FI104374B - T-solu-epitooppi-oligopeptidejä ja niitä sisältävien konjugaattien valmistus - Google Patents

Description

, 104374 T-solu-epitooppi-oligopeptidejä ja niitä sisältävien kon-jugaattien valmistus 1. Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee oligopeptidejä ja menetelmä niitä sisältävän konjugaatin valmistamiseksi. Tällaiset rokotekoostumukset sisältävät antigeenin, antigeenideter-minantin tai -hapteenin konjugoituna kantajamolekyyliin. Tarkemmin sanottuna formulaatiot käsittävät antigeenin, 10 antigeenideterminantin tai hapteenin konjugoituna bakteeriperäisen tuotteen T-solun epitooppiin. Nämä koostumukset pystyvät tehokkaasti indusoimaan käytettyjä immunogeenejä vastaan suojäävien vasta-aineiden tuotannon, mutta samalla vältetään suurempien proteiinikantajamolekyylien käyttö. 15 2. Keksinnön tausta

Suojaavan immuunivasteen tuottaminen mitä tahansa tiettyä infektoivaa ainetta vastaan selkärankaisissa riippuu alun perin sopivan ärsykkeen antamisesta isännän immuunisysteemille. Itse infektoiva organismi tuo tyypil-20 lisesti monia immuunisysteemiä stimuloivia yhdisteitä eli antigeenejä sen solumembraanin koostumusten luonteesta johtuen tai isännän kehoon vapauttamiensa aineenvaihdunta- I * tuotteista johtuen. Immuunisysteemi tunnistaa nämä aineet, ; tavallisesti suurikokoisemmat molekyylit, kuten proteii- 25 nit, lipopolysakkaridit tai glykoproteiinit vieraiksi ja

t « J

*#/# saa aikaan yhden- tai useammantyyppisen isännän reaktion, • · jonka tarkoituksena on poistaa tunkeutuva organismi tai V * saattaa se toimintakyvyttömäksi. Antigeeni voi stimuloida herkistyneitä lymfosyyttejä (T-soluja), jotka saavat ai- · · : : ’· 30 kaan soluvälitteisen immuniteetin. Vaihtoehtoisesti anti- geeni voi myös stimuloida B-lymfosyyttejä aloittamaan va- m *t. päiden vasta-aineiden tuotannon ja erittämisen vereen ja ; i « . muihin kehon nesteisiin (humoraalinen immuniteetti) ja voi t « « · * • « « « * 2 104374 toimia B-lymfosyyttien kanssa. Kehon suojaavan immuunivasteen kehittyminen riippuu jommankumman tai toisen näistä systeemeistä stimuloitumisen kynnystason saavuttamisesta, toisin sanoen B-solujen aktivoitumisesta yhdessä aktivoi-5 tujen T-solujen kanssa (katso edellä). Väliaikainen immuniteetti tulehdusta vastaan voidaan usein saada aikaan antamalla yksilölle ennalta muodostettuja vasta-aineita toiselta saman tai eri lajin yksilöltä; tämä tunnetaan passiivisen immuniteetin nimellä. Esimerkki tällaisesta 10 immuniteetista on äidin vasta-aineiden siirtymisen istukan kautta tai maidon välityksellä sikiöön tai vastasyntyneeseen antama suoja. Toinen esimerkki on poolattu aikuisten gammaglobuliini, jota voidaan käyttää tuhkarokon, vesirokon, maksatulehduksen, isorokon tai jäykkäkouristuksen 15 estämiseksi tai sairauden vaikutusten modifioimiseksi. Nämä saadut vasta-aineet kuluvat lopulta vuorovaikutuksessa antigeenien kanssa tai keho hajottaa ne ja siten suoja lopulta menetetään. Pysyvämpi suoja saadaan aktiivisilla immunisoinneilla rokottamalla, jolloin isännän oma immuu-20 nivaste stimuloituu tuottamaan suojaavia vasta-aineita, aktivoimalla B- ja T-lymfosyyttejä. Lyhyesti kuvattuna ro-kotus antaa aktiivisen suojaavan immuniteetin käyttämällä ! hyväksi antigeenin vaaratonta tai ei-virulenttia muotoa, esim. tapettua tai geneettisesti muutettua bakteeria, tai ^ e 25 mikro-organismin soluseinästä tai kapselista eristettyä • · · : ·* polysakkaridia tai glykoproteiinia, immuunisysteemin en- • · · simmäisenä ärsykkeenä. Tämä saa aikaan melko hitaan vas- • · · · teen vasta-aineiden tuottamisessa, jolloin syntyy vasta- ainepiikki, joka sitten laskee. Keho on kuitenkin hälyy-30 tetty antigeenin olemassa olon suhteen ja seuraavalla ker-;*·*: ralla, kun altistuminen tapahtuu oletettavasti elävälle, • . virulentille organismille, havaitaan toinen vaste, jolloin esiintyy paljon nopeampi ja runsaampi vasta-aineiden tuot- I · · * ' taminen. Tämä toinen vaste on tavallisesti riittävä estä- • « • · · • · · • · 3 104374 mään mikro-organismin asettumisen kehoon riittävästi kyetäkseen aiheuttamaan täysin puhjennen infektion.

2.1.1. B-solun aktivaation mekanismi Kun antigeeni tulee kehon sisään, fagosytoivat 5 makrofagit saattavat niellä ja hajottaa ainakin osan siitä; toiset dendriittiset makrofagit (antigeenin esittelevät solut eli APCt) ottavat antigeenin pintamembraanilleen tarkoituksenaan esittää ne lymfosyyteille ja aktivoida nämä. Aikaisin B-solun kehityksessä kukin solu kehittää 10 sitoumuksen tietyn antigeenin sitomisspesifisyydeksi ja tuottaa vasta-ainetta, joka on spesifinen sen solupinnal-la olevalle antigeenille. Antigeenin ensiesittely antigeeni-spesifiselle B-solulle johtaa hitaasti nousevaan vasta-aineen synteesiin tavallisesti IgM:n dominoidessa. Tämä on 15 primaarinen vaste, joka on se vastetyyppi, joka tyypillisesti stimuloidaan rokottamalla; se saa aikaan B-lymfosyy-tin kypsymisen plasmasoluksi, joka on erittäin erikoistunut vasta-aineiden tuottamiseen. Kohdatessaan saman antigeenin toisen kerran yleensä antigeeniä kantavalle eläväl-20 le mikro-organismille altistuttaessa systeemi on jo oppinut tunnistamaan antigeenin ja tapahtuu paljon nopeampi ja suurempi vaste (sekundaarinen vaste), jota dominoi igG. Tämä "oppiminen" perustuu pitkäikäisiin muistisoluihin, jotka kiertävät jatkuvasti ensimmäisen antigeenille altis-25 tumisen jälkeen; nämä muisti-B-solut kantavat pinnoillaan • · · ; *.* immunoglobuliineja, jotka sitoutuvat vahvasti uudelleen- ·*· ϊ,,,; tunkeutuvaan antigeeniin ja tuottavat nopeasti uuden vas- : ta-aineen ja parhaimmissa olosuhteissa estävät infektoivan organismin aiheuttamasta sairautta.

30 2.1.2 B- ja T-solujen yhteistyö .···. Edellä esitetään erittäin yleisellä tavalla B-so- • · · lun stimuloitumisen ja vasta-aineiden tuotannon mekanismi. Todellisuudessa kuitenkin B-solut eivät toimi täysin itse-• näisesti suojaavaa vastetta muodostettaessa. Vaikka T-so- 35 lut eivät itse eritä vasta-aineita, tarvitaan usein yhtä (

HIM

4 104374 T-solutyyppiä, auttaja-T-soluja, auttamaan B-solujen stimuloi tumista, koska joidenkin antigeenien vuorovaikutus pintaan sitoutuneiden vasta-aineiden kanssa ei useinkaan yksinään riitä stimuloimaan B-solujen kasvua ja liukoisten 5 vasta-aineiden erittämistä. Auttaja-T-solut ovat myös vuorovaikutuksessa ja tunnistavat antigeenejä antigeenin esittelevien makrofagien pinnalla ja kehittävät antigeenin tunnistamisen. Sitten T-solut tunnistavat antigeenin makrofagien pinnalla ja välittävät lepäävien B-solujen 10 aktivointia ja erilaistumista. Liukoisia tekijöitä erittä mällä B-solun kasvutekijät lisäävät aktivoituneiden B-so-lujen lukumäärää vuorovaikutuksellaan niiden pintaresepto-rien kanssa ja kypsymistekijä pysäyttää proliferaation ja stimuloi erilaistumisen vasta-ainetta erittäviksi plasma-15 soluiksi.

Tiettyjen antigeenien spesifisten tyyppien täytyy saada apua T-soluilta synnyttämään sopiva vaste T-soluis-ta. Yleisesti sanottuna nämä antigeenit, joissa determinantti esiintyy vain kerran molekyyliä kohti, kuten asym-20 metrinen proteiini, ovat erittäin riippuvaisia T-solun vuorovaikutuksesta ja niiden täytyy tukeutua sen muihin determinantteihin tai T-solun epitooppihin molekyylin pinnalla, jotta T-solut tunnistaisivat ne. Siten T-solu oletettavasti lähettää auttavan signaalin B-solulle, mikä 25 auttaa B-solujen antigeenistimulaatiota olemaan tehokkaam- • * · : ·’ pi.

• · · ·...' 2.2 Kantajavaikutus iti V· Tietyt molekyylityypit, kuten pienet peptidit tai hapteenit, ovat itsessään tuskin lainkaan immunogeenisiä 30 tai ovat heikosti immunogeenisiä, eivätkä ne pysty tuot- ·*;*; taamaan vasta-ainevastetta missään olosuhteissa. Toiset • , molekyylit, kuten tietyt bakteeriperäiset kapselipolysak- »•lit karidit (CPt) voivat olla erittäin immunogeenisiä aikui- t I t t l sissa, mutta heikosti kehittyneessä lapsessa immuunisys-35 teemi ei pysty tuottamaan riittävää suojaavaa vastetta.

I * tiili • 5 104374

Immuunivasteen indusoimisessa heikosti immunogee-nisillä molekyyleillä, kuten pienillä peptideillä, hap-teeneilla, CP:illä ja vastaavilla molekyyleillä, kohdattujen ongelmien kiertämiseksi näiden immunogeenisyyttä on 5 yritetty parantaa sitomalla ne "kantajamolekyyleihin". Nämä kantajat ovat tavallisimmin suuria immunogeenisiä proteiineja; näiden konjugaattien tarkoituksena on jäljitellä T-solun yhteistyövaikutusta, jota esiintyy luonnostaan immunogeenisillä molekyyleillä. Toisin sanoen kanta-10 jaan kovalenttisesti sitoutunut polysakkaridi saa aikaan T-solujen osallistumisen vasta-aineiden tuotantoon siten, että T-solu reagoi kantajassa olevien determinanttien läsnäoloon. Sitten T- ja B-solujen vuorovaikutus etenee tavalliseen tapaan, kuten edellä kuvattiin suurille, immu-15 nogeenisille proteiineille. Kiinnittämällä T-solut kanta-jadeterminantteihin B-solut aloittavat vasta-aineen tuotannon eivät pelkästään itse kantajaa vastaan vaan myös sitoutunutta polysakkaridimolekyyliä vastaan. Tätä lähestymistapaa pienten tai heikosti immunogeenisten molekyy-20 lien immunogeenisyyden lisäämiseksi on käytetty menestyksellisesti vuosikymmenten ajan [katso esimerkiksi Goebel et ai., J. Exp. Med. 69 (1939) 53] ja on kuvattu monia rokotekoostumuksia, joissa puhdistettuja kapselipolymeere-jä on konjugoitu kantajaproteiineihin tehokkaampien roko- , 25 tekoostumusten muodostamiseksi käyttäen hyväksi tätä "kan- • · · ; ’ tajavaikutusta".

f · '··' Esimerkiksi Schneerson et ai. [J. Exp. Med. 152 • · · * (1980) 361 - 376] kuvaavat Haemophilus influenzae b -po lymeerin proteiinikonjugaatteja, jotka antavat immuni-Γ: : 30 teetin tuon mikro-organismin aiheuttamia tunkeutuvia tau- teja vastaan. Konjugoinnin tarkoituksena oli ohittaa ikään * . liittyvä kapselipolymeerien immunologinen käyttäytyminen . lapsissa. Polymeerit konjugoitiin lukuisiin eri proteii neihin, kuten seerumin albumiiniin, Limulus polyphemus • · I * · • t · • f 6 104374 -hemosyaniiniin ja difteriatoksiiniin käyttäen kytkentäai-netta, kuten adipiinidihydratsiinia.

PRP:n (polyribosyyliribitolifosfaatti, H. influenzae b:n kapselipolymeeri) konjugaattien on osoitettu ole-5 van tehokkaampia kuin pelkkään polysakkadidiin perustuvat rokotteet [Chu et ai., Infect. Immun. 40 (1983) 245;

Schneerson et ai., Infect. Immun. 45 (1984) 582 - 591]. Konjugoinnin on myös osoitettu sivuuttavan heikon vasta-ainevasteen, joka havaitaan yleisesti lapsilla immunisoi-10 taessa vapaalla polysakkaridilla [Anderson et ai., J. Pediatr. 107 (1985) 346; Insel et ai., J. Exp. Med. 158 (1986) 294].

Geyer et ai. (Med. Microbiol. Immunol. 165 (1979) 171 - 288] valmistivat konjugaatteja, jotka muodostuivat 15 tietyistä Klebsiella pneumoniae -bakteerin kapselipoly-sakkaridifragmenteista kytkettyinä nitrofenyylietyyliamii-niliittäjään pelkistävän aminaation kautta ja sitten deri-vatisoitu sokeri kiinnitettiin proteiiniin atso-kytkennän avulla.

20 2.2.1 Kantajaproteiinit

Se, että kantaja-aineperiaatteen käyttö muodostaa . . tehokkaan menetelmän kapselipolymeerejä sisältävien ro- kotteiden parantamiseksi, on laajalti hyväksytty ajatus.

' Näillä polymeeri-proteiinikonjugaateilla on kuitenkin ♦ * * '« '· 25 haittansa erityisesti ihmiskäytössä. Esimerkiksi eetti- ♦ · · • ♦ ♦ : .* sesti ihmisille antoon mahdollisina kantajaproteiineina käytettäviksi hyväksyttyjen proteiinien lukumäärä on suh-· teellisen rajoitettu. Tällä hetkellä käytettävissä olevat kaksi ensisijaista proteiinia ihmiskäyttöön ovat tetanus-;*·*: 30 toksoidi ja difteriatoksoidi. Vielä yksi arvokas kantaja- proteiini on CRM197, proteiini, joka sisältää yhden aminoha- • , pon muutoksen natiiviin difteriatoksiiniin verrattuna, » « * I i « i »

I I

mutta joka itsessään ei ole myrkyllinen ja sillä on säily nyt oleellisesti identtinen natiivin proteiinin immunogee- 35 nisyys. Näiden tunnettujen kantajaproteiinien rutiinikäyt- 7 104374 töön vaikuttavat myös monet näkökohdat. Esimerkiksi käytettävissä olevien proteiinien rajoitettu määrä tarkoittaa sitä, että suuri joukko rokotetuotteita perustuu yhdelle näistä proteiineista; monet rokotukset aineilla, jotka on 5 konjugoitu näihin lukumäärältään rajoitetuihin kantajiin, lisää sitä mahdollisuutta, että ei-toivottuja reaktioita näille proteiineille voi esiintyä toistuvien immunisointien seurauksena. Etukäteen olevien vasta-aineiden läsnäolo saattaa myös indusoida haitallisia paikallisia tai 10 systeemisiä immunologisia herkistymisreaktioita. Lisäksi on olemassa myös se mahdollisuus, että konjugaatin sisältämä proteiini saattaa reagoida ristiin isännän normaalin kudoksen kanssa ja siten nostattaa autoimmuunityyppisen ilmiön mahdollisuuden. On myös mahdollista, että epitoopin 15 suppressioilmiö saattaa tapahtua käytettäessä konjugaatti- rokotteita. Lyhyesti kuvattuna tämä ilmiö, jonka kuvasivat ensimmäisinä tulivuorikotilon hemosyaniinikonjugaateille Herzenberg et ai. [J. Exp. Med. 155 (1982) 1741] ja teta-nustokdoidikonjugaateille Joliet et ai. [Biochem. Bio-20 phys. Res. Comm. 117 (1983) 359] ja Schulte et ai. [J.

Immunol. 135 (1985) 2319] havaitaan, kun immuniteetti kon-,·, jugaatin sisältämälle proteiinille esiintyy jo rokotetta-

I

vassa yksilössä ja häiritsee vasteen muodostumista kova-lenttisesti kytketylle polysakkaridille. Vaikkakaan tätä \'m . 25 ei ole vielä kuvattu ihmisillä, tällä suppressiolla (jos • · · • ·’ sitä esiintyy) voi mahdollisesti olla vakavia vaikutuksia • · · ·...* konjugaattirokotteiden kehittämiseen.

·*· V ' Lopuksi koska proteiinit ovat biologisen prosessin tuotteita, niillä esiintyy useita sisäsyntyisiä vaikeuk-ϊ’ϊ’: 30 siä. Ensiksikin biologisen systeemin tuotteena proteiinis- j*;’; sa esiintyy väistämättä vaihtelua erästä toiseen; tämä • , vaihtelu saattaa mahdollisesti muuttaa proteiinin T-solus- ; »iiri | ta riippuvaisia ominaisuuksia tai sen kokonaisantigeeni- syyttä. Siten tarvitaan tiukempaa tuotannon monitorointia, 35 mihin liittyy kustannusten nousua. Toiseksi biologisen • · III’* • β 104374 tuotteen valmistukseen ja puhdistukseen liittyy selviä kohonneita kustannuksia.

Selvästi siis tarvitaan vaihtoehtoa tällä hetkellä saatavissa oleville konjugaattirokotteille, joilla välte-5 tään immunologiset vaikeudet, jotka liittyvät näiden rokotteiden käyttöön ja jotka kuitenkin säilyttävät oleellisesti saman immunogeenisyyden kuin tunnetut tehokkaat rokotteet. Nyt on osoitettu, että on mahdollista saada sellainen rokote konjugoimalla antigeeni, antigeenide-10 terminantti tai hapteeni bakteerituotteen T-solun epi-tooppiin.

2.3 T-solun determinantit Tällä hetkellä ei ole vielä selvää, kuinka T-solut tunnistavat proteiineja tai minkä T-solu tunnistaa immuno-15 geeniseksi determinantiksi.

Useiden vuosien ajan on oltu yleisesti yhtä mieltä siitä, että proteiinien antigeenisillä vasta-aineeseen si-toutumisdeterminanteilla on kaksi erilaista rakennetta. Proteiinien determinantit voivat esiintyä primaarisen sek-20 venssin lyhyinä segmentteinä, jotka sisältävät aminohapot , , suoraan kytkettyinä peptidisidoksin. Tällaiset determi- nantit on nimetty "sekventiaalisiksi" tai "jatkuviksi" determinanteiksi. Vaihtoehtoisesti determinantti voi muodostua aminohapoista, jotka ovat kaukana toisistaan • I 1 « V 25 primaarisekvenssissä, mutta jotka ovat avaruudellisesti lähekkäin sekundaarisen yhteenkiertymisen vuoksi. Deter-minantit, joilla on tämä rakenne, on nimetty "topografisiksi" tai harvemmin "epäjatkuviksi" determinanteiksi. Lisäksi ollaan yleisesti yhtä mieltä siitä, että vasta- * ·* * .··/. 30 aineet tunnistavat proteiinin saavutettavissa olevia pin- • · · ta-alueita, jotka ovat konformaatiosta riippuvaisia ja *** ’ joiden pituus on vähintään 5-7 aminohappotähdettä.

T-solun proteiinien tunnistaminen on monimutkai-; sempi tapahtuma kuin vasta-aineen sitoutuminen ja sen 35 vuoksi se tunnetaan huonommin. T-solu j en on yleisesti 9 104374 ajateltu tunnistavan jatkuvia determinantteja. Monta vuotta sitten osoitettiin, että T-solut pystyivät tunnistamaan sekä proteiinin natiivin että denaturoidun muodon toisin kuin vasta-aine [Maizels et ai., Eur. J. Immunol.

