CN104293814A - 一种滞育激素融合基因、融合蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种滞育激素融合基因、融合蛋白、制备方法及应用，属于生物技术领域。本发明以分月扇舟蛾(Clostera anastomosis)滞育激素基因(Cloan-DH)编码序列为基础，设计改造合成遗传密码子得到优化的人工基因，以增强型绿色荧光蛋白EGFP为标签，人工合成TAT蛋白转导结构域，通过构建TAT-Cloan-DH（TCDH）融合基因，在大肠杆菌中表达融合蛋白，借助TAT的高效跨膜转导作用，通过害虫取食途径将外源DH作用于害虫，达到预防和控制虫害的目的。

Description

一种滞育激素融合基因、融合蛋白、制备方法及应用

技术领域

本发明具体涉及一种滞育激素融合基因，同时还涉及一种滞育激素融合蛋白以及该融合蛋白的制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

TAT(transactivator of transcription，TAT)为病毒有效转录和复制所必须的多肽序列。TAT蛋白转导域能够将与之共价连接的生物大分子(如核酸、多肽、蛋白质等)非特异地转导细胞内部，这种过程既不依赖于受体和转运蛋白，也与温度和能量无关，而且对宿主细胞几乎没有毒性。这种具有携带外源蛋白穿透细胞膜能力的特异多肽序列称为蛋白转导域(Protein transduction Domains，PTDs)，也称细胞穿膜肽(cell penetratingpeptides，CPP)。

昆虫滞育激素(diapause hormone，DH)是昆虫神经肽类激素的一种，控制滞育行为。滞育行为对昆虫种群的繁衍有两方面的积极意义，一是度过不良环境，维持个体生存；二是使群体发育整齐，增强雌雄个体间交配机率。滞育激素作为昆虫内分泌调节神经肽之一，其引起昆虫生理反应所需剂量极低，理论上只需极微量的外源DH进入虫体，便可对害虫造成强烈生理干扰作用，但是如何有效保持外源DH活性，仍有待解决。

发明内容

本发明的目的是提供一种滞育激素融合基因。

其次，本发明提供一种滞育激素融合蛋白。

再者，本发明提供一种滞育激素融合蛋白的制备方法。

同时，本发明提供一种滞育激素融合基因在预防和控制虫害方面的应用。

最后，本发明提供一种滞育激素融合蛋白在预防和控制虫害方面的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种滞育激素融合基因，其含有TAT-Cloan-DH（TCDH）融合基因，TCDH融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，滞育激素融合基因还包含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，EGFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述的TAT-Cloan-DH（TCDH）融合基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因通过一段编码柔性连接肽的核苷酸序列连接。具体的，滞育激素融合基因的核苷酸序列如SEQID NO:3所示。

一种滞育激素融合蛋白，其含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。该氨基酸序列由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列编码。

一种滞育激素融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）以pUC57-TCDH质粒为模板扩增TAT-Cloan-DH（TCDH）融合基因，并连接到pGEX-4T载体中构建pGEX-4T-TCDH载体；

（2）以pEGFP-NI质粒为模板扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，并连接到pGEX-4T-TCDH载体中构建pGEX-4T-TCDH-EGFP载体；

（3）将pGEX-4T-TCDH-EGFP载体转化大肠杆菌，诱导表达即得滞育激素融合蛋白（TCDH-EGFP融合蛋白）。

所述步骤（1）中扩增TAT-Cloan-DH（TCDH）融合基因采用的引物对A为：

A上游引物：5’-CGGAATTCATGTACGGCCGCAAGAAGAGG-3’（如SEQ ID NO:5所示），

A下游引物：5’-ACGCGTCGACGTCGACATTGTCTTCACTG-3’（如SEQ ID NO:6所示）。

扩增反应体系为：总体系50μl，40.5μl dH₂O、5μl 10×Buffer、1μl dNTP(25μM)、1μl primer forward(12μM)、1μl primer reverse(12μM)、0.5μl pfu Taq(5U/μl)、1μlTemplete cDNA(<20pg/μl)。

