CN104321335A

CN104321335A - 菌毛蛋白质和组合物

Info

Publication number: CN104321335A
Application number: CN201380010739.4A
Authority: CN
Inventors: D·迈文; R·柯兹; C·D·日努阿多; M·拉扎林; F·泽尔比尼; I·马格里特伊若斯
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2013-02-23
Publication date: 2015-01-28
Also published as: RU2014138418A; EP2817320A1; AU2013224026A1; WO2013124473A1; JP2015509713A; US20150273042A1; MX2014010011A; CA2865028A1

Abstract

本发明提供体外形成菌毛的方法和适用于这些方法的蛋白质。本发明还提供由这些方法产生的菌毛和包含这些菌毛的用于治疗和预防细菌疾病的组合物，尤其是由链球菌(Streptococcus)引起的病症。

Description

菌毛蛋白质和组合物

技术领域

本发明提供体外形成菌毛的方法，和适用于这些方法的突变分选酶和蛋白质。本发明还提供由这些方法产生的菌毛和包含这些菌毛的用于治疗和预防细菌疾病的组合物，尤其是由链球菌(Streptococcus)引起的病症。本发明还提供用于相同应用的连接蛋白(ligating protein)和分选酶的一般方法。

背景技术

大多数细菌病原体包含菌毛(也称作纤毛)，菌毛是从其表面伸出的长细丝状结构，该结构常与宿主定殖过程中细菌对组织的初始粘附有关。所知已久，革兰氏阴性细菌有菌毛，其通常由菌毛蛋白亚基之间的非共价相互作用形成。近期，革兰氏阳性细菌，包括链球菌属(Streptococcus)细菌，也已显示具有菌毛，所述菌毛通常由分选酶通过亚基共价连接形成，所述分选酶由菌毛特异性毒力岛(pathogenicity island)编码。

例如，革兰氏阳性细菌无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(或“B组链球菌”，缩写为“GBS”)，具有三种菌毛变体，其各自由不同毒力岛PI-1、PI-2a或PI-2b编码[1,2]。各毒力岛如下组成：i)编码菌毛三种结构成分(菌毛骨架蛋白(BP)和两种辅助蛋白(AP1和AP2))的基因；和ii)编码两种分选酶蛋白(SrtC1和SrtC2)的基因，所述分选酶蛋白涉及菌毛组装。所有GBS菌株携带这三种毒力岛中至少一种。

相似的毒力岛存在于其它革兰氏阳性细菌中，包括酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)或“A组链球菌”，缩写为(“GAS”)，和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(也称作肺炎球菌)。肺炎球菌中的毒力岛编码菌毛的三种结构成分(RrgA、RrgB和RrgC)和三种分选酶(SrtC1、SrtC2和SrtC3)，所述分选酶催化菌毛形成。GAS中，FCT区编码主链和辅助蛋白，而这些蛋白质的聚合也由分选酶(SrtC1)介导。

认为这些革兰氏阳性细菌中的菌毛结构是感兴趣的疫苗候选物，并且已有工作评估了纯化的来自菌毛结构的重组蛋白质的免疫原性。还希望以其在组装菌毛中的天然形式研究这些蛋白质，但是目前进行该工作的唯一途径是通过辛苦操作从细菌纯化野生型菌毛。因此，本发明的一个目的是提供用于体外产生重组菌毛而无需纯化野生型菌毛的方法。

上文讨论的链球菌细菌与一系列疾病相关联。GBS导致免疫力低下个体和新生儿中菌血症和脑膜炎。GAS是常见的人病原体，估计其存在于5～15％的正常个体中而不显示疾病病征。然而，当宿主抵抗力下降或当GAS引入脆弱组织或宿主时，出现急性感染。由GAS引起的疾病包括产褥热、猩红热、丹毒、咽炎、脓疱病、坏死性筋膜炎、肌炎和链球菌中毒性休克综合征。肺炎球菌是成年人和五岁以上儿童的急性细菌性脑膜炎的最常见病因。

已经进行研究开发针对这些肺炎球菌的蛋白质型疫苗，但目前没有市售可得的蛋白质型疫苗。因此仍需要针对肺炎球菌感染的有效疫苗。本发明的另一个目的是提供免疫原性组合物，其可用于开发针对肺炎球菌感染的疫苗。

发明内容

在本发明的第一方面，提供连接至少两个部分的方法，所述方法包括在适合发生分选酶介导的转肽作用反应的条件下使所述至少两个部分与菌毛相关的分选酶C酶在体外接触，其中所述菌毛相关的分选酶C酶包含暴露的活性位点。

具体而言，所述菌毛相关分选酶C酶来自链球菌，更具体地，来自无乳链球菌(GBS)、肺炎链球菌(肺炎球菌)和酿脓链球菌(GAS)。更具体地，所述菌毛相关分选酶C酶是分选酶C1酶(srtC1)、分选酶C2酶(SrtC2)或分选酶C3酶(SrtC3)。

在某些实施方式中，所述菌毛相关分选酶C酶突变包含盖(lid)的部分或全部缺失。具体而言，所述突变包括GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ IDNO:3)的第84、85和/或86位氨基酸缺失，或另一种菌毛相关分选酶C酶的氨基酸序列中相应位置处的氨基酸缺失。

具体而言，所述突变包括GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ IDNO:3)的第84、85和/或86位氨基酸取代，或另一种分选酶C酶的氨基酸序列中相应位置处的氨基酸取代。

具体而言，菌毛相关分选酶C酶包含或由选自下组的氨基酸序列组成：SEQID NO:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和71。

在本发明的一个实施方式中，所述方法是体外形成重组菌毛或人造菌毛的方法。所述至少两个部分包含LPxTG基序和菌毛素基序。例如，所述菌毛素基序可包含氨基酸YPAN。本文公开的任何分选酶识别基序中的“X”可以是任何标准或非标准的氨基酸，并且公开每种变化形式。在一些实施方式中，X选自在活生物体中发现的蛋白质中最常见的20种标准氨基酸。当识别基序是LPXTG或LPXT时，X可以是D、E、A、N、Q、K或R。具体而言，X选自LPXTG或LPXT基序中的K、S、E、L、A、N。

特别地，所述至少两个部分来自革兰氏阳性细菌。所述至少两个部分可来自革兰氏阳性细菌的相同菌株或类型，或来自革兰氏阳性细菌的不同菌株或类型。而更具体地，所述至少两个部分是链球菌多肽。另外更具体地，所述至少两个部分是链球菌骨架蛋白和/或辅助蛋白。

例如，所述至少两个部分包含或由如下氨基酸序列组成：(a)与具有SEQ IDNO:72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97中任一氨基酸序列的多肽具有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)的氨基酸序列；或(b)是这些序列之一的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是20或更大(例如，25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150或更大；例如，20或更大；或例如50或更大；或例如80或更大)。

在本发明的其它方面，提供从或可从前述方法获得的人造菌毛或重组菌毛。在一个实施方式中，提供包含骨架蛋白GBS59的至少两个变体的人造菌毛或重组菌毛。具体地，所述至少两个变体选自B组链球菌菌株2603、H36B、515、CJB111、CJB110和DK21。而更具体地是，所述人造菌毛或重组菌毛是嵌合菌毛，所述嵌合菌毛包含选自链球菌菌株2603、H36B、515、CJB111、CJB110和DK21的GBS骨架蛋白GBS59的至少一个变体，和选自下组RrgA、RrgB和RrgC的肺炎链球菌的至少一种骨架蛋白。在其它实施方式中，人造菌毛和重组菌毛还包含GBS80和/或GBS1523。

在本发明的特点方面中，所述人造菌毛或重组菌毛用于药物，而更具体地是用于预防或治疗链球菌感染。因此，在另一个实施方式中，提供治疗或预防有需要的患者中的链球菌感染的方法，所述方法包括给予患者有效量的通过本发明方法形成的人造菌毛或重组菌毛。

在本发明的第二方面，提供一种方法，其中所述至少两个部分包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含氨基酸基序LPXTG(其中X是任何氨基酸)，所述第二部分包含至少一个氨基酸。

特定地，所述第一部分是第一多肽，而所述第二部分是第二多肽。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽来自革兰氏阳性细菌。例如，所述第一多肽和第二多肽可来自革兰氏阳性细菌的相同类型或菌株，或来自革兰氏阳性细菌的不同类型或菌株。在一些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽是链球菌多肽。例如，所述第一多肽和第二多肽可以是链球菌骨架蛋白和/或辅助蛋白。

在本发明的一些实施方式中，第一部分或第二部分包含可检测标记物。通过非限制性示例，所述可检测标记物可以是荧光标记物、放射性标记物、化学发光标记物、磷光标记物、生物素标记物或链霉亲和素标记物。在一些实施方式中，所述第一部分或第二部分可以是多肽，而其它部分可以是细胞表面上的蛋白质或糖蛋白。在另一个实施方式中，所述第一部分或第二部分是多肽，而其它部分包含偶联至固体支持物的氨基酸。在另一个实施方式中，所述第一部分或第二部分是多肽，而其它部分包含偶联至多核苷酸的至少一个氨基酸。

本发明的方法可用于将第一部分的N末端连接至第二部分的N末端。本发明的方法可用于将第一部分的C末端连接至第二部分的C末端。或者，所述第一部分和第二部分是某一部分(例如多肽链)的N末端和C末端，且连接导致形成环状多肽。因此，提供由本文所述方法获得或可获得的偶联物。

在本发明的其它方面中，提供一种药盒，所述药盒包含来自无乳链球菌的分选酶C1或分选酶C2酶，以及包含氨基酸基序LPXTG的部分(其中X是任何氨基酸)。

在本发明的另一个方面，提供来自链球菌的在其盖区域包含突变的分选酶C酶，由其是来自链球菌的分选酶C酶，所述链球菌来自无乳链球菌(GBS)、肺炎链球菌(肺炎球菌)或酿脓链球菌(GAS)。更具体地，提供来自链球菌的分选酶C酶，其中所述来自链球菌的分选酶C酶是分选酶C1酶、分选酶C2酶或分选酶C3酶。在某些实施方式中，提供来自链球菌的分选酶C酶，其中所述突变包括所述分选酶C酶的盖区域的部分或全部缺失。具体而言，所述突变包括GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第84、85和/或86位氨基酸缺失，或另一种分选酶C酶的氨基酸序列中相应位置处的氨基酸缺失。在其它实施方式中，提供来自链球菌的分选酶C酶，其中所述突变包括GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第84、85和/或86位氨基酸的取代，或另一种分选酶C酶的氨基酸序列中相应位置处的氨基酸取代。

具体而言，提供来自链球菌的在其盖区域中包含突变的分选酶C酶，并且其中所述分选酶C酶包含或由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或71。

附图说明

图1：GBS分选酶C的序列的比对显示盖区域的位置(以加粗和下划线表示)。

图2：肺炎链球菌和酿脓链球菌(GAS)分选酶C的序列的比对显示盖区域的位置(以加粗和下划线表示)。

图3：A：在GBS菌毛2a(BP-2a)、GBS59(菌株515,TIGR注释SAL_1486)的骨架蛋白中鉴定的保守氨基酸基序。菌毛素基序：包含高度保守的赖氨酸残基(Lys189)；E-box：包含高度保守的谷氨酸残基(Glu589)；分选信号：包含位于第641-646位的残基IPQTGG。B:采用识别GBS菌毛2a(α-BP)的骨架蛋白的抗体进行免疫印迹，显示菌BP-2a的菌毛素基序的Lys189是通过野生型分选酶C的菌毛聚合所需的。生成编码突变型BP-2a的质粒，该突变型BP-2a携带Lys189由Ala取代的突变(BP_K189A)。缺失骨架蛋白的GBS突变型菌株(GBS_ΔBP)用该质粒转化(泳道2)，或用编码野生型BP-2a(BP_WT)的对照质粒转化(泳道1)。星号指示对应于单体的、未聚合化的BP-2a蛋白的蛋白质条带的位置。对应于聚合化的BP-2a的高分子量蛋白质条带仅能在用编码野生型BP-2a的质粒转染的GBS的细胞提取物中检测到(泳道1)。C:采用识别GBS菌毛2a的骨架蛋白(α-BP)的抗体(泳道1、2和3)或识别GBS菌毛2a的辅助蛋白(α-AP1)的抗体(泳道4和5)进行免疫印迹，显示BP-2a的IPQTG基序是菌毛聚合所需的。生成编码突变型BP-2a的质粒，所述突变型BP-2a携带IPQTG分选信号缺失的突变(BP_ΔIPQTG)。缺失骨架蛋白的GBS突变菌株(GBS_ΔBP)用该质粒转化(泳道3和4)。采用编码野生型BP-2a的对照质粒(BP_WT)(泳道1)或无质粒(ΔBP)(泳道2和5)作为对照。星号指示对应于单体的、未聚合化的BP-2a蛋白的蛋白质条带的位置。三角形指示对应于单体AP1蛋白的蛋白质条带。方框指示对应于BP-2a–AP1偶联物的蛋白质条带。对应于聚合化的BP-2a的高分子量蛋白质条带仅能在用编码野生型BP-2a的质粒转染的GBS的细胞提取物中检测到。