5 10 (1980) 509]. Tämän havainnon tulkittiin osoittavan T- solujen tunnistavan pelkästään sekventiaalisia determinantteja ja osoittavan kahtiajakoisuutta T- ja B-solujen proteiinin tunnistamisessa (Maizels et ai., yllä). Vaikka ei vakiintuneena, käsitys, että T- ja B-solut tunnistavat 10 periaatteellisesti eri rakenteita, kuitenkin säilyy [Benjamin et ai., Ann. Rev. Immunol. 2 (1984) 67].

Ristiriitaisuus siitä, mitä T-solu tunnistaa determinantiksi, ulottuu myös siihen, kuinka T-solu havaitsee proteiinin. On hyvin osoitettu, että immuunisysteemi 15 tunnistaa proteiinin geneettisesti säädellyllä tavalla ja että T-solu havaitsee proteiinit yhdessä Ia-molekyylin kanssa antigeenin esittelevän solun pinnalla. On ehdotettu, että APC kohtaa ensin proteiinin, nielaiseen sen ja hajottaa proteiinin pienemmiksi fragmenteiksi. Alkuperäi-20 sen proteiinin pienet fragmentit ekspressoidaan sitten Ia:n kanssa APC:n pinnalle, jossa T-solut voivat sen tunnistaa. Niinpä T-solu voisi nähdä vain "prosessoidun" peptidi fragment in.

Vaikka vieläkään ei ole selvää, mitä T-solu ha-; . 25 vaitsee, monet, erilaiseja malleja käyttävät ryhmät ovat :>4>ϊ yhtä mieltä siitä, että 7-17 aminohappotähdettä sisäl- :*·*: tävä alue tarvitaan tunnistukseen. Jo vuonna 1972 osoi- m tettiin, että 7 tähdettä sisältävä poly-L-lysiinipolymee- .*:·. ri indusoi viivästyneen tyyppisen yliherkkyyden marsuilla • · » 1 2 3 4 5 6 [Schlossman, Transplant Rev. 10 (1972) 97]. Myöhemmät 2 • * · 3 tutkimukset monilla erilaisilla luonnontuotteilla, kuten ’* ’ fibrinopeptidillä, influenza-hemagglutiniinilla, syto- 4 kromilla, lysotsyymillä, ovalbumiinilla ja myoglobiinil-.·. : la, ovat osoittaneet minimipeptidikoon T-solujen stimu- 5

a I

6 lointiin olevan 7-17 aminohappotähdettä. Tietyn spesifi- 10 104374 syyden omaavia T-soluklooneja käyttäen havaittiin, että tarvitaan koko 10 - 14 tähdettä T-soluvasteen saamiseksi [Atassi et ai., Biochem. J. 246 (1987) 3037 - 312]. T-so-lun tunnistamiseen tarvittava suurempi peptidikoko ver-5 rattuna vasta-aineen sitomiseen tarvittavaan 5-7 tähteeseen voi viitata ylimääräisiin tähteisiin, jotka tarvitaan determinantin ekspressioon Ia-molekyylin yhteydessä.

Ia:n ja synteettisten peptidien vuorovaikutus on todellakin osoitettu monilla malleilla. Ia-sitoutumisessa 10 mukana oleva alue, agretooppi, pidettiin selviönä [Katz et ai., J. Mol. Cell Immunol. 1 (1983) 3]. Tämän jälkeen laita sisältäviä tasomaisia membraaneja on käytetty synteettisten peptidien esittelemiseksi T-soluille [Watts et ai., PNAS 81 (1984) 7564]. Viimeaikaisemmat tutkimukset 15 ovat osoittaneet synteettisten peptidien sitoutuvan suoraan Ia-molekyyleihin [Babbett et ai., Nature 317 (1985) 359; Buss, PNAS 83 (1986) 3968], jotka esiteltiin geneettisesti rajoitetulla tavalla Ia-molekyylin alkuperästä riippuen [Groillet et ai., Science 235 (1987) 865]. Suu-20 relta osin näiden tutkimusten vuoksi on väitetty, että T-soluepitooppi muodostuisi hydrofiilisestä alueesta, joka voi olla vuorovaikutuksessa T-solun reseptorien kanssa ja hydrofobisesta agretoopista, joka sitoutuu Ia-molekyyleihin. Lisäksi oletetaan, että nämä fragmentit, jotka edus- ; 25 tavat jatkuvia determinantteja, muodostuisivat alkuperät- • · · sen proteiinin proteolyyttisissä prosessoinnissa.

Yritettäessä ennustaa vasta-aineen sitomispaikkoja tai T-solun determinantteja on käytetty useita erilaisia lähestymistapoja. Useita vuosia sitten Hopp ja Woods [PNAS 30 78 (1981) 3824; EP-hakemusjulkaisu 0 056 249; ZA-patentti • · · *· e 823 952] määrittelivät numeerisen hydrofobisuus/hydrofii- * ’ lisyys-indeksin jokaiselle aminohapolle ja tutkivat usei- den proteiinin primaarisekvenssin tällä indeksillä. Heidän analyysiensä perusteella tunnetut proteiinien vasta-aineen i 1 35 sitomispaikat korreloivat hydrofiilisiin alueisiin. Kyte • · 11 104374 ja Doolittle [J. Mol. Biol. 157 (1982) 105 - 132] käyttivät samanlaista lähestymistapaa käyttäen hieman erilaista derivoinnin numeerista indeksiä.

Myöhemmin on yritetty korreloida proteiinialueet, 5 joilla esiintyy suurempaa taipuisuutta tai segmentaalista liikkuvuutta, vasta-aineen sitomisalueisiin [Tainer et ai., Nature 315 (1985) 327; Ann. Rev. Immunol. 3 (1985) 501; Westhoff et ai., Nature 311 (1984) 123]. Tässä lähestymistavassa röntgensäde- tai neutronidiffraktiomal-10 leista saadut tulokset antavat arvion tähteen suhteellisesta konformationaalisesta vaihtelevuudesta, joka ilmaistaan atomisena lämpötilatekijänä. Graafinen esitys atomi-sisesta lämpötilatekijästä tähteen numeron funktiona osoittaa suhteellista liikkuvuusastetta tietyn proteiinin 15 polypeptidiketjussa. Korkean liikkuvuuden alueiden ajateltiin korreloivan tunnettuihin vasta-aineen sitomispaikkoi-hin (Tainer et ai., yllä).

Jotkut tutkimusryhmät ovat pitäneet T-solujen determinantteja amfipaattisen rakenteen omaavina, toisin 20 sanoen determinantin on ajateltu muodostuvan hydrofiili-sestä alueesta, joka sitoutuu T-solun reseptoriin ja myös hydrofobisesta alueesta, joka sitoutuu Ia-molekyyleihin.

i · ·

Lysotsyymin 16 tähteen pituisen T-solun determinantin havaittiin muodostuvan lyhyestä, jatkuvasta hydrofUlisten . 25 tähteiden sarjasta [Allen et ai., PNAS 81 (1984) 2489].

;***: Muut ovat kuitenkin ehdottaneet, että T-solujen determi- :*·*: nanteilla on taipumus muodostaa pysyviä, helikaalisia ra- * kenteita, joissa hydrofiiliset tähteet asettuvat suoraan riviin heliksin toisella pinnalla, kun taas hydrofobiset • · · J··. 30 tähteet asettuvat suoraan riviin vastakkaisella pinnalla [DeLisi ja Berzofsky, PNAS 82 (1985) 2489; Watts et ai., * *·**’ PNAS 82 (1985) 7048]. Algoritmi tietyn proteiinisekvens- sin etsimiseksi alueille, joilla on taipumus muodostaa helikaalisia, amfipaattisia rakenteita, on kehitetty 35 (DeLisi ja Berzofsky, yllä) ja sitä on sovellettu usei- 12 104374 siin proteiinimalleihin. Sitä vastoin monet tutkijat ovat edelleen sitä mieltä, että T-solun determinantit liittyvät proteiininsisäisiin beeta-käännöksiin [Katz et ai., J. Immunol. 135 (1985) 1386]. Selkeä kuva siitä, mitkä teki-5 jät ovat tärkeitä T-solujen determinanttien ennustamisessa on vielä saamatta.

Useat tutkimusryhmät ovat havainneet, kuinka tärkeää on sisällyttää T-solujen determinantti osaksi synteettistä rokotetta. Milch et ai. (US-patenttijulkaisut 10 4 599 230 ja 4 599 231) ovat syntetisoineet peptidirokot- teen, joka muodostuu hepatiitti B -viruksen pinta-antigeenin T- ja B-soludeterminanteista. Samoin malariarokote muodostettiin circumsporozoiittiproteiinin auttaja-T-solun epitoopista kovalenttisesti kytkettynä tämän proteiinin 15 tärkeimpään B-solun determinanttiin [Good et ai., Science 235 (1987) 1059]. Mielenkiintoista on, että auttaja-T-so-lujen determinantti ennustettiin DeLisin ja Berzofskyn, yllä, algoritmien avulla. Näissä molemmissa tutkimuksissa käytettiin T- ja B-solun determinantteja samasta pro-20 teiinista rokotteen muodostamiseksi. Toisin kuin edellä , , Leclerc et ai. [Eur. J. Immunol, 17 (1987) 269] muodos- tivat rokotteen kopolymeroimalla streptokokkiperäinen pep-' tidi, S - 34, joka sisältää sekvenssissään sekä T- että B- solujen determinantit, viruspeptidiin, joka edustaa hepa-> . 25 tiitti B -viruksen B-solun determinanttia. T-solun deter- minantti, joka tässä tapauksessa vastasi oleellisesti na-:*·*: tiivia peptidiä, teki viruspeptidin immunogeeniseksi toi- mien siten kantajamolekyylinä.

3. Keksinnön yhteenveto p···, 30 Keksinnön kohteena on oligopeptidi, jolle on tun- • · · nusomaista, että se koostuu oleellisesti bakteeriperäisen "’** toksiinin, CRM:n tai toksoidin vähintään yhdestä T-solun '·" epitoopista. Toisin sanoen keksintö antaa käyttöön uusia : eristettyjä tai synteettisiä bakteerituotteiden T-solun 35 epitooppeja ja tällaiset epitoopit ovat käyttökelpoisia 13 104374 valmistettaessa rokotekoostumuksia, joiden käyttökelpoisuus on analoginen aikaisemmin tunnettujen rokotteiden kanssa, joissa käytetään kantajaproteiineja vasta-ainetuotannon lisäämiseksi. Tällaisia epitooppeja ovat baktee-5 ritoksiineista, erityisesti difteriatoksiinista tai sen kanssa ristiin reagoivasta materiaalista (CRM) ja tetanus-toksiinista, eristetyt epitoopit. Tässä selitysosassa ja vaatimuksissa käytettyinä keksinnön mukaiset T-solun epitoopit viittaavat itse T-solun epitooppeihin.

10 T-solun epitooppeja voidaan käyttää yhdessä ulko puolisen B-solun determinantin kanssa, jotta saataisiin tuotetuksi huomattavia määriä vasta-ainetta B-solun determinanttia vastaan tuottamatta vasta-aineita T-solun epi-toopeille. Nyt on yllättäen keksitty, että tällainen yh-15 distelmä voi tuottaa oleellisesti yhtä tehokkaan vasta-aineen tuotannon tason kuin tällä hetkellä yleisesti käytetyt B-solun determinantti-kantajaproteiini-yhdistelmät. Tällaisen yhdistelmän saatavuus ja osoitettu käyttökelpoisuus tekevät nyt mahdolliseksi välttää potentiaalisesti 20 ei-toivottuja immunologisia seurauksia, joita voi liittyä . . kantajaproteiinipohjaisten rokotteiden käyttöön. Lisäksi itse T-solun epitoopin käyttö vastakohtana suuremman, i « 1 _ epitoopin sisältävän peptidin käytölle tuottaa taloudel- ' ' lista hyötyä, sillä epitooppi voidaan helposti synteti- ; V 25 soida, samoin kuin turvallisuushyödyn välttämällä kokonai- ··· sen proteiinin käytön.

:*! : Keksintö antaa käyttöön myös menetelmän im- munogeenisen konjugaatin valmistamiseksi. Keksinnön mukai-selle menetelmälle on tunnusomaista se, että kytketään 30 polysakkaridiantigeeni oligopeptidiin, joka koostuu oleel- • · · ’ ’· lisesti bakteeriperäisen toksiinin, CRM:n tai toksoidin M··· * ’ vähintään yhdestä T-solun epitoopista. Nämä konjugaatit sisältävät eristetyn tai synteettisen T-solun epitoopin .·. : konjugoituna antigeeniin, antigeenideterminanttiin tai • « 35 hapteeniin. Näiden kahden elementin konjugointi rokote- φ » 14 104374 koostumuksessa mahdollistaa tehokkaamman vasta-ainevaste-tason antigeenille. Nämä rokotteet ovat käyttökelpoisia tuotettaessa vasta-aineita minkätyyppiselle antigeenille tahansa, mukaan lukien ei vain patogeenisiin organismeihin 5 (bakteereihin, viruksiin tai parasiitteihin) liittyvät antigeenit vaan myös allergeenit ja syöpään liittyvät antigeenit ja vastaavat. Konjugaatit ovat kuitenkin erityisen käyttökelpoisia formuloitaessa rokotekoostumuksia käyttäen antigeenejä, jotka ovat vain heikosti immunogee-10 nisiä, toisin sanoen antigeenejä, jotka perinteisesti on ollut pakko konjugoida kantajaproteiineihin tyydyttävän vasta-aineiden tuotantotason saavuttamiseksi.

Näiden konjugaattien saatavuus mahdollistaa menetelmän immuunivasteen stimuloimiseksi lämminverisillä 15 eläimillä, jossa menetelmässä eläimelle annetaan immuno-geeninä tehokas määrä mielenkiinnon kohteena olevaa antigeeniä konjugoituna bakteerituotteen T-solun epitooppiin. Menetelmä sisältää suojaavan immunisoinnin perinteisessä mielessä, toisin sanoen injektion tiettyä mikrobipatogee-20 niä vastaan, mutta sen on tarkoitettu sisältävän myös min- , , kä muun tyyppinen käsittely tahansa, jossa lisääntynyt • « < ' vasta-aineen tuotanto olisi toivottavaa, esimerkiksi tätä menetelmää voidaan käyttää kasvainspesifisten tai kasvaimiin liittyvien antigeenin vastaisten vasta-aineiden sti- 25 mulointiin, tai tuotettaessa vasta-aineita yleisille al- 1**^ lergeeneille. Menetelmä on myös erityisen käyttökelpoinen immunisoitaessa ihmislapsia, joiden immuunisysteemi ei vielä ole täysin kehittynyt. Tätä menetelmää voidaan käyt- ,···. tää sekä terapeuttisessa että ennaltaehkäisevässä mieles- • · · ’···. 30 sä.

: : : *. 4. Kuvioiden kuvaus

Kuvio 1 esittää CRM:n primaarisekvenssin normaalina « yksikirjaimisena koodina. Ne alueet, joilla on taipumus .·. : muodostaa amfipaattisia helikaalisia rakenteita, on mer- • · ' 35 kitty numerolla 1 ja ne sekvenssit, joilla on mahdollista T-solun epitooppiaktiivisuutta on alleviivattu.

is 104374

Kuvio 2 esittää peptidin 6 HPLC-analyysin. A. Raa-kapeptidin 6 kromatogrammi; pylväs osoittaa yhdistetyt alueet. B. Peptidin 6 (edellä saatujen yhdistettyjen fragmenttien) uudelleenkromatografointi; synteettinen 5 peptidi eluoitiin tekstissä kuvatulla tavalla.

Kuvio 3 esittää synteettisen peptidin 6 PTH-joh-dannaisten valittuja kromatogrammeja,- peptidi sekvenoitiin tekstissä kuvatulla tavalla; luvut osoittavat Edman-syk-lit; piikit a ja b, jotka toimivat sisäisinä merkkiainei-10 na, edustavat N',N-dimetyyli-N'-fenyylitioureaa ja vastaavasti N',N-difenyylitioureaa. Sykli 2 osoittaa ty-rosiinin, sykli 5 valiinin, sykli 9 isoleusiinin, sykli 17 asparagiinin, sykli 22 proliinin ja sykli 28 glysiinin läsnäoloa.

15 Kuvio 4 esittää valittujen, PRP:tä vastaan muodos tettujen monoklonaalisten vasta-aineiden avulla todettujen peptidikonjugaattien Western blot -analyysia; vasemmalta oikealle rivit sisältävät molekyylipainovakion (LMW) ja konjugaatit PRP-(peptidi 357 - 380), PRP-(peptidi 306 -20 334) ja PRP-CRM, PRP:n ja lyhyt PRP-(peptidi 366 - 383) . -konjugaatin.

I > '

Kuvio 5 esittää diagrammin muodossa kantajalle, I I 1 DT:lle, esialtistuksen vaikutuksen immuunivasteeseen PRP-

I I

'· '· (306 - 334) -konjugaatilla.

i i » i 25 Kuvio 6 esittää diagrammin muodossa vasta-ainevas- ·«·

teen RS-viruksen (Respiratory Syncytial Virus) (RSV) F

• · · :#i : -proteiinikonjugaateille.

5. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus .*·*; 5.1. Bakteeriperäiset T-solun epitoopit 3 0 Tämän keksinnön monet sovellutusmuodot perustuvat • · # • ^ siihen havaintoon, että eristetyt tai synteettiset bak-

• ••M

• * teerituotteiden T-solun epitoopit voivat toimia yhtä te- « hokkaasti kuin antigeenien kantajaproteiinit immunisointi-tarkoituksissa. Aikaisemmin ei ole osoitettu, että baktee- I * 35 rituotteen T-solun determinantti voi antigeeniin sidottuna • · toimia samalla tavalla kuin samaan antigeeniin konjugoitu 1β 104374 kokonainen natiivi proteiini. Tieto siitä, että bakteeri-tuotteen T-solun epitooppi voi toimia yhtä tehokkaasti kuin kantajaproteiini vasta-ainevasteen aikaansaamiseksi, on avannut oven kokonaan uudentyyppisille rokotteille, 5 jotka perustuvat eristettyjen T-solun epitooppien käyttöön yhdessä B-solun determinantin tai koko antigeenin kanssa. Seuraavassa tarkastelussa kuvataan yksityiskohtaisesti keinot sopivien T-solun epitooppien identifioimiseksi ja eristämiseksi tässä keksinnössä käytettäväksi. Sen lisäk-10 si, että saadaan samanlaiset immunologiset ominaisuudet, epitooppien käytöllä (vastakohtana kokonaisen natiivin proteiinin käytölle) saatetaan välttää mahdolliset yliherkkyyteen, autoimmuunisuuteen ja perusteelliseen puhdistamiseen liittyvät ongelmat tehokkutta uhraamatta.

15 5.1.1. T-solun epitooppien identifiointimenetelmät

Vaikka bakteerituotteiden T-solun epitooppeja ei olekaan aikaisemmin identifioitu, kirjallisuudessa on kuvattu monia menetelmiä, joita voidaan käyttää mielenkiinnon kohteena olevan bakteerituotteen sisältämän T-solun 20 epitoopin tai sisältämien T-solun epitooppien identifioin-, , tiin. Esimerkiksi DeLisi et ai. [PNAS 82 (1985) 7048; katso myös Margalite et ai., J. Immunol. 138 (1987) 2213] i i ovat ehdoittaneet, että mahdolliset epitooppialueet voidaan paikallistaa identifioimalla molekyylin potentiaali- « * 1 25 set amfipaattiset alfahelikaaliset alueet. Rothbard et ai.

