CN111228478A - 三糖重复单元寡糖链在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了三糖重复单元寡糖链在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用，属于医药领域。本发基于化学合成手段，经过结构优化，获得三糖重复单元寡糖链；将该寡糖链偶联载体蛋白和固定化于基质表面，可制得糖芯片；偶联蛋白制得糖蛋白缀合物，具有突出的免疫活性，进一步制备得到的单克隆抗体可特异性识别金黄色葡萄球菌；原料廉价易得、制备方法简单易重复，在金黄色葡萄球菌的疫苗开发中具有非常好的应用前景。

Description

三糖重复单元寡糖链在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用
技术领域
本发明涉及三糖重复单元寡糖链在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用，属于医药领域。
背景技术
细菌，病毒和寄生虫等病原体表面的糖类抗原具有高度结构特异性，且在其侵染宿主过程中发挥重要作用，是疫苗开发的重要靶点。基于提取细菌表面多糖的糖缀合蛋白疫苗，如流感嗜血杆菌，脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌疫苗等每年都保障着数百万人的生命健康(C.Anish et al.,Chem Biol,2014,21:38)。但是，随着对于疫苗质量，效力和安全性要求的不断提高，通过提取法制备相对均一的多糖产品往往需要极为繁琐的纯化步骤。此外，不可避免的杂质和非保护性表位混入将导致副反应和低反应性，已严重限制了多糖类疫苗的开发和生产。而合成法制备结构明确，组成均一的寡糖提供了极有价值的替代技术，尤其是针对无法大规模培养的致病菌疫苗开发(C.Anish et al.,Chem Biol,2014,21:38)。随着b型流感嗜血杆菌合成寡糖蛋白缀合疫苗QuimiHi
Figure BDA0002391070490000011
(CIGB，La Habana)的上市，研究人员对于致病菌合成寡糖类疫苗开发进行了大量研究工作(P.Kaplonek et al.,PNAS,2018,115:13353)。合成寡糖抗原具有一个巨大的优势是结构明确，组成均一的寡糖将有利于抗原表位研究，将极大促进糖类抗原结构优化设计。不仅如此，对于通常含有稀有单糖砌块和稀有修饰基团的致病菌表面糖链，最小抗原表位的明确将有助于降低寡糖合成的工作量，以便生产高性价比疫苗(C.Anish et al.,Chem Biol,2014,21:38)。
由于多数病原体表面糖链为重复性多糖，其重复单元寡糖链便成为抗原发现和免疫原设计的优先选择。而对于由长链重复单元组成的多糖(通常含有六个以上糖单元)和非重复性多糖，通常需要基于链长，末端糖基，连接序列和修饰基团等因素制备相应的寡糖片段库，将便于利用病人抗血清开展寡糖的抗原性分析(C.Anish et al.,Chem Biol,2014,21:38)。对于表现良好抗原性的寡糖，经蛋白缀合开展动物免疫实验可对寡糖的免疫原性进行探究，其标志性效能为刺激免疫系统产生可识别完整病原体的抗体(G.Liao et al.,ACS Cent Sci,2016,2:210；F.Broecker et al.,Nat Commun,2016,7:11224；M.Emmadi etal.,J Am Chem Soc,2017,139:14783)。通过单克隆抗体的制备，可开展寡糖抗原与抗体相互作用的研究，提供糖类抗原的表位信息，将显著提高寡糖类疫苗的开发效率(B.Schumannet al.,Sci Transl Med,2017,9:eaaf5347)。
金黄色葡萄球菌是最常见的人类机会致病菌之一，其感染可导致一系列致命性疾病，如心内膜炎，脓肿，菌血症，败血症和骨髓炎等。高度流行的金黄色葡萄球菌的抗生素耐药性菌株，如甲氧西林和万古霉素耐药性菌株，使其成为医院感染高发致病菌，且增加了处理其感染的难度。尤其是抗生素耐药性金黄色葡萄球菌血液感染被认为是血液透析患者致残和致死的主要病因(E.C.O’Brien et al.,Trends Mol Med,2019,25:171)。因此，开发金黄色葡萄球菌疫苗，特别是针对临床上最主要的5型和8型荚膜多糖菌株，已迫在眉睫(D.Gerlach et al.,Nature,563:705)。在过去二十年中，虽然研究人员围绕金黄色葡萄球菌疫苗研发开展大量工作，尚未有疫苗成功上市(S.Ansari et al.,Infect Drug Resist,2019,12:1243)。其中基于5型和8型荚膜多糖的实验疫苗StaphVAX(NabiBiopharmaceuticals，Rockville，MD)和基于铁表面决定簇IsdB的实验疫苗V710(Merck，Kenilworth，NJ)是仅有的两个进入临床3期的金黄色葡萄球菌实验疫苗，但均因无法提供有效的保护作用而以失败告终。需要指出的是，实验疫苗V710存在增高受试组死亡率的安全性风险，而实验疫苗StaphVAX在研究中表现出良好的安全性，而其免疫效果低下被认为与所用8型荚膜多糖质量不稳定和抗原种类过于单一有关(S.Ansari et al.,Infect DrugResist,2019,12:1243)。所以研究人员进一步开发了含有多种金黄色葡萄球菌抗原的实验疫苗，其中含有5型和8型荚膜多糖蛋白缀合物，重组细菌表面蛋白聚集因子A(ClfA)和重组锰转运蛋白C(rMntC)的四价疫苗(SA4Ag)在健康成年人体内产生显著的保护性免疫应答，目前正在开展临床2B研究(S.Ansari et al.,Infect Drug Resist,2019,12:1243；E.Begier et al.,Vaccine,2017,35:1132)。
由此可见，目前关于金黄色葡萄球菌疫苗的制备都涉及到复杂的荚膜多糖类化合物的配合使用，这类方法一方面疫苗的稳定性难以控制，且工艺繁琐、成本较高。因此。提供一种简单有效的金黄色葡萄球菌疫苗制备方法是有迫切需求的。
发明内容
本发明基于化学合成方法得到组装有正交连接臂的特定的三糖重复片段→3)-4-O-Ac-β-D-ManpNAcA-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-α-D-FucpNAc-(1→，通过氨基连接臂与载体蛋白缀合制得寡糖蛋白缀合物实验疫苗，经过动物免疫实验对其免疫活性进行验证。本发明通过氨基连接臂将合成寡糖固定于芯片表面，并利用寡糖芯片应用于免疫原性研究中的抗血清中抗体的检测，进一步制备的合成寡糖单克隆抗体可特异性识别金黄色葡萄球菌，探究了该三糖重复片段的构效关系，具有突出的免疫活性，可用于制备或开发金黄色葡萄球菌疫苗，获得三糖重复单元的糖蛋白缀合疫苗。
本发明要解决的技术问题是：克服糖类结构的结构性能多样性和难以预期性，基于化学合成的手段，从分子水平探究其免疫表位和构效关系，探究了该三糖重复片段[3)-4-O-Ac-β-D-ManpNAcA-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-α-D-FucpNAc-(1→]的免疫活性；并通过还原端氨基连接臂与载体蛋白缀合制备寡糖蛋白缀合物实验疫苗，以及通过氨基连接臂将合成寡糖固定于芯片表面制备合成寡糖芯片。三糖蛋白缀合物需可刺激实验动物产生特异性抗体，并可通过合成寡糖芯片对其抗体组成和滴度进行分析。三糖蛋白缀合物免疫动物进一步制备单克隆抗体，且所制备单克隆抗体应能特异性识别金黄色葡萄球菌。
本发明涉及基于化学合成三糖重复单元的糖蛋白缀合疫苗(图1)。本发明首次完成了组装有正交连接臂的三糖重复片段的化学合成，通过氨基连接臂与载体蛋白缀合制得寡糖蛋白缀合物实验疫苗，经过动物免疫实验对其免疫活性进行验证。通过氨基连接臂将合成寡糖固定于芯片表面，并利用寡糖芯片应用于免疫原性研究中的抗血清中抗体的检测。进一步制备合成寡糖单克隆抗体并验证其特异性识别金黄色葡萄球菌的能力，以便证明合成该三糖重复片段具有突出的免疫活性。
本发明的一个目的是提供三糖重复单元寡糖链在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用；所述多糖类化合物；所述三糖重复单元寡糖链组装有氨基连接臂，化学结构式可表示为：U1-U2-U3-O-L-NH2，其中L表示连接臂，U1，U2和U3如下所示：
Figure BDA0002391070490000031
本发明还提供一种用于制备金黄色葡萄球菌疫苗的蛋白缀合物；所述蛋白缀合物的化学结构式可表示为：[U1-U2-U3-O-L-NH-(C＝O)-S-(C＝O)-NH]n-CP，其中U1，U2和U3如上所述；n为1-20；L表示连接臂；S表示延伸臂；CP表示载体蛋白。
本发明中作为连接臂原料组装于寡糖链还原末端的化合物可表示为通式1，
Figure BDA0002391070490000032
其中PGa，PGb为苄基，苄氧羰基。
本发明中连接臂L可以是2-40碳原子数(包括侧链的碳原子数)的链式结构。
本发明中连接臂L的主链长为4-8原子数时，链中可以包含1、2或3个杂原子(O，N和S)。当连接臂的主链长为9-14原子数时，链中可以包含1、2、3、4、5或6个杂原子(O，N和S)。
本发明中连接臂-L-可以全部或部分氟取代。连接臂-L-可以包含一个三、四、五或六元饱和碳环；也可以包含一个五元不饱和碳环(非芳香环)；也可以包含四、五或六元饱和氧杂环；也可以包含一个四、五或六元饱和氮杂环；也可以包含一个六元芳香碳环。
