TR201811681T4 - İmmünojenik bileşimler. - Google Patents

Abstract

Bu buluş, aşağıda belirtilenleri içeren bir immünojenik bileşim ortaya koyar: a) taşıyıcı proteine konjuge GBS serotipi Ia'ya ilişkin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; b) taşıyıcı proteine konjuge GBS serotipi Ib'ye ilişkin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; ve c) taşıyıcı proteine konjuge GBS serotipi III'e ilişkin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat. Bu buluş, ayrıca, bir difteri toksoidi veya onun bir derivatı ile önceden immünize edilmiş olan bir hastayı GBS kaynaklı enfeksiyona karşı immünize etmek için olan ve hastaya bir difteri toksoidine veya onun derivatına konjuge bir GBS kapsüler sakkaridi olan bir konjugatın uygulandığı bir basamak ihtiva eden bir yöntem de ortaya koyar.

Description

TEKNIK ALAN Bu bulus, Streptococcus agalactiae kapsüler sakkaritleri ile tasiyici proteinlerden olusan konjugatlarin yer aldigi immünojenik bilesiinler ile ilgilidir. Bahsi geçen bilesimler, immünizasyon için faydalidirlar.

ARKA PLAN TEKNIGI Bakterilerin kapsüler sakkaritleri, kapsüllü bakterilere karsi asilarda yillarca kullanilmislardir. Ancak sakkaritler T-bagimsiz antijenler olduklari için, immünojenisiteleri zayiftir. Bunlarin bir tasiyiciya konjuge edilerek kullanilmalari, T-bagimsiz antijenlerin T-bagimli antijenlere dönüsmesini ve böylelikle hafiza cevaplarinin kuvvetlenmesini ve koruyucu immünitenin gelismesini saglayabilir.

Dolayisiyla en etkili sakkarit asilar glikokonjugatlara dayanan asilardir ve bu bilgi isiginda hazirlanan prototip konjugat asi, Haemophilus influenzae tip b'ye ('Hib') karsi gelistirilen asi olmustur Stereptococcus agalactiae bakterisi, konjugat asi gelistirme çalismalarina konu olan bir diger bakteridir. Bu alandaki çalismalarin birçogu Dennis Kasper ve arkadaslari tarafindan gerçeklestirilmistir ve referanslar 1 ilâ 9'un 'örnek gösterilebilecegi çesitli eserlerde açiklanmaktadir. GBS serotipleri Ia, Ib, II, III ve V'e karsi gelistirilen konjugat asilarin hepsinin insanlarda güvenli ve immünojenik oldugu ortaya konmustur [10]. Lancaster ve arkadaslari [283], GBS serotipleri farelerde test ve deneyler gerçeklestirmislerdir. Paoletti ve arkadaslari Ve oiilara konjuge tetanos toksoidini içeren bir tetravalent bilesiin ortaya koymuslardir. Tüm bu çalismalarin fayda getirdigi açik olmakla birlikte, daha gelismis baska GBS konjugat asilarina hâlâ ihtiyaç duyulmaktadir.

BULUSUN AÇIKLAMASI Bulusun ilk özelligine göre, bu bulus, (a) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ia'ya iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; (b) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ib'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; ve (o) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi III'e iliskin bir kapsüler polisakkarit olan bir konjugat içeren ve (i) içerdigi her GBS kapsüler sakkaridi birim doz basina yaklasik 5 ug, 10 ug veya 20 ug'ye denk bir miktarda bulunan, (ii) yukaridaki (a), (b) ve (c) kalemlerinde bahsi geçen tasiyici protein difteri toksoidi veya CRM197 olan ve (iii) bir alüminyum tuzu adjuvani ihtiva etmeyen bir immünojenik bilesim ortaya koyar. Bu tarz bilesimler, bahsi geçen GBS serotiplerinden kaynaklanabilecek enfeksiyonlari önlemeye yönelik asilar olarak kullanilabilirler.

Bulusuii ikinci özelligine göre, bu bulus, bir hastayi GBS kaynakli enfeksiyona karsi immünize etmeye yönelik olan ve bir difteri toksoidi veya onun bir derivati ile önceden immünize edilmis olan söz konusu hastada bilesimle uygulama yapilmasina dayali bir basamak içeren bir yöntemde kullaniin için ve bir ilaç, asi olarak kullanim için, bulusun birinci özelligine uygun immünojenik bilesimler ortaya koyar.

Immünojenik bilesimler Uç veya dört kon jugat içeren bu bulusa uygun soinut örnekler asagida açiklanmaktadir. Bulus sahipleri, bu bilesiinler arasindan bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi lb'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat ihtiva eden bilesimlerin GBS serotipi Ib'nin yani sira GBS serotipi Ia'ya karsi da koruma saglayabileceklerini saptamislardir. Bu gözlem, tip Ib konjugatlarin tip Ia bakterileri öldürebilecek antikorlar indükleme kabiliyetine sahip olmadiklarinin ileri sürüldügü referans ll'de belirtilenler ile uyumsuzdur.

Dolayisiyla, bir tasiyici proteine kon juge GBS serotipi Ib'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat ihtiva eden, asagida açiklanan bulusa uygun bilesim örnekleri, serotip Ia'ya karsi (bilesimde bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ia'ya iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat bulundugu durumda) daha iyi bir koruma saglamalarindan ileri gelen bir avantaja sahip olabilirler.

Immünojenik bilesimler üç kon jugat içerirler. Ilk konjugat, bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ia'ya iliskin bir kapsüler sakkarittir; ikinci kon jugat, bir tasiyici proteine kon juge GBS serotipi Ib'ye iliskin bir kapsüler sakkarittir; ve üçüncü konjugat, bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi lll'e iliskin bir kapsüler sakkarittir. Bulus sahipleri, (asagida örnekleri verilen) bu gibi bilesimlerin özellikle GBS kaynakli eiifeksiyonu önlemeye yönelik asilar olarak kullanima uygun olduklarini saptamislardir.

Immünojenik bilesimler dört konjugat da içerebilirler. Bulusun yapilarindan birinde, ilk kon jugat, bir tasiyici proteine kon juge serotip proteine konjuge GBS serotipi Ib'ye iliskin bir kapsüler sakkarittir; üçüncü konjugat, bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi lll'e iliskin bir kapsüler sakkarittir; ve dördüncü konjugat, bir tasiyici proteine kon juge GBS serotipi V'e iliskin bir kapsüler sakkarittir.

Yukarida açiklanan iinmünojenik bilesimler normalde burada özel olarak bahsi geçen konjugatlar haricinde herhangi bir konjugat içermeyeceklerdir, somutlastirmak gerekirse burada özel olarak bahsi geçen GBS serotipleri disindaki GBS serotiplerine iliskin kapsüler sakkaritler barindiran konjugatlar içermeyeceklerdir. Bununla birlikte bulusun bazi yapilarinda, bilesimler, baska GBS serotiplerine iliskin kapsüler sakkaritler barindiran konjigatlarin aralarinda bulundugu baska konjugatlar ihtiva edebilirler. Ornegin, bilesimler, bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi II'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat içerebilirler. Benzer sekilde, bilesimler, bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi VI'ya iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat içerebilirler. Bir diger ihtimal, bilesimlerin, bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi VIII'e iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir kon jugat içermeleridir.

Burada ayrica, birim doz basina 0,] ile 50 ug arasi miktarlarda kapsüler sakkarit(ler) ihtiva eden iinmi'inojenik bilesimler konu edilmektedir. Her GBS kapsüller sakkaridi normalde 1 ile 30 ug arasi bir miktarda, Örnegin 2 ile 25 ug arasi bir miktarda ve daha da spesifik olmak gerekirse 5 ile 20 ug arasi bir miktarda bulunur. Uygun kapsüler sakkarit miktarlari arasinda, özellikle de GBS serotipleri la, söz konusu oldugu duruma uygun kapsüler sakkarit miktarlari arasinda, birim doz basina 5, 10 ve 20 ug sayilabilir. Dolayisiyla her kapsüler sakkarit için birim doz basina uygun miktar, ilgili bulus yapisinin bilesimdeki kapsüler sakkarit(ler)in türetildikleri serotip(ler) çerçevesinde gösterilmis oldugu asagidaki tablolarda belirtilen numaralandirilmis seçenekler arasindan seçilebilir: Tablo C - Uç kon jugat içeren immünojenik bilesimler Dozlama Bulus yapisi seçenegi la, [b & iii la, Ib & V la, iii & v [b, [11 & v Bulus sahipleri, Tablo C'de gösterilen dozlama seçenekleri arasindan, a) bir tasiyici proteine kon juge GBS serotipi la'ya iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; b) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ib'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; ve e) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi llI'e iliskin bir kapsüler sakkarit olanbir konjugatin yer aldigi immünojenik bilesimlerin söz konusu oldugu bulus yapisina 'Özel olarak 1, 14 ve 27 numarali seçeneklerin etkili olduklarini saptamislardir. Dolayisiyla bu bulusta, kullanilmasi tercih edilir. Olasi toksisiteyi indirgemek adina birim doz basina toplain kapsüler sakkarit miktarini asgari düzeyde tutinak avantajli olabilir. Bundan dolayi, 1 nuinarali dozlama seçenegi bilhassa tercih edilir.

Birim doz basina düsen kapsüler sakkarit miktarini daha da minimize etmek mümkün olabilir. Buna bagli olarak, birim doz basina 0,1 ilâ 5 ug araliginda degisen kapsûler sakkarit miktarlari da burada konu edilmektedir. Örnegin, her GBS kapsüler sakkaridi, birim doz basina 0,1 ile 5 ug arasi bir miktarda, örnegin 0,5, 2,5 veya 5 ug'ye denk bir miktarda, 0,5 ile 5 pg arasi bir miktarda, 1 ile 4 tig arasi bir miktarda, 2 ile 3 Mg arasi bir miktarda ya da yaklasik 2,5 ug'ye denk bir miktarda bulunabilir. Asagidaki tabloda her kapsüler sakkarit için birim doz basina düsebilecek olasi miktarlar siralanmaktadir.

Tablo C' - GBS serotipleri Ia, Ib ve III'e iliskin kapsüler sakkaritler içeren immünojenik bilesimler Birim doz basina kaps'i'iler sakkarit Dozlama miktari (pg) seçenegi Ia Ib III 1 0,5 0,5 0,5 2 0,5 0,5 2,5 3 0,5 0,5 5 4 0,5 2,5 0,5 0,5 2,5 2,5 6 0,5 2,5 5 7 0,5 5 0,5 8 0,5 5 2,5 9 0,5 5 5 2,5 0,5 0,5 1 1 2,5 0,5 2,5 12 2,5 0,5 5 13 2,5 2,5 0,5 14 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 5 16 2,5 5 0,5 17 2,5 5 2,5 18 2,5 5 5 19 5 0,5 0,5 5 0,5 2,5 21 5 0,5 5 22 5 2,5 0,5 23 5 2,5 2,5 24 5 2,5 5 5 5 0,5 26 5 5 2,5 27 5 5 5 oldugu gibi).

Bulus sahipleri, Tablo C"de siralanan dozlaina seçenekleri arasindan seçeneklerde GBS kapsüler sakkaritlerinin her birinin miktari aynidir (Örnegin asagida 'Örneklendirilen daha yüksek dozlu bilesimlerde Tablo D - Dört kon jugat içeren imniünojenik bilesiinler Bulus yapisi -la, lb, [ll & V Dozlama Dozlama Dozlama seçenegi seçenegi seçenegi Vz5ng Vz5ng V:5ng V:10ng V:10ng V:10ng V: 20 ng V: 20 ng V: 20 ng V:5gg V:5gg V:5gg 32 59 V: 10gg V: IOgg V:lOgg 6 Lig 33 gg 60 gg V: 20 gg V: 20 gg V: 20 gg 7 34 6] V:5gg V:5gg V:5gg 8 Lig 35 gg 62 ”2% V: 10 gg V: 10 gg V: 10 gg 9 36 63 V: 20 gg V: 20 gg V: 20 gg gg 37 gg 64 gg V:5gg V:5gg V:5gg 11 38 65 111: 5 gg III: 5 gg III: 5 gg V: 10 gg V: 10 gg V: 10 gg 12 39 66 V: 20 gg V: 20 gg V: 20 gg V:5gg V:5gg V:5gg V:10gg V 10gg Vzlûgg V: 20 gg V 20 gg V: 20 gg V:5gg V:5gg V:5gg V: 10 gg V: 10 gg V: 10 gg V: 20 gg V: 20 gg V: 20 gg V:5gg V:5gg V:5gg V: 10 ug V: 10 pg V: 10 ;Lg V: 20 pg V. 20 pg V: 20 pg Vz5ug V:5ug Vr5ug V: 10 pg V: 10 ug V: 10 ug V: 20 ug V: 20 pg V: 20 ug Vz5pg Vz5pg Vr5ug V: IOug V: IOug V:10p.g V: 20 ”g V: 20 pg V: 20 pg Belirli bir kapsüler sakkaridin kütlesinin diger kapsüler sakkarit(ler)in kütlesine orani farklilik gösterebilir. Asagidaki tablolarda, her kapsüler sakkaride iliskin uygun oranlar (a/a), numaralandirilmis seçenekler halinde açiklaninaktadir: Tablo F - Uç konjugat içeren immünojenik bilesimler Oran seçenegi Bulus yapisi 1 1:12] 2 1:1:2 3 1:1:4 4 12:] 1:2:2 6 1:2:4 7 1:4:1 8 1:4:2 9 12424 2:1:1 11 2:1:2 12 2:1:4 13 2:22] 14 2:4:1 4:1:1 16 4:12 17 4:1:4 18 4:2:1 19 4:4:1 Bulus sahipleri, Tablo F'de gösterilen oran seçenekleri arasindan, a) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ia'ya iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; b) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ib'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; ve 0) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi III'e iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugatin yer aldigi iinmünojenik bilesimlerin söz konusu oldugu bulus yapisina özel olarak 1 numarali seçenegin etkili oldugunu saptamislardir. Dolayisiyla bu bulusta, özellikle de bu bulus yapisinda bu oran seçeneginin kullanilinasi tercih edilir.

Tablo G - Dört kon jugat içeren immünojenik bilesimler Oran“ [3 : Ib : [ll: Oran seçenegi la : lb : Oran“ la : lb : [ll: seçenegi V 111: V seçenegi V Yukarida belirtildigi gibi, bu bulus, kismen, diger konjugatlarin yani sira, bir tasiyici proteine kon juge GBS serotipi V'e iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat da ihtiva eden immünojenik bilesimler ile ilgilidir. Bulus sahipleri, bu bilesimlerde yer alan GBS serotipi V'e iliskin kapsüler sakkaride verilen immün cevabin eger immünojenik bilesimde ayrica bir veya daha fazla sayida ek antijen daha bulunuyorsa azalabilecegini tespit etmislerdir. Belirli herhangi bir teoriye körü körüne bagli kalinmasi hedeflenmemekle birlikte, bu gibi ek antijen(ler)in varliginin "immün enterferansina" sebep olacagi ve bunun sonucunda GBS serotipi V'e iliskin kapsüler sakkaride verilen cevabin azalacagi düsünülmektedir.

Bulus sahipleri, bu immünojenik bilesimlerde bulunan GBS serotipi V'e iliskin kapsüler sakkaride verilen cevabin eger bilesimde bir adjuvan yer alirsa artabilecegini teSpit etmislerdir. Bu gözlem, adjuvanlarin GBS konjugatlarina verilen immün cevaplarda bir gelisme saglamayacaklarinin ileri sürüldügü referans 12'de belirtilenler ile uyumsuzdur. Sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlar, bu bilesimlerde kullanilabilecek olan adjuvanlari belirleyip ayirt edebilirler.

Bulus sahipleri, ayrica, GBS serotipi V'e iliskin kapsüler sakkaride verilen cevabi kapsüler sakkarit dozunu artirmak suretiyle gelistirmenin de mümkün oldugunu saptamislardir. Özellikle de, tip V kapsüler sakkaridin dozu diger GBS serotiplerine iliskin kapsüler sakkaritlerin dozlarindan yüksek tutularak tip V kapsüler sakkaride verilen cevap kuvvetlendirilebilir. Buna bagli olarak, bulusun bir diger yapisinda, bu bulus, a) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi V'e iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat ihtiva eden ve içerdigi tip V kapsüler sakkaridin dozu diger GBS serotiplerine iliskin kapsüler sakkaritlerin toplam dozundan daha yüksek olan ya da diger GBS serotiplerine iliskin kapsüler sakkaritlerin dozlarinin en az birinden veya söz konusu kapsüler sakkaritlerin ortalama dozundan daha yüksek olan bir immünojenik bilesiin ortaya koyar. Tip V fazla olabilir. Tip V kapsüler sakkaridin dozunun diger GBS serotiplerine iliskin kapsüler sakkaritlerin ortalama dozundan daha fazla olmasi tipik tercihtir. Buna göre, bulusun bu yapisinin kapsamina giren bilesimler arasinda, bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi V'e iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugatin yer aldigi ve ayrica tasiyici proteinlere konjuge GBS serotipleri la, lb ve ve tip V kapsüler sakkaridin dozunun diger GBS serotip(ler)ine iliskin kapsüler sakkarit(ler)in toplam dozundan veya diger GBS serotiplerine iliskin kapsüler sakkaritlerin dozlarindan en az birinden veya söz konusu kapsüler sakkaritlerin ortalama dozuiidan daha fazla oldugu burada açiklandigi gibi olan iinmünojenik bilesiinlerden herhangi biri sayilabilir.

Asagida, bu bulusa konu olan immünojenik bilesimleri uygulama yöntemleri tartisilmaktadir. Kisaca belirtmek gerekirse, bu bulusa konu olan immünojenik bilesiinler tek seferde ya da birden fazla doz halinde uygulanabilirler. Bulus sahipleri, bulusa konu olan immünojenik bilesimleriii tek doz haliiide uygulanmasina dayali yaklasimin etkili bir yaklasim oldugunu, özellikle de GBS serotipleri bilesim söz konusu oldugunda ve daha ilgili olarak, a) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ia'ya iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; b) bir tasiyici proteine kon juge GBS serotipi lb'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; ve c) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi lll'e iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat ihtiva edeii bir imniünojenik bilesim söz konusu oldugunda bunun geçerli oldugunu tespit etmislerdir. Bundan dolayi, bu bulusta, özellikle de bu bulus yapilarina istinaden tek doz halinde uygulamaya dayali yaklasimin kullanilmasi tercih edilir.

Alternatif olarak, bir birim doz ve onu takip eden bir ikinci birim dozdan olusan bir uygulama da etkili olabilir. Normalde bahsi geçen ikinci (veya üçüncü., dördüncü, besinci ve benzeri) birim doz, birinci birim doza esit bir doz olarak ayarlanir. Ikinci birim doz, birinci birim doz uygulaiidiktan sonra uygun bir zamanda, somutlastirniak gerekirse 1, 2 veya 3 ay sonra uygulanabilir. Örnegin, GBS serotipleri Ia, Ib ve konusu oldugu durumda, ikinci birim doz birinci birim dozdan 3 ay sonra uygulanabilir. Bir diger örnege göre, eger immünojenik bilesim ayrica GBS serotipi V'e iliskin bir kapsüler sakkarit de içeriyorsa, o halde ikinci birim doz birinci biriiii dozdan 1 ay sonra uygulanabilir.

Bulusa konu olan immünojenik bilesimler normalde intramüsküler yolla, `Örnegin asagida açiklandigi gibi uyluga veya üst kola intramüsk'uler yolla uygulama yapilarak uygulanacaklardir.

Bulus sahipleri, ad juvansiz bilesimlerin kullaniiniiiin etkin ve etkili bir sonuç verdigini, 'Özellikle de immünojenik bilesimde GBS serotipleri daha da ilgili olarak, immünojenik bilesimde a) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ia'ya iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; b) bir tasiyici proteine kon juge GBS serotipi lb'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan olan bir konjugat; ve c) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi lll'e iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugatin bulundugu ve (i) her GBS kapsüler sakkaridinin birim doz basina 5 ug, 10 ug ve 20 ug'ye denk bir miktarda bulundugu ve (ii) yukaridaki (a), (b) ve (c) kalemlerindeki tasiyici proteinin difteri toksoidi veya CRM197 oldugu durumda etkin ve etkili bir soiiuç sagladigini saptamislardir. Olasi bir toksisiteyi indirgemek adina bilesime adjuvan katilmamasi avantajli olabilir. Dolayisiyla, bu bulusta, özellikle de bu bulus yapilarina istinaden herhangi bir adjuvan içermeyen (Özellikle de herhangi bir alüminyum tuzu adjuvani içermeyen) immünojenik bilesimlerin kullanilmasi tercih edilir.

Kaps'i'iIer sakkarit Bu bulus, Streptococcus agalactiae kapsüler sakkaridine dayanir. Bu kapsüler sakkarit, GBS'nin peptidoglikan omurgasina kovalent baglidir ve peptidoglikan omurgasina bagli bir diger sakkarit olan B grubu anti jenden ayri ve farklidir.

GBS kapsüler sakkaritleri, kimyasal olarak birbirleri ile iliskilidirler, fakat antijenik olarak birbirlerinden çok farklidirlar. Tüm GBS kapsüler sakkaritleri asagida gösterilen trisakkarit çekirdegini paylasirlar: Çesitli GBS serotipleri, bu çekirdegin modifikasyon sekline bagli olarak birbirlerinden ayrilirlar. Ornegin Ia ve III serotiplerini birbirinden ayiran, bu çekirdekte ardisik trisakkarit çekirdeklerini baglamak için GlcNAc'nin (la) ya da Gal'in (Ill) kullanilmasidir (Sekil 1). Ia ve Ib serotiplerinin her ikisinde de çekirdekteki GlcNAc'ye bagli bir [a-D-NeupNAc(2-›3)ß-D-Galp-(`l-›] disakkaridi vardir, fakat baglanti ya 1-›4 (Ia) ya da 1-›3't`ûr (Ib).

GBS ile iliskili hastalik agirlikli olarak serotipler la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII ve VIII'ten kaynaklanir ve vakalarin %85'inden fazlasindan bes serotip sorumludur: Ia, Ib, III & V. Bu bulusta, tercihen, bu dört serotipin üçü veya daha fazlasindan, somutlastirmak gerekirse Ia, Ib ve III serotiplerinden türetilen bir sakkarit kullanilir. Sekil 2'de gösterildigi gibi, bu dört serotipin her birinin kapsüler sakkaridinde, (a) her halükarda bir galaktoz artigma 2-›3 bagli olan bir terminal N- asetil-nöraminik asit (NeuNAc) artigi (yaygin olarak sialik asit olarak atif yapilir) ve (b) trisakkarit çekirdegi içerisinde yer alan bir N-asetil- glukozamin artigi (GlcNAc) bulunur.

Dört sakkaridin dördünde de, trisakkarit çekirdegi içerisinde galaktoz artiklari bulunur, fakat Ia, Ib, II & III serotiplerinde ayrica her tekrar biriminde ek galaktoz artiklari da yer alir.

Bu bulusa göre kullanilan sakkaritler dogal formlarmda bulunabilecekleri gibi inodifiye edilmis formlarda da bulunabilirler. Örnegin, sakkarit, nativ kapsüler sakkaritten daha kisa olabilir ya da kimyasal olarak modifiye edilmis olabilir. Somutlastirmak gerekirse, bu bulusta kullanilan serotip V kapsüler sakkaridi, referanslar 13 ve 14'te tarif edildigi gibi modifiye edilmis olabilir. Örnegin, referanslar 13 ve 14'te tarif edildigi gibi büyük ölçüde sialilden arindirilmis olan bir serotip V kapsüler sakkaridi (Sekil 3) bu bulus kapsaminda kullanilmasi tasarlanan unsurlardan biridir. Sialilden arindirilmis GBS serotipi V kapsüler sakkaridi, referans l3'te belirtildigi gibi, saflastirilmis GBS serotipi V kapsüler sakkaridinin hafif asidik kosullar altinda (örnegin 80°C sicaklikta 60 dakika boyunca 0,] M sülfürik asit uygulanmasi) islemden geçirilmesi ya da nöraminidaz uygulanmasi yoluyla hazirlanabilir. Sialilden arindirilmis GBS serotipi V kapsüler sakkaridi hazirlamak için kullanilmasi tercih edilen yöntemlerden biri, saflastirilmis sakkaridi 81°C +/- 3°C sicaklikta 2 saat boyunca 1 M asetik asit ile islemden geçirmeye dayanir. Dolayisiyla, bu bulus uyarinca kullanilan sakkarit, dogada oldugu gibi bir büyük ölçüde tam boy kapsüler polisakkarit ya da dogal uzunlugundan daha kisa bir uzunluga sahip olan bir sakkarit olabilir. Tam boy polisakkaritler, bu bulusta kullanilacak daha kisa boylu fragmanlar haline getirilmek üzere ve örnegin hafif asidik kosullarda hidroliz yoluyla, isitma yoluyla, boyutlandirma kromatografisiyle veya benzeri baska bir yöntemle depolimerize edilebilirler. Tavsanlarda yapilan bir çalismada zincir uzunlugunun GBS sakkaritlerinin immünojenisitesini etkiledigi rapor edilmistir [4].

Somutlastirmak gerekirse, bu bulusta kullanilan serotip II ve/Veya III kapsüler sakkaritler referanslar 15 ve 16'da tarif edildigi gibi depolimerize edilebilirler. Bu yayinlarda, indirgen terminal 2,5- anhidro-D-mannoz artiklarinin bulundugu antijenik fragmanlar elde etmeye dayali hafif deaminatif yarma uygulamasiyla tip II ve tip II kapsüler sakkaritlerin kismi depolimerizasyonu anlatilmaktadir.

Kisaca aktarmak gerekirse, kapsüler sakkarit, 0,5 N NaOH'de çözündürülür ve yaklasik 1-4 saat boyunca 70°C sicaklikta isitilir. Bu ink'ûbasyonun uzunlugu, standart yöntemler ile (örnegin referans 15'te belirtildigi gibi HPLC ile) tayin edilebilecek olan depolimerizasyonun derecesini belirleyen faktördür. Numune, bir buzlu su banyosunda sogutulur ve daha sonra glasiyal asetik asit eklenerek pH seviyesi 4'e getirilir. Kismen N-deasillenen 'ürün, daha sonra %5 (a/h) NaNOz eklenip 4°C sicaklikta 2 saat boyunca karistirilarak deamine edilir.

Olusturulan 2,5-a11hidro-D-mannoz artiklarindan olusan serbest aldehitler, asagida açiklandigi gibi bir tasiyici proteine konjugasyon için kullanilabilirler.

Bir tetanos toksoidi tasiyicisi içeren konjugatlar olusturmak için depolimerize materyal kullanimina dayali serotip III kapsüler sakkaridin endo-ß-galaktosidaz ile depolimerizasyonuna yönelik bir islem rapor edilmistir [referanslar l & 4-6]. Depolimerizasyon için, GBS serotipleri III ve Vlll'e iliskin kapsüler polisakkaritlerin ozonolizinden istifade edildigi de olmustur [17]. Molekül agirligi 30 kDa'dan fazla olan sakkaritlerin kullanilmasi tercih edilir ve büyük ölçüde tam boy olan kapsüler polisakkaritler kullanilabilir. Serotip 175-275 kDa arasi olan polisakkaritlerin kullanilmasi tercih edilir.

Normalde, molekül agirligi yaklasik 200 kDa veya yaklasik 260 kDa olan bir serotip la sakkarit kullanilir. Serotip Ib'ye istinaden, molekül polisakkaritlerin kullanilmasi tercih edilir. Normalde, molekül agirligi yaklasik 200 kDa veya yaklasik 230 kDa olan bir serotip Ib sakkarit kullanilir. Serotip III'e istinaden, molekül agirligi 50-200 kDa arasi olan, özellikle de 80-150 kDa arasi olan polisakkaritlerin kullanilmasi tercih edilir. Normalde, molekül agirligi yaklasik 100 kDa veya yaklasik 140 kDa olan bir serotip III sakkarit kullanilir. Serotip V'e istinaden, molekül agirligi 50 kDa civarina varan düzeyde olan polisakkaritlerin kullanilmasi tercih edilir. Normalde, molekül agirligi yaklasik 100 kDa olan bir serotip V sakkarit kullanilir. Bu moleküler kütleler, dekstran standartlarina, örnegin Polymer Standard Service'ten edinilebilecek olan standartlara kiyasla jel filtrasyon gerçeklestirilerek ölçülebilirler [18].

Sakkarit, dogal formuna göre kimyasal olarak modifiye edilmis olabilir. Örnegin, sakkarit, de-O-asetillenmis (kismen veya tamamen), de-N-asetillenmis (kismen veya tamamen), N-pr0pionatlanmis (kismen veya tamamen) ya da benzeri baska bir modifikasyona tâbi tutulmus olabilir. De-asetilasyon, kon jugasyondan önce, konjugasyon sirasinda ya da konjugasyondan sonra meydana gelebilir, fakat kon jugasyondan önce meydana gelmesi tercih edilir. Sakkaridin hangi sakkarit olduguna bagli olarak, de-asetilasyon immünojenisiteyi etkileyebilir de etkileineyebilir de. GBS sakkaritlerinde O- asetilasyonun önemi ve anlami, çesitli farkli serotiplere istinaden referans 19'da tartisilmaktadir ve bulusun bazi yapilarinda, 7, 8 ve/veya 9 numarali pozisyonlardaki sialik asit artiklarinin O- asetilasyonu örnegin koruma/koruma kaldirma yoluyla, tekrar- asetilasyon yoluyla ya da benzeri baska bir yolla konjugasyondan önce, kon jugasyon sirasinda ve kon jugasyondan sonra korunmaktadir.