« · · (Modern Trends in Human Leukemia VII, 1986) kuvaavat myös kokeellisen lähestymistavan T-solun epitooppien identifioimiseksi tutkimalla proteiinin primaarisekvenssiä hydro-fobisuuden, varauksen, poolisuuden ja glysiini- tai pro-30 liinitähteiden esiintymisen suhteen. Sekvenssi, jossa va- • ♦ · rattua tähdettä tai glysiinitähdettä seurasi kaksi hydro-*·’ * fobista tähdettä, viittasi mahdolliseen T-solun epitoop- v piin. Bixler et ai. [Immunol. Comm. 12 (1983) 593; J. Im-: munogenet. 11 (1984) 245; J. Immunogenet. 11 (1984) 339] 35 kuvaavat strategian, jossa syntetisoidaan päällekkäisiä synteettisiä peptidejä, jotka käsittävät koko proteiinimo-

«I

« i 17 104374 lekyylin, T-solun epitooppien rajaamiseksi. Gysen'n kuvaama uusi synteesimenetelmä [Giba Foundation Symposium 119 (1986) 130] antaa mahdollisuuden syntetisoida monia eri peptidejä pieninä määrinä, jolloin on mahdollista jälji-5 teliä erilaisia mahdollisia sitoutumispaikkoja, mikä puolestaan sallii molekyylin nopean seulonnan. Perinteisemmät menetelmät, kuten proteiinien entsymaattinen tai kemiallinen hajotus, tuottavat peptidifragmentteja, jotka voidaan helposti testata T-soluaktiivisuuden suhteen. Esimerkiksi 10 entsyymeillä, kuten kymotrypsiini, elastaasi, fisiini, papaiini, pepsiini tai trypsiini, saadaan aikaan rajoitettuja ja ennustettavia fragmentteja pilkkomalla tietyt ami-nohappoliitokset. Samoin kemialliset yhdisteet, kuten N-kloorisukkinimidi-BPNS-skatoli, syanogeenibromidi, muura-15 haishappo tai hydroksyyliamiini, tuottavat myös fragmentteja vaikuttaessaan proteiineihin. Halutun T-soluja stimuloivan aktiivisuuden läsnäolo missä tahansa tietyssä fragmentissa voidaan helposti määrittää saattamalla puhdistetut fragmentit normaaliin T-solun proliferaatiomäärityk-20 seen tai analysoimalla puhdistamattomat fragmentit T-solun , , Western-määritysmenetelmällä [Young et ai., Immunol. 59 (1986) 167].

I « 5.1.2. T-solun epitooppien lähteet

On lukuisia bakteerituotteita, jotka muodostavat i Y 25 käteviä mahdollisesti käyttökelpoisten T-solun epitooppien t · « ϊ,,,ϊ lähteitä sen ansiosta, että natiivia kantamolekyyliä voi- daan käyttää kantajaproteiinina. Esimerkiksi voidaan käyttää erilaisten gram-negatiivisten bakteerien ulkomemb-raaniproteiineja, kuten Haemophilus influenzae'n OMP:tä. 3 0 Monien gram-negatiivisten bakteerien pinnalla esiintyvät • · · "· ^ karvat (fimbrit), kuitumaiset, ei-flagellaariset lisäk- * ' keet, samoin kuin flagelliini, bakteerien flagellojen pro- teiinikomponentti, edustavat mahdollista T-solun determi- i nanttilähdettä. Tiettyjen bakteerien, esim. pertussisbak- t ' 35 teerin, kuitumaiset hemagglutiniinit (FHA) sopivat myös T- solun determinattilähteeksi.

« I

18 104374

Arvokkaimpia bakteerien proteiineja tässä keksinnössä käytettäviksi ovat tunnetut bakteeritoksiinit, joita on käytetty menestyksellisesti kantajaproteiineina perinteisissä rokotekoostumuksissa. Vaikka edellä mainittuja 5 bakteeritoksiineja ja toksoideja on käytetty vuosia ihmisten immunisointiin, tiedetään hyvin vähän siitä, kuinka immuunisysteeni tunnistaa ne. Se vähän, mitä kirjallisuudessa on kuvattu, on ollut keskeneräistä. Triebel et ai. [Eur. J. Immunol. 16 (1986) 47] tutkivat ihmisen perifee-10 risiä valkosoluja T-solureaktiivisuuden suhteen syanogee-nibromidilla pilkkomalla saatuihin difteriatoksiinin frag-mentteihin. Kuitenkin vain rajoitettu suurten fragmenttien joukko otettiin huomioon, eikä T-solun determinanttien tarkka rajaaminen ollut mahdollista. Niinpä bakteeritok-15 siinin tarkkaa T-solun determinanttia ei ole vielä identifioitu.

Tässä kuvattu bakteeritoksiinin T-solun deter-minanttivalmiste voi perustua mihin tahansa tunnettuun toksiiniin, joita yleisesti käytetään natiivissa muodos-20 saan vain heikosti immunogeenisten antigeenisten yhdisteiden kantajina. Tunnettuja bakteeritoksiineja, -CRM:iä tai -toksoideja ovat Pseudomonas-, Staphylococcus-, Strepto-, . coccus- ja Pertussis-bakteerien sekä enterotoksisten bak- ; ' teerien, esim. E. colin, toksiinit, CRM:t ja toksoidit.

25 Yleisimmin hyväksyttyjä kantajaproteiineja ovat kuitenkin • · · *. *ϊ tetanus- ja difteriatoksoidit, jotka käytössä ovat osoit- «I i • *.· tautuneet turvallisiksi. Erityisen edullinen T-solun epi- • · · ϊ,#,ϊ tooppi eristetään CRM197: stä, difteriatoksiinin myrkyttömäs- tä mutantista.

30 5.1.3 CRM197-epitoopit "Ristiinreagoivat aineet" eli CRM:t ovat geneetti-,··,·. sesti muunnettuja proteiineja, jotka antigeenisiltä omi naisuuksiltaan ovat samanlaisia kuin natiivi proteiini-'' ' toksiini ja ovat kuitenkin myrkyttömiä. Difteriatoksiinin t 35 CRM on jo osoittautunut tehokkaaksi nostattamaan vasta-j ainevasteen bakteerien kapselipolymeereille [Anderson et « « * is 104374 ai., J. Pediatr. 107 (1985) 346]. CMR197:nä tunnettu ris-tiinreagoiva aine on huomionarvoinen, sillä siinä esiintyy yksi ainoa aminohapon muutos ja se on immunologisesti erottamaton natiivista difteriatoksiinista. CRM197-pro-5 teiinia tuottavan Corynebacterium diphtheriae -kannan C7 (β 197) viljelmä on talletettu American Type Culture Collection -talletuslaitokseen, Rockville, Maryland, ja sille on annettu talletusnumero ATCC 53281.

Mahdollisten T-solun determinanttien paikallista-10 miseksi CRM:ssä huomio kohdistettiin proteiinin helikaa-lisiin, amfipaattisiin alueisiin DeLisin ja Berzofskyn teorian mukaan [PNAS 82 (1985) 2489]. Paikka määritettiin algoritmin avulla tietokoneella ja validoitiin vertaamalla saatuja tuloksia valaan sperman myoglobiinin analyysiin 15 DeLisin ja Berzofskyn, yllä, kuvaamalla tavalla. Sitten ohjelmaa sovellettiin tunnettuun CRM197:n sekvenssiin [Collier, Bacteriol. Rev. 39 (1975) 54; Drazin et ai., J.

Biol. Chem. 254 (1979) 5832] . Kuusi CRM-aluetta valittiin yksityiskohtaisen tutkimuksen kohteeksi. Nämä alueet syn-20 tetisoitiin normaalilla vaiheittaisella Merrifieldin kiinteä faasi -synteesillä.

Kun tietyn CRM-alueen oli kokeellisesti varmistettu , , sisältävän T-solun determinantin tai sen osan, determi- I I · nantin tarkat rajat voitiin kartoittaa. Tämä toteutettiin < i · ' 25 käyttäen useita erilaisia synteettisten peptidien joukko- m * · ·. ” ja, jotka systemaattisesti analysoivat mielenkiinnon koh- ·· · • teenä olevan alueen. Ensimmäisessä peptidi joukossa • · « peptidin N-päätä muuteltiin lisäämällä peräkkäin 3-5 luonnollista sekvenssitähdettä kerrallaan pitäen C-pää 30 muuttumattomana. Tämä mahdollistaa N-pään rajan karkean arvioinnin. Rajan sijainnin määrittämiseksi tarkemmin syn-,···, tetisoitiin toinen peptidisarja, joka analysoi tämän alueen, lisäämällä yksi luonnollinen sekvenssitähde kerrallaan N-päähän. Kolmannessa peptidijoukossa C-pään täh-35 teet poistettiin peräkkäin 1-3 tähteen vaiheissa pitäen : N-pää muuttumattomana. Koska tämä johtaa asteittaisesti • » « 104374 20 lyhyempiin peptideihin, mikä voisi vaikuttaa haitallisesti niiden tunnistukseen, oli välttämätöntä korvata koon pieneneminen lisäämällä N-päähän ylimääräisiä tähteitä, jotka eivät kuuluneet proteiinin luonnolliseen sekvenssiin. Kun 5 determinantin sekä N- että C-päät oli kartoitettu, rajattua aluetta vastaava peptidi syntetisoitiin ja varmistettiin T-solun determinantiksi.

Kuviossa 1 mahdollisiksi T-solun epitoopeiksi rajatuista alueista alueella 357 - 383 oleva peptidi aiheutti 10 huomattavan vasteen stimuloitaessa difterialla (DT) herkistettyjä imusolmukesoluja. Lisätutkimukset paikallistivat epitoopin CRM197.-n 369 - 383 -alueeksi. Sekvenssi edustaa CRM197:n ja difteriatoksiinin T-solun epitooppia. Peptidi on kovalenttisesti sidottuna kapselipolymeeriin 15 PRP osoitettu tehokkaaksi nostamaan haluttu vasta-ainevas-te PRP:lie in vivo, eikä se myöskään indusoi vasta-aineita, jotka reagoisivat ristiin koko CRM:n tai DT-toksiinin kanssa. Siten tällä peptidillä on bakteeritoksiinikonju-gaatille toivotut ominaisuudet. Toinen T-solun epitooppi 20 on paikallistettu CRM:n 306 - 334 -alueelle.

5.1.4. CMR:n T-solun epitoopin valmistus

Kuten edellä viitattaessa esimerkkeihin mainittiin, . , peptidin pituutta voidaan muuttaa monella tavalla vaikut- tamatta T-soluvasteaktiivisuuteen ja katsotaankin, että ' 25 tämä keksintö kattaa mitkä tahansa peptidifragmentit, jot- • · · *. ”· ka säilyttävät stimuloivan aktiivisuuden, mutta jotka ei- ·· · • *.· vät aiheuta haitallisia immunologisia reaktioita, joita • « · !<t<· natiivit proteiinit voivat aiheuttaa. Katsotaan myös, että ;T: tämä keksintö kattaa variaatiot aktiivisessa peptidissä, 30 jonka primaarisekvenssiin tehdään aminohapposubstituutioi- ta vaikuttamatta peptidin aktiivisuuteen. Alan ammattimies ,···, tuntee hyvin tällaiset substituutiot. Substituutioita voi- r i * ' f daan tehdä esimerkiksi kyseisten tähteiden poolisuuden, ’ * varauksen, liukoisuuden, hydrofobisuuden, hydrofiilisyyden 35 ja/tai amfipaattisen luonteen samanlaisuuden perusteella.

: Negatiivisesti varattuja aminohappoja ovat asparagiinihap- * I · 21 104374 po ja glutamiinihappo; positiivisesti varattuja aminohappoja ovat lysiini ja arginiini; aminohappoja, joissa on varauksettomia poolisia pääryhmiä tai poolittomia pääryhmiä, joilla on samanlaiset hydrofiilisyysarvot, ovat leu-5 siini, isoleusiini, glutamiini, seriini, treoniini, fe- nyylialaniini ja tyrosiini.

Valmistusmenetelmäksi voidaan valita mikä tahansa peptidisynteesialalla tunnetuista menetelmistä. Yleisemmin käytettyihin menetelmiin kuuluu kytkentä Merrifieldin 10 kiinteä faasi -synteesillä ([J. Am. Chem. Soc. 96 (1964) 2986 - 2983], jossa suojattu aminohappo sidotaan hartsi-partikkeliin. Aminohapot, joissa on funktionaalisia ryhmiä, esim. tyrosiini, suojataan yleensä helposti poistettavalla suojaryhmällä. Jokainen näistä menetelmistä sopii 15 yhtä hyvin tämän keksinnön tarkoituksiin.

5.1.5. Tetanustoksiiniepitoopit CRM197:n T-solun epitooppien identifioinnin lisksi tutkittiin myös tetanustoksiinimolekyyli T-solun epitoopin läsnäolon suhteen. Näiden epitooppien paikallistamiseksi 20 tetanustoksiinimolekyyli pilkottiin kooltaan tunnettuihin fragmentteihin erilaisia proteaaseja käyttäen. Näin muodostetut fragmentit tutkittiin aluksi niiden kyvyn suhteen . stimuloida hiiren T-solujen proliferaatiota. Joukko pääl- lekkäisiä peptidejä, jotka sisälsivät aktiiviset fragmen- ^ 25 tit, syntetisoitiin ja testattiin T-soluaktiivisuuden suh- • · · *· teen. Edulliset epitoopit ovat tetanustoksiinin peptidit ·· · I 961 - 980 ja 1021 - 1040.

• · · 5.2. Antigeeni-T-solun epitooppi-konjugaatit

»M

: Tämän keksinnön mukaiset T-solun epitoopit voidaan 30 arvokkaasti yhdistää käytännössä mihin tahansa antigeeni’; niin, antigeeniseen determinanttiin tai hapteeniin, jolla on lääketieteellistä tai eläinlääketieteellistä mielenkiintoa ja jonka immunogeenisyyden lisäys olisi toivottavaa. Nämä antigeenit voivat esimerkiksi olla bakteeri-, 35 virus-, parasiitti- tai sieniperäisiin infektoiviin ai-neisiin liittyviä ja esimerkkejä näistä ovat pneumokokki- r i i i i i i 104374 22 peräiset polysakkaridit, gonokokkiperäiset ulkomembraanip-roteiinit, Mycoplasma pneumoniae'n adheesioproteiinit tai gram-negatiivisten bakteerien lipopolysakkarideihin liittyvät pintasakkaridit. Alan ammattimies tunnistaa helposti 5 lisää tämäntyyppisiä antigeenejä.

Toinen antigeenisten materiaalien tyyppi, jota voidaan käyttää immunogeenisten konjugaattien B-soluosana, ovat mitkä tahansa tunnetuista allergeeneista. Esimerkkejä allergeenityypeistä, jotka saattaisivat olla käyttökel-10 poisia ovat B-soludeterminantit tuoksukista [Atassi et ai., FEBS Letters 188 (1985) 96], raiheinästä [Standring et ai., Int. Arch. Allergy Appi. Immunol. 83 (1987) 96], pölypunkkiproteiinit Der pl ja Der f [Chapman et ai., J. Immunol. 139 (1987) 1479]; mehiläisen myrkyn fosfolysaatti 15 A2: n hiilihydraattiepitooppi [Weber et ai., Allergy 42 (1987) 464]; penisilloyylideterminantit [Ahlstedt et ai., Int. Arch. Allergy Appi. Immunol. 61 (1980) 91], meritup-pien hiilihydraattideterminantit [Oka et ai., J. Allergy Clin. Immunol. 80 (1987) 57]; ja Ascaris-antigeenit [Dar-20 den et ai., Immunol. Comm. 7 (1978) 393].

Sopiviin antigeeneihin kuuluvat myös kasvaimeen liittyvät antigeenit. Paremmin karakterisoituja anti-, . geenejä ovat karsinoembryonaalinen antigeeni [Kuroki et r i ' ai., Cancer Res. 46 (1983) 300; Laferti ja Krantz, Mol.

'·' ' 25 Immunol. 20 (1983) 421], adenokarsinoomaan liittyvä anti- • · geeni DU-DAN-2 [Lan et ai., Cancer Res. 45 (1985) 305] ja ·· · • *.* gastrointestinaalispankreatiittinen antigeeni [Magnani et ai., Cancer Res. 43 (1983) 5489].

Mahdollisesti mielenkiintoisia ovat myös autoim-30 muunisairauksiin, kuten nivelreumaan ja lupus erythemato-ses -tautiin, liittyvät erilaiset antigeenit.

Edellä esitetystä tulee ymmärtää, että käytettäessä < 4 termiä antigeeni tarkoitetaan joko koko antigeeniä tai ' ' yhtä sen determinanteista ja sen on tarkoitettu sisältävän i 35 myös hapteenimolekyylit, jotka saattaisivat hyötyä immuu- « < i · <

* II

« *

II

23 1 0 4 3 7 4 nivasteen lisäämisestä, mikä tapahtuu konjugaatiossa bakteeriperäiseen T-solun epitooppiin. Edellä oleva antigee-niluettelo on vain esimerkinluonteinen ja alan ammattimiehet tunnistavat helposti muita käyttökelpoisia antigeene-5 ja.

5.2.1. Kapselipolymeerit

Kuten aikaisemmin on mainittu, bakteerien kapseli-polymeerit ovat antigeeniryhmä, joita olisi mahdollista käyttää tehokkaasti rokotteessa, mutta jotka ovat vain 10 heikosti immunogeenisiä nuorissa ihmisissä. Tässä hakemuk sessa käytettynä termi "kapselipolymeerit" viittaa sokeria sisältäviin polymeereihin, kuten sokerien, sokerihappojen, aminosokereiden, polyhydristen alkoholien ja sokerifos-faattien polymeereihin, eikä viittaa aminohappoja sisältä-15 viin polymeereihin. Näihin "kapselipolymeereihin" viita taan lääketieteellisessä kirjallisuudessa usein "kapseli-polysakkarideina", vaikka ne saattavat sisältää muitakin sidoksia kuin glykosidisidoksia ja muita aineosia kuin sokereita, kuten edellä lueteltuja aineita.

20 Kapselipolymeerit (CP) voivat olla peräisin monista erityyppisistä bakteereista. Näitä ovat Haemophilus influenzae, Streptococcus-lajit, kuten pneumoniae (eri- . . tyisesti serotyypit 1, 4, 5, 6A, 6B, 9V, 14, 18C, 19F ja 23F) , pyogenes ja aglactiae, Neisseria meningitidis, Y 25 Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ja Staphy- • 4 · *. ” lococcus aureus.

• 4 · • *.· Eri bakteerien CP:iden immunogeenisyys vaihtelee 4 4 4 •mmm· huomattavasti ihmiselämän ensimmäisen vuoden aikana. Jot- kut ovat kohtalaisen aktiivisia, kuten Streptococcus 30 pneumoniae serotyyppi 3 ja Neisseria meningitidis sero-tyyppi A. Herkkyys koteloituvien bakteerin aiheuttamaan 4 systeemiseen infektioon on suurempi elämän ensimmäisenä « 4 '· _ vuotena. Immunogeeninen vaste monille bakteeriperäisille ' * kapselipolymeereille lapsilla on iästä riippuvainen, tämä 4 4 4 4 4 4 • 4 4 m 104374 tarkoittaa, että immunokompetenssi CP:ille kasvaa aikuisen tasoille noin kuuden vuoden iässä.

Inaktiivisia CP:itä ovat Haemophilus influenzae tyypin b, Streptococcus pneumoniae serotyyppien 6 ja 12 ja 5 Neisseria meningitidis seroryhmän C CP:t. Esimerkkejä CP:istä, jotka stimuloivat keskiasteisen vasteen lapsilla, ovat Streptococcus pneumoniae serotyypit 19 ja 51. Organismeista, kuten Neisseria meningitidis seroryhmästä B, on löydetty myös polysakkarideja, jotka eivät ole immunogee-10 nisiä missään ikäryhmässä.

Ei-bakteeriperäiset polymeerit voivat olla peräisin hiivasta ja sienistä, esimerkiksi Crytococcus neoformans'-ista, tai sakkaridiyksiköitä, joita löytyy yksinomaan syöpäsoluista, tai allergeeneihin liittyvistä sakkaridi-15 yksiköistä.

5.2.2. Muut antigeenit

Muita antigeenejä, jotka ovat käyttökelpoisia im-munogeenisen koostumuksen valmistamisessa, ovat mikrobi-peräiset antigeenit, virusantigeenit, kasvainantigeenit, 20 allergeenit ja autoimmuunisuuteen liittyvät antigeenit. Esimerkkejä mikrobiperäisistä antigeeneistä ovat ulkomemb-raaniproteiinit (esim. Haemophilus influenzae'sta tai . . Branhamella catarrhalis'sta) ja pintaproteiinit (esim.

« i « ';// Streptococcus pyogenes'in M-proteiini) . Esimerkkejä vi- _ « « * '·' ' 25 rusproteiineista ovat RS-viruksen (RSV) F- ja G-proteii- • · e *. *: nit.