本发明中连接臂-L-也可以包含酰胺键和/或脲基。
本发明中连接臂-L-可以含有一个或多个取代基团，这些取代基可以包括：-F，-Cl，-CH3，-C2H5，-C3H7，-C5H9，-C6H13，-OC2H5，-OCH3，-CH2F，-CF3，-NHC(O)CH3，-CHF2，-C(O)-NH2，-SCH3，-N(CH3)2，-SC2H5和-N(C2H5)2。
本发明中用于将合成寡糖与载体蛋白CP共价连接的延伸臂可以表示为通式2，
Figure BDA0002391070490000041
本发明中延伸臂中-S-可以是2-40碳原子数(包括侧链的碳原子数)的链式结构。
本发明中延伸臂中-S-的主链长为4-8原子数时，链中可以包含1、2或3个杂原子(O，N和S)。当连接臂的主链长为9-14原子数时，链中可以包含1、2、3、4、5或6个杂原子(O，N和S)。
本发明中延伸臂中-S-可以全部或部分氟取代。连接臂-S-可以包含一个三、四、五或六元饱和碳环；也可以包含一个五元不饱和碳环(非芳香环)；也可以包含四、五或六元饱和氧杂环；也可以包含一个四、五或六元饱和氮杂环；也可以包含一个六元芳香碳环。
本发明中延伸臂中-S-也可以包含酰胺键和/或脲基。
本发明中延伸臂中-S-可以含有一个或多个取代基团，这些取代基可以包括：-F，-Cl，-CH3，-C2H5，-C5H9，-C3H7，-C6H13，-OC2H5，-OCH3，-NHC(O)CH3，-CH2F，-CF3，-CHF2，-C(O)-NH2，-SCH3，-SC2H5，-N(CH3)2和-N(C2H5)2。
本发明中所合成糖链结构中含有碱性(氨基)和酸性(羧基)基团，它们可以与有机或无机的酸或碱形成相应的盐。可以用于成盐的酸有盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，乙酸，柠檬酸，草酸，丙二酸，水杨酸，对氨基水杨酸，葡萄糖酸，乳酸，苹果酸，延胡索酸，丁二酸，抗坏血酸，硝酸，甲酸，膦酸，高氯酸，邻甲苯酒石酸，丙酸，酒石酸，丙醇二酸，萘磺酸，对氨基苯磺酸，羟基马来酸，丙酮酸，樟脑磺酸，扁桃酸，苯乙酸，马来酸，磺酸，苯甲酸，对氨基苯甲酸，对羟基苯甲酸，甲磺酸，乙磺酸，亚硝酸，羟基乙磺酸，乙烯磺酸，对甲苯磺酸，邻甲基扁桃酸，羟基苯磺酸，苦味酸，己二酸，氨基萘磺酸，以及其他矿物酸或羧酸类物质。可以用于成盐的无机或有机碱有氢氧化钾，氢氧化钠，四烷基氢氧化铵，氨水，赖氨酸，精氨酸等。
本发明中所合成糖链结构中因同时含有碱性(氨基)和酸性(羧基)基团，也可以通过分子内质子迁移，即酸性基团的质子转移至碱性基团，而通式I可以是含有-O-和-NH3 +的两性分子。
本发明中单糖砌块(U1，U2，U3)之间的连接方式均为一单糖砌块通过端基位碳(1号位碳)与另一单糖砌块的相应羟基氧所形成的糖苷键。
本发明中进行糖蛋白缀合物制备时，连接臂L与延伸臂S之间的连接方式均为由连接臂L上氨基与延伸臂S上羧基形成酰胺键。
本发明中进行糖蛋白缀合物制备时，延伸臂S与载体蛋白之间的连接方式为由延伸臂S上羧基与蛋白结构中赖氨酸和精氨酸侧链氨基形成酰胺键。
本发明中进行寡糖芯片制备时，连接臂L与芯片表面的连接方式为由连接臂L上氨基与芯片表面修饰的羧基形成酰胺键。
本发明中进行糖蛋白缀合物制备时，所用载体蛋白CP可以包括：锁孔蓝蛋白，脱毒白喉毒素，白喉毒素脱毒突变体，经化学或酶法修饰的脱毒白喉毒素，经化学或酶法修饰的白喉毒素脱毒突变体，脱毒破伤风类毒素，破伤风类毒素脱毒突变体，经化学或酶法修饰的脱毒破伤风类毒素，经化学或酶法修饰的破伤风类毒素脱毒突变体，外膜蛋白，牛血清白蛋白，脱毒霍乱类毒素，霍乱类毒素脱毒突变体，经化学或酶法修饰的脱毒霍乱类毒素，经化学或酶法修饰的霍乱类毒素脱毒突变体。上述化学或酶法修饰，可以包括对天冬氨酸或谷氨酸的侧链羧基形成酰胺键连的修饰，可以包括对半胱氨酸的侧链巯基形成二硫键的修饰，但不包括与赖氨酸或精氨酸侧链氨基形成酰胺键的修饰。
本发明提供了以D-葡萄糖作为原料合成寡糖链中D-岩藻糖胺的方法，其特征在于依次进行6号位脱氧和4号位转位，包括以下步骤：
Figure BDA0002391070490000051
1)6-对甲苯磺酰基-D-葡萄糖胺3经转碘反应，制得6-碘代-D-葡萄糖胺4，R1I可以是KI，NaI，TBAI等，反应温度可以在40-80℃之间；
2)6-碘代-D-葡萄糖胺4经氰基硼氢化钠处理脱去6号位碘，制得D-奎诺糖胺5；
3)D-奎诺糖胺5经4号位三氟甲磺酰化，制得4-三氟甲磺酰-D-奎诺糖胺6，反应温度在-40℃至室温之间；
4)4-三氟甲磺酰-D-奎诺糖胺6经Lattrell-Dax反应实现4号位构型翻转，制得D-岩藻糖胺7，R2NO2可以是亚硝酸钾(KNO2)，亚硝酸钠(NaNO2)，四丁基亚硝酸铵(TBANO2)等，反应温度可以是室温至80℃之间。
其中，PG1为羟基保护基团，可以选自如下基团：乙酰基(Ac)，乙酰丙酰基(Lev)，苯甲酰基(Bz)，氯乙酰基(ClAc)，二氯乙酰基(DCA)，三氯乙酰基(TCA)，新戊酰基(Piv)，烯丙氧羰酰基(Alloc)，2-萘甲基(Nap)，对甲氧苄基(PMB)，叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)，叔丁基二苯基硅烷基(TBDPS)，三乙基硅烷基(TES)等。PG2为端基保护基团，可以选自如下基团：硒苯基(SePh)，乙硫基(SEt)，苯硫基(SPh)，对甲苯硫基(STol)，烯丙基(OAll)，烯戊基(OPent)，叔丁基二甲基硅烷氧基(OTBDMS)等。
有益效果：
本发明基于化学方法完成了组装有正交连接臂的三糖重复片段[3)-4-O-Ac-β-D-ManpNAcA-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-α-D-FucpNAc-(1→]的获取；通过还原端氨基连接臂与载体蛋白缀合制得寡糖蛋白缀合物实验疫苗，通过氨基连接臂将合成寡糖固定于芯片表面制备得到合成寡糖芯片。结合动物免疫实验和合成寡糖芯片分析，开展抗血清中抗体的检测，探究合成寡糖蛋白缀合物具有良好的免疫原性。进一步制备的合成寡糖单克隆抗体可特异性识别金黄色葡萄球菌，证明了三糖重复片段可以产生针对完整细胞的免疫应答，可用于制备、开发金黄色葡萄球菌疫苗。
本发明通过化学合成制备寡糖片段，可以获得纯度高以及结构确定一致的化合物单体，可以从分子水平探究其免疫表位和构效关系。同时，确定最小免疫表位可以大大降低化学合成的难度和成本，并对该最小免疫表位进行结构优化，实现金黄色葡萄球菌疫苗的成功开发。
附图说明
图1：基于化学合成金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖三糖重复单元的糖蛋白缀合疫苗。
图2：通式I中U1，U2，U3所示化合物。
图3：组装于寡糖链还原末端的连接臂。
图4：将合成寡糖与载体蛋白共价连接的延伸臂。
图5：由D-葡萄糖3合成D-岩藻糖胺7。
图6：化合物10＊的化学合成反应式。
图7：化合物14＊的化学合成反应式。
图8：化合物23＊的化学合成反应式。
图9：糖蛋白缀合物的表征(A)SDS-PAGE检测糖蛋白缀合物；1：蛋白分子量标准(Marker)，2：CRM197，3：水溶液中的糖缀合物，4：PBS溶液中的糖缀合物。(B)MALDI-TOF/TOF-MS基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱仪分析CRM197和糖蛋白缀合物平均分子质量。
图10:糖芯片检测小鼠血清；(A)使用抗鼠IgG的标记Alexa Fluor 488的二抗检测；糖芯片点样模式如图所示；其中，1：三糖23，点样浓度分别为0.1，0.5，1M，2:连接臂，点样浓度分别为0.1，0.5，1mM，3：CRM197，点样浓度分别为0.1，0.05μM.4：大肠杆菌O55：B5LPS，点样浓度0.2mg/mL.5：点样缓冲液，50mM磷酸钠溶液，pH 8.5,6：合成的类志贺邻单胞菌O51血清型O抗原3糖，点样浓度0.5mM,7:合成的α-1-6-葡萄三糖，点样浓度0.5mM。小鼠1-3为PBS免疫的对照组，小鼠4-6为糖缀合物免疫的实验组；(B)定量检测PBS和糖蛋白缀合物免疫组小鼠的平均荧光强度。误差线为来自两个不同检测区的3个不同点的标准差。
图11:腹水纯化情况SDS-PAGE检测；1：未纯化腹水，2：纯化腹水，3：marker。重链为中间泳道的上部条带，轻链为下部条带。
图12：激光共聚焦检测小鼠血清与菌结合情况(a)金黄色葡萄球菌8型(ATCC49525)与1：50稀释免疫前小鼠血清，(b)金黄色葡萄球菌8型(ATCC 49525)与1：50稀释免疫后小鼠血清，(c)大肠杆菌(BL21)与1：50稀释免疫后小鼠血清。标尺为5μm。
图13:激光共聚焦检测小鼠血清与单克隆抗体结合情况(a)金黄色葡萄球菌8型(ATCC 49525)(b)大肠杆菌(BL21)与1：50稀释免疫后小鼠血清,使用单克隆抗体浓度为186μg/mL.标尺为5μm。
具体实施方式
根据权利要求所包含的内容举例说明。
实验中所用商品化试剂均未经处理直接使用。反应所用无水溶剂由MBraun MB-SPS 800型溶剂干燥系统制备。薄层层析(TLC)所用硅胶板为60-F254硅胶制备的玻璃基或铝箔基硅胶板。薄层层析显色试剂为糖显色剂(0.1％(v/v)3-甲氧基苯酚，2.5％(v/v)硫酸乙醇溶液)，或CAM显色剂(5％(w/v)钼酸铵，1％(w/v)硫酸铈(II)和10％(v/v)硫酸水溶液)，或茚三酮显色剂(1.5％(w/v)茚三酮和3％(v/v)醋酸正丁醇溶液)。正相硅胶柱层析所用硅胶为200-300目硅胶。
