. Los análisis in vitro se realizan para entender si la proteína tiene un efecto sobre la organización de la matriz de fibronectina de células humanas. La confirmación de que la actividad enzimática observada es específica para Difl53 se obtiene al generar una proteína recombinante inactiva mutada en el sitio catalítico. Este polipéptido el cual es una zinc-metalopeptidasa nueva con actividad degradante de fibronectina puede ser un buen candidato para limitar o evitar la colonización de C. difficile .

EJEMPLO 14: ANÁLISIS ADICIONAL DE Difl83 Para caracterizar la función de Difl83 (CD3669), se generó un mutante por supresión. La localización subcelular de Difl83 se investigó mediante microscopía confocal sobre células vegetativas y por análisis de Western blot sobre fracciones celulares. El método se describe en el ejemplo 6. Estos análisis mostraron que Difl83 se asocia con la superficie bacteriana (figura 19).

La presencia de Difl83 en sobrenadantes de cultivo (recolectados tanto en la fase exponencial como después de 48 horas de fase estacionaria) se confirmó por Western blot. Además, el análisis de inmunotransferencia mostró que existe no solo sobre el sobrenadante total sino también en las fracciones de ultracentrifugación. Después de 48 horas de fase estacionaria los inventores detectaron la proteína tanto en el sobrenadante de ultracentrifugación como en el sedimento de la ultracentrifugación. Esta observación puede indicar una asociación de la proteína con estructuras macromoleculares (flagelos, vesículas) que se han observado previamente en sedimentos de sobrenadantes en microscopía electrónica (figura 20).

Para investigar la función de Difl83, la curva de crecimiento del mutante por supresión en medio rico se comparó con el tipo silvestre. Se realizaron cuentas vitales tanto de células vegetativas como de esporas (figura 21). Mientras en fase exponencial el mutante presenta un perfil de crecimiento comparable con el de wt (figura 21A), la densidad óptica de la cepa mutante disminuye más rápidamente durante la fase estacionaria tardía (figura 21B). Las cuentas vitales de las células vegetativas no mostraron una diferencia entre wt y el mutante (figura 21C). Por el contrario, las cuentas vitales de las esporas mutantes después de inactivación de ETOH de células vegetativas es de aproximadamente 10 veces menor que la de wt (figura 21D). Este fenotipo se puede asociar con un defecto en uno o más procesos biológicos, tal como la formación de la espora, resistencia de esporas a tratamiento con etanol o germinación de esporas.

Se realizó caracterización adicional de Difl83. Se generó una cepa complementada con Difl83 para confirmar la especificidad del fenotipo observado. La expresión de proteína se probó en diferentes puntos de tiempo de crecimiento y en extractos de espora. Se determinó si el fenotipo está asociado con un defecto en la esporulación o la germinación (cuenta de esporas, análisis de germinación). El efecto de los sobrenadantes de tipo silvestre y con bloqueo de expresión se probaron en germinación de esporas. El análisis de microscopía electrónica se realiza sobre el tipo con bloqueo de expresión y tipo silvestre sobre células vegetativas y esporas. Este polipéptido, el cual es un factor nuevo de esporulación/germinación puede ser un buen candidato para limitar o evitar la colonización de .

A partir de más de 3700 objetivos potenciales, los inventores han utilizado una combinación de téenicas para identificar diversos polipéptidos con utilidad potencialmente significativa en infección por .

. Las SEC ID NOS: y los identificadores de DIF para cada uno de estos polipéptidos se muestran en la figura 1 y la localización predicha de estos polipéptidos se resume en la figura 2.

EJEMPLO 15: COMBINACIÓN DE FRAGMENTOS ToxB GT y TcdA con ANTÍGENOS POLIPEPTÍDICOS Los estudios de inmunización en hámster típicamente involucran hámster Sirios dorados. Los antígenos se probaron mediante inmunizaciones sistémicas (en 4 ocasiones, separadas por dos semanas). Se probaron las diferencias en el tiempo de muerte, signos de infección y colonización de bacterias.

