JPH03502691A - 接合体ワクチンの担体分子としてのｔ細胞のエピトープ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

接合体ワクチンの担体分子としてのＴ細胞のエピトープこの出願は、１９８８年 ２月１日提出の米国特許出願第０７／１５０゜本発明は、担体分子に接合した、 抗原、抗原決定基またはハプテンからなるワクチン組成物に関する。さらに詳し くは、配合物は、バクテリアの産生物のＴ細胞のエピトープ接合した、抗原、抗 原決定基またはハプテンからなる。本発明の組成物は使用する免疫系に対する保 護の抗体の産生を効果的に誘発することができると同時に、より大きいタンパク 質担体分子の使用を回避する。 ２・茜里Ω貢章 を椎動物において所定の感染因子に対する保護の免疫応答の生成は、宿主の免疫 系に対する適当な刺激の提供に最初に依存する。感染性有機体それ自体は、典型 的には、その細胞膜組成物のまさに性質によりか、多数の免疫刺激化合物まｔ； は抗原を提供する。これらの物質は、通常より大きい分子、例えば、リボ多糖ま たは糖タンパク賞は、免疫系により外米物質として認識され、そして侵略する有 機体を除去または不能にする努力において宿主から１または２以上の異なる型の 反応を引き出す。 抗原は細胞仲介免疫性を提供する、増感されたリンパ球（Ｔ細胞）を刺激するこ とができる。あるいは、抗原は、また、Ｂ−リンパ球を刺激して、遊離の抗体を 合成しそしてそれを血液または他の体液の中に分泌させる（体液の免疫性）こと ができ、モしてＢ−リンパ球とともに作用することができる。体の保護の免疫応 答の発生は、これらの系の一方または双方の刺激の限界レベル、すなわち、活性 化Ｔ細胞からの共同によりＢ細胞の活性化を達成することに依存する（下を参照 ）。感染ｄこ対する一次的免疫性は、しばしば、同一またはＤＮＡ断片種の他の 個体から個々の予備形成された抗体を与えることによって提供されうる；これは 受動免疫性として知られている。このような免疫性の１例は、母由来の抗体胎盤 の転移ならびに乳を経る転移により、胎児または新生児へ与えられたｆｉ＃護で ある。他の例はプールされた大人のガンマグロブリンであり、これははしか、ニ ワトリのはしか、肝炎、ｆｆｌ［および破傷風の作用を防止または変更するため に使用できる。これらの獲得した抗体は、究極的に、抗体との相互作用により特 性決定することができるか、あるいは体により物質代謝されることができ、こう して保護は究極的に失われる。 保護のより永久の形態は、ワクチン接種による活性免疫化により与えられ、この ワクチン接種はＢ−リンパ球またはＴ−リンパ球の活性化により宿主自身の免疫 系を刺激して保護の抗体を産生させる。藺単に述べると、ワクチン接種は、無害 またはビルレントの形態の抗原、例えば、殺したまたは遺伝子的に変更したバク テリア、微生物の細胞壁または莢膜から分離した多糖または糖タンパク質を、免 疫系に対する一次刺激として、使用することによって、活性の保護の免疫性を与 える。これは、ピークとなりそして低下する抗体の保護においてむしろ遅い応答 を誘発する。しかしながら、体は抗原の存在に対して変更されており、そして次 の暴露は、多分生きている、ビルレント有機体、第２応答で起こり、二次の応答 は、非常により急速な豊富な抗体の産生をもって、観測される。 この二次応答は、典型的には、微生物がフルーブラウン（ｆｕｌｌ−ｂ　Ｉ　ｏ ｗｎ）感染を引き起こすのを予防するために十分であろう。 ２．１．１．Ｂ細胞の活性化の機構 抗原が体に入るとき、その少なくともある部分は食作用のマクロファージにより 接種されそして消化されることができる：しかしながら、他の樹木状マクロファ ージ（抗原を提示する細胞またはＡＰＣ）はは、リンパ球の提示および活性化の 目的で抗原をそれらの表面膜の中に組み込む。カタル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌ ｌａ　　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の発育において早期に、各細胞は特定の抗原 の結合の特異性と同時に発育し、そしてその細胞表面上の抗原に対して特異性を もつ抗体を産生する。抗原特異的Ｂ細胞への抗原の第１の提示は、通常１ｇＭが 支配する、抗原のゆっくり起こる合成を生ずる。これは−次応答であり、これは 典型的にはワクチン接種により刺激される応答の型である；それは抗体の産生に ついて高度に特殊化される血漿細胞にＢ−リンパ球を成熟させる。 一般に抗原を有する生きている微生物による対抗の形態で、同一抗原に第２回目 に直面すると、この系は抗原を認識することを学習しおり、そしてＩｇＧが支配 する、非常により急速なより大きい応答（二次応答）が起こる。この「学習（ｌ ｅａｒｎｉｎｇ）Ｊは、抗原への第１暴露後に循環し続ける、長く生きるメモリ ー細胞に基づく：それらのメモリーＢ細胞はそれらの表面上に免疫グロブリンを 有し、これらは免疫グロブリンは再侵攻性抗原、急速に産生ずる新しい抗体と強 く結合し、そして、最良の環境において、感染因子が病気を引き起こすのを防止 する。 ２．１．２．Ｂ細胞およびＴ細胞の共同前の説明は、非常に一般的方法で、Ｂ細 胞の刺激および抗体の産生についての機構を表す。しかしながら、最近、Ｂ細胞 は保護の応答の発生において完全に独立に機能しない。Ｔ細胞それら自体は抗体 を分泌しないが、Ｔ細胞の１つの型、すなわち、ヘルパーＴ細胞は、しばしば、 Ｂ細胞の刺激の促進に必要である。なぜなら、ある抗原と表面結合した抗体との 間の相互作用は単独では、可溶性抗体のＢ細胞の増殖および分泌を刺激するため に不十分であるからである。ヘルパーＴ細胞は、また、抗原を提示するマクロフ ァージの表面上の抗原と相互作用しかつそれを認識し、そして抗原の認識を発生 する。次いで、Ｔ細胞はマクロ７アージの表面上の抗原を認識し、そして反応す るＢ細胞の活性化および分化を仲介する。可溶性因子の分泌を通して、Ｂ細胞の 増殖因子はそれらの表面のレセプターとの相互作用により増加し、成熟因子は増 殖を停止し、そして抗体分泌性血漿細胞への分化を刺激する。 抗原のある種の特定の型は、Ｔ細胞からの適当な応答を誘発することにおいて、 Ｔ細胞の助けを約束しなくてはならない。一般に、決定基が分子当たり１同視れ る抗原、例えば、非対称タンパク質は、Ｔ細胞の相互作用に高度に依存し、モし てＴ細胞により認識されるべき分子上のその他の決定基またはＴ細胞のエピトー プに頼らなくてはならない。次いで、Ｔ細胞はＢ細胞へのアクセサリ−シグナル を送り、そしてこのシグナルはＢ細胞の抗原の刺激をより効果的にすることを促 進する。 ２．２．担体の作用 分子のある種の型、例えば、小さいペプチドまたはハプテンは、固有に免疫原性 まｔ；は弱く免疫原性であり、いかなる環境下にも抗原の応答を生成することが できない、他の分子、例えば、ある種のバクテリアの莢膜多糖（ＣＰ）は、大人 において高度に免疫原性であることができるが、発生が劣った乳児の免疫系にお いて、適切な保護の応答を生成することができない。 弱く免疫原性の分子、例えば、小さいペプチド、ハプテン、ＣＰなどで免疫応答 を誘発するとき直面する問題を排除するために、それらを「担体」分子に結合す ることによって、それらの免疫原性を増大する試みがなされた。これらの担体は 最も普通に大きい免疫原タンパク質である；これらの接合体の意図する作用は、 天然に産出する分子で起こるＴ細胞が共同する作用をまねることである。換言す ると、担体に共有結合した多糖は、担体上の決定基の存在へのＴ細胞の応答によ る抗体の産生へのＴ細胞の参加を誘発であろう。次いで、Ｔ細胞およびＢ細胞の 相互作用は、大きい免疫原性タンパク質に関して上に概説したように、観察され る通常の方法で進行するであろう、Ｔ細胞を担体の決定基とかみ合わせることに よって、Ｂ細胞は担体それ自体に対するばかりでなく、かつまた結合した多糖分 子に対する抗体の産生を開始するであろう。小さいか、あるいは劣った免疫原性 分子の免疫原性を増加するためのこのアプローチは、数十年の間首尾よく利用さ れてきており［参照、例えば、ゲーベル（Ｇｏｅｂｅｌ）　　ｅｔ　　ａｌ、、 ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、） 　、６９　：　５３．１９３９］、そして多数のワクチン組成物が記載されてき ており、ここで精製された莢膜のポリマーは担体タンパク質に、この「担体の作 用」を利用することによって、接合されてより効果的なワクチン組成物を生成し ている。　例えば、シュネーソン（Ｓｈｎｅｅｒｓｏｎ）ｅｔ　　ａｌ。 菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉ　ｌｕｓ　　ｉｎｆ　１ｕｅｎｚａｅ）ｂのポリマーを記 載しており、このポリマーはその微生物により引き起こされる侵攻性病気に対す る免疫性を与える。接合体の意図は、乳児における莢膜のポリ！−の年令に関係 する免疫学的挙動を克服するこ七であった。ポリマーはある数の異なるタンパク 質、例えば、血清アルブミン、リムルス・ボリフェムス（Ｌｉｍｕｌｕｓｐｏｌ ｙｐｈｅｍｕｓ）のヘモシアニン、おりジフテリアの機素に結合因子、例えば、 アジピン酸ジヒドラジドにより接合された。 ＰＲＰ（ポリリボシルリヒトルホスフエート、インフルエンザ薗（Ｈｏｉｎｆ　 １ｕｅｎｚａｅ）ｂの莢膜のポリマー］は、多糖単独にに基づくワクチンにより 有効であることが示された［チュー（Ｃｈｕ）　　ｅｔ遊離の多糖で免疫化した とき、乳児において通常観測末端劣った抗体の応答をバイパスすることが示され た

【アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ｅｔ　　ａｌｏ、ジャーナル・オブ・ペ リアドリクス（Ｊ、Ｐｅｄｒｉ土土工、１．１６５，３４６．１９８５；インセ ル（Ｉｎｓｅｌ）ゲイアー（Ｇｅｙｅｒ）　　ｅｔ　　ａｌ、［メディカル・マ イクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（Ｍｅｄ、Ｍｉｃ　ｒｏｂ　ｉｏ　 １．１ｍｍｕｎｏ　１．）、上６５　：　ｌ　７１−２８８．１９７９）は、ニ トロフェニルエチルアミンのりンカーへ結合した、ある種の肺炎杆菌（Ｋ　ｌｅ 　ｂｓｉｅｌｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の莢膜多糖の断片を、還元性アミ ノ化により調製し、次いで誘導化された糖をタンパク質にアゾカップリングによ り取り付けた。 ２．２．１．担体タンパク質 担体の原理の使用が莢膜のポリマーを含有するワクチンを改良する有効な方法を 構成することは、広く受は入れられている。しかしながら、これらのタンパク質 接合体は、とくにヒトの使用について、欠点をもたないわけではない。例えば、 ヒトの投与のための潜在的な担体としての使用に正しく許容されるタンパク質の 数は比較的制限される。現在入手可能な２つの主なタンパク質は、破傷風のトキ ソイドおよびジフテリアのトキソイドである。他の価値ある担体タンパク質はＣ ＲＭ＋ｓｙであり、これは自然のジフテリアの毒素からの単一のアミノ酸の交換 を有するタンパク質であるが、固有に無毒であり、そして自然タンパク質に実質 的に同一の免疫原性を保持する。多数の考察は、また、これらは既知の担体タン パク質の日常の使用に影響を与える。例えば、制限された数の入手可能なタンパ ク質は、多数のワクチン生成物がこれらはタンパク質の１つに基づくであろうこ とを意味する：この限定された数の担体と接合した物質を使用する複数のワクチ ン接種は、これらのタンパク質に対する望ましくない反応が反復した免疫化後に 起こりうる可能性を増加する。 前に存在する抗体の存在は、また、悪い局所的または全身の免疫学的感受性の反 応を誘発しうる。さらに、また、接合体中に含有されるタンパク質が正常の宿主 の組織を交差反応し、これにより自己免疫型の現象の現象を発生するという可能 性が存在する。エピトープの抑制の現象は、接合体のワクチンの使用で起こるこ とがある。簡潔的には、この現象は、最初にキーホールリンベットのヘモシアニ ン（ｋｅｙｈｏｌｅ　　ｌｉｍｐｅｔ　　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）の接合体につ いてハーゼンバーブ（Ｈより記載され、そしてデータが破傷風のトキソイドの接 合体についてジ１（Ｓｃｈｕｌｔｅ）ら［ジャーナル・オプ・イムノロジー（Ｊ 、ＩｍｍｕｎＯｌ）、上３５：２３１９．１９８５］により報告されたが、接合 体中に含有末端タンパク質に対する免疫性がワクチン中に既に存在したとき、観 測され、そして共有結合でカップリングした多糖に対する応答の発生を妨害する 。まだヒトにおいて報告されていないが、この抑制（起こる場合）は接合体のワ クチンの開発における重大な関連性を潜在的に有しうる。 最後に、タンパク質は生物学的プロセスの産生物であるので、いくつかの固有の 困難が存在する。第１に、生物学的産生物として、避は得られないロフト毎の変 動が存在するであろう；この変動はタンパク質のＴ細胞依存性特性またはその全 体の抗原性を潜在的に変更することがある。 こうして、産生のより厳格な監視が要求され、これ関連してコストは増加する。 第２に、生物学的産生物の調製および精製に含まれるコストは明らかに増加する 。 明らかなように、これらのワクチンの使用のとき付随する免疫学的困難を回避し 、しかも既知の有効なワクチンと同一の免疫原性を実質的に保持する、現在入手 可能な接合体ワクチンの代替物が必要である。われわれは、今回、抗原、抗原決 定基またはハプテンをバクテリアの産生物のＴ細胞のエピトープと接合すること によって、このようなワクチンを得ることができることを示した。 ２．３．７細胞の決定基 現在、Ｔ細胞がタンパク質をどのようにして認識するか、あるいはＴ細胞が免疫 原性決定基として何を認識するかはまだ明らかでない。 数年間、タンパク質の抗原性抗体結合決定基が２つの明確な構造を示すことが一 般に認められた。タンパク質の決定基は、ペプチド結合により直接結合されたア ミノ酸を含有する一次配列の短いセグメントとして存在することができる。この ような決定基は、「順次の（３ｅｑｕｅｎｔｉａｌ）」または「連続の」決定基 と名付けられた。あるいは、決定基はアミノ酸から構成され、それらのアミノ酸 は一次配列において離れているが、二次フォルディングのために空間的に、密に 近接している。 この構成を示す決定基は、「トポグラフィ−的」と、あるいはそれほど不明瞭で はないが「不連続の」決定基と呼ばれてきた。さらに、抗体はコンフォメーショ ン的に依存性でありかつ５〜７アミノ酸残基の最小長さを有するタンパク質の接 近可能な表面を認識することが一般に受は入れられている。 タンパク質のＴ細胞の認識は、抗体の結合より複雑なプロセスであり、結局それ ほど明瞭に理解されていない。Ｔ細胞は一般に認識する連続の決定基として見な されて来ている。多年以前に、Ｔ細胞は自然および変性した両者の形態のタンパ ク質を認識することができるが、抗体はそれをすることができないことが立証さ れた［マイゼルス（Ｍａ　ｉ　ｚｅ　ｌ　ｓ）Ｊ、ＩｍｍｕｎＯｌ、）、ｊ　Ｏ ：　５０９．１９８０］、この発見は、Ｔ細胞による順次の決定基の独占的な認 識を示しそしてタンパク質のＴｍ胞およびＢ細胞の認識の間の二分を実証するも のとして解釈された［マイゼルス（Ｍａｉｚｅｌｓ）　　ｅｔ　　ａｌ−５ｓｕ ｐｒａ］ｏ　しかしながら、解決されていないが、Ｔ細胞およびＢ細胞は基本的 に異なる構造を認識するという考えがなお存続している［ベンジャミン（Ｂｓｎ ｊａｍｉｎ）　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、２：６ ７．１９８４］。 Ｔ細胞により決定基として何が認識されるということについての論争は、Ｔ細胞 がタンパク質を知覚する方法に及んだ。免疫系が遺伝子的に制限された方法でタ ンパク質を認識すること、およびＴｍ胞が抗原を提示する細胞の表面上のＩａ分 子に関してタンパク質を知覚することは非常によく確立されている。ＡＰＣはま ずタンパク質に直面し、それを内部化し、そしてタンパク質をより小さい断片に 消化することが示唆された。次いで、もとのタンパク質の小さい断片は、それが Ｔ細胞により認識されうる、ＡＰＣの表面上のＩａに関して発現される。したが って、Ｔｍ胞は「処理された」ペプチド断片のみを見るであろう。 Ｔ細胞は何を知覚するかまだ明らかではないが、種々のモデルを使用するいくつ かのグループの間で、７〜１７アミノ酸残基の領域が認識に必要であることは一 致している。１９７２程度に早い時期ｔ：、、７残基のポリーＬ−リジンポリマ ーはモルモットにおいて遅延された型の過敏症を誘発することが実証された［シ ュロスマン（Ｓｃｈｏ　Ｉ　ｓ　ｓｍａｎ）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、Ｒｅｖ、 、１０：９７．１９７２］、フイブリノペズチド、インフルエンザ赤血球凝集、 チトクロム、リゾチーム、オバルブミンおよびミオグロブリンを包含する種々の 自然タンパク質は、７〜１７アミノ酸残基のＴ細胞の刺激について最小ペプチド 大きさを示した。既知の特異性のＴ細胞のクローンを使用して、１０〜１４３！ ！基の大きさはＴ細胞の応答に要求されることが発見された［アタシ（Ａｔａい ペプチド大きさは、抗体の結合に要求される５〜７残基に比較して、１ｍ分子に 関して決定基の発現に要求される追加の残基を反映する。 事実、Ｉａおよび合成ペプチドの相互作用はいくつかのモデルにおいて実証され た。ｒａの結合に含まれる領域のアグレトープ（ａｇｒｅｔんだ平らな膜は、合 成ペプチドをＴ細胞に提示するために使用された［ワッツ（Ｗａｔｔｓ）　　ｅ ｔ　　ａｌ、、ＰＮＡＳ％　８土：　７５６４　：１９８４］。より最近の研究 はＩａ分子への合成ペプチドの直接の結合て遺伝子的に制限された方法で提示さ れた［ブロイレット（Ｇｒｏｉｌｌｅｔ）　　ｅｔ　　ａｌ、、サイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ　　、２３５：８６５．１９８７］、大きくこれらの研究のために 、Ｔ細胞のエピトープはＴ細胞のレセプターと相互作用する親水性領域およびＩ ａ分子に結合する疎水性アグレトープから成るであろうことが推定された。さら に、連続の決定基を表すこれらの断片は、もとのタンパク質のタンパク質分解処 理により発生するであろう。 抗体の結合またはＴ細胞の決定基の位置を予測する試みにおいて、いくつかの異 なるアプローチが使用されてきている。数年前、ホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッ ズ（Ｗｏｏｄｓ）［ＰＮＡＳ、乙８　：　３８２４　；欧州特許出願第００５６ ２４９号；南アフリカ特許第８２３９５２号］は、数の親木性／疎水性指数をア ミノ酸の各々に割り当て、そしてこの指数に関していくつかのタンパク質の一次 配列を検査した。彼らの分析に従い、検査したタンパク質の既知の抗体結合部位 を親水性領域に相関関係づけた。同様なアプローチは、カイト（Ｋｙｔｅ）およ びドーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ オロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ−）、上旦ヱ：１０５−１３２．１９８２］に よりわずかに異なる誘導の数の指数を使用して適応された。 