CN110251667A - 一种免疫组合制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种免疫组合制剂及其制备方法与应用，其中，所述免疫组合制剂包括肺炎链球菌荚膜多糖‑CRM197蛋白缀合物和B型流感嗜血杆菌荚膜多糖‑CRM197蛋白缀合物，其中B型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CRM197蛋白质的质量比为(0.3‑1):1，B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的质量含量为10～15μg/剂。本发明的联合疫苗可有效诱导机体产生针对所选血清型的肺炎链球菌多糖以及B型流感嗜血杆菌荚膜糖的高滴度、特异性抗体；且各抗原成分之间无干扰，发明人通过对组合方式进行筛选达到了更高的免疫效果；其制成疫苗后可减少接种针次，简化免疫程序，并可有效预防人及动物因上述细菌所致的疾病。

Description

一种免疫组合制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种免疫组合制剂及其制备方法与应用，属于生物医药领域。

背景技术

一、肺炎链球菌及其流行病学

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是引发细菌感染性疾病的主要病原菌之一，可引起肺炎、脑膜炎、败血症、中耳炎等疾病，5％～10％健康成年人以及20％～40％儿童的鼻咽等呼吸道中携带此菌。该菌为革兰氏染色阳性，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株在其菌体外形成荚膜多糖，有毒株是引起人类疾病的重要病原菌。肺炎球菌寄居于正常人的鼻咽腔中，可引起细菌性大叶性肺炎、肺炎、支气管炎、脑膜炎、败血症、中耳炎等疾病，5％-10％健康成年人以及20％-40％儿童的鼻咽等呼吸道中携带此菌，据联合国统计，每年全球有超过一百万名两岁以下儿童死于肺炎链球菌引起的疾病。在我国，由肺炎链球菌引起的菌血症的死亡率约为25％～29％。3类人群特别容易受到侵袭：65岁以上的人群、 5岁以下儿童(特别是2岁以下的幼童)、高危族(如长期病患者)等。

当前由于肺炎链球菌对抗菌药物的抗药性增加，以及抗药菌株在世界范围的传播，因此除使用疫苗预防外，尚无其他有效的公共干预措施。但肺炎链球菌荚膜多糖为胸腺非依赖性抗原(Thymus independent antigen，TI-Ag)，抗体反应主要依赖于其重复单位组成的线性表位，在无T淋巴细胞辅助的情况下直接与B淋巴细胞表面的IgM受体交联，所诱导的抗体主要为IgM和IgG2，缺少较好的补体活化能力，抗体水平不能维持足够长的时间，且不能诱导免疫记忆，无法在2岁以下幼儿中产生免疫保护，而该年龄段人群是肺炎链球菌感染的高危人群。

荚膜多糖复杂的结构导致每一个血清型的免疫原性不同，无法产生有效的免疫应答。肺炎链球菌结合疫苗包括的血清型别多，各型别用于结合的特异性结构不同，导致其每个型别的结合方法相异。对荚膜多糖的修饰及与载体蛋白的结合要在保证荚膜多糖特异基团不丢失、抗原性和免疫原性不受影响的前提下进行，同时为了避免糖链的过度交联和结合物除菌过滤的要求，对荚膜多糖及结合物分子的大小应当有一定控制。已经发现的肺炎链球菌有90多个血清型，目前已上市的有23价肺炎链球菌多糖疫苗，以及10价与13价的肺炎链球菌多糖结合疫苗。但上市单苗是不够的，无法应对肺炎球菌感染与其他细菌感染的同时发生，针对儿童和老人这类易感人群，肺炎球菌不仅存在多种疾病的感染风险，还会增加其他细菌的感染风险。为了防治联合感染，一苗多用已经成为行业内的主要研究方向。

二、B型流感嗜血杆菌及其流行病学

流感嗜血杆菌中B型流感嗜血杆菌侵袭力最强的一个血清型，HIB(B型流感嗜血杆菌) 是儿童鼻咽部常见的共生细菌，可引起儿童肺炎和脑膜炎，在尚未开展大规模HIB疫苗接种的地区，HIB疾病是一个主要的公共卫生问题。每年至少有300万严重病例发生，约38.6万死亡。HIB发病与死亡多见于发展中国家，疾病负担在4-18月龄儿童最为严重，但小于3月龄和大于5岁儿童也偶有发病。在未免疫人群，HIB是1岁以内儿童非流行性细菌性脑膜炎的主要病因。即便及时给予足量的抗生素治疗，3-20％的HIB脑膜炎患者仍会死亡。细菌荚膜多糖是HIB的主要毒力因子之一，其主要成分是PRP。PRP具有抗原性，能在Hib感染和克隆过程中提供生存优势，抵抗补体介导的吞噬作用，抑制血清杀菌活性，逃脱鼻粘膜免疫，促进细菌在人群中的传播，在人体中诱发保护性免疫力，在较大儿童和成人中可诱导产生很高的杀菌抗体。但PRP是一种非胸腺依赖性抗原，虽然可以产生较弱的IgM型抗体但不产生免疫记忆。18月龄以下的婴儿，其B淋巴细胞尚未成熟不能产生自我保护能力因而无法受到保护。

