CN104582722A - 作为疫苗的艰难梭菌多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于预防或治疗哺乳动物中艰难梭菌感染的方法、蛋白质、核酸和抗体。

Description

作为疫苗的艰难梭菌多肽
技术领域
本发明涉及来源于艰难梭菌(C.difficile)的多肽，特别是使用该多肽治疗和预防艰难梭菌感染的方法。
背景技术
艰难梭菌是一种革兰氏阳性、杆状、厌氧产孢子细菌。第一个完全测序的艰难梭菌基因组公开于2006年[1]，并鉴定到了3776个预测的编码序列。艰难梭菌是肠道菌群的常见组分，在没有疾病迹象的情况下估计占总群体的3％。在肠道菌群的天然平衡受到干扰时，艰难梭菌会变得更为普遍。该过度生长导致细菌开始在群体信号调节因子的控制下生产毒素。干扰肠道菌群天然平衡的最常见原因是给予了有害于一些肠道细菌但不影响艰难梭菌的抗生素。艰难梭菌是抗生素相关腹泻(AAD)的主要原因，但症状可发展至威胁生命的伪膜性肠炎。在老年住院患者中感染的流行程度最高，但在非典型组(如青少年和妊娠女性)中感染逐渐增多[2]。已观察到那些艰难梭菌感染者中有12％至35％在2个月内复发[3]。
在20世纪70年代，艰难梭菌仅被鉴定为AAD的致病物。从那以后，尝试了多种用于对抗感染的策略。特定的抗生素(如万古霉素、甲硝唑、硝唑尼特、杆菌肽或梭链孢酸)最初被用于治疗艰难梭菌感染，并且沿用至今(参见参考文献4、5和6)。但是，使用这些抗生素进行广泛治疗是不利的，因为艰难梭菌存在风险，也因为随着时间推移，其他肠道细菌也变得耐药。最近，已适用基于细菌分泌的类毒素的疫苗和靶向这类毒素的被动免疫治疗来进行治疗。在18-85岁患者的II期试验中测试了含和不含佐剂的类毒素疫苗以确定在给予第三次剂量的该疫苗后9周时该疫苗预防复发性CDI的效力。类毒素疫苗通常需要重复给药和佐剂以引发免疫应答。此外，其给药通常与注射位点免疫反应相关。然而，基于毒素的疫苗仅预防毒素结合，中和炎性作用；这类疫苗通常不能完全预防建群或从身体中清除存在的病原体。例如，孢子可能剩余，这表明可能发生具有相关症状的进一步感染或感染复发。
因此，需要改善的用于治疗或预防艰难梭菌感染的组合物和方法。具体而言，需要可用作疫苗组分并可用于在疫苗接种对象中限制或消除建群(包括孢子)以进一步预防艰难梭菌传递的多肽。本发明的目的是提供能够有效产生针对艰难梭菌的免疫应答的多肽和组合物，其用于研发预防和/或治疗艰难梭菌相关疾病的疫苗。
图1：提供了各经选择多肽的概要信息，包括内部名称、基因标识符(GI)、基因座标记、氨基酸序列长度(AA)、最初从中分离出多肽的菌株标识名称、对应于各多肽的SEQ ID NO、克隆的多肽和多个引物的SEQ ID NO。
图2：总结了分泌组、NMR和共聚焦显微实验的结果。
图3：提供了NMR分析中所用方法的示意图。
图4：Diff44的15N-HSCQ谱
图5：显示了通过Western印迹进行的表面暴露研究的结果
图6：提供了Dif232的代表性FACS数据
图7：提供了涉及细胞结合实验的数据总结。通过FACS分析进行的人Vero细胞上重组多肽和通过共聚焦显微分析进行的人Vero和Caco-2细胞上重组多肽的结合试验
图8：采用抗Dif192和抗Dif44抗体对艰难梭菌参考菌株(630、R20291和M120)的总细胞提取物和代表不同PCR核糖体型的临床分离物进行的Western印迹分析。Dif192成熟形式是647aa和71.1kDa。Dif44成熟形式是286aa和31kDa。
图9：提供了涉及ELISA结合试验的结果总结
图10：通过Western印迹，对艰难梭菌重组多肽(100ng)进行识别，(A)仓鼠的血清，使用毒素A和B联合疫苗接种并使用艰难梭菌630菌株或B1菌株攻击的仓鼠的血清，(B)未感染的仓鼠的血清。
图11：人血清抗体对艰难梭菌重组多肽的识别。
图12：人血清抗体对艰难梭菌重组多肽的识别。
图13：人血清抗体对艰难梭菌重组多肽的识别。
图14：小鼠血清抗体对艰难梭菌重组多肽的识别。使用由浓缩的上清液(5)Dif183(CD3669)免疫的小鼠的血清对重组蛋白进行免疫印迹。
图15：Dif153和炭疽热致死因子的C端(残基589-810)之间的比对；Dif153与炭疽热致死因子的C端同源；与PA相互作用所必需的N端结构域缺失；催化位点(HEXXH)是保守的。
图16：荧光测定试验显示在锌存在的情况下Dif153的明胶酶/胶原酶活性较弱。
图17：含量递减的重组Dif153与同一量的所需底物(胶原I-VI，纤连蛋白)孵育。该反应在0,5mM ZnCl2存在的条件下在37℃下进行16小时。将反应产物加载到凝胶上用于SDS-PAGE，随后使用银或考马斯染色。
图18：Dif183含有GerMN结构域。
图19：(A)使用抗Dif183血清对菌株630细胞组分进行的Western印迹分析；(B)对菌株630营养细胞的免疫荧光分析。
图20：通过Western印迹分析培养物上清组分中是否存在Dif183。
图21：Dif183缺失突变体具有孢子形成/萌发表型。
图22：优选的艰难梭菌重组毒素片段的示意图。ED＝酶结构域；GT＝葡糖基转移酶结构域；CP＝半胱氨酸蛋白酶结构域；T–易位结构域；B＝结合结构域。所有结构域都是可溶的，不同之处在于TcdA的T4和PTA2结构域是不可溶的。
图23：显示了给予具有Dif44或Dif208的毒素片段抗原并随后进行艰难梭菌630攻击后，经疫苗接种的动物的温度波动。
图24：显示了使用毒素片段抗原联合Dif44或Dif208进行疫苗接种的动物中，在艰难梭菌攻击后收集的粪粒中观察到的艰难梭菌数目(CPU/100mg)。
图25：显示了对于使用毒素片段抗原联合Dif44或Dif208进行疫苗接种并随后进行艰难梭菌630攻击的动物，在实验终点时盲肠腔(Cae-LA)、结肠腔(Col-LA)、盲肠组织(Cae-TA)和结肠组织(Col-TA)中艰难梭菌的数目。
图26：显示了所有经疫苗接种的组在实验终点(攻击后第14天)时分离的艰难梭菌总数。
图27：显示了实验终点时肠道样品中的毒素效价。
图28：显示了来自实施例15的仓鼠1-5的(A)血清或(B)结肠和直肠洗出物对重组ToxAp5_6、ToxB_GT和Dif44的识别。
图29：显示了来自实施例15的仓鼠6-10的(A)血清或(B)结肠和直肠洗出物对重组ToxAp5_6、ToxB_GT和Dif208的识别。
图30：显示了来自实施例15的仓鼠1-5的血清对各种细胞壁蛋白(cwp)的识别。
发明内容
本发明提供了包含选自下组的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO 79、81、93、105、111、113、125、133,139、141、153、165、171、173,185、187、189、300、322、357、359、361、433、435,437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463和465。所述多肽已经鉴定来自艰难梭菌。具体地，本发明的多肽具有免疫原性且适用于免疫原性组合物，例如疫苗组合物。
在一个实施方式中，本发明的多肽总结于下文以及图1中。
Dif44：该蛋白质也称为“CD0844”并标注为来自艰难梭菌的细胞表面蛋白cwp25。该多肽的核酸序列和氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:78和138以及SEQ ID NO:79和139中所列序列。
Dif51：该蛋白质也称为“CD0999”并标注为来自艰难梭菌的ABC转运蛋白底物结合蛋白脂蛋白。该多肽的核酸序列和氨基酸序列分别对应于SEQ IDNO:80和140以及SEQ ID NO:81和141中所列序列。N端半胱氨酸缺失的该多肽的核酸序列和氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:356和357所示序列。
Dif130：该蛋白质也称为“CD2645”并标注为推定的来自艰难梭菌的胞外溶质结合蛋白。该多肽的核酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:92和152以及SEQ ID NO:93和153。N端半胱氨酸缺失的该多肽的核酸序列和氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:358和359所示序列。
Dif153：该蛋白质也称为CD2830并标注为220个氨基酸的假拟蛋白。BLAST分析显示了与炭疽热致死因子蛋白(锌金属肽酶家族)的同源性。具体而言，Dif153显示了与炭疽热致死因子C端结构域的同源性。与保护性抗原相互作用所必需的炭疽的N端结构域缺失。催化位点(HEXXH)是保守的(图17)。该多肽的核酸序列和/或氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:299、321和434以及SEQ ID NO:300、322和435所示的序列。BLAST分析显示了与炭疽热致死因子蛋白(锌金属肽酶家族)的同源性。具体而言，Dif153显示了与炭疽热致死因子C端结构域的同源性。与保护性抗原相互作用所必需的炭疽的N端结构域缺失。催化位点(HEXXH)是保守的(图15)。可通过使该多肽的氨基酸序列或编码的核酸序列突变来实现Dif153的脱毒，包括删除全部或部分锌金属肽酶结构域和在降低蛋白酶活性的锌金属肽酶结构域中进行点突变。Dif153(CD2830)的单突变的示例是H142A、E143A、E143R、H146A、D149A、H150A、Y178F和C208S。Dif153(CD2830)的双突变的示例是H142A/H146A、H142A/Y178F、H142A/E143R、H142A/E143A、E142A/Y178F，其相对于SEQID NO:300和435的野生型CT153(CD2830)多肽序列。本发明还提供了CT153(CD2830)多肽的其他突变体，以单独或组合形式：H142A/H150A和E143A/D149A。上述脱毒免疫原性多肽优选保留SEQ ID NO:300和435的至少一个表位或免疫原性片段。这些突变体所涉及的核酸序列和氨基酸序列总结于表1。
Dif183：该蛋白质也称为“CD3669”并标注为来自艰难梭菌的假拟蛋白。C端含有一个拷贝的GerMN结构域，该结构域涉及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的孢子形成/萌发(图20)。该多肽的核酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:186、188、187和189。N端半胱氨酸缺失的该多肽的核酸序列和氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:359和360所示序列。
Dif192：该蛋白质也称为“CD1035”并标注为来自艰难梭菌的细胞表面蛋白(推定的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶)cwp16。该多肽的核酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:104和164以及SEQ ID NO:105和165。
Dif208：该蛋白质也称为“CD2831”并标注为来自艰难梭菌的胶原结合蛋白分选酶底物。该多肽的核酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:132和432以及SEQ ID NO:133和433。片段Dif208A对应于Dif208的氨基酸32-480。多肽Dif208A的核酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:110和170以及SEQ ID NO:111和171。片段Dif208B对应于Dif208的氨基酸481-938。多肽Dif208B的核酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:112和172以及SEQ IDNO:113和173。
Dif232：该蛋白质也称为“CD1031”并标注为来自艰难梭菌的细胞壁锚定蛋白。该多肽的核酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:124和184以及SEQ ID NO:125和185。
特别优选的本发明的多肽是Dif44和Dif208。已证明这些多肽在体内减少了艰难梭菌的肠道建群并可特别用于免疫治疗组合物。
一般而言，本发明的多肽是用于药物和治疗的多肽，特别涉及艰难梭菌领域，例如在针对艰难梭菌相关疾病(CDAD)的被动免疫中。本发明还提供了这类多肽在药物制造中的应用。
在一个具体实施方式中，本发明的多肽是用于预防、治疗哺乳动物中艰难梭菌感染或降低其严重程度的多肽。在一些实施方式中，本发明还提供了这类组合物在药物制造中的应用。
在体内模型中测试时，本发明的多肽和上文所述多肽，特别是Dif44和Dif208，出乎意料地显示其减少了艰难梭菌的肠道建群(实施例15)。具体地，这与孢子诱导疾病的复发相关，所述复发是艰难梭菌感染中最显著的临床问题之一。之前并未证明，提供针对艰难梭菌的保护性作用的实验性疫苗能够将艰难梭菌的肠道建群减少至与包含本发明的多肽和上文所述多肽(特别是Dif44和Dif208)的抗原组合相同的水平。
发明人证明，当给予对象引发针对艰难梭菌的保护性作用的抗原组合和Dif44或Dif208，随后使用艰难梭菌攻击时，可观察到肠道建群的减少。该作用表现为攻击后各时间点处粪便中脱落的艰难梭菌量，或者在实验终点处从肠道洗出物或组织回收的艰难梭菌量。与给予引发针对艰难梭菌的保护性作用的抗原组合并随后使用艰难梭菌攻击的对象相比，在给予引发针对艰难梭菌的保护性作用的抗原组合和Dif44或Dif208并随后使用艰难梭菌攻击的对象中，肠道建群减少。
因此，本发明的多肽和上文所述多肽(特别是Dif44和Dif208)特别用于治疗、预防艰难梭菌孢子诱导的疾病复发或降低其严重程度，或者用于治疗、预防或减少艰难梭菌的肠道建群。“减少”表示导致参数下降，优选统计学上显著的下降。因此，艰难梭菌的肠道建群的减少指，在对象接触艰难梭菌后特定时间点时(例如在对象接触艰难梭菌后1、2、3、4、5、6、7天、周或月)，对象肠道中艰难梭菌数目下降。该减少是，例如，与未给予本发明的多肽、组合物或疫苗的对象相比，与已给予引发针对艰难梭菌的保护性作用的组合物(该组合物优选不含Dif44、Dif51、Dif130、Dif153、Dif183、Dif192、Dif208、Dif208A和Dif232中的一种或多种，特别不含DIF44或DIF208)的对象相比，和/或与未给予引发针对艰难梭菌的保护性作用的任何组合物的对象相比。该减少可以是至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％。
因此，本发明的多肽可用于例如本文所述的免疫原性组合物、疫苗和医疗方法，但在与一种或多种其他抗原(优选提供针对艰难梭菌或针对CDAD的保护性作用的抗原)联用时特别有用。
当相关混合物(例如抗原或抗原组合)的给药预防和/或降低了后续感染或疾病的可能性、持续时间或严重程度，则可以说观察到了针对艰难梭菌或CDAD的保护性作用。这可使用本领域熟知的方法测试，例如其中将相关化合物给予对象和使用艰难梭菌攻击对象的那些。攻击的效果以例如攻击后存活的动物的百分比表示，且该值可与使用适当对照获得的值相比，例如不给予任何化合物或任何提供保护性作用的化合物。
提供针对艰难梭菌或CDAD的保护性作用的艰难梭菌抗原的示例是例如WO2013/084071中公开的那些，该文献的内容通过引用纳入本文。因此，诸如WO2013/084071中所述的那些试验可用于确定给定的化合物是否具有这类保护性作用。具体而言，全长艰难梭菌Tox A(或TcdA)抗原与全长艰难梭菌ToxB抗原的联用被视为黄金标准，并因此可作为保护性作用的阳性对照。因此，提供保护性作用的抗原的有效程度是黄金标准的至少50、60、70、80、90、95或100％。
提供针对艰难梭菌或针对CDAD的保护性作用的优选的艰难梭菌抗原及其组合公开于WO2013/084071。这些抗原也被称作艰难梭菌毒素抗原。本发明的免疫原性组合物优选还包含一种或多种其他抗原，优选提供针对艰难梭菌或针对CDAD的保护性作用的抗原。更优选地，该其他抗原是艰难梭菌毒素抗原。本发明的免疫原性组合物优选还包含(a)至少一种ToxB-GT抗原和(b)至少一种TcdA抗原。优选地，该ToxB-GT抗原和/或该TcdA抗原是脱毒的。
因此，优选的本发明的免疫原性组合物包含艰难梭菌抗原的组合，所述组合包含(a)选自下组的一种或多种多肽：Dif44、Dif51、Dif130、Dif153、Dif183、Dif192、Dif208、Dif208A和Dif232；(b)至少一种ToxB-GT抗原和(c)至少一种TcdA抗原，且优选包含艰难梭菌抗原的组合，所述组合包含(a)至少一种选自Dif44和Dif208的抗原；(b)至少一种ToxB-GT抗原和(c)至少一种TcdA抗原。本文所用“组合”指抗原的二价、三价或多价组合。组合优选能够引发保护性应答和/或治疗、预防或减少艰难梭菌的肠道建群。在使用组合时，个体组分可连续、同时或单独给予。
在一些实施方式中，该ToxB-GT抗原是包含特定氨基酸序列、由其组成或基本由其组成的多肽，该氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60具有80％或更高的相同性；和/或(b)是SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60的至少7个连续氨基酸的片段，或与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60具有80％或更高的相同性且包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60的表位的多肽片段。优选地，该ToxB-GT抗原包含SEQ ID NO:18、由其组成或基本由其组成。
在一些实施方式中，该TcdA抗原是包含特定氨基酸序列或由其组成的多肽，该氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:1具有80％或更高的相同性；和/或(b)是SEQ ID NO:1的至少7个连续氨基酸的片段，或与SEQ ID NO:1具有80％或更高的相同性且包含SEQ ID NO:1的表位的多肽片段。
在某些实施方式中，该免疫原性组合物包含或还包含ToxB-GT抗原和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种TcdA抗原，例如1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、2-9、3-8、4-7、5-6种TcdA抗原。优选地，一种或多种TcdA抗原选自(1)ToxA-ED抗原(SEQ ID NO:3)、(2)ToxA-GT抗原(SEQ ID NO:4)、(3)ToxA-CP抗原(SEQ ID NO:5)、(4)ToxA-T抗原(SEQID NO:6)、(5)ToxA-T4抗原(SEQ ID NO:7)、(6)ToxA-B抗原(SEQ ID NO:8)、(7)ToxA-PTA2抗原(SEQ ID NO:9)、(8)ToxA-P5-7抗原(SEQ ID NO:10)、(9)ToxA-P5-6抗原(SEQ ID NO:11)、(10)ToxA-P9-10抗原(SEQ ID NO:12)、(11)ToxA-B2抗原(SEQ ID NO:13)、(12)ToxA-B3抗原(SEQ ID NO:14)、(13)ToxA-B5抗原(SEQ ID NO:15)、(14)ToxA-B6抗原(SEQ ID NO:16)或全长TcdA抗原(SEQ ID NO:1)。更优选地，该TcdA抗原是ToxA-P5-6抗原，其包含SEQ ID NO:11、基本由其组成或由其组成。如本文他处讨论的那样，一种或多种TcdA抗原优选(a)与这些序列具有80％或更高的相同性，和/或(b)是这些序列中一种或多种序列的至少7个连续氨基酸的片段，或与这些序列中一种或多种序列具有80％或更高的相同性且包含相关序列的表位的多肽片段。
在某些实施方式中，该免疫原性组合物包含或还包含ToxA-GT抗原和1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多种TcdB抗原，例如1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、2-9、3-8、4-7、5-6种TcdA抗原，其任选地选自(1)ToxB-ED抗原(SEQ ID NO:17)、(2)ToxB-GT抗原(SEQ ID NO:18)、(3)ToxB-CP抗原(SEQ ID NO:19)、(4)ToxB-T抗原(SEQ ID NO:20)、(5)ToxB-B抗原(SEQ ID NO:21)、(6)ToxB-B2抗原(SEQ ID NO:22)、(7)ToxB-B7(SEQ ID NO:23)或(8)全长TcdB抗原(SEQ ID NO:2)。优选地，一种或多种TcdB抗原是ToxB-GT抗原，其具体包含SEQ ID NO:18、基本由其组成或由其组成。
在具体实施方式中，该免疫原性组合物包含或还包含ToxB-GT抗原和TcdA抗原，该TcdA抗原选自ToxA-P5-6和ToxA-B2。更具体地，该TcdA抗原是ToxA-P5-6。更具体地，该ToxA-P5-6抗原包含特定的氨基酸序列、基本由其组成或由其组成，该氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:11具有80％或更高的相同性；和/或(b)是SEQ ID NO:11的至少7个连续氨基酸的片段，或与SEQ ID NO:11具有80％或更高的相同性且包含SEQ ID NO:11的表位的多肽片段。
ToxB-GT抗原
全长TcdB抗原(在本文中也称作ToxB和毒素B(ToxinB))包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(由SEQ ID NO:31的核酸序列编码)。脱毒的TcdB抗原在本文中称作类毒素B。缩写“ToxB-GT”指ToxB的葡糖基转移酶结构域，其位于酶结构域(ED)的N端区域内(并示于图22)。ToxB-GT结构域(SEQ ID NO:18，由SEQ ID NO:47的核酸序列编码)是对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1-543的TcdB的片段。