より最近、抗体結合の領域をもつ高い柔軟性またはセグメントの移動度を有する タンパク質の領域を相関関係づける試みがなされた【タイナ−（Ｔａｉｎｓｒ） 　　ｅｔ　　ａｌ−、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３上５　：　３２７．１９ ８５；　　ａｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、３：５０１％ １９８５；ウェストラフ（Ｗｅｓｔｈｏｆｆ）ｅｔ　　ａｌ、、ネイチ＋−（Ｎ ａｔｕｒｅ）、３上土：１２３．１９８４１、このアプローチにおいて、Ｘ線ま たはニュートロンから誘導されたデータは、原子温度ファクターとして表された 残基の相対的コン７オメーシ薦ンの変動の推定を提供する。原子温度ファクタ一 対残基の数のグラフは、所定のタンパク質についてポリペプチド鎖に沿った相対 的移動度を示す。高い移動度の領域は既知の抗体結合部位相関関係づけられるを 考えられた［タイナー（Ｔａｉｎｅｒ）ｅｔ　　ａｔ、、５ｕｐｒａ］＊Ｔ細胞 の決定基は、あるグループにより、両親媒性の構造を示すとして見られた、すな わち、決定基はＴ細胞レセプターに結合するセイヨウワサビペルオキシダーゼ領 域およびまた１８分子に結合する疎水性領域から構成されと考えられる。リゾチ ームの１６残基のＴ細胞の決定基は、短い、連続する系列の親木性残基から構成 されることが発見された［アレン（ＡＩｌｅｎ）　　ｅｔ　　ａｌ、、ＰＮＡＳ 、８土２４８９．１９８４］。しかしながら、他の者はＴ細胞の決定基が安定な らせんの構造を形成する傾向を有することを示唆し、ここで親木性残基はらせん の１つの表面上で整列し、一方線水性領域は反対の表面上で整列している［デリ シ（ＤｅＬｉｓｉ）およびベロシフスキー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）、する傾向を もつ領域について、所定のタンパク質の配列をサーチするアルゴリズムは開発さ れ［デリシ（ＤｅＬｉｓｉ）およびベロシフスキー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）、５ ｕｐｒａｌそしていくつかのモデルに適用された。対照的に、ある研究者らは、 Ｔ細胞の決定基はタンパク質的のベータの回転に関連することを支持する［カッ ツ（ｋａｔｚ）　　ｅｔａｌ、、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ）、１３５：１３８６．１９８５］。どの因子がＴ細胞の決定基の予測 に重要であるという明瞭な映像をなお出現すべきである。 いくつかのグループは、合成ワクチンの一部分としてＴ細胞の決定基を包含する 重要性を認識した。ミルチ（Ｍｉｌｃｈ）　　ｅｔ　　ａｌ、［米国特許第４． ５９９，２３０号および米国特許第４．５９９，２３１号］は、Ｂ型肝炎ウィル スの表面抗原のＴ細胞およびＢ細胞の決定基から構成されペプチドのワクチンを 合成した。同様に、サーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ）のタンパク質のＴ細胞のエピトープから構成されたマラリアのワクチンを、こ のタンパク質のＢ細胞のには、Ｔヘルパーの決定基は、デリシ（ＤｅＬｉｓｉ） およびベロシアスキー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）、１見し工土のアルゴリズムによ り予測された。これらの報告の両者は、同一のタンパク質的からのＴ細胞および Ｂ細胞の決定基を使用してワクチンを構成した。対照的に、レクレルク（Ｌｅｃ ｌｅｒｃ）　　ｅｔ　　ａｌ、（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジ ー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、上ヱ：２６９．１９８７］は、その配列 内にＴ細胞およびＢ細胞の決定基を含有する、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ ｃｃｕｓ）のペプチドの共重合によりワクチンを構成し、ここでウィルスのペプ チドはＢ型肝炎ウィルスからのＢ細胞の決定基を表す。Ｔ細胞の決定基、これは この場合において自然ペプチドに実質的に相当する、は、ウィルスのペプチドに 免疫性を与え、これにより担体分子として機能した。 ３、及盟Ω！致 本発明は、バクテリアの産生物の新規な分離したまたは合成のＴ細胞のエピトー プを提供する；このようなエピトープは、担体タンパク質を利用して抗体の産生 を増強する従来知られているワクチンにそれらの実用性が類似する、ワクチン組 成物の調製において有用である。これらのエピトープには、バクテリアの毒素、 詳しくはジフテリアの毒素または交差反応性物質（ＣＲＭ）および破傷風の毒素 から分離したものがある。 ここで、および請求の範囲において使用するとき、本発明のＴ細胞のエピトープ はＴ細胞のエピトープそれ自体を呼ぶ。 Ｔ細胞のエピトープは無関係のＢ細胞の決定基と組み合わせて使用して、Ｔ＃胞 のエピトープに対する抗体を産生じないで、Ｂ細胞の決定基に対する抗体を有意 な量で産生ずることができる。今回、驚くべきことには、このような組み合わせ は、現在普通に使用されているＢ細胞の決定基−担体タンパク質の組み合わせと 実質的に同程度に有効なレベルで抗体を産生ずることができることが発見されｔ ；。こうして、このような組み合わせの入手可能性および実証された実用性は、 担体−タンパク質に基づくワクチンの使用に関連させうる、潜在的に望ましくな い免疫学的結果を回避することができる。さらに、ＴＩＩａＩ胞のエピトープそ れ自体の使用は、そのエピトープを含有するより大きいペプチドと反対に、それ が容易に合成されことにおいて経済的利点ならびに全タンパク質の使用を回避す ることにおける安全性の利点を提供する。 本発明は、また、抗原、抗原決定基まｔ；はハプテンに接合した、分離しにまた は合成のＴ細胞のエピトープからなる、新規な接合体を提供する。ワクチン組成 物中の２つの要素の接合は、抗原に対するより効率よいレベルの抗原の応答を可 能とする。これらのワクチンは任意の型の抗原に対する抗体の産主において有用 であり、この抗原は病原性有機体（バクテリア、ウィルス、寄生体）に関する抗 原ばかりでなく、かつまたアレルゲン、および癌に関係する抗原などを包含する 。しかしながら、接合体は、はんの弱く免疫原性である抗原、すなわち、伝統的 に担体のタンパク質に接合して満足すべきレベルの抗体の産生を達成しなくては ならなかった抗原、を利用するワクチン組成物の配合においてとくに有用である 。 これらの接合体の入手可能性は、また、バクテリアの産生物のＴ細胞のエピトー プに接合体した問題の抗原の免疫原的に有効量を、温血動物に投与することから なる、温血動物において免疫応答を刺激する方法を提供する。この方法は、伝統 的な意味における保護の免疫性、すなわち、特定の微生物の病原体に対する接種 を包含するが、また、抗体の産生を望む、任意の他のタイプの処置を包含するこ とを意図し、例えば、本発明の方法は腫瘍特異的または腫瘍に関連する抗原に対 する抗体の刺激において、あるいは普通のアレルゲンに対する抗体の産生におい て使用することができる。この方法は、また、治療および予防の両者において使 用することができる。 ４、図面の説明 第１図は、標準の単一の文字のコードにおいてＣＲＭの一次配列を示す。両親媒 性のらせん構造を形成する傾向を有する領域は数字ｌにより表示し、そして潜在 的Ｔ細胞のエピトープの活性を有する配列は下線を付されている。 第２図は、ペプチド６のＨＰＬＣ分析を示す。Ａ、粗製ペプチド６のクロマトグ ラム。Ｂ、ペプチド６（上から得られたプールした分画）の再クロマトグラム。 合成ペプチドはこのテキストに記載されているように溶離した。 第３図は、合成ペプチド６のＰＴＨ誘導体の選択したクロマトグラムを示す。ペ プチドはこのテキストに記載されているように配列決定した。 数はエドマン（Ｅｄｍａｎ）サイクルを示す。ビークａおよびｂは、内部のマー カーとして働き、それぞれ、Ｎ、Ｎ’　−ジメチル−Ｎ′−７エニルチオ尿素お よびＮ、Ｎ″　−ジフェニルチオ深索を表す。サイクル２はチロシンの存在を示 す；サイクル５はバリン；サイクル９、インロイシン；サイクル１７、アスパラ ギン；サイクル２２、プロリン、そしてサイクル２８、グリシン。 第４図は、ＰＲＰに対するモノクローナル抗体で検出された、選択しＩ；ペプチ ド接合体のウェスタンプロット分析を示す。左から右に、レーンは分子量の標準 （ＬＭＷ）、ＰＲＰ　（ペプチド３５７−３８０）、ＰＲＰ（ペプチド３０６− ３３４）、ＰＲＰ−ＣＲＭ、ＰＲＥ’およびＰＲＰの短い（ペプチド３６６−３ ８３）を含有する。 ｗＣ５図は、担体ＤＴへの暴露前の、ＰＲＰ−（３０６−３３４）　に対する免 疫応答への、作用の線図的表示を示す。 第６図は、呼吸系のシンシチウムのウィルス（Ｒ３Ｖ）Ｆタンパク質接合への抗 体の応答の線図的表示を示す。 本発明の種々の実施態様は、バクテリアの産生物の分離したまたは合成のＴ細胞 のエピトープが免疫化の目的で抗原のための担体のタンパク質硫酸アンモニウム 効果的に働くすることができるという発見の基づく。 バクテリアの産生物のＴ細胞の決定基は、抗原に結合したとき、同−抗原に接合 した全自然タンパク質と同・−の方法で機能することができるということは、従 来実証されてきていない。バクテリアの産生物のＴ細胞のエピトープは抗体の応 答を促進するとき担体のタンパク質と同程度に効果的に機能できるという知識は 、Ｂｍ胞の決定基または全抗原と組み合わせて分離しｔ；Ｔ細胞のエピトープの 使用に基づくワクチンの完全に新しいクラスに対する扉を開いた。次の論考は、 本発明において使用するための適当なＴｍ胞のエピトープの同定および分離の手 段の詳細な説明を提供する。同様な性質を有することに加えて、エピトープの使 用（完全な自然タンパク質の使用と反対に）は、過敏症、自己免疫、および経費 のかかる精製の潜在的問題を、有効性を犠牲にしないで、排除する。 ５．１．１．Ｔ細胞のエピトープの同定の技術バクテリアの産生物のＴ細胞のエ ピトープは従来同定されてきていないが、問題のバクテリアの産生物内の１また は２以上のＴ細胞のエピトープの同定に適用できる複数の方法は文献に記載され ている。例えば、デリシ（Ｄｅｌｉｓｉ）ら［ＰＮＡＳ、８２ニア０４８．１９ ８５；参照、また、マルガライト（ｍａｒｇａｌｉｔｅ）　　ａｔ　　ａｌ、、 ジャー＋Ｊいオブ・イム）ロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）、上主旦：２２１３． １９８７］は、潜在的にエピトープの領域は分子中の潜在的な両親媒性のアルフ ァらせん領域の同定により位置決定することができることを示唆した。ロスバー ド（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）ら［ヒトの白血病ＶＩＩにおける現代の傾向（Ｍｏｄｅ ｒｎ　　Ｔｒｅｎｄｓ　　ｉｎ　　）（ｕｍａｎＬｅｕｋｅｍｉａ　　ＶＩ　！ ）、１９８６］は、また、タンパク質の一次配列を疎水性、電荷、極性およびグ リシンまたはプロリン残基の存在に関して検査することによって、Ｔ細胞のエピ トープを同定する実験的アプローチを記載している。電荷またはグリシンの次ぎ に２つの疎水性残基が存在する配列は、潜在的Ｔ細胞のエピトープを示唆した。 ビクスラ−（Ｂｉｘｌｅｒ）ら（Ｉｍｍｕｎｏ　１．Ｃｏｍｍ、、上１５９３． １９８３）；Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ、、１１：２４５；１９８４；Ｊ、Ｉ ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ、、１１　：　３３９　；　１９８４）は、Ｔ細胞のエピ トープを描写するために全体のタンパク質分子を含むオーバーラッピングする合 成ペプチドを合成する方法を記載している。ギセン（Ｇｙｓｅｎ）［チバ・ファ ンディジョン・シンポジウム（Ｃｉｂａ　　Ｆ。 ｕｎｄａｔｉｏｎ　　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）、　Ｉに９；１３０、　ｌ　９８ ６コに記載されている新しい合成方法は、種々の潜在的結合部位をまねることを 可能とし、次いで分子の急速な走査を可能とする、少量の大きい種類のタンパク 質をの合成することができる。より伝統的な方法、例えば、タンパク質の酵素的 または化学的消化は、Ｔ細胞の活性について容易に試験することができるタンパ ク質の断片を与える。例えば、酵素、例えば、キモトリプシン、エラスターゼ、 フィチン、パパイン、ベグシン、またはトリ／シンは、特定したアミノ酸結合の 切断により制限したかつ予測可能な断片を提供する。同様に、化合物、例えば、 Ｎ−クロロスクシンイミドＢＰＭＳ−スカトール、臭化シアン、ギ酸、またはヒ ドロキシルアミンは、また、タンパク質へのそれらの作用により定義可能な断片 を生成する。いずれの所定の断片における所望のＴ細胞刺激活性の存在は、精製 した断片を標準のＴ細胞増殖に付すか、あるいは未精製の断片をＴ細胞のウェス タンアッセイ　〔ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ｅ　ｔ　　ａ　１．、疫学（Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、）、５旦：１６７、ｌ　９８６］で分析することによって、容易に決定す ることができる。 ５．１．２．７細胞のエピトープ源 担体のタンパク質として自然親分子を利用することによって、潜在的に有用なＴ 細胞のエビドーグの便利な源を提供するある数のバクテリアの産生物が存在する 。例えば、種々のダラム陰性バクテリアからの外膜タンパク質、例えば、インフ ルエンザ菌（Ｈａａｍｏｐｈｉｌｕｓ　　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）からのＯＭＦ を使用することができる。ピリ線毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）、多数のグラム陰性バ クテリア上に見いだされるフィラメント状の非鞭毛の付属器、ならびに７ラゲリ ン、バクテリアの鞭毛のタンパク質成分のタンパク質は、ＴＪａｌ胞の決定基の 潜在的源を表す。ある種のバクテリアのフィラメント状赤血球凝集（ＦＨＡ）、 例えば、百日咳は、また、Ｔ細胞の決定基源として考えられる。 本発明の目的について最も価値あるバクテリアのタンパク質には、伝統的ワクチ ン組成物において担体のタンパク質として首尾よく使用されてきている、よく知 られたバクテリアの毒素である。前述のバクテリアの毒素およびトキソイドはヒ トを免疫化するために数年間使用されてきているが、免疫系によるそれらの認識 についてほとんど知られていない。 文献にほとんど記載されていないものは決定的ではない。トリーベル（Ｔｒｉｅ ｂｅｌ）ら【ヨーロピアン・ジャーナＪし・オブ・イムノロジー　　Ｅｕｒ、Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１旦：４７、ｌ　９８６］は、臭化シアンの切断により 発生したジフテリア毒素の断片に対するＴ細胞の反応性についてのヒト末梢白血 球を検査した。しかしながら、制限された組の大きい断片のみが考慮され、そし てＴＪＩ胞の決定基の正確な描写は不可能であった。したがって、バクテリアの 宿主の正確なＴ細胞の決定基はまだ同定されてきていない。 バクテリアの毒素のＴ細胞の決定基の接合体の現在の調製は、弱く免然の形態に おいて有用である任意の既知の毒素に基づく。既知のバクテリアの毒素のうちで 、ＣＲＭまｔ；はトキソイドはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓ 　ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔ ｏｃｏｃｃｕｓ）ｓペルツシス属（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のもの、および腸性毒 発生バクテリア、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉである。しかしながら、最も広く受は入 れられている担体のタンパク質は、確立された安全の歴史を有する、破傷風およ びジフテリアのトキソイドである。きくに好ましいＴＪＩＩＩｎのエピトープは 、ＣＲＭ　、　ｇ　ｙ、すなわち、ジフテリアの毒素の無毒の突然変異体から分 離される。 ５．１．３．旦ＲＭユ週ｌ了上二ノ 「交差反応性材料」またはＣＲＭＳは、自然タンパク質の毒素に抗原的に類似し 、そしてしかも無毒である、遺伝子的に変更されている。ジフテリアの毒素は、 バクテリアの莢膜のポリマーに対する抗体の応答を増強するとき有効であること が既に証明されている〔アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）　　ｅｔ　　ａｌ、 、ジャーナル・オブ・ペジアトリクス（Ｊ、　Ｆｅｄ　ｉ　ａ　ｔ　ｒ、）、上 旦ヱ：３４６、ｌ　９　ｓ　ｓｌ−ＣＲＭ＋ｓｔとして知られている交差反応性 材料は、単一のアミノ酸交換を有し、そして自然ジフテリアの毒素と免疫学的に 区別不可能であることは、注目に値する。ＣＲＭ＋＊ｙタンパク質を産生ずる、 コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｄｉ ｐｈｔｈｅｒｉａｅ）菌株Ｃ７（β１９７）の培養物は、アメリカン・タイプ・ カルチャー−コレクシ菅ン（ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、米国マリイランド州ロックビレ）に受は 入れＮｏ、ＡＴＣＣ５３２８１で受託されている。 ＣＲＭ内の潜在的Ｔ細胞の決定基を局在化するために、デＶシ（ＤｅＬｉｓｉ） およびベルシフスキー（Ｂｅｚｏｆｓｋｙ）（ＰＮＡＳ、８２：２４８９．１９ ８５）に従い、タンパク質のらせんの両親媒性の領域に注意が集中された。デリ シ（ＤｅＬｉｓｉ）およびベルシフスキー（Ｂｅｚｏｆｓｋｙ）、５ｕｐｒａ、 に記載されているような、パーソナルコンピューターのアルゴリズムにより決定 され、そして精子クジラミオグロブリンの分析について得られた結果の比較によ り確認された局在化。次いで、プログラムをＣＲＭ　、＊　ｔの既知の配列に適 用した【コリア−（Ｃｏｌｌｉｅｒ）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｒｅｖ、、３旦： ５４．１９７５；ドラジン（Ｄｒａｚｉｎ）　　ｅｔ　　ａｌ、、ジャーナル− オした。これらの領域は、漂準段階的同相のメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅ ｌｄ）の合成により合成された。 いったんＣＲＭの所定の領域がＴ細胞の決定基またはその一部分を含有するとし て評価されたとき、決定基の正確な境界をマツピングすることができた。これは 、問題の領域を系統的に切断する合成ペプチドのいくつかの異なる組を使用する ことによって達成される。ペプチドの＊１のｉｌｊ：おいて、固定したＣ末端を 維持しながら一度に３〜５の自然配列残基をペプチドのＮ末端を連続的に添加こ とによって、ペプチドのＮ末端を変えた。これによりＮ末端の境界をおおまかに 決めることができる。 境界の位置をさらに洗練するために、この領域を切断した二次系列のペプチドを Ｎ末端への自然配列残基の単一工程の付加により合成した。第３組のペプチドに おいて、固定したＮ末端の境界を維持しなからＣ末端の残基を１〜３残基の工程 で連続的に欠失した。