Bununla birlikte, bu bulusta kullanilan GBS sakkaridinde nomialde 7, 8 ve/veya 9 numarali pozisyonlardaki sialik asit artiklarinda heinen hemen hiç O-asetilasyon bulunmaz. Daha somut ifade etmek gerekirse, GBS sakkaridiiiin asagida açiklandigi gibi baz ekstraksiyonu ile saflastirilmis oldugu durumda O-asetilasyonu bu saflastirma sonucunda yitirilmis olur (referans 19). De-asetilasyon ve benzeri tekniklerin etkisi rutin eseyler çerçevesinde degerlendirilebilir.

Kapsüler sakkaritler, burada belirtilen referanslarda, örnegin referanslar 2 ve 20'de açiklandigi gibi olan bilinen teknikler kullanilarak saflastirilabilirler. Standart bir proseste, baz ekstraksiyonu, santrifû j, filtrasyon, RNaz/DNaz uygulamasi, proteaz uygulamasi, konsantrasyon, boyut dislama kroinatografisi, ultrafiltrasyon, anyon degistirme kromatografisi ve ek ultrafiltrasyon bulunur. GBS hücrelerinin bakteriyel hücre duvarini yararak hücre duvari komponentlerinin serbest kalmasini saglayan mutanolizin enziini ile islemden geçirilmesine dayali uygulama da faydalidir.

Alternatif olarak, referans 21'de açiklanan saflastirma prosesi kullanilabilir. Bu proseste, baz ekstraksiyonu, etanol/CaClz uygulamasi, CTAB presipitasyonu ve tekrar-çözünürlestirine bulunur.

Bir diger alternatif proses, referans 22'de anlatilmaktadir.

Bununla birlikte, bu bulus, dogal kaynaklardan saflastirilarak elde edilen sakkaritler ile sinirli degildir; sakkaritler, baska yöntemlerle, örnegin toplam veya kismi sentez yoluyla da elde edilebilirler.

Konjugasyon Bu bulus, bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipleri Ia, Ib, III ve istege bagli olarak V'ye iliskin kapsüler sakkaritler olan kon jugatlar ile ilgilidir. Genel olarak ifade etmek gerekirse, sakkaritleriii tasiyicilara kovalent konjugasyonu, sakkaritlerin T-bagimsiz anti jenlerden T- bagimli aiitijenlere dönüsmelerini ve buna bagli olarak immünolojik hafizanin çalismasini saglamasi sayesinde sakkaritlerin immünojeiiisitesini artirir. Konjugasyon bilhassa pediatrik asilar için faydalidir [örnegin referans 23] ve iyi bilinen bir tekniktir [örnegin referanslar 24 ilâ 32'de incelenmistir]. Dolayisiyla bu bulusa konu olan prosesler kapsaminda, saflastirilmis sakkaridin bir tasiyici moleküle konjuge edildigi bir basamak da bulunabilir.

GBS sakkaritlerinin konjugasyonu sektörde pek çok defa rapor edilmis olan bir uygulamadir. Örnegin bkz: referanslar 1 ilâ 9. GBS sakkaritlerinin kon jugasyonu için bu bulustan önce sektörde kullanilaii proseslerde standart olarak yer alan uygulamalardan biri, bir saflastirilmis sakkaridin tetanos toksoidi (TT) veya CRMl97 gibi bir tasiyici proteine indirgen aminasyonudur [2]. Indirgen aminasyon, tasiyicida yer alan bir amino asidin yan zincirindeki amiii grubu ile sakkaritteki bir aldehit grubunu ilgilendiren bir islemdir. GBS kapsüler sakkaritleri dogal formlarinda bir aldehit grubu barindirmadiklari için, normalde konjugasyon gerçeklestirilmeden önce sakkaridin sialik asit artiklarinin bir kismi (örnegin %5 ile %40 arasi bir bölümü, özellikle de %10 ile %30 arasi bir bölümü, tercihen yaklasik %20'si) oksidasyona (örnegin periodat oksidasyonu) ugratilarak söz konusu grubun olusmasi saglanir. [2, 33]. Bu yolla hazirlanan konjugat asilariiiin GBS serotipleri la, Ib, II, III ve V'in her birine istinaden beseri kullanimda güvenli ve immünojenik olduklari daha 'önceden ortaya konmustur [10]. Bu bulusa konu olan imiriünojenik bilesiinlerdeki konjugatlarin hepsi normalde bu sekilde hazirlanir. Fakat bulus kapsaminda sialilden arindirilmis bir serotip V kapsüler sakkarit kullanilacaksa, bu sakkaritteki aldehit grubu, konjugasyon yapilmadan önce sakkaridin galaktoz artiklarinin bir kismi (örnegin %5 ile %40 arasi bir bölümü, Özellikle de %10 ile %30 arasi bir bölümü, tercihen yaklasik %20'si) oksidasyona (örnegin periodat oksidasyonu) ugratilarak olusturulabilir [14]. Referans 34'te tarif edildigi gibi olan alternatif bir konjugasyon prosesinde, bifonksiyonel baglayicilar ile birlikte sakkaritte -NHZ gruplari kullanilir (ya aminler sokulduktan sonra ya da de-N-asetilasyondan itibaren). Bulusun bazi yapilarinda, bulusa konu olan immünojenik bilesimlerdeki konjugatlarin biri veya birden fazlasi bu sekilde hazirlanmistir. Bir diger alternatif proses referanslar 15 ve 16'da anlatildigi gibidir. Bu proseste, indirgen aininasyon ile konjugasyon için, tip 11 veya tip llI kapsüler sakkaritlerin hafif deaininatif yarma ile depoliinerizasyonundan ileri gelen termiiial 2,5-anhidro-D-mannoz artiklarinin olusturduklari serbest aldehit gruplari kullanilir. Bulusun bazi yapilarinda, bulusa konu olan immünojenik bilesimlerdeki kon jugatlarin biri veya birden fazlasi bu sekilde hazirlanmistir.

Bu bulusun kapsamina, difteri toksoidi veya CRMl97 olan tasiyici moleküllerin kullanimi da girer. Tetanos toksoidi gibi baska bakteriyel toksinler veya toksoidlerin aralarinda bulundugu baska tasiyici proteinler de burada ele alininaktadir. Toksin veya toksoid fragmanlari, örnegin tetanos toksodi fragmani C de burada konu edilmektedir [35]. Difteri toksininin CRM197 mutanti [36-38], bu bulusta kullanim için bilhassa faydalidir. N. meningitidis dis meinbran bogmaca proteinleri [44, 45], sitokinler, [46], lenfokinler [46], hormonlar [46], büyüme faktörleri [46], insan serum albümini (tercihen rekombinan), çesitli farkli patojen kaynakli antijenlere ait birden çok insan CD4+ T hücresi epit0punun yer aldigi artifisyel proteinler [47], örnegin N19 [48], H. influenzae kaynakli protein D demir alim proteinleri [53], C. difficile kaynakli toksin A veya B [54], rekombinan Pseudomonas aeruginosa eksoproteini A (rEPA) [55], bir GBS proteini (asagidaki kisma bakiniz, özellikle de GB867) [204] ve benzerlerinin aralarinda bulundugu tasiyici proteinler de bu bulusun kapsamina girmektedir.

Tasiyici ile baglanti, örnegin tasiyici proteindeki bir lizin artiginin ya da bir arjinin artiginin yan zincirindeki ya da N-terminaldeki tercihen bir -NHZ grubu araciligiyla kurulur. Baglanti, örnegin bir sistein artiginin yan zincirinde bulunan bir -SH grubu araciligiyla da kurulabilir.

Birden fazla sayida tasiyici protein kullanmak, örnegin tasiyici supresyonu riskini azaltmak adina birden fazla sayida tasiyici protein kullanmak mümkündür. Dolayisiyla farkli GBS serotipleri için farkli tasiyici proteinlerin kullanimi da bulusun kapsamina giren konulardan biridir; örnegin serotip Ia sakkaritler CRMl97'ye konjuge edilirken, serotip lb sakkaritler tetanos toksodine kon juge edilebilirler. Belirli bir sakkarit anti jeni için birden fazla sayida tasiyici protein kullanmak da mümkündür; örnegin serotip III sakkaritler iki gruba ayrilabilir ve bir grup CRMl97'ye konjuge edilirken, diger grup tetanos toksodine konjuge edilebilir. Bununla birlikte genel olarak bakildiginda, bütün sakkaritler için ayni tasiyici proteinin kullanilinasi tercih edilir.

Bir tasiyici protein birden fazla sayida sakkarit anti jeni tasiyabilir [56, 57]. Örnegin, bir tasiyici protein, hem serotip Ia sakkaridine hein de serotip Ib sakkaridine konjuge edilebilir. Kullanilacak farkli sakkaritler konjugasyon reaksiyonu gerçeklestirilmeden önce karistirilarak bu saglanabilir. Ancak genel olarak bakildiginda, her serogrup için ayri konjugatlar bulunmasi, farkli sakkaritlerin konjugasyondan sonra karistirilinalari tercih edilir. Bu ayri konjugatlar ayni tasiyiciya dayali olabilirler.

Norinalde, sakkaritzprotein orani (a/a) 1:5 (yani proteinin fazla oldugu durum) ile 5:] (yani sakkaridin fazla oldugu duruin) arasi bir seviyede olan konjugatlar, özellikle de 1:5 ile 221 arasi bir seviyede olan konjugatlar kullanilir. Bulus kapsaminda bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ia'ya iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat kullanilacaksa, konjugatin sakkaritzprotein orani (a/a) normalde yaklasik H ile 1:2 arasi bir seviyeye, 'Özellikle de yaklasik 1:1,3 seviyesine ayarlanir. Benzer sekilde, bulus kapsaminda bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ib'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat kullanilacaksa, söz konusu oran normalde yaklasik 121 ile 1:2 arasi bir seviyeye, özellikle de yaklasik 1:1,3 seviyesine ayarlanir.

Bulus kapsaminda bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi III'e iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat kullanilacaksa, sakkarit:protein orani (a/a) normalde yaklasik 3:] ile 1:] arasi bir seviyeye, 'Özellikle de yaklasik 2:l seviyesine ayarlanir. Bununla birlikte, bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi III°e iliskin bir kapsüler sakkarit olan ve bulus kapsaininda kullanilmasi tercih edilen bir konjugatin sakkaritzprotein oraiii (a/a) yaklasik 1:l ile 115 arasi bir seviyede, özellikle de yaklasik 1:3,3 seviyesinde de olabilir. Son olarak, bulus kapsaminda bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi V'e iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat kullanilacaksa, mevzubahis oran normalde yaklasik 221 ile 1:] arasi bir seviyeye, daha uzun sakkarit zincirleri için geçerli olmak üzere, agirlik bakiinindan sakkaridin daha fazla olmasi normal sayilir.

Bilesimler az bir miktarda serbest tasiyici barindirabilirler [58]. Bir tasiyici protein bulusa konu olan bir bilesimde hem serbest formda hem de konjuge formda bulunuyorsa, konjuge olmayan serbest form bütün olarak bilesimdeki toplam tasiyici protein miktarinin tercihen üzerine çikmaz.

Konjugasyondan sonra serbest ve konjuge sakkaritler ayrilabilirler.

Bunun için kullanilabilecek olan ve aralarinda hidrofobik kromatografi, tanjansiyel ultrafiltrasyon, diafiltrasyon ve benzeri tekniklerin bulundugu birçok uygun yöntem vardir [ayrica bkz: referanslar 59 & 60 ve benzerleri]. Tercih edilen yöntemlerden biri referans 61 'de anlatilmaktadir.

Bulusa konu olan bilesimde bir depolimerize oligosakkarit yer alinasi hedefleniyorsa, depolimerizasyonun konjugasyondan 'Önce yapilmis olmasi tercih edilir.

Konjugatlar ve baska antijenlerden olusan kombinasyonlar Bu bulusa konu olan immünojenik bilesimlerde bir veya daha fazla sayida ek anti jen de bulunabilir.

Bu ek antijen(ler) baska ek GBS konjugatlari barindirabilirler. Bu farkli GBS konjugatlari arasinda, ayni GBS serotipi ile elde edilen ve/Veya farkli GBS serotipleri ile elde edilen farkli konjugat çesitleri bulunabilir. Bu tarz bir bilesim, olagan sekilde, ayri konjugatlar (örnegin her serotip için farkli bir konjugat) hazirlanip daha sonra bu kon jugatlar kombine edilerek üretilecektir.

Bahsi geçen ek antijen(ler)de, asagida belirtildigi gibi olan GBS amino asit sekanslari bulunabilir.

Bu ek anti jen(ler), GBS olmayan patojenlere ait anti jenler içerebilirler.

Dolayisiyla bu bulusa konu olan bilesimler, ek bakteriyel, Viral veya parazitik antijenlerin dahil olabilecegi GBS olmayan bir veya daha fazla sayida antijen de ihtiva edebilirler. Bunlar, asagida siralanan anti jenler arasindan seçilebilirler: o protein '287' (asagiya bakiniz) ve onun derivatlari (örnegin serogrup B kaynakli bir protein aiitijeni, ömegin referanslar 62 ilâ 68'de açiklananlar; N. meningitidis serogrup B'den elde edilen bir dis membran vezikülü (OMV) preparati, örnegin referanslar 69, 70, 71, 72 ve benzeri referanslarda açiklananlar; N. meningitidis serogrup A, C, W135 ve/Veya Y'den elde edilen bir sakkarit anti jeni, örnegin serogrup C'den elde edilen referans 73'te açiklanan oligosakkarit ya da referans 74'te açiklanan oligosakkaritler; Streptococcus pneumoniae kaynakli bir sakkarit anti jeni hepatit A Virüsü kaynakli bir antijen, örnegin inaktive Virüs hepatit B Virüsü kaynakli bir antijen, örnegin yüzey ve/Veya çekirdek antijenleri [örnegin referanslar 79, 80; referans 84, hepatit C Virüsü kaynakli bir anti jen [örnegin referans 81]; istege bagli olarak pertaktin ve/veya aglütinogenler 2 ve 3 ile kombinasyon halinde olmak üzere, Bordetalla pertussis kaynakli bir antijen, örnegin B. pertussis kaynakli bogmaca holotoksini (PT) ve filamentöz hemagli'itinin (FHA) [örnegin referanslar 82 & 83; referans 84, bölüm 21]; bir difteri anti jeni, örnegin difteri toksoidi [örnegin referans 84, bir tetanos anti jeni, örnegin bir tetanos toksoidi [örnegin referans 84, bölüm 27]; Haemophilus influenzae B kaynakli bir sakkarit anti jeni N. gouorrhoeae kaynakli bir anti jen [örnegin referanslar 62, 63, o Chlamydia pneumoniae kaynakli bir anti jen [örnegin referanslar o Chlamydia trachomatis kaynakli bir antijen [örnegin referans o Prophyromouas gingivalis kaynakli bir anti jen [örnegin referans 93]; o polio antijen(ler)i [örnegin referanslar 94, 95; referans 84, bölüm 24], örnegin IPV; o kuduz antijen(ler)i [örnegin referans 96], örnegin liyofilize inaktive virüs [örnegin referans 97, RabAvertTM]; o kizamik, kabakulak ve/Veya kizamikçik antijenleri [örnegin referans 84, bölüinler 19, 20 ve 26]; o influenza anti jen(ler)i [ömegin referans 84, bölümler 17 & 18], örnegin hemaglütinin ve/Veya nöraminidaz yüzey proteinleri; o Moraxella catarrhalis kaynakli bir antijen [örnegin referans o Streptococcus pyogenes kaynakli bir antijen (grup A streptokok) [örnegin referanslar 99, 100, 101]; ve . Staphylococcus aureus kaynakli bir anti jen [örnegin 102].

Bir sakkarit veya karbonhidrat antijeni kullanilacaksa, bu antijenin immünojenisiteyi artirmak adina bir tasiyici proteine kon juge edilmesi tercih edilir. H. influenzae B, meningokokal ve pnömokokal sakkarit anti jenlerinin kon jugasyonu iyi bilinen bir konudur.

Toksik protein anti jenleri gerekiyorsa detoksifiye edilebilirler (örnegin bogmaca toksininin kimyasal ve/Veya genetik yol ve yöntemlerle detoksifikasyonu [83]).

Bilesime difteri antijeni katilacaksa, ayni zamanda tetanos ve bogmaca antijenlerinin de katilmasi tercih edilir. Benzer sekilde, eger bir tetanos antijeni kullanilacaksa, yaiii sira difteri ve bogmaca antijenlerinin de bulunmasi tercih edilir. Benzer sekilde, eger bir bogmaca antijeni buluiiacaksa, yani sira difteri ve tetanos anti jenlerinin de katilmasi tercih edilir.

Bir tercih edilen bilesim tipinde, asagida siralananlarin 'ornek gösterilebilecegi cinsel yolla bulasan patojenlere ait ek antijeiiler de bulunur: herpes Virüs; N. gonorrhoeae; C. trachomatis; ve benzerleri.

Bir diger tercih edilen bilesim tipinde, yaslilari ve/Veya immün sistemi bozulmus bireyleri etkileyen ek baska anti jenler de bulunur ve dolayisiyla bu bulusa konu olan GBS antijenleri, asagida siralanan GBS olmayan patojenlere iliskin bir veya daha fazla sayida anti jen ile kombine edilebilirler: influenza Virüsü, Euterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Pseudoinonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis ve parainfluenza Virüsü.

Bilesimdeki antijenlerin her biri normalde en az 1 tig/ml konsantrasyonunda bulunacaktir. Genel olarak, belirli herhangi bir anti jenin kullanildigi konsantrasyon, 0 anti jene karsi bir immün cevap olusmasini saglayacak kadar yüksek olacaktir.

Bulusa konu olan bilesimde protein aiitijenlerinin kullanimina bir alternatif olarak, antijeni kodlayan nükleik asit de kullanilabilir bilesimlerin protein komponentleri, proteini kodlayan nükleik asit (örnegin bir plazmid formunda olmak üzere tercihen DNA) ile degistirilebilirler.

Pratik açidan bakildiginda, bu bulusa konu olan bilesimlerde yer alabilecek antijen adedi için bir üst sinir söz konusu olabilir. Bulusa konu olan bir bilesimdeki antijenlerin (GBS anti jenleri dahil) sayisi, az, 6'dan az, 5'ten az, 4'ten az, 3'ten az ya da 2'den az olabilir. Bulusa konu olan bir bilesimdeki GBS anti jenlerinin sayisi, 6'dan az, 5'ten az, 4'ten az, 3'ten az ya da 2'den az olabilir.

Farmasötik yöntemler ve kullanim alanlari ve sekilleri Bu bulusa konu olan immünojenik bilesimlerde bir farmasötik açidan kabul edilebilir tasiyici da yer alabilir. Standart 'farmas'otik açidan kabul edilebilir tasiyicilar' arasinda, bilesimi alan birey için zararli olacak antikorlarin üretimini indüklemeyen her türlü tasiyici sayilabilir. Uygun tasiyicilar, normalde büyük ve yavas nietabolize olan makromolekülleri teskil ederler; örnek olarak proteinler, polisakkaritler, polilaktik asitler, poliglikolik asitler, polimerik amino asitler, amino asit kopolimerleri, sukroz [112], trehaloz [113], laktoz ve lipid agregatlari (örnegin yag damlaciklari veya lipozomlar) gösterilebilir. Bu gibi tasiyicilar, sektörde olagan bir bilgi ve beceriye sahip olan uzmanlarca iyi bilinirler. Asilarda, su, salin, gliserol ve benzeri seyrelticiler de yer alabilir. Bunlarin yani sira, islatici veya emi'ilsifiye edici ajanlar, pH tamponlama maddeleri ve benzerlerinin pirojen içermeyen, fosfat tamponlu fizyolojik salin tipik tasiyicilardan biridir. Referans 114'te, farmasötik açidan kabul edilebilir yardimci maddeler hakkinda yapilmis kapsamli bir tartismaya yer verilmektedir.

Bu bulusa konu olan bilesimler aköz formda (yani çözeltiler veya süspansiyonlar) ya da kurutulmus formda (örnegin liyofilize) bulunabilirler. Eger bir kurutulmus asi kullanilacaksa, o asi enjekte edilmeden önce bir sivi vasat ile sulandirilip 'Öyle enjekte edilecektir.

Konjugat asilarinin liyofilizasyonu sektörde bilinen bir konudur; örnegin MenjugateTM adli ürün liyofilize fonnda sunulmaktadir.

Bulusa konu olan immünojenik bilesiinlerde birden fazla sayida GBS serotipiiie iliskin kapsüler sakkaritlerin yer aldigi konjugatlarin bulunmasi hedefleniyorsa, tipik uygulamaya göre bu konjugatlar ayri ayri hazirlanip daha sonra karistirilir ve ardindan liyofilize edilirler.

Bu yolla, burada taniinlaiidigi gibi olan iki, 'üç veya dört ya da daha fazla sayida konjugatin yer aldigi liyofilize bilesimler hazirlanabilir.

Konjugatlarin liyofilizasyon sirasiiida stabil kalmalarini saglamak adina, bilesime l mg/ml ile 30 mg/ml arasi (örnegin yaklasik 25 mg/ml) bir konsantrasyonda bir seker alkolü (ömegin mannitol) ve/Veya bir disakkarit (örnegin sukroz veya trehaloz) katilmasi tercih edilebilir. GBS konjugat asilari için bir stabilizatör olarak sukrozun kullanilmasi tavsiye edilmistir (referans 115). Ancak normalde bu bulusta kullanilaii stabilizatör olarak niannitol kullanilir. Kurutulmus asi enjekte edilmeden önce bir sivi vasatta sulandirildiginda, artik mannitol'un konsantrasyonu normalde yaklasik 2-20 mg/ml arasi bir seviyede, örnegin 3,75 mg/ml, 7,5 mg/ml veya 15 mg/ml seviyesinde olacaktir. Mannitol kullanilmasi daha avantajlidir, çünkü mannitol GBS kapsüler sakkaritlerinin monosakkarit alt-birimlerinden kimyasal olarak farklidir. Bu fark, kapsüler sakkaritlerde örnegin kalite kontrol analizi için belirleme yapilacaginda, bu belirlemeiiin mannitol kaynakli bir enterferans söz konusu olinaksizin sakkarit alt- birimlerinin varligi temelinde yapilabilmesine olanak saglar. Diger yaridan, sukroz benzeri bir stabilizatör glukoz içerir ve bu durum, sakkaritlerdeki glukoz alt-birimlerinin belirlenmesine engel olabilir.

Bilesimler flakonlarda ya da kullanima hazir enjektörlerde sunulabilirler. Enjekt'orler, yani sira igne ile birlikte veya igne olmadan tek basina sunulabilirler. Bir enjektör bilesimin tek bir dozunu ihtiva edecektir; bir flakon ise bir veya birden fazla sayida doz içerebilir.

Bulusa konu olan aköz bilesimler, liyofilize formda bulunan baska asilari sulandirmak için de uygundurlar. Bulusa konu olan bir bilesim bu gibi bir ekstamporane sulandirina için kullanilacaksa, bulus, iki flakon barindiran ya da en jektörün muhteviyatinin en jeksiyondan önce flakoiiun muhteviyatini tekrar aktive etmek maksadi ile kullanilacagi bir kullanima hazir en jektör ve bir flakon barindiran bir kit formunda sunulabilir.

Bulusa konu olan bilesimler birim doz formunda ya da birden çok doz formunda ambalajlanabilirler. Birden çok doz formlari için kullanima hazir enjektörler yerine flakonlarin kullanilmasi tercih edilir. Etkili dozaj hacimleri rutin test ve denemeler ile belirlenebilir; bununla birlikte, örnegin intramüsküler enjeksiyon için tipik bir beseri bilesim dozu 0,5 ml hacmindedir.

Bilesimiii pH'sinin 6 ile 8 arasi bir düzeyde olmasi tercih edilir ve yaklasik 7 olmasi daha çok tercih edilir. pH seviyesi, bir tampon kullanilarak stabil tutulabilir. Bulusa konu olan immünojenik bilesiinler normalde bir potasyum dihidrojen fosfat tampoiiu ihtiva ederler. Potasyum dihidrojen fosfat tamponu, yaklasik 1-10 mM potasyum dihidrojen fosfat, örnegin 1,25 mM, 2,5 mM veya 5,0 mM potasyum dihidrojen fosfat içerebilir. Bilesim steril ve/veya pirojen içermez olabilir. Bulusa konu olan bilesimler, insanlar için izotoiiik olabilirler.

Bu bulusa konu olan bilesimler immünojeniktirler ve daha çok tercihen asi bilesimlerini teskil ederler. Bulusa konu olan asilar profilaktif (yani enfeksiyonu önleme amaçli) ya da terapötik (yani enfeksiyonu tedavi amaçli) olabilirler, fakat normalde profilaktik olacaktirlar. Asi olarak kullaiiilan immünojenik bilesimler, gereken baska her türlü komponentin yani sira, immünolojik açidan etkili bir miktar antijen(ler) içerirler. Burada geçen 'immünolojik açidan etkili miktar' tabiri, bir bireye tek doz halinde ya da bir dizi uygulaiiianin bir parçasi olarak uygulandiginda tedavi edici veya önleyici etki açiga çikmasini saglama konusunda etkili olan bir miktar aiilamina gelir. Bu miktar, tedavi edilecek bireyin saglik durumu ve fiziksel durumuna, yasina, tedavi edilecek bireyin taksonomik grubuna (örnegin insan disindaki primatlar, priinat ve benzeri), bireyin immün sisteminin antikor sentezleme kapasitesine, hedeflenen koruma derecesine, asinin forinülasyonuna, tedaviyi yürüten doktorun tibbi durum hakkindaki degerlendirmesine ve diger ilgili faktörlere bagli olarak farklilik gösterir. Bu miktarin rutin deneyler yardimiyla belirlenebilecek olan nispeten genis bir aralik içerisinde yer almasi beklenir.

Bir sakkarit anti jeninin her doz içerisindeki miktari, genelde (sakkaridin kütlesi olarak ölçülen) 0,1-50 ug arasi bir seviyede, spesifik olarak 1-50 ug arasi veya 0,5-25 ug arasi bir seviyede, daha da spesifik olarak 2,5-7,5 ug arasi bir seviyede örnegin 1 ug, yaklasik ya da yaklasik 25 ug seviyesinde olacaktir. Her doz içerisindeki toplam GBS kapsüler sakkaridi miktari, genelde (sakkaridin kütlesi olarak ölçülen) S 70 ug seviyesinde, örnegin S 60 ug seviyesinde olacaktir. Spesifik olarak, bahsi geçen toplam miktar S 40 ug (örnegin S 30 ug) veya 5 20 ug (örnegin 5 15 ug) seviyesinde olabilir. Bulus sahipleri, bu t0plam miktarlarin hepsinin etkili oldugunu, 'Özellikle de immünojenik bilesimin asagida belirtilen konjugatlari içerdigi durumda bunun geçerli oldugunu tespit etmislerdir: a) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi Ia'ya iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; b) bir tasiyici proteine kon juge GBS serotipi lb'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat; ve 0) bir tasiyici proteine konjuge GBS serotipi III'e iliskin bir kapsüler sakkarit olanbir konjugat. Dolayisiyla bu bulusta, özellikle de bu bulus yapisinda bu toplam iniktarlarin kullanilmasi tercih edilir. Olasi toksisiteyi indirgemek adina birim doz basina düsen toplam kapsüler sakkarit miktarinin asgari düzeyde tutulmasi avantaj saglayabilir. Buna göre, 5 seviyesinde bir toplam miktar tercih edilir.

GBS vücudun çesitli alanlarini etkiler ve dolayisiyla bu bulusa konu olan bilesimler çesitli farkli formlarda hazirlanabilirler. Bilesimler örnegin sivi çözelti veya süspansiyon halindeki enjektabllar olarak hazirlanabilirler. Bilesim pulmoner uygulama için, örnegin bir ince toz veya bir Spreyin kullanildigi bir iiihaler olarak hazirlanabilir. Bilesim bir supozituvar veya peser olarak hazirlanabilir. Bilesim, nazal, aural veya oküler uygulama için, örnegin sprey, damla, jel veya toz formunda hazirlanabilir [örnegin referanslar 116 & 117]. Pnömokokal ve Hib ile MenC sakkarit kon jugatlarindari olusan karisimlar [122] ile nazal uygulamada basariya ulasildigi rapor edilmistir.

Bu bulusa konu olan bilesimler, bilhassa birden çok doz formatinda ambalajlandiklari durumlarda bir antimikrobiyal içerebilirler.

Bu bulusa konu olan bilesimler, deterjan, örnegin Tween 80 gibi bir Tween (polisorbat) ihtiva edebilirler. Deterjanlar genelde düsük seviyelerde, örnegin < %0,01 seviyesinde kullanilirlar.