对HIB感染最有效的预防措施是肌肉注射HIB偶联菌苗，可大大降低肺炎及脑膜炎的发病几率。HIB荚膜多糖虽然有一定的免疫原性，但由于儿童免疫系统发育不健全，对多糖的免疫应答较弱，因此，需将HIB荚膜多糖与载体蛋白进行缀合后免疫，激发婴幼儿体内的 TD免疫途径，以增强婴幼儿对多糖的免疫应答。目前国内上市的HIB疫苗多为HIB荚膜多糖与TT的缀合疫苗。

三、载体蛋白

多糖蛋白结合疫苗的研究重点是选择安全有效的蛋白质作为载体，这种蛋白质必须对人体没有毒性，也不会引起变态反应，同时又能增强多糖的免疫原性。目前，应用于结合疫苗的蛋白质载体主要有四种：破伤风类毒素(TTd)，白喉类毒素(DTd)，白喉毒素的无毒变异体(CRM197)和B群脑膜炎球菌外膜蛋白复合体(OMPC)。

类毒素作为载体可诱导产生全身及局部免疫反应，具有粘膜佐剂作用，但具有局限性。因为，用福尔马林或戊二醛脱毒的类毒素，会改变其自身的蛋白结构，可能破坏了重要的T 细胞抗原位点，会影响其免疫原性。而且，体内存在的类毒素抗体可能影响结合疫苗的免疫应答。使用无毒的毒素就可以避免这些问题。目前研究的最多的蛋白载体是白喉毒素的无毒突变体(CRM197)。

CRM197(cross reacting material 197)是白喉毒素的一种突变体，它的第52位氨基酸由Gly 突变为Glu，致使白喉毒素酶活性位点发生改变，从而不能对细胞产生毒性作用。虽然丧失酶活性及毒性，但在抗原性和免疫原性上CRM197仍与天然的自喉毒素保存一致。

目前国内以CRM197作为载体的结合疫苗有B型流感嗜血杆菌(HIB)结合疫苗(HBOC)， 7价肺炎球菌结合疫苗(PCV，Prevnar)，C群脑膜炎球菌结合疫苗，A+C群脑膜炎球菌结合疫苗，这些结合疫苗与多糖疫苗相比具有优势，能够在成人，儿童和小于2岁的儿童中诱导特异性免疫应答，且可以持续较长时间。而且以CRM197为抗原成分的自喉疫苗也在研制中。

四、联合疫苗的制备

随着疫苗种类增多，儿童接种疫苗剂次的增加，不但增加服务的成本，且还会增加疑似预防接种异常反应的风险。国家药管局已在2010年批准DTaP-IPV/Hib五价联苗在中国上市。国内外数据均显示其具有良好的免疫效果和安全性，有望代替不同疫苗分次免疫接种。

为了针对已有的联合感染的需要，目前在研发的联合疫苗主要有两个方向，一个是单苗的临用前混合，获得免疫组合制剂；另一种是从分子水平进行抗原本身的修饰重组，形成新的抗原或者抗原抗体复合物。联合疫苗的制备并不是各种不同抗原成分的简单混合，联合疫苗中各种成分之间所发生的化学或物理相互作用会导致各类抗原免疫原性发生变化，因此在制备过程中需要解决以下问题：(1)是否会影响各种抗原的免疫原应答效果；(2) 不同抗原间是否存在不相容性或相互干扰；(3)不同抗原成分之间是否会发生拮抗效应；(4) 疫苗中各种抗原的用量及混合比例是否恰当。将多种抗原联合于同一剂疫苗中，各种组成成分疫苗的安全性和免疫原性不会明显降低，而且在一些情况下，必须维持其效力。