图4：A：蛋白质凝胶显示，野生型GBS分选酶无法催化野生型骨架蛋白的体外聚合。使不同浓度的重组骨架蛋白(BP)(25、100和200μM)与PI-2a的野生型分选酶C1(SrtC1_WT)在37℃孵育0、24和48小时。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离反应混合物中包含的蛋白质，并对其进行观察。未检测到对应于聚合化BP的高分子量条带的形成。星号指示单体BP。井号指示SrtC1_WT。泳道1：BP 25μM+SrtC1_WT t0，泳道2：BP 25μM+SrtC1_WT t24h，泳道3：BP 25μM+SrtC1_WT t48h，泳道4：BP 100μM+SrtC1_WT t0，泳道5：BP100μM+SrtC1_WT t24，泳道6：BP 100μM+SrtC1_WT t48h；泳道7：BP200μM+SrtC1_WT t0，泳道8：BP 200μM+SrtC1_WT t24。B:蛋白质凝胶显示，野生型骨架蛋白(BP)能够在无催化分选酶活性存在下形成BP-BP同源二聚体，这解释了图A中观察到的额外条带。使不同浓度的重组BP(25和100μM)孵育0、24、48和72小时，并通过SDS-PAGE观察反应混合物中包含的蛋白质。泳道1：BP25μM t0h，泳道2：BP 25μM t24h，泳道3：BP 25μM t48h，泳道4：BP 25μM t72；泳道5：BP 100μM t0h，泳道6：BP 100μM t24h，泳道7：BP 100μM t48h，泳道8：BP 100μM t72h。

图5：A：蛋白质凝胶显示，在盖区域携带突变的突变型GBS分选酶能够体外催化野生型骨架蛋白(BP)的聚合。使不同浓度的重组蛋白BP(100和200μM)与携带第86位酪氨酸被丙氨酸取代的PI-2a的突变型分选酶C1(SrtC1_Y86A)孵育0、24或48小时，并使通过SDS-PAGE观察反应混合物中包含的蛋白质。星号指示单体BP。在孵育24或48小时之后，能检测到对应于聚合化BP的高分子量条带(≥260kDa)。泳道1：BP 100μM+SrtC1_Y86A t0h，泳道2：BP 100μM+SrtC1_Y86A t24h，泳道3：BP 100μM+SrtC1_Y86A t48h；泳道4：BP 200μM+SrtC1_Y86A t0h，泳道5：BP 200μM+SrtC1_Y86A t24h。B:采用识别GBS菌毛2a的骨架蛋白(αBP)的抗体进行免疫印迹，显示聚合化BP的图案与来自野生型细菌(本文中是GBS菌株515)的菌毛中所含的BP聚合物类似。星号指示单体BP。泳道1：BP，泳道2：SrtC1_Y86A，泳道3：BP+SrtC1_Y86A，泳道4：GBS515野生型菌毛。C:蛋白质凝胶显示不同浓度的SrtC1_Y86A对BP聚合化效率的影响。使10、50或100μM的SrtC1_Y86A与BP混合并孵育0小时、48小时、3和4天，然后通过SDS-PAGE观察反应混合物中包含的蛋白质。星号指示单体BP。D:蛋白质凝胶显示不同浓度的BP对BP聚合化效率的影响。使25、50或100μM的BP与25μM的SrtC1_Y86A混合并孵育0小时、3天、5天和7天，然后通过SDS-PAGE观察反应混合物中包含的蛋白质。星号指示单体BP。

图6：蛋白质凝胶显示，能够成功纯化体外聚合的菌毛结构。使25μM的SrtC1_Y86A与100μM的BP-2a在37℃孵育7天。通过尺寸排阻色谱将所述混合物中包含的蛋白质分成多个部分，并通过SDS-PAGE观察。包含纯化的聚合化BP的高分子量部分率先洗脱(白色方框)，然后是单体BP(星号)和SrtC1_Y86A(叉号)。

图7：蛋白质凝胶显示突变型分选酶聚合来自不同革兰氏阳性细菌的菌毛蛋白。A：使25μM的SrtC1_Y86A(GBS PI-2a分选酶C1)与100μM的GBS的骨架蛋白PI-1(也称作GBS 80)在37℃孵育7天，并通过SDS-PAGE观察反应混合物中包含的蛋白质。使单独SrtC1_Y86A或GBS 80在相同条件下孵育，作为对照。星号指示单体BP。泳道1：SrtC1_Y86A，泳道2：BP PI-1，泳道3：SrtC1_Y86A+BP PI-1。B:使25μM的SrtC1_Y86A(GBS PI-2a分选酶C1)与50或100μM的来自肺炎链球菌的菌毛蛋白(也称作RrgB)在37℃孵育3天，并通过SDS-PAGE观察反应混合物中包含的蛋白质。使单独SrtC1_Y86A或RrgB在相同条件下孵育，作为对照。星号指示单体RrgB。泳道1：SrtC1_Y86A，泳道2：RrgB，泳道3：SrtC1_Y86A+RrgB(50μM)，泳道4：SrtC1_Y86A+RrgB(100μM)。

图8：来自GBS菌株515的PI-2a和来自GBS菌株A909的PI-2b的同源性SrtC1分选酶的成对序列比对。催化性三位密码子(单线下划线)是保守的，而经典盖基序(双线下划线)不存在于PI-2b SrtC1中。作为替代的是看起来模拟盖功能的色氨酸。

图9：来自PI-2b(SAK_1437)的SrtC2分选酶和来自PI-2a(SAL_1484)的SrtC1分选酶的成对比对。SrtC2缺失盖序列(方框中突出显示)和C末端跨膜结构域。PI-2b SrtC2序列中存在三个半胱氨酸残基(叉号标记)。

图10：来自源自GBS 515的突变菌株(其中PI-2a岛缺失(515Δ2a))的培养物的总蛋白质提取物和来自补充有含SrtC1和BP基因或单独BP基因的野生型A909菌株的总蛋白质提取物的Western印迹。采用针对BP的抗体。高分子量信号指示补充菌株中的菌毛聚合化。M：标志物；泳道1：515Δ2a；泳道2：515Δ2a+BP；泳道3：515Δ2a+BP+SrtC1；泳道4：515Δ2a+BP+SrtC1；泳道5：A909+BP；泳道6：A909+BP+SrtC1。

图11：聚合化反应的SDS-PAGE。泳道1：SrtC1Y86A+BP-2a-515；泳道2：SrtC1Y86A+BP-2a-H36B；泳道3：SrtC1Y86A+BP-2a-CJB111；泳道4：标志物；泳道5：SrtC1Y86A+BP-2a-515-H36B-CJB111。

图12A：针对BP-1的多克隆抗体的Western印迹。泳道1：SrtC1Y86A；泳道2：BP-2a-515变体；泳道3：BP-2a-H36B变体；泳道4：BP-1；泳道5：RrgB；泳道6：SrtC1Y86A+BP-1；泳道7：SrtC1Y86A+BP-2a-515+BP-1；泳道8：SrtC1Y86A+BP-2a-H36B+BP-1；泳道9：SrtC1Y86A+RrgB；泳道10：SrtC1Y86A+BP-2a-515+RrgB；泳道11：SrtC1Y86A+BP-2a-H36B+RrgB。

图12B：采用针对RrgB的多克隆抗体的Western印迹。泳道1：SrtC1Y86A；泳道2：BP-2a-515变体；泳道3：BP-2a-H36B变体；泳道4：BP-1；泳道5：RrgB；泳道6：SrtC1Y86A+BP-1；泳道7：SrtC1Y86A+BP-2a-515+BP-1；泳道8：SrtC1Y86A+BP-2a-H36B+BP-1；泳道9：SrtC1Y86A+RrgB；泳道10：SrtC1Y86A+BP-2a-515+RrgB；泳道11：SrtC1Y86A+BP-2a-H36B+RrgB。

图13：突变型SrtC能够聚合用IPQTG序列标记的绿色荧光蛋白(GFP)。

图14A：LPXTG基序是体外菌毛聚合所必需的。37℃下孵育T0、48和72小时，SrtC1Y86A和重组BP-2aΔIPQTG之间的反应进行。SrtC1Y86A和BP-2aΔIPQTG的浓度分别固定在25μM和100μM。没有鉴定出高分子量图案的形成，显示LPXTG样基序是BP聚合化所必需的。单独孵育SrtC1Y86A(左侧)和BP-2aΔIPQTG(右侧)作为对照。

图14B：菌毛素基序的赖氨酸不是体外菌毛聚合化所必需的。使SrtC1Y86A(25μM)和重组BP-2a K189A(100μM)在37℃混合，并通过SDS-PAGE分析不同时间点的(0、48h和72h)反应。能鉴定出高分子量图案，显示SrtC1Y86A利用与赖氨酸189不同的亲核体。

图14C：当SrtC1Y86A与辅助蛋白(AP1-2a和AP2-2a)的重组形式混合时，其仅在BP-2a蛋白存在下能够被体内聚合(数据未显示)，形成一些HMW结构。这些数据证明，SrtC1Y86A能利用不同的亲核体来分解所述酶和LPXTG-样分选信号之间的酰基-中间物。

发明详述

对于革兰氏阳性细菌中的菌毛相关C-分选酶的结构研究已证明这些酶中有许多酶的活性位点包含催化性三联氨基酸，其在底物不存在时被活动“盖”区域覆盖。因此，菌毛相关的分选酶的特征是：存在盖，该盖不仅阻止对活性位点的接触(即，其包封活性位点)，还携带两个关键残基(通常是Asp和疏水氨基酸)，其在催化缝隙本身内部相互作用，被称作“锚定子(anchor)”。一般而言，能够在迄今表征的所有菌毛相关的分选酶中鉴定出对应于盖区域的序列。具体而言，已证明该盖结构存在于来自GBS PI-1、PI-2a和PI-2b的分选酶C1酶中[3]，存在于来自肺炎链球菌的分选酶C1、分选酶C2和分选酶C3酶中f[4,5]，并且存在于来自GAS的分选酶C1酶中。已显示来自GBS PI-2a的分选酶C1酶中的盖区域的突变对互补研究[3]中的菌毛生成无负面作用，但至今尚无关于突变型分选酶体外聚合蛋白质的能力进行的研究。

发明人现已发现分选酶C酶能够比野生型分选酶C酶更有效地体外聚合蛋白质，例如，导致产生重组菌毛。野生型分选酶C酶包含“活动盖”区域，该区域在底物不存在时以紧密构象包封活性位点。例如，SrtC1的盖涵盖3个残基，Asp84、Pro85和Tyr86，其与活性位点和周围的残基相互作用。因此，分选酶C酶在体外无活性，并且无法使部分(例如菌毛素骨架和辅助蛋白)连接或聚合。发明人现已发现，通过使盖区域突变，能够暴露该催化位点，从而使这些突变的酶具有体外活性。如下文讨论，并且令人吃惊的是，这些突变的酶比其野生型对应物更具活性，并且更令人吃惊的是，其能够识别更广范围的氨基酸。具体而言，本发明的突变的酶具有或包含暴露的催化位点，该位点不被“盖”包封，并且可用于催化转肽反应来体外形成酰基酶中间物。

因此，本发明的方法可用于产生人造菌毛或重组菌毛而无需常用的费力的纯化操作。令人吃惊的是，这些突变型分选酶C酶还能用于聚合来自不同来源(例如革兰氏阳性细菌)的蛋白质，不只是源自与突变型分选酶C酶本身来源相同细菌的蛋白质。此外，由这些方法获得的菌毛具有免疫原性，并且可用于开发治疗或预防由革兰氏阳性细菌所引起的疾病的疫苗，其中所述菌毛的组成蛋白来自该革兰氏阳性细菌。

菌毛中的一些菌毛素亚基包含自然形成的蛋白内异肽键，这可能使该菌毛结构稳定。因此，在关于疫苗的内容中，用模拟侵入/感染过程中免疫系统遇到的那些菌毛的人造菌毛或重组菌毛结构形式的蛋白质免疫对象可能还有用于存在其它表位(例如基于三位结构的结构或构象表位)的情况。当菌毛蛋白在包含分离的纯化形式的组合物中或以偶联物(例如糖复合物)形式提供时，此类结构或构象表位可能不存在于亚单位疫苗中。因此，聚合的菌毛蛋白可能包含无法由单独蛋白质的结构预测的三维表位。

突变型分选酶C酶

本发明方法中所用的突变型分选酶C酶源自来自链球菌的野生型分选酶C酶。所述突变型分选酶C酶可以，例如，源自来自无乳链球菌(GBS)、肺炎链球菌(肺炎球菌)或酿脓链球菌(GAS)的野生型分选酶C酶。所述突变型分选酶C酶可能源自分选酶C1酶、分选酶C2酶或分选酶C3酶。突变型分选酶C酶源自包含盖区域的野生型链球菌分选酶C酶。所述盖区域是约15～18个氨基酸的环形区域，其在底物不存在时覆盖分选酶C酶的活性位点中发现的催化性三联氨基酸。所述盖区域位于分选酶C酶的可溶性核心结构域中，位于该酶N末端处的信号肽和跨膜(TM)区与该酶C末端的带正电结构域之间。不同野生型链球菌分选酶C酶中的盖区域的位置总结于下表。这些序列全部是野生型序列，其包含N末端信号肽。

表1：链球菌分选酶中盖区域的位置

技术人员通过结构分析或更简单地通过用表1所示具有已知位置处的盖区域的链球菌蛋白质的序列与其它链球菌分选酶C酶的序列比对，能够容易地确定这些酶中盖区域的位置。图1提供GBS分选酶C酶的比对，其中突出显示盖区域位置。图2提供来自GAS和肺炎球菌的分选酶C酶的相似比对。这些图中所示的具有盖区域的任何分选酶C酶均可用于本发明方法。

