MX2014010011A - Proteinas y composiciones de pilus. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos para formar pili in vitro y proteínas apropiadas para el uso en estos métodos. La invención también proporciona pili producidos por estos métodos y composiciones que comprenden estos pili para el tratamiento y prevención de una enfermedad bacteriana, en particular de las afecciones causadas por Streptococcus.

Description

PROTEINAS Y COMPOSICIONES DE PILUS CAMPO DE LA INVENCION La invención proporciona métodos para formar pili (pelos) in vitro y enzimas de sortasa mutantes y proteínas apropiadas para el uso en estos métodos. La invención también proporciona pili producidos por estos métodos y composiciones que comprenden estos pili para el tratamiento y prevención de enfermedades bacterianas, en particular de afecciones causadas por Streptococcus . La invención también proporciona métodos generales para ligar proteínas y enzimas de sortasa para el uso en los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La mayoría de los patógenos bacterianos comprenden pili (también conocidos como fimbria), estructuras filamentosas largas que se extienden desde su superficie, que a menudo son responsables de la adhesión inicial de bacterias a tejidos durante la colonización del hospedero. Las bacterias Gramnegativas se han conocido durante muchos años que tienen pili, formados típicamente por interacciones no covalentes entre las subunidades de pilina. Más recientemente, las bacterias Grampositivas , incluyendo las bacterias de Streptococcus, también se han mostrado que tienen pili formados típicamente a través de la asociación covalente de sub-unídades por sortasas que se codifican por islas de REF. : 250152 patogenicidad específica del pilus.

La bacteria Grampositiva Streptococcus agalactiae (o "estreptococo del grupo B" , abreviado por "GBS"), por ejemplo, tiene tres variantes de pilus, cada una codificada por una isla de patogenicidad distinta, PI-1, PI-2a o PI-2b [1, 2] . Cada isla de patogenicidad consiste de: i) genes que codifican los tres componentes estructurales del pilus (la proteína de la estructura de pilus (BP) y 2 proteínas auxiliares (API y AP2 ) ) ; y ii) genes que codifican 2 proteínas sortasa (SrtCl y SrtC2) que están involucrados en el montaje del pilus. Todas las cepas de GBS portan por lo menos una de estas 3 islas de patogenicidad.

Las islas de patogenicidad similares están presentes en otras bacterias Grampositivas incluyendo Streptococcus pyogenes o "estreptococos del grupo A" , abreviado como "GAS")/ y Streptococcus pneumoniae (también conocida como neumococo) . La isla de patogenicidad en neumococo codifica los 3 componentes estructurales del pilus (RrgA, RrgB y RrgC) y tres sortasas (SrtCl, SrtC2 y SrtC3) que catalizan la formación de pilus. En GAS, las regiones de FCT codifican las proteínas estructurales y accesorias y la polimerización de estas proteínas también es mediada por una sortasa (SrtCl) .

Las estructuras de pilus en estas bacterias Grampositivas se consideran que son candidatos de vacunas interesantes y se ha hecho un trabajo sobre la valoración de la inmunogenicidad de las proteínas recombinantes purificadas de las estructuras de pilus. También es deseable estudiar estas proteínas en su forma nativa dentro de los pili montados, pero actualmente, la única manera de hacer esto es mediante el proceso laborioso de purificar los pili de tipo silvestre de las bacterias. Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar un proceso para producir pili recombinantes in vitro sin la necesidad de purificar los pili de tipo silvestre.

Las bacterias estreptocócicas descritas anteriormente, se asocian con varias enfermedades. GBS causa bacteremia y meningitis en individuos inmunocomprometidos y en neonatos. GAS es un patógeno humano frecuente, que se estima que está presente entre 5-15% de los individuos normales sin signos de enfermedad. Cuando las defensas del hospedero están inmunocomprometidas o cuando GAS se introduce a tejidos o hospederos vulnerables, se presenta una infección aguda. Las enfermedades causadas por GAS incluyen fiebre puerperal, escarlatina, erisipelas, faringitis, impétigo, fascitis necrótica, miositis y síndrome de choque tóxico estreptocócico . El neumococo es la causa más común de meningitis bacteriana aguda en adultos y en niños mayores de 5 años de edad.

Las investigaciones se han llevado a cabo en el desarrollo de vacunas a base de proteínas contra estas bacterias estreptocócicas , pero actualmente, no están disponibles comercialmente vacunas a base de proteínas. Por lo tanto, hay una necesidad de vacunas efectivas contra la infección estreptocócica. Es un objetivo adicional de la invención proporcionar composiciones inmunogénicas que puedan ser usadas en el desarrollo de vacunas contra la infección estreptocócica .

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un primer aspecto de la invención proporciona un método para ligar por lo menos dos radicales, que comprende poner en contacto por lo menos los dos radicales con una enzima de sortasa C relacionada con pilus in vitro, bajo condiciones apropiadas para que se presente una reacción de transpeptidación mediada por sortasa, en donde la enzima de sortasa C relacionada con pilus comprende un sitio activo expuesto .

Particularmente, la enzima de sortasa C relacionada con pilus es de Streptococcus , más particularmente de Streptococcus agalactias (GBS) , Streptococcus pneumonía (neumococo) y Streptococcus pyogenes (GAS) . Aún más particularmente, la enzima de sortasa C relacionada con pilus es una enzima de sortasa Cl (srtCl) , enzima de sortasa C2 (SrtC2) o una enzima de sortasa C3 (SrtC3) .

En algunas modalidades, la mutación de la enzima de sortasa C relacionada con pilus comprende una supresión de la parte o todo de la tapa. Particularmente, la mutación comprende una supresión de los aminoácidos en las posiciones 84, 85 y/u 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) , o la supresión de los aminoácidos en las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácido de otra enzima de sortasa C relacionada con pilus .

En otras modalidades, la mutación comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 84, 85 y/u 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3), o la sustitución de los aminoácidos en las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácido de otra enzima de sortasa C.

En particular, la enzima de sortasa C relacionada con pilus comprende o consiste de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 y 71.

En una modalidad de la invención, el método es un método para formar un pilus recombinante o artificial in vitro. Aquí, por lo menos dos radicales comprenden el motivo de LPxTG y un motivo de pilina. Por ejemplo, el motivo de pilina puede comprender los aminoácidos YPAN. 'X' en cualquier motivo de reconocimiento de sortasa descrito en la presente, puede ser cualquier aminoácido estándar o no estándar y se describe cada variación. En algunas modalidades, X se selecciona de los 20 aminoácidos estándares encontrados más comúnmente en las proteínas encontradas en los organismos vivientes. En donde el motivo de reconocimiento es LPXTG o LPXT, X puede ser D, E, A, N, Q, K o R. En particular, X se selecciona de K, S, E, L, A, N en un motivo de LPXTG o LPXT.

En particular, por lo menos dos radicales son de bacterias Grampositivas . Por lo menos dos radicales pueden ser de la misma cepa o tipo de bacterias Grampositivas o de cepas diferentes o tipos de bacterias Grampositivas. Aún más particularmente, por lo menos dos radicales son polipéptidos estreptocócicos . Aún más particularmente, por lo menos dos radicales son proteínas estructurales estreptocócicas y/o proteínas auxiliares.

Por ejemplo, por lo menos dos radicales comprenden o consisten de una secuencia de aminoácido: (a) que tiene 50% o más identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de cualquier de las SEC ID NOs : 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, ó 97; o (b) que es un fragmento de por lo menos (n' aminoácidos consecutivos de una de estas secuencias en donde '?' es 20 o más (por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más; por ejemplo, 20 o más; o por ejemplo 50 o más; o por ejemplo, 80 o más) .

En otros aspectos de la invención, se proporciona un pilus artificial o recombinante obtenido o que se puede obtener del método mencionado anteriormente. En una modalidad, se proporciona un pilus artificial o recombinante que comprende por lo menos dos variantes de la proteína estructural GBS59. Particularmente, por lo menos dos variantes se seleccionan de las cepas de Streptococcus del grupo B 2603, H36B, 515, CJB111, CJB110 y DK21. Aún más particularmente, el pilus artificial o recombinante es un pilus quimérico que comprende por lo menos una variante de la proteína estructural de GBS, GBS59, seleccionada de las cepas de Streptococcus 2603, H36B, 515, CJB111, CJB110 y DK21 y por lo menos una proteína estructural de Streptococcus pneumonía seleccionada del grupo que consiste de RrgA, RrgB y RrgC . En otras modalidades, pili artificiales o recombinantes además comprende GBS80 y/o GBS1523.

En los aspectos particulares de la invención, el pilus artificial o recombinante es para el uso en medicina, aún más particularmente, para el uso en la prevención o tratamiento de una infección estreptocócica . De esta manera, en otra modalidad, se proporciona un método para el tratamiento o prevención de una infección estreptocócica en un paciente con necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad efectiva de un pilus artificial o recombinante formado por los métodos de la invención a un paciente.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método, en donde por lo menos dos radicales comprenden un primer motivo que comprende el motivo de aminoácido LPXTG, en donde X es cualquier aminoácido, y un segundo radical que comprende por lo menos un aminoácido.

En particular, el primer radical es un primer polipéptido y el segundo radical es un segundo polipéptido. En algunas modalidades, el primer polipéptido y el segundo polipéptido son de bacterias Grampositivas o de diferentes tipos o cepas de bacterias Grampositivas. En algunas modalidades, el primer polipéptido y el segundo polipéptido son polipéptidos estreptocócicos . Por ejemplo, el primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden ser proteínas estructurales estreptocócicas y/o proteínas auxiliares.

En algunas modalidades de la invención, ya sea el primer radical o el segundo radical comprende una marca detectable . A manera de ejemplo no limitante, la marca detectable puede ser una marca fluorescente, una radiomarca, una marca quimioluminiscente , una marca fosforescente, una marca de biotina o una marca de estreptavidina . En algunas modalidades, el primer radical o el segundo radical puede ser un polipéptido y el otro radical puede ser una proteína o una glucoproteína sobre la superficie de una célula. En modalidades adicionales, ya sea el primer radical o el segundo radical es un polipéptido y el otro radical comprende los aminoácidos conjugados a un soporte sólido. En algunas modalidades adicionales, ya sea el primer radical o el segundo radical es un polipéptido y el otro radical comprende por lo menos un aminoácido conjugado a un polinucleótido .

El método de la invención puede usarse para ligar el N-terminal de un primer radical al N-terminal de un segundo radical. El método de la invención puede usarse para ligar el C-terminal de un primer radical al C-terminal de un segundo radical. Alternativamente, el primer radical y el segundo radical son el N-terminal y el C-terminal de un radical, tal como una cadena polipeptídica, y la ligación resulta en la formación de un polipéptido circular. De esta manera, se proporciona un conjugado obtenido o que se puede obtener del método descrito en la presente.

En otros aspectos de la invención, se proporciona un kit que comprende una enzima de sortasa Cl o una sor asa C2 de -Streptococcus agalactiae y un radical que comprende el motivo de aminoácido LPXTG, en donde X es cualquier aminoácido.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una enzima de sortasa C de Streptococcus que comprende una mutación en su región de tapa, particularmente una enzima de sortasa C de Streptococcus que es de Streptococcus agalactiae (GBS) , Streptococcus pneumonía (neumococo) o Streptococcus pyogenes (GAS). Aún más particularmente, una enzima de sortasa C de Streptococcus, en donde la enzima de sortasa C de Streptococcus es una enzima de sortasa Cl, enzima de sortasa C2 o una enzima de sortasa C3. En algunas modalidades, se proporciona una enzima de sortasa C de Streptococcus, en donde la mutación comprende la supresión de la parte o toda la región de tapa de la enzima de sortasa C. Particularmente, la mutación comprende de las posiciones de los aminoácidos en las posiciones 84, 85 y/u 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) , o la supresión de los aminoácidos en las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácido de otra enzima de sortasa C. En otras modalidades, se proporciona una enzima de sortasa C de Streptococcus, en donde la mutación comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 84, 85 y/u 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) , o la sustitución de los aminoácidos en las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácido de otra enzima de sortasa C.

En particular, se proporciona una enzima de sortasa C de Streptococcus que comprende una mutación en su región de tapa y en donde la enzima de sortasa C comprende o consiste de una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEC ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ó 71.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Alineación de las secuencias de la sortasa C de GBS que muestra la localización de la región de tapa en negritas y subrayado.

Figura 2 : Alineación de las secuencias de sortasa C de Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes (GAS) que muestran la localización de la región de tapa en negritas y subrayado .

Figuras 3A-3C: Fig. 3A: Motivos de aminoácidos conservados en la proteína estructural de pilus GBS 2a (BP-2a) , GBS59 (cepa 515, anotación TIGR SAL_1486) . Motivo de pilina: que contiene un residuo de lisina altamente conservado (Lysl89) ; E-box: que contiene un residuo de ácido glutámico altamente conservado (Glu589) ; Señal de clasificación: que contiene los residuos IPQTGG localizado en las posiciones 641-646. Fig. 3B: Inmunomanchado realizado con un anticuerpo que reconoce la proteína estructural de pilus de GBS 2a (a-??) , que muestra que Lysl89 del motivo de pilina de BP-2a se requiere para la polimerización de pilus por la sortasa C de tipo silvestre. Se generó un plásmido que codifica una mutante BP-2a que porta una sustitución en Lysl89 con Ala (BPKI89A) ¦ Una cepa mutante de GBS que carece de las proteínas estructurales (GBSABP) se transformó con este plásmido (carril 2) , o un plásmido de control que codifica BP-2a de tipo silvestre (BPWT) (carril 1) . El asterisco indica la localización de las bandas de la proteína que corresponden a la proteína de BP-2a monomérica, no polimerizada . Las bandas de la proteína de alto peso molecular, que corresponden a BP-2a polimerizada, son detectables únicamente en los extractos celulares de GBS transformados con el plásmido que codifica BP-2a de tipo silvestre (carril 1) . Fig. 3C: Inmunomanchados realizados con anticuerpos que reconocen la proteína estructural de pilus 2a de GBS (a-BP) (carriles 1, 2 y 3) o la proteína auxiliar de pilus 2a de GBS (a-API) (carriles 4 y 5) , que muestran que el motivo de IPQTG de BP-2a se requiere para la polimerización de pilus. Se generó un plásmido que codifica un BP-2a mutante que porta una supresión de la señal de clasificación IPQTG (BPMEQTG) . Una cepa mutante de GBS que carece de las proteínas estructurales (GBS^BP) se transformó con esta plásmido (carriles 3 y 4) . Como controles, se usó un plásmido de control que codifica BP-2a de tipo silvestre (BPWT) (carril 1) , o sin plásmido (???) (carriles 2 y 5) . El asterisco indica la localización de las bandas de proteína que corresponden a la proteína BP-2a monomérica, no polimerizada. El triángulo indica la banda de la proteína que corresponde a la proteína API raonomérica. El cuadro indica la banda de la proteína que corresponde a los conjugados de BP-2a-APl. Las bandas de proteínas de alto peso molecular, que corresponden a BP-2a polimerizado, son detectables únicamente en los extractos celulares de GBS transformados con el plásmido que codifica BP-2a de tipo silvestre.

Figuras 4A-4B: Figura 4A: Proteína que muestra que la sortasa de GBS de tipo silvestre no cataliza la polimerización in vitro de la proteína estructural de tipo silvestre. Se incubaron varias concentraciones de la proteína estructural recombinante (BP) (25, 100 y 200 µ?) a 37°C con la sortasa Cl de tipo silvestre de PI-2a (SrtClwT) durante 0, 24 y 48 horas. Las proteínas contenidas en la mezcla de reacción se resolvieron por electroforesis de gel de dodecilsulfato de sodio de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se visualizaron. No fue detectable la formación de bandas de alto peso molecular, que corresponden a BP polimerizada . El asterisco indica BP monomérica. El símbolo de número indica SrtClwT- Carril 1: BP 25uM+SrtClWT t0, Carril 2: BP 25µ? + SrtClWT t 24 h. Carril 3: BP 25µ? + SrtClWT t 48 h; Carril 4: BP 100 µ? + SrtClWT t 0, Carril 5: BP 100 µ? + SrtClWT t 24, Carril 6: BP 100 µ? + SrtClwr t 48 h; Carril 7: BP 200 µ? + SrtClWT t 0, Carril 8: BP 200 µ? + SrtClWT t 24. Figura 4B: El gel de proteína que muestra que la proteína estructural de tipo silvestre (BP) puede formar homodímeros de BP-BP en ausencia de la actividad de sortasa catalítica, explicando las bandas adicionales observadas en el panel A. Se incubaron varias concentraciones de BP recombinante (25 y 100 µ?) durante 0, 24, 48 y 72 horas y las proteínas contenidas en la mezcla de reacción se visualizaron por SDS-PAGE. Carril 1: BP 25 µ? tO h, Carril 2: BP 25 µ? t24 h, Carril 3: BP 25 µ? t48 h, Carril 4: BP 25 µ? t72 h; Carril 5: BP 100 µ? tO h, Carril 6: BP 100 µ? t24 h. Carril 7: BP 100 µ? t48 h, Carril 8: BP 100 µ? t72 h.