本发明的组合物中包含的ToxB-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由其组成的多肽，该氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:18具有50％或更高的相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)是SEQ ID NO:18的至少“n”个连续氨基酸的片段，或与SEQ ID NO:18具有50％或更高的相同性的多肽片段，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:18的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO:18的C末端的一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或N末端的一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，而保留SEQ ID NO:18的至少一个表位。因此，ToxB-GT的氨基酸片段可包含例如SEQ ID NO:18的多至30、多至40、多至50、多至60、多至70、多至80、多至90、多至100、多至125、多至150、多至175、多至200、多至250、多至300、多至350、多至400、多至450、多至500或多至540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的组合物中包含的ToxB-GT抗原可以是脱毒的。脱毒可通过使用本领域已知的任何适当方法(如定点诱变)突变野生型ToxB-GT抗原的氨基酸序列或编码的核酸序列来实现。优选地，相对于SEQ ID NO:18的野生型ToxB-GT抗原序列，该ToxB-GT抗原包含一个或多个氨基酸取代(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多个突变)。例如，相对于SEQ ID NO:18的野生型ToxB-GT抗原序列，该ToxB-GT抗原包含一个或多个氨基酸取代(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个突变，例如在氨基酸位置17、102、139、269、270、273、284、286、288、384、449、444、445、448、449、450、451、452、455、461、463、472、515、518和/或520处。例如，该ToxB-GT抗原可在对应于SEQ ID NO:18的Tox-GT抗原序列的氨基酸270、273、284、286和/或288的1、2、3、4或5个位置处包含取代。具体而言，对应于SEQ ID NO:18的Tox-GT抗原序列的氨基酸270、273、284、286和/或288位置处的1、2、3、4或5个氨基酸可以被取代，优选使用丙氨酸残基取代。在这些位置处具有丙氨酸取代的脱毒ToxB-GT抗原的氨基酸序列示于SEQ ID NO:60。
当ToxB-GT包含两个氨基酸取代时，该取代优选不是在SEQ ID NO:18的ToxB-GT抗原序列的氨基酸位置102和278或氨基酸位置102和288处。因此，本发明的组合物中包含的脱毒ToxB-GT抗原可以是包含特定氨基酸序列或由其组成的多肽，该氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:60具有50％或更高的相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)是SEQ ID NO:60的至少“n”个连续氨基酸的片段，或与SEQ ID NO:60具有50％或更高的相同性的多肽片段，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540或更多)。因此，脱毒ToxB-GT的氨基酸片段包含例如SEQ ID NO:60的多至30、多至40、多至50、多至60、多至70、多至80、多至90、多至100、多至125、多至150、多至175、多至200、多至250、多至300、多至350、多至400、多至450、多至500或多至540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。优选的片段包含SEQ ID NO:60的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO:60的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、60、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:60的至少一个表位。
ToxA-GT抗原
全长TcdA抗原(在本文中也称作ToxA和毒素A(ToxinA))包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(由SEQ ID NO:30的核酸序列编码)。脱毒的TcdA抗原在本文中称作类毒素A。缩写“ToxA-GT”指ToxA的葡糖基转移酶结构域，其位于酶结构域(ED)的N端区域内。ToxA-GT结构域(SEQ ID NO:4，由SEQ ID NO:33的核酸序列编码)是对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1-541的TcdA的片段。
本发明的组合物中包含的ToxA-GT抗原是包含特定氨基酸序列或由其组成的多肽，该氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:4具有50％或更高的相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)是SEQ ID NO:4的至少“n”个连续氨基酸的片段，或与SEQ ID NO:4具有50％或更高的相同性的多肽片段，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:4的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO:4的C末端的一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或N末端的一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，而保留SEQ ID NO:4的至少一个表位。
因此，ToxA-GT的氨基酸片段包含例如SEQ ID NO:4的多至30、多至40、多至50、多至60、多至70、多至80、多至90、多至100、多至125、多至150、多至175、多至200、多至250、多至300、多至350、多至400、多至450、多至500或多至540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的组合物中包含的ToxA-GT抗原可以是脱毒的。脱毒可通过使用本领域已知的任何适当方法(如定点诱变)突变野生型ToxA-GT抗原的氨基酸序列或编码的核酸序列来实现。优选地，相对于SEQ ID NO:4的野生型ToxA-GT抗原序列，该ToxA-GT抗原包含一个或多个氨基酸取代(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多个突变)。例如，该ToxA-GT抗原可在对应于SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸283、285和287的1、2或3个位置处包含取代。具体而言，对应于SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸283、285和287的位置处的1、2或3个氨基酸可以被取代，优选使用丙氨酸残基取代。在这些位置处具有丙氨酸取代的脱毒ToxA-GT抗原的氨基酸序列示于SEQ ID NO:56。
当ToxA-GT抗原包含一个氨基酸取代时，该取代优选不在SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸位置278处。当ToxA-GT抗原包含两个氨基酸取代时，该取代优选不在SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸位置101和278处。当ToxA-GT抗原包含三个氨基酸取代时，该取代优选不在SEQ ID NO:4的ToxA-GT抗原序列的氨基酸位置101、278和519或氨基酸位置101、287和519处。
因此，本发明的组合物中包含的脱毒ToxA-GT抗原可以是包含特定氨基酸序列或由其组成的多肽，该氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:56具有50％或更高的相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)是SEQ ID NO:56的至少“n”个连续氨基酸的片段，或与SEQ ID NO:56具有50％或更高的相同性的多肽片段，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、250、300、400、500、540或更多)。优选的片段包含SEQ ID NO:56的表位。其它优选片段缺少SEQ ID NO:56的C末端的一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸和/或N末端的一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)氨基酸，而保留SEQ ID NO:56的至少一个表位。因此，脱毒ToxB-GT的氨基酸片段包含例如SEQ ID NO:56的多至30、多至40、多至50、多至60、多至70、多至80、多至90、多至100、多至125、多至150、多至175、多至200、多至250、多至300、多至350、多至400、多至450、多至500或多至540个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
TcdA抗原：TcdA抗原是包含特定氨基酸序列或由其组成的多肽，该氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO:1具有80％或更高的相同性；和/或(b)是SEQ IDNO:1的至少7个连续氨基酸的片段，或与SEQ ID NO:1具有80％或更高的相同性且包含SEQ ID NO:1的表位的多肽片段。其他的TcdA抗原包括(1)ToxA-ED抗原(SEQ ID NO:3)、(2)ToxA-GT抗原(SEQ ID NO:4)、(3)ToxA-CP抗原(SEQ ID NO:5)、(4)ToxA-T抗原(SEQ ID NO:6)、(5)ToxA-T4抗原(SEQ ID NO:7)、(6)ToxA-B抗原(SEQ ID NO:8)、(7)ToxA-PTA2抗原(SEQ ID NO:9)、(8)ToxA-P5-7抗原(SEQ ID NO:10)、(9)ToxA-P5-6抗原(SEQ ID NO:11)、(10)ToxA-P9-10抗原(SEQ ID NO:12)、(11)ToxA-B2抗原(SEQ ID NO:13)、(12)ToxA-B3抗原(SEQ ID NO:14)、(13)ToxA-B5抗原(SEQ ID NO:15)、(14)ToxA-B6抗原(SEQ ID NO:16)或全长TcdA抗原(SEQID NO:1)，如图22所示。
本发明所用的优选多肽包含特定氨基酸序列，该氨基酸序列：(a)与SEQID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、54、56、58、60、62、64、79、81、93、105、111、113、125、133、139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463或465具有50％或更高的相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)，例如90％的相同性或更高，或95％的相同性或更高，或99％的相同性或更高；和/或(b)包含SEQ ID NO:的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多；例如20或更多；或例如50或更多；或例如80或更多)。这些多肽包括SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、54、56、58、60、62、64、79、81、93、105、111、113、125、133、139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463或465的变体。优选的(b)的片段包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、54、56、58、60、62、64、79、81、93、105、111、113、125、133、139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463或465的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、54、56、58、60、62、64、79、81、93、105、111、113、125、133、139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463或465的C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、54、56、58、60、62、64、79、81、93、105、111、113、125、133、139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463或465的至少一个表位。因此，本发明的多肽的氨基酸片段可包含例如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、54、56、58、60、62、64、79、81、93、105、111、113、125、133、139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463或465的多至30、多至40、多至50、多至60、多至70、多至80、多至90、多至100、多至125、多至150、多至175、多至200、多至250、多至300、多至350、多至400、多至450、多至500、多至550、多至600、多至650、多至700个连续氨基酸残基的氨基酸序列。其它片段省去一个或多个多肽结构域。例如，可省去天然前导肽和/或分选酶识别序列。如他处所讨论的那样，优选的抑制艰难梭菌肠道建群的多肽是Dif44和Dif208(即SEQ ID NO:79、139、133和433，以及涉及208A和208B片段的SEQ ID NO 111、171、113和173)。优选地艰难梭菌毒素抗原是ToxB_GT(SEQ ID NO 18和60)和ToxA_p5-6(SEQID NO 11)。
术语“多肽”或“蛋白质”指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性或支链聚合物，可包含修饰的氨基酸，可被非氨基酸介入。该术语也包括天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。也包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其它修饰的多肽。多肽可以单链或结合链的形式出现。
本发明多肽可采取各种形式(如天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂化多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蔻酰化多肽、非肉豆蔻酰化多肽、单体、多聚体、颗粒、变性多肽等)。例如，本发明的多肽可不具有N端半胱氨酸。本发明还提供了N端半胱氨酸缺失的多肽(例如Dif51(SEQ ID NO:357)、Dif130(SEQ ID NO:359)和Dif183(SEQ ID NO:361))。本发明的多肽可不具有锚定结构域(例如Dif208(SEQ ID NO:433)、DIf208B(SEQ ID NO:173)和Dif232(SEQ ID NO:185))。
在一些实施方式中，序列相同性的程度是大于50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高(例如对本文所述序列和序列表中所列序列)。这些多肽包括同系物、直向同源物、等位基因变体和功能突变体。通常认为，两个多肽之间50％或更高的相同性表明其功能等同。优选通过MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定蛋白质之间的相同性，其中参数为缺口开放罚分＝12、缺口延伸罚分＝1。
在另一个实施方式中，可使用本发明的多肽的片段。该片段可包含序列中的至少n个连续氨基酸，且根据具体序列，n是10或更多(如12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多)。因此，该片段可包含例如多至30、多至40、多至50、多至60、多至70、多至80、多至90、多至100、多至125、多至150、多至175、多至200、多至250、多至300、多至350、多至400、多至450、多至500、多至640或多至1105个连续氨基酸残基的氨基酸序列。因此，该片段可包含例如小于30、小于40、小于50、小于60、小于70、小于80、小于90、小于100、小于125、小于150、小于175、小于200、小于250、小于300、小于350、小于400、小于450、小于500、小于640或小于1105个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在某些实施方式中，氨基酸片段可包含多肽，该多肽包含不超过50、不超过60、不超过75、不超过100、不超过150、不超过200、不超过250、不超过300、不超过350、不超过400个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选片段包含表位或是免疫原性片段。具体而言，该片段可包含来自序列的一个或多个表位。其它片段是(a)本发明的多肽的N端信号肽，(b)本发明的多肽，但不含其N端信号肽，以及(c)本发明的多肽，但不含其N端氨基酸残基。具体而言，本发明提供了片段Dif208A(CD2831)和Dif208B(CD2831)。这些片段的氨基酸序列总结于图1。
本文所用术语“片段”指是另一序列子集的序列。与氨基酸或核酸序列联用时，术语“片段”和“子序列”可互换使用。这些术语用于表示完整或完全的野生型多肽的一部分，但包含的氨基酸残基少于完整或完全的野生型多肽。因此，该术语指对应于野生型或参考多肽的一个或多个区域的截短或较短的氨基酸序列。片段的一个示例是表位序列。氨基酸序列的片段或子序列可以是任何特定数目的残基，该数目小于天然产生的多肽或参考多肽中发现的残基数目。当本发明涉及“表位”时，该表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位。这类表位可凭经验确定(例如，使用PEPSCAN[9,10]或相似方法)，或它们可被预测(如利用Jameson-Wolf抗原性指数[11]、基于矩阵的方法[12]、MAPITOPE[13]、TEPITOPE[14,15]、神经网络[16]、OptiMer和EpiMer[17,18]、ADEPT[19]、T位点(Tsites)[20]、亲水性[21]、抗原性指数[22]或[23-27等]中公开的方法等)。表位是由抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并与之结合的抗原某部分，它们也称作“抗原决定簇”。
本领域技术人员应理解，当这类片段是参考序列的截短或较短片段时，可对这类片段进行修饰以使其包含未在参考序列中发现的其他序列，例如以形成融合蛋白，包括“标签”序列(如组氨酸标签或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签)、接头序列等。因此，在这类经修饰的片段中，片段N端氨基酸的氨基基团未通过肽键与该氨基酸在参考多肽中连接的氨基酸的羧基基团相连，且/或片段C端氨基酸的羧基基团未通过肽键与该氨基酸在参考多肽中连接的氨基酸的氨基基团相连。
第一多肽和第二多肽的相同性百分比一般通过对所述第一多肽和第二多肽之间匹配位置的数量计数并将该数字除以最短多肽的总长度然后将所得值乘以100来确定。对于多肽片段而言，该值通常是约100％，因此几乎没有意义。因此，在本发明的片段内容中，采用术语“参考多肽百分比”(以百分数表示)。参考多肽百分比通过对片段和参考多肽之间的匹配位置计数，然后将该数字除以参考多肽的总长度，然后将所得值乘以100来计算。具体而言，片段将包含少于参考多肽序列的90％、80％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或少于参考多肽序列的20％。
因此，例如，本发明的组合物、疫苗和方法中所用多肽可具有序列表中所列序列，或可以是其变体和/或片段，如他处所述。就使用的这类变体和/或片段而言，其与序列表中所列序列共有功能特性。例如，序列表中所列艰难梭菌毒素序列的变体和/或片段优选共有具有所列序列的多肽的能力以提供针对艰难梭菌的保护性作用(例如与相关或相应序列表中所列艰难梭菌毒素序列相比，提供至少是其50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的保护性作用)。序列表中所列艰难梭菌多肽Dif44、Dif51、Dif130、Dif153、Dif183、Dif192、Dif208和Dif232的变体和/或片段优选共有具有所列序列的多肽的能力以减少艰难梭菌的肠道建群(例如与相关或相应序列表中所列艰难梭菌多肽Dif44、Dif51、Dif130、Dif153、Dif183、Dif192、Dif208和Dif232相比，获得至少是其50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的艰难梭菌肠道建群减少)。
本发明所用多肽可通过各种方式(如重组表达、由细胞培养物纯化、化学合成等)制备。通常，本发明的多肽优选以纯化或基本纯化的形式提供(即基本不含其它多肽(如不含天然产生的多肽)，特别是不含其它艰难梭菌或宿主细胞多肽)，且其纯度通常为至少约50％纯(以重量计)，且通常至少约90％纯(即组合物中少于约50％，更通常少于约10％(如5％)是其它表达的多肽)。因此，组合物中的多肽与表达该分子的完整生物体分离。
在优选实施方式中，本发明提供了包含特定氨基酸序列、基本由其组成或由其组成的多肽，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO 79,81、93、105、111、113、125、133,139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435,437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463和465，其是免疫原性的。
在本文所述的多肽或蛋白质的语境中，术语“免疫原性的”用于表示，例如当用于免疫对象(优选哺乳动物，更优选人或小鼠)时，抗原或多肽能引起针对其衍生源性野生型艰难梭菌蛋白质的免疫应答(如体液或细胞免疫应答，优选同时引起上述两种应答)。免疫原性多肽通常表示抗原性。当某一分子能够特异性与免疫系统的抗原识别分子(如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)相互作用时，则称该分子具有“抗原性”。抗原性多肽含有的表位具有至少约5个氨基酸，且具体而言至少约10个、至少15个、至少20个或至少25个氨基酸。多肽的抗原性部分也称为表位，可以是对抗体或T细胞受体识别具有优势免疫的那部分，或者其可以是用于通过将抗原性部分与载体多肽偶联以进行免疫从而生成针对该分子的抗体的那部分。本领域技术人员应理解，抗原性分子本身不需要是免疫原性的，例如一些抗原需要佐剂或载体的存在以使其能够引发免疫应答。