·· * • *,· 5.2.3. Antigeeni-epitooppi-konjugaattien valmistus

Kuvatut antigeeni-epitooppikonjugaatit voidaan val-mistaa millä tahansa alalla tunnetulla biologisesti hyväk-30 syttävällä menetelmällä antigeenien kytkemiseksi kanta- jiin. Konjugaattien tehokkaimman hyväksikäytön varmistami- ,*j·. seksi kytkentämenetelmä on edullisimmin kovalenttinen kyt- • · · kentä. Tällä hetkellä on käytettävissä monia tällaisia menetelmiä poly- ja oligosakkaridien, proteiinien ja pep- 9 35 tidien kytkemiseksi peptidikantajiin. Useimmissa menetel- » t • · * • I I • · • * 25 104374 missä muodostetaan joko amiini- tai amidisidoksia tai joissakin tapauksissa tioestereitä.

Kytkentäkemiaa voidaan muuttaa tietyssä määrin T-solun epitoopin modifioitujen analogien synteesin kautta.

5 Tällaisia modifikaatioita voivat esimerkiksi olla lysiinin tai kysteiinin lisääminen peptidin N-päähän välittäjämolekyylin kanssa tai ilman sitä. Tällaisten analogien kykyä stimuloida T-soluja on verrattu modifioimattoman peptidin vastaavaan kykyyn.

10 (a) Polysakkkaridit tai oligosakkaridit peptideihin

Eräs käyttökelpoinen menetelmä sakkaridin kytkemiseksi on pelkistävä aminointi. Poly- ja oligosakkarideilla on vapaita pelkistäviä pääteryhmiä, jotka voidaan aminoida pelkistävästi peptidin N-terminaalisen aminohapon tai ly-15 siinin e-aminoryhmien typpeen. Muodostunut sidos on sekundaarinen amiini. Vaihtoehtoisesti poly- tai oligosakkaridi voidaan hapettaa esimerkiksi perjodaatti-ionilla, jolloin saadaan sisäisiä ja/tai terminaalisia aldehydiryhmiä. Al-dehydiryhmät voidaan myös pelkistävästi aminoida peptidien 2 0 N-terminaaliseen aminohappoon tai lysiinin e-aminoryhmiin.

Lyhyitä bi funktionaali s ia välittäjämolekyyliryhmiä, joissa on aminoryhmä toisessa päässä ja aktiivinen ryhmä, <·ι: kuten amino-, peitetty aldehydi-, karboksyylihappoesteri-,

I I

aktiivinen esteri- tai tioryhmä, toisessa päässä, voidaan

« « I

’' ^ 25 aminoida pelkistävästi sakkaridiin ja sitten kytkeä se • ♦ · *· peptidiin välittäjämolekyylin toisen pään kautta, a-amino- • · · : .1 kapronihappo ja 4-aminobutyylidimetyyliasetaali ovat esi- • · · ·...· merkkejä tällaisista välittäjämolekyyliryhmistä.

··· : Terminaalisten pelkistävien sokereiden reaktio O- 30 fenyleenidiamiinin ja nitrofenyylihydratsiinien kanssa tuottaa substituoituja 1-fenyyliflavatsoleja. Funktiona-lisoitujen sakkaridien kytkentä peptideihin tapahtuu muut- • # tamalla nitroryhmä diatsoryhmäksi.

« · · • · 26 1 0 4 3 7 4

Sakkaridin hydroksyyliryhmien aktivointi on vaihtoehtoinen menetelmä. Sakkaridien hydroksyyliryhmät voidaan aktivoida käyttäen joko syanogeenihalogenideja (tavallisesti syanogeenibromidia) tai karbonyylidi-imidat-5 solia, jolloin saadaan derivatisoitu hydroksyyli, joka voi kytkeytyä peptidin N-terminaaliseen aminohappoon tai e-aminoryhmiin. Muodostunut sidos on joko isourea tai karba-maatti.

Lisämenetelmänä sakkaridit, joissa on karboksyyli-10 happo-funktionaalisia ryhmiä, kuten uronihapporyhmiä tai aldonihapporyhmiä, voidaan kytkeä peptidien N-terminaali-seen aminohappoon tai lysiinin e-aminoryhmiin aktivoimalla karboksyyliryhmät muodostamalla aktiivisia estereitä käyttäen karbodi-imidejä tai isobutyylikloorikarbonaatteja. 15 Saatu sidos on amidisidos.

Polysakkaridit tai oligosakkaridit, joissa on vapaita aminoryhmiä, voidaan myös kytkeä peptideihin joko karboksiterminaalisen tai N-terminaalisen aminohapon välityksellä. Kytkentä karboksiterminaaliseen päähän tai 20 aminohappoihin, kuten glutamiinihappoon, tapahtuu akti voimalla karboksyylihapporyhmä karbodi-imideillä, kuten edellä on kuvattu. Kytkentä N-terminaaliseen typpeen tai ι·ι ; lysiineihin tapahtuu käyttäen bifunktionaalista välittäjä- • « ryhmää, kuten disukkinimidyylisubstraattia, joka reagoi • « « '·' \ 25 molemmissa päissään aminoryhmien kanssa.

• · · *· *· (b) Proteiinit tai peptidit peptideihin : *.* Karboksyylihapporyhmät voidaan aktivoida karbodi- • · · imideillä tai kloorikarbonaateilla, jolloin saadaan ak- • · · '· tiivisia estereitä, jotka voidaan saattaa reagoimaan pep- 30 tidin aminoryhmien kanssa. Saatu sidos on amidi.

;*j*: Yleisempi menetelmä proteiinien tai peptidien kyt- kemiseksi peptideihin on bifunktionaalisten silloitusrea- • . genssien käyttö. Nämä ovat pieniä välittäjämolekyylejä, ' ’ joiden molemmissa päissä on aktiiviset ryhmät. Välittäjä- ’ · 35 molekyyleillä voi olla samanlaiset tai erilaiset aktiivi- • · • · · « · « • • · 27 104374 set ryhmät molemmissa päissä. Yleisimmät muodostuvat aktiiviset ryhmät, kytkentäryhmä ja sidokset ovat seuraavat: 1. Aldehydi - amino - sekundaarinen amiini 2. Maleimino - sulfhydryyli - tioeetteri 5 3. Sukkinimido - amino - amidi 4. Imidaattiesterit - amino - amidi 5. Fenyyliatsidit - amino - fenyyliamiini 6. Asyylihalogenidi - sulfhydryyli - tioeetteri 7. Pyridyylidisulfidit - sulfhydryyli - disulfidi 10 8. Isotiosyanaatti - amino - isotiourea 5.3. Rokotteiden formulointi ja anto Tässä esitetyt konjugaatit ovat käyttökelpoisia valmistettaessa rokotekoostumuksia minkä tahansa tyyppisen mikrobi-infektion käsittelyyn. Konjugaatit voidaan yhdis-15 tää mihin tahansa tavallisesti käytettyyn farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan, kuten veteen, fysiologiseen suolaliuokseen, etanoliin, polyoleihin (kuten glyseroliin tai propyleeniglykoliin) tai kasviöljyihin, samoin kuin mihin tahansa alalla tunnettuun rokoteadjuvanttiin. Ne voidaan 20 myös viedä liposomeihin. Tässä käytettynä "farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantajia" ovat mitkä tahansa ja kaikki liuottimet, dispergointiväliaineet, antibakteriaaliset ja . . antifungaaliset aineet, isotoniset ja absorptiota viiväs-

I I I

tyttävät aineet ja vastaavat aineet. Täydentäviä aktiivi- t 1 i ’m‘ ] 25 siä aineita voidaan myös käyttää.

• » · *· ” Antotapa on tyypillisesti parenteraalinen, toisin f· i ; .* sanoen suoneen, lihakseen, vatsaonteloon tai ihon alle.

• 9 ·

Myös suun kautta anto on mahdollinen. Konjugaatin määrä : tällaisessa rokotteessa vaihtelee ja on riippuvainen käy- 30 tetystä antigeenistä. Perinteisille kantajakonjugaateille käytettyjen ohjeannosrajojen säätely ja manipulointi kon- t jugaattirokotteille soveltuvaksi on alan ammattimiehen • · · ’· < taitoihin kuuluvaa. Esimerkiksi PRP:stä ja CRM:stä muodos tuvien tunnettujen kantajakonjugaattien tyypillinen annos « : * 35 on 1 - 25 μg peptidiä. Tässä kuvatut rokotteet ja menetel- * « « I I )

( I

« « V t 28 104374 mät ovat myös erityisen käyttökelpoisia, koska useimmat lapset on jo "herkistetty" antamalla difteria- ja tetanus-rokotteita pian syntymän jälkeen. Nämä rokotteet on tarkoitettu käytettäviksi hoidettaessa sekä kasvavia että 5 täysikasvuisia lämminverisiä eläimiä ja erityisesti ihmisiä. Sairaudet, joiden tehokas ennaltaehkäisy voidaan saavuttaa tässä esitetyllä menetelmällä, ovat ilmiselviä alan ammattimiehelle hänen luettuaan tämän julkaisun. Menetelmien käyttö ei myöskään ole rajoitettu ennaltaehkäisevään 10 sovellutukseen; terapeuttinen käyttö on myös itsestäänselvä .

Edullisessa sovellutusmuodossa konjugaatti sisältää bakteeriperäistä antigeeniä tai sen antigeenistä fragmenttia konjugoituna difteriatoksiinin T-solun epi-15 tooppiin. Tämä yhdistelmä on käyttökelpoinen hoidettaessa aivokalvontulehdusta. Tämä tauti, jonka aiheuttaa tavallisimmin H. influenzae b, esiintyy alle 6-vuotiailla lapsilla ja noin 60 % tapauksista esiintyy alle 2-vuotiailla. Suoja tätä tautia vastaan on vaikea saada alle 18-kuukau-20 tisilla lapsilla perinteisillä rokotekoostumuksilla. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat koostumukset tuottavat : kuitenkin merkittävän vasta-aineen tuotantotason uusien T- i i « solujen muodostumisesta johtuen.

I < < 1 . Seuraavat keksintöä rajoittamattomat esimerkit ku- 25 vaavat T-solun epitooppikonjugaattien valmistusta ja te- • · · • ·* hokkuutta.

• · ·...· 6. Esimerkit * · · :.· · 6.1. Kiinteä faasi -peptidisynteesimenetelmä

Synteettiset peptidit muodostettiin käyttäen vai-:T: 30 heittaista Merrifieldin kiinteä faasi -menetelmää (1963) ja Applied Biosystems Model 430A Peptidi Synthesizer * , -peptidisyntetisaattoria. Kaikki synteettiset peptidit «« « * < koottiin liukenemattomalle kopolymeerihartsille, joka < « < * · muodostui styreenistä ja divinyylibentseenistä. Kaikki : 35 näiden peptidien kokoamisessa käytetyt aminohapot olivat f • 29 1 0 4 3 7 4 α-aminiryhmästään t-BOC (t-butyylioksikarbonyyli) -ryhmällä suojattuja. Peptidiketjut kiinnitettiin hartsiin "PAM" (fenyyliasetamido) -kytkijällä.

Kiinteä faasi -synteesin periaate on lyhyesti ku-5 vattuna seuraava. Yksi ekvivalentti t-BOC-suojattua aminohappoa, jota säilytetään kuivana jauheena yksittäisissä ampulleissa, liuotetaan dikloorimetaaniin (DCM) ja siirretään aktivaattoriastiaan, jossa se aktivoidaan puolella ekvivalentilla disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC), jol-10 loin saadaan (α-aminosuojattu, t-BOC) aminohappo-symmetrinen aldehydi, jota käytetään asetyloivana aineena. Symmetrinen aldehydijohdannainen siirretään konsentraattori-astiaan, kun taas liukenematon sivutuote, disykloheksyy-liurea, liuotetaan metanoli-DCM-seokseen ja huuhdellaan 15 pois aktivaattoriastiasta. DCM poistetaan konsentraattori-astiasta ja korvataan Ν,Ν-dimetyyliformamidilla (DMF), jota käytetään lisäämään symmetrisen anhydridin ja ladatuille PAM-hartseille koottujen peptidien välisen kytken-täreaktion tehokkuutta. Kun liuotin on vaihdettu, symmet-20 rinen anhydridi lisätään reaktioastiaan. Ennen symmetrisen anhydridin DMF:ssä vientiä reaktioastiässä olevan peptidi-hartsin N-(a)-suojaryhmät on poistettu TFA/DM C -seoksel-

« I

la, pesty DCM:llä ja neutraloitu N,N-di-isopropyyli- ; etyyliamiini/DMF-liuoksella. Symmetrisen anhydridin reak- .! 25 tioastiaan lisäyksen jälkeen suoritetaan kytkentäreaktio, * jolloin saadaan t-BOC-aminohapon aktivoidun karboksyylin • · ’···* kovalenttinen kiinnittyminen hartsiin sidotun peptidin o- • · · ’·* * aminoryhmään, josta suojaryhmä on poistettu. Kun synteesi

on loppunut, reaktioastia tyhjennetään ja pestään DM

• · · ·,· ; 30 C:llä, ja siten valmistetaan peptidihartsi uuteen syntee- sisykliin.

Symmetrisiä aldehydi johdannaisia käytettiin asy- I · . loivina aineina useimmille aminohapoille paitsi asparagii- · • « 4 4· 4 « « f • · 30 104374 nille, glutamiinille ja arginiinille. Nämä kolme aminohappoa kytkettiin 1-hydroksibentsotriatsoliestereinä.

Aminohappojen reaktiiviset sivuketjut suojattiin peptidi-ketjujen synteesin aikana. Käytetyt suojaryhmät olivat 5 O-bentsyyli Asprlle ja Glu.-lle, bentsyyli Ser.-lle ja Thr:lle, 4-metyylibentsyyli Cys:lle, tosyyli Argrlle ja His:lle, 2-kloorikarbobentsoyylikarbonyyli Lys:lle, O-(p-bromibentsyylioksikarbonyyli) Tyr:lle ja formyyli Trp:lle. Kytkennän päättymistä jokaisessa vaiheessa monitoroitiin 10 kvantitatiivisella ninhydriinimäärityksellä (Sarin, V.K. et ai., 1981), joka mittaa peptidihartsiin jäljelle jääneitä vapaita ö-aminoryhmiä. Tyypillisesti saavutettiin yli 99,5 %:n kytkentätehokkuus. Jos kytkentätehokkuus ei ollut hyväksyttävä, synteesi toistettiin käyttäen vaikean 15 tähteen "kaksoiskytkentä"-sykliä.

Synteesin jälkeen kukin peptidi pilkottiin yksittäin hartsista 10 ml :11a vedetöntä nestemäistä HF:ää, johon oli lisätty 1 ml dimetyylisulfidia ja 1 ml anisolin ja p-tiokresolin seosta moolisuhteessa 1:0,2. Nämä pilk-20 komisreaktiot suoritettiin -8 °C:ssa 50 minuutin ajan.

Pilkkomisen jälkeen hartsi pestiin 3-25 ml:n annoksella ,: vedetöntä dietyylieetteriä mahdollisten jäljelle jääneiden orgaanisten epäpuhtauksien poistamiseksi. Lopuksi raaka peptidimateriaali uutettiin hartsista pesemällä 3 -10 25 ml:lla laimeaa (30 tilavuus-%) jääetikkahappoa vedessä.

• » ·

Uutokset yhdistettiin 100 ml:n päärynänmuotöisessä pullos- • · '···’ sa ja etikkahappo/vesi-seos poistettiin pyöröhaihdutuksel- V : la. Kuivattu jäljelle jäänyt jäännös otettiin mahdollisimman pieneen tilavuuteen TFA/H20-seosta, siir-:T: 30 rettiin 150 ml:n kylmäkuivauspulloon, jäädytettiin no- peasti nestetypellä ja kylmäkuivattiin yli yön.

« \ <

I I

.s 5 <114« 3i 104374 6.2. Synteettisten peptidien kemiallinen karakterisointi

Synteettisten peptidien puhtaus määritettiin ensin käänteisfaasi-HPLC:llä, edullisesti käyttäen kahdenlaisia 5 erilaisia gradiettiolosuhteita. Peptidi, joka eluoitui yhtenä homogeenisena piikkinä, joka alue oli yli 95 % kokonaisalasta HPLC-kromatogrammissa, aminohapposekvenoitiin suoraan sen analysoimiseksi edelleen.

A. HPLC-analyysi 10 Pilkottu puhdistamaton peptidimateriaali analysoi tiin HPLCillä käyttäen Vydac C4 -analyyttistä kolonnia (4,6 mm x 250 mm) ja 0 % -> 60 % asetonitriiligradienttia 30 minuutin aikana. Jos gradientti ei riittänyt, se vaihdettiin vastaavasti piikin resoluution optimoimiseksi raa-15 kaseoksesta. Myös muut kromatografiset tekijät, kuten kolonnin koko, pakkaustehokkuus, partikkelikoko, pakkausmateriaalin sitomisominaisuudet ja peptidiseosten liukoi-suusominaisuudet, otettiin huomioon koko HPLC-puhdistuk-sen aikana. Kun sopiva erotusprotokolla oli löydetty kul-20 lekin peptidille, nämä ajo-olosuhteet muutettiin puolipre-paratiiviseen muotoon käyttäen Vydac C4-kolonnia (10 mm x 250 mm), jotta saataisiin milligrammasta grammaan olevia määriä puhdistettua tuotetta. Tämän jälkeen puhdistettu materiaali kromatografoitiin uudelleen analyyttisissä ajo-. 25 olosuhteissa tuotteen lopullisen puhtauden määrittämisek-

• I I

si, jolloin hyväksyttävä taso oli suurempi kuin 95 %.

• · B. Aminohapposekvenssianalyysi.

• · * *·’ * Ennen sekvenointia kylmäkuivattu peptidi liuotet tiin 0,l-%:iseen TFA/vesi-seokseen. Noin 500 pikomoolia V · 30 laitettiin täplänä polypreenillä päällystetylle lasikui- tupaperille ennen automaattisen, toistuvan Edmanin hajo- ’ r tuksen aloittamista Applied Biosystems 477A -pulssineste- . proteiini/peptidisekvenaattorilla, joka oli varustettu on- . line-kytketyllä Model 120A PTH -analysaattorilla. Jokaisen « « '·/·· 35 Edman-hajotuksen jälkeen kustakin aminohaposta muodostunut • · 32 1 0 4 3 7 4 fenyylitiatsolinonijohdannainen muutettiin pysyvämmäksi fenyylitiohydantoiini (PTH) -johdannaiseksi käsittelemällä 25 %:lla TFAilla 64 °C:ssa 20 minuutin ajan.

PTH-johdannaiset erotettiin käänteisfaasi-HPLC:llä 5 Brownlee C-18 -kolonnilla (220 mm x 2,1 mm) käyttäen kahta liuotingradienttisysteemiä, joka muodostui liuottimes-ta A, Jossa oli (litraa kohti) 5 % tetrahydrofuraania, joka sisälsi 3 mol/1 natrlumasetaattipuskuria (27,0 ml pH

3,8 -liuosta ja 6,2 ml pH 4,6 -liuosta), ja liuottimesta 10 B, jossa oli (litraa kohti) asetonitriiliä, joka sisälsi 500 nanomoolia hapetinsieppaajaa, N,N-dimetyyli-N-fenyyli-tioureaa (DMPTU). Kromatografipiikkien muodon ja PTH-his-tidiinin ja PTH-arginiinin erottumisen parantamiseksi liuottimeen A lisättiin 0,5 ml 12,5 % trimetyyliamiinia. 15 Nominaaliset HPLC-parametrit olivat seuraavat: virtausnopeus 200 μΐ/min, detektorin aallonpituus 254 nm ja kolonnin lämpötila 55 °C. Optimaalinen PTH-johdannaisten erottuminen saatiin seuraavalla lineaarisella gradientilla: 12 % B:tä aikana 0 min, 38 % B:tä aikana 18 min, 38 % B:tä ai-20 kana 25 min, 90 % B:tä aikana 25,1 min, 90 % B:tä aikana 29 min. Kunkin syklin PTH identifioitiin vertaamalla PTH-aminohappojen seoksen (Applied Biosystems) standardi-kromatogrämmiin.