Figuras 5A-5D: Figura 5A: Un gel de proteína que muestra que una sortasa de GBS mutante que porta una mutación en la región de tapa es capaz de catalizar la polimerización in vitro de la proteína estructural (BP) de tipo silvestre. Se incubaron varias concentraciones de BP recombinante (100 y 200 µ?) con sortasa Cl mutante de PI-2a que porta una sustitución de tirosina a alanina en la posición 86 (SrtClY86A) durante 0, 24 ó 48 horas y las proteínas contenidas en la mezcla de reacción se visualizaron por SDS-PAGE. El asterisco indica BP monomérica. Las bandas de alto peso molecular (=260 kDa) , que corresponden a la BP polimerizada, fueron detectables después de 24 ó 48 horas de incubación. Carril 1: BP 100 µ? + SrtClY86A tO h, Carril 2: BP 100 µ? + SrtClY86A t24 h, Carril 3: BP 100 µ? + SrtClY86A t48 h; Carril 4: BP 200 µ? + SrtClY86A tO h, Carril 5: BP 200 µ? + SrtCly86A t24 h. Figura 5B : El inmunomanchado se realizó con un anticuerpo que reconoce la proteína estructural del pilus 2a de GBS (a??) , que muestra que el patrón de la BP polimerizada es similar a los polímeros de BP contenidos en pili de las bacterias de tipo silvestre (en la presente, cepa 515 de GBS) . El asterisco indica BP monomérica. Carril 1: BP, Carril 2: SrtClY86A, Carril 3 : BP + SrtClY86A, Carril 4: Pili de tipo silvestre GBS515. Figura 5C: Gel de proteína que muestra el efecto de diferentes concentraciones de SrtClY86A en la eficiencia de la polimerización de BP . 10, 50 ó 100 µ? de SrtClY86A se mezclaron con BP y se incubaron durante 0 horas, 48 horas, 3 y 4 días y las proteínas contenidas en las mezclas de reacción se visualizaron por SDS-PAGE. El asterisco indica la BP monomérica. Figura 5D : Gel de proteína que muestra el efecto de diferentes concentraciones de BP sobre la eficiencia de la polimerización de BP. 25, 50 ó 100 µ? de BP se mezclaron con 25 µ? de SrtClY86A y se incubaron durante 0 horas, 3 días, 5 días y 7 días y las proteínas contenidas en las mezclas de reacción se visualizaron por SDS-PAGE. El asterisco indica la BP monomérica.

Figura 6: Gel de proteína que muestra que las estructuras de pili polimerizados in vitro pueden purificarse exitosamente. 25 µ? de SrtClY86A se incubaron con 100 µ? de BP-2a a 37 °C durante 7 días. Las proteínas contenidas dentro de la mezcla se separaron en fracciones por cromatografía de exclusión de tamaño y se visualizaron por SDS-PAGE. Las fracciones de alto peso molecular que contienen la BP polimerizada purificada BP eluyen primero (cuadro blanco) , seguido de la BP tnonomérica (asterisco) y SrtCly86A (cruz) .

Figuras 7A-7B: Gel de proteína que muestra que las enzimas de sortasa mutantes polimerizan las proteínas de pilus de una variedad de bacterias grampositivas . Figura 7A: 25 µ? de SrtClY86A (sortasa Cl de GBS de PI-2a) se incubaron con 100 µ? de la proteína estructural PI-1 de GBS (también referido como GBS 80) a 37°C durante 7 días y las proteínas contenidas en las mezclas de reacción se visualizaron por SDS-PAGE. Como controles, se incubaron SrtCiY86A o GBS 80 sólo bajo las mismas condiciones. El asterisco indica BP monomérica. Carril 1: SrtClY86A/ Carril 2: PI-1 de BP, Carril 3: SrtClY86A + PI-1 de BP. Figura 7B: 25 µ de SrtClY86A (sortasa Cl de GBS de PI-2a) se incubaron con 50 ó 100 µ? de la proteína de pilus de Streptococcus pneumoniae (también referida como RrgB) a 37 °C durante 3 días y las proteínas contenidas en las mezclas de reacción se visualizaron por SDS-PAGE. Como controles, SrtClY86A o RrgB sólo se incubaron bajo las mismas condiciones. El asterisco indica RrgB monomérica. Carril 1: SrtClY86A, Carril 2: RrgB, Carril 3: SrtClY86A+RrgB (50 µ?) , Carril 4: SrtClY86A+RrgB (100 µ?) .

Figura 8: Alineación se secuencia apareada de las sortasas SrtCl homologas de PI-2a de la cepa 515 de GBS y PI-2b de la cepa A909 de GBS. La triada catalítica (subrayado simple) se conserva, mientras que el motivo de la tapa canónica (subrayado doble) no está presente en PI-2b SrtCl. En vez de esto hay un triptófano que parece que imita la función de la tapa.

Figura 9: Alineación apareada de la sortasa SrtC2 de PI-2b (SAK_1437) y la sortasa SrtCl de PI-2a (SAL_1484) . SrtC2 carece de la secuencia de tapa (resaltada en el cuadro) , y el dominio de transmembrana C-terminal. Tres residuos de cisteína están presentes en la secuencia PI-2b SrtC2 (marcada con cruces) .

Figura 10: Western blot de los extractos proteínicos totales del cultivo de una cepa mutante derivada de GBS 515, en la que la isla de PI-2a se ha eliminado (515A2a) y de la cepa A909 de tipo silvestre complementada por un plásmido que contiene los genes de SrtCl y BP o el gen BP sólo. Se usaron anticuerpos contra BP. Las señales de alto peso molecular indican la polimerización de pili en las cepas complementadas. M: Marcador; Carril 1: 515A2a; Carril 2: 515A2a+BP; Carril 3: 515A2a+BP+SrtCl ; Carril 4: 515A2a+BP+SrtCl; Carril 5: A909+BP; Carril 6: A909+BP+SrtCl .

Figura 11: SDS-PAGE de las reacciones de polimerización. Carril 1: SrtClY86A + BP-2a-515; Carril 2: SrtClY86A + BP-2a-H36B; Carril 3: SrtClY86A + BP-2a-CJBlll ; Carril 4: Marcador; Carril 5: SrtClY86A + BP-2a-515-H36B-CJBlll .

Figura 12A: Western blot con anticuerpo policlonal contra BP-1. Carril 1: SrtClY86A; Carril 2: variante de BP-2a - 515; Carril 3: variante de BP-2a - H36B; Carril 4: BP-1; Carril 5: RrgB; Carril 6: SrtClY86A + BP-1; Carril 7: SrtClY86A + BP-2a-515+ BP-1; Carril 8: SrtClY86A + BP-2a -H36B+ BP-1; Carril 9: SrtClY86A + RrgB; Carril 10: SrtClY86A + BP-2a -515+ RrgB; Carril 11: SrtClY86A + BP-2a-H36B+ RrgB.

Figura 12B: Western blot con anticuerpo policlonal contra RrgB. Carril 1: SrtClY86A; Carril 2: variante de BP-2a-515; Carril 3: variante de BP-2a-H36B; Carril 4: BP-1; Carril 5: RrgB; Carril 6: SrtClY86A + BP-1; Carril 7: SrtClY86A + BP-2a-515+ BP-1; Carril 8: SrtClY86A + BP-2a -H36B+ BP-1; Carril 9: SrtClY86A + RrgB; Carril 10: SrtClY86A + BP-2a-515+ RrgB; Carril 11: SrtClY86A + BP-2a-H36B+RrgB .

Figura 13: La mutante de SrtC puede polimerizar la proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) marcada con una secuencia IPQTG.

Figura 14A: El motivo de LPXTG es esencial para la polimerización de pilus in vitro. La progresión de la reacción entre SrtClY86A y BP-2a AIPQTG recombinante a TO, 48 y 72 horas de incubación a 37 °C. Las concentraciones de SrtClY86A y BP-2a AIPQTG se fijaron a 25 µ? y 100 µ? respectivamente. No pudo identificarse un patrón de formación de alto peso, que muestra que el radical similar a LPXTG es necesario para la polimerización de BP. Como los controles, se incubaron solo SrtClY86A (a la izquierda) y BP-2a AIPQTG (a la derecha) .

Figura 14B: La lisina del motivo de pilina no es esencial para la polimerización in vitro. SrtClY86A (25 µ?) y BP-2a K189A recombinante (100 µ?) se fijaron a 37°C y a diferentes intervalos (0, 48 h y 72 h) las reacciones se analizaron por SDS-PEGE. Puede identificarse un patrón de alto peso molecular, que muestra que SrtClY86A usó otro nucleófilo diferente de la lisinal89.

Figura 14C: Cuando SrtClY86A se mezcló con las formas recombinantes de las proteínas auxiliares (APl-2a y AP2-2a) , que pueden polimerizarse in vivo solamente en presencia de la proteína BP-2a (datos no mostrados) , se formaron algunas estructuras de HM . Estos datos demuestran que SrtClY86A puede usar diferentes nucleófilos para resolver el intermediario acilo entre la enzima y la señal de clasificación similar a LPXTG.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los estudios estructurales de las sortasas C en las bacterias grampositivas han demostrado que el sitio activo de muchas de estas enzimas contiene una triada catalítica de aminoácidos que se cubren por una región de "tapa" móvil en ausencia de sustrato. De esta manera, una característica de las sortasas relacionada con pilus en la presencia de una tapa que no bloque solamente el acceso del sitio activo, es decir, encapsula el sitio activo, sino también porta dos residuos claves, en general, un Asp y un aminoácido hidrofóbico, que interactúan dentro de la hendidura misma, que sirve como "anclas". En general, las secuencias que corresponden a las regiones de tapa pueden identificarse en todas las sortasas relacionada con pilus, caracterizadas hasta la fecha. En particular, esta estructura de tapa se ha demostrado que está presente en las enzimas Cl de sortasa de GBS PI-1, PI-2a y PI-2b [3] , en las enzimas de la sortasa Cl, sortasa C2 y sortasa C3 de Streptococcus pneumoniae [4, 5] , y en la enzima de la sortasa Cl de GAS. La mutación de la región de tapa en la enzima de la sortasa Cl de PI-2a de GBS se ha mostrado que no tiene un impacto adverso sobre la producción de pilus en los estudios de complementación [3], pero hasta ahora, no se han llevado a cabo estudios en la capacidad de las sortasas mutantes para polimerizar las proteínas in vi tro .

Los inventores han encontrado ahora que las enzimas de la sortasa C son capaces de polimerizar las proteínas in vitro más efectivamente que la enzima de la sortasa C de tipo silvestre, por ejemplo, resultando en la producción de pili recombinantes . La enzima de la sortasa C de tipo silvestre comprende una región de "tapa móvil" que encapsula el sitio activo en una conformación cerrada en ausencia de sustrato. Por ejemplo, la tapa de SrtCl alberga 3 residuos, Asp84, Pro85 y Tyr86, los cuales hacen interacciones con los residuos del sitio activo y alrededores. De esta manera, las enzimas de la sortasa C son inactivas in vi tro e incapaces de ligar o polimerizar los radicales, tales como la estructura de pilina y las proteínas auxiliares. Los inventores han descubierto ahora que mutando la región de tapa, el sitio catalítico puede exponerse, haciendo estas enzimas imitadas activas in vitro . Como se describe a continuación, y sorprendentemente, estas enzimas mutadas son más activas que sus contrapartes de tipo silvestre, y aún más sorprendentemente, son capaces de reconocer una gama más amplia de aminoácidos. Particularmente, las enzimas mutadas de la invención poseen o comprenden un sitio catalítico expuesto, el cual no está encapsulado por una "tapa" y est disponible para catalizar una reacción de transpeptidación para formar un intermediario de enzima de acilo in vitro.

De esta manera, los métodos de la invención pueden usarse para producir pili artificiales y recombinantes sin la necesidad de procedimientos de purificación laboriosos usados actualmente. De manera sorprendente, estas enzimas de la sortasa C mutante también pueden usarse para polimerizar proteínas de una variedad de fuentes, tales como bacterias grampositivas , no sólo las proteínas derivadas de las mismas bacterias, como la enzima de la sortasa C mutante misma. Además, los pili que resultan de estos métodos son inmunogénicos y pueden usarse en el desarrollo de vacunas para tratar o prevenir las enfermedades causadas por las bacterias grampositivas , de las cuales se derivan las proteínas componentes de los pili.

Algunas subunidades de pilina dentro del pilus contienen enlaces isopeptídicos intra-proteína que se forman espontáneamente, que estabilizan presumiblemente la estructura del pilus. De esta manera, en el contexto de las vacunas, la inmunización de un paciente con proteínas en la forma de una estructura de pilus artificial o recombinante que imita las encontradas por el sistema inmune durante la invasión/ infección, también puede tener ventajas en términos de la presencia de epítopos adicionales, tales como los epítopos estructurales o conformacionales basados en la estructura tridimensional. Tales epítopos estructurales o conformacionales pueden estar ausentes de las vacunas sub-unitarias cuando las proteínas de pilus se proporcionan en las composiciones que comprenden las formas aisladas, purificadas o como conjugados, tales como glicoconjugados . De esta manera, las proteínas de pili polimerizados pueden comprender los epítopos tridimensionales no predecibles de la estructura de las proteínas solas.

Enzimas de sortasa C mutante La enzima de la sortasa C mutante usada en los métodos de la invención se deriva de una enzima de sortasa C de tipo silvestre de Streptococcus . La enzima de la sortasa C mutante, por ejemplo, puede derivarse de una enzima de sortasa C de tipo silvestre de Streptococcus agalactiae (GBS) , Streptococcus pneumonía (neumococo) o Streptococcus pyogenes (GAS) . La enzima de la sortasa C mutante puede derivarse de una enzima de sortasa Cl , una enzima de sortasa C2 o una enzima de sortasa C3. La enzima de la sortasa C mutante se deriva de una enzima de sortasa C estreptocócica de tipo silvestre que comprende una región de tapa. La región de tapa es la espira estructural de aproximadamente 15-18 aminoácidos que cubre la triada catalítica de los aminoácidos encontrados en el sitio activo de una enzima de sortasa C en ausencia de un sustrato. La región de tapa se localiza dentro del dominio de centro soluble de la enzima de sortasa C, entre el péptido de señal y la región de transmembrana (TM) localizada en el N-terminal de la enzima y el dominio cargado positivamente localizado en el C-terminal de la enzima. La localización de la región de tapa en una variedad de enzimas de sortasa C estreptocócicas de tipo silvestre se resume en la siguiente tabla. Estas secuencias son todas secuencias de tipo silvestre que incluyen el péptido de señal N-terminal.

Tabla 1: Localización de la región de tapa en las sortasas estreptocócicas La localización de la región de tapa en otras enzimas de sortasa C estreptocócicas puede determinarse fácilmente por la persona experimentada mediante el análisis estructural o más simplemente, por alineación de las secuencias de estas enzimas con las secuencias de las proteínas estreptocócicas que tienen las regiones de tapa en las localizaciones conocidas en la Tabla 1. La Figura 1 proporciona una alineación de las enzimas de sortasa C de GBS, sobresaltando la localización de las regiones de tapa. La Figura 2 proporciona una alineación similar para las enzimas de la sortasa C de GAS y neumococo. Cualquiera de las enzimas de la sortasa C mostradas en estas Figuras que tienen una región de tapa, puede usarse en los métodos de la invención.

La enzima de la sortasa C de Streptococcus usada en los métodos de la invención comprende una mutación en su región de tapa. La mutación puede ser una sustitución, supresión o inserción en la secuencia de aminoácido de la región de tapa de la enzima de la sortasa mutante con relación a la secuencia de aminoácido de la enzima de la sortasa C de tipo silvestre.

Mutantes de supresión Cuando la mutación es una supresión, la mutación puede comprender la supresión de la parte o toda la región de tapa de la enzima de sortasa C de tipo silvestre. LA región de tapa es típicamente de alrededor de 15-18 aminoácidos de longitud y la mutación puede comprender la supresión de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o más aminoácidos de la región de tapa, o supresión de todos los aminoácidos en la región de tapa.

La mutación puede comprender la supresión de los aminoácidos en las posiciones predichas que interactúan con la triada catalítica en el sitio activo de la enzima de la sortasa C. Por ejemplo, la mutación puede comprender la supresión de los aminoácidos en las posiciones 84, 85 y/u 86 de las secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) , o la supresión de los aminoácidos en las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácido de otras enzimas de sortasa C. De esta manera, la mutación puede comprender la supresión de: i) un aminoácido en la posición 84; ii) un aminoácido en la posición 85; iii) un aminoácido en la posición 86; iv) dos aminoácidos en las posiciones 84 y 85; v) dos aminoácidos en las posiciones 84 y 86; vi) dos aminoácidos en las posiciones 85 y 86; o vii) tres aminoácidos en las posiciones 84, 85 y 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID N0:3) , o la supresión de los aminoácidos en las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácido de otra enzima de sortasa C. Los aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 84, 85 y 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) pueden determinarse fácilmente por alineación.

Los aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 84, 85 y 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) se encuentran en: - posiciones 90, 91 y 92 de la sortasa Cl de GBS de PI-1 (SEC ID NO: 1) , - posiciones 84, 85 y 86 de la sortasa C2 de GBS de PI-1 (SEC ID NO: 2) , - posiciones 88, 89 y 90 de la sortasa C2 de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 4) , - posiciones 53, 54 y 55 de la sortasa Cl de GBS de PI-2b (SEC ID NO: 5) , - posiciones 58, 59 y 60 de la sortasa Cl neumocócica (SEC ID NO: 6) , - posiciones 50, 51 y 52 de la sortasa C2 neumocócica (SEC ID NO: 7) , - posiciones 74, 75 y 76 de la sortasa C3 neumocócica (SEC ID NO: 8) , o - posiciones 46, 47 y 48 de la sortasa Cl de GAS (SEC ID NO: 9), respectivamente.

Alternativamente, la mutación puede comprender la supresión de todos los aminoácidos en la región de tapa. La supresión puede comprender los cambios adicionales en las posiciones dentro de la secuencia de sortasa restante. Por ejemplo, la sortasa puede comprender sustituciones, supresiones o inserciones en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más posiciones de aminoácidos adicionales. A manera de ejemplo adicional, la sortasa puede comprender sustituciones, supresiones o inserciones en menos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 posiciones de aminoácidos adicionales o cualquier intervalo entre los mismos.