分别对各反应步骤产率进行计算，产率计算方式为：(目标产物物质的量/原料物质的量)×100％。利用核磁图谱，红外图谱，旋光度，高分辨质谱对于产品进行结构鉴定，利用核磁图谱和高效液相色谱对于产品进行纯度分析。氢谱、碳谱以及二维核磁谱由BrukerUltrashield Plus 400兆核磁共振仪在25℃下测得。高分辨质谱由Agilent 6220电喷雾离子源-飞行时间质谱仪测得。旋光度由Schmidt&Haensch UniPol L 1000全自动旋光仪在589nm下测得，测定浓度(c)单位为g/100mL。红外图谱由Thermo Fisher ScientificNicolet iS5红外仪测得。
实施例1：
硒苯基3-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖(1＊)的合成
反应方程式如图6所示；
将硒苯基4,6-O-苄叉基-3-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖(C.Qinet al.,J Am Chem Soc,2018,140:3120)(6g，12.6mmol)溶解于80％乙酸溶液(94mL)中，加热至55℃，搅拌5小时，TLC监测原料反应完全。降温至室温，直接旋干溶剂，用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝8:1→5:1→4:1→3:1→2:1)，得到1＊(4.9g，12.6mmol，当量反应)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.26(s,5H,ArH),5.89(d,J＝5.4Hz,1H,H-1),5.11(dd,J＝10.2,9.2Hz,1H,H-3),4.16(dt,J＝9.8,3.8Hz,1H,H-5),3.97(dd,J＝10.2,5.4Hz,1H,H-2),3.80(ddd,J＝5.5,3.8,1.8Hz,2H,H-6a,H-6b),3.71(td,J＝9.6,5.5Hz,1H,H-4),3.01(d,J＝5.7Hz,1H,4-OH),2.21(s,3H,-CH3),1.76(t,J＝6.4Hz,1H,6-OH)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝172.1,135.0,129.3,128.3,83.7,77.2,76.6,74.3,69.8,62.2,61.7,21.0.
实施例2：
硒苯基6-O-对甲基苯磺酰基-3-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖(2＊)的合成反应方程式如图6所示；
将1＊(4.9g，12.6mmol)溶解在无水吡啶(90mL)中，在氩气保护下加入对甲苯磺酰氯(4.1g，21.4mmol)，室温下搅拌12小时，TLC监测原料反应完全。加入乙酸乙酯稀释，用1M的盐酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液，水清洗有机相，合并的有机相经无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1→8:1→7:1→6:1→4:1)，得到2＊(5.9g，10.9mmol，87％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.26(s,10H,ArH),5.81(d,J＝5.4Hz,1H,H-1),5.06(t,J＝9.7Hz,1H,H-3),4.35(dd,J＝11.2,4.1Hz,1H,H-6a),4.28(ddd,J＝9.9,4.1,1.8Hz,1H,H-5),4.10(dd,J＝11.0,1.9Hz,1H,H-6b),3.93(dd,J＝10.2,5.4Hz,1H,H-2),3.69(td,J＝9.5,5.5Hz,1H,H-4),3.01(d,J＝5.5Hz,1H,4-OH),2.44(s,3H,-CH3),2.20(s,3H,-CH3).
实施例3：
硒苯基6-碘-3-O-乙酰基-2-叠氮基-2,6-二脱氧-α-D-吡喃葡萄糖(3＊)的合成
反应方程式如图6所示；
在氩气保护下将2＊(5.9g，10.9mmol)溶解于丁酮溶液(134mL)中，加入乙酸溶液(0.8mL)，加入碘化钠(8.1g，53.7mmol)，搅拌加热至80℃，搅拌3小时，TLC监测原料反应完全。恢复至常温，加入DCM溶液(100mL)，用1M硫代硫酸钠溶液，水清洗，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得到粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝15:1→10:1→8:1→7:1)，得到3＊(4.9g，9.8mmol，91％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.26(s,5H),5.90(d,J＝5.3Hz,1H,H-1),5.09(dd,J＝10.2,9.1Hz,1H,H-3),3.99(dd,J＝10.2,5.3Hz,1H,H-2),3.84(ddd,J＝9.3,4.8,2.9Hz,1H,H-5),3.57(t,J＝9.2Hz,1H,H-4),3.48(dd,J＝11.0,4.8Hz,1H,H-6a),3.41(dd,J＝11.0,2.9Hz,1H,H-6b),2.22(s,3H,-CH3)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝172.3,134.7,129.3,128.2,127.8,84.0,77.2,76.3,73.6,72.5,62.2,29.7,20.9,6.4.
实施例4：
硒苯基3-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-α-D-吡喃奎诺糖(4＊)的合成
反应方程式如图6所示；
在氩气保护下将3＊(4.8g，9.7mmol)溶解于DMF(108mL)中，加入氰基硼氢化钠(4.8mg，77.9mmol)，加热至95℃，持续搅拌反应3小时，TLC监测原料反应完全，降温至室温，加入水(80mL)淬灭反应，用DCM萃取该体系，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，旋干得到粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1→8:1→7:1)，得到产物4＊(1.4g，3.9mmol，40％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.86-6.91(m,5H,ArH),5.82(d,J＝5.3Hz,1H,H-1),5.04(dd,J＝10.2,9.2Hz,1H,H-3),4.15(dq,J＝9.6,6.2Hz,1H,H-4),3.97(dd,J＝10.2,5.4Hz,1H,H-2),3.33(td,J＝9.4,5.9Hz,1H,H-5),2.66(d,J＝6.0Hz,1H,4-OH),2.21(s,3H,-CH3),1.28(d,J＝6.2Hz,3H,-CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝172.3,134.7,129.2,128.1,84.0,78.5,75.3,75.0,71.0,62.5,21.0,17.2.
实施例5：
硒苯基4-O-三氟甲磺酰基-3-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-α-D-吡喃奎诺糖(5＊)的合成
反应方程式如图6所示；
在氩气保护下将4＊(1.1g，2.8mmol)溶解于无水DCM(20mL)中，加入无水吡啶(2mL)，将体系降温至-20℃，搅拌20分钟，逐滴加入三氟甲磺酸酐(1mL)，搅拌反应同时温度缓慢回升至-10℃，2小时后TLC检测原料反应完全，加入DCM(20mL)稀释，用1M盐酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液，水萃洗，收集有机相经无水硫酸钠除水，旋干溶剂得到粗产品用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝80:1→70:1→50:1→40:1→30:1→20:1)，得到5＊(1.1g，2.1mmol，74％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.90-6.90(m,6H,ArH),5.86(d,J＝5.5Hz,1H,H-1),5.45(t,J＝9.7Hz,1H,H-3),4.59(t,J＝9.5Hz,1H,H-4),4.55-4.43(m,1H,H-2),4.00(dd,J＝10.2,5.5Hz,1H,H-5),2.19(s,3H,-CH3),1.31(d,J＝6.1Hz,3H,-CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝169.3,134.8,129.4,128.4,127.3,84.6,83.2,78.9,75.0,70.9,67.7,63.3,20.6,17.0.