6.3. T-solujen aktivaatio . 25 A. Hiiren T-solujen proliferaatio • · · l„'m Hiiriltä, jotka oli etukäteen immunisoitu optimaa- • · ’···* lisella annoksella antigeeniä emulgoituna (tilavuussuh- V * teessä 1:1) Freundin täydelliseen adjuvanttiin, otettiin talteen nivus- ja aortan takaiset imusolmukkeet. Yksi ai- ·«« ' 30 noa solususpensio valmistettiin RPMI:hin, joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia. Yhden pesun jälkeen solut suspendoitiin uudelleen RPMl:hin, jossa ei ollut seerumia,

I I

, ja laskettiin tryptan blue exclusion -värjäyksellä faasi- 4 4 111 kontrastimikroskoopilla. Solujen lukumäärä säädettiin pi-‘./•ί 35 toisuuteen 3 x 106 solua/ml RPMI:tä, joka sisälsi 2 % nor- f 4 4»»· • · 33 104374 maalia hiiren seerumia. Eri pitoisuuksia antigeenejä, mi-togeenejä tai muita kontrollimateriaaleja sisältävät valmisteet tehtiin RPMI:hin, jossa ei ollut seerumia, ja jaettiin pieninä määrinä (0,1 ml) kolmoisnäytteinä käsi-5 tellyille, 96-kuoppaisille, tasapohjaisille kudosvilje- lylevyille. Kaikille antigeeneille käytettiin rutiininomaisesti laajaa annosaluetta. Näille levyille lisättiin 0,1 ml solususpensiota. Siten saatiin loppupitoisuus 3 x 105 solua/kuoppa väliaineessa, joka sisälsi 1 % hiiren see-10 rumia. Kun solut oli lisätty, viljelmät vietiin kostutettuun, 5 % C02:ta sisältävään, 37 °C:iseen inkubaattoriin. Kolmen päivän inkuboinnin jälkeen viljelmiä pulssitettiin 18 tunnin ajan, 1 pCi/kuoppa, [3H]-tymidiinillä ja solut otettiin talteen nestetuikelaskurilla laskentaa varten. 15 Tymidiinin sisäänotto ilmaistaan rinnakkaisten koearvojen keskiarvona vähennettynä rinnakkaisten stimuloimattomien (tausta) arvojen keskiarvolla.

B. Ihmisen T-solujen proliferaatio.

Vapaaehtoisilta henkilöiltä otettiin verta hepa-20 riiniputkiin ja veri laimennettiin (1:1) lämpimällä (37 °C) RPMIrllä, jossa ei ollut seerumia. Perifeerisen veren leukosyytit eristettiin saattamalla laimennettu veri (25 ml) kerrokseksi 15 ml: n päälle Ficoll histopaque -liuosta (Sigma). Huoneenlämpötilassa sentrifugoinnin jälkeen ,, 25 (1 500 rpm, 5 min) Ficollin ja veren välikerroksessa ole- i · · vat solut imettiin pois ja pestiin kolmesti RPMI:llä, joka • *···' sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia. Viimeisen pesun jäi- • · · V · keen solut suspendoitiin uudelleen RPMI:hin, jossa ei ol lut seerumia, ja laskettiin trypan blue exclusion -vär- *. i 30 jäyksellä käyttäen faasikontrastimikroskooppia. Solujen lukumäärä säädettiin 0,75 x 10® soluksi/ml RPMI:tä, joka * . sisälsi 20 % poolattua ihmisen seerumia. Eri pitoisuuksia antigeenejä, mitogeenejä tai muita kontrollimateriaaleja sisältävät valmisteet tehtiin RPMI:hin, jossa ei ollut ; 35 seerumia, ja jaettiin pieninä määrinä (0,1 ml) koi- «•«fr I f 34 104374 moisnäytteinä käsitellyille, 96-kuoppaisille, pyöreäpoh-jaisille kudosviljelylevyille. Näille levyille lisättiin 0,1 ml solususpensiota. Siten saatiin loppupitoisuus 0,75 x 105 solua/kuoppa väliaineessa, joka sisälsi 10 % 5 ihmisen seerumia. Kun solut oli lisätty, viljelmät vietiin kostutettuun, 5 % C02:ta sisältävään, 37 °C:iseen inkubaat-toriin. Kuuden päivän inkuboinnin jälkeen viljelmiä puls-sitettin 6-8 tunnin ajan, 1 pCi/kuoppa, [3H]-tymidiinillä ja solut otettiin talteen nestetuikelaskimella laskentaa 10 varten. Tymidiinin sisäänotto ilmaistaan rinnakkaisten koearvojen kesiarvona vähennettynä rinnakkaisten stimuloi-mattomien (tausta) arvojen keskiarvolla.

6.4. HbO-peptidikonjugaattien valmistus A. Haemophilus influenzae tyypin b oligosakkaridin 15 (HbO) valmistus

HiBjn polysakkaridi (PRP) liuotetaan veteen ja riittävä määrä natriumfosfaattipuskuria (2,0 mol/1, pH 7,0) lisätään, jotta saadaan lopullinen liuos 0,2 molaa-riseksi fosfaatin suhteen. Natriummetaperjodaattia (0,2 x 20 PRP:n moolimäärä) lisätään kaikki kerrallaan nopeasti sekoittaen. Liuos jätetään pimeään 4 °C:ssa yli yöksi. Puh-distamaton oligosakkaridi ultrasuodatetaan ensin 30 000 molekyylipainorajan kalvoa käyttäen suurempien oligosakkaridien poistamiseksi ja suodos ultrasuodatetaan 10 000 ; 25 molekyylipainorajan kalvoa käyttäen pienempimolekyylipai- • · noisten oligosakkaridien poistamiseksi, jolloin reten- ·»» taatti otetaan talteen. Retentaatti kromatografoidaan

Biogel P-100 -kolonnissa fysiologisessa suolaliuoksessa ja ... fraktiot analysoidaan riboosin ja pelkistävien ryhmien • · · 30 suhteen Orcinol- ja vastaavasti Park-Johnson-määrityksiä • ♦ · *·* * käyttäen. Tyypillisesti oligopeptidien Dp on keskimäärin •f*: 20. Sitten puhdistetut oligosakkaridit kylmäkuivataan ja ·:··: niitä säilytetään -20 °C:ssa.

. B. HbO-peptidikonjugaattien synteesi ' 35 Peptidi liuotetaan vedettömään DMS0:hon pitoisuu tena 5 mg/ml. Sitten liuos lisätään kaksinkertaiseen moo- 35 104374 limäärään kylmäkuivattua HbOrta. Reaktiossa käytetty HbO:n määrä voi vaihdella yksinkertaisesta kaksinkertaiseen riippuen syntetisoitavan peptidikonjugaatin tyypistä (kaksi- vai yksipäinen). Reaktioseosta inkuboidaan 37 °C:ssa 24 5 tuntia, jonka jälkeen lisätään 10-kertainen moolimäärä (HbO:n suhteen) natriumboorihydridiä liuotettuna pieneen määrään DMSO:ta. Liuosta inkuboidaan vielä toiset 24 tuntia, jonka jälkeen lisätään vettä DMSO:n tilavuuden verran. Ylimäärä natriumboorihydridiä saatetaan reagoimaan 10 pienen määrän kanssa etikkahappoa ja tuote liuotetaan veteen tai fysiologiseen suolaliuokseen. Reagoimaton peptidi voidaan poistaa geelisuodattamalla tai dialyysillä käyttäen 6 000 - 8 000 molekyylipainorajäistä kalvoa. HbO:n konjugointi peptidiin varmistettiin Western blot -analyy-15 sillä.

6.4.1. Polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE) PRP-peptidikonjugaatit liuotettiin 100 pl:aan näy-tepuskuria (0,2 mol/1 Tris-puskuri, joka sisälsi 5 % SDS:ää, 0,025 % bromifenolisinistä, 10'1 mol/1 2-ME:tä ja 20 20 % glyserolia), ja liuosta kuumennettiin 5 minuuttia 100 °C:ssa. Useimmat rutiinianalyysit suoritettiin käyttäen Bio-Rad Mini Protein Gel -systeemiä (Redmond, Ca). Geelit olivat 1,5 mm:n paksuisia ja erotusgeeli sisälsi 15 % akryyliamidia (akryyliamidin suhde bis:iin 30:0,8) ·’ . 25 0,375 mol/1 Tris-HCl:a, pH 8,8, ja 0,1 % SDS:ää. Konsen- • · trointigeeli sisälsi 4,8 % akryyliamidia (akryyliamidin • · ·

suhde bistiin sama kuin edellä) 125 mmol/1 Tris-HCl:a, pH

I I I

7,0, ja 0,1 % SDS:ää.

...^ 10 - 15 μΐ liuoksia, jotka sisälsivät 1 - 10 pg 30 näytteitä, vietiin kullekin kaistalle. Elektroforeesin • · · *·) jälkeen geelejä värjättiin vähintään yhden tunnin ajan ·;··: 0,125 %:lla Coomassie Blue -värillä etanoli :etikkahap- . po:vesi-seoksessa (5:1:5), jonka jälkeen väri poistettiin samalla liuoksella, jossa ei ollut väriainetta. Esivär-35 jättyjä molekyylipainovakioita (fosforylaasi b, 92 500; 36 104374 naudan seerumin albumiini, 69 000; ovalbumiini, 43 000; ja karbonihappoanhydraasi, 30 000) käytettiin proteiinien suhteellisten molekyylipainojen määrittämisessä. Värjää-mättömiä rinnakkaisgeelejä käytettiin Western-analyysissä.

5 6.4.2. Western blot -analyysi PAGE:11a erotetut näytteet siirrettiin elektrofo-reettisesti nitroselluloosakalvoille Hoeffer Transphor -laitteella käyttäen 0,45 mA:n virtaa 90 minuutin ajan, 25 mmol/1 Tris:ä ja 383 mmol/1 glysiiniä sisältävässä pus-10 kurissa, pH 8,8, huoneenlämpötilassa. Kun proteiinien siirto oli tehty, nitroselluloosakalvot upotettiin BL0TT0-liuokseen (5 % rasvatonta kuivamaitoa fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa) 37 °C:ssa yhden tunnin ajaksi. Kalvoja inkuboitiin etukäteen liuoksessa, 15 joka sisälsi määritetyn pitoisuuden PRP:tä tai CRM197:ää vastaan muodostettuja vasta-aineita, yhden tunnin ajan 37 °C:ssa ja pestiin BLOTTO-liuoksella 20 minuutin ajan 37 °C:ssa. Sitoutuneet vasta-aineet todettiin piparjuuri-peroksidaasilla konjugoidulla vuohen anti-hiiri-vasta-ai-20 neella (Kirkegaard & Perry, M.D.) laimennoksena 1:250 BLOTTO-liuoksessa yhden tunnin ajan 37 °C:ssa. Blotit pestiin kolmesti PBS:llä ja kehitettiin PBS:llä, joka sisälsi 0,01% vetyperoksidia ja 0,06 % 4-kloori-l-naftolia (Sigma Chemical Co., MO) metanolissa, 20 minuutin ajan huoneen- • 25 lämpötilassa. Reaktio pysäytettiin siirtämällä suodattimet • · .*··. tislattuun veteen ja suodattimet kuivattiin painamalla.

• · · 6.4.3. Immunisointi • · e

Hiiren T-solujen herkistämiseksi difteriatoksoidi, CRM tai CRM-peptidit liuotettiin fosfaatilla puskuroituun • · · 1 2 3 4 5 6 fysiologiseen suolaliuokseen ja emulgoitiin yhtä suureen 2

• t I

3 *·] * tilavuuteen Freundin täydellistä adjuvanttia. Hiiret sai- 4 ·:··! vat 0,1 ml emulsiota, joka sisälsi optimaalisen pitoisuu 5 den antigeeniä, ihon alle hännän tyveen. Maksimaalinen T-soluvaste havaittiin rutiininomaisesti yhden viikon ku- 6 luttua.

37 104374

Vasta-ainevasteen saamiseksi hiiret immunisoitiin antamalla 2,5 pg PRP-CRM-konjugaattia tai 5 pg PRP-pepti-dikonjugaatteja suspendoituna fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen. Konjugaatit annettiin 5 0,1 ml:n tilavuutena lihakseen käyttämättä adjuvanttia.

Mahdolliset seuraavat immunisoinnit annettiin kahden viikon välein käyttäen samaa annosta ja injektioreittiä.

6.4.4. Farr-määritys PRP:tä vastaan muodostuneet vasta-aineet määritet-10 tiin standardisoidulla Farrin radioimmunologisella määritysmenetelmällä. Erilaiset laimennokset seerumeita, seeru-mivakiota ja määrityksen kontrolleja valmistettiin naudan sikiön seerumiin ja 25 μ1:η määrät siirrettiin rinnakkais-näytteinä 1,5 ml:n eppendorfputkiin. [3H]-PRP (50 μΐ) ja 15 [1C1]-merkkiaine lisättiin kaikkiin putkiin. Näytteet se koitettiin Vortex-sekoittajalla ja niitä inkuboitiin yli yön 4 °C:ssa. Kyllästettyä ammoniumsulfaattia (75 μΐ) lisättiin kaikkiin näytteisiin, jonka jälkeen näytteet sekoitettiin Vortex-sekoittajalla ja niitä inkuboitiin 20 4 °C:ssa 40 minuuttia. Supernatantti imettiin huolellisesti

Ja 400 μΐ tislattua vettä lisättiin kaikkiin nappeihin. Vortex-sekoittajalla sekoituksen jälkeen pullon koko sisältö ja itse pullo vietiin laskentapulloon, joka sisälsi 10 ml tuikenestettä. Voimakkaan sekoituksen jälkeen pullot . . 25 laskettiin nestetuikelaskurissa. PRP:hen sitoutuneen vas- • · ta-aineen pitoisuus laskettiin tunnettuun vakioon verrat- • · · tuna CPM-lukeman ja seerumilaimennoksen käyrän lineaari-seita osalta.

6.4.5. ELISA-määritys • i « 30 CRM:ää vastaan muodostuneet vasta-aineet määritet-

• · P

tiin normaalilla ELISA-määrityksellä. Määrityksen suorit-*'*" tamiseksi 96-kuoppaiset poly styreeni levyt päällystettiin yli yön 37 °C:ssa kostutetussa inkubaattorissa 100 plrlla , . : CRM197:ä/kuoppa (1 pg/ml 0,1 mol/1 karbonaattipuskurissa, I i i 35 pH 9,6). Kuopat pestiin kolmesti fosfaatilla puskuroidul-

I I l n I I

38 104374 la fysiologisella suolaliuoksella (PBS), joka sisälsi 0,05 % Tween-20:tä, ja sitorniskohdat täytettiin käyttäen 200 μΐ kuoppaa kohti PBSrää, joka sisälsi 0,1 % gelatiinia, 45 minuuttia huoneenlämpötilassa. Kun kuopat oli 5 pesty kahdesti PBS-Tween-liuoksella, 100 pl:aa kuoppaa kohti laimennusliuoksella (PBS; joka sisälsi 0,05 % Tween-20 :tä ja 0,1 % gelatiinia) laimennettua seerumia lisättiin. Levyjä inkuboitiin 90 minuuttia huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen ne pestiin kolmesti PBS-Tween-liuoksella. 10 Toinen vasta-aine (100 μΐ kuoppaa kohti vuohi-hiiri-alka-linen fosfataasikonjugaattia laimennoksena 1:1 000) lai-mennusliuoksessa lisättiin ja levyjä inkuboitiin 60 minuuttia huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen ne pestiin kolmesti PBS-Tween-liuoksella. Substraatti (100 μΐ kuoppaa 15 kohti p-nitrofenyylifosfaattia, 1 mg/ml dietanoliamiinis-sa, joka sisälsi MgCl2 x 6H20:ta, pH 9,8) lisättiin ja levyjä inkuboitiin 60 minuuttia huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä 150 μΐ kuoppaa kohti 2 mol/1 natriumhydroksidia. Absorbanssi aallonpi-20 tuuksilla 410 ja 690 nm luettiin käyttäen Bio-Tek 310 Au-toreader -lukulaitetta.

6.4.6. Immunoglobuliiniluokka- ja -alaluokkamääri- tykset PRPille spesifisten vasta-aineiden luokka- ja -ala- . 25 luokka määritettiin ELISA-määritysmenetelmällä. 96-kuop- • · .***. paiset polystyreenilevyt päällystettiin 1:2000-laimennok- sella PRP-tyramiinia PBS:ssä. Antigeeniä (100 μΐ/kuoppa) • · inkuboitiin 90 minuuttia 37 °C:ssa, minkä jälkeen levyt ...^ pestiin kahdesti PBS:llä ja sitomiskohdat täytettiin 30 inkuboimalla 60 minuuttia huoneenlämpötilassa käyttäen • · · * 200 μΐ kuoppaa kohti PBS:ää, joka sisälsi 0,1 % gelatii- ·;·*: nia. Kun kuopat oli pesty kahdesti PBS:llä, 50 pl:aa lai- ·;··': mennusliuoksella (PBS; joka sisälsi 0,05 % Tween-20:tä ja . 0,1 % gelatiinia) laimennettua testiseerumia lisättiin ja ' 35 levyjä inkuboitiin kaksi tuntia huoneenlämpötilassa, minkä 39 1 0 4 3 7 4 jälkeen ne pestiin automaattisesti PBS:llä, joka sisälsi 0,1 % Tween-20:tä. Kuoppiin lisättiin 100 μΐ kuoppaa kohti tarkoituksenmukaista laimennosta vuohen tai kanin anti-hiiri-immunoglobuliinin (luokka- tai alaluokkaspesifinen) 5 alkaalinen fosfataasi -konjugaattia kahdeksi tunniksi huoneenlämpötilassa. Levyt pestiin automaattiset! kuten yllä. Kuoppiin lisättiin 200 μΐ substraattia (p-nitrofenyylifos-faattia, 1 mg/ml dietanoliamiinissa, joka sisälsi MgCl2 x 6H20:ta, pH 9,8) ja levyjä inkuboitiin 60 minuuttia huo-10 neenlämpötilassa. (Antiseerumi-entsyymikonjugaattien saatavuudesta riippuen voidaan kuitenkin käyttää muita ent-syymi-substraattiyhdistelmiä.) Reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 μΐ kuoppaa kohti 2 mol/1 natriumhydroksidia. Ab-sorbanssi aallonpituuksilla 410 ja 690 nm luettiin käyt-15 täen Bio-Tek 310 Autoreader -lukulaitetta.

6.5. Tetanustoksiinifragmenttin muodostaminen Tetanuseksotoksiini liuotettiin kuumentamalla 100 °C:ssa 5 minuuttia näytepuskurissa, joka sisälsi 0,1 mol/1 DTT:tä ja 2 % SDS:ää, minkä jälkeen siitä ajet-20 tiin SDS-PAGE. Kaksi suurta proteiininauhaa, jotka edustavat tetanustoksiinin H- ja L-ketjuja, leikattiin SDS-gee-listä ja uutettiin elektroeluutiolla kolmen tunnin ajan 25 V:ssa 50 mmol/1 NH4C03-liuokseen, jossa oli 0,2 % SDSrää ja 1 mmol/1 DTT:tä, pH 8,2. Elektroeluution jälkeen mate- • 25 riaali kylmäkuivattiin ja liuotettiin sitten välittömästi ennen T-solun proliferaatiomääritystä. C-fragmentti saa- • · · .·*.·. tiin kaupallisesti Calbiochem-yhtiöstä, CA.

Proteiinifraktiot, joiden havaittiin olevan eri-tyisen aktiivisia indusoimaan hiiren T-soluja, hajotet- • · · 30 tiin proteolyyttisesti T-solun epitooppien määrittäämi- • · · seksi tarkemmin. Käyttäen hajotussysteemiä, joka sisälsi *:·*: 0,125 mol/1 Tris-HCl:a, 0,05 mol/1 DTT:tä, 0,5 % SDS:ää ja *:"! 10 % glyserolia pH:ssa 7,0, proteiinifragmentteja inkuboi- #·' ; tiin 37 °C:ssa 30 minuuttia joko kymotrypsiinin (67 pg/ml), f » · ! 35 pronaasin (5 pg/ml), fisiinin (3 pg/ml), subtilisiinin 40 104374 (0,4 μg/Inl) tai v8-proteaasin (62,5 pg/ml) kanssa. Näin muodostetut peptidit voidaan erottaa käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen Vydac C4 -kolonnia. Sitten eristetyt fragmentit voidaan testata niiden kyvyn suhteen stimuloi-5 da T-soluja.