En particular, la mutación además puede comprender la supresión de parte o todo el péptido de señal y/o el dominio de transmembrana de la enzima de la sortasa C de tipo silvestre que es N-terminal de la región de tapa en la enzima de tipo silvestre. El dominio de transmembrana comprende dos hélices alfa. La mutación puede comprender supresión de una o ambas de estas dos hélices alfa y, opcionalmente , también puede comprender la supresión del péptido de señal N-terminal del dominio de transmembrana. Por ejemplo, la mutación puede comprender la supresión de parte o toda la región de tapa y la supresión de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o más aminoácidos N-terminales de la región de tapa. A manera de ejemplo adicional, la mutación puede comprender la supresión de parte o toda la región de tapa y la supresión de menos de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 aminoácidos N-terminales de la región de tapa o cualquier intervalo entre los mismos. En algunas modalidades, la mutación comprende la supresión de todos los aminoácidos en la región de tapa y todos los aminoácidos N-terminales de la región de tapa. De esta manera, la enzima de sortasa C en esta modalidad de la invención, consiste del dominio C-terminal/cargado positivamente de la enzima de la sortasa C de tipo silvestre.

La mutación puede consistir de las supresiones descritas anteriormente en ausencia de cualesquiera mutaciones adicionales. Por ejemplo, la mutación puede consistir de la supresión de parte o toda la región de tapa, supresión de parte o toda la región de tapa y el péptido de señal y/o el dominio de t ansmembrana, o supresión de parte o toda la región de tapa y la región N-terminal total en ausencia de cualquiera de las mutaciones adicionales. Ejemplos de las 2 secuencias de las enzimas de la sortasa C, en donde la mutación consiste de a) supresión de toda la región de tapa y el péptido de señal/dominio de transmembrana, b) supresión de toda la región de tapa y las regiones N-terminales totales y c) supresión del péptido de señal /dominio de transmembrana y los aminoácidos en la triada catalítica que son apropiados para el uso en los métodos de la invención, se proporcionan en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2 : Mutantes de supresión de las enzimas de sortasa C De esta manera, las enzimas de la sortasa mutante usadas en los métodos de la invención pueden comprender o consistir de una secuencia de aminoácido seleccionada de SEC ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ó 36. Las enzimas de sortasa mutante usadas en los métodos de la invención también pueden comprender o consistir de una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEC ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ó 36, excepto para la sustitución, supresión o inserción de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos.

Mutación de sustitución La mutación puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos en la región de tapa comparado con la secuencia de la enzima de sortasa C de tipo silvestre. La(s) sustitución (es) puede (n) ser en las posiciones en la región de tapa predicha para interactuar con los aminoácidos en el sitio catalítico, de modo que las sustituciones cancelan la función normal de la tapa. La mutación puede comprender la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 84, 85 y/u 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima Cl de sortasa de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) , o la supresión de sustitución de los aminoácidos en las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácido de otras enzimas de sortasa C. De esta manera la mutación puede comprender la sustitución de: i) un aminoácido en la posición 84; ii) un aminoácido en la posición 85; iii) un aminoácido en la posición 86; iv) dos aminoácidos en las posiciones 84 y 85; v) dos aminoácidos en las posiciones 84 y 86; vi) dos aminoácidos en las posiciones 85 y 86; o vii) tres aminoácidos en las posiciones 84, 85 y 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3), o la sustitución de los aminoácidos en las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácido de otra enzima DE sortasa C. Los aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 84, 85 y 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO : 3) pueden determinarse fácilmente por alineación.

Los aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 84, 85 y 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) se encuentran en: - posiciones 90, 91 y 92 de la sortasa Cl de GBS de PI-1 (SEC ID NO: 1) , - posiciones 84, 85 y 86 de la sortasa C2 de GBS de PI-1 (SEC ID NO: 2) , - posiciones 88, 89 y 90 de la sortasa C2 de GBS de PI- 2a (SEC ID NO: 4) , - posiciones 53, 54 y 55 de la sortasa Cl de GBS de PI-2b (SEC ID NO: 5) , - posiciones 58, 59 y 60 de la sortasa Cl neumocócica (SEC ID NO: 6) , - posiciones 50, 51 y 52 de la sortasa C2 neumocócica (SEC ID NO: 7) , - posiciones 74, 75 y 76 de la sortasa C3 neumocócica (SEC ID NO: 8) , o - posiciones 46, 47 y 48 de la sortasa Cl de GAS (SEC ID NO: 9), respectivamente.

Las sustituciones en las posiciones que corresponden a la posición 84 y/o la posición 85 y/o la posición 86, pueden comprender el reemplazamiento del residuo de tipo silvestre en estas posiciones con un residuo de alanina.

Cuando la sortasa es la sortasa Cl de GBS de PI-1 (SEC ID NO: 1), la mutación puede comprender el reemplazamiento del residuo de aspartato en la posición 90 con un residuo de alanina (D90A) y/o el reemplazamiento del residuo de prolina en la posición 91 con un residuo de alanina (P91A) y/o el reemplazamiento del residuo de tirosina en la posición 92 con un residuo de alanina (Y92A) .

Cuando la sortasa es la sortasa C2 de GBS de PI-1 (SEC ID NO: 2), la mutación puede comprender el reemplazamiento del residuo aspartato en la posición 84 con un residuo de alanina (D84A) y/o reemplazamiento del residuo de prolina en la posición 85 con un residuo de alanina (P85A) , y/o el reemplazamiento del residuo de fenilalanina en la posición 86 con un residuo de alanina (F86A) .

Cuando la sortasa es sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3), la mutación puede comprender el reemplazamiento del residuo aspartato en la posición 84 con un residuo de alanina (D84A) y/o reemplazamiento del residuo de prolina en la posición 85 con un residuo de alanina (P85A) , y/o el reemplazamiento del residuo de tirosina en la posición 86 con un residuo de alanina (Y86A) .

Cuando la sortasa es sortasa C2 de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 4) , la mutación puede comprender el reemplazamiento del residuo de aspartato en la posición 88 con un residuo de alanina (D88A) y/o el reemplazamiento del residuo de prolina en la posición 89 con un residuo de alanina (P89A) , y/o el reemplazamiento del residuo de tirosina en la posición 90 con un residuo de alanina (Y90A) .

Cuando la sortasa es la sortasa Cl de GBS de PI-2b (SEC ID NO: 5), la mutación puede comprender el reemplazamiento del residuo de metionina en la posición 53 con un residuo de alanina ( 53A) y/o el reemplazamiento del residuo de lisina en la posición 54 con un residuo de alanina (K54A) , y/o el reemplazamiento del residuo de triptófano en la posición 55 con un residuo de alanina (W55A) .

Cuando la sortasa es la sortasa Cl neumocócica (SEC ID NO: 6) , la mutación puede comprender el reemplazamiento del residuo de aspartato en la posición 58 con un residuo de alanina (D58A) y/o el reemplazamiento del residuo de prolina en la posición 59 con un residuo de alanina (P59A) , y/o el reemplazamiento del residuo de triptófano en la posición 60 con un residuo de alanina (W55A) .

Cuando la sortasa es la sortasa C2 neumocócica (SEC ID NO: 7), la mutación puede comprender el reemplazamiento del residuo de aspartato en la posición 50 con un residuo de alanina (D50A) y/o reemplazamiento del residuo de prolina en la posición 51 con un residuo de alanina (P51A) , y/o el reemplazamiento del residuo de fenilalanina en la posición 52 con un residuo de alanina (F52A) .

Cuando la sortasa es sortasa C2 neumocócica C2 (SEC ID NO: 8), la mutación puede comprender el reemplazamiento del residuo de aspartato en la posición 74 con un residuo de alanina (D74A) y/o el reemplazamiento del residuo de prolina en la posición 75 con un residuo de alanina (P75A) , y/o el reemplazamiento del residuo de fenilalanina en la posición 76 con un residuo de alanina (F76A) .

Cuando la sortasa es GAS sortasa Cl (SEC ID NO: 9) , la mutación puede comprender el reemplazamiento del residuo de aspartato en la posición 46 con un residuo de alanina (D46A) y/o el reemplazamiento del residuo de fenilalanina en la posición 48 con un residuo de alanina (F48A) . La enzima de la sortasa Cl de GAS ya comprende un residuo de alanina en la posición 47.

La mutación puede comprender los cambios del aminoácido en las posiciones diferentes de las posiciones que corresponden a las posiciones 84 y/u 85 y/u 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) . Por ejemplo, la mutación puede comprender las sustituciones en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más posiciones de aminoácidos adicionales. Alternativamente o además de estas sustituciones adicionales, la mutación puede comprender supresiones y/o inserciones. En particular, la mutación puede comprender las sustituciones en las posiciones que corresponden a las posiciones 84 y/u 85 y/u 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) y la supresión de a) el péptido de señal y/o el dominio de transmembrana, o b) supresión de la región N-terminal total de la enzima de sortasa de tipo silvestre.

La sortasa puede consistir de sustituciones en las posiciones 84 y/u 85 y/u 86 en ausencia de cualquiera de las mutaciones. Ejemplos de las secuencias de las enzimas de sortasa C que consisten de las sustituciones en las posiciones que son equivalentes a las posiciones 84 y/u 86 de la región de tapa de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) y que también consisten de la supresión del péptido de señal/región de transmembrana que son apropiadas para el uso en los métodos de la invención, se proporcionan en la siguiente Tabla 3.

Tabla 3: Mutantes de sustitución de las enzimas de sortasa C De esta manera, las enzimas de sortasas mutantes usadas en los métodos de la invención pueden comprender o consistir de una secuencia de aminoácido seleccionada de SEC ID NO: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ó 71. Las enzimas de sortasas mutantes usadas en los métodos de la invención también pueden comprender o consistir de una secuencia de aminoácido seleccionada de la SEC ID NO:37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ó 71 excepto para la sustitución, supresión o inserción de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos .

Las enzimas de la sortasa C mutantes apropiadas para el uso en los métodos de la invención descritos anteriormente también son modalidades de la invención en su propio derecho.

En particular, las mutantes de sortasa son la SrtClY92A y SrtC2F86A debido a que la estabilidad de estas enzimas es mayor, se expresan mejor y son más solubles en comparación con, por ejemplo, las mutantes de supresión SrtCl-??? y SrtC2-ANT. Esto es sorprendente dado que la Vmáx de la reacción de escisión para las mutantes Y92A y F86A fue menor que la de las mutantes SrtCl-??? y SrtC2 -??? que también son más difíciles de purificar.

Acción de la sortasa Las sortasas escinden el motivo de LPXTG de, por ejemplo, las proteínas de pilina y enlazan covalentemente el C-terminal de un radical, tal como la subunidad de pilina, a un grupo NH2 de cadena lateral Lys sobre el siguiente radical o subunidad. Dos eventos de reconocimiento están involucrados en esta acción de sortasa. Primero, el motivo de reconocimiento de sortasa (LPXTG o una variante) de la proteína de sustrato debe reconocerse y enlazarse. Segundo, el sustrato aceptor, al que la proteína de sustrato será transferido, debe reconocerse y enlazarse, y un grupo amino específico ponerse en posición para atacar el intermediario de tioacilo.

Polipéptido bacterianos polimerizados por las enzimas de la sortasa C mutante Las enzimas de la sortasa C mutante descritas anteriormente, pueden usarse para polimerizar uno o más polipéptidos . Las enzimas de la sortasa C mutante se ponen en contacto con uno o más polipéptidos in vitro y después de un periodo de incubación, se detectan los polipéptidos polimerizados , por ejemplo, identificando un patrón de bandas de alto peso molecular sobre los geles de SOS. La incubación puede llevarse a cabo a 37°C. La incubación puede llevarse a cabo durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días o más. Los polipéptidos y las enzimas de la sortasa C mutante pueden incubarse en presencia de un agente reductor, por ejemplo DTT 1 mM, para mantener activa la cisteína catalítica de la enzima de la sortasa C mutante. La incubación puede llevarse a cabo a pH alrededor de 7-8.

Contrario con las enzimas de la sortasa C mutante de la invención, las enzimas de sortasa C de tipo silvestre no polimerizan los polipéptidos in vitro. Para evitar dudas, el uso del término "in vitro" se refiere al uso de los componentes aislados y/o purificados de una célula, tal como una enzima, para efectuar la polimerización de pilus sin requerir la presencia de la célula misma.

Los polipéptidos polimerizados por las enzimas de la sortasa C mutante de la invención comprenden típicamente el motivo de LPxTG. Además comprenden un motivo de pilina ( xxxVxVyPK consenso) y/o un radical de E-Box (YxLxETxAPxGY consenso) que se muestra que es importante para el montaje de pilus [6] . En particular, los polipéptidos pueden comprender un residuo de lisina conservado (K) , por ejemplo, encontrado en el motivo de pilina. En otras modalidades, los polipéptidos no comprenden un residuo de lisina conservado (K) en el motivo de pilina, es decir, en donde se excluye la presencia del residuo de lisina conservado. En algunas modalidades, los polipéptidos polimerizados por las enzimas de la sortasa C mutante de la invención pueden comprender un residuo de glicina N-terminal. Otros motivos de la secuencia serán evidentes para un experimentado en la técnica y pueden incluir, a manera de ejemplo no limitante: LPETGG, LPXT, LPXTG, LPKTG, LPATG, LPNTG, IPQTG, IQTGGIGT .

Ejemplos de los polipéptidos que pueden polimerizarse por las enzimas de sortasa C mutante de la invención incluyen los polipéptidos de bacterias Grampositivas , tales como las proteínas estructurales y proteínas auxiliares que se encuentran en los pili de las bacterias Grampositivas. En particular, la enzima de la sortasa C mutante puede ponerse en contacto con una proteína estructural encontrada en un pilus de GBS, GAS o Streptococcus pneumoniae . Por ejemplo, la enzima de la sortasa C mutante puede ponerse en contacto con la proteína estructural de GBS PI-1 (GBS80/SAG0645) , la proteína estructural de GBS PI-2a (GBS59/SAG1407) , la proteína estructural de GBS PI-2b (Spbl/SA 1518) , la proteína estructural de Streptococcus pneumoniae (RrgB) , o la proteína estructural de GAS (fee6, spyl28, orf80, eftLSLA) .

Alternativamente, o además, la enzima de la sortasa C mutante puede ponerse en contacto con una proteína auxiliar encontrada en un pilus de GBS, GAS o Streptococcus pneumoniae . Por ejemplo, la enzima de la sortasa C mutante puede ponerse en contacto con la proteína auxiliar 1 (AP-1) de GBS PI-1 (GBS104), la AP-1 de GBS PI-2a (GBS67/SAG1408) , la AP-1 de GBS PI-2b (SA 1519) , la AP-1 de Streptococcus pneumoniae (RrgA) o la AP-1 de GAS (cpa) , la proteína auxiliar 2 (AP-2) de GBS PI-1 (GBS52 ) , la AP-2 de GBS PI-2a (GBS150/SAG1404) , la AP-2 de GBS PI-2b (SAN1516), la AP-2 de Streptococcus pneumoniae (RrgC) o la AP-2 de GAS spyl30, orf82, orf2) .

Las enzimas de la sortasa C imitantes de la invención pueden usarse para polimerizar homólogos, fragmentos o variantes de la proteína estructural de tipo silvestre y las secuencias de las proteínas auxiliares, con la condición de que estos homólogos, fragmentos y variantes mantengan las secuencias descritas anteriormente necesarias para la polimerización por las enzimas de la sortasa C mutante. Por ejemplo, las variantes de estos polipéptidos que pueden usarse en los métodos de la invención incluyen las secuencias de proteínas estructurales y/o proteínas auxiliares, de las cuales el dominio de transmembrana se ha eliminado, comparado con la secuencia de tipo silvestre. Además, o en lugar de, la supresión del dominio de transmembrana, las variantes pueden comprender el adicional de un residuo de glicina en N-terminal para promover la polimerización.

A manera de ejemplo no limitante, las secuencias de algunos de estos polipéptidos que pueden polimerizarse por las enzimas de sortasa mutantes de la invención, se proporcionan a continuación por referencia. Las secuencias de los polipéptidos adicionales que pueden polimerizarse por las sortasas mutantes de la invención pueden determinarse fácilmente por una persona experimentada. Los detalles adicionales de estos polipéptidos se proporcionan en la referencia [7] .

BP de PI-1 (GBS80) La secuencia de aminoácido de GBS80 de longitud total, como se encuentra en la cepa 2603 se proporciona como la SEC ID NO: 72 en la presente. GBS80 de tipo silvestre contiene una región de secuencia líder N-terminal o de señal en los aminoácidos 1-37 de la SEC ID NO: 72. Pueden removerse uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o de señal de GBS80, por ejemplo, la SEC ID NO: 73.

BP de PI-2b (GBS1523/SAN1518) La secuencia de ,GBS1523' original (SAN1518; Spbl) se anotó como una proteína de la familia de ancla de superficie de pared celular (ver GI : 77408651). Para propósitos de referencia, la secuencia de aminoácido de GBS 1523 de longitud total, como se encuentra en la cepa COH1 se proporciona como la SEC ID NO: 110 en la presente. Los polipéptidos de GBS 1523 preferidos para el uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácido: (a) que tiene 60% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) a la SEC ID NO: 110; y/o (b) que comprende un fragmento de por lo menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEC ID NO: 110, en donde ' ' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) .