随着联合疫苗研究的深入，联合疫苗的安全性在临床阶段受到了较多的关注，分子水平改造的联合疫苗在安全性方面需要更全面的检验和更长的检验周期，因此目前还没有获批上市的品种。但市场对于联合免疫的疫苗具有较大需求，以单苗混合的方式进行免疫具有安全性高、验证周期短，制备成本低的优势，因此在安全可靠的重组抗原疫苗上市之前，单苗混合方式的组合疫苗具有十分良好的市场前景。多价肺炎链球菌多糖结合疫苗与HIB 结合疫苗同作为针对婴幼儿免疫的疫苗，有广泛的受种人群，且接种群的年龄较相似。该两种疫苗均为多剂免疫，受种人群需要多次接种，费时费力。将二者制成联合疫苗，在不降低二者免疫效果的同时节省受种次数，节约时间和人力资源。目前并无相关产品上市，但已有一些文献报道，如CN103623401A公开了一种多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物及其制备方法，公开了含有肺炎球菌多糖的免疫组合物，但其仅限于肺炎球菌疫苗与蛋白的结合，未给出具体的联合疫苗实例；如CN101112619A公开了一种疫苗组合物，该疫苗组合物中公开了包含肺炎球菌多糖和HIB多糖，实施例4公开了Hib-11价肺炎球菌缀合 (Hib/Strep11V)疫苗的制备方法，但其采用的方法是常规方法，并未对各疫苗的组分配比和工艺方法进行限定，如CN106109486A中报道了13价多价肺炎链球菌多糖结合疫苗与HIB结合疫苗的联苗，该专利中报道的联苗即为单苗的临用混合，但申请人在按照其公开的内容实施的时候发现，该专利中给出的技术方案存在以下问题：一、配比范围过大，单苗取极值时的免疫效果较差，且容易引起不良反应；二、现有的b型流感嗜血杆菌的菌种在制备荚膜糖抗原时，通过申请人研究的不断推进我们发现，荚膜糖的聚合度对免疫效果具有一定的影响，并且二者之间的相关性可以确定，聚合度在一定情况下制作联合疫苗具有更好的免疫效果。故为了获得效价更稳定、免疫效果更好的联合疫苗，仍需对肺炎链球菌多糖结合疫苗与HIB结合疫苗的联苗进行开发。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种免疫组合制剂及其制备方法与应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的免疫组合制剂及其制备方法与应用的技术方案如下：

本发明提供了一种免疫组合制剂，所述免疫组合制剂包括肺炎链球菌荚膜多糖 -CRM197蛋白缀合物和B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物，其中B型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CRM197蛋白质的质量比为(0.3-1):1，B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的质量含量为10～15μg/剂。

在一种HIB多糖-CRM197蛋白缀合物中，所述CRM197蛋白与多糖结合时为 CRM197-ADH衍生物，所述B型流感嗜血杆菌多糖与蛋白结合是经过1-氰基-4-二甲氨基- 吡啶四氟硼酸活化(CDAP)的HIB多糖。在另一种情况下，HIB多糖活化后与CRM197 蛋白加入EDAC反应。由实施例的实验数据可知，CRM197-ADH衍生物制备的HIB多糖 -CRM197蛋白缀合物的结合效果优于EDAC加入反应的抗体水平。优选的，B型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CRM197蛋白质的质量比为(0.3-0.7):1，更进一步地，B型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CRM197蛋白质的质量比优选为0.4:1-0.6:1。

根据常规的生物学理论，抗原含量与抗体水平成正比，但在实验过程中发现当HIB多糖与CRM197蛋白质的质量比处于范围中段时抗体水平远高于抗原含量最大值时的抗体水平，并且数据差异显著，说明质量比含量在范围中段时有更优异的免疫效果。但产生该现象的原因，需要进一步验证。目前的HIB多糖与CRM197的质量比最佳比例为0.54:1。

所述免疫组合制剂中，所述肺炎链球菌选自下述13种血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；其中，血清型6B荚膜糖的质量含量为3.6～5.2μg/ 剂，其它血清型肺炎链球菌荚膜多糖的质量含量为1.8～2.6μg/剂。

优选的，血清型6B荚膜糖的质量含量优选为4～4.8μg/剂，更优选4.4μg/剂，其它血清型肺炎链球菌荚膜多糖的质量含量优选为2～2.4μg/剂，更优选2.2μg/剂；B型流感嗜血杆菌荚膜糖的质量含量优选为10μg/剂。

作为一种优选的实施方式，其它血清型肺炎链球菌荚膜多糖的质量含量在2μg/剂时，仍维持正常的免疫效果，这一点与常规的2.2μg/剂相比，有一定的剂量突破。

进一步地，免疫组合制剂的单个血清型肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物中，各个血清型肺炎链球菌荚膜多糖与CRM197载体蛋白的质量比优选为1:3-3:1，较优选1:2-2:1(例如1:1)。

可理解为，本发明所述的免疫组合制剂中，免疫活性成分为所述13价肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物和所述B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物。

所述的免疫组合制剂中，还可包含适用的赋形剂和/或佐剂。所述的佐剂优选为铝佐剂，例如磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝中的一种或多种；所述铝佐剂的铝元素的含量优选为0.28mg ±30％/剂(如0.0.28mg±20％/剂，又如0.28mg mg±10％/剂)；作为优选所述铝佐剂为1.25mg ±30％/剂(如1.25mg±20％/剂，又如1.25mg±10％/剂)的磷酸铝佐剂。

本发明一个优选的实例中，将每个血清型的肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物以及B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物分别吸附于铝佐剂后，再混合得到所述的免疫组合制剂；其中肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物共吸附于0.125mg±30％ (如0.125mg±20％，又如0.125mg±10％)元素铝佐剂/每剂，更优选地吸附于0.56mg±30％ (如0.56mg±20％，又如0.56mg±10％)磷酸铝佐剂/每剂；B型流感嗜血杆菌荚膜多糖 -CRM197蛋白缀合物吸附于0.3mg±30％(如0.3mg±20％，又如0.3mg±10％)元素铝佐剂/每剂，更优选地吸附于1.36mg±30％(如1.36mg±20％，又如1.36mg±10％)磷酸铝佐剂/每剂。

