CN111819184A - 合成寡糖衍生物作为抗博德特百日咳杆菌疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基于百日咳博德特氏菌脂寡糖末端五糖的合成寡糖片段，一种获得合成寡糖片段及其偶联物的方法。还提供含有此类糖缀合物的疫苗组合物，所述寡糖缀合物引发减少百日咳杆菌在鼻咽部定植的免疫应答。
Description
技术领域
本发明提供基于百日咳博德特氏菌脂寡糖末端五糖的合成寡糖片段，一种获得合成寡糖片段及其偶联物的方法。这些寡糖缀合物具有免疫原性，对百日咳博德特氏杆菌在鼻咽的定植起免疫保护作用，可作为百日咳预防的药物成分。
本发明讲述了合成寡糖片段与适宜载体偶联组成的具有免疫原性的糖-蛋白偶联物，制备寡糖片段及其偶联物的方法，药物组合物，及其含有这种糖偶联物的疫苗组合物。这种糖-蛋白偶联物能特别有效地诱导产生抗百日咳脂寡糖抗体，这些抗体可特别有效地减少百日咳博德特氏菌在鼻腔的定植。这种新诱导产生的免疫作用在使用无细胞百日咳疫苗免疫后完全缺失，在用全细胞百日咳疫苗免疫接种后仅低水平存在。因此，本发明是对预防百日咳一个重要贡献。
本发明属于抗菌糖缀合物疫苗领域。
背景技术
百日咳是一种由博德特氏杆菌引起的一种急性呼吸道高度传染性疾病，婴幼儿为主要传染对象。自1950年代以来，针对这种疾病的疫苗一直在使用，全球疫苗接种覆盖率已经达到85％以上。全细胞百日咳疫苗的高免疫反应，以及对作为主要保护性抗原的百日咳毒力因子分子作用机制深入理解，促成了无细胞百日咳疫苗的诞生1。然而，这种疾病在任何国家都没有得到控制，甚至在工业化国家也出现了惊人的逆转，在工业化国家第一代全细胞疫苗已经被更新的、副反应小的无细胞百日咳疫苗所取代。这种疫苗可预防疾病出现逆转的诸多原因中包括疫苗的免疫诱导能力逐渐减弱、百日咳杆菌菌株的遗传突变以及一直存在的感染后带菌人群的无症状传播。虽然对发展中国家百日咳疫苗接种后的保护期知之甚少,几项研究表明工业化国家的免疫保护在接种4到12年后开始消退2。百日咳疾病报告在较大的儿童、青少年和成年人中越来越多。在美国的一项血清学研究表明，21％(95％置信区间[13-32％])的长时间咳嗽(持续>2周)成年人患有百日咳3。
青少年和成人是把百日咳博德特氏菌传播到未接种疫苗婴幼儿的主要传播源。在加拿大、法国、德国和美国进行的一项研究表明，婴儿百日咳病例中76-83％的感染4，源自其家庭成员(主要是父母)的传染。非人灵长类动物的研究表明，无论是全细胞还是无细胞疫苗都不能阻止百日咳杆菌的传播。发病率数据模型研究表明无症状传播是疫苗接种人群百日咳复发的主要原因5。
对于荚膜多糖病原体，如b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟菌，鼻咽部传染也是感染的先决条件和传播源。以多糖-蛋白为基础的结合疫苗能在局部粘膜诱导高度免疫反应，在降低传染过程中起着至关重要的作用6。对于非荚膜细菌而言，由于脂多糖(LPS)中的糖大部分在外膜上暴露出来，这些糖类化合物及针对这些糖类化合物免疫应答可发挥类似的作用7。就百日咳博德特氏杆菌而言,针对其非荚膜细菌核心寡糖的免疫球蛋白G抗体显示出对人体的保护作用，同时可以引发补体依赖的细菌杀灭8,9,10。在百日咳博德特氏杆菌中，脂多糖也称为脂寡糖，具有非常短的寡糖链。寡糖是具有独特结构的支链化十二糖(图1)，但脂寡糖本身免疫原性低。脂寡糖可以在酸性条件下水解并分离纯化，进而与载体蛋白结合以提供更好的脂寡糖免疫原性11。这种缀合物能诱导小鼠的杀菌抗体。通过拆解百日咳博德特氏杆菌寡多糖,进一步改进脂寡糖结构的杀菌活性，得到了末端五聚糖12。它们的蛋白缀合物可重现上述十二糖蛋白缀合物的杀菌活性。