これはそれらの認識に悪影響を及ぼしうる漸進的に短いペ プチドを生ずるので、タンパク質の自然配列に無関係の追加の残基のＮ末端への 付加により、減少する大きさについて補償することが必要であっｌ；。マツピン グした決定基のＮ末端およびＣ末端の両者で、描写した領域の領域に相当するペ プチドを合成し、モしてＴ細胞の決定基として評価した。 可能なＴ細胞のエピトープとして第１図に描写した領域のうちで、領域３５７− ３８３におけるペプチドはジフテリア（Ｄ　Ｔ）−プライムド（ｐｒｉｍｅｄ） リンパ節細胞の刺激において実質的な応答を示した。 それ以上の研究は、エピトープをＣＲＭ、、、の３６６−３８３に局在化した。 この配列はＣＲＭ＋＊ｙ８よびジフテリアの毒素のＴ細胞のエピトープを表す。 このペプチドは、莢膜のポリマーのＰＲＰに共有結合すると、生体内でＰＲＰへ の所望の抗体の応答を誘発するとき有効であることが示され、そしてまた、全体 のＣＲＭまたはＤＴ毒素と交差反応しない抗体を誘発しない。こうして、このペ プチドはバクテリアの毒性の接合体において望ましい特性を有する。他のＴ細胞 のエピトープはＣＲＭの３０６−３３４に局在化された。 ５．１．４．ＣＲＭのＴ細胞のエピトープ調製下の実施例を参照して説明するよ うに、ペプチドの長さ上のある数の変動をＴ細胞の応答の活性に影響な及ぼさな いで行うことができ、そして本発明は刺激活性を保持するが、自然タンパク質に より誘発されうる悪い免疫学的反応を引き起こさないペプチドの任意の断片を包 含することが考えられる。また、本発明は、ペプチドの活性に影響を与えないで 、−次配列においてアミノ酸が置換されている活性なペプチドにおける変動を包 含することが考えられる。このような置換はこの分野においてよく知られている 。例えば、置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および ／または両親媒性に８ける類似性に基づいてなすことができる。陰性に帯電した アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する；陽性に？？Ｆｔし たアミノ酸はリジンおよびアルギニンを包含する；類似する親水性値を有する、 帯電しない極性のヘッド基または非極性のヘッド基をもつアミノ酸は、次のもの を包含する：ロイシン、インロイシン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェ ニルアラニン、チロシン。 調製の方法は、ペプチドの合成についてこの分野において知られているものいず れからも選択することができる。より普通に使用されている２９８６−２９８３ 、＋９６４］　を経るカップリングであり、ここで保護されたアミノ酸を樹脂粒 子に結合する。官能基を有するアミノ酸、例えば、チロシンは、一般に、除去容 易なブロッキング基で保護される。 これらの技術の各々は、本発明の目的に対して等しく適当である。 ５．１．５．破傷風の毒素のエピトープＣＲＭ、、、のＴ細胞のエピトープの同 定に加えて、破傷風の毒素の分子を、まｆ；、Ｔ細胞のエピトープについて検査 した。このようなエピトープを局在化するために、破傷風の毒素の分子を種々の プロテアーゼを使用して大きさ決定可能な断片に切断した。この方法において発 生した断片は、最初に、不ズミのＴ細胞の増殖を刺激するそれらの能力について 試験した。活性断片を包含する１組のオーバーラッピングするペプチドを合成し 、モしてＴ細胞の活性について試験しｔ；。好ましいエピトープは、破傷風の毒 素のペプチド９６１−９８０および１０２１−１０４本発明のＴ細胞のエピトー プは、免疫原性の増加が望ましい、医学または獣医学において興味ある、事実上 任意の抗原、抗原決定基、まＩ；はハプテンと価値あるように組み合わせること ができる。例えば、これらの抗原は、バクテリア、ウィルス、寄生体または菌・ かび由来の感染因子に関連させることができる；例は次のものを包含する：肺炎 球菌の多糖、淋菌の外膜タンパク質、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍ ａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の付着タンパク質、またはダラム陰性バクテリア のリポ多糖に関連する表面サツカリド。このタイプの追加の抗原を、当業者は容 易に認識するであろう。 免疫原性接合体のＢ細胞部分として使用することができる抗原材料の他のグルー プは、任意の既知のアレルゲンである。本発明において有用であることが証明さ れるであろうタイプのアレルゲンの例は、次の通りである：ブタフサ（アタシ（ Ａｔａｓｓｉ）　　ｅｔ　　ａｌ、、ＦＥＢＳレターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１ ８８　：　９６．１９８５］、ライグラ８３：９６．１９８７］のＢ細胞の決定 基；ダニのタンパク質のＤｅｒｐ＋およびＤｅｒｆ［チャプマン（Ｃｈａｐｍａ ｎ）ｅ　ｔ　　ａ　１．、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ り、１３９：１４７９．１９８７）　　；ミツバチの毒液のホスホリゼートＡ、 の炭水化物のエピトープ［ウニパー（Ｗｅｂｂｅｒ）　　ｅｔ　　ａｌ、、アレ ルギーまた、腫瘍ｌ；関連する抗原は本発明の範囲内に入る。よりよく特性決定 される抗原には、次のものがある：癌胚の抗原［クロキ（Ｋｕｒｏｋｉ）４５： ３０５，１９８５］、および胃腸／膵臓に関連する抗原［マグナニ（Ｍａｇｎａ ｎｉ）ｅｔ　　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、、４３：５４８９．１９８３ ］。 また、潜在的に興味あるものは、自己免疫病、例えば、慢性関節リウマチおよび エリテマトーデスに関連する種々の抗原である。 上の説明から、用語抗原の使用は、全抗原またはその決定基の１つを含むことを 意味し、そして、また、バクテリアのＴ細胞のエピトープとの接合とともに起こ る免疫応答の増加により利益を受けるハシテン分子を包含することを意味するこ とを理解すべきである。抗原の上の列挙は、例示のみを目的とし、そして追加の 有用な抗原は当業者により容易に認識されるであろう。 ５．２．１．莢膜のポリマー 前に説明したように、ワクチンにおいて潜在的に有効であるが、若いヒトにおい て弱くのみ免疫原性である抗原のグループの中にはバクテリアの莢膜のポリマー 存在する。この出願において使用とき、用語［莢膜のポリマー（ｃａｐｓｕｌａ ｒ　　ｐｏｌｙｍｅｒ）Ｊは糖を含有するポリマー、例えば、糖、糖の酸、アミ ノ糖、多価アルコールおよび糖のホスフェートのこのようなポリマーを呼び、そ してアミノ酸を含有するポリマーを呼ばない。これらの「莢膜のポリマー」は、 医学の文献においてしばしば「莢膜の多糖」と呼ばれているが、グリコシドの結 合以外の結合および上に列挙したおうな糖以外の構成成分を含有することができ る。 莢膜のポリマー（ＣＰ）は、多数の異なるタイプのバクテリアから誘導すること ができる。これらのタイプは、次のものを包含する：インフルエンザ薗（Ｈａｅ ｍｏｐｈｉｌｕｓ　　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、連鎖球菌属（Ｓｔ　ｒｅｐｔｏ ｃｏｃｃｕｓ）種、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（とくに血清型１，４．５．６Ａ、６Ｂ、９Ｖ％　１４． １８Ｃ，１９Ｆまたは２３Ｆ）化１Ｍ３［１１１＃ｌｌ菌Ｃ３ｔｒｅｐｔｏｃｏ ｃｃｕｓ　　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびストレプトコッカス・アグラクチアエ（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇｌａｃｔｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒ ｉａ　　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　　ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏ ｓａ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ ）。 異なるバクテリアのＣＰは、ヒトの寿命の第１年において免疫原性が広く変化す る。あるもの、例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ。 ｃｃｕｓ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）血清型３および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒ ｉａ　　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清をＡは適度に活性である。 莢膜をもつバクテリアによる全身の感染に対する感受性は、寿命の第１年におい てより大きい。子供における多くの莢膜のポリマーに対する免疫原性応答は年令 に依存する、すなわち、ＣＰに対する免疫能は年令の約６オで大人のレベルに増 加する。 不活性のＣＰには、インフルエンザ菌（Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｈｂ、肺炎 連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６お よび１２、および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血 清型Ｃのそれらがある。乳児において中程度の応答を刺激するＣＰの例は、肺炎 連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ。 ｃｃｕｓ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９および５１である・また、有機 体、例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血 清ｆｆ１Ｂにおいて見いだされる多糖類が存在し、これらはいずれの年令におい ても免疫原性ではない。 非バクテリアのポリマーは酵母菌および菌・かび、例えば、クトコッ力ス拳ネオ ７オルマンス（Ｃｒｙｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｎｅｏｆｏｒｍａｎ　ｓ　）　、ま たは癌細胞上に独特に見いだされるサツカリド単位またはアレルゲンに関連して 見いだされるものから誘導することができる。 免疫原性構成体の調製において有用な他の抗原は、微生物の抗原、ウィルスの抗 原、腫瘍の抗原、アレルゲン、および自己免疫に関する抗原から成る群より選択 される抗原を包含する。微生物の抗原の例は、他の膜のタンパク質［例えば、イ ンフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈ　ｉ　１ｕｓｉｎＩＩｕｅｎｚａｅ）またはカ タル球菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）から］および表面 のタンパク質［例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐｙｏ ｇｅｎｅｓ）からのＭタンパク質］を包含する。ウィルスのタンパク質の例は、 呼吸系のシンシチウムのウィルス（ＲＳ　Ｖ）のＦおよびＧタンパク質を包含す る。 ５．２．３．抗原−エピトープの接合体の調製本発明の抗原−エピトープの接合 体は、抗原を担体にカップリングするためにこの分野において知られている生物 学的に許容されうる方法のいずれによっても調製することができる。本発明の接 合体の最も効率よい利用を確実にするために、カップリングの方法は最も好まし くは共有結合のカップリングである。多くのこのような方法は、多糖またはオリ ゴ糖、タンパク質、およびペプチドをペプチドの担体にカップリングするために 現在利用可能である。はとんどの方法は、アミンまたはアミドの結合、またはあ る場合においてチオ−エステルをつくる。 カップリングの化学は、ある程度まで、Ｔｍ胞のエピトープの修飾された類似体 の合成により、変更することができる。このような修飾は、例えば、スペーサー 要素を使用しであるいは使用しないで、ペプチドのＮ末端にリジンまたはシステ ィンを付加することを包含する。Ｔ細胞を刺激するこのような類似体の能力は、 非修飾ペプチドのそれと比較した。 （ａ）多糖またはオリゴ糖対ペプチド サツカリドのカップリングのための１つの有用な方法は、還元的アミド化である 。多Ｍおよびオリゴ糖は遊離の還元性末端基を有し、これの基はＮ末端アミノ酸 またはペプチドのリジンのε−アミノ基の窒素に還元的にアミン化することがで きる。形成する結合は第二アミンである。 あるいは、多糖またはオリゴ糖は、例えば、過ヨウ素酸のイオンにより酸化して 、内部および／または末端のアルデヒド官能を生成することができる。アルデヒ ド基は、まｆ：、、Ｎ末端のアミノ酸にあるいはペプチド中のリジンの茗−アミ ノ基に還元的にアミン化することができる。 一方の末端にアミノ基および他方の末端に活性基、例えば、アミノ、マスクした アルデヒド、カルボン酸または活性エステルまたはチオ基を有する、短い二官能 性スペーサー基は、還元的にアミン化してサツカリドにし、次いでスペーサーの 他の末端基を通してペプチドにカップリングすることができる。ａ−アミノカプ ロン酸４−アミノブチルジメチルアセタールはこのようなスペーサー基の例であ る。 末端の還元性糖を０−フ二二レンジアミンおよびニトロフェニルヒドラジンと反 応させると、置換された１−７エニルフラバゾールが生成する。官能化したサツ カリドのペプチドへのカップリングは、ニトロ基をジアゾ官能に転化することに よる。 サツカリドのヒドロキシル基の活性化は変更された方法である。サツカリドのヒ ドロキシル基は、ハロゲン化シアン（通常臭化シアン）またはカルボニルジイミ ダゾールを使用して活性化して誘導化されたヒドロキシルを生成し、これをペプ チドのＮ末端アミノまたはＣ−アミノ基にカップリングすることができる。形成 した結合はイソ尿素またはカルバメートである。 追加の方法として、カルボン酸官能基、例えば、ウロン酸基またはアルドン酸の 官能を有するサツカリドは、ペプチドのリジンのＮ末端のアミノまｔ：はｔ−ア ミノ基に、カーポジイミドまたはインブチルクロロカーボネートを使用して活性 エステルの形成によりカルボキシル基を活性化することによってカップリングす ることができる。生ずる結合はアミド結合である。 また、遊離アミン基を有する多糖は、カルボキシル末端またはＮ末端のアミノ酸 を通してペプチドにカップリングすることができる。カルボキシル末端またはア ミノ酸、例えば、グルタミン酸へのカップリングは、前述のカーポジイミドによ りカルボキシル官能の活性化による。Ｎ末端の窒素またはリジンへのカップリン グは、二官能性基、例えば、各末端においてアミノ官能と反応するジスクンニミ ジル基質を使用することによって達成される。 （ｂ）タンパク質またはペプチド対ベプチドカルボキフル官能は、カーポジイミ ドまたはタロロカーポネートにより活性化して、ぺ／チド上のアミン基と反応す ることができる活性エステルを生成することによって、活性化することができる 。形成する生ずる結合はアミドである。 ペプチドをペプチドにカップリングするより一般的方法は、二官能性架橋試薬を 使用することによる。これらは各末端１こ活性基を有する小さい分子である。ス ペーサー分子は、各末端に同一であるか、あるいは異なる活性基を有する。最も 普通の活性な官能性、カップリング基および形成される結合は、次の通りである 。 １、アルデヒド−アミノ−第二アミン ２、マレイミノ−スルフヒドリル−チオエーテル３、スクシンイミド−アミノ− アミド ４、イミデートエステル−アミノ−アミド５、フェニルアジド−アミノ−７二二 ルアミン６、アシルハライド−スル７ヒドリルーチオエーテル７、ピリジルサル ファイド〜スルフヒドリルージサルファイド８、インシアネート−アミノ−イソ チオ塚素５．３．ワクチンの配合および投与 本発明の接合体は、微生物の感染の任意の型の処置のためのワクチン組成物の調 製において有用である。接合体は任意の普通に使用されている製剤学的に許容さ れうる担体、例えば、水、生理的塩類溶液、エタノール、ポリオール（例えば、 グリセロールまたはプロピレングリコール）、または植物注油、ならびにこの分 野において知られている任意のワクチンアジュバントと組み合わせることができ る。それらは、また、リポソーム中に組み込むことができる。ここで使用すると き、「製剤学的に許容されうる担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒質 、抗生物質、抗菌・かび剤、等張および吸収遅延剤などを包含する。補助的に活 性な成分を、また、使用することができる。 投与のモードは、典型的には、非経口的、すなわち、静脈内、筋肉内、腹腔内ま たは皮下である。経口的投与は、また、可能である。このようなワクチンにおけ る使用量は、使用する抗原の同一性に依存する。本発明の接合体のワクチンへの 適合のために伝統的な担体の接合体とともに使用する確立された投与量の範囲の 調節および操作は、当業者の技量の範囲内である。例えば、ＰＲＰおよびＣＲＭ からなる既知の担体の接合体の典型的な投与量は、はぼ１〜２５μｇのペプチド である。本発明のワクチンおよび方法は、また、とくに有用である。なぜなら、 はとんどの乳児は、生まれてすぐ後に、ジフテリアおよび破傷風のワクチンの投 与により既に［プライムド（ｐｒｉｍｅｄ）Ｊされているからである。 本発明の接合体は、未熟および大人の両者の温血動物、とくにヒトの処置におけ る使用に意図されている。有効な予防を本発明の方法により達成することができ る病気は、この開示を読むと、当業者にとって明らかであろう。また、本発明の 方法８よび接合体の使用は、予防の適用に制限されない：治療の適用も考えられ る。 好ましい実施態様において、接合体は、ジフテリアの毒素のＴ細胞のエピトープ に接合した、バクテリアの莢膜の抗原、またはその抗原の断片からなる。この組 み合わせは、髄膜炎の処置において有用である。この状態は、最も普通にインフ ルエンザ菌（Ｈ，ｉｎｆ　Ｉｕｅｎｚａｅ）ｂにより引き起こされれ、６オ以下 のの年令の子供において起こり、この場合の６０％は２才以下の年令の子供にお いて起こる。この病気に対する保護は、伝統的ワクチン組成物を使用して１８力 月の乳児において達成することは困難であった。しかしながら、本発明の組成物 は、Ｔ細胞のレクリートメントのために実質的なレベルの抗体の産生を生成する 。 次の非制限的実施例は、本発明のＴＪａｌ胞のエピトープの接合体の調製および 有効性を実証する。 アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４ ３０Ａ型ペプチド合戊装置でメリフィールド（ＭｅｒｉｆｉｅＩｄ）（ｉ９６３ ）の段階的固相アプローチを使用して、合成ペプチドを合成した。すべての合成 ペプチドは、スチレンおよびジビニルベンゼンから成る不溶性コポリマーの樹脂 上でアセンブリングした。これらのペプチドのアセンブリーにおいて使用したす べてのアミノ酸は、ｔ−ＢＯＣ（ｔ−ブチル１０オキシカルボニル）部分により 保護【７たａ−アミノ基で供給した。