JP6964623B2 - C.ディフィシルの毒素aおよび毒素bタンパク質の単離ポリペプチドならびにその使用 - Google Patents
C.ディフィシルの毒素aおよび毒素bタンパク質の単離ポリペプチドならびにその使用 Download PDFInfo
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Description
を含有する単離ポリペプチド、ならびにそのワクチンとしての使用に関する。この単離ポ
リペプチドは、両毒素に対する抗毒素免疫を提供する。
病院、養護施設および他の介護施設における大きな健康問題となっている。病院に対する
費用は、欧州において20億ドル、米国において32億ドルと見積もられている。
する、グラム陽性芽胞形成性嫌気性細菌である。C.ディフィシル関連疾患(CDAD)
は、通常は抗生物質投与の結果である正常な結腸細菌叢の破壊により誘導される。環境中
のC.ディフィシル芽胞への暴露後、生物は腸粘膜においてコロニー形成する可能性があ
り、そこで疾患原因毒素の産生がCDADをもたらし得る。疾患は、軽度の合併症を伴わ
ない下痢から、重度の偽膜性大腸炎および中毒性巨大結腸症まで様々となり得る。
物質を与えられた入院患者の31%においてC.ディフィシルがコロニー形成し、コロニ
ー形成したそれらの患者の56%が、続いてCDADを発症することが報告されている。
概して、C.ディフィシルは、全ての抗生物質関連下痢の10〜25%、抗生物質関連大
腸炎の50〜75%、および抗生物質関連偽膜性大腸炎の90〜100%の原因である。
CDADの治療には、原因抗生物質の停止と、それに続くメトロニダゾールまたはバンコ
マイシンによる処置が伴う。抗生物質治療が停止された後の再発は、患者の約20%に生
じ、これは多くの場合C.ディフィシル(C.difficile)によるコロニー再形
成の結果である。
merican Phenotype 1/027(NAP1)として知られるC.ディ
フィシルのより毒性の強い株の出現を示した。NAP1は、以前の株と比較して、より高
い毒性、より低い転帰、ならびにより高い疾病率および死亡率に関連している。この株の
出現は、CDADの発生の阻止の試みにおいてすでに生じている問題を増大させる。
域大環状抗生物質の新たなクラスにおいて最初の物質である(Revill,P.;Se
rradell,N.;Bolos,J.(2006).”Tiacumicin B:
macrolide antibiotic treatment of C.diff
icile−associated diarrhea”.Drugs of the
Future 31 (6):494-497).これは、放線菌ダクチロスポランギウ
ムアウランチアクム(Dactylosporangium aurantiacum)
亜種ハムデネシス(hamdenesis)から得られる発酵産物である。フィダキソマ
イシンは、非全身性、つまり血流への吸収が極僅かであり、殺菌性であり、また、病原性
クロストリジウム・ディフィシルの選択的根絶を示し、正常な健康腸細菌叢を構成する複
数種の細菌に対する破壊が極僅かである。結腸における正常な生理学的状態の維持は、ク
ロストリジウム・ディフィシル感染症再発の可能性を低減し得る(Johnson,St
uart(2009−06).”Recurrent Clostridium dif
ficile infection:a review of risk factor
s,treatments,and outcomes”.Journal of In
fection 58(6):403−410)。この新たなクラスの抗生物質の導入は
CDADの治療を改善することが考えられるが、特に高齢者および免疫力のない患者等の
高リスク患者においては、まだ予防薬の医学的必要性が存在する。
それぞれCTAおよびCTBとも呼ばれる)の作用の結果である。それらの毒素は共に、
複数の官能性ドメインを有する高分子量(〜300kDa)の分泌タンパク質である(V
oth DE and Ballard JD,Clinical Microbiol
ogy Reviews 18:247−263(2005))。両毒素のN末端ドメイ
ンは、Rho様GTPaseを修飾するADP−グルコシルトランスフェラーゼ活性を含
有する。この修飾は、アクチン重合の損失および細胞骨格の変化を引き起こし、結腸上皮
密着結合の破壊をもたらす。これは、結腸への過度の流体滲出、および結果として下痢を
もたらす。中央ドメインは、疎水性ドメインを含有し、膜輸送に関与すると推測される。
両毒素のC末端ドメインは、標的細胞への毒素結合に関与する反復単位(RU)と呼ばれ
る複数の相同領域を含有する(Ho et al,PNAS 102:18373−18
378(2005))。反復単位は、短鎖(21〜30アミノ酸)または長鎖(〜50ア
ミノ酸)として分類される。反復単位は、組み合わさってクラスタを形成し、それぞれ、
通常1つの長鎖および3〜5個の短鎖反復単位を含有する。全長毒素Aは、8個のクラス
タに組織化される39個の反復単位(ARU)を有し(Dove et al.Infe
ct. Immun.58:480−488(1990)、一方全長毒素Bは、5個のク
ラスタに組織化される24個の反復単位(BRU)を含有する(Barroso et
al,Nucleic Acids Res.18:4004(1990); Eich
el−Streiber et al,Gene 96:107−113 (1992
))。
らの保護における抗毒素抗体の役割が示されている。ホルマリン不活性化毒素Aおよび毒
素Bで免疫化されたハムスターは、高レベルの抗毒素抗体を生成し、C.ディフィシル細
菌の致死的負荷から保護された(Giannasca PJ and Warny M,
Vaccine 22:848−856(2004))。さらに、マウス抗毒素抗体の受
動伝達は、用量依存的にハムスターを保護した。Kyne Lら(The Lancet
357:189−193 (2001))は、CDADの初期発現時の抗毒素A抗体反
応の発達が、疾患再発に対する保護と相関することを報告した。
単位を含有するC末端ドメインに局在している。最初に、Lyerlyら(Curren
t Microbiology 21 :29−32 (1990))は、33個の反復
単位を含有する毒素AのC末端ドメインが、中和抗毒素抗体の産生を誘導することができ
、C.ディフィシル感染から保護し得ることを明らかにした。この研究において、ハムス
ターには、細菌による負荷の前に精製組み換えポリペプチドが複数回皮下投与されたが、
部分的な保護しか達成されなかった。別の研究(Ryan et al,Infect.
Immun.65:2941 −49(1997))では、CTAのC末端からの720
アミノ酸残基を含有する単離ポリペプチド、および大腸菌溶血素A(コレラ菌において発
現)の分泌シグナルが、ウサギCDADモデルにおいて、少用量のCTAに対して保護的
な全身性および粘膜免疫を誘導することが示された。
めに必要であることが報告された(Kink and Williams,Infect
.Immun.66:2018−25 (1998),U.S.Pat.No.5,73
6,139(1998))。この研究は、各毒素のC末端ドメインが、毒素中和抗体の産
生において最も効果的であることを明らかにした。これは、ハムスター致死モデルにおい
てCTAおよびCTBのC末端ドメインに対して惹起された、経口送達トリ抗体(抗毒素
)の有効性を実証した。結果はまた、抗毒素が、人間におけるCDADの治療および管理
において効果的となり得ることを示している。別の研究において、ヒト抗毒素AおよびB
モノクローナル抗体が、ハムスターにおけるC.ディフィシル誘導死に対する保護を付与
すると報告された(Babcock et al.,Infect.Immun.74:
6339−6347(2006))。いずれかの毒素の受容体結合ドメインに対する抗体
によってのみ保護が観察され、また両抗毒素AおよびB抗体による処置後に、向上した保
護が観察された。
は、アジュバント活性の研究のために、C.ディフィシル毒素Aからの14反復単位(1
4CTA)を考慮した。反復単位は、N末端ポリヒスチジンタグでクローン化および発現
され(14CTA−HIS)、または、破傷風毒素からの非毒性結合ドメインに融合され
た(14CTA−TETC)。鼻腔内投与された両方の融合タンパク質は、マウスにおい
て抗毒素A血清抗体を産生したが、粘膜表面における反応を示さなかった。大腸菌易熱性
毒素(LT)またはその突然変異型LTR72との併用投与後に、向上した全身性および
粘膜抗毒素A反応が観察された。データに基づき、Wardらは、クロストリジウム病原
体に対するヒトワクチンにおける粘膜アジュバントとしての、非毒性14CTA−TET
C融合の使用を示唆した。
構造を形成するための最小配列要件に注目している(Demarest S J et
al.,J.Mol.Bio.346:1197−1206(2005))。毒素Aから
得られる11反復単位ペプチドは、正しい三元構造を有するが、毒素AおよびBからの6
および7反復単位はそれを有さないことが判明した。正しく折り畳まれた11反復単位セ
グメントは、受容体結合特性を維持することが判明した。第2の研究は、6、11または
15反復単位を含有する毒素A断片の機能的特性を検査した(Dingle T,Gly
cobiology 18:698−706(2008))。11および15反復単位の
みが、抗毒素A抗体の毒素中和能力を競合的に阻害することができた。3つ全ての断片が
、赤血球凝集活性を有することが判明したが、より長い断片は、より短いものよりも高い
赤血球凝集活性を示した。データは、毒素受容体結合ドメイン構造および免疫原性が、1
1〜14を超える反復を含有するドメイン断片において保持されることを示している。
999))は、粘膜アジュバントとしてのC.ディフィシル毒素A、毒素Bおよびそのあ
る特定の断片(例えば、反復単位の一部または全てを含有するC末端ドメイン)を開示し
た。彼らは、CTAまたはCTBの鼻腔内投与が、複数のマウス区画において、ヘリコバ
クター・ピロリウレアーゼ、オボアルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン
(KLH)等の異種抗原への粘膜免疫反応を大幅に向上させ、ヘリコバクターによる負荷
に対する保護に関連することを示した。さらに、毒素A融合タンパク質のアジュバント活
性が評価され、ARU(毒素A反復単位)を含むCTAの794C末端アミノ酸残基が、
グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)に融合し、結果的なポリペプチドGS
T−ARUが大腸菌において発現した。この研究は、血清および粘膜分泌物における併用
投与された抗原に対するGST−ARUによる免疫反応の著しい向上を実証した。
またはそれらの組み合わせを含む非毒性組み換えタンパク質の、CDADに対する活性ワ
クチンの生成のための潜在的な使用を示唆している。現在、C.ディフィシルに対するワ
クチンは市販されていないが、ホルマリン解毒全毒素AおよびBからなる候補ワクチンが
、人間におけるフェーズIおよびIIa試験において評価されている。このワクチンによ
る非経口免疫化は、抗毒素IgGおよび毒素中和抗体反応を誘導することが報告されてい
る(Kotloff KL et al.,Infect.Immun.69:988−
995(2001);Aboudola S et al.,Infect.Immun
.71:1608−1610(2003))。
する組み換え融合タンパク質の構築が、全体またはその断片において、ワクチン開発のた
めの効率的および商業的に実行可能な手法であることを示している。そのような手法は、
Varfolomeevaらにより、毒素Aの700塩基対断片および毒素Bの1300
塩基対断片の2つの部分からなる融合タンパク質として試みられている(Mol.Gen
etics,Microb.and Virol.3:6−10(2003))。この手
法はまた、BelyiおよびVarfolomeeva(FEMS Letters 2
25:325−9(2003))により説明されており、3つの部分:C.ディフィシル
毒素Aおよび毒素Bの反復単位で構成される2つのC末端ドメインに続く、ウェルシュ菌
エンテロトキシンCpeの断片からなる組み換え融合タンパク質の構築を示している。融
合タンパク質は、大腸菌において発現されたが、生成物は封入体内に蓄積し、安定ではな
かった。さらに、この研究において達成された純粋な生成物の収量(培地100ml当た
り50μg)は、著しく低いものであった。
04))もまた、組み換えC.ディフィシル毒素AおよびB反復単位(組み換えARUお
よび組み換えBRU)、ならびにCDADに対するワクチンの調製のための多糖類複合体
の使用を説明している。得られる組み換えARUタンパク質は、867個のアミノ酸残基
を含み、一方組み換えBRUタンパク質は、622個のアミノ酸の長さを含有している。
前に言及した研究とは異なり、この研究は、大腸菌における組み換えARUおよびBRU
可溶性タンパク質の高レベルの発現を実証した。組み換えARUおよび多糖類複合化組み
換えARUをワクチン接種されたマウスは、共に高レベルの中和抗毒素A抗体を有し、ま
たC.ディフィシル毒素Aによる致死的負荷から極めて保護された。さらに、Wilki
nsらは、ワクチン調製のための、ARUおよびBRUの両方からなる組み換え融合タン
パク質の使用を示唆した。
組み換え融合タンパク質が、ワクチンとして潜在的に有用となり得る。
の新たなツールおよび方法を提供する。本発明は、配列番号2(C−TAB.G5)また
はその誘導体、配列番号4(C−TAB.G5.1)を含む単離ポリペプチドC−TAB
を提供する。C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1は、毒素BのC末端ドメイン
の23反復単位に融合した、毒素AのC末端ドメインの19反復単位を含む。本発明はま
た、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドを含む組成物および
製剤を含む。組成物または製剤は、単離ポリペプチド、追加の抗原、アジュバント、およ
び/または賦形剤を含有してもよい。代替として、組成物または製剤は、本質的に、アジ
ュバントまたは他の活性成分を含まない単離ポリペプチドからなってもよい(但し、担体
、緩衝剤および/または安定剤等の賦形剤を随意に含む)。さらに、本発明の組成物また
は製剤は、特に、例えば再発性CDADを有する対象、または頻繁および/もしくは長期
の抗生物質の使用を必要とする対象において、抗生物質等の他の薬物と併用して投与され
てもよい。
らに、アジュバント、例えば例えばalum、ADP−リボシル化外毒素から得られるア
ジュバント、またはその他を含んでもよい。ワクチンは、単一投薬計画、2回投薬計画(
例えば最初の投薬から3日から20日以内、例えば10日から15日後に投与される)、
3回投薬計画(例えば最初の投薬から約7日後および約21日後に投与される)、または
4回以上の投薬計画、好ましくは2回または3回投薬計画で投与されてもよく、用量は、
20μgから200μgの量の本発明のポリペプチドを含む。
、CDAD等の疾患の1つ以上の症状を予防、治療、または軽減する方法を提供する。C
−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドは、筋肉内または他の送達
経路により対象に投与され得る。
のリスクを有する対象に、本発明の単離ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを含む組成
物を投与することにより、CDAD等の疾患を予防する方法を提供する:i)より弱い免
疫系を有する対象、例えば高齢対象(例えば65歳を超える対象)もしくは2歳未満の対
象等;ii)免疫力のない対象、例えばAIDSを有する対象等;iii)免疫抑制薬を
投与されている、もしくは投与される予定がある対象;iv)入院の予定がある対象、も
しくは入院している対象;v)集中治療(ICU)を受けている、もしくは受ける予定が
ある対象;vi)消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vii)養
護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象;viii)頻繁な、
および/もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象;ix)上述
のプロファイルの2つ以上を有する対象である対象、例えば消化管手術を受ける予定があ
る高齢対象等;x)炎症性大腸炎を有する対象;ならびに/またはxi)再発性CDAD
を有する対象、例えばCDADの1つ以上のエピソードを経験している対象等。
リペプチドを生成する方法を提供する。C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単
離ポリペプチドは、大腸菌発現系等の細菌発現系を使用して、C−TAB.G5またはC
−TAB.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸から生成され得る。
リペプチドを提供し、毒素Aの19反復単位が、少なくとも4、5、6、7、8、9、ま
たは10個のアミノ酸残基からなるリンカーを介して、毒素Bの23反復単位に接続して
いる。例として、本発明のリンカーは、配列RSMH(Arg−Ser−Met−His
)(配列番号2または配列番号4のアミノ酸439〜442)を含んでもよい。
とも1つの突然変異(例えば、挿入、置換または欠失)を含む、単離ポリペプチドの変異
体を提供する。変異体の配列は、配列番号2に対する85%、86%、87%、88%、
89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
または99%同一性を有してもよい。
B.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドまたはその変異体を生成するため
の方法を提供する。一実施形態において、本発明は、C−TAB.G5またはC−TAB
.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸を構築するための方法を提供する。別の実
施形態において、本発明は、大腸菌発現系等の細菌発現系を使用して、C−TAB.G5
またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドを生成する方法を提供する。
するための方法を提供する。この方法において、C−TAB.G5またはC−TAB.G
5.1は、対象に単独で投与されるか、またはalumもしくはその他等の1種以上のア
ジュバントと併用投与される。対象は、C.ディフィシルへの暴露のリスクがある健常個
人、C.ディフィシル感染症の治療を受けた、もしくはそれから回復したが、C.ディフ
ィシルによる再感染のリスクがある人間対象、または、現在C.ディフィシルに感染して
おり、その状態がC.ディフィシル毒素中和抗体の誘導により改善され得る人間対象であ
ってもよい。
する。免疫原性組成物は、さらに、抗原特異的免疫応答を向上させるアジュバントおよび
/または薬学的に許容される担体および/またはそれを必要とする対象への適用に好適な
製剤中の他の構成成分を含んでもよい。免疫原性組成物は、筋肉内(IM)送達、皮内(
ID)送達、皮下(SC)送達、腹腔内(IP)送達、経口送達、経鼻送達、口腔送達、
または直腸送達により送達され得る。
してその細胞毒性活性を中和する抗体を生じさせ、そのようにしてC.ディフィシル関連
疾患(CDAD)に対する長期活性保護、および/または治療を提供する。
防または治療に有用な免疫原性組成物を提供する。
ードする核酸およびその断片または変異体を提供する。本発明はまた、C−TAB.G5
またはC−TAB.G5.1をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
中和、ヒト化、モノクローナル、キメラおよびポリクローナル抗体等の抗体およびその断
片を提供する。抗体またはその断片は、毒素Aおよび/または毒素Bを認識することがで
きる。
含むワクチンを提供する。
キットを提供する。
は本説明から明らかとなり得るか、または本発明の実践から学習され得る。
本発明は、毒素Aの19反復単位(RU)および毒素Bの23反復単位(RU)または
そのペプチド断片もしくは変異体を含む、単離ポリペプチドC−TAB.G5(配列番号
2)またはその誘導体、C−TAB.G5.1(配列番号4)の使用を含む、C.ディフ
ィシル毒素AおよびBに対する保護的および/または治療的免疫反応を誘導するための免
疫原性組成物を提供する。
する方法、ならびに哺乳動物におけるCDADの予防および/または治療に有用な組成物
(例えばワクチン)を調製する方法を提供する。以下の説明は、組み換え単離ポリペプチ
ドの構築、発現、および精製、特異的免疫反応を誘導するため、および対象における保護
を評価するための抗原としてのその使用のさらなる詳細および例を提供する。対象は、動
物または人間であってもよい。
G5.1単離ポリペプチドは、いくつかの標準的方法のいずれかを使用して調製され得る
。例えば、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1は、標準的組み換えDNA技術
を使用して生成されてもよく、好適な宿主細胞は、毒素コード核酸断片の一部を含有する
適切な発現ベクターにより形質転換される(例えば、Dove et al.,Infe
ct.Immun.58:480−8(1990)、およびBarroso et al
.,Nucleic Acids Research 18:4004(1990)を参
照されたい)。広範な発現系のいずれも、組み換えポリペプチドを生成するために使用さ
れ得る。C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1は、原核宿主細胞(例えば、大腸
菌または桿菌等の細菌)または真核宿主細胞(例えば、酵母細胞、哺乳動物細胞(例えば
、COS1、NIH3T3、もしくはJEG3細胞)、または昆虫細胞(例えば、ヨトウ
ガ(SF9)細胞))において産生され得る。そのような細胞は、例えば、アメリカ培養
細胞系統保存機関(ATCC)から入手可能である。形質転換およびトランスフェクショ
ンの方法、ならびに発現ベクターの選択は、選択される宿主系に依存する。形質転換およ
びトランスフェクションの方法は、例えば、Ausubel et al.,ISBN:
047132938Xにより説明されている。また、C−TAB.G5またはC−TAB
.G5.1、特に短鎖断片は、化学合成により、例えば、Solid Phase Pe
ptide Synthesis,1984,2nd ed.,Stewart and