天然的脂寡糖存在两种不同的寡糖结构形式，经电泳分离后被称为带-A(完整十二糖结构)和带-B(缺少末端三糖的九糖结构)13，也被间接用于增进对杀菌抗体特异性的理解。例如，七种针对百日咳全细胞单克隆抗体是脂寡糖特异的。其中五种还表现出强抗脂寡糖杀菌活性。这些单克隆抗体对各种百日咳细胞都显示强的识别和杀菌性能,但仅有含带-B脂寡糖结构的博德特氏百日咳菌株134除外。
另一个间接的重要证明，同样的单克隆抗体对带有相同重复三糖单元荚膜多糖的博德特氏支气管败血杆菌有交叉反应。为了获得适合疫苗开发的抗原，通过裂解脂寡糖深化理解抗原表位的进一步尝试探索，未取得清晰一致的结果14。
尽管之前报道都有重要价值，但是迄今为止还没有得到证据表明参与抗百日咳脂寡糖抗菌活性的精确抗原表位，因此，通过合成手段寻找精准抗原就成为开发制备糖缀合物疫苗的一种潜在可能。
另外，先前描述的两种类型百日咳博德特菌寡糖-蛋白质缀合物，虽然显示出良好的基本杀菌活性，但产品开发难度高，制备工艺复杂，首先需要进行细菌培养、对寡糖进行分离和纯化、以及进一步与蛋白质进行结合。因此，到目前为止该产品还没有实现实际的应用。
为了开发一种适合的合成抗原及其糖缀合物，需要对参与关键杀菌作用的抗原表位分子进行准确定义，只有这样，更简单的合成寡糖-糖缀合物才有实用性。
能被保护性抗体识别的包含抗原表位的寡糖片段，只能用周密设计的合成分子片段来界定。一旦确定了抗原表位，这种片段就可更容易、更精确地合成出来，同时与载体蛋白进行结合。
发明内容
本发明提供了存在于百日咳杆菌末端五糖(图2)的所有寡糖片段。同时还提供糖偶合物并证明了一些寡糖在抗百日咳杆菌免疫反应特异性方面的作用。此外，确证了它们在细菌定殖过程中的作用。
虽然市售的百日咳疫苗疗效有限，但在几十年内可被视为阻止百日咳流行暴发起到重要的贡献。15然而，本发明中所述糖缀合物的使用将有助提供预防百日咳的现有疫苗中不存在的特性：直接影响百日咳博德特杆菌的鼻腔定植，从而减少其从受感染的人到最易感人群的传播。
本发明中所述的糖缀合物也可作为新型抗百日咳疫苗的一部分，主要用于阻止感染甚至是疾病治疗。
本发明提供了一种合成的百日咳杆菌寡糖缀合物疫苗，该疫苗诱导的免疫应答具有杀菌作用，可干扰细菌的定殖，因此可在无症状细菌携带和主动传播中起到重要的作用。
研究表明寻找提高杀菌免疫应答的方式，可以增强现有全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗的疗效10。百日咳的杀菌免疫应答可在多克隆血清中检测到，并与其抗脂多糖的免疫应答相关9。此外，还发现了几种抗脂寡糖的单克隆抗体具有抗菌活性16,17,18。
本发明的一个实施方案中，提供了与百日咳脂寡糖相对应抗原结构的化学组成和合成方法，百日咳脂寡糖是外膜的重要组分。众所周知，百日咳杆菌的临床分离株在接种的压力下进化，但脂寡糖的结构保持不变19。
本发明提供了如表1所示的合成抗原结构AB、ABC和ABCDE，其含有由百日咳杆菌引起的脂寡糖特异性抗体所识别的表位。
在另一个实施方案中，本发明提供了表1中所示的寡糖AB、ABC和ABCDE，带有末端为马来酰亚胺官能团的连接臂衍生物，如图3所示。