La secuencia de tipo silvestre contiene un motivo de aminoácido indicativo de un ancla de pared celular (LPSTG) en los aminoácidos 468-472 de la SEC ID NO: 110. Un cuadro E que contiene un residuo glutámico conservado también se ha identificado en los aminoácidos 419-429 de la SEC ID NO: 110, con un ácido glutámico conservado en el residuo 423. El motivo del cuadro E puede ser importante para la formación de las estructuras similares a pilus oligomérico, y, de esta manera, los fragmentos útiles de GBS1523 pueden incluir el residuo del ácido glutámico conservado. Una mutante de GBS1523 se ha identificado, en la que la glutamina (Q) en la posición 41 de la SEC ID NO: 110 se sustituye por una lisina (K) , como resultado de una mutación de un codón en la secuencia nucleotídica codificante de CAA. a AAA. Esta sustitución puede estar presente en las secuencias GBS1523 y los fragmentos GBS1523 (por ejemplo, la SEC ID NO: 112) . Una variante adicional de GBS1523 C0H1 sin la región de la secuencia de señal se proporciona como la SEC ID NO: 111.

BP de GBS PI-2a (GBS59) La secuencia de aminoácido de GBS59 de longitud total, como se encuentra en la cepa 2603, se proporciona como la SEC ID NO: 74 en la presente. Las variantes de GBS59 existen en las cepas H36B, 515, CJB111, DK21 y CJB110. La secuencia de aminoácido de GBS59 de longitud total, como se encuentra en las cepas H36B, 515, CJB111, CJB110 y DK21 se proporcionan como la SEC ID NOs : 75, 76, 77, 78 y 79.

BP de GBS PI-2b (Spbl) La secuencia de aminoácido de Sbpl de longitud total, como se encuentra en la cepa COH1, se proporciona como la SEC ID NO: 80 en la presente. Spbl de tipo silvestre contiene una región de secuencia líder N-terminal o de señal. Pueden removerse uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder de Spbl, por ejemplo, SEC ID NO: 81.

BP de Streptococcus pneumoniae (RrgB) La subunidad de pilus de RrgB tiene por lo menos tres clases. Las secuencias de aminoácidos de referencia para las tres clases son la SEC ID NOs : 82, 83 y 84 en la presente.

AP-1 de GBS PI-1 (GBS104/SAG0649) La secuencia de aminoácido de GBS 104 de longitud total, como se encuentra en la cepa 2603 se proporciona como la SEC ID NO: 85 en la presente.

AP-1 de GBS PI-2a (GBS67) La secuencia de aminoácido de GBS67 de longitud total, como se encuentra en la cepa 2603 se proporciona como la SEC ID NO: 86 en la presente. Una variante de GBS67 (SAI1512) existe en la cepa H36B. La secuencia de aminoácido de GBS67 de longitud total como se encuentra en la cepa H36B se proporciona como la SEC ID NO: 87. Las variantes de GBS67 también existen en las cepas CJB111, 515, NEM316, DK21 y CJB110. Las secuencias de aminoácido de GBS67 de longitud total, como se encuentra en las cepas CJB111, 515, NEM316, DK21 y CJB110 se proporcionan como la SEC ID NOS: 88, 89, 90, 91, y 92 en la presente.

AP-1 de GBS PI-2b (GBS1524/SAN1519) La secuencia de aminoácido de GBS1524 de longitud total (SAN1519) , como se encuentra en la cepa COH1 se proporciona como la SEC ID NO: 93 en la presente.

AP-1 de Streptococcus pneumoniae (RrgA) La secuencia de aminoácido de RrgA de longitud total se proporciona como la SEC ID NO: 94 en la presente.

AP-2 de GBS PI-1 (GBS052/SAG0646 ) La secuencia de aminoácido de GBS052/SAG0646 de longitud total como se encuentra en la cepa 2603 se proporciona como la SEC ID NO: 95 en la presente.

AP-2 de GBS PI-2a (GBS150/SAG1404 ) La secuencia de aminoácido de GBS150/SAG1404 de longitud total, como se encuentra en la cepa 2603 se proporciona como la SEC ID NO: 96 en la presente.

AP-2 de Streptococcus pneumonía (Rr C) La secuencia de aminoácido de RrgC longitud total se proporciona como la SEC ID NO: 97 en la presente.

De esta manera, los polipéptidos para el uso con la invención, pueden comprender o consistir de una secuencia de aminoácido: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NOS: 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 ó 97 o a cualquiera de otras secuencias estructurales o auxiliares descritas anteriormente; o (b) que es un fragmento de por lo menos ' n' aminoácidos consecutivos de una de estas secuencias, en donde ??' es 20 o más (por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más; por ejemplo, 20 o más; o por ejemplo 50 o más; o por ejemplo, 80 o más) . Alternativamente, '?' es menor de 20 o menor de 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o menor de 150.

Los métodos de la invención pueden involucra polimerización de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 polipéptidos que tienen 50% de identidad a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NOs : 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 ó 97, o de los fragmentos de por lo menos xn' aminoácidos consecutivos de una de estas secuencias, en donde 'n' es 20 o más (por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más; por ejemplo, 20 o más; o por ejemplo, 50 o más; o por ejemplo, 80 o más) .

Los métodos de la invención pueden involucrar la polimerización de l, 2, 3, 4, 5 Ó 6 polipéptidos que tienen 50% de identidad, por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) a un polipéptido que tiene la secuencia del aminoácido de cualquiera de la SEC ID NOs : 74, 75, 76, 77, 78 y 79, o de los fragmentos de por lo menos ??' aminoácidos consecutivos de una de estas secuencias, en donde *n' es 20 o más (por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más; por ejemplo, 20 o más; o por ejemplo, 50 o más; o por ejemplo, 80 o más) .

Los métodos de la invención pueden involucrar la polimerización de 1, 2 ó 3 polipéptidos que tienen 50% de identidad, por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% ó 97%), 98% ó 99%), 99.5% o más) a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de cualquiera de la SEC ID NOs : 82, 83 y 84, o de los fragmentos de por lo menos n' aminoácidos consecutivos de una de estas secuencias, en donde *n' es 20 o más (por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más; por ejemplo, 20 o más; o por ejemplo, 50 o más; o por ejemplo, 80 o más) .

Los fragmentos de aminoácido de estas proteínas estructurales y auxiliares puede comprender una secuencia de aminoácido de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 650, hasta 700, hasta 750, hasta 800, hasta 850, hasta 900, hasta 950, hasta 1000, hasta 1 100, hasta 1200, hasta 1300, hasta 1400, hasta 1500, residuos de aminoácidos consecutivos de las secuencias proporcionadas anteriormente. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de polipéptidos , por ejemplo, el dominio de transmembrana.

Las enzimas de la sortasa C mutantes de la invención polimerizan estos polipéptidos de una manera que es análoga a la polimerización de las proteínas estructurales y proteínas auxiliares por las enzimas de la sortasa C estreptocócica de tipo silvestre in vivo, para formar un pilus. De esta manera, los polipéptidos polimerizados producidos de acuerdo con estos métodos son estructuralmente similares a un pilus producido por una bacteria estreptocócica in vivo.

Los pili en las bacterias Grampositivas se construyen de cualquiera de dos o tres tipos de subunidades de pilina. En los pili de dos componentes, el eje del pilus se forma por copias múltiples de una subunidad de pilina principal, mientras que la punta del pilus contiene una copia simple de una subunidad de pilina de 'punta' menor que funciona típicamente como una adhesina. Los pili de tres componentes son similares, pero también contienen una subunidad de pilina 1 basal' que se enlaza covalentemente a la pared celular. Se han realizado varios estudios de microscopía electrónica (EM) de transmisión y marcado de inmuno-oro para la conclusión que las subunidades de pilina 'básales' también se interpretan a través de todo el eje del pilus, presumiblemente porque las enzimas de sortasa son promiscuas en los sustratos que reconocen.

Las enzimas de sortasa C imitantes pueden ponerse en contacto con 1 polipéptido, lo que conduce a la formación de un pilus monomérico. Por ejemplo, la enzima de sortasa mutante puede ponerse en contacto con GBS80, GBS59 o RrgB, lo que conduce a la formación de un pilus monomérico que comprende las subunidades de GBS80, GBS59 o RrgB respectivamente. Cuando el polipéptido es de una bacteria Grampositiva, la enzima de la sortasa mutante que se usa para polimerizar tal polipéptido no necesita ser de la misma bacteria Grampositiva. De esta manera, una enzima de sortasa C mutante derivada de GBS puede usarse para polimerizar las proteínas no sólo de GBS, sino también de Streptococcus pneumoniae y/o GAS. Las variantes de algunas proteínas de pilus, tal como GBS59, en general no son de protección cruzada. Por lo tanto, la capacidad para polimerizar las combinaciones de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6 o más de estas variantes dentro de un pilus individual es ventajosa, por ejemplo, para evitar la necesidad de composiciones más complejas o usar fusiones de proteínas para obtener la protección cruzada. Particularmente, los pili polimerizados in vitro pueden incluir una combinación de las variantes de GBS59 de las cepas de GBS 515, CJB111, H36B, 2603, DK21 y 090, más particularmente una combinación de variantes de GBS59 de las cepas de GBS 515, CJB111, H36B y 2603. Estos pili que comprenden dos o más variantes de GBS59 no se encuentran en la naturaleza debido a que las cepas de las bacterias de tipo silvestre expresan solamente una variante de la proteína estructural (BP-2a/GBS59) .

Alternativamente, la enzima de la sortasa C mutante puede ponerse en contacto con 2, 3, 4, 5 o más polipéptidos diferentes que pueden ser de 1 , 2, 3, 4, 5 o más bacterias Grampositivas , lo que conduce a la formación de un pilus quimérico. La enzima de la sortasa C mutante puede ponerse en contacto con las proteínas estructural y accesoria de una bacteria Grampositiva simple, las cuales se encuentran en combinación en un pilus estreptocócico natural de tal bacteria, resultando en un pilus quimérico que es equivalente en estructura a un pilus que se presenta naturalmente. Tales pili quiméricos son una herramienta útil para permitir el estudio de las propiedades del pilus sin el proceso de purificación laborioso usado actualmente para aislar los pili de las bacterias Grampositivas .

Además, como se describió anteriormente, las estructuras tridimensionales de los pili monoméricos y quiméricos producidos por los métodos de la invención, las hacen particularmente convenientes y efectivas para los propósitos de inmunización comparado con la administración de las proteínas recombinantes . De hecho, las pruebas de protección han mostrado que estos pili son más efectivos para inducir la protección contra las bacterias de estreptococos, de las cuales se derivan de las proteínas recombinantes monoméricas. Se postula que esto podría ser debido a que los pili contienen epítopos presentes en los pili in vivo que no se replican en las proteínas recombinantes monoméricas, particularmente tales epítopos son epítopos estructurales.

La invención incluye pili obtenidos o que se pueden obtener usando los métodos de la invención. En algunos aspectos, las combinaciones de polipéptidos encontrados en estos pili difieren de la combinación de polipéptidos encontrados en los pili que se presentan naturalmente en las bacterias estreptocócicas . Ejemplos de los pili que pueden producirse de acuerdo con los métodos de la invención incluyen los pili que comprenden o que consisten de las proteínas estructurales y/o proteínas auxiliares del estreptococo descrito anteriormente. En algunas modalidades, estos pili no contienen las combinaciones de polipéptidos encontrados en los pili que se presentan naturalmente encontrados en GBS, GAS o Streptococcal pneumoniae. Particularmente, los pili polimerizados in vitro difieren de los pili que se presentan naturalmente en términos de su composición, por ejemplo, debido a que el intermediario de la enzima de acilo no se enlaza a una sortasa de tipo silvestre, sino que se enlaza a una sortasa mutante de la invención, en otros casos, los pili polimerizados in vitro no comprenden componentes de pared/membrana celular, tal como lípido II o precursores de peptidoglicano, tal como ácido MurNAc-N-acetil -murámico . En aún otros casos, los pili polimerizados in vitro comprenden combinaciones de proteínas de pilus no encontradas en la naturaleza. De esta manera, los pili polimerizados in vitro pueden diferenciarse de los que se presentan naturalmente. De esta manera, el término "artificial" se refiere a una composición derivad de síntesis o no celular, particularmente, una estructura que se sintetiza in vitro y que no es idéntica a las estructuras encontradas en las bacterias nativas, tal como estreptococo. Composiciones inmunogenicas que comprenden pili La invención proporciona composiciones inmunogenicas que comprenden los pili descritos anteriormente, los cuales pueden obtenerse o que se pueden obtener por los métodos de la invención. El término "inmunogénico" se usa para entenderse que el pilus es capaz de provocar una respuesta inmune, tal como una respuesta mediada celular y/o un anticuerpo, contra el polipéptido o polipéptidos que forman el pilus cuando se usan para inmunizar a un paciente (de preferencia un mamífero, más preferentemente, un humano o un ratón) . Particularmente, la respuesta inmune es una respuesta inmune protectora que proporciona inmunidad protectora.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden ser útiles como vacunas. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir una infección) o terapéuticas (es decir, para tratar una infección), pero serán típicamente profilácticas. Las vacunas profilácticas no garantizan la protección completa de la enfermedad debido a que aun si el paciente desarrolla anticuerpos, puede haber un retardo o retraso antes de que el sistema inmune sea capaz de combatir la infección. Por lo tanto, y para evitar dudas, el término vacuna profiláctica también se puede referir a vacunas que mejoran los efectos de una futura infección, por ejemplo, reduciendo la gravedad o duración de tal infección.

Los términos "protección contra infección" y/o "proporcionan inmunidad protectora" se entienden que el sistema inmune de un paciente se ha cebado (por ejemplo, por vacunación) para desencadenar una respuesta inmune y rechazar la infección. Particularmente, la respuesta inmune desencadenada es capaz de rechazar la infección contra un número de diferentes cepas de bacterias. De esta manera, un paciente vacunado puede infectarse, pero es más capaz de rechazar la infección que un paciente de control .

De esta manera, las composiciones pueden ser farmacéuticamente aceptables. Usualmente, incluirán los componentes además de los antígenos, por ejemplo, incluyen típicamente uno o más soportes y/o excipientes farmacéuticos. Una descripción completa de tales componentes está disponible en la referencia [8] .

En general, las composiciones serán administradas a un mamífero en la forma acuosa. Sin embargo, antes de la administración, pueden haber estado en la forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se manufacturan en la forma acuosa, después se llenan y distribuyen y administran también en la forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la manufactura y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento del uso. De esta manera, una composición de la invención puede secarse, tal como una formulación liofilizada.

La composición puede incluir conservadores, tales como tiomersal ó 2 -fenoxietanol . Sin embargo, se prefiere que la vacuna debiera estar sustancialmente libre de (por ejemplo, menos de 5 ug/ml) de material de mercurio, por ejemplo, libre de tiomersal. Se prefieren más las vacunas que no contienen mercurio. Se prefieren particularmente las vacunas libres de conservadores .

Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector de la temperatura. Se proporcionan a continuación detalles adicionales de tales agentes.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl) , el cual puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 10±2 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, fosfato diácido de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

En general, las composiciones tendrán una osmolalidad de entre 20 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, de preferencia entre 240-360 mOsm/kg, y, más preferentemente, caerán dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más amortiguadores. Los amortiguadores típicos incluyen: un amortiguador de fosfato; un amortiguador de Tris; un buffer de borato; un amortiguador de succinato; un amortiguador de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un amortiguador de citrato. Los amortiguadores serán incluidos típicamente en el intervalo de 5-20 mM.

En general, el pH de una composición estará entre 5.0 y 8.1, y más típicamente entre 6.0 y 8.0, por ejemplo, 6.5 y 7.5, o entre 7.0 y 7.8.

La composición es preferentemente estéril. De preferencia, la composición es no pirogénica, por ejemplo, que contiene <1 EU (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y de preferencia, <0.1 EU por dosis. La composición es preferentemente libre de gluten.

La composición puede incluir un material para una sola inmunización, o puede incluir un material para inmunizaciones múltiples (es decir un kit 'multidosis ' ) . La inclusión de un conservador se prefiere en los arreglos multidosis. Como una alternativa (o además de) para incluir un conservador en composiciones múltiples, las composiciones pueden contenerse en un recipiente que tiene un adaptador aséptico para la remoción del material .

Típicamente, las vacunas humanas se administran en un volumen de dosificación de aproximadamente 0.5 mi, aunque puede administrarse a los niños la mitad de la dosis {es decir, aproximadamente 0.25 mi) .

Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. De preferencia, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante THl y/o un adyuvante TH2 , que se describen a continuación.

Los adyuvantes que pueden usarse en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a: · sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio, incluyendo hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos) , fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos , ortofosfatos) y sulfatos, etc. [por ejemplo, ver los capítulos 8 y 9 de la referencia 9] ; · emulsiones de aceite en agua, tales como emulsiones de escualeno-agua, que incluyen MF59 (5% de escualeno, 0.5% de Tween 80 y 0.5% de Span 85, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador) [capítulo 10 de la ref. 9, ver también la ref. 10-13, capítulo 10 de la ref. 14 y capítulo 12 de ref. 15], adyuvante de Freund completo (CFA, por sus siglas en inglés) y adyuvante de Freund incompleto (IFA, por sus siglas en inglés) ; • formulaciones de saponina [capítulo 22 de la ref. 9], tal como QS21 [16] y ISCOMs [capítulo 23 de la ref. 9] ; · virosomas y partículas similares a virus (VLPs) [17-23] ; • derivados bacterianos o microbianos, tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) , derivados del lípido A [24, 25], oligonucleótidos inmunoestimulantes [26-31] , tales como IC-31™ [32] (desoxinucleótido que comprende secuencia 26-mer 5 ' - (IC) i3-3 ' (SEC ID NO: 46) y un péptido polimérico policatiónico que comprende la secuencia de aminoácido 11-mer KLKLLLLLKLK (SEC ID NO: 47)) y toxinas ribosilantes de ADP y derivados destoxificados de los mismos [33-42] ; · inmunomoduladores humanos, que incluyen citosinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [43, 44], interferones (por ejemplo, interferón-?) , factor de estimulación de colonia de macrófago, y factor de necrosis tumoral; • bioadhesivos y mucoadhesivos , tales como quitosana y sus derivados, microesferas del ácido hialurónico esterificado [45] o mucoadhesivos, tales como derivados reticulados del ácido poli (acrílico) , alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa [46] ; • micropartículas (es decir, una partícula de ~ 100 nm a -150 um de diámetro, más preferentemente -200 nm a -30 um de diámetro, y más preferentemente -500 nm a -10 um de diámetro) formado de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un ácido poli (a-hidroxi) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, un policaprolactona, etc.); • liposomas [Capítulos 13 y 14 de la ref. 9, ref. 47-49]; • éteres de polioxi etileno y ésteres de polioxi etileno [50] ; • formulaciones de PCPP [51 y 52] ; • péptidos de muramilo, que incluyen N-acetil-muramil -L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-1-alanil-d-isoglutamine (nor-MDP) y N-acetilmuramil-l-alanil-d-isoglutaminil - l-alanin-2 - (-2' -dipalmitoil-sn-glicero-3 -hidroxifosforiloxi) -etilamina TP-PE) ; y • compuestos de imidazoquinolona, que incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo, "Resiquimod 3M" ) [53 y 54] .

