CN106084037B - 一种炭疽杆菌荚膜表面三糖缀合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种炭疽杆菌荚膜表面三糖缀合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种炭疽杆菌荚膜表面三糖缀合物及其制备方法和应用，所述三糖蛋白缀合物结构通式如式I所示：其中，所述R为载体蛋白KLH或BSA。本发明以氨基葡萄糖盐酸盐和D‑半乳糖为原料，合成了如上式所示的三聚寡糖，并将其与载体蛋白偶联得到糖蛋白缀合物。将制备的化合物作为抗炭疽疫苗免疫小鼠，结果表明本发明的化合物能诱导机体产生较强的免疫应答，因此本发明具有较强的应用价值。

Description

一种炭疽杆菌荚膜表面三糖缀合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及糖蛋白缀合物，具体地说，是一种炭疽杆菌荚膜表面三糖缀合物及其制备方法和应用。
背景技术
多数致病病原体的外壳通常包裹一层具有弱免疫原性的多糖，使其能够逃避过宿主的免疫监控；由于其结构的高度保守性及免疫应答的可靠性，基于此类细菌荚膜多糖结构的疫苗已经在感染性疾病控制方面取得了突破性的进展，已有针对新生儿、幼儿肺炎和脑膜炎的疫苗上市，针对疟疾、肿瘤和多种真菌、细菌感染的疫苗处于不同的研究阶段，显示出了良好的研究前景。
炭疽杆菌为致病菌中最大的革兰氏阳性杆菌，属于需氧芽孢杆菌属，其繁殖体易被杀灭。但是炭疽杆菌的芽孢可在动物、尸体及其污染环境和泥土中存活多年。炭疽杆菌一旦进入人体，便会迅速产生外毒素，引起组织水肿、出血和坏死，使人丧失劳动力，直至死亡。
现有炭疽疫苗存在许多弊端，主要问题在于：(一)组成成分复杂而不确定；(二)免疫反应所对应的抗原不够明确，针对性较差；(三)疫苗的支链难以控制，效果不稳定；(四)免疫效果不理想。
糖类合成的难点在于有更多的功能基团需要保护与去保护，且为了区分这些相似的官能团，保护和去保护的方法必须具有很好的选择性和专一性；更重要的是，糖苷键的形成还应具有较好的立体选择性，并且在后续合成中要保持其构型不变，这些因素都是限制多糖合成的主要原因。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物。
本发明的再一的目的是，提供如上所述的炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物的制备方法。
本发明的另一的目的是，提供如上所述三糖蛋白缀合物的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物，所述三糖蛋白缀合物结构通式如式I所示：
Figure BDA0001013512940000021
其中，所述R为载体蛋白KLH或BSA。
所述三糖蛋白缀合物由三聚寡糖与载体蛋白偶联制得。
所述组成寡糖的单糖单元为氨基葡萄糖和D-半乳糖。
所述以戊二烯基作为三糖和载体蛋白的连接基团。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物的制备方法
包括如下步骤：
(1)化合物2与化合物3在NIS/AgOTf作用下发生反应制备化合物5；
(2)化合物5的4,6-位脱去苄叉基制备化合物6；
(3)化合物6与化合物4在NIS/TMSOTf作用下发生糖基化反应制备化合物7；
(4)化合物7脱除保护基分别制备得到化合物8和化合物1；
(5)化合物1在戊二醛和甘氨酸条件下活化偶联载体蛋白KLH或BSA，得目标糖蛋白缀合物；
所述化合物1-8结构及合成路线如下：
Figure BDA0001013512940000031
优选地，所述的制备方法，包括如下步骤：
(1)化合物2与化合物3在无水DCM、NIS/AgOTf的条件下于-30℃反应制备化合物5；所述NIS/AgOTf摩尔比为15:1；
(2)化合物5与对甲苯磺酸和乙硫醇在无水二氯甲烷条件下反应制备化合物6；所述化合物5、对甲苯磺酸、乙硫醇的摩尔比为1:0.2:9；
(3)化合物6与化合物4在无水DCM、NIS/TMSOTf的条件下于-70℃反应制备化合物7；所述NIS/TMSOTf摩尔比为15:1；
(4)化合物7与乙二胺溶于正丁醇，在90℃加热回流4小时；产物溶于无水吡啶，与醋酸酐及DMAP反应得到化合物8；
(5)化合物8在二氯甲烷、甲醇、氯化钯、氢气的条件下反应得到化合物1；所述二氯甲烷与甲醇的摩尔比为1:4；
(6)化合物1溶解在蒸馏水中，BSA或KLH溶解在PBS缓冲液中，将二者融合，先加入戊二醛搅拌反应2小时后，再加入甘氨酸，反应得到目标糖蛋白缀合物。
优选地，所述制备方法如下：
(1)以氨基葡萄糖盐酸盐和D-半乳糖为原料，在反应助剂的作用下制备氨基葡萄糖受体，氨基葡萄糖硫苷供体和2,3,4,6-O-四苄基半乳糖硫苷供体；
(2)上述制备的半乳糖供体和单糖受体在催化剂(NIS/AgOTf)作用下发生糖基化反应制备二糖，在二糖的4,6-位脱去苄叉基制备二糖受体；二糖受体和氨基葡萄糖硫苷供体催化剂(NIS/TMSOTf)作用下发生糖基化反应制备三糖；将三糖脱去所有保护基得化合物1；