实施例6：
硒苯基3-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-α-D-吡喃岩藻糖(6＊)的合成
反应方程式如图6所示；
在氩气保护下将5＊(1g，2mmol)溶解于无水DMF(20mL)中，加入亚硝酸钾(0.9g，10mmol)，升温至50℃搅拌反应，1小时后TLC检测原料反应完全，加入DCM(10mL)稀释，用饱和食盐水萃洗，收集有机相经无水硫酸钠干燥除水，旋干溶剂得到粗产品用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1→8:1→6:1→5:1)，得到6＊(514mg，1.4mmol，69％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.26(s,6H,ArH),5.93(d,J＝5.5Hz,1H,H-1),5.06(dd,J＝10.8,3.0Hz,1H,H-3),4.43(q,J＝6.6Hz,1H,H-5),4.31(dd,J＝10.7,5.4Hz,1H,H-2),3.99(s,1H,H-4),2.19(s,3H,-CH3),1.22(d,J＝6.6Hz,3H,-CH3).
实施例7：
硒苯基4-O-苄基-3-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-α-D-吡喃岩藻糖(7＊)的合成
反应方程式如图6所示；
在氩气保护下将6＊(450mg，1.2mmol)溶解于无水DCM(12mL)中，将体系置于冰浴中，在0℃下加入溴化苄(1.4mL，12.2mmol)，搅拌20分钟，加入氧化银(855mg，3.6mmol)，保持0℃下搅拌反应24小时，TLC检测原料反应完全，过滤除去氧化银，旋干有机相得到粗产品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝70:1→50:1→30:1→20:1)，得到7＊(249mg，0.54mmol，45％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.68-7.21(m,9H,ArH),5.91(d,J＝5.3Hz,1H,H-1),5.46(dd,J＝3.3,1.2Hz,1H,H-4),4.75(d,J＝10.7Hz,1H,PhCH2-),4.53(d,J＝10.7Hz,1H,PhCH2-),4.48-4.37(m,1H,H-5),4.12(dd,J＝10.3,5.4Hz,1H,H-2),3.78(dd,J＝10.4,3.3Hz,1H,H-3),2.15(s,3H,-CH3),1.12(d,J＝6.5Hz,3H,-CH3)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝136.9,134.5,129.1,128.5,128.3,128.1,127.9,85.1,77.3,71.7,68.9,67.8,60.4,20.8,16.1.
实施例8：
4-O-苄基-3-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-D-吡喃岩藻糖三氯乙酰亚胺酯(8＊)的合成
反应方程式如图6所示；
化合物7＊(160mg，0.348mmol)溶解于1:1(v/v)四氢呋喃/水混合液(1mL)，加入N-溴代丁二酰亚胺(150mg，0.843mmol)，反应液在室温下反应3小时。待TLC检测显示反应结束后，以二氯甲烷(5mL)稀释反应液，以10％硫代硫酸钠溶液/1M碳酸氢钠溶液(1:1，v/v)萃取清洗。有机相经无水硫酸钠除水，减压蒸馏得到粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯，4:1，v/v)得到1-羟基化合物(108mg，0.336mmol，97％)。
在氩气保护下，将1-羟基化合物(108mg，0.336mmol)溶解于无水二氯甲烷(4mL)，在0℃下加入三氯乙腈(0.3mL，2.992mmol)和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)(5μL，0.033mmol)，反应液在室温下搅拌4小时。待TLC检测显示反应结束后，在30℃下减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯，10:1，v/v，含0.5％三乙胺)得到三氯乙酰亚胺酯8＊(149mg，0.320mmol，95％)。
实施例9：
N-苄基-N-苄氧羰基-3-氨基丙基4-O-苄基-3-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-D-吡喃岩藻糖(9＊)的合成
反应方程式如图6所示；
在氩气保护下，8＊(149mg，0.320mmol)，N-苄基-N-苄氧羰基-3-氨基丙-1-醇(115mg，0.384mmol)和噻吩(0.3mL，3.747mmol)溶解于3:1(v/v)无水乙醚/无水二氯甲烷混合液(8mL)，加入活化的分子筛(Aw-300)后在室温下搅拌反应液30分钟。在-30℃下加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(70μL，0.387mmol)，反应液搅拌2小时后TLC检测显示反应结束，加入三乙胺(0.1mL)淬灭反应，过滤得到滤液以饱和碳酸氢钠溶液萃取清洗。有机相经无水硫酸钠除水后减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯，6:1，v/v)得到α和β产物(80％，α：β＝3.5:1)，其中α构型为目标产物9＊(120mg，0.199mmol，62％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.41-7.12(m,15H,3Ph),5.26(s,1H,3-H),5.22-5.13(m,2H,Bn-CH2),4.84(s,1H,1-H),4.69(d,J＝11.3Hz,1H,Bn-CH2),4.63-4.39(m,3H,Bn-CH2),3.90(m,1H,5-H),3.76(m,3H,2-H,4-H,linker-1H),3.36(m,3H,linker-3H),2.09(s,3H,CH3CO),1.87(m,2H,linker-2H),1.14(s,3H,6-CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝170.3,137.7,128.6,128.5,128.4,128.2,127.99,127.96,127.90,127.4,98.2,77.2,75.7,71.5,67.3,66.3,65.9,57.7,51.0,20.9,16.4.
实施例10：
N-苄基-N-苄氧羰基-3-氨基丙基4-O-苄基-2-叠氮基-2-脱氧-α-D-吡喃岩藻糖(10＊)的合成
反应方程式如图6所示；
化合物9＊(61mg，0.10mmol)溶解于甲醇(2mL)，加入甲醇钠(3mg，0.06mmol)后反应液在室温下搅拌2h。待TLC检测显示反应结束后，以Amberlite IR 120H+阳离子交换树脂中和反应液，过滤得到滤液减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯，6:1，v/v)得到目标产物10＊(56mg，0.1mmol，当量反应)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.46-7.11(m,15H,3Ph),5.18(m,2H,Bn-2H),4.78(m,2H,Bn-1H,1-H),4.65(d,J＝11.5Hz,1H,Bn-1H),4.60-4.39(m,2H,Bn-2H),3.91(m,2H,3-H,5-H),3.59(m,2H,linker-2H),3.35(m,4H,2-H,4-H,linker-2H),2.05(d,J＝9.0Hz,1H,3-OH),1.82(m,2H,linker-2H),1.23(d,J＝6.4Hz,3H,6-CH3).
实施例11：
烯丙基2-叠氮基-2-脱氧-β-L-吡喃岩藻糖(11＊)的合成
反应方程式如图7所示；
烯丙基3,4-二-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-β-L-吡喃岩藻糖(C.Qin et al.,JAm Chem Soc,2018,140:3120)(447mg，1.43mmol)溶解于甲醇(15mL)，加入甲醇钠(39mg，0.72mmol)后，反应液在室温下搅拌4小时。待TLC检测显示反应结束后，以Amberlite IR120H+阳离子交换树脂中和反应液，过滤得到滤液减压蒸馏除去溶剂得到白色固体状目标产物11＊(327mg，1.43mmol，当量反应)。[α]D 20＝-27.6°(c＝1.00,CHCl3)；IRνmax(film)3312,2865,2111,1348,1279,1162,1071,999,925,755cm-1；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝6.04-5.85(m,1H,CH＝C),5.34(dq,J＝17.3,1.6Hz,1H,C＝CHa),5.23(dd,J＝10.5,1.6Hz,1H,C＝CHb),4.41(ddt,J＝12.9,5.3,1.5Hz,1H,OCHa),4.30(d,J＝7.9Hz,1H,1-H),4.14(ddt,J＝12.8,6.1,1.4Hz,1H,OCHb),3.70(d,J＝3.2Hz,1H,4-H),3.63-3.53(m,1H,5-H),3.53(dd,J＝10.1,7.8Hz,1H,2-H),3.45(dd,J＝10.1,3.3Hz,1H,3-H),3.04(s,1H,OH),2.68(s,1H,OH),1.35(d,J＝6.5Hz,3H,6-Me)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝133.5,117.8,101.1,72.6,70.9,70.6,70.3,64.0,16.3；HR-ESI-MS(m/z):calcd for C9H15N3O4Na+(M+Na+):252.0960,found:252.0954.
实施例12：
烯丙基3-O-对甲氧基苄基-2-叠氮基-2-脱氧-β-L-吡喃岩藻糖(12＊)的合成
反应方程式如图7所示；
在氩气保护下将11＊(4.2g，18.4mmol)溶解于无水甲苯(184mL)中，加入二丁基氧化锡(14.1g，27.6mmol)，加热至120℃回流，搅拌反应4小时，降温旋干至剩余一半溶剂，加入对甲氧基苄基氯(5.5mL，22.1mmol)，然后加入四丁基溴化铵(6.5g，20.2mmol)，重新加热至120℃搅拌反应3小时，TLC检测原料反应完全。将体系降温至室温，直接旋干溶剂，得到粗产品用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝15:1→10:1→8:1→5:1)，得到12＊(3.8g，10.9mmol，59％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.26(s,5H,ArH),6.05-5.86(m,1H,-OAll),5.38-5.28(m,1H,-OAll),5.21(dd,J＝10.4,1.5Hz,1H,-OAll),4.64(s,2H,PhCH2-),4.43-4.34(m,1H,-OAll),4.22(d,J＝8.1Hz,1H,H-1),4.16-4.05(m,1H,-OAll),3.81(s,3H,-CH3),3.73-3.66(m,1H,H-4),3.59(dd,J＝10.0,8.1Hz,1H,H-2),3.47(q,J＝6.5Hz,1H,H-5),3.30(dd,J＝10.0,3.3Hz,1H,H-3),2.34-2.25(m,1H,4-OH).
