CN109091668A - 16价肺炎链球菌结合疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开16价肺炎链球菌结合疫苗组合物，所述疫苗组合物由分离纯化获得的肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白偶联结合后混合组成，所述荚膜多糖由以下16种肺炎链球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、11A、14、15B、18C、19A、19F和23F组成，本发明公开的16价肺炎链球菌结合疫苗组合物能够覆盖我国绝大部分常见致病菌型或耐药菌型，对高危易感人群如新生婴儿、老年人及2岁以下儿童具有广谱高效的保护作用。

Description

16价肺炎链球菌结合疫苗组合物

技术领域

本发明属于肺炎疫苗领域，更具体地讲，涉及16价肺炎链球菌结合疫苗组合物。

背景技术

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)引发的疾病是全球儿童尤其是发展中国家儿童发病率和死亡率的最主要病因，肺炎链球菌感染引起的疾病己成为全球一个严重的公共健康问题。肺炎链球菌高危易感人群主要来自于新生婴儿、5岁以下儿童、65岁以上老人和免疫力低下者。据世界卫生组织(WTO)估算，在2005年有160万人死于肺炎球菌疾病，包括70～100万5岁以下的儿童，其中大多数为发展中国家儿童(http://www.who.int/biologicals/areas/vaccines/pneumo/en/)。此外，季节性流感病毒、HIV病毒感染和其他与免疫缺陷相关的病症者感染肺炎球菌病的几率也会大增。

肺炎链球菌属革兰氏阳性菌，被荚膜多糖所包围，荚膜多糖成分的差别使得其从血清学上区分90多种荚膜类型(Habib,et al,Capsular serotyping of Streptococcuspneumoniae using the Quellung reaction,Journal of Visualized Experiments,2014(84):e51208-e51208)。不同血清型的肺炎链球菌其致病力也不尽相同，高致病性的肺炎链球菌有近20多种，其流行有很大的国家和地域差别。在我国，根据1980年至今发表的文献记载报导的肺炎链球菌血清型有：1、2、3、5、6A、6B、7F、8、9v、10A、11A、14、15B、18C、19A、19F、20、23F、33F等，其中以19F、23F、19A、6B、14、6A和15B血清型最为常见，其次为3、5、1、18、2、9V、11A、8、7F、10A、4、33F和20型血清(丁绍卿等，肺炎球菌血清学分型的研究，生物制品学杂志，1988，1(1):18-22；韦宁等，中国≤18岁人群肺炎球菌相关病例中肺炎球菌血清型分布的系统评价，中国疫苗和免疫，2014，20(6)：547-555；苏楠等，中国内地儿童侵袭型肺炎链球菌感染血清型的分布特征，中华医学杂志，2016,96(18):1465-1469)。这一结果与近年来亚洲和世界范围内统计的血清型分布略有不同，跟据2010年Johnson等整理显示，世界范围内儿童肺炎链球菌最常见血清型依次为：14、6B、1、23F、5、19F、6A、19A、9V、18C和2型(Johnson,et al，Systematic Evaluation of Serotypes Causing InvasivePneumococcal Disease among Children Under Five:The Pneumococcal GlobalSerotype Project,PLoS Medicine,2010,7(10):1-13)。

广泛应用抗菌药物治疗肺炎链球菌感染在一定程度上影响了肺炎链球菌血清型的分布(Lynch et al,Streptococcus pneumoniae:epidemiology,risk factors,andstrategies for prevention,Semin Respir Crit Care Med,2009,30(2):189-209)。在上世纪80年代对我国18个省市临床病例中分离的肺炎链球菌进行血清分型显示，常见的血清型依次为5、6、1、19、2、14、23和3型(丁绍卿等，肺炎球菌血清学分型的研究，生物制品学杂志，1988，1(1):18-22)，而2010-2011年我国10个城市13家医院临床分离的非重复性肺炎链球菌471株进行血清型鉴定，显示最常见的血清型依次为19F(112，23.8％)、19A(63，13.4％)、3(48，10.2％)、14(43，9.1％)、23F(29，6.2％)、15(25，5.3％)和6A(23，4.9％)，同时菌株对15种抗生素产生不同程度耐药性，其中对红霉素、克林霉素和四环素的耐药率甚至达到80％以上(王启等，2010-2011年中国肺炎链球菌耐药性和血清型研究，中华结核和呼吸杂志,2013,36(2):106-112)。