ペプチド鎖はｒＰＡＭＪ　　（フェニルア セタミド）リンカ−を通して樹脂Ｉこ取り付けた。 固相合成の原理を下に簡単に述べる。個々のバイアル中に乾燥粉末として貯蔵し たｔ−ＢＯＣ＃ｉ！アミノ酸の１当量を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で溶解し、 アクチベーター容器に移し、ここでそれを０．５当量のジシクロへキシルカーポ ジイミド（ＤＣＣ）で活性化して、（α−アミノ保護、ｔ−ＢＯＣ）アミノ酸対 称無水物を生成し、これをアシル化種として利用する。対称無水物誘導体を濃縮 容器中に移し、その間不溶性副生物、ジシクロヘキシル尿素をメタノール−ＤＣ Ｍで溶解し、そしてアクチベーター容器からフラッシュする。濃縮容器にむいて 、ＤＣＭを除去し、モしてＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で置換し、 これは対称無水物と装入したＰＡＭ−樹脂上でアセンブリングしたペプチドとの 間のカップリング反応の効率を増加するために使用する。溶媒の除去後、対称無 水物を反応器も添加する。ＤＭＦ中で対称無水物を供給するまえに、反応器中の ペプチド−樹脂をＴＦＡ／ＤＭＣ混合物でＮ−（アルファ）−脱保護し、ＤＣＭ で洗浄し、モしてＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン／ＤＭＦ溶液で中和する 。対称無水物を反応器に添加した後、カップリング反応を実施し、樹脂結合した ペプチドの脱保護したα−アミノ基にｔ−ＢＯＣアミノ酸の活性化カルボキシル は共有結合する。合成が完結したとき、反応器を排液し、ＤＭＣで洗浄し、こう して合成の他のサイクルのためのペプチド−樹脂を調製する。 対称無水物誘導体は、アスパラギン、グルタミンおよびアルギニンを除外するほ とんどのアミノ酸のためのアシル化種として使用した。これらの３つのアミノ酸 はｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルとしてカップリングした。アミノ 酸の反応性側鎖は、ペプチド鎖の合成の間保護した。使用した保護基は次の通り であった：Ａ３ｐｓＧｌｕについて０−ベンジル；Ｓｅｒ、Ｔｈｒについてベン ジル；Ｃｙｓについて４−メチル−ベンジルＨＡｒｇ、Ｈｉｓについてトシル； Ｌｙｓについて２−ＣＩ−カーボベンゾイルカルポニル；ＴｙｒについてＯ−（ ｐ−ブロモペンシルオキシカルボニル）；Ｔｒｐについてホルミル。各工程にお けるカップリングの完結は、定量的ニンヒドリンのアッセイ　［Ｖ、Ｋ。 サリン（Ｓａｒｉｎ）　　ａｔ　　ａｔ、、１９８１１により監視し、このアッ セイはペプチド−制限酵素上の残留するα−アミノ基を測定した。 典型的には、９９．５％より大きいカップリングの効率が達成された。 カップリングの効率が許容されえないとき、合成を異なる残基の「二重カップリ ング」サイクルを使用して反復した。 合成後、各ペプチドをｌ０ｍ１２のの無水液体ＨＦで樹脂から伽々に切断し、こ のＨＦには１ｍＱのジメチルサルファイド、およびアニソールおよびｐ−チオク レゾールのｌ：ｏ、２モル混合物を添加した。これらの切断反応は一８℃におい て５０分間実施した。いったん切断されると、樹脂を３〜２５ｍＱの部分の無水 ジエチルエーテル残留しうる有機不純物を除去する。最後に、粗製ペプチド材料 を、水中の氷酢酸の希溶液（３０ν／ｖ）の３〜１０ｍＱの洗浄液で樹脂から抽 出した。抽出液を１００ｍ１２のセイヨウナシのをのフラスコ中で一緒にし、そ して酢酸／水溶液を回転蒸発により除去した。残留する乾燥した残留物を０．１ ％のＴＦＡ／Ｈ！Ｏの最小体積にし、１５０ｍ１２の凍結乾燥フラスコに移し、 液体窒素中で急速に凍結し、そして−夜凍結乾燥した。 ６．２０合成ペプチドの化学的特性決定合成ペプチドの純度を、まず、逆相ＨＰ ＬＣにより、好ましくは２つの異なる勾配の条件を使用してアッセイした。ＨＩ ’ＬＣのクロマトグラム中で合計面積の９５％より大きい面積をもつ単一の均質 なピークとして溶離するペプチドを、それ以上の分析のために直接アミノ酸配列 決定した。 Ａ、ＨＰＬＣ分析。切断した粗製のペプチド材料を、バイダク（Ｖｙｄａｃ）Ｃ ａ−分析力ラム＜４−６ｍｍＸ２５０ｍｍ）のＨＰＬＣにより０％〜６０％のア セトニトリルの勾配を使用して３０分かけて分析した。勾配が不適切な場合、そ れをそれじ応じて変えて、粗製混合物中のピークの分解を最適にした。また、他 のクロマトグラフィーの因子、例えば、カラムの大きさ、充填材料の充填効率、 粒子大きさ、結合の化学、およびベグチドｎ合物の溶解特性をＨＰＬＣの精製プ ロセスを通じて考慮する。いったん適当な分離のプロトコルが各ペプチドについ て得られたら、これらの実験の条件をバイダク（Ｖ　ｙ　ｄ　ａ　ｃ）　Ｃａ− 分析力ラム（ｌ　０ｍｍＸ２５０ｍｍ）を使用して半調製のモードに移して、ミ リグラムルブラムの量の精製された生成物を得Ｉ；。引き続いて、精製された材 料を分析実験条件下に再クロマトグラフィーにかけて、生成物の最終の純度を決 定し、許容されうるレベルは９５％であった。 Ｂ、アミノ酸分析。配列決定の前に、凍結乾燥したペプチドを０．１％のＴＦＡ ／水中に溶解した。はぼ５００ピコモルをポリプレン被覆したガラス繊維の紙上 でスポツティングした後、オン−ラインの１２０Ａ型ＰＴＨ−分析装置を装備し たアプライド・バイオシステニス４フフＡパルスト液体装ンパク質／ペプチド配 列決定装置を使用して、自動化反復エドマン分解を開始した。各エドマン分解後 、各アミノ酸から形成したフェニルチアゾリノン誘導体を、より安定なフェニル チオヒダントイン（ＰＴＨ）誘導体に２５％のＴＦＡで６４℃において２０から 処理して転化した。 ＰＴＨ誘導体を、ブラウンリー（Ｂｒｏｗｎ　１ｅｅ）Ｃ−１８カラム（２２０ ｍｍＸ２−１ｍｍ）の逆相ＨＰＬＣにより、次の溶媒を使用して分離した：溶媒 Ａ　Ｃ１０当たり）＝３モルの酢酸ナトリウム緩衝液を含有する５％のテトラヒ ドロフラン（２７，０ｍＮのｐＨ３，８および６．２ｍｆｆ１のｐＨ４，６）お よび溶媒Ｂ　（１４当たり）：５００ナノモルのオキシダントのスカベンジャー 、Ｎ、Ｎ’　−ジメチル−Ｎ′−フェニルチオ尿素（ＤＭＰＴＬＩ）を含有する アセトニトリル。クロマトグラフィーのピークの形状およびＰＴＨ−ヒスチジン およびＰＴＨ−アルギニンの分解を改良するために、０．５ｍｇの１２．５％の トリメチルアミンを溶媒ＡＪ二添加した。公称ＨＰＬＣのパラメーターは次の通 りであった＝２００μＱ／分の流速；２５４ｎｍにおける検出器の波長；および ５５℃のカラムの温度。ＰＴＨ誘導体の最適な分離は、次の直線の勾配を使用し て達成した２１２％のＢ、０分；３８％のＢ、１８分；３８％のＢ１２５分；９ ０％のＢ、２５．１分；９０％のＢ、２９分。各サイクルのＰＴＨはＰＴＨ−ア ミノ酸の混合物（アプライド・バイオシステムス）の標準のクロマトグラムと比 較することによって同定した。 ６．３．Ｔ細胞の活性化 Ａ、ネズミのＴ細胞の増殖。完全７０インドアジユバント中の乳化した（１　： 　ｌ　ｖ／ｖ）の最適な投与量の抗原で前以て免疫化したマウスから、鼠径およ び大動脈肩囲のリンパ節を無菌的に収穫した。単一の細胞懸濁液を１０％の胎児 ウシ血清を含有するＲＰＭＩ中で調製した。単一の洗浄後、細胞を血清を含有し ないＲＰＭＩ中に再懸濁し、そして位相差顕微鏡でトリバンブルー排除により計 数しｔ；。細胞の数を、２％の正常マウス血清を含有するＲＰＭＩ中の３Ｘ１０ ＠細胞／ｍαの濃度に調節した。種々の濃度の抗原、ミトゲンまたは他の対照材 料を、血清を含有しないＲＰＭＩ中で調製し、そして三重反復実験で９６ウエル の平らな底の組織培養処理した平板にアリコートＣＯ−１ｍＱ）を取った。広い 範囲の投与量を日常的にすべての抗原について使用した。これらの平板に、Ｑ、 １ｍ１２の細胞懸濁液を添加した。こうして、最終細胞濃度は、１％のマウス血 清を含有する培地中で３ＸｌＯ’細胞／ウエルであった。 細胞の添加後、培養物を加湿した５％のｃｏ、のインキュベーター中に３７℃に おいて配置した。３０間インキュベージＢンした後、培養物を１８時間１μＣ４ ／ウエルの［”ＨＦ　−チミジンでパルスし、そして液体シンチレーシ」ンによ る計数のために収穫した。チミジンの組み込みを、反復実験の値の平均−反復実 験の非刺激（バックグラウンド）の値の平均として表す。 Ｂ、ヒトＴ細胞の増殖。血液をボランティアからヘパリン処理しｔ；管に集め、 次いで血清を含有しない加温した（３７℃）ＲＰＭＩで希釈（１：　ｌ）した。 末梢血液の白血球を、希釈した血液（２５ｍ！２）を１５ｍＱのフィコール（Ｆ ｉｃｏｌｌ）ヒストバーク（Ｓ　Ｉ　ｇｍａ）の上に層状にすることによって分 Ｃした。室温において遠心（１５００ｒｐｍ、５分）ｖｉ、フィコール−血液界 面における細胞を吸引し、そして１０％の胎児つ／血清を含有するＲＰＭＩで洗 浄（３Ｘ）した。最後の洗浄後、細胞を血清を含有しないＲＰＭＩ中に再懸濁し 、そして位相差顕微鏡を使用してトリバンプルーの排除により計数した。細胞数 は、２０％のプールしたヒト血清を含有するＲＰＭＩ中の０．７５Ｘ］、Ｏ’細 胞／ｍＱに調節した。種々の濃度の抗原、ミトゲンまたは他の対照材料を血清を 含有しないＲＰＭＩ中で調製し、そして三重反復実験において９６ウエルの丸底 組織培養処理した平板中にアリコート（０，１ｍ１２）で添加した。広い範囲の 投与量をすべての抗原について田常的に使用した。 これらの平板に、０．１ｍＱの細胞懸濁液を添加した。こうして、達成された最 終細胞濃度は１０％のヒト血清を含有する培地中で０．７５Ｘ１０“細胞／ｍＱ であった。細胞の添加後、培養物を加湿した５％のＣＯｌのインキュベーター中 に３７℃において配置した。６日間インキュベーションした後、培養物を６〜８ 時間１１ｔＣｉ／ウエルの［３Ｈ］　−チミジンでパルスし、そして液体シンチ レーシ２ン４こよる計数のために収穫した。チミジンの組み込みを、反復実験の 値の平均−反復実験の非刺激（バックグラウンド）の値の平均きして表す。 中に溶解し、そして十分な量のリン酸ナトリウム緩衝液（２モル、ｐＨ７，０） を添加して最終溶液を０．２モルにする。ナトリウムメタバーイオデート（０， ２ＸモルのＰＲＰ）を、急速に撹拌しながらすべて一度に添加する。この溶液を ４℃に一夜放置する。粗製オリゴ糖をまず３ｏ、ｏｏｏ分子量のカットオフ膜で 限外濾過して、より大きいオリゴ糖を除去し、モして濾液１０．０００分子量の カットオフの膜で限外濾過して、より小さい分子量のオリゴ糖を除去してリチン ティト（ｒｅｔｅｎ　ｔ　ａ　ｔ　ｅ）を節約する。リチンティトを生理的塩類 溶液中のバイオゲル（Ｂｉｏｇｅ　１）Ｐ−１００カラムのクロマトグラフィー にかけ、そして分画を、それぞれ、オルシノール（Ｏｒｃｉｎｏｌ）およびバー クージ璽ンソン（ｐｌｒｌ＜−Ｊｏｈｎｓｏｎ）アッセイにより、リボースおよ び還元性基について分析する。典型的には、オリゴ糖は２０の平均Ｄｐを有する 。次いで、精製したオリゴ糖を凍結乾燥し、そして−２０℃において貯蔵する。 Ｂ、Ｈｂｏ−ペプチド接合体の合成。ペプチどを無水ＤＭＳＯ中に５ｍｇ／ｍ４ の濃度で溶解する。次いで、この溶液を２Ｘモルの量の凍結乾燥したＨｂｏに添 加する。反応ｌごおいて使用したＨｂｏの量は合成すべきペプチド接合体の型に 依存してｌ×〜２×で変化させることができる：二重まｔ：は−重の末端。反応 混合物を３７℃に８いて２４時間インギュベーションし、次いで小さい体積のＤ ＭＳＯ中に溶解したＩＯＸモル（Ｈｂｏに基づいて）のホウ水素化ナトリウムを 添加する。この溶液をさらに２４４時間インキュページタン、次いでＤＭＳＯの 体積６二等しい水を添加する。過剰のホウ水素化ナトリウムを少量の酢酸と反応 させ、そして生成物を水または生理的塩類溶液中に溶解する。未反応のペプチド を大きさ排除クロマトグラフィーまたは６〜８，０００分子量のカットオフ膜を 使用する透析により除去することができる。ペプチドへのＨｂｏの接合はウェス タンプロット分析により評価しｔ二重６．４．１．、ポリアクリル−ミドゲルの １笈炊勢ニーＰＡＧ旦とＰＲＰ−ペプチド接合体を１００μｇの試料緩衝液（５ ％のＳＤＳ、０．０２５％のブロモフェノールブルー、１０′□１モルの２−Ｍ Ｅおよび２０％のグリセロールを含有する、０．２モルのトリス緩衝液）中に溶 解し、そして１００℃において５分間加熱する。はとんどの日常の分析をバイオ −ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）プロティン・ゲル系（カリフォルニア州しドモンド） を使用して実施した。ゲルは１．５ｍｍの厚さであり、そして分離ゲルは１５％ のアクリルアミド、３０：０．８のアクリルアミド対ビスの比、０．３７５モル のトリス−ＨＣｌ　　ｐＨ８，８および０．１％のＳＤＳを含有した。スタッキ ング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）ゲルは４．８％のアクリルアミド、同一の比のアクリ ルアミド対ビス、１２５ミリモルのトリス−ＨＣｌ　　ｐＨ７，０および０．１ ％のＳＤＳを含有した。 １−１０μｇの試料を含有するｌＯ〜１５μａを各レーンに適用した。 電気泳動後、ゲルをエタノール：酢酸：水（５：　ｌ　：　５）中で０．１２５ ％のクーマツシイブルーで少なくとも１時間染色し、次いで色素を含有しない同 一溶媒系中で脱染色した。染色前の分子量標準（ホスホリラーゼｂ、９２．００ ０；ウシ血清アルブミン、６９，０００；オバルプミン、４３．０００；および 炭酸アンヒドラーゼ３０，０００）を使用して、相対的分子量のタンパク質の決 定を促進した。染色しない二重反復実験のゲルをウェスタン分析に使用した。 ６．４．２．ウェスタンプロット分析 ＰＡＧＥで分離した試料を、ヘファー・トアンス７オール（Ｈｏｅｆｆｅｒ　　 Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ）装置で０．４５ミリアンペアにおいて９ｏ分間２５ミリモ ルのトリス−３８３ミリモルのグリシンｐＨ８，８中の室温において、ニトロセ ルロースの膜上に電気泳動的に移した。いったんタンパク質の移送が完結すると 、ニトロセルロースの膜をプロット（ＢＬＯＴＴＯ）（リン酸塩緩衝液中の５％ の非油脂ドライミルク）中で３７℃において１時間ソーキングした。膜を前以て 決定した濃度のＰＲＰまたはＣＲＭ　ｌｓアに対する抗体で３７℃において１時 間プロービングし、そしてプロットで３７℃において２０分間洗浄した。結合し た抗原をセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス（Ｋｉｒｋｅｇａａ ｄおよびｐｅｒｒｙ、マリイランド州）で、プロット中の１＝２５０希釈で３７ ℃において１時間で検出した。プロットをＰＢＳで洗浄（３Ｘ）Ｌ、そしてメタ ノール中の０．０１％の過酸化水素、０．０６％の４−クロロ−１−ナフトール （Ｓｉｇｍａ　　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、　ミゾリー州）を含有するＰＢＳで 室温において展開した。反応はフィルターを蒸留水に移すことによって停止し、 そしてフィルターをプロッティングにより乾燥した。 ６．４．２．久区狽 ネズミＴ細胞のプライミングのために、ジフテリアのトキソイド、ＣＲＭまたは ＣＲＭペプチドをリン酸塩緩衝化生理的塩類溶液中に溶解し、そして等しい体積 のフロイント完全アジュバント中で乳化した。マウスに最適な濃度の抗原を含有 する０、１ｍ（２の乳濁液を尾の基部に皮下投与した。最大のＴ細胞の応答は１ 週後日常的に観測された。 抗体の応答のために免疫化するために、リン酸塩緩衝化生理的塩類溶液中に懸濁 しｆ：、２．５μｇのＰＲＰ−ＣＲＭ接合体または５μｇのＰＲｐ−ペプチド接 合体を日常的にマウスに与えた。接合体を、アジュバントを使用しないで、０． １ｍ１２の体積で筋肉内に投与した。引き続く免疫化は、同一の投与量またはル ートを使用して２週の間隔で投与した。 ６．４．４．ＦＡＲＲアッセイ ＰＲＰに対する抗体を標準化したＦａｒｒラジオイムノアッセイにより決定した 。血清、血清の標準およびアッセイの対照の種々の希釈物を胎児ウシ血清中で制 振し、そして２５μＱのアリコートを、二重反復において、１．５ｍＱのエッペ ンドルフ管に移した。　［３Ｈ］　−ＰＲＰ（５０μＱ）および［”ＣＩ）−） レーサーをすべての管に添加した。 試料を撹拌し、そして４℃Ｉ：おいて一夜インキュベーシ３ンした。飽和した硫 酸アンモニウム（７５μＱ）をすべての試料に添加し、次いで試料を撹拌し、そ して４℃において４０分間インキユペーシーンした。上澄み液を注意して吸引し 、そして４００μｇの蒸留水をすべての沈澱に添加した。撹拌後、バイアルの内 容物全体およびバイアルそれ自体を１０ｍ１２のシンチレーシ璽ン流体を含有す るシンチレーシ覆ンバイアル中に入れた。激しく撹拌した後、バイアルを液体シ ンチレーシコンカウンターで計数した。ＰＲＰに結合した抗原の濃度を、既知の 標準と比較して、ＣＰＭおよび血清の希釈のプロットから計算した。 ６．４．５．ＥＬＩＳＡアッセイ ＣＲＭに対する抗体を標準のＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイにより決定した。アッセイ を実施するために、９６ウエルのポリスチレン平板を３７℃において加湿したイ ンキュベーター内で１００μａ／ウエルのＣＲＭ＋ｓｙ（炭酸化緩衝液、ｐＨ９ ，６）で−夜被覆した。ウェルを０．０５％のツイーン２０を含有するリン酸塩 緩衝化生理的塩類溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗浄（３Ｘ）Ｌ、そして０．１％のゼラ チンを含有する２００μＱ／ウエルのＰＢＳで室温において４５５分間ブロッキ ングた。ＰＢＳ−ツイーンで洗浄（２×）後、希釈剤（０，０５％のツイーン２ ０および０．１％のゼラチンを含有するＰＢＳ）で希釈した１００μａ／ウエル の血清を添加した。平板を室温において９０分間インキュベージ１ンし、次いで ＰＢＳ−ツイーンで洗浄（３Ｘ）した、希釈剤中の二次抗体（１００μｍ２／ウ エルのヤギ−マウスアルカリ性ホスファターゼ接合体のｌ：１０００希釈物）を 添加し、室温において６０分間インキユベーシーンし、そしてＰＢＳ−ツイーン で洗浄（３Ｘ）した。基質（１００μＱ／ウエルのｐ−ニトロ７ニニルホスフエ ー）、ＭｇＣｌ□Ｘ６Ｈ□ｏｔ−含有するジェタノールアミンｐＨ９，８）を添 加し、そして室温において６０分間インキュベージ■ンし、次いで反応を１５０ μｍ２／ウエルの２モルの水酸化ナトリウムの添加により停止した。４１０ｎｍ および６９０ｎｍにおける光学密度を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ３１０オートリーダーで 読んだ。 ６．４．６．免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスの決定ＰＲＰに対して特 異的な抗体のクラスおよびサブクラスをＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイにより決定した 。ポリスチレンの９６ウエルの平板をＰＢＳ中のＰＲＰ−チラミンの１／２００ ０希釈物で被覆した。抗原（１００μａ／ウエノリを３７℃において９０分間イ ンキュベーションし、そして室温において６０分間２００μＱ／ウエルの０．１ ％のゼラチンを含有するＰＢＳとともにインキュベーションしてブロッキングし た。ＰＢＳで洗浄（２Ｘ）後、希釈剤（０，０５％のツイーン２０および０．１ ％のゼラチンを含有するＰＢＳ）中で希釈した５０μａの試験血清を添加し、平 板を２時間室温においてインキュベーションし、次いで０．