WO2013120159A1 - Cepa de mycobacterium recombinante, composição imunogênica e uso - Google Patents

Cepa de mycobacterium recombinante, composição imunogênica e uso Download PDF

Info

Publication number
WO2013120159A1
WO2013120159A1 PCT/BR2013/000049 BR2013000049W WO2013120159A1 WO 2013120159 A1 WO2013120159 A1 WO 2013120159A1 BR 2013000049 W BR2013000049 W BR 2013000049W WO 2013120159 A1 WO2013120159 A1 WO 2013120159A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mycobacterium
recombinant
bcg
tuberculosis
strain
Prior art date
Application number
PCT/BR2013/000049
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Luciana Cezar DE CERQUEIRA LEITE
Ivan PEREIRA NASCIMENTO
Original Assignee
Fundação Butantan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fundação Butantan filed Critical Fundação Butantan
Priority to BR112014020297-4A priority Critical patent/BR112014020297B1/pt
Priority to EP13749037.1A priority patent/EP2816106B1/en
Priority to CN201380020308.6A priority patent/CN104271733B/zh
Priority to IN1799MUN2014 priority patent/IN2014MN01799A/en
Priority to US14/379,149 priority patent/US9512186B2/en
Publication of WO2013120159A1 publication Critical patent/WO2013120159A1/pt
Priority to ZA2014/06437A priority patent/ZA201406437B/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides

Definitions

  • the present invention relates to recombinant Mycobacterium strains encoding the mutated Escherichia coli thermo-labile toxin LT or subunit A of the mutated Escherichia coli thermo-labile toxin LT.
  • the present invention also relates to Mycobacterium strains encoding the LT therapeutically labile toxin or subunit A of the Escherichia coli LT thermo-labile toxin LT.
  • the present invention relates to Mycobacterium strains encoding the LT thermo-labile toxin or Escherichia coli LT thermo-labile toxin A subunit mutated at serine to lysine position.
  • the present invention also provides immunogenic compositions comprising the strains of the present invention.
  • the present invention further provides for the use of said strains and immunological compositions in the manufacture of vaccine for prevention of tuberculosis and infections caused by Mycobacterium tuberculosis.
  • the present invention relates to methods of preventing or treating tuberculosis in animals.
  • Mycobacteria make up the genus Mycobacterium of the family Mycobacteriacae of the order Actinomycetales of the Actinomycetes class.
  • the mycobacteria that make up this genus have a slightly curved rod shape, from 1 to 10 ⁇ in length and 0.2 to 0.6 ⁇ in diameter. These bacteria cannot be classified as Gram positive or Gram negative.
  • the most striking feature of this bacillus is the complex nature of its cell envelope, containing a relatively small percentage.
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) high lipid levels, which include the long chains of mycolic acid. This envelope gives it a strong hydrophobicity, making it resistant to lysis and relatively impervious to antibiotics and other chemical agents.
  • the bacilli are said to be acid-alcohol resistant, that is, they are resistant to weak acid discoloration after staining with Fuchsin or similar dyes.
  • Genomic DNA contains a high guanosine / cytosine content, between 58-79%, which impairs the use of Escherichia coli bacteria as a genetic host. These aspects are considered basic characteristics for identification of the bacillus as a member of the Mycobacterium genus [ORME, I.
  • Mycobacteria have been classified into two main groups: slow-growing bacteria, which have a generation time of around 13 hours and can take from 3 weeks to 3 months of culture to provide visible colonies; and fast growing bacteria, which have a generation time of around 2-5 hours.
  • Slow-growing mycobacteria include many of the major animal and human pathogens such as M. tuberculosis, M. bovis, M. paratuberculosis, M. avium, M. leprae, etc.
  • fast-growing mycobacteria include non-pathogenic species such as M. smegmatis, M. aurum, M. vaccae, etc.
  • Four of the five pathogenic species of mycobacteria are grouped in the M.
  • tuberculosis complex - a group of four species that can cause tuberculosis disease (. Tuberculosis, M. bovis, M. microft and M. africanum); the fifth is M. leprae, the causative agent of Hansen's disease (informally known as leprosy) [SHINNICK, T. M & GOOD, RC (1994) Mycobacterial taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11: 884-901; ORME, I. (1995) Medical Intelligent Unit: Immunity to Mycobacteria. Austin: RG Lands Company, p. 5; CONNELL, ND (2001) Expression systems for use in Actinomycetes and related organisms. Current Opinion in Biotechnology 12: 446-449].
  • M. tuberculosis is transmitted mainly through the airway, and although it can cause disease in many organs, pulmonary tuberculosis is the most common. It is estimated that one third of the world's population is infected with the bacillus and that 200 million will have symptoms of tuberculosis, of which 35 million could die by 2020 if control and prevention measures are not taken (WHO Annual Publication, 2000).
  • BCG Calmette-Guérin Bacillus
  • tuberculosis itself [Sweeney, KA, Dao, DN, Goldberg, MF, Hsu, T., Venkataswamy, MM, Henao-Tamayo, M., Ordway, D., Sellers, RS, Jain, P Chen, B., Chen, M., Kim, J., Lukose, R., Chan, J., Orme, IM, Porcelli, SA and Jacobs, WR Jr. (2011) A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal. immunity against Mycobacterium tuberculosis. Nat Med. 4: 1261-1268; Kaufmann, SH (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567-577;
  • smegmatis [Sweeney, KA, Dao, DN, Goldberg, MF, Hsu, T., Venkataswamy, MM, Henao-Tamayo, M. , Ordway, D., Sellers, RS, Jain, P., Chen, B., Chen, M., Kim, J., Lukose, R., Chan, J., Orme, IM, Porcelli, SA and Jacobs, WR Jr. (2011) A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium tuberculosis. Nat Med. 4: 1261-1268; Kaufmann, SH (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567-577].
  • BCG is the most widely used vaccine in the world because it has a long lasting immune response and a very low frequency of serious adverse effects. This and other features make BCG an excellent vehicle candidate for presentation of heterologous antigens through BCG-based recombinant vaccines (US Patent 6,673,353).
  • Adjuvant properties have been attributed to several bacterial toxins.
  • tetanus TT
  • diphtheria DT
  • choleric CT
  • LT heat-labile toxin
  • E. coli LT toxin is among the most potent adjuvants ever described [Lycke, N. et al. (1992) The adjuvant effect of Vibrio cholerae and Escherichia coli heat-labile enterotoxins is linked to their ADP-ribosyltransferase activity. Eur J Immunol. 22: 2277-2281; Pizza, M. et al. (2001) Mucosal vaccines: non-toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants. Vaccine, 19: 2534-2541].
  • the E. coli LT toxin is formed by a single A-subunit molecule (LTA, 27kDa), with ADP ribosyltransferase activity, linked to a B-subunit pentamer (LTB, 11.6 kDa each) that binds to the ganglioside receptor GM1. of mammalian cells.
  • LT subunit B is a potent signaling molecule capable of modulating the immune response.
  • the immunostimulatory effect of LTB seems to be related to its ability to increase antigen presentation via the major class I (MHC-I) and class II (HC-II) histocompatibility complex, among other factors.
  • LTB has been directly related to GM1 binding activity, through the activation of B cells and CD4 + T cells through the interaction of B subunit pentamers and GM1 receptors of these cells.
  • LTB increases antigen presentation by activating dendritic cells (DCs) and other antigen presenting cells (APCs). Binding of LTB to GM1 ganglioside allows the toxic A subunit to enter the cell [Spangler, BD (1992) Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Microbiol Rev. 56: 622-647].
  • LT as an adjuvant
  • Subunit B due to its lack of toxicity, has been more often used as an adjuvant [from Haan, L., Verweij, WR, Feil, IK, Holtrop, M., Hol, WG, Agsteribbe, E. and Wilschut, J. (1998) Role of GM1 binding in the mucosal immunogenicity and adjuvant activity of the heat-labile Escherichia coli enterotoxin and its B subunit. Immunology, 94: 424-430].
  • LT can also influence dendritic cell maturation, antigen presentation and T cell activation and promote induction of response by antigen-specific cytotoxic T cells in an animal model.
  • the use of LT as adjuvant commonly leads to a cytokine balance, involving the production of a response by cytokines with both Th1 and Th2 characteristics and some antibody classes in mice and humans.
  • This toxin is capable of activating an immune response against another antigen when presented simultaneously on the mucosal surface or by oral, intranasal or parenteral administration [Holmgren, J., Lycke, N. and Czerkinsky, C. (1993). cholera B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems. Vaccine, 11: 1179-1184].
  • LT has been used extensively as an adjuvant in animal models.
  • immunomodulatory action of LT it is highly toxic and inappropriate for clinical use in humans.
  • different strategies have been employed, including isolation of the non-toxic B subunit and the construction of non-toxic LT mutants containing site mutations. -specific addresses.
  • Through computational modeling studies of the LT protein structure it was possible to identify some amino acids potentially involved in the enzymatic activity of this protein that could be studied by exchanging them for site-directed mutation [Magagnoli, C. et al., (1996 ) Infect Immun. 64: 5434-5438].
  • mutants such as LTR192G (arginine to glycine substitution at position 192) have a mutation in a loop region that is protease sensitive, making this region insensitive to protease action, a key step in activating enzymatic activity and therefore of its toxicity.
  • mutants have a mutation in the enzymatically active region of the A subunit, such as LTR72 (substitution of alanine for arginine at position 72), which retains only 1% of ADP-ribosyltransferase activity.
  • LTK63 replacement of serine for lysine at position 63. This mutation eliminates toxicity-associated ADP-ribosyltransferase activity; eliminating it, however, retains all other biological properties, including adjuvant properties of native LT [Pizza, M., et al., (2001) Mucosal vaccines: non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants. Vaccine, 19: 2534-2541].
  • LTK63 has been shown to act as a potent adjuvant when administered mucosally or parenterally.
  • De Haan and colleagues [De Haan, L., Holtrop, M. , Verweij, R., Agsteribbe, E. and Wilschut, J. (1999) Mucosal immunogenicity and adjuvant activity of the recombinant A subunit of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Immunology, 97: 706-7013] suggest that adjuvants using non-toxic LTA in combination with the LTB pentamer may be more potent than adjuvants using the B subunit alone, as the complex could stimulate the immune system more strongly than each molecule individually. .
  • Data pointing to an important subunit function Enzymatically inactive in inducing an immune response, as well as in immunomodulatory activities such as effects on antigen processing and presentation, support this view.
  • LTB and LTK63 have typically been expressed in E. coli. However, other expression systems have been used.
  • the LTB molecule has been expressed in Mycocabterium bovis BCG, Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, as well as plants including Oryza sativa (rice), Lactuca sativa (lettuce) and Peperomia pellucid.
  • LTK63 has also been expressed in tobacco and chloroplasts, as well as attenuated serovar enteric Salmonella Typhimurium [da Hora, V.P. et al. (2011) Non-toxic derivatives of LT as potent adjuvants. Vaccine, 29: 1538-1544].
  • BCG Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin
  • strains of Mycobacterium in particular Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), which encode the heat-labile LT toxin or A-subunit of the Escherichia coli thermo-labile LT toxin 63
  • strains of Mycobacterium in particular Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), which encode the heat-labile LT toxin or subunit A of Escherichia coli heat-labile toxin LT serine position 63 for lysine, respectively rBCG-LTK63 and rBCG-LTAK63.
  • BCG Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin
  • Another object of the invention is to provide the use of said strains and immunological compositions in the manufacture of vaccines for prevention of tuberculosis and / or infections caused by Mycobacterium tuberculosis or other mycobacteria.
  • the present invention aims to provide improved tuberculosis BCG vaccines (ie that induce better protection than the conventional BCG strain) comprising the recombinant Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) strains of the present invention.
  • BCG Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin
  • the present invention further objects methods for preventing or treating tuberculosis in animals, more particularly humans.
  • BCG refers to attenuated Mycobacterium bovis, Calmette-Guérin Bacillus
  • LTK63 refers to Escherichia coli thermo-labile toxin containing subunit A modified by site-directed mutagenesis
  • LTAK63 refers to the subunit A of the term Escherichia coli labile toxin, modified by site-directed mutagenesis
  • rBCG-LTK63 or rBCG-LTAK63 refers to recombinant BCG expressing LTK63 or LTAK63.
  • Figure 1 shows an agarose gel containing PCR products that confirm the presence of the LTK63 gene in recombinant BCG (rBCG-LTK63).
  • PCR products were amplified from plasmid DNA extracted from the rBCG-LTK63 construct using specific primer oligonucleotides to amplify the LTA subunit or LTB unit. 1Kb plus, molecular weight; lane 1, complete LTA fragment (-700 bp); well 2, complete LTB fragment (-316 bp).
  • Figure 2 shows the characterization of LTAK63 (-31.0 kDa) expression in recombinant BCG.
  • Soluble protein extract (-10 g) from pLNIP-LTAK63-transformed rBCG (A), or empty BCG as negative control (B) was used in this immunoassay.
  • Figures 3 and 4 show comparative analysis of the induced IgG1 and IgG2a antibody response against proteins recovered from the BCG - PDS culture supernatant.
  • Four-week-old female BALB / c mice (18-22g) from the Veterinary Medicine Faculty of the USP were immunized with BCG or rBCG-LT ( Figure 3) or BCG or rBCG-LTAK63 ( Figure 4). and isotypes determined in isolated sera one day before challenge against MTB or 90 days after immunization. Sera from 5 animals per group were individually analyzed by ELISA using mouse anti-IgG1 and IgG2a specific antibodies.
  • Figures 5 and 6 show IFN- ⁇ production by splenocytes cultured in the presence of PDS.
  • Female BALB / c mice were immunized with 1 x 10 6 CFU of BCG or rBGC-LT ( Figure 5) or BCG or rBCG-LTAK63 ( Figure 6) and after four weeks or eight weeks, respectively, the spleens were recovered and preparations of Single cells were cultured in vitro (2 x 10 6 cells / well) in the presence of 2.0 ⁇ g / mL PDS. Culture supernatants were recovered after 48 h and IFN- ⁇ levels determined by ELISA.
  • Figures 7 and 8 show TNF- ⁇ production by splenocytes cultured in the presence of PDS.
  • Figures 9 and 10 show the profile of CD4 * T cells producing cytokines INF- ⁇ and TNF-a, respectively.
  • Eight weeks after immunization the spleens were recovered and single cell preparations were cultured in vitro (2 x 10 6 cells / well) in the presence of 2.0 pg / ml PDS.
  • the profile of CD4 + T-cells producing the various cytokines were analyzed by Flow Cytometry (FACs) using specific anti-CD4, anti-INF- ⁇ and anti-TNF-a antibodies labeled with the appropriate fluorochrome.
  • FACs Flow Cytometry
  • Figure 11 shows the outcome of protection trials against an intratracheal challenge with the M. tuberculosis H37Rv strain.
  • Female BALB / c mice (n 10 per group) A and B were immunized sc only with M. bovis BCG or rBCG-LT. An unimmunized group was used as a negative control.
  • a and B represent two assays performed at different times under the same conditions.
  • the present invention relates to recombinant Mycobacterium strains encoding the mutated Escherichia coli heat-labile toxin LT.
  • the present invention also relates to recombinant Mycobacterium strains encoding the subunit A of the mutated Escherichia coli heat-labile LT toxin.
  • the present invention relates to strains of
  • Mycobacterium encoding the LT thermo-labile toxin or Escherichia coli LT thermo-labile toxin A subunit.
  • the present invention relates to Mycobacterium strains encoding the LT thermo-labile toxin or Escherichia coli LT thermo-labile toxin A subunit mutated at serine to lysine position, respectively rBCG-LTK63 and rBCG-LTAK63 .
  • Said mutations allow the Escherichia coli LT thermo-labile toxin or the Escherichia coli LT thermo-labile toxin A subunit to retain the adjuvant properties of native LT, but lose the toxicity-associated ADP-ribosyltransferase activity, avoiding thus toxicity problems in the case in humans or other animals.
  • Mycobacterium strains encoding the LT thermo-labile toxin or Escherichia coli LT thermo-labile toxin A subunit that show other mutations in their sequences which have an equivalent effect, ie maintenance of native LT adjuvant properties and toxicity reduction or suppression, are also contemplated in the present invention.
  • Such mutations may include, but are not limited to, positions 72 and 192.
  • strains of the present invention are obtained from any strain of the genus Mycobacterium as a carrier for the presentation of one or more antigens of distinct organisms, obtained and cloned into mycobacterial expression vector and inserted by genetic manipulation.
  • the recombinant Mycobacterium strains of the present invention comprise strains of the MTB complex, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium microft. and Mycobacterium africanum or fast growing mycobacteria, Mycobacterium smegmatis, M. aurum, M. vaccae, etc.
  • the recombinant Mycobacterium strains of the present invention comprise Mycobacterium bovis strains Bacillus Calmette Guerin (BCG).
  • the present invention relates to immunogenic compositions comprising one or more strains of the present invention and one or more of a physiologically acceptable carrier, excipient, diluent or solvent.
  • compositions of the present invention comprise strains of Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), which encode LT-mutated thermo-labile toxin from serine to lysine, i.e., rBCG-LTK63.
  • BCG Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin
  • compositions of the present invention preferably comprise strains of Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), which encode the subunit A of the serine-lysine LT-mutated thermo labile toxin, ie, rBCG-LTAK63.
  • BCG Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin
  • the compositions of the present invention may further comprise a mixture of Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) strains encoding the serine-lysine mutated thermo-labile toxin LT, ie, rBCG-LTK63 and toxin A subunit thermo-labile LT mutated at position 63 from serine to lysine, ie, rBCG-LTAK63.
  • the immunogenic compositions of the present invention may further comprise one or more antigens, preferably inactivated toxins.
  • antigens may be for use in the prevention and / or treatment of tuberculosis or other diseases caused by distinct pathogens.
  • the inactivated components of the synergistic immunogenic compositions of the present invention may be obtained by any method known in the art, such as chemical procedures, such as treatment with formaldehyde or hydrogen peroxide, or even DNA recombination techniques.
  • Adjuvants are attenuated or dead attenuated molecules, components, macromolecules or microorganisms that enhance the response to immunizations, reduce the amount of antigen needed, and direct the type of immune response to be developed, and sustain it by longer period of time as an immunogen; is any material or substance that alters the type, speed, intensity or duration of the immune response.
  • compositions of the present invention may further comprise excipients such as bactericides, bacteriostats, antioxidants, preservatives, buffers, stabilizers, pH adjusters, osmolality adjusters, antifoam agents and surfactants; and residues of antigen inactivation or fractionation agents, growth media and solvents commonly used in vaccine production; Examples of these types of components can be found on Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases The Pink Book, 11th edition, "Vaccine Excipient & Media Summary” section (Centers for Disease Control and Prevention. Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases. Atkinson, Wolfe S, Hamborsky J, McLntyre L, ed. 11th Washington DC: Public Health Foundation, 2009) incorporated herein by reference.
  • excipients such as bactericides, bacteriostats, antioxidants, preservatives, buffers, stabilizers, pH adjusters, osmolality adjusters, antifoam agents
  • the term "pharmaceutically acceptable” means a non-toxic, inert solid, semi-solid liquid excipient, diluent, auxiliary formulation of any kind, or simply a sterile aqueous medium, such as saline.
  • Examples of materials that may serve as pharmaceutically acceptable carriers are sugars such as lactose, glucose and sucrose, starches such as cornstarch and potato starch, cellulose and derivatives thereof such as sodium carboxymethylcellulose, ethyl cellulose and cellulose acetate, cyclodextrin; oils such as peanut oil, cottonseed oil, sunflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil; glycols such as propylene glycol, polyols such as glycerin glycol, sorbitol, mannitol and polyethylene; esters such as ethyl laurate, ethyl oleate, agar buffering agents such as aluminum hydroxide and magnesium hydroxide; alginic acid, - pyrogen free water; isotonic saline, Ringer's solution; ethyl alcohol and phosphate buffer solutions as well as other compatible non-toxic substances used in pharmaceutical formulations.
  • sugars such as lactose, glucose and sucrose
  • a variety of routes of administration of the compositions Immunotherapeutic agents and vaccines described in the present invention are available. The particular mode selected will depend upon the particular active ingredient selected, the dosage required for therapeutic efficacy and the patient to whom the composition will be administered.
  • the methods of the present invention can generally be practiced using any biologically acceptable mode of administration, ie any modality that produces effective levels of immune response without causing clinically undesirable adverse effects.
  • modes of administration include intradermal, oral, rectal, sublingual, topical, nasal, transdermal or parenteral routes.
  • parenteral includes subcutaneous, intravenous, epidural, irrigation, intramuscular, release, or infusion pumps. Particularly in this invention intradermal, oral, parenteral and nasal routes are preferred for administration of the compositions claimed herein.
  • the active ingredients may also be dissolved in a pharmaceutical carrier and administered as a solution, emulsion, including micro and nanoemulsions, or suspension.
  • suitable carriers are water, saline, dextrose solutions, fructose solutions or oils of animal, vegetable or synthetic origin.
  • the active ingredients may be dissolved in a pharmaceutical carrier and administered as a solution, emulsion, including micro and nanoemulsions, or suspension.
  • suitable carriers are water and saline or solid suspensions such as spray, lactose, fructose or chitosan flakes.
  • Other carriers may also contain other ingredients, for example preservatives, suspending agents, solubilizing agents, buffers and the like.
  • the immunogenic compositions of the present invention are for intradermal, oral and parenteral administration.
  • the strains and immunogenic compositions of the present invention have an unexpected synergistic effect on the immune response against Mycobacterium.
  • Recombinant LTK63 or LTAK63 antigens have the unexpected technical effect of inducing an adjuvant effect against Mycobacterium's own proteins.
  • the strains and immunogenic compositions of the present invention have the unexpected technical effect of eliciting a stronger anti-TB immune response when compared to vaccines comprising traditional BCG. That is, the addition of an immunogenic domain, such as the non-toxic E. coli heat-labile toxin subunit LTAK63, which is known to have no connection with any type of mycobacteria, in a recombinant mycobacterium, in particular BCG, causes an increased protective response against tuberculosis.
  • an immunogenic domain such as the non-toxic E. coli heat-labile toxin subunit LTAK63, which is known to have no connection with any type of mycobacteria, in a recombinant mycobacterium, in particular BCG, causes an increased protective response against tuberculosis.
  • strains and immunogenic compositions of the present invention promote a decrease in lung bacillary burden in animal models of tuberculosis.
  • strains and immunogenic compositions of the present invention lead to a significant increase in IFN- ⁇ expression over the control group, a cytokine considered essential in the response against tuberculosis; This signals a polarized Thl type response.
  • the strains and immunogenic compositions of the present invention also lead to a significant increase in TNF- ⁇ . Since TNF- ⁇ is a signaling agent for proinflammatory action, characterizing the acute phase of the inflammatory process triggered by the bacilli, then the vaccines of the present invention promote direct activation of the immune system.
  • strains and immunogenic compositions of the present invention by combining mycobacteria, in particular BCG, and toxins from other pathogens, preferably from Escherichia coli, generating a recombinant mycobacterial strain, constitute a new, more potent and effective vaccine than the conventional BCG for tuberculosis prophylaxis or immunization.
  • the immunogenic compositions for the prevention of mycobacterial infections, in particular Mycobacterium tuberculosis in animals, more particularly humans.
  • Another aspect of the present invention is the use of one or more recombinant Mycobacterium strains or one or more immunogenic compositions of the present invention in the manufacture of a vaccine.
  • Still another aspect of the present invention is methods of preventing or treating tuberculosis in animals, more particularly human.
  • Example 1 describes obtaining the vaccines of the present invention.
  • Example 2 to 3 the properties and use of the vaccine of the present invention are illustrated. These Examples are given by way of illustration only and should in no way be construed as limiting the scope and scope of the present invention.
  • This example describes obtaining the rBCG-LTK63 and rBGC-LTAK63 vaccines.
  • a) Preparation of competent BCG stock lot For preparation of competent BCG stocks, one or more BCG colonies were grown in Middlebrook 7H9 plus Tween-80 liquid medium and supplemented with 10% albumin dextrose catalase (MB7H9 / Tw / ADC) to the exponential phase.
  • the culture was then pelleted by centrifugation at 4000 rpm and washed twice with 10% glycerol at 4 ° C, finally resuspended in 5% of the original volume with 10% glycerol and stored at -70 ° C until transformed by electroporation with plasmid pNL12-LTK63 or plasmid pNL12-LTAK63.
  • LTK63 gene expression vector in recombinant BCG referred to herein as pNL12-LTK63;
  • the mycobacterial expression vector used for LTK63 expression in recombinant BCG is called pMIP12 and has been described by Le Dantec [Le Dantec et al. 2001 J Bacteriol. 183: 2157-2164].
  • the LTK63 gene was kindly provided by Dr. Rino Rappuoli (Novartis).
  • the recombinant BCG expression vector of the LTK63 gene was constructed using standard molecular biology methods.
  • LTK63 The gene was amplified by PCR using the following primers: N-terminal (5 '- 3 TAGGGTACCCAAAAATATAACTTCATTTTTTTTATTTT- ") containing the Kpn I restriction site (underlined) and C- terminal (5' - TAGCTGCAGCTAGTTTTTCATACTGATTGCCC-3 '), containing the Pst I restriction site (underlined)
  • the PCR product corresponding to the LTK63 gene was generated using the following PCR conditions: 94 ° C for 4 minutes, 25 cycles of 94 ° C for 1 min, 50 ° C for 1 min and 72 ° C for 30 s and final 4 ° C.
  • This PCR product was then digested with restriction enzymes Kpn I and Pst I and then cloned into the pMIP12 expression vector, which was also previously digested with the same enzymes. Kpn I and Pst I, thus generating the expression vector called pMIP12 / LTK63.
  • pLN12-LTAK63 Construction of the LTAK63 gene expression vector in recombinant BCG termed herein pLN12-LTAK63:
  • the recombinant BCG expression vector of the LTAK63 gene was constructed using conventional molecular biology methods.
  • the LTAK63 gene was PCR amplified from LTK63 gene using the following primer oligonucleotides: N-terminal (5'-)
  • PCR product corresponding to the LTAK63 gene was generated using the following PCR conditions: 94 ° C for 4 minutes; 25 cycles of 94 ° C for 1 min, 50 ° C for 1 min and 72 ° C for 30 s; and 4 ° C final.
  • This PCR product was then digested with the restriction enzymes BamH I and Kpn I and then cloned into the expression vector pMIP12, which was also previously digested with the same enzymes BamH I and Kpn I, thus generating the expression vector called pLNIP. -LTAK63.
  • rBCG-LTK63 For preparation of rBCG-LTK63, a 50-200 ⁇ stock aliquot of competent BCG was mixed with 0.1-1 ⁇ pNL12-LTK63 in cuvettes. 2 mm electroporation and is subjected to 2.5 kV, 25 pF and 1000 ⁇ pulses in a pulsation electroporator (GenePulser, BioRad, Hemel Hempstead, UK).
  • the contents of the cuvettes were recovered in 2 mL of antibiotic-free medium (MB7H9 / Tw / ADC) and incubated at 37 ° C for 20 h before being seeded in Middlebrook 7H10 (Difco) solid medium supplemented with oleic acid.
  • Middlebrook 7H10 Middlebrook 7H10
  • albumin dextrose catalase 10% (MB7H9 / OADC) plus kanamycin (20 pg / mL) for selection of transformants.
  • Approximate composition of the solid medium Middlebrook 7H10 according to manufacturer (Difco-BD): Ammonium Sulphate, Potassium Monophosphate, Potassium Biophosphate, Sodium Citrate, Magnesium Sulphate, Calcium Chloride, Zinc Sulphate, Copper Sulphate L-Glutamic Acid, Ferric Ammonium Citrate, Pyridoxine Hydrochloride, Biotin, Malachite Green and Agar.
  • the selected rBCG colonies were then transferred to 5 mL of kanamycin MB7H9 / Tw / ADC liquid culture medium (20 pg / mL).
  • rBCG-LTAK63 a 50-200 ⁇ competente stock aliquot of competent BCG was mixed with 0.1-1 pg of pLN12-LTAK63 in 2 mm electroporation cuvettes and submitted. at 2.5 kV, 25] iF and 1000 ⁇ pulses in a pulsation electroporator (GenePulser, BioRad, Hemel Hempstead, U).
  • the contents of the cuvettes were recovered in 2 ml antibiotic-free medium (MB7H9 / Tw / ADC) and incubated at 37 ° C for 20 h before being seeded in Middlebrook 7H10 (Difco) solid medium supplemented with oleic albumin - 10% dextrose catalase (MB7H9 / OADC) plus kanamycin (20 pg / mL) for selection of transformants.
  • Approximate composition of the solid medium Middlebrook 7H10 according to manufacturer (Difco-BD): Ammonium Sulphate, Potassium Monophosphate, Potassium Bi-Phosphate, Sodium Citrate, Magnesium Sulphate, Calcium Chloride, Zinc Sulphate, Copper Sulphate L-Glutamic Acid, Ferric Ammonium Citrate, Pyridoxine Hydrochloride, Biotin, Malachite Green and Agar.
  • the selected rBCG colonies were then transferred to 5 mL of kanamycin (MB7H9 / Tw / ADC) liquid culture medium (20 g / mL).
  • LTK63 gene expression could not be determined by the classical immunoassay method
  • characterization of LTK63 expression was performed indirectly by confirming the presence of the LTK63 gene in the plasmid within recombinant BGC. This characterization was performed by PCR assay using specific primers, the same as those described above and used to amplify and clone the LTK63 gene in the pMIP12 vector ( Figure 1).
  • LTAK63 gene expression was verified using a Western blot as follows: one or more aliquots of rBCG-LTAK63 were sonicated for 1.5 min under ice. at a constant amplitude corresponding to half the maximum value (Soniprep 150 MSE, UK) and centrifuged for solids precipitation. Supernatants were recovered and protein concentration dosed using the BIO-RAD Protein Assay Kit (Bio-Rad) using bovine albumin as standard. Samples containing 10 pg of total protein were applied to 10% polyacrylamide gel in the presence of sodium (10% SDS-PAGE). Electrophoresis was performed at room temperature at 120 V until the dye reached the end of the gel.
  • the proteins were transferred to 0.45 ⁇ m pore PDVF membrane (GE Healthcare) using a semi-dry transfer system.
  • the LT-containing gel as a positive control, was glued under the PDVF membrane, dipped in transfer buffer (0.25 M Tris, pH 8.3, 0.129 M glycine and 20% methanol) and placed between five filter sheets as well. soaked in the same buffer. The assembly was placed between two plates and subjected to a 120 mA current for 1.5 h at room temperature. At the end of the electrotransfer, the membrane was removed from the system and incubated in a blocking solution (PBS containing 5% milk - PBS-L) at 4 ° C overnight.
  • PBS containing 5% milk - PBS-L
  • the membrane was incubated at room temperature for 2 h with anti-LT serum diluted in PBS-L (1: 1000 dilution). After this incubation period the PVDF membrane was washed three times under mild agitation with 0.1% PBS / Tween20 (PBS-T) at 10 min intervals. The membrane was then incubated for 2 h under the same conditions in PBS-L containing HRP-conjugated anti-IgG antibody (Sigma, Chem Co, St. Luis) and again washed 3 times with PBS-T. Developing was by chemiluminescence using the ECL kit (Amersham) by exposure on photocumentation device (ImageQuant LAS4000 - GE) ( Figure 2).
  • EXAMPLE 2 Humoral and cellular immune response assay of animals immunized with rBCG-LTK63.
  • mice Female BALB / c mice (Mus musculus, Rodentia, Mammalia), 6 to 8 weeks old, from and maintained under the standard conditions of the Central Biotery of the University of S ⁇ o Paulo School of Medicine were used.
  • BCG group animals immunized subcutaneously (sc) with 0.1 ml BCG suspension (1x10 6 CFU / mouse suspended in PBS IX);
  • rBCG-LTK63 group animals immunized subcutaneously (sc) with 0.1 ml rBCG-LTK63 suspension (1x10 6 CFU / mouse suspended in PBS IX);
  • rBCG-LTKA63 group animals immunized subcutaneously (sc) with 0.1 ml rBCG-LTAK63 suspension (1x10 6 CFU / mouse suspended in PBS IX); Control Group: animals inoculated with 0.1 mL saline (PBS IX).
  • Humoral response For this procedure, animals immunized or inoculated with the control, either BCG or rBCG-LT ( Figure 3) or BCG or rBCG-LTAK63 ( Figure 4), were bled retro-orbital one day before. challenge and the separated and aliquoted serum for further characterization by the ELISA method. Isotypes were determined in isolated sera one day before MTB challenge or 90 days after immunization. Sera from 5 animals per group were individually analyzed by ELISA using mouse anti-IgG1 and IgG2a specific antibodies. Humoral response analysis was performed by comparing the concentration of PDS specific antibodies and / or IgG1 and IgG2a subtypes in the different immunization groups.
  • mice Initially the spleens of the immunized mice as described above were removed 30 days after the first and only immunization, macerated and passed through 70 ⁇ porosity sieves (Celi strainer- ⁇ Falcon, Bedford, MA). The splenocytes thus obtained from each group (Saline, BCG and rBCG-LTK63) were counted in a Neubauer chamber and their viability evaluated by Trypan blue staining.
  • rBCG-LTAK63 Cell Response The evaluation of the Saline, BCG, and rBCG-LTAK63 Cell Response was performed by ELISA and Flow Cytometry (FACS) methods. Initially the spleens of the immunized mice as described above were removed 60 days after the first and only immunization, macerated in Pyrex-type tissue homogenizers (Fischer Scientific - USA) and the splenocytes recovered. The splenocytes thus obtained from each group (Saline, BCG and rBCG-LTA 63) were counted in a Neubauer chamber and their viability evaluated by Trypan blue staining.
  • FACS Flow Cytometry
  • RPMI 1640 (GIBCO Life Technologies), penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 g / ml) plus 10% fetal bovine serum] at a concentration of 2x10 6 cells / ml for ELISA and FACS.
  • RPMI 1640 GEBCO Life Technologies
  • penicillin 100 U / ml
  • streptomycin 100 g / ml
  • a volume of 500 pL of cells was seeded in a 96-well plate under PDS stimulation (5 pg / mL) and incubated for 5 hours at 37 ° C with 5% CO 2 atmosphere.
  • PDS stimulation 5 pg / mL
  • Each sample was aliquoted and labeled in three different tubes (200 ⁇ / tube) following intracellular permeabilization protocol and labeling to separately analyze intracellular expression of INF- ⁇ and TNF-a within the CD4 + T cell subpopulation.
  • Standard protocol provided by the manufacturer was used for surface labeling (anti-CD4-PerCP, BD Pharmingen, San Diego, CA.
  • EXAMPLE 3 Development of the animal model of tuberculosis challenge - Protection trials against an intracheal challenge with the M. tuberculosis H37Rv strain.
  • mice C57BL / 6 mice were used.
  • the Mycobacterium tuberculosis (MTB) 37HRv strain which was grown in MB7H9 / Tw / ADC liquid medium in an oven at 37 ° C and 5% CO 2 , was used for challenge assays.
  • the MTB bacillary suspension was cultured in 7H9 / Tw / ADC medium for two weeks and only suspensions with at least 80% viable bacilli were used for intratracheal challenge.
  • the bacillary culture was centrifuged at 4000 rpm and washed twice with equal volume of culture with PBS IX. Then the pellet was resuspended in 1 ml PBS IX and the bacillus number estimated using the Macfarland scale.
  • the animals were followed for four weeks. After this period , they were sacrificed camera C0 2 and lungs removed for processing. One of the lobes of each lung was separated and macerated in a total volume of 1 ml PBS IX solution. This material was then serially diluted and seeded into 7H10 / OADC solid medium petri dishes. Thirty days later, the number of CFUs was determined on the plates corresponding to each group of immunized animals ( Figure 11).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

A presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada. A presente invenção refere-se também a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63. Especificamente, a presente invenção refere- se a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63 de serina para lisina. A presente invenção fornece também composições imunogênicas que compreendem as cepas da presente invenção. A presente invenção prevê ainda o uso das referidas cepas e composições imunológicas na manufatura de vacina para prevenção contra tuberculose e infecções causadas por Mycobacterium tuberculosis. Por último, a presente invenção refere-se a métodos de prevenir ou tratar tuberculose em animais.

Description

"CEPA DE MYCOBACTERIUM RECOMBINANTE , COMPOSIÇÃO IMUNOGÉNICA E USO."
A presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutada ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.
A presente invenção refere-se também a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63.
Especificamente, a presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63 de serina para lisina.
A presente invenção fornece também composições imunogênicas que compreendem as cepas da presente invenção.
A presente invenção prevê ainda o uso das referidas cepas e composições imunológicas na manufatura de vacina para prevenção contra tuberculose e infecções causadas por Mycobacterium tuberculosis.
Por último, a presente invenção refere-se a métodos de prevenir ou tratar tuberculose em animais.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Das micobactérias
As micobactérias compõem o género Mycobacterium da família das Mycobacteriacae da ordem dos Actinomycetales da classe dos Actinomycetes . As micobactérias que compõe esse género possuem um formato de bastonetes ligeiramente curvos, de 1 a 10 μιτι de comprimento e 0,2 a 0,6 μπι de diâmetro. Estas bactérias não podem ser classificadas como Gram-positivas, nem como Gram-negativas . A característica mais marcante desse bacilo é a natureza complexa de seu envelope celular, contendo uma percentagem relativamente
FOLHA DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) alta de lipídios, os quais incluem as longas cadeias de ácido micólico. Esse envelope lhe confere uma forte hidrofobicidade, tornando-o resistente à lise e relativamente impermeável a antibióticos e outros agentes químicos. Os bacilos são ditos ácido-álcool resistentes, ou seja, são resistentes às descolorações por ácidos fracos após coloração com Fucsina ou corantes similares. O DNA genômico contém um alto conteúdo de guanosina/citosina, entre 58-79%, o que prejudica o uso da bactéria Escherichia coli como um hospedeiro genético. Estes aspectos são considerados características básicas para a identificação do bacilo como membro do género Mycobacterium [ORME, I. (1995) Medicai Intelligent Unit: Immunity to Mycobacteria . Austin: R.G. Lands Company, p. 5; JAWETZ, E . , MELNICK, J.L. Sc ADELBERG, E.A. (1998) Medicai Microbiology . 213t Ed. Appleton & Lange, Stamford, Connecticut ; SHINNICK, T .M. & GOOD, R. C. (1994) Mycobacterial taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11: 884-901] .
As micobactérias foram classificadas em dois principais grupos: bactérias de crescimento lento, que possuem um tempo de geração em torno de 13 horas e que podem levar de 3 semanas a 3 meses de cultura para fornecer colónias visíveis; e as bactérias de crescimento rápido, que possuem um tempo de geração em torno de 2-5 horas. As micobactérias de crescimento lento incluem muitos dos maiores patógenos de animais e humanos, como M. tuberculosis , M. bovis, M. paratuberculosis, M. avium, M. leprae, etc, enquanto as de crescimento rápido incluem espécies não patogênicas, tais como M. smegmatis , M. aurum, M. vaccae, etc. Quatro das cinco espécies patogênicas de micobactérias são agrupadas no complexo M. tuberculosis - um grupo de quatro espécies que pode causar a doença tuberculose ( . tuberculosis , M. bovis, M. microft e M. africanum) ; a quinta é a M. leprae, o agente causador da doença de Hansen (informalmente conhecida como lepra) [SHINNICK, T . M . & GOOD, R. C. (1994) Mycobacterial taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11: 884-901; ORME, I. (1995) Medicai Intelligent Unit : Immunity to Mycobacteria. Austin: R.G. Lands Company, p. 5; CONNELL, N.D. (2001) Expression systems for use in Actinomycetes and related organisms. Current Opinion in Biotechnology 12: 446-449] .
O M. tuberculosis (MTB) é transmitido, sobretudo pela via respiratória e, embora possa causar doenças em diversos órgãos, a tuberculose pulmonar é a mais comum. Estima- se que um terço da população mundial esteja infectada pelo bacilo e que 200 milhões irão apresentar sintomas de tuberculose, dos quais 35 milhões poderão morrer até 2020 se medidas de controle e prevenção não forem tomadas (OMS Publicação Anual, 2000) .
Da profilaxia da tuberculose e do uso do bacilo de Calmette-Guérin (BCG)
No início do século passado, Albert Calmette e Camille Guérin, atenuaram uma cepa virulenta de Mycobacterium bovis. Esta cepa é conhecida atualmente como Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) , sendo a única vacina contra a tuberculose usada atualmente com sucesso, tendo já sido administrada a mais de três bilhões de indivíduos em todo o mundo .
Não obstante, a sua eficácia contra a forma adulta da tuberculose tem sido motivo de controvérsia, uma vez que pode variar de 0-80%, dependendo do estudo [Andersen, P. and Doherty, T.M. (2005) The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nat Rev Microbiol. 3: 656-662] . Assim, vários esforços têm sido empreendidos no desenvolvimento de novas vacinas, baseadas a) em proteínas recombinantes ou antígenos dominantes de MTB; b) na expressão desses mesmos antígenos em diversos vetores, tais como vetores virais, vetores bacterianos ou vetores baseados em BCG recombinante; c) em outras micobactérias que não causam tuberculose tais como Mycobacterium smegmatis ; ou d) no próprio M. tuberculosis atenuado [Sweeney, K.A, Dao, D.N., Goldberg, M.F., Hsu, T. , Venkataswamy, M.M., Henao-Tamayo, M. , Ordway, D., Sellers, R.S., Jain, P., Chen, B., Chen, M. , Kim, J., Lukose, R. , Chan, J. , Orme, I.M., Porcelli, S.A. and Jacobs, W.R Jr. (2011) A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium tuberculosis . Nat Med. 4:1261-1268; Kaufmann, S.H. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567-577;
De um modo geral, a idéia por trás destas vacinas é buscar uma forma de mimetizar o que acontece numa situação real, ou seja, apresentar o patógeno por inteiro numa forma morta ou viva, porém, atenuada e que não provoque infecção [Kaufmann, S.H. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567-577], ou usando uma outra espécie do mesmo género, também morta ou atenuada, como a BCG, que possui antígenos importantes em comum com o patógeno de interesse. Outra variante dessas vacinas seria o seu uso como veículos vivos para apresentação ou expressão de antígenos heterólogos, neste caso moléculas de MTB sendo expressas em BCG ou M. smegmatis [Sweeney, K.A, Dao, D.N., Goldberg, M.F., Hsu, T. , Venkataswamy, M.M., Henao-Tamayo, M . , Ordway, D., Sellers, R.S., Jain, P., Chen, B., Chen, M. , Kim, J., Lukose, R. , Chan, J. , Orme, I.M., Porcelli, S.A. and Jacobs, W.R Jr. (2011) A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium tuberculosis . Nat Med. 4:1261-1268; Kaufmann, S.H. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567- 577] .
Apesar dos esforços, os resultados em modelo animal quando comparados com a vacina BCG apontam para uma redução da carga bacilar nos pulmões de somente 1,0 log, ainda assim seguindo um regime de imunização baseado em "prime- boost" . Neste esquema de imunização, a primeira dose é administrada por uma das formulações mencionada acima seguida por uma segunda dose em uma outra formulação, ou seja, são necessárias duas imunizações com formulações ou apresentações diferentes para se chegar a um resultado melhor que a vacina BCG usada atualmente, que é administrada como dose única [Sweeney, K.A, Dao, D.N., Goldberg, M.F., Hsu, T., Venkataswamy, M.M., Henao-Tamayo, M. , Ordway, D., Sellers, R.S., Jain, P., Chen, B., Chen, M . , Kim, J. , Lukose, R. , Chan, J., Orme, I.M., Porcelli, S.A. and Jacobs, W.R Jr. (2011) A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium tuberculosis. Nat Med. 4:1261-1268; Kaufmann, S.H. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567- 577] .
Do BCG Recombinante
O BCG é a vacina mais utilizada no mundo pois apresenta uma resposta imune duradoura e uma frequência muito baixa de efeitos adversos sérios. Essa e outras características tornam a BCG um excelente candidato a veiculo para apresentação de antígenos heterólogos através de vacinas recombinantes baseadas em BCG (Patente US 6,673,353) . Neste sentido, a expressão de domínios imunogênicos de bactérias, vírus e parasitas tem sido utilizado com sucesso no BCG, gerando cepas recombinantes (rBCG) , as quais produzem resposta imune não só contra o bacilo da tuberculose, mas também, contra os patógenos cujas proteínas seriam expressas nesse rBCG (Patente US 5, 504, 005) .No entanto, vale salientar que nas rBCGs descritas até a data, a adição de um domínio imunogênico heterólogo confere a proteção imunológica específica esperada contra os patógenos cujas proteínas seriam expressas no referido rBCG. Reações distintas das que são de conhecimento habitual, isto é, em que o rBCG confere a proteção imunológica diferente daquela esperada, ainda não foram descritas.
Da toxina termo-lábil LT de Escherichía coli e suas propriedades imunomoduladoras
Propriedades adjuvantes têm sido atribuídas a diversas toxinas bacterianas. Por exemplo, é amplamente conhecido que as toxinas tetânica (TT) , diftérica (DT) , colérica (CT) e a toxina termo-lábil (LT) de Escherichía coli (E. coli) , atuam como adjuvantes que direcionam a resposta imunológica para Th2 quando co-administradas com outros antígenos [Ryan, E.J. et al. (2000) Modulation of innate and acquired immune responses by Escherichía coli heat-labile toxin: distinct pro- and anti-inflammatory effects of the nontoxic AB complex and the enzyme activity. J Immunol. 165:5750- 5759; Miyaji, E.N. et al. (2001) Induction of neutralizing antibodies against diphtheria toxin by priming with recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing CRM197, a mutant diphtheria toxin. Infect Immun. 69:869-874] , Em particular, a toxina LT de E. coli está entre os mais potentes adjuvantes já descritos até o momento [Lycke, N. et al. (1992) The adjuvant effect of Vibrio cholerae and Escherichia coli heat-labile enterotoxins is linked to their ADP-ribosyltransferase activity. Eur J Immunol. 22: 2277-2281; Pizza, M. et al. (2001) Mucosal vaccines: non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants. Vaccine, 19:2534-2541] .
A toxina LT de E. coli é formada por uma única molécula de subunidade A (LTA, 27kDa) , com atividade ADP ribosiltransferase , ligada a um pentâmero de subunidade B (LTB, 11,6 kDa cada) que se liga ao receptor gangliosídeo GM1 de células de mamíferos. A subunidade B de LT é uma potente molécula sinalizadora capaz de modular a resposta imunológica. O efeito imunoestimulatório de LTB parece estar relacionado com a capacidade desta de aumentar a apresentação de antígeno via o complexo de histocompatibilidade principal classe I (MHC-I) e classe II ( HC-II) , entre outros fatores . Já o efeito adjuvante de LTB tem sido relacionado diretamente à atividade de ligação a GM1 , através da ativação de células B e células T CD4+ por meio da interação dos pentâmeros de subunidade B e os receptores GM1 destas células. Além disso, LTB aumenta a apresentação de antígenos pela ativação de células dendríticas (DCs) e outras células apresentadoras de antígenos (APCs) . A ligação da LTB ao gangliosídeo GM1 permite que a subunidade A, que é tóxica, entre na célula [Spangler, B.D. (1992) Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Microbiol Rev. 56: 622-647] .
O uso da LT como adjuvante não é recomendado, em função da toxicidade da subunidade A. Já a subunidade B, por não apresentar esta toxicidade, tem sido mais frequentemente utilizada como adjuvante [de Haan, L., Verweij , W.R., Feil, I.K., Holtrop, M. , Hol, W.G., Agsteribbe, E. and Wilschut, J. (1998) Role of GM1 binding in the mucosal immunogenicity and adjuvant activity of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin and its B subunit. Immunology, 94: 424-430] .
As propriedades imunomodulatórias que levam ao aumento da imunogenicidade e eficácia protetora de LT têm sido amplamente estudadas. Embora os mecanismos que levam a esse efeito não sejam bem caracterizados, alguns aspectos como o aumento de citocinas inflamatórias e produção de quimiocinas, bem como recrutamento transiente de células imunoefetoras até o sítio de inflamação têm sido estabelecidos como fatores importantes . LT pode também influenciar a maturação de células dendríticas, apresentação de antígenos e ativação de células T e promover a indução de resposta por células T citotóxica antígeno-específico em modelo animal. O uso de LT como adjuvante leva comumente a um balanço de citocinas, envolvendo a produção de uma resposta por citocinas com características tanto Thl como Th2 e algumas classes de anticorpos em camundongos e humanos .
Esta toxina é capaz de ativar uma resposta imunológica contra outro antígeno quando apresentados simultaneamente na superfície de mucosa ou por administração oral, intra- nasal ou parenteral [Holmgren, J. , Lycke, N. and Czerkinsky, C. (1993) Cholera toxin and cholera B subunit as oral -mucosal adjuvant and antigen vector systems. Vaccine, 11: 1179-1184] .
Como uma consequência dessas propriedades, LT tem sido empregada extensivamente como adjuvante em modelos animais. No entanto, apesar da ação imunomodulatória de LT, este é altamente tóxico e inapropriado para uso clínico em humanos. Assim, para evitar a toxicidade associada com o uso da toxina nativa, porém mantendo suas propriedades adjuvantes, diferentes estratégias têm sido utilizadas, incluindo o isolamento da subunidade B (não tóxica) e a construção de mutantes de LT não-tóxicos, contendo mutações sítio-dirigidas específicas. Por meio de estudos de modelagem computacional da estrutura da proteína LT, foi possível identificar alguns aminoácidos potencialmente envolvidos na atividade enzimática desta proteína que poderiam ser estudados através da troca dos mesmos por mutação sítio-dirigida [Magagnoli, C. et ai., (1996) Infect Immun. 64: 5434-5438] . Alguns desses mutantes, tais como LTR192G (substituição de arginina para glicina na posição 192) , possuem uma mutação numa região de alça que é sensível a protease, tornando esta região insensível à ação de proteases, etapa fundamental para a ativação da atividade enzimática e consequentemente da sua toxicidade. Outros mutantes apresentam uma mutação na região enzimaticamente ativa da subunidade A, tal como LTR72 (substituição de alanina por arginina na posição 72) , a qual retém somente 1 % da atividade ADP-ribosiltransferase .
Um outro mutante importante é LTK63 (substituição de serina por lisina na posição 63) . Essa mutação elimina a atividade ADP-ribosiltransferase associada à toxicidade; eliminando a mesma, porém, mantém todas as outras propriedades biológicas, incluindo propriedades adjuvantes do LT nativo [Pizza, M. , et ai., (2001) Mucosal vaccines : non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants. Vaccine, 19:2534-2541] .
LTK63 tem mostrado atuar como um potente adjuvante quando administrado mucosaraente ou parentalmente. De Haan e colaboradores [De Haan, L., Holtrop, M . , Verweij , .R., Agsteribbe, E. and Wilschut, J. (1999) Mucosal immunogenicity and adjuvant activity of the recombinant A subunit of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Immunology, 97: 706-7013] sugerem que adjuvantes usando LTA não tóxicos em associação com o pentâmero LTB podem ser mais potentes que adjuvantes usando a subunidade B sozinha, uma vez que o complexo poderia estimular o sistema imunológico mais fortemente do que cada molécula individualmente. Dados que apontam para uma função importante da subunidade A enzimaticamente inativa na indução de uma resposta imune, bem como em atividades imunomoduladoras , tais como efeitos sobre o processamento e apresentação de antígeno, dão suporte a essa visão.
Da expressão de LT e suas variantes
LTB e LTK63 recombinantes têm sido expressas tipicamente em E. coli. No entanto, outros sistemas de expressão têm sido usados. A molécula LTB foi expressa em Mycocabterium bovis BCG, Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris , bem como plantas que incluem Oryza sativa (arroz) , Lactuca sativa (alface) e Peperomia pellucid. LTK63 tem sido expresso também em tabaco e cloroplastos , assim como Salmonella entérica serovar Typhimurium atenuada [da Hora, V.P. et ai. (2011) Non-toxic derivatives of LT as potent adjuvants. Vaccine, 29: 1538- 1544] .