另外，肺炎链球菌疫苗的接种也会影响肺炎链球菌血清型流行病的变化，7价肺炎结合疫苗于2000年在美国大规模接种后，在小于1岁儿童中观察到非疫苗血清型肺炎链球菌感染成为最大增长，达到10.8/10万。在小于5岁儿童中19A血清型引发的肺炎链球菌感染发病率从1998～1999年的2.6/10万增长至2005年的9.3/10万。2005年，在小于5岁儿童中的IPD的40％是非疫苗血清型19A引起的，19A成为发病率增长最高的血清型(Reingold etal,Invasive pneumococcal disease in children 5years after conjugate vaccineintroduction--eight states,1998-2005,Mmwr Morbidity&Mortality Weekly Report,2008,299(11):1253-1255.)。另一研究者也指出，2002～2005年小于5岁儿童中每年肺炎链球菌感染的72～91％是非疫苗血清型菌株引发的(Pelton et al,Emergence of 19A asvirulent and multidrug resistant Pneumococcus in Massachusetts followinguniversal immunization of infants with pneumococcal conjugate vaccine,PediatrInfect DisJ.2007:26(6):468-472.)。

肺炎球菌对抗生素(如青霉素、头孢菌素、复方新诺明、大环内醋类和氟喳诺酣类)的耐药性在全世界己经成了一个相当严峻的、急剧发展的现象。我国文献报道中出现频率较高的6A、6B、14、19A、19F和23F血清型都被证实对一种或多重抗生素有较强抗药性(景春梅等，2009-2014年重庆地区儿童感染肺炎链球菌的耐药性及血清分型研究，中国抗生素杂志，2016,41(1):64-69；Liu et al,Serotypes and patterns of antibiotic resistancein strains causing invasive pneumococcal disease in children less than 5yearsof age,Plos One,2013,8(1):e54254；李马超等，241株肺炎链球菌血清分型及耐药性研究，中国疫苗和免疫,2013(4):336-340；Pan et al,Serotype Distribution,Antimicrobial Susceptibility,and Molecular Epidemiology of Streptococcuspneumoniae Isolated from Children in Shanghai,China,Plos One,2015,10(11):e0142892)，抗生素类药物的广泛或者过度使用可能是其重要原因。随着肺炎链球菌对常用抗生素的耐药性日益增加，当前亟需有效的疫苗来控制肺炎球菌疾病(WHO,WeeklyEpidemiological Record,2007,(12):93-104)。

预防肺炎链球菌感染的生物制品包括多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine,PCV)，其中23价多糖疫苗可用于2岁以上人群，主要适用人群是老年人以及一些免疫功能低下的特殊人群等。由于多糖分子属于T细胞非依赖性抗原，在婴幼儿体内只能产生较弱的免疫反应，接种婴幼儿后免疫效果不理想。同样，老年人对肺炎链球菌多糖疫苗的应答较弱。而多糖-蛋白结合疫苗可将非T细胞依赖性质的多糖抗原转变为T细胞依赖性质的抗原，激发机体的T辅助细胞产生一系列的免疫增强及免疫记忆效应，比多糖疫苗具有明显的优势，是肺炎链球菌疫苗研制的一个重要方向。

目前已上市的肺炎链球菌结疫苗包括辉瑞公司“7价肺炎链球菌结合疫苗”包含血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F，以及在7价基础上增加了6个血清型(1，3，5，7F，6A，19A)的13价结合疫苗。葛兰素史克公司的“10价肺炎链球菌结合疫苗”，包含肺炎链球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F。由于这些肺炎结合疫苗血清型组成主要是根据几十年前美国及欧洲发达国家的流行病学数据而筛选的，例如疫苗中有少数血清型较为少见，如4，而我国肺炎链球菌常见血清型如：15B并未包含在内(韦宁等，中国≤18岁人群肺炎球菌相关病例中肺炎球菌血清型分布的系统评价，中国疫苗和免疫，2014，20(6)：547-555)。13价结合疫苗对我国肺炎链球菌保护平均也只有70～85％的覆盖率(秦颖等，2012年WHO关于肺炎链球菌疫苗立场文件的解读，中华预防医学杂志，2014，48(2):85-90；王颖童等，肺炎链球菌疫苗在不同年龄组儿童中应用价值分析，实用预防医学，2016，23(5):545-547)，因此，一些未包含在已有疫苗血清型中的高致病力的肺炎球菌血清型有急剧增加风险。