扩增反应条件为：94℃4min预变性后，94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸7min。

所述步骤（2）中扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因采用的引物对B为：

B上游引物：5’-ACGCGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’（如SEQ IDNO:7所示），

B下游引物：5’-AATGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’（如SEQ IDNO:8所示）。

扩增反应体系为：总体系50μl，40.5μl dH₂O、5μl 10×Buffer、1μl dNTP(25μM)、1μl primer forward(12μM)、1μl primer reverse(12μM)、0.5μl pfu Taq(5U/μl)、1μlTemplete cDNA(<20pg/μl)。

扩增反应条件为：94℃4min预变性后，94℃30s，62℃30s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸7min。

一种滞育激素融合基因在预防和控制虫害方面的应用。

一种滞育激素融合蛋白（TCDH-EGFP）在预防和控制虫害方面的应用。

具体的，滞育激素融合蛋白在制备杀虫组合物方面的应用。其中，TCDH-EGFP融合蛋白为杀虫组合物的活性成分，其有效添加量大于1×10^-4%。

所述的杀虫组合物的制备方法为：取TCDH-EGFP融合蛋白与常规辅料混匀即得。常规辅料如棉铃虫人工饲料等，棉铃虫人工饲料配方（500ml）：麦麸70g，大豆粉40g，干酵母10g，玉米油3ml，琼脂8g，山梨酸1g，抗坏血酸15g，溶剂为水。

本发明的有益效果：

本发明以分月扇舟蛾(Clostera anastomosis)滞育激素基因(Cloan-DH)编码序列为基础，设计改造合成遗传密码子得到优化的人工基因，以增强型绿色荧光蛋白EGFP为标签，人工合成TAT蛋白转导结构域，通过构建TAT-Cloan-DH（TCDH）融合基因，在大肠杆菌中表达融合蛋白，借助TAT的高效跨膜转导作用，通过害虫取食途径将外源DH作用于害虫，达到预防和控制虫害的目的。

本发明分析了TAT对保持DH生物活性的作用，为利用以DH为例的昆虫神经肽提供了理论依据和实践经验。本发明的意义主要表现在以下几个方面：在世界范围内，虫害每年造成的损失约占作物总产量的15%，损失数千亿美元。目前虫害的防治主要依赖化学农药，虽一时缓解了矛盾，但由此造成了环境污染、害虫抗药性和害虫再猖獗等生态问题。昆虫神经肽类激素调控影响昆虫的生长、发育和变态、昆虫的生殖、代谢行为和遗传信息的表达，以及性信息素的合成和释放等多种生理过程。由于神经肽类激素具有如此重要的生物功能，因此，通过干扰神经肽活动可以达到控制害虫的目的。本发明成功人工表达出有活性的昆虫滞育激素，昆虫通过自然取食行为将外源激素摄入体内，从而打破其内分泌系统平衡，导致虫体发育减慢，死亡率增加，对害虫具有控制作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中TCDH基因PCR扩增片段的电泳图；

图2为实施例1中EGFP基因PCR扩增片段的电泳图；

图3为实施例1中重组质粒pGEX-4T-TCDH的EcoRI、SalI双酶切片段电泳图；

图4为实施例2中重组质粒pGEX-4T-TCDH-EGFP的SalI、NotI双酶切片段电泳图；

图5为实施例3中TCDH-EGFP融合蛋白原核表达的SDS-PAGE电泳图；

图6为实施例3中TCDH-EGFP融合蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图；

图7为实施例4中棉铃虫幼虫取食TCDH-EGFP融合蛋白中肠体段切片荧光图；

图8为实施例5中棉铃虫幼虫死亡率统计图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

重组质粒pGEX-4T-TCDH的构建：

1、引物设计及PCR扩增

限制性核酸酶EcoRI、SalI、NotI，普通Taq酶、T4连接酶均为美国MBI Fermentas产品；质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒为上海生工产品；其他所用试剂分析纯均为BBI产品。