Young,Eds.,Pierce Chemical Co.,Rockford
,Ill.において説明されている方法、または標準的in vitro翻訳方法により
生成され得る。
で免疫原性であるその変異体を提供する。変異体は、C−TAB.G5またはC−TAB
.G5.1と同じレベルの免疫原性を有してもよい。変異体は、配列番号2または配列番
号4と比較してアミノ酸置換、欠失、または挿入を有してもよい。C−TAB.G5もし
くはC−TAB.G5.1またはその変異体をコードする遺伝子は、標準的方法を使用し
て作製され得る(以下を参照されたく、また、例えば Ausubel et al.,
上記参照も参照されたい)。
を含むC−TAB.G5のさらなる誘導体を提供する。例として、融合タンパク質、C−
TABNCTB(配列番号18、配列番号17によりコードされる)は、C−TAB.G
5と同様に、CTAの19反復単位(アミノ酸2272〜2710)、CTBの23反復
単位(アミノ酸1850〜2366)、およびCTBのC末端に融合したCTBのさらな
る追加的な10反復(アミノ酸1834〜2057)を含む。さらなる変異体、C−TA
DCTB融合タンパク質(配列番号20、配列番号19によりコードされる)は、C−T
AB.G5(CTAの19反復およびCTBの23反復)、ならびにC−TAB.G5の
C末端に融合したCTBの追加的な24反復単位(アミノ酸1834〜2366)を含む
。また、変異体は、C−TAB.G5の追加的な複製またはその一部を含んでもよい。例
えば、C−TADCTBは、C−TAB.G5に存在するCTBの反復単位の二重部分を
含んでもよい。
細胞に導入すること、およびC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1を発現させる
ことを含む、大腸菌等の細菌系における高レベル発現C−TAB.G5またはC−TAB
.G5.1のための方法を提供する。
アジュバントに共有結合または架橋してもよい(例えば、Cryz et al.,Va
ccine 13:67−71(1994);Liang et al.,J.Immu
nology 141:1495−501(1988)およびCzerkinsky e
t al.,Infect.Immun.57:1072−77(1989)を参照され
たい)。
はC−TAB.G5.1単離ポリペプチドを含むワクチンを提供する。本発明のワクチン
は新規な抗体を含み、筋肉内(IM)、皮内(ID)、皮下(SC)、経口、経鼻、口腔
、または直腸経路で送達され得る。ワクチンは、免疫保護を提供するか、または受動免疫
化のための抗体を誘導し得る。
に対し免疫化するためのワクチンを提供する。本発明のC−TAB.G5またはC−TA
B.G5.1単離ポリペプチドまたはその変異体は、C.ディフィシル関連疾患、例えば
CDADに対する保護範囲を、これまで知られていない、または公開されていないレベル
まで拡大することを目標とする組合せワクチン候補である。C.ディフィシル関連疾患か
らの保護またはその重症度の低下を提供する単一ワクチンのこの概念は、世界規模での公
衆衛生管理、特に流行病の重症度の低減(例えば、養護施設、クルーズ船)における独特
の進歩を示す。
とは、CDADの主な原因であるC.ディフィシルの毒性タンパク質を指す。毒素Aおよ
び毒素Bは、C末端結合ドメインにおける免疫原性を担う複数の反復単位を含む。
内因的に見られるような核酸またはアミノ酸配列を含む全長タンパク質を指す。
クロストリジウム・ディフィシル関係疾患」、「クロストリジウム・ディフィシル−関連
疾患」、「クロストリジウム・ディフィシル毒素媒介疾患」、「クロストリジウム・ディ
フィシル感染」および「CDAD」という用語は、直接的または間接的に、クロストリジ
ウム・ディフィシルの感染により引き起こされる疾患を指す。
えば、抗原は、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、炭水化物、
脂質、糖脂質、リポタンパク質、融合タンパク質、リン脂質、またはそれらの組合せの複
合体であってもよい。抗原は、B細胞受容体(すなわち、B細胞の膜上の抗体)またはT
細胞受容体により認識される、単一の免疫原性エピトープ、または複数の免疫原性エピト
ープを含んでもよい。抗原は、ウイルス様粒子(VLP)または病原菌もしくは微生物全
体、例えば細菌もしくはビリオン等として提供されてもよい。抗原は、不活性または弱毒
化生ウイルスであってもよい。抗原は、細胞全体もしくは膜のみからの、抽出物もしくは
溶解物から得られてもよく、または、抗原は、化学合成または組み換え手段により生成さ
れてもよい。抗原は、単独で、またはアジュバントと共に投与され得る。単一の抗原分子
は、抗原およびアジュバント特性の両方を有してもよい。
特異的または非特異的に増強するために使用される任意の物質を意味する。アジュバント
の例は、油エマルジョン(例えば、完全または不完全フロイントアジュバント)、Mon
tanide不完全Seppicアジュバント、例えばISA、水中油エマルジョンアジ
ュバント、例えばRibiアジュバント系、ムラミールジペプチドを含有するシンタック
スアジュバント製剤、アルミニウム塩アジュバント(ALUM)、ポリカチオン性ポリマ
ー、特にポリカチオン性ペプチド、特にポリアルギニンまたは少なくとも2つのLysL
euLysモチーフを含有するペプチド、特にKLKLLLLLKLK、定義された塩基
コンテクスト内に非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド(CpG)を含有する免
疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)(例えばWO96/02555に記載)ま
たはイノシンおよびシチジンに基づくODN(例えばWO01/93903に記載)また
はデオキシイノシンおよび/もしくはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核酸(W
O01/93905およびWO02/095027に記載)、特にOligo(dIdC
)13(WO01/93903およびWO01/93905に記載)、神経活性化合物、
特にヒト成長ホルモン(WO01/24822に記載)、またはそれらの組み合わせ、ケ
モカイン(例えば、デフェンシン 1もしくは2、RANTES、MIP1−α、MIP
−2、インターロイキン−8、またはサイトカイン(例えば、インターロイキン−1β、
−2、−6、−10もしくは−12;インターフェロン−γ;腫瘍壊死因子−α;または
顆粒球単球コロニー刺激因子)(Nohria and Rubin,1994において
考察されている)、ムラミールジペプチド変異体(例えば、ムラブチド、トレオニル−M
DPまたはムラミールトリペプチド)、MDPの合成変異体、熱ショックタンパク質また
は変異体、森林型熱帯リーシュマニアLeIFの変異体(Skeiky et al.,
1995,J.Exp.Med.181: 1527−1537)、トリプシン切断部位
での変異体を含む細菌ADP−リボシル化外毒素の非毒性変異体(bARE)(Dick
enson and Clements,(1995)Infection and I
mmunity 63 (5):1617-1623)および/または作用性ADP−リ
ボシル化(Douce et al.,1997)または化学的解毒bARE(トキソイ
ド)、QS21、Quill A、N−アセチルムラミール−L−アラニル−D−イソグ
ルタミル−L−アラニン−2−[1,2−ジパルミトイル−s−グリセロ−3−(ヒドロ
キシホスホリルオキシ)]エチルアミド(MTP−PE)ならびに代謝可能な油および乳
化剤を含有する組成物を含む。アジュバントは、抗原の経路と同じ経路により、または抗
原の経路とは異なる経路により、抗原と共に投与されてもよく、または単独で投与されて
もよい。単一のアジュバント分子は、アジュバントおよび抗原特性の両方を有してもよい
。
、または薬物に関しては、状態を治療もしくは診断するのに十分な治療薬剤の量を意味す
る。免疫反応のそのような誘導は、例えば免疫保護、脱感作、免疫抑制、自己免疫疾患の
調整、癌の免疫学的監視の増強、または確立された感染性疾患に対する治療的ワクチン接
種等の治療を提供し得る。治療は、治癒、改善、または予防を含む。
ル結合により繋がったその配列を意味する。
おいて使用され得る任意の分子を意味する。例えば、治療薬剤は、抗原または薬物であっ
てもよい。
よい。対象は、家畜、実験動物(ラット、ハムスター、スナネズミ、もしくはマウス等の
げっ歯類を含むがこれらに限定されない)またはペット動物であってもよい。一実施形態
において、動物は、哺乳動物であってもよい。哺乳動物の例は、人間、霊長類、有袋類、
イヌ、サル、げっ歯類、ネコ、類人猿、クジラ、イルカ、ウシ、ブタ、およびウマを含む
。対象は、疾患の処置を必要としていてもよく、または予防的処置を必要としていてもよ
い。
する能力を有する免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の断片を意味する。抗体
は、免疫学の分野における当業者に周知である。本明細書において使用される場合、「抗
体」という用語は、全長抗体分子だけでなく、抗原結合能力を保持する抗体分子の断片も
意味する。そのような断片はまた、当該技術分野において周知であり、通常in vit
roおよびin vivoの両方で使用される。具体的には、本明細書において使用され
る場合、「抗体」という用語は、全長免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性断片F
(ab’)2、Fab、Fv、およびFd等の抗原結合活性断片も意味する。
パク質および/またはポリペプチドおよび/またはペプチドを含んでもよく、1つ以上の
残基が機能的に類似した残基で保存的に置換されており、さらにこれは、野生型ポリペプ
チドの実質的に同一の機能的特性を示す。保存的置換の例は、1つの非極性(疎水性)残
基の別の残基(例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニン)別の残基と
の置換、1つの極性(親水性)残基の別の残基との置換(例えばアルギニンとリシンとの
間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間)、1つの塩基性残基の
別の残基(例えばリシン、アルギニンもしくはヒスチジン)との置換、または1つの酸性
残基の別の残基(例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸)との置換を含む。変異体
は、本明細書に記載のポリペプチドの機能的特性も示す、本発明のポリペプチドに実質的
に同一の三元構造を有する任意のポリペプチドを含んでもよい。変異体は、野生型ポリペ
プチドの突然変異であってもよい。
試みにおいて使用される任意の種類の干渉を含み得る。治療は、例えば、単独の、または
当該技術分野において一般的に知られている他の治療法と組み合わせた薬学的組成物の投
与を含み得るが、これに限定されない。「治療」は、予防的に、または病理学的事象の開
始後に行われてもよい。
わされると、成分が生物活性を保持するのを可能にし、対象の免疫系と非反応性である任
意の材料を含み得る。薬学的に許容される担体および/または賦形剤は、緩衝剤、安定剤
、希釈剤、保存剤、および可溶化剤を含み得る。一般に、担体または賦形剤の性質は、使
用されている具体的な投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとし
て、水、生理食塩水、平衡塩溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等の薬学的およ
び生理学的に許容される流体を含む注射液を含む。固体組成物(例えば、粉末、ピル、錠
剤、またはカプセル形態)の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードの
マンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生
物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、微量の非毒性補助物質、例え
ば湿潤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラ
ウリン酸ソルビタンを含有してもよい。
ンテクストにおいて、互いに自然に関連して見られない配列を含む核酸およびポリペプチ
ドを示し得る。融合核酸またはポリペプチドは、核酸またはポリペプチドの自然配列全体
を含むとは限らない。融合タンパク質は、通常のペプチド結合により互いに結合した、2
つ以上のセグメントを有する。融合核酸は、通常のホスホジエステル結合により互いに結
合した、2つ以上のセグメントを有する。
単離ポリペプチド
3反復単位を含む、それぞれ配列番号2および配列番号4に記載のC−TAB.G5また
はC−TAB.G5.1単離ポリペプチドを提供する。C−TAB.G5のホモログ、例
えばC−TAB.G5.1は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のア
ミノ酸だけC−TAB.G5と異なってもよい。C−TAB.G5.1ポリペプチドは、
C−TAB.G5と同じ毒素BのC末端ドメインを含有するが、C.ディフィシル630
株から得られる対応するC−TAB.G5ポリペプチドのホモログであるC.ディフィシ
ルVPI−10463株から得られる毒素AのC末端ドメインを含有しない融合タンパク
質であり、155〜156位において2個のアミノ酸だけ異なる。配列番号3に記載され
るC−TAB.G5.1コード配列は、大腸菌宿主細胞内での改善された発現のためにコ
ドン最適化された。本発明のC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプ
チドは、C.ディフィシル毒素Aおよび毒素Bの毒性作用の中和に効果的となり得る。
およびtrdB(配列番号7)遺伝子によりコードされる。構造的には、C.ディフィシ
ル毒素は、ADP−グリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼド
メイン、疎水性領域、および受容体結合領域を含む。C末端ドメインは、極めて反復的な
単位(RU)(組み合わせ反復オリゴペプチド(CROPS)としても知られる)を含有
する。RUは、長鎖または短鎖オリゴペプチドであってもよく、反復するコンセンサスY
YFモチーフを有する20から50個のアミノ酸を含み得る。RUは、クラスタとしてグ
ループ化される。一例として、毒素A、野生型trdA遺伝子(配列番号5)によりコー
ドされた株630(配列番号6)は、39個のRUを有する。39個のRUは、8個のク
ラスタにグループ化される。毒素B、野生型trdB遺伝子(配列番号7)によりコード
された株630(配列番号8)は、5個のクラスタにグループ化される24個のRUを含
有する。以下の表1および2は、trdA遺伝子およびtrdB遺伝子によりコードされ
たC.ディフィシル毒素Aおよび毒素BにおけるRUのそれぞれのアミノ酸位置を示す。
ぞれ、C.ディフィシル毒素AのC末端ドメインからの19RU、およびC.ディフィシ
ル毒素BのC末端ドメインからの23RUを含む。C−TAB.G5またはC−TAB.
G5.1は、配列番号8の毒素Bアミノ酸1850〜2366に融合した配列番号6の毒
素Aアミノ酸2272〜2710を含む。C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1
単離ポリペプチドは、それぞれ、配列番号2および配列番号4に記載のアミノ酸配列を含
む。
は、C.ディフィシル毒素Aまたは毒素Bの変異体からのものであってもよい。C−TA
B単離ポリペプチドにおけるこれらのRUはまた、C.ディフィシル毒素Aまたは毒素B
の自然発生物または変異体の組み合わせであってもよい。
RUおよび短鎖RUを含み、長鎖RUおよび短鎖RUは、クラスタとして配列される。本
発明のC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドは、C.ディフィ
シル毒素Aの3個から5個の短鎖RUに続く1個の長鎖RUの4個のクラスタ、およびC
.ディフィシル毒素Bの3個から5個の短鎖RUに続く1個の長鎖RUの5個のクラスタ
を含む。
、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26個のアミノ酸を
含んでもよい。各短鎖反復単位は、YYF、FYF、YFF、FYI、またはHYF等の
保存されたチロシンモチーフを含んでもよい。短鎖反復単位は、続く反復単位が長鎖反復
単位である場合、チロシンモチーフの前にアスパルテート/ヒスチジン残基をさらに含ん
でもよい。長鎖反復単位は、27、28、29、30、31、32、33、34、または
35個のアミノ酸を含んでもよい。各長鎖反復単位は、FEYF、FKYF、またはYK
YF等のチロシン反復モチーフを含んでもよい。
素Aおよび毒素B部分は、直接互いに融合していてもよい。毒素Aおよび毒素B部分は、
リンカー領域により隔てられていてもよい。リンカー領域は、1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11から15、20から30、40、45、または50個のアミノ酸
を含んでもよい。C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドにおけ
る各毒素反復単位が、その発現および折り畳まれた形状において、潜在的エピトープを最
適に暴露し、その免疫原性を保持するように位置付けられるように、リンカー領域は、毒
素Aおよび毒素B部分の位置付けを改変するために適合されてもよいことが、当業者に認
識される。C−TAB単離ポリペプチドにおけるRUおよびクラスタもまた、リンカーに
より隔てられていてもよい。一実施形態において、リンカーは、ペプチドRSMH(配列
番号2または配列番号4の439〜442)を含む。
5%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、9
5%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性または配列類似性を有しても
よい。当該技術分野において知られているように、2つのポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドの間の「類似性」は、1つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアミノ酸また
はヌクレオチド配列およびその保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸置換を、第2のポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較することにより決定される。また、2つ
のポリペプチドまたは2つのポリヌクレオチド配列の2つの鎖の間の照合の同一性により
決定される、そのような配列の間の配列関連性の程度を意味する「同一性」が、当該技術
分野において知られている。同一性および類似性は共に、容易に計算され得る(Comp
utational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed
.,Oxford University Press,New York,1988;
Biocomputing:Informatics and Genome Proj
ects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New Y
ork,1993;Computer Analysis of Sequence D
ata,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.
,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;Seque
nce Analysis in Molecular Biology,von He
inje,G.,Academic Press,1987;およびSequence
Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,
J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991)。
2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性および類似性を測定するい
くつかの方法が存在するが、「同一性」および「類似性」という用語は、当業者に周知で
ある(Sequence Analysis in Molecular Biolog
y,von Heinje,G.,Academic Press,1987;Sequ
ence Analysis Primer,Gribskov,M.and Deve
reux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1
991;およびCarillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.A
pplied Math.,48:1073(1988)。2つの配列の間の同一性また
は類似性を決定するために一般的に使用される方法は、Guide to Huge C
omputers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Pr
ess,San Diego,1994およびCarillo,H.,and Lipm
an,D.,SIAM J.Applied Math.48:1073(1988)に
おいて開示されるものを含むが、これらに限定されない。
である。例えば、本発明のC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチ
ドは、対応する細菌毒素Aの免疫活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、ま
たは90%を有してもよく、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプ
チドは、対応する細菌毒素Bの免疫活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、
または90%を有してもよい。本発明のC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単
離ポリペプチドは、CDADの症状の治療、予防、または軽減のためのワクチンとして使
用され得る。
れぞれ配列番号2または配列番号4を有するC−TAB.G5またはC−TAB.G5.