鉴于疫苗对肺炎球菌疾病所带来的巨大的公共卫生影响，因此，我们应结合我国流行的、高致病性肺炎链球菌血清型，开发适合中国的安全、有效、价格适中，并能为肺炎球菌疾病提供更广谱保护的肺炎球菌疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够覆盖我国绝大部分常见高致病菌型或耐药菌型，对易受肺炎困扰的老年人及2岁以下儿童具有广谱高效的肺炎链球菌结合疫苗组合物。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：16价肺炎链球菌结合疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物由分离纯化获得的肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白偶联结合后混合组成，所述荚膜多糖由以下16种肺炎链球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、11A、14、15B、18C、19A、19F和23F组成。

作为一个优选方案，所述载体蛋白为白喉杆菌类毒素、白喉杆菌无毒变异蛋白CRM197、破伤风类毒素蛋白及其变异体、流感嗜血杆菌D蛋白或其他药学可接受的载体。

所述肺炎球链球菌血清型的选择基于以下事实：(1)根据1980年至今发表文献中出现频率较高，即我国最常见的肺炎链球菌血清型，选择：19F、23F、19A、6B、14、6A、15B血清型；(2)基于世界范围内儿童肺炎链球菌常见血清型以及我国较为常见血清型，选择：1、2、3、4、5、7F、9V、11A、18C血清型。其中，血清型2、11A、15B是目前13价肺炎-蛋白结合疫苗所未包含的血清型。

所述载体蛋白为白喉杆菌类毒素、白喉杆菌素无毒变异蛋白CRM197、破伤风毒素蛋白及其变异体、流感嗜血杆菌D蛋白，以及其他免疫学上可接受的载体蛋白质，包括霍乱类毒素、大肠杆菌(E.coli)LT、大肠杆菌ST、来自铜绿假单胞菌的外毒素A、细菌外膜蛋白质例如外膜复合物c(OMPC)，孔蛋白，转铁蛋白结合蛋白，肺炎球菌表面蛋白质A、肺炎球菌粘附素蛋白质(PsaA)、肺炎球菌溶血素、其他蛋白质例如卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、热休克蛋白。

所述肺炎链球菌荚膜多糖通过本领域技术人员已知的标准技术进行制备，通过基于肺炎链球菌通用的培养基培养，从菌种活化、小瓶规模摇瓶培养、放大发酵培养，从发酵液中纯化得到。发酵液的处理和纯化涉及如下过程，如细菌裂解、离心、沉淀、微滤及超滤、利用复合型离子交换层析、羟基磷酸灰质盐层析去除各种杂质如蛋白质、核酸、脂类、小分子物质等。纯化的荚膜多糖收率在50％以上，多糖纯度至少符合欧盟标准，其中蛋白质和核酸等杂质含量远低于欧盟药典限定的国际标准。

本发明所述肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白结合技术，利用本领域技术人员已知的标准技术进行制备：(1)利用氧化剂如高碘酸盐(包括高碘酸钠、高碘酸钾或高碘酸)将所述多糖氧化产生的醛基直接与载体蛋白上的氨基反应，再经还原剂如硼氢化钠还原，形成稳定的多糖-蛋白(C-N结构)结合物。(2)所述荚膜多糖用氰化物溴化氰(CNBr)或1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化以形成氰酸酯，由此，活化的糖可直接载体蛋白的氨基偶联，或经由间隔臂(接头)基团与载体蛋白羧基偶联，如氰酸酯(经CDAP化学制备)与己二胺或己二酸二酰肼(ADH)偶联形成氨基衍生多糖。在碳二亚胺(例如，EDAC或EDC)的介导下，衍生多糖上的胺基再与蛋白载体上的羧基反应形成多糖蛋白质结合物。荚膜多糖与载体蛋白质结合后，通过包括超滤、分子筛等柱层析和无菌过滤等步骤纯化多糖蛋白结合物。

血清型2、11A、15B荚膜多糖和蛋白的结合物在动物中的免疫原性评价是通过免疫小鼠或大鼠进行。含有0.5μg to 50μg免疫结合物及佐剂通过肌肉、皮下或腹腔途径，分别在0、14、28天免疫，抽取在35天血清，评价其特异性抗体含量。所有2、11A、15B荚膜多糖和蛋白的结合物都能诱导特异性抗体，所述抗体滴度与其它血清型相当。

本发明的优点在于：本发明公开的16价肺炎链球菌结合疫苗组合物能够覆盖我国绝大部分常见致病菌型或耐药菌型，对高危易感人群如新生婴儿、老年人及2岁以下儿童具有广谱高效的保护作用。调配成疫苗的免疫原性组合物可增加针对婴儿和幼儿中的高致病性的肺炎链球菌保护作用的广泛覆盖。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.