Se adquirieron hámsteres Sirios dorados hembra (100 g, de peso) de Harían Olac, Reino Unido. Los animales se albergaron individualmente en agua y alimentos suministrados libremente. Se insertaron chips de telemetría (Vitalview Emitter) i.p. mediante laparotomía por lo menos 3 semanas antes de la primera vacunación. Una vez que las heridas sanaron, se colocó a los animales sobre almohadillas receptoras y se monitoreó la temperatura corporal y la actividad (programa Vital View) . Los animales fueron inmunizados por medio intraperitoneal (i.p.) con cuatro dosis de combinaciones de antígeno (50 pg) de p5-6 y toxB_GT con ya sea 20 mg de los antígenos anti-colonización Dif044 o DIF208) formulados en adyuvante MF59 los días 1, 14, 28 y 36. Todos los componentes se almacenaron correctamente y se sometieron a ciclos mínimos de congelamiento/recalentamiento.

Para asegurar la sensibilidad de cada animal a colonización, en el día 60 cada uno fue tratado con 30 mg/kg de fosfato de clindamicina. Después de 12 horas posterior a la administración del antibiótico, cada hámster fue expuesto con aproximadamente 1000 esporas de . i ic e 630.

Después de la exposición los animales fueron monitoreados estrechamente en búsqueda de signos de infección durante el inicio y la duración de heces sueltas (cola húmeda). Como se ha reportado previamente, los animales muestran una disminución en la temperatura corporal de más de dos grados (35°C) fueron sacrificados. Los animales cuya temperatura no disminuyó por debajo de 35°C pero habían perdido más de 10% de su cuerpo en masa también fueron sacrificados. Los animales que sobrevivieron por más de dos semanas después de la exposición se consideró que se habían recuperado de la infección y se sacrificaron para proporcionar un criterio de valoración al experimento. 1. Tiempos para la muerte: el tiempo tomado para alcanzar 35°C después de la exposición de los animales Todos los animales sobrevivieron a la exposición con 9.4 x 104 esporas/dosis y ninguno de los animales mostró algún signo clínico, incluyendo diarrea. Los sedimentos fecales se recolectaron durante el procedimiento para verificar la diseminación de esporas. Esto concuerda con las observaciones realizadas (por ejemplo, en W02013/084071) para inmunización con P5/6 + toxB_GT sin los agentes anticolonización. 2. Temperaturas corporales: las temperaturas de todos los animales se monitorearon por telemetría a través del experimento. Todos los animales mostraron fluctuaciones normales de temperatura diurna sin que se observará incidencia en las primeras 48 h para los animales 6 a 9. El chip de telemetría en H10 no funcionó y por lo tanto no se encuentran datos de temperatura disponibles para este animal.