No entanto, o objetivo de todos estes trabalhos, foi utilizar a molécula de LT ou uma de suas subunidades ou variantes para produzir vacinas contra E. coli. 0 uso de LT em vacinas contra tuberculose não foi descrito nem sugerido na literatura existente.
OBJETIVOS DA INVENÇÃO
Constitui um objetivo da presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.
Em particular, constitui um objetivo da presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , recombinantes que codificam a toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.
Mais especificamente, constitui um objetivo da presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium, em particular Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , que codificam a toxina termo- lábil LT ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63.
Mais especificamente, constitui um objetivo da presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium, em particular Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , que codificam a toxina termo- lábil LT ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli, mutadas na posição 63 de serina para lisina, respectivamente rBCG- LTK63 e rBCG-LTAK63.
Constitui também um objetivo da presente invenção fornecer composições imunogênicas que compreendem as cepas da presente invenção.
Um outro objetivo da invenção é prover o uso das referidas cepas e composições imunológicas na manufatura de vacinas para prevenção contra tuberculose e/ou infecções causadas por Mycobacterium tuberculosis ou por outras micobactérias .
Em particular, tem a presente invenção o objetivo de prover vacinas de BCG melhoradas contra tuberculose (i.e. que induzem melhor proteção que a cepa BCG convencional) que compreendem as cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) recombinantes da presente invenção. A presente invenção objetiva ainda métodos de prevenir ou tratar tuberculose em animais, mais particularmente humanos .
DEFINIÇÕES
No âmbito deste pedido de patente são utilizadas por diversas vezes abreviaturas cujas definições conforme empregues nèste pedido, encontram- se resumidas abaixo:
•BCG refere-se ao Mycobacterium bovis atenuado, Bacilo de Calmette-Guérin;
•LTK63 refere-se à toxina termo-lábil de Escherichia coli contendo a subunidade A modificada por mutagênese sítio-dirigida; ,
• LTAK63 refere-se à subunidade A da toxina termo,- lábil de Escherichia coli, modificada por mutagênese * ^sítio- dirigida; e
•rBCG-LTK63 ou rBCG-LTAK63 refere-se ao BCG recombinante expressando LTK63 ou LTAK63.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS i^j
As figuras a seguir fazem parte do presente relàtprio e estão aqui inclusas a fim de ilustrar determinados aspectos da invenção. O objeto da presente invenção pode ser' "melhor entendido com referência a uma ou mais dessas figuras, em combinação com a descrição detalhada da modalidade preferida aqui apresentada.
A Figura 1 mostra um gel de agarose contendo os produtos de PCR que confirmam a presença do gene LTK63 no BCG recombinante (rBCG-LTK63 ) . Os produtos de PCR foram amplificados à partir do DNA plasmidial extraído da construção rBCG-LTK63 usando oligonucleotídeos iniciadores específicos para amplificar a subunidade LTA ou a unidade LTB. 1Kb plus, peso molecular; poço 1, fragmento LTA completo (-700 pb) ; poço 2, fragmento LTB completo (-316 pb) .
A Figura 2 mostra a caracterização da expressão de LTAK63 (-31,0 kDa) em BCG recombinante . Extrato de proteínas solúveis (-10 g) de rBCG transfornado com pLNIP- LTAK63 (A) , ou BCG vazio como controle negativo (B) foram usados neste imunoensaio. Foi utilizado um soro (policlonal) feito em coelho anti-LT 1:1000).
As Figuras 3 e 4 mostram a análise comparativa da resposta de anticorpos IgGl e IgG2a induzida contra proteínas recuperadas do sobrenadante de cultivo de BCG - PDS. Camundongos BALB/c, fêmeas, com quatro semanas (18- 22g) , provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina Veterinária - USP, foram imunizados com BCG ou rBCG-LT (Figura 3) ou com BCG ou rBCG-LTAK63 (Figura 4) e os isotipos determinados em soros isolados um dia antes do desafio contra MTB ou 90 dias após imunização. Os soros de 5 animais por grupo foram analisados individualmente por ELISA, usando anticorpos específicos anti IgGl e IgG2a de camundongo .
As Figuras 5 e 6 mostram a produção de IFN-γ por esplenócitos cultivados na presença de PDS. Camundongos BALB/c fêmeas foram imunizados com 1 x IO6 UFC de BCG ou rBGC-LT (Figura 5) ou BCG ou rBCG-LTAK63 (Figura 6) e após quatro semanas ou oito semanas, respectivamente, os baços foram recuperados e preparações de células únicas foram cultivadas in vitro (2 x IO6 células/poço) na presença de 2,0 μg/mL de PDS. Os sobrenadantes das culturas foram recuperados após 48 h e os níveis de IFN-γ determinados por ELISA.
As Figuras 7 e 8 mostram a produção de TNF-α por esplenócitos cultivados na presença de PDS. Camundongos BALB/c fêmeas foram imunizados com 1 x IO6 UFC de BCG ou rBGC-LT (Figura 7) ou BCG ou rBCG-LTAK63 (Figura 8) . Após 4 semanas (Figura 7) ou oito semanas (Figura 8) os baços foram recuperados e preparações de células únicas foram cultivadas in vitro (2 x IO6 células/poço) na presença de 2,0 μg/mL de PDS. Os sobrenadantes das culturas foram recuperados após 24 h (Figura 7) ou 48 h (Figura 8) e os níveis de TNF-α determinados por ELISPOT (Figura 7) ou ELISA (Figura 8, respectivamente) . SFU = unidades formadoras de pontos.
As Figuras 9 e 10 mostram o perfil de células T CD4* produtoras das citocinas INF-γ e TNF-a, respectivamente. Camundongos BALB/c fêmeas (n = 5 por grupo) foram imunizados s.c. uma única vez com lxlO6 UFC/animal com BCG ou rBCG-LTK63. Um grupo não imunizado foi utilizado como controle negativo. Oito semanas após a imunização os baços foram recuperados e preparações de células únicas foram cultivadas in vitro (2 x IO6 células/poço) na presença de 2,0 pg/mL de PDS. O perfil de células T CD4+ produtoras das diversas citocinas foram analisadas por Citometria de Fluxo (FACs) usando anticorpos anti-CD4, anti-INF-γ e anti-TNF-a específicos e marcados com o fluorocromo apropriado.
A Figura 11 mostra o resultado dos ensaios de proteção contra um desafio intra- traqueal com a cepa de M. tuberculosis H37Rv. Camundongos BALB/c fêmeas (n = 10 por grupo) A e B foram imunizados s.c. uma única vez com M. bovis BCG ou com rBCG-LT . Um grupo não imunizado foi usado como controle negativo. Oito semanas após a imunização os animais foram desafiados pela via intra-traqueal com lxlO5 UFC de M. tuberculosis H37Rv. Barras de erro representam o desvio padrão da média. A e B representam dois ensaios realizados em tempos diferentes nas mesmas condições. C, representa um ensaio realizado com camundongos C57BL/6 fêmeas (n = 10 por grupo) imunizados s.c. uma única vez com M. bovis BCG ou rBCG-LTA. Oito semanas após a imunização os animais foram desafiados pela via intra-traqueal com lxlO5 UFC de M. tuberculosis H37Rv. Barras de erro representam o desvio padrão da média.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Descrição das cepas
A presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.
A presente invenção refere-se também a cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.
Em particular a presente invenção refere-se a cepas de
Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63.
Mais particularmente a presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63 de serina para lisina, respectivamente rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63.
As referidas mutações permitem que a toxina termo-lábil LT de Escherichia coli ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli codificadas pelo Mycobacterium mantenham as propriedades adjuvantes do LT nativo, porém percam a atividade ADP-ribosiltransferase associada à toxicidade, evitando assim problemas de toxicidade no caso em humanos ou outros animais.
Cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo- lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli que apresentam outras mutações em sua sequência que objetivem um efeito equivalente, i.e. manutenção das propriedades adjuvantes do LT nativo e dimunuição ou supressão da toxicidade, estão também contempladas na presente invenção. Tais mutações podem incluir, mas não estão limitadas às posições 72 e 192.
As cepas da presente invenção são obtidas a partir de qualquer cepa do género Mycobacterium como carreador para apresentação de um ou mais antígenos de organismos distintos, obtidos e clonados em vetor de expressão em micobactéria e inseridos por meio de manipulação genética.
Preferencialmente as cepas de Mycobacterium recombinantes da presente invenção compreendem cepas do complexo de MTB, Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium bovis, Mycobacterium microft. e Mycobacterium africanum ou de micobactérias de crescimento rápido, Mycobacterium smegmatis, M. aurum, M. vaccae, etc.
Mais preferencialmente as cepas de Mycobacterium recombinantes da presente invenção compreendem cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) .
Descrição das composições imunogenicas
A presente invenção refere-se a composições imunogênicas que compreendem uma ou mais cepas da presente invenção e um ou mais dentre um veículo, excipiente, diluente ou solvente fisiologicamente aceitáveis.
Preferencialmente as composições da presente invenção compreendem cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , que codificam a toxina termo- lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina, i.e., rBCG-LTK63.
Alternativamente, as composições da presente invenção compreendem preferencialmente cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , que codificam a subunidade A da toxina termo- lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina, i.e., rBCG-LTAK63. As composições da presente invenção podem ainda compreender uma mistura de cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , que codificam a toxina termo-lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina, i.e., rBCG-LTK63 e a subunidade A da toxina termo-lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina, i.e., rBCG- LTAK63.
As composições imunogênicas da presente invenção, podem ainda compreender adicionalmente um ou mais antígenos, preferencialmente toxinas inativadas. Tais antígenos podem ser para uso na prevenção e/ou tratamento de tuberculose ou de outras doenças causadas por patógenos distintos. Os componentes inativados das composições imunogênicas sinérgicas da presente invenção podem ser obtidos por qualquer método conhecido na técnica, tais como procedimentos químicos, como o tratamento com formaldeído ou água oxigenada, ou mesmo técnicas de recombinação de DNA .
De acordo com a presente invenção, adjuvantes são moléculas, componentes, macromoléculas ou microorganismos atenuados ou mortos que potencializam a resposta às imunizações, reduzem a quantidade de antígeno necessária e direcionam o tipo de resposta imune a ser desenvolvida, além de sustentá-la por um período de tempo maior, como um imunógeno; é qualquer material ou substância que altera o tipo, a velocidade, a intensidade ou a duração da resposta imune .
As composições da presente invenção podem compreender ainda excipientes, como bactericidas, bacteriostáticos, antioxidantes, conservantes, tampões, estabilizantes , ajustadores de pH, ajustadores de osmolaridade, agentes antiespuma e tensoativos ; e resíduos de agentes de inativação ou fracionamento de antígenos, componentes de meios de crescimento e solventes comumente utilizados na produção de vacinas; exemplos destes tipos de componentes podem ser encontrados no Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases The Pink Book, 11a edição, seção "Vaccine Excipient & Media Summary" (Centers for Disease Control and Prevention. Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases. Atkinson , Wolfe S, Hamborsky J, Mclntyre L, eds . 11th ed. Washington DC: Public Health Foundation, 2009) incorporado aqui como referência.
Conforme usado na presente invenção, o emprego do termo " farmaceuticamente aceitável" significa um sólido não- tóxico, inerte, excipiente líquido semi-sólido, diluente, formulação auxiliar de qualquer tipo, ou simplesmente um meio aquoso estéril, tal como solução salina. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, os amidos, tais como amido de milho e o amido de batata, a celulose e os seus derivados, tais como a carboximetilcelulose de sódio, a etilcelulose e o acetato de celulose, ciclodextrina; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girasol, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de semente de soja; glicóis, tais como propilenoglicol , polióleos, tais como glicerinaglicol , sorbitol, manitol e de polietileno; ésteres, tais como o laurato etílico, oleato etílico, ágar agentes tamponantes, tais como o hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio; ácido algínico,- água livre de pirogênio; salina isotônica, solução de Ringer; soluções tampões de álcool etílico e fosfato, assim como outras substâncias não tóxicas compatíveis usadas em formulações farmacêuticas .
Uma variedade de vias de administração das composições imunoterápicas e vacinas descritas na presente invenção está disponível. O modo particular selecionado dependerá do princípio ativo em particular selecionado, a dosagem necessária para eficácia terapêutica e do paciente ao qual será administrada a composição. Os métodos da presente invenção, geralmente, podem ser praticados usando qualquer modo de administração biologicamente aceitável, i.e., qualquer modalidade que produzir níveis eficazes de resposta imune sem causar efeitos adversos clinicamente indesejáveis. Tais modos de administração incluem as vias intradérmica, oral, retal, sublingual, tópica, nasal, transdermal ou parenteral . O termo "parenteral" inclui subcutânea, intravenosa, epidural, irrigação, intramuscular, bombas de liberação, ou de infusão. Particularmente, nesta invenção as vias intradérmica, oral, parenteral e nasal são preferidas para administração das composições aqui reivindicadas.
Para a administração parenteral, os princípios ativos podem igualmente ser dissolvidos em um veículo farmacêutico e administrados como uma solução, emulsão, incluindo micro e nanoemulsões , ou suspensão. Exemplos de veículos apropriados são água, salina, soluções de dextrose, soluções de frutose ou óleos de origem animal, vegetal ou sintéticos .
Para a administração nasal, os princípios ativos podem ser dissolvidos em um veículo farmacêutico e administrados como uma solução, emulsão, incluindo micro e nanoemulsões, ou suspensão. Exemplos de veículos apropriados são água e solução salina ou suspensões sólidas, como spray, lactose, frutose ou flocos de quitosana. Outros veículos podem também conter outros ingredientes, por exemplo, preservativos, agentes suspensores, agentes solubilizantes , tampões e similares. Preferencialmente as composições imunogênicas da presente invenção são para administração intradérmica, oral e parenteral .
Propriedades das cepas e das composições imunogênicas da presente invenção
As cepas e as composições imunogênicas da presente invenção apresentam um efeito sinérgico inesperado sobre a resposta imunológica contra Mycobacterium . Os antígenos recombinantes do LTK63 ou LTAK63 apresentam o efeito técnico inesperado de induzir um efeito adjuvante contra as proteínas do próprio Mycobacterium .
Conforme poderá ser visto nos Exemplos abaixo, as cepas e as composições imunogênicas da presente invenção apresentam o efeito técnico inesperado de provocar uma resposta imunológica anti-TB mais intensa quando comparadas a vacinas compreendendo BCG tradicional. Ou seja, a adição de um domínio imunogênico, como por exemplo a subunidade não-tóxica LTAK63 da toxina termo- lábil de E. coli, que sabidamente não tem nenhuma ligação com nenhum tipo de micobactéria, em uma micobactéria recombinante, em partiular BCG, provoca um aumento da resposta protetora contra tuberculose.
Em particular as cepas e as composições imunogênicas da presente invenção promovem uma diminuição da carga bacilar no pulmão em modelos animais de tuberculose.
Além disso, as cepas e as composições imunogênicas da presente invenção levam a um aumento significativo da expressão de IFN-γ em relação ao grupo controle, uma citocina considerada essencial na resposta contra tuberculose; este fato sinaliza para uma resposta polarizada do tipo Thl .
As cepas e as composições imunogênicas da presente invenção levam também a um aumento significativo de TNF-a. Uma vez que o TNF-α é relacionado como sinalizador da ação pro- inflamatória, caracterizando a fase aguda do processo inflamatório desencadeado pelos bacilos, então as vacinas da presente invenção promovem a ativação direta do sistema imune .
Finalmente podemos concluir que as cepas e as composições imunogênicas da presente invenção, ao combinar micobactérias , em particular BCG, e toxinas de outros patôgenos, preferencialmente de Escherichia coli, gerando uma cepa de micobactéria recombinante, constituem uma nova vacina, mais potente e eficaz que o BCG convencional para a profilaxia ou imunização para tuberculose.