制备菌种库

不同血清型的肺炎链球菌，通过接种到新鲜羊血平板在36゜C，5％CO₂中培养传代，然后在液体培养基中放大培养，到一定细胞密度后制备主代及工作代菌种库，低温冷藏保存。菌种库通过鉴别和鉴定实验确定肺炎链球菌血清型、存活力、无菌、稳定性等，适合于研发和规模化生产。

发酵和收获

取工作菌种在固体培养基划线挑取菌种，接种于5ml的液体培养基中，36℃培养后，转种到500ml的培养液后经过培养再扩增至10L或50L发酵罐。发酵液保持在pH 6.5-8.5,控制空气流量，并定期检测OD₆₀₀。发酵结速后，加入适量灭活剂，确定灭活完全，然后进行一系列收液、离心、沉淀、深层过滤、超滤等工艺方法得到粗制多糖，去除大量杂质如蛋白质、核酸、小分子物质等。

多糖精纯化

肺炎球菌多糖的精纯化由浓缩/超滤滤操作、柱层析和除菌过滤几个步骤组成。将上述得到的肺炎链球菌粗制多糖溶液以分子截留为50-100kDa膜浓缩,用磷酸钠缓冲液进行超滤换液，调节溶液pH至中性。超滤主要目的是从含有荚膜多糖溶液中去除一些小分子物质，诸如核酸、蛋白质和低分子量的培养基组分。

接下来，用上样缓冲液(含5-50mM磷酸缓冲液，盐离子浓度(NaCl)优选地在100-300mM)，进一步超滤换液，直到达到恒定电导。Capto Adhere层析柱用相同缓冲液平衡，随后将换液后的荚膜多糖溶液上Capto Adhere层析柱，收集流穿液。上样完成后，用1-2个柱体积磷酸缓冲液，含相同盐离子浓度的缓冲液进一步洗涤，多糖在的流穿液和洗涤液中被回收。结合在Capto Adhere层析柱上的蛋白、核酸以及多糖用0.1M乙酸洗脱下来。CaptoAdhere层析后回收的含有荚膜多糖溶液，经超滤换液调节(或不调节)溶液盐离子浓度后，接着继续上Hydroxyapatite层析柱，同样收集含多糖的流穿液。

使用分子截留为30kDa膜浓缩多糖溶液，然后超滤换液。将超滤后的多糖溶液通过0.2μm滤膜除菌过滤，低温保存。经检测不同指标，制备多糖符合欧盟药典标准。不同血清型荚膜多糖质量分析结果见下表1。

表1.肺炎链球菌不同血清型荚膜多糖质量分析结果

肺炎链球菌荚膜多糖-载体蛋白结合物的制备

氨基还原法制备多糖-蛋白结合物：将纯化的多糖溶解于水中至1–5mg/mL的浓度，将溶解的多糖经过其压力为100-1000bar的机械匀质机均质。在多糖分子量减小后，使用分子截留为30kDa滤膜，用注射用水超滤换液至少10个体积。接着在高碘酸钠存在下通过在20-42℃温育12-48小时进行氧化。使用分子截留为30kDa滤膜浓缩活化反应混合物，并超滤换液至少10个体积。用缓冲液，将溶液调整至pH 5.0–8.5，通过0.2μm滤器过滤活化多糖溶液。将活化多糖与载体蛋白以0.2–2比1配料比混合，加入氰基硼氢化钠溶液达到0.4–2.0摩尔氰基硼氢化钠/摩尔糖类而起始结合反应，将反应混合物在20-42℃温育24–120小时。在结合反应温育结束后，用碳酸氢钠缓冲液或磷酸钾缓冲液将反应液调整pH至6.0–9.0。加入硼氢化钠溶液达到0.5–2.0摩尔硼氢化钠/摩尔糖类，将反应混合物温育45–120分钟封闭未反应醛基。将反应混合物在分子截留为100kDa滤膜上超滤，依次使用最低限度20体积的100mM磷酸钾溶液、150mM氯化钠溶液对反应混合液换液。将超滤换液后的多糖-蛋白结合物通过0.2μm滤器过滤除菌。