作为一种优选的实施方式，13价肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物共吸附于 0.125mg±30％元素铝佐剂/每剂；B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物吸附于 0.3mg±30％元素铝佐剂/每剂。

本发明的免疫组合制剂可为液体制剂。当为液体制剂时，所述的免疫组合制剂还可进一步包含赋形剂，所述赋形剂可为氯化钠和缓冲剂，所述缓冲剂可为磷酸盐缓冲剂或琥珀酸钠缓冲剂。

所述免疫组合制剂还包含一种或者多种选自如下所示血清型肺炎链球菌荚膜多糖蛋白缀合物；2、6C、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、10A、10B、10C、10F、11A、11B、11C、 11D、11F、12A、12B、12F、13、15A、15B、15C、15F、16A、16F、17A、17F、18A、 18B、18F、19B、19C、20、21、22A、22F、23A、23B、24A、24B、24F、25A、25F、27、 28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、35B、35C、36、 37、38、39、40、41、41F、42、43、44、45、46、47A、47F和/或48。

优选的，所述的免疫原性组合制剂还包含一种或者多种选自如下所示血清型肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物：8、10A、11A、12F、15B、22F和/或33F。血清型8、10A、11A、12F、15B、22F或33F肺炎链球菌荚膜多糖的质量含量为1.8～2.6μg/剂，优选的为 2～2.4μg/剂，更优选2.2μg/剂。

所述的免疫组合制剂，优选地为单剂0.5ml剂量。

作为本发明一个优选的实施例，本发明所述的组合制剂是0.5ml单剂量，其含有血清型 6B荚膜糖的质量含量为4.4μg，其它血清型肺炎链球菌荚膜多糖的质量含量为2.2μg；B 型流感嗜血杆菌荚膜多糖的质量含量为10μg，0.28mg元素铝佐剂；以及氯化钠，磷酸盐缓冲剂或琥珀酸钠缓冲剂。

本发明所述的免疫组合制剂中，所述的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物由下述方法制备：B型流感嗜血杆菌荚膜多糖经CDAP活化后，与CRM197-ADH(己二酰肼)衍生物进行结合反应，得到B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物。

作为本发明的一个实施方式，CDAP活化B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的步骤中：B型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CDAP的质量比可为1:1～2:1，再进一步可为1.5:1；B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的浓度可为5～20mg/ml，进一步可为10mg/ml；PH可为9-9.5，进一步可为9.2；可以使用NaOH调节PH，进一步可使用0.3M的NaOH溶液；室温反应约1～5min；具体可包括如下步骤；将B型流感嗜血杆菌荚膜多糖溶于超纯水或注射用水中，调节PH，后加入CDAP，室温反应。

作为本发明的一个实施方式，CRM197-ADH衍生物的制备：CRM197蛋白浓度可为 2～8mg/ml，进一步可为5mg/ml，溶剂为PBS；ADH浓度可为80～200mg/ml，进一步可为 100mg/ml，溶剂为碳酸氢钠水溶液，进一步为0.2M碳酸氢钠水溶液；CRM197与ADH的质量比为1:3～1:10。具体可包括如下步骤；CRM197与ADH混合后加入EDAC反应，即可。EDAC用量一般为加至其终浓度为0.1mol/L。反应结束后还可以采用pH7.0左右的磷酸盐缓冲液超滤透析得到CRM197-ADH衍生物。

作为本发明的一个实施方式，活化的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CRM197-ADH衍生物的反应中；活化多糖与CRM197-ADH衍生物的投料质量比可为1:1；PH可为9-9.5，进一步可为9.2；结合后可加入甘氨酸淬灭反应；进一步地甘氨酸用量与CDAP质量比可为 1:1；淬灭反应的PH可为9.2。反应结束后还可进一步采用超滤透析和凝胶层析纯化去除游离蛋白、游离多糖和反应化学试剂，经0.2μm滤器除菌过滤，即可得到所述的B型流感嗜血杆菌多糖蛋白缀合物原液。

本发明的另一方面提供一种制备如上所述的免疫组合制剂的方法，包括步骤：将各血清型的肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物混合后与B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物混合，即可；优选包括步骤：(1)将各血清型的肺炎链球菌荚膜多糖 -CRM197蛋白缀合物分别与铝佐剂吸附后混合；(2)将B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197 蛋白缀合物与铝佐剂吸附后与步骤(1)制得的混合物混合。所述肺炎链球菌荚膜多糖 -CRM197蛋白缀合物，以及B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物的缀合方法可以参照本领域常规方法进行合成。