用于本发明方法的来自链球菌的分选酶C酶在其盖区域中包含突变。所述突变可以是突变型分选酶C酶相对于野生型分选酶C酶的氨基酸序列的盖区域氨基酸序列中的取代、缺失或插入。

缺失突变体

当突变是缺失时，所述突变可包含野生型分选酶C酶的盖区域的部分或全部缺失。所述盖区域通常长约15～18个氨基酸，并且所述突变可包含所述盖区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或更多氨基酸缺失，或所述盖区域的全部氨基酸缺失。

所述突变可包含预计与所述分选酶C酶活性位点中的催化性三联体相互反应的位置处的氨基酸的缺失。例如，所述突变可包括GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第84、85和/或86位氨基酸缺失，或其它分选酶C酶的氨基酸序列中相应位置处的氨基酸缺失。因此，所述突变可包含如下部分的缺失：GBS PI-2a分选酶C酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的i)第84位氨基酸；ii)第85位氨基酸；iii)第86位氨基酸；iv)第84和85位的两个氨基酸；v)第84和86的两个氨基酸；vi)第85和86位的两个氨基酸；或vii)第84、85和86位的三个氨基酸，或者是其它分选酶C酶的氨基酸序列中相应位置上的氨基酸的缺失。对应GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第84、85和86位的位置的氨基酸能容易地通过比对确定。

发现对应GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第84、85和86位的位置的氨基酸分别在：

-GBS PI-1分选酶C1(SEQ ID NO:1)的第90、91和92位，

-GBS PI-1分选酶C2(SEQ ID NO:2)的第84、85和86位，

-GBS PI-2a分选酶C2(SEQ ID NO:4)的第88、89和90位，

-GBS PI-2b分选酶C1(SEQ ID NO:5)的第53、54和55位，

-肺炎球菌分选酶C1(SEQ ID NO:6)的第58、59和60位，

-肺炎球菌分选酶C2(SEQ ID NO:7)的第50、51和52位，

-肺炎球菌分选酶C3(SEQ ID NO:8)的第74、75和76位，或

-GAS分选酶C1(SEQ ID NO:9)的第46、47和48位。

或者，所述突变可包含盖区域所有氨基酸的缺失。所述缺失还可包含在剩余分选酶序列中的位置处的缺失。例如，所述分选酶可包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个其它氨基酸位置处的取代、缺失或插入。通过另一个示例，所述分选酶可包含在少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个其它氨基酸位置处或其间任何范围的取代、缺失或插入。

具体而言，所述突变可额外包含野生型分选酶C酶的信号肽和/或跨膜结构域的部分或全部的缺失，其在野生型酶中盖区域的N末端。所述跨膜结构域包含两个α螺旋。所述突变可包含这两个α螺旋的之一或两者的缺失，任选地，还可包含跨膜结构域的信号肽N末端的缺失。例如，所述突变可包含盖区域的部分或全部缺失，以及盖区域的N末端的10、20、30、40、50、60、70、80、90个或更多个氨基酸的缺失。通过进一步示例，所述突变可包含盖区域的部分或全部缺失，以及盖区域的N末端的少于10、20、30、40、50、60、70、80、90个氨基酸或其间任何范围的缺失。在一些实施方式中，所述突变包含盖区域中的全部氨基酸和盖区域N末端的全部氨基酸缺失。因此，本发明的该实施方式中的分选酶C酶由野生型分选酶C酶的C末端/带正电的结构域组成。

在没有任何其它突变存在的情况下，所述突变可由上述缺失组成。例如，在没有任何其它突变存在的情况下，所述突变可由盖区域的部分或全部缺失、盖区域和信号肽和/或跨膜结构域的部分或全部缺失，或盖区域和整个N末端区域的部分或全部缺失组成。适合用于本发明方法的分选酶C酶序列的示例示于下表2，其中突变如下组成：a)盖区域和信号肽/跨膜结构域全部缺失，b)盖区域和整个N末端区域全部缺失，和c)信号肽/跨膜结构域和催化性三联体中的氨基酸缺失。

表2：分选酶C酶的缺失突变体

因此，本发明方法中所用的突变型分选酶可包含或由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、缺失或插入以外，本发明方法中所用的突变型分选酶还可包含或由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。

取代突变体

所述突变可包含相对于野生型分选酶C酶序列的盖区域中的一个或多个氨基酸取代。所述取代可位于预计与催化性位点中的氨基酸相互作用的盖区域中的任何位置，从而所述取代破坏正常盖功能。所述突变可包括GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第84、85和/或86位氨基酸的取代，或其它分选酶C酶的氨基酸序列中相应位置处的氨基酸的取代。因此，所述突变可包含对如下部分的取代：GBS PI-2a分选酶C酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的i)第84位氨基酸；ii)第85位氨基酸；iii)第86位氨基酸；iv)第84和85位的两个氨基酸；v)第84和86的两个氨基酸；vi)第85和86位的两个氨基酸；或vii)第84、85和86位的三个氨基酸，或者是对其它分选酶C酶的氨基酸序列中相应位置上的氨基酸的取代。对应GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第84、85和86位的位置的氨基酸能容易地通过比对确定。

-GBS PI-1分选酶C1酶(SEQ ID NO:1)的第90、91和92位，

-GBS PI-1分选酶C2酶(SEQ ID NO:2)的第84、85和86位，

-GBS PI-2a分选酶C2酶(SEQ ID NO:4)的第88、89和90位，

-GBS PI-2b分选酶C1酶(SEQ ID NO:5)的第53、54和55位，

-肺炎球菌分选酶C1(SEQ ID NO:6)的第58、59和60位，

-肺炎球菌分选酶C2(SEQ ID NO:7)的第50、51和52位，

-肺炎球菌分选酶C3(SEQ ID NO:8)的第74、75和76位，或

-GAS分选酶C1(SEQ ID NO:9)的第46、47和48位。

对应于第84位和/或第85位和/或第86位的位置处的取代可包括用丙氨酸残基替代这些位置处的野生型残基。

当分选酶是GBS PI-1分选酶C1(SEQ ID NO:1)时，所述突变可包含用丙氨酸残基替代第90位的天冬氨酸残基(D90A)，和/或用丙氨酸残基替代第91位的脯氨酸残基(P91A)，和/或用丙氨酸残基替代第92位的酪氨酸残基(Y92A)。

当分选酶是GBS PI-1分选酶C2(SEQ ID NO:2)时，所述突变可包含用丙氨酸残基替代第84位的天冬氨酸残基(D84A)，和/或用丙氨酸残基替代第85位的脯氨酸残基(P85A)，和/或用丙氨酸残基替代第86位的苯丙氨酸残基(F86A)。

当分选酶是GBS PI-2a分选酶C1(SEQ ID NO:3)时，所述突变可包含用丙氨酸残基替代第84位的天冬氨酸残基(D84A)，和/或用丙氨酸残基替代第85位的脯氨酸残基(P85A)，和/或用丙氨酸残基替代第86位的酪氨酸残基(Y86A)。

当分选酶是GBS PI-2a分选酶C2(SEQ ID NO:4)时，所述突变可包含用丙氨酸残基替代第88位的天冬氨酸残基(D88A)，和/或用丙氨酸残基替代第89位的脯氨酸残基(P89A)，和/或用丙氨酸残基替代第90位的酪氨酸残基(Y90A)。

当分选酶是GBS PI-2b分选酶C1(SEQ ID NO:5)时，所述突变可包含用丙氨酸残基替代第53位的甲硫氨酸残基(M53A)，和/或用丙氨酸残基替代第54位的赖氨酸残基(K54A)，和/或用丙氨酸残基替代第55位的色氨酸残基(W55A)。

当分选酶是肺炎球菌分选酶C1(SEQ ID NO:6)时，所述突变可包含用丙氨酸残基替代第58位的天冬氨酸残基(D58A)，和/或用丙氨酸残基替代第59位的脯氨酸残基(P59A)，和/或用丙氨酸残基替代第60位的色氨酸残基(W55A)。

当分选酶是肺炎球菌分选酶C2(SEQ ID NO:7)时，所述突变可包含用丙氨酸残基替代第50位的天冬氨酸残基(D50A)，和/或用丙氨酸残基替代第51位的脯氨酸残基(P51A)，和/或用丙氨酸残基替代第52位的苯丙氨酸残基(F52A)。

当分选酶是肺炎球菌分选酶C2(SEQ ID NO:8)时，所述突变可包含用丙氨酸残基替代第74位的天冬氨酸残基(D74A)，和/或用丙氨酸残基替代第75位的脯氨酸残基(P75A)，和/或用丙氨酸残基替代第76位的苯丙氨酸残基(F76A)。

当分选酶是GAS分选酶C1(SEQ ID NO:9)时，所述突变可包含用丙氨酸残基替代第46位的天冬氨酸残基(D46A)和/或和/或用丙氨酸残基替代位于第48位的苯丙氨酸残基(F48A)。所述GAS分选酶C1酶已在第47位包含丙氨酸残基。

所述突变可包含在对应于GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列的(SEQ IDNO:3)的第84和/或85和/或86位的位置以外的其它氨基酸变化。例如，所述突变可包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个其它氨基酸位置处的取代。或者，或除这些进一步取代以外，所述突变可包含缺失和/或插入。具体而言，所述突变可包含对应于GBSPI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第84和/或85和/或86位的位置处的取代，和如下部分的缺失：a)信号肽和/或跨膜结构域，或b)野生型分选酶的整个N末端区域的缺失。

在不存在任何其它突变的情况下，所述分选酶可由第84和/或85和/或86位的取代组成。由在等同于GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的盖区域的第84和/或86位的位置处的取代和信号肽/跨膜区缺失组成的适用于本发明方法的分选酶C酶的序列的示例示于下表3。

表3：分选酶C酶的取代突变体

因此，本发明方法中所用的突变型分选酶可包含或由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或71。除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的取代、缺失或插入以外，本发明方法中所用的突变型分选酶还可包含或由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:10、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或71。

上述适用于本发明方法的突变型分选酶C酶也是本发明的实施方式本身。具体而言，分选酶突变体是SrtC1_Y92A和SrtC2_F86A，因为相较于例如SrtC1-ΔNT和SrtC2-ΔNT缺失突变体，这些酶的稳定性更高，其更好地表达且更加可溶。这是令人惊讶的，因为Y92A和F86A突变体的切割反应的Vmax低于SrtC1-ΔNT和SrtC2-ΔNT突变体(其也较难纯化)。

分选酶作用

分选酶切割例如菌毛素蛋白的LPXTG基序，并且将一个部分(例如菌毛素亚基)的C末端共价接合至下一个部分或亚基上的Lys侧链NH2基团。该分选酶作用涉及这两种识别事件。首先，底物蛋白的分选酶识别基序(LPXTG或变体)需要被识别并结合。其次，受体底物(对其传送底物蛋白)必需被识别并结合，并将特定氨基基团带入位置以攻击硫酰基中间物。

通过突变型分选酶C酶聚合的细菌多肽

上述突变型分选酶C酶可用于聚合一种或多种多肽。将述突变型分选酶C酶带入以与一种或多种多肽体外接触，并允许一段时间的孵育，检测聚合化多肽，例如通过在SDS凝胶上鉴定高分子量条带的图案来进行所述检测。孵育可在37℃下进行。孵育可进行1、2、3、4、5、6、7天或更久。可使所述多肽和突变型分选酶C酶在还原剂(例如DTT 1mM)存在下孵育，以保持突变型分选酶C酶的催化性半胱氨酸的活性。孵育可在约pH7-8下进行。

与本发明的突变型分选酶C酶不同，野生型分选酶C酶无法体外聚合多肽。为避免疑问，所用术语“体外”的应用指分离的和/或纯化的细胞成分(例如酶)用以促进菌毛合成而无需细胞本身存在的应用。

由本发明的突变型分选酶C酶聚合的多肽通常包含LPxTG基序。其可进一步包含菌毛素基序(共有WxxxVxVyPK)和/或E-Box基序(共有YxLxETxAPxGY)，其显示对菌毛组装具有重要性[6]。特定地，所述多肽可包含保守赖氨酸(K)残基，例如，在菌毛素基序中。在其它实施方式中，所述多肽在菌毛素基序中不包含保守赖氨酸(K)残基，即，其中排除保守赖氨酸残基的存在。在一些实施方式中，由本发明的突变型分选酶C酶聚合的多肽可包含N末端甘氨酸残基。其它序列基序对于本发明技术人员而言应是显而易见的，并且包括，通过非限制性示例举例：LPETGG、LPXT、LPXTG、LPKTG、LPATG、LPNTG、IPQTG、IQTGGIGT。

可由本发明突变型分选酶C酶聚合的多肽的示例包括来自革兰氏阳性细菌的多肽，例如革兰氏阳性细菌的菌毛中发现的骨架蛋白和辅助蛋白。具体而言，可将所述突变型分选酶C酶与GBS、AGAS或肺炎链球菌的菌毛中发现的骨架蛋白接触。例如，可将所述突变型分选酶C酶与如下蛋白质接触：来自GBS PI-1的骨架蛋白(GBS80/SAG0645)、来自GBS PI-2a的骨架蛋白(GBS59/SAG1407)、来自GBS PI-2b的骨架蛋白(Spb1/SAN1518)、来自肺炎链球菌的骨架蛋白(RrgB)或来自GAS的骨架蛋白(fee6、spy128、orf80、eftLSLA)。