(3)化合物1在戊二醛和甘氨酸条件下活化偶联载体蛋白，即得相应糖蛋白缀合物。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述三糖蛋白缀合物在制备预防和/或治疗抗炭疽感染的药物中的应用。
如上任一所述三糖蛋白缀合物在制备抗炭疽感染的疫苗中的应用。
一种药物组合物，它还包含权利要求1-4任一所述三糖蛋白缀合物和药学上可接受的辅料或佐剂。
本发明提供了氨乙基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(α1→6)-(β-D-吡喃半乳糖基)-(α1→3)-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖的制备方法，包括：
(1)以氨基葡萄糖盐酸盐和D-半乳糖为原料，按照文献方法制备氨基葡萄糖受体，氨基葡萄糖硫苷供体和2,3,4,6-O-四苄基半乳糖硫苷供体；
(2)上述制备的半乳糖供体和单糖受体在催化剂(NIS/AgOTf)作用下发生糖基化反应制备二糖，在二糖的4,6-位脱去苄叉基制备二糖受体；二糖受体和氨基葡萄糖硫苷供体催化剂(NIS/TMSOTf)作用下发生糖基化反应制备三糖；将三糖脱去所有保护基即得目标化合物。
本发明还提供了氨乙基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(α1→6)-(β-D-吡喃半乳糖基)-(α1→3)-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖蛋白的制备方法，包括：
(1)将按上述方法制备的氨乙基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(α1→6)-(β-D-吡喃半乳糖基)-(α1→3)-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖在戊二醛和甘氨酸条件下活化偶联载体蛋白，即得相应糖蛋白缀合物。
本发明优点在于：
1、本发明的糖蛋白缀合物作为抗炭疽疫苗免疫小鼠，结果表明本发明的化合物能诱导机体产生较强的免疫应答，因此本发明具有较强的应用价值。
2、本发明的三糖蛋白缀合物合成路线简洁，操作简单，原料成本低，通用性强，糖基化反应立体选择性好，产物收率高。
附图说明
附图1是氨乙基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(α1→6)-(β-D-吡喃半乳糖基)-(α1→3)-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖蛋白缀合物通式。
附图2是二糖、三糖合成路线。反应条件：a)
Figure BDA0001013512940000051
-MS,NIS,AgOTf,-30℃；b)TsOH,EtSH,DCM；c)
Figure BDA0001013512940000052
-MS,NIS,TMSOTf,-70℃；d)NH2CH2CH2NH2,n-Butanol,90℃,reflux；thenAc2O,DMAP,pyridine；then MeOH,NaOMe；e)MeOH,PdCl2,H2。
附图3是化合物1-BSA的MALDI-TOF-MS谱图。
附图4是化合物1-KLH免疫小鼠后检测血清中总抗体滴度。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1 三糖缀合物1-BSA和1-KLH的合成
(1)二糖受体6的合成
取化合物(3.29g，5.1mmol)(AcadJSecMilMed Univ,2016,37(2):145-152)和3(2g，3.4mmol)(Eur.J.Org.Chem.2014,4577–4584)溶于无水DCM(40mL)后加入分子筛(2.5g)，在氩气保护下室温搅拌1h。降温至-30℃，迅速加入N-碘代丁二酰亚胺(1.15g，5.1mmol)和三氟甲磺酸银(87.3mg，0.34mmol)继续搅拌1h。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝2:1，Rf＝0.5)监测反应完全。加三乙胺淬灭反应后，过滤除去分子筛，滤渣用DCM洗涤，合并滤液。依次用饱和硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗两遍。