实施例13：
烯丙基4-O-苄基-3-O-对甲氧基苄基-2-叠氮基-2-脱氧-β-L-吡喃岩藻糖(13＊)的合成
反应方程式如图7所示；
将12＊(3.6g，10.3mmol)溶解在DMF(60mL)中，置于冰浴10分钟降温至0℃，在氩气保护下缓慢加入氢化钠(530mg，20.7mmol)，在冰浴中搅拌0.5小时，在0℃下逐滴加入溴化苄(2mL，15.5mmol)，冰浴下搅拌0.5小时后，撤下冰浴，恢复常温搅拌2小时，TLC监测原料反应完全。加入DCM(30mL)溶液稀释反应液，缓慢加入水(100mL)，用DCM萃取，合并有机相经饱和食盐水和无水硫酸钠除水，滤液旋干后所得粗产品用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝50:1→20:1→15:1→10:1)，得到13＊(3.2g，7.3mmol，71％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.59-6.74(m,10H,ArH),5.93(dddd,J＝16.9,10.9,6.1,5.0Hz,1H,-OAll),5.31(dq,J＝17.2,1.7Hz,1H,-OAll),5.22-5.17(m,1H,-OAll),4.93(d,J＝11.7Hz,1H,PhCH2-),4.70-4.52(m,3H,PhCH2-),4.38(ddt,J＝12.9,5.1,1.6Hz,1H,-OAll),4.21(d,J＝8.0Hz,1H,H-1),4.14-4.04(m,1H,-OAll),3.88–3.76(m,4H,H-2,-CH3),3.50(dd,J＝2.9,1.0Hz,1H,H-4),3.45–3.36(m,1H,H-5),3.29(dd,J＝10.4,2.8Hz,1H,H-3),1.19(d,J＝6.4Hz,3H,-CH3)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ＝138.3,133.8,129.8,129.5,128.4,128.2,127.7,117.4,113.9,100.9,80.8,74.9,74.6,72.3,70.6,69.9,63.0,55.3,16.9.
实施例14：
烯丙基4-O-苄基-2-叠氮基-2-脱氧-β-L-吡喃岩藻糖(14＊)的合成
反应方程式如图7所示；
将13＊(3.2g，7.3mmol)溶解在DCM(300mL)中，加入DDQ(2.5g，11mmol)，加入水(18mL)，室温下搅拌7小时，TLC检测原料反应完全，加入DCM(100mL)稀释，用5％的硫代硫酸钠溶液萃洗，收集有机相经无水硫酸钠除水，旋干溶剂得到粗产品用硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝40:1→30:1→20:1→10:1)，得到14＊(2.1g，6.6mmol，90％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.46-7.18(m,5H),5.94(dddd,J＝16.9,10.9,6.1,5.1Hz,1H,H-OAll),5.33(dd,J＝17.2,1.7Hz,1H,H-OAll),5.21(dd,J＝10.4,1.5Hz,1H,H-OAll),4.82(d,J＝11.6Hz,1H,PhCH2-),4.72(d,J＝11.6Hz,1H,PhCH2-),4.41(ddt,J＝12.9,5.0,1.5Hz,1H,H-OAll),4.26(d,J＝7.9Hz,1H,H-1),4.18–4.06(m,1H,H-OAll),3.64–3.48(m,3H,H-3,H-4,H-5),3.45(ddd,J＝10.2,7.7,3.4Hz,1H,H-2),2.22(d,J＝7.7Hz,1H,3-OH),1.32(d,J＝6.5Hz,3H,-CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝137.9,133.6,128.6,128.2,128.1,117.5,101.0,78.5,76.0,73.0,70.9,70.1,64.6,16.9.
实施例15：
烯丙基4-O-苄基-3-O-(4,6-O-苄叉基-3-O-苄基-2-O-乙酰丙酰基-β-D-吡喃葡萄糖)-2-叠氮基-2-脱氧-β-L-吡喃岩藻糖(15＊)的合成
反应方程式如图8所示；
在氩气保护下，对甲基苯硫基4,6-O-苄叉基-3-O-苄基-2-O-乙酰丙酰基-β-D-吡喃葡萄糖(S.David et al.,Carbohyd Res,1989,188:193；Y.H.Wang et al.,CarbohydRes,2013,375:118；T.Li et al.,ChemMedChem,2014,9:1071)(180mg，0.32mmol)与14＊(51mg，0.16mmol)溶解于无水二氯甲烷(7mL)，加入活化好的分子筛(AW-300)在室温下搅拌30分钟，在0℃下加入碘代丁二酰亚胺(86mg，0.38mmol)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(29μL，0.16mmol)，反应液继续搅拌4h。待TLC检测显示反应结束后，以三乙胺(0.5mL)淬灭反应，过滤所得滤液经5％硫代硫酸钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液萃取。有机相经无水硫酸钠除水后减压蒸馏除去溶剂，所得粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯，4:1，v/v)得到15＊(107mg，0.14mmol，88％，单一β构型)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.55-7.25(m,15H,3Ph),5.94(m,1H,allyl-1H),5.60(s,1H,PhCH),5.32(m,1H,allyl-1H),5.21-5.16(m,1H,allyl-1H),5.10(dd,J＝8.5,7.4Hz,1H,2’-H),4.93-4.83(m,2H,Bn-2H),4.80(d,J＝7.7Hz,1H,1’-H),4.70(d,J＝11.7Hz,1H,Bn-1H),4.52(d,J＝11.3Hz,1H,Bn-1H),4.46(dd,J＝10.4,5.2Hz,1H,6’-CHa),4.39(m,1H,allyl-1H),4.22(d,J＝8.0Hz,1H,1-H),4.11(dd,J＝13.0,6.3Hz,1H,allyl-1H),3.91(m,2H,6’-CHb,4’-H),3.83-3.68(m,2H,3’-H,2-H),3.63(dd,J＝10.3,2.7Hz,1H,3-H),3.54(m,2H,4-H,5’-H),3.48(q,J＝6.4,5.7Hz,1H,5-H),2.69-2.25(m,4H,Lev-CH2),2.06(s,3H,lev-CH3),1.18(d,J＝6.5Hz,3H,6-CH3).
实施例16：
烯丙基4-O-苄基-3-O-(4,6-O-苄叉基-3-O-苄基-β-D-吡喃葡萄糖)-2-叠氮基-2-脱氧-β-L-吡喃岩藻糖(16＊)的合成
反应方程式如图8所示；
化合物15＊(0.34g，0.450mmol)溶解于20：1(v/v)二氯甲烷/甲醇混合液(5mL)，加入醋酸肼(51mg，0.55mmol)，反应液在室温下搅拌5小时。待TLC检测显示反应结束，减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯，8:1，v/v)得到16＊(222mg，0.337mmol，75％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.55-7.27(m,15H,3Ph),5.94(m,1H,allyl-1H),5.60(s,1H,PhCH),5.33(d,J＝16.9Hz,1H,allyl-1H),5.21(d,J＝10.2Hz,1H,allyl-1H),5.00(m,2H,Bn-2H),4.78(d,J＝11.5Hz,1H,Bn-1H),4.75(d,J＝11.4Hz,1H,Bn-1H),4.64(d,J＝5.3Hz,1H,1’-H),4.40(m,2H,allyl-1H,6’-CHa),4.26(d,J＝7.8Hz,1H,1-H),4.09(dd,J＝12.9,6.1Hz,1H,allyl-1H),3.83(m,2H,3’-H,6’-CHb),3.79-3.63(m,4H,4’-H,2-H,3-H,5’-H),3.60(d,J＝2.7Hz,1H,4-H),3.56-3.38(m,2H,2’-H,H-5),2.37-2.27(m,1H,2’-OH),1.20(d,J＝6.5Hz,3H,6-CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝138.31,138.29,137.2,133.7,129.7,129.1,128.47,128.45,128.3,128.24,128.20,128.0,127.9,127.7,126.0,117.7,101.7,101.3,100.8,81.2,80.4,78.6,77.2,75.5,74.72,74.66,73.2,70.5,70.0,68.7,66.9,61.9,16.8.