TCDH基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成（其中TAT与Cloan-DH的连接基于共价连接），连接保存于pUC57质粒中构成中间载体pUC57-TCDH（线性小片段TCDH基因由人工化学合成，小片段双链DNA没有制粒DNA稳定性高，由上述公司合成后连接保存于克隆载体中，pUC57为常用质粒载体），引物对A以pUC57-TCDH质粒为模板；引物对B扩增获取EGFP基因，以质粒pEGFP-NI为模板，pEGFP-NI购买自上海生工生物工程有限公司。

根据目的基因及载体(pGEX-4T)序列设计引物，并分别在上下游引物5’端引入EcoRI、SalI酶切位点，命名A上游引物及A下游引物。为后续添加EGFP标签，设计引物B上游引物及B下游引物，并引入SalI、NotI酶切位点，引物对A、B详见下表1。

表1 引物序列

两次扩增反应体系如下表2所示，在500μl PCR管中建立反应体系。

表2 扩增反应体系

TCDH基因PCR扩增反应条件为：94℃4min预变性后，94℃30s，60℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸7min。电泳结果如图1所示，电泳显示，在相应位置出现明显的条带，大小225bp，与目的片段大小一致，表明目的片段成功获得了扩增（图1中M为DNA Marker，1为TCDH基因的PCR扩增片段；电泳条件为：1%琼脂糖凝胶，150V，20min）。

EGFP基因PCR扩增反应条件为：94℃4min预变性后，94℃30s，62℃30s，72℃60s，共30个循环，最后72℃延伸7min。电泳结果如图2所示，电泳显示，在相应位置出现明显的条带，大小720bp，与目的片段大小一致，表明目的片段成功获得了扩增（图2中M为DNA Marker，1为EGFP基因的PCR扩增片段；电泳条件为：1%琼脂糖凝胶，150V，20min）。

PCR产物通过凝胶回收试剂盒进行纯化回收。

2、目的基因（TCDH）及pGEX-4T载体的双酶切

对PCR产物及载体pGEX-4T分别进行EcoRI、SalI双酶切，37℃、3h。在200μl离心管中建立如下表3所示的酶切反应体系。

表3 EcoRI、SalI双酶切反应体系

将双酶切获得的目的基因及pGEX-4T片段通过试剂盒（上海生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒）进行回收，以备连接之用。