Uso das cepas e das composições imunogênicas da presente invenção.
Considerando as propriedades das cepas de Mycobacterium recombinantes e das composições imunogênicas da presente invenção, constitui outro aspecto da presente invenção o uso das composições imunogênicas para a prevenção de infecções causadas por micobactérias, em partcular Mycobacterium tuberculosis em animais, mais particularmente humanos .
Constitui um outro aspecto da presente invenção o uso de uma ou mais cepas de Mycobacterium recombinantes ou de uma ou mais composições imunogênicas da presente invenção na manufatura de uma vacina.
Mais particularmente, constitui um aspecto da presente invenção o uso de uma ou mais cepas de Mycobacterium recombinantes ou de uma ou mais composições imunogênicas da presente invenção na manufatura de uma vacina para prevenção e/ou tratamento de tuberculose e/ou infecções causadas por micobactérias.
Constitui ainda um outro aspecto da presente invenção métodos de prevenir ou tratar tuberculose em animais, mais particularmente humanos.
EXEMPLOS
Para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos, são apresentados abaixo, como exemplos, os resultados dos diferentes ensaios efetuados com relação a esta invenção.
No Exemplo 1 é descrita a obtenção das vacinas da presente invenção. Nos demais Exemplos (2 a 3) são ilustradas as propriedades e o uso da vacina da presente invenção. Estes Exemplos são apresentados a titulo meramente ilustrativo e não devem ser de forma alguma considerados como limitativos do âmbito e do alcance da presente invenção.
EXEMPLO 1 : Obtenção das vacinas rBCG-LTK63 e rBCG- LTAK63
Este exemplo descreve a obtenção das vacinas rBCG-LTK63 e rBGC-LTAK63.
a) Preparação de lote estoque de BCG competente: para preparação de estoques de BCG competente, uma ou mais colónias de BCG foi cultivada em meio líquido Middlebrook 7H9 mais Tween-80 e suplementado com albumina-dextrose- catalase 10% (MB7H9/Tw/ADC) até a fase exponencial. Composição do meio Middlebrook 7H9 de acordo com o fabricante (Difco-BD) : Sulfato de Amónio, Ácido L- Glutâmico, Citrato de Sódio, Piridoxina, Biotina, Di- Fosfato de Sódio, Mono- fosfato de Potássio, Citrato de Amónio Férrico, Sulfato de Magnésio, Cloreto de Cálcio, Sulfato de Zinco e Sulfato de Cobre. Em seguida, a cultura foi sedimentada por centrifugação a 4000 rpm e lavada duas vezes com glicerol 10% a 4°C, sendo finalmente re- suspendida em 5% do volume original com glicerol 10% e armazenada à -70°C até ser transformada por eletroporação com o plasmídeo pNL12-LTK63 ou com o plasmídeo pNL12- LTAK63.
b) Construção do vetor de expressão do gene LTK63 em BCG recombinante aqui denominado de pNL12-LTK63; o vetor de expressão de micobactéria usado para expressão de LTK63 em BCG recombinante é denominado pMIP12 e foi descrito por Le Dantec [Le Dantec et al. 2001 J Bacteriol . 183: 2157-2164] , O gene LTK63 foi gentilmente cedido pelo Dr. Rino Rappuoli (Novartis) . O vetor de expressão em BCG recombinante do gene LTK63 foi construído usando métodos convencionais de biologia molecular. O gene LTK63 foi amplificado por PCR usando os seguintes oligonucleotídeos iniciadores: N- terminal ( 5 ' - TAGGGTACCCAAAAATATAACTTCATTTTTTTTATTTT- 3 " ) , contendo o sítio de restrição Kpn I (sublinhado) e C- terminal ( 5 ' - TAGCTGCAGCTAGTTTTTCATACTGATTGCCC-3 ' ) , contendo o sítio de restrição Pst I (sublinhado) . O produto de PCR correspondente ao gene LTK63 foi gerado usando as seguintes condições de PCR: 94°C por 4 minutos; 25 ciclos de 94°C por 1 min, 50°C por 1 min e 72°C por 30 s ; e 4°C final. Esse produto de PCR foi então digerido com as enzimas de restrição Kpn I e Pst I e então clonado no vetor de expressão pMIP12, que foi também previamente digerido com as mesmas enzimas Kpn I e Pst I, gerando assim o vetor de expressão denominado de pMIP12/LTK63.
Sequência gênica do plasmídeo pNP12-LTK63
GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGC TGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAG TTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGT GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAA TTCGAGCTCGACTTAATTAACTCCGGGTGGTCACTGAGTACATCCCGTCGGTGCGTTCG GCATCGGTCGGGGTGTGGGTGGGTGTCGGCTCCCGCGACGAAGGACGAAGCGTCGCGGG TGCCGCCCACTTCTTGGAGCATCTGCTGTTCAAGGCCACCCCGACGCGCACGCGGTCGA CATCGCGCAGGCTGTCGATGCCGTCGGCGGTGAGCTGAACGCGTTCACCACGCGCGAGC ACACCTGTTACTACGCGCATGTGCTCGACTCCGACCTGGAGCTCGCGGTCGACCTGGTG CGCCGATGTCGTGTTGCGTGGGCGTTGTGCCACCGAGGATGTCGAAGTGGAGCGCGACG TCGTCCTCGAGGAGATCGCCATGCGTGACGACGATCCCGAGGACAGCCTCGGCGACGTG TTCCTCTCGGCGATGTTCGGCGATCACCCGGTGGGACGTCCGGTGATCGGCAGCGTCGA GTCGATCGAGACCATGACGCGTGCACAGCTGCATTCGTTCCACGTCCGGCGTTACACAC CCGAACGGATGATCGTGGCGGTGGCCGGCAACGTCGACCACGACGTGTGGTGTCGTTGG TCCGAGAGCATTTCGGCCCCCGGCTGGAGGCCGACGTTCCGCGGTGGCTCCCCGTAAGG CTCGGGACGGGTCGGTGGTAAGCCATCGCTGCTCGTGGTCGACCGCGACGGGGAACAGT CCCATGTCTCGCTGGGCGTTCGCACGCCCGGCCGGCACTGGGAGCACCGGTGGGCCCTG TCGGTGTTGAACACCGCGCTGGGAGGCGGGCTCAGTTCTCGTCTGTTCCAACAGATTCG CGAGTCCCGCGGCCTGGCCTACCTCGGTGTACTCGACCGTGGACCACTTCGCGACAGCG GGGCTCTGTCGGTGTATGCGGGATGTCAGCCGGAACGTTTCGACGAAGTGGTGCGGGTG ACCACCGAAGTTTTGGAAGGTGTTGCCAGAGACGGGATCACCGCCGACGAATGCCGGAT CGCCAAAGGCTCGTTGCGCGGTGGGCTGGTGCTCGGCCTGGAGGATTCCGGATCACGTA TGCACCGGATCGGCCGTAGCGAGCTCAATTACGGTGgAGCACCGGACCATCGACCACAC GCTGGCCCAGATCGAGGCAGTCACTCTAGAAGAGGTCAACGCCGTCGCTCACCAGTTGC TGTCGCGGGACTACGGTGCCGCCGTACTCGGTCCCTATAGTTCGAAAAAGGCGCTGCCA CAACAGCTTCAAACTATCGCCGGCTGACCCGCTACACTGGGTCCAATGGATTAGAAGGA GAAGTACCGATGGGATCCGGTACCAATGGCGACAGATTATACCGTGCTGACTCTAGACC CCCAGATGAAATAAAACGTTCCGGAGGTCTTATGCCCAGAGGGCATAATGAGTACTTCG ATAGAGGAACTCAAATGAATATTAATCTTTATGATCACGCGAGAGGAACACAAACCGGC TTTGTCAGATATGATGACGGATATGTTTCCACTAAGCTTAGTTTGAGAAGTGCTCACTT AGCAGGACAGTCTATATTATCAGGATATTCCACTTACTATATATATGTTATAGCGACAG CACCAAATATGTTTAATGTTAATGATGTATTAGGCGTATACAGCCCTCACCCATATGAA
CAGGAGGTTTCTGCGTTAGGTGGAATACCATATTCTCAGATATATGGATGGTATCGTGT TAATTTTGGTGTGATTGATGAACGATTACATCGTAACAGGGAATATAGAGACCGGTATT ACAGAAATCTGAATATAGCTCCGGCAGAGGATGGTTACAGATTAGCAGGTTTCCCACCG GATCACCAAGCTTGGAGAGAAGAACCCTGGATTCATCATGCACCACAAGGTTGTGGAAA TTCATCAAGAACAATCACAGGTGATACTTGTAATGAGGAGACCCAGAATCTGAGCACAA
TATATCTCAGGGAATATCAATCAAAAGTTAAGAGGCAGATATTTTCAGACTATCAGTCA GAGGTTGACATATATAACAGAATTCGGGATGAATTATGAGGATTAGGAGAAGTACCGGA ATTCATGAATAAAGTAAAATGTTATGTTTTATTTACGGCGTTACTATCCTCTCTATGTG CATACGGAGCTCCCCAGTCTATTACAGAACTATGTTCGGAATATCGCAACACACAAATA TATACGATAAATGACAAGATACTATCATATACGGAATCGATGGCAGGCAAAAGAGAAAT GGTTATCATTACATTTAAGAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAAC ATATAGACTCCCAAAAAAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATAT CTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAAT TGCGGCAATCAGTATGGAAAACTAGCTGCAGCATCACCATCACCATCACTAGTGAAATA GCGAAACACGGGATCGGGCGAGTTCGACCTTCCGTCGGTCTCGCCCTATTAATAGTGGC ATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTT ACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGA GGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGA TGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGCAGGGGGGGG GGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGAACGAGGAC AGTCGCACGACGAAGTTCTTCTGGATCGCGCCCGTGCTGGAAGCACTCAACCTCGAAGC GTGTGGTTGCGGAGCCATCTAGCAACCACACGAAACATGCGCAACGAACCGCGCAACGA ACAACGCCTAGAACTGGCCCTAGATGAGCTGACTCGTATCGTTGGTAAACCTAGTTTGA CCAGCATGTTTTAACTACGTTCGGTGAGCTGTCAACGGGGCCTGTAACGGCACAACGAA CCGTGCAACGAGAGTGGCCACGGATGCCACCACAGGCACTACAACGGAGTTCGCCACGT ACATCACCACAACCACCGATTCTGGCGGTGAGCTCCCCGATATTCAGCGGAAATGGCTT GGTATCGACCAAGATTCGTAGAACCCCGTCTCGTCTGGCTGGTATTCAAAACGGGCGCA ACGAAACACGCAACGAGACAGGCATGGCCCAAACCAGAAAACTAGCGTCTACCAGGACT TTTACCTGTCCGACCCGTTGCAACGGAACCCCCCACGGAACCCCCGCGACACCCGCTCC CCAATTGCGTTAGAACAGCGGTGGATTGTCGGCTTCGTTGTGGGCCTTTTGAGCCGCTT CCTGTTCTGCCGCACGCTCTTTCCTCGCCCGATAGCCGAGTCGCTTAACGGTGTCCAGA TGCAGCCCGAAATGTTTGGCCGTTTGCGGCCAAGAGTGGCCCTCGTCGTCGTGATAGGC GCGGATGCGTTCGCGGCGTGCAGCCTGCTCGGCGAGCCACTCGCTGCGTTCCTGCGCCA
CGAGCCGGACGACGTGGCGTTCGGATAGTCCGGTGATTCGAGCGCCTTCGGCGGCGGTC ACGCGCCGCTTTTTGCGGACAGTCGGCTGCCGGTTGTAGCCGTCGCTGTAGCCGTCGCT CATAGCAATGCCTCCATGGCTGACGCGGACTTTGCGCGCCGCGCAACTGTGCTCGCCGC CGTGCGCGCTGCTGCGCCCTTCCGCGAGATGGCCGACTGGCGCGCACTGAGTGTGGCCT CGTAGACCACGATCCCGTCCGCCCAAATGCGCGACTTGGTTGTGATCCAACGCCAAATG
CTGTTGGCGATGGCGCGGACCTCGCTGTCCGGTAGCGGTCCGGGACACACGTCGTTGCA CGGGAATTCGGCGTTTCGCGCGTGGCACTCGGCATAGATCGCGCGGCCGAGTCCGTCCA CGTTCCGGGTCGGCAGGTAGATCCGCATGAGGGCGGGACGATAGGCCCACAACCTGACG GAATCGAACAGTGCGCAATTCCGCCCTAGCGGCGTCGGAGCCGCTTTGTACGTGGTCTG CTGACGCCAGCGCGGCGGTGGCATGTTCGCGCCGAGCTCGGCCTCGATGTGGCTGAGTG TGTAGAGATCTGAGTGGAGCCATTCCGTTTCCCAGGCGATGTGGCCGGGGTTTTTGGTC ATGAGGCCTGAGTAACTGCGGTCGCCGTCGACGGCGCGCCGAAGGCCTTCGGCGCACGC CGCCATGTATGCGAGCGGCTTACGCCGCGCGTATTCGGTGCGTGGAACAGGGGCGTTGA GTGCCCACACTGCGTGTGCGTGGCCGTTGGCGCGATTGCCCACGATCGCGTTGGGCAGC GGATGGGACCCCCGGGCGCTGAGCGCTCGGAGCGCTGCGTCTGGATGGTCTACGTCCAC GACCAGCAGGTTTGCCAGCGCTGTTGGGTTCGCCTCGATGTACCGGCGGCCTAGGGCCG ACGCGCGGCTTTGGCGGTAGATCCCCTCGAGCAGATCGTCGCTTGCCAGCGGCCAGTAC GGCAGCCAGAGCTGCTCAAATTCGTCGGCGACGTGGCTCACGCTTGGTAGTAGACCACG ATTAATCACCGGTGTATGGTCCGACACGAGCTCCAAGTCAGATATTTCGCTGAGGGGCC ACCCCACAACTGCACACTCCCCCGCTCTCCCGTCGAGCCCTGGTGGTGGAACACCAGCG ACAGCCGAGCACCCCCAACCACCTGTACCAACCAGGAGGAACACATGCGTCGTTTCGAG GACGTTTCCGGGCCGCTGAGAGCCGCTGTGGCGGCCGTACACGCCGCCTTAGACCCGTT AGACCCCCTGCCGCCTGAATGCGCGGGTACGAGCCACACAGCGCCCGAACTTACGGAGC TGGTGGGCTCACCTGGCTTTATGGCGTACGAATCGGCTGTGTGCGACCTGTTGGGCGAG GTGAGGTACGCGCTACTCACGCTGGCAAGGGCGACACAGCCGCCCCACCGAGCCCGCAC GGCCGCGCGCGGTGTCAACAACCGGGTGAGTCGTGCACACCAGCAGGTGTTCGAGGCTT GGCTCGAAGTGCAGGACATCGTGGCGAACGCCGCCCGATGAGCCGCGCCTTACGCTGGC TGCCAGCCGTTCGCGGGCTGGTTGGTGCAGCGCGTCGAGCGGTTAGAGGCCCTGCGGTG TTCCACCACCGCAGGGCCTCGCCCTTTTTAAGGCTGAATTTGCTTGTCTCCGAATCCAA CTGGCTTGTCCAAGGGTGTATCTACGCTTAATCCAAAGTTCAAACGAGGGGATTACACA TGACCAACTTCGATAACGTTCTCGGCTCGATCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAA AGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGA ACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTC
AACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATG CTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAA ATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTT TCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAA
AATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCA AAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCA AAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAA TACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGA ACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGG AATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGAT AAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCT CATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCA TCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGC CCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAG ACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGAC AGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTG AGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAA GCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA ATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAA GTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTA GGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCC ACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTG CGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCC GGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATAC CAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCA CCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAA GTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGG GCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTG AGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGA CAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGG GAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGA TTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTT
TTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCC CTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGC CGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA
c) Construção do vetor de expressão do gene LTAK63 em BCG recombinante aqui denominado de pLN12-LTAK63 : o vetor de expressão em BCG recombinante do gene LTAK63 foi construído usando métodos convencionais de biologia molecular. O gene LTAK63 foi amplificado por PCR a partir do gene LTK63 usando os seguintes oligonucleotídeos iniciadores: N- terminal (5'-
TAGGGATCCAATGGCGACAGATTATACCGTTG-3') , contendo o sítio de restrição BamH I (sublinhado) e C- terminal (5'- TAGGGTACCTAATTCATCCCGAATTCTGTTATA-3') , contendo o sítio de restrição Kpn I (sublinhado) . O produto de PCR correspondente ao gene LTAK63 foi gerado usando as seguintes condições de PCR: 94°C por 4 minutos; 25 ciclos de 94°C por 1 min, 50°C por 1 min e 72°C por 30 s; e 4°C final. Esse produto de PCR foi então digerido com as enzimas de restrição BamH I e Kpn I e então clonado no vetor de expressão pMIP12, que foi também previamente digerido com as mesmas enzimas BamH I e Kpn I, gerando assim o vetor de expressão denominado de pLNIP-LTAK63.
Sequência gênica do plasmideo pNLl2-LTAK63
GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGC TGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAG TTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGT GTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAA TTCGAGCTCGACTTAATTAACTCCGGGTGGTCACTGAGTACATCCCGTCGGTGCGTTCG GCATCGGTCGGGGTGTGGGTGGGTGTCGGCTCCCGCGACGAAGGACGAAGCGTCGCGGG TGCCGCCCACTTCTTGGAGCATCTGCTGTTCAAGGCCACCCCGACGCGCACGCGGTCGA CATCGCGCAGGCTGTCGATGCCGTCGGCGGTGAGCTGAACGCGTTCACCACGCGCGAGC ACACCTGTTACTACGCGCATGTGCTCGACTCCGACCTGGAGCTCGCGGTCGACCTGGTG CGCCGATGTCGTGTTGCGTGGGCGTTGTGCCACCGAGGATGTCGAAGTGGAGCGCGACG
TCGTCCTCGAGGAGATCGCCATGCGTGACGACGATCCCGAGGACAGCCTCGGCGACGTG TTCCTCTCGGCGATGTTCGGCGATCACCCGGTGGGACGTCCGGTGATCGGCAGCGTCGA GTCGATCGAGACCATGACGCGTGCACAGCTGCATTCGTTCCACGTCCGGCGTTACACAC CCGAACGGATGATCGTGGCGGTGGCCGGCAACGTCGACCACGACGTGTGGTGTCGTTGG TCCGAGAGCATTTCGGCCCCCGGCTGGAGGCCGACGTTCCGCGGTGGCTCCCCGTAAGG
CTCGGGACGGGTCGGTGGTAAGCCATCGCTGCTCGTGGTCGACCGCGACGGGGAACAGT CCCATGTCTCGCTGGGCGTTCGCACGCCCGGCCGGCACTGGGAGCACCGGTGGGCCCTG TCGGTGTTGAACACCGCGCTGGGAGGCGGGCTCAGTTCTCGTCTGTTCCAACAGATTCG CGAGTCCCGCGGCCTGGCCTACCTCGGTGTACTCGACCGTGGACCACTTCGCGACAGCG GGGCTCTGTCGGTGTATGCGGGATGTCAGCCGGAACGTTTCGACGAAGTGGTGCGGGTG ACCACCGAAGTTTTGGAAGGTGTTGCCAGAGACGGGATCACCGCCGACGAATGCCGGAT CGCCAAAGGCTCGTTGCGCGGTGGGCTGGTGCTCGGCCTGGAGGATTCCGGATCACGTA TGCACCGGATCGGCCGTAGCGAGCTCAATTACGGTGgAGCACCGGACCATCGACCACAC GCTGGCCCAGATCGAGGCAGTCACTCTAGAAGAGGTCAACGCCGTCGCTCACCAGTTGC TGTCGCGGGACTACGGTGCCGCCGTACTCGGTCCCTATAGTTCGAAAAAGGCGCTGCCA CAACAGCTTCAAACTATCGCCGGCTGACCCGCTACACTGGGTCCAATGGATTAGAAGGA GAAGTACCGATGGGATCCGGTACCAATGGCGACAGATTATACCGTGCTGACTCTAGACC CCCAGATGAAATAAAACGTTCCGGAGGTCTTATGCCCAGAGGGCATAATGAGTACTTCG ATAGAGGAACTCAAATGAATATTAATCTTTATGATCACGCGAGAGGAACACAAACCGGC TTTGTCAGATATGATGACGGATATGTTTCCACTAAGCTTAGTTTGAGAAGTGCTCACTT AGCAGGACAGTCTATATTATCAGGATATTCCACTTACTATATATATGTTATAGCGACAG CACCAAATATGTTTAATGTTAATGATGTATTAGGCGTATACAGCCCTCACCCATATGAA CAGGAGGTTTCTGCGTTAGGTGGAATACCATATTCTCAGATATATGGATGGTATCGTGT TAATTTTGGTGTGATTGATGAACGATTACATCGTAACAGGGAATATAGAGACCGGTATT ACAGAAATCTGAATATAGCTCCGGCAGAGGATGGTTACAGATTAGCAGGTTTCCCACCG GATCACCAAGCTTGGAGAGAAGAACCCTGGATTCATCATGCACCACAAGGTTGTGGAAA TTCATCAAGAACAATCACAGGTGATACTTGTAATGAGGAGACCCAGAATCTGAGCACAA TATATCTCAGGGAATATCAATCAAAAGTTAAGAGGCAGATATTTTCAGACTATCAGTCA GAGGTTGACATATATAACAGAATTCGGGATGAATTATGACTGCAGCATCACCATCACCA TCACTAGTGAAATAGCGAAACACGGGATCGGGCGAGTTCGACCTTCCGTCGGTCTCGCC CTATTAATAGTGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGG AAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGG CGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGG
CGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCA TATGCAGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATA CCAGGAACGAGGACAGTCGCACGACGAAGTTCTTCTGGATCGCGCCCGTGCTGGAAGCA CTCAACCTCGAAGCGTGTGGTTGCGGAGCCATCTAGCAACCACACGAAACATGCGCAAC GAACCGCGCAACGAACAACGCCTAGAACTGGCCCTAGATGAGCTGACTCGTATCGTTGG
TAAACCTAGTTTGACCAGCATGTTTTAACTACGTTCGGTGAGCTGTCAACGGGGCCTGT AACGGCACAACGAACCGTGCAACGAGAGTGGCCACGGATGCCACCACAGGCACTACAAC GGAGTTCGCCACGTACATCACCACAACCACCGATTCTGGCGGTGAGCTCCCCGATATTC AGCGGAAATGGCTTGGTATCGACCAAGATTCGTAGAACCCCGTCTCGTCTGGCTGGTAT TCAAAACGGGCGCAACGAAACACGCAACGAGACAGGCATGGCCCAAACCAGAAAACTAG CGTCTACCAGGACTTTTACCTGTCCGACCCGTTGCAACGGAACCCCCCACGGAACCCCC GCGACACCCGCTCCCCAATTGCGTTAGAACAGCGGTGGATTGTCGGCTTCGTTGTGGGC CTTTTGAGCCGCTTCCTGTTCTGCCGCACGCTCTTTCCTCGCCCGATAGCCGAGTCGCT TAACGGTGTCCAGATGCAGCCCGAAATGTTTGGCCGTTTGCGGCCAAGAGTGGCCCTCG TCGTCGTGATAGGCGCGGATGCGTTCGCGGCGTGCAGCCTGCTCGGCGAGCCACTCGCT GCGTTCCTGCGCCACGAGCCGGACGACGTGGCGTTCGGATAGTCCGGTGATTCGAGCGC CTTCGGCGGCGGTCACGCGCCGCTTTTTGCGGACAGTCGGCTGCCGGTTGTAGCCGTCG CTGTAGCCGTCGCTCATAGCAATGCCTCCATGGCTGACGCGGACTTTGCGCGCCGCGCA ACTGTGCTCGCCGCCGTGCGCGCTGCTGCGCCCTTCCGCGAGATGGCCGACTGGCGCGC ACTGAGTGTGGCCTCGTAGACCACGATCCCGTCCGCCCAAATGCGCGACTTGGTTGTGA TCCAACGCCAAATGCTGTTGGCGATGGCGCGGACCTCGCTGTCCGGTAGCGGTCCGGGA CACACGTCGTTGCACGGGAATTCGGCGTTTCGCGCGTGGCACTCGGCATAGATCGCGCG GCCGAGTCCGTCCACGTTCCGGGTCGGCAGGTAGATCCGCATGAGGGCGGGACGATAGG CCCACAACCTGACGGAATCGAACAGTGCGCAATTCCGCCCTAGCGGCGTCGGAGCCGCT TTGTACGTGGTCTGCTGACGCCAGCGCGGCGGTGGCATGTTCGCGCCGAGCTCGGCCTC GATGTGGCTGAGTGTGTAGAGATCTGAGTGGAGCCATTCCGTTTCCCAGGCGATGTGGC CGGGGTTTTTGGTCATGAGGCCTGAGTAACTGCGGTCGCCGTCGACGGCGCGCGGAAGG CCTTCGGCGCACGCCGCCATGTATGCGAGCGGCTTACGCCGCGCGTATTCGGTGCGTGG AACAGGGGCGTTGAGTGCCCACACTGCGTGTGCGTGGCCGTTGGCGCGATTGCCCACGA TCGCGTTGGGCAGCGGATGGGACCCCCGGGCGCTGAGCGCTCGGAGCGCTGCGTCTGGA TGGTCTACGTCCACGACCAGCAGGTTTGCCAGCGCTGTTGGGTTCGCCTCGATGTACCG GCGGCCTAGGGCCGACGCGCGGCTTTGGCGGTAGATCCCCTCGAGCAGATCGTCGCTTG CCAGCGGCCAGTACGGCAGCCAGAGCTGCTCAAATTCGTCGGCGACGTGGCTCACGCTT