1単離ポリペプチドの変異体を含む。変異体は、単離ポリペプチドの活性、機能または形
状に対する影響が僅かである、または影響を有さないアミノ酸挿入、置換および/または
欠失を有してもよい。そのような置換の例は、1つの非極性残基の別の残基との置換、1
つの極性残基の別の残基との置換、1つの塩基性残基の別の残基との置換、または1つの
酸性残基の別の残基との置換を含む。C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離
ポリペプチド変異体は、さらに、天然毒素Aまたは毒素Bの細胞外ドメインのアミノ酸配
列と比較して、ポリペプチドの活性、機能および/または構造に対する影響が僅かである
アミノ酸の挿入、置換および/または欠失を含んでもよい。当業者には、非天然アミノ酸
が使用されてもよいことが認識される。非天然アミノ酸は、例えば、ベータ−アラニン(
ベータ−Ala)、または他のオメガ−アミノ酸、例えば3−アミノプロピオン酸、2,
3−ジアミノプロピオン酸(2,3−diaP)、4−アミノ酪酸等、アルファ−アミン
イソ酪酸(Aib)、サルコシン(Sat)、オルニチン(Orn)、シトルリン(Ci
t)、t−ブチルアラニン(t−BuA)、t−ブチルグリシン(t−BuG)、N−メ
チルイソロイシン(N−MeIle)、フェニルグリシン(Phg)、およびシクロヘキ
シルアラニン(Cha)、ノルロイシン(Nle)、システイン酸(Cya)2−ナフチ
ルアラニン(2−Nal);1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−カルボン
酸(Tic);ベータ−2−チエニルアラニン(Thi);ならびにメチオニンスルホキ
シド(MSO)を含む。
ヌクレオチド配列は、様々な宿主細胞における発現を向上させるようにコドン最適化され
てもよい。コドン最適化は、対象宿主細胞におけるタンパク質発現を向上させるために、
天然配列の1つ以上のコドンを、その宿主細胞の遺伝子、または細胞が由来する宿主の遺
伝子においてより頻繁に使用されるコドンで置き換えることにより、ヌクレオチド配列を
変更することを指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対する特定の偏
りを示す。本発明は、大腸菌における向上した発現のために、C−TAB.G5.1単離
ポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を提供する。
知の技術により調製され得る。例えば、単離ポリペプチドは、遺伝子操作により発現され
得る。例として、組み換えDNAの翻訳である。C−TAB.G5またはC−TAB.G
5.1単離ポリペプチドはまた、合成的に調製され得る。例として、C−TAB.G5ま
たはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドは、Merrifield(J.Am Ch
em.Soc.85:2149−2154)(参照により本明細書に組み入れられる)に
より最初に説明された固相合成技術を使用して合成され得る。他のポリペプチド合成技術
は、例えば、Kentら(1985)のSynthetic Peptides in
Biology and Medicine,eds.Alitalo et al.,
Elsevier Science Publishers,295−358.において
見出すことができる。
純粋な形態で単離する、または得ることができる。実質的に純粋とは、タンパク質および
/またはポリペプチドおよび/またはペプチドが、自然またはin vivoシステムに
おいて共に見出すことができる他の物質を、その使用目的のために現実的および適切な程
度まで実質的に含まないことを意味する。具体的には、C−TAB.G5またはC−TA
B.G5.1単離ポリペプチドは、例えば、抗体生成、配列決定、または薬学的調製物の
生成において有用となるように、十分に純粋であり、宿主細胞の他の生物学的構成物質を
十分に含まない。当該技術分野において周知の技術により、実質的に純粋なポリペプチド
は、本明細書に開示される核酸およびアミノ酸配列に照らして生成され得る。本発明の実
質的に精製された単離ポリペプチドは、薬学的調製物中の薬学的に許容される担体と混合
され得るため、単離ポリペプチドは、調製物のある特定の重量パーセントのみを占めるこ
とができる。それにもかかわらず、単離ポリペプチドは、生体系内で関連し得る物質から
実質的に分離されているという点で、実質的に純粋である。
B.G5.1単離ポリペプチドを提供する。追加的なポリペプチドは、より大きなポリペ
プチドの断片であってもよい。一実施形態において、C−TAB.G5またはC−TAB
.G5.1単離ポリペプチドに融合した、1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の追
加的なポリペプチドがある。いくつかの実施形態において、追加的なポリペプチドは、C
−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドのアミノ末端に対して融合
している。他の実施形態において、追加的なポリペプチドは、C−TAB.G5またはC
−TAB.G5.1単離ポリペプチドのカルボキシル末端に対して融合している。さらな
る実施形態において、追加的なポリペプチドは、C−TAB.G5またはC−TAB.G
5.1単離ポリペプチドに隣接している。さらなる実施形態において、追加的なポリペプ
チドは、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドの毒素A部分と
毒素B部分との間に分散している。
TAB.G5.1単離ポリペプチドの分泌または細胞内局在の誘導を補助する。そのよう
なポリペプチドは、「シグナル配列」と呼ばれる。分泌シグナルは、例えば、共に参照に
より全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,291,212号および米国特許第
5,547,871号において説明されている。分泌シグナル配列は、分泌ペプチドをコ
ードする。分泌ペプチドは、細胞からのC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1の
分泌を誘導するように作用するアミノ酸配列である。分泌ペプチドは、一般に、疎水性ア
ミノ酸のコアを特徴とし、典型的には、新たに合成されたタンパク質のアミノ末端に見ら
れる(但しこれに限らない)。分泌ペプチドは、分泌中に、C−TAB.G5またはC−
TAB.G5.1単離ポリペプチドから切断されてもよい。分泌ペプチドは、分泌経路を
通過する際に成熟タンパク質からのシグナルペプチドの切断を可能とするプロセシング部
位を含有してもよい。プロセシング部位は、シグナルペプチド内にコードされてもよく、
または、例えばin vitro突然変異誘発により、シグナルペプチドに追加されても
よい。分泌シグナル配列は、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1の分泌を可能
とするための複雑な一連の翻訳後プロセシングステップに必要となり得る。シグナル配列
は、開始コドンのすぐ後に続いてもよく、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1
のアミノ末端部でシグナルペプチドをコードする。シグナル配列は、停止コドンに先行し
てもよく、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1のカルボキシ末端部でシグナル
ペプチドをコードする。ほとんどの場合、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ば
れる特定のプロテアーゼにより切断される。分泌シグナル配列の例は、ompA、pel
B、およびST pre−proを含むが、これらに限定されない。
TAB.G5.1単離ポリペプチドの安定化、構造および/または精製を補助する。いく
つかの実施形態において、追加的なポリペプチドは、エピトープを含んでもよい。他の実
施形態において、追加的なポリペプチドは、親和性タグを含んでもよい。例として、エピ
トープおよび/またはC−TAB.G5もしくはC−TAB.G5.1単離ポリペプチド
への親和性タグを含むポリペプチドの融合は、ポリペプチドの精製および/または同定を
補助し得る。例として、ポリペプチドセグメントは、His−タグ、myc−タグ、S−
ペプチドタグ、MBPタグ(マルトース結合タンパク質)、GSTタグ(グルタチオンS
−トランスフェラーゼ)、FLAGタグ、チオレドキシンタグ、GFPタグ(緑色蛍光タ
ンパク質)、BCCP(ビオチンカルボキシル担体タンパク質)、カルモジュリンタグ、
Strepタグ、HSV−エピトープタグ、V5−エピトープタグ、およびCBPタグで
あってもよい。そのようなエピトープおよび親和性タグの使用は、当業者に知られている
。
位を含むC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドを提供し得る。
一例として、ポリペプチドは、ペプチド結合の加水分解により切断され得る。いくつかの
実施形態において、切断は、酵素により行われる。いくつかの実施形態において、切断は
、細胞内で生じる。他の実施形態において、切断は、切断酵素の人為的操作および/また
は人為的導入により生じる。例として、切断酵素は、ペプシン、トリプシン、キモトリプ
シン、トロンビン、および/または第Xa因子を含み得る。切断は、ポリペプチドからの
C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドの容易な単離を可能とす
る。切断は、さらに、毒素B部分からの毒素A部分の分離を可能とし得る。切断はまた、
例えば発現タンパク質を精製するために使用されるエピトープの切断により、ポリペプチ
ドに融合したC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドの他のポリ
ペプチドからの単離を可能とし得る。
合成ペプチドと共有しない追加の構造的変化、例えばアデニル化、カルボキシル化、グリ
コシル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化またはミリスチル化を有してもよい。こ
れらの追加の構造的変形は、さらに、組み換え発現系の適切な選択により、選択または優
先されてもよい。一方、融合ポリペプチドは、その配列が、有機合成の原理および慣習に
より延長されてもよい。
フィシル毒素Bから得られるポリペプチド部分を含む、C−TAB.G5またはC−TA
B.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸を提供する。核酸は、デオキシリボヌク
レオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのポリマーの一本鎖もしくは二本鎖形態を含
んでもよい。本発明は、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチド
をコードするリボ核酸を提供する。本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、C−T
AB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸およびその補
体にハイブリダイズする核酸を提供する。ストリンジェントな条件とは、プローブとフィ
ルタ結合核酸との間の相同性の程度を指し、ストリンジェンシーが高い程、プローブとフ
ィルタ結合核酸との間のパーセント相同性が高い。ストリンジェントな洗浄のための温度
は、核酸のTmに基づいて決定され得る(G/C含量に基づく)。ストリンジェントな条
件は、さらに、標準クエン酸ナトリウム(SSC)等の緩衝液中の塩の濃度に影響され得
る。本発明は、配列番号1との約85%、86%、87%、88%、89%、90%、9
1%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列
類似性または配列同一性を有する核酸を提供する。
領域、例えば約50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、また
は1アミノ酸残基未満のリンカーを含んでもよい。リンカーは、毒素Aから得られたポリ
ペプチド部分またはその一部、および毒素Bから得られたポリペプチド部分に、またはそ
れらの間に共有結合し得る。
−TAB.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸を提供する。遺伝子コードの縮重
は、毒素Aタンパク質、毒素Bタンパク質および/または対象単離ポリペプチドのヌクレ
オチド配列の多様性を可能とするが、依然として天然DNA配列によりコードされるポリ
ペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成する。「コドン最適化」(参
照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第5,547,871号に記載され
ている)として知られるこの手順は、そのような改変されたDNA配列を設計する手段を
提供する。コドン最適化遺伝子の設計は、生物におけるコドン使用頻度、最近接頻度、R
NA安定性、2次構造形成の可能性、合成経路、およびその遺伝子の意図される将来のD
NA操作を含む、様々な因子を考慮すべきである。特に、酵母発現系が使用される場合は
酵母により、または昆虫細胞発現系が使用される場合は昆虫細胞により最も容易に認識さ
れるコドンで所与の単離ポリペプチドをコードするコドンを改変するために、利用可能な
方法が使用され得る。また、遺伝子コードの縮重は、同じアミノ酸配列がコードされ、多
くの異なる様式で翻訳されることを可能にする。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギ
ニンは、それぞれ6個の異なるコドンによりコードされるが、バリン、プロリン、トレオ
ニン、アラニンおよびグリシンは、それぞれ4個の異なるコドンによりコードされる。し
かしながら、そのような同義コドンの使用頻度は、真核生物および原核生物の間のゲノム
間で変動する。例えば、哺乳動物の間での同義コドン選択パターンは非常に類似している
が、酵母(例えばS.セレビシアエ)、細菌(例えば大腸菌)および昆虫(例えばキイロ
ショウジョウバエ)等の進化的に遠い生物は、明確に異なるゲノムコドン使用頻度パター
ンを示す(Grantham,R.,et al.,Nucl.Acid Res.,8
,49−62(1980);Grantham,R.,et al.,Nucl.Aci
d Res.,9,43−74(1981);Maroyama,T.,et al.,
Nucl. Acid Res.,14,151−197(1986);Aota,S.
,et al.,Nucl.Acid Res.,16,315−402(1988);
Wada,K.,et al.,Nucl.Acid Res.,19 Supp.,1
981−1985(1991);Kurland,C.G.,FEBS Lett.,2
85,165−169(1991))。コドン選択パターンのこれらの差は、ペプチド延
長速度の調整により、個々の遺伝子の全体的発現レベルに寄与するようである(Kurl
and,C.G.,FEBS Lett.,285,165−169(1991);Pe
dersen,S.,EMBO J.,3,2895−2898 (1984);Sor
ensen,M.A.,J.Mol.Biol.,207,365−377(1989)
;Randall,L.L.,et al.,Eur. J.Biochem.,107
,375−379(1980);Curran,J.F.,and Yarus,M.,
J.Mol.Biol.,209,65−77(1989);Varenne,S.,e
t al.,J.Mol.Biol.,180,549−576(1984)、Vare
nne,S.,et al.,J.Mol,Biol.,180,549−576(19
84);Garel,J.−P.,J.Theor.Biol.,43,211−225
(1974);Ikemura,T.,J.Mol.Biol.,146,1−21(1
981);Ikemura,T.,J.Mol.Biol.,151,389−409(
1981))。
ことが意図される細胞/生物の抽出(または可能な限り密接に関連した)ゲノムから得ら
れる核遺伝子のコドン使用率を反映すべきである。
えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータプログラム
において体系化される。2つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコ
ンピュータプログラム方法は、GCGプログラムパッケージ(Devereux, et
al.,Nucl.Acid Res.12(1):387(1984))、BLAS
TP、BLASTN、FASTA(Atschul,et al.,J.Mol.Bio
l.215:403(1990))を含むが、これらに限定されない。上述の類似性また
は同一性の程度は、2つの配列間の同一性の程度として決定され、しばしば第2の配列か
らの第1の配列の誘導を示す。2つの核酸間の同一性の程度は、当該技術分野において知
られたコンピュータプログラム、例えばGCGプログラムパッケージ内に提供されるGA
Pを使用して決定され得る(Needleman and Wunsch J.Mol.
Biol.48:443−453 (1970))。本発明のために2つの核酸間の同一
性の程度を決定する目的で、GAPは、以下の設定で使用される:GAP生成ペナルティ
5.0およびGAP伸長ペナルティ0.3。
ードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターは、異なる生成環境の間の移送のため
、または宿主細胞における発現のための制限およびライゲーションにより、所望の配列が
挿入されてもよいいくつかの核酸のいずれであってもよい。ベクターは、典型的にはDN
Aで構成されるが、RNAベクターもまた利用可能である。ベクターは、プラスミドおよ
びファージミドを含むが、これらに限定されない。クローニングベクターは、宿主細胞内
で複製することができ、さらに1つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を特徴とするベク
ターであり、その部位では、ベクターは、測定可能な様式で切断されてもよく、また、新
たな組み換えベクターが宿主細胞内で複製する能力を保持するように所望のDNA配列が
ライゲーションされてもよい。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドが宿
主細菌内でコピー数の増加を示すと共に何回も、または宿主が有糸分裂により再生する前
に宿主当たり1回だけ生じ得る。ファージの場合、複製は、溶解段階の間能動的に、また
は溶原段階の間受動的に生じ得る。
酸の転写を開始するための部位を含有するコード領域の上流に位置する、非翻訳核酸を含
んでもよい。また、プロモーター領域は、遺伝子発現の調節因子として機能する他の要素
を含んでもよい。本発明のさらなる実施形態において、発現ベクターは、発現ベクターが
組み込まれた細胞の選択を補助するための追加的領域を含有する。プロモーター配列は、
多くの場合、転写開始部位によりその3’末端で境界され(包含的)、上流側(5’方向
)に伸長して、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するために必要
な最少数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内では、転写開始部位、およびRN
Aポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインが見られる。真核プロモーターは、
必ずではないが、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含有することが多い
。
よび選択における使用に好適な、1つ以上のマーカー配列を含有してもよい。マーカーは
、例えば、抗生物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性を増加または低下させ
るタンパク質をコードする遺伝子、当該技術分野において知られている標準的アッセイに
よりその活性が検出可能な酵素(例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファ
ターゼ)をコードする遺伝子、および、形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿
主、コロニーまたはプラークの表現型に明らかに影響する遺伝子を含む。好ましいベクタ
ーは、作用可能に結合したDNAセグメント内に存在する構造遺伝子産物の自己複製およ
び発現が可能なベクターである。
うに、所望の核酸が制限およびライゲーションにより挿入され得るベクターである。発現
は、内在性遺伝子、導入遺伝子または細胞内のコード領域の転写および/または翻訳を指
す。
御下に置くように共有結合している場合に、作用可能に結合している。コード配列が機能
タンパク質に翻訳されることが望ましい場合は、5’調節配列におけるプロモーターの誘
導がコード配列の転写をもたらす場合、および2つのDNA配列の間の結合の性質が、(
1)フレームシフト突然変異の導入をもたらさない、(2)コード配列の転写を誘導する
プロモーター領域の能力に干渉しない、または(3)タンパク質に翻訳される対応するR
NA転写産物の能力に干渉しない場合、2つのDNA配列は作用可能に結合していると言
われる。したがって、プロモーター領域が、得られる転写産物が所望のタンパク質または
ポリペプチドに翻訳され得るようにそのDNA配列の転写をもたらすことができる場合、
プロモーター領域はコード領域に作用可能に結合している。
内にコード核酸を発現させることにより生成され得る。核酸は、宿主細胞に形質転換また
はトランスフェクトされ得る。したがって、本発明のいくつかの態様は、C−TAB.G
5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸の形質転換および/ま
たはトランスフェクションを含む。形質転換は、外来または異種核酸の原核細胞の内部へ
の導入である。トランスフェクションは、外来または異種核酸の真核細胞の内部への導入
である。形質転換またはトランスフェクト核酸は、細胞のゲノムを構成する染色体DNA
内に統合(共有結合)されてもよく、またはされていなくてもよい。例えば、原核細胞に
おいては、形質転換核酸は、プラスミドまたはウイルスベクター等のエピソーム要素上で
維持され得る。真核細胞に関しては、安定にトランスフェクトされた細胞は、トランスフ
ェクト核酸が染色体複製を通して娘細胞により遺伝されるように染色体内に統合された細
胞である。この安定性は、トランスフェクトされた核酸を含有する娘細胞の集団を含む細
胞株またはクローンを確立する真核細胞の能力により示される。
パク質を発現させてもよく、その増殖手順は既知である(例えば、Kruse et a
l. (1973) Tissue Culture, Academic Press
を参照されたい)。
離ポリペプチドの発現のための宿主細胞およびベクターも提供される。原核細胞または真
核細胞の任意のベクターまたは宿主細胞が使用され得る。そのような目的のための多くの
ベクターおよび宿主細胞が、当該技術分野において知られている。所望の用途のための適
切な組を選択することは、十分に当該技術の範囲内である。
ならびに当該技術分野において知られている他の既知の毒素Aおよび毒素B発現原核生物
から得られる、様々なゲノムまたはcDNAライブラリからクローニングされ得る。プロ
ーブベースの方法を使用してそのようなDNA配列を単離するための技術は、従来の技術
であり、当業者に周知である。そのようなDNA配列を単離するためのプローブは、公開
されたDNAまたはタンパク質配列に基づいてもよい。代替として、Mullisら(米
国特許第4,683,195号)およびMullis(米国特許第4,683,202号
)(参照により本明細書に組み込まれる)により開示されているポリメラーゼ連鎖反応(
PCR)法が使用されてもよい。ライブラリの選択およびそのようなDNA配列の単離の
ためのプローブの選択は、当該技術のレベルの範囲内である。
、シュードモナス属、例えば緑膿菌、大腸菌、ブドウ球菌属、例えば黄色ブドウ球菌およ
びS.エピデルミス、セラチア・マルセッセンス、桿菌属、例えば枯草菌および巨大菌、
クロストリジウム・スポロゲネス、エンテロコッカス・フェカリス、マイクロコッカス属
、例えばM.ルテウスおよびM.ロゼウス、ならびにプロテウス・ブルガリスを含む。高
等真核細胞において本発明のポリペプチドを発現させるための好適な宿主細胞は、酵母、
例えばサッカロマイセス(例えばS.セレビシアエ);293(ヒト胎児腎臓)(ATC
C CRL−1573);293F(Invitrogen、Carlsbad CA)
;293Tおよび変異体293T/17(293tsA1609neoおよび変異体AT
CC CRL−11268)(SV40 T抗原により形質転換されたヒト胎児腎臓);
COS−7(SV40で形質転換されたサル腎臓CVI系)(ATCC CRL1651
);BHK(ベビーハムスター腎臓細胞)(ATCC CRL10);CHO(チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞);マウスセルトリ細胞;CVI(サル腎臓細胞)(ATCC
CCL70);VERO76(アフリカミドリザル腎臓細胞)(ATCC CRL158
7);HeLa(ヒト子宮癌細胞)(ATCC CCL2);MDCK(イヌ腎臓細胞)
(ATCC CCL34);BRL3A(バッファローラット肝臓細胞)(ATCC C
RL1442);W138(ヒト肺細胞)(ATCC CCL75);HepG2(ヒト