氰基活化法制备多糖-蛋白结合物：溶解肺炎链球菌多糖，调整pH值至9-11，按质量比为0.5-2mg CDAP/mg多糖加入CDAP乙腈溶液(浓度为100mg/ml)，维持pH值为9-11反应2-10分钟，将按蛋白质/多糖量比为0.5-2/1将纯化的载体蛋白加入至活化的多糖溶液中。调节反应液pH值特定值下偶联反应1-2小时，调节pH值至9.0-11.0，加入甘氨酸猝灭未反应的氰酸酯基团并终止偶联反应。超滤或透析获得多糖结合物。结合物经分子排阻层析纯化，获得多糖-蛋白结合物原液。

另外，CDAP活化的多糖也可经由接头(己二胺或己二酸二酰肼)基团与载体蛋白羧基偶联。如上，经CDAP活化的多糖中按蛋白质/多糖量比为0.5-2/1将纯化的载体蛋白加入至活化的多糖溶液中，接着加入ADH至终浓度0.1-0.4M，当ADH完全溶解时，将pH调节至6.0-8.0。然后加入EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)，以达到0.01-0.04M终浓度，在调节pH至6.0-8.0，搅拌混合物1小时。通过于25℃增加pH至9.0达至少30分钟终止缩合反应。结合物经超滤浓缩换液、分子排阻层析等纯化步骤，获得多糖-蛋白结合物原液。

多糖-蛋白结合物原液的质量控制

多糖与载体蛋白结合反应工艺步骤复杂，条件控制要求高。为了确保多糖-蛋白结合物的稳定性和批次的一致性，必须建立相应的质量控制方法。由于结合反应可能影响多糖的结构，多糖-蛋白结合后(单价结合物未混合前)进行多糖的鉴定实验。此外，对纯化后的多糖-蛋白结合物进行以下检测:①采用适宜的化学检测方法，确保多糖-蛋白结合物原液经过纯化后，多糖-蛋白结合反应中所使用的试剂(CDAP、ADH等化学试剂)己被清除；②分别测定结合物中多糖和蛋白的含量，确定结合物中多糖/蛋白比；③采用高效液相色谱检测蛋白，多糖和结合产物的含量；④采用凝胶电泳或层析方法对多糖-蛋白结合物中蛋白相对分子大小进行测定；⑤按《中国药典》的要求，测定多糖-蛋白结合物溶液的内毒素含量；确保多糖-蛋白结合物质量合格；⑥通过免疫分析方法确定每一种结合物与特异性的免疫血清反应。

每一种结合物的免疫原性是通过动物免疫来评价。免疫动物为小鼠或大鼠，免疫途径为肌肉、皮下、腹腔注射，配以佐剂，免疫抗原剂量在0.5ug到50ug之间。免疫通常为第0天、14天、28天分别注射，在28天或35天收集抗血清。每组免疫动物在5-10个之间。免疫血清使用ELISA法评价其特异性对不同多糖蛋白结合物的抗体滴度水平(见表2)。表2中说明了，不同种的免疫结合物都可以诱导特异性的免疫抗体，其抗体滴度相当，进一步说明血清型2、11A、15B、荚膜多糖和蛋白的结合物可以作为免疫原，诱导特异性抗体，达到保护目的。这些免疫原组合物可以与现有的不同血清型结合物，如1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F组合使用，可诱导保护覆盖率更广的疫苗。

表2.肺炎链球菌多糖-蛋白结合物免疫原性分析

实施例2.

发酵和收获

取工作种子在大豆蛋白胨固体培养基划线挑取菌种，接种于5ml的液体综合培养基，36±2℃培养后，转种到500ml的培养液后经过培养再扩增至10L培养液和50L含有大豆培养基的发酵罐。用无菌碳酸钠溶液保持pH7.4，对数生长期末期加入合适量的无菌的脱氧胆酸钠以裂解细菌细胞和释放细菌荚膜多糖。裂解后，冷却发酵罐。用乙酸调节裂解的培养液的pH到约pH6.0。通过连续流离心，接着深层过滤和0.45μm微量过滤澄清裂解物。

多糖纯化

肺炎球菌多糖的纯化由浓缩/超滤滤操作、柱层析和除菌过滤几个步骤组成。将来澄清得到肺炎链球菌裂解液以分子截留为100kDa膜浓缩,用磷酸钠缓冲液进行超滤换液，调节溶液pH至7.4。超滤主要目的是从含有荚膜多糖溶液中去除一些小分子物质，诸如核酸、蛋白质和低分子量的培养基组分。