实施例17：
烯丙基4-O-苄基-3-O-(4,6-O-苄叉基-3-O-苄基-2-叠氮基-2-脱氧-β-D-吡喃甘露糖)-2-叠氮基-2-脱氧-β-L-吡喃岩藻糖(17＊)的合成
反应方程式如图8所示；
在氩气保护下，化合物16＊(139mg，0.211mmol)溶解于无水二氯甲烷(1.5mL)，加入吡啶(0.3mL)，在-20℃下滴加三氟甲磺酸酐(0.1mL，0.585mmol)，缓慢升温至10℃继续搅拌4h。待TLC检测显示反应结束，加入5mL二氯甲烷稀释反应液，以1M盐酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液萃取清洗，有机相经无水硫酸钠除水，浓缩得到粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯，5:1，v/v)得到三氟甲磺酰化合物(107mg，0.134mmol，64％)。
在氩气保护下，三氟甲磺酰化合物(107mg，0.134mmol)溶解于无水DMF(2mL)，加入叠氮钠(57mg，0.88mmol)，反应液加热至60℃反应3h。待TLC检测显示反应结束，加入6mL二氯甲烷稀释反应液，经水萃取清洗后，有机相以无水硫酸钠除水。减压蒸馏浓缩得到粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯，5:1，v/v)得到17＊(81mg，0.120mmol，90％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.51-7.27(m,15H,3Ph),5.95(m,1H,allyl-1H),5.58(s,1H,PhCH),5.34(dd,J＝17.2,1.9Hz,1H,allyl-1H),5.22(dd,J＝10.7,1.7Hz,1H,allyl-1H),4.85(d,J＝12.6Hz,1H,Bn-1H),4.80(d,J＝11.9Hz,1H,Bn-1H),4.74(d,J＝12.5Hz,1H,Bn-1H),4.64(d,J＝11.8Hz,1H,Bn-1H),4.45-4.39(m,1H,allyl-1H),4.38(d,J＝1.2Hz,1H,1’-H),4.31(dd,J＝10.4,4.8Hz,1H,6’-CHa),4.26(d,J＝7.5Hz,1H,1-H),4.17-4.06(m,1H,allyl-1H),4.04(t,J＝9.3Hz,1H,4’-H),3.91(t,J＝10.1Hz,1H,6’-CHb),3.77(dd,J＝10.6,7.8Hz,1H,2-H),3.69(dd,J＝10.2,3.1Hz,1H,3-H),3.60-3.51(m,2H,4-H,3’-H),3.51-3.39(m,2H,2’-H,5-H),3.21(td,J＝9.5,4.6Hz,1H,5’-H),1.35(d,J＝6.2Hz,3H,6-CH3)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ＝138.1,137.8,137.2,133.7,129.0,128.53,128.51,128.47,128.45,128.41,128.37,128.3,128.2,128.1,127.98,127.95,127.8,127.7,126.0,117.5,101.5,101.0,100.9,97.0,78.3,77.6,76.3,75.4,75.0,72.9,70.4,70.1,68.3,67.68,67.65,63.3,62.1,17.1.
实施例18：
4-O-苄基-3-O-(4,6-O-苄叉基-3-O-苄基-2-叠氮基-2-脱氧-β-D-吡喃甘露糖)-2-叠氮基-2-脱氧-1-(N-苯基)-2,2,2-三氟乙酰亚胺酯-L-吡喃岩藻糖(18＊)的合成
反应方程式如图8所示；
化合物17＊(26mg，0.038mmol)溶解于20:1(v/v)乙酸/水混合液(3mL)，加入醋酸钠(183mg，2.244mmol)和氯化钯(11.4mg，0.065mmol)，反应液在室温下搅拌3h。待TLC检测显示反应结束后，加入6mL乙酸乙酯稀释反应液，经硅藻土过滤所得滤液以饱和碳酸氢钠溶液萃取清洗。有机相经无水硫酸钠除水后减压蒸馏浓缩，粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯，2:1，v/v)得到1-羟基化合物(20mg，0.031mmol，82％)。
在氩气保护下，1-羟基化合物(20mg，0.031mmol)溶解于无水二氯甲烷(2mL)，在0℃下加入N-苯基三氟乙酰亚胺氯(10μL，0.067mmol)和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)(11μL，0.074mmol)，反应液在室温下搅拌10h。待TLC检测显示反应结束，减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯，5:1，v/v)得到18＊(15mg，0.018mmol，58％)。
实施例19：
N-苄基-N-苄氧羰基-3-氨基丙基4-O-苄基-3-O-(4-O-苄基-3-O-[4,6-O-苄叉基-3-O-苄基-2-叠氮基-2-脱氧-β-D-吡喃甘露糖]-2-叠氮基-2-脱氧-α-L-吡喃岩藻糖)-2-叠氮基-2-脱氧-α-D-吡喃岩藻糖(19＊)的合成
反应方程式如图8所示；
在氩气保护下,供体18＊(60mg，0.074mmol)和受体10＊(30mg，0.054mmol)溶解于3:1(v/v)乙醚/二氯甲烷混合液(2.5mL)，加入活化的分子筛(AW-300)和噻吩(70μL，0.874mmol)后反应液在室温下搅拌30分钟。在-10℃下加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.5μL，0.008mmol)，反应液在-10℃下搅拌5h。待TLC检测显示反应结束后，加入三乙胺(0.5mL)淬灭反应，硅藻土过滤所得滤液经饱和碳酸氢钠溶液萃取清洗。有机相经无水硫酸钠除水后，减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯，3:1，v/v)得到19＊(52mg，0.044mmol，82％，单一α构型)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.63-7.15(m,30H,6Ph),5.58(s,1H,PhCH),5.21(d,J＝4.2Hz,1H,1'-H),5.19-5.12(m,2H,Bn-2H),4.88(m,2H,1-H,Bn-1H),4.79(d,J＝11.2Hz,1H,Bn-1H),4.76-4.60(m,4H,Bn-4H),4.56(m,3H,1”-H,NBn-2H),4.17(m,2H,3'-H,6”-CHa),4.06(m,2H,4”-H,3-H),3.91(m,2H,5-H,5'-H),3.83(m,2H,2-H,6”-CHb),3.73(dd,J＝10.5,3.7Hz,1H,2'-H),3.63(m,3H,linker-1H,3”-H,2”-H),3.56(d,J＝2.6,1H,4'-H),3.53(s,1H,4-H),3.42(m,1H,linker-1H),3.32(m,2H,linker-2H),3.23(td,J＝9.7,4.8Hz,1H,5”-H),1.83(m,2H,linker-2H),1.21(m,6H,6-CH3,6'-CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝138.4,137.9,137.3,136.8,129.0,128.6,128.52,128.49,128.4,128.3,128.2,128.1,128.0,127.94,127.9,127.82,127.78,127.7,127.4,126.1,101.6,99.9,98.2,98.1,79.9,78.4,77.22,77.17,76.9,76.5,76.4,75.7,75.3,75.2,73.0,68.4,67.8,67.5,67.3,66.9,66.0,63.6,60.3,58.5,16.8.
实施例20：
N-苄基-N-苄氧羰基-3-氨基丙基4-O-苄基-3-O-(4-O-苄基-3-O-[4,6-O-苄叉基-3-O-苄基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃甘露糖]-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-L-吡喃岩藻糖)-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃岩藻糖(20＊)的合成
反应方程式如图8所示；
化合物19＊(12.2mg，10μmol)溶解于吡啶(1mL)，加入水(289μL，16.05mmol)，三乙胺(62μL，0.45mmol)和1,3-丙二硫醇(60μL，0.60mmol)，所得反应液在室温下搅拌4小时。待TLC检测显示反应结束，减压蒸馏除去溶剂，所得粗品直接用于下一步反应。
在氩气保护下，将上一步氨基产物粗品溶解于甲醇(0.5mL)，加入醋酸酐(12μL，0.12mmol)，反应液在室温下搅拌18小时。待TLC检测显示反应结束，减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇，40:1，v/v)得到黄色糖浆状产品20＊(8.3mg，6.7μmol，两步产率67％)。IRνmax(film)3326,2872,1665,1530,1453,1370,1087,1047,734,697,576cm-1；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.60-7.12(m,30H,6Ph),7.02(d,J＝9.3Hz,1H,2-NH),6.25(d,J＝9.6Hz,1H,2'-NH),6.16(d,J＝8.4Hz,1H,2”-NH),5.56(s,1H,PhCH),5.24-5.05(m,2H,Bn-2H),4.94-4.81(m,3H,Bn-2H,1'-H),4.77(m,4H,Bn-2H,2-H,2”-H),4.70-4.55(m,4H,Bn-2H,2'-H,1-H),4.51(d,J＝2.1Hz,1H,1”-H),4.46(d,J＝11.3Hz,1H,Bn-1H),4.37(d,J＝15.9Hz,1H,Bn-1H),4.22(dd,J＝10.8,4.7Hz,1H,6”-CHa),4.00-3.89(m,2H,5-H,3-H),3.84(d,J＝6.7Hz,1H,5'-H),3.79-3.57(m,6H,linker-2H,6”-CHb,4”-H,3”-H,3-H),3.46(dd,J＝5.8,2.6Hz,2H,4-H,4'-H),3.37-3.10(m,3H,linker-2H,5”-H),2.12(s,3H,CH3CO),2.01(s,6H,2CH3CO),1.73(m,2H,linker-2H),1.26(d,J＝6.5Hz,3H,6-CH3),1.22(d,J＝6.4Hz,3H,6'-CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝172.0,171.4,156.5,138.6,138.5,138.2,137.4,137.3,136.4,128.9,128.7,128.50,128.47,128.3,128.24,128.19,127.9,127.8,127.7,127.5,127.2,127.1,126.1,101.5,100.4,98.8,97.9,80.6,79.5,78.4,76.1,75.4,75.1,71.6,68.6,67.5,67.0,51.0,49.7,48.8,47.7,24.1,23.2,16.9,16.8.