肝細胞)(HB8065);ならびにMMT 060652(マウス乳腺腫瘍)(ATC
C CCL51)を含む。
ポリペプチドを含む単離ポリペプチドならびに追加的なポリペプチドをコードする核酸を
提供する。融合ポリペプチドの産生のための真核発現系を構築するために有用なベクター
は、適切な転写活性化配列、例えばプロモーターおよび/またはオペレーターに作用可能
に結合した単離ポリペプチドをコードする核酸を含む。他の典型的な特徴は、適切なリボ
ソーム結合部位、停止コドン、エンハンサー、ターミネーター、またはレプリコン要素を
含み得る。これらの追加的な特徴は、従来のスプライス技術、例えば制限エンドヌクレア
ーゼ分解およびライゲーション等により、適切な部位(複数を含む)でベクターに挿入さ
れ得る。
G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸に融合されてもよい。融合核酸は、C−TA
B.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドのコドンリーディングフレームを
シフトさせずに、精製および/または免疫原性および/または安定性を補助し得るポリペ
プチドをコードしてもよい。融合核酸は、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1
単離ポリペプチドから切断されてもよい、またはされなくてもよい分泌配列をコードして
もよい。融合核酸は、発現ポリペプチドを大きく延長しなくてもよい。融合核酸は、C−
TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドに対して、60個未満の余分
なアミノ酸をコードしてもよい。いくつかの実施形態において、融合核酸は、C−TAB
.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸に続く。他の実施
形態において、融合核酸は、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプ
チドをコードする核酸に先行する。他の実施形態において、融合核酸は、C−TAB.G
5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸に隣接している。
.1単離ポリペプチドの精製を補助するポリペプチドをコードしてもよい。いくつかの実
施形態において、融合核酸は、エピトープおよび/または親和性タグをコードする。精製
を補助するポリペプチドの例は、His−タグ、myc−タグ、S−ペプチドタグ、MB
Pタグ、GSTタグ、FLAGタグ、チオレドキシンタグ、GFPタグ、BCCP、カル
モジュリンタグ、Strepタグ、HSV−エピトープタグ、V5−エピトープタグ、お
よびCBPタグを含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、融合核酸は、
切断へと誘導される、または切断されやすい部位を有するC−TAB.G5またはC−T
AB.G5.1単離ポリペプチドをコードしてもよい。一実施形態において、融合核酸は
、酵素的切断の部位を含むポリペプチドをコードしてもよい。さらなる実施形態において
、酵素的切断は、さらに他のポリペプチドからのC−TAB.G5またはC−TAB.G
5.1単離ポリペプチド、および他の融合ポリペプチドセグメントの単離を補助し得る。
例として、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドをコードする
核酸とエピトープとの間に配置される酵素的切断部位をコードする中間核酸が、発現され
たC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドおよびエピトープの後
の分離を可能としてもよい。そのような部位はまた、毒素A部分と毒素B部分との間に存
在してもよい。
現および提供を補助するように設計される発現系を提供する。発現系は、C−TAB.G
5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトラ
ンスフェクトされた宿主細胞を含んでもよい。宿主細胞は、原核生物であってもよい。原
核生物は、大腸菌であってもよい。宿主細胞は、真核細胞であってもよい。
コードする核酸での形質転換またはトランスフェクトに成功した宿主細胞の選択を補助す
る薬剤を含んでもよい。例えば、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリ
ペプチドをコードする核酸は、さらに、抗生物質に抵抗する宿主細胞を補助する遺伝子、
例えばカナマイシンまたはゲンタマイシンまたはアンピシリンまたはペニシリンに抵抗す
る遺伝子を発現してもよい。そのような抵抗性遺伝子は、当業者に知られているように、
C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸を適切
に組み込んだ宿主細胞の選択を可能とする。
B.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドで対象を免疫化することにより生
成される抗体を含むが、これに限定されない。C−TAB.G5もしくはC−TAB.G
5.1単離ポリペプチドでの免疫化により生成される抗体は、毒素Aもしくは毒素Bに特
異的に結合することができ、または、それらはC−TAB.G5もしくはC−TAB.G
5.1単離ポリペプチドと交差反応することができる。本発明のC−TAB.G5または
C−TAB.G5.1単離ポリペプチドにより生成される抗体は、当該技術分野において
周知の方法を使用して特性決定され得る。
とにより生成される抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片(例え
ば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、キメラ抗体、二重特異性抗体
、重鎖のみの抗体、ヘテロ結合抗体、単鎖(ScFv)、単一ドメイン抗体、その変異体
、抗体部分を含む単離ポリペプチド、ヒト化抗体、ならびに、抗体のグリコシル化変異体
、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合的に修飾された抗体を含む、必要な特性の
抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾構造を包含し得る。好ましい抗
体は、マウス、ラット、ヒト、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、ネ
コ、霊長類、または任意の他の源から得られる(キメラ、断片および/またはヒト化抗体
を含む)。
ドでの免疫化により生成された抗体は、次いで、当該技術分野において知られている方法
によりヒト化される。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンから得られる最小配列を含有
する免疫グロブリン分子である。さらに他の実施形態において、特定のヒト免疫グロブリ
ンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用することにより、完全ヒト
抗体が得られる。他の実施形態において、抗体は、キメラである。キメラ抗体は、2つの
異なる抗体からの特性を組み合わせた抗体である。キメラ抗体を調製する方法は、当該技
術分野において知られている。
は増殖のためにベクターにクローニングされる。別の実施形態において、抗体は、当該技
術分野において知られている方法を使用して、組み換えにより作製および発現される。例
として、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドは、これらの技
術により組み換え抗体を単離するために、抗原として使用され得る。抗体は、宿主細胞内
で組み換えにより抗体を発現させるために、遺伝子配列を使用して組み換えにより作製さ
れ得る。抗体の変異体および組み換え抗体を作製するための方法は、当該技術分野におい
て知られている。
、または生物学的試料もしくは検体中の天然毒素Aもしくは毒素BもしくはC.ディフィ
シルの検出における使用のために、当該技術分野における従来の方法により担体に結合さ
れる。
組成物および製剤
組成物を提供する。組成物は、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペ
プチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であってもよい。本発明の方法
において使用される組成物は、一般に、限定ではなく例として、効果的な量の本発明のC
−TAB.G5もしくはC−TAB.G5.1単離ポリペプチド(例えば、免疫反応を誘
導するのに十分な量)、またはC−TAB.G5もしくはC−TAB.G5.1単離ポリ
ペプチドに対する抗体(例えば、感染症を緩和する、感染症の症状を軽減する、および/
もしくは感染症を予防するのに十分な量の中和抗体の量)を含む。薬学的組成物は、さら
に、当該技術分野において知られている薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤
を含んでもよい(一般に、Remington,(2005)The Science
and Practice of Pharmacy,Lippincott,Will
iams and Wilkinsを参照されたい)。
に罹患した人間および/または動物を免疫化または治療するための方法に使用され得る。
したがって、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドは、薬学的
組成物中で使用され得る。本発明の薬学的組成物は、さらに、薬学的に許容される担体お
よび/または賦形剤を包含し得る。本発明において有用な薬学的に許容される担体および
/または賦形剤は、従来のものであり、緩衝剤、安定剤、希釈剤、保存剤、および可溶化
剤を含み得る。E.W.MartinによるRemington’s Pharmace
utical Sciences,Mack Publishing Co.,East
on,PA,15th Edition (1975)は、本明細書において開示される
ポリペプチドの薬学的送達に好適な組成物および製剤を説明している。一般に、担体また
は賦形剤の性質は、使用されている具体的な投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は
、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩溶液、デキストロース水溶液、グリセ
ロール等の薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射液を含む。固体組成物(例
えば、粉末、ピル、錠剤、またはカプセル形態)の場合、従来の非毒性固体担体は、例え
ば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネ
シウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、微量の
非毒性補助物質、例えば湿潤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤等、例えば酢酸ナ
トリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。
んでもよい。アジュバントは、投与方法に基づいて選択することができ、鉱物油系アジュ
バント、例えばフロイント完全および不完全アジュバント、Montanide不完全S
eppicアジュバント、例えばISA、水中油エマルジョンアジュバント、例えばRi
biアジュバント系、ムラミールジペプチドを含有するシンタックスアジュバント製剤、
水酸化アルミニウムまたはアルミニウム塩アジュバント(alum)、ポリカチオン性ポ
リマー、特にポリカチオン性ペプチド、特にポリアルギニンまたは少なくとも2つのLy
sLeuLysモチーフを含有するペプチド、特にKLKLLLLLKLK、定義された
塩基コンテクスト内に非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド(CpG)を含有す
る免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド(ODN)(例えば、WO96/02555に記
載)またはイノシンおよびシチジンに基づくODN(例えばWO01/93903に記載
)またはデオキシイノシンおよび/もしくはデオキシウリジン残基を含有するデオキシ核
酸(WO01/93905およびWO02/095027に記載)、特にOligo(d
IdC)13(WO01/93903およびWO01/93905に記載)、神経活性化
合物、特にヒト成長ホルモン(WO 01/24822に記載)、またはそれらの組み合
わせを含み得る。そのような組み合わせは、例えば、WO01/93905、WO02/
32451、WO01/54720、WO01/93903、WO02/13857、W
O02/095027およびWO03/047602に記載のものに従う。好ましくは、
アジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバントである。
し非毒性である。担体、賦形剤または安定剤は、さらに緩衝剤を含んでもよい。賦形剤の
例は、炭水化物(例えば単糖類および二糖類)、糖(例えばスクロース、マンニトール、
およびソルビトール)、ホスフェート、シトレート、酸化防止剤(例えば、アスコルビン
酸およびメチオニン)、保存剤(例えば、フェノール、ブタノール、ベンザノール;アル
キルパラベン、カテコール、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化
ヘキサメトニウム、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3−ペンタノール、塩化ベン
ザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、およびm−クレゾール)、低分子量ポリペプチド、
タンパク質(例えば、血清アルブミンまたは免疫グロブリン)、親水性ポリマーアミノ酸
、キレート剤(例えばEDTA)、塩形成対イオン、金属錯体(例えばZn−タンパク質
錯体)、ならびに非イオン性界面活性剤(例えばTWEEN(商標)およびポリエチレン
グリコール)を含むが、これらに限定されない。
用する追加的薬剤を含んでもよい。例として、サブユニットワクチンとして投与されてい
る本発明のC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドの免疫原性を
向上させるために、薬学的組成物は、さらにアジュバントを含んでもよい。
たはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性
組成物は、さらに、哺乳動物における注射に好適な製剤中の薬学的に許容される担体もし
くは他の担体および/または賦形剤を含んでもよい。免疫原性組成物は、免疫原性組成物
が注射または別様に導入された場合に哺乳動物宿主において免疫反応を惹起する材料の任
意の組成物である。免疫反応は、液性、細胞性、またはその両方であってもよい。ブース
ター効果は、同じ免疫原性組成物に対する哺乳動物宿主の後の暴露後の、免疫原性組成物
に対する増加した免疫反応を指す。液性反応は、免疫原性組成物に対する暴露後の哺乳動
物宿主による抗体の産生をもたらす。
を惹起する。免疫反応は、細胞依存的反応または抗体依存的反応またはその両方であって
もよく、さらに、反応は、哺乳動物宿主における免疫記憶またはブースター効果を提供し
得る。これらの免疫原性組成物は、ワクチンとして有用であり、C.ディフィシルの株に
よる感染に対する、哺乳動物対象または宿主による保護反応を提供し得る。
コードする核酸を構築して、微生物宿主においてC−TAB.G5またはC−TAB.G
5.1単離ポリペプチド構成成分を発現させ、宿主の培養物からC−TAB.G5または
C−TAB.G5.1単離ポリペプチドを回収し、C−TAB.G5またはC−TAB.
G5.1単離ポリペプチドを第2のタンパク質構成成分に複合化し、複合タンパク質およ
び多糖類構成成分を回収することにより、免疫原性組成物を生成するための方法を含む。
C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸は、一
定および安定な選択的圧力により宿主の成長を通して維持され得る。発現ベクターの維持
は、選択的遺伝子型をコードする遺伝子配列の発現ベクターへの組込みによりもたらすこ
とができ、微生物宿主細胞におけるその発現は、選択的発現型をもたらす。また、選択的
遺伝子型配列は、条件致死突然変異を補完する遺伝子を含んでもよい。他の薬物耐性遺伝
子または致死突然変異を補完する遺伝子等の他の遺伝子配列が、発現ベクター内に組み込
まれてもよい。微生物宿主は、グラム陽性細菌、大腸菌等のグラム陰性細菌、酵母、糸状
菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または植物細胞を含み得る。
g/リットルを超えるレベル、約500mg/リットルを超えるレベル、または約1g/
リットルを超えるレベルの、宿主におけるC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1
単離ポリペプチドの発現のレベルを提供する。本発明はまた、タンパク質が、硫酸アンモ
ニウム沈殿に続くイオン交換クロマトグラフィー等の、タンパク質の単離および回収の技
術分野における当業者に知られた任意の数の方法により回収され得ることを提供する。
より、タンパク質構成成分が第2のタンパク質構成成分に複合化されることを提供する免
疫原性組成物を調製するための方法を含む。
TAB.G5.1単離ポリペプチドを含む製剤を提供する。一実施形態において、製剤は
、本発明のC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチド、アジュバン
ト、および薬学的に許容される担体を含んでもよい。別の実施形態において、製剤は、本
発明のC−TAB.G5もしくはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドを含む、または
本質的に1つ以上の本発明のC−TAB.G5もしくはC−TAB.G5.1単離ポリペ
プチドからなる。製剤は、本発明のC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポ
リペプチドおよびアジュバントを含んでもよい。製剤は、さらに、追加的な抗体または薬
物を含んでもよい。さらに、製剤は、1つ以上の薬物を含んでもよく、また単離ポリペプ
チドおよび/またはアジュバントに加えて1つ以上の薬物を含んでもよい。
たは乾燥形態であってもよい。乾燥製剤は、容易に保存および輸送され得る。乾燥製剤は
、ワクチンの製造場所からワクチン接種が行われる地点までに必要なコールドチェーンを
打破する。代替として、製剤の乾燥活性成分自体が、抗体提示細胞により取り込まれ処理
される固体微粒子形態を提供することによる改善であってもよい。これらの可能なメカニ
ズムは、本発明またはその均等物の範囲を制限するように議論されず、本発明の作用に対
する洞察を提供し、免疫化およびワクチン接種における本製剤の使用をガイドするように
議論される。
たは顆粒粉末、凍結乾燥粉末、均一膜、ペレット、および錠剤等の様々な形態で提供され
得る。製剤には、空気乾燥、高温による乾燥、凍結乾燥、フリーズドライもしくは噴霧乾
燥、固体基板上へのコーティングもしくは噴霧後の乾燥、固体基板上への振り掛け、急速
冷凍に次ぐ真空下での低速乾燥、またはそれらの組み合わせが行われてもよい。異なる分
子が製剤の活性成分である場合、それらは、溶液中で混合されてから乾燥されてもよく、
または乾燥形態のみで混合されてもよい。
単離ポリペプチドを含む製剤は、同じもしくは離れた部位において、または同時もしくは
頻繁な繰り返しの適用により1つまたはそれ以上のアジュバントが適用されてもよい。製
剤は、製剤の投与が複数の抗原に対する免疫反応を誘導するように、他の抗原を含んでも
よい。そのような場合、他の抗原は、異なる抗原に特異的な免疫反応を誘導するように、
異なる化学構造を有してもよい。投与前に、少なくとも1つの抗原および/またはアジュ
バントが乾燥形態で維持されてもよい。後の貯蔵部からの液体の放出または製剤の乾燥成
分を含有する貯蔵部への液体の進入は、少なくとも部分的にその成分を溶解する。
み込まれてもよい。固体形態(例えば、ナノ粒子またはマイクロ粒子)は、活性成分の分
散または可溶化を補助する、抗原提示細胞によりオプソニン化され得る基質への、アジュ
バント、C−TAB.G5もしくはC−TAB.G5.1単離ポリペプチド、またはその
両方の結合点を提供する、あるいはそれらの組み合わせを提供することができる。シート
、ロッド、またはビーズとして形成された多孔質固体からの製剤の持続放出は、デポー製
剤として作用する。
TAB.G5.1単離ポリペプチド、アジュバント、または薬物)は、製剤の投与前に乾
燥形態で提供されてもよい。この製剤はまた、従来の腸内、粘膜、または非経口免疫化技
術と併せて使用されてもよい。
剤およびワクチンの適切な規制当局(例えば、食品医薬品局、EMEA)に認可される無
菌条件下で製造され得る。随意に、乾燥剤、賦形剤、安定剤、保湿剤、保存剤、またはそ
れらの組み合わせ等構成成分が、免疫学的に不活性であるとしても、製剤中に含まれても
よい。しかしながら、それらは、他の所望の特性または特徴を有し得る。
される担体またはビヒクル、および随意の添加剤(例えば、希釈剤、結合剤、賦形剤、安
定剤、乾燥剤、保存剤、着色剤)の任意の組み合わせと組み合わされてもよい。固体担体
の使用、および乾燥構成成分または免疫原性もしくはアジュバント活性の安定剤の可溶化
を補助する賦形剤の添加が、好ましい実施形態である。一般に、Ullmann’s E
ncyclopedia of Industrial Chemistry,6th
Ed.(electronic edition,2003);Remington’s
Pharmaceutical Sciences,22nd(Gennaro,20
05,Mack Publishing);Pharmaceutical Dosag
e Forms,2nd Ed.(様々な編集者、1989−1998,Marcel
Dekker);およびPharmaceutical Dosage Forms a
nd Drug Delivery Systems(Ansel et al.,20
05,Williams&Wilkins)を参照されたい。
EA)により規制されている。無菌液体製剤は、製剤の意図される構成成分を十分な量の
適切な溶媒に溶解し、続いて汚染微生物を除去するための濾過により滅菌することにより
調製され得る。一般に、製剤の様々な滅菌された構成成分を、基本的分散媒を含有する無
菌ビヒクルに組み込むことにより、分散液が調製される。無菌であることが要求される固
体形態の生成には、真空乾燥またはフリーズドライが使用され得る。
の活性成分または構成成分から作製され得る。
態をカプセル化する、または区画もしくはチャンバ内で液体から隔離することにより生成
されてもよい。各用量のサイズおよび対象への投薬の間隔を使用して、錠剤、カプセル、
区画またはチャンバの好適なサイズおよび形状を決定することができる。
、担体または好適な量のビヒクルと共に、効果的な量の活性成分(例えば、薬物、抗原お
よびアジュバント)を含有する。
ポリペプチドの量、および投薬スケジュールは、対象(例えば、動物または人間)に対す
る有効な投与のために、適切に調節され得る。この調節はまた、対象の具体的な疾患また
は状態、および治療または予防が意図されるかどうかに依存し得る。対象への製剤の投与
を単純化するために、各単位用量は、単一ラウンドの免疫化のための所定量の活性成分を
含有する。
する。変質の場合、タンパク質の配置または三次元構造が乱され、タンパク質は、その通
常の球状構造から広がる。自然の配置へのリフォールディングではなく、疎水性相互作用
が分子同士の凝塊化(すなわち凝集)、または異常な配置へのリフォールディングを引き
起こし得る。これらの結果のいずれも、免疫原性またはアジュバント活性の減退または喪
失を伴い得る。そのような問題を低減または防止するために、安定剤が添加されてもよい
。
乾燥安定剤)で前処理され、次いで氷結晶形成を最小限化する冷却速度および最終温度に
供されてもよい。抗凍結薬剤の適切な選択および事前に選択された乾燥パラメータの使用
により、ほぼいずれの製剤も、好適な所望の最終用途のために凍結調製され得る。
の機能により説明されることを理解されたい。したがって、特定の化学物質は、賦形剤、
安定剤、乾燥剤、および/または保存剤のある組み合わせとして作用し得る。そのような
化学物質は、直接的に免疫反応を誘導しないため、免疫学的に不活性であるが、抗原また
はアジュバントの免疫活性を向上させることにより、例えば、抗原もしくはアジュバント
の改質、または乾燥および溶解サイクル中の変質を低減することにより、反応を増加させ
る。
9号を参照されたい)。スクロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、デキ
ストラン、およびグリセリン等の好適な保存剤もまた、最終製剤を安定化するために添加
され得る(Howell and Miller, 1983)。非イオン性界面活性剤
、D−グルコース、D−ガラクトース、D−キシロース、D−グルクロン酸、D−グルク
ロン酸の塩、トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、およびそれらの
混合物から選択される安定剤が、製剤に添加されてもよい。随意に血清アルブミンを含む
アルカリ金属塩または塩化マグネシウムの添加は、C−TAB.G5またはC−TAB.