或者或此外，可将所述突变型分选酶C酶与GBS、AGAS或肺炎链球菌的菌毛中发现的辅助蛋白接触。例如，可将所述突变型分选酶C酶与如下蛋白质接触：来自GBS PI-1的辅助蛋白1(AP-1)(GBS104)、来自GBS PI-2a的AP-1(GBS67/SAG1408)、来自GBS PI-2b的AP-1(SAN1519)、来自肺炎链球菌的AP-1(RrgA)或来自GAS的AP-1(cpa)、来自GBS PI-1的辅助蛋白2(AP-2)(GBS52)、来自GBS PI-2a的AP-2(GBS150/SAG1404)、来自GBS PI-2b的AP-2(SAN1516)、来自肺炎链球菌的AP-2(RrgC)或来自GAS的AP-2(spy130、orf82、orf2)。

本发明的突变型分选酶C酶可用于聚合野生型骨架蛋白和辅助蛋白序列的同源物、片段或变体，前提条件是这些同源物、片段或变体保留上述由突变型分选酶C酶聚合所必需的序列。例如，可用于本发明方法的这些多肽的变体包括来自相较于野生型序列其中跨膜结构域缺失的骨架蛋白和/或辅助蛋白序列。除了跨膜结构域以外或作为跨膜结构域的替代，变体可在N末端包含额外的甘氨酸残基以促进聚合。

通过非限制性示例的方式，可通过本发明突变型分选酶C酶聚合的这些多肽中的一些的序列在下文中提供以作为参考。可通过本发明突变型分选酶C酶聚合的额外多肽的序列可由技术人员容易地确定。这些多肽的其它细节于参考文献[7]中提供。

来自PI-1的BP(GBS80)

2603菌株中发现的全长GBS80的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO:72。野生型GBS80在SEQ ID NO:72的第1-37位氨基酸处包含N末端前导序列或信号序列区域。GBS80前导序列或信号序列区域的一个或多个氨基酸可被去除，如SEQ ID NO:73。

来自PI-2b的BP(GBS1523/SAN1518)

原始'GBS1523'(SAN1518；SpbI)序列注释为细胞壁表面锚定子家族蛋白(参见GI:77408651)。出于参比目的，将COH1菌株中发现的全长GBS 1523氨基酸序列定位本文中的SEQ ID NO:110。本发明所用的优选GBS1523多肽包含某一氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：110具有60％或更高的相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：110的至少'n'个连续氨基酸的片段，其中'n'是7或更高(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。

野生型序列在SEQ ID NO:110的第468-472位氨基酸处包含指示细胞壁锚定子的氨基酸基序(LPSTG)。还在SEQ ID NO:110的第419-429位氨基酸处鉴定到含保守谷氨酸残基的E盒，在残基423处具有保守的谷氨酸。所述E盒基序可能对寡聚菌毛样结构的形成很重要，且因此GBS1523的有用片段可包括该保守谷氨酸残基。鉴定到GBS1523的突变，其中SEQ ID NO:110的第41位处的谷氨酰胺(Q)替换为赖氨酸(K)，这是由于编码核苷酸序列中的密码子从CAA突变为AAA。该替代可存在于GBS1523序列和GBS1523片段中(如SEQ ID NO:112)。GBS1523COH1的不含信号序列区的另一个变体列为SEQ ID NO:111。

来自GBS PI-2a的BP(GBS59)

2603菌株中发现的全长GBS59的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO:74。GBS59的变体存在于H36B、515、CJB111、DK21和CJB110菌株中。将H36B、515、CJB111、CJB110和DK21菌株中发现的全长GBS59的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO:75、76、77、78和79。

来自GBS PI-2b的BP(Spb1)

COH1菌株中发现的全长Sbp1的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO:80。野生型Spb1包含N末端前导序列和信号序列区。Spb1前导序列或信号序列区域的一个或多个氨基酸可被去除，如SEQ ID NO:81。

来自肺炎链球菌的BP(RrgB)

RrgB菌毛亚基具有至少三个进化支。三个进化支的参比氨基酸序列在本文中是SEQ ID NO:82、83和84。

来自GBS PI-1的AP-1(GBS104/SAG0649)

2603菌株中发现的全长GBS104的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO:85。

来自GBS PI-2a的AP-1(GBS67)

2603菌株中发现的全长GBS67的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO:86。H36B株系中存在GBS67(SAI1512)变体。H36B菌株中发现的全长GBS67的氨基酸序列列为SEQ ID NO:87。GBS67变体存在于CJB111、515、NEM316、DK21和CJB110菌株中。将CJB111、515、NEM316、DK21和CJB110菌株中发现的全长GBS67的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO:88、89、90、91和92。

来自GBS PI-2b的AP-1(GBS1524/SAN1519)

COH1菌株中发现的全长GBS1524(SAN1519)的氨基酸序列在本文中列为SEQID NO:93。

来自肺炎链球菌的AP-1(RrgA)

将全长RrgA的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO:94。

来自GBS PI-1的AP-2(GBS052/SAG0646)

2603菌株中发现的全长GBS052/SAG0646的氨基酸序列在本文中列为SEQID NO:95。

来自GBS PI-2a的AP-2(GBS150/SAG1404)

2603菌株中发现的全长GBS150/SAG1404的氨基酸序列在本文中列为SEQID NO:96。

来自肺炎链球菌的AP-2(RrgC)

将全长RrgC的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO:97。

因此，用于本发明的多肽可包含或由如下氨基酸序列组成：(a)与具有SEQID NO:72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97中任一氨基酸序列的多肽或上述任何其它骨架或辅助蛋白序列具有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；或(b)是这些序列之一的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是20或更大(例如，25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150或更大；例如，20或更大；或例如50或更大；或例如80或更大)。或者，‘n’小于20或小于25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或小于150。

本发明方法可涉及与具有SEQ ID NO:72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97中任一氨基酸序列或这些序列之一的至少“n”个连续氨基酸的片段的多肽具有50％相同性的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个多肽的聚合，其中“n”是20或更大(例如，25,30,35,40,50,60,70,80,90,100,150或更大，例如20或更大；或例如50或更大；或例如80或更大)。

本发明的方法可涉及与具有SEQ ID NO:74、75、76、77、78和79中任一氨基酸序列，或这些序列之一的至少“n”个连续氨基酸的片段的多肽具有50％相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高相同性)的1、2、3、4、5或6个多肽的聚合，其中“n”是20或更大(例如25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150或更大；例如20或更大；或例如50或更大；或例如80或更大)。

本发明的方法可涉及与具有SEQ ID NO:82、83和84中任一氨基酸序列，或这些序列之一的至少“n”个连续氨基酸的片段的多肽具有50％相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高相同性)的1、2或3个多肽的聚合，其中“n”是20或更大(例如25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150或更大；例如20或更大；或例如50或更大；或例如80或更大)。

这些骨架和辅助蛋白的氨基酸片段可包含如下氨基酸序列：例如，上文提供的序列的多至30个、多至40个、多至50个、多至60个、多至70个、多至80个、多至90个、多至100个、多至125个、多至150个、多至175个、多至200个、多至250个、多至300个、多至350个、多至400个、多至450个、多至500个、多至550个、多至600个、多至650个、多至700个、多至750个、多至800个、多至850个、多至900个、多至950个、多至1000个、多至1100个、多至1200个、多至1300个、多至1400个、多至1500个连续氨基酸残基。其它片段省去一个或多个多肽结构域，例如，跨膜结构域。

本发明的突变型分选酶C酶以与野生型链球菌分选酶C酶体外聚合骨架蛋白和辅助蛋白以形成菌毛类似的方式聚合这些多肽。因此，按照这些方法产生的聚合多肽与链球菌体内生成的菌毛结构类似。

革兰氏阳性细菌的菌毛由两种或三种类型的菌毛素亚基构建。在2-成分菌毛中，该菌毛的轴由主要菌毛素亚基的多个拷贝构成，而该菌毛的顶端包含单一拷贝的次(minor)“顶端”菌毛素亚基，其主要起粘附作用。3-成分菌毛是类似的，但其还包含次“基础”菌毛素亚基，其共价连接至细胞壁。数次透射电子显微镜(EM)和免疫金标记研究已得出结论，次“基础”菌毛素亚基还贯穿菌毛的轴发生散布，猜测是因为分选酶对于其识别的底物是混杂的。

可将突变型分选酶C酶与1种多肽接触，导致形成单体菌毛。例如，可将突变型分选酶与GBS80、GBS59或RrgB接触，导致形成分别包含GBS80、GBS59或RrgB亚基的单体菌毛。其中所述多肽来自革兰氏阳性细菌，用于聚合多肽的突变型分选酶不必来自相同的革兰氏阳性细菌。因此，源自GBS的突变型分选酶C酶可用于聚合不仅来自GBS而且来自肺炎链球菌和/或GAS的蛋白质。一些菌毛蛋白的变体，例如GBS59一般不是交叉保护性的。因此，聚合个体菌毛中的这些变体中至少2、3、4、5、6种或更多种的组合是有利的，例如，免去对多种复杂组合物的需要，或采用蛋白融合物以实现交叉保护的需要。具体而言，体外合成的菌毛可包括来自GBS菌株515、CJB111、H36B、2603、DK21和090的GBS59变体的组合，更具体地，来自GBS菌株515、CJB111、H36B和2603的GBS59变体的组合。此类包含两种或更多种GBS59变体的菌毛并未在自然中发现，因为野生型细菌的菌株仅表达一种骨架蛋白变体(BP-2a/GBS59)。

或者，可将突变型分选酶C酶与可能来自1、2、3、4、5种或更多种革兰氏阳性细菌的2、3、4、5或更多种不同多肽接触，导致形成嵌合菌毛。可将突变型分选酶C酶带入与来自单一革兰氏阳性细菌的骨架和辅助蛋白接触，这些蛋白质在来自该细菌的自然链球菌菌毛中以组合形式发现，导致结构上与天然产生的菌毛等同的嵌合菌毛。此类嵌合菌毛是使菌毛性质研究成为可能，而无需目前用以从革兰氏阳性细菌分离菌毛的费力纯化操作的有用手段。

此外，如上所述，通过本发明方法产生的单体和嵌合菌毛的三维结构使其相较于给予个体重组蛋白而言特别方便且有效地供于免疫目的。事实上，保护试验已显示这些菌毛在诱导针对来自其来源的链球菌的保护方面比单体重组蛋白更有效。假设这可能是因为菌毛在体内包含存在于菌毛中的表位，其并没有在单体重组蛋白中复制，尤其此类表位是结构表位。

本发明包括采用本发明方法获得或可获得的菌毛。在一些方面，这些菌毛中发现的多肽的组合不同于链球菌中天然产生的菌毛中发现的多肽的组合。可按照本发明方法产生的菌毛的示例包括含有或由来自上述链球菌的骨架蛋白和/或辅助蛋白组成的菌毛。在一些实施方式中，这些菌毛不包含GBS、GAS或肺炎链球菌中发现的天然产生的菌毛中发现的多肽的组合。具体而言，体外聚合的菌毛和天然产生菌毛在其组合方面不同，例如，因为酰基酶中间物不连接至野生型分选酶，但连接至本发明的突变型分选酶。在其它情况中，体外聚合的菌毛不包含细胞壁/膜成分，例如脂质II或肽聚糖(例如MurNAc-N-乙酰基-胞壁酸)的前体。在其它情况中，体外聚合的菌毛包含自然中未发现的菌毛蛋白的组合。因此，体外聚合的菌毛可与天然产生的那些区分开。因此，术语人造摂指合成，或非细胞源性组合物，尤其是体外合成的结构，并且其不同于天然细菌(例如链球菌)中发现的结构。

包含菌毛的免疫原性组合物

本发明提供包含上述菌毛的免疫原性组合物，其可通过本发明方法获得或可获得。所用术语“免疫原性”是指，所述菌毛能够引发免疫应答，例如在用于免疫对象(优选哺乳动物，更优选人或小鼠)时，引发针对组成所述菌毛的一种或多种多肽的细胞介导的免疫应答和/或抗体反应。优选地，所述免疫应答是保护性免疫应答，其提供保护性免疫力。

本发明免疫原性组合物可用作疫苗。本发明的疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但通常是预防性疫苗。预防性疫苗不保证完全保护不患疾病，因为即便患者发展出抗体，在免疫系统能够击退感染之前也有滞后和延迟。因此，为了避免疑问，术语预防性疫苗还可指改善未来感染的影响的疫苗，例如，通过降低此类感染的严重性或缩短感染时间。

术语针对感染的保护摂和/或提供保护性免疫力摂指的是对象的免疫系统已经预先准备好(例如，通过疫苗接种)触发免疫应答并击退感染。具体而言，被触发的免疫应答能够击退针对大量不同细菌菌株的感染。因此，经疫苗接种的对象可能被感染，但能够比对照对象更好地击退该感染。

因此，组合物可以是药学上可接受的。除抗原外，它们通常还包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献[8]。

组合物通常以水性形式给予哺乳动物。然而在给药前，该组合物可以是非水性形式。例如，虽然一些疫苗制备成水性形式然后以水性形式填装、分销和给药，但其他疫苗在制备过程中冻干，并在使用时重建成水性形式。因此，本发明组合物可被干燥，例如冻干制剂。

该组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞。更优选无汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。

为了提高热稳定性，组合物可包含温度保护剂。这种试剂的更多详情如下所述。

为了控制张度，优选包含生理盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，它的浓度可以是1-20mg/ml，例如约10±2mg/ml NaCl。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。