3、连接转化

CaCl₂制备新鲜的TOP10大肠杆菌感受态细胞

（1）挑取一单菌落（直径2～3mm），转至50mL LB培养液中，37℃，240rpm振荡培养至OD值0.3～0.5；

（2）无菌条件下将细菌转移至50mL聚丙烯离心管中，冰上放10分钟；

（3）4℃，5000r/min离心10min；

（4）倒出上清，倒置离心管流尽培养液；

（5）用10mL冰预冷的0.1moL/L CaCL2重悬，放置冰上；

（6）4℃，5000r/min离心10min；

（7）倒出上清，倒置离心管流尽液体；

（8）每50mL初始培养物用2mL冰预冷的0.1moL/L CaCl₂重悬沉淀；

（9）用预冷的无菌吸头，把感受态细胞悬液100μL每份分装，4℃备用；

将获取的目的片段与载体连接，于500μL离心管中按下表4所示的反应体系加入试剂，22℃、3h后进行转化。

表4 目的片段TCDH与pGEX-4T载体连接反应体系

（1）转化采用42℃热激法进行，感受态菌株为TOP10。取5μl连接产物，冰上备用；

（2）取100μl感受态细胞加入上述溶液，冰浴30min；

（3）将离心管加入预热到42℃的水浴锅中热激90s，注意不要晃动；

（4）快速将离心管转移到冰上，使细胞冷却1～2min；

（5）在离心管中加入500μl LB培养基，37℃，150rpm振荡40min；

（6）取200μl菌液到含（Amp）的LB固体培养基上，涂抹均匀；

（7）将平板放入37℃培养箱，培养12-16h后检测。

4、重组质粒pGEX-4T-TCDH的鉴定

（1）将筛选的阳性克隆二次划板，挑取单菌落接入含Amp的LB培养基，37℃，300rpm摇菌8～12h，在超净台中取1ml待送公司测序，剩余的菌液提取质粒；

（2）将20ml菌液分装两个10ml离心管，4℃8000rpm离心5min收集菌体；

（3）倒掉上清，每管加入2ml预冷的STE，重悬菌体；

（4）10000rpm离心8min收集菌体；

（5）倒掉上清，每管加入1ml溶液Ⅰ悬浮菌体，加入1.5ml新配置的裂解液Ⅱ，盖上离心管，轻轻颠倒几次，彻底混匀，室温放置10min；（溶液Ⅰ、裂解液Ⅱ、溶液Ⅲ为质粒DNA小量提取试剂盒SK8161内试剂，购自上海生工生物工程有限公司）

（6）加入2ml冰浴冷的溶液Ⅲ，混匀，冰上放置10min；

（7）4℃，12000rpm离心15min，转移上清到一新的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀室温放置10min；

（8）室温10000rpm离心10min，回收核酸沉淀；

（9）弃去上清，加入2ml70%乙醇洗涤沉淀，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上除去残留的乙醇；

（10）加入0.5ml TE溶解沉淀，1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取情况。质粒采用EcoRI、SalI双酶切鉴定，酶切反应体系同上。电泳结果如图3所示，重组质粒经EcoRI、SalI双酶切后，电泳显示在相应位置出现条带，与预期大小（225bp）一致（图3中M为DNA Marker，1为重组质粒pGEX-4T-TCDH的EcoRI、SalI双酶切片段；电泳条件为：1%琼脂糖凝胶，150V，20min）。

实施例2

重组质粒pGEX-4T-TCDH-EGFP的构建：

1、目的基因（EGFP）及载体pGEX-4T-TCDH的双酶切

对PCR产物（EGFP）及载体pGEX-4T-TCDH分别进行SalI、NotI双酶切，37℃、3h。在200μl离心管中建立如下表5所示的酶切反应体系。

表5 SalI、NotI双酶切反应体系

将双酶切获得的目的基因及pGEX-4T-TCDH片段通过PCR产物回收试剂盒进行回收，以备连接之用。

2、连接转化

将获取的目的片段与载体连接，于500μL离心管中按下表6所示的反应体系加入试剂，22℃、3h后进行转化。

表6 目的片段EGFP与pGEX-4T-TCDH载体连接反应体系

22℃、3h后进行转化，转化采用42℃热激法进行（同上），感受态菌株为TOP10（同上）。

3、重组质粒pGEX-4T-TCDH-EGFP的鉴定

挑取转化后平板上的单菌落于试管中37℃、220rpm/min培养过夜，抽提质粒，采用SalI、NotI双酶切鉴定，酶切反应体系同上，并将重组质粒进行测序鉴定。电泳结果如图4所示，重组质粒经SalI、NotI双酶切后，电泳显示在相应位置出现条带，与预期大小（720bp）一致（图4中M为DNA Marker，1为重组质粒pGEX-4T-TCDH-EGFP的SalI、NotI双酶切片段；电泳条件为：1%琼脂糖凝胶，150V，20min）。对酶切鉴定正确的重组质粒进行送样测序，测序结果经比对后与原始序列一致，表明成功构建了重组质粒。

实施例3

TCDH-EGFP融合蛋白的原核表达：

1、转化

Rosetta（DE3）感受态细胞制作方法同上（CaCl₂制备新鲜的TOP10大肠杆菌感受态细胞），转化方法同上（TOP10大肠杆菌感受态细胞转化步骤）。

将鉴定正确的重组质粒转化表达菌株Rosetta（DE3），获得单菌落平板。

2、培养

（1）挑取单菌落于试管中（5mL LB培养基，50ug/mL氨苄青霉素，35ug/mL氯霉素）37℃，220rpm/min过夜培养；

（2）将培养的菌液按1:100比例接种于200ml LB培养基中，添加50ug/mL氨苄青霉素，35ug/mL氯霉素，37℃，180rpm/min扩大培养；

（3）当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.6mM的IPTG，30℃，100rpm/min诱导3.5h，收取样品；