G5.1単離ポリペプチドを安定化することができ、フリーズドライによりさらに安定性
が向上され得る。C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドはまた
、デキストラン、コンドロイチン硫酸、デンプン、グリコーゲン、インスリン、デキスト
リン、およびアルギニン酸塩からなる群から選択されるサッカリドと接触させることによ
り安定化され得る。添加され得る他の糖は、単糖類、二糖類、糖アルコール、およびそれ
らの混合物(例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、スクロー
ス、マルトース、ラクトース、マンニトール、キシリトール)を含む。ポリオールは、ポ
リペプチドを安定化することができ、水混和性または水溶性である。好適なポリオールは
、マンニトール、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチ
ルグリコール、ビニルピロリドン、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンノー
ス、マルトース、スクロース、およびそれらのポリマーを含む、ポリヒドロキシアルコー
ル、単糖類および二糖類であってもよい。血清アルブミン、アミノ酸、ヘパリン、脂肪酸
およびリン脂質、界面活性剤、金属、ポリオール、還元剤、金属キレート剤、ポリビニル
ピロリドン、加水分解ゼラチン、ならびに硫酸アンモニウムを含む様々な賦形剤もまた、
ポリペプチドを安定化し得る。
賦形剤または安定剤の好適な選択により、スクロース、トレハロース、ポリ(乳酸)(P
LA)およびポリ(ラクチド−co−グリコリド)(PLGA)ミクロスフェア内で安定
化され得る(Sanchez et al., 1999)。スクロース、またはトレハ
ロースは、非還元性サッカリドであり、したがってタンパク質等のアミノ基を有する物質
とアミノカルボニル反応を引き起こさないため、添加剤として有利に使用され得る。スク
ロースまたはトレハロースは、サッカリド等の他の安定剤と組み合わされてもよい。
、例えば麻酔薬、鎮痛剤、抗炎症剤、ステロイド、抗生物質、抗関節炎薬、食欲減退薬、
抗ヒスタミン剤、および抗新生物薬剤等の治療薬剤を含んでもよい。そのような治療薬剤
の例は、リドカインおよび非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)を含む。別の実施形態
において、治療薬剤は、抗原およびアジュバントである。さらに別の実施形態において、
抗原および/またはアジュバントを含む製剤が、別個であるが、例えば麻酔薬、鎮痛剤、
抗炎症剤、ステロイド、抗生物質、抗関節炎薬、食欲減退薬、抗ヒスタミン剤、および抗
新生物薬剤等の他の治療薬剤と共に適用されてもよい。好ましい実施形態において、抗生
物質は、フィダキソマイシン、メトロニダゾールまたはバンコマイシンである。
筋肉内等の様々な投与経路を介して送達され得る。
存剤として作用すると共に、乾燥形態の活性成分を溶解するために使用される溶液を飽和
する活性成分の濃度を低減し得る。そのような低減は、ポリマーが、「空」の空間を充填
することにより溶液の有効体積を低減するために生じる。したがって、抗原/アジュバン
トの量は、飽和溶液の量を低減することなく保存され得る。重要な熱力学的考慮は、飽和
溶液中の活性成分が、より低濃度の領域に「駆動」されるという点である。溶液中では、
ポリマーもまた製剤の可溶化された成分の抗原/アジュバント活性を安定化および/また
は保存することができる。そのようなポリマーは、エチレンまたはプロピレングリコール
、ビニルピロリドン、ならびに0−シクロデキストリンポリマーおよびコポリマーを含む
。
剤の単一または単位用量が提供される。単位用量のアジュバントおよび/またはC−TA
B.G5もしくはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドの量は、約0.001μgから
約10mgの広い範囲内のいずれかとなり得る。この範囲は、約0.1μgから約1mg
であってもよく、より狭い範囲は、約5μgから約500μgである。他の好適な範囲は
、約20μgから約200μgの間、例えば約20μg、約75μg、または約200μ
g等である。C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドの好ましい
用量は、約20μgから、または200μg以下である。C−TAB.G5またはC−T
AB.G5.1単離ポリペプチドとアジュバントとの間の比は、約1:1または約1:1
.25であってもよいが、より高い比が使用されてもよく(例えば、約1:10以下)、
または、アジュバントに対するC−TAB単離ポリペプチドのより低い比が使用されても
よい(例えば、約10:1以上)。
れてもよく、免疫細胞に提示されてもよく、抗原特異的免疫反応が誘導される。これは、
C.ディフィシル等の病原体による感染の前、間、または後に生じ得る。製剤の免疫原性
がアジュバント活性を必要としない程十分である場合は、C−TAB.G5またはC−T
AB.G5.1単離ポリペプチドのみが必要で、追加的なアジュバントが必要でなくても
よい。製剤は、製剤の適用が複数の抗原に対して免疫反応を誘導する(すなわち多価であ
る)ように、追加的な抗原を含んでもよい。抗原特異的リンパ球が免疫反応に関与しても
よく、Bリンパ球が関与する場合、抗原特異的抗体が免疫反応の一端を担い得る。上述の
製剤は、当該技術分野において知られた乾燥剤、賦形剤、保湿剤、安定剤、および保存剤
を含んでもよい。
、対象(例えば、疾患の予防、感染症の影響からの保護、CDAD等の疾患の症状の低減
もしくは軽減、またはそれらに組み合わせ等の治療を必要とする人間または動物)を治療
するために使用され得る。例えば、本発明のC−TAB.G5またはC−TAB.G5.
1単離ポリペプチドを含む製剤は、例えば以下のプロファイルを有する対象等のCDAD
のリスクを有する対象を治療するために使用され得る:i)より弱い免疫系を有する対象
、例えば高齢対象(例えば65歳を超える対象)もしくは2歳未満の対象等;ii)免疫
力のない対象、例えばAIDSを有する対象等;iii)免疫抑制薬を投与されている、
もしくは投与される予定がある対象;iv)入院の予定がある対象、もしくは入院してい
る対象;v)集中治療(ICU)を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vi)
消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vii)養護施設等の長期介
護を受けている、もしくは受ける予定がある対象;viii)頻繁な、および/もしくは
長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象;ix)上述のプロファイルの
2つ以上を有する対象である対象、例えば消化管手術を受ける予定がある高齢対象等;x
)炎症性大腸炎を有する対象;ならびに/またはxi)再発性CDADを有する対象、例
えばCDADの1つ以上のエピソードを経験している対象等。
原性作用に対して対象にワクチン接種してもよい。製剤は、既存の疾患を治療するため、
保護的に疾患を予防するため、疾患の重症度および/もしくは期間を低減するため、疾患
の症状を改善するため、またはそれらの組み合わせのために治療的に使用され得る。
皮下、皮内、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、胸腔内、腹腔内、心室内、およ
び/または舌下経路を含むがこれらに限定されない様々な投与経路により送達され得る。
い。通常、アジュバントおよび製剤は、抗原への提示の前に混合されるが、代替として、
短い時間間隔内に別個に提示されてもよい。
ュバント)、Montanide不完全Seppicアジュバント、例えばISA、水中
油エマルジョンアジュバント、例えばRibiアジュバント系、ムラミールジペプチドを
含有するシンタックスアジュバント製剤、水酸化アルミニウムまたはアルミニウム塩アジ
ュバント(ALUM)、ポリカチオン性ポリマー、特にポリカチオン性ペプチド、特にポ
リアルギニンまたは少なくとも2つのLysLeuLysモチーフを含有するペプチド、
特にKLKLLLLLKLK、定義された塩基コンテクスト内に非メチル化シトシン−グ
アニンジヌクレオチド(CpG)を含有する免疫刺激オリゴデオキシヌクレオチド(OD
N)(例えばWO96/02555に記載)またはイノシンおよびシチジンに基づくOD
N(例えばWO01/93903に記載)またはデオキシイノシンおよび/もしくはデオ
キシウリジン残基を含有するデオキシ核酸(WO01/93905およびWO02/09
5027に記載)、特にOligo(dIdC)13(WO01/93903およびWO
01/93905に記載)、神経活性化合物、特にヒト成長ホルモン(WO01/248
22に記載)、またはそれらの組み合わせ、ケモカイン(例えば、デフェンシン 1もし
くは2、RANTES、MIP1−α、MIP−2、インターロイキン−8、またはサイ
トカイン(例えば、インターロイキン−1β、−2、−6、−10もしくは−12;イン
ターフェロン−γ;腫瘍壊死因子−α;または顆粒球単球コロニー刺激因子)(Nohr
ia and Rubin,1994において考察されている)、ムラミールジペプチド
変異体(例えば、ムラブチド、トレオニル−MDPまたはムラミールトリペプチド)、M
DPの合成変異体、熱ショックタンパク質または変異体、森林型熱帯リーシュマニアLe
IFの変異体(Skeiky et al.,1995)、トリプシン切断部位での変異
体を含む細菌ADP−リボシル化外毒素の非毒性変異体(bARE)(Dickenso
n and Clements,1995)および/または作用性ADP−リボシル化(
Douce et al.,1997)または化学的解毒bARE(トキソイド)、QS
21、Quill A、N−アセチルムラミール−L−アラニル−D−イソグルタミル−
L−アラニン−2−[1,2−ジパルミトイル−s−グリセロ−3−(ヒドロキシホスホ
リルオキシ)]エチルアミド(MTP−PE)ならびに代謝可能な油および乳化剤を含有
する組成物であって、油および乳化剤は、実質的に全てが1ミクロン未満の直径を有する
油滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在する組成物(例えば、EP0399843
を参照されたい)を含む。また、免疫化に有用な他のアジュバントに関して、Richa
rds et al.(1995)を参照されたい。
IgM、IgD、IgA1、IgA2、分泌IgA、IgE、IgG1、IgG2、Ig
G3、および/もしくはIgG4)、または特定のT細胞サブセット(例えば、CTL、
Th1、Th2および/もしくはTDTH)(例えば、Munoz et al.,19
90;Glenn et al.,1995を参照されたい)を優先的に誘導するように
選択され得る。
性化することが知られている(Stacey et al.,1996)。DNAの他の
形態がアジュバントとして使用されてもよい。細菌DNAは、免疫系にその病原性の源を
認識させ、先天性免疫応答を刺激して適応免疫反応をもたらすパターンを有する構造のク
ラスに含まれる(Medzhitov and Janeway,1997,Curr.
Opin.Immunol.9(1):4−9)。これらの構造は、病原体関連分子パタ
ーン(PAMP)と呼ばれ、リポ多糖類、テイコ酸、非メチル化CpGモチーフ、二本鎖
RNA、およびマンニン(mannin)を含む。PAMPは、炎症反応を媒介し、T細
胞機能の共刺激因子として作用し、エフェクター機能を制御することができる内因性シグ
ナルを誘導する。これらの反応を誘導するPAMPの能力は、アジュバントとしての可能
性において役割を果たし、その標的は、マクロファージおよび樹枝状細胞等のAPCであ
る。PAMPはまた、異なる共刺激分子を誘導し、異なるエフェクター機能を制御して、
免疫反応、例えばTh2からTh1の反応をガイドするために、他のアジュバントと併せ
て使用されてもよい。
のワクチン剤としての使用に関する。本発明のワクチンまたは免疫原性組成物は、効果的
な量の抗原を使用し得る。後のC.ディフィシルに対する暴露からの対象の保護をもたら
すように、対象に特定の十分な免疫反応を生成させる量の抗原が含まれる。抗原は、C−
TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドであってもよい。一実施形態
において、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドは、単独で、
またはアジュバントと組み合わせて投与される。
のサブユニットワクチンとしての使用を含む。サブユニットワクチンは、病原体の断片の
接種薬剤としての使用を指す。当業者には、サブユニットワクチンが、病原体の特定部分
または領域に対する抗体を生成する手段を提供することが分かる。
いる方法により決定され得る。ワクチンの量および免疫化計画は、特定の抗原および使用
されるアジュバント、投与の様式および頻度、ならびに所望の効果(例えば、保護および
/または治療)に依存し得る。一般に、本発明のワクチンは、1μgから100mgの間
、例えば60μgから600μgの間等の範囲の量で投与され得る。C−TAB.G5ま
たはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドを含むワクチンの単一用量は、約1μgから
約1mg、好ましくは約5μgから約500μg、より好ましくは約20μgから約20
0μgの範囲内であってもよい。C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリ
ペプチドとalum等のアジュバントとの間の比は、約1:1、例えば1:1.25等で
あってもよいが、より高い比が使用されてもよく(例えば、約1:10以下)、またはよ
り低い比が使用されてもよい(例えば、約10:1以上)。一実施形態において、C−T
AB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドを含むワクチンにおいて、アジ
ュバントである水酸化アルミニウムが、約50μg/mLから約200μg/mLの範囲
内、好ましくは約125μg/mL(最終製剤)の量で使用される。
口、静脈内、皮下、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、胸腔内、腹腔内、心室内、および
/または舌下により投与され得る。
の投与は、当業者により必要に応じて決定されるように繰り返されてもよい。例えば、準
備用量に続いて1回、2回、3回、またはより多くのブースター用量が、1週間毎、2週
間毎または1月毎の間隔で投与されてもよい。本発明の一実施形態において、準備用量に
続いて1回または2回のブースター投与が、約7日から約14日の間隔で、例えば初回投
薬から7日後および21日後等に投与される。好ましい実施形態において、治療上効果的
な量のワクチンが、2回または3回、14日+/−1、2または3日(2週間毎)の間隔
で対象に投与される。本発明の一実施形態において、治療上効果的な量のワクチンが1回
投与される。
団は、C.ディフィシルへの暴露のリスクを有する健常個人、特に入院または介護施設で
の滞在間際の個人、ならびに病院、養護施設および他の介護施設内の者を含む。別の実施
形態において、集団は、抗生物質治療の停止後に再発した以前に感染していた患者、また
は抗生物質治療が効果的でない患者を含む。
む。1つの好ましい実施形態において、人間対象は、18歳から65歳である。別の好ま
しい実施形態において、人間対象は、65歳を超える高齢者である。後者の年齢群は、C
.ディフィシル感染を受ける最も脆弱な集団である。いくつかのさらなる実施形態におい
て、人間対象は、18歳より若い。
C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドの使用方法
5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドは、C.ディフィシルに関連した疾患を
予防または治療するために使用され得る。例として、本発明の単離ポリペプチドを対象の
免疫系に導入することは、対象が単離ポリペプチドに対する抗体を産生することを含む免
疫反応を誘導し得る。そのような抗体は、C.ディフィシルの認識に有用である。
に投与することを含む方法を提供する。単離ポリペプチドは、液体または固体として投与
され得る。単離ポリペプチドは、さらに、薬学的に許容される担体を含んでもよい。
インを識別および単離するための方法であって、免疫反応を生成するためのC−TAB.
G5またはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドの使用と、C−TAB.G5またはC
−TAB.G5.1単離ポリペプチドに応答して生成された抗体を精製し、次いで特性決
定することとを含む方法を提供する。識別されたエピトープは、さらなる抗体またはその
断片のクローニングに使用され得る。
いくつかの実施形態において、動物等の対象は、C.ディフィシルの治療および/または
予防および/または検出を受ける。他の実施形態において、動物は人間である。例えば、
本発明のポリペプチドは、in vivoでC.ディフィシルに対する抗体を惹起するた
めに使用され得る。さらなる例として、本発明のポリペプチドは、対象がC.ディフィシ
ルに対する抗体を生成するかどうかを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態
において、ポリペプチドは、抗体を単離するために使用され得る。例として、ポリペプチ
ドは、親和性マトリックスに結合され得る。
して、本発明のポリペプチドおよび/または抗体を組み換えにより生成するために使用さ
れ得る。本発明の核酸はまた、例えば、対象がC.ディフィシルに感染しているかどうか
を決定するために使用され得る。例として、これは、放射性標識ハイブリダイゼーション
の方法を使用して達成され得る。
用され得る。例として、抗体は、天然毒素Aおよび/または毒素Bを抗原として認識し得
る。本発明の抗体はまた、C.ディフィシルによる感染と闘うために使用され得る。例と
して、ヒト化抗体または抗体断片またはモノクローナル抗体は、C.ディフィシル感染に
対する対象自身の免疫反応を使用し得る。さらなる例として、本発明の抗体は、サイトカ
インまたは毒素または酵素またはマーカーと結合して、感染症の治療および検出を補助し
得る。
られた多くのアッセイと共に使用される。当業者には、本発明のポリペプチド、核酸およ
び抗体の、広範な研究ベースの使用が認識される。本発明のポリペプチド、抗体および核
酸は、例えば、放射性、化学発光性、蛍光性および/または染色分子等で標識化され得る
。本発明の抗体、核酸およびポリペプチドは、DNAアッセイ(例えばサザンブロット法
)、RNAアッセイ(例えばノーザンブロット法)、タンパク質アッセイ(例えばウェス
タンブロット法)、クロマトグラフィー分析(例えばガス、液体、HPLC、サイズ排除
)、免疫測定法(例えばELISA)、ならびに構造アッセイ(例えば結晶学およびNM
R分光法)等のアッセイにおける使用に役立つ。本発明の抗体、ポリペプチドおよび核酸
は、さらに、プローブとして使用され得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイ
もまた、当業者に知られている。
キット
.G5.1単離ポリペプチドをコードする核酸、C−TAB.G5もしくはC−TAB.