GGTAGTAGACCACGATTAATCACCGGTGTATGGTCCGACACGAGCTCCAAGTCAGATAT TTCGCTGAGGGGCCACCCCACAACTGCACACTCCCCCGCTCTCCCGTCGAGCCCTGGTG GTGGAACACCAGCGACAGCCGAGCACCCCCAACCACCTGTACCAACCAGGAGGAACACA TGCGTCGTTTCGAGGACGTTTCCGGGCCGCTGAGAGCCGCTGTGGCGGCCGTACACGCC GCCTTAGACCCGTTAGACCCCCTGCCGCCTGAATGCGCGGGTACGAGCCACACAGCGCC
CGAACTTACGGAGCTGGTGGGCTCACCTGGCTTTATGGCGTACGAATCGGCTGTGTGCG ACCTGTTGGGCGAGGTGAGGTACGCGCTACTCACGCTGGCAAGGGCGACACAGCCGCCC CACCGAGCCCGCACGGCCGCGCGCGGTGTCAACAACCGGGTGAGTCGTGCACACCAGCA GGTGTTCGAGGCTTGGCTCGAAGTGCAGGACATCGTGGCGAACGCCGCCCGATGAGCCG CGCCTTACGCTGGCTGCCAGCCGTTCGCGGGCTGGTTGGTGCAGCGCGTCGAGCGGTTA GAGGCCCTGCGGTGTTCCACCACCGCAGGGCCTCGCCCTTTTTAAGGCTGAATTTGCTT GTCTCCGAATCCAACTGGCTTGTCCAAGGGTGTATCTACGCTTAATCCAAAGTTCAAAC GAGGGGATTACACATGACCAACTTCGATAACGTTCTCGGCTCGATCCTGAATCGCCCCA TCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCA GTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCG TGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTC AAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAAC TCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTT TTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGG CAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAAT TTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATC CGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCAT TACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCC TGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATG CAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATT CTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCA TCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTT TAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAA ACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCG ACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCG CGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGT TTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAA CATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTATCATTGCAGCACTG
GGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAAC TATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGT AACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAA TTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACG TGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAG
ATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCG GTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAG CAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCA AGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCT GCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAA GGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGA CCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAA GGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAG GGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCT GACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCC AGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATA CCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA
e) Obtenção da cepa de BCG recombinante expressando LTK63, rBCG-LTK63: para preparação de rBCG-LTK63 , uma alíquota estoque de 50-200 μΐ de BCG competente foi misturada com 0,1-1 μ de pNL12-LTK63, em cubetas de eletroporação de 2 mm e esta submetida a pulsações de 2,5 kV, 25 pF e 1000 Ω, num eletroporador de pulsação (GenePulser, BioRad, Hemel Hempstead, UK) . Após eletroporação, o conteúdo das cubetas foi recuperado em 2 mL de meio (MB7H9/Tw/ADC) sem antibiótico e incubado a 37°C por 20 h antes de ser semeado em meio sólido Middlebrook 7H10 (Difco) , suplementado com ácido oléico-albumina- dextrose-catalase 10% (MB7H9/OADC) mais canamicina (20 pg/mL) para seleção dos transformantes . Composição aproximada do meio sólido Middlebrook 7H10 de acordo com o fabricante (Difco-BD) : Sulfato de Amónio, Mono-fosfato de Potássio, Bi-Fosfato de Potássio, Citrato de Sódio, Sulfato de Magnésio, Cloreto de Cálcio, Sulfato de Zinco, Sulfato de Cobre Ácido L-Glutâmico, Citrato de Amónio Férrico, Hidrocloreto de Piridoxina, Biotina, Verde de Malaquita e Agar. As colónias de rBCG selecionadas foram então transferidas para 5 mL de meio líquido de cultura MB7H9/Tw/ADC com canamicina (20 pg/mL) .
e) Obtenção da cepa de BCG recombinante expressando a subunidade A LTAK63 , rBCG-LTAK63 : para preparação de rBCG- LTAK63, uma alíquota estoque de 50-200 μΐ de BCG competente foi misturada com 0,1-1 pg de pLN12-LTAK63 , em cubetas de eletroporação de 2 mm e esta submetida a pulsações de 2,5 kV, 25 ]iF e 1000 Ω, num eletroporador de pulsação (GenePulser, BioRad, Hemel Hempstead, U ) . Após eletroporação, o conteúdo das cubetas foi recuperado em 2 mL de meio (MB7H9/Tw/ADC) sem antibiótico e incubado a 37°C por 20 h antes de ser semeado em meio sólido Middlebrook 7H10 (Difco) suplementado com ácido oléico-albumina- dextrose-catalase 10% (MB7H9/OADC) mais canamicina (20 pg/mL) para seleção dos transformantes . Composição aproximada do meio sólido Middlebrook 7H10 de acordo com o fabricante (Difco-BD) : Sulfato de Amónio, Mono-fosfato de Potássio, Bi-Fosfato de Potássio, Citrato de Sódio, Sulfato de Magnésio, Cloreto de Cálcio, Sulfato de Zinco, Sulfato de Cobre Ácido L-Glutâmico, Citrato de Amónio Férrico, Hidrocloreto de Piridoxina, Biotina, Verde de Malaquita e Agar. As colónias de rBCG selecionadas foram então transferidas para 5 mL de meio líquido de cultura MB7H9/Tw/ADC com canamicina (20 g/mL) .
g) Preparação dos lotes de rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63 : Em seguida, os clones destas duas cepas foram expandidos para 50 mL de meio líquido MB7H9/Tw/ADC ou em qualquer meio descrito para cultivo de micobactérias mais canamicina (20 g/mL) . Após 2-3 semanas, quando o cultivo atinge D06oo 0,6- 0,8, as amostras foram centrifugadas , lavadas duas vezes com H20 destilada, resuspendidas em 1 mL de glicerol 10% e aliquotadas em volume de 50 μΐ e então armazenadas a -80°C, para posterior utilização nos ensaios de imunização.
h) Avaliação dos Lotes de rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63 : a viabilidade dos lotes de rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63 foi avaliada por meio de contagem do número de unidades formadoras de colónia (UFC) . O número de UFC foi determinado como segue: uma ou mais alíquotas do lote congelado a -80°C foram descongeladas e realizadas várias diluições sucessivas (lxlO2, lxlO4, lxlO5 e lxlO6) . Em seguida as diluições lxlO5 e lxlO6 foram plaqueadas em meio MB7H10/OADC mais kanamicina (20 pg/mL) e incubadas a 37°C. Após 3-4 semanas fez -se a contagem do número de colónias na placa.
i) Caracterização da expressão de LTK63 em BCG recombinante
Uma vez que não foi possível determinar a expressão do gene LTK63 pelo método clássico de imunoensaio, a caracterização da expressão LTK63 foi realizada de maneira indireta pela confirmação da presença do gene LTK63 no plasmídeo dentro do BGC recombinante . Essa caracterização foi realizada através de ensaio de PCR utilizando iniciadores específicos, os mesmos já descritos acima e utilizados para amplificar e clonar o gene LTK63 no vetor pMIP12 (Figura 1) .
j) Caracterização da expressão LTAK63 em BCG recombinante
Para verificação da expressão do gene LTAK63, foi utilizado um imunoensaio (Western blot) , usando um soro policlonal anti-LT, procedendo-se da seguinte maneira: uma ou mais alíquotas estoques de rBCG-LTAK63 foram sonicadas por 1,5 min sob gelo numa amplitude constante correspondente a metade do valor máximo (Soniprep 150 MSE, UK) e centrifugadas para precipitação de sólidos. Os sobrenadantes foram recuperados e a concentração de proteínas dosada usando o kit BIO-RAD Protein Assay (Bio- Rad) , utilizando albumina bovina como padrão. Amostras contendo 10 pg de proteínas totais foram aplicadas em gel de poliacrilamida 10% em presença de duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE 10%) . A eletroforese foi realizada à temperatura ambiente a 120 V até o corante atingir o final do gel. Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para membrana de PDVF com poros de 0,45 μπι (GE Healthcare), utilizando-se um sistema de transferência semi-seco. O gel contendo LT, como controle positivo, foi colado sob a membrana de PDVF, mergulhado em tampão de transferência (Tris 0,25 M, pH 8,3, glicina 0,129 M e metanol 20 %) e colocados entre cinco folhas de filtro também embebidos no mesmo tampão. O conjunto foi colocado entre duas placas e submetido a uma corrente de 120 mA por 1,5 h a temperatura ambiente. Ao final da eletrotransferência, a membrana foi retirada do sistema e incubada em solução bloqueadora (PBS contendo leite 5% - PBS-L) a 4°C, durante toda noite. Ao término do bloqueio, a membrana foi incubada a temperatura ambiente por 2 h com soro anti-LT diluído em PBS-L (diluição 1:1000). Após este período de incubação a membrana de PVDF foi lavada três vezes, sob leve agitação, com PBS/Tween20 0,1% (PBS-T) , em intervalos de 10 min. A membrana foi então incubada por 2 h nas mesmas condições em PBS-L contendo anticorpo anti-IgG conjugado a HRP (Sigma, Chem Co, St. Luis) e novamente lavada 3 vezes com PBS-T. A revelação foi feita por quimiluminescência usando o kit ECL (Amersham) por exposição em aparelho de fotodocumentação (ImageQuant LAS4000 - GE) (Figura 2) .
EXEMPLO 2 : Ensaio de resposta imunológica humoral e celular dos animais imunizados com rBCG-LTK63.
Foram utilizados camundongos das linhagens BALB/c (Mus musculus, Rodentia, Mammalia) , fêmeas, adultas, com 6 a 8 semanas de vida, provenientes e mantidos nas condições padrões do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Os animais foram divididos em quatro grupos (n=30) : •Grupo BCG: animais imunizados por via subcutânea (s.c.) com 0,1 mL de suspensão de BCG (lxlO6 UFC/camundongo suspensas em PBS IX) ;
•Grupo rBCG-LTK63: animais imunizados por via subcutânea (s.c.) com 0,1 mL de suspensão de rBCG-LTK63 (lxlO6 UFC/camundongo suspensas em PBS IX) ;
•Grupo rBCG-LTKA63: animais imunizados por via subcutânea (s.c.) com 0,1 mL de suspensão de rBCG-LTAK63 (lxlO6 UFC/camundongo suspensas em PBS IX) ; Grupo Controle: animais inoculados com 0,1 mL de salina (PBS IX).
a) Resposta humoral: para tal procedimento, os animais imunizados ou inoculados com o controle, com BCG ou rBCG-LT (Figura 3) ou com BCG ou rBCG-LTAK63 (Figura 4), foram sangrados pela via retro-orbital um dia antes do desafio e o soro separado e aliquotado para posterior caracterização pelo método de ELISA. Os isótipos foram determinados em soros isolados um dia antes do desafio contra MTB ou 90 dias após imunização. Os soros de 5 animais por grupo foram analisados individualmente por ELISA, usando anticorpos específicos anti IgGl e IgG2a de camundongo. A análise da resposta humoral foi realizada comparando a concentração dos anticorpos e/ou subtipos IgGl e IgG2a específicos contra PDS nos diferentes grupos de imunização. Para tal foi utilizada a curva padrão desses anticorpos detectados por anticorpos monoclonais específicos contra as respectivas imunoglobulinas . A análise comparativa da resposta de anticorpos IgGl e IgG2a induzida contra proteínas de micobactérias (PDS) é importante, uma vez que pode fornecer dados sobre o perfil ou comportamento da resposta imune contra essas proteínas. Destacando que um perfil de resposta mais Thl e, portanto mais adequado para combater uma infecção por MTB, pode ser identificado através da relação IgGl/IgG2a (Figuras 3 e 4. b) Resposta celular de rBCG-LTK63: a avaliação da resposta celular dos grupos Salina, BC6 e rBCG-LTK63 foi feita pelos métodos de ELISA e ELISPOT. Inicialmente os baços dos camundongos imunizados como descrito acima, foram removidos 30 dias após a primeira e única imunização, macerados e passados por peneiras com porosidade de 70 μπι (Celi strainer-ΒΌ Falcon, Bedford, MA) . Os esplenócitos , assim obtidos, de cada grupo (Salina, BCG e rBCG-LTK63 ) foram contados em câmara de Neubauer e tiveram sua viabilidade avaliada através da coloração de azul de Trypan. Procedeu- se, então, à diluição celular era meio RPMI completo [RPMI 1640 (GIBCO Life Technologies) , penicilina (100 U/ml) , estreptomicina (100 μg/ml) mais 10% de soro fetal bovino] , na concentração de 2x10s células/mL no ensaio de ELISA e lxlO5 células/mL no ensaio de ELISPOT, seguida de semeadura em placa de cultura celular de 24 poços sob o estimulo de PDS (2 pg/mL) e incubadas por 24 horas e 48 horas, respectivamente, a 37°C com atmosfera de C02 a 5%. No grupo tratado com rBCG-LTK63 observou-se um aumento significativo nos níveis de INF-γ e TNF-α em relação ao grupo BCG. Fato este, que sinaliza para uma resposta polarizada do tipo Thl (Figuras 5 e 6) .
c) Resposta celular de rBCG-LTAK63: a avaliação da resposta celular dos grupos Salina, BCG e rBCG-LTAK63 foi feita pelos métodos de ELISA e Citometria de Fluxo (FACS) . Inicialmente os baços dos camundongos imunizados como descrito acima, foram removidos 60 dias após a primeira e única imunização, macerados em homogenizadores de tecidos do tipo Pyrex (Fischer Scientific - USA) e recuperados os esplenócitos. Os esplenócitos, assim obtidos de cada grupo (Salina, BCG e rBCG-LTA 63) , foram contados em câmara de Neubauer e tiveram sua viabilidade avaliada através da coloração de azul de Trypan. Procedeu-se, então, à diluição celular em meio RPMI completo [RPMI 1640 (GIBCO Life Technologies) , penicilina (100 U/ml) , estreptomicina (100 g/ml) mais 10% de soro fetal bovino] , na concentração de 2xl06 células/mL para os ensaios de ELISA e FACS . No ensaio de ELISA as células foram semeadas em placa de cultura celular de 24 poços sob o estímulo de PDS (2 pg/mL) e incubadas por 48 horas, a 37°C com atmosfera de C02 a 5%. No ensaio de FACS, um volume de 500 pL de células foi semeado em placa de 96 poços sob o estímulo de PDS (5 pg/mL) e incubadas por 5 horas a 37°C com atmosfera de C02 a 5%. Cada amostra foi aliquotada e marcada em três diferentes tubos (200 μΐ/tubo) seguindo protocolo de permeabilização intracelular e marcação para analisar separadamente a expressão intracelular de INF-γ e TNF-a dentro da subpopulação de células T CD4+. Foi utilizado protocolo padrão fornecido pelo fabricante para a marcação de superfície (anti-CD4-PerCP, BD Pharmingen, San Diego, CA. USA) e para marcação intracelular os anticorpos monoclonais (mAb) anti-IFN-γ (clone 4S.B3; BD Pharmingen, San Diego, C.A., USA) e anti- TNF-α (clone MAbll; BD Pharmingen, San Diego, C.A., USA) . No grupo tratado com rBCG-LTAK63 observou-se um aumento significativo nos níveis de INF-γ e TNF-α em relação ao grupo BCG, tanto nos ensaios de ELISA como no de citometria de fluxo. Fato este, que sinaliza para uma resposta polarizada do tipo Thl (Figuras 7 e 8, ELISA; Figuras .9 e 10, FACS).
EXEMPLO 3 : Desenvolvimento do modelo animal de desafio contra tuberculose -Ensaios de proteção contra um desafio intra- raqueal com a cepa de M. tubérculosis H37Rv.
Foram utilizados camundongos das linhagens C57BL/6 ou
BALB/c {Mus musculus , Rodentia, Mammalia) , fêmeas, adultas, com 6 a 8 semanas de vida, provenientes e mantidos nas condições padrões do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Utilizou-se para os ensaios de desafio a cepa de Mycobacterium tuberculosis (MTB) 37HRv, a qual foi cultivada em meio líquido MB7H9/Tw/ADC em estufa a 37°C e 5% de C02. A suspensão bacilar de MTB foi cultivada em meio 7H9/Tw/ADC por duas semanas e somente suspensões com no mínimo de 80% de bacilos viáveis foram usados para o desafio pela via intratraqueal . 0 cultivo bacilar foi centrifugado a 4000 rpm e lavados duas vezes com igual volume do cultivo com PBS IX. Em seguida o sedimento foi ressuspendido em 1 mL de PBS IX e o número de bacilo estimado usando a escala de Macfarland.
O desafio intratraqueal seguiu o método previamente descrito [Pelizon et al. (2010) Neonatal BCG immunization followed by DNAhsp65 boosters: highly immunogenic but not protective against tuberculosis - a paradoxical effect of the vector? Scand J Immunol . 71: 63-69. Os camundongos foram infectados com lxlO5 UFC de MTB viáveis ou inoculados com 100 L de PBS (Tampão Fosfato Salina) intratraquealmente sob anestesia (200 pL de uma mistura de Quetamina/Xilazina)
Os animais foram acompanhados por quatro semanas. Após este período todos foram sacrificados em câmera de C02 e os pulmões retirados para serem processados . Um dos lóbulos de cada pulmão foi separado e macerado num volume total de 1 mL de solução de PBS IX. Em seguida esse material foi diluído serialmente e semeado em placas de petri contendo meio sólido 7H10/OADC. Trinta dias depois, o número de UFC foi determinado nas placas correspondentes a cada grupo de animais imunizados (Figura 11) .