有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝6:1)得白色固体5(2.94g，79％)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.72(d,J＝1.9Hz,2H,Ar),7.40(d,J＝4.0Hz,2H,Ar),7.37-7.28(m,18H,Ar),7.18-7.10(m,6H,Ar),7.05-6.98(m,6H,Ar),5.54(d,J＝3.8Hz,1H,Hgala-1),5.34(s,1H,PhCH(O)2),5.28(d,J＝8.5Hz,1H,HgluN-1),5.00(d,J＝12.4Hz,1H),4.9-4.81(m,4H),4.71(d,J＝11.2Hz,1H),4.65(d,J＝11.6Hz,1H),4.50(d,J＝12.4Hz,1H),4.41-4.38(m,2H),4.33-4.31(m,1H),4.25(d,J＝11.2Hz,1H),3.92(s,2H),3.89-3.86(m,2H),3.83-3.73(m,3H),3.70-3.66(m,1H),3.63(s,1H),3.61-3.58(m,1H),3.38-3.36(m,1H),3.30-3.22(m,3H),2.88-2.86(m,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ156.1,138.9,138.6,138.5,137.92,136.9,136.5,134.2,131.3,129.3,128.5,128.4,128.2,128.1,128.1,128.0,128.0,127.4,127.3,127.2,127.1,127.0,126.3,101.7(PhCH(O)2),99.0(Cgala-1),97.3(CgluN-1),78.1,75.4,74.8,74.8,73.3,72.9,72.5,71.7,69.4,69.1,68.7,67.8,66.6,65.9,55.3,40.8.ESI-MS calcd.for C65H64N2O14[M+Na]+m/z,1119.43,found:1119.64。
取化合物5(2.2g，2mmol)，对甲苯磺酸(70mg，0.4mmol)和乙硫醇(1.3mL，18mmol)溶于无水二氯甲烷(50mL)，室温下搅拌反应3h，待TLC(石油醚：乙酸乙酯＝3:2，Rf＝0.3)检测反应结束，加三乙胺淬灭反应。浓缩溶剂，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)得白色产物6(1.84g，91％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.72(d,J＝7.1Hz,1H,Ar),7.61(t,J＝7.8Hz,1H,Ar),7.53-7.42(m,2H,Ar),7.39-7.26(m,18H,Ar),7.24-7.18(m,5H,Ar),7.15(d,J＝7.7Hz,2H,Ar),5.19(s,1H),5.11(d,J＝8.3Hz,1H),5.10-4.97(m,2H),4.85(d,J＝11.7Hz,1H),4.78(d,J＝11.1Hz,1H),4.74-4.65(m,4H),4.38-4.33(m,2H),4.17-4.07(m,3H),3.98-3.90(m,4H),3.80-3.72(m,3H),3.68-3.54(m,3H),3.36-3.20(m,2H),3.10(t,J＝9.1Hz,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ168.5,167.7,156.2,138.6,138.2,138.1,136.91,136.5,134.0,133.9,131.6,128.8,128.6,128.5,128.4,128.3,128.1,128.1,128.0,127.9,127.7,127.6,127.5,127.4,127.3,123.4,102.5,98.9,83.7,79.3,75.9,75.4,74.9,74.6,74.0,73.0,72.4,72.2,70.0,69.2,66.9,66.6,62.9,55.4,41.0.ESI-MScalcd.for C58H60N2O14[M+Na]+m/z,1031.39,found:1031.84。
(2)目标化合物1的合成
取化合物6(505mg，0.5mmol)和4(406mg，0.75mmol,Carbohydrate Research,2008,343:2894–2902)溶于无水DCM(15mL)后加入分子筛(500mg)，在氩气保护下室温搅拌1h。降温至-70℃，迅速加入N-碘代丁二酰亚胺(168mg，0.75mmol)和TMSOTf(0.1mL，0.05mmol)继续搅拌3h。TLC(石油醚：乙酸乙酯＝2:1，Rf＝0.5)检测反应完全。加三乙胺淬灭反应后，过滤除去分子筛，滤渣用DCM洗涤，合并滤液。