Las composiciones y vacunas inmunogénicas de la invención también pueden comprender combinaciones de los aspectos de uno o más adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, pueden usarse las siguientes composiciones adyuvantes en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [55]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) [56] ; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [57] ; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [58]; (6) SAF, que contiene 10% de escualano, 0.4% de Tween 80™, 5% de copolímero de bloque pluronic L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrométrica o formado con vórtice para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualeno, 0.2% de Tween 80, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforilípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS), de preferencia MPL + CWS (Detox™) ; y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL) . Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se describen en el capítulo 7 de la ref . 9.

El uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio se prefiere particularmente, y, en general, los antígenos se adsorben a estas sales. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferido. Otras combinaciones de adyuvantes preferidos incluyen combinaciones de adyuvantes de Thl y Th2 , tales como CpG & alumbre o resiquimod & alumbre. Puede usarse una combinación del fosfato de aluminio y 3dMPL (ésta se ha reportado como efectiva en la inmunización neumocócica [59] ) .

Las composiciones de la invención pueden provocar una respuesta inmune mediada celular, así como una respuesta inmune humoral. De preferencia, esta respuesta inmune inducirá los anticuerpos de larga duración (por ejemplo, neutralizantes) y una inmunidad mediada celular que puede responder rápidamente con la exposición a la infección.

En general, dos tipos de células T, las células CD4 y CD8 , se cree que son necesarios para iniciar y/o mejorar la inmunidad mediada celular y la inmunidad humoral . Las células T CD8 pueden expresar un co-receptor CD8 y se refieren comúnmente como linfocitos citotóxicos T (CTLs) . Las células T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con los antígenos exhibidos en las moléculas de MHC de Clase I.

Las células T CD4 pueden expresar un co-receptor CD4 y se refieren comúnmente como células T auxiliares. Las células T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos enlazados a las moléculas MHC de clase II. Con la interacción con una molécula de MHC de clase II, las células CD4 pueden secretar factores, tales como citosinas. Estas citosinas secretadas pueden activar las células B, células T citotóxicas, macrófagos y otras células que participan en una respuesta inmune. Las células T auxiliares o las células CD4+ pueden dividirse además en dos subclases funcionalmente distintas: fenotipo TH1 y fenotipos TH2 que difieren en su citosina y función efectora.

Las células TH1 activadas mejoran la inmunidad celular (incluyendo un aumento en la producción de CTL de antígeno específico) y, por lo tanto, son de valor particular para responder a las infecciones intracelulares . Las células TH1 activadas pueden secretar una o más de IL-2, IFN-? y TNF-ß. Una respuesta inmune TH1 puede resultar en las reacciones inflamatorias locales activando los macrófagos, células MK (asesinos naturales) y células T citotóxicas CD8 (CTLs) . Una respuesta inmune TH1 también puede actuar para expandir la respuesta inmune estimulando el crecimiento de las células B y T con IL-12. Las células B estimuladas con TH1 pueden secretar IgG2a.

Las células TH2 activadas mejoran la producción de anticuerpos y, por lo tanto, son de valor en respuesta a infecciones extracelulares . Las células TH2 activadas pueden secretar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Una respuesta inmune TH2 puede resultar en la producción de IgGl, IgE, IgA y células B de memoria para la protección futura.

Una respuesta inmune mejorada puede incluir una o más de una respuesta inmune THl mejorada y una respuesta inmune TH2.

Una respuesta inmune THl puede incluir uno o más de un aumento en CTLs, un aumento en una o más de las citosinas asociadas con una respuesta inmune THl (tal como IL-2, IFN-? y TNF-ß) , un aumento en los macrófagos activados, un aumento en la actividad de NK, o un aumento en la producción de IgG2a. De preferencia, la respuesta inmune THl mejorada incluirá un aumento en la producción de IgG2a.

Una respuesta inmune THl puede ser producida usando un adyuvante de THl . En general , un adyuvante de THl provocará aumentos en los niveles de la producción de IgG2a con relación a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de THl apropiados para el uso en la invención pueden incluir, por ejemplo, formulaciones de saponina, virosomas y partículas similares a virus, derivados no tóxicos de lipopolisacáridos enterobacterianos (LPS) , oligonucleótidos inmunoestimuladores . Los oligonucleótidos inmunoestimuladores , tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG, son los adyuvantes THl preferidos para el uso en la invención.

Una respuesta inmune TH2 puede incluir uno o más de un aumento en una o más de las citosinas asociadas con una respuesta inmune TH2 (tal como IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10) , o un aumento en la producción de IgGl, IgE, IgA y células B de memoria. De preferencia, la respuesta inmune TH2 mejorada incluirá un aumento en la producción de IgGl.

Una respuesta inmune TH2 puede producirse usando un adyuvante TH2. En general, un adyuvante TH2 provocará aumento en los niveles de la producción de IgGl con relación a la inmunización del antígeno sin el adyuvante. Los adyuvantes TH2 apropiados para el uso en la invención incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite y toxinas de ADP-ribosilantes y derivados destoxificados de los mismos. Las composiciones que contienen minerales, tales como sales de aluminio son los adyuvantes de TH2 preferidos para el uso en la invención.

De preferencia, la invención incluye una composición que comprende una combinación de un adyuvante TH1 y un adyuvante TH2. De preferencia, tal composiciones provoca una respuesta THl mejorada y una respuesta TH2 mejorada, es decir, un aumento en la producción de IgGl e IgG2a con relación a la inmunización sin un adyuvante. Aún más preferentemente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante de THl y de TH2 provoca un aumento en la respuesta inmune de THl y/o un aumento en TH2 con relación a la inmunización con un adyuvante simple (es decir, con relación a la inmunización con un adyuvante de THl simple o inmunización con un adyuvante de TH2 simple) .

La respuesta inmune puede ser una o ambas de una respuesta inmune THl y una respuesta TH2. De preferencia, la respuesta inmune proporciona una o ambas de la respuesta TH1 mejorada y una respuesta TH2 mejorada.

La respuesta inmune mejorada puede ser una o ambas de una respuesta inmune sistémica y una mucosal. De preferencia, la respuesta inmune proporciona una o ambas de una respuesta inmune sistémica mejorada y mucosal mejorada. De preferencia, la respuesta inmune mucosal es una respuesta inmune ??2. De preferencia, la respuesta inmune mucosal incluye un aumento en la producción de IgA.

Las composiciones de la invención pueden prepararse de varias formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea soluciones o suspensiones líquidas. También pueden prepararse formas sólidas apropiadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición secada congelada por atomización) . La composición puede prepararse para la administración tópica, por ejemplo, como un ungüento, crema o polvo. La composición puede prepararse para la administración oral, por ejemplo, como un comprimido o cápsula, como una atomización o como un jarabe (opcionalmente saborizado) . La composición puede prepararse para la administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o una atomización. La composición puede prepararse como un supositorio o pesario. La composición puede prepararse como una forma de dosificación sólida para la administración parenteral o sin aguja, por ejemplo, administración intra-dérmica. La composición puede prepararse para la administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, como gotas. La composición puede ser en la forma de un kit, diseñado de manera que una composición combinada se reconstituye antes de la administración a un paciente. Estos kits pueden comprender uno o más antígenos en la forma líquida y uno o más antígenos liofilizados .

Cuando la composición va a prepararse extemporáneamente antes del uso (por ejemplo, cuando un componente está presente en la forma liofilizada) y se presenta como un kit, el kit puede comprender dos ampolletas, o puede comprender una jeringa llenada lista y una ampolleta, siendo los contenidos de la jeringa usados para reactivar los contenidos de la ampolleta antes de la inyección.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva del pilus, así como cualesquiera otros componentes, conforme sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva", se entiende que la administración de tal cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratarse, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratarse (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración del doctor tratante de la situación médica y de otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse por medio de las pruebas de rutina. Ejemplos de una cantidad inmunológicamente efectiva son de aproximadamente 0.1 pg-10 ]ig de pilus, por ejemplo, 0.5 ug-10 pg de pilus.

Como se mencionó anteriormente, una composición puede incluir un agente protector de la temperatura, y este componente puede ser particularmente útil en las composiciones de adyuvantes (particularmente las que contienen un adyuvante mineral, tal como una sal de aluminio) . Como se describe en la referencia 60, un agente protector de la temperatura líquido puede adicionarse a una composición de vacuna acuosa para disminuir su punto de congelación, por ejemplo, para reducir el punto de congelación a menos de 0°C. De esta manera, la composición puede almacenarse a menos de 0°C, pero arriba de su punto de congelación, para inhibir la ruptura térmica. El agente protector de la temperatura también permite la congelación de la composición, mientras que protege a los adyuvantes de la sal mineral contra la aglomeración o sedimentación después del congelado y descongelado, y también puede proteger la composición a temperaturas elevadas, por ejemplo, arriba de 40°C. Una vacuna acuosa de partida y el agente líquido protector de la temperatura pueden mezclarse, de manera que el agente líquido protector de la temperatura forma de 1-80% en volumen de la mezcla final. Los agentes protectores de la temperatura apropiados deberían ser seguros para la administración humana, fácilmente miscibles/solubles en agua, y no deberían dañar otros componentes (por ejemplo, antígeno y adyuvante) en la composición. Ejemplos incluyen glicerina, propilenglicol y/o polietilenglicol (PEG) . Los PEGs apropiados pueden tener un peso molecular promedio que oscila de 200-20,000 Da. En una modalidad preferida, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 300 Da ("PEG-300").

Métodos de tratamiento y administración de la vacuna La invención también proporciona un método para provocar una respuesta inmune en un mamífero, que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de una composición de la invención, o un pilus de la invención. La respuesta inmune es preferentemente protectora y, de preferencia, involucra anticuerpos y/o inmunidad mediada celular. El método puede provocar una respuesta estimulante.

La invención también proporciona combinaciones o composiciones inmunogénicas para el uso como un medicamento, por ejemplo, para el uso en el surgimiento de una respuesta inmune en un paciente, tal como un mamífero.

La invención también proporciona el uso del pilus de la invención en la manufactura de un medicamento para el surgimiento de una respuesta inmune en un mamífero.

Provocando una respuesta inmune en el mamífero mediante estos usos y métodos, el mamífero puede estar protegido contra las enfermedades causadas por las bacterias, de las cuales se derivan los polipéptidos en el pilus. En particular, el mamífero puede estar protegido contra una enfermedad causada por bacterias estreptocócicas , que incluyen GAS, GBS y Streptococcus pneumoniae . La invención también proporciona un dispositivo de liberación pre- llenado con una composición inmunogénica de la invención.

El mamífero es preferentemente un humano, un mamífero veterinario grande (por ejemplo, caballos, vacas, venados, cabras, cerdos) y/o una mascota doméstica (por ejemplo, perros, gatos, gerbos, hámsteres, cobayos, chinchillas). Más preferentemente, el mamífero es un humano, por ejemplo, un paciente humano. Cuando la vacuna es para el uso profiláctico, el humano puede ser un niño (por ejemplo, un niño que comienza a caminar o un infante) o un adolescente; cuando la vacuna es para el uso terapéutico, el humano puede ser un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada para los niños también puede administrarse a los adultos (por ejemplo, para valorar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc. Un mamífero (por ejemplo, humano, por ejemplo un paciente) puede estar en riesgo de la enfermedad misma o puede ser una hembra embarazada, por ejemplo, una mujer ("inmunización maternal") . La vacunación de las hembras embarazadas puede ser ventajosa como un medio para proporcionar una protección pasiva mediada por anticuerpos a los mamíferos recién nacidos. La inmunidad pasiva materna es un tipo de inmunidad pasiva adquirida naturalmente, y se refiere a la inmunidad mediada por anticuerpos transportada al feto por su madre durante el embarazo. Los anticuerpos maternos (MatAb) se pasan a través de la placenta al feto mediante un receptor de FcRn en las células de la placenta. Esto se presenta alrededor del tercer mes de gestación. Particularmente, los anticuerpos son inmunoglobulina G (IgG) o inmunoglobulina A (IgA) . Los isotipos del anticuerpo de IgGy pueden pasar a través de la placenta durante el embarazo. La inmunidad pasiva también puede proporcionarse a través de la transferencia de anticuerpos de IgA encontrados en la leche materna que se transfieren al intestino del infante, protegiéndolo contra las infecciones bacterianas, hasta que el recién nacido puede sintetizar sus propios anticuerpos .

Una manera de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico involucra monitorear la infección después de la administración de las composiciones de la invención. Una manera de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico involucra monitorear las respuestas inmunes, sistémicamente (tal como monitorear el nivel de producción de IgGl e IgG2a) y/o mucosalmente (tal como monitorear el nivel de la producción de IgA) , contra los antígenos en el pilus de la invención, después de la administración de la composición. Típicamente, las respuestas del anticuerpo de suero de antígeno específico se determinan post-inmunización, pero pre-estimulación, mientras que las respuestas del anticuerpo mucosal de antígeno específico se determinan post-inmunización y post-estimulación .

Otra manera de valorar la inmunogenicidad de las composiciones de la presente invención es expresar las proteínas recombinantemente para seleccionar los sueros del paciente o las secreciones mucosales por inmunomanchado y/o microarreglos . Una reacción pasiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha montado una respuesta inmune a la proteína en cuestión. Este método también puede usarse para identificar los antígenos inmunodominantes y/o epítopos dentro de los antígenos.

La eficacia de las composiciones de la invención también puede determinarse in vivo estimulando los modelos animales de infección, por ejemplo, cobayos o ratones, con las composiciones de la vacuna.

En general, las composiciones de la invención serán administradas directamente a un paciente. La liberación directa puede realizarse por inyección parenteral (por ejemplo, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente , o al espacio intersticial de un tejido), o mucosalmente , tal como por administración rectal, oral (por ejemplo, comprimido, atomización), vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra mucosal .

La invención puede usarse para provocar inmunidad sistémica y/o mucosal, de preferencia, para provocar una inmunidad sistémica y/o mucosa mejorada.

De preferencia, la inmunidad sistémica y/o mucosal mejorada se refleja en una respuesta inmune Thl y/o TH2 mejorada. De preferencia, la respuesta inmune mejorada incluye un aumento en la producción de IgGl e/o IgG2a e/o IgA.

La dosificación puede ser mediante cualquier esquema de dosificación simple o un esquema de dosificación múltiple. Las dosis múltiples pueden usarse en un esquema de inmunización primario y/o en un esquema de inmunización estimulador. En un esquema de dosificación múltiple, las diferentes dosis pueden administrarse por las mismas rutas o rutas diferentes, por ejemplo, un primario parenteral o estimulación mucosal, un primario mucosal y estimulación parenteral, etc. Las dosis múltiples serán administradas típicamente por lo menos 1 semana espaciadas (por ej emplo, aproximadamente 2 semanas , aproximadamente 3 semanas , aproximadamente 4 semanas , aproximadamente 6 semanas , aproximadamente 8 semanas , aproximadamente 10 semanas , aproximadamente 12 semanas , aproximadamente 16 semanas , etc . ) .

Las vacunas preparadas de acuerdo con la invención pueden usarse para tratar a los niños y adultos. De esta manera, un paciente humano puede ser menor de 1 año de edad, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad o por lo menos 55 años de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, >50 años de edad, >60 años de edad, y de preferencia, >65 años de edad) , los jóvenes (por ejemplo, <5 años de edad) , pacientes hospitalizados, trabajadores del cuidado de la salud, servicio del ejército y personal militar, mujeres embarazadas, enfermos crónicamente o pacientes inmunodeficientes . Sin embargo, las vacunas no son apropiadas exclusivamente para estos grupos, y pueden usarse más generalmente en una población.

Las vacunas producidas por la invención pueden administrarse a pacientes a sustancialmente el mismo tiempo (por ejemplo, durante la misma consulta o visita médica a un profesional del cuidado de la salud o centro de vacunación) que otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que la vacuna de sarampión, vacuna de paperas, vacuna de rubéola, una vacuna de MMR, una vacuna de varicela, una vacuna de MMRV, una vacuna de difteria, una vacuna de tétanos, una vacuna de tos ferina, una vacuna de DTP, una vacuna de H. influenzae tipo b conjugada, una vacuna de virus de polio inactivada, una vacuna de virus de hepatitis B, una vacuna conjugada meningocócica (tal como una vacuna A-C-W135-Y tetravalente) , una vacuna de virus sincitial respiratorio, etc.

Componentes antigénicos adicionales de las conposiciones de la invención La invención también proporciona composiciones adicionales que comprenden por lo menos un antígeno adicional.