１％のツイーン２０ を含有するＰＢＳで自動的に洗浄した。ウェルに、１００ｐＱ／ウエルのヤギま ｔ；はウサギ抗マウス免疫グロブリン（特異的クラスまたはサブクラス）アルカ リ性ホスファターゼ接合体を室温Ｉ：おいて２時間添加した。平板を前述のよう に自動的に洗浄した。ウェルに、２００μＱの基質（ｐ−二トロフェニルホスフ ェート、ＭｇＣ１，Ｘ６Ｈ２０を含有するジェタノールアミン中のｐＨ９，８１ ｍｇ／ｍＱ）を添加し、そして室温において６０分間インキュベージコンした。 （しかしながら、抗血清接合体の入手可能性に依存して、他の酵素−基質の組み 合わせを使用することができる。）反応を５０ｐＱ／ウエルの２モルの水酸化ナ トリウムの添加より停止した。４１０ｎｍ８よび６９０ｎｍにおける光学密度を 、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ３１０オートリーダーで読んだ。 ６．５．破傷風の毒素の断片の　生 破傷風のエキソトキシンを、０．１モルのＤＴＴおよび２％のＳＤＳを含有する 試料緩衝液中で、１００℃に５分間加熱し、次いで５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。 破傷風の毒素のＨおよびＬ鎖を表す、タンパク質の２つの主なバンドをＳＤＳゲ ルから切断し、そして５０ｍｍのＮＨ＋ＣＯｓ、０．２％のＳＤＳおよび１ｍｍ のＤＴＴ　　ｐＨ８，２中で２５ボルトで３時間電気溶離することによって抽出 した。電気溶離後、材料を凍結乾燥し、次いでＴ細胞増殖アッセイ直前に再構成 した。Ｃ断片はカルバイオケム（ｃａ　Ｉ　ｂ　Ｉｏｃｈｅｍｓカリフォルニア 州）から商業的に入手した。 ネズミＴ細胞の誘発にとくに活性であることが発見されたタンパク質断片を、Ｔ 細胞のエピトープをさらに定めるために、タンパク質分解消化シタ。０．１２５ モルのトリス−ＨＣｌ、０　、０５　モ４ノＤＴＴ、　　０　。 ５％のＳＤＳおよび１０％のグリセロールから構成された消化系ｐＨ７゜０を使 用して、タンパク質断片を、３７℃において３０分間、６７μｇ／ｍ（ｌのキモ トリプシン、５μｇ／ｍｌｌのプロナーゼ、３μｇ／ｍ（ｌのフィチン、０，４ μｇ／ｍ（ｌのスブチリシンまたは６２．５μｇ　／　ｍ　Ｑのプロテアーゼｖ ８のいずれかとともにインキュページ鯉ンした。この方法において発生したペプ チドを、逆相ＨＰＬＣによりバイダク（Ｖｙｄａｃ）Ｃ４カラムを使用して分離 することができる。次いで、分離した断片をＴｅａを刺激する能力について試験 することができる。 潜在的両親媒性領域の突起のためのデリシ（ＤｅＬｉｓｉ）およびベルシフスキ ー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｉ）のアルゴリズム（ＰＮＡＳ、８２　ニア８４８．１９ ８５）を、第１の概算としてＣＲＭの一次配列に適用した０分子のコンピュータ ーの分析は、第１図に示すように、タンパク質的に６つの領域を明らかにし、こ れは可能なＴ細胞のエピトープについての基準を満足する。これらの領域は残基 １−１７．１１２−１３５．２２９−２５６．３０６−３３４．３５７−３８０ および３８６−４０８として同定された。これらの領域の各々は最小７の連続す る残基から構成されており、これらは、タンパク質の一次配列に関して検査する と、アルファらせん構造を形成する。さらに、領域１５８−１７３は、また、陰 性の対照材料として選択した。なぜなら、コンピュータープログラムから、アル ファらせん構造を形成することが期待されなかったからである。したがって、こ れらのペプチドはＣＲＭ内のＴ細胞のエピトープを描写するｔ；めの最初の研究 の焦点であった。 ６．６．２．合成ペプチドの分析 それらのアミノ酸配列をもつ合成ＣＲＭペプチドは表１に列挙されている。前述 しｌ；ように、オーバーラッピングするペプチドの異なる組は固相のアプローチ による余分のアミノ酸残基のＮ末端の末端への付加により発生した。 表１は、まＩ；、各合成ペプチドについての平均の段階的カップリングの効率を 提供する。すべての場合において、平均の効率は９９％を越えた。段階的カップ リングび効率に基づいて、合成の累積理論的収率をまた計算しＩ；；この理論的 値の収率％は合成の完結時の正しいアミノ酸配列を有するペプチドの収率％を示 す。表１の最後の欄は、逆相ＨＰＬＣ分析により決定した粗製ペプチド混合物の 純度を示す。粗製の合成材料（ペプチド６）の典型的なＨＰＬＣ分析を、第２Ａ 図に示す。ペプチドは２５．８分における主要なピークとして溶離され、そして 合計区域の６６％の量であった。この材料の分画を集め、濃縮し、そして第２Ｂ 図に描写するようｌこ再クロマトグラフィーにかけた。生ずるクロマトグラムは ９５％またはそれより大きい純度を示しｔ；。すべての場合において、９５％よ り小さい純度を有する粗製ペプチド材料（表１）は、ｌまたは２以上の追加のＨ ＰＬＣ展開にかけて、最終の均質な生成物を得た。 合成ペプチドの正しい配列は、表１に示すように、直接のアミノ酸配列決定によ り評価した。実施例に例示するように、第３図はＴＦＡ処理したガラス繊維のデ ィスク上にスポツティングした０、５ナノモルのＨＰＬＣ精製したペプチド６か ら、単一の文字の略字で、ＰＴＨ−誘導体の選択したクロマトグラムを示す。数 字はエドマンサイクルに相当する；ピークａおよびｂは、それぞれ、Ｎ、Ｎ″− ジメチル−Ｎ′−フェニルチオメ素８よびＮ、Ｎ’−ジフェニルチオ深索であり 、これらはエドマン反応から生ずる副生物である。ＰＴＨのクロマトグラムの各 々は、最大の同定されｔ；アミノ酸ピークに対して一定の割合で決定した。期待 するように、バックグラウンドの「ノイズ」のレベルはより高いサイクル数に８ いて増加しｆ−、それにもかかわらず、示しｔ；サイクルについてのアミノ酸ピ ークの割り当ては既知の配列と一致したく表１）。各サイクルについての「ブレ ビｚ−（ｐｒｅｖｉｅｗ）Ｊ残基（Ｋｅｎｔ酢酸エチル、１９８２）の検査は、 また、欠失ペプチドの不存在を示唆した；こうして、最終生成物の均質性を支持 する。 ６．６．３．ＰＲＰ−ペプチド接合体のウェスタンプロット分析種々のペプチド へのＰＲＰの共有結合のカップリングを、ＰＲＰについて特異的な七ツクローナ ル抗体を使用するウェスタンプロット分析により定性的に評価した。第４図に示 すように、検査したすべてのペプチド接合体（Ｐ　ＲＰ、ペプチド３５７−３８ ０）；ＰＲＰ、ペプチド３０６−３３４　；およびＰＲＰ短い、ペプチド３６６ −３８３）は、明白な、分子量の広い連続の範囲から成ることが発見された。あ る材料は積み重なったゲル中に保持される。ペプチド接合体のパターンは、ＰＲ Ｐ−ＣＲＭのそれに非常に類似する。対照的ｌこ、転移の時ニトロセルロースに 付着することが期待されない、ＰＲＰ単独は検出することができなかった。した がって、これが示唆するように、検出されたバンドは、ニトロセルロースへ結合 したタンパク質またはペプチドに共有結合でカップリングしたＦ’ＲＰを表す。 これらの接合体の広いバンドは、種々のオリゴ糖種によるペプチドのグリコジル 化のためでありうる。 ６．６．４゜ネズミＴ細胞についての免疫原性ペプチドＣＲＭの予測した領域が 、事実、Ｔｍ胞の増殖の応答を誘発することができるかどうかを実験的に評価す る！こめに、これらのペプチドに対するＤＴプライムドリンパ節細胞の応答を検 査した。表２に示すように、ＤＴ−免疫マウスから得られたリンパ節細胞は、期 待するように、ＤＴおよびＣＲＭに対して特異的に応答したが、ＴＴに対して応 答しなかった。さらに、これらの細胞は、また、推定上のＴｗｉ胞のエピトープ の１つ、詳しくは領域３５７−３８０による生体外対抗に対して実質的な応答を 発生した。領域３０６−３３４および３８６−４０８に対する限界の応答は、ま た、観測された。領域１５８−１７３、陰性の対照のペプチド、まｔ；は無関係 のＲ５Ｖペプチドに対する応答は認められなかった。 さらに、細胞は両者のＴ細胞のミトゲンに対して適当に応答した。 表２ ＤＴ　　　　　　　　　　　６４．０５５±４．５７２　　　　　１０ＣＲＭ　 　　　　　　　　　　５１．２５８±１．２６２　　　　１００ＣＲＭ（１００ ＣＲ２７４±２８５０ ＣＲＭ（１１２−１３５）　　　　　　　　　０　　　　　　　　５ＣＲＭ（１ ５８−１７３）　　　　　　　　　４７±６　　　　　　１００ＣＲＭ（２２９ １００ＣＲ８３３±１１３　　　　　１００ＣＲＭ（３０６１００ＣＲ１、１０ ０±１９７１ＣＲＭ（３５７−３８０）　　　　　　　１２．２３２±２３１　 　　　　１００ＣＲＭ（３８６１００ＣＲ２，４７８±３３　　　　　　１Ｃｏ ｎ＾　　　　　　　　　５９，０９２±２．３４４　　　　　１ＬＰＳ　　　　 　　　　　　　６０．５２９±５．１３５　　　　１００バツクグラウンド（Ｃ ＰＭとして）　　１．３１９第２６９“　マウスをフロイント完全アジュバント 中で乳化した５０μｇのＤＴの最適な濃度で免疫化した。 １　培養物を広い範囲（０，０５〜１００μｇ　／　ｍα）のタンパク質または ペプチドで対抗した。最大の観測された応答のみを示す。 Ｃｏｎ　　ＡおよびＢ細胞ミトゲン、リポ多糖（Ｌ　Ｐ　Ｓ）。したがって、コ ンピューター分析により同定された６つの潜在的Ｔ細胞エピトープのうち、領域 ３５７−３８０のみが使用したネズミのモデルにおいてＴ細胞の応答を刺激する ことができた。 別のカップリングの化学の可能性を検査するために、ＣＲＭＴ細胞エピトープ３ ６６−３８３の修飾した類似体を調製した。修飾は、スペーサー要素を使用しで あるいは使用しないで、ペプチドのＮ末端へのりジンまｔ；はシスティンの付加 を包含した。次いで、ネズミＴ細胞を刺激する類似体の能力を、非修飾ペプチド のそれと比較した。 Ｔｍ胞刺激のアッセイの結果を表３に示す。この研究において、ＣＲＭペプチド ３６６−３８３の類似体は、３６６−３８３それ自体と比較して、ＤＴまたはＣ ＲＭ＋＊ｔプライムドＴ細胞を刺激する能力の大部分を保持したことが示された 。こうして、Ｔ細胞エピトープに、Ｔ細胞活性を刺激するその能力を障害しない で、有意の変化を行うことができる。 実証するように、これらの修飾は、改良されたカップリングの目的（示した例は より効率よいカップリングのために６−アミノ基を提供する）、異なるカップリ ングの技術へのアクセスを提供する目的（示した例はシスティン残基を提供する ）、あるいは反応性を改良するため（示さず）であることができる。これらの修 飾は、Ｂ細胞エピトープの広い範囲の接合を可能とすることによって、ペプチド の実用性を拡張する。 表３ Ｔ細胞の認識へのＣＲＭペプチド３６６−３８３の修飾の効果ＤＴ　　　　　　 　　　　　　　　８１．８２５　　　　　３１．３４８ＣＲＭ　　　　　　　　 　　　　　６３．３４８　　　　　８８．００９ＴＴ　　　　　　　　　　　　 　　　８０４　　　　　　　　０ＣＲＭペプチド １５７−１７３　　　　　　　　　　　１．９３５　　　　　　１．１４７３５ ７−３８３　　　　　　　　　　　２３．０４７　　　　　１６，００９３６６ −３８３　　　　　　　　　　　４３．２６３　　　　　２２．７２２３６９− ３８３　　　　　　　　　　　４０．４８９　　　　　　２８．１９８修飾ＣＲ Ｍペプチド Ｌ−（３６６−３８３）　　　　　　　　　３５，２０２　　　　　２６．７０ ５ＬＧ−（３６６−３８３）　　　　　　　　　３３．３５４　　　　　２２． ８５２ＣＧ−（３６６−３８３）　　　　　　　　　４６．２４１　　　　　２ ６．３３７Ｒ５Ｖペプチド　　　　　　　　　　１．７２６　　　　　　　　０ ミトゲン Ｃｏｎ　Ａ　　　　　　　　　　　　　４２．０１７　　　　　　３４．１１７ ＬＰＳ　　　　　　　　　　　　　　５７．１４３　　　　　　４０．５２０パ ツクグラウンド 培地（ｃｐｍとして）　　　　　　　　１，５３７　　　　　　１．２１０６． ６．６．ヒトＴ細胞についての免疫原性ペプチドのプロフィル推定上のＴＮｉ胞 エピトープに対するネズミＴ細胞の応答を検査することに加えて、ペプチドの応 答のプロフィルまたは焼入かのヒトのボランティアからの末梢血液の白血球を検 査した。個体を不規則に選択し、そしてアッセイの前に故意に免疫化しなかった 。したがって、ＤＴに対する応答は、個体の歴史の結果としておよびそれらの独 特の遺伝子組成に基づいて変化することが期待された。４つの個体のうちの２つ はＤＴまたはＣＲＭに対して非常に低い応答を生成し、そしてまた、いずれのペ プチドに対しても応答せず（データは示されていない）、ペプチドはミトゲン、 非抗原特異的活性を欠くことが実証された。表４に示すように、残りの個体はＤ ｔ、ＣＲＭＩ；よびＴＴＩ：対して実質的に応答し、モして０１Ｍペプチドの各 々による生体外対抗に対する応答を変化する程度で生成した。両者の個体におけ る一定した陽性の応答は、ペプチド３０６−３３４．３５７−３８３および３８ ６−４０８で認められた。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、ヒトＴ細胞ミトゲ ンに対する陽性の応答は、また、認められた。 ＣＲＭのコンピューター投影した両極性領域に対するヒト末梢血液白血球の応答 群　　　　　　　　　［３Ｈ］−チミジン組み込み、ＩｃＰＭ±ＳＤとしてＤＴ 　　　　　　　　　２４４，７７６±２，８８９（１０）　　　　　８８．５９ ５±８．６３５　（１０）ＣＲＭ　　　　　　　　　１８６，０７６±２１，２ ０８（５）　　　　１００，９３８±１２．８０５　（５）ＴＴ　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　３８，９＋７±６，９１１　　（５）　　　　　　　 　１４３．９５５±１３．５０２（２０j ペプチド ＣＲＭ（１−１７）　　　　　　　　　　　１８．３２９±４０３　　　（ｔｏ ｏ）　　　　　　　　　６，９３２±２７８　　　　（ｔｏj ＣＲＭ（１１２−１３５）　　　　　　　１０，９９０±１，８９５（１００） 　　　　　　　　８．５０５±２１４　　　　（１０）ＣＲＩＪ（１５８−１７ ３）　　　　　　　　　１，３２４±８３　　　　（１００）　　　　　　　　 　５，３４６±２，０５２　　　（T） ＣＲＭ（２２９−２５６）　　　　　　　　６，８０３±１，７５３　　（５０ ）　　　　　　　　６．１１１±３７９　　　　（１０）ＣＲＭ（３０６−３３ ４）　　　　７．９７４±１，１９４（１００）　　　　１８．０２３±７３３ 　　（１０）ＣＲＭ（３５７−３８０）　　　　　　　１０，３５１±１，０７ ７（１００）　　　　　　　１３，００４±８８１　　　　（１００）ＣＲＭ（ ３８６−４０８）　　　　１４，１６０±６５３　　（１００）　　　　２３， ３３７±３．５３１　　（１０）Ｒ５Ｖペプチド　　　　　　０　　　　　（５ ）　　　　　５．２０１±１．０７９　　（５）ミトゲン ＰＨＡ　、　　　　　　　　　　　　　　　１６１．９５６±９，２６７　　　 （５）　　　　　　　３７，８８１±３．２９３　　　　（T） パックグラウンド　２．０２４±７９　　　　　　　　Ｌ６９４土１，７７８（ 廿Ｍ上りｒ、＞、、−一、、、　　−、、、−一、、−−−−、−、−−一、　 、、−−−−−−−、−一−、−−、−°　培養物はタンパク質またはペプチド の広い範囲（０，０５〜１００μｇ／ｍＱ）で対抗しＩ；。最大の観測された応 答のみを示す。 ６．６．７．抗ペプチドＴ細胞の応等 ＣＲＭの領域３５７−３８０は子細胞エピトープとしてＤｔ−プライムドＴ細胞 により認識されることが実証されたので、ペプチドそれ自体が有効なミトゲンで あるか否かを決定することは不必要であった。したがって、ＳＪＬマウスを１０ ０μｇのＣＲＭ　（３５７−３８０）または５０μｇのＤＴまたはＣＲＭで免疫 化した。追加の群のマウスに、別のペプチドとして１００μｇのＣＲＭ　（３０ ６−３３４）を与えて、応答の特異性を実証した。表５に示すように、ＤＴで免 疫化したマウスからの子細胞はＤＴ、ＣＲＭおよびペプチドＣＲＭ　（３５７− ３８０）に対して期待するように応答した。反応性の同様なパターンはＣＲＭで 免疫化したマウスからの細胞を使用して観測されたが、ＣＲＭおよびペプチドに 対する応答は実質的により高かった。興味あることには、ＣＲＭ　（３５７−３ ８０）プライムド細胞は、ＣＲＭによる対抗に対して特異的に応答し、ならびに ＣＲＭタンパク質と交差反応した。対照的に、ＣＲＭ（３５７−３８０）プライ ムド細胞は、検査したタンパク質のいずれによる生体外対抗に対する有意の応答 を生成せず、そして免疫化ペプチド３０６−３３４それ自体による対抗に対して 弱くのみ応答性であった。 しかしながら、細胞のすべては、事実、ＣｏｎＡおよびＬＰＳの両者に対して適 当に応答した。明らかなように、領域３５７−３８０は自然タンパク質でプライ ミングされた細胞により認識されるのでＣＲＭの子細胞決定基であるばかりでな く、かつまた自然タンパク質を認識することができる抗ペプチドＴ細胞を誘発す ることができる。 ＳＪＬマウスにおいてペプチドまたはタンパク質のプライミング後の子細胞の応 答 ［３Ｈ１−チミジン組み込み、ΔＣＰＩＪ±ＳＤとして生体外対抗 プライミング抗原 培地　　　　　　　１，０４８±２３６　　　５７０±１３　　　１，３３３± ６７１　　　２．０５８±３０６タンパク質 ＤＴ　　　　　　　５１．１３６±４．８４４　　　０　　　　１．８５７±４ ８６　　３８．１６６±３．７０１ＣＲＭ　　　　　　　４８，０３３±２．９ ９０　　　０　　　　１１．４６０±９２４　　１４４．４０１±１２，６８８ ＴＴ　　　　　　　　　　Ｏ００４３４±７２ペプチド ＣＲＭ（３０６−３３４）　　　　　０　　　　１，０５１±１８３　　　　０ 　　　　　　　０ＣＲＭ（３５７−３８０）　　　５．２０６±６９７　　　　 ０　　　　２５．１４０±２．５８２　１７．８５６±３５ＣＲＭ（１５８−１ ７３）　　　　　　　３８６±６６　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　 　　　　０　　　　　　　　　　１．３R５±３８７ ＲＳＶペプチド　　　　　０　　　　　　０　　　　　　０　　　　　　０ミト ゲン Ｃｏｎ　Ａ　　　　　　６６．３１５ｔ５，４９１　６９．８５１±２．７８６ 　６９．７６２±１．２５５　４９．３７１±３，５６４ＬＰＳ　　　　　　　 　　　　　　７０，０１８±２．０３４　　５３，２３６±１．６３３　　５５ ．９８９±３．１３３　　６６．１７V±１．８８８ “　マウスは、７０インド完全アジユバント中で乳化した、５０μｇのタンパク 質、ＤＴまたはＣＲＭ、あるいは１００μｇのペプチド、ＣＲＭ　（３０６−３ ３７）またはＣＲＭ　（３５７−３８０）で免疫化した。 １　培養物はタンパク質またはペプチドの広い範囲（０，０５〜１１００ｐ／ｍ Ｒ）で対抗した。最大の観測された応答のみを示す。 ６．６．８．子細胞の境界の細分 子細胞の応答を引き出すために必要な領域３５７−３８０内の最小配列を定める ために、Ｎ末端が変化する１組のペプチドを合成した。さらに、完全な子細胞エ ピトープはこの組のペプチド内に存在することを確証するために、Ｃ末端を活性 ペプチド３５７−３８０の境界を４残基越えた残基３８４において確立した。し たがって、次のペプチドを調製し、そして子細胞の活性についてアッセイした： ３５７−３８３．３８２−３８３．３６６−３８３．３７２−３８３および３７ ３−３８３゜表６に示すように、ＤＴまたはＣＲＭでプライミングしたマウスは 同様にペプチド３５７−３８０またはペプチド３５７−３８３に対して応答した が、３５７−３８３に対する応答はわずかにより高かった。より短いペプチド３ ６２−３８３はＤＴプライムドＴ細胞の刺激において同等であったが、ＣＲＭプ ライムドＴ細胞の刺激においてより長いペプチドより有効であった。