依次用饱和硫代硫酸钠溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得白色固体7(540mg，76％)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.84-7.77(m,2H,Ar),7.70-7.61(m,3H,Ar),7.58-7.56(m,1H,Ar),7.49-7.41(m,2H,Ar),7.38-7.27(m,16H,Ar),7.25-7.23(m,2H,Ar),7.22-7.18(m,5H,Ar),7.13-7.11(m,2H,Ar),5.81-5.78(m,1H),5.48(d,J＝8.5Hz,1H),5.17(t,J＝9.6Hz,1H),5.06(t,J＝5.6Hz,1H),5.00(d,J＝12.4Hz,1H),4.96-4.90(m,2H),4.79-4.74(m,2H),4.71-4.64(m,3H),4.58(d,J＝3.4Hz,1H),4.38-4.30(m,3H),4.25-4.15(m,3H),4.14-4.07(m,2H),4.00-3.97(m,1H),3.93-3.86(m,3H),3.85-3.79(m,1H),3.72-3.61(m,2H),3.57(t,J＝8.5Hz,1H),3.40-3.32(m,3H),3.10-2.97(m,3H),2.26-2.23(m,1H),2.13(s,3H,Ac),2.03(s,3H,Ac),1.86(s,3H,Ac).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ170.3,169.7,169.0,167.9,167.2,155.7,138.0,137.7,137.6,136.4,136.2,133.9,133.5,133.3,131.1,131.0,130.8,128.2,128.1,127.9,127.7,127.6,127.5,127.4,127.2,127.1,126.9,126.8,123.1,122.9,102.0,97.7,83.1,78.7,75.1,74.8,74.4,73.9,73.4,72.5,71.8,71.3,71.0,70.3,69.4,68.5,68.4,67.8,66.3,66.0,61.5,54.8,54.2,40.4,20.3,20.2,20.0.ESI-MS calcd.for C78H79N3O23[M+Na]+m/z,1448.50,found:1448.77。
取化合物7(154mg，0.11mmol)和乙二胺(0.15mL，2.2mmol)溶于正丁醇(5mL)，加热回流(90℃)4h。反应完毕，蒸干溶剂，真空干燥，得中间产物；溶于无水吡啶(3mL)并加入醋酸酐(0.5mL)和催化量DMAP室温下搅拌过夜。反应结束，加甲醇淬灭反应，蒸干溶剂，加DCM(50mL)萃取，依次使用1M HCl溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥,。硅胶柱层析纯化得白色产物8(100mg，73％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.41-7.35(m 8H),7.33-7.27(m,13H),7.24-7.22(m,4H),5.31-5.25(m,1H),5.21(d,J＝7.8Hz,1H),5.14-5.08(m,3H),5.04(t,J＝9.6Hz,1H),4.94-4.89(m,2H),4.82(d,J＝12.0Hz,1H),4.77(d,J＝3.3Hz,1H),4.69-4.62(m,3H),4.56(d,J＝11.7Hz,1H),4.41(s,2H),4.31-4.28(m,2H),4.23-4.20(m,1H),4.10-3.91(m,5H),3.78-3.76(m,1H),3.67(d,J＝1.9Hz,1H),3.64-3.60(m,3H),3.53-3.51(m,1H),3.32-3.29(m,3H),3.10-3.08(m,1H),2.79-2.76(m,1H),2.06(s,3H,Ac),2.03(s,3H,Ac),2.01(s,3H,Ac),1.83-1.67(m,6H,Ac).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ171.5,170.3,170.2,170.1,168.8,156.0,138.1,137.7,137.6,136.4,136.1,128.1,128.1,128.0,128.0,128.0,127.9,127.6,127.6,127.5,127.47,127.41,127.21,127.10,101.08,98.98,98.59,79.23,77.99,75.03,74.0,73.34,73.0,72.7,71.8,71.4,70.5,70.1,69.0,68.4,68.0,67.6,66.2,61.5,58.7,53.5,40.6,22.6,22.4,20.2,20.1。