G5.1単離ポリペプチド、および/またはC−TAB.G5もしくはC−TAB.G5
.1単離ポリペプチドに対する抗体を含むキットを提供する。キットは、1つ以上の容器
と、本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従う使用のための説明とを含んでもよい
。本発明のC−TAB.G5もしくはC−TAB.G5.1単離ポリペプチドおよび/ま
たは抗体は、C.ディフィシルを検出するための免疫測定法を含む様々なアッセイにおい
て使用され得る。一実施形態において、C−TAB.G5またはC−TAB.G5.1単
離ポリペプチドは、生体試料中の抗体の検出を目的とした抗原として機能するように役立
つ。容器は、単位用量、大量包装(例えば、複数用量包装)または副次的単位用量であっ
てもよい。本発明のキットは、好適な包装内にある。また、特定のデバイス、例えば吸入
器、経鼻投与デバイス、または注入デバイスと組み合わせた使用のための包装も企図され
る。キットは、無菌アクセスポートを有してもよい。容器もまた、無菌アクセスポートを
有してもよい。キットは、随意に、緩衝剤等の追加的構成成分および解釈情報を提供し得
る。
した疾患、例えばCDADを検出するために使用され得る。また、キットは、C.ディフ
ィシルに関連した疾患を予防または治療するために使用され得る。また、本発明のキット
は、C.ディフィシルに関連した疾患の症状を軽減するために使用され得る。
求される発明を作製および利用することができると考えられる。したがって、以下の実施
例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであり、決して本開示の残りを
制限するものとして解釈されるべきではない。本出願を通して参照される全ての論文、出
版物、特許および文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本実施例は、大腸菌細胞における発現のためのC.ディフィシル毒素A(CTA)およ
びB(CTB)の一部を含む単離ポリペプチドの調製を説明する。後述の方法は、CTA
およびCTBを含む様々な単離ポリペプチドを作製するために使用され得る。一例として
、CTAのC末端ドメインの一部およびCTBのC末端ドメインの一部を含む単離ポリペ
プチドが説明される。
実施例1.1:C−TAB.G5およびC−TAB.G5.1遺伝子コンストラクトのク
ローニング。
ssion番号YP−001087137)の一部を、以下のプライマーを使用して、C
.ディフィシル株630(ATCC BAA−1382)のゲノムDNAからPCRによ
り増幅した。
順方向:5’−caccACTAGTatgaacttagtaactggatggc−
3’(配列番号9)および
逆方向:5’−CTCGAGttagccatatatcccaggggc−3’(配列
番号10)。
順方向プライマーによる増幅は、SpeI部位を形成し、逆方向プライマーによる増幅は
、Xhol部位を形成した。
ssion番号:YP−00108735)の一部を、以下のプライマーを使用してPC
Rにより増幅した。
順方向:5’−caccATGCATatgagtttagttaatagaaaaca
g−3’(配列番号11)および
逆方向:5’−ggcCTCGAGctattcactaatcactaattgagc
−3’(配列番号12)。
順方向プライマーによる増幅は、Nsil部位を形成し、逆方向プライマーによる増幅は
、Xhol部位を形成した。
った。サイクル条件は、95℃で2分、95℃で45秒、55℃で50秒、68℃で8分
(30サイクル)、および72℃で10分であった。PCR生成物は、迅速遺伝子抽出キ
ット(Invitrogen社)で精製し、PCR 2.1 TOPOベクター(Inv
itrogen社)にライゲーションした。ライゲーション混合物を使用して、大腸菌M
ech−1細胞を熱ショックにより形質転換した。形質転換体をImMedia Amp
Blue(Invitrogen社)のプレート上に播種した。白色コロニーを採取し
、100μg/mlのアンピシリンを含有する4mlのLB培地を有する15ml管内で
培養した。培養物を37℃で一晩インキュベートし、プラスミドを迅速プラスミドミニプ
レップキット(Invitrogen社)で抽出した。
oI,で分解させ、断片を、同じくT4 DNA Ligaseを使用してSpeIおよ
びXhoIで分解させた中間ベクターにクローン化した。次いで、3つの制限部位(Bg
LII−NsiI−SacI)を含有するリンカーを、以下の合成プライマーの組を使用
して、PCRによりCTA遺伝子断片の3’端部に挿入した。
順方向:5’−AGATCTATGCATGAGCTCctcgagcccaaaacg
aaaggctcagc−3’(配列番号13)
逆方向:5’−cggtccggggccatatatcccaggggcttttac
tcc−3’(配列番号14)。
で分解させ、分解されたCTB遺伝子断片を、同じくNsiIおよびXhoIで分解させ
たCTA遺伝子およびリンカーを含有する中間ベクターにライゲーションした。CTB遺
伝子をリンカーに3’位で挿入し、コンストラクト配列5’−CTA−リンカー−CTB
−3’を形成した。この融合コンストラクトは、C−TAB.V1中間ベクターと呼ばれ
る。
ターからPCRにより増幅した。
順方向:5’−caccCCATTGatggtaacaggagtatttaaagg
a(配列番号15)
逆方向:5’−CTCGAGctattcactaatcactaattgagctg(
配列番号16)。
PCR反応は、PCR Super mix(Invitrogen社)を使用して行っ
た。サイクル条件は、95℃で2分、95℃で45秒、55℃で50秒、68℃で4分(
30サイクル)および72℃で10分であった。PCR生成物は、迅速遺伝子抽出キット
(Invitrogen社)で精製し、PCR2.1−TOPOベクター(Invitr
ogen社)にライゲーションした。ライゲーション混合物を使用して、大腸菌Mech
−1細胞を熱ショックにより形質転換した。形質転換体をImMedia Amp Bl
ue(Invitrogen社)のプレート上に播種した。白色コロニーを採取し、10
0μg/mlのアンピシリンを含有する4mlのLB培地を有する15ml管内で培養し
た。培養物を37℃で一晩インキュベートし、プラスミドを迅速プラスミドミニプレップ
キット(Invitrogen社)で抽出した。PCR 2.1−TOPOTAベクター
中のC−TAB.G5融合遺伝子を、NcoIおよびXhoI 制限酵素で分解させた。
これらのC−TAB断片を、同じ制限酵素で分解させたpET28発現ベクターにライゲ
ーションした。この得られたコンストラクトは、アミノ酸1851から2366からの毒
素BのC末端ドメインに融合した、アミノ酸2272から2710からの毒素AのC末端
ドメインをコードする。pET28/C−TAB.G5コンストラクトを、発現のために
大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。C−TAB.G5融合遺伝子を含有する5つ
のコロニーを、分析のために選択した。
ドン最適化により得られた。コドン使用量は、大腸菌遺伝子のコドンバイアスに基づいて
適合させた。さらに、mRNA半減期を延長するようにGC含量を調節し、非常に高い(
>80%)または非常に低い(<30%)GC含量の領域を回避した。したがって、最適
化された遺伝子は、大腸菌における高く安定な発現率を可能とする。コドン最適化された
C−TAB.G5.1遺伝子は、in situで合成し、発現ベクターpET−28b
(+)にサブクローニングした。
を使用して、プラスミドDNA配列を確認した。Jellyfishソフトウェアを使用
して配列決定データを分析した。
実施例1.2:大腸菌における組み換えC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1融
合タンパク質の発現
における発現のための標準的手順を使用して行うことができる。
ーニングのために、コロニーを採取し、50μg/mlのカナマイシンを含む4mlのL
B培地を有する15mlのFalcon管内で成長させた。管を250rpmで混合しな
がら37℃で一晩培養した。初期成長期の後、各管からの1mlの培養物を24ウェル組
織培養プレートに移し、1mMのイソプロピル−β−D−1−チオガラクト−プラノシド
(IPTG)で30℃で3時間発現を誘導した。微小遠心分離機での12,000gで1
分間の遠心分離により、細胞ペレットを回収した。細胞ペレット溶解物を調製し、可溶性
分画をC−TAB融合タンパク質の発現に関してSDS−PAGEおよびウェスタンブロ
ット分析により分析した。陽性クローンをさらなる評価のために選択した。
した150mlのSuper Broth培地を含有する500mlの振とうフラスコ内
で、種培養物を成長させた。OD600が2〜2.5に達するまで、培養物を275rp
mで連続撹拌しながら28℃で12時間成長させた。振とうフラスコを使用して、10L
のSuper Brothを含有する発酵槽を植菌した。OD600=3.5〜4となる
まで、培養物を37℃で約4.5時間成長させた。生成物発現の誘導のため、0.1mM
のIPTGを添加し、25℃でさらに4時間成長を継続させた。次いで、遠心分離により
細胞を回収し、細胞ペーストを−70℃で凍結保存した。この発酵プロセスにより達成さ
れた典型的な生成物特異的発現速度は、約200mg/mlであった。
リセロールストック(−75℃で保存)を使用して、1L振とうフラスコ内の30μg/
mlカナマイシンを添加した100mlの前培養培地を植菌した。前培養物を、OD60
0=1.0〜2.0に達するまで、約150rpmでの一定撹拌下で37℃で約7時間イ
ンキュベートした。流加回分発酵を行うことができるプロセス制御システムを装備した標
準的産業用15L発酵槽内で、25mLの前培養物を使用して7Lの回分発酵培地を植菌
した。グルコースが枯渇するまで、7Lの回分培養段階を37℃で12時間実行した(O
D600=12〜15)。次いで、急激供給モードにより、特定の成長速度定数μ=0.
25/時間で37℃で6時間(OD600=40〜50)、グルコース供給段階(バイオ
マス生成)を開始した。一定供給段階への切り替えおよび1mM IPTG(生成物生成
)の最終濃度での誘導の1時間前に、温度を30℃に低下させて、封入体形成のリスクを
低減した。30℃における一定供給での生成物発現段階をさらに5時間継続し(OD60
0=約100)、23時間の全発酵プロセス時間および約8.2Lの最終培養物体積を得
た。遠心分離により約1.2kgの湿潤細胞バイオマスを回収し、−70℃以下で保存し
た。そのような流加回分発酵により達成された典型的な生成物特異的発現速度は、最大1
.3g/Lであった。
実施例1.3:組み換えC−TAB.G5またはC−TAB.G5.1融合タンパク質の
精製。
Mクエン酸/NaOH緩衝液中に再懸濁し、細胞スラリーを550バールでホモジナイザ
(GEA Niro Soaviホモジナイザ)に2回通過させた。懸濁液を2回、つま
り13500rpmで30分を1回、および2回目に超遠心分離機内で18000rpm
で1時間遠心分離した。上澄みをプールし、50mMクエン酸緩衝液(pH3)でpHを
5.6に調節した。浄化された細胞溶解物を、pH5.6の10mMクエン酸/NaOH
緩衝液と共にSP急速流動カラムに通過させた。タンパク質を、20mM NaPi中0
mMから500mMに増加する塩化ナトリウムの線形勾配で溶出した。C−TAB.G5
を含有する分画をプールした。蒸留H2Oにより伝導度を5mS/cmまで下方調節した
。25mMの最終濃度までトリスを添加した。プールした分画をDEAE急速流動カラム
に通過させた。タンパク質を、25mMトリス中50mMから500mMに増加する塩化
ナトリウムの線形勾配で溶出した。再び、C−TAB.G5を含有する分画をプールし、
0.4Mの最終濃度まで1.5Mクエン酸Na(pH7.5)を添加した。C−TAB.
V1プールを、25mMトリス、0.4Mクエン酸Na(pH 7.5)で平衡化された
フェノールセファロースHPカラムに投入した。C−TAB.G5融合タンパク質を、5
mMトリス(pH7.5)を使用して線形勾配で低下する塩濃度で溶出した。全てのカラ
ムを、AKTA Primeクロマトグラフィーシステムにより監視した。精製されたC
−TAB融合タンパク質を、50K膜を使用してPBSに緩衝液交換した。
C−TAB.G5.1バルク調製物の精製:バイオマスを、処理まで−80℃で保存した
。450gの凍結細胞ペースト(2.90Lの発酵槽に相当)を、4体積の溶解緩衝液(
20mM Hepes、pH7.5、約0.6mS/cm)で希釈し(例えば450gの
ペースト+1800mLの緩衝液)、このようにして約1時間±0.5時間、機械的撹拌
下で解凍した。随意の残りの塊を、Ultraturraxを使用して(例えば8000
rpmで5分間)再懸濁することができる。細胞溶解は、Niro Soavi Pan
da高ホモジナイザで行う(640±25バール、3サイクル)。熱交換器を使用して溶
解物を10℃未満まで冷却し、遠心分離までこの温度で維持する。粗細胞溶解物を、14
000rpm(30000g)で4℃で30分間、バッチ遠心分離ステップ(Beckm
ann Avanti JLA 60.25)に供する。上澄みを回収してプールする。
濾過ステップの詰まりのリスクを低減するために、ペレットの半液体部分も廃棄する。次
いで、プールされた上澄みをSupercap PDH4 100/5インチ深さのフィ
ルタカプセル(Pall社)(250cm2有効濾過面積)を通して濾過する。フィルタ
ハウジング内の残りの溶解物を、溶解緩衝液で洗い流す。浄化後、1Mトリス原液(pH
7.5)の一定量を、25mM.の最終濃度まで溶解物に添加する。最終溶解物の緩衝組
成物は、20mM Hepes、25mMトリス(pH7.5、伝導度約6mS/cm)
である。溶解物は濾過後もまだ若干混濁している可能性があるが、これはその後の捕捉ス
テップに影響しない。捕捉ステップは、直径50mm、充填層高さ20cm、充填層体積
約400mLの寸法を有するXK50/30カラム(GE Healthcare社)に
おいて、DEAE Sepharose FF(GE Healthcare社)で室温
で行う。投入密度は、約0.8gから1.2gバイオマス/mLゲルである。プロセスは
、Akta Explorerシステム(GE Healthcare社)により行い、
280nmで監視する。平衡化は、100cm/時間で、約5CVの25mMトリス、2
0mM Hepes、25mM NaCl(pH7.5、伝導度約5mS/cm)を用い
て、pH、伝導度および280nm吸光度が安定するまで行う。溶解物を75cm/時間
でカラムに投入し、通過物を廃棄する。全ての濾過された溶解物を投入したら、280n
m吸光度が安定化するまで、流動を約5CVの平衡化緩衝液で再開する。5CVの25m
Mトリス、175mM NaCl(pH7.5、伝導度19mS/cm)による洗浄ステ
ップ2の間に不純物をカラムから除去する。3CVの25mMトリス、375mM Na
Cl(pH7.5、伝導度36mS/cm)での段階的溶出により、C−TABタンパク
質をカラムから溶出する。280nm吸光度が増加し始めたら(通常1CV後)、C−T
AB含有分画の回収を開始し、約0.5CVから1.0CVの間継続する。C−TABを
含有するプールされた分画は、2〜8℃で一晩保存することができる。中間精製ステップ
は、直径50mm、充填層高さ20cm、充填層体積約400mLの寸法を有するXK5
0/30カラム(GE Healthcare社)において、SP−Sepharose
FF(GE Healthcare社)で室温で行う。最大投入密度は、約4〜5mg
C−TAB/mLゲルである。プロセスは、Akta Explorerシステム(G
E Healthcare社)により行い、280nmで監視する。平衡化、洗浄および
線形勾配溶出ステップを、過度の背圧(>4バール)により妨げられない限り、200c
m/時間(65mL/分)の最大流速で行う。pH、伝導度および280nm吸光度が安
定となるまで、約5〜10CVの緩衝液Gで200cm/時間で平衡化を行う。投入前に
、SP−FF樹脂上へのC−TABの結合を可能とするようにDEAEプールを調節する
必要がある。最終伝導度が3.5mS/cm(pH5.5±0.1)以下となるまで、S
P−FF平衡化緩衝液(10mMクエン酸、2mM EDTA(pH5.5±0.1、伝
導度約2mS/cm))でDEAEプールを25倍希釈する。必要な場合は、所望の伝導
度を達成するために追加のMilliQ水を添加する。SP−FF上へのC−TABの結
合を可能とするためには、低い伝導度が極めて重要であることに留意されたい。試料を1
50cm/時間でカラムに投入し、通過物を廃棄する。試料の投入後、280nm吸光度
が安定化するまで、流動を約5CVの平衡化緩衝液で200cm/時間で再開する。0%
平衡化緩衝液から、10CVを超える30% 20mMリン酸ナトリウム、500mM
NaCl(pH7.0)まで、100cm/時間の線形勾配により溶出を行う。分画を回
収し、UV280nm吸光度によりプールを行う。プールは、ピーク最大値の15%で開
始し、ピーク最大値の15%で終了する。1.5Mクエン酸原液(pH8.0)を使用し
て、プールをすぐに400mMのクエン酸(最終pH7、約49mS/cm)まで調節す
る。調節されたSPFFプールは、pH7および約49mS/cmを有するべきであり、
2〜8℃で一晩保存される。
填層体積約300mLの寸法を有するXK50/30カラム(GE Healthcar
e社)において、Phenyl−Sepharose HP(GE Healthcar
e社)で室温で行う。投入密度は、約4〜5mg C−TAB/mLゲルである。プロセ
スは、Akta Explorerシステム(GE Healthcare社)により行
い、280nmで監視する。平衡化、投入、洗浄および溶出ステップを、過度の背圧(>
4バール)により妨げられない限り、100cm/時間(33mL/分)の最大流速で行
う。そのような場合、流速を低下させる必要がある。平衡化は、100cm/時間で、約
5〜10CVの25mMトリス、400mMクエン酸ナトリウム(pH7.5、46mS
/cm)を用いて、pH、伝導度および280nm吸光度が安定するまで行う。試料を1
00 cm/時間でカラムに投入し、通過物を廃棄する。試料の投入後、280nm吸光
度が安定化するまで、流動を約5CVの平衡化緩衝液で100cm/時間で再開する。1
00%平衡緩衝液/0% 5mMトリス(pH7.5、0.5mS/cm)から、20C
Vを超える100% 5mMトリス(pH7.5、0.5mS/cm)まで、100cm
/時間の線形勾配により溶出を行う。分画を回収し、UV280nm吸光度によりプール
を行う。プールは、ピーク最大値の約10〜15%で開始し、ピーク最大値の約20%で
終了する。調節されたプールを、2〜8℃で一晩保存する。最終C−TAB原薬タンパク
質溶液の調製は、室温で操作される30kDaカットオフ接線流濾過(TFF、Pell
icon 2膜、Millipore)により達成される。タンパク質溶液は、透過物p
Hが6.5±0.2と等しくなるまで、製剤緩衝液(20mMヒスチジン、75mM N
aCl、5%スクロース、0.025% Tween(登録商標)80(pH6.5))
に対して膜分離される。
ュベット)の280nmにおける比吸光係数として1.566を使用して、最終タンパク
質濃度を2mg/mLに調製する。
.G5またはC−TAB.G5.1融合タンパク質を、ベータ−メルカプトエタノールを
含有するNu−Page試料緩衝液中に再懸濁し、10分間煮沸した。試料(25μl)
を3〜8%トリス−アセテートゲル上に投入した。電気泳動(150Vで1時間)後、単
純に青色染色によりゲルを染色することによりタンパク質を可視化し、またはウェスタン
ブロット分析に使用した。
たウェスタンブロット分析により決定した。10%メタノール中の1×トランスファー緩
衝液を使用して、タンパク質を23Vで60分間PVDF膜に移した。リン酸緩衝生理食
塩水(PBS)中0.5%のカゼインで、膜を室温で1時間ブロックした。毒素Bに対す
るモノクローナル抗体(GenWay;クローンB426M)または独自に得た毒素Aに
対するモルモットポリクローナル抗体(List Biological Labs)と
共に、トランスファー膜を室温で2時間インキュベートした。洗浄した膜を、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ複合化抗モルモットIgGまたは抗マウスIgGと共にインキ
ュベートした。ブロットを洗浄し、AEC基質を添加した。ブロットを穏やかに混合しな
がら5〜10分間インキュベートした。ブロットを水で濯ぎ、発色を停止させた。
)を凝集することができることが示されている。凝集プロセスは、毒素A がウサギRB
Cに対する血液抗体において見られるグリカン配列に結合した結果である。試料(C−T
AB.G5および天然毒素A)を、PBS中で100μg/mlに希釈する。V字底マイ
クロタイタープレート内で、2倍連続希釈物をプレートにわたり2回調製し、100μg
/mlから開始して50μlの希釈物を各ウェルに残す。50マイクロリットルの0.7
5%ウサギRBC/PBS懸濁液をマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、プレ
ートを室温で1時間インキュベートする。プレート底部でのRBCペレット形成の失敗に
より、血球凝集が示される。試料の血球凝集力価は、RBCペレットが観察されない最大
試料希釈物を有するウェル内に存在するタンパク質の濃度により表現される。
実施例2:マウスにおけるalumの存在下および非存在下での組み換えC−TAB.G
5融合タンパク質の用量力価測定。
しでのC−TAB.G5のin vivo用量力価測定の実現可能性を決定するためのも
のであった。使用したalumは、Alydragel(水酸化alum、Brennt
ag社)であった。8週から9週齢の間のC57BL/6雌マウス(Charles R
iver Labs.)を、免疫化に使用した。全ての動物は、0日目に右大腿筋への筋
肉内(IM)注射(50μl)による第1の免疫化を受けた。第2の免疫化は、14日目
に左大腿筋へのIM注射により行った。全部で72匹のマウスを、以下のようにワクチン
接種された12の群に分割した。
・群1:PBSのみ
・群2:100(154)ngのC−TAB.G5
・群3:300(462)ngのC−TAB.G5
・群4:1,000(1,540)ngのC−TAB.G5
・群5:3,000(4,620)ngのC−TAB.G5
・群6:10,000(15,400)ngのC−TAB.G5
・群7:50μgのalumを含むPBS
・群8:50μgのalum OHを含む10.0(15.4)ngのC−TAB.G5
・群9:50μgのalum OHを含む30.0(46.2)ngのC−TAB.G5
・群10:50μgのalum OHを含む100(154)ngのC−TAB.G5
・群11:50μgのalum OHを含む300(462)ngのC−TAB.G5
・群12:50μgのalum OHを含む1,000(1,540)ngのC−TAB
.G5
Protein Assay(Bio−Rad社)に従い、タンパク質濃度を測定した
。後に、実施例1.3に記載の手順に従い、280nmでのUV測定によりタンパク質濃
度(括弧内に示す)を再び測定した。追跡調査では、UV法によりタンパク質濃度を測定
した。
28日目)に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−20℃で保存した
。
Bと呼ばれる)、毒素Aおよび毒素Bまたはそのトキソイドに対し惹起された血清抗体を
、酵素免疫測定法(ELISA)において評価した。簡潔に述べると、1.0μg/ml
の毒素A、毒素BまたはC−TAB.G5単離ポリペプチドの原液を、PBS中で調製し
、100μlを96ウェルプレートの各ウェルに加えた。4℃で一晩のインキュベーショ
ン後、プレートを洗浄し、0.5%カゼインブロック緩衝液でブロックした。プレートを
再び洗浄し、試験血清の連続2倍希釈物をプレートに加えた。第2の4℃で一晩のインキ
ュベーション後、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ複合化抗マウスIgG(H+L)
と共にインキュベートした。室温で2時間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄
し、ペルオキシダーゼ基質(2,2’−アジノビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−
スルホネート)を添加し、室温で2時間発色させた。50μlの2%SDSをウェルに添
加することにより、反応を停止させた。プレートを405nmの吸収でELISAプレー
トリーダーで読み出した。血清抗体力価は、ELISA単位の幾何平均として報告される
が、これは、1.0のOD 405nm読み出しをもたらす血清希釈である。陰性対照と
して、第1の免疫化の前にプレブリードされた動物から得られた事前免疫化血清のプール
試料を使用して、抗体反応を評価した。
アジュバントは、より低いC−TAB.G5の用量で大幅に改善された抗体力価を可能に
した。図3は、抗C−TAB、抗毒素Aおよび抗毒素B IgGの力価を示す。図4は、
alumの存在下または非存在下での抗体力価のグラフ比較を示す。
実施例3:マウスにおけるC−TAB.G5の免疫原性および保護効果
ウスにおける、C−TAB.G5の免疫原性および保護効果を評価するためのものであっ
た。6〜7週齢の雌C57BL/6マウス(Charles River Labs.)