组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。

组合物可含有一种或多种缓冲剂。常用的缓冲液包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(具体是有氢氧化铝佐剂时)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲液的浓度一般为5-20mM。

组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。

该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。

所述组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，所述组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。

人疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。

本发明免疫原性组合物也可包含一种或多种免疫调节剂。优选地，一种或多种免疫调节剂包括一种或多种佐剂。佐剂可包括TH1佐剂和/或TH2佐剂，详述见下。

可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：

·矿物盐，例如铝盐和钙盐，包括氢氧化物(例如，氢氧化合物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)和硫酸盐等[例如参见参考文献9的第8和9章]；

·水包油乳剂，例如鲨烯-水乳剂，包括MF59(5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，采用微射流机制成亚微米颗粒)[参考文献9第十章，还参见参考文献10-13，参考文献14的第10章和参考文献15的第12章]，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；

·皂苷制剂[参考文献9的第22章]，例如QS21[16]和ISCOM[参考文献9的第23章]；

·病毒体和病毒样颗粒(VLP)[17-23]；

·细菌或微生物衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物[24,25]、免疫刺激性寡核苷酸[26-31]，例如IC-31^TM[32](包含26-基体序列5'-(IC)₁₃-3'的脱氧核苷酸(SEQ ID NO:46)和包含11-基体氨基酸序列KLKLLLLLKLK的多聚阳离子聚合肽(SEQ ID NO:47))，和ADP-糖基化毒素及其脱毒化的衍生物[33-42]；

·人免疫调节剂，包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[43,44])，干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子；

·生物粘着剂和粘膜粘着剂，例如壳聚糖及其衍生物、酯化透明质酸微球[45]或粘膜粘着剂，如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素[46]。

·微颗粒(即，直径为约100nm～约150μm的颗粒，更优选直径为约200nm～约30μm的颗粒，且最优选直径为约500nm～约10μm的颗粒)，所述微颗粒由生物可降解且无毒的材料形成(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯(polyorthoester)、聚酸酐、聚己酸内酯，等)；

·脂质体[参考文献9的第13和14章，参考文献47-49]；

·聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[50]；

·PCPP制剂[51和52]；

·胞壁酰肽，包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)；和

·咪唑并喹诺酮化合物，包括咪喹莫特及其同系物(例如，“瑞喹莫德3M”)[53和54]。

本发明的免疫原性组合物和疫苗还可包含上述鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，可将以下佐剂组合物用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂[55]；(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[56]；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)[57]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[58]；(6)SAF，含有10％鲨烯、0.4％吐温80^TM、5％普流罗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液。(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(瑞比免疫化学公司(Ribi Immunochem))，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；和(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。用作免疫刺激剂的其它物质公开于参考文献9的第7章。

特别优选使用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂，抗原通常吸附于这些盐。磷酸钙是另一种优选佐剂。其它优选的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和明矾或雷西莫特和明矾。可使用磷酸铝和3dMPL的组合(已报道这种组合在肺炎球菌免疫中有效[59])。

本发明组合物可引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答。此种免疫应答优选诱导长期(如中和性)抗体和细胞介导的免疫，以便在接触感染时迅速作出反应。

通常认为两种T细胞类型CD4和CD8细胞是启动和/或增强细胞介导免疫和体液免疫所必需的。CD8T细胞可表达CD8共受体，通常称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CD8T细胞能够识别MHC I型分子上展示的抗原或与之相互作用。

CD4T细胞可表达CD4共受体，并通常称为T辅助细胞。CD4T细胞能够识别结合MHC II型分子的抗原性肽。与MHC II型分子相互作用后，CD4细胞可分泌诸如细胞因子等因子。这些分泌的细胞因子可激活B细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞和参与免疫应答的其它细胞。辅助T细胞或CD4+细胞可进一步分为两个功能不同的亚组：即细胞因子和效应功能不同的TH1表型和TH2表型。

活化的TH1细胞能增强细胞免疫(包括抗原特异性CTL生产增加)，因而对响应胞内感染具有特定价值。活化的TH1细胞可分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β中的一种或多种。TH1免疫应答可通过激活巨噬细胞、NK(自然杀伤)细胞和CD8细胞毒性T细胞(CTL)导致局部炎症反应。通过用IL-12刺激B和T细胞的生长，TH1免疫应答也可用于放大免疫应答。TH1刺激的B细胞可分泌IgG2a。

活化的TH2细胞提高抗体生成，因此对响应胞外感染具有价值。活化的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫应答可引起生成IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞来用于未来的保护。

增强的免疫应答可包括增强的TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或多种。

TH1免疫应答可包括以下一种或多种：CTL增加，与TH1免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如IL-2、IFN-γ和TNF-β)增加，活化巨噬细胞增加，NK活性增加，或者IgG2a生成增加。增强的TH1免疫应答优选包括IgG2a生成增加。

可使用TH1佐剂引发TH1免疫应答。相对于不用佐剂的抗原免疫，TH1佐剂通常引起IgG2a生成水平增加。适用于本发明的TH1佐剂可包括例如，皂苷制剂、病毒体和病毒样颗粒、肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、免疫刺激性寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸是本发明所用的优选TH1佐剂。

TH2免疫应答可包括以下一种或多种：与TH2免疫应答相关的一种或多种细胞因子(如IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)增加，或者IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞生成增加。增强的TH2免疫应答优选包括IgG1生成增加。

可使用TH2佐剂引发TH2免疫应答。相对于不用佐剂的抗原免疫，TH2佐剂通常引起IgG1生成水平增加。适用于本发明的TH2佐剂包括例如，含矿物质组合物、油乳剂和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。含矿物质组合物如铝盐是本发明使用的优选TH2佐剂。

本发明优选包括含TH1佐剂和TH2佐剂组合的组合物。这种组合物优选引起增强的TH1和增强的TH2反应，即IgG1和IgG2a的生成相对于不用佐剂的免疫均有增加。更优选地，相对于用单一佐剂的免疫(即，相对于只用TH1佐剂的免疫或只用TH2佐剂的免疫)，包含TH1和TH2佐剂组合的组合物引起TH1和/或TH2免疫应答增强。

所述免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答之一或两种。免疫应答优选提供增强的TH1反应和增强的TH2反应之一或两种。

增强的免疫应答可以是全身免疫应答和粘膜免疫应答之一或两种。该免疫应答优选提供增强的全身免疫应答和增强的粘膜免疫应答之一或两种。优选粘膜免疫应答为TH2免疫应答。粘膜免疫应答优选包括IgA生成增加。

本文所述组合物可以各种形式制备。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体载剂的固体形式(如冻干组合物或喷雾冻干组合物)。所述组合物可以制备成外用制剂，例如，油膏、乳膏或粉末。该组合物可制备成口服给药制剂，如片剂或胶囊，喷雾剂，或糖浆剂(任选调味)。所述组合物可以制备成使用细粉或喷雾的肺部给药制剂，例如吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或子宫托。可将所述组合物制备成用于肠胃外或无针给予(例如用于皮肤内给予)的固体剂型。所述组合物可以制成鼻部、耳部或眼部给药制剂，例如滴剂。可将所述组合物设计在药盒形式内，从而在临对患者给予之前重建合并的组合物。此类药盒可包含一种或多种液体形式的抗原以及一种或多种冻干抗原。

临用前制备组合物(例如，以冻干形式提供组分时)和以药盒形式提供组合物时，该药盒可包括两个药瓶，或者可包括一个填充好的注射器和一个药瓶，注射器内容物用于在注射前重激活药瓶内容物。

作为疫苗使用的免疫原性组合物包含免疫有效量的菌毛，以及需要的任何其它组分。“免疫学有效量”是指以单一剂量或一系列剂量的部分给予个体的对治疗或预防有效的量。此量取决于待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(如非人灵长动物、灵长动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素。预计所述量将落入可通过常规试验可确定的相对较宽范围内。免疫有效量的示例是约0.1μg～10μg菌毛，例如，0.5μg～10μg菌毛。

如上所述，一种组合物可包含温度保护剂，此种组分可能在含佐剂组合物(特别是含有矿物质佐剂，如铝盐的组合物)中特别有用。如参考文献60所述，可将液体温度保护剂加入水性疫苗组合物中，以降低其凝固点，例如将凝固点降低至0℃以下。因此该组合物可以储存于0℃以下但在其凝固点以上，以抑制热裂解。温度保护剂也允许冷冻该组合物，同时保护矿物盐佐剂在冻融后不发生团聚或沉降，还可在较高温度，例如40℃以上保护该组合物。可混合初始的水性疫苗与液体温度保护剂使液体温度保护剂占最终混合物体积的1-80％。合适的温度保护剂应该是对人给药安全的、易于混溶/可溶于水的、并且不应损害组合物的其他成分(如抗原和佐剂)。示例包括甘油、丙二醇和/或聚乙二醇(PEG)。合适PEG的平均分子量可为200-20,000Da。在优选实施方式中，聚乙二醇的平均分子量可以约为300Da(‘PEG-300’)。

治疗方法和疫苗的给予

本发明还提供了引起哺乳动物免疫应答的方法，所述方法包括给予有效量的本发明组合物或本发明菌毛的步骤。所述免疫应答优选为保护性免疫应答，并优选涉及抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可以产生加强的应答。

本发明还提供免疫原性组合物或用作药物的组合物，例如用于在对象(例如，哺乳动物)内产生免疫应答。

本发明还提供本发明菌毛在制备引起哺乳动物中的免疫应答的药物中的应用。

通过这些应用和方法在哺乳动物中产生免疫应答，所述哺乳动物能被保护抵抗由所述菌毛中多肽来源的细菌引起的疾病。具体而言，可保护所述哺乳动物抵抗由链球菌引起的疾病，所述链球菌包括GAS、GBS和肺炎链球菌。本发明还提供了一种预填充本发明免疫原性组合物的递送装置。

所述哺乳动物优选是人、大型脊椎动物(例如，马、牛、鹿、山羊、猪)和/或家养宠物(例如，狗、猫、沙鼠、仓鼠、豚鼠、南美栗鼠)。最优选地，所述哺乳动物是人，例如，人患者。当疫苗用于预防性用途时，人可以是儿童(如幼童或婴儿)或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人可以是青少年或成人。意图用于儿童的疫苗也可给予成年人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。哺乳动物(例如人，例如患者)可以自身处于发生该疾病的风险中，或者可以是妊娠女性，例如，女性(“母体免疫”)。对于妊娠女性的疫苗接种作为提供抗体介导的被动保护至新生哺乳动物而言可能是有利的。母方被动免疫是自然获得性被动免疫的一种类型，并且指的是通过妊娠中的母亲传递给其胎儿的抗体介导的免疫。母方抗体(MatAb)通过胎盘由胎盘细胞上的FcRn受体传递给胎儿。这在怀孕约第三个月发生。特定地，所述抗体是免疫球蛋白G(IgG)或免疫球蛋白A(IgA)。IgGy抗体同种型能够在妊娠期间通过胎盘。被动免疫也可通过母乳中的IgA抗体传递，其传送进入婴儿的肠道，保护针对细菌感染，直至新生儿能够合成其自身的抗体。

检测治疗性治疗功效的一种方式包括在给予本发明组合物后监测传染。一种检查预防性治疗疗效的途径包括给予组合物后监测对抗本发明菌毛中一种或多种抗原的全身免疫应答(如监测IgG1和IgG2a产生水平)和/或粘膜免疫应答(如监测IgA产生水平)。通常，在免疫后但在刺激前测定抗原特异性血清抗体应答，而在免疫后且刺激后测定抗原特异性粘膜抗体应答。

另一评价本发明组合物免疫原性的途径是重组表达蛋白，通过免疫印迹和/或微阵列筛查患者血清或粘膜分泌物。蛋白质和患者样品间的阳性反应表明患者已经产生对受试蛋白的免疫应答。该方法也可用于鉴定免疫显性抗原和/或抗原中的表位。

本发明的组合物的功效还可通过用疫苗组合物刺激动物模型(例如，豚鼠或小鼠)感染来体内测定。

本发明的组合物通常直接给予患者。可通过胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙)，或通过粘膜，如通过直肠、口腔(如片剂、喷雾)、阴道、局部、透皮或经皮、鼻内、眼、耳、肺或其它粘膜途径完成直接递送。

本发明可用于引发全身和/或粘膜免疫，优选引发增强的全身和/或粘膜免疫。

增强的全身和/或粘膜免疫优选表现为提高的TH1和/或TH2免疫应答。增强的免疫应答优选包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA生成增加。

可通过单剂量方案或多剂量方案来进行给药。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强的免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径(如肠胃外初次和粘膜加强，粘膜初次和肠胃外加强等)给予多个剂量。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。

根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。因此，人患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受疫苗的患者优选老年人(如>50岁、>60岁并优选>65岁)，幼儿(如<5岁)，住院病人、保健护理人员、武装人员和军人、孕妇、慢性病人或免疫缺陷病人。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。

可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或访问期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗等基本上同时给药。

本发明组合物的其它抗原性组分

本发明还提供另包含至少一种其它抗原的组合物。

具体而言，本发明也提供含有本发明多肽和一种或多种以下其它抗原的组合物：

–来自脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)血清组A、C、W135和/或Y(优选全部四种)的糖类抗原。