興味あるこ とには、４つの残基を除去すると、ペプチド３６６−３８３は′ｒ細胞の認識に ついて劇的な効果を有した。両者のＤＴおよびＣＲＭプライムドＴ細胞では、大 きく増加した応答がこのペプチドによる生体外対抗の時観測された。ペプチド３ ７２−３８３および３７３−３８３で示すように、追加の残基を除去すると、Ｄ ＴおよびＣＲＭプライムド細胞の両者における子細胞の応答は減少した。さらに 、細胞の両者の群はＤＴ、ＣＲＭおよびミトゲンに対して適当に応答した。 この領域内のエピトープをさらに定めるために、２組のペプチドを合成した。ペ プチドの１組は残基３８３で固定したＣ末端をもつｌ系列のペプチドから成って いたが、Ｎ末端は残基３５７から残基３７３へ段階的に変化しＩ；。第２組のペ プチドは残基３６６においてＮ末端を維持したが、Ｃ末端は残基３７５から３８ ３に段階的に変化した。両者の組のペプチドはＴ細胞の増殖によりアッセイした 。 ３つの個々の実験を実施して、同様な結果が得られた。代表的な実験は表７に表 されている。Ｎ末端のマツピングにおいて、匹敵するＴ細胞の活性は、両者のＤ ＴおよびＣＲＭプライムド群において内包的ペプチドのサブセット３５７−３８ ３〜３７０−３８３で見られた。Ｎ末端残基３７１，３７２または３７３の欠失 は、Ｔ細胞の活性を顕著に減少させた。この観察が強く示唆するように、Ｔ細胞 エビドーグのＮ末端の境界は残基３６９または３７０である。Ｃ末端を解明する 試みにおいて、結果は最大のＴ細胞の活性はペプチド３６６−３８３で得られる ことを示した。Ｃ末端残基のいずれの欠失もＴ細胞の活性を減少した。この発見 が示唆するように、エピトープのＣ末端は残基３８３またはそれを越えたところ に存在する。これらの残基によりマツピングするとさ、Ｔ細胞エピトープはＣＲ Ｍ　ｒ　＊アの３６９　（３７０）−３８３に局在化される。 表６ ＣＲＭの領域３５７−３８３内のペプチドのネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）組に対 するタンパク質−プライムドＳＪＬマウスのＴ細胞の応答［”Ｈ］−チミジン組 み込み、ΔＣＰＭ±ＳＤとして（投与量、μｇ／ｄ） 生体外対抗 プライミング：　　　　ＤＴ　　　　　　　　　　ＣＲＭタンパク質 ＤＴ　　　　　　　　　　　４６．７０１±１．４３９　（１０）　　３４，０ ２７±３．６５９　　（ｔｏ）ＣＲＭ　　　　　　　　　　　９９，９３３±２ ．５８１（２００）　　１７７．４４０±４，２７８　（１００）ＰＲＰ−ＣＲ Ｍ　　　　　　　　　　　　　　　　　　５４．６４４±８８５　　　（１００ ）　　　１２６．７００±１０．４０２（２０O） ＴＴ　　　　　　　　　　　　　　Ｏ（２００）　　　　４０５±３１　　　　 （５）ペプチド ＣＲＭ（３５７−３８０）　　　　　　　　　　　　　　　２．８８５±８９　 　　　　（５０）　　　　１０．４０１±６２２　　　　（Q００） ＣＲＭ（３５７−３８３）　　　　　　　　　　　　　　　６．６３７土２０２ 　　　　（５０）　　　　１３．４１１±４５１　　　　　i５０） ＣＲＭＣ３６２−３８３＞　　　　　　　　　　　　　　　６．２２２±１．４ ３２（０，１）　　　　１９．６７３±２４９　　　　　（P０） Ｃ１２Ｍ（３６６−３８３）　　　　　　　　　　　　３２．１５４±１．６１ ５（２００）　　　　３６，７３２±５８０　　　　　（５O） ＣＲＭ（３７２−３８３）　　　　　　　　３　、９９６±９３１　　　（５） 　　１０．６６１±７０７　　（２００）ＣＲＭ（３７３−３８３）　　　　　 　　　　　　　　　　　　　８７６土６６　　　　　　（５）　　　　　８．６ ３７±１．６４４　　@（５０） ＣＲＭ（３０６−３３４）　　　　　　　　　６７４±８　　　（０，１）　　 　４．８３８±５４７　　　（５）ＣＲＭ（１５１３−１７３）　　　　　　　 　　４２１±９　　　（１００）　　　５．００７±１，０１６　（２００）Ｒ ＳＶペプチド　　　　　　　　　　０　　　　（１００）　　　４．５５７＋３ １４　　　（５）ミトゲン Ｃｏｎ　Ａ　　　　　　　　　　　４１．９８９±３，２０６　　（１）　　４ ８．８１９±３．３２３　　（１）ＬＰＳ　　　　　　　　　　　　６１．２７ ７±４．４７７　（５０）　　５９．７０５±１，２０７　　（５０）パックグ ラウンド　　　　１．６６１±４１９　　−　　　６９６±５７ＣＣＰＭとして ） １　マウスは、７０インド完全アジユバント中で乳化した、最適な濃度の５０μ ｇのＤＴまたはＣＲＭで免疫化しｔ；。 ゝ　培養物を広い範囲（０，１〜２００μｇ／ｍＱ）のタンパク質またはペプチ ドで対抗した。最大の観測された応答のみを示す。 素ヱ ジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ−プライムドからのリンパ節細胞を使用する ＣＲＭの領域３５７−３８３内のＴｍＦＩ！Ｊ決定基のＮ末端およびＣ末端の境 界のマツピング ［”Ｈ］−チミジン組み込み、ΔＣＰＩＪ４ＳＤとして生体外対抗 ＤＴ−プライムド　ＣＲＭ−プライムド対照として使用したタンパク質 ジフテリアトキソイド　　　　　　　１０９，５３４　　　　５１．６３２ＣＲ Ｍ　　　　　　　　　　　　　　　　９７．００２　　　　１５９．６６３破傷 風の青票　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　１．３４７Ｎ末端のマツピ ングのために使用したＣＲＭペプチド：ＣＲＭ（３５７−３８３）　　　　　　 　　　　　　　４３．５７７　　　　　４１．６４１ＣＲＭ（３６２−３８３） 　　　　　　　　　　　　　３５．７８５　　　　　４６．６３７ＣＲＭ（３６ ６−３８３）　　　　　　　　　　　　　５７，０８１　　　　　４４．４０３ ＣＲＭ（３６７−３８３）　　　　　　　　　　　　　５５．６２４　　　　　 ４８．５８９ＣＲＭ（３６８−３８３）　　　　　　　　　　　　　５０，５４ ３　　　　　６３．７１８ＣＲＭ（３６９−３８３）　　　　　　　　　　　　 　５４．３５４　　　　　６１．９４１ＣＲＭ（３７０−３８３）　　　　　　 　　　　　　　７３．４６１　　　　　６４．３２０ＣＲＭ（３７１−３８３） 　　　　　　　　　　　　　３０．９８０　　　　　４７．４１１ＣＲＭ（３７ ２−３８３）　　　　　　　　　　　　　］　７．４６０　　　　　２４．３４ ３ＣＲＭ（３７３−３８３）　　　　　　　　　　　　　４．１７８　　　　　 ２．５９８表７　続き Ｃ末端のマツピングのｔ；めに使用したＣＲＭペプチド：ＣＲＭ（３６δ−３８ １）−Ｇｌｙ　　　　　　　　　４３，４２９　　　　　３９．９８３ｃＲＭ（ ３６６−３７９）−Ｇ　ｌｙ　　　　　　　　　３１．２６５　　　　　３６　 、３７０ＣＲＭ（３６６−３７７）−Ｇｌｙ　　　　　　　　　１５，０７３　 　　　　２０．０２３ＣＲＭ（３６６−３７５）−Ｇｌｙ　　　　　　　　　　 ６，３３３　　　　　　６．３２６対照として使用したＣＲＭペプチド＝ ＣＲＭ（１５８−１７３）　　　　　　　　　　　　　５９０　　　　　　　７ ３３ＣＲＭ（３０６−３３４）　　　　　　　　　　　　３．４３５　　　　　 　１．１５１対照として使用した無関係のペプチド：ＲＳＶ　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　０　　　　　　１，４０９ミトゲン ＣＯＮ　Ａ　　　　　　　　　　　　　　　３２．９５２　　　　　　４５，７ ７１ＬＰＳ　　　　　　　　　　　　　　　　６５．７６５　　　　　　６７． １００バツクグラウンド（ＣＰＭとして）　　　　　２．５０１　　　　　　２ ．００７６．７．ペプチド接合により誘発された抗ＰＲＰおよび抗ＣＲＭの応Ｃ ＲＭ内にＴ細胞認識の決定基が予備的に局在化されると、輪郭を描写されｔ；領 域がＰＲＰについて有効な担体分子として働くか否かを決定することは必要であ った。さらに、担体タンパク質へのタンパク質、ＤＴｌへの予備暴露がＰＲＰ接 合体の認識を変更するかどうかを決定することは、また、興味あることである。 したがって、マウスを７０インド化した。１週後、動物の群をＰＲＰ接合体で免 疫化した。！２接合体の免疫化は、２週の間隔後、投与した。これらの動物にお いて誘発されたＰＲＰに対する抗体の応答は、表８に描写されている。ＤＴまｔ ；は生理的塩類溶液で前置て処置された、それらの動物の両者のＰＲＰ−ＣＲＭ および、有意に、ＰＲＰ−（３５７−３８０）の免疫化後、ＰＲＰに対する予備 的（第２１日に示された）を検出した。調製に対する抗体がこれらの群の両者に おいて明らかであったので、ＤＴへの予備暴露は抗体の応答の発生基＝明らかに 影響を及ぼさなかった。むしろ、ＰＲＰ−（３５７−３８０）は、それ自体、大 きさがＰＲＰ−ＣＲＭにより誘発される応答に非常に類似する一次の応答を誘発 するために十分であった。ＰＲＰに対する二次応答は、また、ＰＲＰ−ＣＲＭお よびＰＲＰ−（３５７−３８０）の免疫化後、検出された。これらの結果が明瞭 に示すように、ＰＲＰおよび合成ペプチドから構成された接合体ワクチンはＰＲ Ｐに対する抗体を誘発することができる。 表８ ジフテリアトキソイドプライムドマウスにおけるＰＲＰ−ＣＲＭ接合体ワクチン またはＰＲＰ−ＣＲＭペプチド接合体に対する抗体の応答免疫化の日　ＰＲＰに 対する抗体（μｇ／ＩＩＩａ）、日１ＤＴＰＲＰ−ＣＲＭ　　　　　　　ＰＲＰ −ＣＲＭ　　　　　　　＜０．１０　　　２，９４　　　８．４０　　　８．７ ２　　　４．５８ＤＴ　　ＰＲＰ−（３５７−３８３）ＰＰＰ−（３５７−３８ ３）＜０．１０　　　３．２９　　　１．３９　　　６．４９　　　８．４３Ｄ Ｔ　　ＰＲＰ−（３０６−３３４）　　ＰＰＰ−（３０６−３３４）　　＜０． １０　　　＜０．１０　　　５．９５　　　＜０．１０　@　＜０．１０ ＤＴ　　ＰＰＰ−（２２９−２５６）ＰＰＰ−（２２９−２５６）　　＜０．１ ０　　　＜０．１０　　　＜０．１０　　　＜０．１０　　@＜０．１０ ＤＴＰＲＰ−ＲＳＶ　　　　　　　　ＰＲＰ−ＲＳＶ　　　　　　　　＜０．１ ０　　　＜０．１０　　　＜０．１０　　　＜０．１０　　@＜０．１０ ＴＴＰＲＰ−ＣＲＭ　　　　　　　　ＰＲＰ−ＣＲＭ　　　　　　　　＜０．１ ０　　　０．４３　　　５．０２　　　４．０５　　　１．O３ ＴＴ　ＰＲＰ−（３５７−３８３）　ＰＰＰ−（３５７−３８３）　＜０．１０ 　　＜０．１０　２．０８　２．８７　３．４５ＴＴ　　Ｐ１１？Ｐ−（３０６ −３３４）ＰＰＰ−（３０６−３３４）　　＜０．１０　　　＜０．１０　　　 ＜０．１０　　　＜０．１０@　　＜０．１０ ＴＴ　　ＰＲＰ−（２２９−２５６）ＰＰＰ−（２２９−２５６）　　＜０．１ ０　　　＜０．１０　　　０．１６　　　＜０．１０　　　モO．１０ ＴＴ　　ＰＲＰ−ＲＳＶ　　　　　　　　ＰＲＰ−１？ｓＶ　　　　　　　　＜ ０．１０　　　（０，１０＜０．１０　　　＜０．１０　　@＜０．１１ ０５ＡＰＲＰ−ＣＲＰＲＰ−ＣＲＭ　　　　　Ｏ，２４３，８５１１，４６９， ３２１０，７７ＳＡ　ＰＲＰ−（３５７−３８３）　ＰＰＰ−（３５７−３８３ ）　＜０．１０　２．３２　３．８９　３．８５　４．１７ＳＡ　　ＰＲＰ−（ ３０６−３３４）ＰＰＰ−（３０６−３３４）＜０．１０　　　＜０．１０　　 　＜０．１０　　　＜０．１０　　　＜O．１０ ＳＡ　　ＰＲＰ−（２２９−２５６）ＰＰＰ−（２２９−２５６）　　＜０．１ ０　　　＜０．１０　　　０．３１　　　０．２１　　　０D２９ ＳＡＰＲＰ−ＲＳＶ　　　　　　　　ＰＲＰ−ＲＳＶ　　　　　　　　＜０．１ ０＜０．１０　　　０．２２　　　０．２２　　　０．２８“　マウスは、フロ イント完全アジュバント中で乳化しＩ；、最適な濃度の５０μｇのＤＴで免疫化 し、引き統いて週１および週３において生理的塩類溶液中のペプチド（５μｇ） またはタンパク質（２，５μｇ）接合体ワクチンで対抗した。 ゝ　ＤＴで免疫化後、７．２Ｌ　３２，４２および４９日において個々のマウス から血清を集めた。次いで、所定の領域内の血清試料を放射能イムノアッセイの ためにプールした。 ＰＲＰに対する二次応答を、また、ＰＲＰ−（３０６−３３４）で免疫化後、観 測した。この領域はコンピューター分析によりＴ細胞エピトープを含有すること が投影されたことを思い起こすと、なお、ジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ、 、、でブライミングした動物から得られたＴ細胞を刺激する最小の能力が実証さ れた。さらに、このペプチドは抗ペプチド応答のためのプライミングにおいて有 効ではなかった。互換的に、第５図に示すように、ＰＲＰ−（３０６−３３４） で免疫化後の応答はトキソイド、ＤＴへの予備暴露した動物において誘発された 。集合的に、ＣＲＭペプチド３０６−３３４はＰＰＰのための担体分子として有 用であることが実証された。標準の増殖のアッセイはこの領域がＴ細胞エピトー プであることを説得的に示さなかったが、完全なタンパク質への暴露前の陽性の 影響を示すこれらの実験は、この領域が事実Ｔ細胞のエピトープであることを支 持する。 また、ペプチドの接合体が全体のＣＲＭタンパク質と交差反応する抗体を誘発す るかどうかを決定することは重要である。したがって。これらの血清は、また、 抗ＣＲＭ抗体についてＥＬ　Ｉ　ＳＡによりスクリーニングした。表９に示すよ うに、ＣＲＭに対する結合活性は、ＰＲＰ−ＣＲＭで免疫化したか、あるいはＤ Ｔで予備処置した動物においてのみ検出された。ペプチド接合体のいずれも、Ｔ Ｔまたは生理的塩類溶液で予備処置した群に注射したとき、ＣＲＭに対する抗体 を誘発しなかった。 ＰＲＰ−ＣＲＭの接種について上に概説した手順に従い、マウスをまた種々の型 の特異的肺炎の多糖類およびＣＲＭの接合体で免疫化した。 これらの接種の結果を表１０に示す。再び、これらのデータが示すように、バク テリアのＴ細胞エピトープを含有するＢ細胞決定基は、接種した被検体において 免疫応答を効果的に誘発することができる。 ワクチンとしてのＰＲＰ−ペプチド接合体の実用性の独立の確証は、誘発された 機能的分析により得られた。Ｔ細胞の刺激に必要な最小配列の密接に近似するこ とが期待されるＣＲＭペプチド３６９−３８３への還元的アミン化により、ＰＲ Ｐをカップリングした。ＰＲＰ−ペプチドまたはＰＲＰ−ＣＲＭを、アジュバン トを使用しないで、使用してＯおよび２週にＳＪＬマウスを免疫化した。血清を 表１１に示すように集め、そして２つのインフルエンザ菌（Ｈ，ｉｎｆ　１ｕｅ ｎｚａｅ）菌株、Ｅａｇａｎまたは臨床的分離物Ｈｓｔ５４のいずれかに対する 生体外バクテリア活性についてアッセイした。力価の４倍の上昇は、免疫学的に 意味があると考えられれる。 表１１に示すように、ＰＲＰ−ＣＲＭまたはＰＲＰ−ペプチドで免疫化した後、 誘発される抗体は第０週と第２週との間の力価の４倍の上昇から明らかなように 、両者の菌株に対して有意な活性を有した。さらに、ＰＲＰ−ペプチドおよびＰ ＲＰ−ＣＲＭで免疫化した動物の間で達成されたピークの差は、有意に異ならな かった。ペプチド接合体により誘発された抗体は、自然タンパク質で免疫化後得 られたものに機能的に等しい。 ジフテリアトキンイドプライムドマウスにおけるＰＲＰ−ＣＲＭ接合体ワクチン またはＰＲＰ−ＣＲＭペプチドに接合体対する抗体の応答免疫化の日　血清希釈 の逆数としてのＰＰＰに対する抗体（μｇ／ｒｎの、日ゝＤＴ　ＰＲＰ−ＣＲＭ 　　　　ＰＲＰ−Ｃ１２Ｍ　　　　　２００　　＞５１．２００　　＞５１．２ ００　　＞５１．２００　　＞５１．Q００ ＤＴＰＩ？Ｐ−（３５７−３８３）　ＰＰＰ−（３５７−３８３）　　４００　 　＞５１．２００　　＞５１．２００　　＞５１．２００　@＞５Ｌ２００ ＋：＋ｒｐＲｐ−（３ｏａ−ａ３；５）ｐＲＰ−（３ｏａ−３３４）２００　　 ＞５１．２００　　＞５１．２００　　＞５１．２００　　рT１．２００ ＤＴ　ＰＲＰ−（２２９−２５６）　ＰＰＰ−（２２９−２５６）　１．６００ 　　＞５１，２００　　＞５１．２００　　＞５１．２００@　＞５１，２００ ＤＴＰＲＰ−Ｒ５Ｖ　　　　ＰＲＰ−Ｒ５Ｖ　　　　　８００　　＞５１，２０ ０　　＞５１．２００　　＞５１．２００　　＞５Ｌ２００ＴＴＰＲＰ−ＣＲＭ 　　　　ＰＲＰ−ＣＲＭ　　　　　＜２０　２５．６００　　＞５１．２００　 　＞５１．２００　２５，６００ＴＴ　　ＰＲＰ−（３５７−３８３）ＰＲＰ− （３５７−３８３）　　　　　２０　　　　　　　＜２０　　　　　　　＜２０ 　　　　　　@＜２０　　　　　　　＜２０ ＴＴ　ＰＲＰ−（３０６−３３４）　ＰＰＰ−（３０６−３３４）　　＜２０　 　　　＜２０　　　　＜２０　　　　＜２０　　　　＜２０ＴＴ　　ＰＲＰ−（ ２２９−２５６）ＰＰＰ−（２２９−２５６）　　　　＜２０　　　　　　　＜ ２０　　　　　　　＜２０　　　　　　@＜２０　　　　　　　＜２０ ＴＴＰＲＰ−Ｒ３Ｖ　　　　　　　　ＰＲＰ−Ｒ５Ｖ　　　　　　　　　　＜２ ０　　　　　　　＜２０　　　　　　　＜２０　　　　　　@＜２０　　　　　 　　＜２０ ＳＡＰＲＰ−（Ｊ？Ｍ　　　　ＦＲＦ（Ｊ２Ｍ　　　　　１００　２５．６００ 　　）５１．２００　　＞５１．２００　　＞５１．２００ＳＡ　　ＰＲＰ−（ ３５７−３８３）ＰＰＰ−（３５７−３８３）　　　　　２０　　　　　　　＜ ２０　　　　　　　＜２０　　　　　　@（２０＜２０ ｓＡｐＲｐ−（３０６−３３４）ｐＲｐ−（３０６−３３４）　　＜２０　　　 ２０　　　４０　　　２０　　　２０ＳＡ　　ＰＲＰ−Ｃ２２９−２５６ン　Ｐ ｌ？Ｐ−（２２９−２５６）　　　　＜２０　　　　　　　＜２０　　　　　　 　＜２０　　　　@　　＜２０　　　　　　　＜２０ ＳＡＰＲＰ−Ｒ５Ｖ　　　　　　　　ＰＲＰ−Ｒ５Ｖ　　　　　　　　　　＜２ ０　　　　　　　＜２０　　　　　　　２０　　　　　　　モQ０　　　　　　 　＜２０ °　マウスは、７０インド完全アジユバント中で乳化した、最適な濃度の５０日 ｇのＤＴで免疫化し、引き続いて週１および週３において生理的塩類溶液中のペ プチド（５μｇ）またはタンパク質（２，５μｇ）接合体ワクチンで対抗した。 ゝ　ＤＴで免疫化後、７．２１．３２．４２および４９日において個々のマウス から血清を集めた。次いで、所定の領域内の血清試料をＥＬＩＳＡのためにプー ルした。 嚢上旦 合成ペプチド担体分子上の投与した型特異的肺炎多糖類に対する抗体の応答 疫化　　　　　　　次の週における型特異的抗体、μｇ／ｍＱオリゴ糖　　担体 　　アジュバント　　０　　２　４　６型１４　　　ペプチド　　　　　　　　 ＜０．１０　０．１９　２．６７　　ＮＡペプチド　　　＋　　　　＜０．１０ 　０．４１　３．７４　　ＮＡＣＲＭ　　　　　　　　　　　　＜０．１０　０ ．３９　０．５５　　ＮＡＡｌＯ２ペプチド　　　　　　　　　＜（ＬＩＯ＜０ ．１０　０．２０　　ＮＡペプチド　　　　＋　　　　　＜０．１０　　＜０． １０　０．７３　　ＮＡＣＲＭ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　＜０．１０　　　＜０．１０　　　ＮＡ　　　　　　ＮＡＣＲＭ　ｒ　＊　 ｒまにはＣＲＭペプチド３５７−３８３にカップリングした型持異的肺炎オリゴ 糖で、マウスを免疫化した。接合体は第０週および第２週に、アジュバントとし て１００μｇの四重を使用しであるいは使用しないで、接合体を投与した。抗体 の値を標準のファル（Ｆ　ａ　ｒ　ｒ）アッセ１により決定した。 表１１ ＰＲＰ−ペプチドまたはＰＲＰ−ＣＲＭ接合体による免疫化により誘発された抗 体のバクテリア活性 免疫原　　　　　　免疫化後火の週におけるバクテリア活性Ｅａｇａｎに対する 活性 ＰＲＰ−ＣＲＭ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（１１５１／２０　　 　　１／２０ＰＲＰ−ＣＲＭ（３６９−３８３）　　　　　　　＜１１５　　１ ／１０　　　］／１０８３ｔ５４に対する活性 ＰＲＰ−ＣＲＭ　　　　　　　　　　　　１１５　　１／８０　　１／１０ＰＰ Ｐ−ＣＲＭ（３６９−３８３）　　　　　　　　　　　＜１１５　　　１／４０ 　　　　１／１０６．