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Cepa de Mycobacterium recombinante caracterizada pelo fato de que codifica a toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.
2. Cepa de Mycobacterium recombinante caracterizada pelo fato de que codifica a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Escherichia coli mutada.
3. Cepa de Mycobacterium recombinante de acordo com qualquer uma das reivinidicações 1 ou 2 caracterizada pelo fato de que a toxina termo-lábil LT Escherichia coli é mutada na posição 63.
4. Cepa de Mycobacterium recombinante de acordo com a revindicação 3 caracterizada pelo fato de que a mutação é uma substituição de serina por lysina.
5. Cepa de Mycobacterium recombinante de acordo com qualquer uma das reivinidicações 1 a 4 caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo consistindo de cepas de Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium microft, Mycobacterium africanum, ou Mycobacterium smegmati.s , Mycobacterium avium, Mycobacterium vaccae, etc.
6. Cepa de Mycobacterium recombinante de acordo com a reivinidicação 5 caracterizada pelo fato de que a cepa de Mycobacterium. recombinante é uma cepa de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) .
7. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de compreender ao menos uma cepa de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) , recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um ou mais dentre um veículo, excipiente, diluente ou solvente fisiologicamente aceitáveis.
8. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um ou mais antígenos.
9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivinidcações 7 ou 8 caracterizada pelo fato de ser para administração intradermica, oral ou parenteral .
10. Uso de uma ou mais cepas de Mycobacterium recombinantes conforme definidas nas reivinidicações 1 a 6 ou de uma ou mais composições imunogênicas , conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma vacina.
11. Uso de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma vacina para prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou infecções causadas por bactérias do género WycoJ a cteri uin .
12. Uso de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma vacina para prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou infecções causadas por Mycobacterium tuberculosis .
13. Uso de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo de ser na manufatura de uma vacina para prevenção e/ou tratamento de tuberculose.
14. Método de prevenir ou tratar doenças e/ou infecções causadas por bactérias do género Mycobacterium em animais caracterizado por ser administrada aos animais uma quantidade efetiva de uma ou mais cepas de Mycobacterium recombinantes conforme definidas nas reivinidicações 1 a 6 ou de uma ou mais composições imunogênicas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 7 a 9.
15. Método de prevenir ou tratar tuberculose em animais, caracterizado por ser administrada aos animais uma quantidade efetiva de uma ou mais cepas de Mycobacterium recombinantes conforme definidas nas reivinidicações 1 a 6 ou de uma ou mais composições imunogênicas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 7 a 9.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o animal é um mamífero.
17. Método de acordo com a reivindicação 16 caracterizado pelo fato de que o mamífero é um humano.
PCT/BR2013/000049 2012-02-17 2013-02-18 Cepa de mycobacterium recombinante, composição imunogênica e uso WO2013120159A1 (pt)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR112014020297-4A BR112014020297B1 (pt) 2012-02-17 2013-02-18 Cepa de mycobacterium recombinante, composição imunogênica e uso
EP13749037.1A EP2816106B1 (en) 2012-02-17 2013-02-18 Recombinant strain of mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin (bcg) immunogenic composition and use
CN201380020308.6A CN104271733B (zh) 2012-02-17 2013-02-18 重组牛分枝杆菌菌株、免疫原性组合物和用途
IN1799MUN2014 IN2014MN01799A (pt) 2012-02-17 2013-02-18
US14/379,149 US9512186B2 (en) 2012-02-17 2013-02-18 Recombinant strain of Mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin (BCG), immunogenic composition and use
ZA2014/06437A ZA201406437B (en) 2012-02-17 2014-09-02 Recombinant strain of mycobacterium bovis bacillus calmette-guerin (bcg), immunogenic composition and use