–来自肺炎链球菌的糖类或多肽抗原[例如，61,62,63]。

–来自甲肝病毒的抗原，例如灭活病毒[例如64,65]。

–来自乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如65、66]。

–白喉抗原，如白喉类毒素[例如参考文献67的第3章]或CRM₁₉₇突变体[例如68]。

–-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如，参考文献67的第4章]。

–百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3的组合[例如参考文献69和70]。

–流感嗜血杆菌B的糖抗原[如71]。

–脊髓灰质炎病毒抗原[例如72、73]，如IPV。

–-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献67的第9、10和11章]。

–流感抗原[如参考文献67的第19章]，如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。

–粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[例如74]。

–无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)的蛋白质抗原[例如75、76]。

–无乳链球菌(B组链球菌)的糖抗原。

–嗜热链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)的抗原[例如76，77，78]。

–来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原[例如79]。

–来自大肠杆菌(E.coli)的抗原。

所述组合物可以包含一种或多种这些其它抗原。

必要时，可使有毒的蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒[70])。

所述组合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。

糖抗原优选偶联物形式。偶联物的载体蛋白包括白喉毒素、破伤风毒素、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[80]、合成肽[81、82]、热激蛋白[83、84]、百日咳蛋白[85、86]、流感嗜血杆菌的蛋白D[87]、细胞因子[88]、淋巴因子[88]、链球菌蛋白、激素[88]、生长因子[88]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[89]、摄铁蛋白[90]等。优选的载体蛋白是白喉类毒素的CRM197突变体[91]。

所述组合物中抗原存在的浓度一般是至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫反应。

作为在本发明免疫原性组合物中使用蛋白质抗原的替代方式，可以使用编码该抗原的核酸(优选DNA，例如质粒形式的DNA)。

抗原优选吸附于铝盐。

令人吃惊的是，发明人发现，菌毛素基序不是本发明突变型分选酶的聚合所必需的，这与野生型分选酶(所述突变型的来源)不同，其中该基序的存在是必需的。此外，本发明的突变型分选酶能够利用不同的亲核体来分解所述酶和LPXTG-样分选信号之间的酰基-中间物。相反，所述突变型分选酶的来源野生型分选酶需要赖氨酸残基存在。本发明的突变型分选酶在催化转肽反应和形成GBS菌毛蛋白聚合物方面是体外有效的。本发明的突变型分选酶还可用于多种蛋白质工程改造应用。本发明分选酶和革兰氏阳性细菌中其它菌毛相关的分选酶之间的结构差异能够提供新功能，并且允许进行新的体外方法，或可允许更有效地进行聚合和连接反应。

本发明的突变型分选酶可用于进行包含LPXTG识别基序(或上述那些)的任何部分和包含能够提供亲核体以完成转肽反应的氨基酸残基的任何部分之间的连接反应。如实施例中所示，本发明的突变型分选酶能够切割并聚合骨架蛋白和辅助蛋白(包含LPXTG基序)。先前的工作已证明细菌分选酶仅需要单一氨基酸来提供亲核体以完成转肽反应(Proft.,Biotechnology Letters,2010,32:1-10；Popp等,Current Protocols in Protein Science,2009,15,WO2010/087994)。

在本发明方法的某些实施方式中，连接中的第一部分或第二部分是多肽，并且其它部分是细胞表面上的蛋白质或多糖。本发明的分选酶可用于将多肽连接至细胞表面的蛋白质。这可能特别有用于，例如，标记细胞表面上的特定蛋白质。在某些实施方式中，所述细胞已被转染以表达带有LPXTG基序的感兴趣的表面蛋白。然后可靶向该基序以供采用本发明的分选酶进行的连接。或者，所述蛋白质标记物可包含所述基序。

分选酶用于连接除菌毛蛋白以外的底物的应用

在本发明的其它实施方式中，本发明的突变型分选酶用于将连接蛋白连接至固体支持物，并且第一部分或第二部分是多肽，而其它部分包含偶联至固体支持物的氨基酸。此类共价连接允许进行大量清洗。在某些此类实施方式中，所述蛋白质包含LPXTG基序，并且所述固体支持物具有与其偶联的氨基酸，例如赖氨酸。在某些实施方式中，所述固体支持物是珠，例如聚苯乙烯珠或金珠或颗粒例如纳米颗粒。

类似地，本发明的方法允许多肽链环化。在此类实施方式中，所述第一部分和第二部分是多肽链的N末端和C末端，从而所述连接导致形成环状多肽。

对于蛋白质修饰和工程改造应用而言，细菌分选酶也引起显著兴趣。分选酶通过催化骨架蛋白和辅助蛋白之间的转肽反应促进菌毛素体内形成。分选酶识别并切割识别基序(例如，LPXTG)并形成带有靶标蛋白的酰胺连接。通过利用识别基序，可进行多种蛋白质工程改造功能。采用分选酶进行的连接反应是灵活、有效的，并且需要的步骤少于相当的化学连接技术。因此，本发明的另一个目的是提供用于蛋白质工程改造应用的改进的分选酶。分选技术是本领域已知的。

除了上述分选酶突变体以外，其它分选酶可用于连接。例如，来自GBS毒力岛PI-2b的分选酶SrtC1和SrtC2。

来自PI-2b的野生型SrtC1的氨基酸序列列于SEQ ID NO:5。具体而言，本发明方法中所用的SrtC1不包含信号肽或N末端跨膜结构域(列于SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:100)。在某些优选实施方式中，本发明方法中所用的SrtC1包含SEQ ID NO:101，其对应于克隆的可溶结构域。包含SEQ ID NO:101的SrtC1，其对应于克隆的可溶结构域。在某些实施方式中，SrtC1可具有W55F突变(列于SEQ ID NO:102)。W55在调节SrtC1活性方面可能具有重要性，因为其位于链球菌分选酶的经典分选酶盖基序所在的区域。W55能够模拟其它分选酶中的盖的功能。在某些实施方式中，用于本发明方法的SrtC1可具有C188A突变(列于SEQ ID NO:103)。C188可以是催化性半胱氨酸。

来自PI-2b的野生型SrtC2的氨基酸序列列于SEQ ID NO:105。在某些实施方式中，用于本发明方法的SrtC2的半胱氨酸可被丙氨酸取代(列于SEQ IDNO:106)。在本发明的某些实施方式中，用于本发明方法的SrtC2不包含信号肽或N末端跨膜结构域(列于SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:109)。本领域技术人员能够鉴定任何信号肽或N末端跨膜结构域。

因此，用于本发明的PI-2b分选酶C1和分选酶C2酶可包含或由以下氨基酸序列组成：(a)与具有SEQ ID NO:5、98、100、101、102、103、105、106、108和109任一氨基酸序列的多肽具有70％或更高相同性(例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；或(b)是这些序列之一的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是100或更大(例如，120、150、170或190或更大)。用于本发明的PI-2b分选酶C1和分选酶C2酶保留进行连接和聚合反应的能力。编码SrtC1和SrtC2的核苷酸序列列于SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:107。特定识别基序可包括LPETGG、LPXTG、LPXT、LPKTG、LPATG、LPNTG、LPET、VPDT、IPQT、YPRR、LPMT、LAFT、LPQT、NSKT、NPQT、NAKT、NPQS、LPKT、LPIT、LPDT、SPKT、LAET、LAAT、LAET、LAST、LPLT、LSRT。

概述

除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如参考文献92-99等。术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括其它物质，例如X+Y。

术语“基本由……组成”意味着组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤和/或部分，但仅在额外成分、步骤和/或部分不会在物质上改变所要求的组合物、方法或结构的基本和新颖的特征。术语“由……组成”一般认为是指要求权利的本发明限于权利要求中聚体所述的那些成员(并且可包括其等同物，在等同物原理可行的范围内)。

与数值x相关的术语“约”表示例如，x±10％。

两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献100的7.7.18部分所述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选的比对通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。参考文献101中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。第一多肽和第二多肽的相同性百分比一般通过对所述第一多肽和第二多肽之间匹配位置的数量计数并将该数字除以最短多肽的总长度然后将所得值乘以100来确定。对于多肽片段而言，该值通常是约100％，因此几乎没有意义。因此，在本发明的片段内容中，采用术语“参考多肽百分比”(以百分数表示)。参考多肽百分比通过对片段和参考多肽之间的匹配位置计数，然后将该数字除以参考多肽的总长度，然后将所得值乘以100来计算。具体而言，片段将包含少于90、80、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25或少于参考多肽序列的20％。

具体实施方式

实施例1：GBS SrtC1的功能调节：盖区域中的单一突变增强BP体外聚合。

概述

细胞表面菌毛是重要毒力因子并且有望成为疫苗候选物。革兰氏阳性细菌通过分选酶C催化的转肽作用机制从骨架和辅助菌毛素底物精制菌毛。对于个体亚基的共价交联而言，特定残基和/或基序，例如菌毛素基序和保守LPxTG分选信号是绝对必要的。GBS PI-2a分选酶C1(SrtC1)的定点诱变揭示盖调节位点中的Tyr86对于重组SrtC1活化的特定作用。该示例显示，重组BP高分子量菌毛结构可采用催化性酶浓度在体外获得。这提供了关于通过盖的存在引起分选酶C酶自我抑制的直接证据，并且为研究通过利用由分选酶活性突变体聚合的重组菌毛柱状的菌毛开拓了领域，减少了对来自病原性细菌的野生型菌毛进行大量纯化的必要性。

背景

B组链球菌(GBS)，或无乳链球菌，是新生儿中生命威胁性疾病的主要病因，并且也成为了非妊娠、年长或免疫力低下成人的侵入性疾病的常见病因[102]。菌毛，从细菌表面突出的细长纤维，已在革兰氏阳性病原体中发现是重要的毒力因子并且是潜在的疫苗候选物。从对于GBS的八个测序基因组的分析来看，已鉴定两个基因组岛，其各自编码三种不同菌毛[103；1]。此外，编码“管家基因”分选酶A(SrtA)的srtA基因座存在于所有分析GBS菌株的不同基因组区域中[103]。各菌毛基因组岛编码三种LPXTG蛋白：代表主要菌毛亚基的骨架蛋白(BP)，和两种辅助蛋白(AP1和AP2)。此外，各岛编码至少两类C分选酶，其各自具有针对辅助蛋白之一的特异性[1；104]。最近已解析若干菌毛相关分选酶的晶体结构，来自肺炎链球菌的SrtC1-3[4]、来自口腔放线菌(Actinomyces oris)的AcSrtC-1[105]，以及来自猪链球菌(S.suis)的SrtC1(106)，仅猪链球菌SrtC1处于开放活性位点的构象。此外，化脓性链球菌(S.pyogenes)Spy_0129的晶体结构已被解析，显示其术语B类分选酶家族，不同于其它表征的菌毛特异性分选酶(属于C类)。我们先前已报道了GBS SrtC1-2a的结构和功能表征。GBSSrtC1-2a的可溶核心晶体结构，包含其催化结构域，指示SrtC1利用由His157-Cys219-Arg228组成的催化性三联体，这对菌毛纤维形成是必需的并且由一个称作“盖”的环覆盖，盖对于分选酶体内活性而言是非必需的[3]。然而，晶体结构表明SrtC1通过盖的存在被折叠成自动失活酶，盖在空间上阻碍活性位点。盖区域在酶调节和活性中的功能仍不清楚，但已表明在选择合适的菌毛蛋白用于聚合方面起着重要作用。在该工作中，我们第一次揭示通过采用催化性酶浓度有效重组BP高分子量结构。

方法

细菌菌株和生长条件

GBS 515菌株和突变体在37℃下于托-休二氏培养基(THB)或胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)(补充有5％绵羊血)中生长。

重组蛋白的克隆、表达和纯化

将蛋白质SrtC1_43-292,(SEQ ID NO:3不带信号和跨膜结构域)、SrtC1_Y86A(SEQ ID NO:48)和SrtC1_Δ盖(SEQ ID NO:12)表达为His-MBP、TEV可切割的融合蛋白，并如先前所述纯化[3]。将包含菌毛素基序和分选信号的重组BP_30-649克隆进入speedET载体，并如先前所述表达[107]，通过PIPE定点诱变，采用野生型BP_30-649生成BP_K189A。将不含C末端LPxTG基序的重组BP_30-640克隆进入speedET载体，并表达并采用于用于野生型BP的相同方案纯化为N末端His-标签，TEV可切割的融合蛋白。抗血清

通过用纯化的重组蛋白免疫CD1小鼠来产生针对BP-2a和AP1-2a蛋白的抗血清[107,108]。

互补载体构建和位点特异性诱变

如前报道[1]产生BP的GBS敲除(KO)突变菌株。就对应于野生型BP(SAL_1486)的互补载体DNA片段的产生而言，从GBS 515基因组PCR扩增基因，并将产物克隆进入大肠杆菌-链球菌穿梭载体pAM401/gbs80P+T，如前所述[11,27]并包含gbs80基因的启动子和终止子区域(TIGR注释为SAG_0645)。pAM_BP的定点诱变采用PIPE(聚合酶不完全引物延伸)方法进行[19]。将互补载体pAM_BP_ΔLPXTG和pAM_BP_K189A电转化进入KO菌株ΔBP。互补通过由Western印迹检查BP表达来确认。