本发明还提供了一种如上所述的免疫组合制剂在制备用于治疗或预防由B型流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染引起的疾病的药物中的应用。优选地，所述的免疫组合制剂在制备预防B型流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的疫苗中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种药盒，所述药盒含有第一容器和第二容器；使用时第一容器与第二容器临用混合，其中，第一容器中含有如上所述的肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197 蛋白缀合物；第二容器中含有如上所述的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物；所述药盒在使用时将第一容器与第二容器中的物质混合后给药。

优选地，所述药盒含有第一容器和第二容器；其中，

第一容器中含有肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物，所述肺炎链球菌选自下述 13种不同的血清型：1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，其中，血清型6B荚膜糖的质量含量为3.6～5.2μg/剂，其它血清型肺炎链球菌荚膜多糖的质量含量为1.8～2.6μg/剂；

第二容器中含有B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物，B型流感嗜血杆菌荚膜糖的质量含量为10～15μg/剂；

所述药盒在使用时将第一容器与第二容器中的物质混合后给药。

所述药盒中，血清型6B荚膜糖的质量含量优选为4～4.8μg/剂，更优选4.4μg/剂，其它血清型肺炎链球菌荚膜多糖的质量含量优选为2～2.4μg/剂，更优选2.2μg/剂；B型流感嗜血杆菌荚膜糖的质量含量优选为10μg/剂。

进一步地，所述药盒中，所述单个血清型肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物中，各个血清型肺炎链球菌荚膜多糖与CRM197载体蛋白的质量比优选为1:3-3:1，较优选1:2-2:1(例如1:1)。所述B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物中，B型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CRM197蛋白质的质量比为(0.5～1):1。

进一步地，所述第一容器，还可进一步包含一种或者多种选自如下所示血清型肺炎链球菌荚膜多糖蛋白缀合物；2、6C、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、10A、10B、10C、10F、 11A、11B、11C、11D、11F、12A、12B、12F、13、15A、15B、15C、15F、16A、16F、 17A、17F、18A、18B、18F、19B、19C、20、21、22A、22F、23A、23B、24A、24B、24F、 25A、25F、27、28A、28F、29、31、32A、32F、33A、33B、33C、33D、33F、34、35A、 35B、35C、36、37、38、39、40、41、41F、42、43、44、45、46、47A、47F和48。

作为本发明一优选的实施例，所述第一容器还可包含一种或者多种选自如下所示血清型肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物：8、10A、11A、12F、15B、22F和33F。血清型8、10A、11A、12F、15B、22F或33F肺炎链球菌荚膜多糖的质量含量可为1.8～2.6μg/ 剂，进一步可为2～2.4μg/剂，更进一步可为2.2μg/剂。可理解为，所述第一容器中的免疫活性成分为所述肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物。所述第一容器中还可包含适用的赋形剂和佐剂，所述的佐剂优选为铝佐剂，例如磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝中的一种或多种。本发明一个优选的实例中，所述肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物共吸附于 0.125mg±30％(如0.125mg±20％，又如0.125mg±10％)元素铝佐剂/每剂，更优选地吸附于0.56mg±30％(如0.56mg±20％，又如0.56mg±10％)磷酸铝佐剂/每剂。

可理解为，所述第二容器中的免疫活性成分为所述B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197 蛋白缀合物。所述第二容器中还可包含适用的赋形剂和佐剂所述的佐剂优选为铝佐剂，例如磷酸铝、硫酸铝和氢氧化铝中的一种或多种。本发明一个优选的实例中，B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物吸附于0.3mg±30％(如0.3mg±20％，又如0.3mg±10％) 元素铝佐剂/每剂，更优选地为吸附于1.36mg±30％(如1.36mg±20％，又如1.36mg±10％) 磷酸铝佐剂/每剂。

所述第一容器与第二容器可独自地为液体制剂。当为液体制剂时，所述的免疫组合制剂还可进一步包含赋形剂，所述赋形剂为氯化钠和缓冲剂，所述缓冲剂可为磷酸盐缓冲剂或琥珀酸钠缓冲剂。

本发明所述第一容器的制备方法如下：将各血清型的肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物混合即可，优选地，将各血清型的肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物分别与铝佐剂吸附后，再混合。所述药盒中，所述肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物，以及B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物的缀合方法可以参照本领域常规方法进行合成。

本发明还提供了一种如上所述的药盒在制备用于治疗或预防由B型流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染引起的疾病的药物中的应用。优选地，所述的药盒在制备预防B型流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的疫苗中的应用。

本发明中，术语B型流感嗜血杆菌荚膜多糖是指聚合度为10～35的B型流感嗜血杆菌荚膜糖；其可通过下述方式制备：B型流感嗜血杆菌通过发酵、纯化获得天然的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖，然后通过酸水解等方式切断天然多糖获得的B型流感嗜血杆菌寡糖。