Bu bulusa konu olan bilesimler, tonisite saglamasi için sodyum tuzlari (örnegin sodyum klorür) içerebilirler. Tipik bir NaCl konsantrasyonu ± 2 mg/ml'dir. Bulusun bazi yapilarinda, NaCl, 4-10 mg/ml konsantrasyonunda, ömegin 9,0, 7,0, 6,75 veya 4,5 mg/ml konsantrasyonunda kullanilabilir.

Bu bulusa konu olan bilesimlerde genelde bir tampon da yer alacaktir.

Bu amaçla kullanilabilecek standart tampon bir fosfat tamponudur.

Bulusa konu olan bilesimler, baska immünoregüle edici ajanlar ile birlikte uygulanabilirler. Bilesimler, bir alüminyum tuzu adjuvaninin aralariiida bulunmadigi bir veya daha fazla sayida adjuvan barindirabilirler. Kullaiiilabilecek adjuvanlar arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, asagida açiklanaiilar bulunur: A. Mineral içeren bilesimler Bu bulus kapsaminda adjuvan olarak kullanima uygun mineral içeren bilesimler arasinda, kalsiyum tuzlari (ya da bunlardan olusan karisiinlar) gibi mineral tuzlari bulunur. Kalsiyum tuzlarina örnek olarak kalsiyum fosfat (ömegin, referans 123'te açiklanan "CAP" partikülleri) gösterilebilir. Bu tuzlarla adsorbsiyon iliskisi kurulmasi tercih edilir. Mineral içeren bilesimler, bir metal tuzu partikülü olarak da formüle edilebilirler [124].

B. Yag emülsivonlari Bu bulus kapsaminda adjuvan olarak kullanima uygun yag einülsiyonu bilesimleri arasinda, MF59 (bir mikro-akiskanlastirici kullanilarak mikron alti partiküller halinde formüle edilen ve %5, Skualen, %O,5 Tween 80 ile %0,5 Span 85'ten olusan ürün) gibi skualen-su emülsiyonlari bulunur [ayrica bkz: referanslar 125-127].

MF59, FLUADTM influenza Virüsü trivalent alt-birim asisinda ad juvan olarak kullanilmaktadir.

Bilesimlerde kullanilmasi 'ozellikle tercih edilen adjuvanlar mikron alti boyutlardaki suda-yag emülsiyonlaridir. Mikron alti boyutlardaki suda-yag emülsiyonlarindan tercih edilenleri ise, istege bagli olarak degisken miktarlarda MTP-PE ihtiva edebilecek olan skualen/su emülsiyonlari, `Örnegin %4-5 a/h skualen, %O,25-1,0 a/h Tween 80 (polioksietilensorbitan monooleat) ve/Veya %0,25-1,0 Span 85 (sorbitan trioleat) ve istege bagli olarak N-asetilmurainil-L-alanil-D- izoglutaminil -L-alanin-2-( 1 '-2 '-dipalmitoil -sn-gliser0-3 - hidroksifosfoforiloksi)-etilamin (MTP-PE) ihtiva eden mikron alti boyutlardaki bir suda-yag emülsiyonudur. Mikron alti boyutlardaki suda-yag emülsiyonlari, bu emülsiyonlari yapma yöntemleri ve bulus konusu bilesimlerde kullanima uygun immünostimüle edici ajanlar, anlatilmakta ve açiklanmaktadirlar. Bulus kapsaminda adjuvan olarak tamamlanmis Freund adjuvani (CFA) ve tamamlanmamis Freund ad juvani (IFA) da kullanilabilir.

C. Saponin formülasvonlari Bu bulus kapsaminda adjuvan olarak saponin formülasyonlari da kullanilabilir. Saponinler, türlü çesit bitki türünün kabuk, yaprak, gövde, sap, kök ve hatta çiçek kisimlarinda bulunan ve sterol glikozitler ile triterpenoid glikozitlerden olusan heterolog bir gruptur.

Quillaia saponaria Molina agacinin kabugundan elde edilen saponinlerin adjuvan olarak tasidiklari potansiyel epey kapsamli sekilde incelenmis ve çalisilmistir. Ticari piyasada Sniilax ornata (saparna), Gypsophila paniculata (bahar yildizi) ve Saponaria officianalis'den (sabunotu) elde edilmis olan saponinler de vardir.

Saponin adjuvan forinülasyonlari arasinda, QSZ] gibi saflastirilmis forinülasyonlar ve ISCOM'lar gibi lipid forinülasyonlari bulunur.

Saponin bilesimleri, HPLC ve RP-HPLC kullanilarak saflastirilmistirlar. Bu teknikler kullanilarak belirlenmis olan spesifik saf fraksiyonlar arasinda, QS7, QSl7, QSlS, QSZl, QH-A, QH-B ve QH-C bulunur. Tercih edilen saponin QSZl'dir. Referans l30'da, QSZ] üretmeye yönelik bir yöntem açiklanmaktadir. Saponin formülasyonlari, kolesterol gibi bir sterol de ihtiva edebilirler [131].

Saponinler ile kolesterollerden olusan kombinasyonlar, immünostimüle edici kompleksler (ISCOM'lar) adiyla bilinen özgün ve essiz partiküller olusturinak ainaciyla kullanilabilirler. bir fosfolipid de bulunur. lSCOM'larda bilinen herhangi bir saponin kullanilabilir. ISCOM'da tercihen Quil A, QHA ve QHC'den biri veya birden fazlasi bulunur. ISCOM'lar, referanslar 131-133'te daha ayrintili anlatilinaktadirlar. Istege bagli olarak, ISCOM'lar ilaveten herhangi bir deterjan ihtiva etmeyebilirler [134].

Referanslar 135 & l36'da, saponin bazli adjuvanlarm gelistirilme sürecine iliskin derleyici bilgi ve veriler bulunabilir.

D. Virozomlar ve virüs benzeri partiküller Bu bulus kapsaminda adjuvan olarak virozomlar ve Virüs Benzeri Partiküller de (VLP'ler) kullanilabilir. Bu yapilar, genelde, istege bagli olarak bir fosfolipidle kombine veya formüle edilen bir virüs kaynakli bir veya daha fazla sayida protein ihtiva ederler. Bunlar genelde patojenik olmazlar, replike olmazlar ve nativ Viral genomun herhangi bir kismini içermezler. Viral proteinler tam virüslerden rekombinan yollarla üretilebilir veya izole edilebilirler. Virozomlar veya VLP'lerde kullaniina uygun olan bu viral proteinler arasinda, influenza Virüsü (örnegin HA veya NA), Hepatit B virüsü (ömegin çekirdek veya kapsid proteinleri), Hepatit E virüsü, kizamik virüsü, Sindbis virüsü, Rotavirüs, sap hastaligi Virüsü, Retrovir'ûs, Norwalk virüsü, insan papilloma virüsü, HIV, RNA-fajlari, Qß-faji (örnegin kilif proteinleri), GA-faji, fr-faji, AP205 faji ve Ty'den (örnegin retrotransposon Ty proteini pl) elde edilen proteinler bulunur. VLP'ler, referanslar 137- l42'de daha ayrintili bir dille anlatilinakta ve açiklanmaktadirlar.

Virozomlar ise, örnegin referans 143'te daha ayrintili bir dille anlatilmakta ve açiklanmaktadirlar.

E. Bakteriyel veya mikrobiva] derivatlar Kullanima uygun ad juvanlar arasinda, enterobakteriyel lipopolisakkaridin (LPS) toksik olmayan derivatlari, Lipid A derivatlari, immünostimüle edici oligonükleotidler ve ADP ribozilasyonu yapan toksinler ve onlarin detoksifiye derivatlari gibi bakteriyel veya inikrobiyal derivatlar da bulunur.

LPS'nin toksik olmayan derivatlari arasinda, monofosforil lipid A (MPL) ve 3-O-deasile MPL (3dMPL) bulunur. 3dMPL, 4, 5 veya 6 adet asile zincir ihtiva eden bir 3-de-O-asile monofosforil lipid A karisimidir. 3-de-O-asile monofosforil lipid A'nin tercih edilen "küçük partikül" forinu referans l44'te açiklanmaktadir. Bu 3dMPL "küçük partikülleri", bir 0,22 um membran araciligiyla steril filtrelenmeye yetecek kadar küçük ebatlara sahiptirler [144]. Diger toksik olmayan LPS derivatlari arasinda, aminoalkil glukozaminid fosfat derivatlari, örnegin RC-529 gibi monofosforil lipid A mimetikleri bulunur [145, 146].

Lipid A derivatlari arasinda, Örnegin OM-174 gibi Escherichia coli kaynakli lipid A derivatlari bulunur. OM-174, ömegin referanslar 147 Bu bulusta kullanima uygun immûnostimüle edici oligonükleotidler arasinda, bir CpG motifi ihtiva eden nükleotid sekaiislari (bir fosfat bagi araciligiyla bir guanozine bagli olan bir metillenniemis sitozin ihtiva eden bir dinükleotid sekansi) bulunur. Palindromik veya poli(dG) sekanslari ihtiva eden çift iplikçikli RNA'lar ve oligon'ûkleotidlerin de immünostimüle edici bir karaktere sahip olduklari rapor edilmistir.

CpG'ler arasinda fosforotioat modifikasyonlari gibi nükleotid modifikasyonlari / aiialoglari da sayilabilir ve CpG'ler çift iplikçikli ya da tek iplikçikli olabilirler. Referanslar 149, 150 ve 151'de, olasi analog ikameler, 'Örnegin guanozinin 2'-deoksi-7-deazaguaiiozin ile degistirilmesi yoluyla olusturulan bir analog anlatilmakta ve açiklanmaktadir. CpG oligonükleotidlerinin adjuvan etkisi referanslar 152-157'de daha ayrintili açiklanmakta ve tartisilmaktadir.

CpG sekansi, TLR9'u, `Örnegin GTCGTT veya TTCGTT motifini hedef alan bir sekans olabilir [158]. CpG sekaiisi bir Th'l immün cevabi indüklemeye özgü bir sekans, örnegin bir CpG-A ODN olabilir ya da bir B hücresi cevabi ind'ûklemeye 'Özgü bir sekans, 'Örnegin bir CpG-B ODN olabilir. CpG-A ve CpG-B ODN'ler, referanslar 159- 161'de açiklanmakta ve tartisilmaktadirlar. CpG'nin bir CpG-A ODN olmasi tercih edilir.

CpG oligonükleotidi, tercihen, 5' ucu reseptör tanimasina açik ve müsait olacak sekilde yapilir. Istege bagli olarak, iki CpG oligonükleotid sekansi 3' uçlari üzerinden birbirlerine tutturularak ADP ribozilasyonu yapan bakteriyel toksinler ve onlarin detoksifiye derivatlari da bu bulusta ad juvan olarak kullaiiilabilirler. Söz konusu proteinin E. coli (isiya dayaniksiz E. coli enterotoksini "LT“), kolera toksini ("CT") ya da bogmaca toksini ("PT") kaynakli olmasi tercih edilir. ADP ribozilasyonu yapan detoksifiye toksinlerin mukoza] adjuvanlar olarak kullanimi referans 165'te, parenteral ad juvanlar olarak kullanimi ise referans 166'da anlatilmakta ve açiklanmaktadir.

Toksin veya toksoidin hem A alt-birimini hem de B alt-birimini içeren bir holotoksin formunda olmasi tercih edilir. A alt-biriminin bir detoksifiye edici inutasyon barindirniasi, B alt-biriminin ise inutasyona ugratilmamis olmasi tercih edilir. Ad juvanin LT-K63, LT- R72 ve LT-G192 gibi bir detoksifiye LT mutanti olmasi tercih edilir.

ADP ribozilasyonu yapan toksinlerin ve onlarin detoksifiye derivatlarinin, özellikle de LT-K63 ve LT-R72'nin adjuvanlar olarak kullanimi referanslar 167-174'te açiklanmakta ve anlatilmaktadir.

Amino asit ikainelerine iliskin sayisal atiflarin atif yoluyla bütün olarak bu tarifnameye dahil edilmis sayilan referans l75'te ortaya konan ADP ribozilasyonu yapan toksinlerin A ve B alt-birimleri arasindaki hizalamalara dayanmasi tercih edilir.

F. Insan imm'i'inomod'ûlatörleri Bu bulusta ad juvan olarak kullanima uygun insan immünomodülatörleri arasinda, sitokinler, örnegin interlökinler edici faktör ve tümör nekroz faktörü bulunur.

G. Bivoadezitler ve mukoadezifler Biyoadezifler ve mukoadezifler de bu bulusta adjuvan olarak kullanilabilirler. Uygun biyoadezifler arasinda, esterifiye hyalüronik asit mikrosferleri [178] ya da poli(akrilik asit), polivinil alkol, polivinil pirolidon, polisakkaritler ve karboksimetilselülozun çapraz bagli derivatlari gibi mukoadezifler sayilabilir. Bulus kapsaininda ad juvan olarak kitosan ve kitosan derivatlari da kullanilabilir [179].

H. Mikropartik'ûller Bu bulusta adjuvan olarak mikropartiküller de kullanilabilir.

Poli(laktid-k0-glikolid) ile toksik olmayan biyobozunur maddelerden (örnegin bir poli(a-hidroksi asit), bir polihidroksibütirik asit, bir poliortoester, bir polianhidrit, bir polikaprolakton ve benzerleri) yapilan ve istege bagli olarak, bir negatif yüklü yüzeye sahip olmalari için (örnegin SDS ile) ya da bir pozitif yüklü yüzeye sahip olmalari için (Örnegin CTAB gibi bir katyonik deterjan ile) islemden geçirilmis olan mikropartiküller (yani, çaplari yaklasik 100 nm ile yaklasik 150 nm arasi, daha çok tercihen yaklasik 200 nm ile yaklasik 30 um arasi ve en çok tercihen yaklasik 500 nm ile yaklasik 10 nm arasi bir uzunlukta olan partiküller) tercih edilirler.

Adjuvan olarak kullaniina uygun lipozoin formülasyonu 'ornekleri referanslar 1 80-] 82'de açiklanmaktadir.

J. Polioksietilen eter ve polioksietilen ester formülasyonlari Bu bulus kapsaminda kullanima uygun adjuvanlar arasinda polioksietilen eterler ve polioksietilen esterler de bulunur [183]. Bu gibi formülasyonlar arasinda, bir oktoksinolle kombinasyon halinde polioksietilen sorbitan ester yüzey aktif inaddeleri [184] ve ayrica en az bir adet ek iyonik olinayan yüzey aktif maddeyle, örnegin bir oktoksinolle kombinasyon halinde polioksietilen alkil eterler veya ester yüzey aktif maddeleri de bulunur [185]. Tercih edilen polioksietilen eterler sunlardir: polioksietilen-9-lauril eter (laureth 9), polioksietilen-9-steoril eter, polioksietilen-8-steoril eter, polioksietilen-4-1auril eter, polioksietilen-35-lauril eter ve K. Polifosfazen (PCPP) PCPP formülasyonlari örnegin referanslar 186 ve 187'de açiklanmakta ve anlatilmaktadirlar.

L. Muramil peptidler Bu bulus kapsaminda ad juvan olarak kullanima uygun muramil peptid örnekleri arasinda, N-asetil-muramil-L-treonil-D-izoglutamin (thr- MDP), N-asetil-normuramil-L-alanil-D-izoglutamin (nor-MDP) ve N- asetilmuramil-L-alanil -D-izoglutaminil-L-alanin-2-(1 '-2'dipalmitoil- sn-glisero-3-hidroksifosforiloksi)-etilamin (MTP-PE) sayilabilir.

M.Imidazokinolon bilesikleri Bu bulus kapsaminda ad juvan olarak kullanima uygun imidazokinolon bilesigi örnekleri arasinda, referanslar 188 ile 189'da daha ayrintili ele alinmakta olan Imikimod ve Imikimod analoglari bulunur (örnegin Bu bulus kapsaminda adjuvan olarak kullanima uygun tiosemikarbazon bilesigi örnekleri ve ayrica bunlari formüle etme, üretme ve tarama yöntemleri referans 190'da anlatilmakta ve açiklanmaktadir. Tiosemikarbazonlar 'ozellikle insan periferal kan mononükleer hücrelerini TNF-(x gibi sitokinler üretme yönünde stimüle etme konusunda etkin ve etkilidirler.

O. Triptantrin bilesikleri Bu bulus kapsaminda adjuvan olarak kullanima uygun triptantrin bilesigi örnekleri ve ayrica bunlari formüle etme, üretme ve tarama yöntemleri referans l91'de anlatilmakta ve açiklanmaktadir.

Triptantrin bilesikleri özellikle insan periferal kan mononükleer hücrelerini TNF-a gibi sitokinler üretme yönünde stimüle etme konusunda etkin ve etkilidirler.

Bu bulus, yukarida belirtileii adjuvanlardan birideii veya birden fazlasini ihtiva eden adjuvan kombinasyonlari da kapsar. Bu bulus kapsaminda `Örnegin asagida siralanan adjuvan bilesimleri kullanilabilir: (1) bir saponin ve bir suda-yag emülsiyonu [192]; (2) bir saponin (örnegin QSZl) + bir toksik olmayan LPS derivati olmayan LPS derivati (ömegin 3dMPL) + bir kolesterol; (4) bir saponiii (örnegin QSZl) + 3dMPL + IL-12 (istege bagli olarak + bir sterol) [194]; (5) 3dMPL ile örnegin QSZl ve/veya suda-yag emülsiyoiilariiidan olusan kombinasyonlar [195]; (6) ya mikro- akiskanlastirmaya tâbi tutularak mikron alti ebatlara sahip bir emülsiyon haline getirilen ya da girdaplanarak büyük partikül ebatlarina sahip bir emülsiyon haline getirilen %10 skualen, %0,4 Tween 80““, %5 pluronik blok poliineri L12] ve thr-MDP'nin bulundugu SAF; (7) monofosforilipid A (MPL), trehaloz dimikolat (TDM) ve hücre duvari iskeleti (CWS) arasindan seçilen ve tercihen MPL + CWS'yi teskil eden (DetoxTM) bir veya daha fazla sayida bakteriyel hücre duvari koniponenti, %2 skualen ve %0,2 Tween 80 ihtiva eden RibiTM adjuvan sistemi (RAS) (Ribi Immunochem); ve (8) bir veya daha fazla sayida mineral tuzu + bir toksik olmayan LPS derivati (örnegin 3dMPL).

Konjugatlarin hepsinin adsorbe olmasi gerekmez, yaiii koiijugatlarin bir kisini veya tainaini çözeltide serbest halde bulunabilir.

Tedavi yöntemleri Bu bulus, bir memelide bir immün cevap ortaya çikarmak için olan ve o memeliye bulusa konu olan bir farmasötik bilesimi uygulamaya dayanan bir yöntemde kullanima yönelik immünojenik bilesiinler de ortaya koyar. Bahsi geçen immün cevabin koruyucu bir cevap olmasi tercih edilir ve bu cevapta rol oynayan unsurlar arasinda tercihen antikorlar da bulunur. Söz konusu yöntem, kuvvetlendirici bir cevap ortaya çikarabilir.

Bahsi geçen memelinin bir insan olmasi tercih edilir. Hazirlanan asi profilaktik amaçli kullanim için ise, uygulama yapilacak insanin bir çocuk (örnegin bir yeni yeni yürümeye baslamis bir çocuk ya da bebek) veya bir ergen olmasi tercih edilir; diger yandan, hazirlanan asi terap'otik amaçli kullaniin için ise, uygulama yapilacak insanin bir yetiskin olmasi tercih edilir. Çocuklarda kullanilmasi hedeflenen bir asi, 'Örnegin güvenlik, dozaj, immünojenisite veya benzeri baska yönlerden degerlendirmek maksadiyla yetiskinlere de uygulanabilir.

Tedavi için tercih edilen insan popülasyonlarindan biri, dogurganlik çagindaki kadinlardir (örnegin genç ve üstü). Tercih edilen bir diger popülasyon hamile kadinlardir. Yasli hastalar (örnegin 50, 60, 70, 80 veya 90 yasindan yasli olanlar, bilhassa 65 yasindan yasli olanlar), özellikle de GBS enfeksiyonu riskinin normal kosullara kiyasla daha fazla olabilecegi bakimevlerinde yasayan yasli hastalar ([196]), tedavi için tercih edilen bir diger insan popülasyonunu teskil ederler.

Bulusun bazi yapilarinda, uygulama yapilacak insanda, GBS serotipi bilesim uygulanmadan önce tespit edilemez bir düzeyde bulunurlar.

Bulusun baska yapilarinda, uygulama yapilacak insanda, GBS serotipi bilesiin uygulanmadan önce tespit edileinez bir düzeyde bulunurlar.

Bulusun baska yapilarinda, uygulama yapilacak insanda, GBS serotipi uygulaninadan önce tespit edilemez bir düzeyde bulunurlar. Uygulama yapilacak insanda, GBS serotipi Ia'ya iliskin kapsüler sakkaridi hedef alan antikorlar ve GBS serotipi Ib'ye iliskin kapsüler sakkaridi hedef alan antikorlar farmasötik bilesim uygulanmadan önce tespit edilemez düzeylerde bulunabilirler. Alternatif veya ek olarak, uygulama yapilacak insanda, GBS serotipi III'e iliskin kapsüler sakkaridi hedef alan antikorlar farmasötik bilesim uygulanmadan önce tespit edilemez bir düzeyde bulunabilirler. Kapsüler sakkarit(ler)i hedef alan antikorlarin seviye(ler)i, asagidaki Insan Çalismasi (1)'de açiklanan ELISA uygulanarak belirlenebilirler. Bahsi geçen antikor seviye(ler)i, uygulamadan bir ay önceki, bilhassa uygulamadan 'Önceki bir ay içerisindeki (örnegin uygulaina günündeki veya uygulainadan önceki iki hafta veya bir hafta içerisindeki) seviyeler olabilirler. Kapsüler sakkarit(ler)i hedef alan antikorlarin tespit edileinez seviye(ler)de bulundugu kadinlarin bebeklerinde GBS enfeksiyonu oranlari daha yüksek olabilir. Bunun nedeni, GBS kapsüler sakkaritlerini hedef alan maternal antikorlarin seviyeleri ile bebeklerdeki hastalik riski arasinda bir ters orantinin söz konusu olmasidir [referanslar 197 ve 198]. Buna bagli olarak, bu bulusta bu kadinlarda uygulama yapilmasi Özel olarak tasarlanmaktadir.

Bulusun bazi yapilarinda, hasta, örnegin asagidaki Onceden immünize edilen hasta bölümünde bulusun ikinci özelligine istinaden açiklanmis oldugu gibi bir difteri toksoidi veya onun bir derivati ile önceden immünize edilmistir. Bulusun bu yapilarinda, immünojenik bilesimdeki konjugatlardan en az birinin bir GBS kapsüler sakkaridi ile ona konjuge bir difteri toksoidi veya onun bir derivatindan olusan bir konjugat olmasi tercih edilir. Bulus sahipleri, hasta bir difteri toksoidi veya onun bir derivati ile önceden immünize edilinis oldugunda sakkaridi o difteri toksoidi veya onun derivati üzerinde suninak suretiyle kapsüler sakkaride verilecek immün cevabin kuvvetlendirilebilecegini saptamislardir. Bilesimde bulunan difteri toksoidi veya onun derivatma kon juge kapsüler sakkarit, örnegin GBS serotipi Ia, Ib veya Ill'e iliskin bir sakkarit olabilir. Kapsüler sakkarit, örnekte gösterildigi gibi). Bulusun bu yapilarinda, bilesimde bulunan GBS kapsüler sakkaritlerinin hepsinin bir difteri toksoidi veya onun bir derivatina konjuge edilmis olmasi tipik uygulamayi teskil eder.

Tasiyici veya ön-imm'ûnizasyon anti jeninin bir difteri toksoidinin bir derivati olniasi halinde, 0 derivatin Dt'ye karsi sahip oldugu immünolojik çapraz-reaktivitesini koruyan bir derivat olmasi ve spesifik olarak CRM 197 olniasi tercih edilir.

Bu bulus, bir ilaç olarak kullanim için olan bulusa uygun bir bilesim de ortaya koyar. Bahsi geçen ilacin bir inemelide bir immün cevap ortaya çikmasini saglayabilecek bir ilaç olmasi (yani bir immünojenik bilesim olmasi) tercih edilir ve bir asi olmasi daha çok tercih edilir.

Bu bulus, bulusa uygun bir bilesiniiii bir memelide bir immün cevap ortaya çikarmaya yönelik bir ilacin üretiminde kullaniini ile de Bu kullanim alanlari ve yöntemleri, tercihen, S. agalactiae'nin sebep oldugu bir hastaligin, örnegin neonatal sepsis veya bakteremi, neonatal pnömoni, neonatal menenjit, endometrit, osteomiyelit, septik artrit veya benzeri bir hastaligin önleninesi ve/veya tedavisi içindir.

Hastaligin önlenmesinin hedeflendigi denek, bulusa konu olan konjugatin verildigi denek olmayabilir. Örnegin, bir konjugat bir disiye onun yavrusunu veya yavrularini korumak maksadi ile (gebelikten önce veya gebelik esnasinda) uygulanabilir (buna Terapötik tedavinin etkinligini kontrol etme yollarindan birinde, bulusa konu olan bilesim uygulandiktan sonra GBS enfeksiyonu izlenir. Profilaktik tedavinin etkinligini kontrol etme yollarindan birinde, bilesim uygulandiktan sonra GBS anti jenlerine karsi gelisen immün cevaplar izlenir.

Bulusa uygun olan bilesimlerden tercih edilenleri, bir hastada, insan deneklerin kabul edilebilir bir yüzdesi için her anti jenik komponente iliskin serokoruma kriterinden daha üstün bir antikor titresi olusmasini saglayabilen bilesimlerdir. Uygulama yapilan konakçida anti jene karsi serokonversiyon gerçeklesmis oldugu yönünde bir degerlendirmede bulunulmasini saglayan asgari antikor titreleri iyi bilinirler ve bu titre degerleri WHO gibi kurum ve örgütler tarafindan yayimlanirlar.

Istatistiksel açidan anlamli bir denek örneklem grubunun tercihen tercihen %93'ünden fazlasi ve en çok tercihen %96 ilâ %100'ü serokonverte olur.

Bulusa konu olan bilesimler bir hastaya genelde dogrudan uygulanacaklardir. Dogrudan uygulama, parenteral enjeksiyon (örnegin subkütan, intraperitoneal, intravenöz, intramüsküler ya da bir dokunun interstisyel alanina dogru) ya da rektal, oral, vajinal, topikal, transdermal, intranazal, oküler, aural, pilinoner veya baska bir yolla gerçeklestirilen mukozal uygulama ile yapilabilir. Uyluk veya üst kola dogru yapilan intramüsküler uygulama tercih edilir. Enjeksiyon bir igne (örnegin bir hipodermik igne) araciligiyla gerçeklestirilebilir, fakat bununla birlikte alteriiatif olarak bir ignesiz enjeksiyon da gerçeklestirilebilir. Tipik bir intramüsküler doz 0,5 ml'dir.

Bu bulus, sistemik ve/Veya mukozal immünite ortaya çikarmak maksadi ile kullanilabilir.

Dozaj bir tek doz programina ya da bir çok dozlu programa dayanabilir. Primer immünizasyon programinda da rapel immünizasyon programinda da birden çok doz kullanilabilir. Bir primer doz programini takiben bir rapel doz programi uygulanabilir.

Primer dozlar arasinda (örnegin 4-16 hafta arasi) ve primer dozlar ile rapel dozlari arasinda birakilacak olan süre rutin ve standart yollarla belirlenebilir.

GBS proteini antijenleri Yukarida belirtildigi gibi, bulusa konu olan bilesimlere GBS proteinleri katilabilir. Bunlar, bulusa konu olan konjugatlar için tasiyici proteinler olarak, baska konjugatlar için tasiyici proteinler olarak ya da baska bir unsur ile konjuge eilmemis protein antijenleri olarak kullanilabilirler.

Bu bulusta kullanima uygun GBS proteini anti jenleri arasinda, referanslar 99 ve 202-204'te açiklananlar bulunur. Bu bulusta kullanilmasi tercih edilen iki GBS proteini anti jeni sunlardir: GB867 ve GBSSO [bkz: referans 99]. Bu bulusta kullanilmasi tercih edilen bir diger GBS proteini anti jeni Spbl olarak bilinir [bkz: referans 205]. Bu üç anti jene iliskin ek ayrintilar asagida verilmektedir.

Bu üç GBS proteininin tam boy sekanslari burada SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 3 olarak sunulmaktadir. Dolayisiyla, bu bulusa konu olan bilesimlerde, (a) SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 3 arasindan seçilen bir amino asit sekansi içeren bir polipeptid ve/Veya (b) (i) SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 3'ten biri veya birden fazlasi ile sekans Özdesligine sahip olan bir amino asit sekansini ve/veya (ii) SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 3'ten birinin bir fragmanini içeren bir polipeptid bulunabilir.

Bulusa konu olan bilesiinler, bu GBS proteini anti jenlerinden olusan karisiinlar da barindirabilirler.