En particular, la invención también proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención y uno o más de los siguientes antígenos adicionales: un antígeno de sacárido del serogrupo de N. meningitidis A, C, W135 y/o Y (de preferencia los cuatro) . un antígeno de sacárido o polipeptídico de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, 61, 62, 63] . - un antígeno del virus de hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo, 64, 65] . - un antígeno del virus de hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o centro [por ejemplo, 65, 66] . - un antígeno de difteria, tal como un toxoide de difteria [por ejemplo, capítulo 3 de la ref . 67] o la imitante CRM197 [por ejemplo, 68] . - un antígeno de tétanos, tal como un toxoide de tétanos [por ejemplo, capítulo 4 de la ref. 67] . - un antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de tos ferina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B . pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, refs. 69 y 70] . - un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, 71] . - antígeno(s) de polio [por ejenplo, 72, 73] tal como IPV. antígenos de sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo, capítulos 9, 10 y 11 de la ref. 67] . - antígeno (s) de influenza [por ejemplo, capítulo 19 de la ref. 67], tal como las proteínas superficiales de hemaglutinina y/o neuraminidasa . - un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 74] . - un antígeno de proteína de Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B) [por ejemplo, 15, 76] . - un antígeno de sacárido de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B) . - un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A) [por ejemplo, 76, 77, 78] . - un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, 79] . - un antígeno de E. coli.

La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales.

Los antígenos de proteínas tóxicas pueden destoxificarse cuando sea necesario (por ejemplo, destoxificación de la toxina de tos ferina por medios químicos y/o genéticos [70] ) .

Cuando se incluye un antígeno de difteria en la composición, también se prefiere incluir el antígeno de tétanos y los antígenos de tos ferina. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de tétanos, también se prefiere incluir los antígenos de difteria y tos ferina. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de tos ferina, también se prefiere incluir los antígenos de difteria y tétanos. De esta manera, se prefieren las combinaciones de DTP.

Los antígenos de sacáridos están preferentemente en la forma de conjugados. Las proteínas de vehículo para los conjugados incluyen la toxina de difteria, toxina de tétanos, proteína de membrana exterior de N. meningitidis [80] , péptidos sintéticos [81, 82] , proteína de choque térmico [83, 84], proteínas de tos ferina [85, 86], proteína D de H. influenzae [87] , citosinas [88] , linfocinas [88] , proteínas estreptocócicas , hormonas [88], factores de crecimiento [88], toxina A o B de C. difficile [89] , proteínas de captación de hierro [90] , etc. Una proteína de vehículo preferida es la mutante CRM 197 de la toxina de difteria [91] .

Los antígenos en la composición estarán presentes típicamente a una concentración de por lo menos 1 µg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para provocar una respuesta inmune contra tal antígeno.

Como una alternativa para usar los antígenos de proteínas en las composiciones inmunogénicas de la invención, puede usarse el ácido nucleico (de preferencia ADN, por ejemplo, en la forma de un plásmido) que codifica el antígeno.

De preferencia, los antígenos se adsorben a una sal de aluminio .

De manera sorprendente, los inventores han descubierto que el motivo de pilina no se requiere para la polimerización por las sortasas mutantes de la invención, contrario con las sortasas de tipo silvestre (de las cuales se derivan las mutantes), en donde es esencial la presencia de este motivo. Además, las sortasas mutantes de la invención pueden usar diferentes nucleófilo (s) para resolver el intermediario de acilo entre la enzima y la señal de clasificación similar a LPXTG. Por el contrario, las sortasas de tipo silvestre, de las cuales se derivan las sortasas mutantes, requieren la presencia de un residuo de lisina. Las sortasas mutantes de la invención son efectivas in vitro para catalizar las reacciones de transpeptidación y formar polímeros de proteínas de pilus de GBS . Las sortasas imitantes de la invención son útiles además en una variedad de aplicaciones de ingeniería de proteínas. Las diferencias estructurales entre las sortasas de la presente invención y otras sortasas relacionadas con pilus en las bacterias grampositivas , puede proporcionar nueva funcionalidad y permitir realizar nuevos métodos in vitro, o puede permitir que se realicen las reacciones de polimerización y ligación más eficientemente.

Las enzimas de las sortasas mutantes de la invención son útiles para realizar las reacciones de ligación entre cualquier radical que comprende el motivo de reconocimiento de LPXTG (o los listados anteriormente) y cualquier radical que comprende un residuo de aminoácido que puede proporcionar que el nucleófilo complete la reacción de transpeptidación . Como se muestra en los Ejemplos, las sortasas mutantes de la invención son capaces de escindir y polimerizar las proteínas estructurales y las proteínas auxiliares que comprenden el motivo de LPXTG. El trabajo previo ha demostrado que las sortasas bacterianas requieren solamente un solo aminoácido para proporcionar el nucleófilo para completar la reacción de transpeptidación {Proft., Biotechnology Letters, 2010, 32: 1-10; Popp et al, Current Protocols in Protein Science, 2009, 15, WO2010/087994) .

En algunas modalidades de los métodos de la invención, el primer radical o el segundo radical en la ligación es un polipéptido y el otro radical es una proteína o glucoproteína sobre la superficie de una célula. Las sortasas de la invención pueden usarse para unir los polipéptidos a las proteínas sobre la superficie celular. Esto puede ser particularmente útil para, por ejemplo, proteínas específicas de marcado sobre la superficie celular. En algunas modalidades, la célula se ha transfectado para expresar la proteína superficial de interés con un motivo de LPXTG. Este motivo después puede dirigirse para la ligación usando una sortasa de la invención. Alternativamente, la marca de la proteína puede comprender el motivo.

Uso de sortasas para la ligación de sustratos diferentes de las proteínas de pilus En otras modalidades de la invención, las sortasas mutantes de la invención se usan para ligar proteínas a un soporte sólido y ya sea el primer radical o el segundo radical es un polipéptido y el otro radical comprende aminoácidos conjugados a un soporte sólido. Tal enlace covalente permite que se lleve a cabo un lavado extensivo. En algunas de estas modalidades, la proteína comprende el motivo de LPXTG y el soporte sólido tiene aminoácidos, tales como lisina, conjugado a éste. En algunas modalidades, el soporte sólido es una cuenta, tal como una cuenta de poliestireno o cuente de oro o partícula, tal como una nanopartícula .

De manera similar, los métodos de la invención permiten la circularización de las cadenas polipeptídicas . En tales modalidades, el primer radical y el segundo radical son el N-terminal y C-terminal de una cadena polipeptídica, y la ligación resulta en la formación de un polipéptido circular.

Las sortasas bacterianas también son de interés significativo para la modificación de la proteína y las aplicaciones de ingeniería. Las sortasas promueven la formación de pilina in vivo catalizando una reacción de transpeptidación entre la estructura y las proteínas auxiliares. Las sortasas reconocen y escinden un motivo de reconocimiento (por ejemplo, LPXTG) y forman un enlace amida con una proteína blanco. Usando el motivo de reconocimiento, puede realizarse una variedad de funciones de diseño de proteínas. Las reacciones de ligación realizadas usando las sortasas son flexibles, eficientes y requieren menos etapas que las técnicas de ligación química comparables. Por lo tanto, otro objetivo de la invención es proporcionar sortasas mejoradas para las aplicaciones de diseño de proteínas. Las técnicas de Sortagging son conocidas en la literatura.

Además de las mutantes de sortasa anteriores, pueden usarse otras enzimas de sortasa para la ligación. Por ejemplo, las sortasas SrtCl y SrtC2 de la isla de patogenicidad de GBS de PI-2b.

La secuencia de aminoácido de tipo silvestre SrtCl de PI-2b se presenta en la SEC ID NO: 5. En particular, SrtCl como se usa en los métodos de la invención, no comprende un péptido de señal o un dominio de transmembrana N-terminal (como en la SEC ID NO: 98, SEC ID NO: 99 o SEC ID NO: 100) .

En algunas modalidades, SrtCl, como se usa en los métodos de la invención, comprende la SEC ID NO: 101, que corresponde al dominio soluble clonado. SrtCl que comprende la SEC ID NO: 101, que corresponde al dominio soluble clonado. En algunas modalidades, SrtCl puede tener una mutación W55F (como en la SEC ID NO: 102) . W55 puede ser importante en la regulación de la actividad de SrtCl, debido a que se localiza en la región que el radical de tapa de las sortasas canónicas se encuentra normalmente en las sortasas estreptocócicas . W55 puede imitar la función de la tapa encontrada en otras sortasas. En algunas modalidades, SrtCl, como se usa en los métodos de la invención, puede tener una mutación C188A (como en la SEC ID NO: 103) . C188 puede ser una cisteína catalítica.

La secuencia de aminoácido de SrtC2 de tipo silvestre de PI-2b se presenta en la SEC ID NO: 105. En algunas modalidades, la SrtC2, como se usa en los métodos de la invención, puede tener sus cisteínas sustituidas con alaninas (como en la SEC ID NO: 106) . En algunas modalidades de la invención, SrtC2, como se usa en los métodos de la invención, no comprende un péptido de señal o dominio de transmembrana N-terminal (como en la SEC ID NO: 108 o la SEC ID NO: 109) .

La persona experimentada es capaz de identificar cualquier péptido de señal o dominio de transmembrana N-terminal.

De esta manera, las enzimas de la sortasa Cl y sortasa C2 de PI-2b para el uso con la invención, puede comprender o consistir de una secuencia de aminoácido: (a) que tiene 70% o más de identidad (por ejemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de cualquier SEC ID NOs: 5, 98,100, 101, 102, 103, 105, 106, 108 y 109; O (b) que es un fragmento de por lo menos xn' aminoácidos consecutivos de una de estas secuencias, en donde 4n' es 100 o más (por ejemplo, 120, 150, 170 ó 190 o más) . Las enzimas de sortasa Cl y sortasa C2 de PI-2b para el uso con la invención mantienen la capacidad para realizar las reacciones de ligación y polimerización. Las secuencias nucleotídicas que codifican SrtCl y SrtC2 se proporcionan en la SEC ID NO: 104 y SEC ID NO: 107. Los motivos de reconocimiento particulares pueden incluir LPETGG, LPXTG, LPXT, LPKTG, LPATG, LPNTG, LPET, VPDT, IPQT, YPR, LPMT, LAFT, LPQT, NSKT, NPQT, NAKT, NPQS, LPKT, LPIT, LPDT, SPKT, LAET, LAAT, LAET, LAST, LPLT, LSRT.

Panorama general La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, los métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, las referencias 92-99, etc. El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste" , por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.

El término "que consiste esencialmente de" significa que la composición, método o estructura pueden incluir ingredientes adicionales, etapas y/o partes, pero solamente si los ingredientes adicionales, etapas y/o partes no alteran materialmente las características básicas y nuevas de la composición reivindicada, método o estructura. El término "que consiste de" en general se entiende que significa que la invención, como se reivindica, se limita a los elementos mencionados específicamente en la reivindicación (y pueden incluir sus equivalentes, en la medida en que la doctrina de los equivalentes sea aplicable) .

El término "aproximadamente" con relación al valor numérico x significa, por ejemplo, x+10%.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando sea alineada, tal porcentaje de aminoácidos es el mismo en comparación con las dos secuencias. Esta alineación y el por ciento de homología o la identidad de secuencia pueden determinarse usando los programas de elementos de programación (software) conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref. 100. Una alineación preferida se determina por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de espacio afín con una penalidad de abertura de espacio de 12 y una penalidad de extensión de espacio de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se describe en la ref. 101. La identidad porcentual de un primer polipéptido y un segundo polipéptido en general se determina contando el número de posiciones igualadas entre el primer y el segundo polipéptidos y dividiendo este número por la longitud total del polipéptido más corto, seguido de la multiplicación del valor resultante por 100. Para los fragmentos de polipéptidos este valor es usualmente de aproximadamente 100% y, por lo tanto, tiene un significado corto. Por lo tanto, en el contexto de los fragmentos de la presente invención, se usa el término "proporción del polipéptido de referencia" (expresada como un porcentaje) . La proporción del polipéptido de referencia se calcula contando el número de posiciones igualadas entre el fragmento y los polipéptidos de referencia y dividiendo tal número por la longitud total del polipéptido de referencia seguido de la multiplicación del valor resultante por 100. En particular, los fragmentos comprenderán menos de 90, 80, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25 o menos de 20% de la secuencia del polipéptido de referencia.

MODALIDADES PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Ejemplo 1: Regulación funcional de SrtCl de GVS : una mutación simple en la región de tapa mejora la polimerización de BP in vi tro.

Resumen Los pili de superficie celular son factores de virulencia importantes y candidatos de vacunas prometedores. Las bacterias Grampositivas elaboran pili mediante un mecanismo de transpeptidación catalizada por la sortasa C de los sustratos de pilina estructurales y auxiliares. Para la reticulación covalente de las subunidades individuales, son absolutamente necesarios los residuos y/o motivos específicos, tales como el motivo de pilina y la señal de clasificación de LPxG conservada. La mutagénesis de sitio dirigido de la sortasa Cl de GBS de Pi-2a (SrtCl) revela el implicación específica de Tyr86 en el sitio regulador de tapa en la activación de SrtCl recombinante . Este ejemplo muestra que las estructuras de pili de alto peso molecular de BP recombinante pueden obtenerse in vitro usando las concentraciones de enzimas catalíticas. Esto proporciona una evidencia directa de la auto- inhibición de las enzimas de sortasa C por la presencia de la tapa y abre un campo para estudiar los montajes de pili usando los pili polimerizados por una mutante activa de sortasa, reduciendo la necesidad de purificar una alta cantidad de los pili de tipo silvestre de bacterias patogénicas.

Antecedentes El estreptococo del grupo B (GBS) , o Streptococcus agalactiae, es la causa líder de las enfermedades que arriesgan la vida en el recién nacido y también está llegando a ser una causa común de una enfermedad invasiva en los adultas no embarazadas, ancianos o inmuno-comprómetidos [102] . Los pili, fibras filamentosas largas que sobresalen de la superficie bacteriana, se han descubierto en los patógenos de las bacterias Grampositivas como factores de virulencia importantes y candidatos de vacunas potenciales. Del análisis de los ocho genomas secuenciados de GBS, se han identificado dos islas genómicas, cada una codifica tres pili diferentes [103; 1] . Además, el locus de srtA que codifica la sortasa A "doméstica" (SrtA) está presente en una región de genoma diferente en todas las cepas de GBS analizadas [103] . Cada isla genómica de pilus codifica tres proteínas de LPXTG: la proteína estructural (BP) que representa la subunidad del pilus principal, y dos proteínas auxiliares (API y AP2) . Además, cada isla codifica por lo menos dos sortasas de clase C, cada una tiene una especificidad para una de las proteína auxiliares [1; 104]. Las estructuras cristalinas de varias sortasas relacionadas con pilina, SrtCl-3 de S. pneumoniae [4], AcSrtC-1 de Actinomyces oris [105] y SrtCl de S.suis (106) se han resuelto recientemente, con solamente SrtCl de S.suis en una conformación de sitio activo abierto. Además, la estructura cristalina de Spy_0129 de S. pyogenes se ha resuelto, mostrando que pertenece a la familia de la sortasa de clase B, diferente a las otras sortasas específicas de pilina caracterizadas, las cuales pertenecen a la clase C. Se ha reportado previamente una caracterización estructural y funcional de SrtCl-2a de GBS. La estructura cristalina del centro soluble de GBS SrtCl-2a, que contiene su dominio catalítico, indica que SrtCl emplea una triada catalítica compuesta de Hisl57-Cys219-Arg228 , esencial para la formación de la fibra de pilus y cubierta por una espira, conocida como "tapa", que es prescindible para la actividad de sortasa in vivo [3] . Además, la estructura cristalina sugiere que SrtCl se pliega como una enzima auto-inactivada, por la presencia de la tapa que bloquea estéricamente el sitio activo. La función de la región de la tapa en la regulación y la actividad de la enzima y aún no es clara, pero se supone que tiene un papel en la selección de las proteínas de pilus apropiadas para la polimerización. En este trabajo se muestran, por primera vez, estructuras de alto peso molecular de BP recombinante , eficientes, usando las concentraciones de la enzima catalítica.

Métodos Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento La cepa GBS 515 y mutantes se crecieron en caldo Todd Hewitt (THB) o en agar de soya Tripticasa (TSA) suplementado con 5% de sangre de oveja a 37°C.

Clonación, expresión y purificación de proteínas recombinantes Las proteínas SrtCl43-292 , (SEC ID NO : 3 sin señal y dominios de transmembrana) , SrtClY86A (SEC ID NO: 48) y SrtClaLID (SEC ID NO: 12) se expresaron como His-MBP, proteínas de fusión TEV escindibles, y purificadas como se describió anteriormente [3] . BP30-649 recombinante , que contiene el motivo de pilina y la señal de clasificación, se clonó en el vector speedET y se expresó como se describió anteriormente [107] , y BPKIS9A se generó por mutagénesis de sitio dirigido PIPE usando BP30-649 de tipo silvestre. BP30-64o recombinante, que carece del motivo de LPxTG C-terminal, se clonó en el vector speedET y se expresó y purificó como la marca His N-terminal, proteína de fusión TEV escindible, usando el mismo protocolo empleado para BP de tipo silvestre. Antisueros Los antisueros específicos para las proteínas BP-2a y APl-2a se produjeron inmunizando ratones CD1 con las proteínas recombinantes purificadas [107, 108] .