本发明的所述的免疫组合制剂或药盒可用于预防或者治疗由于肺炎链球菌或B型流感嗜血杆菌感染引发肺炎或脑膜炎的病人，疫苗可以通过肌肉、皮下、皮内途径注射或经过粘膜给药，适于接种人和动物。

本发明提供的免疫组合制剂或药盒，具有针对所选血清型的肺炎链球菌及B型流感嗜血杆菌侵袭的多重免疫原性和保护性能，覆盖范围广，理化性质稳定。效果实验表明，本发明的联合疫苗可有效诱导机体产生针对所选血清型的肺炎链球菌多糖以及B型流感嗜血杆菌荚膜糖的高滴度、特异性抗体；且各抗原成分之间无干扰，发明人通过对组合方式进行筛选达到了更高的免疫效果；其制成疫苗后可减少接种针次，简化免疫程序，并可有效预防人及动物因上述细菌所致的疾病。

另外，本发明采的CDAP作为活化试剂避免使用了对人和环境危害较大的溴化氢作为活化试剂提高了安全性。进一步，采取了活化的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CRM197-ADH衍生物进行反应，进一步提高了HIB多糖蛋白的免疫活性。

本发明中对于各组分的深入研究和细化，为该免疫组合制剂的进一步产业化奠定了坚实的理论基础。其中对比肺炎链球菌多糖含量的减量、HIB多糖与CRM197载体蛋白质量比的新发现，对于组合制剂的深入研究具有十分重要的意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的免疫组合制剂及其制备方法与应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。

实施例1肺炎链球菌荚膜多糖原液制备

1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F、8、10A、11A、12F、 15B、22F、33F血清型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)菌株来源于中国药品生物制品检定所与丹麦血清研究所(SSI)。将上述菌种进行传代建立原始种子库、主种子库和工作种子库，代次分别为：原始种子批为第1代，主种子批为第4代，工作种子批为第8代。工作种子批启开后至接种发酵罐培养，传代应不超过10代。每代种子采用奶粉做冻干保护剂，冻干保藏。取工作种子在大豆蛋白胨固体培养基划线挑取菌种，接种于5ml的液体综合培养基，35℃培养后，转种到200ml的培养液后经过培养再扩增至2L培养液和30L培养液。于对数生长期的后期或静止期的前期中止培养，取样进行纯菌检查，在收获的培养液中加入福尔马林溶液杀菌两小时后再加入适量的去氧胆酸钠至终浓度为0.3％搅拌两小时以裂解细菌并释放荚膜多糖。将已裂解的培养液离心后收集上清液，上清液用100KD截留分子量的超滤膜包超滤浓缩10倍。

用pH 7.0左右的磷酸盐缓冲液对超滤液进行超滤换液，然后加入无水乙醇，使乙醇终浓度为30％，充分搅拌后离心去除核酸。

向上清中加入乙醇使其终浓度达到70％，搅拌后，离心，去除上清收集沉淀。

加水溶解沉淀，加入2倍溶液体积的苯酚进行多次抽提，去除蛋白。

向上清中加入乙醇，使其终浓度达到55％，离心后收集沉淀，将沉淀采用注射水复溶，经过0.22μm的无菌滤器除菌过滤后，获得1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、 19F、23F、8、10A、11A、12F、15B、22F、33F血清型的肺炎链球菌荚膜多糖原液。

实施例2多价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的制备

分别向实施例1中制备的肺炎链球菌荚膜多糖原液中加入1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(CDAP)活化多糖，活化完成后按照多糖：蛋白质＝1:1的重量比加入纯化后的白喉类毒素CRM197蛋白质进行结合，结合后加入甘氨酸终止结合反应，制备肺炎链球菌荚膜多糖结合物，结合物采用超滤透析，去除未结合的蛋白质和多糖，纯化后采用0.2μm的滤器除菌过滤，得到肺炎链球菌荚膜多糖-蛋白质单价缀合物。

实施例3多价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物铝吸附

将实施例2中得到的纯化后的血清型的肺炎链球菌荚膜多糖蛋白缀合物分别与0.5mg/ml的磷酸铝佐剂吸附，再将吸附完成的单价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物混合，使6B型多糖含量为8.8μg/ml，其余各血清型多糖含量均为4.4μg/ml，铝元素终浓度为0.5mg/ml。

实施例4 B型流感嗜血杆菌的培养和多糖纯化

B型流感嗜血杆菌菌种来源于中国医学菌种保藏中心(菌号：CMCC 58534)，工作种子在Hib综合培养基上扩增、培养、热灭活后离心收集上清，上清液用100KD截留分子量的超滤膜包浓缩超滤。

用pH7.0左右的磷酸盐缓冲液对超滤液进行超滤换液，然后加入无水乙醇，使乙醇终浓度为30％，充分搅拌后离心去除核酸。

向上清中加入乙醇使其终浓度达到70％，搅拌后离心，收集沉淀。

沉淀经注射用水复溶后，加入2倍溶液体积的苯酚抽提4～6次，去除蛋白。

向苯酚抽提液中加入乙醇，使其终浓度达到65～75％，离心后收集沉淀，将沉淀采用注射水复溶，经过0.22μm的无菌滤器除菌过滤后，获得B型流感嗜血杆菌荚膜多糖原液。