（4）收集菌体并用PBS缓冲液悬浮。

采取各组份样品，进行SDS-PAGE分析，电泳显示在相应位置（61kD）出现明显的新生条带，表明融合蛋白TCDH-EGFP成功得到了表达（见图5，图中M为蛋白Marker，1为诱导后样品，2为诱导前样品；电泳条件为：10%SDS-PAGE，150V）。

3、超声波破碎菌体

（1）冰浴中超声破碎菌体，功率200W，每200mL培养基进行99次循环（超声3S，暂停3S为一个循环）；

（2）超声完毕，12000rpm/min，4℃，离心30min，收集上清和沉淀。

4、融合蛋白的纯化

（1）收集沉淀，5ml洗涤液(2M urea)重悬沉淀，将沉淀转移到10ml离心管中，冰浴中200W超声波1分钟，向管内再补加5ml洗涤液(2M urea)4℃孵育30分钟；

（2）离心（4000rpm/min，4℃20分钟），弃上清；

（3）5ml洗涤液(0.1%TritonX-100)重悬沉淀，冰浴中200W超声破碎1分钟，再加入5ml洗涤液(0.1%TritonX-100)，4℃孵育20分钟；

（4）离心（4000rpm/min，4℃20分钟），弃上清；

（5）5ml洗涤液(0.1%TritonX-100)重悬沉淀，再加入5ml洗涤液(0.1%TritonX-100)，冰浴中200W超声破碎1分钟，再加入5ml洗涤液(0.1%Triton)，4℃孵育15分钟；

（6）离心（6000rpm/min，4℃20分钟），弃上清，加入5ml包涵体溶解液（8M尿素）室温震荡3h，12000rpm/min，4℃，离心30min，取上清置于透析袋中，在PBS缓冲液（pH=8.0）中缓慢透析12h，收集透析后的样品，SDS-PAGE分析并保存备用。

融合蛋白经多次洗涤后进行SDS-PAGE电泳分析，在相应位置（61kD）出现明显条带，表明融合蛋白TCDH-EGFP成功得到了纯化（见图6，图中M为蛋白Marker，1为纯化后的TCDH-EGFP融合蛋白；电泳条件为：10%SDS-PAGE，150V）。

实施例4

融合蛋白穿透棉铃虫中肠细胞荧光观察：

1、供试昆虫

洛阳棉铃虫室内种群：采自洛阳市郊区，室内用棉铃虫人工饲料饲养8代，期间从未施用过任何杀虫剂。

2、昆虫饲料

实验时配制新鲜棉铃虫人工饲料，人工饲料配方（500ml）：首先将琼脂8g煮沸融化，温度低于90℃后依次加入无菌麦麸70g，干酵母10g，玉米油3ml，琼脂，山梨酸1g，抗坏血酸15g，边加入边搅拌均匀。

3、添加TCDH-EGFP融合蛋白的饲料

待人工饲料温度50℃时，加入融合蛋白搅拌均匀，融合蛋白在饲料中含量为2.5mg/L。

取3龄初棉铃虫幼虫，饲喂添加TCDH-EGFP融合蛋白的饲料，幼虫取食后4h、8h、12h、24h、48h、72h和90h分别取虫体进行冰冻切片，分析中肠体段的荧光变化。