术语“抗原”指一种分子，对象可针对该分子起始免疫应答，例如体液和/或细胞免疫应答。对组合物或疫苗的“免疫应答”指对感兴趣的组合物或疫苗在宿主中发展细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于一种或多种以下效果：特异性针对感兴趣的组合物或疫苗中包括的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的生产。优选地，对象会显示治疗性或保护性免疫应答，从而增强对新感染的抗性和/或降低疾病的临床严重程度。这类保护显示为：通常由受感染对象显示的症状的减少或缺失、较快的恢复时间和/或受感染宿主中病原体或细菌荷载下降。本文所用术语“免疫原性的”蛋白质或多肽指引起上述免疫应答的氨基酸序列。
杂交艰难梭菌多肽
本发明所用的多肽可以单独分开多肽的形式存在于组合物中。然而，使用一种以上多肽时，它们不必须以分开多肽的形式存在。取而代之的是，至少两种(如2、3、4、5或更多种)多肽可以单一多肽链(“杂交”多肽)表达。杂交多肽具有以下两个主要优点：首先，本身不稳定或者表达较差的多肽可以通过加入能够克服该问题的合适杂交伴侣得到改善；其次，商业生产得以简化，因为只需利用一次表达和纯化以生产可作抗原应用的两种多肽。与单独或简单混合形式的至少两种多肽中的一种或多种多肽相比，至少两种多肽的杂交多肽还可具有更强的免疫原性。杂交多肽可包含来自各本发明多肽的两种或更多种多肽序列，或在该序列在菌株之间有部分变化的情况下，可包含相同多肽的两种或更多种变体。可使用由两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种多肽的氨基酸序列组成的杂交体。在一些实施方式中，使用了由两种、三种、四种或五种多肽(如两种或三种多肽)的氨基酸序列组成的杂交体。不同的杂交多肽可以在单一制剂中混合在一起。杂交体可与非杂交多肽混合。在这类组合中，多肽可以多于一种杂交多肽和/或非杂交多肽的形式存在。然而，多肽通常以杂交体或者作为非杂交体存在，但不同时以两种形式存在。杂交多肽也可与下述偶联物或非艰难梭菌多肽组合。
杂交多肽可表示为NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH，其中：X是艰难梭菌多肽的氨基酸序列，如上所述；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列；n是2或更大的整数(如2、3、4、5、6等)。n通常是2或3。如果-X-部分具有野生型形式的前导肽序列，则在杂交多肽中可以包含或者略去该序列。在一些实施方式中，前导肽可缺失，除非-X-部分位于杂交多肽的N-末端，即保留X1的前导肽，但略去X2…Xn的前导肽。这相当于删除所有前导肽并使用X1的前导肽作为-A-部分。在{-X-L-}的各个n值的情况下，接头氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如，当n＝2时，杂交体可以是NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-一般较短(如20个或更少个氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。示例包括有利于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接头(即包含Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)，和组氨酸标签(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合适的接头氨基酸序列对本领域技术人员而言是显而易见的。有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO:351)或GSGSGGGG(SEQ ID NO:352)，Gly-Ser二肽由BamHI限制位点形成，因而有助于克隆和操作，(Gly)4四肽是常用的多聚甘氨酸接头。其他合适接头，尤其用作最后一个Ln的接头是ASGGGS(SEQ ID NO:353)或Leu-Glu二肽。-A-是任选的N末端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少个氨基酸，即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。示例包括指导蛋白质运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合适的N-末端氨基酸序列对于本领域技术人员来说是显而易见的。如果X1缺少其自身的N末端甲硫氨酸，-A-通常是提供N末端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，如Met-Ala-Ser或单个Met残基。-B-是任选的C末端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少个氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。示例包括指导蛋白质运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(如包含组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，或能提高蛋白质稳定性的序列。其它合适的C末端氨基酸序列对于本领域技术人员来说是显而易见的。使用杂交多肽时，杂交体内的单个多肽(即单个-X-部分)可来自一种或多种菌株。例如，n＝2时，X2可来自与X1相同的艰难梭菌菌株，或来自不同的艰难梭菌菌株。当n＝3时，该菌株可以是(i)X1＝X2＝X3(ii)X1＝X2≠X3(iii)X1≠X2＝X3(iv)X1≠X2≠X3或(v)X1＝X3≠X2等。
在(c)组内，缺失或取代可在N末端和/或C末端，或者可以在两个末端之间。因此，截短是缺失的一个例子。截短可包括在N末端和/或C末端缺失多达40个(或更多个)氨基酸。N末端截短可移除前导肽，例如，以有利于在异源宿主中重组表达。C末端截短可移除锚定序列例如有利于在异源宿主中重组表达。根据本发明，Xn可包含选自下组的两种或多种抗原的氨基酸序列：Dif44、Dif51、Dif130、Dif153、Dif183、Dif192、Dif208、Dif208A、Dif232、ToxB-GT抗原和TcdA抗原。各Xn可以是本发明的抗原组合中的抗原的氨基酸序列(如上文所述)。在某些实施方式中，n是2。当n是2时，X1通常是ToxB-GT抗原且通常是TcdA抗原，但两种上述抗原的任何其他组合也可用于本发明。例如，当n是3时，可使用三种上述抗原的任何组合。例如，当n是4时，可使用四种上述抗原的任何组合。通常，两个或更多个的Xn可以是同一抗原，或者当n是2、3或4时，各Xn可以是不同的抗原。当两个或多个Xn是同一抗原的序列时，所述两个或多个Xn可具有相同多肽序列或不同多肽序列，例如可以是给定抗原的不同变体或片段，如上文所述。当这些抗原定义为(a)与给定序列具有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含给定序列的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)时，对于各X而言，(a)中的相同性水平和(b)中“n”的值可以是相同的。本发明所用多肽可包含序列-P-Q-或-Q-P-，其中：-P-是上文定义的氨基酸序列，-Q-不是上文定义的序列(即以融合蛋白的形式提供)。-P-的N-末端密码子不是ATG且此密码子未出现在多肽的N末端时，它将被翻译成该密码子的标准氨基酸，而不是Met。然而，当该密码子位于多肽N末端时，它将被翻译成Met。-Q-部分的示例包括但不限于：组氨酸标签(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更高)、麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。本发明中所用多肽可在异源宿主中进行表达(重组表达)，例如在大肠杆菌中。异源宿主可以是原核(例如细菌)或真核生物。作为非限制性示例，其他合适的宿主包括枯草杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、乳酰胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseriacinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如结核分支杆菌(M.tuberculosis))、酵母等。本领域技术人员应理解，在这类宿主中改变密码子以优化表达效率而不影响编码的氨基酸可能是有帮助的。
核酸
在另一个实施方式中，本发明编码氨基酸序列的核酸，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO 79、81、93、105、111、113、125、133、139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463和465。SEQID NO 79、139、133、433、111、171、113和173是优选的。具体的核酸序列是SEQ ID NO:78、80、92、104、110、112、124、132、138、140、152、164、170、172、184、186、188、356、358、360、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462和464。SEQ ID NO 78、132、138、432、110、170、112和172是优选的。
可根据遗传密码设计编码抗原组合的肽的核酸序列。因此，这类核酸序列可编码SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、54、56、58、60、62、64中的一种或多种(如编码ToxB和TcdA分子)，或可包含SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、55、57、59、61、63、65、66、67、68、69中的一种或多种。
这些核酸适用于组合物中，例如在疫苗或其他免疫原性组合物中。该核酸(例如核酸组合、载体或载体组合)编码本发明所用多肽、本发明所用多肽或杂交多肽组合。还可使用包含特定核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码本发明的抗原组合的一种或多种(例如2、3或4种)多肽或杂交多肽。核酸可以是例如载体(例如克隆或表达载体)。编码本发明多肽的核酸(通常是DNA)可用于基于核酸免疫的组合物、方法和应用。现在，核酸免疫是一个成熟的领域(参见参考文献28-35等)。
可用于本发明的组合物的本发明的核酸是SEQ ID NO:78、80、92、104、110、112、124、132、138、140、152、164、170、172、184、186、188、356、358、360、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462和464，以及SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、55、57、59、61、63、65、66、67、68、69。此外，包含与这类核苷酸序列具有序列相同性的核酸序列的核酸也可用于本发明的组合物。序列之间的相同性优选通过Smith-Waterman同源性搜索算法(如上文所述)确定。这类核酸包括使用替代密码子编码相同氨基酸的那些核酸。替代密码子的使用有助于疫苗接种后哺乳动物中的表达。
因此，可使用包含与任意所述核酸具有50％或更高相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高，例如90％相同性或更高，或95％相同性或更高，或99％相同性或更高)的核苷酸序列的核酸。本发明的组合物中也可使用与选自下组的核酸杂交的核酸：SEQ ID NO:78、80、92、104、110、112、124、132、138、140、152、164、170、172、184、186、188、356、358、360、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462和464，以及SEQ ID NO:30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、55、57、59、61、63、65、66、67、68、69。可以在不同“严谨性”的条件下进行杂交反应。增加杂交反应严谨性的条件在本领域众所周知且已发表。相关条件的示例包括(按严谨性提高的顺序)：25℃、37℃、50℃、55℃和68℃的孵育温度；10x SSC、6x SSC、1x SSC、0.1x SSC的缓冲液浓度(其中SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)和使用其它缓冲液体系的等同条件；0％、25％、50％和75％的甲酰胺浓度；5分钟至24小时的孵育时间；1个、2个或更多个洗涤步骤；1、2或15分钟的洗涤孵育时间；和6x SSC、1x SSC、0.1x SSC或去离子水的洗涤溶液。杂交技术及其优化方法是本领域众所周知的[例如，参见参考文献36，37等]。在一些实施方式中，本发明核酸与靶标在低严谨条件下杂交；在其它实施方式中，其在中等严谨条件下杂交；在优选实施方式中，其在高严谨条件下杂交。一组示例性的低严谨杂交条件是50℃和10x SSC。一组示例性的中等严谨杂交条件是55℃和1x SSC。一组示例性的高严谨杂交条件是68℃和0.1x SSC。
在一些组合物中，可使用上文所述核酸序列的片段(如具有序列表中所列特定序列的分子的片段或上文所定义的变体的片段，其参考与序列表中所列特定序列的杂交能力或序列相同性百分比来定义)。在本发明的某些实施方式中，核酸的长度为至少7个核苷酸(如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300个核苷酸或更长)。在本发明的某些实施方式中，核酸长度至多为500个核苷酸(如450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15个核苷酸或更短)。核酸片段优选编码序列表中所列特定序列的表位。
本发明所述核酸可采取各种形式(如单链、双链、载体、引物、探针、标记等)。本发明的核酸可以是环状或分支的，但通常是线性的。除非另有说明或要求，利用核酸的本发明任何实施方式可采用双链形式和构成该双链形式的两条互补单链形式中的每条链。引物、探针以及反义核酸通常是单链。涉及核酸时，术语“互补”或“互补的”指沃森-克里克碱基配对。因此，C的互补物是G，G的互补物是C，A的互补物是T(或U)，T(或U)的互补物是A。也能使用如I(嘌呤肌苷)的碱基，例如与嘧啶(C或T)互补。
可使用编码本文所述抗原的核酸，例如：产生多肽；作为检测生物样品中的核酸的杂交探针；产生额外的核酸拷贝；产生核酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针；或作为形成三链体的寡核苷酸。本发明提供了产生编码本文所述抗原的核酸的方法，其中所述核酸部分或完全用化学方式合成。本发明提供了包含编码本文所述抗原的核苷酸序列的载体(如克隆或表达载体)和用这种载体转化的宿主细胞。
核酸免疫
编码多肽的核酸可在递送给哺乳动物后进行体内表达，然后表达的多肽刺激免疫系统。活性成分通常采用核酸载体形式，其包含：(i)启动子；(ii)可操作连接于启动子的多肽编码序列；以及任选的(iii)可选择标志物。在一些实施方式中，所述载体还可包含(iv)复制起点；以及(v)位于(ii)下游并与其可操作连接的转录终止子。通常，(i)和(v)为真核的，(iii)和(iv)为原核的。典型的启动子是病毒启动子，如来自巨细胞病毒(CMV)的病毒启动子。除启动子以外，载体还可以包含转录调节序列(如增强子)与启动子功能性相互作用。载体可包含立即早期CMV增强子/启动子，且还可包含CMV内含子A。将该启动子可操作连接于编码多肽的下游序列，从而使多肽编码序列的表达在该启动子的控制之下。当使用标志物时，通常其在微生物宿主中(如原核生物、细菌、酵母中)具有功能。标志物通常是原核选择标志物(如在原核启动子控制之下转录)。方便起见，典型的标志物为抗生素抗性基因。该载体通常选自主复制附加体或染色体外载体，如质粒。该载体通常包括复制起点。该复制起点通常在原核生物中有活性而在真核生物中无活性。因此，载体可包含用于选择载体的原核标志物、原核复制起点以及驱动多肽编码序列转录的真核启动子。因此载体(a)在原核宿主中扩增并选择，但不进行多肽表达，而(b)在真核宿主中表达，但不进行扩增。这种配置对于核酸免疫载体来说是理想的。该载体可以在编码序列下游包含真核转录终止序列。这能增强转录水平。当编码序列本身不包含聚腺苷酸化序列时，载体可包含聚腺苷酸化序列，例如来自牛生长激素的聚腺苷酸化序列。该载体可包含多克隆位点。
除多肽和标志物的编码序列外，载体还可以包含第二真核编码序列。载体还可在该第二序列上游包含IRES(内部核糖体进入位点)，以从与该多肽相同的转录物中翻译第二真核多肽。或者，多肽编码序列可以在IRES的下游。该载体可包含非甲基化CpG基序，如非甲基化DNA序列，它们都在鸟苷之前有一个胞嘧啶，侧接有两个5'嘌呤和两个3'嘧啶。已证明非甲基化形式的这些DNA基序是多种类型免疫细胞的强效刺激因子。载体可以靶向方式进行递送。例如，参考文献38-43中描述了受体介导的DNA递送技术。在基因治疗方案中，以约100ng-约200mg DNA的范围局部给予包含核酸的治疗性组合物。在基因治疗方案中也能使用浓度范围是约500ng-约50mg，约1μg-约2mg，约5μg-约500μg以及约20μg-约100μg DNA。诸如作用方法(如增强或抑制编码基因产物的水平)以及转化和表达效率等因素是影响最终效果所需剂量的考虑因素。当需要在更大面积组织上更强表达时，可能需要更大量的载体或在连续给药方案中重复给予相同量，或对不同相邻或紧密组织部分多次给药，以实现积极的治疗效果。在所有情况下，临床试验中的常规实验方法可确定最优治疗效果的特定范围。可用基因递送载剂来递送载体。基因递送运载体可以是病毒或非病毒来源(通常参见参考文献44-47)。本领域熟知用于递送所需核酸并在所需细胞中表达的基于病毒的载体。示例性基于病毒的载体包括但不限于：重组逆转录病毒(例如参考文献48-58)，基于α病毒的载体(如辛德毕斯病毒载体、西门利克森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCCVR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCCVR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532)；还可以使用这些病毒的杂交体或嵌合体)、痘病毒载体(如牛痘、鸟痘、金丝雀痘、改性安卡拉牛痘等)、腺病毒载体和腺伴随病毒(AAV)载体(例如参见参考文献59-64)。还能给予与杀死的腺病毒连接的DNA[65]。
还能使用非病毒递送运载体和方法，包括但不限于：连接或不连接杀死的腺病毒的聚阳离子凝聚DNA[如65]，配体连接的DNA[66]，真核细胞递送运载体细胞[如参考文献67-71]和核电荷中和或与细胞膜融合。还能使用裸露DNA。参考文献72和73中描述了示例性裸露DNA引入方法。参考文献74-78中描述了可作为基因递送运载体的脂质体(如免疫脂质体)。参考文献79和80中描述了其它方法。其它适用的非病毒递送包括机械递送系统，如参考文献80所述的方法。.而且，通过光聚合水凝胶材料沉积或使用电离辐射可对此编码序列和其表达产物进行递送[如参考文献81和82]。其它可用于递送编码序列的常规基因递送方法包括例如，使用手持式基因传递颗粒枪[83]或使用离子辐射激活转移的基因[81和82]。使用PLG(聚丙交酯乙交酯共聚物)微粒递送DNA是一个尤其优选的方法，如吸附于微粒上，微粒任选处理成表面带负电(如用SDS处理)或带正电(如用阳离子去垢剂如CTAB处理)。
核酸通常以纯化或基本纯化的形式提供，即基本不含其它核酸(如不含天然产生的核酸)，特别是不含其它艰难梭菌或宿主细胞核酸，通常其至少为约50％纯(以重量计)，通常至少为约90％纯。可以多种方式制备本发明中使用的核酸，例如，完全或部分化学合成(例如DNA的亚磷酰胺合成)、利用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)、由基因组或cDNA文库制备等。术语“核酸”通常包括任何长度的核苷酸聚合形式，其包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体。它也包括DNA或RNA类似物，如含有修饰主链(如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰碱基的类似物。因此，本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、分枝核酸、质粒、载体、探针、引物等。当本发明的核酸采取RNA形式时，其可能具有或不具有5'帽。
核酸可以是载体的一部分，即设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建物的一部分。载体可以是，例如，设计用于分离、增殖和复制所插入核苷酸的“克隆载体”、设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”、设计用于产生重组病毒或病毒样颗粒的“病毒载体”或具有多于一种载体类型的属性的“穿梭载体”。典型的载体是质粒。“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是外源核酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然、偶然或有意的突变和/或改变，这些后代与原始亲本细胞(在形态或总DNA互补方面)不必完全相同。宿主细胞包括使用本发明的核酸体内或体外转染或感染的细胞。
应理解，当核酸是DNA时，RNA序列中的“U”被DNA中的“T”所替代。相似地，应理解当核酸是RNA时，DNA序列中的“T”被RNA中的“U”所替代。涉及核酸时，术语“互补”或“互补的”指沃森-克里克碱基配对。因此，C的互补物是G，G的互补物是C，A的互补物是T(或U)，T(或U)的互补物是A。也能使用如I(嘌呤肌苷)的碱基，例如与嘧啶(C或T)互补。
抗体
在另一个实施方式中，提供了能够结合特定多肽的抗体，所述多肽由选自下组的氨基酸序列编码：SEQ ID NO 1、23、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、54、56、58、60、62、64、79、81、93、105、111、113、125、133、139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435,437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463和465。更优选地，该组由SEQ ID NO 79、139、133、433、111、171、113和173组成。
本文所述抗体能够结合本发明中使用的多肽，并因此包括结合本文所述序列的变体和/或片段那样的多肽，如他处所述。具体而言，能够结合本发明的多肽的抗体是中和抗体。术语中和抗体指能够结合特定蛋白质、多肽或感染体从而抵消或减少所述蛋白质、多肽或感染体作用的抗体。更具体地，中和抗体是能够中和或减弱病原体在宿主中起始和/或保持感染的能力(例如减少或限制生长、组织连接、扩散、组织损伤等)的抗体。