８．修飾されたペプチド類似体を包含する接合体により誘 発されＣＲＭのＴ細胞エピトープ３６６−３８３の修飾された類似体はネズミＴ 細胞増殖を刺激することが決定されると、このような類似体は有効な担体分子と して機能することができるかどうかを決定することが必要テアった。ＰＲＰはＣ −アミノ基を経るＣＲＭペプチドのリジン類似体への還元的アミン化によりカッ プリングした。接合後、種々の投与量のＰＲＰ−［Ｌｙｓｌ−ＣＲＭ（３６６− ３８３）を使用して、アジュバントを使用しないでＳＪＬマウスを免疫化しｔ； 。動物を第０週および第４週に促進した。血清を表１２に示す間隔で集め、モし てＰＲＰに対する抗体の特異性についてアッセイしｔ；。 表１２に示すように、種々の投与量の特異性のペプチド接合体ＰＲＰ−［Ｌｙｓ ｌ−ＣＲＭ（３６６−３８３）は、ｌｐｇ／ｍＱの濃度を越えるＰＲＰに対して 特異性の抗体を誘発した。したがって、この研究はＣＲＭペプチド３６６−３８ ３のリジン類似体が担体分子として実用性を有することを実証する。 表１２ ＳＪＬマウスにおいてＣＲＭ担体ペプチド３６６−３８３へのＮ末端リジンの付 加を検査する最初の研究 次の免疫化後の週におけるＰＰＰに対する抗体（μｇ／ｍＱ）免疫原　　　　　 　　　　　投与量　　０　　２　　４　　６ＰＰＰ−［Ｌｙｓ］−ＣＲＭ（３６ ６−３８３）　　　　　　１０　　　　　　＜０．１０　　　＜０．１０　　　 ＜０．１０　　　＜０．P０ ５　　　　　　＜０．１０　　　０．１６　　　０．７７　　　２．４３２．５ 　　０．２８　０，３１　０，３４　１．１０１．０　　＜０．１０　０．２０ 　１．７１　１．８５０．５　　　　＜０．１０　　　０．１０　　　０．９８ 　　　１．３００．１　　　　＜０．１０　　　０．７５　　　２．２２　　　 ２−６４ＰＲＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５ 　　　　＜［１１０＜０．１０　　　＜０．１０　　　０．３４ＰＲＰ−ＣＲＭ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５　　　　＜０．１０　　 　１．０６　　　２．３７　　　９．６０６．９．破傷風の毒素のエピトープ 破傷風の毒素ＨＳＬおよびＣの断片を、ネズミＴ細胞の増殖を刺激するそれらの 能力について試験した。すべての３つの断片は実質的なＴ細胞の活性を誘発した が、表１３に示すように、Ｃ断片は明らかによりすぐれていた。刺激活性は、ま た、ヒト末梢血液の単核細胞のアッセイにおいて観測された。表１４に示すよう に、主要なＴｍ胞活性はこの個体における破傷風の毒素の重鎮に関連した。 断片Ｃは、ネズミＴ細胞の増殖の刺激において非常に活性であることが発見され 、プロナーゼ、フィシン、スブチリシンまたはＶ８によるタンパク質分解消化に 付した。破傷風の毒素の断片Ｃの粗製酵素消化物の５ＤＳ−ＰＡＧＥは、上に列 挙する４つの酵素で消化後、検出可能な完全な断片Ｃを示さなかった。次いで、 消化物をネズミＴｍ胞を刺激する能力について試験した。プロテアーゼ消化混合 物のうちの３つ（プロナーゼ、スブチリシンおよびＶ８）は、表１５に示すよう に実質的なＴ細胞活性を保持しｔ；。表１５に記載されているデータは、プロナ ーゼまｔ；は■８プロテアーゼ消化のいずれもＴ細胞エピトープのマツピングに おいてとくに有用であるペプチド断片を生ずることを示唆する。 Ｖ８の消化により発生した断片内の潜在的Ｔｍ＃ｌエピトープをさらに定めるた めに、これらの断片は逆相ＨＰＬＣにより分離した。５つの断片を集め、モして ５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。５つの分画のうちの４つは主要なペプチドを 含有することが発見され、そしてすべてをネズミＴ細胞の増殖のアッセイにおい て試験した。表１６に示すように、分画３．４および５は有意なＴ細胞の応答を 誘発した。分画３はＩＯＫの分子量を有する主要なバンドを含有し、そして分画 ４および５は、それぞれ、はぼ２２におよび１７の主要なバンドを含有する。 ■８消化断片をさらに分析するために、分画ｌ〜５は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分 離し、インモビロン（ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、そ して直接配列決定した。２つの断片の部分的配列、分画４からの２２にのバンド および分画Ｓからの１７にのバンドが決定され、そして破傷風の毒素の既知の配 列と比較した〔エイセル（Ｅ　ｉ　５ｅｌ）ｅｅ　　ａｔ、、ＥＭＢＯジャーナ ル（Ｊ、）５　：　２４９５−２５０２．１９８６］。５ＤＳ−ＰＡＧＥからの 分子量および配列決定のデータに基づいて、２２にの断片は破傷風の毒素の残基 １１２８−１３０９に相当し、そして１７にの断片は残基９７４−１１１６から のものであることが結論された。 Ｃ断片内でＴ細胞エビドーグをより密接に局在化するために、オーバーラッピン グする合成ペプチドを使用する方法を使用した。この方法は、長さが１９〜２０ 残基でありモして７残基がオーバーラツプする３７のペプチドを合成して、Ｃ断 片の全体の一次配列を検査することを要求した。プロテアーゼ消化の研究はＴ細 胞活性が１７におよび２２にの断片に潜在的に関連することを示唆したので、最 初の努力はこれらの２つの領域のほとんどの効力に集中されｔ；。表１７に示す ように、残基９７で始まりそして領域９７４−１１１６の一部分にまたがるオー バーラッピング合成ペプチドをＴ細胞の活性について検査した。検査したものの うちで、Ｃ断片内に入る破傷風の毒素のペプチド９６１−９８０および１０２１ −１０４０は、破傷風の毒素プライムドネズミリンパ球による有意のＴ細胞増殖 の応答を引き出した。こうして、破傷風の毒素の断片Ｃの２つの潜在的Ｔ細胞エ ビドーグはこれらの技術の適用により局在化されｔ二。 表１３ 破傷風の毒素の断片に対する破傷風トキソイドプライムドＳＪＬマウスのＴ細胞 の応答 ３Ｈ］の組み込み（ＣＰＭ） 対抗　　　　　　　　　　　　　試験＃ｌ　　　　　　試験＃２ジフテリア　　 　　　　　　　　　　　ｏＯＣ断片　　　　　　　　　　　　　　２２．１８０ 　　　　　　４４．３２８Ｈｇ　　　　　　　　　　　　　　　　１８，６２９ 　　　　　　２９．８７０Ｌ鎖　　　　　　　　　　　　　２６．６５５　　　 　　　１２．５４３Ｃｏｎ　Ａ　　　　　　　　　　　　　２３．３５４　　　 　　　４０．５８８ＬＰＳ　　　　　　　　　　　　　　３９，９４６　　　　 　　４２．５７８バツクグラウンド 培地（ｃｐｍとして）　　　　　　　　　　　６５５　　　　　　　１．０１１ １２表１４ 破傷風トキソイドおよび破傷風の毒素の断片に対するヒト増殖の応答抗原［’Ｈ ］−チミジンの組み込み　　投与量ΔＣＰＭ　　　　　　　　　μｇｌ頂ＱＣｏ ｎ　Ａ　　　　　　　　　　　　　　１４．５３９ＰＨＡ　　　　　　　　　　 　　　　　１７．１１０ＰＨＡ÷緩衝液の対照　　　　　　　　２５，６２１Ｌ Ｐ５　　　　　　　　　　　　　　　５，０５３破傷風の毒素　　　　　　　　 　　９０．２７１　　　　　　　　１０重鎮　　　　　　　　　　　　　７８． ８３０　　　　　　　　１軽鎖　　　　　　　　　　　　　　６４，２９０　　 　　　　　　１００Ｃ断片　　　　　　　　　　　　　　４１．３０６　　　　 　　　　　５０ジフテリアトキソイド　　　　　　　７．９７３　　　　　　　 　１００衆よ】 破傷風の毒素のＣ断片の酵素の消化−子細胞の増殖の研究＊酵素　投与量Ｃ’ｇ ／ｍρ）’　　Ｅ”ＨＪ−チミジンの組み込みΔＣＰＭプロナーゼ　　１　　　 　４５，２５４　　２７．６８１　　７０２　　　　０フイシン　　　　０．１ 　　　　４．３５７　　　４，１７９　２．２４３　　　３３２スビチリシ７　 １　　　　４５，２５４　　１９，８８４　　７０２　　　　０ｖｓ　　　　　 　　Ｏ，５２１，９０３３０，２６４８，１８７０＊　ΔＣＰＭとしての対照の 応答（最大における応答）：ＴＴ１０２．７３０　（５）；Ｃ断片１２ＣＩＳ　 １２６　（１００）；Ｃａｎ　　Ａ３１．３４３　（＋）８．１：びＬＰｓ３９ ．７５０　（５０）、　バックブラウントノ応答は１．３３４ｃｐｍであった。 １　酵素消化における断片Ｃの投与量。「なし」は、最大の応答が消化において 得られた投与量における、断片Ｃ単独に対する応答を呼ぶ。 表１６ 断片Ｃおよび断片Ｃのペグチドへの破傷風のトキソイドープライムドＴ細胞の増 殖の応答 最大　ＣＰＭ±ＳＤ（投与量μｇ／ｍ４）培地　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　９４５土２３４ＣＡ　１．０μｇ／ｍ（１３７，７５８±６８７ＬＰＳ 　５０．０μｇ／ｍＱ６１．３９０±２．６６２破傷風のトキソイド　　　　　 　　　　　１４９．５７８±１０．５８１ジフテリアのトキソイド　　　　　　 　　　　８７９土２６Ｃ断片　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０，０ ２５±１０．１５６プロテア一ゼ断片１　　　　　　　　　　　１，２７０±８ プロテア一ゼ断片２　　　　　　　　　　　１，８２８±２４０グロテア一ゼ断 片３　　　　　　　　　　　５．１５計３７２グロテア一ゼ断片４　　　　　　 　　　　　１４　、７７２±１．３０８グロテア一ゼ断片５　　　　　　　　　 　２３，０６５±１．１８１表１７　破傷風の断片Ｃの選択した領域からなるオ ーバーラッピング合成ペプチドへの破傷風のトキソイドープライムドリンパ節細 胞のＴ細胞の応答 生体外対抗　　　　［３Ｈ］−チミジンの組み込み（ΔＣＰＭ）　　投与量（μ ｇ／ｍＱ）タンパク質 破傷風トキソイド　　　　　　　２４２．４２１　　　　　　　　　５破傷風断 片Ｃ２９６，８０１１００ ジフテリアトキソイド　　　　　　３．８９２　　　　　　　　　１破傷風の毒 素のペプチド ９６１−９８０　　　　　　　　　　　　３２．２７６　　　　　　　　１００ ９７３−９９２　　　　　　　　　　　　１０．４５７　　　　　　　　１００ ９９７−１０１６　　　　　　　　　　　　６．３４７　　　　　　　　１００ ９８５−１００４　　　　　　　　　　　　３．６００　　　　　　　　５０１ ００９−１０２８　　　　　　　　　　　５．１３０　　　　　　　　１００１ ０２１−１０４０　　　　　　　　　　１００．３３２　　　　　　　　５０１ ２７３−１２９２　　　　　　　　　　　１１．２３０　　　　　　　　５０ミ トゲン Ｃａｎ　Ａ　　　　　　　　　　　　　　　４４．０７７　　　　　　　　　　 １ＬＰＳ　　　　　　　　　　　　　　　　８６．７４０　　　　　　　　　５ ０パツクグラウンド 培地（ｃｐｍとして）　　　　　　　　　３，６３９７．０．非炭水化物ハプテ ン接合体に対する抗体の応答呼吸系のシンンチウムのウィルス（Ｒ５Ｖ）タンパ ク質Ｆを、ＣＲＭのＴ細胞エピトープ３６９−３８３または完全な自然タンパク 質にカップリングした。ＳＪＬマウスを、明嚢と混合しＩ；ペプチド３６９−３ ８３の５μｇ重量当量で、第０週および第２週に免疫化した。血清を集めた。第 ６図に示すように、Ｒ５ＶのＦタンパク質に対する抗体は、全ＣＲＭまたはＣＲ Ｍペプチド３６９−３８３のいずれかにカップリングしたＲ５Ｖ　（２８３−３ １５）のＢ細胞エピトープで免疫化後、誘発された。この実験において、炭水化 物以外の材料のための担体分子として働＜ＣＲＭペプチド３６９−３８３の実用 性が実証される。この場合において、特定の実施例はウィルスのタンパク質のＢ 細胞エピトープを表すペプチドである。 らせん両極性領域についての ＣＲＭタンパク質の分析 ＬＦＦＥＩＫＳ ｏｏｏｏ＊★★ ＊この分析は■と記す位置においてＧを使用して本来実施した：この位置におけ るＥは分析を変化させない。 時間（分） 時間（分） 時間（分） 時間（分） 時間（分） 時間（分） 担体への存在する免疫性の効果 ペプチドの接合体の免疫化後の週の数 吸収 ０　０　　ｏ　　０　０　　）−１１−１１−１２３、リジンまたはシスティン の残基はグリシン残基を通してアミノ補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法 第１８４条の８）平成２年７月３１日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１００３８８ ２、発明の名称 接合体ワクチンの担体分子としてのＴ細胞のエピトープ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国ニューヨーク州１４６２３０チェスター・スィート３０ ０・コーポレートウッズ３０〆名　称　プラクシス・バイオロジクス・インコー ホレーテッド４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正書の提出年月日 １９９０年１月１２日 ６、添付書類の目録 （１）　　補正書の写しく翻訳文）　　　　　　　　　１通７、補正の説明 補正書翻訳文Ｍｌ〜２頁は請求の範囲第２３〜３４項の差し替えであります。 補正書翻訳文第３〜４頁は請求の範囲第６６〜７６項の差し替えであります。 補正書翻訳文第５頁は請求の範囲第１０５〜１０７項の差し替えであります。 載の接合体。 末端またはカルボキシ末端に結合されている、上記第２２項記載のオリゴペプチ ド。 ２４、バクテリアの少なくとも１つのＴ細胞のエピトープに相当するオリゴペプ チドに結合した抗原からなる免疫原性接合体。 ２５、抗原およびエピトープは共有結合している、上記第２４項記載の接合体。 ２６、産生物はバクテリアの毒素、ＣＲＭまたはトキソイドである、上記第２４ 項記載の接合体。 ２７、バクテリアの産生物はジフテリア、破傷風または百日咳の毒素、ＣＲＭま たはトキソイドである、上記第２６項記載の接合体。 ２８、ジフテリアの毒素はＣＲＭ　＋　＊　ｙである、上記第２４項記載の接合 体。 ２９、エビドーグはＣＲＭ　＋　＊アのペプチド３５７−３８３、抗原の断片、 その相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第２８項記載の接合体。 ３０、エビドーグはＣＲＭ　＋　＊　ｙのペプチド３６６−３８３、抗原の断片 、その相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第２８項記載の接合体 。 ３１、エピトープはＣＲＭ＋ｓｒのペプチド３６９−３８３、抗原の断片、その 相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第２８項記載の接合体。 ３２、エピトープはＣＲＭ　ｌ＊　７のペプチド３０６−３３４、抗原の断片、 その相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第２８項記３３、トキソ イドは破傷風のトキソイドである、上記第２４項記載の接合体。 ３４、エピトープは破傷風の毒素のペプチド９６１−９８０、抗原の断片、その 相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第３３項記載の接合体。 ６６、ポリマーは肺炎連鎖球菌（Ｓ、ｐｎｅｕｍｏｎ　１ａｅ）の血清型ｌ、４ ．５．６Ａ、６Ｂ、９Ｖ％　１４．１８Ｃ，１９Ｆまたハ２３　Ｆである、上記 第６５項記載の接合体。 ６７、Ｔ細胞のエピトープに結合したポリリポシルリビトルホスフェートからな る免疫原性接合体。 ６８、Ｔ細胞のエピトープはＣＲＭ　ｒ　＊　ｙのペプチド３６９−３８３のア ミノ酸配列を有する、上記第６７項記載の免疫原性接合体。 ６９、製剤学的に許容されうるベヒクル中のバクテリアの産生物の少なくとも１ つのＴ細胞のエピトープに相当するオリゴペプチドに結合した少なくとも１つの 抗原からなる免疫原性接合体からなるワクチン組成物。 ７０、さらに、アジュバントを含有する、上記第６９項記載のワクチン組成物。 ７■、バクテリアの産生物はバクテリアの毒素、ＣＲＭまたはトキソイドである 、上記第６９項記載のワクチン組成物。 ７２、バクテリアの産生物はＣＲＭ、、、である、上記第６９項記載のワクチン 組成物。 ７３、エビドーグはＣＲＭ＋ｓｚのペプチド３６９−３８３、抗原の断片、その 相同体または類似体のアミノ酸を有する、上記第７９項記載のワクチン組成物。 ７４、バクテリアの産生物は破傷風の毒素である、上記第７１項記載のワクチン 組成物。 ７５、エピトープは破傷風の毒素のペプチド９６１−９８０または１０２１−１ ０４０のアミノ酸配列を有する、上記第７４項記載のワタチン組成物。 ７６、製剤学的に許容されうるベヒクル中の少なくとも１つのＴ細胞のエビドー グに相当するオリゴペプチドに結合したサツカリドからなる免疫原性接合体から なるワクチン組成物。 １０５、ウィルスは呼吸系のンンシチウムのウィルス（ＲＳ　Ｖ）であり、そし てウィルスの抗原はＲ５ＶのＦタンパク質である、上記第１０３項記載の方法。 １０６、ウィルスの抗原はＦタンパク質のペプチド２８３−３１５である、上記 第１０５項記載の方法。 ＋０７、異なる分子のＢ細胞のエピトープに相当するオリゴペプチドに接合した Ｔ細胞のエピトープからなる免疫原性接合体。 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成２年７月３１日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００３８８ ２、発明の名称 接合体ワクチンの担体分子としてのＴ細胞のエピトープ３、特許出願人 名　称　プラクシス・バイオロジクス・インコーホレーテッド４、代理人　〒１ ０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正音の提出年月日 １９９０年３月１４日 ６、添付書類の目録 （１）　　補正音の写しく翻訳文）　　　　　　　　　１通７、補正の説明 補正書翻訳文第１〜２頁は請求の範囲第１−１を項の差し替え請求の範囲 ｌ、バクテリアの産生物のＴ細胞のオリゴペプチド。 ２、産生物はバクテリアの毒素、ＣＲＭまたはトキソイドである、上記第１項記 載のオリゴペプチド。 ３、産生物はジフテリア、破傷風または百日咳の毒素、ＣＲＭまたはトキソイド である、上記第２項記載のオリゴペプチド。 ４、ジフテリアの毒素はＣＲＭ　ｌｓ　ｒである、上記第３項記載のオリゴペプ チド。 ５、ＣＲＭｌ＊ｔのペプチド３５７−３８３、抗原の断片、その相同体または類 似体のアミノ酸配列を有する、上記第４項記載のオリゴペプチド。 ６、ＣＲＭ　ＩＩ　７のペプチド３６６−３８３、抗原の断片、その相同体また は類似体のアミノ酸配列を有する、上記第５項記載のオリゴペプチド。 ７、ＣＲＭ　ｌｓ　ｙのペプチド３６９−３８３、抗原の断片、その相同体また は類似体のアミノ酸配列を有する、上記第４項記載のオリゴペプチド。 ８、ＣＲＭ＋ｓｒのペプチド３０６−３３４、抗原の断片、その相同体または類 似体のアミノ酸配列を有する、上記第４項記載のオリゴペプチド。 ９、毒素、ＣＲＭまたはトキソイドは破傷風の毒素またはトキソイドである、上 記第３項記載のオリゴペプチド。 １０、破傷風の毒素のペプチド９６１−９８０、抗原の断片、その相同体または 類似体のアミノ酸配列を有する、上記第９項記載のオリゴペプチド。 ＩＬ破傷風の毒素のペプチド１０２１−１０４０、抗原の断片、その相同体また は類似体のアミノ酸配列を有する、上記第９項記載のオリゴペプチド。 国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００３８８ いＩＩＩＩＩＩＪＩＩ＠１１１１１　、、＊工、ニー　　　２ＰＣＴ／ＵＳ　　 ８９１００３８８ −齢−−幻崗―噌胸　３ ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００３８Ｂ ｌＰｌｄｍＭ−＾・−ｔｃａ−肯＋ｉｓ４国際調査報告 ｐ−岬町１防【−一嘗「倒Ｃ１−１−庸一判−１哩神伽−噛−ｄぜ一贈喝は一一 一―軒−−−軸一一搦ｌ龍−一け−６゜Ｔｈｅｒｒ−Ｃ１１１ｂｅ＋ｙａｎｍｅ ＊＋＋ｎｉ＋＋ａ４ｉａ＋ｍＥ−１ｒ１−蓼−−１−１−Ｐｓ＋ｅ＋＋＊Ｏｒｒ ｍ、ＥΩＰｆ１１ｅ■{３１１１６１１？ Ｔｂｅ　ｆｚｅｐｅｗ　Ｐｍ＋ｓｍＯｍｅｎ　ｗｗａｗｗｙｌ＋ｄｋ１ｗ−ｐｎ ｌｓ＋ｖ−ｗｅｌｌＩ？ｍＦ−１ｗ呻−ｅ１ｍａｒ＋＊ａ＋奄■＝B