4、试验结果

棉铃虫取食TCDH-EGFP融合蛋白后，不同取食时间的虫体在中肠体段进行冰冻切片，分析比较体段切片荧光的变化，如图7所示，发现伴随取食时间的增加，荧光强度逐渐增强，荧光不但在肠壁细胞上呈现亮度增加，肠壁外围的肌肉组织、血淋巴、神经组织和体壁荧光均呈现同样趋势的增加，在取食24h后荧光亮度已经达到峰值，随着取食时间的进一步增加，荧光强度基本一致。结果表明TCDH-EGFP融合蛋白能够成功通过肠壁细胞扩散到达虫体其他部位。图7中1为取食0h，2为取食4h，3为取食8h，4为取食12h，5为取食24h，6为取食48h，7为取食72h，8为取食90h。

实施例5

融合蛋白对棉铃虫的毒力测定：

1、昆虫饲料

实验时配制新鲜棉铃虫人工饲料，人工饲料配方（500ml）：首先将琼脂8g煮沸融化，温度低于90℃后依次加入无菌麦麸70g，干酵母10g，玉米油3ml，琼脂，山梨酸1g，抗坏血酸15g，边加入边搅拌均匀。

2、试验分组

待人工饲料温度50℃时，加入TCDH-EGFP融合蛋白搅拌均匀作为试验组，融合蛋白在饲料中含量为5pg/L，以清水为对照组进行实验。

3、试验方法

饲料切成1cm³方块，放入2.5×10cm平底试管中(棉塞封口)，并接入正常的棉铃虫初孵化1龄幼虫，接虫300头，每管1头，置于培养箱中。

处理后试虫的饲养条件：温度27±1℃，相对湿度65～70%，光照比(L：D)16：8h。检查结果，以小毛笔或尖锐镊子轻触虫体，不能协调运动认为死亡，每隔3天更换一次饲料，饲养至化蛹。

4、数据统计

试验数据采用DPS软件进行方差分析。

5、试验结果

统计棉铃虫幼虫取食融合蛋白后的生长发育过程，结果表明，棉铃虫幼虫取食TCDH-EGFP融合蛋白对其生长产生了明显的抑制致死作用，校正死亡率达到为51.7%（见图8），幼虫发育历期为21.7±3.2d，比对照组平均延长了2.5d（见表7）。

由于绿色荧光蛋白对生物细胞和生物体（细菌、植物、动物）没有任何毒性，而TCDH-EGFP融合蛋白能够成功借助消化道细胞转导至虫体其他部位，可以确定棉铃虫致死由TCDH成功转导引起。

表7 化蛹幼虫历期比较

Claims (10)

1.一种滞育激素融合基因，其特征在于：其含有TCDH融合基因，TCDH融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的滞育激素融合基因，其特征在于：还包含EGFP基因，EGFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述的滞育激素融合基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

4.一种滞育激素融合蛋白，其特征在于：其含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

5.一种如权利要求4所述的滞育激素融合蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）扩增TCDH融合基因并连接到pGEX-4T载体中构建pGEX-4T-TCDH载体；

（2）扩增EGFP基因并连接到pGEX-4T-TCDH载体中构建pGEX-4T-TCDH-EGFP载体；

（3）将pGEX-4T-TCDH-EGFP载体转化大肠杆菌，诱导表达即得滞育激素融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的滞育激素融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中扩增TCDH融合基因采用的引物对A为：

A上游引物：5’-CGGAATTCATGTACGGCCGCAAGAAGAGG-3’，

A下游引物：5’-ACGCGTCGACGTCGACATTGTCTTCACTG-3’。

7.根据权利要求5所述的滞育激素融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中扩增EGFP基因采用的引物对B为：

B上游引物：5’-ACGCGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’，

B下游引物：5’-AATGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’。

8.一种如权利要求1-3任一项所述的滞育激素融合基因在预防和控制虫害方面的应用。

9.一种如权利要求4所述的滞育激素融合蛋白在预防和控制虫害方面的应用。

10.根据权利要求9所述的滞育激素融合蛋白在预防和控制虫害方面的应用，其特征在于：滞育激素融合蛋白在制备杀虫组合物方面的应用，其中，滞育激素融合蛋白为杀虫组合物的活性成分，其有效添加量大于1×10^-4%。