实施例5 B型流感嗜血杆菌多糖蛋白物的制备

步骤A：CRM197衍生物制备

CRM197蛋白(浓度10mg/ml，溶剂：PBS)与己二酰肼(100mg/ml，溶剂：碳酸氢钠水溶液)混合，CRM197蛋白与己二酰肼投料质量为1:10；加入EDAC(1mol/L，溶剂：水)至其终浓度分别为0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L，分别在室温反应2小时，各反应物均以pH7.0左右的磷酸盐缓冲液超滤透析后即得CRM197蛋白衍生物，标记为5a、5b、5c，衍生率测定结果见表1。

表1蛋白衍生率的测定

实施例	5a	5b	5c
				衍生率(W/W％)	1.24％	2.81％	5.44％

步骤B：B型流感嗜血杆菌多糖活化与结合反应

按照B型流感嗜血杆菌多糖与CDAP质量比为1:0.75向B型流感嗜血杆菌多糖溶液(多糖浓度为10mg/ml)中加入CDAP，控制PH为9.2，室温反应约2分钟。按B型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CRM197-ADH衍生物质量比1:1的进行结合反应，PH为9～9.5，反应3小时加入甘氨酸(甘氨酸与CDAP的质量比为1:1)终止结合反应，结合物经超滤透析和凝胶层析纯化去除游离蛋白、游离多糖和反应化学试剂，经0.2μm滤器除菌过滤，即为B型流感嗜血杆菌蛋白缀合物原液。分别将步骤A中获得的CRM197蛋白衍生物与B型流感嗜血杆菌多糖按上述描述制备得到的B型流感嗜血杆菌多糖蛋白缀合物原液编号为实施例5A、实施例5B、实施例5C。

实施例6 B型流感嗜血杆菌多糖蛋白物的制备

步骤A B型流感嗜血杆菌多糖衍生物制备

B型流感嗜血杆菌多糖活化方式同实施例5；活化后的B型流感嗜血杆菌多糖与己二酰肼等体积混合，多糖与己二酰肼的质量比为1:10，室温反应2小时，pH7.0左右的磷酸盐缓冲液超滤透析后即得多糖衍生物，衍生率测定结果见表2。

步骤B结合反应

向多糖衍生物与CRM197蛋白(多糖衍生物与CRM197蛋白的投料质量比同实施例5)混合溶液中加入EDAC至其终浓度为0.1mol/L，室温反应2～4小时，再经超滤透析和凝胶层析纯化去除游离蛋白、游离多糖和反应化学试剂，经0.2μm滤器除菌过滤，即为B型流感嗜血杆菌蛋白缀合物原液。

实施例7以CN 106109486A公开的内容结合本领域公知的HIB多糖制备方法，制得该文件中公开的HIB多糖缀合物，其多糖衍生物衍生率测定结果见表2。并对实施例5、实施例6、实施例7制备缀合物进行多糖蛋白缀合物表征测试，测试结果如下表3：

表2多糖衍生率的测定

实施例	6	7
			衍生率(W/W％)	3.12％	2.89％

表3蛋白缀合物表征测试

实施例	5A	5B	5C	6	7
						多糖/蛋白比	0.86	0.54	0.34	0.58	0.64
游离多糖含量	6％	1％	0％	13％	15％
						经CL-4B测得结合物Kd值	0.08	0.01	0.00	0.16	0.18

表3检测结果显示，实施例5样品(5A、5B、5C)的分子量较大，同时游离多糖含量明显低于实施例6和实施例7制备的缀合物。

实施例8流感嗜血杆菌寡糖蛋白缀合物铝吸附

分别将实施例5A、5B、5C和实施例6获得的纯化后的B型流感嗜血杆菌荚膜蛋白缀合物原液与磷酸铝佐剂吸附，使含B型流感嗜血杆菌荚膜多糖含量为20μg/ml，磷酸铝佐剂终浓度为2.72mg/ml。

实施例9 Hib多糖蛋白缀合物免疫原性测试

免疫14-18g的NIH小鼠，每组10只，每组分别皮下注射实施例7和实施例8所述的吸附结合疫苗，阴性对照组注射0.5ml无菌生理盐水，每2周免疫1次，每次0.5ml，共3 次。第6周采血，以公司自制阳性血清(100EU)为标准品，采用ELISA方法检测各小鼠血清中IgG的含量，检测结果如表4所示：

表4抗体水平(GM，95％CI)