6.6. Tulokset 6.6.1. CRM:n ennustetut T-solun epitoopit

DeLisin ja Berzofskyn algoritmiä [PNAS 82 (1985) 7848] mahdollisten amfipaattisten alueiden projisoimiseksi 10 käytettiin CRM:n primaarisekvenssiin ensimmäisenä arviointina. Molekyylin tietokoneanalyysi paljasti proteiinissa kuusi aluetta, jotka täyttivät mahdollisen T-solun epi-toopin kriteerit, kuten kuviossa 1 on esitetty. Nämä alueet identifioitiin tähteiksi 1-17, 112 -135, 229 -15 256, 306 - 334, 357 - 380 ja 386 - 408. Jokainen näistä alueista muodostuu vähintään seitsemästä peräkkäisestä tähteestä, joilla proteiinin primaarirakenteen yhteydessä tutkittaessa on taipumus muodostaa alfahelikaalinen rakenne. Lisäksi myös alue 158 - 173 valittiin mielivaltaisesti 20 toimimaan negatiivisena kontrollimateriaalina, sillä tie-tokoneprojektion perusteella sen ei odoteta muodostavan : alfahelikaalista rakennetta. Niinpä nämä peptidit olivat i r i alkututkimusten kohteena CRM:n T-solun epitooppien rajaa- miselle.

; · . 25 6.6.2. Synteettisten peptidien analyysi • ·

Synteettiset CRM-peptidit ja niiden aminohapposek- .·:*. venssit on lueteltu taulukossa 1. Kuten edellä on kuvat- • « · tu, muodostettiin erilaisia päällekkäisten peptidien ^...^ joukkoja lisäämällä N-terminaalisiin päihin ylimääräisiä » · * 30 aminohappotähteitä kiinteä faasi -menetelmällä.

i i « *·) Taulukossa 1 annetaan myös keskimääräinen vaiheit- *;**! täinen kytkentätehokkuus jokaiselle synteettiselle pepti- •: ·*: dille. Kaikissa tapauksissa keskimääräinen tehokkuus oli / . yli 99 %. Keskimääräisen vaiheittaisen kytkentätehokkuu- • · · ’ ! 35 den perusteella laskettiin myös kumulatiiviset teoreetti- 41 104374 set synteesin saannot; tämä teoreettinen arvo osoittaa niiden peptidien saantoprosenttia, joilla on oikea aminohapposekvenssi synteesin lopussa. Viimeinen sarake taulukossa 1 esittää puhdistamattoman peptidiseoksen puhtautta 5 käänteisfaasi-HPLC-analyysillä määritettynä. Tyypillinen puhdistamattoman synteesimateriaalin (peptidi 6) HPLC-analyysi on esitetty kuviossa 2A. Peptidi eluoitui suurena piikkinä 25,8 minuutin kohdalla ja sen määrä oli 66 % kokonaisalueesta.

10 Tämän peptidimateriaalin fraktiot kerättiin, kon sentroitiin ja kromatografoitiin uudelleen, kuten kuviossa 2B on esitetty. Saatu kromatogrammi osoittaa 95 %:n tai sitä suurempaa puhtautta. Kaikissa tapauksissa puhdista-mattomista peptidimateriaaleista, joiden puhtaus oli alle 15 95 % (taulukko 1), ajettiin yksi tai useampia ylimääräisiä HPLC-ajoja lopullisen homogeenisen tuotteen saamiseksi.

Synteettisten peptidien oikea sekvenssi varmistettiin suoralla aminohapposekvenoinnilla, kuten taulukossa 1 on esitetty. Valaisevana esimerkkinä kuvio 3 esittää 20 valikoidut PTH-johdannaisten kromatogrammit yksikirjaimisina lyhenteinä 0,5 nanomoolista HPLC-puhdistettua pepti-di 6:tta vietynä täpläksi TFA-käsitellyille lasikuitukie-koille. Numerot vastaavat Edman-sykliä; piikit a ja b ovat N', N-dimetyyli-N'-fenyylitiourea ja vastaavasti Ν',Ν-dife- • . 25 nyylitiourea, Jotka muodostuvat sivutuotteina Edman-reak- i · tiossa. Jokainen PTH-kromatogrammi mitoitettiin suurimman ·«· identifioidun aminohappopiikin mukaan. Kuten oli odotet- • · * tua, "taustahälinän" taso kasvoi korkeammilla sykliluvuil-la; aminohappopiikin määritys osoitetuilla sykleillä piti 30 kuitenkin yhtä tunnetun sekvenssin kanssa (taulukko 1).

• · · '•\m "Esikatselu"-tähteiden ("preview" residues; Kent et ai., ·;·'! 1982) tarkastelu jokaiselle syklille viittasi myös delee- tiopeptidien poissaoloon siten edelleen tukien lopputuot- . teen homogeenisyyttä.

( «· · φ t 104374 42 «o » I H ., C ·Η »H £

«J M >1 ·· — o O O O O - OOOOC C N O C O

~ .-- ' - --- „ - - ^ ~ m jCllrti—IJ —' Of'· — m a vfl Ό O c " o nl' ' •J d dj fl| in ·. rv ιβ VO \ö O O Ch o □ rv n, ^ ^ in fu ^ -p E ” 2 tn Λ o *> Pj ci'- h1 , I il -P ^ H-hSc-S rn — — |~V a^O' r-^t-1 o m O (Ö

3 5 n S cn~ r0 VT·-' CN~ o" ΠΟΝΟΝ N Π J v# O M

K Ή U £j *0 rs B a O C3 O Ö' C' O' O' O' O' O' O' !*< p ·Η 0) ·Η ru .!=.

^ +J +J +J U) m

Ί fi 1) # · P

I m Ψ +J — · *aj aJ c w irö ·Η ·Ρ t/1 m n n n π Ό ΐΛ eo n λ irt »n ό rn Ή Q) -P ¢) ? O' O' O' O' O' O' O' O' O' O' o O' O' O' O' ^ C i) ^ ,¾ O' O O' O' O' O' O' O' O' O' O' O' O' O' O' 'i (/) Ή Ή p 7¾ <D *<d D >1 O υ ^ P P y £ n m — in tn in in in u U U 'J C ^ 1/5 V) «Λ ΙΛ W Π «till B—ϋ ΰ ϋ U ϋ ^ cd n .

^ J J J m r-» — « U U (J Ίϊ c. c. ft- ft. ft. *0

W

< < < < < cl cl o. c. c. in m w in w w (Tj Γν| m w m w ut w W W l/l V) >* V V >· >· fl ό *S 1 m — n n n in n >*>->->->· <<<<< r„ ' CD p = = = 2* = CD < < < < < r·. —. ft- ft. S- G. ft. fo rs r-i

< < < < < «—» — e-ft.ft.o-c- ec es es cs es «U

P

> > > ϊ> es:aSftSC£« = = = = = 4J

r^. — — = = = = >->—?—>->- ^ ΓΝ m — cj ω ω ω u >->->-►.>« in tn n n m J- m fi I u: u (j l: u r> tn w n m w — — ns = = Q>

._i rs. n -P

II | H ·— {-· i—· p· rt —~ j; 2 S S S — B B B S Ή A " s. -v ·*. ^ ä) <V ·Η ----- ---- =>=>=>:>=> .wf2 cm = = = = > > > > > > > >η| I W cm Lj 52 G C n — == = = = > > > 02·= ij S -P <D O *ä u T3 > >>=> a = = = o — U.U. -g

• · o m I V

« * ' < < < n tiu b. li. 4J

1, ’; -p

•h out· -a j -P

. ! . .h ^ s = a = = = w en ^ — ·ο<< -- >, \ ' 8, 3 -h

• i i L3 (J5 rn — ι/ι w M

« < +j ifö j , ¢) = = u u «o

W E

.···. -H CM > > > • · 4J — q • · · jj r“» — 1/11/1 U. <rf : : : S « a = o

* *JJ M VO - >- O

£ O " I < -H « UJ Oi +-> ... rv cu <1> w

• : * C O O

... ·, n — —J +J Ό • 2 I 0) Λ ... s i — tn o : : : u -m -n - . _ _ o — n n >nn u)

. — γμ m vt m »o r· m o ,· —, MC

* i—I 4) fl) ····? -H -H ·Η -rt -H -H -H vH -H -rt -H -H -H -H -H 1¾ Φ o O'dTJ'dTd ό τί Ό Ό 'd'd'd^J'O 0 ä , ^ *H *H *H *H *H »rl *H *rl Ή ·Η ·Η ·Η *Η ·Η ·Η Ρ ..... 2 ^J4J4J-P4J 4J Ρ «Ρ -Ρ «Ρ ΡΡΡ ΡΡ Η·η * * ρ 0^ Ο-ι CL| Ο4 Ο4Ο4Ο4Ο4Ο1 Q4O4CI4O4CP ►> Η φ 0) φ 0) 0) ¢) Φ Φ Φ Φ 0) φ φ 0) φ * ‘ . q O4D4&O4Q4 Ο4Ο4Ο1Ο4Ο1 O4O4O4O4PL1 .·· : 1 1 1 ·· ·; S § §

....; u υ G

*3 104374 43 6.6.3. PRP-peptidikonjugaattien Western blot -analyysi PRP:n kovalenttinen kytkentä eri peptideihin varmistettiin kvalitatiivisesti Western blot -analyysillä 5 käyttäen PRP:lie spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita. Kuten kuviossa 4 on esitetty, kaikkien tutkittujen peptidikonjugaattien (PRP, peptidi 357 - 380; PRP, peptidi 306 - 334, ja lyhyt PRP, peptidi 366 - 383) havaittiin muodostuvan laajasta jatkuvasta näennäisen molekyylipai-10 non alueesta. Jotkut materiaaleista jäivät konsentrointi-geeliin. Peptidikonjugaattien kuvio oli hyvin samanlainen kuin PRP-CRM:n. Sitä vastoin pelkkää PRP:tä, jonka ei odotettaisi tarttuvan nitroselluloosaan siirrossa, ei havaittu. Siten tämä viittaa siihen, että todetut nauhat edusta-15 vat PRP;tä, joka on kovalenttisesti kytkeytynyt nitroselluloosaan sitoutuneisiin proteiineihin tai peptideihin. Näiden konjugaattien leveä nauha saattaa johtua peptidien glykosylaatiosta eri oligosakkaridiryhmillä.

6.6.4. Immunogeenisyyden peptidiprofiili hiiren 20 T-soluilla

Jotta varmistettaisiin kokeellisesti, pystyivätkö ennustetut CRM-alueet todella indusoimaan T-solun proli-feratiivisen vasteen, tutkittiin DT-herkistettyjen imusol-: ' mukesolujen vaste näille peptideille. Kuten taulukossa 2 25 on esitetty, DT-immuuneista hiiristä saadut imusolmukeso- « * .*·*; lut muodostivat odotetusti vasteen spesifisesti DTille ja ··· CRMille mutteivät TT:lie. Lisäksi nämä solut muodostivat • · · huomattavan vasteen in vitro -altistuksessa yhdellä mah- ... dollisella T-solun epitoopilla, spesifisesti alueella • · · *·*.* 30 357 - 380. Marginaaliset vasteet havaittiin myös alueille '·* * 306 - 334 ja 386 - 408. Mitään vastetta ei havaittu ·;**: alueelle 158 - 173, negatiiviselle kontrollipeptidille, ·:··· eikä asiaankuulumattomalle RSV-peptidille. Lisäksi solut . muodostivat vasteen asianmukaisesti molemmille T-solun ’· * 35 mitogeeneille, Con A:lie ja B-solun mitogeenille lipopoly- .. 104374 44 sakkaridille (LPS). Niinpä tietokoneanalyysillä identifioiduista kuudesta mahdollisesta T-solun epitoopista vain alue 357 - 380 pystyi stimuloimaan T-soluvasteen käytetyssä hiirimallissa.

5

Taulukko 2

Difteriatoksoidilla immunisoitujen* hiiren T-solujen vaste tietokoneella projisoiduille CRM:n amfipaat-tisille alueille 10

Ryhmä (¾]-tymidiinin In vitro sisäänotto -altistuksen annos ACPM +SD pg/ml 15 _

Proteiinit DT 64 055 ± 4 572 10 CRM 51 258 ± 1 262 100 20 TT 675 ±6 1

Peptidit CRM(1 - 17) 274 ± 28 50 25 CRM(112 - 135) 0 5 CRM(158 - 173) 47+6 100 CRM(229 - 256) 833 ± 113 100 CRM(306 - 334) 1 100 + 197 1 V : CRM(357 - 380) 12 232 ± 231 100 .·, : 30 CRM(386 - 408) 2 478 ±33 1 RSV-peptidi 0 1 • · · « · • · *..! Mitogeenit • · • · .**·. 35 Con A 59 092 ± 2 344 1 LPS 60 529 ± 5 135 100 ... Tausta (CPM: inä) 1 319 ± 269 • · · » · · • _____________________________ ··· ϊ,ί · 40 "Hiiret immunisoitiin optimaalisella pitoisuudella 50 pg DT:tä emulgoituna Freundin täydelliseen adjuvant- • · tiin.

• · bViljelmät altistettiin laajalla proteiinien tai • · peptidien pitoisuusalueella (0,05 - 100 pg/ml). Vain ha- « = : 45 vaittu maksimaalinen vaste on esitetty.

104374 45 6.6.5. Peptidianalogien immunogeenisyysprofiili hiiren T-soluille

Vaihtoehtoisen kytkentäkemian mahdollisuuden tutkimiseksi valmistettiin CRM:n T-solun epitoopin 366 - 383 5 modifioituja analogeja. Modifikaatiot sisälsivät lysiinin tai kysteiinin lisäämisen peptidin N-päähän joko välittäjämolekyylin kanssa tai ilman sitä. Sitten analogien kykyä stimuloida hiiren T-soluja verrattiin modifioimattoman peptidin vastaavaan kykyyn.

10 T-solujen stimulointimääritysten tulokset on esi tetty taulukossa 3. Tutkimus osoitti, että CRM:n peptidin 366 - 383 analogeilla säilyi suurin osa kyvystä stimuloida DT- tai CRM197-herkistettyjä T-soluja verrattuna itseensä 366 - 383 -peptidiin. Siten T-solun epitooppiin 15 voidaan tehdä huomattavia muutoksia heikentämättä sen kykyä stimuloida T-solun aktiivisuutta. Kuten on osoitettu, nämä modifikaatiot voidaan tehdä parantuneen kytkennän takia (esitetty esimerkki tuottaa €-aminoryhmän tehokkaamman kytkennän aikaansaamiseksi), mahdollisuuden käyttää 20 erilaisia kytkentämenetelmiä takia (esitetty esimerkki tuottaa kysteiinitähteen) tai T-solujen reaktiivisuuden « < parantamiseksi (ei esitetty). Nämä modifikaatiot laajen- V ; tavat peptidikantaj ien käyttökelpoisuutta mahdollistamalla V. suuren joukon B-solun epitooppien konjugoinnin.

« · I • * « « · • · • · « • · • · ·♦· t «· • ♦ · f · · • · · • · · • · · • · ·

I « I

• · • # * · · « * • · V * · f · » • * » ( · · • · 46 104374

Taulukko 3 CRM-peptidin 366 - 383 modifioinnin vaikutukset T-solujen tunnistukseen 5 [hl]-tymidiinin sisäänotto (ACMP)

Altistus ___ DT-herkistys CRM-herkistys 10 Proteiinit DT 81 825 31 348 CRM 63 348 88 009 TT 804 0 15 CRM-peptidit 157 - 173 1 935 1 147 357 - 383 23 047 16 009 20 366 - 383 43 263 22 722 369 - 383 40 489 28 198

Modifioidut CRM-peptidit 25 L- (366 - 383) 35 202 26 705 LG- (366 - 383) 33 354 22 852 CG-(366 - 383) 46 141 26 337 RSV-peptidi 1 726 0 30 ';,, Mitogeenit i i I Con A 42 017 34 117 V LPS 57 143 40 520 ·'·'' 35 f · * * Tctus*td !***.: Väliaine (CPM:inä) 1 537 1 210 ·«· • · · ___ _ _ _ - _ _ • · · ... 40 6.6.6. Immunogeeni syyden peptidiprofiili ihmisen m a · T-soluille ·♦« • · · V · Hiiren T-solujen vasteen mahdollisille T-solun ·;·*: epitoopeille tutkimisen lisäksi tutkittiin useilta vapaa- ..·» ehtoisilta ihmisiltä saatujen perifeerisen veren valkoso- . 45 lujen peptidivasteprofiili. Yksittäiset henkilöt valittiin • · « '· "· satunnaisesti, eivätkä he vältäämättä olleet immunisoitu- * * * » > · • · 104374 47 neita DT:lle ennen määritystä. Niinpä vasteen DT:lle odotettiin vaihtelevan tuloksena yksittäisistä historioista ja henkilöiden ainutlaatuisesta geneettisestä koostumuksesta. Kaksi neljästä henkilöstä tuotti hyvin alhaiset 5 vasteet DT:lle tai CRM:lle, eivätkä he myöskään muodostaneet vastetta millekään peptidille (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, ettei peptideillä ollut minkäänlaista mitogeenistä, ei-antigeenispesifistä aktiivisuutta. Kuten taulukossa 4 on esitetty, jäljelle jääneet henkilöt 10 muodostivat huomattavan vasteen DT:lle, CRM:lle ja TT:lie ja muodostivat eriasteisia vasteita in vitro -altistuksessa jokaiselle CRM-peptidille. Molemmilla henkilöillä havaittiin yhdenmukaiset ja positiiviset vasteet peptideille 306 - 334, 357 - 383 ja 386 - 408. Positiivinen 15 vaste fytohemagglutiniinille (PHA), ihmisen T-solun mi-togeenille havaittiin myös.

i

I I I

f I · f

f I

• I ! • * • Ψ ··· • · • · ··«

• •I

# · · • · ·

• •I

• · « « · · • · ·

• · I

I · I « • t I « « • · I I I f »1 • « ft'.» • « 48 104374

Taulukko 4

Ihmisen perifeerisen veren valkosolujen vaste tietokoneen projisoimme CRM:n amfipaatt isille alueille 5 ______ 1¾]-tymidiinin sisäänotto, ACMP ± SD Ryhmät (In vitro -altistuksen annos, pg/ml)“

SP WM

10

Proteiinit DT 244 776±2 889 (10) 88 595±8 635 (10) CRM 186 076±21 208 (5) 100 938±12 805 (5) 15 TT 38 917±6 911 (5) 143 955±13 502 (20)

Peptidit CRM(1 - 17) 18 329±403 (100) 6 932+278 (10) 20 CRM(112 - 135) 10 990±1 895 (100) 8 505±214 (10) CRM(158 - 173) 1 324+ 83 (100) 5 346±2 052 (5) CRM(229 - 256) 6 803+1 753 (50) 6 111±379 (10) CRM(306 - 334) 7 974+1 194 (100) 18 023±733 (10) CRM(357 - 380) 10 351±1 077 (100) 13 004±881 (100) 25 CRM(386 - 408) 14 160±653 (100) 23 337±3 531 (10) RSV-peptidi 0 (5) 5 201±1 079 (5)

Mitogeenit 30 PHA 161 956±9 267 (5) 37 881±3 293 (5)

Tausta 2 024+79 1 694+1 778 (CPM:inä) ·'· · 35 ·,,* “Viljelmät altistettiin laajalla proteiinien tai peptidien • ♦ *···* pitoisuusalueella (0,05 - 100 pg/ml). Vain havaittu maksi- V ’ maalinen vaste on esitetty.

ί,ί ί 40 6.6.7. Anti-peptidi-T-soluvasteet

Kun oli osoitettu, että DT-herkistetyt T-solut *t. tunnistivat CRM:n alueen 357 - 380 T-solun epitoopiksi, . oli välttämätöntä määrittää, oliko itse peptidi tehokas immunogeeni. Niinpä SJL-hiiret immunisoitiin 100 pg:lla 45 CRM(357 - 380)-peptidiä tai 50 pg:lla DT:tä tai CRM:ää.

• · « 104374

Ylimääräinen hiiriryhmä sai 100 pg CRM(306 - 334)-peptidiä vaihtoehtoisena peptidinä vasteen spesifisyyden osoittamiseksi. Kuten taulukossa 5 on esitetty, DT:llä immunisoitujen hiirten T-solut muodostivat odotetusti vas-5 teen DT:lle, CRM:lle ja CRM(357 - 380)-peptidille. Samanlainen reaktiivisuuskuvio havaittiin myös CRM:llä immunisoiduista hiiristä saaduilla soluilla, vaikka vasteet CRM:lle ja peptidille olivat olleellisesti korkeammat. Mielenkiintoista oli, että CRM(357 - 380)-peptidillä her-10 kistetyt solut vastasivat spesifisesti altistukseen CRM(357 - 380)-peptidillä samoin kuin reagoivat ristiin CRM-proteiinin kanssa. Päinvastaisesti CRM(306 - 334)-peptidillä herkistetyt solut eivät tuottaneet merkittävää vastetta in vitro -altistuksessa millekään tutkituista 15 proteiineista ja vastasivat vain heikosti altistuksessa itse immunisointiin käytetyllä peptidillä 306 - 334. Kaikki solut muodostivat kuitenkin asiaankuuluvasti vasteen sekä Con A:lie että LPSrlle. Selvästikään alue 357 - 380 ei ole ainoa CRM:n T-solun determinantti, koska natiivilla 20 proteiinilla herkistetyt solut tunnistavat sen, mutta se pystyy myös indusoimaan anti-peptidi-T-soluja, jotka voivat tunnistaa natiivin proteiinin.