Konuyu somutlastirmak gerekirse, bulusa konu olan bilesimlerde asagida belirtilenler bulunabilir: (al) SEKANS KOD NO.: 1 amino asit sekansini içeren bir polipeoptid ve/veya (b]) (i) SEKANS KOD NO.: 1 ile sekans özdesligine sahip olan bir amino asit sekansini ve/Veya (ii) SEKANS KOD NO.: l'in bir fragmanini içeren bir polipeptid; (az) SEKANS KOD NO.: 2 amino asit sekansini içeren bir polipeoptid ve/Veya (bz) (i) SEKANS KOD NO.: 2 ile sekans özdesligine sahip olan bir ainino asit sekansini ve/Veya (ii) SEKANS KOD NO.: 2'nin bir fragmanini içeren bir polipeptid.

Benzer sekilde, bulusa konu olan bilesiinlerde asagida belirtilenler bulunabilir: (al) SEKANS KOD NO.: 1 amino asit sekansini içeren bir polipeoptid ve/veya (b) (i) SEKANS KOD NO.: 1 ile sekans özdesligine sahip olan bir amino asit sekansini ve/Veya (ii) SEKANS KOD NO.: l'in bir fragmanini içeren bir polipeptid; (az) SEKANS KOD NO.: 3 amino asit sekansini içeren bir polipeOptid ve/veya (bz) (i) SEKANS KOD NO.: 3 ile sekans özdesligine sahip olan bir amino asit sekansini ve/Veya (ii) SEKANS KOD NO.: 3'i`in bir fragmanini içeren bir polipeptid.

Yine ayni sekilde, bulusa konu olan bilesimlerde asagida belirtilenler bulunabilir: (al) SEKANS KOD NO.: 2 amino asit sekansini içeren bir polipeoptid ve/Veya (b]) (i) SEKANS KOD NO.: 2 ile sekans özdesligine sahip olan bir amino asit sekansini ve/Veya (ii) SEKANS KOD NO.: 2'nin bir fragmanini içeren bir polipeptid; (az) SEKANS KOD NO.: 3 ainino asit sekansini içeren bir polipeoptid ve/Veya (bg) (i) SEKANS KOD NO.: 3 ile sekans özdesligine sahip olan bir amino asit sekansini ve/Veya (ii) SEKANS KOD NO.: 3'ün bir fragmanini içeren bir polipeptid.

Bulusa konu olan bilesimlerde asagida belirtilenler bulunabilir: (al) SEKANS KOD NO.: 1 amino asit sekansiiii içeren bir polipeoptid ve/Veya (bi) (i) SEKANS KOD NO.: 1 ile sekaiis özdesligine sahip olan bir amino asit sekansini ve/Veya (ii) SEKANS KOD NO.: l'in bir fragmanini içeren bir polipeptid; (az) SEKANS KOD NO.: 2 ainino asit sekansini içeren bir polipeoptid ve/Veya (hz) (i) SEKANS KOD NO.: 2 ile sekans özdesligine sahip olan bir ainino asit sekansini ve/Veya (ii) SEKANS KOD NO.: 2'nin bir fragmanini içeren bir polipeptid; (a3) SEKANS KOD NO.: 3 amino asit sekansini içeren bir polipeoptid ve/Veya (b3) (i) SEKANS KOD NO.: 3 ile sekans özdesligine sahip olan bir amino asit sekansini ve/Veya (ii) SEKANS KOD NO.: 3'ün bir fragmanini içeren bir polipeptid.

Bu bulusta kullanilmasi tercih edilen diger üç GBS proteini antijeni, GBSlO4, GBSZ76 ve GBS322 olarak bilinir [bkz: referans 99].

Serotip V izole sus 2603 V/R'den elde edilen yabani tip GBSlO4 amino asit sekansi referans 21'de SEKANS KOD NO.: 3 olarak sunulmaktadir. Bu bulusun yapilarinin SEKANS KOD NO.: l'e yapilan atif veya atiflar çerçevesinde tanimlanmis oldugu pasajlarda, SEKANS KOD NO.: l'e yapilan söz konusu atif veya atiflar referans 21'deki SEKANS KOD NO.: 3'e yönelik atif veya atiflar ile degistirilebilirler. Serotip V izole sus 2603 V/R'den elde edilen yabani tip GBSZ76 amino asit sekansi referans 21'de SEKANS KOD NO.: 4 olarak sunulmaktadir. Bu bulusun yapilarinin SEKANS KOD NO.: 2'ye yapilan atif veya atiflar çerçevesinde tanimlanmis oldugu pasajlarda, SEKANS KOD NO.: Z'ye yapilan söz konusu atif veya atiflar referans 21'deki SEKANS KOD NO.: 4'e yönelik atif veya atiflar ile degistirilebilirler. Serotip V izole sus 2603 V/R'den elde edilen yabani tip GBS322 amino asit sekansi referans 21'de SEKANS KOD NO.: 5 olarak sunulmaktadir. Bu bulusun yapilarinin SEKANS KOD NO.: 3'e yapilan atif veya atiflar çerçevesinde tanimlanmis oldugu pasajlarda, SEKANS KOD NO.: 3'e yapilan söz konusu atif veya atiflar referans 21'deki SEKANS KOD NO.: 5'e yönelik atif veya atiflar ile degistirilebilirler.

Hangi SEKANS KOD NUMARASININ söz konusu olduguna bagli olarak, (i)'de bahsi geçen sekans özdesliginin %50'den yüksek olmasi polipeptidler arasinda, homologlar, ortologlar, allelik varyantlar ve fonksiyonel mutantlar bulunur. Iki polipeptid sekansi arasinda %50 veya daha yüksek bir özdeslik bulunmasi genelde bir fonksiyonel denklik göstergesi olarak kabul edilir. Polipeptidler arasindaki özdeslik, tercihen, MPSRCH programinda (Oxford Molecular) uygulandigi haliyle Smith-Waterman homoloji tarama algoritmasi kullanilarak ve bosluk açma bedeli = 12 ve bosluk uzatma bedeli = 1 olarak ayarlanip bir afin bosluk taramasi yapilarak belirlenir.

Hangi SEKANS KOD NUMARASININ söz konusu olduguna bagli olarak, (ii)'de bahsi geçen fragmanlar, ilgili sekanslarda yer alan ardisik dizili en az n adet amiiio asidi içermelidirler ve ilgili sekansa bagli olarak, burada geçen n, 7 veya daha büyük bir sayidir (örnegin 8, 100 veya daha büyük). Fragman, ilgili sekansta yer alan en az bir adet T-hücresi veya tercihen bir B-h'ûcresi epitopunu barindirabilir. T- ve B-hi'icresi epit0plari, ampirik olarak (örnegin PEPSCAN [206, 207] veya benzeri yöntemler) belirlenebilirler ya da çesitli yöntein ve yaklasimlar çerçevesinde (örnegin Jameson-Wolf antijenik indeksi hidrofilisite [216], antijenik indeks [217] ya da referans 218'de açiklanan yöntemler veya benzeri teknik veya yöntemler kullanilarak) kestirilebilirler. Diger tercih edilen fragmanlar, SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 3 sekanslarinin N-terminal ainino asit artigi ya da N-terminal sinyal peptidi bulunmayan versiyonlaridir. Bir veya daha fazla sayida domain, örnegin bir lider veya sinyal sekansi bölgesi, bir transmembraii bölge, bir sitoplazmik bölge veya bir hücre duvari ankorlama motifi çikarilabilir. Belli bir proteine ait tercih edilen fragmanlar, o proteinin tam boy formuna baglanabilen bir antikora baglanabilecek, örnegin SEKANS KOD NO.: 1, 2 veya 3 sekansina baglanan bir antikora baglanabilecek olan yapilardir. Asagida bazi kullanima uygun fragmanlar belirtilmektedir (SEKANS KOD NO.: 4 Bu polipeptidlerde, SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 3 sekanslarina kiyasla, benzeri) konservatif amino asit degisikligi söz konusu olabilir; baska bir deyisle, bir amino asit, iliskili bir yan zincire sahip olan baska bir amino asit ile degistirilmis olabilir. Genetik olarak kodlanan amino asitler genel itibariyla dört aileye ayrilirlar: (1) asidik, yani aspartat, glutamat; (2) bazik, yani lizin, arjinin, histidin; (3) polar olmayan, yani alanin, valin, lösin, izol'ösin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; ve (4) yüksüz polar, yani glisin, asparajin, glutamin, sistein, serin, treonin, tirozin. Fenilalanin, triptofan ve tirozin bazen birlikte aromatik amino asitler olarak siniflandirilirlar. Bu ailelere mensup tekil ainino asitlerle yapilan substitüsyonlarin genelde biyolojik aktiviteye dönük majör bir etkisi olmaz. Polipeptilerde, SEKANS KOD NO.: 1 ila 3 sekanslarina kiyasla bir veya daha fazla sayida delesyon da söz konusu olabilir. Polipeptilerde, SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 3 sekanslarina kiyasla bir veya daha fazla sayida (örnegin, 1, 2, 3, veya 5 adet amino asitten olusan) da söz konusu olabilir.

Bu bulusa konu olan polipeptidler, birçok farkli yolla, örnegin kimyasal sentez yoluyla (kismen veya bütün olarak), daha uzun boylu polipeptidlerin proteazlardan istifade edilerek parçalanmasi yoluyla, RNA'dan translasyon yoluyla, (ömegin rekombinan ekspresyon ile edinilen) hücre kültüründen, organizmanin kendisinden (örnegin bakteriyel kültürden sonra veya dogrudan hastalardan) saflastirma yoluyla ve benzeri baska bir yolla hazirlanabilirler. 40'tan daha az sayida amino asidin yer aldigi peptidlerin üretimi için tercih edilen bir yöntemde in vitro kimyasal sentez gerçeklestirilir [219, 220]. Kati faz peptid sentezi, örnegin tBoc veya Fmoc [221] kimyasina dayanan yöntemler bilhassa tercih edilirler. Yapiya kismen veya tam olarak ulasmak için enziinatik senteze [222] de basvurulabilir. Kimyasal senteze bir alternatif olarak biyolojik sentez gerçeklestirilebilir, örnegin polipeptidler translasyon yoluyla üretilebilirler. Bu uygulama in vitro veya in vivo ortamda gerçeklestirilebilir. Biyolojik yöntemler genelde L-amino asitlerine dayanan polipeptidlerin üretimi ile sinirlidir, ancak translasyon düzenegi (ömegin aminoasil tRNA molekülleri) D-amino asitlerinin (veya diger dogal olmayan amino asitlerin, örnegin iyodotirozin veya metilfenilalanin, azidohomoalanin ve benzeri amino asitlerin) dahil oldugu polipeptidlerde çalismaya olanak saglayacak bir manipülasyona ugratilabilir [223]. Bununla birlikte, D-amino asitlerinin söz konusu oldugu durumlarda kimyasal senteze basvurulmasi tercih edilir. Bulusa konu olan polipeptidlerin C- terininal ve/veya N-terminallerinde kovalent modifikasyonlar olabilir.

Bu GBS proteinleri bulusa konu olan bilesimlerde çesitli farkli formlarda kullanilabilirler (örnegin nativ, füzyonlar, glikozile, glikozile olmayan, lipide, lipide olmayan, fosforile, fosforile olmayan, miristoile, miristoile olmayan, monomerik, multimerik, partiküllü, denatüre ve benzeri). Tercihen saflastirilmis veya büyük ölçüde saflastirilmis bir formda, baska bir deyisle baska polipeptidlerin (örnegin dogada kendiliginden olusan polipeptidlerin), özellikle de baska GBS veya konakçi hücre polipeptidlerinin yani sira mevcut olmadigi bir formda kullanilirlar.

Serotip V sus 2603 V/R'den sekanslanmis olan GBSÖ7'nin nükleotid ve ainino asit sekanslari referans 99'da SEKANS KOD NO.: 3745 & 3746 olarak sunulmaktadir. Amino asit sekansi burada SEKANS KOD NO.: 1 olarak sunulmaktadir: MRETJKFE [(1 LT LEE. LI-TLEJI PLH'HF.' LGET-.T'JFL'NI :AFRH L'.”.'PI}J'IIJCÇNK REHA? ?CU/.THM Hz' 5 IZ I EKI'TAEL'I SEZAI'FUHLL PSUYTLBEE I'ÄPEG'I'PIPIIIIlg!”Q'-'K`~`EL3IIGIII I IUNSGCENS I IGUNQEELH'IUSE P'IGI IF. IJ'IFEG OIL SNSHHNDI?III-"JRHIIKAEFAAEALGTN-'EU I LGÂIISDNR'›'ÃU\'Y`IGSC I FIC9.5'i'D'û'!CGFKEIÇC'ETYSUZ-'UI F! 1 "JTI S'i'P'JESTÂI !mi-*Kumu EE'JFECMK!.Iîü'i'LIîl/.SNFLLI'DE'IPEE IKî'JIIBES'i'FLFPLDSIC'DJI I SQIL/ÇIKLJIYLI ;HL REFF. F EFEY'K'TPI 'a'TT-.AEITF mu: 1 LSEÄÜWFETILTI'.ENRI'.'N'1TIEE HISSE lli' LC IIJIGCT :JJ-FS 3 x'TIJÇIIJi 1:11:11` HHDEIAIGBPHND'331LEE/KLEIN'SN'îLî'U'F GUI USEIGÇGI'.' `I l'I i'L"`\' H LDL' SF JSN ?î 5'i' [I'NlGR'rI'LHHLS E DH” L.? ÜFI'Z PF. I Kül/KEYFI' I I` I FIIIEI'ZIîLGE I E? I K'-'DKDNIIEL 2. LEGA'I F'îlßî FIiEUîI-IL'J' U" I EMINE-PIZ'K-'Iîîîgi'fgî 13 `:17 F I 1. I '389935 I &GSI 2' I HI-IF.':'I'CPI.?~1$ÜHE~ IKKD GBSÖ7, yukaridaki SEKANS KOD NO.: 1'de C-terminalin en yakinindaki alti çizili bölge olarak gösterilen bir C-terminal traiismembran bölge ihtiva eder. Bu transmembran bölgedeki bir veya daha fazla sayida amino asit çikarilabilir ya da transmembran bölgeden hemen önceki amino asit kesilebilir. Bu gibi bir GBS67 fragmaninin bir örnegi asagida SEKANS KOD NO.: 4 olarak sunulmaktadir.

E`- ?151 «DIN DS PHFQP H UTP! FIFA A813. DS 'l` F.`.'P~"[i I L !3 ANSCMF'VB LR'T'i'Gi& DI FEG Râ'flî'uri'l'ß î?' î F-I'l-"i' TG [Çil li' FT' 1 f." I'E -IT/FZ FE. `Ud l-TUFHLÄSÂE 'i'&1510FL&NEED;'i'LNEciNFLLTLI'IPELIE'ZGNGES i'I* Li F LGS YC'PÇ'I ISCIS LÜ! UI i' LDLH L RS FSEKFEYTTP IIFTSRMSNNEZ LS Z OWFETILTKENSI'JNG'I IEU FICCHINLOLGUGÇTLCFEC ITLZGNC'SS'.' Ml& [I: I .-`-.1".~I':F')JliEI'_~/SI LM: v'ln LE.! [GPJLL i' 'i'f-IBLNLGEG'SEN Il.? 'i' D-'En LITÜJ F J'Ç-'NPL F'i' ?Hit- 9 H LM Hâlâ EEIPNI LÜ. ÜLFIbKYQl I &3.1.75 PEEIYQF [ TUFP [ L TE"E`i"-'FGS I FNI Ikilik& l SETHEEGDKH LI TH'IH J F E !Gi IFN'I'YICQIIS I Lii GBSÖ7, yukaridaki SEKANS KOD NO.: l'de italik karakterle gösterilen ve bir hücre duvari ankorunun göstergesi olan bir amino asit motifi içerir. Bazi rekombirian konakçi hücre sistemlerinde, konakçi hücreden bir rekombinan GB567 proteininin salgilanmasini kolaylastirmak adina bu motifin çikartilmasi tercih edilebilir. Buna göre, bu bulusta kullanilmasi tercih edilen bir GB867 fragmaninda, GB867'deki transmembran ve hücre duvari ankoru motifi çikartilirlar.

Bu gibi bir GB867 fragmaninin bir örnegi asagida SEKANS KOD NO.: 5 olarak sunulmaktadir. r-Iri. F. !ON FS E I I.'l`[.."i I .FPIS-JI ?1 .LT lFe'Ii'IEßî'.' ?IHBAR-:RK I.'.".'?IY. TDBCfiE( F 1.:::I/J`1'F'.'11~ZT ?AH FE F. !I I E' KT!“ E I.? “SMMMCîsf'NFCFF-.HNFAH HÃÂEÄDSI'NIEU l LGÃIIEiBNF.'i'J~L'-'T'J`G$UI I CGHE-'i'U'i"-'Y.GIKSCC'F'I'AI'GLÜ" l'I ?TIC/`II GVF". F5 `II-'- I lItJFP'Llê-ÄE `i'î.E{IFE.'Ç~HlîFHS'I'LHVEJIFL LTÜH PEK.' l EGHGES'fFL F P LCIS`:'QTÇ- l ISSN LOYL 91`i' LE :H L 17'i' FTIÜT I &IDSPVFEH-ST P'TRL'i' I NSM: 'JKIIYD I FYIF E 1' D IS "ol-'R Ü'i'THE !'.Yî-IPGIIQ-DGTFCFILXEU TK 1.-'i EGE 1 TEK“ ULFZGFIQL I E'Xv'SPEDi'QKI TIIKPI LTFE'FIFGSZ FNI I B'i'lIl-'Çi ISGYH EEGDHHLI TH'I'H 1 F FPIISI Alternatif olarak, bazi rekombinan konakci hücre sistemlerinde, rekombinan eksprese edilen proteini hücre duvarina ankorlamak için hücre duvari ankoru motifinin kullanilmasi tercih edilebilir. Eksprese edilen proteinin ekstraselüler domaini saflastirma sirasinda yarilabilir ya da rekombinan protein nihai bilesimde inaktive konakçi hücrelere veya hücre membranlarina bagli halde birakilabilir.

GB867'de, korunmus lizin artiklari içeren üç pilin motifi belirlenmistir. Bu korunmus lizin artiklari, 478 ve 488 nuinarali amino asit pozisyonlari, 340 ve 342 numarali amino asit pozisyonlari ve 703 ve 717 numarali amino asit pozisyonlarinda bulunmaktadirlar. Pilin sekanslarinin ve 'Özellikle de söz konusu korunmus lizin artiklarinin GBSÖ7'nin oligomerik, pilus benzeri yapilarinin olusmasi için 'Önemli unsurlar olduklari düsünülmektedir. GBSö7'nin tercih edilen fragmanlari en az bir adet korunmus lizin artigi içerirler. GB867'de, korunmus glutamik artiklar içeren iki E kutusu da belirlenmistir.

GB867'nin tercih edilen fragmanlari en az bir adet korunmus glutamik asit artigi içerirler. GB567, alfa helis yapilarini olusturduklari sanilan birkaç bölge ihtiva ederler. Bu alfa helis yapilari büyük ihtimalle sarili sarmal yapilar olusturmaktadirlar ve GBS67'nin oligomerizasyonunda rol oynuyor olabilirler. GBSÖ7, S. aureus kollajene baglanan yüzey proteininin (pfam05738) Cna_B domainine hoinolog bir bölge de içerir. Bu bölge, bir beta sandviç yapisi olusturabilir. GBS67, bir von Willebrand faktörü (VWF) tip A domainine hoinolog bir bölge de barindirir.

Serotip lb sus H3ÖB'den sekanslanmis olan GB867'nin ainino asit sekansi referans 224'te SEKANS KOD NO.: 20906 olarak sunulmaktadir. Söz konusu sekans burada SEKANS KOD NO.: 24 olarak sunulniaktadir: MEV. `filli FS F.: LTIS [.Fif"l.f- 'JI PK.“ TU'.'1.!`.E.'-.T`.' PElllîâEfSM ETIKETCCÇNPI F1.? KI.? FTI F ?TS H.? F5 KV!' Filli `.-`I EFT“IÄÄDITNFT?KEAPEkrßGSTSLGLTPFFFFETÜISEVGETTTHYÄTNEACTI[55IQPESPTIIVHLTDTFPTF sm i ::SF-m ?susma FLRI Kastrrrmiuziiiiri-'i TUDPEK i il(.!i:;ES'il-' IJ' 9135.70 ro i i r-.miLoaLm' ;DIJILN'i' Mir. r : `(F.155P`-/F.EHISTPTKL':' r vsimxiirm FHFG I m SSFPQ'rrnerriîinzqnGTFQILKEEAFE LSDGE :rsmmssss EFEYZ[PIUISAEISNHEILSLIDÜQFEESLTEENSIVDEIÃEUPHHDKÃULHLGNEUTLUPEUîILUGNUHbIHEDbL ATGQPNNDGSILwyvKLZîIKHKLYVRGLULGEGUKVTLTTÜUKLUDSY2SNKFîDTEGPTîLNPHSEE?OTLPDFPIP r.: RDVREYPT i r i riisiziîussz !IE-'TFJDK'JPTNF ;LLFGATFELÇIEFNEDYPZL'I'LPI HIIIIISSI'PJTGEHGX-î[ si'mLFD: tzQLlEâ`"PßUTQhITNFPILIFEETFGSIQHI[AUHKUIbbrhrlüUFHLlîuthZPPbîlIPMTLUKüllâfJLSG çanusia ':klwKRHEESEUASIEKD Bulusun bazi yapilarinda, GBS67'nin bu varyanti kullanilabilir. Buna bagli olarak, bulusun yapilarinin SEKANS KOD NO.: l'e yapilan atif veya atiflar çerçevesinde tanimlanmis oldugu pasajlarda, SEKANS KOD NO.: l'e yapilan söz konusu atif veya atiflar SEKANS KOD NO.: 24'e yönelik atif veya atiflar ile degistirilebilirler.

Serotip V sus 2603 V/R'den sekanslanmis olan GBS67'ye benzer sekilde serotip lb sus H363'den sekanslanmis olan GBS67 de, yukaridaki SEKANS KOD NO.: 24'te C-terminalin en yakinindaki alti çizili bölge olarak gösterilen bir C-terminal transmembran bölge ihtiva eder. Bu transmembran bölgedeki bir veya daha fazla sayida amino asit çikarilabilir ya da transinembran bölgeden heinen önceki amino asit kesilebilir. Bu gibi bir GBSö7 fragmaninin bir örnegi asagida SEKANS KOD NO.: 25 olarak sunulmaktadir.

HREYJKFF P. [ 1.? : F'IF. HSE-:S H'JEKZ-"HE'J'T SET-'KusIPDSIILEALA'INPISSEGEZH I RE: IQEGTLSHQ l SERISI. C'Xtllî'i'lîî E 1.72'SGES I 15"! INEZDEE'LEK'KIF'ILHI SHEJIKNNGi-:mimxERGENE?I :HEP/;GAIPJENPAA 1.&'73'658 i FEGPT'JE'J l I'll." FPIEC basim Pî'i`C-WC-'i'3 fl? S'rAZNSF'.'KGS '. 'iAWFER 1 km› vs'iuii NN'i'F [TÜMÜ : mns-:3 i'î Li P ws'i'oici ISGNLIJE Lv. iLE-Lu w i' Ç m; T [ 'r'êî ”SWF E HGT PTFLY I I:E-L+›'UFN`r'(i I FHFG I D I &Fayanscvi'rrucoc'rroer NICE& FE :5% E I'l'î :”45- F3:) EPEIZTP:'i'rSâDb'SIINEILSEIQQQFEEILIKEIJE mmissmxmuuucimzmrsc :nazaran-mi::: FT'r'O'..! EMS [mt-'rpm run! LTI-'E'i'V'I-'GS i om isriwc ISE'mE EGCfî H L ITIITH 1 F F mi numarasi ;5 Serotip V sus 2603 V/R'den sekanslanmis olan GB867'ye benzer sekilde serotip lb sus H36B'den sekanslanmis olan GBSÖ7 de, yukaridaki SEKANS KOD NO.: 24'te italik karakterle gösterilen ve bir hücre duvari ankorunun göstergesi olan bir amino asit motifi içerir.

Buna göre, bu bulusta kullanilmasi tercih edilen bir GBS67 fragmaninda, GBSö7'deki transmembran ve hücre duvari ankoru motifi çikartilirlar. Bu gibi bir GBSÖ? fragmaninin bir örnegi asagida SEKANS KOD NO.: 26 olarak sunulmaktadir.

MRlTi'Jl-IFP V. I I.? 1.5. LFCLEQL PLN'I'W.'1.EEST.'FENIIAKCKL'.".`PI}JTCCÇm/. F Lar/.AT rak: m.: &sss mr Kamran' 3EETFUII;TFSI???LSEE'I'APEG`ti-'FT?Çîwu'icx'ssnsMT 10315 tcmrs 1 IEÇRÇ E E L :-irizri' F L-TG.'i'i'E ETKEE 'mt FIFT'IJI &MSI MT.! ?XEAFEAHN'SGTS LGLTPEFHREYU LSEÇ'i'GETF'!T S'itl Z HEP". 13:* Y 'ramiszp :l [fb IJ'i* LÜ!` HN'rF [TDI] PE?` :EUNGES i'F L F P Liîîiiâ'i'lg Tu] :::GN Lzsiiil Lh. fLDLH UI i' F #ß TI `i^F.I$'_.5"i'RE_H GI` PTEZL'i' I IîâiLFIUFN'r'D I FNFIIII] Z SCFP:32312EDTHENÇDCTFQ??UZEL!. ?E ;ECC E I? Ellitlîi F 35 AI'GEPNNDSSI ;l .: 'fiili 2' 1 Etli-1;.? 'i'kfsLN LEEGUH'J 11.? 'i' ÜK'KLC-L'GE löh'HF'i'L'› RIGRTILUE &GEEFM ;Pt-F E I 9 K1' RÜ”IRE"{PT T T IFHEFFDGE1'EFTPNDP'mnWLLLI-'GA'I'FE [DEFNE D'i'YL'i'L r : [~riiriraspr'r."rr,giiçxianrpi `m', Krom EM'S PFGTDXI run! Lrz-'E'Jvi-'Gs 1 OH I 15':ch ISHIHEEGCE H l. ITIITH 1 F E Kül GBSSO, hücre duvari yüzeyine ankorlu protein ailesine mensup bir putatif proteindir. Serotip V izole sus 2603 V/R'den sekanslanmis olan GB80'in nükleotid ve amino asit sekanslari referans 99'da SEKANS KOD NO.: 8779 & 8780 olarak sunulmaktadir. Amino asit sekansi burada SEKANS KOD NO.: 2 olarak sunulmaktadir: ml 1.? KELLFEAÂI'LTH'JNSE›'I'i'E PZ'FiÜFÄ'I'IîN'S l'-'P›AAE'~'SCIEF WQI'I'I'JNK 'i KILIS› DR `a' NS LI I5 ”7431 &ISKELET I 5› NYAEUSDEI'IK'JLOTIQ?Kâî'iî'i'KTD J SYDF: LI'IE'ILT'I'.'EAÄIA}I\'ÇT 1 [1:15:65 LPC l'î'INÂÇÇLZ'Z'IûLI'SKE WIRYLYV AHLGÜYEEPEI YDKFADSLT't'l-IF-Z'GKI F. insitruiauean im: PTJDNÇN'ILF 17 Fî-î Fu: n22 Ltd-1 LLHfJ-!I L'JKHQC LGGAE FUL LAS [ßTAu'KiJTm L I FANTNF'HYI AGEA'JTGO P 1 FL .'11'|r'1`f113 .wri' FUIE I ”1 PEG'I'.'L FI'EEI EET'i'SQI'Sf-:NI'EP'IDI ?TUBAIJAI PD'I l almasi:: : avm: IG'IAI ?iki mart-zariwiiüz-ixaari::: GBSSO, yukarida alti çizili sekans ile gösterilen bir N-terminal lider veya sinyal sekansi bölgesi ihtiva eder. GBSSO'in söz konusu ider veya sinyal sekansi bölgesinden bir veya birden fazla sayida amino asit çikartilabilir. Bu gibi bir GBS80 fragmaninin bir örnegi asagida SEKANS KOD NO.: 6 olarak sunulmaktadir: .ww-1 JBRPRFITTJJI 'i'izL-st^r'i«:;=.i;i nam::: ir-:uxoi'uii' ISHTÂK uzun; 1"'.'.L13(`.'JCI i: R 1' mi: 1-:- I svnziiii: LI'I'iJ H` I'KII'P-Tûu'tîrDEF-'KELGQDDAIHT I LSLE FEN? LEE-'H MM Lut-'inin I 'Ivir Hurma' 55.51%!. I x hiç-.i HI LURD EH'ITI UEFI'UUNONTLEI TFKPEKFHE : AE 1. :EGO-!7 Eli/.ISCIJÂILKÂ'ZMFTE BAAFIE I ?TAST I Hziîfüi'liîiYAI FJTI'F ELQYOHTFOKFSHPEPSNPPSHPE'JHTGGHF !"JE-îHDsTE'SiNLCGAE ft LLHSCGTKCKWTDALI mmixm !ACUN rcvçipi FLV 5 H'IDG'I'FFt FGLA'i'âh'DMI-VAEGTA'JT'i'K wmv. FEiJ i'K'Z Hirs 1 F F'i'v'siS-T 53'” T FF'I DI bir 5 ATI.: I PF- GBSSO, yukaridaki SEKANS KOD NO. 2'nin ucunun yanindaki alti çizili sekans ile gösterilen bir C-terminal transmembran bölge ihtiva eder. Bu transmembran bölgeden ve/Veya bir sitoplazmik bölgeden bir veya birden fazla sayida amino asit çikartilabilir. Bu gibi bir fragmanin bir örnegi asagida SEKANS KOD NO.: 7 olarak sunulinaktadir: ANLGÜ'L'E'E-.PEI (DEFADSLT `iES-'GH I F I GSFI'LNRÜEH'SI IDE. PT's'BH'BU LE] ?FE ?EF ?HE 1MB L ;SCSI-?I LK'FUÜL" ALÜIAETAI'ITDDAAFLEH PUAN' I !JEL'JG'LGFA [ EN 3 FELGYÜH? FENA EN F E FGH P PF! EEK'H'IGGHPF'.' f`.I)F'I`E"I`\`.'"I` LGCiî-.EFÜLLAS ['GTAU'KWYDALI FAN YlIEIN 'i' ZAGEHWIGC P 1 ELE-IS H'IEG TTS I KG L'i â'g'.`D!il|.'-_EJS'IF±'-E'I'i' ?IUIITKR F'EGT'JI PIIP'E I FFITEÇTS TNT?' ?TDI T'-'DE~`-`~.[`IHT ?DT I MINI-'P PS ;' ?HIS GBSSO, yukaridaki SEKANS KOD NO.: 2'de italik karakterle gösterilen ve bir hücre duvari ankorunun göstergesi olan bir amino asit motifi içerir. Bazi rekombinan konakçi hücre sistemlerinde, konakçi hücreden bir rekombinan GBSSO proteininin salgilanmasini kolaylastirmak adina bu inotifin çikartilmasi tercih edilebilir.