针对本发明的艰难梭菌多肽的抗体可用于上文所述方法中的被动免疫。因此，本发明提供了一种组合物，其包含能够结合包含本文所公开氨基酸序列的多肽的至少一种抗体。提供了本发明中的抗体组合以进行同时、单独或连续给药。本发明还提供了包含这类抗体的免疫原性和药物组合物。因此，在本发明中，术语“抗体”包含本发明的抗体的组合。具体而言，本发明提供了抗体组合，其包含：(a)识别选自下组的抗原的一种或多种抗体：Dif44抗原、Dif51抗原、Dif130抗原、Dif153抗原、Dif183抗原、Dif192抗原、Dif208抗原、Dif208A抗原和Dif232抗原，优选Diff44或Dif208抗原(b)识别ToxB-GT抗原的抗体和(c)识别TcdA抗原(优选ToxA_p5_6)的抗体。该组合可以组合物的形式存在。
组合物包含可用于治疗的抗体。本发明还提供了本发明的抗体在药物和治疗中的应用，例如用于针对CDAD的被动免疫。本发明还提供了此类抗体在药物制造中的应用。本发明还提供了一种治疗哺乳动物的方法，该方法包括给予有效量的本发明抗体的步骤。如上文中关于组合物的描述，这些方法和应用能够保护哺乳动物对抗艰难梭菌感染。具体地，本发明的抗体可用于治疗或预防艰难梭菌引起的感染的方法，所述方法包括向哺乳动物给予治疗有效量的上述抗体组合或包含这类抗体的组合物的步骤。在这些方法中，至少2种(例如2、3或4种)本发明的抗体可同时、单独或连续给予。
本发明的抗体通常特异性结合至来自艰难梭菌的多肽，例如以1μM、100nM、10nM、1nM、100pM或更紧密的亲和性进行上述结合。术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子及其能结合多肽的片段。它们包括杂交(嵌合)抗体分子[84,85]；F(ab′)2和F(ab)片段和Fv分子；非共价异源二聚体[86,87]；单链Fv分子(sFv)[88]；二聚和三聚抗体片段构建物；微型抗体[89,90]；人源化抗体分子[91-93]；任何获自此类分子的功能性片段，以及通过非常规工艺(如噬菌体展示)获得的抗体。在一些实施方式中，该抗体是单克隆抗体。获取单克隆抗体的方法为本领域熟知。在一些实施方式中，该抗体是人源化或完全是人的抗体。
本发明还提供了包含本发明的抗体组合的组合物。例如，提供了包含不同抗体组合的组合物，所述抗体对至少三种(即3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种)本发明的抗原(包括所述抗原中任一种的变体和免疫原性片段)组合具有特异性，以及用于制备本发明的抗体组合混合物的方法，所述方法包括混合上文所定义的任意抗体组合中抗体的步骤。例如，本发明提供了一种包括混合至少两种(即2、3或4种)抗体的步骤的方法，所述抗体选自识别本发明的艰难梭菌多肽和/或其表位的抗体。用于制备抗体混合物的本发明的方法可包括将该混合物配制为药物的额外步骤。这类方法还可包括包装该制剂的步骤，以用于以药物的形式存储或分配。
抗生素
在某些情况下，如在使用抗生素治疗或给药期间或之后，肠道菌群的天然平衡被干扰。结果是，艰难梭菌更普遍地导致感染症状。因此，本发明的组合物可与抗生素联用以治疗潜在病症并同时预防或治疗任何艰难梭菌感染。
在一个实施方式中，该方法包括在给予抗生素后给予有效量的本发明组合物。作为替代方案，该方法包括在给予本发明组合物后给予抗生素。作为其他替代方案，该方法包括在给予本发明组合物的同时给予抗生素。因此，抗生素和有效量的一种或多种多肽可连续或单独给予。通常，这些方法中使用的抗生素应适用于治疗潜在的但已知与艰难梭菌AAD相关的感染。虽然任何抗生素都可导致抗生素相关腹泻或较严重的艰难梭菌感染相关病症之一，但最常见的致病物是氨苄青霉素、克林霉素、头孢菌素(如头孢泊肟)和所有氟喹诺酮。因此，这些方法特别适用于涉及本领域已知抗生素的治疗方案，所述抗生素与艰难梭菌AAD频繁联系。因此，在一些实施方式中，本发明的组合物还可包含抗生素，如上文所列抗生素。
组合物和药物
在另一个实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含：(a)包含特定氨基酸序列的一种或多种多肽，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO 71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187189、190、191、193、195、260、262、264、266、268、270、272、274、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、331、357、359、361、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457；和/或
(b)编码(a)中所列氨基酸序列的一种或多种核酸序列，该核酸序列选自：SEQ ID NO 70、72、74、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、192、194、259、261、263、275、267、269、271、273、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、356、358、360、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462和464和/或
(c)能够结合包含(a)中所列氨基酸序列的多肽的一种或多种抗体，或者能够结合包含(a)中所列氨基酸序列的多肽的一种或多种抗体，其中所述抗体是中和抗体。
在所有情况下，优选的分子具有序列SEQ ID NO 79、81、93、105、111、113、125、133、139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463和465或者编码或结合至具有这些序列的分子，且特别优选的分子具有序列SEQ ID NO 79、139、133、433、111、171、113和173或者编码或结合至具有这些序列的分子。
在其他实施方式中，本发明的组合物包含至少一种药物载体和/或赋形剂。具体地，本发明的组合物是药物组合物或疫苗组合物。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种包含多肽组合的组合物，该多肽组合包含至少一种特定多肽、基本由其组成或由其组成，该特定多肽选自：SEQ ID NO71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187189、190、191、193、195、260、262、264、266、268、270、272、274、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、331、357、359、361、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463和465。具体地，这类组合物包含多肽组合，该多肽组合包含两种或更多种(即2、3或更多种)选自上组的氨基酸序列、基本由其组成或由其组成。具体地，优选组合物可包含多肽组合，该多肽组合包含选自下组的至少一种多肽、基本由其组成或由其组成，该多肽选自：SEQ ID NO 79、81、93、105、111、113、125、133、139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463和465，或者选自：SEQ ID NO 79、139、133、433、111、171、113和173。具体地，这类优选组合物可包含多肽组合，该多肽组合包含选自下组的两种或更多种(即2、3或更多种)氨基酸序列、基本由其组成或由其组成，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO 79、81、93、105、111、113、125、133、139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、465、463和465，或者选自：SEQ ID NO 79、139、133、433、111、171、113和173。
优选的本发明组合物可包含至少一种特定氨基酸序列、基本由其组成或由其组成，该氨基酸序列编码选自下组的至少一种多肽：Dif44(CD0844)、Dif51(CD0999)、Dif130(CD2645)、Dif192(CD1035)、Dif183(CD3669)、DIF153(CD2830)、Dif232(CD1031)、Dif208(CD2831)和Dif208A。具体地，这类优选组合物包含艰难梭菌多肽组合，更具体地包含选自下组的两种或更多种(即2、3、4种)多肽、基本由其组成或由其组成，该多肽选自Dif44(CD0844)、Dif51(CD0999)、Dif130(CD2645)、Dif192(CD1035)、Dif183(CD3669)、DIF153(CD2830)、Dif232(CD1031)、Dif208(CD2831)和Dif208A。特别优选的是Dif44(CD0844)和Dif208(CD2831)。
特定的本发明组合物可包含以下多肽、基本由其组成或由其组成：多肽DIF44(CD0844)和多肽DIF192(CD1035)；和/或多肽DIF51(CD0999)和多肽DIF130(CD2645)；和/或多肽DIF232(CD1031)和多肽DIF208(CD2831)；和/或多肽Dif183(CD3669)和多肽DIF225(CD0438)；和/或多肽DIF44(CD0844)和多肽DIF51(CD0999)；和/或多肽DIF130(CD2645)和多肽DIF192(CD1035)；和/或多肽Dif183(CD3669)和多肽DIF153(CD2830)；和/或多肽DIF232(CD1031)和多肽DIF208A(CD2831)。多肽Dif44(CD0844)、Dif51(CD0999)、Dif130(CD2645)和/或Dif192(CD1035)；和/或多肽Dif183(CD3669)、DIF153(CD2830)、Dif232(CD1031)和/或Dif208(CD2831)；和/或多肽Dif183(CD3669)、DIF153(CD2830)、Dif232(CD1031)和/或Dif208A(CD2831)；和/或多肽DIF44(CD0844)、DIF153(CD2830)和/或Dif208(CD2831)；和/或多肽DIF44(CD0844)、DIF153(CD2830)和/或Dif208A(CD2831)；和/或多肽Dif51(CD0999)、Dif130(CD2645)、Dif183(CD3669)、DIF192(CD1035)和/或DIF232(CD1031)；和/或多肽DIF44(CD0844)和一种或多种(例如2、3、4、5、6、7种)或至少1、2、3、4、5或6种的多肽DIF51(CD0999)、DIF130(CD2645)、DIF153(CD2830)、DIF192(CD1035)、DIF208(CD2831)、Dif183(CD3669)和DIF232(CD1031)，例如多肽DIF44和一种或多种(例如2、3、4种)或至少1、2或3种的多肽DIF153、DIF192、DIF208、Dif183和Dif232，例如DIF44和DIF153、DIF44和DIF192、DIF 44和DIF208、DIF 44和Dif183、DIF 44和DIF232；和/或多肽DIF208(CD2831)和一种或多种(例如2、3、4、5、6、7种)或至少1、2、3、4、5或6种的多肽DIF 44(CD0844)、DIF51(CD0999)、DIF130(CD2645)、DIF153(CD2830)、DIF192(CD1035)、Dif183(CD3669)和DIF232(CD1031)，例如多肽DIF208和一种或多种(例如2、3、4种)或至少1、2或3种的多肽DIF44、DIF153、DIF192、Dif183和Dif232，例如DIF208和DIF153、DIF208和DIF192、DIF208和Dif183、DIF208和DIF232；和/或多肽DIF44(CD0844)、Dif208(CD2831)，和一种或多种(例如2、3、4、5、6种)或至少1、2、3、4或5种的DIF51(CD0999)、DIF130(CD2645)、DIF153(CD2830)、DIF192(CD1035)、Dif183(CD3669)和DIF232(CD1031)，例如多肽DIF44(CD0844)、Dif208(CD2831)，和一种或多种(例如2、3、4种)或至少1、2或3种的多肽DIF153、DIF192、Dif183和Dif232。
可使用编码的核酸分子和/或针对所列分子的抗体制备等价的组合或组合物，从而可使用编码所述肽组合的核酸分子组合，如同可在本发明组合物中使用针对所列分子的抗体的组合。具体地，本发明的组合物是免疫原性组合物。
如上文所述，所有上述本发明的组合物和组合都还可包含一种或多种额外的抗原，例如提供针对艰难梭菌或针对CDAD的保护性作用的那些，编码这类抗原或结合这类抗原的分子(如抗体)的分子。相关分子以及这些分子的序列提供于本文各处。
同样，优选的本发明组合物可包含以下组合、基本由其组成或由其组成：ToxB-GT和TdcA和选自下组的至少一种多肽：Dif44(CD0844)、Dif51(CD0999)、Dif130(CD2645)、Dif192(CD1035)、Dif183(CD3669)、DIF153(CD2830)、Dif232(CD1031)和Dif208(CD2831)，例如选自下组两种或更多种(即2、3、4种)多肽：Dif44(CD0844)、Dif51(CD0999)、Dif130(CD2645)、Dif192(CD1035)、Dif183(CD3669)、DIF153(CD2830)、Dif232(CD1031)和Dif208(CD2831)。
所有上文所列DIF44、DIF51、DIF130、DIF153、DIF192、DIF208、Dif183和/或DIF232多肽的组合都可额外地与ToxB-GT和TcdA联合制备，如上文所描述和定义。TcdA选自ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5、ToxA-B6和/或ToxA-B7，且优选的组合是TcdA是ToxA-P5-6的组合。最优选的组合是(i)ToxB-GT、ToxA-P5-6和DIF44，(ii)ToxB-GT、ToxA-P5-6和DIF208，(iii)ToxB-GT、ToxA-P5-6、DIF44和DIF208。
这类组合的示例包括以下抗原组合：
Tox-GT+TdcA+Dif208；Tox-GT+TdcA+Dif208A；Tox-GT+TdcA+Dif51；Tox-GT+TdcA+Dif44；Tox-GT+TdcA+Dif130；Tox-GT+TdcA+Dif192；Tox-GT+TdcA+Dif183；Tox-GT+TdcA+Dif153；Tox-GT+TdcA+Dif232。
因此，本发明还提供了以下抗原或抗体组合，所述抗体包括识别任意以下抗原组合的抗体：Tox-GT+TdcA+多肽DIF44(CD0844)和多肽DIF192(CD1035)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽DIF51(CD0999)和多肽DIF130(CD2645)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽DIF232(CD1031)和多肽DIF208(CD2831)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽Dif183(CD3669)和多肽DIF225(CD0438)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽DIF44(CD0844)和多肽DIF51(CD0999)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽DIF130(CD2645)和多肽DIF192(CD1035)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽Dif183(CD3669)和多肽DIF153(CD2830)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽DIF232(CD1031)和多肽DIF208A(CD2831)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽Dif44(CD0844)、Dif51(CD0999)、Dif130(CD2645)和/或Dif192(CD1035)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽Dif183(CD3669)、DIF153(CD2830)、Dif232(CD1031)和/或Dif208(CD2831)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽Dif183(CD3669)、DIF153(CD2830)、Dif232(CD1031)和/或Dif208A(CD2831)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽DIF44(CD0844)、DIF153(CD2830)和/或Dif208(CD2831)；和/或Tox-GT+TdcA+多肽DIF44(CD0844)、DIF153(CD2830)和/或Dif208A(CD2831)；Tox-GT+TdcA+多肽Dif51(CD0999)、Dif130(CD2645)、Dif183(CD3669)、DIF192(CD1035)和/或DIF232(CD1031)。
TcdA选自ToxA-B、ToxA-PTA2、ToxA-P5-7、ToxA-P5-6、ToxA-P9-10、ToxA-B2、ToxA-B3、ToxA-B5、ToxA-B6和/或ToxA-B7。例如，本发明还提供了以下抗原或抗体组合，所述抗体包括识别任意以下抗原组合的抗体：Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽DIF44(CD0844)和多肽DIF192(CD1035)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽DIF51(CD0999)和多肽DIF130(CD2645)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽DIF232(CD1031)和多肽DIF208(CD2831)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽Dif183(CD3669)和多肽DIF225(CD0438)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽DIF44(CD0844)和多肽DIF51(CD0999)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽DIF130(CD2645)和多肽DIF192(CD1035)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽Dif183(CD3669)和多肽DIF153(CD2830)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽DIF232(CD1031)和多肽DIF208A(CD2831)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽Dif44(CD0844)、Dif51(CD0999)、Dif130(CD2645)和/或Dif192(CD1035)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽Dif183(CD3669)、DIF153(CD2830)、Dif232(CD1031)和/或Dif208(CD2831)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽Dif183(CD3669)、DIF153(CD2830)、Dif232(CD1031)和/或Dif208A(CD2831)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽DIF44(CD0844)、DIF153(CD2830)和/或Dif208(CD2831)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽DIF44(CD0844)、DIF153(CD2830)和/或Dif208A(CD2831)；和/或Tox-GT+ToxA-P5-6+多肽Dif51(CD0999)、Dif130(CD2645)、Dif183(CD3669)、DIF192(CD1035)和/或DIF232(CD1031)。
Tox-GT+TcdA(优选ToxA-P5-6)还可与以下多肽组合：多肽DIF44(CD0844)和一种或多种(例如2、3、4、5、6、7种)或至少1、2、3、4、5或6种的多肽DIF51(CD0999)、DIF130(CD2645)、DIF153(CD2830)、DIF192(CD1035)、DIF208(CD2831)、Dif183(CD3669)和DIF232(CD1031)，例如多肽DIF44和一种或多种(例如2、3、4种)或至少1、2或3种的多肽DIF153、DIF192、DIF208、Dif183、DIF232，例如DIF44和DIF153、DIF44和DIF192、DIF 44和DIF208、DIF 44和Dif183、DIF 44和DIF232；和/或多肽DIF208(CD2831)和一种或多种(例如2、3、4、5、6、7种)或至少1、2、3、4、5或6种的多肽DIF 44(CD0844)、DIF51(CD0999)、DIF130(CD2645)、DIF153(CD2830)、DIF192(CD1035)、Dif183(CD3669)和DIF232(CD1031)，例如多肽DIF208和一种或多种(例如2、3、4种)或至少1、2或3种的多肽DIF44、DIF153、DIF192、Dif183，例如DIF208和DIF153、DIF208和DIF192、DIF208和Dif183、DIF208和DIF232；和/或多肽DIF44(CD0844)、Dif208(CD2831)，和一种或多种(例如2、3、4、5、6种)或至少1、2、3、4或5种的DIF51(CD0999)、DIF130(CD2645)、DIF153(CD2830)、DIF192(CD1035)、Dif183(CD3669)和DIF232(CD1031)，例如多肽DIF44(CD0844)、Dif208(CD2831)和一种或多种(例如2或3或4种)或至少1或2或3种的多肽DIF153、DIF192、Dif183、DIF232。
可使用编码的核酸分子和/或结合所列分子的抗体(例如识别任意抗原组合的抗体)制备等价的组合或组合物，从而可使用编码所述肽组合的核酸分子组合，如同可在本发明组合物中使用结合所列分子的抗体(例如识别任意抗原组合的抗体)的组合。免疫原性组合物通常包含至少一种抗原性蛋白质或抗原。当提及DIF208时，可在这些组合物中使用DIF208A或DIF208B替代。