( I

* ♦ ♦ • · • 1 • · · • · • · • · f • · · I · • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · f · • · «f 1 tl 50 104374

Taulukko 5 T-soluvasteet peptidi- tai proteiiniherkistyksen jälkeen SJL-hiirillä

5 [3H]-tymidiinin sisäänotto, ACPM ± SD

In vitro _______ -altistus

DT CRM(306-334) CRM(357-380) CRM

10 ' / ppM * 4 nM ^ Väliaine * 1048±236 570±13 1333±671 2058±306

Proteiinit 15 DT 51136±4844 0 1857±486 38166±3701 CRM 48033±2990 0 11460±924 144401±12688 TT 0 0 0 434±72 20 Peptidit CRM(306-334) 0 1051±183 0 0 CRM(357-380) 5206±697 0 25140±2582 17856±35 CRM(158-173) 386±66 0 0 1335+387 25 RSV-peptidi 0 0 0 0

Mitogeenit

Con A 6631515491 6995H2786 69762H255 4937H3564 30 LPS 7001812034 53236H633 55989+3133 6617711888 “Hiiret immunisoitiin 50 pg:lla proteiinia, joko DT:tä tai CRM:ää, tai 100 pg:lla peptidiä, joko CRM(306 - • ·* 35 337)- tai CRM(357 - 380)-peptidiä emulgoituna Freundin ··» täydelliseen adjuvanttiin.

V bViljelmät altistettiin laajalla proteiinien tai peptidien pitoisuusalueella (0,05 - 100 pg/ml). Vain ha-vaittu maksimaalinen vaste on esitetty.

40 • · · m * . 6.6.8. T-solun rajojen tarkentaminen

Alueen 357 - 380 sisällä olevan minimialueen, joka tarvitaan T-soluvasteen herättämiseksi, määrittämiseksi syntetisoitiin joukko peptidejä, joiden N-päät vaihteli- # si 104374 vat. Jotta varmistettaisiin, että koko T-solun epitooppi olisi tämän peptidijoukon sisällä, määritettiin lisäksi C-pää tähteestä 384, mikä oli neljä tähdettä aktiivisen peptidin 357 - 380 rajan ulkopuolella. Niinpä valmistettiin 5 seuraavat peptidit ja niiden aktiivisuus T-solureaktiivi-suuden suhteen määritettiin: 357 - 383, 362 -383, 366 -383, 372 - 383 ja 373 - 383. Kuten taulukossa 6 on esitetty, joko DT:llä tai CRM:llä herkistetyt hiiret vastasivat samalla tavalla joko peptidille 357 - 380 tai peptidille 10 357 - 383, vaikka vaste peptidille 357 - 383 olikin hiukan suurempi. Lyhyempi peptidi 362 - 383 oli yhtä hyvä kuin peptidi 357 - 383 stimuloimaan DT-herkistettyjä T-soluja, mutta oli tehokkaampi kuin pidempi peptidi stimuloimaan CRM-herkistettyjä T-soluja. Mielenkiintoista oli, että 15 vielä neljän peptidin poistolla, peptidi 366 - 383, oli dramaattinen vaikutus CRM-herkistettyjen T-solujen tunnistamiseen. Sekä DT- että CRM-herkistetyillä T-soluilla havaittiin suuresti lisääntynyt vaste in vitro -altistuksessa tällä peptidillä. Vielä ylimääräisten tähteiden 20 poisto, kuten peptideillä 372 - 383 ja 373 - 383 on osoitettu, johti vähentyneisiin T-soluvasteisiin sekä DT- että CRM-herkistetyillä soluilla. Lisäksi molemmat soluryh-mät muodostivat asiaankuuluvasti vasteen DT:lle, CRM:lle ja mitogeeneille.

i < · · · t » • « · • · • 1

«M

• « 1 « · i i r

• M

• · « • « · • · · I l I · · « « f f f f • < 4 · ' • f 1 • · « · 52 104374

Taulukko 6

Proteiinilla herkistettyjen SJL-hiirten T-soluvas-teet testatulle peptidijoukolle CRH:n alueella 357 - 383 5 ______________ [^-tymidiinin sisäänotto, ACPM ± SD In vitro (Annos pg/ml) -altistus ___ 10 DT-herkistys CRM-herkistys

Proteiinit: 15 DT 46701±1439 (10) 34027±3659 (10) CRM 99933±2581 (200) 177440±4278 (100) PRP-CRM 54644±885 (100) 126700±10420(200) TT 0 (200) 405+31 (5) 20 Peptidit: CRM(357-380) 2885±89 (50) 1040l±622 (200) CRM(357-383) 6637±202 (50) 13411±451 (50) CRM(362-383) 6222±1432 (0,1) 19673±249 (10) 25 CRM(366-383) 32154±1615 (200) 36732+580 (50) CRM(372-383) 39961931 (5) 106611707 (200) CRM(373-383) 876+66 (5) 863711644 (50) CRM(306-334) 67418 (0,1) 4838+547 (5) CRM(158-173) 421+9 (100) 500711016 (200) 30 RSV-peptidi 0 (100) 4557+314 (5)

Mitogeenit: :· ‘ Con A 4198913206 (1) 48819+3323 (1) I'·': 35 LPS 61277+4477 (50) 59705+1207 (50) • ·

Ml

Tausta (CPM: inä) 1661+419 - 696+57 • · · • · · • · · 40 “Hiiret immunisoitiin optimaalisella pitoisuudel- ·*·*: la, 50 pgrlla joko DT:tä tai CRM:ää emulgoituna Freundin täydelliseen adjuvanttiin.

•. ‘Viljelmät altistettiin laajalla proteiinien tai peptidien pitoisuusalueella (0,1 - 200 pg/ml). Vain ha- ‘ 45 vaittu maksimaalinen vaste on esitetty.

« « i

« I I

I I

• *||« i ΐ 53 104374 Tällä alueella olevan epitoopin määrittämiseksi tarkemmin syntetisoitiin kaksi peptidijoukkoa. Toinen peptidi joukko muodostui sarjasta peptidejä, joiden C-pää oli pysyvästi 383, kun taas N-päätä vaihdeltiin asteittain 5 tähteestä 357 tähteeseen 373. Toisen peptidijoukon N-pää oli pysyvästi 366, kun taas C-pää vaihteli asteittain tähteestä 375 tähteeseen 383. Molemmat peptidijoukot analysoitiin T-so-lun proliferaatiomäärityksellä.

Kolme yksittäistä koetta suoritettiin samanlaisin 10 tuloksin. Edustava koe on esitetty taulukossa 7. N-pään kartoituksessa verrannollinen T-solun aktiivisuus havaittiin täydellisellä peptidialajoukolla (357 - 383) - (370 -383) sekä DT- että CRM-herkistetyissä ryhmissä. N-termi-naalisten tähteiden 371, 372 tai 373 deleetio johti huo-15 mättävään T-soluaktiivisuuden vähenemiseen. Tämä havainto tukee voimakkaasti sitä, että T-solun epitoopin N-termi-naalinen raja on tähde 369 tai 370. C-pään selvitysyrityk-sissä tulokset osoittivat, että maksimaalinen T-soluaktii-visuus saatiin peptidillä 366 - 383. Kaikki C-terminaa-20 listen tähteiden deleetiot johtivat vähentyneeseen T-solu-aktiivisuuteen. Tämä havainto viittaa siihen, että epitoopin C-pää on tähteessä 383 tai kauempana. Näiden tutkimusten avulla kartoitettuna T-solun epitooppi sijaitsisi CRM197: n tähteissä 369 (370) - 383.

• * · • · • · • · · • · • · • · · *·· • · • · r m • · « • · · • · · t·· • · · • · · C » r r r 54 104374

Taulukko 7 T-solun determinantin N- ja C- pään rajojen kartoitus CRM:n alueella 357 - 383 käyttäen difteriatok-soidilla tai CRM:llä herkistettyjen SLJ-hiirten 5 imusolmukesoluja.

In vitro -altistus [^H]-tymidiinin sisäänotto

in vitro, ACPM

10 _ DT-herkistys CRM-herkistys

Kontrolleina käytetyt proteiinit: 15

Difteria-toksoidi 109 534 51 632 CRM 97 002 159 663

Tetanus-toksoidi 0 1 347 20 N-terminaaliseen kartoitukseen käytetyt CRM-peptidit: CRM(357 - 383) 43 577 41 641 CRM(362 - 383) 35 785 46 637 CRM(366 - 383) 57 081 44 403 25 CRM(367 - 383) 55 624 48 589 CRM(368 - 383) 50 543 63 718 CRM(369 - 383) 54 354 61 941 CRM(370 - 383) 73 461 64 320 CRM(371 - 383) 30 980 47 411 30 CRM(372 - 383) 17 460 24 343 CRM(373 - 383) 4 178 2 598 C-terminaaliseen kartoitukseen käytetyt CRM-peptidit: : 35 CRM(366 - 381)-Gly 43 429 39 983 CRM( 366 - 379 )-Gly 31 265 36 370 CRM( 366 - 377 )-Gly 15 073 20 023 CRM( 366 - 375 )-Gly 6 333 6 326 • · · 40 Kontrolleina käytetyt CRM-peptidit: ... CRM( 158 - 173) 590 733 V: CRM( 306 - 334) 3 435 1 151 • · · • · ·

Kontrollina käytetty ulkopuolinen peptidi: 45 RSV 0 1 409 a i ·:··* Mitogeenit:

Con A 32 952 45 771 .\ : LPS 65 765 67 100 • i * : so ··.·': Tausta (CPM:inä) 2 501 2 007 55 104374 6.7. Peptidikonjugaattien nostattama anti-PRP- ja anti-CRM-vaste

Kun alustavasti oli paikallistettu CRM:n sisäinen T-solun tunnistusdeterminantti, oli välttämätöntä määrit-5 tää, voisiko rajattu alue toimia tehokkaana kantajamole-kyylinä PRP:lle. Lisäksi oli mielenkiintoista määrittää, muuttiko etukäteinen altistuminen kantajaproteiinille, DT:lle, PRP-konjugaattien tunnistusta. Niinpä hiiret immunisoitiin DT:llä, TT:llä tai fysiologisella suolaliuokselle la emulgoituna Freundin täydelliseen adjuvanttiin. Viikon kuluttua eläinryhmät immunisoitiin PRP-konjugaatilla. Toinen konjugaatti-immunisointi tehtiin kahden viikon kuluttua. PRPrlle näissä eläimissä muodostunut vasta-ainevaste on esitetty taulukossa 8. Primaariset (päivänä 21 esiin-15 tyvät) vasta-ainevasteet PRP:lle todettiin sekä PRP-CRM:llä ja, merkittävästi, PRP-(357 -380):11a immunisointien jälkeen niissä eläimissä, jotka oli aikaisemmin käsitelty DTrllä tai fysiologisella suolaliuoksella. Koska vasta-aineita PRP:lle esiintyi näissä molemmissa ryhmissä, 20 etukäteinen altistuminen DT:lle ei nähtävästi vaikuttanut vasta-ainevasteen muodostumiseen. Pikemminkin PRP-(357 -380) pelkästään riitti indusoimaan PRP:lle primaarisen vasteen, joka oli suuruudeltaan samanlainen kuin PRP-CRM:n nostattama vaste. Sekundaariset vasteet PRP:lle todettiin e 25 myös PRP-CRM:llä ja PRP-(357 - 380):lla immunisointien *,.* jälkeen. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että PRP:stä • · ja synteettisestä peptidistä muodostuva konjugaattirokote » * ’·* * pystyy indusoimaan vasta-aineita PRP:lle.

• · · • · · • · · • · · • · · • · · i · « * I · · « * • I « * · • · 56 104374

Taulukko 8

Vasta-alnevaste PRP-CRM-konjugaattirokotteelle tai PRP-CRM-peptidikonjugaateille difteriatoksoidilla herkistetyillä hiirillä 5 _______

Immunisointi· Vasta-aine PRP:lle (pg/ml) päivänä päivänä11 10 0 7 ja 21 7 21 32 42 49 DT PRP-CRM <0,10 2,94 8,40 8,72 4,58 15 DT PRP-CRM(357-383) <0,10 3,29 1,39 6,49 8,43 DT PRP-CRM(306-334) <0,10 <0,10 5,95 <0,10 <0,10 DT PRP-CRM(229-256) <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 DT PRP-RSV <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 20 TT PRP-CRM <0,10 0,43 5,02 4,05 1,03 TT PRP-CRM(357-383) <0,10 <0,10 2,08 2,87 3,45 TT PRP-CRM(306-334) <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 TT PRP-CRM(229-256) <0,10 <0,10 0,16 <0,10 <0,10 TT PRP-RSV <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 25 SA PRP-CRM 0,24 3,85 11,46 9,32 10,77 SA PRP-CRM(357-383) <0,10 2,32 3,89 3,85 4,17 SA PRP-CRM(306-334) <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 SA PRP-CRM(229-256) <0,10 <0,10 0,31 0,21 0,29 30 SA PRP-RSV <0,10 <0,10 0,22 0,22 0,28 • «

Hiiret immunisoitiin optimaalisella pitoisuudella \ 50 pg DT:tä Freundin täydellisessä adjuvantissa ja altis- • i : 1.· 35 tettiin tämän jälkeen peptidi (5pg) tai proteiini (2,5 pg) • · · ϊ,.,ί -konjugaattirokotteella fysiologisessa suolaliuoksessa :1Γϊ viikolla 1 ja viikolla 3.

bSeerumit otettiin yksittäisiltä hiiriltä 7., 21., 32., 42. ja 49. päivänä DT:llä immunisoinnin jälkeen.

40 Sitten tietyn ryhmän seeruminäytteet yhdistettiin radio- « · · ’· immunologista määritystä varten.

*' 1 Sekundaarinen vaste PRP:lle havaittiin myös PRP- (306 - 334):11a immunisoinnin jälkeen. Tulee muistaa, et- « : tä tietokoneanalyysi projisoi tämän alueen sisältävän T- • # t 57 104374 solun epitoopin, mutta se osoitti minimaalista kapasiteettia stimuloida difteriatoksoidilla tai CRM197:llä herkistetyistä eläimistä saatuja T-soluja. Tämä peptidi ei myöskään ollut tehokas herkistämään anti-peptidivasteel-5 le. Mielenkiintoista on, kuten kuviossa 5 esitetään, vaste PRP-(306 -334):11a immunisoinnin jälkeen kehittyi niissä eläimissä, jotka oli etukäteen altistettu toksoi-dille, DT:lle. Yhteenvetona edellisestä voidaan sanoa, että CRM-peptidi 306 - 334 on osoitettu käyttökelpoiseksi 10 kantajamolekyyliksi PRP:lle. Vaikka normaalit proliferaa- tiomääritykset eivät vakuuttavasti ole osoittaneet tämän alueen olevan T-solun epitooppi, nämä kokeet, jotka osoittavat intaktille proteiinille etukäteisaltistumisen positiivisen vaikutuksen, tukevat sitä johtopäätöstä, että 15 tämä alue on todellakin T-solun epitooppi.

On myös tärkeää määrittää, indusoivatko peptidi-konjugaatit vasta-aineita, jotka reagoivat ristiin koko CRM-proteiinin kanssa. Niinpä nämä seerumit seulottiin myös ELISA:11a anti-CRM-vasta-aineiden suhteen. Kuten 20 taulukossa 9 on esitetty, sitoutumisaktiivisuutta CRM:lle havaittiin vain niissä eläimissä, jotka oli immunisoitu PRP-CRM:llä tai esikäsitelty DT:llä. Yksikään peptidikon- . jugaateista injektoituna TT:llä tai fysiologisella suola- liuoksella käsiteltyihin ryhmiin ei indusoinut vasta-ai-25 neita CRM:lle.

Noudattaen edellä PRP-CRM-injektioille esitettyjä • · menetelmiä hiiriä immunisoitiin myös erityyppisten spesi- • · · *·* ' fisten pneumokokkiperäisten polysakkaridien ja CRM:n kon- jugaateille. Näiden injektioiden tulokset esitetään tau- * · V’ 30 lukossa 10. Nämä tulokset osoittavat taaskin, että B-so- • · · V : lun determinantti, joka sisältää antigeenin konjugoituna bakteeriperäiseen T-solun epitooppiin, voi tehokkaasti nostattaa immuunivasteen infektoidussa yksilössä.

• * • · • · · • · · « · | >. · I • ·

Taulukko 9 58 104374

Vasta-alnevasteet PRP-CRM-konjugaattirokotteelle tai PRP-CRM-peptidikonjugaateille difteriatoksoi-dllla herkistetyillä hiirillä 5 ___

Immunisointi* Vasta-aine CRN:lie seerumi- päivänä laimennoksen käänteisarvona päivänä1* 10 _...__ 0 7 ja 21 7 21 32 42 49 15 DT PRP-CRM 200 >51200 >51200 >51200 >51200 DT PRP-CRM(357-383) 400 >51200 >51200 >51200 >51200 DT PRP-CRM(306-334) 200 >51200 >51200 >51200 >51200 DT PRP-CRM(229-256) 1600 >51200 >51200 >51200 >51200 DT PRP-RSV 800 >51200 >51200 >51200 >51200 20 TT PRP-CRM <20 25600 >51200 >51200 25600 TT PRP-CRM(357-383) 20 <20 <20 <20 <20 TT PRP-CRM(306-334) <20 <20 <20 <20 <20 TT PRP-CRM(229-256) <20 <20 <20 <20 <20 25 TT PRP-RSV <20 <20 <20 <20 <20 SA PRP-CRM 100 25600 >51200 >51200 >51200 SA PRP-CRM(357-383) 20 <20 <20 <20 <20 SA PRP-CRM( 306-334) <20 20 40 20 20 30 SA PRP-CRM( 229-256) <20 <20 <20 <20 <20 : SA PRP-RSV <20 <20 20 <20 <20 • I r I i ;*v “Hiiret immunisoitiin optimaalisella pitoisuudella • ) IV. 35 50 pg DT:tä emulgoituna Freundin täydelliseen adjuvant- .*··. tiin ja altistettiin tämän jälkeen peptidi (5 pg) tai ,···, proteiini (2,5 pg) -konjugaattirokotteella fysiologisessa f · · suolaliuoksessa viikolla 1 ja viikolla 3.

... bSeerumit otettiin yksittäisiltä hiiriltä 7., 21., t · f 40 32., 42. ja 49. päivänä DT:llä immunisoinnin jälkeen.

*·* * Sitten tietyn ryhmän seeruminäytteet yhdistettiin ELISA- T'* määritystä varten.

I « t ( i i r I · ' 4 111« 59 104374

Sitten tietyn ryhmän seeruminäytteet yhdistettiin ELISA-määritystä varten.