を本試験に使用した。全ての動物は、0日目に右大腿筋への筋肉内(IM)注射(50μ
l)による第1のワクチン接種を受けた。第2のワクチン接種は、14日目に左大腿筋へ
のIM注射により行った。116匹のマウスを、以下のようにワクチン接種された群に分
割した。
・群1:PBSのみ
・群2:3μgのC−TAB.G5
・群3:10μgのC−TAB.G5
・群4:30μgのC−TAB.G5
・群5:3μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
・群6:10μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
・群7:30μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
・群8:PBSのみ
・群9:3μgのC−TAB.G5
・群10:10μgのC−TAB.G5
・群11:30μgのC−TAB.G5
・群12:3μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
・群13:10μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
・群14:30μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
分析まで血清を−20℃で保存した。次いで、C−TAB、毒素Aおよび毒素Bに対する
血清抗体力価を、ELISAにより測定し、ELISA単位(EU)として報告した。
−TAB、毒素Aおよび毒素Bに対する血清抗体力価を示す。本試験は、C−TAB.G
5融合タンパク質がマウスにおいて極めて免疫原性であり、アジュバントを添加しなくて
も、毒素Aおよび毒素Bの両方に対して強い抗体反応を誘導し得ることを示した。C−T
AB.G5免疫原性は、水酸化alumとの併用送達により大きく増強され得る(1対数
超)。alumあり、またはなしでC−TAB.G5を与えられた動物は、片対数用量範
囲にわたり抗体反応の2倍の増加を示した。
n vitro毒素中和アッセイ(TNA)において、天然毒素AおよびBを中和する能
力に関して評価した。
A(5ng/ml)または毒素B(1ng/ml)を、免疫化マウスから得られた抗血清
の125μlの連続希釈物と共にインキュベートした。37℃で1時間のインキュベーシ
ョン後、毒素:血清混合物を、Vero細胞(サル腎臓細胞)を含有するマイクロタイタ
ーウェルに加え、マイクロタイタープレートを18時間インキュベートした。毒素Aまた
はBおよびVero細胞のインキュベーションは、細胞形態の変化、および非接着性細胞
の除去後の毒素処理細胞の中性赤色染色により測定される細胞接着の喪失をもたらした。
血清の毒素中和力価は、毒素活性の50%低減をもたらす血清希釈として報告される。
生成された抗体が、天然毒素Aの毒性活性を中和することができるが、毒素Bは中和でき
ないことを示している。C−TAB.G5がalumと併用送達された場合、TNA力価
は、抗毒素A TNAにおいて約6倍の増加を伴って増強され、抗毒素B TNAにおい
てはわずかに2分の1低い力価であった。このデータは、C−TAB.G5単離ポリペプ
チドが、天然毒素中に存在する抗体認識抗原エピトープを保持するだけでなく、機能的毒
素中和抗体の生成に必要とされる重要な抗原エピトープも含むことを示している。このよ
うに、C−TAB.G5は、C.ディフィシル毒素Aおよび毒素Bの毒性作用の中和に効
果的であり、したがってワクチン接種に有用である。
5免疫化の能力を決定した。第2のワクチン接種から3週間後(試験35日目)に、ワク
チン接種および非ワクチン接種群(N=8)内の動物は、25ngの毒素Aまたは50n
gの毒素Bの致死用量を腹腔内(IP)投与により受けた。マウスの生存率をその後9日
間にわたり監視したが、その結果を図6に示す。本実験は、alumアジュバントの非存
在下でのC−TAB.G5によるマウスの免疫化が、天然毒素Aによる致死的負荷に対し
100%の保護、および毒素B負荷に対する50%の保護を付与することができることを
実証した。C−TAB.G5のAlumとの併用送達は、毒素Bに対する保護免疫を10
0%保護まで向上させた。このデータは、C−TAB.G5ワクチン接種が、致死的負荷
モデルにおいて、マウスを毒素Aおよび毒素Bの両方の毒性作用から保護するのに十分な
免疫反応を誘導することを示している。
実施例4:幼若および老齢マウスにおける、C−TAB.G5の免疫原性および保護効果
の評価。
るためのものであった。それぞれ6〜7週齢および18ヶ月齢の雌C57BL/6マウス
(Charles River Labs.)を本試験に使用した。全ての動物は、0日
目に右大腿筋への筋肉内(IM)注射(50μl)による第1のワクチン接種を受けた。
第2のワクチン接種は、14日目に左大腿筋へのIM注射により行った。192匹のマウ
スを、以下のようにワクチン接種された群に分割した。
−群1:幼若マウスへのPBS
−群2:老齢マウスへのPBS
−群3:幼若マウスへの10μgのC−TAB.G5
−群4:幼若マウスへの30μgのC−TAB.G5
−群5:老齢マウスへの10μgのC−TAB.G5
−群6:老齢マウスへの30μgのC−TAB.G5
−群7:幼若マウスへの10μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
−群8:幼若マウスへの30μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
−群9:老齢マウスへの10μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
−群10:老齢マウスへの30μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
−群11:幼若マウスへのPBS
−群12:老齢マウスへのPBS
−群13:幼若マウスへの10μgのC−TAB.G5
−群14:幼若マウスへの30μgのC−TAB.G5
−群15:老齢マウスへの10μgのC−TAB.G5
−群16:老齢マウスへの30μgのC−TAB 5th
−群17:幼若マウスへの10μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
−群18:幼若マウスへの30μgのC−TAB.G5+ 50μgのalum OH
−群19:老齢マウスへの10μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
−群20:老齢マウスへの30μgのC−TAB.G5+50μgのalum OH
接種群(N=6)内の動物は、25ngの毒素Aまたは50ngの毒素Bの腹腔内(IP
)注射により致死的負荷を受けた。マウスの生存率をその後9日間にわたり監視した。
28日目)に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−20℃で保存した
。次いで、C−TAB、毒素Aおよび毒素Bに対する血清抗体力価を、ELISAにより
測定し、ELISA単位(EU)として報告した。毒素Aおよび毒素B中和抗体(TNA
)を、細胞毒性量の組み換え毒素Aおよび毒素Bで処理されたVero細胞を使用して決
定した。
いレベルの試験した全ての抗体を示した。水酸化alumの存在下でC−TAB.G5を
ワクチン接種された幼若マウスにおいて特に高い抗体力価が得られた(図7)。毒素B
TNA力価において特に顕著な改善が達成された。同時に、毒素Aおよび毒素B負荷に耐
える能力において、幼若マウスと老齢マウスとの間に大きな差はなかった。しかしながら
、両群とも、alumの存在下でワクチン接種された場合、改善された保護率を示した。
図7は、幼若マウス対老齢マウスにおけるC−TAB.G5免疫原性および保護効果の比
較を示す。図8は、幼若および老齢マウスにおける抗C−TAB抗体増加の反応速度を示
す。
実施例5:C−TAB.G5.1ならびにとトキソイドAおよびBの免疫原性および保護
効果の比較。
するためのものであった。使用したトキソイドA/Bは、等量(1:1)のトキソイドA
(ロット#1009132)およびトキソイドB(ロット#1009133)の混合物で
あった。トキソイドは、ホルマリン固定により調製され、TechLabにより提供され
た。6〜7週齢の雌C57BL/6マウス(Charles River Labs.)
を本試験に使用した。全ての動物は、0日目に右大腿筋への筋肉内(IM)注射(50μ
l)による第1のワクチン接種を受けた。第2のワクチン接種は、14日目に左大腿筋へ
のIM注射により行った。180匹のマウスを、以下のようにワクチン接種された群に分
割した。
−群1:PBSのみ
−群2:10μgのC−TAB.G5.1
−群3:30μgのC−TAB.G5.1
−群4:10μgのC−TAB.G5.1+50μgのalum OH
−群5:10μgのC−TAB.G5.1+50μgのalum OH
−群6:30μgのトキソイドA/B
−群7:10μgのトキソイドA/B
−群8:30μgのトキソイドA/B+50μgのalum OH
−群9:30μgのトキソイドA/B+50μgのalum OH
−群10:PBS
−群11:10μgのC−TAB.G5.1
−群12:30μgのC−TAB.G5.1
−群13:10μgのC−TAB.G5.1+50μgのalum OH
−群14:30μgのC−TAB.G5.1+50μgのalum OH
−群15:10μgトキソイドA/B
−群16:30μgのトキソイドA/B
−群17:10μgのトキソイドA/B+50μgのalum OH
−群18:30μgのトキソイドA/B+50μgのalum OH
接種群(N=6)内の動物は、28ngの毒素Aまたは50ngの毒素Bの腹腔内(IP
)注射により致死的負荷を受けた。マウスの生存率をその後9日間にわたり監視した。
28日目)に、全ての動物から血液試料を回収した。分析まで血清を−20℃で保存した
。次いで、C−TAB、毒素Aおよび毒素Bに対する血清抗体力価を、ELISAにより
測定し、ELISA単位(EU)として報告した。毒素Aおよび毒素B中和抗体(TNA
)を、細胞毒性量の組み換え毒素Aおよび毒素Bで処理されたVero細胞を使用して決
定した。
イドA/Bの免疫原性および保護効果を実証する。C−TAB.G5.1を与えられた動
物は、トキソイドA/Bを与えられた動物と比較して、より低いが有意な抗C−TAB抗
体力価を示した。また、alumの併用送達は、全ての試験された抗体反応を大きく増強
した。結果として、alumの存在下でC−TAB.G5.1またはトキソイドA/Bで
免疫化された動物において達成された抗C−TABおよび抗毒素A抗体のレベルは、同様
である。マウスがC−TAB.G5.1で免疫化された場合、トキソイドA/Bで免疫化
されたマウスと比較して、抗毒素B抗体は僅かにより低い抗体力価が観察された。注目す
べきことに、毒素分子のC末端部分におけるC−TAB.G5.1認識エピトープに対し
て生成された抗体とは異なり、トキソイド免疫化により誘導された抗体は、毒素分子のN
末端部分に特異的であり、これは抗毒素ELISAにおいて読み出された。したがって、
C−TAB.G5.1およびトキソイドA/Bで免疫化されたマウスにおいて生成された
抗毒素Aおよび抗毒素B抗体は、異なる特異性の抗体であり、したがって直接比較するこ
とはできない。しかしながら、データは、C−TAB.G5.1免疫化に対する抗体反応
が、トキソイドによる免疫化の場合と同様に著しく高いことを示している。さらに、毒素
負荷試験は、マウスを致死的負荷から保護するC−TAB.G5.1免疫化の能力が、ト
キソイドAおよびBの保護効果に匹敵することを実証した。図9は、C−TAB.G5.
1およびトキソイドA/Bの免疫原性の比較を示す。図10は、トキソイドA/Bで免疫
化されたマウスと比較して、C−TAB.G5.1で免疫化されたマウスに対する毒素中
和および保護データを示す。
実施例5.1:異なる免疫化計画におけるC−TAB.G5.1の抗体力価および保護効
果の比較。
B.G5.1の免疫原性および保護効果を比較するためのものであった。6〜7週齢の雌
C57BL/6マウス(Charles River Labs.)を本試験に使用した
。135匹のマウスを、14の群に分割した。群番号2〜13における全ての動物は、以
下に示す日に、右大腿筋または左大腿筋への筋肉内(IM)注射(50μl)により、3
回のワクチン接種を受けた。群1および8内のマウスは、ワクチン接種を受けず、陰性対
照として役立った。以下のように免疫化を行った。
を回収した。分析まで血清を−20℃で保存した。C−TAB、毒素Aおよび毒素Bに対
する血清抗体力価を、ELISAにより測定し、ELISA単位(EU)として報告した
。試験42日目に、毒素Aおよび毒素B中和抗体(TNA)を、細胞毒性量の組み換え毒
素Aおよび毒素Bで処理されたVero細胞を使用して決定した。
接種群(N=8)内の動物は、28ngの毒素Aまたは50ngの毒素Bの腹腔内(IP
)注射により致死的負荷を受けた。マウスの生存率をその後9日間にわたり監視した。
た全ての抗体力価が、全ての免疫計画において同等であるが、0/14/28の免疫化計
画が最良の免疫反応を示すことを実証している。第2のワクチン接種から2週間後に測定
された抗体力価を比較すると、0/14/28の免疫化計画が、0/7/21の免疫化計
画よりも良好であり、0/3/14の免疫化計画よりもはるかに良好である。本試験によ
り、抗原が水酸化アルミニウムと併用注射された場合、抗毒素A/B抗体力価が大幅に向
上することが確認された(データは示さず)。試験はまた、alumと共に2回のワクチ
ン投薬が2週間の間隔をおいて行われた場合でも、3回のワクチン投薬後に得られるレベ
ルに匹敵する高い抗体レベルを惹起し得ることを示している。
いて、0/3/14の免疫化計画よりもはるかに高い。
計画においてalumを必要としないが、0/3/14においては必要とする。alum
ありでの0/14/28の免疫化計画は、毒素B負荷に対して最も高いレベルの保護(8
7.5%)を誘導し、一方0/7/21の免疫化計画は、37.5%の保護を提供し、0
/3/14は、28.6%の保護を示す。本試験の結果を図20に示す。
実施例6:ハムスターにおける組み換えC−TAB.G5.1融合タンパク質の免疫原性
および保護効果の評価。
み換え融合タンパク質C−TAB.G5.1の免疫原性をさらに評価するためのものであ
った。
用した。全ての動物は、0日目に右大腿筋へのボーラス(50μl)筋肉内(IM)注射
による第1のワクチン接種を受けた。第2のワクチン接種は14日目に左大腿筋へのIM
注射により行われ、第3のワクチン接種は28日目にIM注射により行われた。ハムスタ
ーを群(N=6)に分割し、以下のようにワクチン接種した。
・群1:製剤緩衝液のみ
・群2:10μgのC−TAB.G5.1
・群3:10μgのC−TAB.G5.1+100μgのalum OH
・群4:30μgのC−TAB.G5.1
・群5:30μgのC−TAB.G5.1+100μgのalum OH
・群6:100μgのC−TAB.G5.1
・群7:100μgのC−TAB.G5.1+100μgのalum OH
・群10:製剤緩衝液のみ
・群11.10μgのC−TAB.G5.1
・群12.10μgのC−TAB.G5.1+100μgのalum OH
・群13.30μgのC−TAB.G5.1
・群14.30μgのC−TAB.G5.1+100μgのalum OH
・群15.100μgのC−TAB.G5.1
・群16.100μgのC−TAB.G5.1+100μgのalum OH
ン接種群(N=6)内の動物は、75ngの毒素Aまたは125ngの毒素Bの腹腔内(
IP)注射により致死的負荷を受けた。44日目に毒素Aまたは毒素B負荷の用量力価測
定にさらに12匹のハムスターを使用した。ハムスターの生存率をその後8日間にわたり
監視した。
目)、および第3の免疫化から2週間後(試験35日目)に、全ての動物から血液試料を
回収した。分析まで血清を−20℃で保存した。次いで、C−TAB、毒素Aおよび毒素
Bに対する血清抗体力価を、ELISAにより測定し、ELISA単位(EU)として報
告した。毒素Aおよび毒素B中和抗体(TNA)を、細胞毒性量の組み換え毒素Aおよび
毒素Bで処理されたVero細胞を使用して決定した。
的に反応することを実証した。C−TAB.G5.1を与えられた動物は、全ての試験さ
れた抗体力価において用量依存的な増加を示し、一方alumアジュバントは、C−TA
B.G5の全ての用量において抗体力価を大幅に改善した。最大の抗体力価は、第2の投
与から2週間後(試験28日目)に観察された。図11(A〜C)は、免疫化されたハム
スターの各群に対する抗体力価を示す。図12は、水酸化alumの存在下または非存在
下でのC−TAB.G5で免疫化されたハムスターにおける抗C−TAB抗体増加の反応
速度を示す。
と同様であり、ハムスターにおいてC−TAB.G5.1融合タンパク質に対して生成さ
れた抗体が、C.ディフィシル毒素Aおよび毒素Bの毒性作用の中和に効果的であること
を示している。
における保護データを示す。アジュバントの非存在下でのC−TAB.G5.1によるワ
クチン接種でも、高い保護が達成された。ワクチンにalumを添加することにより、保
護レベルは100%まで改善された。
実施例7:クリンダマイシン処理ハムスターにおけるC.ディフィシル芽胞負荷に対する
C−TAB.G5.1融合タンパク質の保護効果。
を生じる場合は、抗生物質関連下痢を引き起こし得る。人間のC.ディフィシル関連疾患
(CDAD)は、動物をコロニー形成、下痢および死亡し易くするために、通常は毒素産
生株での植菌から数日以内にクリンダマイシンを使用してハムスターにおいてモデル化さ
れる。C−TAB.G5.1ワクチン有効性を評価するために、ワクチン接種および非ワ
クチン接種ハムスターにクリンダマイシンおよびC.ディフィシル株630を負荷した。
100μgのC−TAB.G5.1を、125μgの水酸化alumアジュバントと混合
した。体重約100gの雌成体ハムスターが、0、14および28日目に筋肉内(IM)
注射により3回のワクチン接種を受けた。プラセボはPBSであった。48匹のハムスタ
ーを、以下のようにワクチン接種される8匹の群に分割した。
群1:PBSのみ+102芽胞負荷
群2:C−TAB.G5.1+102芽胞負荷
群3:PBSのみ+103芽胞負荷
群4:C−TAB.G5.1+102芽胞負荷
群5:PBSのみ+104芽胞負荷
群6:C−TAB.G5.1+104芽胞負荷
の経口投薬を受けた。43日目に、全ての群内の全ての動物に、C.ディフィシル株63
0の洗浄芽胞を強制経口投与により投薬した。3つのレベルの芽胞負荷を使用した(約1
02、103および104)。治療を行わずに観察を54日目まで継続した。試験の終了
時に、全ての生存動物は、5日間以上疾患を有さなかった。
試験のための血清を得た。1日目および42日目に、ハムスターの肛門から直接、または
必要に応じて寝床の中から糞便を回収した。
タは、Kaplan−Meier生存率適合曲線としてプロットし、統計分析はログラン
ク分析を使用して行った。全ての芽胞用量において、ワクチン接種群内のハムスターの1
00%生存率が観察され、プラセボ群と比較して生存率が有意に向上した:102芽胞で
p=0.0245、103芽胞でp=0.0006、104芽胞でp<0.0001。
実施例8:サルにおけるC−TAB.G5.1の免疫原性および保護効果。
るためのものであった。4歳から6歳の間の年齢および2kgから4kgの間の体重の6
匹の雌のカニクイザルを、本試験に使用した。3匹のサルの2つの群を準備し、第1の群
(群1)に200μgのC−TAB.G5.1を与え、第2の群(群2)に200μgの
C−TAB.G5.1および250μgのalumを与えた。alumアジュバントとし
て、Rehydragel(Reheis社、ロット#534401、PBS中で2mg
/mlに希釈)を使用した。血液採取または免疫化の前に、(必要に応じて)動物を剃毛
した。
2の免疫化(試験14日目)は右腕(三角筋)に施した。群1には、0.5ml 1×P
BS中の200μgのC−TAB.G5.1のみをIM注射により与え、群2には、0.