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BRBR102012003790-4A BR102012003790A2 (pt) 2012-02-17 2012-02-17 Cepa de mycobacterium recombinante, composição imunogênica e uso
BRBR1020120037904 2012-02-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013120159A1 true WO2013120159A1 (pt) 2013-08-22

Family

ID=48983477

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/BR2013/000049 WO2013120159A1 (pt) 2012-02-17 2013-02-18 Cepa de mycobacterium recombinante, composição imunogênica e uso

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9512186B2 (pt)
EP (1) EP2816106B1 (pt)
CN (1) CN104271733B (pt)
BR (2) BR102012003790A2 (pt)
IN (1) IN2014MN01799A (pt)
WO (1) WO2013120159A1 (pt)
ZA (1) ZA201406437B (pt)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201911636D0 (en) 2019-08-14 2019-09-25 Univ Surrey Vaccine
CN118715022A (zh) * 2022-02-11 2024-09-27 布坦坦研究所 包含重组分枝杆菌菌株的组合物、其用途和用于预防和/或治疗癌症的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5504005A (en) 1987-03-02 1996-04-02 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Recombinant mycobacterial vaccine
US6673353B1 (en) 1997-08-22 2004-01-06 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Tuberculosis vaccine
WO2009089535A2 (en) * 2008-01-11 2009-07-16 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Polypeptide vaccine and vaccination strategy against mycobacterium

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0313242D0 (en) * 2003-06-09 2003-07-16 Imp College Innovations Ltd Pulmonary immunopathology

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5504005A (en) 1987-03-02 1996-04-02 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Recombinant mycobacterial vaccine
US6673353B1 (en) 1997-08-22 2004-01-06 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Tuberculosis vaccine
WO2009089535A2 (en) * 2008-01-11 2009-07-16 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Polypeptide vaccine and vaccination strategy against mycobacterium

Non-Patent Citations (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Cholera toxin and cholera B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems", VACCINE, vol. 11, 1993, pages 1179 - 1184
"Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases The Pink Book", 2009, PUBLIC HEALTH FOUNDATION, article "Vaccine Excipient & Media Summary"
ANDERSEN, P.; DOHERTY, T.M.: "The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine", NAT REV MICROBIOL., vol. 3, 2005, pages 656 - 662
CONNELL, N.D.: "Expression systems for use in Actinomycetes and related organisms", CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, vol. 12, 2001, pages 446 - 449, XP002470819, DOI: doi:10.1016/S0958-1669(00)00243-3
DA HORA, V.P. ET AL.: "Non-toxic derivatives of LT as potent adjuvants", VACCINE, vol. 29, 2011, pages 1538 - 1544, XP028139969, DOI: doi:10.1016/j.vaccine.2010.11.091
DE HAAN, L.; HOLTROP, M.; VERWEIJ, W.R.; AGSTERIBBE, E.; WILSCHUT, J.: "Mucosal immunogenicity and adjuvant activity of the recombinant A subunit of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin", IMMUNOLOGY, vol. 97, 1999, pages 706 - 7013
DE HAAN, L.; VERWEIJ, W.R.; FEIL, I.K.; HOLTROP, M.; HOL, W.G.; AGSTERIBBE, E.; WILSCHUT, J.: "Role of GM1 binding in the mucosal immunogenicity and adjuvant activity of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin and its B subunit", IMMUNOLOGY, vol. 94, 1998, pages 424 - 430, XP002526353, DOI: doi:10.1046/j.1365-2567.1998.00535.x
JAWETZ, E.; MELNICK, J.L.; ADELBERG, E.A.: "Medical Microbiology", 1998, APPLETON & LANGE
KAUFMANN, S.H.: "Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box", IMMUNITY, vol. 33, 2010, pages 567 - 577
LE DANTEC ET AL., J BACTERIOL., vol. 183, 2001, pages 2157 - 2164
LYCKE, N. ET AL.: "The adjuvant effect of Vibrio cholerae and Escherichia coli heat-labile enterotoxins is linked to their ADP-ribosyltransferase activity", J IMMUNOL., vol. 22, 1992, pages 2277 - 2281, XP002058448, DOI: doi:10.1002/eji.1830220915
MAGAGNOLI, C. ET AL., INFECT IMMUN., vol. 64, 1996, pages 5434 - 5438
MIYAJI, E.N. ET AL.: "Induction of neutralizing antibodies against diphtheria toxin by priming with recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing CRM197, a mutant diphtheria toxin", INFECT IMMUN., vol. 69, 2001, pages 869 - 874
ORME, I.: "Medical Intelligent Unit: Immunity to Mycobacteria", 1995, AUSTIN: R.G. LANDS COMPANY, pages: 5
PALMA, C ET AL.: "The LTK63 adjuvant improves protection conferred by Ag85B DNA-protein prime-boosting vaccination against Mycobacterium tuberculosis infection by dampening IFN-y response", VACCINE, vol. 26, 2008, pages 4237 - 4243, XP022938973 *
PELIZON ET AL.: "Neonatal BCG immunization followed by DNAhsp65 boosters: highly immunogenic but not protective against tuberculosis - a paradoxical effect of the vector?", SCAND J IMMUNOL., vol. 71, 2010, pages 63 - 69
PIZZA, M. ET AL.: "Mucosal vaccines: nontoxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants", VACCINE, vol. 19, 2001, pages 2534 - 2541
RYAN, E J. ET AL.: "Modulation of innate and acquired immune responses by Escherichia coli heat-labile toxin: distinct pro- and anti-inflammatory effects of the nontoxic AB complex and the enzyme activity", J IMMUNOL, vol. 165, 2000, pages 5750 - 5759, XP002283476
See also references of EP2816106A4
SHINNICK, T .M.; GOOD, R. C.: "Mycobacterial taxonomy", EUR J CLIN MICROBIOL INFECT DIS, vol. 11, 1994, pages 884 - 901
SHINNICK, T .M.; GOOD, R. C.: "Mycobacterial taxonomy", EUR J CLIN MICROBIOL INFECT MDIS, vol. 11, 1994, pages 884 - 901
SPANGLER, B.D.: "Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin", MICROBIOL REV., vol. 56, 1992, pages 622 - 647
SWEENEY, K.A; DAO, D.N.; GOLDBERG, M.F.; HSU, T.; VENKATASWAMY, M.M.; HENAO-TAMAYO, M.; ORDWAY, D.; SELLERS, R.S.; JAIN, P.; CHEN,: "A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium tuberculosis", NAT MED., vol. 4, 2011, pages 1261 - 1268
TAKAHASHI ET AL.: "Mutant Escherichia coli enterotoxin as a mucosal. adjuvant induces specific Thl responses of CD4 + and CD8+T cells to nasal killed-bacillus calmette-guerin in mice", VACCINE, vol. 24, 2006, pages 3591 - 3598, XP028010893 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2816106B1 (en) 2021-10-06
CN104271733A (zh) 2015-01-07
US9512186B2 (en) 2016-12-06
BR112014020297B1 (pt) 2022-01-25
IN2014MN01799A (pt) 2015-07-03
BR112014020297A2 (pt) 2017-06-20
EP2816106A4 (en) 2015-07-29
EP2816106A1 (en) 2014-12-24
CN104271733B (zh) 2018-02-27
US20150152145A1 (en) 2015-06-04
BR102012003790A2 (pt) 2014-04-22
ZA201406437B (en) 2016-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11744884B2 (en) Live Salmonella typhi vectors engineered to express heterologous outer membrane protein antigens and methods of use thereof
US20230090746A1 (en) Attenuated salmonella synthesizing antigens for vaccinating against helicobacter pylori
Yamamoto et al. Genetically modified Bifidobacterium displaying Salmonella-antigen protects mice from lethal challenge of Salmonella Typhimurium in a murine typhoid fever model
Tyagi et al. Development of vaccines against tuberculosis
ES2307402B1 (es) Vacuna profilactica contra la tuberculosis.
Sharma et al. Immune response characterization and vaccine potential of a recombinant chimera comprising B-cell epitope of Aeromonas hydrophila outer membrane protein C and LTB
Xu et al. Live attenuated Salmonella typhimurium vaccines delivering SaEsxA and SaEsxB via type III secretion system confer protection against Staphylococcus aureus infection
Baker et al. Intradermal vaccination with a Pseudomonas aeruginosa vaccine adjuvanted with a mutant bacterial ADP-ribosylating enterotoxin protects against acute pneumonia
US7063852B2 (en) Hybrid LT-A/CT-B holotoxin for use as an adjuvant
Banerjee et al. Pentavalent outer membrane vesicles immunized mice sera confers passive protection against five prevalent pathotypes of diarrhoeagenic Escherichia coli in neonatal mice
US10953081B2 (en) Methods and compositions for inducing an immune response to Pseudomonas aeruginosa pulmonary infections
WO2013120159A1 (pt) Cepa de mycobacterium recombinante, composição imunogênica e uso
Chuang et al. Intranasal Immunization with DnaK protein induces protective mucosal immunity against tuberculosis in CD4-depleted mice
US8287855B2 (en) V. cholerae hyperexpressing recombinant cholera toxin B subunit showing dual immunogenicity
US7803363B2 (en) Attenuated Francisella bacteria
US10226521B2 (en) Genetically modified Yersinia as vaccines against Yersinia species
Chakraborty et al. Intranasal Immunization of Mice with a Chimeric Antigen of Cholera Toxin B and Salmonella Typhi outer membrane protein T2544 elicits protective antibodies and T cell response at the intestinal mucosa
WO2005056769A2 (en) Orally-administered live bacterial vaccines for plague
Terrinoni Novel approaches to mucosal vaccine development Strategies in vaccine antigen production, construction of a novel mucosal adjuvant and studies of its mode of action
Chakraborty et al. Intranasal immunization of mice with chimera of Salmonella Typhi protein elicits protective intestinal immunity
JP2024540918A (ja) リポ多糖（ｌｐｓ）欠損アシネトバクター・バウマニ多価ワクチン
EP4419135A1 (en) Lipopolysaccharide (lps) deficient acinetobacter baumannii multivalent vaccine
BR102022002660A2 (pt) Composições compreendendo cepas de mycobacterium recombinantes, respectivos usos e métodos para a prevenção e/ou tratamento de câncer
Martinez-Becerra et al. Development of Subunit Vaccines Against Shigellosis: An Update
Faiyaz The effects of environmental mycobacteria on VLP and MVA based vaccines against tuberculosis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13749037

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14379149

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013749037

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112014020297

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112014020297

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20140815