Los resultados representativos se muestran en la figura 23. 3. Dispersión de esporas de C. i c e en heces o animales vacunados: se recolectan sedimentos fecales de diversos días después de la exposición. Estos se recolectan ya sea al colocar al animal en una jaula estéril nueva o después de sustitución del lecho sucio con un lecho estéril limpio. Los sedimentos se resuspenden en PBS estéril y el número de organismos C. i ic e recuperados se enumeran al sembrar en placa sobre agar Braziers CCEY con eritromicina. Se determina el número de colonias por 100 mg de material fecal. Los resultados muestran que la dispersión inicial de C. difficile en animales vacunados con anticuerpo anti-antígenos de factor de colonización (DIF044 y DIF208) son similares a los niveles diseminados en animales vacunados con los fragmentos de toxina únicamente (datos históricos de animales inmunizados con p5/6 + tox GT). Los niveles de diseminación de los animales vacunados anti-factor de colonización disminuyen entre los días 3 y 4 después de la exposición en un momento en el que típicamente se han observado que los niveles de bacteria se incrementan en fragmento de toxina en animales únicamente inmunizados. Al día 8 después de la exposición los niveles de diseminación en todos los grupos de animales vacunados son similares (figura 24). 4. Colonización de . ifficile en el intestino en el criterio de valoración: los números de C. i fici e se enumeran localizados en el lumen del ciego (Cae-LA) y colon (Col-LA) y estos se asocian con el tejido de estos órganos (Cae-TA y Col-TA). Se extirpan los intestinos y se determinan las cuentas bacterianas sobre bacterias recuperadas. Para enumerar la carga bacteriana total (esporas y células vegetativas), cada sección se abre longitudinalmente y el contenido se extrae mediante lavado ligero en dos cambios de 10 i de PBS. Los tejidos se homogeneizan en 5 mi de PBS durante 1 min utilizando un Stomacher, y las cuentas viables se determinan para los homogeneizados. Se siembran en placas diluciones seriadas decimales sobre placas de agar sangre CCFA que contienen 20 g/ml de anfotericina B para suprimir el crecimiento de levaduras. Para calcular los números de esporas presentes en las muestras las muestras se calientan durante 10 min a 56°C y los números de esporas presentes se determinan por el método de cuenta viable. El análisis microbiológico muestra que Hl, H4, H5 y H6 no tienen . c e detectable en el criterio de valoración experimental. H8 y H10 tienen números muy bajos de . c con solo algunas colonias creciendo hasta el criterio de valoración (figura 25). La colonización promedio del intestino en el criterio de valoración se compara con los resultados del experimento previo con animales que fueron vacunados únicamente con p5/6 + toxB_GT (figura 26).

El número de C. c e aislado es el más alto en todos los grupos en el lumen del colon. Los números de bacterias asociados con el lumen tanto del ciego como del colon fueron comparables en todos los grupos vacunados. El número de bacterias en los grupos vacunados con anti-antígenos de colonización fueron menores asociados con el tejido en el ciego. No se aislaron bacterias del grupo vacunado con DIF044 asociado con el tejido en el colon. 5. Estimación de toxina en contenidos de intestino: también se realizaron determinaciones de contenido de toxina en el intestino. Los lavados de intestino se filtraron a través de un filtro de 0.22 mm para eliminar células bacterianas. Los lavados filtrados después se colocan sobre células Vero confluentes con concentraciones que disminuyen 10 veces (5 veces para el colon) durante 24 horas. Después de la incubación las células se lavan, se fijan y después se tiñen con tinción de Giemsa. Si la toxina está presente entonces la ronda de células provoca desprendimiento y la ausencia de color. Los datos de contenido de toxina representan diluciones a las cuales las células permanecen unidas (teñidas). Existe muy poca o nula toxina activa presente en alguna de las muestras de intestino calculadas por la adición de muestras de contenido de intestino sobre ya sea células HT29 (susceptibles a toxina A) o células Vero (susceptibles a toxina B) como se muestra en la figura 27. 6. Detección de anticuerpo y sueros de lavados de intestino: los sueros o lavados de intestino de hámsteres se prueban para la medición de anticuerpos anti-toxina, anti-Dif44 y anti-Dif208, mediante Western blot. Para este análisis, 200 ng de cada proteína recombinante (p5-6, toxB_GT, Dif44 y Dif208) se separaron por SDS-PAGE utilizando el sistema de gel NuPAGE (Invitrogen) y se transfieren sobre membranas de nitrocelulosa para análisis de Western blot. Las membranas se bloquean 1 hora con PBS-polvo de leche 10% a temperatura ambiente. Las membranas después se incuban ya sea con suero (dilución 1:200) o lavados de intestino (dilución, 1:10) de los hámsteres del ejemplo 15 durante 90 min a 37°C: particularmente, los sueros de los lavados de intestino de los hámsteres 1 a 5 del ejemplo 15 se utilizaron para detectar anticuerpos anti-Dif44 y sueros de lavados de intestino de los hámsteres 6 a 10 del ejemplo 15 se utilizaron para detectar anticuerpos anti-Dif44. Después de incubación con anticuerpo secundario de anti-hámster (dilución 1:10,000) durante 45 min a 37°C, la detección de anticuerpos unidos se llevó a cabo con el sustrato quimioluminiscente Super Signal (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se puede observar a partir de la figura 28 y la figura 29 que los anticuerpos Dif44 y anti-Dif208 están presentes en suero y lavados de intestino.