取化合物8(30mg,0.024mmol)溶于二氯甲烷和甲醇(DCM:MeOH＝1:4,5mL),加入催化量氯化钯，通入氢气震荡反应3h。待反应结束，滤去氯化钯残渣，浓缩滤液，得中间产物。置于含催化量甲醇钠的无水甲醇中搅拌反应20min，加入酸性树脂调节溶液pH＝6～7，除去树脂，浓缩滤液，再由P2凝胶柱纯化得白色终产物1(10mg，67％)。1H NMR(600MHz,CD3OD/D2O)δ5.35(d,J＝3.2Hz,2H,H-1,HgluN-1),4.59-4.58(m,3H,Hgala-1,NH2),4.27(dd,J＝28.5,13.4Hz,1H),4.10-4.03(m,2H),3.96-3.81(m,10H),3.76-3.71(m,8H),3.66(d,J＝9.2Hz,1H),3.29-3.13(m,3H),2.06,2.02(s,6H,Ac).13C NMR(150MHz,CD3OD/D2O)δ173.6,100.5,99.2,80.0,75.2,70.6,70.2,69.1,68.7,68.3,65.0,60.2,60.0,53.4,39.0,21.7。
(3)三糖缀合物1-BSA和1-KLH的合成
取三糖化合物1(2mg)和10mg BSA或KLH分别溶解在0.5ml蒸馏水和0.5ml PBS缓冲液中，然后将二者融合。向混合液中加1mL 0.2％戊二醛(过量)后，旋转搅拌反应2小时。向反应液中加0.5mL 1M甘氨酸，继续旋转搅拌反应1小时。待反应结束，取反应液对蒸馏水透析过夜，冻干得1-BSA或1-KLH白色粉末。
实施例2 本发明的化合物免疫活性测试
一、试验材料及来源
供试化合物：本发明实施例1中所制备得到的糖蛋白化合物1-KLH。
二、试验方法
(一)小鼠免疫方案
1)选用6-8周雌性Balb/c小鼠(购于中国科学院上海实验动物中心)，每组5只小鼠；
2)将糖蛋白化合物1-KLH添加相应佐剂(溶于PBS)混悬液皮下注射小鼠，每次免疫的糖蛋白含有2μg的糖，每隔3周再用同样方法加强免疫，共免疫3次。分别于免疫前和第三次免疫后一周，分离血清并置于-80℃冰箱冻存待测。
(二)小鼠免疫前后血清中抗体滴度测定
1、包被抗原(ELISA包被缓冲液，5μg/mL)100μl/well，4℃包被过夜；
2、Blacking:洗板，gelatin，200μL/well，37℃孵育2小时；
3、Ab1:洗板，以不同稀释倍数加入抗体血清，100μL/well，37℃孵育2小时；
4、Ab2:洗板，羊抗小鼠-HRP，100μL/well，37℃孵育1小时；
5、加底物显色:反应7min，加2M H2SO4中止；
6、ELISA仪测450OD值。
检测设置空白对照(本底)，即在Ab1反应时以稀释液代替样品。
三、试验结果
本发明制备的KLH-糖蛋白缀合物1-KLH皮下免疫小鼠，均能诱导机体产生较强的免疫应答，实验结果见附图4。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物，其特征在于，所述三糖蛋白缀合物结构通式如式I所示：
Figure FDA0002124450070000011
其中，所述R为载体蛋白KLH或BSA。
2.根据权利要求1所述炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物，其特征在于，所述三糖蛋白缀合物由三聚寡糖与载体蛋白偶联制得。
3.根据权利要求2所述炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物，其特征在于，所述组成寡糖的单糖单元为氨基葡萄糖和D-半乳糖。
4.根据权利要求2所述炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物，其特征在于，以戊二烯基作为三糖和载体蛋白的连接基团。
5.权利要求1-4任一所述炭疽杆菌荚膜表面三糖蛋白缀合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)化合物2与化合物3在无水DCM、NIS/AgOTf的条件下于-30℃反应制备化合物5；所述NIS/AgOTf摩尔比为15:1；
(2)化合物5与对甲苯磺酸和乙硫醇在无水二氯甲烷条件下反应制备化合物6；所述化合物5、对甲苯磺酸、乙硫醇的摩尔比为1:0.2:9；
(3)化合物6与化合物4在无水DCM、NIS/TMSOTf的条件下于-70℃反应制备化合物7；所述NIS/TMSOTf摩尔比为15:1；
(4)化合物7与乙二胺溶于正丁醇，在90℃加热回流4小时；产物溶于无水吡啶，与醋酸酐及DMAP反应得到化合物8；
(5)化合物8在二氯甲烷、甲醇、氯化钯、氢气的条件下反应得到化合物1；所述二氯甲烷与甲醇的摩尔比为1:4；
(6)化合物1溶解在蒸馏水中，BSA或KLH溶解在PBS缓冲液中，将二者融合，先加入戊二醛搅拌反应2小时后，再加入甘氨酸，反应得到目标糖蛋白缀合物；
所述化合物1-8结构及合成路线如下：
Figure FDA0002124450070000021
6.权利要求1-4任一所述三糖蛋白缀合物在制备预防和/或治疗抗炭疽感染的药物中的应用。
7.权利要求1-4任一所述三糖蛋白缀合物在制备抗炭疽感染的疫苗中的应用。
8.一种药物组合物，其特征在于，它包含权利要求1-4任一所述三糖蛋白缀合物和药学上可接受的辅料或佐剂。
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