Construcción de vectores de complementación y mutagénesis de sitio específico La cepa mutante de GBS modificada genéticamente (knock-out) (KO) para BP se generó como se reportó previamente [1] . Para la generación de los fragmentos de ADN de vectores de complementación que corresponden a BP de tipo silvestre (SAL 1486) , el gen se amplificó por PCR del genoma de GBS 515 y el producto se clonó en el vector de lanzadera estreptocócico de E . coli pAM40l/gbs80P+T, descrito previamente [11, 27] y que contiene las regiones de promotor y terminador del gen gbs80 (anotación de TIGR SAG 0645) . La mutagénesis de sitio dirigido de pAM BP se realizó usando el método PIPE (Extensión de Cebador incompleto de Polimerasa) [19] . Los vectores de complementación PAM BPALPXTG y pAM_BPKi89A se electroporaron en la cepa de KO ???. La complementación se confirmó verificando la expresión de BP por Western Blotting. Análisis de Western Blotting Se suspendieron células bacterianas de fase exponencial media en Tris-HCl 50 mM que contiene 400U de mutanolisina (Sigma-Aldrich) e inhibidores de proteasa COMPLETE (Roche) . Las mezclas después se incubaron a 37°C durante 1 h y las células se lisaron por tres ciclos de congelado-descongelado. Los residuos celulares se removieron por centrifugación y la concentración proteínica se determinó usando la prueba de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL) . Los extractos de la proteína total (20 µg) o los pili recombinantes se resolvieron en 3-8% ó 4-12% de geles NuPAGE precast (Invitrogen) por SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa . LAs membranas se sondearon con antisuero de ratón dirigido contra las proteínas BP y API (dilución 1:1,000) seguido de un anticuerpo secundario conjugado de peroxidasa de rábano picante de anti-ratón de conejo (Dako, Glostrup, Dinamarca) . Las bandas después se visualizaron usando un kit de sustrato 0pti-4CN (Bio-Rad) .

Resultados La lisina 189 en el motivo de pilina putativo y señal de clasificación de IPQTG de BP-2a son esenciales para la formación de pilus por la sortasa C de tipo silvestre.

En la proteína estructural de pilus de GBS 2a, BP-2a (cepa 515, la anotación TIGR SAL 1486) se identificó un motivo de pilina putativa que contiene un residuo de lisina altamente conservado (Lysl89) y el motivo de IPQTGG en el residuo 641-646 como el motivo de clasificación de C (Figura 3 A) . Para investigar la contribución específica en el montaje de pilus de cada residuo/motivo se usó mutagénesis de sitio específico y estudios de complementación usando el método de mutagénesis de PIPE (Extensión de cebador incompleta de polimerasa) al vector pAM401 usado previamente en los estudios de complementación de las cepas imitantes modificadas genéticamente (KD) de GBS. Como molde para la introducción por PCR de las mutaciones/supresiones específicas se usó el vector de complementación que porta el gen BP-2a (pAM_BP) .

Para evaluar el papel de Lysl89 en el motivo de pilina y el motivo de IPQTGG en la señal de clasificación de la pared celular (C SS) de BP-2a, se generó un plásmido (pAM_BPKi89A) que expresa una proteína estructural mutada que porta una sustitución del residuo de lisina del motivo de pilina con una alanina y un segundo plásmido (pAM_BPñIPQTG) que porta la supresión completa de la señal de clasificación de IPQTG. K189 y la señal de clasificación de C-terminal de BP-2a se requirieron absolutamente para la polimerización de pilus y la incorporación de las proteínas auxiliares en las estructuras de alto peso molecular (Figura 3B) . Cuando K189 se mutó en una alanina, solamente podría identificarse la forma del monómero de BP, mientras que cuando la señal de clasificación de IPQTG se eliminó en BP, además de la forma monomérica de BP, también se observó una banda de mayor peso molecular (Figura 3C) . El inmunomanchado realizado con los anticuerpos originados contra BP y API, mostró que esta banda de peso molecular superior, resistente al tratamiento de SDS, contuvo la proteína estructural (BP) y la proteína auxiliar principal (API) (Figura 3C) . La polimerización de la BP no se puede presentar ya que se elimina su señal de clasificación, pero el motivo de pilina de la BP está aún disponible para formar un enlace covalente entre el motivo de pilina BP y la señal de clasificación de API.

La señal de clasificación similar a LPXTG es esencial para la reacción de transpeptidación mediada in vitro por la mutante SrtClY86A/ pero el motivo de pilina NO.

Para investigar la contribución específica de la Lysl89 en el motivo de pilina y la señal de clasificación de IPQTG en la reacción de polimerización in vitro, se expresó en E. coli y las formas mutadas purificadas de la proteína BP-2a, BPfii QTG y BPKI89A, que portan la supresión de la región IPQTG y la sustitución de la Lysl89 con una alanina, respectivamente. Después de mezclar SrtCly86A activa con la mutante de BPflIPQTG recombinante , los polímeros de HMW no podrían detectarse, confirmando que la reacción de polimerización se presenta a través de la escisión de la señal de clasificación y la formación del intermediario de acilo entre SrtClY86A y el motivo de IPQTG (Figura 14A) . Por el contrario, no podría observarse en las reacciones en las que la SrtClY86A activa se incubó con polímeros de HMW de ?? ?89?/ lo que indica que el residuo de Lys del motivo de pilina (K189) , de manera diferente de lo que pasa en GBS, no es esencial para la polimerización in vitro (Figura 14B) . Además, cuando se mezcló SrtClY86A con las formas recombinantes de las proteínas auxiliares (APl-2a y AP2-2a), que in vivo pueden polimerizarse solamente en presencia de la proteína BP-2a (los datos no se muestran) , se formaron algunas estructuras de HMW (Figura 14C) . Estos datos demuestran que SrtClY86A puede usar diferentes nucleófilo (s) para resolver el intermediario de acilo entre la enzima y la señal de clasificación similar a LPXTG. Por lo tanto, dado que no se requiere el motivo de pilina, sorprendentemente este descubrimiento sugiere que la enzima mutante puede usarse en una gama más amplia de reacciones y es capaz de catalizar las reacciones con las proteínas a las que se ha adicionado un motivo de LPXTG.

SrtCl-2a de tipo silvestre no es capaz de inducir la polimerización de BP recombinante in vitro.

La presencia de pili en la superficie de GBS se caracteriza por un peldaño de bandas de alto peso molecular en SDS-PAGE por análisis de inmunomanchado de las preparaciones de la pared celular, en las que los monómero de BP de GBS se enlazan covalentemente para formar la estructura del pilus [1] . Para probar la hipótesis que es la interacción con el sustrato de la proteína estructural que inducen la conformación activa de la tapa abierta de SrtCl, se probó la actividad funcional in vitro de SrtCl recombinante (r-SrtCl) y la proteína estructural recombinante (r-BP) (107) , mediante la investigación de un patrón de bandas de alto peso molecular en los geles de SDS de gradiente. La BP de la subunidad de pilina principal de GBS recombinante que porta el motivo de pilina K189 y el sitio de reconocimiento LPxTG C-terminal, se mezcló con WT SrtCl, a varias relaciones y se incubó a 37 °C durante diferentes tiempos que también alcanzan las cantidades de altas en enzimas usadas para SrtCl de S. pneumoniae [4] . Sin embargo, el análisis de SDS-page de estas muestras, no mostró una formación de las bandas de alto peso molecular que podrían representar los polímeros de pilus (Figura 4A) , sino solamente la formación de un complejo compatible con la formación de un heterodímero formado por rSrtCl y rBP, como se describió previamente para S. pneumoniae [4] y un dímero BP-BP que también se forma en ausencia de SrtCl (Figura 4B) .

Las estructuras de BP de alto peso molecular pueden montarse in vitro por la mutante de tapa SrtCl recombinante.

Para confirmar nuestra hipótesis de que la cisteína catalítica se cierra por el anillo aromático de Tyr86, se realizó el mismo experimento mezclando SrtC-lY86A recombinante [3] , con BP purificada recombinante y se probó la capacidad de esta mutante de sortasa para polimerizar los monómero de BP de GBS. El patrón de pili típico de las bandas con pesos moleculares arriba de 260 kDa, visibles por SDS-page, podrían generarse cuando r-BP monomérica se incubó con rSrtClY86A (Figura 5 A) . La reacción después de 48 h se apagó y se analizó mediante Western Blotting usando los anticuerpos de BP, verificando el escalón típico de la polimerización de BP comparado con los pili de tipo silvestre de la cepa GBS 515 (Figura 5B) .

Como parte del monómero de BP, aún permanece sin procesar después de 10 días de reacción, se probó si mayores cantidades de la enzima podrían alcanzar una conversión completa de BP monomérica en las estructuras poliméricas.

Se encontró que las concentraciones de la enzima de 10 a 100 µ? con una concentración de BP fijada, no cambió la velocidad de formación de los polímeros de BP recombinantes (Figura 5C) . Usando una concentración de enzima fijada de 25 µ? para la reacción de polimerización, también se probó la variación de la concentración de BP monomérica (Figura 5D) .

La formación de las estructuras de BP de alto peso molecular in vi tro por la mutante de SrtCly86A recombinante es mediada por LPXTG y motivos de pilina.

Para confirmar que la polimerización de BP se presenta a través de los motivos correctos, la polimerización in vitro se probó incubando r-BPñLPXTG y r-BPK189A con SrtClY85A confirmando que la polimerización se presenta a través de una escisión de la señal de clasificación de LPXTG y el enlace subsecuente al motivo de pilina de la siguiente subunidad. Producción y purificación de las estructuras de HMW de BP.

La purificación de pili de patógenos grampositivos es muy estimulante y consumidor de tiempo y permite la purificación de bajas cantidades sólo de material. Como podría obtenerse una polimerización de BP en un volumen de reacción de 50 µ?, se intentó escalar la producción de la producción de pili recombinantes. Se encontró que las mejores condiciones de reacción se obtuvieron usando la enzima a 25 µ? y la BP a 100 µ?. El volumen de reacción también es importante, ya que usa hasta 100 µ? de la reacción disminuye la eficiencia de la polimerización de BP. Se realizaron 10 reacciones usando estas concentraciones de sustrato y enzima en 100 µ? cada una, para una cantidad total de 6.5 mg de BP pura, y se incubó la reacción durante 7 días en presencia de un agente reductor. Después de este tiempo, se separó el fondo de las reacciones (1 mi total) por filtración en gel . Dos fracciones, que contienen principalmente pili de alto peso molecular, se aislaron de BP monomérica y SrtCl, y se cuantificaron para contener 0.5 mg de pili (Figura 6). La Figura 7 muestra que las enzimas de la sortasa mutante polimerizan las proteínas de pilus de una variedad de bacterias grampositivas . SrtClY86A (sortasa Cl de GBS de PI-2a) se incubó con la proteína estructural PI-1 de GBS (también referido como GBS 80) (Figura 7A) o con la proteína de pilus de Streptococcus pneumoniae (también referido como RrgB) (Figura 7B) .

Conclusión En las bacterias Grampositivas , la asociación covalente de pili requiere la acción de sortasas específicas. La biosíntesis de pilus 2a en GBS se promueve por dos enzimas de sortasa (SrtC-1 y SrtC-2) que polimerizan la BP y exhiben especificidad de sustrato de proteínas auxiliares. Previamente, se ha mostrado que una triada compuesta de residuos de His, Cys y Arg es esencial para la actividad de SrtC-1. Además, la estructura cristalina indica claramente que SrtCl de GBS se auto- inhibe por la presencia de la tapa en el paquete catalítico. Recientemente, nuestro grupo midió la actividad catalítica para SrtCl de GBS usando un péptido fluorescente auto-apagado mezclado con SrtCl de GBS T y las mutantes de tapa para monitorear la escisión del sustrato, y se encuentra que la mutantes de tapa son aún más activas que WT. Estos datos, de acuerdo con los experimentos in vivo con mutantes de tapa, se sugirió que la activación de las sortasas C se podrían presentar por un cambio conformacional que resulta en el movimiento de la tapa lejos del sitio catalítico que podría inducirse por los sustratos proteínicos .

Partiendo de estas observaciones, se realizaron experimentos in vitro usando SrtCl de GBS WT recombinante y las mutantes de tapa se mezclaron con la proteína de pilus estructural recombinante y se observó que la enzima SrtCl de WT no fue capaz de inducir la polimerización de la proteína BP recombinante. Se logró la activación de la enzima, in vitro, por medio de una sola mutación en la región de la tapa de SrtCl-2a recombinante que mejora la polimerización de BP in vitro y la formación de pili recombinantes . Estos experimentos sugieren que para SrtC, el mecanismo detrás del reconocimiento y polimerización de las subunidades de pilus no podrían depender solamente de la interacción entre la proteína del eje fimbrial y la sortasa, ya que la activación de la enzima no podría lograrse in vitro, simplemente mezclando SrtCl T con la BP. Los experimentos con las mutantes de la tapa indican que la presencia de la tapa, y en particular, de la Tyr86 en este ciclo, previenen la polimerización de BP. Este trabajo proporciona la primera evidencia directa de auto- inhibición de las enzimas de sortasa C por la presencia de la tapa y abre un campo para estudiar el montaje de los pili usando los pili polimerizados mediante una mutante activa de sortasa, reduciendo la necesidad de purificar la alta cantidad de los pili de tipo silvestre de las bacterias patogénicas. Además, el anclaje de muchos factores de virulencia superficiales en bacterias Grampositivas es mediado por la actividad de la sortasa y, por lo tanto, estas enzimas son blancos atractivos para el diseño de nuevos terapéuticos anti-infecciosos .

Ejemplo 2: Estudios de inmunización usando pili polimerizados in vi tro.

Las estructuras de pili polimerizados in vi tro pueden usarse en estudios de inmunización en ratones. Por ejemplo, 10 ug de pili recombinantes purificados pueden mezclarse con un adyuvante (por ejemplo, alumbre) y se inyectan en los ratones en un volumen final de 200 µ? . Esto puede seguirse por una o más inmunizaciones estimulantes. Los ratones después pueden analizarse para una respuesta inmune a las estructuras de los pili. Esta respuesta inmune puede ser protectora contra las bacterias, de las cuales las proteínas de pili monoméricas se derivaron originalmente.

Se ha llevado a cabo un estudio de inmunización en el que los ratones se inmunizaron con pili monoméricos que comprenden GBS59 generado de acuerdo con los métodos de la invención, en combinación con alumbre, y la respuesta inmune protectora se verificó después de la estimulación subsecuente con GBS. Los resultados se compararon con la inmunización usando un protocolo similar con GBS59 recombinante no en la forma de pilus y alumbre, la mutante de SrtC l (Y86A) y alumbre, Crmla y alumbre. Los resultados del experimento de inmunización se proporcionan en la siguiente Tabla 4.

Tabla 4: Inmunización con pili GBS59 Estos resultados muestran que los pili de GBS59 generados usando las enzimas de la sortasa C mutantes, de acuerdo con los métodos de la invención son significativamente más efectivos para generar una respuesta inmune protectora a GBS que la proteína monomérica recombinante y son equivalentes al uso de CRM la.

Ejemplo 3: Polimerización de variantes de BP-2a (GBS59) in vitro.

Se probó la capacidad de la imitante de sortasa para polimerizar las variantes de monomeros de BP de GBS de GBS59 que corresponde a las SEC IDs : 74, 75, 76, 77, 78 y 79.

Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento Las cepas de GBS usadas en este trabajo fueron 2603 V/R (serotipo V) , 515 (la) , CJB111 (V) , H36B (serotipo Ib) , 5401 (II) y 3050 (II) . Las bacterias se crecieron a 37°C en caldo Todd Hewitt (THB; Difco Laboratories) o en agar de soya tripticasa suplementado con 5% de sangre de oveja.

Clonación, expresión, purificación de proteínas recombinantes y antisueros .

El ADN genómico se aisló mediante un protocolo estándar para bacterias grampositivas usando un kit NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel) , de acuerdo con las instrucciones de fabricante. Las proteínas de BP-2a recombinantes de longitud total, que corresponden a las variantes alélicas 515, CJB111 y 2603 (anotación TIGR SAL1486, SAM1372 y SAG1407, respectivamente) , se produjeron como se reporta en Margarit et al, Journal of Infectious Diseases, 2009, 199: 108-115, mientras que la variante de H36B de longitud total (anotación TIGR SAI_1511) se clonó en pET24b+ (Novagen) usando la cepa H36B como una fuente de ADN. Los cebadores se diseñaron para amplificar las regiones de codificación sin el péptido de señal y la secuencia 3' terminal que inicia desde el motivo LPXTG.

Para la expresión de la proteína recombinante , los cultivos se mantuvieron a 25 °C durante 5 h, después de la inducción con IPTG 1 mM para los clones de pET o con 0.2% de arabinosa para los clones de SpeedET . Todas las proteínas recombinantes se purificaron por cromatografía de afinidad y filtración en gel . Brevemente, las células se cosecharon por centrifugación y se Usaron en el "amortiguador de lisis", que contiene imidazol 10 mM, 1 mg/ml de lisozima, 0.5 mg/ml de DNAse y cóctel de inhibidores COMPLETE (Roche) en PBS . El lisado se clarificó por centrifugación y se aplicó en una columna His-Trap HP (Armesham Biosciences) pre-equilibrada en PBS que contiene imidazol 10 mM. La elución de la proteína se realizó usando el mismo amortiguador que contiene imidazol 250 mM, después de dos etapas de lavado usando amortiguadores de imidazol 20 mM y 50 mM. Las proteínas eluidas después se concentraron y se cargaron en HiLoad 16/60 Superdex 75 (Amersham Biosciences) pre -equilibrada en PBS.

Los antisueros específicos para cada proteína se produjeron inmunizando los ratones CD1 con las proteínas recombinantes purificadas como se describió previamente ( O 90/07936) . Las respuestas inmunes específicas de la proteína (Ig total) en sueros de fondo se monitorearon por ELISA.