实施例21：
N-苄基-N-苄氧羰基-3-氨基丙基4-O-苄基-3-O-(4-O-苄基-3-O-[3-O-苄基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃甘露糖醛酸苄酯]-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-L-吡喃岩藻糖)-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃岩藻糖(21＊)的合成
反应方程式如图8所示；
化合物20＊(8.3mg，6.7μmol)溶解于二氯甲烷(0.7mL)，加入水(2μL)和三氟乙酸(70μL，0.94mmol)，反应液在室温下搅拌18小时。待TLC检测显示反应结束，加入三乙胺(0.1mL)淬灭反应，减压蒸馏除去溶剂后，粗品经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇，20:1，v/v)得到4，6-二羟基糖(6mg，5.2μmol，78％)。
二羟基三糖(12.7mg，11μmol)溶解于二氯甲烷(0.6mL)，加入水(0.28mL)，TEMPO(0.9mg，5.5μmol)和二乙酰氧基碘苯(9mg，27.7μmol)，所得反应液在室温下搅拌4小时。待TLC检测显示反应结束后，将反应液经硅胶过滤(二氯甲烷：甲醇，5:1，v/v)，滤液浓缩所得粗品经油泵抽干。在氩气保护下，粗品溶解于无水DMF(1.1mL)，加入溴苄(10μL，82.5μmol)和碳酸氢钠(5mg，50μmol)，反应液在室温下搅拌12h。待TLC检测显示反应结束后，向反应液中加入2mL水淬灭反应，经乙酸乙酯(3×5mL)萃取后，有机相以饱和食盐水(5mL)萃取清洗。有机相经无水硫酸钠处理后减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇，50:1，v/v)得到无色糖浆状化合物21＊(12.0mg，9.6μmol，两步产率87％)。IRνmax(film)2942,2865,1722,1366,1294,1242,1190,1104,1046,732cm-1；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.51-7.09(m,30H,5Ph),6.90(d,J＝9.3Hz,1H,N-H),6.32(m,2H,N”-H,N-H),5.43-5.24(m,2H,Bn-2H),5.13(s,2H,Bn-2H),4.99-4.82(m,3H,Bn-2H,1’-H),4.83-4.69(m,4H,Bn-2H,2-H,2’-H),4.68-4.56(m,3H,1-H,NBn-1H,2”-H),4.54(d,J＝2.0Hz,1H,1”-H),4.47(dd,J＝11.3,3.4Hz,2H,Bn-2H),4.38(d,J＝15.8Hz,1H,NBn-1H),3.99-3.85(m,3H,5'-H,3-H,4”-H),3.79(d,J＝9.3Hz,2H,5”-H,5-H),3.71(dd,J＝10.7,2.6Hz,2H,3'-H,linker-1H),3.68-3.57(m,1H,linker-1H),3.50-3.37(m,3H,4-H,4'-H,3”-H),3.28(s,1H,linker-1H),3.20(d,J＝13.9Hz,1H,linker-1H),2.74(d,J＝2.5Hz,1H,4”-OH),2.05(s,3H,CH3CO),2.00(s,6H,2CH3CO),1.71(m,2H,linker-2H),1.26(d,J＝7.0Hz,3H,6'-CH3),1.20(d,J＝6.5Hz,3H,6-CH3).
实施例22：
N-苄基-N-苄氧羰基-3-氨基丙基4-O-苄基-3-O-(4-O-苄基-3-O-[4-O-乙酰基-3-O-苄基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃甘露糖醛酸苄酯]-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-L-吡喃岩藻糖)-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃岩藻糖(22＊)的合成
反应方程式如图8所示；
在氩气保护下，化合物21＊(7mg，5.6μmol)溶解于吡啶(0.2mL)，加入醋酸酐(6μL，63.5μmol)后，反应液在室温下搅拌3h。待TLC检测显示反应结束，加入甲醇(50μL)淬灭反应，减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇，70:1，v/v)得到无色浆状产品22＊(5.8mg，4.5μmol，80％)。[α]D 20＝-13.47°(c＝0.50,CHCl3)；IRνmax(film)3334,2923,1754,1671,1526,1454,1368,1232,1095,1051,736,698cm-1；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.51-7.10(m,30H,6Ph),6.84(d,J＝9.5Hz,1H,N-H),6.57(d,J＝9.1Hz,1H,N”-H),6.36(d,J＝9.6Hz,1H,N-H),5.38(t,J＝6.5Hz,1H,4”-H),5.27-5.00(m,5H,Bn-5H),4.98(d,J＝3.8Hz,1H,1'-H),4.91-4.67(m,5H,1-H,2-H,2'-H,Bn-2H),4.67-4.47(m,5H,1”-H,2”-H,Bn-3H),4.46-4.34(m,2H,Bn-2H),4.29-4.18(m,1H,3'-H),4.04(d,J＝6.1Hz,1H,5”-H),3.96(m,3H,5-H,5'-H,3-H),3.67(m,3H,4-H,linker-2H),3.51(m,2H,4'-H,3”-H),3.38-3.15(m,2H,linker-2H),2.04(s,3H,CH3CO),2.00(s,3H,CH3CO),1.92(s,3H,CH3CO),1.82(s,3H,CH3CO),1.76(m,2H,linker-2H),1.25(d,J＝6.4Hz,6H,6-CH3,6'-CH3)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ＝171.9,169.7,169.6,167.4,156.4,139.0,138.3,137.9,136.5,135.0,128.8,128.7,128.6,128.5,128.4,128.3,128.2,128.1,127.8,127.5,127.3,100.3(anomeric),98.0(anomeric),94.5(anomeric),74.7,74.4,72.1,67.9,67.7,67.5,67.2,63.5,49.7,48.8,47.7,47.0,29.7,23.6,22.9,20.8,17.3,17.0；HR-ESI-MS(m/z):calcdfor C72H84N4O18Na+(M+Na+):1315.5678,found:1315.5697.
实施例23：
3-氨基丙基3-O-(3-O-[4-O-乙酰基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃甘露糖醛酸]-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-L-吡喃岩藻糖)-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃岩藻糖(23＊)的合成
反应方程式如图8所示；
三糖22＊(4.7mg，3.63μmol)溶解于叔丁醇/水/二氯甲烷混合液(5mL，5:2:1，v/v/v)中，氮气置换反应体系后，加入10％钯碳加氢催化剂，继续氮气置换5分钟。进一步以氢气置换反应体系5分钟后，反应液在氢气环境下搅拌24小时，硅藻土过滤后浓缩得到的粗品以C18小柱(Macherey-Nagel,Düren,德国)(洗脱液为水和甲醇)纯化得到白色固体状目标三糖23＊(2.5mg，3.53μmol，97％)。[α]D 20＝-45.25°(c＝0.20,H2O)；1HNMR(400MHz,D2O)δ＝5.13-5.05(m,2H,4”-H,1'-H),5.02(s,1H,1”-H),4.83(d,J＝3.8Hz,1H,1-H),4.59(d,J＝4.4Hz,1H,2”-H),4.33(dd,J＝11.1,3.8Hz,1H,2-H),4.27-4.20(m,2H,2'-H,4'-H),4.13(dd,J＝9.6,4.5Hz,3H,3”-H,5-H,5'-H),4.08(s,1H,3'-H),4.04-3.94(m,2H,5”-H,3-H),3.85(d,J＝3.2Hz,1H,4-H),3.81(dd,J＝10.9,5.6Hz,1H,linker-CH2),3.57(dt,J＝11.2,6.0Hz,1H,linker-CH2),3.16(t,J＝7.6Hz,2H,linker-CH2),2.18(s,3H,CH3CO),2.11(s,6H,2CH3CO),2.03(s,5H,linker-CH2,CH3CO),1.28(d,J＝2.3Hz,3H,6'-CH3),1.27(d,J＝2.7Hz,3H,6-CH3)；13CNMR(100MHz,D2O)δ＝175.6,173.9,173.8,173.1,98.9(1'-C),97.2(1-C),95.1(1”-C),74.1,73.3,73.1,71.1,70.1,69.5,67.6,66.9,66.5,65.0,53.0,48.5,47.6,37.2,26.8,22.3,21.94,21.92,20.3,15.5,15.3；HR-ESI-MS(m/z):calcd forC29H48N4O16Na+(M+Na+):731.2963,found:731.2962.