Dolayisiyla, GBSSO'deki transmenibran ve/veya sitoplazinik bölgeler ve hücre duvari ankoru motifi çikartilabilirler. Bu gibi bir fragmanin bir örnegi asagida SEKANS KOD NO.: 8 olarak sunulmaktadir.

ED LEIISFS NITFÂYÂ'/?FFLELP'IAISTGTGFLSE I II I'lPE'HYû'TCZHî'I ZKÜ-'ECI-ILCCC :%Cî'TîCE'EHIWFUTSTI F ANLSÜIIÂEG'.PEI IDEÂPÄDSLI`14K5`-'GHII›'IESKI'UJRÜEH'SI ICE. P'rs'ûthU LE J '7 FE FE.“ ?FE IÃE L LII'ÇR-SI'LTl'ElrSC' PEG'FJI PIIVE IEF'PJSIÇITS ?HTF ?TDI TJÜSÂDAT ?DT I ?'!INFP PS Alternatif olarak, bazi rekombinan konakçi hücre sistemlerinde, rekombinan eksprese edilen proteini hücre duvarina ankorlaniak için hücre duvari ankoru motifinin kullanilmasi tercih edilebilir. Eksprese edilen proteinin ekstraselüler domaini saflastirma sirasinda yarilabilir ya da rekoinbinan protein nihai bilesimde inaktive konakçi hücrelere veya hücre membranlarina bagli halde birakilabilir.

Bulusun yapilarindan birinde, GBS80 sekansindaki lider veya sinyal sekansi bölgesi, traiismembraii ve sitoplazmik bölgeler ve hücre duvari ankoru motifi çikartilirlar. Bu gibi bir GBSSO fragmaninin bir örnegi asagida SEKANS KOD NO.: 9 olarak sunulmaktadir: EIAADAKJ'C I` I LEE& `i'SLE`QKT NâüGL'.".'DâLBS bîSIl'i'R `i' LEVEL' LENS Fil( l Iri-'151' h'i' FI` JLELî-'Jbll S IIS'IL'. PLS E IN EH 'i'TI DE FF."CNCU'ILPZITFKPE'ZF'XE I AELLFGHTL'IXHQOÄL3PIATAIl'TDCx`.A FL! I FIESTI NIVA'JLEEP. I ENTF EDS-i' DH'T ?BITLWF F. PSHPPF.HPE'.'HT-i}:ERF'JBZKE'S'I'EYÜT ILGAEFE LU5DIITA'JI'A'TDA LI HIJ( INHI'A' IMJA'J ICQ? 1 li LZSMT'JZ'YFE l NCUz'i'f-f.'DAIJAE:TPS-?YELEEYEZA FEG'f'x'I FC'P'E IEF?'~'SÇ?S`)'IITFHDI T'JDS FILE??? TIRRUIFPS GBSSO'in bilhassa immünojenik olan bir fragmani proteinin N- terminaline dogru olan kisminda yer alir ve burada SEKANS KOD NO.: 10 olarak sunulmaktadir: AHUSJERPAFTTJII 'r'IZLÇIAUS'x'hISEI ?5.10313 IEHKDGEX' ISIHME I JJCN'Ü'ÇIÇÇUÇ ?II R1' ?TJK T'IZ-I S'V'DF ;HI LI'I'i.' EÂPBM-IUSTI LEE'îli'SLP'JI-"YNEÜGL`i".'D.'xLDSPîL-`H'i'9`î '_ ?SESLI-HS PS ?0 I IYI.! i'h'i' F FUL! LP'U'ÄI! SM'JFLSI III l'tl'i'iill'ii'i't'ÜEI'NIUKU'IKKLEÜÜÜAGKIITISESI-HH.:LES:1F`5IGU3D'E'ENFEII`Ül$âljßLl`f#5.53243IKI'SEIITLPJHU FH'I'TI [IFPVi'DlIQIITLI'I TFHPî'l-'FE-TI ÄELLFG Serotip III sus COHl'den elde edilmis olan yabani tip Spbl sekansi burada SEKANS KOD NO.: 3 olarak sunulmaktadir: ”Kismi I @SLLZ-'ASLAI-'GHÄ'JS var 5' uyurum 1 T.' uc ': '39:: ;:.r 'i' irki'izi'îuu ::amina ustu: riza: z LI mr.! EA E'i Las TDF i iSLFT I* II "335- T 'i'h'Yl-lûWlASM :E I A Iühb'sl SAM TFRS Ik' ?ESNIJL'GIE'J IN'SSÇIx'G i i i“ç S srstirm N.' E w:rs::r mat I HEK!]1`DaWGOGGGH'I'VCortî'i'si'JGCTJK” I'ra'I'îNA'i'rt'i'HßTEXT:0'i? I !îcw-ik-î-MERT ;HE MIATE 'ftf-::Amr I ?I TGLEEGTYT ISIK :â PLGîrîLLCtiSOE? I mzigrzmscuma'urrctzmiizri: ;PRTiî-GI Yabani tip Spbl, yukarida alti çizili sekans ile gösterilen bir lider veya sinyal sekansi bölgesi (aa 1-29) içerir. Spbl'in lider veya sinyal sekansindan bir veya birden fazla sayida amino asit çikartilabilir. Bu gibi bir Spbl fragmaninin bir örnegi asagida SEKANS KOD NO.. 11 olarak sunulmaktadir: AE TGT` I FiÜÜTCIPIGÄT 't'lîk'x'iî'i'F DAEI DI!›\)I`^.'E.DS}IIÃD ;AS 't' 1. I POGEEAEY ELÄFi'IDFIJFS ;PTT THIGCHT`i".'THK:TA SANSI aman i s.: impvswre smimm: t NVSQ'I'-'3'f'z^°r",'s smmsm mxrsvrpnm i HEi'r:îmrmassiz ru'ozisrrsisstrrvrrt r i'riiiiiixvirrHaramen':KornpsaswoLNErzsrsvr:mesgul ::Hassas-mann WJTTFJ'GCI 'r i mri marmara::.rNLmiamaFLuFuarina'smfmnare'ama :i i 'r ITGLTîEGT`i"i'L'.'Ifî Yabani tip Spbl sekansi, bir hücre duvari ankorunun göstergesi olan bir amino asit inotifi ihtiva eder (LPSTG). Bazi rekombinan konakçi hücre sistemlerinde, konakçi hücreden bir rekombiiian Spbl proteininin salgilanmasini kolaylastirmak adina bu motifin çikartilmasi tercih edilebilir. Dolayisiyla, Spbl'deki hücre duvari ankoru motifi ve bu motifin C-terminalindeki sekans çikartilabilirler.

Bu gibi bir fragmanin bir örnegi asagida SEKANS KOD NO.: 12 olarak sunulmaktadir: MEKIK!OSLLFÂShAFCHÄUSPV??IÄFAAEÜGTITJÇCT'.GATYFÂYNVFEÄEZZUÄNVLDHNNDIAS&LIVJCHEA ETKESTUFUELFTTTTHSSFTTUYFEUTÂEANE[ATKAHSISAHTTFTSTVÜEENN:GTE?INVSQTGYYIVSSTTÜNG RU# LH'0`I45"i'I` PIL-XI` I UCU] I L'AI'P'UU!SGGIC'I'VUQH'I i'5'~"JC'I 'i'EI î? l'I'i'lIU.'i'~`!l !MG IKI-'L' 1'i.." !“i' l! L'IY~ll-'5.-`~.Eîli'v DLUE EAEPSSAZILPCIII'IJIAI'I “PufSIIDDPGDKU'Z".'RUGOII l ECE-:IE GS'IYIAS DOGAI FFUIHKIGÇ FUIWUHHWEHB'II NMTET TT'SÂDGI I TI TCELKEGT'Ü' L'i'IIIKÂ PLG'SM LLCNS'JK'J I LGEIÇVRTZ' T'INS Eti LLVN I'I'JEUII HC IE Alternatif olarak, bazi rekombinan konakçi hücre sistemlerinde, rekombinan eksprese edilen proteini hücre duvarina ankorlamak için hücre duvari ankoru motifinin kullanilmasi tercih edilebilir. Eksprese edilen proteinin ekstraselüler domaini saflastirma sirasinda yarilabilir ya da rekombinan protein nihai bilesimde inaktive konakçi hücrelere veya hücre membranlarina bagli halde birakilabilir.

Bulusun yapilarindan birinde, Spbl'deki lider veya sinyal sekansi bölgesi, hücre duvari ankoru motifi ve bu motifin C-terminalindeki sekans çikartilirlar. Bu gibi bir Spbl fragmaninin bir örnegi asagida SEKANS KOD NO.: 13 olarak sunulmaktadir: SAT IEI &THREE I SitWYPVS T'i'TEE NIJDETEV I N`.-'SQ`I"'3':"K"("JS ST'o'YlN GN.' I H'J'T'S'i'f ?NAT I H KENT EVET HGDGGGF.

LLEEIIMHFTI TI VHÄÃUTTPTGNTQHIANÜCIFFTFC INT? r'.'r'{rci't..=75ciîpcsinumirn 1:.? IEIPHI'SIIDC PG:) Wi'Ti'FibGÇ 1' T I ?FI [FC-STFÄSLÇPGÄI Fi'l'..FmÄTGQFLNFIIDTHIHEWSTEMîATEYT 'GÄDGI 1 T ITGLIIEGT Yil/!IF KRI'SSTHLLDIm-ü ?In-`I LSDGATDY T ”5 DIJLLWI PU'EIIIIEGTE Spbl 'de bir korunmus glutamik artik içeren bir E kutusu (alti çizili) da tespit edilmistir ve korunmus glutamik asit 423 numarali artikta (koyu karakter) bulunmaktadir. E kutusu motifi, oligomerik pilus benzeri yapilarin olusuinu açisindan önemli olabilir ve dolayisiyla Spbl'in ise yarar fragmanlarinda korunmus glutamik asit artigi bulunur.

Yabani tip Spbl sekansi, bir Shine-Dalgarno sekansinin çekirdek sekansini (alti çizili parça) bünyesinde barindiran ve 12 mer uzunlugundaki bir upstream sekans (SEKANS KOD NO.: 14) olan TAATMÇTGT sekansina sahip olan bir iç metionin kodonu (Met-162) ihtiva eder. Burada bahsi geçen Shine-Dalgamo sekansinin bir kesilmis Spb] sekansinin translasyonunu baslattigi tespit edilmistir. Bu yerde translasyon baslamasini 'Önlemek için, ekspresyon için kullanilan Spbl kodlayici sekanstaki Shine-Dalgariio sekansi bozulabilir. Ribozoin baglanmasini önlemek için uygun herhangi bir nükleotid mutasyona ugratilabilecek olmakla birlikte, söz konusu sekans, hem Shine-Dalgarno çekirdeginin bir parçasini teskil eden hem de iç metionin kolonu ile çerçeve içerisinde yer alan bir GGA glisin kodonu barindirir. Bu kodondaki üçüncü baz, kodlanan glisinde degisiklige yol açilmaksizin ve dolayisiyla Spbl sekaiisinda herhangi bir degisim meydana gelmesinden kaçinilarak mutasyona ugratilip C, G veya T'ye dönüstürülebilir.

Bulusa konu olan bilesimler, X'in bir Spbl sekansi oldugu, L'nin bir istege bagli baglayici oldugu, Y'nin bir GBSSO sekansi oldugu, W'nin bir istege bagli N-teiininal sekans oldugu ve Z'nin bir istege bagli C- terminal sekans oldugu NHz-W-X-L-Y-Z-COZH amino asit sekansina sahip olan referans [225]'te tanimlandigi gibi olan bir polipeptid de içerebilirler. Bu polipeptide dair ek ayrintilar asagida belirtilmektedir.

Bu bilesimler, yukarida tanimlanan GBS proteini anti jenlerinden birini veya birden fazlasini ihtiva edebilirler. Daha soinut ifade etmek gerekirse, bulusa konu olan bilesimler, (a) NHz-W-X-L-Y-Z-COZH amino asit sekansina sahip olan bir polipeptid; ve (bi) yukarida tanimlandigi gibi olan SEKANS KOD NO.: 1 ainino asit sekansini içeren bir polipeptid ve/Veya (hz) (i) yukarida tanimlandigi gibi olan SEKANS KOD NO.: 1 sekansi ile sekans özdesligine sahip olan bir amino asit sekansini ve/Veya (ii) yukarida tanimlandigi gibi olan SEKANS KOD NO.: l'in bir fragmanini içeren bir polipeptid barindirabilirler.

Söz konusu polipeptid, normalde, X'in bir Spbl sekansi oldugu, L'nin bir istege bagli baglayici oldugu ve Y'nin bir GBSSO sekansi oldugu bir amino asit sekansi olan X-L-Y sekansini içerir.

X: Spbl sekansi X moietesi bir Spbl sekansidir. Bu Spbl sekansi bir denege uygulandiginda, yabani tip Sbpl proteinine baglanan, örnegin SEKANS KOD NO.: 3 amino asit sekansina (COHl susuna ait tam boy yabani tip sekans) sahip olan S. agalactiae proteinine baglanan antikorlarin rol oynadigi bir antikor cevabi olusmasini saglayacaktir.

Spbl sekansi, SEKANS KOD NO.: 13 sekansi ile en az %a oraninda sekans özdesligine sahip olan bir amino asit sekansi içerebilir. 99 veya daha büyük olabilir. Spbl sekansi, SEKANS KOD NO.: 13'ü içerebilir.

Spbl sekansi, SEKANS KOD NO.: 3 ve/Veya SEKANS KOD NO.: 13'i`in bir fragmanini içerebilir. Bu fragman, genelde, b degiskeni 5, 6, büyük bir degere karsilik gelmek 'üzere SEKANS KOD NO.: 3/13 sekansina ait en az b adet amino asidi bünyesinde barindiracaktir. Bu fragmanda, genelde, SEKANS KOD NO.: 3/13'teki en az bir T- hücresi veya tercihen bir B-hücresi epitopu yer alacaktir. T- ve B- hücresi epitoplari, yukarida açiklanan yöntemler ile belirlenip ayirt edilebilirler. Yukarida açiklandigi gibi, SEKANS KOD NO.: 13 sekansinin kendisi SEKANS KOD NO.: 3 sekansinin bir fragmanini teskil eder.

Spbl sekansi, yukarida tanimlandigi gibi hem SEKANS KOD NO.: 13 sekansi ile en az %a oraninda sekans özdesligine sahip olan hem de bir SEKANS KOD NO.: 13 fragmani barindiran bir amino asit sekansi ihtiva edebilir. daha büyük bir degere karsilik gelmek üzere en az 0 adet amino asit uzunlugunda olacaktir. degere karsilik gelmek üzere (:1 adet amino asidin tekabül ettigi uzunluktan daha uzun olmayacaktir. 430-450 amino asit uzunlugunda olacaktir.

Serotip III sus COHl'e ait yabani tip Spbl sekansi, yukarida bahsi geçen SEKANS KOD NO.: 3'tür. Bu sekansin yukaridaki "Spbl" bölümünde açiklanan spesifik derivatlari, bulusun bu yapisina iliskin Spbl sekansi ile de iliskilidirler.

Y: GBS80 sekansi Y inoietesi, bir GBSSO sekansidir. Bu GBS80 sekansi bir denege uygulandiginda, yabani tip GBSSO proteinine baglanan, örnegin SEKANS KOD NO.: 2 amino asit sekansina (2603V/R susuna ait tam boy yabani tip sekans) sahip olan S. agalactiae proteinine baglanan antikorlarin rol oynadigi bir antikor cevabi olusmasini saglayacaktir.

GBSSO sekansi, SEKANS KOD NO.: 9 sekansi ile en az %e oraninda sekans özdesligine sahip olan bir amino asit sekansi içerebilir. 99 veya daha büyük olabilir. GBS80 sekansi, SEKANS KOD NO.: 9'u içerebilir.

GBSSO sekansi, SEKANS KOD NO.: 2 veya SEKANS KOD NO.: 9'un bir fragmanini içerebilir. Bu fragman, genelde, f degiskeni 5, 6, 7, büyük bir degere karsilik gelinek üzere SEKANS KOD NO.: sekansina ait en az f adet amino asidi bünyesinde barindiracaktir. Bu fragmanda, genelde, SEKANS KOD NO.: 2/9'daki en az bir T-hücresi veya tercihen bir B-hücresi epit0pu yer alacaktir. Yukarida açiklandigi gibi, SEKANS KOD NO.: 9 sekansinin kendisi SEKANS KOD NO.: 2 sekaiisinin bir fragmanini teskil eder.

GBSSO sekansi, yukarida tanimlandigi gibi hem SEKANS KOD NO.: 9 sekansi ile en az %e oraninda sekans özdesligine sahip olan hem de bir SEKANS KOD NO.: 9 fragmani barindiran bir amino asit sekansi ihtiva edebilir. degere karsilik gelmek üzere en az g adet amino asit uzunlugunda olacaktir. veya daha küçük bir degere karsilik gelmek üzere 11 adet amino asidin tekabül ettigi uzunluktan daha uzun olmayacaktir. 470-490 amino asit uzunlugunda olacaktir.

Serotip V izole sus 2603 V/R'ye ait yabani tip GBS80 sekansi, yukarida bahsi geçen SEKANS KOD NO.: 2'dir. Bu sekansin yukaridaki "GBS80" bölümünde açiklanan spesifik derivatlari, bulusun bu yapisina iliskin GBS80 sekansi ile de iliskilidirler.

L: baglayici Polipeptidde istege bagli olarak X ve Y moietelerine bagli bir L moietesi de bulunur. Bu L moietesi, normalde kisa bir amino asit sekansini, örnegin 2-40 amino asit uzunlugunda olan, örnegin 2, 3, 4, amino asitten olusan bir amino asit sekansini teskil eder.

Baglayicilar, genelde, yapisal esnekligin kuvvetlenmesini saglayan en az bir adet glisin artigi içereceklerdir. Baglayici, 'örnegin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veya daha fazla sayida glisin artigi ihtiva edebilir.

Glisinler, en az iki ardisik glisinden olusan bir sekans halinde, örnegin bir Gly-Gly dipeptid sekansi halinde ya da daha uzun bir oligo-Gly sekansi halinde, baska bir deyisle SEKANS KOD NO.: 15: GGGG'de karsilik geldigi bir Gly11 sekansi halinde dizilebilirler.

Baglayicilar, restriksiyon enzimlerinin tanima sekanslarinda bulunan kodonlar ile kodlanabilirler. Örnegin, belirli bir restriksiyon enziminin hedefini teskil edeii 6 mer uzunlugundaki bir sekans bir dipeptid kodlayabilir. Buna göre, BamHI'ya iliskin tanima sekansi (GGATCC) Gly-Ser sekansini kodlar ve dolayisiyla bir baglayicida bir Gly-Ser dipeptid sekansi yer alabilir. Bu gibi sekanslar klonlamayi ve manipülasyonu kolaylastirirlar.

Kullaniina uygun baglayici sekanslar arasinda, yukarida gösterilen SEKANS KOD NO.: 15 ve asagida gösterilen SEKANS KOD NO.: 16, 17 ve 18 bulunur: GSGGGG (SEKANS KOD NO.: 18) Bununla birlikte, tercih edilen baglayicilarda, bir insan polipeptid sekansi ile ortak 10 veya daha fazla sayida bitisik ainino asidin yer aldigi bir sekans bulunmaz. Örnegin, bu bulusta kullanilabilecek glisin açisindan zengin bir baglayici sekans, 14 mer uzunlugundaki SEKANS KOD NO.: 16'dir. Ancak bu 14 mer bir insan RNA baglanma proteininde (gi: 8051631) de bulunur ve dolayisiyla L moietesi içerisinde bu sekansin yer alinamasi tercih edilir.

W: N-terminal sekans X moietesi polipeptidin N-terminalinde bulunabilir, fakat ayrica X'e göre upstream tarafinda kalan amino asitler mevcut olmasi da mümkündür. Bu istege bagli amino asitler bir W moietesi olustururlar.

Bu W moietesi, normalde kisa bir amino asit sekansini, 'Örnegin 2-40 amino asit sekansini teskil eder.

W moietesi örnekleri arasinda protein trafigini yönlendiren lider sekanslar ve klonlainayi veya saflastirmayi kolaylastiran kisa peptid sekanslari (örnegin histidin taglari, baska bir deyisle n degiskeninin 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veya daha büyük bir degere karsilik geldigi Hisn) bulunur. Sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlar, diger uygun N- terminal ainino asit sekanslarinin neler olduklarini anlayacaklardir.

Yeni olusmus bir polipeptidde W moietesi, polipeptide N-terminal kisimda bir metionin (bakterilerdeki formil-metionin, fMet) artigi kazandirabilir. Buiiunla birlikte, bu bulusa uygun bir polipeptiddeki W moietesinin bir N-terminal metionin artigi barindirmasi sart olmadigi için, yeni olusmus bir W moietesinin N-terminalindeki bir veya daha fazla sayida amino asit yarilabilir.

Kullanima uygun W inoietelerinden biri SEKANS KOD NO.: 19: MAS'dir.

Z: C-terminal sekans Y moietesi polipeptidin C-terminalinde bulunabilir, fakat ayrica Y'ye göre downstream tarafinda kalan amino asitler mevcut olmasi da mümkündür. Bu istege bagli amino asitler bir Z moietesi olustururlar.

Bu Z nioietesi, normalde kisa bir amino asit sekansini, 'Örnegin 2-40 amino asit sekansini teskil eder.

Z moietesi 'Örnekleri arasinda protein trafigini yönlendiren sekanslar, klonlamayi veya saflastirmayi kolaylastiran kisa peptid sekanslari (örnegin histidin taglari, baska bir deyisle n degiskeninin 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 veya daha büyük bir degere karsilik geldigi Hisn içeren sekanslar) ve protein stabilitesini kuvvetlendiren sekanslar bulunur.

Sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlar, bir glutatyon-S-transferaz, tioredoksin, S. aureus protein A'nin 14 kDa büyüklügündeki fragmaiii, bir biyotinli peptid, bir inaltoz-baglanma proteini, bir enterokinaz bayragi ve benzerlerinin 'ornek gösterilebilecegi diger uygun C- terminal amino asit sekanslarinin neler olduklarini anlayacaklardir.

Kullanima uygun Z moietelerinden biri SEKANS KOD NO.: 20: HHHHHH sekansini içerir.

Kullanima uygun kombinasyonlar Çesitli X, Y ve L moieteleri ile olusturulabilecek kullanima uygun kombinasyonlar arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, asagida gösterilenler bulunur: ”RT-.RE TGT I T'iÜE'TüliGâT'i'EIÄ'i'I-IYFÜAE I mlâll'i'FiDSPlHrfJçî'k' LI FCCHLÃE 'x' .1023 IÜFMF LFI'I'TIIIIÄET'X'ZI' I KK EYULLEENNHFT I'.' 1' FWTNTP'I'GXITQNCÄIIECFF'YEC INTI 'I'WTI'TIJLKECÂKFCSÃDLPm1IRTI IJFNTEUDD KI TFKPEIlZI-'FEI I ÂELLKCHTL'JKHÜJALDHA'IMI'I' GOM! LE I F'Çi'iS'T 131 EEK.' ULU` 1 EJI'I'FEDJT CIR TPC'KAÜNPI'.? 1 ,1 C'LP.!R'JDAIIALSIA'JI '11* Lil Tl-FaPL13`i"-`l P'.I+~1ilh'F'I'.'c5Ç"IiiiHII'ê'l [I'l IL'lI'cihtîiPlHîl lê'NNV-PPEHHHNHH HASÂE ?CT I I'.'F:D3!«IFZD1`J.5`i' 1.1 FC& KELEYHkî'ICIFIIFi LFTI'I IR'JÃFI 1"J'I`YJ'3 i-.u;:i:i".';›w< 1 'r 'asiirui '(1'11 :mami H-'jl'îîl arrow.' I 1-1 mm Pößiök'[:vLNElj'ö'i'Ek' r l'hgwjtiüül 'Il l'm<:›561f.›'~ TU PGOK'.' ?250331 r: m1: ::5 rmsiocair'umiamçewmn'rztm't'iec'xaam'rz :naar-:i i ririsuiwri' IL E ; ?maci EMI-IDGE'II suyu( L-:uri'.'i L'.".'D›\i.osi~:sir.°sz L'i"/EDLK!ISPS!J L i'm'i'x.'1=$'.'i.si. &aranmasi; iii i i' ?mmossiz'roxz'urriiaacizm H TGSKRFUKKDSTETÜTLESAEFD 1.

(SEKANS KOD NO.: 23) Polipeptid, SEKANS KOD NO.: 21 sekansi ile en az %i oraninda sekans özdesligine sahip olan bir amino asit sekansi içerebilir.

KOD NO.: 21 sekansini içerebilir.

Polipeptid, SEKANS KOD NO.: 23 sekansi ile en az %i oraninda sekans özdesligine sahip olan bir amino asit sekansi içerebilir.

KOD NO.: 23 sekansini içerebilir.

Bu bulusta kullanilan bir polipeptid: (a) SEKANS KOD NO.: 21 veya 23 sekansi ile özdes (yani (b) SEKANS KOD NO.: 21 veya 23 ile sekans 'özdesligi paylasan; (c) yukaridaki (a) veya (b) kaleniinde bahsi geçen sekaiislardan farkli olarak, ayri konumlarda veya bitisik pozisyonlarda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 veya 10 (veya daha fazla sayida) adet tek amino asitlik alterasyonlar (delesyonlar, insersiyonlar, substitüsyonlar) barindiran; ve ((1) bir ikili hizalama algoritmasi kullanilarak SEKANS KOD NO.: 21 veya 23 ile hizalandiginda, N-terminalden C-terminale dogru giden yönde x adet amino asitten olusan her bir hareketli pencerede (örnegin, p > x olmak üzere, p adet amiiio asidi kapsayan bir hizalamada bu gibi pencerelerden p-X+l adet bulunur) en az X'y adet özdes hizalanmis amino asidin bulundugu görülen bir ainino asit sekansi içerebilir; burada ve eger x~y, bir tanisayiya denk gelmiyorsa, çikan sonuç en yakin tainsayiya yuvarlanir. Tercih edilen ikili hizalama algoritmasi, varsayilan parainetreler ile (öniegin EBLOSUM62 skorlama matrisi çerçevesinde bosluk açma bedeli = 10,0 ve bosluk uzatma bedeli = 0,5 ile) kullanilan Needleman-Wunsch global hizalama algoritmasidir [226]. Bu algoritma, EMBOSS paketinde yer alan needle araci araciligiyla rahatlikla uygulanabilir [227].

Yukaridaki (0) grubu içerisinde gösterilen delesyonlar veya substitüsyonlar N-terminal kisimda ve/Veya C-terminal kisimda ya da bu iki terminal kisim arasinda kalaii bölgede bulunabilirler.

Dolayisiyla bir trunkasyon bir delesyon örnegi olarak gösterilebilir.

Trunkasyonlarda, N-terminal kisim ve/veya C-terminal kisimdaki 40'1 bulan sayida (ya da daha fazla) amino asit silinebilir.

Polipeptidlerdeki Spb] ve GBS80 sekanslari, bir veya daha fazla sayida GBS susundan elde edilebilirler. Örnegin, SEKANS KOD NO.: 21 ve 23, sirasiyla COHl susua ait Spbl sekansini ve 2603V/R susuna ait GBS80 sekansini içerirler.