本发明的组合物可用于预防或治疗艰难梭菌感染的方法。因此，本发明提供了一种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，该方法包括给予有效量的包含一种或多种上文所述抗原的本发明组合物的步骤。该免疫应答通常是保护性的且涉及抗体和/或细胞介导的免疫。本发明还提供了一种预防或治疗哺乳动物中艰难梭菌感染的方法，该方法包括给予有效量的本发明的组合物的步骤。该方法可引起加强应答。
艰难梭菌感染的主要原因之一是使用了干扰肠道菌群的抗生素。因此，本发明的组合物可在治疗方案中与抗生素联用以同时治疗潜在病症并治疗或预防任何艰难梭菌感染。通过使用这些组合物和方法，可保护哺乳动物抵抗艰难梭菌感染，特别是医院感染。在一些实施方式中，艰难梭菌感染导致腹泻、抗生素相关腹泻(AAD)、腹痛、发烧、白细胞增多、伪膜性结肠炎或中毒性巨结肠中的一种或多种，且所述治疗可预防、减少或消除这些疾病中的一种或多种。
在一些实施方式中，本发明的组合物是用于药物和治疗的组合物，例如用于针对CDAD的被动免疫。本发明还提供了这类抗体或组合物在药物制造中的应用，所述药物优选用于本文所述的任何治疗类型。
在其他实施方式中，本发明的组合物是用于预防或治疗哺乳动物中艰难梭菌感染的组合物。
在一些实施方式中，本发明还提供了本发明的多肽、核酸和抗体在药物制造中的应用，所述药物优选用于本文所述的任何治疗类型。
当所述免疫原性组合物预防、缓解、减轻或消除来自动物的疾病时，可任选将该免疫原性组合物称作疫苗。本文所用术语“疫苗”指包含纯化的抗原决定簇、编码纯化的抗原决定簇的核酸或其片段、不含致病性生物体的疫苗组合物。这类疫苗也可称作“亚单位疫苗(sub-unit vaccine)”。该术语并不旨在包括“全细胞疫苗”，例如来源于全病毒细胞的那些疫苗，所述全病毒细胞已被杀死并可含有作为复合且未鉴定组合物的一部分的未纯化形式的抗原决定簇。因此，在具体实施方式中，可排除或放弃全细胞疫苗。本文所用术语“多价”指疫苗含有结构类似或“相关”的来自至少两种菌株或分离物的抗原决定簇，这些抗原决定簇是同源的且在其氨基酸序列之间具有非常小的差异。
因此，本发明的组合物可用作疫苗。本发明的疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但通常是预防性疫苗。术语“针对感染保护”指对象的免疫系统已经预先准备好(例如，通过疫苗接种)触发免疫应答并抵抗感染。本领域技术人员应理解，经疫苗接种的对象可因此受到感染，但与对照对象相比，其能更好地抵抗感染。术语“治疗”包括治疗性治疗或预防性治疗，其中目标是预防或减轻感染。例如，治疗可包括直接影响或治愈、阻止、抑制、预防例如感染，或者降低其严重程度、延迟其发生、减少其相关症状，或其组合。“预防”可包括延缓症状的发生、预防疾病复发等。治疗还可包括“阻止”或“抑制”感染或疾病，例如降低严重程度、症状的数目、发生或潜伏期、缓解症状、减少继发症状、减少继发感染、延长患者存活，或其组合。
术语“抗原”指一种分子，对象可针对该分子起始体液和/或细胞免疫应答。对组合物或疫苗的“免疫应答”指对感兴趣的组合物或疫苗在宿主中发展细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于一种或多种以下效果：特异性针对感兴趣的组合物或疫苗中包括的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的生产。优选地，对象会显示治疗性或保护性免疫应答，从而增强对新感染的抗性和/或降低疾病的临床严重程度。这类保护显示为：通常由受感染对象显示的症状的减少或缺失、较快的恢复时间和/或受感染宿主中病毒效价下降。本文所用术语“免疫原性”蛋白质或多肽指引起上述免疫反应的氨基酸序列。
因此，组合物可以是药学上可接受的。除抗原外，它们通常还包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献[94]。组合物可以水性形式给予哺乳动物。然而在给药前，该组合物可以是非水性形式。例如，虽然一些疫苗制备成水性形式然后以水性形式填装、分配和给药，但其他疫苗在制备过程中冻干，并在使用时重建成水性形式。因此，本发明组合物可以是经干燥的，例如冻干制剂。
该组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即少于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞。更优选无汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。为了提高热稳定性，组合物可包含温度保护剂。这种试剂的更多详情如下所述。为了控制张力，优选包含生理盐(如钠盐)。优选氯化钠(NaCl)，它的浓度可以是1至20mg/ml，例如约10±2mg/ml NaCl。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。组合物可含有一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂(尤其是含氢氧化铝佐剂时)或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般为5至20mM的范围。组合物的pH通常为5.0至8.1，更常为6.0至8.0，例如6.5至7.5，或者7.0至7.8。组合物优选是无菌的。该组合物优选无热原，如每剂量含有小于1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量小于0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。
该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即“多剂量”药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，该组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。人疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。
本发明组合物也可包含一种或多种免疫调节剂。优选地，一种或多种免疫调节剂包括一种或多种佐剂。该佐剂可包括TH1佐剂和/或TH2佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：
·矿物盐，例如铝盐和钙盐，包括氢氧化物(例如，氢氧化合物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)和硫酸盐等[例如，参见参考文献95的第8和第9章]；
·水包油乳剂，例如鲨烯-水乳剂，包括MF59(5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，采用微射流机制成亚微米颗粒)[参考文献95第10章，还参见参考文献96-99，参考文献100的第10章和参考文献101的第12章]，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；
·皂苷制剂[参考文献95的第22章]，例如QS21[102]和ISCOM[参考文献95的第23章]；
·病毒体和病毒样颗粒(VLP)[103-109]；
·细菌或微生物衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物[110,111]、免疫刺激性寡核苷酸[112-117]，例如IC-31TM[118](包含26-基体序列5'-(IC)13-3'的脱氧核苷酸(SEQ ID NO:354)和包含11-基体氨基酸序列KLKLLLLLKLK的多聚阳离子聚合多肽(SEQ ID NO:355))，和ADP-糖基化毒素及其脱毒化的衍生物[119-128]；
·人免疫调节剂，包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[129,130])，干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子；
·生物粘着剂和粘膜粘着剂，例如壳聚糖及其衍生物、酯化透明质酸微球[131]或粘膜粘着剂，如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素[132]。
·微颗粒(即，直径为约100nm至约150μm的颗粒，更优选直径为约200nm至约30μm的颗粒，且最优选直径为约500nm至约10μm的颗粒)，所述微颗粒由生物可降解且无毒的材料形成(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯(polyorthoester)、聚酸酐、聚己酸内酯等)；
·脂质体[参考文献95的第13和14章，133-135]；
·聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[136]；
·PCPP制剂[137和138]；
·胞壁酰多肽，包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)；和
·咪唑并喹诺酮化合物，包括咪喹莫特及其同系物(例如，“瑞喹莫德3M”)[139和140]。
本发明的组合物和疫苗还可包含上述鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，可将以下佐剂组合物用于本发明：(1)皂苷和水包油乳液[141]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)[142]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[143]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳液的组合[144]；(6)SAF，含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普流罗尼-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流体化形成亚微米乳液或涡旋产生粒度较大的乳液。(7)RibiTM佐剂系统(RAS)(瑞比免疫化学公司(Ribi Immunochem))，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。
用作免疫刺激剂的其它物质可参见参考文献95的第7章。特别优选使用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂，抗原通常吸附于这些盐。磷酸钙是另一种优选佐剂。其它优选的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和明矾或雷西莫特和明矾。可使用磷酸铝和3dMPL的组合(已报道这种组合在肺炎球菌免疫中有效[145])。
本发明组合物可引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答。此种免疫应答优选诱导长期(如中和性)抗体和细胞介导的免疫，以便在接触艰难梭菌时迅速作出反应。通常认为两种T细胞类型CD4和CD8细胞是启动和/或增强细胞介导免疫和体液免疫所必需的。CD8T细胞可表达CD8共受体，通常称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CD8T细胞能够识别MHC I型分子上展示的抗原或与之相互作用。CD4T细胞可表达CD4共受体，并通常称为T辅助细胞。CD4T细胞能够识别结合MHC II型分子的抗原性肽。与MHC II型分子相互作用后，CD4细胞可分泌诸如细胞因子等因子。这些分泌的细胞因子可激活B细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞和参与免疫应答的其它细胞。辅助T细胞或CD4+细胞可进一步分为两个功能不同的亚组：即细胞因子和效应功能不同的TH1表型和TH2表型。活化的TH1细胞能增强细胞免疫(包括抗原特异性CTL生产增加)，因而对响应胞内感染具有特定价值。活化的TH1细胞可分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β中的一种或多种。TH1免疫应答可通过激活巨噬细胞、NK(自然杀伤)细胞和CD8细胞毒性T细胞(CTL)导致局部炎症反应。通过用IL-12刺激B和T细胞的生长，TH1免疫应答也可用于放大免疫应答。TH1刺激的B细胞可分泌IgG2a。活化的TH2细胞提高抗体生成，因此对响应胞外感染具有价值。活化的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答可引起生成IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞来用于未来的保护。增强的免疫应答可包括增强的TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或多种。TH1免疫应答可包括以下一种或多种：CTL增加，与TH1免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如IL-2、IFN-γ和TNF-β)增加，活化巨噬细胞增加，NK活性增加，或者IgG2a产量增加。在一些实施方式中，提高的TH1免疫应答将包括IgG2a生成增加。可使用TH1佐剂引发TH1免疫应答。相对于不用佐剂的抗原免疫，TH1佐剂通常引起IgG2a生成水平增加。适用于本发明的TH1佐剂可包括例如，皂苷制剂、病毒体和病毒样颗粒、肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、免疫刺激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸是本发明所用的典型TH1佐剂。TH2免疫应答可包括以下一种或多种：与TH2免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)增加，或者IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞生成增加。在一些实施方式中，提高的TH2免疫应答将包括IgG1生产的增加。可使用TH2佐剂引发TH2免疫应答。相对于不用佐剂的抗原免疫，TH2佐剂通常引起IgG1生成水平增加。适用于本发明的TH2佐剂包括例如，含矿物质组合物、油乳剂和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。含矿物质组合物如铝盐是本发明使用的典型TH2佐剂。
在一些实施方式中，本发明包括含TH1佐剂和TH2佐剂组合的组合物。通常，这种组合物引起增强的TH1和增强的TH2应答，即IgG1和IgG2a的生成相对于不用佐剂的免疫均有增加。一般，相对于用单一佐剂的免疫(即，相对于只用TH1佐剂的免疫或只用TH2佐剂的免疫)，包含TH1和TH2佐剂组合的组合物引起TH1和/或TH2免疫应答增强。该免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答之一或两种。该免疫应答可以提供增强的TH1应答和增强的TH2应答之一或两种。增强的免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答之一或全部两种。该免疫应答可以提供增强的全身免疫应答和增强的粘膜免疫应答之一或两种。典型粘膜免疫应答为TH2免疫应答。粘膜免疫应答通常包括IgA生成增加。
艰难梭菌感染可影响机体的各个部分，因此可将本发明组合物制备成各种形式。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体载剂的固体形式(如冻干组合物或喷雾冻干组合物)。所述组合物可以制备成局部制剂，例如油膏、乳膏或粉末。所述组合物可制备成口服给药制剂，如片剂或胶囊，喷雾剂，或糖浆剂(任选调味)。该组合物可以制备成使用细粉或喷雾的肺部给药制剂，例如吸入剂。该组合物可制备为栓剂或子宫托。该组合物可以制成鼻部、耳部或眼部给药制剂，例如滴剂。该组合物可以是药盒的形式，设计成在临给予哺乳动物之前重建的合并组合物。此类药盒可包含一种或多种液体形式的抗原以及一种或多种冻干抗原。
临用前制备组合物(例如，以冻干形式提供组分时)并以药盒形式提供组合物时，该药盒可包括两个药瓶，或者可包括一个填充好的注射器和一个药瓶，注射器内容物用于在注射前重激活药瓶内容物。
用作疫苗的组合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它组分。“免疫学有效量”是指以单一剂量或一系列剂量的部分给予个体的对治疗或预防有效的量。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(如非人灵长动物、灵长动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预计该量将落入可通过常规试验可确定的相对较宽范围内。组合物中包含一种以上抗原时，存在的两种抗原的剂量可以相同或不同。
如上所述，一种组合物可包含温度保护剂，此种组分可能在含佐剂组合物(特别是含有矿物质佐剂，如铝盐的组合物)中特别有用。如参考文献146所述，可将液体温度保护剂加入水性疫苗组合物中以降低其凝固点，例如将凝固点降低至0℃以下。因此该组合物可以储存于0℃以下但在其凝固点以上，以抑制热裂解。温度保护剂也允许冷冻该组合物，同时保护矿物盐佐剂在冻融后不发生团聚或沉降，还可在较高温度，例如40℃以上保护该组合物。可混合初始的水性疫苗与液体温度保护剂使液体温度保护剂占最终混合物体积的1-80％。合适的温度保护剂应该是对人给药安全的、易于混溶/可溶于水的、并且不应损害组合物的其他成分(如抗原和佐剂)。示例包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。合适PEG的平均分子量可为200-20,000Da。在一个实施方式中，聚乙二醇的平均分子量可以约为300Da(‘PEG-300’)。
本发明提供包含以下组分的组合物：(i)一种或多种上文公开的抗原；和(ii)温度保护剂。该组合物可通过混合以下组分形成：(i)包含一种或多种抗原(例如抗原组合中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种抗原)的水性组合物；和(ii)温度保护剂。然后，该混合物可储存于例如0℃以下、0-20℃、20-35℃、35-55℃或更高温度。它可以液体或冻结形式储存。该混合物可以是冻干的混合物。或者，可通过混合(i)含一种或多种抗原的干燥组合物与(ii)含温度保护剂的液体组合物来形成该组合物。因此，可利用组分(ii)重建组分(i)。
与艰难梭菌糖偶联物的组合
本发明的多肽可与糖多肽联用或偶联。因此，本发明提供一种包含以下组合的组合物：(1)一种或多种多肽和/或抗体和(2)艰难梭菌糖和载体蛋白的一种或多种偶联物，或者与艰难梭菌糖和任选的载体蛋白偶联的一种或多种多肽和/或抗体。该组合可用于治疗或预防艰难梭菌感染的方法中，或者生成免疫应答的方法中，如上文所述。
该组合组分(2)中所用的偶联物包括糖部分和载体部分。糖部分来自艰难梭菌。艰难梭菌糖可具体地选自参考文献147中所述PS-I、PS-II和PS-III糖。PS-I包含重复的式A的五糖单元：
→4)-αRha-(1→3)-βGlc-(1→4)-αGlc-(1→2)-αGlc-(1→P
                           3
                           ↑                     (A)
                      αRha-(1
其中Rha是鼠李糖，P是糖基磷酸盐/酯且Glc是葡萄糖。
具体而言，本发明中使用的PS-I糖可以具有式A’：
[→4)-αRha-(1→3)-βGlc-(1→4)-αGlc-(1→2)-αGlc-(1→P]n
                           3
                           ↑                     (A’)
                      αRha-(1
其中n是1至1000的整数，Rha是鼠李糖，P是糖基磷酸盐/酯且Glc是葡萄糖。
PS-II包含重复的式B的六糖单元：
→6)-βGlc-(1→3)-βGalNAc-(1→4)-αGlc-(1→4)-βGalNAc-(1→3)-αMan-(1→P
                                           3
                                           ↑             (B)
                                      βGlc-(1
其中Glc是葡萄糖，GalNAc是N-乙酰-半乳糖胺，P是糖基磷酸盐/酯且Man是甘露糖。
具体而言，本发明中使用的PS-II糖可以具有式B’：
[→6)-βGlc-(1→3)-βGalNAc-(1→4)-αGlc-(1→4)-βGalNAc-(1→3)-αMan-(1→P]n
                                            3
                                            ↑            (B’)
                                       βGlc-(1
其中n是1至1000的整数，Glc是葡萄糖，GalNAc是N-乙酰-半乳糖胺，P是糖基磷酸盐/酯且Man是甘露糖。
Ps-III在其共价化学结构内包含甘油、醛醇磷酸盐/酯(alditol phosphate)、葡萄糖和N-乙酰-半乳糖胺。在上述式(A’)和(B’)中，整数n的值通常是1至100，例如2至100，10至100和25至100。组分(2)中使用的偶联物中的载体部分通常是蛋白质或者可以是或不是(1)的多肽之一。典型的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素，或者其类毒素或突变体或片段。可用CRM197白喉毒素突变体[148]。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白复合物[149]、合成肽[150,151]、热激蛋白[152,153]、百日咳蛋白[154,155]、细胞因子[156]、淋巴因子[156]、激素[156]、生长因子[156]、包含多种来自各种病原体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白[157]如N19[158]、来自流感嗜血杆菌的蛋白D[159-161]、肺炎球菌溶血素[162]或其无毒衍生物[163]、肺炎球菌表面蛋白PspA[164]、摄铁蛋白[165]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[166]、重组铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA)[167]等。在一些实施方式中，该载体蛋白是金黄色葡萄球菌蛋白。在其他实施方式中，该载体是本发明的艰难梭菌多肽。