Taulukko 10

Vasta-ainevasteet tyyppispesifisille pneumokokki-5 peräisille polysakkarideille annettuna synteettisen peptidikantajamolekyylin kanssa

Immunisointi Tyyppispesifinen vasta- aine (pg/ml) viikolla 10 _

Oligosakkaridi Kantaja Adjuvatti 0246

Tyyppi 14 Peptidi - <0,10 0,19 2,67 NA

15 Peptidi + <0,10 0,41 3,74 NA

CRM - <0,10 0,39 0,55 NA

Tyyppi 19 Peptidi - <0,10 <0,10 0,20 NA

Peptidi + <0,10 <0,10 0,73 NA

20 CRM - <0,10 <0,10 NA NA

Hiiret immunisoitiin tyyppispesifisellä pneumo-kokkiperäisellä oligosakkaridilla, joka oli kytketty CRM197:ään tai CRM-peptidiin 357 - 380. Konjugaatti annet-25 tiin viikolla nolla ja kaksi joko adjuvantin, 100 pg alumiinioksidia, kanssa tai ilman adjuvanttia. Vasta-aine-arvot määritettiin normaalilla Farr-määritysmenetelmällä.

r I » • ♦ · * · · « · • · · • · · • · • · • · · • • ·

«M

• * · • · · • · · * · · • · · • · · l ( ' * < « « « * t · • · ·

Taulukko 11 60 104374

Immunisoinnilla PRP-peptidi- tai PRP-CRM-konjugaa-tilla nostetun vasta-aineen bakterisidinen aktiivisuus 5 __

Immunogeeni Bakterisidinen aktiivisuus immuni soinnin jälkeen viikolla 0 2 4 10 Aktiivisuus Gagania vastaan PRP-CRM <1/5 1/20 1/20 PRP-CRM(369 - 383) <1/5 1/10 1/20 15 Aktiivisuus Hst54:ää vastaan PRP-CRM 1/5 1/80 1/10 PRP-CRM(369 - 383) <1/5 1/40 1/10 20

Itsenäinen varmistus PRP-peptidikonjugaatin käyttökelpoisuudesta rokotteena saatiin sen nostattamien vasta-aineiden funktionaalisesta analyysistä. PRP kytkettiin pelkistävällä aminaatiolla CRM-peptidiin 369 - 383, jonka 25 otaksutaan läheisesti vastaavan minimisekvenssiä, joka tarvitaan T-solujen stimuloimiseksi. PRP-peptidillä tai PRP-CRM:llä ilman adjuvanttia immunisoitiin SJL-hiiriä viikoilla nolla ja kaksi. Seerumit otettiin talteen taulukossa 11 esitetyllä tavalla ja analysoitiin bakteereja : 30 tappavan vaikutuksen in vitro suhteen kahta H. influenzae • · · .Ιφ·1 -kantaa, Eagan- ja kliinisesti eristettyä Hst54-kantaa • · vastaan. Nelinkertainen nousu tiitterissä katsotaan immu- « '1··, nologisesti merkittäväksi.

'·1 ' Kuten taulukosta 11 näkyy, joko PRP-CRM: llä tai 35 PRP-peptidillä tehdyn immunisoinnin nostattamilla vasta- ««· V · aineilla oli merkittävä bakteereja tappava vaikutus mo- t t > ;_! : lempiä kantoja vastaan, mitä osoittaa nelinkertainen tiit- terin nousu viikkojen nolla ja kaksi välisenä aikana. Li-

« I

t<; säksi voidaan nähdä, ettei PRP-peptidillä ja PRP-CRM: llä i 1 « • · • « · I · t · • 1 ei 104374 immunisoiduilla eläimillä saatu piikin ero ole merkittävästi erilainen. Peptidikonjugaatilla nostatetut vasta-aineet ovat funktionaalisesti samanlaisia natiivilla proteiinilla immunisoimalla saatujen vasta-aineiden kanssa.

5 6.8. Konjugaateilla, mm. modifioidulla peptidiana- logilla, nostettu anti-PRP- ja anti-CRM-vaste

Kun oli määritetty, että CRM:n T-solun epitooppi 366 - 383 pystyy stimuloimaan hiiren T-solujen prolife-raatiota, oli tarpeen määrittää, voisiko analogi toimia 10 tehokkaana kantajamolekyylinä. PRP kytkettiin pelkistävällä aminaatiolla CRM-peptidin 366 - 383 lysiinianalo-giin e-aminoryhmän kautta. Konjugoinnin jälkeen SJL-hiiriä immunisoitiin eri annoksilla PRP-[Lys]-CRM(366-383):a ilman adjuvanttia. Eläimille annettiin tehosteannos vii-15 koilla nolla ja neljä. Seerumit otettiin talteen taulukossa 12 esitettyinä aikoina ja analysoitiin PRP:lie spesifisen vasta-aineen suhteen.

Kuten taulukosta 12 näkyy, useat annokset peptidi-konjugaattia PRP-[Lys]-CRM(366-383) nostattivat PRP:lie 20 spesifisiä vasta-aineita yli 1 pg/ml pitoisuuksia. Siten tutkimus osoittaa, että CRM-peptidin 366 - 383 lysiini-analogi on käyttökelpoinen kantajamolekyylinä.

• · • · · • · 1 • · • 1 • · · • · • · • · · • · • · • · 1

IM

• I I

• · ·

• M

• I · • · · t I I < I » « « I · f « · • · · • ' » 62 104374

Taulukko 12

Ensimmäinen vasta-ainetutkimus, jossa tutkitaan N-terminaalisen lysiinin lisäämistä CRM-kantajapep-tidiin 366 - 383 SJL-hiirillä 5 PRP:tä vastaan muodostunut vasta-aine (pg/ml) 10 Viikkoa immunisoinnin jälkeen

Immunogeeni Annos 0248 15 PRP-[Lys]- CRM(366-383) 10 <0,10 <0,10 <0,10 <0,10 5 <0,10 0,16 0,77 2,43 2,5 0,28 0,31 0,34 1,10 1,0 <0,10 0,20 1,71 1,85 20 0,5 <0,10 0,10 0,98 1,30 0,1 <0,10 0,75 2,22 2,64 PRP 2,5 <0,10 <0,10 <0,10 0,34 25 PRP-CRM 2,5 <0,10 1,06 2,37 9,60 6.9. Tetatustoksiiniepitoopit

Tetanustoksiinin H-, L- ja C-fragmentit testattiin 30 niiden kyvyn suhteen stimuloida hiiren T-solujen prolife- raatiota. Kaikki kolme fragmenttia indusoi oleellisen T-solujen aktiivisuuden, mutta kuten taulukosta 13 näkyy, C- ·* .·, : fragmentti oli selvästi ylivoimaisin. Stimuloiva vaikutus • · · havaittiin myös ihmisen perifeerisen veren mononuk- • *> 35 leaaristen solujen määrityksessä. Kuten taulukosta 14 nä- • · *·" kyy, suurin osa T-soluaktiivisuudesta liittyi tetatustok- • · · ’·’ * siinin raskaaseen ketjuun tällä henkilöllä.

Fragmentti C, jonka havaittiin hyvin aktiivisesti ««« V · stimuloivan hiiren T-solujen proliferäätiota, hajotettiin 40 proteolyyttisesti pronaasilla, fisiinillä, subtilisiinil-la tai V8:lla. Tetanustoksiinin C-fragmentin puhdistamat-tomien entsymaattisen hajotustuotteiden SDS-PAGE ei 104374 63 osoittanut havaittavia kokonaisia C-fragmentteja neljällä edellä luetellulla entsyymillä suoritetun hajotuksen jälkeen. Sitten hajotustuotteet testattiin niiden hiiren T-soluja stimuloimiskyvyn suhteen. Kolme proteaasilla (pro-5 naasilla, subtilisiinilla ja V8:lla) hajotettua seosta säilyttivät oleellisen T-solun aktiivisuuden, kuten taulukosta 15 näkyy. Taulukossa 15 esitetyt tulokset viittaa-vat siihen, että joko pronaasi- tai V8-proteaasihajotus tuottaa peptidifragmentteja, jotka ovat erityisen käyttö-10 kelpoisia T-solun epitooppien kartoituksessa.

V8-hajotuksella muodostettujen fragmenttien mahdollisten T-solun epitooppien määrittämiseksi tarkemmin nämä fragmentit erotettiin käänteisfaasi-HPLC:llä. Viisi fraktiota otettiin talteen ja analysoitiin SDS-PAGE:11a. 15 Neljän viidestä fraktiosta havaittiin sisältävän tärkeimmät peptidit ja kaikki testattiin hiiren T-solujen proli-feraatiomäärityksellä. Kuten taulukosta 16 näkyy, fraktiot 3, 4 ja 5 indusoivat merkitsevän T-soluvasteen. Fraktio 3 sisältää suuren nauhan, jonka molekyylipaino on 10K ja 20 fraktiot 4 ja 3 sisältävät suuret, noin 22K:n ja vastaa vasti 17K:n nauhat.

i • · I · · • · · • · ·· · • 1 · • · • · • · · • « • » • · · • · · ♦ 1 » • · · · · • · · • · · M 104374 64

Taulukko 13

Tetanustoksoidilla herkistettyjen SJL-hiirten T-soluvasteet tetanustoksiinifragmenteille 5 [^]-sisäänotto (CPM)

Altistus Koe 1 Koe 2 ~~ 10 Tetanustoksoidi 50 890 45 284

Difteria 0 0 C-fragmentti 22 180 44 328 H-ketju 18 629 29 870 15 L-ketju 26 655 12 543

Con A 23 354 40 588 LPS 39 946 42 578 20 Tausta Väliaine (CPM:inä) 655 1 082 t • · • · · • · · • 1 • i t • · · • · • · • · · * · « ' • · 1 • · · * · · t · » « « · • · · I t f « « « I r I « ) I I I » • · «

» · I

• If • · 65 104374

Taulukko 14

Ihmisen proliferatiiviset vasteet tetanustoksol-dille ja tetanustoksiinifragmenteille 5 [3H]-tymidiinin sisäänotto (CPM) Annos

Antigeeni ACPM pg/ml

Con A 14 539 10 PHA 17 110 PHA + puskurikontrolli 25 621 LPS 5 053

Tetanustoksiini 90 271 10 15 Raskas ketju 78 830 1

Kevyt ketju 64 290 100 C-fragmentti 41 306 50

Difteriatoksoidi 7 973 100 • · • ♦ · • · · • · M · I 1 · • · • · • · · • r 9 9 999 919 9 91 9 9 9 99 9 919 9 91 « i f f » t f i • 1 • · · • · · • « · 66 104374

Taulukko 15

Tetanustoksiinin C-fragmentin entsymaattinen hajotus - T-solujen proliferaatiotutkimukset* 5 [3H]-tymidiinin sisäänotto (ACPM)

Entsyymi Annos Vaste C-fragmentille Pelkkä pg/ml* entsyymi 10 Käsittely: - Entsyymi Puskuri

Pronaasi 1 45254 27681 702 0 15 Fisiini 0,1 4357 4179 2243 332

Subtilisiini 1 45254 19884 702 0 V8 0,5 21903 30264 8187 0 20 _ * Kontrollivasteet ACPMrinä, (suluissa maksimaalisen vasteen annos); TT 102 730 (5), C-fragmentti 102 126 (100), DT 397 (0,5), Con A 31 343 (1) ja LPS 39 750 (50). Taustan vaste oli 1 334 CPM.

25 * Fragmentti C:n annos entsymaattisessa hajotuksessa.

viittaa pelkkään C-fragmenttiin annoksella, jolla saatiin maksimivaste hajotuksessa.

* · ·/·: V8-hajotusfragmenttien analysoimiseksi pidemmälle ♦ · · • *.· 30 fraktiot 1-5 erotettiin SDS-PAGE: 11a, siirrettiin Immoin/· bilon-paperille (Millipore) ja sekvenoitiin suoraan. Kah- den fragmentin, fraktion 4 nauhan 22K ja fraktion 5 nauhan 17K, osittaiset sekvenssit on määritetty ja niitä on ver-rattu tetanustoksiinin tunnettuun sekvenssin [Eisel et • t · ,··· 35 ai., EMBO J. 5 (1986) 2495 - 2502]. SDS-PAGE:sta saatujen ( i molekyylipainoarvioiden ja sekvenointitulosten perusteel-'· ' la tehtiin se johtopäätös, että 22K-fragmentti vastaa te- » « »» a * 104374 67 tanustoksiinitähteitä 1128 - 1309 ja 17K-fragmentti tähteitä 974 - 1116.

T-solun epitoopin paikallistamiseksi tarkemmin C-fragmentissa käytettiin päällekkäin menevien peptidien 5 strategiaa. Tällöin oli syntetisoitava 37 peptidiä, joiden pituus oli 19 - 20 tähdettä ja seitsemän tähteen päällekkäin menevä osa, koko C-fragmentin primaarisekvenssin tutkimiseksi. Koska proteaasihajotustutkimukset viittasivat siihen, että T-soluaktiivisuus mahdollisesti 10 liittyi 17K- ja 22K-fragmentteihin, huomio keskitettiin ensin näiden kahden alueen mahdollisuuksiin. Kuten taulukosta 17 näkyy, tähteestä 97 alkavat ja osan alueesta 974 - 1116 yli ulottuvat päällekkäiset peptidit tutkittiin T-soluaktiivisuuden suhteen. Tutkituista peptideistä teta-15 nustoksiinipeptidit 961 - 980 ja 1021 - 1040, jotka ovat C-fragmentin alueella, aiheuttivat merkitsevät T-solujen proliferaatiovasteet tetanustoksoidilla herkistetyillä hiiren lymfosyyteillä. Siten tetanustoksiinin C-fragmentin kaksi mahdollista T-solun epitooppia on paikallistet-20 tu näitä menetelmiä käyttäen.

I 1 I I

• · • · · • · · • · ·· · I · · • · • · ··· • < · • · · • · · • · · • · « i»· • · ·

• · I

• ti « · « « · < I · i · I I · « « « » 68 104374

Taulukko 16

Tetanustoksoidilla herkistettyjen T-solujen proli-feratiivinen vaste C-fragmentille ja C-fragmentin peptideille 5 ______

Maksimi-CPM±SD (annos pg/ml) Väliaine 945 ± 234 CA 1,0 pg/ml 37 758 ± 687 10 LPS 50,0 pg/ml 61 390 ± 2 662

Tetanustoksoidi 149 578 ± 10 581

Difteriatoksoidi 879 ± 26 C-fragmentti 140 025 ± 10 156 15 Proteaasifragmentti 1 1 270 ± 8

Proteaasifragmentti 2 1 828 ± 240

Proteaasifragmentti 3 5 158 ± 372

Proteaasifragmentti 4 14 772 ± 1 308

Proteaasifragmentti 5 23 065 ± 1 181 20 ___ • · • · · • M • · M · • · · • · • · • · · • « • » • · · • · · « « · • · • 1 · • 1 f • · · * • · f I t I «Il « · 5"! t « · 69 104374

Taulukko 17

Tetanustoksoidilla herkistettyjen imusolmukesolu-jen T-soluvasteet päällekkäisille synteettisille peptideille, jotka sisältävät tetanusfragmentin C 5 vai itiin alueen C3!!]-tymidiinin Annos

In vitro altistus sisäänotto (Δ CPM) (pg/ml) 10 Proteiinit

Tetanus toksoidi 242 421 5

Tetanusfragmentti C 296 801 100

Difteriatoksoidi 3 892 1 15 Tetanustoksiinipeptidit 961 - 980 32 276 100 973 - 992 10 457 100 997 - 1016 6 347 100 985 - 1004 3 600 50 20 1009 - 1028 5 130 100 1021 - 1040 100 332 50 1273 - 1292 11 230 50

Mitogeenit 25 Con A 44 077 1 a LPS 86 740 50 • · ♦ · · • · · • · • · .·**. Tausta • · .···. Väliaine (CPM:inä) 3 639 • ♦ · 30 _ »Φ* • ♦ # *;], 7.0 Vasta-ainevaste ei-hiilihydraattihapteeni- i i konjugaateille ·:··! RS-viruksen (RSV) proteiini F kytkettiin CRM:n T- ·;· 35 solun epitooppiin 369 - 383 tai kokonaiseen natiiviin pro- « ·

« I I

70 104374 teiiniin. SJL-hiiret immunisoitiin viikkoina nolla ja kaksi 5 pgtlla painoyksiköissä vastaavilla määrillä peptidejä 369 - 383 alumiinioksidiin sekoitettuna. Kuten kuviosta 6 näkyy, vasta-aineita RSV:n F-proteiinille muodostui joko 5 kokonaiseen CRM:ään tai CRM-peptidiin 369 - 383 kytketyllä RSV (283 - 315) - B-solun epitoopilla immunisoinnin jälkeen. Tämä koe osoittaa CRM-peptidin 369 - 383 käyttökelpoisuutta kantajamolekyylinä muillekin materiaaleille kuin vain hiilihydraattimateriaaleille. Tässä tapauksessa spe-10 sifinen esimerkki on viruksen proteiinin B-solun epitoop-pia edustava peptidi.

i • · · ♦ ·· • · ·· · • ♦ * • · • · ··« • · • t «·» • ·· • · · • · · • · · t · · • ♦ · « » * • « ·

« « I

9 • • « • I f I I « ' · * r · 4 « » ’ · • «

Claims (16)

104374

1. Oligopeptidi, tunnettu siitä, että se koostuu oleellisesti bakteeriperäisen toksiinin, CRM:n tai 5 toksoidin vähintään yhdestä T-solun epitoopista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen oligopeptidi, tunnettu siitä, että se koostuu oleellisesti CRMi97:n T-solun epitoopista, jolla on CRMi97~peptidin 357 - 383, CRMi97~peptidin 366 - 383, CRMi97-peptidin 369 - 10 383, CRMi97~peptidin 306 - 334 tai näiden antigeenisen va riantin aminohapposekvenssi, joka variantti ei häiritse epitoopin aktiivisuutta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen oligopeptidi, tunnettu siitä, että se koostuu oleellisesti te- 15 tanustoksiinin tai -toksoidin T-solun epitoopista, jolla on tetanustoksiinin peptidin 961 - 980, tetanustoksiinin peptidin 1021 - 1040 tai näiden antigeenisen variantin aminohapposekvenssi, joka variantti ei häiritse epitoopin aktiivisuutta.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen oligopeptidi, tunnettu siitä, että se koostuu oleellisesti bak- I f 1 I I 1 teeriperäisen toksiinin, CRM:n tai toksoidin T-solun epi-toopista, jonka aminohapposekvenssi on QWHNSYNRPAYSPG, V'i NLFQWHNSYNRPAYSPG, AYNFVE (tai G) SIINLFQWHNSYNRPAYSPG, ; 25 ILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIA, VSASHLEQYGTNEYSIISSM tai DKFNAYLANKWVFITITNDR.

5 CRM tai toksoidi on difteriatoksiini, tetanustoksiini, pertussistoksiini, CRM197, toksoidi tai tetanustoksoidi.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen oligopeptidi, tunnettu siitä, että lysiini- tai kysteiinitähde on kytketty aminopäähän, karboksipäähän tai molempiin.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen oligopeptidi, • I I tunnettu siitä, että lysiini- tai kysteiinitähde ** * on kytketty amino- tai karboksipäähän glysiinitähteen vä- lityksellä.

: 7. Menetelmä immunogeenisen konjugaatin valmista- I I 35 miseksi, tunnettu siitä, että kytketään polysak- karidiantigeeni oligopeptidiin, joka koostuu oleellisesti i « 104374 bakteeriperäisen toksiinin, CRM:n tai toksoidin vähintään yhdestä T-solun epitoopista.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeriperäinen toksiini,

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epitoopilla on CRM^97-peptidin 357 - 383, CRMi97~peptidin 366 - 383, CRMi97~peptidin 10 369 - 383, CRMi97-peptidin 306 - 334, tetanustoksiinin peptidin 961 - 980, tetanustoksiinin peptidin 1021 - 1040 tai näiden antigeenisen variantin aminohapposekvenssi, joka variantti ei häiritse epitoopin aktiivisuutta.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että antigeeni on mikrobiperäinen, virusperäinen tai parasiittiperäinen antigeeni, kasvainan-tigeeni, allergeeni tai autoimmuunisuuteen liittyvä antigeeni.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että antigeeni on kapselipolymeeri , , tai sen oligomeeri tai fragmentti.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kapselipolymeeri tai -oligomeeri on peräisin Haemophilus influenzae-, Streptococcus , . 25 pneumoniae-, Neisseria meningitidis- tai Salmonella typhi • · · • ’ -bakteerista. • · · :1Γ:

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, « tunnettu siitä, että kapselipolymeeri on H. influ-enzae -bakteerin polyribosyyliribitolifosfaatti.

14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, ♦ · · tunnettu siitä, että kapselipolymeeri on peräisin *·**· Streptococcus pneumoniae -bakteerin serotyypistä 1, 4, 5, 6A, 6B, 9V, 14, 18C, 19F tai 23F.

: 15. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että antigeeni kytketään oligopep-tidiin, jonka aminohapposekvenssi on QWHNSYNRPAYSPG, 104374 NLFQWHNSYNRPAYSPG, AYNFVE(tai G)SIINLFQVVHNSYNRPAYSPG, ILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIA, VSASHLEQYGTNEYSIISSM tai DKFNAYLANKWVFITITNDR.

16. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että antigeeni on bakteeriperäinen pintasakkaridi tai bakteeriperäinen solunseinän sakkaridi. • · • · · • · • · • · · • · · • · · • · « • # t • · · « · · « 1 · · • t « • · · « • · 74 104374