5ml 1×PBS中の200μgのC−TAB.G5.1および250μgのalum
をIM注射により与えた。
3mLの全血を血清分離管に採取した。血清試料を約−20℃で凍結した。次いで、EL
ISA法を使用して、抗C−TAB、抗毒素Aおよび抗毒素B IgG力価を評価した。
抗体力価は、ELISA単位(EU)で示された。
産生の増加をもたらし、一方alumの存在が抗体レベルを大幅に改善したことを示して
いる。最大抗体力価は、42日目の2回のワクチン接種において観察された。これらのデ
ータは、それを必要とする対象のワクチン接種のための組み換えC−TAB.G5または
C−TAB.G5.1融合タンパク質の使用の実現可能性を明確に示している。
実施例9:C−TAB.G5およびC−TAB.G5.1の免疫原性の比較。
ABが供給される2つの異なる緩衝液の効果を比較するためのものであった。8週から9
週齢の間のC57BL/6雌マウス(Charles River Labs.)を免疫
化に使用した。全ての動物は、0日目に右大腿筋への筋肉内(IM)注射(50μl)に
よる第1の免疫化を受けた。第2の免疫化は、14日目に左大腿筋へのIM注射により行
った。全部で72匹のマウスを、以下のようにワクチン接種された12の群に分割した。
群1:1μgのPBS中のC−TAB.G5
群2:3μgのPBS中のC−TAB.G5
群3:10μgのPBS中のC−TAB.G5
群4:30μgのPBS中のC−TAB.G5
群5:1μgのヒスチジン緩衝液中のC−TAB.G5
群6:3μgのヒスチジン緩衝液中のC−TAB.G5
群7:10μgのヒスチジン緩衝液中のC−TAB.G5
群8:30μgのヒスチジン緩衝液中のC−TAB.G5
群9:1μgのヒスチジン緩衝液中のC−TAB.G5.1
群10:3μgのヒスチジン緩衝液中のC−TAB.G5.1
群11:10μgのヒスチジン緩衝液中のC−TAB.G5.1
群12:30μgのヒスチジン緩衝液中のC−TAB.G5.1
分析まで血清を−20℃で保存した。C−TAB、毒素Aおよび毒素Bに対する血清抗体
力価を、ELISAにより測定し、ELISA単位として報告した。
チン製剤において1〜30μgの容量範囲にわたって有意に異ならなかったことを示して
いる(T−検定分析により明らかなように)。PBSと比較して、ヒスチジン緩衝液中の
C−TAB.G5製剤において、若干高い抗体産生が達成された。C−TAB.G5およ
びC−TAB.G5.1ヒスチジン製剤での免疫化の間では有意な差は観察されなかった
。したがって、本試験は、C−TAB.G5およびC−TAB.G5.1コンストラクト
の同等の免疫原性を実証した。
実施例10:代替C−TABNCTBおよびC−TADCTB融合タンパク質の調製およ
び評価。
メインの1つの部分およびCTBのC末端ドメインの2つの部分を含む2つの他の融合タ
ンパク質の調製について説明する。C−TABNCTB融合タンパク質(配列番号18)
は、C−TAB.G5と同様に、CTAの19反復単位(アミノ酸2272〜2710)
、CTBの23反復単位(アミノ酸1850〜2366)、およびCTBのC末端に融合
したCTBのさらなる追加的な10反復(アミノ酸1834〜2057)を含む。C−T
ADCTB融合タンパク質(配列番号20)は、C−TAB.G5配列(CTAの19反
復およびCTBの23反復)、ならびにC−TAB.G5のC末端に融合したCTBの追
加的な24反復単位(アミノ酸1834〜2366)を含む。したがって、C−TADC
TBは、CTBの反復単位の二重部分を含む。C−TABNCTBおよびC−TADCT
B遺伝子コンストラクトのクローニングは、実施例1.1に記載のものと同様の様式で行
った。組み換え融合タンパク質は、大腸菌細胞において発現され、実施例1.2に記載の
ような標準的手順を使用して精製した。単離ポリペプチドを、動物における免疫原性およ
び保護試験において評価した。
実施例10.1:マウスにおけるC−TAB.G5、C−TABNCTBおよびC−TA
DCTBの免疫原性および保護効果の比較。
C−TAB.G5、C−TABNCTBおよびC−TADCTBの免疫原性および保護効
果を比較するためのものであった。6〜7週齢の雌C57BL/6マウス(Charle
s River Labs.)を本試験に使用した。全ての動物は、2回のワクチン接種
を受け、第1のワクチン接種は、0日目に右大腿筋への筋肉内(IM)注射(50μl)
により行われた。第2のワクチン接種は、14日目に左大腿筋へのIM注射により行った
。全ての免疫化は、alumの非存在下で行った。第2の免疫化から2週間後(試験28
日目)に、血液試料を回収した。分析まで血清を−20℃で保存した。C−TAB、毒素
Aおよび毒素Bに対する血清抗体力価を、ELISAにより測定し、図17に示されるE
LISA単位(EU)として報告した。
C−TAB.G5が、極めて免疫原性であり、アジュバントを添加しなくても毒素Aおよ
び毒素Bの両方に対する強い抗体反応を誘導することができることを実証した。
TBおよびC−TABNCTB免疫化の能力を決定した。第2のワクチン接種から3週間
後(試験35日目)に、ワクチン接種および非ワクチン接種群(N=6)内の動物は、5
0ngの毒素Bの致死用量を腹腔内(IP)投与により受けた。マウスの生存率をその後
9日間にわたり監視したが、その結果を図18に示す。本実験は、alumの非存在下で
の33μgのC−TADCTBによるマウスの免疫化は、天然毒素Bによる致死的負荷に
対する100%の保護を付与することができるが、一方同じ用量のC−TAB.G5およ
びC−TABNCTBは、部分的な保護のみを誘導することを実証した。このデータは、
C−TAB.G5と同様に、2つの他の融合タンパク質C−TADCTBおよびC−TA
BNCTBが、天然毒素による致死的負荷に対して保護的となり得ることを示している。
実施例10.2:ハムスターにおけるC−TAB.G5.1およびC−TADCTBの免
疫原性および保護効果の比較。
された代替融合タンパク質C−TADCTBの免疫原性をさらに評価するためのものであ
った。
の水酸化alumの存在下または非存在下で、IM注射により3回ワクチン接種した(試
験0、14および28日目)。第3のワクチン接種から2週間後(試験42日目)に、全
ての動物は、75ngの毒素Aまたは125ngの毒素Bの腹腔内(IP)注射により致
死的負荷を受けた。試験14、28および35日目に血液試料を回収し、C−TAB、毒
素Aおよび毒素Bに対する血清抗体力価をELISAにより決定した。毒素Aおよび毒素
B中和抗体(TNA)を35日目の血清において測定した。ハムスターの生存率を監視し
、保護の%として報告した。
抗毒素抗体反応を誘導し得ることを実証した。alumアジュバントは、全ての試験され
た抗体力価を大幅に改善した。図19に示されるTNAアッセイの結果は、C−TADC
TBに対して生成された抗体が、C.ディフィシル毒素Aおよび毒素Bの毒性作用の中和
において効果的であることを示している。図19はまた、C−TAB.G5.1またはC
−TADCTBで免疫化されたハムスターに対する保護データの比較を示す。両方の組み
換え融合タンパク質でのワクチン接種により、高い保護が達成された。
実施例11:C−TAB.G5.1を含む薬学的組成物の安全性、免疫原性および用量反
応を評価する非盲検第1相試験
)3ありまたはなしで75μgおよび200μgで、筋肉内(IM)注射により、0、7
および21日目の3回のワクチン接種で投与される、C−TAB.G5.1、切断された
クロストリジウム・ディフィシル(C.ディフィシル)毒素Aおよび毒素Bからなる組み
換え融合タンパク質を含む薬学的組成物。
試験目的
主目的:
・第3のワクチン接種から6か月後までの、C−TAB.G5.1を含む薬学的組成物の
安全性および忍容性を調査すること。
副次的目的:
・最適な用量および製剤の第1の指標を得るための、第1のワクチン接種後0、7、14
、21、28、113、201日目における、3つの異なる用量および2種の製剤に対す
るワクチン抗原C−TAB.G5.1ならびにC.ディフィシルの天然毒素AおよびBに
対して測定される免疫反応を調査すること。
・C.ディフィシル毒素AおよびBをin vitroで中和するC−TAB.G5.1
ワクチン誘導IgG抗体の能力を調査すること。
試験デザイン
試験のパートBは、高齢集団における用量確定を探求するものである。したがって、パートBは、群当たり20名の高齢健常対象の5つの治療群において行う。0、7および21日目のワクチン接種スケジュールを適用する。本試験デザインにより、成人および高齢者の両方における用量反応の比較が可能となる。後者の年齢群は、C.ディフィシルワクチンの主要な標的集団であり、年齢に基づく、または年齢−リスクに基づく予防ワクチン接種手法において、C.ディフィシルワクチンの発達経路における2つの標的指標、すなわち再発性C.ディフィシル下痢の予防および原発性C.ディフィシル感染症の予防に対し最も脆弱な集団を示す。しかしながら、高齢対象は、若年成人よりもワクチン接種に対し反応性が低い可能性があり、したがって、早期発達段階からの高齢標的集団における用量確定が必要である。パートAからの全ての成人がワクチン接種された後の中間解析によって、高齢群内の対象を、ワクチンの潜在的に安全でない、または効果のない用量(例えば最低用量)および/または製剤(例えば非アジュバント製剤)に暴露するリスクを軽減するために、安全でない、または成人において有意なIgG反応を誘導しない用量/製剤を中止することができる。
C−TAB.G5.1ワクチンは、標準的方法により生成された、20mM L−ヒスチジン、75mM NaCl、5%スクロース、0.025% Tween(登録商標)80(pH6.5)中のC−TAB.G5.1の水溶液である。
配列:
好ましいポリペプチドおよびその使用:
1.配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
2.配列番号4に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
3.クロストリジウム・ディフィシルの毒素AのC末端ドメインから得られる19反復単位、およびクロストリジウム・ディフィシルの毒素BのC末端ドメインから得られる23反復単位を含む、態様1または2に記載の単離ポリペプチド。
4.配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する、態様1に記載の単離ポリペプチド。
5.配列番号4に記載のアミノ酸配列を有する、態様1に記載の単離ポリペプチド。
6.配列番号4に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
7.前記単離ポリペプチドをワクチン接種されたハムスターは、全ての芽胞用量(102、103および104)において、致死用量のC.ディフィシル芽胞の胃内投与に対し生存する、態様6に記載のポリペプチド。
8.クロストリジウム・ディフィシルの毒素AのC末端ドメインから得られる19反復単位を含む、態様6または7に記載のポリペプチド。
9.クロストリジウム・ディフィシルの毒素BのC末端ドメインから得られる23、33または47反復単位を含む、態様6から8のいずれか1つに記載のポリペプチド。
10.配列番号2、配列番号4、配列番号18、配列番号20および配列番号2、配列番号4、配列番号18または配列番号20のいずれかと95%、96%、97%、98%、99%同一であるポリペプチドからなる群から選択される、態様6から9のいずれか1つに記載のポリペプチド。
11.単離されている、態様6から10のいずれか1つに記載のポリペプチド。
12.医薬品における使用のための、態様6から11のいずれか1つに記載のポリペプチド。
13.CDADの予防および治療のための、態様6から11のいずれか1つに記載のポリペプチド。
14.CDADのリスクを有する対象におけるCDADの予防のための、態様6から11のいずれか1つに記載のポリペプチド。
15.CDADのリスクを有する対象におけるCDADの予防のための、態様6から11のいずれか1つに記載のポリペプチドであって、CDADのリスクを有する前記対象は、i)65歳を超える対象、もしくは2歳未満の対象;ii)AIDSを有する対象;iii)免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象;iv)入院の予定がある対象、もしくは入院している対象;v)集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vi)消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vii)養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象;viii)頻繁な、および/もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象;またはix)再発性CDADを有する対象である、ポリペプチド。
16.医薬品における使用のための医薬の製造のための、態様6から11のいずれか1つに記載のポリペプチドの使用。
17.CDADの予防および治療のための医薬の製造のための、態様6から11のいずれか1つに記載のポリペプチドの使用。
18.CDADのリスクを有する対象におけるCDADの予防のための医薬の製造のための、態様6から11のいずれか1つに記載のポリペプチドの使用。
19.CDADのリスクを有する対象におけるCDADの予防のための医薬の製造のための、態様6から11のいずれか1つに記載のポリペプチドの使用であって、CDADのリスクを有する前記対象は、i)65歳を超える対象、もしくは2歳未満の対象;ii)AIDSを有する対象;iii)免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象;iv)入院の予定がある対象、もしくは入院している対象;v)集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vi)消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vii)養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象;viii)頻繁な、および/もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象;またはix)再発性CDADを有する対象である、使用。
20.態様1から11のいずれか1つに記載のポリペプチドを含む、対象におけるC.ディフィシル感染を検出するための診断キット。
好ましい核酸:
1a.態様1から11のいずれか1つに記載のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
2a.態様1から11のいずれか1つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から本質的になる、態様1aに記載の核酸。
3a.配列番号1、配列番号3、配列番号17および配列番号19の群から選択されるヌクレオチド配列を含む、態様1aまたは2aに記載の核酸。
4a.配列番号1、配列番号3、配列番号17および配列番号19の群から選択されるヌクレオチド配列から本質的になる、態様1aまたは2aに記載の核酸。
好ましい薬学的組成物:
1c.態様1から11のいずれか1つに記載のポリペプチドまたは態様1aから4aのいずれか1つに記載の核酸、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物。
2c.C.ディフィシル毒素AおよびBの両方を中和する抗体を惹起する、態様1cに記載の薬学的組成物。
3c.C.ディフィシル毒素AおよびBに対する、対象における防御免疫反応を惹起する、態様1cまたは態様2cに記載の薬学的組成物。
4c.アジュバントをさらに含む、態様1cから3cのいずれか1つに記載の薬学的組成物。
5c.アジュバントが、alumを含む、態様4cに記載の薬学的組成物。
6c.追加的な抗原または薬物をさらに含む、態様1cから5cのいずれか1つに記載の薬学的組成物。
好ましい抗体:1d.態様1から11のいずれか1つに記載のポリペプチドに対する抗体であるが、C.ディフィシル毒素A(配列番号6)およびB(配列番号8)のいずれかまたは両方を認識しない抗体。
好ましい方法
1e.態様1から10のいずれか1つに記載のポリペプチドを生成するための方法であって、宿主細胞内に、ポリペプチドをコードする核酸を導入することと、ポリペプチドの発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養することと、ポリペプチドを単離することとを含む方法。
2e.宿主細胞は、大腸菌である、態様1eに記載の方法。
3e.対象におけるC.ディフィシル関連疾患(CDAD)を治療および/または予防する方法であって、それを必要とする対象に、態様1から11のいずれか1つに記載の単離ポリペプチドを投与することを含む方法。
4e.対象においてC.ディフィシルの毒素AおよびBの両方に対する特異的免疫反応を誘導する方法であって、態様1から11のいずれか1つに記載のポリペプチドを対象に、または態様1cから6cのいずれか1つに記載の薬学的組成物を投与することを含む方法。
5e.対象におけるC.ディフィシル感染により引き起こされる原発性疾患を予防する方法であって、態様1から11のいずれか1つに記載のポリペプチドを対象に、または態様1cから6cのいずれか1つに記載の薬学的組成物を投与することを含む方法。
6e.C.ディフィシル関連疾患(CDAD)のリスクを有する対象における C.ディフィシル感染により引き起こされる原発性疾患を予防する方法であって、CDADのリスクを有する前記対象は、i)65歳を超える対象、もしくは2歳未満の対象;ii)AIDSを有する対象;iii)免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象;iv)入院の予定がある対象、もしくは入院している対象;v)集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vi)消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vii)養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象;viii)頻繁な、および/もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象;またはix)再発性CDADを有する対象であり、前記方法は、態様1から11のいずれか1つに記載のポリペプチドを前記対象に、または態様1cから6cのいずれか1つの薬学的組成物を投与することを含む方法。 7e.ポリペプチドまたは薬学的組成物は、対象に、筋肉内、皮内、皮下、経口、経鼻、または経直腸投与、好ましくは筋肉内投与される、態様1eから6eのいずれか1つに記載の方法。
8e.ポリペプチドまたは薬学的組成物は、短い間隔(1週間毎または2週間毎)に少なくとも2回以内の投薬で対象に投与される、態様1eから7eのいずれか1つに記載の方法。
9e.生体試料中のC.ディフィシルを検出する方法であって、生体試料を態様1から11のいずれか1つに記載のポリペプチドと接触させることと、生体試料に対するポリペプチドの結合を検出することとを含み、ポリペプチドの結合は、生体試料中のC.ディフィシルの存在を示す方法。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
(構成1)
a)配列番号4に記載のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド、又は
b)配列番号4に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する単離ポリペプチドであって、クロストリジウム・ディフィシル毒素A及びBに対する免疫反応を誘導することができる、前記単離ポリペプチド
を含む、クロストリジウム・ディフィシル毒素A及びBに対する免疫反応を誘導するための、免疫原性組成物又はワクチン組成物。
(構成2)
前記ポリペプチドが、致死用量の10 2 、10 3 および10 4 のクロストリジウム・ディフィシル芽胞の胃内投与後における、前記単離ポリペプチドをワクチン接種されたハムスターの100%生存率をもたらす、構成1に記載の組成物。
(構成3)
前記ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシルの毒素AのC末端ドメインから得られる19反復単位を含む、構成1または2に記載の組成物。
(構成4)
前記ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシルの毒素BのC末端ドメインから得られる23反復単位を含む、構成1から3のいずれか一項に記載の組成物。
(構成5)
前記ポリペプチドが、配列番号4に対して少なくとも99%の配列同一性を有する、構成1から4のいずれか一項に記載の組成物。
(構成6)
アジュバントをさらに含む、構成1から5のいずれか一項に記載の組成物。
(構成7)
前記アジュバントがalumを含む、構成6記載の組成物。
(構成8)
C.ディフィシル関連疾患(CDAD)の予防および治療における使用のための、構成1から7のいずれか一項に記載の組成物。
(構成9)
CDADのリスクを有する対象におけるCDADの予防における使用のための、構成8記載の組成物。
(構成10)
CDADのリスクを有する前記対象は、i)65歳を超える対象、もしくは2歳未満の対象;ii)AIDSを有する対象;iii)免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象;iv)入院の予定がある対象、もしくは入院している対象;v)集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vi)消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vii)長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象;viii)頻繁な、および/もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象;またはix)再発性CDADを有する対象である、構成9記載の組成物。
(構成11)
C.ディフィシル関連疾患(CDAD)の予防および治療における使用のための単離ポリペプチドであって、
a)該単離ポリペプチドが、配列番号4に記載のアミノ酸配列を有するか、又は
b)該単離ポリペプチドが、配列番号4に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、かつ、配列番号4に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する該ポリペプチドが、クロストリジウム・ディフィシル毒素A及びBに対する免疫反応を誘導することができる、
前記単離ポリペプチド。
(構成12)
CDADのリスクを有する対象におけるCDADの予防における使用のための、構成11記載のポリペプチド。
(構成13)
CDADのリスクを有する前記対象は、i)65歳を超える対象、もしくは2歳未満の対象;ii)AIDSを有する対象;iii)免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象;iv)入院の予定がある対象、もしくは入院している対象;v)集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vi)消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vii)長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象;viii)頻繁な、および/もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象;またはix)再発性CDADを有する対象である、構成12記載のポリペプチド。
Claims (8)
- 配列番号4に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する単離ポリペプチドであって、クロストリジウム・ディフィシルの毒素BのC末端ドメインから得られる23反復単位を含み、かつ、天然クロストリジウム・ディフィシル毒素A及び/またはBに対する中和抗体を生じさせることができる、前記単離ポリペプチド。
- クロストリジウム・ディフィシルの毒素AのC末端ドメインから得られる19反復単位を含む、請求項1記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドをワクチン接種された動物の、クロストリジウム・ディフィシル感染に対する保護をもたらすことができる、請求項1〜2のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む、クロストリジウム・ディフィシル毒素A及びBに対する免疫反応を誘導するための免疫原性組成物。
- クロストリジウム・ディフィシル関連疾患(CDAD)の予防及び/または治療において使用するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、請求項4記載の免疫原性組成物。
- CDADのリスクを有する対象におけるCDADの予防であって、前記対象が、i)高齢対象(65歳超)、もしくは2歳未満の対象;ii)AIDSを有する対象;iii)免疫抑制薬を投与されている、もしくは投与される予定がある対象;iv)入院の予定がある対象、もしくは入院している対象;v)集中治療を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vi)消化管手術を受けている、もしくは受ける予定がある対象;vii)養護施設等の長期介護を受けている、もしくは受ける予定がある対象;viii)頻繁な、および/もしくは長期的な抗生物質の使用を必要とする共存症を有する対象;またはix)再発性CDADを有する対象である前記予防において使用するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、請求項4記載の免疫原性組成物。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、請求項4記載の免疫原性組成物を製造するための方法であって、宿主細胞内に、前記ポリペプチドをコードする核酸を導入することと、前記ポリペプチドの発現を可能とする条件下で前記宿主細胞を培養することと、前記ポリペプチドを単離することとを含む、前記方法。
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