表4中的数据显示各组样品均能在小鼠上产生免疫记忆。各组数据统计分析结果显示， 5B组与5A组相比具有显著统计学差异(p<0.05)，5B组与5C组、6组、7组相比具极显著统计学差异(p<0.01)，5A组与5C组、6组、7组相比具有显著统计学差异(p<0.05)， 5C组、6组、7组间比较差异不显著(p>0.05)。根据常规的生物学理论，抗原含量与抗体水平成正比，但在实验过程中发现当HIB多糖与CRM197蛋白质的质量比处于范围中段时抗体水平远高于抗原含量最大值时的抗体水平，并且数据差异显著，说明质量比在范围中段时有更优异的免疫效果。但产生该现象的原因，需要进一步验证。目前的免疫组合制剂后续检测以5B组配比(即HIB多糖与CRM197蛋白质的质量比为0.54:1)进行。

实施例10联苗免疫原性测试

将实施例2、实施例5B、实施例7中制得的缀合物原液分别经铝佐剂吸附，按表5含量要求进行混合，获得联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。共设有A-D共4组，组A、C、D采用实施例2与实施例5B的混合液，组B采用实施例2与实施例7的混合液。

各组联合疫苗组合物分别免疫14-18g的NIH小鼠，每组10只，每组分别皮下注射，阴性对照组注射0.5ml无菌生理盐水，每2周免疫1次，每次0.5ml，共3次。第6周采血， Hib抗体以公司自制阳性血清(100EU)为标准品，采用ELISA方法检测各小鼠血清中抗各型别多糖IgG的含量，肺炎各型多糖抗体检测以GMT评价。Hib抗体水平结果如表6所示，肺炎各型别多糖抗体GMT结果对数值见表7。

表5联合疫苗组合物中的抗原含量

表6 Hib抗体水平(GM，95％CI)

表6数据显示各组动物经联合疫苗免疫后均产生高水平抗体，A、B、C、D组数据统计分析结果显示，A组与B组相比具极显著统计学差异(p<0.01)，A组与C组、A组与D组比较具显著统计学差异(p<0.05)，B组与C组、B组与D组比较具显著统计学差异(p<0.05)， C组和D组间比较差异不显著(p>0.05)。

表7肺炎多糖抗体水平(GMT，95％CI)

表7中的数据说明，各组动物经联合疫苗免疫后均针对免疫抗原产生阳转，同时各组各型别滴度相当。综合表6数据显示，本公司制备的含Hib荚膜糖5μg/剂，肺炎13个型别多糖2μg/剂的联合疫苗在动物模型上与市售剂量相比，可达到相同的效果。同时本公司制备在此基础上设计的20价肺炎+Hib联合疫苗在动物模型上亦能产生良好的免疫效果。该剂量相比于常规的含Hib荚膜糖10μg/剂，肺炎13个型别多糖2.2μg/剂，也具有一定的经济价值和科研价值。为进一步降低减少多糖剂量起到了一定的启发作用。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种免疫组合制剂，其特征在于：所述免疫组合制剂包括肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物和B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物，其中B型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CRM197蛋白质的质量比为(0.3-1):1，B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的质量含量为10～15μg/剂。

2.根据权利要求1所述的免疫组合制剂，其特征在于：所述CRM197蛋白与多糖结合时为CRM197-ADH衍生物。

3.根据权利要求1所述的免疫组合制剂，其特征在于：所述B型流感嗜血杆菌多糖与蛋白结合是经过1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸活化的HIB多糖。

4.根据权利要求1所述的免疫组合制剂，其特征在于：B型流感嗜血杆菌荚膜多糖与CRM197蛋白质的质量比为(0.4-0.7):1。

5.根据权利要求1所述的免疫组合制剂，其特征在于：免疫组合制剂的单个血清型肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物中，各个血清型肺炎链球菌荚膜多糖与CRM197载体蛋白的质量比优选为1:3-3:1。

6.根据权利要求1所述的免疫组合制剂，其特征在于：所述的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物由下述方法制备：B型流感嗜血杆菌荚膜多糖经CDAP活化后，与CRM197-ADH衍生物进行结合反应，得到B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物。

7.根据权利要求6所述的免疫组合制剂，其特征在于：CRM197-ADH衍生物的制备中：CRM197蛋白浓度为2～8mg/ml，溶剂为PBS；ADH浓度为80～200mg/ml，溶剂为碳酸氢钠水溶液。

8.一种根据权利要求1～7任一项所述的免疫组合制剂的制备方法，其特征在于，将各血清型的肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物混合后，再与B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物混合。

9.根据权利要求8所述的免疫组合制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)将各血清型的肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物分别与铝佐剂吸附后混合；(2)将B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物与铝佐剂吸附后与步骤(1)制得的混合物混合。

10.一种药盒，其特征在于，所述药盒含有第一容器和第二容器；使用时第一容器与第二容器临用混合，其中，

第一容器中含有如权利要求1-7任一项所述的肺炎链球菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物；第二容器中含有如权利要求1-7任一项所述的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖-CRM197蛋白缀合物；所述药盒在使用时将第一容器与第二容器中的物质混合后给药。