当组合物包含超过一种偶联物时，每种偶联物可使用相同的载体蛋白或不同的载体蛋白。偶联物可包含过量载体(w/w)或过量糖(w/w)。在一些实施方式中，偶联物可包含基本相同重量的载体和糖。载体分子可与载体直接共价偶联，或通过接头偶联。可通过(例如)糖和载体之间的还原性胺化(如参考文献168所述)，实现与蛋白质的直接连接。可用任何已知方法，如参考文献169和170所述的方法通过接头基团进行连接。一种连接类型是己二酸接头，这种连接可通过以下方式形成：将游离-NH2基团与己二酸偶联(如通过胺化导入糖中)(例如，利用二酰亚胺活化)，然后将蛋白质偶联于所得的糖-己二酸中间体[171,172]。另一种连接形式是羰基接头，这种连接可通过以下方式形成：使糖CDI的游离羟基发生反应[173，174]，然后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连接。其它接头包括β-丙酰胺基[175]、硝基苯基-乙基胺[176]、卤代酰基卤化物[177]、糖苷键[178]、6-氨基己酸[179]、ADH[180]、C4到C12部分[181]等。也可采用碳二亚胺缩合反应[182]。
艰难梭菌糖多肽偶联物可用多种方法制备，例如通过下述方法：a)通过添加含马来酰亚胺基团的接头来激活艰难梭菌糖以形成活化的艰难梭菌糖；b)通过添加含巯基基团的接头来激活载体蛋白以形成活化的载体蛋白；和c)将活化的艰难梭菌糖与活化的载体蛋白反应，形成艰难梭菌糖-载体蛋白偶联物；或者通过下述过程：a)通过添加含巯基基团的接头来激活艰难梭菌糖以形成活化的艰难梭菌糖；b)通过添加含马来酰亚胺基团的接头来激活载体蛋白以形成活化的载体蛋白；和c)将活化的艰难梭菌糖与活化的载体蛋白反应，形成艰难梭菌糖-载体蛋白偶联物；或者通过下述过程：a)通过添加含巯基基团的接头来激活艰难梭菌糖以形成活化的艰难梭菌糖；b)通过添加含巯基基团的接头来激活载体蛋白以形成活化的载体蛋白；和c)将活化的艰难梭菌糖与活化的载体蛋白反应，形成艰难梭菌糖-载体蛋白偶联物。这些偶联物可与本文所述的任何多肽联用。
其它抗原
通常，可使用单个组合物以产生针对一定范围的感染物的免疫。因此，该组合物可包含抗原，该抗原不仅来自艰难梭菌，还来自其他细菌、病毒等。因此，本发明提供了包含一种或多种本发明多肽和一种或多种以下抗原的组合物：来自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的蛋白质抗原，如VacA、CagA、NAP、HopX、HopY[183]，和/或脲酶；来自脑膜炎奈瑟球菌糖(N.meningitidis)血清组B的蛋白质抗原[184]，其中蛋白“287”和衍生物特别有用；来自脑膜炎奈瑟氏菌血清组B的外膜囊泡(OMV)制备物，如文献185中所述；来自脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献186公开的寡糖[也参见187]；来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[188]；来自甲型肝炎病毒(如灭活病毒)的抗原[189]；来自乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如190]；来自丙型肝炎病毒的抗原[如191]；来自百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(百日咳杆菌粘附素)和/或凝集原2和3组合[如192]；白喉抗原，如白喉类毒素[如193]，例如CRM197突变体[如194]；破伤风抗原，如破伤风类毒素[如195]；来自流感嗜血B型杆菌(Haemophilus influenzae B)的糖抗原或多肽；来自淋病奈瑟球菌(N.gonorrheae)的抗原[如196]；来自肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[如197]；来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的抗原[如198]；来自牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的抗原[如199]；脊髓灰质炎抗原[如200]，如IPV或OPV；狂犬病抗原[如201]，如冻干的失活病毒[如202，RabAvertTM]；麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如203]；流感抗原[如204]，如血凝素和/或神经酰胺酶表面蛋白；来自粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原[如205]；来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原[如206]；来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B型链球菌)的蛋白质抗原[如207、208]；来自无乳链球菌(B型链球菌)的糖抗原。具体地，本发明提供了包含一种或多种本发明多肽和一种或多种来自金黄色葡萄球菌的抗原的组合物[如209]。
治疗方法和疫苗的给予
本发明提供了多肽、核酸、抗体或组合物，其用于预防或治疗对象中艰难梭菌感染，或用于治疗、预防对象中艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或用于治疗、预防对象中艰难梭菌的肠道建群或降低其严重程度。该对象可以是动物，特别是哺乳动物，更特别是人，但通过非限制性实施例，也可以是具有商业重要性的动物(如奶牛、猪、绵羊、马或家养动物)或宠物(如猫、狗、小鼠、大鼠、兔、沙鼠或仓鼠)。在某些实施方式中，该对象可以是鸟类对象，例如鸡、鹅、火鸡等。
在另一个实施方式中，本发明提供了多肽、核酸、抗体或组合物，其用于预防或治疗对象中艰难梭菌感染，或用于治疗、预防对象中艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或用于治疗、预防对象中艰难梭菌的肠道建群或降低其严重程度，用于与抗生素化合物连续、同时或伴随给药。特别地，该对象是动物，更特别是哺乳动物，更特别是人，例如成人或儿童。特别地，该人是妊娠妇女或儿童，特别是十岁以下的儿童。该对象也可以是接受广谱抗生素治疗(例如使用万古霉素治疗)的患者。
在另一个实施方式中，本发明提供了多肽、核酸、抗体或组合物，其用于预防或治疗人中艰难梭菌感染，或用于治疗、预防人中艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或用于治疗、预防人中艰难梭菌的肠道建群或降低其严重程度，所述人大于50岁和/或患有医院艰难梭菌感染。
特别地，本发明提供了多肽、核酸、抗体或组合物，其用于预防或治疗艰难梭菌感染相关的腹泻、抗生素相关腹泻(AAD)、腹痛、腹部痉挛、脱水、发烧、白细胞增多、伪膜性结肠炎或中毒性巨结肠。
在其他实施方式中，本发明提供了多肽、核酸、抗体或组合物，其用于预防或治疗艰难梭菌感染相关的腹泻、抗生素相关腹泻(AAD)、腹痛、发烧、白细胞增多、伪膜性结肠炎或中毒性巨结肠，用于与抗生素化合物连续、同时或伴随给药。
在其他实施方式中，本发明提供了本发明的多肽、核酸、抗体或组合物在药物制造中的应用，所述药物用于预防或治疗对象中艰难梭菌感染，或用于治疗、预防对象中艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或用于治疗、预防对象中艰难梭菌的肠道建群或降低其严重程度。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于预防或治疗哺乳动物中艰难梭菌感染，或者用于治疗、预防艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或者用于治疗、预防艰难梭菌的肠道建群或降低其严重程度的方法，该方法包括向对象给予(a)包含特定氨基酸序列、基本由其组成或由其组成的至少一种多肽，该氨基酸序列选自SEQ ID NO 79、81、93、105、111、113、125、133,139、141、153、165、171、173、185、187、189、300、322、357、359、361、433、435,437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463和465，更特别地选自SEQ ID NO 79、139、133、433、111、171、113和173，(b)编码(a)中所列氨基酸序列的至少一种核酸，和/或(c)能够结合至(a)中所列氨基酸序列的至少一种抗体。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于预防或治疗对象中艰难梭菌感染，或者用于治疗、预防对象中艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或者用于治疗、预防对象中艰难梭菌的肠道建群或降低其严重程度的方法，该方法包括向对象给予至少一种特定核酸的步骤，该核酸选自SEQ ID NO:78、80、92,104、110、112、124、132、138、140、152、164、170、172、184、186、188、356、358、360、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462和464，优选地选自SEQ ID NO:78、132、138、432、110、170、112和172。
在用于预防或治疗对象中艰难梭菌感染，或者用于治疗、预防对象中艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或者用于治疗、预防对象中艰难梭菌的肠道建群或降低其严重程度的方法(该方法包括给予至少一种抗体的步骤)中，该抗体优选是中和抗体。
如上文所述，上述抗原组合优选具有一种或多种其他抗原，所述其他抗原提供了针对艰难梭菌或针对CDAD的保护性作用。本文他处公开的组合和包含这些组合的组合物可因此同等地用于上述方法中。上文所述抗原组合物优选由ToxB_GT和TcdA抗原制备，更优选由ToxB_GT和ToxAp 5_6抗原制备。因此，本发明的方法包括其中还给予了提供针对艰难梭菌或针对CDAD的保护性作用的其他抗原的方法，优选地这类抗原是ToxB_GT和ToxAp 5_6。还可使用编码这类抗原的核苷酸分子，如同可以使用结合这类抗原的抗体，如他处所述。在使用了超过一种抗原(或核苷酸分子或抗体)的所有情况下，该抗原(或核苷酸分子或抗体)均可连续、同时或单独给予。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于预防或治疗对象中艰难梭菌感染，或者用于治疗、预防对象中艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或者用于治疗、预防对象中艰难梭菌的肠道建群或降低其严重程度的方法，该方法包括向对象给予本发明的组合物的步骤。
在其他实施方式中，本发明提供了用于预防或治疗对象中艰难梭菌感染，或者用于治疗、预防对象中艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或者用于治疗、预防对象中艰难梭菌的肠道建群或降低其严重程度的方法，该方法包括向对象给予本发明的组合物的步骤，其中该组合物包含至少一种药物载体和/或赋形剂。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于预防或治疗对象中艰难梭菌感染，或者用于治疗、预防对象中艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或者用于治疗、预防对象中艰难梭菌的肠道建群或降低其严重程度的方法，该方法包括向对象给予本发明的组合物的步骤，其中该组合物是药物组合物或疫苗组合物。该方法可用于在对象中产生免疫应答，或者预防或治疗对象中艰难梭菌感染，或者用于治疗、预防艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或者用于治疗、预防对象中艰难梭菌的肠道建群或降低其严重程度。本发明的方法还可包括给予抗生素。
还已知艰难梭菌感染多种哺乳动物，包括野生和家养的动物。该疾病与人类中观察到的非常类似，但观察到分离物异质性较低[2]。因此，本发明的组合物和方法可用于治疗已表现出艰难梭菌感染的哺乳动物(如马、猪或奶牛)。
在一些实施方式中，该哺乳动物最近接受了抗生素，正在接受抗生素或将要接受抗生素。特别优选的哺乳动物是灵长类动物，更优选人。所述人可以是儿童(如幼童或婴儿)，青少年或成人。意图用于儿童的组合物也可给予成年人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。所述人可以正在医院接受治疗。
根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。因此，人可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的人可以是老年人(如大于等于50岁，大于等于60岁并优选大于等于65岁)，儿童(如小于等于5岁)，住院病人、保健护理人员、武装人员和军人、孕妇、慢性病人或免疫缺陷病人。然而该疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。
可将本发明生产的疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)给予人，例如与流感疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、金黄色葡萄球菌疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗等基本上同时给药。
本发明还提供了一种包含本发明的组合物的药盒。该药盒还可包含下列的一种或多种：说明书、注射器或其它递送装置、佐剂、抗生素或药学上可接受的制剂溶液。本发明还提供了一种预填充本发明组合物的递送装置。
一种检测治疗性治疗功效的方式涉及在向哺乳动物给予本发明组合物后监测艰难梭菌感染。一种检查预防性治疗疗效的途径涉及在给予组合物后监测针对本发明组合物中多肽的全身免疫应答(如监测IgG1和IgG2a产生水平)和/或粘膜免疫应答(如监测IgA产生水平)。通常，在免疫后但在攻击前测定多肽特异性血清抗体应答，而在免疫后和攻击后测定多肽特异性粘膜抗体应答。另一种评价本发明组合物免疫原性的方式是重组性地表达蛋白质，用于通过免疫印迹和/或微阵列筛查哺乳动物血清或粘膜分泌物。蛋白质和哺乳动物样品之间的阳性反应表明哺乳动物已经产生针对受试蛋白质的免疫应答。该方法也可用于鉴定免疫显性多肽和/或多肽中的表位。通过用疫苗组合物攻击艰难梭菌感染动物模型如豚鼠或小鼠可在体内测定疫苗组合物的功效。
本发明的组合物通常直接给予哺乳动物。可通过胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙)，或通过粘膜，如通过直肠、口腔(如片剂、喷雾)、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜途径完成直接递送。
本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫，例如引发增强的全身和/或粘膜免疫。通常，增强的全身和/或粘膜免疫表现为提高的TH1和/或TH2免疫应答。通常，增强的免疫应答包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA生成增加。
可通过单剂量方案或多剂量方案来进行给药。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径(如肠胃外初次和粘膜加强，粘膜初次和肠胃外加强等)给予多个剂量。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。
菌株和变体
本发明的多肽最初来源于艰难梭菌菌株630。同样，其可称为艰难梭菌抗原。然而，对本领域技术人员显而易见的是，本发明的多肽用于针对CDAD的免疫，所述CDAD由多种不同的艰难梭菌菌株引起。因此，本发明不限于包含仅来源于菌株630和菌株SM的多肽和/或片段的组合物。数种艰难梭菌菌株的序列是可以获得的，包括艰难梭菌菌株R20291(SM)、艰难梭菌菌株196、艰难梭菌菌株BI1、艰难梭菌菌株BI/NAP1/027(核糖体型027)、C艰难梭菌菌株M120和艰难梭菌菌株M68、菌株855、菌株QCD-63q42、菌株ATCC43255的那些。
可使用标准的检索和比对技术以在任何其他的基因组序列中鉴定艰难梭菌菌株的任何特定序列的同源物，例如在菌株ATCC43255、菌株CIP107932、菌株QCD-23m63、菌株QCD-32g58、菌株QCD-37x79、菌株855、菌株QCD-63q42、菌株QCD-66c26、菌株QCD-76w55、菌株QCD-97b34、菌株CD196、菌株CDBI1、菌株CDCF5、菌株CDSM、菌株CDM68、菌株CDM120或菌株R20291中。而且，可使用可获得的来自当前艰难梭菌菌株的序列来设计引物以扩增来自其他菌株的同源序列。因此，本发明不限于来自该菌株的多肽，而是可以包括来自其他艰难梭菌菌株的这类变体和同源物，以及非天然变体。通常，特定SEQ ID NO的合适变体包括其等位基因变体、其多态性形式、其同源物、其直向同源物、其旁系同源物、其突变体等。
因此，例如，与本文中的SEQ ID NO相比，本发明所用多肽可包括一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9个等)氨基酸取代，如保守取代(即用具有相关侧链的另一氨基酸取代某氨基酸)。遗传编码的氨基酸通常分为四类：(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起归类为芳族氨基酸。通常，这些家族内部的单个氨基酸的取代不会对生物活性产生重要影响。相对于SEQ ID NO序列，该多肽还可包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9等)单个氨基酸的缺失。相对于SEQ ID NO序列，该多肽也可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9个等)插入(如各1、2、3、4或5个氨基酸)。
类似地，本发明所用多肽可包含具有以下特征的氨基酸序列：(a)与序列表公开的某一序列相同(即100％相同)；(b)与序列表公开的某一序列具有序列相同性(如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；(c)与(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或更多个)单一氨基酸改变(缺失、插入、取代)，这些改变可以位于不同位置或连续出现；并用EMBOSS软件包中的needle工具实施[210]，用逐对比对算法与序列表中的特定序列比对时，每个从N-末端向C-末端移动的x个氨基酸的窗口(使得在p(p>x)个氨基酸上比对时，存在p-x+1个这种窗口)具有至少x·y个相同的比对氨基酸，其中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200；y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99；如果x·y不是整数，则四舍五入成最近的整数。优选的成对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[14]，使用默认参数(如缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62积分矩阵)。
通常，当本发明多肽包括与序列表所示完整艰难梭菌序列不同的序列时(例如，当它包含序列相同性<100％的序列，或包含其片段时)，在各种单独情况下，该多肽优选可引发识别相应的完整艰难梭菌序列的抗体。使用杂交多肽时，杂交体内的单个抗原(即单个-X-部分)可来自一种或多种菌株。例如，n＝2时，X2可来自与X1相同的菌株，或来自不同菌株。当n＝3时，该菌株可以是(i)X1＝X2＝X3(ii)X1＝X2≠X3(iii)X1≠X2＝X3(iv)X1≠X2≠X3或(v)X1＝X3≠X2等。
在(c)组内，缺失或取代可在N末端和/或C末端，或者可以在两个末端之间。因此，截短是缺失的一个示例。截短可包括在N末端和/或C末端缺失多达40个(或更多个)氨基酸。
鉴于上述情况，术语“艰难梭菌抗原”或“艰难梭菌多肽”包括上文所定义的分子，例如其他艰难梭菌菌株的变体或同源物，或者本文所述和/或序列表中所提供的多肽或抗原的非天然或非天然产生的变体，并优选满足上文所定义的序列标准。
本发明还提供了属于锌金属肽酶家族的多肽，其具有降低多肽毒性的突变。合适的多肽包括Dif153(CD2830)。减弱毒性的示范性突变包括缺失部分或全部锌素金属蛋白酶(zincin metalloprotease)结构域和锌素金属蛋白酶结构域内降低蛋白酶活性的点突变。脱毒可通过使用本领域已知的任何适当方法(如定点诱变)突变这些多肽的氨基酸序列或编码的核酸序列来实现。优选地，相对于属于锌金属肽酶家族的野生型多肽的序列，属于锌金属肽酶家族的多肽包含一个或多个氨基酸取代(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多个突变)。例如，相对于SEQ ID NO:300和435的野生型Dif153(CD2830)多肽序列，该Dif153(CD2830)多肽序列包含一个或多个氨基酸取代(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个突变)，例如在氨基酸位置134、142、143、146、149、150、178、184和/或288处。例如，该Dif153(CD2830)抗原可在对应于SEQID NO:300和435的Dif153(CD2830)多肽序列的氨基酸134、142、143、146、149、150、178、184和/或208的1、2、3、4或5个位置处包含取代。具体而言，对应于SEQ ID NO:300和435的野生型Dif153(CD2830)多肽序列的氨基酸134、142、143、146、149、150、178、184和/或208的位置处的1、2、3、4或5个氨基酸可被取代，优选被丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)残基取代。Dif153(CD2830)的单突变的示例是H142A、E143A、E143R、H146A、D149A、H150A、Y178F和C208S。Dif153(CD2830)的双突变的示例是H142A/H146A、H142A/Y178F、H142A/E143R、H142A/E143A、E142A/Y178F，其相对于SEQ ID NO:300和435的野生型CT153(CD2830)多肽序列。本发明还提供了CT153(CD2830)多肽的其他突变体(单独或组合)：H142A/H150A和E143A/D149A。上述脱毒免疫原性多肽优选保留了SEQ ID NO:300和435的至少一个表位或免疫原性片段。
本发明还提供了包含突变的艰难梭菌细菌，特别是其中敲除了实施例中详述的一种或多种多肽的艰难梭菌细菌。产生敲除细菌的技术为本领域熟知，且曾报道过敲除的艰难梭菌菌株。敲除突变可位于基因的编码区，或者可位于转录控制区内(如启动子内)。敲除突变会将编码渡头的mRNA水平降低至野生型细菌产量水平的小于1％，优选降低至小于0.5％，更优选降低至小于0.1％，最优选降低至0％。本发明还提供了组成型表达本发明的多肽的细菌(如艰难梭菌细菌)。本发明还提供包含本发明抗原编码基因的梭菌细菌，其中所述基因在诱导型启动子的控制下。这类细菌可用于测试和开发或制备减毒疫苗。
概述