Polipeptidler Polipeptidler veya münferit inoietelerde, SEKANS KOD NO.: 2, 3, 9, , 13, 21 veya 23 sekansina kiyasla, bir veya daha fazla sayida degisikligi söz konusu olabilir; baska bir deyisle, bir amino asit, iliskili bir yan zincire sahip olan baska bir amino asit ile degistirilmis olabilir. Genetik olarak kodlanan amino asitler genel itibariyla dört aileye ayrilirlar: (1) asidik, yani aspartat, glutaniat; (2) bazik, yani lizin, arjinin, histidin; (3) polar olmayan, yani alanin, valin, lösin, izol'osin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; ve (4) yüks'uz polar, yani glisin, asparajin, glutamin, sistein, serin, treonin, tirozin.

Fenilalanin, triptofan ve tirozin bazen birlikte aromatik amino asitler olarak siniflandirilirlar. Bu ailelere mensup tekil amino asitlerle yapilan substit'usyonlarin genelde biyolojik aktiviteye dönük majör bir etkisi olmaz. Polipeptilerde, bir referans sekansa kiyasla bir veya daha asitlik delesyon da söz konusu olabilir. Polipeptilerde, bir referans sekansa kiyasla bir veya daha fazla sayida (örnegin, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ve benzeri) insersiyon (örnegin her biri 1, 2, 3, 4 veya 5 adet amino asitten olusan) da söz konusu olabilir.

Polipeptidler, yukarida açiklandigi gibi birçok farkli yolla hazirlanabilirler. Ayrica polipeptidler yine yukarida açiklandigi gibi çesitli farkli formlarda bulunabilirler (örnegin natiV, füzyonlar, glikozile, glikozile Olmayan, lipide, lipide Olmayan, fosforile, fosforile olmayan, miristoile, miristoile olmayan, monomerik, inultimerik, partiküllü, denatüre ve benzeri). Polipeptidler, yukarida açiklandigi gibi, tercihen saflastirilmis veya büyük ölçüde saflastirilmis bir formda kullanilirlar. polimerine atif yapar. Polimer, lineer ya da dallanmis olabilir, modifiye edilmis amino asitler içeriyor olabilir ve aniino asit olmayan birimlerle kesilebilir. Bu terim, ayni zamanda, dogal yollarla modifikasyona ugramis olan ya da disülfur bagi formasyonu, glikozilasyon, lipidasyon, asetilasyon, fosforilasyon veya bir etiketleme komponenti ile konjugasyon gibi baska herhangi bir manip'ûlasyon veya modifikasyon yöntemiyle müdahale edilerek modifikasyona ugratilmis olan amino asit polimerlerini de içine alan bir anlam tasir. Bir amino asidin (öriiegin dogal olmayan ainino asitler ve benzerleri de dahil) bir veya daha fazla sayida analogunu içeren ve sektörde bilinen baska tür inodifikasyonlara ugramis veya ugratilmis olan polipeptidler de bu terirnin kapsami içerisinde yer alir.

Polipeptidler tek zincir formunda olabilecekleri gibi birbirleriyle baglantili zincirlerden olusan bir formda da olabilirler. Polipeptidler, dogada bulundugu halleriyle glikozile olabilecekleri gibi dogal olmayan artifisyel yöntemler ile glikozile edilmis de olabilirler (baska bir deyisle, kullanilan polipeptid, dogada kendiliginden olusan mütekabil polipeptidde bulunan glikozilasyon paterninden farkli bir glikozilasyon paternine sahip olabilir).

Polipeptidler, en az 40 amino asit uzunlugunda olabilirler (örnegin en amino asitten daha kisa olabilirler.

On-imm'ûnizasyon Bulusun ikinci Özelligine göre, bu bulus, bir hastayi GBS kaynakli enfeksiyona karsi immünize etmek için olan ve hastanin bir difteri toksoidi veya onun bir derivati ile 'Önceden imini'inize edilinis olinasini gerektirinekte olup, 0 difteri toksoidi veya onun derivati ile ona konjuge bir GBS kapsûler sakkaridinden olusan bir konjugatin hastaya uygulandigi bir basainak içeren bir yöntem ortaya koyar. GBS konjugatlari, yukarida tanimlandigi gibi bulusun birinci özelligine konu olan innnünojenik bilesimdeki GBS konjugatlari ile aynidirlar.

Baska bir deyisle, bulusun birinci özelligine konu olan immünojenik bilesimler bulusun ikinci 'özelliginde kullanilirlar. Bilesimde yer alan difteri toksoidi veya onun derivatina kon juge haldeki kapsüler sakkaridin kaynagi GBS serotipleri la, Ib ve III't'ur. Bulusun bu özelliginde, bilesimdeki GBS kapsüler sakkaritlerinin hepsi bir difteri toksoidine veya onun bir derivatina konjugedirler. Tasiyici veya ön- immünizasyon antijeninin bir difteri toksoidinin bir derivati olmasi halinde, o derivatin Dt'ye karsi sahip oldugu immünolojik çapraz- reaktivitesini koruyan bir derivat olmasi ve spesifik olarak CRM197 olmasi tercih edilir. Bulus sahipleri, GBS kapsüler sakkaritleri ile onlara kon juge bir difteri toksoidi veya onun bir derivatindan olusan konjugatlarin tasiyici indüklü epitopik supresyondan (veya genel olarak bilindigi adiyla "tasiyici supresyonu"ndan"), daha somut ifade etmek gerekirse tasiyici ile yapilan ilk immünizasyondan ileri gelen bir supresyondan inustarip olmadiklarini saptamislardir. Asagida yürütülen tartismada belirtildigi gibi, "tasiyici supresyonu", bir hayvanin bir tasiyici protein ile 'Önceden immünize edilmesinin o hayvanin daha sonradan o tasiyici üzerinde sunulan yeni bir anti jeiiik epitopa karsi bir immün cevap olusturmasini önlemesi olarak tarif edilen bir fenomen için kullanilan adlandirmadir [228]. Bulus sahipleri, bu fenomene tezat teskil eden bir bulgu olarak, GPS kapsüler sakkaridi ile difteri toksoidi veya onun derivatindan olusan konjugatlara karsi olusan immün cevabin difteri toksoidi veya onun derivati ile 'Önceden immünizasyon yapilmis olmasi halinde daha kuvvetli bir immün cevap olarak belirebilecegini tespit etmislerdir.

Referaiis 229'da rapor edildigi gibi, bir dizi asi antijeiiinin (bir konjugatta bir tasiyici protein olarak ve/veya bir immünojen olarak kullanilan) ayni protein koiiiponentini içermesi halinde, bu anti jenler arasinda bir enterferans meydana gelmesi olasidir. Referaiis 229'da, bir tetanos toksoidini (Tt) teskil edeii bir tasiyiciya kon juge edilmis bir aiitijene yönelik immün cevap, Tt'ye karsi `Önceden kazandirilmis immüniteden dolayi baskilanmistir.

Referans 230'da, Hib konjugati için kullanilan tasiyici ile D-T-P asisindaki anti jeiiin her ikisinin de tetanos aiitijeni oldugu DTP asilari ile bir Hib kon jugat asisindan olusan bir koinbinasyonun söz konusu durumdan nasil ve ne yönden olumsuz etkilendigi rapor edilmektedir.

Söz konusu eserin yazarlari, ayni tasiyici proteinin kullanilmis olmasindan ileri gelen enterferansin neden oldugu mevzubahis asilar hazirlanirken dikkate alinmasi gerektigi sonucuna varinislardir.

Referans 23 1 'de ise, referanslar 229 ve 230'un tersine, tetanos toksoidi ile önceden immünizasyon yapilinasinin daha sonrandan uygulanan bir Hib-Tt konjugatina karsi gelisen immün cevap üzerinde hiçbir negatif etkisinin olmadigi, fakat anne üzerinden edinilinis anti-Tt antikorlarinin bulundugu hastalarda supresyonun gözlemlendigi rapor edilmistir. Bununla birlikte referans 232'de, tetanos asilainasindan dolayi halihazirda anti-Tt antikorlari tasimakta olan hastalarda bir Tt bazli peptid konjugatina iliskin olarak bir "epitopik supresyon" etkisi rapor edilmistir.

Referans 233'te, tasiyici olarak CRM197'yi (difteri toksininin bir detoksifiye mutanti) içeren bir konjugatin daha 'Önceden bir asinin bir parçasi olarak (örnegin bir D-T-P veya D-T asisinin bir parçasi olarak) difteri toksini verilmemis olan çocuklarda etkisiz olabilecegi ileri sürülmüstür. Bu çalisma, D-T iinin'i'inizasyonu ile olusturulan bir tasiyici ilk immünizasyon etkisinin Hib kon jugatlari ile daha sonradan yapilan immünizasyon için de varligini korudugunun gözlemlendigi referans 234'te anlatilan çalisma ile daha da gelistirilmistir.

Referans 235'te, yazarlar, bir difteri veya tetanos toksoidi tasiyici proteini ile yapilan ön-immünizasyonun bu tasiyicilara konjuge haldeki Hib kapsüler sakkaridi ile daha sonradan yapilaii bir immünizasyondan sonra görülmesi beklenen anti-Hib aiitikoru seviyelerinin düsmesine sebep oldugunu ve bu etkinin lgGl ve lgGZ için ayni siddette meydana geldigini saptamislardir. Konjugatlarin tasiyici kisimlarina yönelik cevaplar da baskilanmistir. Ayrica, bir konjugat ile yapilan ön-iminünizasyon dört hafta sonra uygulanan bir ikinci konjugatin hem tasiyici kismina hem de sakkarit kismina karsi olusan immün cevaplari etkiledigi için, epitopa Özgü olmayan daha genel bir supresyon da görülmüstür.

Referans 23 6'da, ayiii inultivalent pnömokokal kon jugat asisinda farkli tasiyici proteinlerin kullanimi rapor edilmekte ve tasiyici supresyonundan kaçinmak için birden çok tasiyicinin kullanildigi belirtilmektedir. Yazarlar, bir multivalent konjugat asisinda negatif enterferans olusmasiiia neden olmaksiziii tolere edilebilecek bir maksimum tasiyici protein yükü söz konusu oldugu öngörüsüyle hareket etmislerdir. Referans 237'de, karisik halde birden çok tasiyici protein barindiran pnömokokal konjugat asilarinin, anti-pnömokok cevabinin paralelinde, tasiyicilari hedef alan ve kasitli olmayan ek kuvvetlendirici cevaplar ortaya çikardiklari rapor edilmistir.

Difteri ve tetanos rapellerinin monovalent meiiingokokal serogrup C konjugatlari ile uygulanip uygulanamayacaklarini konu alan bir arastirmanin sunuldugu referans 2323'de, tasiyicinin tetaiios toksoidi tasiyicisi oldugu ve hastanin bir tetanos içeren asi ile 'onceden immünize edilmis oldugu durumda meningokokal konjugata karsi gelisen titrelerin aksi duruma kiyasla daha düsük kaldigi rapor edilmistir.

Bir tasiyici ile primer immünizasyon yapilmis olniasinin sakkarit konjugatlarina karsi ortaya çikarilmasi hedeflenen immün cevaplar üzerinde negatif bir etkisinin söz konusu olinasindan ileri gelen sorunun yani sira bunun tersi de meydana gelebilir, yaiii bir konjugat ile yapilan immünizasyonun 0 konjugattaki tasiyiciya karsi gelisecek olasi immün cevaplar üzerinde negatif bir etkisi olabilir [239].

Dolayisiyla bu bulusun ikinci Özelligi, bir hastayi GBS kaynakli enfeksiyona karsi immünize etmek için olan ve hastanin bir difteri toksoidi veya onun bir derivati ile önceden iminünize edilmis olmasini gerektirmekte olup, 0 difteri toksoidi veya onun derivati ile ona kon juge bir GBS kapsüler sakkaridinden olusan bir kon jugatin hastaya uygulandigi bir basamak içeren bir yöntem ile ilgilidir. Bulusun bu özelligi, bir difteri toksoidi veya onun bir derivati ile daha 'Önceden immünize edilmis olan bir hastayi GBS kaynakli enfeksiyona karsi immünize etmekte kullanim için olan ve bir GBS kapsüler sakkaridi ile ona konjuge haldeki söz konusu difteri toksoidi veya onun derivatindan olusan bir konjugat ile de ilgilidir. Bulusun bu özelligi, ayrica, bir GBS kapsüler sakkaridi ile ona konjuge bir difteri toksoidi veya onun bir derivatindan olusan bir konjugatin o difteri toksoidi veya onun derivati ile daha önceden immünize edilmis bir hastayi GBS kaynakli enfeksiyona karsi immünize etmeye yönelik bir ilacin üretiminde kullanimi ile de ilgilidir.

Onceden imm'i'inize edilen hasta Immünize edilmesi hedeflenen hasta, bir difteri toksoidi veya onun bir derivati ile `Önceden immünize edilmistir. Difteri toksoidi veya onun derivati, GBS disindaki bir organizmaya ait bir kapsüler sakkarit ile ona kon juge bir difteri toksoidi veya onun bir derivatindan olusan bir konjugat bünyesinde tasiyici olarak uygulaninis olabilir. Tipik bir ön- immünizasyonda sunlar bulunacaktir: bir difteri toksoidi antijeni; bir difteri toksoidi veya CRMl97'nin tasiyici olarak kullanildigi bir Hib kapsüler sakkaridi konjugati; ve/Veya bir difteri toksoidi veya CRMl97'nin tasiyici olarak kullanildigi bir pnömokokal kapsüler sakkarit kon jugati.

Hasta, ön-immünizasyon anti jen(ler)inden en az bir (örnegin 1, 2, 3 veya daha fazla sayida) doz almis olacaktir ve 0 doz (veya birden fazla sayidaki dozdan ilki), hastaya, bulusuii bu. özelligine konu olan GBS kon jugatlari ile immünizasyon yapilmadan en az alti (örnegin 6, 9, 12, ay önce uygulaninis olacaktir. On-immünizasyonun dogumdan sonraki 3 yil içerisinde, örnegin dogumu takip eden 2 yil içerisiiide, doguinu takip edeii l yil içerisinde, dogumu takip eden 6 ay içerisinde ve hatta dogumu takip eden 3 ay, 2 ay veya 1 ay içerisinde gerçeklestirildigi bir hasta grubu tercih edilen bir hasta grubunu teskil eder. Bulusun özelligine göre immünize edilmesi uygun sayilan hastalar, yukarida Tedavi yöntemleri bölümü altinda tanimlanmaktadirlar.

On-immünizasyon anti jeninin bir difteri toksoidi ile yapilmis oldugu durumda tipik olan, hastanin söz konusu toksoidi, bir D-T-P veya bir D-T ön-inimünizasyonu bünyesinde 'D' antijeni olarak almis olmasidir. Bu gibi imniünizasyonlar normalde 2, 3 ve 4 aylik yeni dogmus çocuklara yapilirlar. Immünizasyonda bir boginaca asisi varsa, bu asi bir tam hücre veya selüler boginaca asisi ('PW') olabilir, fakat bir aselüler bogmaca asisi ('Pa') olmasi tercih edilir. On- immi'inizasyon Pa asilarinda, genelde, asagida sayilan iyi bilinen ve iyi karakterize edilmis B. pertussis antijeiilerinden biri, ikisi veya üçü de yer alacaktir: (1) kimyasal yollarla veya yer-hedefli mutagenez yoluyla detoksofiye edilmis bogmaca toksoidi ('PT'), örnegin pertaktin ('69 kiloDaltonluk dis membran proteini' adiyla da bilinir).

Aselüler bogmaca asilarinda agl'ûtinogen 2 ve/Veya aglütinogen 3 de bulunabilir. Bir D-T-P ön-immünizasyonunun bünyesinde bulunan 'T' anti jeni normalde bir tetanos toksodini teskil eder.

On-immünizasyon anti jeninin bir difteri toksoidi oldugu durumlarda, hasta, söz konusu toksoidi ayrica veya alternatif olarak bir protein- sakkarit konjugatindaki tasiyici protein olarak da almis olabilir. Bu gibi konjugatlar arasinda, 'PRP-D' Hib konjugati [bkz: referaiis 241, Tablo l4-7], örnegin ProHIBITTM ürünü bulunur.

On-immünizasyon antijeninin CRMl97 oldugu durumlarda, hastanin bir Hib konjugati ve/Veya bir multivalent pnömokokal konjugat ile önceden immünize edilmis olmasi normaldir. Bu gibi immünizasyonlar normalde 2, 3 ve 4 aylik yeni dogmus çocuklara yapilirlar. Bir CRMl97 tasiyicisi kullanaii Hib konjugatlari arasinda, ürünü bulunur. Bir CRMl97 tasiyicisi kullanaii pnömokokal konjugatlar arasinda, 7-Valansli PCV7 karisimlari, örnegin PreVNarTM asisi bulunur [242]. Hasta, bir serogrup C meningokokal ('MenC') konjugat ile de önceden immünize edilmis olabilir. Bir CRMl97 tasiyicisi kullanan MenC kon jugatlari arasinda, MeninvactTM/MenjugateTM [243] ve MeningitecTM bulunur.

On-immünizasyonun bir konjuge antijen ile yapilmis oldugu durumlarda, hasta, (örnegin saklama esnasinda konjugatta meydana gelebilecek hidrolizin neden oldugu) düsük düzeydeki konjugat kontaminasyonunun bir sonucu olarak küçük bir miktarda serbest difteri toksoidi (veya derivati) alinis olacaktir, fakat bu küçük miktar normalde istatistiksel açidan anlamli bir iinmün cevap ortaya çikmasini saglamaya yetmeyecektir.

Difteri toksoidi, Coryuebacterium diphtheriae'nin ADP ribozilasyonu olan ekzotoksini formalin veya formaldehit gibi bir inaktive edici kimyasal ile islemden geçirilerek elde edilebilecek olan iyi bilinen iyi karakterize edilmis bir proteindir [örnegin bkz: referans 241, bölüm konjuge sakkarit asilarinda bir tasiyici olarak yaygin olarak kullanilmaktadir. CRMl97 ile Dt'de ortak bulunan birçok tasiyici epitop vardir.

On-immünizasyonun sonucu, hastanin immün sisteminin ön- irrnnünizasyon anti jenlerine maruz kalmis olmasidir. Difteri toksoidi (Dt) ile 'on-immünizasyon açisindan bakildiginda bunun anlami, genelde, hastanin aksi duruma kiyasla daha yüksek bir anti-Dt antikoru cevabina (normalde > 0,01 IU/ml düzeyinde bir anti-Dt titresi saglayacak kadar yüksek) ve Dt'ye karsi spesifisiteye sahip olan hafiza B ve/Veya T lenfositlerine sahip olacak olmasidir; baska bir deyisle, Dt ile ön-immünizasyon, noriiialde, hastada bir anamnestik anti-Dt immün cevabi ortaya çikmasini saglar. Dt'nin (veya onun derivatinin) bir konjugat içerisinde bir sakkarit için bir tasiyici olarak kullanildigi bir ön-immünizasyoii uygulamasi söz konusu oldugunda ise, bu 'Ön- imm'ûnizasyon, bir anti-sakkarit cevabini aksi duruma göre daha yüksek kilacaktir ve hasta, ilgili sakkarite karsi spesifisiteye sahip olan hafiza B ve/veya T lenfositlerine sahip olacaktir; baska bir deyisle, ön- imm'ûnizasyon, normalde, hastada bir ananinestik anti-sakkarit immün cevabi ortaya çikmasini saglar. On-immünizasyonun hastada örnegin difteri hastaligina karsi bir koruyucu immünite ortaya çikmasini saglamasi tercih edilir.

Dolayisiyla, bulusun bu özelligine göre immünize edilmesi hedeflenen hastalar, genel hasta popülasyonundan farkli ve ayridirlar, zira bunlar, immün sistemleri kapsaminda ön-immünizasyon anti jenlerine karsi bir immün cevap zaten var olan genel popülasyon içerisindeki bir altk'umenin 'üyelerini teskil ederler; öyle ki, bir difteri toksoidi (veya onun derivati) tasiyicisi içeren bir GBS konjugati ile bu bulus `Özelligi uyarinca gerçeklestirilen bir immünizasyon uygulamasi, mevzubahis altkümede daha önceden ön-immünizasyon antijenlerine karsi bir immün cevabin ortaya çikarilmamis oldugu hastalarda oldugundan farkli bir immün cevap ortaya çikmasini saglar. Bir konjugattaki (özellikle de bir Hib konjugatmdaki) tasiyici olarak Dt (veya onun derivati) ile `Önceden immünize edilmis olan hastalar tercih edilirler.

Bilhassa tercih edilen hastalar, bir koiijugattaki tasiyici olarak Dt (veya onun derivati) ile ve ayrica konjuge halde bulunmayan bir immünojen olarak Dt ile 'onceden immünize edilmis olan hastalardir.

Hasta, konjuge olan veya olmayan bir formdaki bir difteri toksoidi (veya onun derivati) ile 'Önceden immünize edilmis olmasinin yani sira baska anti jenlerle de önceden immünize edilmis olabilir. Bu anti jenler arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, asagida belirtilen antijenler sayilabilir: boginaca anti jen(1er)i - yukariya bakiniz; tetanos toksoidi - yukariya bakiniz; Haemophilus influenzae tip B - yukariya bakiniz; hepatit B yüzey antijeni (HBsAg); poliovir'us, örnegin bir inaktive poliovirüs asisi (IPV); Streptococcus pneumoniae - yukariya bakiniz; influenza Virüsü; BCG; hepatit A Virüsü antijenleri; kizamik Virüsü; kabakulak virüsü; kizamikçik Virüsü; suçiçegi Virüsü; ve benzerleri.

Hasta, bir veya daha fazla sayida GBS konjugat ile 'Önceden immünize edilmis olabilir de olmayabilir de. Bulusun tercih edilen bazi yapilarinda, ilk kez bir GBS konjugati alan, fakat daha önceden Dt (veya onun derivati) ile Ön-immünizasyona tâbi tutulmus olan hastalar söz konusudur. Bulusun baska yapilarinda, hem (i) Dt veya onun bir derivati ile hem de (ii) bir GBS konjugati ile önceden immünize edilmis olan bir hastaya bir GBS kon jugati uygulanir.

Tetanos toksoidi tasiyicilari Burada ayrica, bir tetanos toksoidi veya onun bir derivati ile 'onceden immünize edilmis olan bir hastayi GBS kaynakli enfeksiyona karsi immünize etmek için olan ve bir GBS kapsüler sakkaridi ile ona konjuge söz konusu tetanos toksoidi veya onun derivatindan olusan bir kon jugatin 0 hastaya uygulandigi bir basamak içeren bir yöntem de konu edilmektedir. Bu yöntemde, bir tetanos toksoidi veya onun bir derivati ile `Önceden immünize edilmis olan bir hastayi GBS kaynakli enfeksiyona karsi immünize etmekte kullaniin için olan ve bir GBS kapsüler sakkaridi ile o tetanos toksoidi veya onun derivatindan olusan bir konjugat kullanilir. Bu yöntem, ayrica, bir GBS kapsüler sakkaridi ile ona konjuge bir tetanos toksoidi veya onun bir derivatindan olusan bir konjugatin 0 tetanos toksoidi veya onun derivati ile daha 'Önceden immünize edilmis bir hastayi GBS kaynakli enfeksiyona karsi immünize etmeye yönelik bir ilacin üretiminde kullanilmasina da olanak saglar. GBS kapsüler sakkaritleri ile onlara konjuge bir tetanos oksoidi veya onun bir derivatindan olusan konjugatlar, tasiyici supresyonuna bagli, daha somut ifade etmek gerekirse tasiyici ile yapilan ilk immünizasyondan ileri gelen bir supresyonuna bagli bir dezavantaj sergilemeyebilirler. Tetanos toksoidi veya onuii derivati ile ön-immünizasyon yapilmasi, GBS kapsüler sakkaridi ile ona koiijuge tetanos toksoidi veya onun derivatindan olusan konjugatlara yönelik olusan immün cevabin kuvvetlenmesini gerçekten de saglayabilir.

Tetanos toksoidi iyi bilinen bir proteindir [örnegin bkz: referans 241, bölüm 27] ve Clostridium tetani'niii ADP ribozilasyonu yapan ekzotoksini inaktive edilerek elde edilebilir. Hastalar, tetaiios toksoidini normalde bir D-T-P veya bir D-T ön-immünizasyonunda bünyesinde 'T' anti jeni olarak ya da bir konjugat içerisindeki tasiyici protein olarak almis olacaklardir. Bu gibi konjugatlar arasinda, 'PRP- T' Hib konjugati [bkz: referans 241, Tablo l4-7], örnegin ActHIBTM, OmniHIBTM ve HIBERIXTM ürünleri bulunur.

Burada geçen "içerir" terimi, hem "ihtiva etme"yi hem de "olusma"yi içine alan bir anlam tasir; örnegin, X unsurunu "içeren" bir bilesim, sadece 0 X unsurundan ibaret olabilecegi gibi, onun yani sira baska unsurlar, örnegin X + Y unsurlarini ihtiva ediyor da olabilir. x ile temsil edilebilecek sayisal degerlere atfen kullanilan "yaklasik" terimi, x ± %10 aiilainina gelir. anlamini dislayan bir anlam tasimaz, örnegin "hemen hemen hiç" Y içemiedigi söylenen bir bilesimde kelimenin gerçek anlamiyla hiç Y bulunmuyor olabilir. Gerekiyorsa ve gerektiginde, "büyük ölçüde" ya da "hemen hemen" tabiri bulusun tanimiiidan çikartilabilir.

Seker halkalarinin hem açik formda hem de kapali formda bulunabilecekleri ve burada sunulan yapisal formüllerde sadece kapali formlarda gösteriliyor olinalarina ragmen açik formlarinin da bu bulusun kapsamina girdigi anlasilacaktir. Benzer sekilde, Sekerlerin hem piranoz formunda hem de furaiioz formunda bulunabilecekleri ve burada sunulan formüllerde sadece piranoz formlarinda gösteriliyor olmalarina ragmen furanoz formlarinin da bu bulusun kapsamina girdigi anlasilacaktir. Sekerlerin farkli anomerik formlari da bulusun Iki veya daha fazla sayida kompoiientiii karistirildigi bir basamak içeren bir proseste, aksi belirtilmedikçe, karistirma isleminin hangi sirayla gerçeklestirilecegi fark etmez. Dolayisiyla koniponentler herhangi bir sirayla karistirilabilirler. Uç komponent varsa, önce komponentlerden ikisi birbirleriyle birlestirilip, daha sonra elde edilen kombinasyon üçüncü koinponentle karistirilabilir ve bunun gibi benzeri uygulamalar yürütülebilir.

Antikorlar hedeflerine karsi genelde spesifisiteye sahip olacaklardir.

Dolayisiyla, hedefleri için, bovin serum albümini gibi ilgisiz bir koiitrol proteini için oldugundan daha yüksek bir afiniteye sahip olacaklardir.

Polipeptidler arasindaki özdeslik, aksi belirtilmedikçe, tercihen, MPSRCH programinda (Oxford Molecular) uygulandigi haliyle Smith-Waterman homoloji tarama algoritmasi kullanilarak ve bosluk açina bedeli : 12 ve bosluk uzatma bedeli : 1 olarak ayarlanip bir afin bosluk taramasi yapilarak belirlenir.

SEKILLERE DAIR KISA AÇIKLAMALAR Sekil 1'de, GBS serotipleri Ia ve III'teki tekrar yapilari arasindaki fark gösterilmektedir.

Sekil 2'de, GBS serotipleri la, lb, II, III & V'teki kapsüler sakkarit tekrar yapilari gösterilmektedir.

Sekil 3'te, GBS serotipi V'e iliskin kapsüler sakkaridin sialilden arindirilmis formunun tekrar yapisi gösterilmektedir.

Sekil 4'te, GBS serotipi III kapsüler sakkaridi ile CRMl97'den olusan ve adjuvan bulunan veya bulunmayan bir konjugat uygulanmadan önce CRM197 ile yapilmis primer immünizasyonun nasil bir etki yarattigi gösterilmektedir.

BULUSU GERÇEKLESTIRME YOLLARI Konjugat 'üretimi Streptococcus agalactiae serotipleri Ia, Ib ve III'e iliskin saflastirilinis kapsüler sakkaritler, önce periodat oksidasyonu ve ardindan indirgen aminasyon gerçeklestirilerek bir tasiyici proteine konjuge edildiler (referans 2). Streptococcus agalactiae serotipi V'e iliskin saflastirilmis, sialilden arindirilmis kapsüler sakkarit, önce periodat oksidasyonu ve ardindan indirgen amiiiasyon gerçeklestirilerek bir tasiyici proteine konjuge edildi (referans 14). Birçok duruinda kullaiiilaii tasiyici protein CRM197'ydi. Özel olarak belirtilen durumlarda tasiyici protein olarak tetanos toksoidi kullanildi.

Fare çalismasi (1) Bu çalismada, bir aktif matemal-neonatal yükleme fare modelinde ya moiiovalent asilar ya da kombinasyon asilari olarak kullanilan GBS serotipi Ia, Ib ve III konjugatlarinin etkinligi ve immünojenisitesi üzerinde ad juvan kullaniminin yarattigi etki degerlendirildi.