EJEMPLO 16; LOS ANTICUERPOS ANTI-Dif44 RECONOCEN OTRAS PROTEÍNAS DE CWP Para determinar si los anticuerpos anti-Dif44 pueden dar reacción cruzada con otra proteínas de cwp, 200 ng de diversas muestras se cargaron en un gel y se sometieron a Western blot. Cada proteína cwp recombinante (enumerada en la figura 30) se separó por SDS-PAGE utilizando el sistema de gel NuPAGE (Invitrogen) y se transfiere sobre membranas de nitrocelulosa para análisis de Western blot.

Las membranas se bloquean 1 hora con PBS-polvo de leche 10% a temperatura ambiente. Las membranas después se incuban con suero de hámsteres 1 a 5 del ejemplo 15 (dilución, 1:200) durante 90 min a 37°C. Después de incubación con anticuerpo secundario anti-hámster (dilución 1:10,000) durante 45 min a 37°C, la detección de los anticuerpos unidos se llevó a cabo con el sustrato quimioluminiscente Super Signal (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Como se muestra en la figura 30, los anticuerpos séricos reconocen cwpl, cwp3, cwp6, cwp7, cwpll, cwpl4, cwp20, cwp21, cwp25, cwp26, cwp27 y cwp29. Las mismas muestras se incubaron también con el suero de hámsteres vacunados con p5_6 + ToxB-GT. Los posibles anticuerpos contra las cwp presentes en este suero se deben a la respuesta inmunitaria contra las exposiciones a bacterias después de la vacunación. Se detecta una reactividad débil únicamente contra cwp5, cwp25, cwp26, cwp29, que demuestra que la adición de dif44 en la vacunación confiere una ventaja en la respuesta contra C. ifficile.

EJEMPLO 17; COMBINACIÓN DE LOS FRAGMENTOS ToxB-GT y P56 CON ANTÍGENOS PARA POLIPÉPTIDO DIF44 Y DIF208 Las composiciones inmunogénicas se prepararon como se describe en lo anterior. Se administraron tres composiciones como sigue: 8 hámsteres con ToxB_GT + P5-6 + DIF 208 + DIF44, 4 hámsteres con ToxB_GT + P5_6 (control negativo) utilizando los procedimientos de administración estándar descritos en otra parte. 6 de los 8 hámsteres administrados con ToxB_GT + P5_6 + DIF208 + DIF44 se expusieron con C. difficile mientras que 2 que permanecieron sin exposición. Las diferencias en el momento de muerte y la colonización de bacterias se probaron in vivo. Debido a que previamente no ha sido posible determinar si los anticuerpos para DIF44 los cuales fueron observados, por ejemplo en el suero de hámsteres inmunizados y expuestos resultan de la infección o la vacunación, también se llevaron transferencias Western para observar los anticuerpos presentes en el suero y lavados de intestino de hámsteres vacunados pero no expuestos.