实施例24：
三糖23＊与CRM-197的蛋白缀合物的制备
在双(己二酸对硝基苯酯)(PNP,26.33mg,67.8μmol)的DMSO/吡啶溶液(1:1,25mL：0.25mL)中加入三乙胺(12μL,86μmol)室温搅拌5分钟。滴加溶于DMSO/吡啶(1：1,0.1mL:0.1mL)的三糖23(1.6mg,2.26μmol)，室温搅拌反应7小时，TLC检测显示原料完全反应，sugar stain显示。冻干反应混合物。冻干固体使用氯仿(1mL)洗6次，得到三糖-PNP酯。CRM197蛋白(1mg,0.017μmol)在超滤管中使用灭菌水(400μL)洗3次，再使用磷酸盐溶液(pH8.0,400μL)洗1次。清洗后的CRM197蛋白加入三糖-PNP酯中，室温搅拌24小时，反应后混合物使用灭菌水和磷酸盐溶液清洗，得到糖蛋白缀合物。使用MALDI-TOF-MS和SDS-PAGE鉴定得到的糖蛋白缀合物。根据图9的SDS-PAGE结果可见，CRM197蛋白连接了一定量的三糖残基后形成了糖缀合物，其条带经糖基化后分子量有增大，聚集性差而加宽。而根据MALDI-TOF/TOF-MS(基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱仪)分析得到糖蛋白缀合物平均分子质量为约63.5kDa,计算可得到平均每个蛋白连接有6个三糖残基，并据此计算免疫实验每只小鼠的所需糖蛋白缀合物的量。
实施例25：糖蛋白缀合物的免疫实验及芯片检测
糖缀合物免疫实验：
使用抗鼠IgG的标记Alexa Fluor 488的二抗检测。并定量检测PBS免疫对照组和糖缀合物免疫实验组小鼠的平均荧光强度。误差线为来自两个不同检测区的3个不同点的标准差。
12只六周大的Balb/c小鼠随机分为两组，6只对照组和6只实验组。6只对照组为PBS免疫的对照组，结果见图10(A)中的小鼠1-3，6只实验组为糖缀合物免疫的实验组，结果见图10(A)中的小鼠4-6。
第0天，实验组小鼠经皮下免疫注射100μL糖缀合物与弗式完全佐剂1：1混合乳液；对照组小鼠注射100μL PBS与弗式完全佐剂1：1混合乳液。第14天，使用弗式不完全佐剂进行加强。实验组小鼠每只每次注射抗原量相当于4μg糖抗原。取第0，14，21天小鼠血清进行芯片检测检测其免疫反应。
糖芯片实验：
点样模式如图10(B)所示。
芯片检测：
点样1：三糖23＊，点样浓度分别为0.1，0.5，1mM；
点样2：连接臂(HOCH2CH2CH2NH2)，点样浓度分别为0.1，0.5，1mM；
点样3：CRM197，点样浓度分别为0.1，0.05μM；
点样4：大肠杆菌O55：B5 LPS，点样浓度0.2mg/mL；
点样5：点样缓冲液，50mM磷酸钠溶液，pH 8.5；
点样6：类志贺邻单胞菌O51血清型O抗原3糖(参见CN108558961A)，点样浓度0.5mM；
点样7：α-1-6-葡萄三糖，点样浓度0.5mM；
将APTES玻片(Electron Microscopy Science,Cat.#63734-01)浸没在溶液A(1.58g四乙二醇琥珀酰基二琥珀酸，257mL DMF，3.6mL二异丙胺)中，40℃，60-70转过夜震荡孵育。超声15分钟，使用无水乙醇洗3次。离心甩干玻片，37℃真空干燥3小时。
待点样固体溶于50mM磷酸钠溶液中，pH 8.5。经过修饰的玻片上使用Arrayjetsprint(Arrayjet)进行点样。点样完成后在26℃,55％湿度的条件下孵育过夜。随后将玻片浸泡在溶液B(50nM Na2HPO4,100nM乙醇胺的水溶液)中，50℃，1小时。玻片使用超纯水洗3次，离心除去残留的水。使用3％BSA(w/v)的PBS溶液，4℃封闭过夜。使用PBST(含0.1％tween的PBS)清洗1次，PBS清洗两次，离心甩干。玻片装入64孔孵育器中(ProPlate)。每孔加入1：50稀释于1％BSA(w/v)的PBS溶液的小鼠血清样品30μL，室温湿盒中避光孵育1小时。移除样品，使用50μL PBST洗3次，加入1：400稀释于1％BSA(w/v)的PBS溶液的二抗，在湿盒中，室温避光孵育45分钟。移除二抗溶液，使用50μL PBST洗3次。拆除64孔孵育器，使用超纯水清洗，再使用超纯水清洗15分钟。离心去除残余的水。
使用芯片扫描仪扫描。根据图10结果所示，相比于对照组小鼠和免疫前的水平，经过免疫和一次加强之后，实验组小鼠有明显的免疫反应，并在血清中产生逐渐增多的IgG抗体。根据与芯片上的CRM197蛋白、点样缓冲液和不同糖样品结合的不同程度可知，该IgG抗体对合成的三糖23＊的特异性最高。根据该结果选取免疫反应最好的小鼠于第28天再次加强免疫，并于7天后收取其脾脏细胞用于杂交瘤细胞的杂交。
实施例26：
单克隆抗体的制备
根据通用方法制备杂交瘤细胞(参考文献Broecker,F.,Anish,C.&Seeberger,P.H.Generation of monoclonal antibodies against defined oligosaccharideantigens.Methods Mol.Biol.1331,57–80(2015))。使用六周大的雌性Balb/c小鼠制备腹水。小鼠腹腔注射无菌0.5mL液体石蜡，一周后，腹腔注射含有0.5×106～1×106个杂交瘤细胞的0.5mL PBS。约9天后，处死小鼠，收集腹水。3000rpm离心15min，移除脂肪，上清分装冻存于-20℃。使用辛酸-硫酸铵沉淀得到纯化腹水。如图11所示，纯化后的腹水中IgG抗体纯度较高，大约70kDa处的条带可对应为抗体重链，29kDa左右处的条带可对应为抗体轻链。
实施例27：
血清及单克隆抗体识别灭活金葡菌的检测
金黄色葡萄球菌(ATCC 49525)在Soybean-Casein Digest培养基中37℃过夜培养。大肠杆菌(BL21)在LB培养基中37℃过夜培养。使用0.4％的多聚甲醛灭活48小时。菌体使用0.1mg/mL的FITC标记，使用稀释的血清(小鼠第二次免疫加强后7天收集的血清)或单克隆抗体结合FITC标记的细菌，使用稀释的羊抗鼠IgG-Alexa Fluor 635二抗进行孵育。激光共聚焦检测结合情况。
如图12和13所示，金葡菌和大肠杆菌的菌体均由FITC标记后呈现绿色荧光，抗体与菌体的结合主要检测IgG-Alexa Fluor 635显示的红色荧光，血清及单克隆抗体均显示较好的针对金葡菌的识别结合能力，而对与大肠杆菌基本没有结合，显示了该糖蛋白缀合物良好的刺激免疫免疫反应的作用及相关抗体的作用特异性。

Claims (10)

1.三糖重复单元寡糖链在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用，其特征在于，所述三糖重复单元寡糖链组装有氨基连接臂，化学结构式可表示为：U1-U2-U3-O-L-NH2，其中L表示连接臂，为不含或者含有杂原子的2-40碳原子数的链式结构，所述杂原子选自O，N和S；U1，U2和U3如下所示：
Figure FDA0002391070480000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述连接臂L的链长为4-8碳原子数时，链中含有1-3个杂原子；当连接臂的链长为9-14碳原子数时，链中含有1-6个杂原子。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，连接臂L的链式结构中含有一个三、四、五或六元饱和碳环；或者含有一个五元不饱和碳环(非芳香环)；或者含有四、五或六元饱和氧杂环；或者含有一个四、五或六元饱和氮杂环；或者含有一个六元芳香碳环。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，连接臂L的链式结构中含有酰胺键和/或脲基。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，连接臂L含有一个或多个取代基团，所述取代基选自：-F，-Cl，-CH3，-C2H5，-C3H7，-C5H9，-C6H13，-OC2H5，-OCH3，-CH2F，-CF3，-NHC(O)CH3，-CHF2，-C(O)-NH2，-SCH3，-N(CH3)2，-SC2H5和-N(C2H5)2。
6.一种用于制备金黄色葡萄球菌疫苗的糖蛋白缀合物，其特征在于，所述糖蛋白缀合物的化学结构式为：[U1-U2-U3-O-L-NH-(C＝O)-S-(C＝O)-NH]n-CP；其中，n为1-20；L表示连接臂；S表示延伸臂，为不含或者含有杂原子的2-40碳原子数的链式结构；CP表示载体蛋白；U1，U2和U3如下所示：
Figure FDA0002391070480000012
7.根据权利要求6所述的糖蛋白缀合物，其特征在于，所述糖蛋白缀合物是利用将权利要求1中所述的三糖重复单元寡糖链中的连接臂L与延伸臂S通过酰胺键连接，延伸臂S与载体蛋白之间通过酰胺键连接。
8.一种用于制备金黄色葡萄球菌疫苗的寡糖芯片，其特征在于，所述寡糖芯片的结构式为：[U1-U2-U3-O-L-NH-(C＝O)-S-(C＝O)-NH]n-芯片；其中，n为1-20；L表示连接臂；S表示延伸臂，为不含或者含有杂原子的2-40碳原子数的链式结构；U1，U2和U3如下所示：
Figure FDA0002391070480000021
9.根据权利要求8所述的寡糖芯片，其特征在于，所述寡糖芯片是利用将权利要求1中所述的三糖重复单元寡糖链中的连接臂L与延伸臂S通过酰胺键连接，延伸臂S与芯片之间通过酰胺键连接。
10.权利要求6-7所述的糖蛋白缀合物和权利要求8-9所述的寡糖芯片在开发和制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。
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