Referans 248'den adapte edilmis olan maternal-neonatal yükleme fare modeli, fiilen asilanmis olan disi hayvanlarin yavrulariiida bu yavrularin annelerinden plasenta araciligiyla edinmis olduklari spesifik antikorlarin etkinligini degerlendirmek için kullanilir.

Somutlastirmak gerekirse, Charles River Laboratories'den (Calco, Italya) alinan 5-6 haftalik disi CD-l fareleri, 1. günde, 21. günde ve nihayetinde 35. günde yapilan iki veya üç immünizasyon uygulamasi kapsaminda adjuvanli veya ad juvansiz intra-peritoneal enjeksiyon ile asilanirlar. Son immünizasyondan sonra fareler çiftlestirilir ve doguma kadar muhafaza edilirler. Neonatal farelerdeki yükleme, immünize bir GBS susu inokulumu ( kullanilarak gerçeklestirilir. Yükleme, dogumu takip eden 48 saat içerisinde intra-peritoneal yolla yapilir. 72. saatte kaç adet yavrunun sag kalmis oldugu kayit altina alinir ve Fisher kesinlik testi çerçevesinde, uygulama yapilan tüm gruplarda elde edilen sagkalim oranlari karsilastirilir. Bir kontrol grubunda, annelere ayni yolla ve ayni dozlaina programi kullanilarak PBS verilir. Son immünizasyonun üzerinden iki hafta geçtikten sonra, iki in vitro esey (asagida açiklanan ELISA ve Opsonofagositoz eseyleri) gerçeklestirilerek yapilacak olan immünojenisite degerlendirmesi için kan numuneleri t0planir.

ELISA eseyi, immünizasyonu takiben üretilen GBS-spesifik antikorlarin titresini belirlemek için gerçeklestirilir. ELISA, ayni zamanda, her kapsüler sakkarit anti jenine karsi olusan toplam lgG'yi ölçmek için de kullanilir. Her farenin serumu analiz edilir ve her grup için Geometrik Ortalama Titrei (GMT) hesaplanir. Kapsüler sakkarit tipleri Ia, Ib ve III'e iliskin antikor titreleri, Fare ELISA Birimi (MEU) cinsinden ifade edilir ve Referans Çizgisi Analiz Yöntemi temelinde hesaplanir.

Opsonofagositoz eseyi (OPA), kompleman-aracili GBS öldürme aktivitesine sahip olan asi-indüklü antikorlarin titresini (referans 249'da açiklanan yaklasim kullanilarak) degerlendirmek için gerçeklestirilir. Bu esey, asagida belirtilen bilesenler bir araya getirilerek gerçeklestirilir: bakteriler, fagositik hücreler (insan kanindan ekstrakte edilen PMN'ler veya farklilasmis HL-60 hücre hatti), kompleinan ve immün serumlar. Reaksiyoii karisiininin alikotlari 37°C sicaklikta 1 saatlik bir inkübasyon uygulaninadan önce Ve sonra plakaya yatirilarak kalan koloni Olusturucu biriinler (CFU) belirlenir. Sag kalan koloni adedinin log degeri baslangiç zaman noktasinda mevcut bulunan CFU sayisinin log degerinden çikartilarak opsonofagositik öldürme miktari (log öldürme) belirlenir. Bir pre- immün serum ve PMN'ler bulunmayan isi-inaktive kompleman negatif kontrol olarak kullanilir. Bakterisidal titre, bakterilerin %50'sinde indirgeiiiiie meydana gelmesini saglayan resiprokal seruin seyreltisi olarak ifade edilir.

Bu çalismada, disi CDI fareleri, O ve 21. günlerde adjuvan (alüminyum hidroksit veya MF59) esligindeki üç farkli konjugattan iki doz (her biri 1 ug) verilerek immünize edildiler. Yenidoganlarda, asagidaki Tablo 1'de gösterilen tipteki spesifik suslarla yükleme yapildi.

Tablo 1: Aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde alüminyum hidroksit veya MF59 esliginde kullanilan GBS serotipi la, Ib ve titrelerinin belirlenmesi Antijen Adjuvan GMT Y'i'ikleme Canli/Uygulama Sagkalim titreleri Susu (tip) Yapilmis (%) PBS - - COHl (III) 0/68 0 - Ilgili degil Hem alüminyum hidroksit kullaniminda hem de MF59 kullaniminda üç serotipe iliskin monovalent asilarin hepsi ile yüksek koruma seviyelerine ulasildi. Bununla birlikte, MF59 ad juvani kullanildiginda, her ne kadar daha yüksek antikor titreleri elde edilmis olsa da biraz daha düsük sagkaliin oranlari gözlemlendi.

Bir ilave deneyde, fareler, adjuvan esligindeki ilgili konjugattan l ug içeren kombinasyonlardan 0, 21 ve 35. günlerde üç doz verilerek imin'ûnize edildiler. Yenidoganlarda, asagidaki Tablo 2'de gösterilen tipteki spesifik suslar ile yükleme yapildi.

Tablo 2: Aktif inaternal-neonatal yükleme fare modelinde adjuvanla birlikte veya ad juvan olinadan kullanilan GBS serotipi la, Ib ve seviyesinin ve antikor titrelerinin belirlenmesi Antijen Adjuvan GMT Yükleme Canli/Uygulama Sagkalim titreleri Susu (tip) Yapilmis (%) Ad juvanla birlikte veya ad juvan olmadan kullanilan 'uç formülasyonda da kombinasyon asilari ile yüksek koruma seviyelerine ulasildi, fakat adjuvansiz kullanimda daha düsük antikor titreleri gözlemlendi.

Fare çalismasi (2) Bu çalismada, aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde serotip üzerinde liyofilizasyonun yarattigi etki degerlendirildi. Fareler, adjuvan esliginde veya adjuvan olinadan kullanilan üç farkli konjugattan 0 ve 21. günlerde iki doz (her biri 1 ug) verilerek immünize edildiler. Yenidoganlarda, asagidaki Tablo 3'te gösterilen tipteki spesifik suslar ile yükleme yapildi.

Tablo 3: Aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde alüminyum hidroksitle birlikte veya alüminyum hidroksit olmadan kullanilan serotip la, Ib ve III/CRM197 konjugatlari farelere sivi veya liyofilize anti jen olarak uygulandiklarinda elde edilen koruma seviyesinin, antikor titrelerinin ve bakterisidal titrelerin belirlenmesi Antijen Adjuvan GMT Bakterisidal Y'i'ikleme Uygulama Sagkalim titresi titre Susu (tip) (%) Yapilmis CRM-Ib Liyofilize Al-H 172 2146 H36B (Ib) ND ND - Ilgili degil; ND: belirlenmedi Liyofilizasyon prosesi, GBS konjugatlarinin immünojenisitesini etkilemedi. Sivi formülasyon verilen fareler ile liyofilize formülasyon farelerdeki antikor titreleri ve bakterisidal titreler denk ve karsilastirilabilir düzeydeydi.

Fare çalismasi (3) Bu çalismada, aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde serotip V/CRM197 konjugatinin etkinligi 'uzerinde liyofilizasyonun yarattigi etki degerlendirildi. Fareler, ad juvan esliginde veya ad juvan olmadan kullanilan kon jugatlardan 0 ve 21. günlerde iki doz (her biri 1, 5 ve 10 tig) verilerek imni'i'inize edildiler. Yenidoganlarda, bir tip V sus ile yükleme yapildi. Sonuçlar, asagida yer alan Tablo 4'te gösterilmektedir.

Tablo 4: Aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde alüminyum hidroksitle birlikte veya alüminyum hidroksit olmadan kullanilan serotip V/CRM197 kon jugati farelere sivi veya liyofilize antijen olarak uygulandiginda elde edilen koruina seviyesinin belirlenmesi Ad juvan yok Alüminyum hidroksit Antijen Ölü/uygulama yapilmis (% sagkalim) Liyofilizasyon prosesi, GBS konjugatinm immünojenisitesini etkilemedi. Sivi formülasyon verilen fareler ile liyofilize formülasyon farelerdeki sagkalim oranlari denk ve karsilastirilabilir düzeydeydi.

Fare çalismasi (4) Bu çalismada, aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde farkli doz kullanimlarinin GBS serotipi Ia, Ib, III ve V konjugatlarindan Olusan bir karisimin etkinligine etkileri degerlendirildi. Fareler, GBS serotipi la, lb, 111 ve V konjugatlarmin her birinden 0,2, 1 ve 5 Lig buluiian bir koinbinasyondan 0 ve 21. günlerde iki doz verilerek immünize edildiler. Yenidoganlarda, asagidaki Tablo 5'te gösterilen tipteki spesifik suslar ile yükleme yapildi.

Tablo 5: Aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde GBS serotipi Ia, Ib, III ve V/CRM197 kon jugatlarmdan olusan kombinasyonlar ile elde edilen koruma seviyesinin belirleninesi Y'i'ikleme susu (tip) Antijen Dozlar Ölü/uygulama yapilmis (% sagkalim) GBS serotipi V konjugatinin yüksek olan dozaji, daha yüksek bir koruma seviyesi elde edilmesini sagladi.

Fare çalismasi (5) Bu çalismada, aktif matemal-neonatal yükleme fare modelinde farkli sayida doz kullanimlarinin GBS serotipi la, Ib, III ve V konjugatlarindan olusan bir karisimm etkinligine etkisi degerlendirildi. Fareler, bir alum adjuvani esliginde kullanilan kombinasyondan duruma göre hangisi uygunsa O, 21 ve 35. günlerde bir, iki veya üç doz (her konjugattan l pg) verilerek immünize edildiler. Yenidoganlarda, asagidaki Sekil 6'da gösterilen tipteki spesifik suslar ile yükleme yapildi.

Tablo 6: Aktif maternal-neonatal yükleme fare inodelinde adjuvan esligindeki GBS serotipi Ia, Ib, III ve V/CRM197 konjugatlardan olusan kombinasyonlar ile elde edilen koruma seviyesinin belirlenmesi Y'ûkleme Susu (tip) Antijen Dozlar Ölü/uygulama yapilmis (% sagkalim) Bu çalismada, serotip la, [b, 111, V konjugatlarindan olusan karisim uygulandiktan sonra bakterisidal titreler ölçüld'û. OPA titreleri asagida gösterilmektedir: Yapilan immünizasyon sayisi, GBS serotipi V konjugatina verilen immün cevabin kuvvetini önemli ölçüde etkiledi.

Fare çalismasi (6) Bu çalismada, aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde GBS serotipi Ia, Ib, III ve V konjugatlarindan olusan bir karisimin etkinligi ile tek basina kullanilan GBS serotipi V konjugatinin etkinligi karsilastirildi. Fareler, alum adjuvaninin eslik ettigi 1 ug GBS serotipi V konjugatindan veya her konjugattan 1 ug bulunan kombinasyonlardan 0, 21 ve 35. günlerde üç doz verilerek immünize edildiler. Yenidoganlarda, CJB 111 ve 2603 V/R tip V suslari ile yükleme yapildi. Elde edilen sonuçlar asagidaki Tablo 7'de gösterilmektedir.

Tablo 7: Aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde ad juvan esliginde tek basina GBS serotipi V konjugati veya GBS serotipi Ia, lb, 111 ve/CRM197 kon jugatlarinin bulundugu kombinasyonlar ile elde edilen koruma seviyesinin belirlenmesi Y'i'ikleme Susu (tip) CJBl 11 (V) 2603 V/R (V) Antijen Ölü/uygulama (% sagkalim) yapilmis Kombo = CRMl97-la + CRMl97-lb + CRMl97-lll + CRMl97-V GBS serotipi V'e iliskin kapsüler sakkaride yönelik immün cevabin, bilesimde ayni zamanda GBS serotipi la, lb ve III konjugatlari da yer aldiginda azaldigi gözlemlendi.

Fare çalismasi (7) Bu çalismada, aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde tek basina GBS serotipi V konjugatina kiyasla GBS serotipi la, lb, 111 ve V konjugatlarindan olusan bir karisimin immünojenisitesi ve etkinligi üzerinde adjuvanin yarattigi etki degerlendirildi. Fareler, adjuvanin eslik ettigi veya etmedigi 1 tig GBS serotipi V konjugati veya her konjugattan 1 iig buluiian kombinasyonlardan O, 21 ve 35. günlerde üç doz verilerek immünize edildiler. Yenidoganlarda, CJ B1 11 tip V susu ile yükleme yapildi. Elde edilen sonuçlar asagidaki Tablo 8'de gösterilmektedir.

Tablo 8: Aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde adjuvanin eslik ettigi veya etmedigi tek basina GBS serotipi V kon jugati veya GBS serotipi Ia, lb, III ve V/CRM197 konjugatlarindan olusan koinbinasyonlar ile elde edilen koruina seviyesi, antikor titreleri ve bakterisidal titrelerin belirleninesi Antijen Adjuvan GMT Bakterisîdal Ulu/uygulama yapilmis titresi titre (% sagkalim) PES Alum - - 122/ 13] (7) Bir kez daha, GBS serotipi V'e iliskin kapsüler sakkaride yönelik immün cevabin bilesimde ayni zainanda GBS serotipi la, Ib ve III konjugatlari da yer aldiginda azaldigi gözlemlendi. GBS serotipi V konjugati tek basina kullanilirken esliginde ad juvan da kullanildiginda adjuvan kullaniminin sagkalim artisi sagladigi bu deneyde gözlemlenmemis olsa da, genel olarak adjuvan takviyesinin sagkalinida bir artis meydana gelmesini sagladigi kaydedildi.

Fare çalismasi (8) Bu çalismada, aktif matemal-neonatal yükleme fare modelinde GBS serotipi la, Ib, III ve V kon jugatlarindan olusan bir karisinidaki GBS serotipi V konjugatinin dozunun artirilinasinin söz konusu karisimin etkinligi üzerindeki etkisi degerlendirildi. Fareler, adjuvanin eslik ettigi veya etmedigi 5 ug GBS serotipi V konjugati ile l'er ug GBS serotipi la, Ib ve III konjugatlari bulunan kombinasyonlardan ya da her konjugattan 1 ug bulunan kombinasyonlardan 0 ve 21. günlerde iki doz verilerek immünize edildiler. Yenidoganlarda, asagidaki Tablo 9'da gösterilen tipteki spesifik suslar ile yükleme yapildi.

Tablo 9: Aktif maternal-neonatal yükleme fare inodelinde farkli dozlarda GBS serotipi V kon jugatinin kullanildigi ve adjuvan esliginde GBS serotipi la, Ib, 111 ve V/CRM197 konjugatlarimn bulundugu kombinasyonlar ile elde edilen koruma seviyesinin belirlenmesi Yükleme Susu (tip) Anti jen Adjuvan Ölü/uygulama yapilmis (% sagkalim) Kombo = CRMI97-Ia + CRM CRM197-V disinda hepsi 1 ug) Bu deneyde, karisimda yer alan GBS serotipi V kapsüler sakkaridine yönelik immün cevabin adjuvan takviyesi sayesinde yine arttigi saptandi. Mevzubahis cevabin ayrica bilesimdeki söz konusu kapsüler sakkaridin dozu artirildiginda da arttigi gözlemlendi. Bununla birlikte, GBS serotipi V'e iliskin kapsüler sakkarit yüksek bir dozda kullanildiginda GBS serotipi la, Ib ve III'e iliskin kapsüler sakkaritlere yönelik cevaplarin azaldigi görüldü. Adjuvan takviyesi, bu sonucun etkisini indirgedi.

Fare çalismasi (9) Bu çalismada, aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde GBS serotipi la, Ib ve III konjugatlari ile GBSÖ7 ve GBSSO proteinlerinden olusan bir karisimin etkinligi degerlendirildi. Fareler, çesitli farkli adjuvanlarin eslik ettigi veya etmedigi kombinasyonlar ile immünize edildiler. Yenidoganlarda, asagidaki Tablo lO'da gösterilen tipteki spesifik suslar ile yükleme yapildi.

Tablo 10: Aktif maternal-neonatal yükleme fare niodelinde GBS serotipi la, Ib ve III/CRM197 konjugatlari ile GB867 ve GBSSO proteinlerinden olusan koinbinasyonlar ile elde edilen koruma seviyesinin belirlenmesi Y'i'ikleme Susu (tip) Antijen Adjuvan Ölü/uygulama yapilmis (“/o sagkalim) Kombo MF59 45/70 (36) (93) (79) (70) (96) Kombo Hiçbiri 47/59 (20) (84) (84) (53) (82) Bu çalismada, serotip Ia, Ib, III ve V konjugatlari ile GB867 ve GBSSO proteinlerinden olusan karisim uygulandiktan sonra antikor titreleri 'Ölçüldü, Bes ayri deneyden elde edilen sonuçlar asagida gösterilmektedir.

Alümin m Alümin m Ad ' van Hidroksit/yZalim HidroksitS/IIIJJBS MF 59 ::k Fare çalismasi (10) Bu çalismada, aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde GBS serotipi Ia, Ib ve III kon jugatlari ile GB867 ve GBS80 proteinlerinden olusan bir karisimin etkinligi degerlendirildi. Fareler, çesitli farkli adjuvanlarin eslik ettigi veya etmedigi kombinasyonlardan 0, 21 ve . günlerde üç doz verilerek immünize edildiler. Yenidoganlarda, asagidaki Tablo ll'de gösterilen tipteki Spesifik suslar ile yükleme yapildi.

Tablo 11: Aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde GBS serotipi la, lb ve lll/CRM197 konjugatlari ile GBS67 ve GBS80 proteinlerinden olusan koinbinasyonlar ile elde edilen koruma seviyesinin belirlenmesi Y'i'ikleme Susu (tip) Antijen Adjuvan Ol'û/uygulama yapilmis (% sagkalim) Kombo Alum + CpG 6/78 (92) 7/8 (91) Fare çalismasi (1 1) Bu çalismada, aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde GBS serotipi la, Ib, III ve V konjugatlari ile GBSÖ7 proteini ve bir Spbl- GBSSO füzyon proteinden olusan bir karisimin etkinligi degerlendirildi. Fareler, adjuvanin eslik ettigi kombinasyon ile immünize edildiler. Yenidoganlarda, asagidaki Tablo 12'de gösterilen tipteki spesifik suslar ile yükleme yapildi.

Tablo 12: Aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde GBS serotipi la, Ib, III ve V/CRMl97 konjugatlari, GB867 proteini ile bir Spbl-GBSSO füzyon proteininden olusan koinbinasyonlar ile elde edilen koruma seviyesinin belirlenmesi Y'ûkleme Susu (tip) Antijen Adjuvan Ol'i'i/uygulama yapilmis (% sagkalim) Kombo Alum PES Alum Kombo = CRM l 97-la + CRM l 97-lb + CRM l 97-III + GBS67 protein + Spbl -GBSSO füzyon proteini Fare çalismasi (12) Bu çalismada, aktif inaternal-neonatal yükleme fare modelinde GBS serotipi la, lb, III ve V konjugatlarinin etkinligi degerlendirildi.

Fareler, her kon jugattan 1 immünize edildiler. ug verilerek Yenidoganlarda, asagidaki Tablo 13'te gösterilen tipteki spesifik suslar ile yükleme yapildi. Deney iki defa tekrarlandi.

Tablo 13: Aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde GBS serotipi la, lb, 111 ve V/CRM197 kon jugatlari ile elde edilen koruma seviyesinin belirlenmesi Y'ûkleme Susu (tip) Deney Antijen 11 Ol'i'i/uygulama yapilmis (% sagkalim) GBS serotipi lb'ye iliskin kapsüler sakkaridin bulundugu konjugat, GBS serotipi Ib'nin yani sira GBS serotipi Ia'ya karsi da koruma sagladi.

Fare çalismasi (13) Bu çalismada, ya tetanos toksoidi (TT) tasiyici proteinine ya da CRM197 tasiyici proteinine konjuge halde kullanilan kapsüler sakkaritlerin immünojenisitesi test edildi ve karsilastirildi. Disi CDl fareleri, alüminyum hidroksit adjuvaninin eslik ettigi 1 'er ug GBS serotipi la, Ib ve III konjugatlarindan O ve 21. günlerde iki doz verilerek immünize edildiler. Yenidoganlarda, asagidaki Tablo l4'te gösterilen spesifik sus tipleri ile yükleme yapildi.

Tablo 14: Aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde TT veya CRM'ye kon juge haldeki GBS serotipi Ia, lb ve III kapsüler sakkaridi ile ulasilan koruma seviyesinin belirlenmesi Yükleme Tasiyici protein Tasiyici protein CPS tipi PBS* susu (tip) Tetanos Toksoidi* Crm* * % Sagkalim (Canli/uygulaina yapilmis) Bahsi geçen üç serotipin yer aldigi CRM197 konjugatlari ile immünize edilen gruplardaki sagkalim oranlari, TT konjugatlari ile immünize edilen grupta gözlemlenen sagkalim oranlari ile denk ve karsilastirilabilir düzeydeydi. Bu sonuçlar temelinde, ek ileri gelistirme çalismalarinda kullanilacak tasiyici proteinin CRM197 olmasina karar verildi.

Fare çalismasi (14) Bu çalismada, kovalent konjugasyon prosesi esnasindaki kapsüler sakkarit oksidasyonu seviyesinin imni'i'inojenisiteye etkisi degerlendirildi. Farkli oranlarda oksidasyon ile hazirlanan sakkaritler ve onlara konjuge edilen TT ve/veya CRM197 ile GBS serotipi la, lb ve III konjugatlarindan bir dizi seri elde edildi ve bu konjugat serileri, disi CD] farelerinde immünojenisiteleri bakimindan test edildiler.

Fareler, alüminyum hidroksit adjuvaninin eslik ettigi üç farkli konjugattan (her birinden 1 ug) O ve 21. günlerde iki doz erilerek immünize edildiler. Yenidoganlarda, asagidaki Tablo 15'te gösterilen tipteki spesifik suslar ile yükleme yapildi.

Tablo 15: Aktif maternal-neonatal yükleme fare modelinde farkli oksidasyon oranlarinin söz konusu oldugu TT veya CRM l 97'ye konjuge haldeki GBS serotipi Ia ve III kapsüler sakkaritleri ile elde edilen koruma seviyesi, antikor titreleri ve bakterisidal titrelerin belirlenmesi Antijen Oksidasyon GMT Y'i'ikleme UyCgauliîriia Sagkalim Bakterisidal seviyesi (%) titreleri Susu (tip) yapilmis (0 o) Titre CRM-la 42/80 52 ND CRM-la 58/60 97 ND CRM-la 48/78 61 ND PBS - - A909 (la) 11/87 13 - -Ilgili degil Annelerin %15-20 oraninda oksidize edilmis sakkaritlerden hazirlanan konjugatlar ile immünize edildigi durumda sagkalim oranlarinda bir pike ulasildi. Oksidasyon seviyeleri artirildikça, fonksiyon 'üzerinde herhangi bir etki gözlemlenmeksizin antikor titrelerinin de arttigi saptandi. Daha yüksek antikor titreleri daha yüksek bakterisidal titreler saglamadi. Bu sonuçlar ve ilave deneyler (bu deneylere iliskin veriler gösterilmemektedir) temelinde, optimum CPS oksidasyonu orani bahsi geçen üç serotip için de %10 ile %30 arasi degerler olarak tanimlandi.

Tavsanlarda ve siçanlarda gerçeklestirilen üreme ve gelisimsel toksikoloji çalismalari Baslikta bahsi geçen iki türden elde edilen sonuçlar, serotip Ia, Ib ve bir etkisinin bulunmadigini gösterdi.

Tavsanlarda, alüminyum hidroksit adjuvani ile üç kon jugattan olusan bir kombinasyon, çiftlesme günü 0. gün olarak kabul edilerek olusturulan bir uygulama takviminin -35, -21 ve -7. günlerinde (çiftlesmeden önceki periyot) ve gebeligin 7 ve 20. günlerinde veya yalnizca gebeligin 7 veya 20, gününde (her sakkaridin kütlesi temelinde) 20/20/20 ug düzeyindeki bir klinik dozda intramüsküler enjeksiyon yoluyla uygulandi. Bu uygulama, uygulamanin yapildigi herhangi bir doz seviyesinde anne hayvanda toksisiteye neden olmadi, çiftlesmeye etki etmedi ve embriyoletalite, fetotoksisite veya teratojenisiteye yol açmadi.

Siçanlarda da benzer sekilde kombinasyon uygulandiginda maternal toksisite meydana gelmedi ve üreme fonksiyonu ve embriyo-fetal gelisim üzerinde herhangi bir etki olusmadi ve kombinasyonun 3 (sadece gebelik sirasinda) veya 6 (gebelikten önce ve gebelik sirasinda) enjeksiyon halinde salinle veya alüminyum hidroksitle uygulandigi gruplar arasinda herhangi bir fark kaydedilmedi.

En jeksiyonlar, çiftlesme günü 0. gün olarak kabul edilerek olusturulan bir uygulama takviminin -35, -21 ve -7. günlerinde ve gebeligin 6. 12 ve 17. veya yalnizca gebeligin 6, 12 ve 17. günlerinde verilediler.

Sütten kesiline öncesi periyot sirasinda F1 jenerasyonu yavrularin sagkalimi, klinik durumlari veya vücut agirliklari üzerinde herhangi bir etki gözlemlenmedi.

Insan çalismasi (1) Bu çalismada, bir monovalent GBS serotipi la kapsüler sakkaridi- CRM197 kon jugati asisi arastirildi. 10 denekten olusan test gruplarina (sakkarit kütlesi olarak ölçülen) 5, 10 veya 20 ug dozlarinda 1 veya 2 enjeksiyon uygulandi. 3 ve 2 denekten olusan plasebo gruplarina sirasiyla 1 ve 2 salin enjeksiyonu uygulandi. Tarama zamaninda ve ilk enjeksiyonun üzerinden bir ay geçtikten sonra ELISA analizi için her denekten kan alindi. Ek olarak, çalismanin üç ayi geride kaldiktan sonra, 2 enjeksiyon uygulanan gruplardaki deneklerden ikinci enjeksiyonun yapildigi günde kan alindi ve bu denekler bir ay sonra tekrar toplanarak bir kez daha kan alimi gerçeklestirildi. Diger kan alimlari, denekte son enjeksiyon yapildiktan 6, 12 ve 24 ay sonra gerçeklestirildiler.

ELISA analizinde, GBS Ia (veya asagida açiklanan çalismalarda oldugu gibi Ib ve III) kapsüler sakkaritlerini hedef alan spesifik antikorlarin konsantrasyonu ölçülür. Mikrotitre plakalari, 1 tig/ml konsantrasyonundaki (HSA'ya konjuge) uygun GBS sakkaridi ile kaplandi ve çalisma deneklerinden alinan serunilarla birlikte 37°C sicaklikta 1 saat boyunca inkübe edildi. 3 defa yikama yapildiktan sonra, plakalar bir fosfataz (AP) etiketli anti-insan lgG sekonder antikoruyla birlikte 37°C sicaklikta 90 dakika boyunca inkübe edildiler ve müteakiben ek 3 yikaina islemine tâbi tutuldular. Daha sonra plakaya substrat (pNPP) eklendi ve oda sicakligi altinda 30 dakikalik bir inkübasyon daha gerçeklestirildi. AP, 405 nm'de (referans filtre 650 nm) bir ELISA okuyucu ile ölçülebilecek olan bir kolorimetrik reaksiyon olusturan söz konusu substrata yönelik hidroliz reaksiyonunu katalize eder. Antikor konsantrasyonu degerlendirmesi bir standart egri kullanilarak gerçeklestirilir. Asagidaki Tablo 16'da, her gruba istinaden anti-la antikorlarinin geometrik ortalama konsantrasyonuna (ug/ml) dair 'Özet veriler sunulmaktadir: Tablo 16: Monovalent GBS serotipi la kapsüler sakkaridi-CRM197 konjugati asisi çalismasinda kaydedilen geometrik ortalama konsantrasyonlar (ve geometrik ortalama oranlar) çizgisine (vi7ite 0) orani N=9 \'=8 N=7 ,\'=9 cizgisnie (vi7ite 0) orani N=1 X=9 cizgisine (vizite 0) orani N=l N=9 .\'=8 N=7 X=S N-7 N-9 N-7 N-7 N-9 N-S çizgisine (vizire 0) orani , ` 3 N=7 N=S N=6 N=6 N=9 N=8 + iki enjeksiyon Genel olarak bakildiginda GMC verileri, taban çizgisi ile daha sonraki zaman noktalari arasinda istatistiksel açidan anlamli bir artis oldugunu göstermektedir (örnegin GMC, son asilamadan bir ay sonraki ölçümde 6 ilâ 43 ug/ml araliginda seyretmektedir) ve her ne kadar zainan içerisinde bir düsüs meydana gelse de, grup GMC'leri çalismanin 24. ayi itibariyla taban çizgisine göre hâlâ birden çok misli ölçüde daha yüksekti (24. ayda yapilan ölçümlerde GMR'nin 7 ilâ 14 misli ölçüde oldugu saptandi). GMC nokta tahmini üzerinden bakilacak olursa, son asilamadan bir ay sonra en yüksek toplam cevabi sergileyen grup, tek asilama halinde 5 ug dozunun verildigi gruptu.