Western印迹分析

将对数中期细菌细胞悬浮于含有400U变溶菌素(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))和COMPLETE蛋白酶抑制剂(罗氏(Roche))的50mM Tris-HCl中。然后使该混合物在37℃孵育1小时，并通过三轮冻融来裂解细胞。通过离心移出细胞碎片，并采用BCA蛋白试验(伊利诺伊州罗克福的皮尔斯公司(Pierce))来测定蛋白质浓度。使总蛋白提取物(20μg)或重组菌毛在3-8％或4-12％NuPAGE预制凝胶(英杰公司(Invitrogen))通过SDS-PAGE分离，并转移至硝化纤维素上。膜用针对BP和AP1蛋白的小鼠抗血清(1:1,000稀释)探测，然后用兔抗小鼠辣根过氧化物酶-偶联的二抗(丹麦格洛斯楚普的丹可公司(Dako))探测。然后，用Opti-4CN底物试剂盒(伯乐公司(Bio-Rad))观察条带。

结果

推断的菌毛素基序中的赖氨酸189和BP-2a的IPQTC分选信号对于通过野生型分选酶C的菌毛形成是必需的。

在GBS菌毛素2a，BP-2a(菌株515，TIGR注释SAL_1486)的骨架蛋白中，我们鉴定了推断的菌毛素基序，其包含高度保守的赖氨酸残基(Lys189)和残基641-646处的IPQTGG基序作为C末端分选基序(图3A)。为了研究各残基/基序在菌毛组装中的特定作用，我们采用定点诱变和互补研究，对先前用于GBS敲除(KO)突变菌株的互补研究的载体pAM401采用PIPE(聚合酶不完全引物延伸)诱变方法。作为供于特定突变/缺失的PCR的引入模板，我们采用携带BP-2a基因的互补载体(pAM_BP)。

为了评价菌毛素基序和IPQTGG基序中的Lys189在BP-2a的细胞壁分选信号(CWSS)中的作用，我们生成了表达突变骨架蛋白的质粒(pAM_BP_K189A)，该突变骨架蛋白携带有菌毛素基序赖氨酸残基被丙氨酸取代的突变，和携带整个IPQTG分选信号缺失的第二质粒(pAM_BP_ΔIPQTG)。BP-2a的K189和C末端分选信号均是菌毛聚合和辅助蛋白嵌入高分子量结构所绝对必需的(图3B)。当K189突变成丙氨酸时，仅能鉴定BP的单体形式，而当分选信号IPQTG在BP中缺失时，除了BP的单体形式以外还观察到了较高分子量条带(图3C)。采用针对BP和AP1产生的抗体进行的免疫印迹显示，该较高分子量条带耐受SDS处理，并包含在骨架蛋白(BP)和主要辅助蛋白(AP1)中(图3C)。无法发生BP聚合，因为其分选信号缺失，但是BP的菌毛素基序仍然可用于形成BP菌毛素基序和AP1分选信号之间的共价键。

LPXTG-样分选信号是通过SrtC1_Y86A突变体体外介导的转肽反应所必需的，但菌毛素基序并非如此。为了研究菌毛素基序和IPQTG分选信号中的Lys189在体外聚合反应中的特定作用，我们在大肠杆菌中表达并纯化了BP-2a蛋白的突变形式，BP_ΔIPQTG和BP_K189A，其分别携带有IPQTG区缺失和Lys189被丙氨酸取代的突变。在将活性SrtC1_Y86A与重组BP_ΔIPQTG突变体混合后，无法检测到HMW聚合物，证实聚合化反应通过分选信号的切割和SrtC1_Y86A与IPQTG基序之间的酰基-中间物的形成来发生(图14A)。相反，在将活性SrtC1_Y86A与BP_K189A孵育的反应中，无法观察到HMW聚合物，指示菌毛素基序中的Lys残基(K189)其并非体外聚合所必需(图.14B)，这与GBS中发生的不同。此外，当SrtC1Y86A与辅助蛋白(AP1-2a和AP2-2a)的重组形式混合时，其仅在BP-2a蛋白存在下能够被体内聚合(数据未显示)，形成一些HMW结构(图14C)。这些数据证明，SrtC1Y86A能利用不同的亲核体来分解所述酶和LPXTG-样分选信号之间的酰基-中间物。因此，由于菌毛素基序并非必需，令人吃惊的是该发现表明突变型酶可用于更宽范围的反应，并且能够催化与已添加LPXTG基序的蛋白质的反应。

野生型SrtC1-2a无法诱导重组BP体外聚合。

GBS表面上的菌毛的存在通过对细胞壁制备物进行免疫印迹分析，通过SDS-PAGE上的梯状高分子量条带来表征，其中GBS BP单体共价连接，形成菌毛骨架[1]。为了测试与骨架蛋白底物的相互作用诱导SrtC1的盖开放活性构象的假说，我们测试了重组SrtC1(r-SrtC1)和重组骨架蛋白(r-BP)的体外功能活性(107)，通过考察梯度SDS凝胶上的高分子量条带图形来进行所述测试。将携带菌毛素基序K189和C末端LPxTG识别位点的重组GBS主要菌毛素亚基BP与WTSrtC1以不同比例混合，并在37℃孵育不同时间，达到用于肺炎链球菌SrtC1的同样高酶量[4]。然而，这些样品的SDS-PAGE分析显示，没有形成可能代表菌毛聚合物的高分子量条带(图4A)，但仅形成一种复合物，所述形成与由rSrtC1和rBP形成的杂二聚体(如先前关于肺炎链球菌所述)[4]以及同样在SrtC1不存在时形成的二聚体BP-BP的形成相当(图4B)。

通过重组SrtC1 盖突变体可在体外组装BP高分子量结构。

为了证实我们的“催化性半胱氨酸被Tyr86芳环锁闭”的假说，我们通过将重组SrtC-1_Y86A[3]与重组纯化的BP混合的相同实验，然后我们测试了该分选酶突变体对聚合GBS BP单体的能力。当将单体r-BP与rSrtC1_Y86A孵育时，能够生成SDS-PAGE可见的，分子量高于260kDa的典型菌毛图形条带(图5A)。48小时后淬灭该反应，并采用αBP抗体通过Western印迹分析，检查BP聚合相对于GBS 515菌株的野生菌毛的特定梯状(图5B)。

因为BP单体的部分在反应10天后仍然保持未加工，我们测试较高酶量是否能够获得聚合物结构中单体BP的完全转换。

我们发现，将10～100μM浓度的酶与固定BP浓度混合并不改变重组BP聚合物形成的速率(图5C)。采用25μM的固定酶浓度用于聚合反应，测试到了不同的单体BP浓度(图5D)。

通过重组SrtC1y86A突变体的BP高分子量结构的体外形成由LPXTG和菌毛素单元介导。

为了证实BP的聚合通过正确单元发生，通过将r-BP_ΔLPXTG和r-BP_K189A与SrtC1_Y86A孵育测试体外聚合证实，该聚合通过切割LPXTG分选信号和连接至下一个亚基的菌毛素基序的序列来发生。

大规模重组BP HMW结构生成和纯化

从革兰氏阳性细菌纯化菌毛素非常具有挑战性，并且耗时，并且仅能纯化低量物质。因为我们能够在50μl的反应体积中实现BP聚合，我们尝试提高生成重组菌毛产物的规模。我们发现，通过采用25μM的酶和100μM的BP获得了最佳反应条件。反应体积是重要的，因为采用多至100μl的反应降低BP聚合的效率。我们采用各100μl的这些浓度的底物和酶进行了10次反应，目的是获得总量6.5mg的纯BP，然后我们将该反应在还原剂的存在下孵育7天。在该时间之后，反应汇集物(总共1ml)通过凝胶过滤分离。从单体BP和SrtC1分离出大部分包含高分子量菌毛的两个分级分离部分，并经定量包含0.5mg的菌毛(图6)。图7显示突变型分选酶聚合来自不同革兰氏阳性细菌的菌毛蛋白。使SrtC1_Y86A(GBS PI-2a分选酶C1)与GBS的骨架蛋白PI-1(也称作GBS 80)(图7A)或与来自肺炎链球菌的菌毛蛋白(也称作RrgB)(图7B)孵育。

结论

革兰氏阳性细菌中，菌毛的共价连接需要特定分选酶的作用。GBS中的菌毛2a生物合成由两种分选酶(SrtC1和SrtC2)促进，所述分选酶聚合BP并显示辅助蛋白底物特异性。先前我们已显示由His、Cys和Arg残基组成的三联体是SrtC-1活性所必需的。然而，晶体结构清楚指示GBS SrtC1因催化口袋中盖的存在而自动抑制。最近，我们的团队通过采用自淬灭荧光肽与重组GBS SrtC1野生型和盖突变体混合以监测底物切割来检测了GBS SrtC1的催化活性，而我们发现盖突变体甚至比野生型更具活性。这些数据，根据采用盖突变的体内实验，表明分选酶C的活化可能通过构象改变而发生，该构象改变导致盖从催化位点移开，所述催化位点可被蛋白质底物诱导。

从这些观察开始，我们采用重组GSB SrtC1野生型和盖突变体与重组骨架菌毛蛋白混合进行体外实验，并且我们观察到野生型SrtC1酶无法诱导重组BP蛋白聚合。通过重组SrtC1-2a的盖区域中的单一突变获得了体外酶活化，该突变增强了体外BP聚合和重组菌毛形成。这些实验表明，对于SrtC，菌毛亚基的识别和聚合后的机制可能不仅依赖于菌毛轴蛋白与分选酶之间的相互作用，因为该酶活化并不能简单地通过混合SrtC1 WT和BP来体外实现。采用盖突变体进行的实验指示，盖尤其是该环中Tyr86的存在阻碍BP聚合。我们的工作首次提供了关于通过盖的存在的分选酶C酶自我抑制的直接证据，并且为研究通过利用由分选酶活性突变体聚合的重组菌毛柱状的菌毛开拓了领域，减少了对来自病原性细菌的野生型菌毛进行大量纯化的必要性。此外，革兰氏阳性细菌表面上许多表面毒力因子的锚定通过分选酶活性介导，因此，这些酶是用于设计新型抗感染治疗的有吸引力的靶标。

实施例2：采用体外聚合的菌毛的免疫研究。

体外聚合的菌毛结构可用于小鼠的免疫研究。例如，可将10μg的纯化的重组菌毛与佐剂(例如，明矾)混合，并以200μl的终体积注射进入小鼠。这之后可进行一次或多次加强免疫。然后分析小鼠对菌毛结构的免疫应答。该免疫应答可以是针对单体菌毛蛋白原始来源的细菌的保护性免疫应答。

已进行免疫反应，其中小鼠用按照本发明方法生成的包含GBS59的单体菌毛联合明矾免疫，并在后续用GBS攻击之后评估保护性免疫应答。将结果与采用相似方案用非菌毛形式的重组GBS59和明矾、SrtCM1(Y86A)突变体和明矾、CrmIa和明矾的免疫作比较。免疫实验的测定结果见下表4所示。

表4：采用GBS59菌毛的免疫

这些结果显示，采用按照本发明方法的突变型分选酶C酶生成的GBS59相较于重组单体蛋白而言显著更有效于产生针对GBS的保护性免疫应答，并且等同于采用CRM Ia。

实施例3：BP-2a(GBS59)变体的体外聚合。

我们测试了分选酶突变体聚合对应于SEQ ID:74、75、76、77、78和79的GBS59的GBS BP单体的变体的能力。

细菌菌株和生长条件

本研究中使用的GBS株系为2603V/R(血清型V)、515(Ia)、CJB111(V)、H36B(血清型Ib)、5401(II)和3050(II)。细菌生长于37℃的托-休二氏培养基(THB；迪菲克实验室(Difco Laboratories))或补充有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂中。

重组蛋白和抗血清的克隆、表达、纯化。

通过革兰氏阳性菌标准方案用NucleoSpin组织试剂盒(MN公司(Machery-Nagel))按照生产商说明分离基因组DNA。与515、CJB111和2603等位基因变体(分别为TIGR注释SAL1486、SAM1372和SAG1407)对应，全长重组BP-2a蛋白如前述生成(Margarit等,Journal of Infectious Diseases,2009,199:108-115)，而全长H36B变体(TIGR注释SAI_1511)使用株H36B作为DNA来源克隆到pET24b+(诺瓦基公司)。设计引物以扩增没有信号肽的编码区域以及起始于LPXTG基序的3'末端序列。

为了表达重组蛋白，对于pET克隆，培养物用1mM IPTG诱导后在25℃维持5小时，或对于SpeedET克隆用0.2％阿拉伯糖。所有重组蛋白用亲和色谱和凝胶过滤纯化。简言之，通过离心收获细胞并在裂解缓冲液摂中裂解，所述缓冲液含溶于PBS的10mM咪唑、1mg\ml溶菌酶、0.5mg\ml DNA酶和COMPLETE抑制剂混合物(罗氏公司(Roche))。裂解物离心澄清并应用在含10mM咪唑的PBS中预平衡的His捕获HP柱(安玛西亚生物科学公司(Armesham Biosciences))。用20mM和50mM咪唑缓冲液进行两次清洗步骤后，用含250mM咪唑的相同缓冲液进行蛋白洗脱。然后浓缩所洗脱的蛋白并且加载到用PBS预平衡的HiLoad 16/60Superdex 75(安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences))。

通过用前述纯的重组蛋白免疫CD1小鼠生产对各蛋白特异的抗血清(WO90/07936)。由ELISA监控所收集血清中的蛋白特异性免疫反应(总Ig)。

我们发现，同之前一样，将10～100μM浓度的酶与固定BP浓度混合并不改变重组GBS59聚合物形成的速率。GBS59变体单体以1:1:1:1:1:1比例混合。采用固定的25μM酶浓度用于聚合反应，同样测试单体BP GBS59变体的不同浓度混合物。