除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如[212-219等]。在一些实施方式中，术语“包含”指包括所示活性物质，如所列多肽，以及包括其他活性物质和药学上可接受的载体、赋形剂、软化剂、稳定剂等，如药学工业中已知的那样。在一些实施方式中，术语“基本由……组成”指仅显示了活性成分的组合物，但也可包括其他化合物，其用于稳定、保存制剂等，但不直接涉及所示活性成分的治疗作用。过渡语“基本由……组成”旨在解释权利要求的范围以在其中包括特定的材料或步骤，以及不会对所要求保护的本发明的基本和新颖特征造成显著影响的那些。参见In re Herz,537F.2d 549,551-52,190USPQ 461,463(CCPA 1976)(在初始时强调)；还可参见MPEP§2111.03。因此，在本发明的权利要求中使用的术语“基本由……组成”并不意在解释为等同于“包含”。术语“由……组成”及其变体包括“包括”和“限于”，除非另有清楚的说明。与数值x相关的术语“约”表示例如，x±10％、x±5％、x±4％、x±3％、x±2％、x±1％。
当上文中描述或特别示例了本发明的某些实施方式时，这并非旨在将本发明限于这些实施方式。可以在不背离权利要求中所列本发明的范围和精神的前提下进行各种修改。
实施例
实施例1：艰难梭菌多肽的鉴定
为鉴定用于针对艰难梭菌的疫苗的多肽，发明人使用PSORT程序(220)分析了由艰难梭菌630编码的约3780个经预测多肽的全体。该经鉴定的蛋白质具有预测的外周亚细胞定位。具体地，鉴定了以下组：
·细胞壁相关蛋白质，通过是否存在典型的LPXTG-样基序来鉴定，该基序代表将蛋白质与细菌细胞壁外侧相连的位点。
·胞外蛋白，通过是否存在N末端前导肽(通常将蛋白质产物引导至胞外基质)和/或通过与已知被输出的其他细菌蛋白质的序列相似性来鉴定。
·具有细菌表面定位的蛋白质。
其他多肽根据其与涉及与宿主相互作用的已知多肽基序和毒力因子的序列同源性进行选择。还鉴定了数种具有未知功能的多肽。随后使用以下实施例中所述方法对多肽进行测试和筛选：
实施例2：分泌的艰难梭菌多肽的鉴定
如下所述进行艰难梭菌分泌组的制备：艰难梭菌(菌株630和StokeMandeville)生长于脑心浸液(BHI)或化学限定培养基(CDM，M.N.Mickelson,J.of Bact.,1964,88:158-164)中。将细菌在琼脂平板上铺板过夜，随后在100mL的适当培养基中在厌氧条件和37℃下生长直至对数中期(OD600为0.5)或早期稳定期(OD600为0.9)。4℃下以3,500x g离心10分钟以除去细菌并将上清液过滤通过0.22μm孔径滤器(密理博公司(Millipore))。使用10％w/v三氯乙酸、0.04％w/v脱氧胆酸钠使上清液中的蛋白质沉淀过夜。将蛋白质重悬于含有5mM二硫苏糖醇、0.1％(沃特斯公司(Waters))的50mM碳酸氢铵中，在90℃下加热10分钟并使用2ug的胰蛋白酶(普洛麦格公司(Promega))消化过夜。加入0.1％v/v甲酸以终止蛋白质水解消化。随后通过质谱分析所得的肽。
如下所述通过纳米LC/MS/MS进行蛋白质鉴定：通过NanoAcquity UPLC系统(沃特斯公司)上的纳米LC对肽进行分离，该系统连接于配备有纳米喷雾源(沃特斯公司)的Q-ToF Premier电喷射离子化(ESI)质谱。将样品加载至NanoAcquity1.7μm BEH130 C18柱(75μm X 25cm，沃特斯公司)，通过NanoAcquity 5μmC18捕获柱(180μm X 20mm，沃特斯公司)。以250nl/分钟的流速，使用98％乙腈、0.1％甲酸溶液的120分钟的2–40％的梯度对肽洗脱。
使用MassLynx软件，4.1版(沃特斯公司)对洗脱的肽进行自动化数据依赖获取，其中使用MS全局扫描以在300–2,000的m/z比例范围上自动选择高电荷肽以进行进一步MS/MS片段化。同时对最多五种不同组分进行MS/MS片段化。数据获取后，使用ProteinLynx，3.5版(沃特斯公司)合并、平滑化并质心化单个谱以获得峰列表文件。使用Mascot Daemon应用(英国伦敦的矩阵科学有限公司(MatrixScience Ltd.))将数据文件自动提交至本地服务器上运行的某一版本的MASCOT(版本2.2.1)。
通过在本地辅助数据库(locally curated database)中检索以实现蛋白质鉴定，该数据库组合了来源于NCBInr数据库的艰难梭菌部分的蛋白质序列数据、序列总数和分别为71233和21677396的残基。MASCOT检索参数设为(i)允许的错误切割数量为1，(ii)可变修饰为甲硫氨酸氧化和谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺，(iii)肽容限为0.2Da，以及(iv)MS/MS容限为0.2Da。仅考虑了显著的命中，如MASCOT评分和概率系统所定义。对于胰蛋白酶消化，用于收录肽鉴定的评分阈值是大于等于33。
发明人发现，多肽Dif183、Dif192和Dif153被分泌并存在于来源于菌株630的上清液中。此外，发明人还发现，以下蛋白质存在于20291菌株的上清液中：Dif183、Dif192和Dif153和片段Dif208A和Dif208B。这些结果总结在图2中。这些分泌的蛋白质/多肽是有用的疫苗靶标，特别用于减少或预防细菌建群或用于减少感染位点处的组织损伤(如坏死)。
实施例3：通过NMR对细胞裂解物的分析
携带用于重组蛋白表达的载体的细菌细胞最初通过如下方式清洗：在800uLM9 1X缓冲液(pH 7.4)中重悬，离心(3,000rpm下5分钟)并弃去上清液。将剩余的细菌沉淀重悬于600uL M9缓冲液中，通过超声裂解细胞，随后在4℃下离心(14,000rpm，20分钟)。随后分离上清液以用于NMR分析。向样品中加入10％D2O(以体积计)用于NMR分析。使用900或800MHz NMR获取快速HSQC或TROSY实验并通过topspin软件处理(图3)。
在NMR分析中，Dif44的HSQC谱显示图片(pics)的良好分散，其中图4中大致相等的强度显示Dif44是良好折叠的。细胞裂解物的NMR分析的结果总结于图2。这些结果鉴定了具有稳定维持其三维结构倾向的多肽，尤其是在异源环境(如大肠杆菌胞质)中表达时——这是一种对提供重组、亚单位疫苗组分而言有用的特性。
实施例4：重组蛋白和片段的克隆、表达、纯化
为制备分离的重组蛋白，使用特定的寡核苷酸并使用艰难梭菌染色体DNA作为模板对艰难梭菌ORF进行PCR扩增。用于基因扩增的引物总结于图1。使用PIPE法(Klock,H.E.,等(2008).Proteins 71:982–994)将所得的PCR产物克隆至pET15b(诺瓦基公司(Novagen))，包括克隆载体的PCR扩增(V-PCR)和插入片段的PCR扩增(I-PCR)。随后，将1μl的V-PCR和1μl的I-PCR混合并转化至化学感受态HK100细胞中(Klock,H.E.,等(2005)J.Struct.Funct.Genomics 6,89–94)。设定I-PCR反应，含有1μM各正向和反向引物、1x克隆Pfu DNA聚合酶反应缓冲液、2.5单位的Pfu Turbo DNA聚合酶(司查塔基公司(Stratagene))、200μM的各dNTP(英杰公司(Invitrogen))和50ng的基因组DNA模板。按如下条件进行反应：95℃起始变性2分钟，随后进行95℃30秒、55℃45秒和68℃3分钟的25次循环，最后冷却至4℃。V-PCR反应与I-PCR反应相同，只是68℃的步骤持续14分钟并使用2ng的pET15b质粒作为DNA模板。通过载体-插入接头的PCR筛选和DNA质粒测序选自正确的转化子。随后从选择的HK100克隆中制备正确的质粒并用于转化BL21(DE3)T1r细胞(西格玛公司(Sigma))以进行蛋白质表达。
为表达克隆的蛋白质，在37℃下使含有pET15b构建体的BL21(DE3)T1r克隆在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上生长直至OD600＝0.5。随后通过加入1mM IPTG诱导蛋白质表达并在相同温度下再生长3小时。进行常规蛋白质提取和SDS-Page以检查蛋白质表达。
实施例5：使用艰难梭菌重组蛋白和片段免疫小鼠
对于图1所述各多肽和片段，使用2组每组4只雌性CD1小鼠。各组使用明矾佐剂(组1)或MF95佐剂配制的10μg抗原免疫。在第0、21和35天时经腹膜内进行免疫。在第49天是进行最后的取血和处死。
针对重组多肽的血清用于通过下文所述Western印迹、共聚焦显微分析和FACS分析鉴定本发明的多肽。该血清也用于被动保护实验以鉴定哪种多肽最适用于中和抗体的制备。
实施例6：通过Western印迹进行的表面暴露研究
为显示所选蛋白质是由艰难梭菌细胞进行表面表达的，在不同的筛选中使用了针对各重组蛋白产生的血清。对细菌组分进行Western印迹分析以验证本发明的多肽是否存在于S层组分(含有细胞壁的非共价锚定蛋白)和总细胞壁提取物(含有细胞壁的所有蛋白质)中；纯化的蛋白质用作血清特异性的阳性对照。艰难梭菌630菌株在BHI培养基中生长过夜并通过离心收获以用于制备S层和总细胞壁提取物。使用低pH甘氨酸孵育制备S层提取物；简言之，将细菌沉淀与0.2M-甘氨酸，pH2.2和蛋白酶抑制剂在室温下孵育20分钟。对细菌悬浮物进行离心并通过添加2M Tris碱中和含有表面蛋白的上清液。
通过将细菌与60μg/ml变溶菌素、1mg/ml溶菌酶和蛋白酶抑制剂在室温下孵育2小时来制备总细胞壁提取物。对细菌悬浮液进行离心并收集含有表面蛋白的上清液。对S层和细胞壁提取物中的蛋白质进行SDS-PAGE和western印迹。针对各重组蛋白产生的所有小鼠血清都以1/1000稀释使用，随后使用1/2500稀释的抗小鼠HRP。
Dif183的分析和艰难梭菌细胞组分的制备：为制备“总细胞提取物”，使菌株630在TYM中生长至OD600 1,3。4000rpm离心10分钟以收获细胞并在PBS中清洗一次。将沉淀重悬于PBS中。为分离含有S层蛋白质和细胞壁中存在的其他蛋白质的“细胞壁组分”，将菌株630在20ml的TYM肉汤中生长至OD6001,3。4℃下4000rpm离心10分钟以收获细胞并在PBS中清洗一次并在Tris-蔗糖缓冲液(10mM Tris-HCl pH6.9，10mM MgCl2，0.5M蔗糖)中清洗一次。随后使沉淀在2ml消化缓冲液(含有250μg/ml变溶菌素和蛋白酶抑制剂的Tris-蔗糖缓冲液)中在37℃下孵育2小时，期间温和旋转振荡。通过离心将含有“细胞壁组分”的反应上清液与含有“原生质体组分”的沉淀分离。将原生质体重悬于PBS中并通过冻-融样品五次进行裂解。
为制备仅含有S层相关蛋白质的“S层组分”，使菌株630在50ml的BHIS肉汤中生长过夜。室温下3500g离心10分钟以将细胞与培养基分离，将细胞在PBS中清洗并在0.5ml的0.2M HCl(pH 2.2)中在室温下并在蛋白酶抑制剂存在的情况下孵育20分钟，期间温和振荡。在4℃下对细菌悬浮液以最高速离心10分钟。移开含有S层蛋白质的上清液并通过加入2M Tris碱进行pH中和。
对于Western印迹分析，基于起始培养基体积对组分进行标准化。
Western印迹分析：对于全细胞裂解物、细胞组分、上清液组合和纯化的重组蛋白的蛋白质分析，将样品与含有还原剂的样品缓冲液混合并在加载前100℃加热10分钟。对样品使用NuPAGE凝胶系统(英杰公司(Invitrogen))通过SDS-PAGE活性分离并转移至硝化纤维素膜上以用于Western印迹分析。在4℃下使用PBS-10％奶粉将膜封闭3小时。使用的一抗是针对重组带his标签的蛋白质产生的多克隆小鼠抗血清。所有一抗均1:1000稀释并在37℃下孵育1小时30分钟；二抗是与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠血清(1:5000，大科公司(Dako))并在室温下孵育45分钟。使用超级信号化学发光底物(Super Signal ChemiluminescentSubstrate)(皮尔斯公司(Pierce))并遵循生产商说明书对结合的抗体进行检测。
由所示血清识别的多肽Dif44、Dif51和Dif192是细胞表面暴露的并可接触对象的免疫系统，因此这些抗原也代表有用的疫苗靶标，特别对于感染的预防、减少建群或感染扩散(图5)。
实施例6A：通过共聚焦显微分析确定表面暴露
为确定所选蛋白质是否是由艰难梭菌细胞进行表面表达的，在进一步的筛选中使用了针对各重组蛋白产生的血清。在固定的细菌上进行共聚焦显微分析以评价特定抗体对各预测暴露蛋白质的可接触性。使用蓝色荧光的DAPI标记细菌DNA；使用特定血清对表面蛋白进行染色，随后使用与红色或绿色染料偶联的二抗染色。
为验证各经选择多肽的表面暴露，在BHI中生长艰难梭菌630菌株至最高OD600 0.5并用PBS清洗。对细菌沉淀使用2％PFA在室温下固定20分钟，并将其点在涂覆有聚赖氨酸的腔式载玻片上。随后对细菌使用2％BSA封闭15分钟并与使用针对各重组蛋白产生并在2％BSA中以1/500稀释的血清在室温下孵育1小时。随后使用山羊抗小鼠Alexa Fluor 568偶联的抗体(分子探针公司(Molecular Probes))对细菌在室温下染色30分钟。随后使用带有DAPI的Gold抗衰减试剂(分子探针公司)封装盖玻片。
发明人发现，针对Dif44、Dif51、Dif153、Dif183、Dif192、Dif208和Dif232产生的血清能够识别630菌株表面上的这些蛋白质。图2中标题为共聚焦显微分析的那一栏显示了艰难梭菌630菌株提取物中表面暴露并检测到的蛋白质。再次说明，这些在细胞表面暴露并可接触免疫系统的抗原代表有用的疫苗靶标。
实施例7：与人上皮细胞相互作用
为评估所选多肽是否能够结合人上皮细胞，在两个结合试验中测试了各重组多肽：
1.FACS分析：使用细胞解离溶液(CDS，西格玛公司(Sigam))以非酶方式分离Vero细胞，收获并重悬于补充了1％FBS的RPMI培养基中。将约105个细胞置于96孔微孔板中并与不同浓度的经纯化蛋白质(浓度范围为500至0.24mg/mL)或单独的培养基在37℃或4℃下混合1小时，每20分钟混合一次以避免细胞附着。使用PBS+2％FBS清洗两次并离心以去除过量的未结合蛋白质。随后将细胞与针对各重组多肽产生的血清在4℃下孵育1小时。将细胞在PBS+2％FBS中清洗两次并在4℃下与R-藻红蛋白偶联的抗小鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories))孵育30分钟。随后将细胞在PBS+2％FBS中清洗并重悬于PBS中。发明人发现，Dif208A、Dif208B、Dif232和Dif192能够结合至Vero细胞的表面。例如，Dif232的FACS分析示于图6，所有的FACS分析结果示于图7。结合至人细胞的多肽可能是限制或阻止艰难梭菌建群的良好候选物。
2.共聚焦显微分析：将Vero和Caco-2细胞接种在腔式载玻片上的补充有10％FCS的DMEM培养基中并孵育24小时。将细胞与20mg/mL稀释于DMEM+10％FCS中的各多肽在37℃下孵育1小时。在PBS+2％BSA中清洗两次以除去过量的未结合多肽并使用2％PFA将细胞在室温下固定20分钟。随后对细胞使用PBS+2％BSA封闭15分钟并与使用针对各重组蛋白产生并在PBS+2％BSA中1/500稀释的血清在室温下孵育1小时。随后使用抗小鼠Alexa Fluor 488偶联的抗体(分子探针公司)对多肽进行染色并使用Alexa Fluor 568偶联的鬼笔环肽对细胞肌动蛋白进行染色。随后使用带有DAPI的Gold抗衰减试剂(分子探针公司)封装盖玻片。
为确定FACS结果，在Vero细胞上通过共聚焦显微分析结合试验测试对FACS阳性的多肽。此外，该分析还扩展至人小肠Caco-2细胞。结合人细胞的多肽可能是限制或阻止艰难梭菌建群的良好候选物。发明人证明，Dif208B、Dif51和Dif192清楚地结合细胞膜而Dif208A与细胞膜潜在相关(图7)。已证明这些多肽结合人细胞且其可能是限制或阻止艰难梭菌建群的良好候选物。
实施例8：与胞外基质(ECM)组分的相互作用
使用10μg/ml的各ECM组分涂覆平板并在4℃下孵育过夜。随后清洗平板并使用2,7％在37℃下封闭2小时。清洗后，将平板在4℃下储存至少16小时。将20-50μg/ml的重组多肽添加至涂覆的细胞并在37℃下孵育2小时。
清洗孔并用针对各重组蛋白产生的血清在37℃下孵育90分钟，随后与HRP偶联的二抗在37℃下孵育90分钟。向各孔中添加HRP底物溶液并通过加入12,5％H2SO4终止反应。通过ELISA酶标仪在490nm处读取平板。
能够结合胞外组分的多肽可能是用于限制或阻止小肠组织建群的良好候选物。例如，Dif208多肽含有胞外基质结合结构域。为验证这些结构域是否能够介导与特定ECM基质的结合，发明人进行了ELISA研究。使用纯化的ECM组分涂覆ELISA平板并将其与连续稀释的重组蛋白(范围为2ug至31.25ng/孔)孵育。在该研究中分析了Dif208蛋白的两个亚结构域(Dif208A和Dif208B)。发明人发现，Dif208亚结构域结合所有ECM组分(图9)。这些多肽能够结合胞外组分并且可能是用于限制或阻止小肠组织建群的良好候选物。
实施例9：艰难梭菌临床分离物中Dif192和Dif44的保守性
通过对艰难梭菌菌株630(核糖体型012)、R20291(核糖体型027)和M120(核糖体型078)以及艰难梭菌临床分离物(其代表来自意大利不同区域的6种普遍的PCR核糖体型(001、014、018、012、078、126))的总细胞提取物或S层制备物进行了Western印迹分析以研究Dif192和Dif44是否存在。全细胞裂解物的制备物通过基于冻-融法的方法获得，如Fagan和Fairweather所述(Fagan,R.,和Fairweather,N.J Biol Chem.286(31):27483-93,2011)。简言之，通过在4℃下5,000x g离心10分钟收获艰难梭菌培养物并将沉淀在-20℃下冷冻。将细菌解冻，重悬于PBS中至OD600nm为20并在37℃下孵育10分钟。进行三轮这种冻-融以获得恒定并可重复的裂解。通过先前所述方法进行S层的提取(Fagan,R.,和Fairweather,N.Methods Mol Biol 646,117-134,2010)。
从在BHI肉汤中生长至稳定期(OD600nm约等于1)的培养物中制备细胞壁蛋白质。通过SDS-PAGE分离提取物，随后使用小鼠中产生的特异性抗体进行Western印迹。以1:2,000的稀释使用一抗并使用1:20,000的辣根过氧化物酶偶联的兔抗小鼠抗体(大科公司)和SuperSignal West Pico化学发光底物(赛默飞世尔皮尔斯公司(Thermo Scientific Pierce))检测。常规使用用于直接观察的标准条带(MagicMark XP Western蛋白质标准品，英杰公司)作为标志物以在Western印迹上估计蛋白质分子量。在所有分析的临床分离物的总提取物中检测Dif192和Dif44的表达，结果显示这些多肽是保守的且这些多肽因此还代表有用的疫苗靶标，特别是用于预防感染、减少建群或感染扩散。
实施例10：小鼠抗体对重组多肽的识别
为进一步确认表面和分泌的蛋白质在梭菌发病机制中重要且能够在体内引发抗体应答，发明人对培养物上清液进行了进一步分析，该上清液同样由630临床菌株制备。不存在可检测的细胞裂解物(数据未显示)。
使用浓缩的上清液对小鼠进行免疫：为获得“抗上清液”血清，将艰难梭菌630生长于进行两次连续稀释的培养基CDMM(Karasawa等，1995)中。获得了OD600 0.5的最终培养物。通过离心并随后通过0.22μm滤器进行过滤将培养基与细菌分离，使用Vivaspin离心浓缩器MWCO 5000Da(西格玛公司)浓缩其中含有的蛋白质。使用二辛可宁酸试验估计所得的蛋质白浓度(美国伊利诺州洛克福德的皮尔斯公司)。使用每剂量20μg的蛋白质免疫8只小鼠并收集所得血清以用于western分析。
Western印迹分析：将50ng的各重组蛋白加载至NuPAGE凝胶上并如下所述进行Western印迹分析，作为用浓缩的上清液免疫的小鼠的一抗血清使用。将含有纯化的蛋白质的样品与含有还原剂的样品缓冲液混合并在加载前100℃加热10分钟。对样品使用NuPAGE凝胶系统(英杰公司(Invitrogen))通过SDS-PAGE活性分离并转移至硝化纤维素膜上以用于Western印迹分析。在4℃下使用PBS-10％奶粉对膜封闭3小时。使用的一抗是针对重组带his标签的蛋白质产生的多克隆小鼠抗血清。所有一抗均1:1000稀释并在37℃下孵育1小时30分钟；二抗是与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠血清(1:5000，大科公司)并在室温下孵育45分钟。使用超级信号化学发光底物(皮尔斯公司)并遵循生产商说明书对结合的抗体进行检测。
为证明所选表面暴露多肽能够在体内引发抗体应答，分析了来自小鼠的血清中是否存在特异性抗体。使用来自用浓缩上清液免疫的小鼠的血清通过Western印迹分析纯化的多肽。使用艰难梭菌细菌的上清液免疫的小鼠血清含有能够识别艰难梭菌重组蛋白和片段的抗体。通过抗体清楚地检测了纯化的Dif183多肽和片段，确认了感染期间这些蛋白质的可接触性和其作为疫苗靶标的适宜性(图14)。
实施例11：仓鼠抗体对重组多肽的识别
对100ng的各重组蛋白进行SDS-PAGE和western印迹。将膜与1/200稀释的仓鼠血清孵育，随后与以1/10.000稀释的抗小鼠HRP孵育。在以下时间点提取血清：a)攻击后15天从经疫苗接种的仓鼠中提取；b)攻击后30-50小时从未经疫苗接种的仓鼠中提取。来自未感染仓鼠的血清用作阴性对照。为证明所选表面暴露多肽能够在体内引发抗体应答，分析了来自受感染仓鼠的血清中是否存在特异性抗体。使用来自受感染仓鼠和来自随后使用A和B毒素组合进行疫苗接种的受感染参数的血清通过Western印迹分析纯化的多肽。
发现来自受感染仓鼠的血清含有少量针对艰难梭菌多肽的抗体。这主要是因为受感染仓鼠在感染后30-50小时死亡，这段时间内不足以建立针对细菌的免疫应答。因此，这些血清中存在的抗体所针对的多肽对于疫苗组合物中的应用和中和抗体的制备特别有用。
来自接种并随后感染的仓鼠的血清含有能够识别纯化的多肽的抗体。在感染前使用毒素组合(p5/6+toxB_GT)进行免疫能够使仓鼠生成有效的抗体应答以预防死亡，但无法预防艰难梭菌建群。通过来自经接种和受感染仓鼠的仓鼠血清中存在的抗体对纯化的多肽和片段进行了检测，确认了感染期间这些蛋白质的可接触性和其作为疫苗靶标的适宜性。来自未感染仓鼠的血清用作阴性对照。例如，来自经接种并随后感染的仓鼠的血清含有能够识别Dif44、Dif51、Dif130、Dif153、Dif183、Dif208和Dif232的抗体，确认了感染期间这些蛋白质的可接触性和其作为疫苗靶标的适宜性(图10)。
来自未感染仓鼠的血清用作阴性对照(图10B)。由于与重组蛋白制备物中的大肠杆菌污染物存在交叉反应，可看到一些条带。
实施例12：来自人血清的抗体(IgA和IgG)的识别
为测试人血清对重组多肽的识别，发明人制备并使用的蛋白质芯片阵列。
1.蛋白质微阵列方法：通过将纯化的重组蛋白(0.5mg/ml)以四次重复点样在硝酸纤维素涂覆的载玻片(FAST载玻片，Schleicher和Schuell)上以生成艰难梭菌蛋白质阵列，所述点样使用了喷墨点烟器Arrayjet(艾瑞杰特有限公司(Arrayjet Limited))，其配备有携带超过100个喷嘴的压电喷墨打印头，形成直径约90-100μm的斑点。作为实验对照，在阵列上点了生物素化BSA、小鼠IgG、人IgG和人IGM的4个曲线重复(0.004至0.5mg/ml)。使用PBS缓冲液进行点样，其数目至少为蛋白质斑点数目的两倍，并用于检测点样期间交叉感染所致非特异性信号。少于5％的PBS斑点显示高于背景值+3标准偏差值的信号强度。