Antikor seviyeleri 2 3 ug/mL düzeyinde olan deneklerin sayisina dair son asilamadan bir ay sonra yapilan 'Ölçümde, farkli dozlar (5, 10 ve prograinlari (her ikisinde de 20'den 18'i) ile birbirine yakin "cevap veren" rakamlari elde edilmis oldugu saptandi (ilgili veriler gösterilmemektedir). Antikor seviyeleri 2 5 ug/mL olan deneklerin yüzdesi de ayni gözlemleri dogruladi (ilgili veriler gösterilmemektedir). Bu› kesme degerleri sayesinde, cevaplarin korumaya iliskin olasi serolojik korelasyonlar baglaminda degerlendirilmesinin (referans 250 temelinde) mümkün olacagi düsünüldü. Bu veriler, ne ikinci asilainanin ne de daha yüksek asi dozunun gözlemlenebilir bir katkisinin bulunduguna isaret etmektedir.

Herhangi bir doz-cevap iliskisi gözlemlenmedigi için, yetiskin popülasyonu için optimum dozun 5 ug veya daha düsük bir doz olmasi mümkündür. 5 ve 20 ug dozlarinda uygulama yapilan gruplarda, 2 enjeksiyon uygulamanin l enjeksiyon uygulamaya göre süreklilik arz eden bir avantajinin bulunmadigi gözlemlendi. 10 tig dozu uygulanan grupta ise, bir enjeksiyon uygulamasina kiyasla iki enjeksiyon uygulamasindan sonra daha yüksek pik cevaplari (asilamadan 1 ay sonraki ölçümde) gözlemlendi, fakat daha sonraki (kararli durum) zaman noktalarinda bu trend tersine döndü.

Güvenlik analizi, bir dizi farkli kriter temelinde gerçeklestirildi. Hiçbir güvenlik sorunu teSpit edilmedi ve dikkate deger bir doz-bagimli cevap saptanmadi.

Insan çalismasi (2) Bu çalismada, monovalent GBS serotipi Ib ve III kapsüler sakkaridi- CRM197 konjugati asilari arastirildi. 10 denekten olusan test gruplarina (sakkarit kütlesi olarak ölçülen) 5, 10 veya 20 ug dozlarinda 1 veya 2 enjeksiyon uygulandi. 3 ve 2 denekten olusan plasebo gruplarina sirasiyla 1 ve 2 salin enjeksiyonu uygulandi.

Tarama zamaninda ve ilk enjeksiyonun üzerinden bir ay geçtikten sonra ELISA analizi için her deiiekten kan alindi. Ek olarak, çalisinaiiin 3 ayi geride kaldiktan sonra, 2 enjeksiyon uygulanan gruplardaki deiieklerden ikinci enjeksiyonun yapildigi sirada kan alindi ve bu denekler bir ay sonra tekrar toplanarak bir kez daha kan alimi gerçeklestirildi. Diger kan alimlari, denekte son enjeksiyon yapildiktan 6, 12 ve 24 ay soiira gerçeklestirildiler. Asagidaki Tablo l7'de, her gruba istinaden anti-Ib ve II antikorlarinin geometrik ortalama konsantrasyonuna dair 'Özet veriler sunulmaktadir: Tablo 17: Monovalent GBS serotipi 111 ve lb kapsüler sakkaridi-CRM197 kon jugati asilari çalismasinda kaydedilen geometrik ortalama konsantrasyonlar (ve geometrik ortalama oranlar) Plasebu Plasebu+ GBS lb 5 GBS "J 5+ GBS II) 10 GBS ll› I0+ GBS lb 20 GBS lb 20+ çizgisine (vizire 0) orani N-l N-4 N-(i N-S N-IO N-7 N-9 G çizgisine (viziie 0) orani N=1 N=4) N=S N=5 N=10 N=7 N=9 1,53) N:1 N:9 N:8 2,07) N:l N:10 N:6 N:9 çizgisine (vizite 0) orani N=4 N=8 N=5 N=9 N=4 N=8 D 1,55) N:1 N:6 N:9 N:9 N:7 0.14 0.0099- çizgisine (vizitc 0) orani N=l) ' ” ' › N=6 N=7 N:9 N:8 N=7 N=9 Son immünizasyondan 6 ay sonra 21 (5,57-76) 2,11)N:1 N:1 N:7 N:9 çizgisine (vizite 0) orani Nîl N:6 N:7 N:9 N:8 N:7 N:8 çizgisine (vizite 0) orani N-l N-l N-ö N-7 N-9 N-S N-7 N-7 1,39) N:1 N:3 N:5 N:5 N:5 N:g çizgisine (vizite 0) orani N=l ' ” ” N=2 N=7 N:s N:5 N=5 N=7 + iki enjeksiyon Bu küçük çalismada da ne bir istatistiksel açidan anlamli doz-cevap iliskisi ne de bir enjeksiyon kullanilinasina karsi iki enjeksiyon kullanilmasinin sagladigi anlamli bir avantaj gözlemlendi.

Güvenlik analizi, bir dizi farkli kriter teinelinde gerçeklestirildi. Hiçbir güvenlik sorunu tespit edilmedi ve dikkate deger bir doz-bagimli cevap saptanmadi. Reaktojenisite göstergeleri arasindan, her iki serotip için de beklenen lokal reaksiyonlardan en yaygin karsilasilani enjeksiyon yerinde agri (serotip Ib'ye istinaden 98 enjeksiyonda 15 vaka ve serotip lll'e istinaden 96 enjeksiyonda 14 vaka), beklenen sistemik reaksiyonlardan en yaygin karsilasilani ise bas agrisiydi, plasebo verilmis bireyler ile asilanmis bireyler arasinda bariz bir farklilik gözlemlenmedi.

Insan çalismasi (3) Bu çalismada, hamile olmayan saglikli kadinlarda bir trivalent GBS serotipi Ia, Ib ve III kapsüler sakkaridi-CRM197 konjugati asisi üzerine çalisildi. Her ikisinde de söz konusu üç sakkaridin esit oranlarda kombine edilmis oldugu iki farkli asi formülasyonu incelendi. Yani sira alum adjuvani kullanilarak ve kullanilmayarak iki farkli doz (0,5 m] içerisinde, her sakkaridin kütlesi olarak ölçülen 5 ug ve 20 ug) test edildi. Bu çalismada, her formülasyon için intramüsküler 1- ve 2-enjeksiyonluk (30 gün arayla) programlar da ayrica degerlendirildi. Asida, 4,5 mg sodyum klor'i'ir, 0,34 mg potasyum dihidrojen fosfat ve 7,5 mg mannitol de vardi. Çalisma gruplari asagidaki Tablo 18'de özetlenmektedirler. 20 denegin yer aldigi bir plasebo grubu (30 gün arayla yapilan iki 0,9 salin enjeksiyonu) da test edildi.

Tablo 18: Trivalent GBS serotipi Ia, Ib ve III kapsüler sakkaridi- CRM197 konjugati asisi çalismasindaki çalisma gruplari l enjeksiyon 2 enjeksiyon Degiskenler Alum yok N:40 N:39 N:40 N:40 Alum N=4O N=39 N=40 N=40 Taramada ve ilk en jeksiyonun üzerinden bir ay geçtikten sonra ELISA ile immünojenisite analizi için her denekten kan alindi. 2 enjeksiyon uygulanan gruplarda, birinci ay zaman noktasinda kan alindiktan sonra ikinci enjeksiyon uygulandi. Çalismada 3 ay tainainlandiktan sonra da tüm gruplarda kan alimi gerçeklestirildi. Asagidaki Tablo 19'da, her gruba istinaden anti-la, Ib ve III antikorlarinin geometrik ortalaina konsantrasyoiiuna dair 'Özet veriler sunulmaktadir (taban çizgisi antikor konsantrasyonlarina göre ayarlanmis olan ve plasebo grubu disarida birakilarak hesaplanan veriler).

Tablo 19: Trivalent GBS serotipi la, lb ve 111 kapsüler sakkaridi-CRM197 kon jugati asisi çalismasinda kaydedilen geometrik ortalama konsantrasyonlar (ve geometrik ortalama oranlar) 8,26 (4,19-16) 31. günün :aramaya orani 61. günün [aramaya olam 31. günün tanimaya orani 61. günün :aramaya uniiii + iki enjeksiyon iia - adjuvzinsiz adv , adjuvanli Asi immünojenikti, deneklerin %80 ilâ %IOO'ünde farkli serotipler genelinde GBS-spesifik antikorlarda en az 2 misli düzeyinde bir artis ind'ukledi. Sekiz gruptan elde edilen GMC degerleri arasinda yapilan kiyaslama sonucunda, a) sadece tek bir enjeksiyonun kullanildigi duruma kiyasla bir ikinci enjeksiyonun herhangi bir katkisinin bulunmadigi, b) adjuvansiz uygulama yapilan duruma kiyasla alum adjuvaninin herhangi bir katkisinin bulunmadigi ve C) 5/5/5 ug'ye kiyasla 20/20/20 ug ile yapilan degerlendirmeye göre daha yüksek olan dozun herhangi bir artisinin bulunmadigi saptandi.

Daha da soinutlastirinak gerekirse, GBS serotiplerinden (la, Ib veya deneklere kiyasla iki asi enjeksiyonunun yapildigi denekler genelinde antikor cevabinda uygulamalar arasindaki mevzubahis fark ile bagintili herhangi bir artis yoktu. Ikinci asi enjeksiyonunun katkida bulunmadigina dair yapilan bu gözlem, hangi doz (5/5/5 veya /20/20 ug) veya formülasyon (alum adjuvani bulunan veya bulunmayan) kullanilirsa kullanilsin degismedi. GBS Ia'ya istinaden çalismanin 61. gününde sekiz grubun her birine istinaden yapilan GMC Ölçümlerinde 7 ile 20 tig/ml arasinda degisen sonuçlar elde edildi. Bu sonuçlara göre, tek enjeksiyona (GMC araligi [9-20 ugml]) kiyasla iki enjeksiyonun (GMC araligi [7-16 ug/ml]) herhangi bir katkisinin bulunmadigi anlasildi (tamami örtüsen %95 C1). Dahasi, tek enjeksiyonun iki enjeksiyona orani 1,2'ydi [95 C1 (0,7, 2,0)]. Bu sonuç, bir enjeksiyon ile iki enjeksiyonun pratikte esdeger olduguna isaret etmektedir (p-degeri = 0,5). GBS Ib'ye istinaden çalismanin 61. gününde sekiz grubun her birine istinaden yapilan GMC ölçümlerinde 2 ile 7 ug/ml arasinda degisen sonuçlar elde edildi. Bu sonuçlara göre, tek enjeksiyona (GMC araligi [4-7 ugml]) kiyasla iki enjeksiyonun (GMC araligi [2-5 ug/ml]) herhangi bir katkisinin buluninadigi anlasildi (tamami örtüsen %95 C1). Tek en jeksiyonun iki enjeksiyona orani yine 1,2'ydi [%95 C1 (0,7, 2,0)]. Bu sonuç, yine, bir enjeksiyon ile iki enjeksiyonun pratikte esdeger olduguna isaret etmektedir (p- degeri = 0,5). GBS III'e istinaden çalismanin 61. gününde sekiz grubun her birine istinaden yapilan ölçümlerde 5 ile 13 tig/ml arasinda degisen sonuçlar elde edildi. Bu sonuçlara göre, tek enjeksiyona (GMC araligi [5-13 ugml]) kiyasla iki enjeksiyonun (GMC araligi [5- örtüsen %95 C1). Tek enjeksiyonun iki enjeksiyona orani yine 0,94'tü Aluniun kullanilmadigi duruma kiyasla alumun kullanildigi durum üzerine yapilan degerlendirmede de alumun GMC'ye hiçbir katkisinin olmadigi saptandi. Alum adjuvaninin katkida bulunmadigina dair yapilan bu gözlem, kullanilan dozun hangisi oldugundan (5/5/5 veya /20/20 ug) veya kaç adet enjeksiyon yapildigindan bagiinsizdi ve üç serotipin (Ia, Ib ve III) hepsi için kaydedildi. GBS Ia'ya istinaden çalismanin 61. gününde yapilan ölçümde sekiz grup genelindeki GMC'nin 7-20 tig/ml araliginda seyrettigi saptandi ve alum kullanilmayan duruma (GMC araligi [13-16 ug/mlD kiyasla yapilan degerlendirmeye göre alumun (GMC araligi [7-15 tig/1111)] bir katkisinin bulunmadigi sonucuiia varildi (tamami Örtüsen %95 C1).

Alum kullanilmayan grubun GMC'sinin alum grubunun GMC'sine edilen cevabin alumlu asi formülasyonu ile elde edilen cevaba göre daha yüksek olmasinin olasi oldugunun bir göstergesiydi (p-degeri = 0,11). GBS Ib'ye istinaden çalismanin 61. gününde yapilaii Ölçümde GMC'nin 2-7 tig/ml araliginda seyrettigi saptandi ve alum kullanilinayan duruina (GMC araligi [4-7 ug/m1]) kiyasla yapilan degerlendirmeye göre aluinun (GMC araligi [2-4 ug/ml)] bir katkisinin bulunmadigi sonucuna varildi (tamaini örtüsen %95 C1).

Alum kullanilmayan grubun GMC'sinin alum grubunun GMC'sine orani 1,4'tü [(%95 C1 (0,8, 2,4)], baska bir deyisle GMC degerleri arasinda esdegerlige yakin bir durum söz konusuydu (p-degeri : 0,2).

GBS lll'e istinaden çalismanin 61. gününde yapilan ölçümde GMC'nin -13 ug/ml araliginda seyrettigi saptandi ve alum kullanilmayan duruma (GMC araligi [5-13 ug/ml]) kiyasla yapilan degerlendirmeye göre alumun (GMC araligi [5-11 ug/ml)] bir katkisinin bulunmadigi sonucuna varildi (tamami örtüsen %95 C1). Alum kullanilmayan grubun GMC'sinin alum grubunun GMC'sine oraiii 1,09'du [(%95 C1 (0,6, 1,9)], baska bir deyisle GMC degerleri arasinda esdegerlige yakin bir durum söz konusuydu (p-degeri = 0,7).

Son olarak, eldeki veriler, iki doz arasinda bir degerlendirme yapilmasina da olanak saglamaktadir (koiijugatlarda bulunan üç sakkaridin her birinden 5 ug'ye kiyasla 20 ug). Eldeki sonuçlar, daha yüksek olan dozun (20 ug) daha yüksek bir antikor cevabi indüklemedigini göstermektedir. Somutlastirmak gerekirse, 5 ug alan deneklerde kaydedilen GMC'lerin (tüm gruplar genelinde) 20 ug alan deneklerde kaydedilen GMC'lere (tüm gruplar genelinde) orani, GBS ve l'e esitlige iliskin istatistiksel testin p-degerlerinin üç serotip üçü için de > 0,15 düzeyinde olmasi, iki doz rejimi arasinda indüklenen antikorlarin seviyesi bakimindan kayda deger bir farklilik bulunmadigini göstermektedir.

Güvenlik, lokal ve sistemik reaktojenisite, advers olaylar ve ciddi advers olaylarin ensidansi temelinde ve ayrica klinik laboratuvar sonuçlar çerçevesinde ölçüld'û. Trivalent GBS asisinin plaseboya kiyasla sekiz asi çalisma grubunun sekizinde de iyi tolere edildigi ve güvenli bir asi oldugu saptandi. Güvenlik, asagida belirtilen parametreler üzerinden degerlendirildi: her asilamayi takip eden 7 günlük periyotlar sirasinda meydana gelen beklenen lokal (yani enjeksiyon yeri agrisi, ekiinoz, eritem, sertlesme ve sisme) ve beklenen sistemik (yani üs'ûme, bulanti, malez, miyalji, bas agrisi, fatig, antralji, ras, ates [aksiller sicakligin 38°C veya daha yüksek olmasi olarak tanimlanir] ve digerleri) reaksiyonlarin söz konusu oldugu deneklerin yüzdeleri ve meydana gelen reaksiyonlarin siddeti; her asilamadan sonra 1. günden 23. güne dek rapor edilen diger tüm advers olaylar; 61. güne varana dek her asi grubunda ciddi advers olaylarin ve/veya çalismadan çekilmeyi gerekli kilan advers olaylarin rapor edildigi deneklerin yüzdeleri.

Insan çalismasi (4) Çalismanin girisindeki antikor (Ab) seviyeleri belirleme sinirinin altinda olan deneklerin (serotipler la, Ib ve III'e istinaden sirasiyla 0,4, 0,084 ve 0,068 tig/ml) cevaplari bilhassa dikkat çekiciydi. Bu altküme analizi, yukarida anlatilan Insan çalismasi (3)'ten elde edilen veriler temelinde gerçeklestirildi. Eldeki veriler, asagida belirtilen parametreler bakimindan ve serotiplerin her birine istinaden ayri ayri degerlendirildi: (a) Her enjeksiyon/formülasyon/doz grubuna iliskin GMC ve mütekabil %95 C1 (b) Hangi grupta yer aldiklari fark etmeksizin (i) l enjeksiyon alan tüm denekler genelindeki GMC; bu deger, 2 enjeksiyon alan tüm deneklere iliskin GMC ile karsilastirildi. Benzer sekilde, adjuvan alinayan deneklerin GMC'si, alum alan deneklerin GMC'si ile karsilastirildi ve 5/5/5 ug dozu alan deneklerin GMC'si, 20/20/20 ug dozu alan deneklerin GMC'si ile karsilastirildi. Degerlendirme, ilgili GMC degerlerinin birbirlerine orani ve hesaplanan bu oran civarindaki iki yönlü ((2) En düsük belirleme seviyesinin (lld) yarisina tekabül ettigi varsayilan taban çizgisine göre en az 4 misli degisim meydana gelmis olan deneklerin orani Genel olarak bakildiginda, serotipler Il] ve la/ lb'ye istinaden kadinlarin sirasiyla yaklasik %25 ve %50'si, belirleine sinirinin altinda kalan Ab seviyeleri sergiledi. Taban çizgisine kiyasla 61. günde Ab seviyesinde 4 misli veya daha yüksek bir artis gözlemlenen (burada taban çizgisi degeri, lld'nin yarisi kabul edilir) mevzubahis altkümedeki deneklerin oraninin %64-95 (serotip la), %80-100 (serotip III) ve %81-100 (serotip Ib) araliginda seyrettigi kaydedildi.

Tam çalisina kohortundan elde edilen sonuçlara benzer sekilde, çalisina girisinde tespit edilemez Ab seviyeleri sergileyen denekler, (l enjeksiyona kiyasla) 2 enjeksiyon kullanimindan, (daha düsük bir dozaja kiyasla) daha yüksek bir dozaj kullaniinindan ya da (hiçbir adjuvanin kullanilmadigi duruma kiyasla) alum takviyesinden de ek fayda saglayamadilar. 61. gün ölçümlerine göre, 1 enjeksiyon alan deneklerin GMC'sinin 2 enjeksiyon alan deneklerin GMC'sine orani serotip Ib); 5 ug dozaji alan deneklerin GMC'sinin 20 pg dozaji alan serotip III) ve 1,4'tü (0,9-2,3; serotip lb); ve herhangi bir adjuvan alinayan deneklerin GMC'sinin alum alan deneklerin GMC'sine orani ve 1,7'ydi (1,1-2,7; serotip lb).

Fare çalismasi (15) Fareler, ilk Önce 0. günde CRM197 arti alüminyum hidroksit ad juvaniyla ya da yalnizca alüminyum hidroksit ad juvaniyla primer immünizasyona tâbi tutuldular ve daha sonra 21 ve 35. günlerde alüminyum hidroksit adjuvaninin eslik ettigi veya etmedigi bir GBS serotipi III/CRMl97 konjugati ile iminünize edildiler. 0. günde ve 21 ve 35. günlerde asilama yapilmadan önce kan alindi. Alinan kan numunelerinde, GBS serotipi III polisakkaridi ve CRM197 tasiyici proteinine yönelik gelisen IgG/IgM serum titreleri ölçüldü.

Sekil 4'te gösterildigi gibi, CRM197 tasiyicisi ile yapilan primer immünizasyon, primer immünizasyon yapilmamis farelerde elde edilen sonuçlara kiyasla asidan (ad juvanli veya ad juvansiz) bir ve iki doz verildikten sonra tasiyiciya karsi istatistiksel açidan daha kuvvetli bir lgG antikoru cevabi olusmasini sagladi (P < 0,0002). Primer immünizasyon, asidan (ad juvanli veya adjuvansiz) iki doz verildikten sonra GBS serotipi III polisakkaridine karsi da iyi bir antikor cevabi olusmasini sagladi. Primer immünizasyon yapilmamis olan farelerde, primer immünizasyon yapilmis olan farelerde gözlemlenen anti- polisakkarit antikoru titresi ile denk ve karsilastirilabilir bir titreye ulasmak için adjuvan kullanilmasi gerekti. Primer immünizasyon yapilmamis farelerde, glikokonjugat asisi adjuvansiz uygulandiginda kaydedileii antikor titresi diger gruplarda kaydedilen titre degerlerinden istatistiksel açidan anlamli ölçüde düsüktü (P < 0,03).

Dolayisiyla, CRM197 ile primer immünizasyon, bir adjuvan olmadan yapilmis olsa dahi, konjugattaki GPS kapsüler sakkaridi komponentine yönelik daha sonradan olusacak olan antikor cevabi üzerinde olumlu bir etkiye sahip gibi görünmektedir.

Siçan ve tavsan çalismalari Siçanlarda ve tavsanlarda, trivalent GBS serotipi la, lb ve 111 kapsüler sakkaridi-CRM197 kon jugati asisinin olasi üreme ve gelisimsel toksisitesini degerlendirme amaçli çalismalar gerçeklestirildi.

Siçan çalismasi, asagida yer alan Tablo 20'ye göre gerçeklestirildi: Tablo 20: Siçan çalismasi Hayvan sayisi 0. günü temsil eden çiftlesme gününe Uygulama antijenin hacmi dogum Dogal d ±( ) ( L) göre dozlama iig günleri (gebeligm 21. dogum Kontrol GBS asisi GBS asisi = serotip la/lb/III Disi siçanlarda çalismanin 1, 15 ve 29. günlerinde (çiftlesmeden önceki periyot) ve/Veya gebeligin 6, 12 ve 17. günlerinde alüininyum hidroksitin eslik ettigi veya etmedigi 20 ug dozunda trivalent asi ile yapilan subkütan uygulama, ne maternal toksisiteye neden oldu, ne de üreme fonksiyonu veya embriyofetal gelisime etki etti. Alüminyum hidroksit adjuvaninin eslik ettigi veya etmedigi trivalent asi ile üç veya alti enjeksiyon yapilarak tedavi edilen gruplar arasinda herhangi bir fark kaydedilmedi. Ek olarak, F1 jenerasyonu yavrularin sagkalimi, klinik durumlari veya Vücut agirliklari üzerinde ya da üreme kabiliyeti üzerinde herhangi bir etki gözlemlenmedi.

Tavsan çalismasi, asagida yer alan Tablo 21 'e göre gerçeklestirildi: Tablo 21: Tavsan çalismasi Hayvan sayisi 0. günü temsil Her IM doz Sezaryen eden çiftlesme Uygulama antîjenin hacmi __ __ __ dogum Dogal d ±( ) ( L) gunune gore dozlama g'i'inleri (gebeligin 29 dogum Kontrol GBS asisi + GBS asisi + ± serotip Ia/Ib/III Disi tavsanlarda çalismanin 1, 15 ve 29. günlerinde (çiftlesineden hidroksitin eslik ettigi 20 ug dozunda trivalent asi ile yapilan intraini'iski'iler uygulama, ne inaternal toksisiteye neden oldu, ne çiftlesmeye etki etti, ne de embriyoletalite, fetotoksisite veya teratojenisiteye yol açti. Kontrol ve asi uygulanmis disi tavsanlarin yetiskin Fl jenerasyonu arasinda herhangi bir fark yoktu.

Bu çalismalar, trivalent asinin immünojenik oldugunu ve gebe siçanlar veya tavsanlar ya da onlarin yavrulari üzerinde herhangi bir prenatal veya postnatal etkiye sahip olmadigini gösterdi.

Stabilite çalismasi Trivalent GBS serotipi Ia, Ib ve III kapsüler sakkaridi-CRM197 konjugatinin stabilitesi, iki farkli sicaklikta 1 ay saklama yapilarak ölçüldü. Asi, her biri 10 mM KH2P04 ve %3 inannitol içinde 80 tig sakkarit/ml ölçüsünde bulunan üç glikokonjugat bir araya getirilerek formüle edildi. 3 ml ölçüsündeki tek dozluk flakonlar, 0,3 ml çözelti ile dolduruldular, bromobütil silikon kauçuk tipa ile agizlari kismen kapatildi ve daha sonra bir dondurma-kurutma döngüsüne tâbi tutuldular. Liyofilizasyon prosesi tamamlandiktan sonra, flakonlar 2- 8°C veya 36-38°C sicakliklarda saklandilar. 36-38°C sicaklik altinda yürütülen saklamada serbest sakkarit içeriginde bir miktar artis tespit edildi (HPAEC-PAD kullanilarak yapilan 'Ölçüme göre). Bununla birlikte, trivalent asi, hem 2-8°C sicakliktaki bir aylik saklamada hem de 36-38°C sicakliktaki bir aylik saklamada genel olarak stabilitesini Burada verilen örneklerin yalnizca bulusun daha iyi anlasilmasini saglamak maksadi ile sunulduklari ve dolayisiyla bunlarda çesitli modifikasyonlar yapilabilecegi anlasilacaktir.

Claims (1)

1. ISTEMLER a) Bir tasiyici proteine konjuge Grup B Streptococcus serotipi proteine konjuge Grup B Streptoccocus serotipi Ib'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir kon jugat; ve c) tasiyici proteine kon juge Grup B Streptococcus serotipi III'e iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat ihtiva eden ve (i) içerdigi her GBS kapsüler sakkaridi birim doz basina yaklasik 5 ug, 10 ug veya 20 ug'ye denk bir miktarda bulunan, (ii) yukaridaki a), b) ve c) kalemlerinde bahsi geçen tasiyici protein, difteri toksoidi veya CRM197 olan ve (iii) bir alüminyum tuzu adjuvani ihtiva etineyen bir immünojenik bilesim. Istem l'e uygun immünojenik bilesim olup, burada Grup B Streptoccosus serotip la, Ib ve III kapsüler sakkaritlerinin birim doz basina miktarlari yaklasik 5 ug, 5 ug ve 5 ug'dir. Istem l°e veya 2'ye uygun immünojenik bilesim olup, burada Grup B Streptococcus serotip Ia, Ib ve III kapsüler sakkaritlerinin kütlelerinin birbirlerine orani 1 :1:1'dir. Istemler l ilâ 3'ten herhangi birine uygun iminünojenik bilesim olup, burada immünojenik bilesim asagida belirtilen unsuru da içerir: (1) tasiyici proteine konjuge Grup B Streptococcus serotipi V'ye iliskin bir kapsüler sakkarit olan bir konjugat. Istemler l ilâ 4'ten herhangi birine uygun immünojenik bilesim olup, burada bilesim tek doz halinde uygulama içindir. Yukaridaki isteinlerden herhangi birine uygun immünojenik bilesiin olup, burada konjugat(lar), sakkaritlerin sialik asit artiklarinin %10 ilâ %30'u oksidize edilerek konjugasyondan önce olusturulan aldehit gruplarinin indirgen aminasyona tâbi tutulmasi yoluyla elde edilebilirler. Yukaridaki istemlerden herhangi birine uygun immünojenik bilesiin olup, burada Grup B Streptococcus kapsüler sakkarit(ler_)inin 7, 8 ve/Veya 9 nuinarali pozisyonlardaki sialik asit artiklarinda hemen hemen hiç O-asetilasyon yoktur. Yukaridaki istemlerden herhangi birine uygun immünojenik bilesim olup, burada bilesim, intramüsküler yolla uygulama Yukaridaki istemlerden herhangi birine uygun immünojenik bilesim olup, burada bilesim ayrica sunlari içerir: (a) SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 3 arasindan seçilen bir amino asit sekansi içeren bir polipeptid ve/Veya (b) (i) SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 3'ten biri veya birden fazlasi ile %90 veya daha yüksek bir oranda sekans özdesligine sahip olan bir ainino asit sekansini ve/Veya (ii) SEKANS KOD NO.: 1 ilâ 3'ten birinin bir fragmanini içeren bir polipeptid. Yukaridaki istemlerden herhangi birine uygun immünojenik bilesim olup, burada bilesim, konjugat(lar)i stabilize etmesi için mannitol ihtiva eder. Bir ilaç olarak kullanim için, yukaridaki istemlerden herhangi birine uygun immünojenik bilesim. Istem 11'e uygun kullanim için veya istemler 1-10'a uygun immünojenik bilesim olup, burada bilesim S. agalactiae'nin sebep oldugu bir hastaligin önlenmesi ve/Veya tedavisinde Istem 11”e veya 12'ye uygun kullaniin için veya istemler l-lO'a uygun immünojenik bilesim olup, burada bilesim dogurganlik çagindaki kadinlar, hamile kadinlar ve yasli hastalar arasindan seçilen insanlarda uygulama içindir. Istemler 11-13'e uygun kullanim için veya istemler 1-10'a uygun immünojeiiik bilesim olup, burada bilesim bir difteri toksoidi veya onun bir derivati ile daha 'Önceden immünize edilmis olan bir hastada uygulama içindir.