Como anteriormente, se encontró que las concentraciones de la enzima de 10 a 100 µ? mezcladas con una concentración de BP fijada, no cambiaron la velocidad de formación del polímero de GBS59 recombinante . Los monómeros de la variante de GBS59 se mezclaron a una relación de 1:1:1:1:1:1. Usando una concentración de enzima fijada de 25 µ? para la reacción de polimerización, también se probó la variación de las concentraciones de la mezcla de variantes de GBS59 de BP monoméricas .

Polimerización in vitro con tres variantes de BP-2a (H36B, 515, CJB111) : BP-2a (variantes H36B, 515, CJB111) concentraciones: 35 µ? cada una - 105 µ? tot .

Concentración de SrtClY86A: 25 µ? Amortiguador: Tris-HCl 25 mM, pH 7.5 - NaCl 100 mM - DTT 1 mM Volumen de reacción total 100 µ? Incubación a 37°C durante 48 h.

El patrón de pili típico de bandas con pesos moleculares arriba de 260 kDa, visible por SDS-page, podría generarse cuando la mezcla de variantes de r-BPs monomérico se incubó con rSrtClY86A (Figura 11) . La reacción después de 48 h se apagó y se analizó por Western Blotting usando anticuerpos de BP, verificando el escaló típico de polimerización de BP comparado con los pili de tipo silvestre. Los pili que comprenden cada una de las variantes de GBS59 se crearon y se usaron para la inmunización. La vacunación de los ratones siguiendo los procedimientos descritos anteriormente, fue exitosa para proteger contra la estimulación con cada una de las tres cepas de GBS. Por el contrario, los ratones vacunados solamente con una forma variante, se protegieron solamente contra la estimulación con tal cepa particular. Sorprendentemente, estos pili artificiales fueron más efectivos para generar una respuesta inmune protectora a GBS que la proteína monomérica recombinante.

Ejemplo 4: Polimerización in vitro con dos tipos de proteínas estructurales (BP-2a + pilus 1 BP (BP-1) y/o neumococo RrgB) : Siguiendo los procedimientos representados anteriormente, se prepararon el pilus quimérico que comprende las proteínas estructurales de Streptococcus agalactiae y neumococo : Concentraciones de BP : 50µ? cada una - 100 µ? tot .

Concentración de SrtClY86A: 25 µ? Amortiguador: Tris-HCl 25 mM, pH 7.5 - NaCl 100 mM- DTT 1 mM Volumen de reacción total 100 µ? Incubación a 37°C durante 48 h.

Como se muestra en la Figura 12A y la Figura 12B, la presencia de las bandas de HMW demuestra la capacidad de las enzimas de la sortasa C mutante para polimerizar las proteínas de otras cepas/tipos de bacterias. La vacunación de los ratones siguiendo los procedimientos descritos anteriormente, fue exitosa para proteger contra la estimulación con estreptococo del grupo B y Streptococcus pneumonía (datos no mostrados) . Las sortasas de la invención también son capaces de polimerizar las combinaciones de GBS67 y GBS59.

Ejemplo 4: SrtC imitante puede polimerizar GFP-IPQTG La secuencia "IQTGGIGT" se adicionó al C-terminal de la secuencia de ADN de la proteína GFP usando mutagénesis: Cebadores usados : GFP-lpxtg_F attccacaaacaggtggtattggtacaTAACGCGACTTAATTAAACGG GFP-lpxtg_Rl TGTACCAATACCACCTGTTTGTGGAATCTTGTACAGCTCGTCCATGCC Molde ADN de mutagénesis: vector SpeedET + GFP Secuencia de ADN EGFP a continuación (de pSpeedET) : CTTTAAGAAGGAGATATACATACCCATGGGATCTGATAAAATTCATCATCATCATCATCAC GAAAACCTGTACTTCCAGGGCatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgc ccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgaggg cgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctg cccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgct accccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtcca ggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttc gagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggca acatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccga caagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagc gtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgc ccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcga tcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctg tacaagTAACGCGACTTAATTAAACGGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAG ATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATC Secuencia de aminoácido EGFP a continuación (de pSpeedET) : MGSD IHHHHHHENLYFQGMVSKGEELFTGWPILVELDGD GHKFSVSGEGEGDATYGK LTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKD DGNYKTRAEVKFEGDTLV RIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKV NFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH VLLEFV TAAGITLGMDELYK Secuencia de ácido nucleico después de la mutagénesis : CTTTAAGAAGGAGATATACATACCCATGGGATCTGATAAAATTCATCATCATCATCATCAC GAAAACCTGTACTTCCAGGGCatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgc ccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgaggg cgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctg cccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgct accccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtcca ggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttc gagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggca acatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccga caagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagc gtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgc ccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcga tcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctg tacaagattccacaaacaggtggtattggtacaTAACGCGACTTAATTAAACGGTCTCCAG CTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATC Secuencia de ácido nucleico después de la mutagénesis : MGSDKIHHHHHHENLYFQGMVSKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGK LTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKD DGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKV NFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFV TAAGITLGMDELYKIPQTGGIGT- Producción de "GFP- IQTGGIGT" recombinante" : expresión y purificación La expresión de GFP- IPQTGGIGT en HK100 en LB + canamicina 30 ug/ml usando medios de biosilta a 30°C, inducción con arabinosa al 0.15% final. Purificación: IMAC estándar Reacción de polimerización de GFP- IQTGGIGT y SrtClY86A: Mezclar SrtClY86A 25 uM con 25-50 ó GFP-IPQTGGIGT 100 uM en el amortiguador Tris 25 mM, pH 7.5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM durante 72 h a 37°C en el termomezclador . Volumen de reacción 50 ul.

Como se muestra en la Figura 13, la mutante de SrtClY8SA fue capaz de polimerizar GFP-IPQTG.

Ejemplo 5: Las proteínas SrtCl y SrtC2 de PI-2b recombinantes son activas in vitro y son capaces de escindir los péptidos fluorescentes que portan el motivo similar a LPXTG de SrtCl y C2 de las proteínas de pilus de longitud total se clonaron (usando la cepa COH1 como molde) en fusión con una marca His- MBP . Las enzimas recombinantes después se expresaron en E. coli y se purificaron con una columna de trampa IMAC o IMAC y MBP. Las pruebas FRET con las sortasas purificadas se llevaron a cabo usando los péptidos fluorescentes sintéticos que portan el motivo de clasificación LPXTG de la proteína estructural PI-1 y de la proteína auxiliar menor PI-1 para verificar la actividad catalítica. Las enzimas SrtCl y SrtC2 de PI-2b son capaces de escindir los péptidos fluorescentes. Estos datos demuestran que las enzimas SrtCl y SrtC2 de PI-2b son activas in vitro y son apropiadas para el uso en las proteínas de ligación y polimerización.

Se usaron los siguientes protocolos y condiciones: Purificación de la enzima SrtCl - IMAC - 3 litros de cultivo de células Rosetta que expresan la construcción SrtCl-MBP-His - pilustillas colectadas y lisadas - Imidazol 10 mM adicionado a 30 mi de lisado - columna: flujo de 5 mi y 4 (aproximadamente 5 ml/min) - lisado cargado y flujo pasante colectado - lavadas con 15 mi de amortiguador con imidazol 10 mM (los primeros 3 mi son el volumen muerto de la columna) - lavado conl5 mi de amortiguador con imidazol 20 mM - eluído con imidazol 300 mM, 10 mL de amortiguador - DTT 1 mM DTT adicionado - concentrado de proteína con amicon a 6000 rpm a 4°C durante 20 minutos la concentración final de la proteína fue de 1.78 mg/ml Purificación de la enzima SrtC2 - IMAC - 3 litros de cultivo de células Rosetta que expresan la construcción SrtC2 -MBP-His - 2 columnas (30 mi de pilustillas con lisado celular + 20 mi de amortiguador 10 mM) 50 mi de FT - pre-lavado con 20 mi de amortiguador 10 mM - lavado con 50 mi de amortiguador 10 mM - lavado con 150 mi de amortiguador 20 mM amortiguador de elución 300 mM: 5 mi de volumen muerto, 10 mi de eluato 2 + 20 µ? de DTT 1M, 10 mL de eluato 3 - los eluatos 1 y 3 se combinaron, mientras que 10 mi de NaCl 300 mM, 50 mM y Tris, pH 8 se adicionaron a 10 mi del eluato 2 Purificación de la enzima de SrtC2 -MBP-trap - se usaron 2 columnas MBP-trap - la columna se lavó con 50 mi de amortiguador con maltosa (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8, maltosa 100 mM) - lavado con 50 mi de urea 8 m, pH 8 - Tris 50 mM - lavado con agua destilada (80 mi) - balanceado con 25 mi de amortiguador Tris 50mM, pH8 , NaCl 300 mM, diluido con agua 1:2 - eluato 2 cargado - eluatos 1 + 3 cargados - lavado - eluido con amortiguador que contiene maltosa Análisis de FRET Placa cerrada con plástico termofluor. 1) 50 µ? de amortiguador (NaCl 300 mM + Tris 50 mM, pH 8) + 50 µ? de 1515 + 1 µ? de péptido BP 2) 50 µ? de amortiguador (NaCl 300 mM + Tris 50 mM, pH 8) + 50 µ? de 1515 + 1 µ? de péptido AP2 3) 100 µ? de 1515 + 1 µ? de péptido BP 4) 100 µ? de 1515 + 1 µ? de péptido AP2 5) 100 µ? de amortiguador de elución (Imidazol 300 mM) + 1 µ? de péptido BP 6) 100 µ? de amortiguador de elución (Imidazol 300 mM) + 1 µ? de péptido AP2 Se usaron 200 µ? [1.78 mg/ml] de proteína concentrada + 2 µ? de péptido LPXTG de BP y AP2 , y como control se usó el amortiguador de elución imidazol 300 mM en lugar de la proteína .

Lector de placa Tecan - 300 ciclos con una medición cada 10 minutos, temperatura [34-37.5°C] con 37°C para el óptimo y la longitud de onda [400 nm-600 nm] se han obtenido con una absorción máxima proporcionada a 500 nm.

Ejemplo 6: SrtCl es efectiva para polimerizar BP La actividad de SrtCl se probó adicionalmente usando una cepa de GBS mutante que no expresa ningún pilus (515A2a) . Esta cepa se transformó con los vectores de complementación PAMp80/t80 que portan los genes que codifican sólo BP o BP con PI-2b SrtCl. La capacidad de los vectores de complementación para restaurar la polimerización de los pili se analizó por western blot . Como se muestra en la Figura 10, la transfección con BP sólo no resultó en ninguna polimerización. Sin embargo, la transfección con BP y SrtCl resultó en la formación de polímeros de alto peso molecular. La cepa A909, la cual expresa el pilus 2b, se usó como un control positivo.

La Figura 10 proporciona un Western blot de la preparación de membrana de la cepa mutante 515A2a y de la cepa A909 de tipo silvestre complementada por un plásmido que contiene los genes SrtCl y BP o el gen de BP sólo. Se usaron anticuerpos contra SrtCl. Las señales esperadas a 30 kDa confirman la expresión y la localización correcta de SrtCl.

Estos datos demuestran que PI-2b SrtCl es efectiva para la polimerización de pili.

Se usaron los siguientes protocolos y condiciones: Electroporación 100 µ? de las cepas A909 y 515A2a se transformaron con 3/7 µ? de Spbl (BP - PI-2b) o Spbl + SrtCl (PI-2b) .

Inoculación En 10 mi de THB + glicerol clm.

Las células se granularon y lavaron con 25 mi de PBS - 940 µ? de TRIS pH 6.8, 50 mM + 60 µ (10 U/µ?) - 2 horas a 37°C, agitación Extractos de GBS de gel y western blot 10 extractos centrifugados durante 10 minutos a velocidad máxima - 30 µ? de sobrenadante + 15 µ? de LDS + 5 µ? de reducción las pilustillas se resuspendieron en 2% de amortiguador TRIS 50 mM, SDS pH 8, NaCl 300 mm - western blot y membrana lavada - lavado con agua - 2 horas de agitación con leche al 5% - enjuagado con PBS - en cada membrana 5 mi de leche al 1% + anticuerpo (anti-Spbl en sobrenadantes de cultivo y anti SrtCl en las pilustillas) - dejar durante la noche con agitación en medio frío - lavado con 10 mi de PBS-Tween al 0.05% durante 10 minutos 3 veces - lavado con PBS durante 5 minutos - 20 mi de leche al 1% + anticuerpo de anti -ratón P161 y dejar durante 1 hora con agitación - lavado con PBS - solución desarrollada preparada (10 mi = 9 mi de agua + 1 mi de diluyente + 200 µ? de sustrato de muestra +) - 5 mi por membrana .

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (34)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Método para ligar por lo menos dos radicales, caracterizado porque comprende poner en contacto por lo menos estos dos con una enzima de sortasa C relacionada con pilus in vitro bajo condiciones apropiadas para que se presente una reacción de transpeptidación mediada por sortasa, en donde la enzima de sortasa C relacionada con pilus comprende un sitio activo expuesto.

2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima de sortasa C relacionada con pilus es de estreptococo.

3. Método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el estreptococo se selecciona del grupo que consiste de Streptococcus agalactiae (GBS) , Streptococcus pneumonía (neumococo) y Streptococcus pyogenes (GAS) .

4. Método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la enzima de sortasa C relacionada con pilus es una enzima de sortasa Cl (SrtCl) , enzima de sortasa C2 (SrtC2) o una enzima de sortasa C3 (SrtC3) .

5. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la mutación de la enzima de sortasa C relacionada con pilus comprende una supresión de parte o toda la tapa.

6. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la mutación comprende una supresión de los aminoácidos en las posiciones 84, 85 y/u 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) , o la supresión de los aminoácidos que corresponden a las posiciones en la secuencia de aminoácido de otra enzima de sortasa C relacionada con pilus.

7. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la mutación comprende la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 84, 85 y/u 86 de la secuencia de aminoácido de la enzima de sortasa Cl de GBS de PI-2a (SEC ID NO: 3) , o la sustitución de los aminoácidos en las posiciones correspondientes en la secuencia de aminoácido de otra enzima de sortasa C.

8. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la enzima de sortasa C relacionada con pilus comprende o consiste de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 y 71.

9. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque por lo menos dos radicales comprenden un motivo LPxTG y un motivo de pilina.

10. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque por lo menos dos radicales son bacterias Grampositivas .

. 11. Método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque por lo menos los dos radicales son de las mismas bacterias Grampositivas o de bacterias Grampositivas diferentes.

12. Método de conformidad con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, caracterizado porque por lo menos los dos radicales son polipéptidos estreptocócicos .

13. Método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque por lo menos los dos radicales son proteínas estructurales estreptocócicas y/o proteínas auxiliares.

14. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque por lo menos los dos radicales comprenden o consisten de una secuencia de aminoácido: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de cualquiera de las SEC ID NOs: 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 ó 97; o (b) que es un fragmento de por lo menos "n" aminoácidos consecutivos de una de estas secuencias, en donde "n" es 20 o más (por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más; por ejemplo, 20 o más; o por ejemplo, 50 o más; o por e emplo, 80 o más) .

15. Pilus artificial, caracterizado porque se obtiene o es capaz de obtenerse del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Pilus artificial, caracterizado porque comprende por lo menos dos variantes de la proteina estructural GBS59 y en donde por lo menos las dos variantes se seleccionan del grupo que consiste de las cepas de estreptococos del grupo B 2603, H36B, 515, CJB111, CJB110 y DK21.

17. Pilus artificial de conformidad con la reivindicación 15 ó 16 para usarse en medicina.

18. Pilus artificial de conformidad con la reivindicación 15 ó 16 para usarse en la prevención o tratamiento de una infección estreptocócica .

19. Método para el tratamiento o prevención de una infección estreptocócica en un paciente en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un pilus artificial de conformidad con la reivindicación 15 o 16 al paciente.

20. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque por lo menos los dos radicales comprenden un primer radical que comprende el motivo de aminoácido LPXTG, en donde X es cualquier aminoácido, y un segundo radical que comprende por lo menos un aminoácido.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el primer radical es un primer polipéptido y el segundo radical es un segundo polipéptido.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el primer polipéptido y el segundo polipéptido son de bacterias Grampositivas .

23. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el primer polipéptido y el segundo polipéptido son de las mismas bacterias Grampositivas o de diferentes bacterias Grampositivas.

24. Método de conformidad con la reivindicación 22 o 23, caracterizado porque el primer polipéptido y el segundo polipéptido son polipéptidos estreptocócicos .

25. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el primer polipéptido y el segundo polipéptido son proteínas estructurales estreptocócicas y/o proteínas auxiliares.

26. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque ya sea el primer radical o el segundo radical comprende una marca detectable.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la marca detectable es una marca fluorescente, una radiomarca, una marca quimioluminiscente, una marca fosforescente, una marca de biotina o una marca de estreptavidina.

28. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque ya sea el primer radical o el segundo radical es un polipéptido y el otro radical es una proteína o glucoproteína sobre la superficie de una célula.

29. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque ya sea el primer radical o el segundo radical es un polipéptido y el otro radical comprende los aminoácidos conjugados a un soporte sólido.

30. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque ya sea el primer radical o el segundo radical es un polipéptido y el otro radical comprende por lo menos un aminoácido conjugado a un polinucleótido .

31. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el primer radical o el segundo radical son el N-terminal y el C-terminal de una cadena polipeptídica, y la ligación resulta en la formación de un polipéptido circular.

32. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el motivo de pilina comprende los aminoácidos YPAN.

33. Kit, caracterizado porque comprende una enzima de sortasa Cl de PI-2b o una sortasa C2 de PI-2b de Streptococcus agalactiae y un radical que comprende el motivo de aminoácido LPXTG, en donde X es cualquier aminoácido.

34. Conjugado, caracterizado porque se obtiene o es capaz de obtenerse del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 31.