通过将阵列与含有3％Top Block(伏路卡公司(Fluka)-BioChemiKa)–含0.1％吐温20的PBS缓冲液(TPBS)的封闭缓冲液预孵育来最小化非特异性结合。使用TPBS清洗后，将人血清在3％Top Block–TPBS中稀释并在25℃下在阵列上覆盖1小时。使用TPBS清洗后，通过将阵列与抗人Cy5偶联的二抗(1:800)在25℃下孵育1小时来检测阵列上打印的抗原与抗体的结合。所有孵育步骤都在振荡下进行，使用HS 4800杂交站(帝肯公司(TECAN))。使用PowerScannner3.5扫描仪(帝肯公司)检测图像荧光信号并在10m/像素分辨率下使用ScanArrayTM软件生成16位图像并使用ImaGene 6.0软件(美国加利福尼亚州的生物发现公司(Biodiscovery Inc))测定斑点荧光强度(FI)。使用公司内部开发的软件进行校正和分析。对各蛋白质，在扣除各斑点周围的背景值后，测定了重复斑点的平均荧光强度(MFI)。认为信号是阳性的标准是：信号的MFI值比使用IgG的实验高2000且比使用IgA的实验高1000，其对应于单独使用抗人Cy5抗体检测后蛋白质斑点的平均荧光强度(MFI)，加3个标准偏差值。添加了两种对照：对应于携带空表达载体的大肠杆菌细胞提取物的斑点的MFI值的NN-His以及对应于仅含缓冲液的斑点的MFI值(背景值)的PBS_Gly。通过软件将这些值自动地从各样品斑点的数值中扣除。
2.Western印迹分析：将两百纳克(200ng)各纯化的重组蛋白加载至1-mm 12孔4-12％Novex Bis-Tris NuPAGE预制凝胶上(英杰公司)，在200V下分离35分钟并使用干系统iBlot(英杰公司)转移至硝酸纤维素膜上。对膜使用含10％脱脂牛奶(蒂福科公司(Difco))的PBS-T(含有0.05％吐温20的PBS)饱和并在室温下孵育1小时，期间温和振荡。随后将封闭的膜与在1％脱脂牛奶PBS-T中以1:500稀释的人血清4705WH孵育并在室温下孵育3小时。对膜使用PBS-T进行一次15分钟清洗和两次5分钟清洗。
随后加入二抗并孵育40分钟(温和振荡)，所述二抗是抗人IgG抗体、HRP偶联的SIGMA A-6029(在1％脱脂牛奶PBS-T中1:2500稀释)或抗人IgA、碱性磷酸酶偶联的SIGMA A-9669(在1％脱脂牛奶PBS-T中1:3000稀释)。使用PBS-T进行一次15分钟清洗和3次5分钟清洗后，使用底物SuperSignal WestPico(皮尔斯公司)溶液覆盖膜并在室温下孵育5分钟(温和振荡)。使用纸巾除去过量底物并将膜暴露于射线照相胶片。
获得了来自康复期供体(供体A、供体B、供体C、供体D和供体E)和健康供体(10WH、3453WH、4016BL、4697WH和4705WH)的人血清。不同血清的ELISA效价示于图11。FGF21是一种作为阴性对照的不相关蛋白质，而ToxA/B是来自因弗内斯医疗公司(Inverness Medical Inc.)的毒素A和B的组合。与FGF21的IgG效价相比，来自康复期供体供体A、供体C和供体D的血清具有针对ToxA和ToxB的IgG，显示已建立针对艰难梭菌的免疫应答。此外，与FGF21的IgG效价相比，来自健康供体10WH和4705WH的血清具有针对ToxA和ToxB的高IgG效价，显示其在过去受感染并已在先前建立了针对艰难梭菌的免疫应答的(图11)。
血清中特异性IgG的存在与针对艰难梭菌的IgG系统性免疫应答相关。通过使用该蛋白质阵列，鉴定了人血清中是否存在针对多肽的特异性IgG。例如，通过使用蛋白质阵列，发明人鉴定了上文所述人血清中是否存在针对Dif51、Dif130、Dif232多肽的特异性IgG。已在名称为4705WH的血清中测量到了针对Dif232多肽的IgG的高效价(MFI>5000)(图12A)。通过Western印迹确认了名称为4705WH的血清中针对Dif232的IgG是否存在(图12B)。
显示强反应的多肽可特别地用于免疫原性或疫苗组合物，特别用于人。此外，血清中特异性IgA的检测与针对艰难梭菌的粘膜免疫相关。测定了人血清中针对本发明多肽的特异性IgA是否存在。例如，发明人鉴定了人血清中特征Dif51多肽的特异性IgA的存在(总结于下文和图13A)。
在名称为供体C的血清中测量了针对Dif51的IgA的效价(MFI>1000)。在名称为供体A、供体C、供体D、3453WH和4705WH的血清中测量了针对Dif130的IgA的效价(MFI>1000)。显示强反应的多肽可特别用于免疫原性或疫苗组合物以生成粘膜免疫应答，提供涉及生物体多种粘膜的保护。这特别适用于感染被限制在结肠粘膜中的艰难梭菌。通过Western印迹确定了血清4705WH中针对Dif130和Dif232多肽的IgA的存在(图13B)。这些多肽可特别用于免疫原性或疫苗组合物以生成粘膜免疫应答，提供涉及生物体多种粘膜的保护。这特别适用于感染被限制在结肠粘膜中的艰难梭菌。表2总结了蛋白质芯片和Western印迹分析中被人血清(4705WH)识别的多肽。
名称 标注 预测的位置
Dif130 细菌胞外溶质结合蛋白 脂蛋白
Dif232 推定的细胞壁锚定蛋白 LPXTG样基序
实施例13：Dif153(CD2830)的进一步分析
已在630和Stoke_Mandeville菌株的上清液中检测了Dif153。Dif153标注为220个氨基酸的假拟蛋白。BLAST分析显示了与炭疽热致死因子蛋白(LF)的同源性。
具体而言，Dif153显示了与炭疽热致死因子C端结构域(残基589-810)的同源性。与保护性抗原相互作用所必须的炭疽的N端结构域缺失。Dif153中催化位点(HEXXH)是保守的，暗示该艰难梭菌蛋白可能是锌依赖的金属蛋白酶(图15)。为理解该蛋白质是否能够结合锌或其他二价阳离子，使用重组蛋白进行了NMR分析。该分析表明重组蛋白具有结合锌、镍和铜的能力，但不结合钙。
为研究Dif153是否具有蛋白质水解活性，进行了荧光测定分析以测试重组蛋白切割明胶底物的能力(图18)。该分析显示，在锌存在的情况下，重组蛋白具有微弱的明胶酶/胶原酶活性，但不是在镍和铜存在的情况下或脱辅基(apo)形式下。已报道梭菌分泌数种金属肽酶，其负责分泌胞外基质组分。因此，发明人在体外测试了重组蛋白对于数种胞外基质元件(胶原I-VI和纤连蛋白)的蛋白质水解活性。初步分析显示重组蛋白能够切割纤连蛋白(图16)。
如下所述对Dif153进行进一步表征：评估了对其他胞外基质元件的蛋白质水解活性，并通过纤连蛋白片段的质谱测序鉴定了切割位点。进行了体外试验以理解该蛋白质是否对人细胞具有毒性作用。进行了体外试验以理解该蛋白质是否影响人细胞的纤连蛋白基质的组织。通过生成催化位点突变的无活性重组蛋白确认了观察到的酶活性是对Dif153特异的。该多肽是一种具有纤连蛋白降解活性的锌金属肽酶，其可能是限制或阻止艰难梭菌建群的良好候选物。
实施例14：Dif183的进一步分析
为表征Dif183(CD3669)的功能，制备了缺失突变体。通过对营养细胞的共聚焦显微分析和对细胞组分的Western印迹分析，研究了Dif183的亚细胞定位。该方法描述于实施例6中。这些分析显示Dif183与细菌表面相连(图19)。
通过Western印迹确认了Dif183在培养物上清液(在对数期和稳定期后48小时收集)中的存在。此外，免疫印迹分析揭示其不仅在总上清液上，还在超速离心组分中。在稳定期后48小时，发明人在超速离心上清液和超速离心沉淀中检测了该蛋白质。该观察表明了蛋白质与大分子结构(鞭毛、囊泡)的联系，所述大分子结构最初通过电子显微分析在上清液沉淀中观察到(图20)。
为研究Dif183的功能，将富培养基中缺失突变体的生长曲线与野生型比较。进行了营养细胞和孢子的活力计数(vital count)(图21)。虽然在对数期突变体具有与野生型可比的生长概况(图21A)，但在稳定期后期突变体菌株的光学密度下降得较快(图21B)。营养细胞的活力计数未显示野生型和突变体之间的差异(图21C)。相反地，营养细胞的ETOH灭活后突变体孢子的活力计数约比野生型低10倍(图21D)。该表型可与一种或多种生物过程中的缺陷相关，如孢子的形成、孢子对乙醇处理的抗性或孢子的萌发。
对Dif183进行了进一步表征。制备了Dif183互补菌株以确认所观察到表型的特异性。在生长的不同时间点和孢子提取物中测试了蛋白质表达。这确定了表型是否与孢子形成或萌发突变相关(孢子计数、萌发试验)。测试了野生型和敲除突变体上清液对于孢子萌发的影响。在敲除突变体和野生型中对营养细胞和孢子进行了电镜分析。该多肽是一种新的孢子形成/萌发因子，其可能是限制或阻止艰难梭菌建群的良好候选物。
从超过3700个潜在靶标中，发明人使用技术组合鉴定了在艰难梭菌感染中具有潜在显著效用的多种多肽。这些多肽中每个多肽的SEQ ID NO和DIF标识物示于图1，而这些多肽的预测定位总结于图2。
实施例15：toxB_GT和TcdA片段和多肽抗原的组合
仓鼠免疫研究通常涉及Golden Syrian仓鼠。通过系统性免疫对抗原进行了测试(进行4次，间隔2周)。测试了死亡时间、感染迹象和细菌建群中的差异。
雌性Golden Syrian仓鼠(重量100g)购自英国哈兰奥拉可公司(HarlanOlac)。独立饲养动物并给予可自由采食的水和食物。在第一次免疫前至少3周通过剖腹手术经腹膜内插入遥测芯片(VE公司(Vitalview Emitter))。一旦伤口愈合，就将动物置于接收垫上，并检测体温或活动(VE公司软件)。在第1、14、28和36天时使用四次剂量的MF59佐剂配制的抗原组合(50ugr的p5-6和toxB_GT与20μg的抗建群抗原Dif044或DIF208)经腹膜内(i.p.)对动物进行免疫。所有组分均正确存储并经历最少的冻/融循环。
为确保各动物对建群的敏感性，在60天时使用30mg/kg的磷酸克林霉素处理各动物。在给予抗生素后12个小时，使用约1000个孢子的艰难梭菌630攻击各仓鼠。
攻击后，严格监测动物中感染迹象，包括稀粪(湿尾巴)的发生和持续。如先前所报道，处死体温下降超过2度(35℃)的动物。还处死体温未下降至35℃以下但失去10％体重的动物。攻击后存活超过两周的动物被认为从感染中恢复并被处死以提供实验终点。
1.死亡时间：动物受到攻击后到达35℃所需时间。
使用9.4x 104个孢子/剂量攻击后所有动物都存活，且没有动物显示任何临床迹象(包括腹泻)。收集全部粪粒以检查孢子的脱落。这与使用不含抗建群抗原的P5/6+toxB_GT免疫时观察到的现象(如WO2013/084071)一致。
2.体温：在整个实验中通过遥测监测了所有动物的体温。所有动物都显示正常的昼夜波动，在动物6-9的第一个48小时内未观察到影响。H10中的遥测芯片未工作，所以没有该动物的温度数据。代表性结果示于图23。
3.经疫苗接种的动物粪便中艰难梭菌孢子的脱落：在攻击后各天收集粪粒。这可以通过将动物置于新的无菌笼中或使用干净的无菌寝具替换弄脏的寝具来实现。将粪粒重悬在无菌PBS中并通过放置于具有红霉素的Braziers CCEY琼脂上来对恢复的艰难梭菌生物体数目进行计数。随后测定每100mg粪便材料中菌落的数目。
结果显示，使用抗建群因子抗原(DIF044和DIF208)接种的动物中艰难梭菌的最初脱落与单独使用毒素片段接种的动物中的脱落水平(使用p5/6+tox GT免疫的动物的历史数据)类似。抗建群因子接种的动物中脱落水平在攻击后3天至4天之间下降，而在这个时间点上我们通常观察到在仅使用毒素片段免疫的动物中细菌水平上升。至攻击后第8天，所有经接种的动物组中的脱落水平都类似(图24)。
4.终点处肠道中的艰难梭菌建群：对定位于盲肠腔(Cae-LA)和结肠腔(Col-LA)以及与这些器官的组织相关的那些(Cae-TA和Col-TA)中对艰难梭菌数目进行了计数。取出肠道并测定了恢复的细菌上的细菌计数。为对总细菌荷载(孢子和营养细胞)进行计数，纵向打开各部分并使用替换两次的10ml PBS温和清洗以除去其中组分。使用匀质器(Stomacher)将组织在5ml的PBS中匀化1分钟并测定匀浆的活力计数。将连续的10倍稀释物涂布在含有20g/ml两性霉素B的CCFA血液琼脂平板上以抑制酵母生长。为预测样品中存在的孢子数目，将样品在56℃下加热10分钟，并通过活力计数方法测定存在的孢子数目。微生物分析显示实验终点时H1、H14、H5和H6不含检测的艰难梭菌。H8和H10具有非常低数目的艰难梭菌，其中在终点处只有少量菌落生长(图25)。将终点处肠道的平均建群与先前实验中使用单独的p5/6+toxB_GT接种的动物所获得的数据相比较(图26)。
在所有组中，结肠腔中分离的艰难梭菌数目最多。所有经接种的组中，与盲肠腔和结肠腔相关的细菌数目是相当的。使用抗建群抗原接种的组中的细菌数目与盲肠中组织的相关程度较低。未从使用与结肠中组织相关的DIF044接种的组中分离出细菌。
5.肠道中的毒素估计：还进行了肠道中毒素含量的评估。通过0.22μm滤器对肠道洗出物进行过滤以除去细菌细胞。随后将过滤的洗出物置于融合的Vero细胞(以10倍下降浓度，对结肠而言是5倍)上，持续24小时。孵育后，对细胞清洗、固定并使用Giemsa染料进行染色。如果毒素存在，则细胞圆化导致脱落和脱色。毒素含量数据代表了细胞维持贴壁(染色)的稀释度。如图27所示，通过将肠道内容物样品加入至HT29细胞(对毒素A敏感)或Vero细胞(对毒素B敏感)上，估计在所有肠道样品中都存在非常少量的无活性毒素。
6.抗体检测和肠道洗出物血清：通过Western印迹对来自仓鼠的血清或肠道洗出物进行了测试，用于测量抗毒素、抗Dif44和抗Dif208抗体。对于该分析，使用NuPAGE凝胶系统(英杰公司)通过SDS-PAGE分离200ng的各重组蛋白(p5-6、toxB_GT、Dif44和Dif208)并将其转移至硝酸纤维素膜上用于Western印迹分析。在室温下使用PBS-10％奶粉对膜封闭1小时。随后将膜与来自实施例15的仓鼠的肠道洗出物(1:10稀释)或血清(1:200稀释)在37℃下孵育90分钟：具体地，来自实施例15的仓鼠1-5的血清或肠道洗出物用于检测抗Di44抗体且来自实施例15的仓鼠6-10的血清或肠道洗出物用于检测抗Dif44抗体。在与抗仓鼠二抗(1:10000稀释)在37℃下孵育45分钟后，使用超级信号化学发光底物(皮尔斯公司)并遵循生产商说明书对结合的抗体进行检测。
从图28和29中可以看到，抗Dif44和抗Dif208抗体存在于血清和肠道洗出物中。
实施例16：抗Dif44抗体识别其他CWP蛋白
为确定抗Dif44抗体是否与其他cwp蛋白交叉反应，将200ng的多种样品加载至凝胶上并进行Western印迹。对各重组cwp蛋白(列于图30)使用NuPAGE凝胶系统(英杰公司)通过SDS-PAGE活性分离并转移至硝化纤维素膜上以用于Western印迹分析。
在室温下使用PBS-10％奶粉对膜封闭1小时。随后将膜与实施例15的仓鼠1-5的血清(1:200稀释)在37℃下孵育90分钟。在与抗仓鼠二抗(1:10000稀释)在37℃下孵育45分钟后，使用超级信号化学发光底物(皮尔斯公司)并遵循生产商说明书对结合的抗体进行检测。
如图30所示，血清抗体识别cwp1、cwp3、cwp6、cwp7、cwp11、cwp14、cwp20、cwp21、cwp25、cwp26、cwp27和cwp29。还将相同的样品与来自使用p5_6+ToxB-GT接种的仓鼠的血清孵育。该血清中可能存在的针对cwp蛋白的抗体是由于接种后针对细菌攻击的免疫应答产生的。仅针对cwp5、cwp25、cwp26、cwp29检测到微弱的反应性，显示在疫苗接种中添加dif44在针对艰难梭菌的应答中提供了优势。
实施例17：ToxB-GT和P5_6片段与DIF44和DIF208多肽抗原的组合
如上文所述制备免疫原性组合物。如下所述给予三种组合物：使用他处所述标准给药方法对8只仓鼠给予ToxB_GT+P5_6+DIF208+DIF44，对4只仓鼠给予ToxB_GT+P5_6(阴性对照)。使用艰难梭菌攻击给予了ToxB_GT+P5_6+DIF208+DIF44的8只仓鼠中的6只，同时保留2只不受攻击。在体内测试了死亡时间和细菌建群的差异。由于先前不可能确定在例如感染或接种所致经免疫和受攻击的仓鼠血清中是否观察到针对DIF44的抗体，还进行了Western印迹以观察经接种但未受攻击的仓鼠的血清和肠道洗出物中存在的抗体。
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Claims (23)

1.一种免疫原性组合物，其包含：
a)选自Dif44和Dif208的艰难梭菌(C.difficile)多肽，
b)编码a)中所述多肽的核酸分子，和/或
c)能够结合至a)中所述多肽的抗体。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含至少一种艰难梭菌ToxB-GT抗原和至少一种艰难梭菌TcdA抗原，编码所述抗原的核酸分子和/或能够结合至所述抗原的抗体。
3.如权利要求2所述的免疫原性组合物，所述ToxB-GT抗原和/或TcdA抗原是脱毒的。
4.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述Dif44多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列：
a)与SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:79具有80％或更高相同性；和/或
b)是SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:79的至少7个连续氨基酸的片段，或者是与SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:79具有80％或更高相同性且包含SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:79的表位的多肽片段。
5.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述Dif208多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列：
a)与SEQ ID NO:433或SEQ ID NO:133具有80％或更高相同性；和/或
b)是SEQ ID NO:433或SEQ ID NO:133的至少7个连续氨基酸的片段，或者是与SEQ ID NO:433或SEQ ID NO:133具有80％或更高相同性且包含SEQ IDNO:433或SEQ ID NO:133的表位的多肽片段。
6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，所述片段包含与SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:173具有80％或更高相同性的氨基酸序列。
7.如权利要求2-6中任一项所述的免疫原性组合物，所述ToxB-GT抗原是包含或由如下氨基酸序列或由其组成的多肽，所述氨基酸序列：
a)与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60具有80％或更高相同性；和/或
b)是SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60的至少7个连续氨基酸的片段，或者是与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60具有80％或更高相同性且包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:60的表位的多肽片段。
8.如权利要求2-7中任一项所述的免疫原性组合物，所述TcdA抗原是包含如下氨基酸序列或由如下氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列：
a)与SEQ ID NO:11、1、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15或16具有80％或更高相同性；和/或
b)是SEQ ID NO:11、1、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15或16中任一条的至少7个连续氨基酸的片段，或者是与SEQ ID NO:11、1、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15或16中任一条具有80％或更高相同性且包含SEQ ID NO:11、1、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15或16中任一条的表位的多肽片段。
9.如权利要求8所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种其他TcdA抗原，所述TcdA抗原任选地选自(1)ToxA-ED抗原(SEQ ID NO:3)、(2)ToxA-GT抗原(SEQ ID NO:4)、(3)ToxA-CP抗原(SEQ ID NO:5)、(4)ToxA-T抗原(SEQ IDNO:6)、(5)ToxA-T4抗原(SEQ ID NO:7)、(6)ToxA-B抗原(SEQ ID NO:8)、(7)ToxA-PTA2抗原(SEQ ID NO:9)、(8)ToxA-P5-7抗原(SEQ ID NO:10)、(9)ToxA-P5-6抗原(SEQ ID NO:11)、(10)ToxA-P9-10抗原(SEQ ID NO:12)、(11)ToxA-B2抗原(SEQ ID NO:13)、(12)ToxA-B3抗原(SEQ ID NO:14)、(13)ToxA-B5抗原(SEQ ID NO:15)、(14)ToxA-B6抗原(SEQ ID NO:16)或全长TcdA抗原(SEQ ID NO:1)。
10.如权利要求2-8中任一项所述的免疫原性组合物，所述TcdA抗原是ToxA-P5-6。
11.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，当存在超过一种抗原时，所述组合物中的至少两种所述抗原以杂交多肽的形式存在。
12.如权利要求1-10中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原均不以杂交多肽的形式存在。
13.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，所述组合物诱导针对艰难梭菌毒素A和毒素B的中和效价。
14.如前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物，包含至少一种其他艰难梭菌抗原，所述其他艰难梭菌抗原可以是糖抗原。
15.一种疫苗组合物，其是前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物。
16.如权利要求15所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物还包含佐剂。
17.用作药物的权利要求16所述的疫苗组合物。
18.用于在哺乳动物中产生免疫应答的权利要求16-17中任一项所述的疫苗组合物。
19.用于治疗或预防艰难梭菌相关疾病的权利要求16-17中任一项所述的疫苗组合物，所述艰难梭菌相关疾病优选是哺乳动物中的艰难梭菌相关疾病。
20.用于治疗、预防艰难梭菌孢子所诱导疾病的复发或降低其严重程度，或者用于治疗、预防或降低艰难梭菌的肠道建群的权利要求16-17中任一项所述的疫苗组合物，优选在哺乳动物中进行所述治疗、预防或降低。
21.如权利要求16-20中任一项所述的疫苗，所述哺乳动物是人。
22.一种在哺乳动物中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物或疫苗的步骤。
23.如权利要求22所述的方法，所述哺乳动物是人。
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