采用Bp-2a的三种变体(H36B、515、CJB111)的体外聚合

BP-2a(变体H36B、515、CJB111)浓度：各35μM-共105μM。

SrtC1_Y86A浓度：25μM

缓冲液：25mM Tris-HCl pH 7,5–100mM NaCl-1mM DTT

总反应体积100μl

37℃孵育48小时

当将单体r-BP的变体混合物与rSrtC1_Y86A孵育时，能够生成SDS-PAGE可见的，分子量高于260kDa的典型菌毛图形条带(图11)。48小时后淬灭该反应，并采用αBP抗体通过Western印迹分析，检查BP聚合相对于野生菌毛的特定梯状。包含GBS59各变体的菌毛经生成并用于免疫。在上述操作之后的小鼠疫苗接种成功保护针对三种GBS菌株每种的攻击。相反，仅用一种变体形式免疫接种的小鼠仅保护针对该特定菌株的攻击。令人吃惊的是，相较于重组单体蛋白而言，这些人造菌毛更有效于产生响应GBS的保护性免疫应答。

实施例4：采用两种类型的骨架蛋白(BP-2a+菌毛1BP(BP-1)和/或肺炎球菌RrgB)的体外聚合：

在上述操作之后，制备包含来自无乳链球菌和肺炎球菌的骨架蛋白的嵌合菌毛：

BP浓度：各50μM-共100μM。

SrtC1_Y86A浓度：25μM

缓冲液：25mM Tris-HCl pH 7,5–100mM NaCl-1mM DTT

总反应体积100μl

37℃孵育48小时

如图12A和图12B中所示，HMW条带的存在证明突变型分选酶C酶聚合来自其它细菌菌株/类型的蛋白质的能力。在上述操作之后，对小鼠进行免疫接种成功地保护针对B组链球菌和肺炎链球菌的共同攻击(数据未显示)。本发明的分选酶还能够聚合GBS67和BGS59的组合。

实施例4：突变型SrtC能够聚合GFP-IPQTG

采用诱变将“IQTGGIGT”序列加至GFP蛋白DNA序列的C末端：所用引物：

GFP-lpxtg_F

attccacaaacaggtggtattggtacaTAACGCGACTTAATTAAACGG

GFP-lpxtg_R1

TGTACCAATACCACCTGTTTGTGGAATCTTGTACAGCTCGTCCATGCC

诱变DNA模板：SpeedET载体+GFP

EGFP DNA序列如下(来自pSpeedET)：

CTTTAAGAAGGAGATATACATACCCATGGGATCTGATAAAATTCATCATCATCATCATCACGAAAACCTGTACTTCCAGGGCatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagTAACGCGACTTAATTAAACGGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATC

EGFP氨基酸序列如下(来自pSpeedET)：

MGSDKIHHHHHHENLYFQGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK

诱变后的核酸序列：

CTTTAAGAAGGAGATATACATACCCATGGGATCTGATAAAATTCATCATCATCATCATCACGAAAACCTGTACTTCCAGGGCatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagattccacaaacaggtggtattggtacaTAACGCGACTTAATTAAACGGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATC

诱变后的氨基酸序列：

MGSDKIHHHHHHENLYFQGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKIPQTGGIGT-

重组“GFP-IQTGGIGT”的生成：表达与纯化

GFP-IPQTGGIGT在HK100中表达，在LB+卡那霉素30ug\ml，采用30℃下的Biosilta培养基，用终0.15％的阿拉伯糖诱导。纯化：标准IMAC

GFP-IQTGGIGT和SrtC1Y86A聚合反应：

使25uM SrtC1Y86A与25-50或100uM GFP-IPQTGGIGT在缓冲液25mMTris pH7.5,150mM NaCl,DTT1mM中于37℃下在热混合器中混合72小时。反应体积50ul。

如图13所示，SrtC1_Y86A突变体能够聚合GFP-IPQTG。

实施例5：重组PI-2b SrtC1和SrtC2蛋白具有体外活性，并且能够切割携带菌毛蛋白LPXTG-样基序的荧光肽

克隆全长SrtC1和C2(采用菌株COH1作为模板)，并于His-MBP-标签融合。然后，在大肠杆菌中表达重组酶，并用IMAC或IMAC与MBP-捕获柱纯化。采用携带PI-1骨架蛋白和PI-1次级辅助蛋白的LPXTG分选基序的合成荧光肽，使用纯化的分选酶进行FRET试验，以评估催化活性。PI-2b SrtC1和SrtC2酶能够切割荧光肽。这些数据证明，PI-2b SrtC1和SrtC2酶具有体外活性，并且适合用于连接和聚合蛋白质。

采用以下PCR方案和条件：

SrtC1酶的纯化-IMAC

-3升表达SrtC1-MBP-His构建体的Rosetta细胞培养物

-收集且裂解团块

-向30ml裂解物添加10mM咪唑

-柱：5ml和4流(约5ml/分钟)

-加载裂解物并通过流收集

-用15ml含10mM咪唑的缓冲液洗涤(最初3ml是柱的死体积)

-用15ml含20mM咪唑的缓冲液洗涤

-用300mM咪唑缓冲液10ml洗脱

-添加1mM DTT-蛋白质用亚米康(amicon)以6000rpm至4℃离心20分钟

-终蛋白质浓度是1.78mg/ml

SrtC2酶的纯化-IMAC

-3升表达SrtC2-MBP-His构建体的Rosetta细胞培养物

-2个柱(30ml的含细胞裂解物的团块+20ml缓冲液10mM)50ml FT

-用20ml的缓冲液10mM预冲洗

-用50ml的缓冲液10mM冲洗

-用150ml的缓冲液20mM冲洗

-洗脱缓冲液300mM：5ml死体积，10ml洗脱物2+20μl DTT 1M，10ml洗脱物3

-合并洗脱物1和3，而向10ml洗脱物2添加10ml的300mM NaCl，50mM和Tris pH8

SrtC2酶的纯化-MBP-捕获

-2柱使用MBP-捕获

-柱用50ml含麦芽糖的缓冲液洗涤(Tris 50mM,150mM NaCl,pH8麦芽糖100mM)

-用50ml尿素8m pH8–Tris 50mM洗涤

-用蒸馏水(80ml)洗涤

-用25ml的Tris缓冲液50mM pH8，用水以1:2稀释的300mM NaCl-洗脱物2上样

-洗脱物1+3上样

-洗涤

-用含麦芽糖的缓冲液洗脱

FRET分析

含热荧光(termofluor)塑料的封闭板。

1)50μl缓冲液(300mM NaCl+50mM Tris pH8)+50μl 1515+1μl BP肽

2)50μl缓冲液(300mM NaCl+50mM Tris pH8)+50μl 1515+1μl AP2肽

3)100μl 1515+1μl BP肽

4)100μl 1515+1μl AP2肽

5)100μl洗脱缓冲液(300mM咪唑)+1μl BP肽

6)100μl洗脱缓冲液(300mM咪唑)+1μl AP2肽

我们采用200μl[1.78mg/ml]浓缩蛋白质+2μl BP和AP2的LPXTG肽，并且采用洗脱缓冲液300mM咪唑代替蛋白质作为对照。

Tecan平板读数仪-300循环，采用每10分钟测量，温度[34-37.5℃]以37℃为最优和波长[400nm-600nm]获得最大吸光度至500nm处提供。

实施例6：SrtC1有效聚合BP

进一步通过采用不表达任何菌毛的突变型GBS菌株(515Δ2a)来评估SrtC1活性。该菌株用携带编码单独BP或BP与PI-2b SrtC1基因的互补载体PAMp80/t80转化。通过weatern印迹分析互补载体重建菌毛聚合的能力。如图10所示，采用单独BP的转染不导致任何聚合。然而，采用BP和SrtC1的转染导致形成高分子量聚合物。表达菌毛2b的菌株A909作为阳性对照使用。

图10提供互补有含SrtC1和BP基因或单独BP基因的质粒的来自515Δ2a突变菌株和来自野生型A909菌株的western印迹。采用针对SrtC1的抗体。30kDa处的预期信号证实SrtC1的表达和正确定位。这些数据证明PI-2b SrtC1有效于聚合菌毛。采用以下PCR方案和条件：

电穿孔

100μl的A909和515Δ2a菌株用3/7μl的Spb1(BP–PI-2b)或Spb1+SrtC1(PI-2b)转化。

接种

在10ml THB+clm甘油中。

使细胞沉淀并用25ml PBS洗涤

-940μl TRIS pH 6.8,50mM+60μ(10U/μl)

-在37℃振荡2小时

凝胶和western印迹GBS提取物

-10提取物以最高速离心10分钟

-30μl上清液+15μl的LDS+5μl的还原

-沉淀重悬于2％缓冲液TRIS 50mM SDS pH8300mm NaCl

-western印迹和膜清洗

-用水洗涤

-用5％牛乳搅拌2小时

-用PBS漂洗

-每张膜上5ml 1％牛乳+抗体(抗-Spb1对于培养物上清液，而抗SrtC1对于沉淀)

-在冷室中振荡留置过夜-用10ml的PBS-吐温0.05％洗涤10分钟3次

-用PBS洗涤5分钟

-20ml的1％牛乳+P161抗-小鼠抗体并在搅拌下放置1小时

-用PBS洗涤

-制备显影溶液(10ml＝9ml水+1ml稀释剂+200μl样品底物+)-5ml/膜

序列表

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Claims

1.一种连接至少两个部分的方法，所述方法包括在适合发生分选酶介导的转肽反应的条件下使所述至少两个部分与菌毛相关的分选酶C酶在体外接触，其中所述菌毛相关的分选酶C酶包含暴露的活性位点。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌毛相关的分选酶C酶来自链球菌(Streptococcus)。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述链球菌选自下组：无乳链球菌(GBS)、肺炎链球菌(肺炎球菌)和酿脓链球菌(GAS)。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌毛相关的分选酶C酶是分选酶C1酶(srtC1)、分选酶C2酶(SrtC2)或分选酶C3酶(SrtC3)。

5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述菌毛相关的分选酶C酶突变包含盖的部分或全部缺失。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述突变包括GBS PI-2a分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第84、85和/或86位氨基酸缺失，或另一种菌毛相关的分选酶C酶的氨基酸序列中相应位置处的氨基酸缺失。

7.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述突变包括PI-2a的GBS分选酶C1酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第84、85和/或86位氨基酸取代，或另一种分选酶C酶的氨基酸序列中相应位置处的氨基酸取代。

8.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述菌毛相关的分选酶C酶包含或由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和71。

9.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少两个部分包含LPxTG基序和菌毛素基序。

10.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少两个部分来自革兰氏阳性细菌。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述至少两个部分来自相同的革兰氏阳性细菌或来自不同的革兰氏阳性细菌。

12.如权利要求9或权利要求10所述的方法，其特征在于，所述至少两个部分是链球菌多肽。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述至少两个部分是链球菌骨架蛋白和/或辅助蛋白。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述至少两个部分包含或由如下氨基酸序列组成：(a)与具有SEQ ID NO:72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97中任一氨基酸序列的多肽具有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)的氨基酸序列；或(b)是这些序列之一的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是20或更大(例如，25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150或更大；例如，20或更大；或例如50或更大；或例如80或更大)。

15.一种由权利要求1～14中任一项所述方法获得或可获得的人造菌毛。

16.一种人造菌毛，其包含骨架蛋白GBS59的至少两个变体，并且其中所述至少两个变体选自下组：B组链球菌菌株2603、H36B、515、CJB111、CJB110和DK21。

17.如权利要求15或16所述的人造菌毛，所述人造菌毛用于医药。

18.如权利要求15或16所述的人造菌毛，所述人造菌毛用于预防或治疗链球菌感染。

19.一种治疗或预防有需要的患者内的链球菌感染的方法，所述方法包括给予所述患者有效量的如权利要求15或16所述的人造菌毛。

20.如权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少两个部分包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含氨基酸基序LPXTG，其中X是任何氨基酸，所述第二部分包含至少一个氨基酸。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述第一部分是第一多肽且所述第二部分是第二多肽。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述第一多肽和所述第二多肽来自革兰氏阳性细菌。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述第一多肽和所述第二多肽来自相同的革兰氏阳性细菌或来自不同的革兰氏阳性细菌。

24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一多肽和所述第二多肽是链球菌多肽。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述第一多肽和所述第二多肽是链球菌骨架蛋白和/或辅助蛋白。

26.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述第一部分或所述第二部分包含可检测标记物。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述可检测标记物是荧光标记物、放射性标记物、化学发光标记物、磷光标记物、生物素标记物或链霉亲和素标记物。

28.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述第一部分或所述第二部分是多肽，且其它部分是细胞表面上的蛋白质或糖蛋白。

29.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述第一部分或第二部分是多肽，且其它部分包含偶联至固体支持物的氨基酸。

30.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述第一部分或第二部分是多肽，且其它部分包含偶联至多核苷酸的至少一个氨基酸。

31.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述第一部分和第二部分是多肽链的N末端和C末端，并且连接导致形成环状多肽。

32.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述菌毛素基序包含氨基酸YPAN。

33.一种药盒，所述药盒包含来自无乳链球菌的PI-2b分选酶C1或PI-2b分选酶C2酶，和包含氨基酸基序LPXTG的部分，其中X是任何氨基酸。

34.一种由权利要求20～31中任一项所述方法获得或可获得的偶联物。