C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - _ - - - _ - - _ - _ - - _ - - - - - - _ - - - - _ - _ - _ - _ - _ - - . - _ - - _ - _ _ _ _ _ - _ _ - - _ _ - - _ _ - _ - - - _ _ - _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ - - - _ _ . - _ - _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ - _ - _ _ _ _ i _ _ _ i _ _ _ _ _ i - _ _ i . - _ - _ - i _ - _ - i i i - i i _ - i i i l _ i _ i i _ _ i l _ _ i _ _ - - i - _ _ - - - frontaL Longitud 23 Dif 149_CD2795_compleme 278 Dif153_CD2830 300 Dif153_CD2830 322 nto de cebador inverso_ Longitud 18 Dif204_CD2789_cebador 279 Dif196_CD1751 301 Dif 196_CD1751 323 frontaL Longitud 23 Dif204_CD2789_compleme 280 Dif 196_CD1751 302 Dif 196_CD1751 324 nto de cebador inverso_ Longitud 23 Dif205 _CD2793_cebador 281 Dif207_CD2796 303 Dif207_CD2796 325 frontaL Longitud 20 Dif205 282 Dif207_CD2796 304 Dif207_CD2796 326 _CD2793_complemento de cebador inverso_ Longitud 28 Dif12_CD0183 283 Dif251 _CD1858 305 DH251 _CD1858 327 Dif12_CD0183 284 Dif251_CD1858 306 Dif251_CD1858 328 Dif327_CDR20291_268 Dif52_CD1029 285 307 Dif327A_CDR20291_2682 329 2 Dif327_CDR20291 _268 Dif52_CD1029 286 308 Dif327A_C DR20291 _2682 330 2 Dif53_CD1047 287 SleC_ CD0551 309 Dif 12A_f25 - 170_CD0183 331 Dif53_CD1047 288 SleC_CD0551 310 Dif12_CD0183, Cebador 332 frontal, longitud 22 Dif75_CD1469 289 Dif12_CD0183 311 Dif12_CD0183, Complemento 333 de cebador inverso, longitud 26 Dif75_CD1469 290 Dif 12_CD0183 312 Dif52_CD1029, Cebador 334 frontal, longitud 25 Dif75A J30 - 715_CD1469 291 Dif52_CD1029 313 Dif52_CD1029, Complemento 335 de cebador inverso, longitud 29 Dif75A_f30 - 715_CD1469 292 Dif52_CD1029 314 Dif53_CD1047, Cebador 336 frontal, longitud 25 Dif75B_f715 - 1007_CD14 293 Dif53_CD1047 315 Dif53_CD1047, Cebador 337 69 frontal, longitud 25 Dif75B_f715 - 1007_CD14 294 Dif53_CD1047 316 Dif75A_f30 - 715_CD1469, 338 69 Cebador frontal, longitud 25 Dif106_CD2193 295 Dif106_CD2193 317 Dif75AJ30 - 715_CD1469, 339 Complemento de cebador inverso, longitud 25 Dif 106_CD2193 296 Dif 106_CD2193 318 Dif75B_f715 - 1007_CD1469, 340 cebador frontal, T -57°, Longitud 19 Dif 146 CD2786 297 Dif146_CD2786 319 Dif75BJ715 - 1007_CD1469, 341 Complemento de cebador inverso, longitud 26 Dif146 CD2786 298 Dif146_CD2786 320 Dif 106_CD2193, Cebador 342 frontal, longitud 25 _ i _ , _ - - - - - - - - - - - i - - I - - i l l REFERENCIAS [1] Sebaihia et al. 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Claims (23)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende: a) un polipéptido de C. ifficile que se selecciona de Dif44 y Dif298, b) una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido del inciso a), y/o c) un anticuerpo capaz de unirse al polipéptido del inciso a).

2. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además por lo menos un antígeno ToxB-GT de C. ifficile y por lo menos un antígeno TCDA de C. i icile, moléculas de ácido nucleico que codifican para los antígenos y/o anticuerpos capaces de unirse a los antígenos.

3. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el antígeno ToxB-GT y/o el antígeno TcdA están destoxificados.

4. La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el polipéptido Dif44 comprende una secuencia de aminoácidos: a) que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 139 o SEC ID NO: 79; y/o b) que es un fragmento de por lo menos 7 aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 139 o la SEC ID NO: 79, o un polipéptido que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 139 o la SEC ID NO: 79 y que comprende un epítopo de la SEC ID NO: 139 o SEC ID NO: 179.