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バクテリアの産生物の分離したＴ細胞のエピトープ。 ２、産生物はバクテリアの毒素、ＣＲＭまたはトキソイドである、上記第１項記 載のエピトープ。 ３、産生物はジフテリア、破傷風または百日咳の毒素、ＣＲＭまたはトキソイド である、上記第２項記載のエピトープ。 ４、ジフテリアの毒素はＣＲＭ１９７である、上記第３項記載のエピトープ。 ５、ＣＲＭ１９７のペプチド３５７−３８３、抗原の断片、その相同体または類 似体のアミノ酸配列を有する、上記第４項記載のエピトープ。 ６、ＣＲＭ１９７のペプチド３６６−３８３、抗原の断片、その相同体または類 似体のアミノ酸配列を有する、上記第５項記載のエピトープ。 ７、ＣＲＭ１９７のペプチド３６９−３８３、抗原の断片、その相同体または類 似体のアミノ酸配列を有する、上記第４項記載のエピトープ。 ８、ＣＲＭ１９７のペプチド３０６−３３４、抗原の断片、その相同体または類 似体のアミノ酸配列を有する、上記第４項記載のエピトープ。 ９、毒素、ＣＲＭまたはトキソイドは破傷風の毒素またはトキソイドである、上 記第３項記載のエピトープ。 １０、破傷風の毒素のペプチド９６１−９８０、抗原の断片、その相同体または 類似体のアミノ酸配列を有する、上記第９項記載のエピトープ。 １１、破傷風の毒素のペプチド１０２１−１０４０、抗原の断片、その相同体ま たは類似体のアミノ酸配列を有する、上記第９項記載のエピトープ。 １２、アミノ酸配列ＱＶＶＨＮＳＹＮＲＰＡＹＳＰＧを有するオリゴペプチド。 １３、リジンまたはシステインの残基はアミノ末端、カルボキシ末端、または両 者に結合している、上記第１２項記載のオリゴペプチド。 １４、リジンまたはシステインの残基はグリシン残基を通してアミノ末端または カルボキシ末端に結合されている、上記第１３項記載のオリゴペプチド。 １５、アミノ酸配列ＮＬＦＱＶＶＨＮＳＹＮＰＡＹＳＰＧ、ＡＹＮＦＶＥ（また はＧ）ＳＩＩＮＬＦＱＶＶＨＮＳＹＮＲＰＡＹＳＰＧまたはＩＬＰＧＩＧＳＶＭ ＧＩＡＤＧＡＶＨＨＮＴＥＥＩＶＡＱＳＩＡを有するオリゴペプチド。 １６、リジンまたはシステインの残基はアミノ末端、カルボキシ末端、または両 者に結合している、上記第１５項記載のオリゴペプチド。 １７、リジンまたはシステインの残基はグリシン残基を通してアミノ末端または カルボキシ末端に結合されている、上記第１６項記載のオリゴペプチド。 １８、アミノ酸配列ＶＳＡＳＨＬＥＱＹＧＴＮＥＹＳＩＩＳＳＭを有するオリゴ ペプチド。 １９、リジンまたはシステインの残基はアミノ末端、カルボキシ末端、または両 者に結合している、上記第１８項記載のオリゴペプチド。 ２０、リジンまたはシステインの残基はグリシン残基を通してアミノ末端または カルボキシ末端に結合されている、上記第１９項記載のオリゴペプチド。 ２１、アミノ酸配列ＤＫＦＮＡＹＬＡＮＫＷＶＦＩＴＩＴＮＤＲを有するオリゴ ペプチド。 ２２、リジンまたはシステインの残基はアミノ末端、カルボキシ末端、または両 者に結合している、上記第２１項記載のオリゴペプチド。 ２３、リジンまたはシステインの残基はグリシン残基を通してアミノ末端または カルボキシ末端に結合されている、上記第２２項記載のオリゴペプチド。 ２４、バクテリアの少なくとも１つのＴ細胞のエピトープに結合した抗原からな る免疫原性接合体。 ２５、抗原およびエピトープは共有結合している、上記第２４項記載の接合体。 ２６、産生物はバクテリアの毒素、ＣＲＭまたはトキソイドである、上記第２４ 項記載の接合体。 ２７、バクテリアの産生物はジフテリア、破傷風または百日咳の毒素、ＣＲＭま たはトキソイドである、上記第２６項記載の接合体。 ２８、ジフテリアの毒素はＣＲＭ１９７である、上記第２４項記載の接合体。 ２９、エピトープはＣＲＭ１９７のペプチド３５７−３８３、抗原の断片、その 相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第２８項記載の接合体。 ３０、エピトープはＣＲＭ１９７のペプチド３６６−３８３、抗原の断片、その 相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第２８項記載の接合体。 ３１、エピトープはＣＲＭ１９７のペプチド３６９−３８３、抗原の断片、その 相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第２８項記載の接合体。 ３２、エピトープはＣＲＭ１９７のペプチド３０６−３３４、抗原の断片、その 相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第２８項記載の接合体。 ３３、トキソイドは破傷風のトキソイドである、上記第２４項記載の接合体。 ３４、エピトープは破傷風の毒素のペプチド９６１−９８０、抗原の断片、その 相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第３３項記載の接合体。 ３５、エピトープは破傷風の毒素のペプチド１０２１−１０４０、抗原の断片、 その相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第３３項記載の接合体。 ３６、抗原は微生物の抗原、ウイルスの抗原、寄生体の抗原、腫瘍の抗原、アレ ルゲン、および自己免疫に関係する抗原から成る群より選択される、上記第２４ 項記載の接合体。 ３７、抗原は莢膜のポリマー、オリゴマーまたはその断片である、上記第３６項 記載の接合体。 ３８、抗原はバクテリアである、上記第３７項記載の接合体。 ３９、ポリマーまたはオリゴマーは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ ｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ ｉｓ）または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｅ）から誘導される、上記第３８項記載の接合体。 ４０、ポリマーはインフルエンザ菌（Ｈ、ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のポリリボシ ルリビトルホスフェートである、上記第３９項記載の接合体。 ４１、ポリマーは肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅ）から誘導される、上記第３９項記載の接合体。 ４２、ポリマーは肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、４、 ５、６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆである、上記第４１ 項記載の接合体。 ４３、抗原はバクテリアの外膜タンパク質である、上記第３６項記載の接合体。 ４４、抗原はインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カタル球 菌（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅ ｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ ｏｌｉ）のバクテリアの外膜タンパク質である、上記第４３項記載の接合体。 ４５、抗原はバクテリアの表面タンパク質である、上記第３６項記載の接合体。 ４６、バクテリアの表面タンパク質は化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＭタンパク質である、上記第４５項記載の接合体。 ４７、抗原はバクテリアの表面または細胞壁のサッカリドである、上記第３６項 記載の接合体。 ４８、抗原はグラム陰性バクテリアのリボ多糖である、上記第４７項記載の接合 体。 ４９、抗原はウイルスの抗原である、上記第３６項記載の免疫原性接合体。 ５０、抗原は呼吸系のシンシチウムのウイルスのＦまたはＧタンパク質である、 上記第４９項記載の免疫原性接合体。 ５１、抗原は呼吸系のシンシチウムのウイルスのタンパク質Ｆのペプチド２８３ −３１５である、上記第５０項記載の免疫原性接合体。 ５２、アミノ酸配列ＱＶＶＨＮＳＹＮＲＰＡＹＳＰＧを有するオリゴペプチドに 結合した抗原からなる免疫原性接合体。 ５３、抗原はオリゴペプチドの末端に結合したリジンまたはシステインの残基を 通してオリゴペプチドに結合している、上記第５２項記載の免疫原性接合体。 ５４、リジンまたはシステインの残基はグリシン残基を通してオリゴペプチドの 末端に結合している、上記第５３項記載の免疫原性接台体。 ５５、アミノ酸配列ＮＬＦＱＶＶＨＮＳＹＮＲＰＡＹＳＰＧ、ＡＹＮＦＶＥ（ま たはＧ）ＳＩＩＮＬＦＱＶＶＨＮＳＹＮＲＰＡＹＳＰＧまたはＩＬＰＧＩＧＳＶ ＭＧＩＡＤＧＡＶＨＨＮＴＥＥＩＶＡＱＳＩＡを有するオリゴペプチドに結合し た抗原からなる免疫原性接合体。 ５６、抗原はオリゴペプチドの末端に結合したリジンまたはシステインの残基を 通してオリゴペプチドに結合している、上記第５５項記載の免疫原性接合体。 ５７、リジンまたはシステインの残基はグリシン残基を通してオリゴペプチドの 末端に結合している、上記第５６項記載の免疫原性接合体。 ５８、アミノ酸配列ＶＳＡＳＨＬＥＱＹＧＴＮＥＹＳＩＩＳＳＭまたはＤＫＦＮ ＡＹＬＡＮＫＷＶＦＩＴＩＴＮＤＲを有するオリゴペプチドに結合した抗原から なる免疫原性接合体。 ５９、抗原はオリゴペプチドの末端に結合したリジンまたはシステインの残基を 通してオリゴペプチドに結合している、上記第５８項記載の免疫原性接合体。 ６０、リジンまたはシステインの残基はグリシン残基を通してオリゴペプチドの 末端に結合している、上記第５９項記載の免疫原性接合体。 ６１、少なくとも１つのＴ細胞のエピトープに相当するオリゴペプチドに結合し た、莢膜のポリマー、オリゴマーまたはその断片からなる免疫原性接合体。 ６２、莢膜のポリマー、オリゴマーまたはその断片はバクテリアのものである、 上記第６１項記載の接合体。 ６３、ポリマーまたはオリゴマーは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ ｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ ｉｓ）または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｅ）から誘導される、上記第６２項記載の接合体。 ６４、ポリマーはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のポリリボシ ルリビトルホスフェートである、上記第６３項記載の接合体。 ６５、ポリマーは肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎ ｉａｅ）から誘導される、上記第６３項記載の接合体。 ６６、ポリマーは肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、４、 ５、６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆである、上記第６５ 項記載の接合体。 ６７、Ｔ細胞のエピトープに結合したポリリボシルリビトルホスフェートからな る免疫原性接合体。 ６８、Ｔ細胞のエピトープはＣＲＭ１９７のペプチド３６９−３８３のアミノ酸 配列を有する、上記第６７項記載の免疫原性接合体。 ６９、製剤学的に許容されうるベヒクル中のバクテリアの産生物の少なくとも１ つのＴ細胞のエピトープに結合した少なくとも１つの抗原からなる免疫原性接合 体からなるワクチン組成物。 ７０、さらに、アジユバントを含有する、上記第６９項記載のワクチン組成物。 ７１、バクテリアの産生物はバクテリアの毒素、ＣＲＭまたはトキソイドである 、上記第６９項記載のワクチン組成物。 ７２、バクテリアの産生物はＣＲＭ１９７である、上記第６９項記載のワクチン 組成物。 ７３、エピトープはＣＲＭ１９７のペプチド３６９−３８３、抗原の断片、その 相同体または類似体のアミノ酸を有する、上記第７９項記載のワクチン組成物。 ７４、バクテリアの産生物は破傷風の毒素である、上記第７１項記載のワクチン 組成物。 ７５、エピトープは破傷風の毒素のペプチド９６１−９８０または１０２１−１ ０４０のアミノ酸配列を有する、上記第７４項記載のワクチン組成物。 ７６、製剤学的に許容されうるベヒクル中の少なくとも１つのＴ細胞のエピトー プに結合したサッカリドからなる免疫原性接合体からなるワクチン組成物。 ７７、さらに、アジュバントを含有する、上記第７６項記載のワクチン組成物。 ７８、サッカリドの抗原はインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のポ リリボシルリビトルホスフェートである、上記第７６項記載のワクチン組成物。 ７９、バクテリアの産生物の少なくとも１つのＴ細胞のエピトープに結合した少 なくとも１つの抗原からなる免疫原性接合体からなるワクチン組成物の有効量を 哺乳動物の宿主に投与することからなる、抗原に対する免疫応答を誘発する方法 。 ８０、抗原は、微生物の感染、ウイルスの感染、アレルギー、自己免疫または癌 から成る群より選択される状態の予防または処置するために投与される、上記第 ７９項記載の方法。 ８１、宿主はヒトである、上記第７９項記載の方法。 ８２、バクテリアの産生物はバクテリアの毒素、ＣＲＭまたはトキソイドである 、上記第７９項記載の方法。 ８３、バクテリアの産生物はジフテリア、破傷風または百日咳の毒素、ＣＲＭま たはトキソイドである、上記第８２項記載の方法。 ８４、ジフテリアの毒素はＣＲＭ１９７である、上記第８３項記載の方法。 ８５、エピトープはＣＲＭ１９７のペプチド３６９−３８３、３６６−３８３ま たは３５７６−３８３、抗原の断片、その相同体または類似体である、上記第８ ３項記載の方法。 ８６、エピトープはＣＲＭ１９７のペプチド３０６−３３４、抗原の断片、その 相同体または類似体である、上記第８３項記載の方法。 ８７、エピトープは破傷風の毒素のペプチド９６１−９８０、抗原の断片、その 相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第８４項記載の方法。 ８８、エピトープは破傷風の毒素のペプチド１０２１−１０４０、抗原の断片、 その相同体または類似体のアミノ酸配列を有する、上記第８４項記載の方法。 ８９、製剤学的に許容されうるベヒクル中のバクテリアの産生物の少なくとも１ つのＴ細胞のエピトープに接合した微生物の抗原またはそのエピトープからなる 免疫原性接合体の有効量からなワクチン組成物を、哺乳動物の宿主に投与するこ とからなる、微生物の感染を予防または処置する方法。 ９０、ワクチン組成物は、さらに、アジュバントを含有する、上記第８９項記載 の方法。 ９１、抗原はバクテリアの莢膜のポリマー、オリゴマーまたはその断片である、 上記第８９項記載の方法。 ９２、ポリマーまたはオリゴマーはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ 　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎ ｅｕｍｏｎｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ ｓ）またはチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）から誘導される、上 記第９１項記載の方法。 ９３、ポリマーはインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のポリリボシ ルリビトルホスフェートである、上記第９２項記載の方法。 ９４、ポリマーまたはオリゴマーは肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ 　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から誘導される、上記第９２項記載の方法。 ９５、ポリマーは肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、４、 ５、６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆまたは２３Ｆである、上記第９４ 項記載の方法。 ９６、抗原はバクテリアの外膜タンパク質である、上記第８９項記載の方法。 ９７、外膜タンパク質はインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜 炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カタル球菌（Ｂｒａ ｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇ ｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）か ら誘導される、上記第９６項記載の方法。 ９８、感染は髄膜炎、中耳炎または血流の感染である、上記第８９項記載の方法 。 ９９、製剤学的に許容されうるベヒクル中の少なくとも１つのＴ細胞のエピトー プに結合したサッカリド抗原からなる接合体の有効量を哺乳動物の宿主に投与す ることからなる、感染性有機体のサッカリドの抗原に対する免疫応答を誘発する 方法。 １００、ワクチン組成物は、さらに、アジュバントからなる、上記第９９項記載 の方法。 １０１、サッカリドの抗原はインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の ポリリボシルリビトルホスフェートである、上記第９９項記載の方法。 １０２、Ｔ細胞のエビトープはジフテリアの毒素のＣＲＭ１９７から誘導される 、上記第９９項記載の方法。 １０３、製剤学的に許容されうるベヒクル中の少なくとも１つのＴ細胞のエピト ープに結合したウイルスの抗原またはそのエピトープからなる接合体の有効量を 哺乳動物の宿主に投与することからなる、ウイルスに対する免疫応答を誘発する 方法。 １０４、ワクチンの組成物は、さらに、アジュバントからなる、上記第１０３項 記載の方法。 １０５、ウイルスは呼吸系のシンシチウムのウイルス（ＲＳＶ）であり、そして ウイルスの抗原はＲＳＶのＦタンパク質である、上記第１０３項記載の方法。 １０６、ウイルスの抗原はＦタンパク質のペプチド２８３−３１５である、上記 第１０５項記載の方法。 １０７、異なる分子のＢ細胞のエピトープに接合したＴ細胞のエピトープからな る免疫原性接合体。