接下来，用上样缓冲液(含10-50mM磷酸缓冲液，盐离子浓度(NaCl)优选地在100-300mM)，进一步超滤换液，直到达到恒定电导。Capto adhere层析柱用相同缓冲液平衡，随后将换液后的荚膜多糖溶液上Capto adhere层析柱，收集流穿液。上样完成后，用1-2个柱体积磷酸缓冲液，含相同盐离子浓度的缓冲液进一步洗涤，多糖在的流穿液和洗涤液中被回收。结合在Capto adhere层析柱上的蛋白、核酸以及多糖用0.1M乙酸洗脱下来。Captoadhere层析后回收的含有荚膜多糖溶液，经超滤换液调节(或不调节)溶液盐离子浓度后，接着继续上Hydroxyapatite层析柱，同样收集含多糖的流穿液。

使用分子截留为30kDa膜浓缩多糖溶液，然后用注射用水(WFI)超滤换液。将超滤后的多糖溶液通过0.2μm滤膜除菌过滤。取出部分样品用于测试，剩余多糖-20℃冷冻保藏。

制备肺炎链球菌荚膜多糖-载体蛋白结合物

氨基还原法制备多糖-蛋白结合物：将纯化的多糖溶解于水中至1–3mg/mL的浓度，将溶解的多糖经过其压力为100-1000bar的机械匀质机均质。在多糖分子量减小后，使用分子截留为30kDa滤膜，用注射用水超滤换液20个体积。接着在高碘酸钠存在下通过在22℃温育16-22小时进行氧化。使用分子截留为30kDa滤膜浓缩活化反应混合物，并用WFI超滤换液20个体积。用磷酸钾缓冲液，将溶液调整至pH 6.3–8.4，通过0.2μm滤器过滤活化多糖溶液。将活化多糖与载体蛋白(如CRM197)以2比1配料比混合，加入氰基硼氢化钠溶液达到2.0摩尔氰基硼氢化钠/摩尔糖类而起始结合反应，将反应混合物在20℃温育48–120小时。在结合反应温育结束后，用碳酸氢钠缓冲液或磷酸钾缓冲液将反应液调整pH至8–10。加入硼氢化钠溶液达到0.6摩尔硼氢化钠/摩尔糖类，将反应混合物温育60分钟封闭未反应醛基。将反应混合物在分子截留为30kDa滤膜上超滤，依次使用最低限度10体积的100mM磷酸钾、150mM氯化钠对反应混合液换液。将超滤换液后的多糖-蛋白结合物通过0.2μm滤器过滤除菌。

氰基活化法制备多糖-蛋白结合物：溶解肺炎链球菌多糖，调整pH值至10，按质量比为2mg CDAP/mg多糖加入CDAP乙腈溶液(浓度为100mg/ml)，维持pH值为10反应3分钟，将按蛋白质/多糖量比为2:1将纯化的载体蛋白加入至活化的多糖溶液中。调节反应液pH值特定值下偶联反应2小时，调节pH值至9.0，加入甘氨酸猝灭未反应的氰酸酯基团并终止偶联反应。超滤或透析获得多糖结合物。结合物经Sepharose 4FF层析纯化，获得多糖-蛋白结合物原液。

另外，CDAP活化的多糖也可经由接头(己二胺或己二酸二酰肼)基团与载体蛋白羧基偶联。如上，经CDAP活化的多糖中按蛋白质/多糖量比为2:1将纯化的载体蛋白加入至活化的多糖溶液中，接着加入ADH至终浓度0.2M，当ADH完全溶解时，将pH调节至7。然后加入EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺)，以达到0.02M终浓度，在调节pH至8，搅拌混合物1小时。通过于25℃增加pH至9.0达至少30分钟终止缩合反应。结合物经超滤浓缩换液、分子排阻层析等纯化步骤，获得多糖-蛋白结合物原液。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.16价肺炎链球菌结合疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物由分离纯化获得的肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白偶联结合后混合组成，所述荚膜多糖由以下16种肺炎链球菌血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、11A、14、15B、18C、19A、19F和23F组成。

2.根据权利要求1所述的16价肺炎链球菌结合疫苗组合物，其特征在于，所述载体蛋白为白喉杆菌类毒素、白喉杆菌无毒变异蛋白CRM197、破伤风类毒素蛋白及其变异体、流感嗜血杆菌D蛋白或其他药学可接受的载体。