5. La composición inmunogénica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el polipéptido Dif208 comprende una secuencia de aminoácidos: a) que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 433 o la SEC ID NO: 133; y/o b) que es un fragmento de por lo menos 7 aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 433 o la SEC ID NO: 133, o de un polipéptido que 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 433 o la SEC ID NO: 133 y que comprende un epítopo de la SEC ID NO: 433 o la SEC ID NO: 133.

6. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el fragmento comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 111, SEC ID NO: 113, SEC ID NO: 171 O SEC ID NO: 173.

7. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizada porque el antígeno ToxB-GT es un polipéptido que comprende o que consiste de una secuencia de aminoácidos: a) que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 18 o la SEC ID NO: 60; y/o b) que es un fragmento de por lo menos 7 aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 18 o la SEC ID NO: 60 o de un polipéptido que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 18 o la SEC ID NO: 60 y que comprende un epítopo de la SEC ID NO: 18 o la SEC ID NO: 60.

8. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizada porque el antígeno TcdA es un polipéptido que comprende o que consiste de una secuencia de aminoácidos: a) que tiene 80% o más de identidad con la SEC ID NO: 11, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16; y/o b) que es un fragmento de por lo menos 7 aminoácidos consecutivos de conformidad con cualquiera de las SEC ID NOS: 11, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16 o de un polipéptido que tiene 80% o más de identidad con cualquiera de las SEC ID NOS: 11, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16 y que comprende un epítopo de conformidad con cualquiera de las SEC ID NOS: 11, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16.

9. La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque comprende además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más antígenos TcdA adicionales, que opcionalmente se seleccionan de (1) un antígeno ToxA-ED (SEC ID NO: 3), (2) un antígeno ToxA-GT (SEC ID NO: 4), (3) un antígeno ToxA-CP (SEC ID NO: 5), (4) un antígeno ToxA-T (SEC ID NO: 6), (5) un antígeno ToxA-T4 (SEC ID NO: 7), (6) un antígeno ToxA-B (SEC ID NO: 8), (7) un antígeno ToxA-PTA2 (SEC ID NO: 9), (8) un antígeno ToxA-P5-7 (SEC ID NO: 10), (9) un antígeno ToxA-P5-6 (SEC ID NO: 11), (10) un antígeno ToxA-P9-10 (SEC ID NO: 12), (11) un antígeno ToxA-B2 (SEC ID NO: 13), (12) un antígeno ToxA-B3 (SEC ID NO: 14), (13) un antígeno ToxA-B5 (SEC ID NO: 15), (14) un antígeno ToxA-B6 (SEC ID NO: 16) o un antígeno TcdA de longitud completa (SEC ID NO: 1).

10. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizada porque el antígeno TcdA es ToxA-P5-6.

11. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque cuando más de un antígeno está presente, por lo menos dos de los antígenos en la composición están en forma de un polipéptido híbrido.

12. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque ninguno de los antígenos está en forma de un polipéptido híbrido.

13. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la composición induce títulos de neutralización contra la toxina A y la toxina B de i ici e.

14. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende por lo menos un antígeno adicional de C. c e, opcionalmente en donde el antígeno adicional de C. di ficile es un antígeno sacárido.

15. La composición inmunogénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque es una composición de vacuna.

16. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende además un adyuvante.

17. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 16, para usarse como una sustancia farmacéutica.

18. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, para usarse en la generación de una respuesta inmunitaria en un mamífero.

19. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, para usarse en el tratamiento o prevención de enfermedad asociada con C. i icile, preferiblemente en un mamífero.

20. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, para usarse en el tratamiento, prevención o reducción en la gravedad de recaída de enfermedad inducida por esporas de . ifficile, o en el tratamiento, prevención o la reducción de colonización del intestino por . i ici e, preferiblemente en un mamífero.

21. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizada porque el mamífero es un humano.

22. La composición inmunogénica o vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para usarse para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero, la cual se administra al mamífero.

23. La composición de conformidad con la reivindicación 22, en donde el mamífero es un humano.