应该认识到，本发明旨在针对用不同的连接臂和/或间隔臂在分子AB、ABC和ABCDE上进行修饰，从而获得上述马来酰亚胺产品(AB-6β、ABC-6β和ABCDE-5)，提供了充分的指导作用。
另一方面，本发明还提供了至少一种上述寡糖的寡糖蛋白缀合物，作为引起抗百日咳免疫应答的疫苗组成部分。
应该认识到，本发明旨在提供足够的指导，用不同蛋白质和/或其他分子的修饰优化这些偶合产品，旨在增加或调节抗糖免疫应答。
在另一个实施方案中，本发明提供的糖缀合物可作为现有联合疫苗的补充成分，例如百白破、五联或六联婴儿疫苗。
末端五糖包含的所有化合物片段的合成
末端五糖化合物由一系列非常见的单糖组成，如图2所示。这些单糖组分分别表示为A:GlcNAc(N-乙酰基-D-氨基葡萄糖)，B:Man2NAc3NAcA(2-乙酰氨基-3-乙酰氨基-2,3-二脱氧-D-甘露糖醛酸)，C:Fuc2NAc4NMe(2-乙酰氨基-4-N-甲基-2,4,6-三脱氧-L-半乳糖)，D:Hep(L-甘油-D-甘露庚糖)，E:GlcN(D-氨基葡萄糖)。因此，如末端二糖也可以简单表述为AB。
寡糖结构的合成方法
合成的寡糖化合物是指基本上不含其它成分的物质，这些其它成分通常会在分离的寡糖化合物中存在，如内毒素、糖脂类或不相关的寡糖。
所合成的化合物纯度不低于90％，可通过高效液相色谱定量，物质鉴定可通过质谱和/或核磁光谱确定。
合成单糖砌块A、B、C、D和E
单糖砌块B(化合物B-5)制备过程如实施例1图4所示。以葡萄糖甲苷(B-1)为原料，依次将4,6位羟基用苄叉选择性保护，2,3位羟基甲磺酰化，然后经过碱性条件下2位选择性酯解和分子内亲核取代生成2,3位环氧糖苷B-2。在叠氮钠作用下，B-2环氧开环生成2位单叠氮糖，然后3位羟基三氟甲磺酰化和叠氮钠的亲核取代得到2,3位双叠氮产物B-3。双叠氮糖B-3在乙酸酐和硫酸的作用下转化为全乙酰基保护形式，继而在三氟化硼/乙醚作用下与对甲苯硫酚反应生成相应的糖对甲苯硫苷，甲醇钠脱去4,6位乙酰基后得到相应的化合物B-4。最后TEMPO氧化6位羟基生成糖醛酸，并在碳酸钾/溴化苄的条件下引入苄酯得到目标化合物B-5。选择性保护的化合物B-5是在所有寡糖中引入B糖单元的基础。
单糖砌块C(化合物C-7)制备过程如实施例2图5所示。L-鼠李糖(C-1)依次经过经全乙酰化和三氟化硼/乙醚催化下的糖基化反应得到全乙酰的L-鼠李糖对甲苯硫苷(C-2)。脱乙酰基，樟脑磺酸催化下与二甲氧基丙烷反应生成化合物C-3。戴斯-马丁氧化处理后与盐酸羟胺反应转化成4位羟肟基的化合物C-4。如实施例所示，肟糖与硼氢化钠/三氧化钼反应并经过氢氧化钠处理转化为氨基糖。脱去丙叉保护基得到的双羟基糖与三光气反应选择性地引入碳酸酯基得到相应的碳酰胺化合物C-5。2位羟基用叔丁基二甲基甲硅烷基保护，碘甲烷/氢化钠条件下4位N进行完成甲基化，酸性条件下脱去2位保护基从而得到化合物C-6。2位羟基通过与三苯基膦、叠氮磷酸二苯酯和偶氮二甲酸二异丙酯反应得到2位构型翻转叠氮糖苷，碱性条件脱除3,4位的碳酰基，并用苄氧羰基保护仲氨基得选择性保护的C单糖单元化合物C-7。
单糖砌块D(化合物D-5)制备过程如实施例3图6所示。全乙酰化的2-叠氮葡萄糖低温下在氨气的四氢呋喃和甲醇饱和溶液中选择性地脱除首位乙酰基，然后在碳酸铯条件下与三氯乙腈反应生成三氯亚胺酯糖基供体D-2。三氟甲磺酸三甲基硅酯催化三氯亚胺酯供体与连接臂受体生成相应的糖苷，脱去乙酰基保护后得化合物D-3。叔丁基二甲基甲硅烷基选择性保护D-3伯位的羟基，其余位置在四氢呋喃的溶液中被氢化钠/溴化苄全苄基化得到化合物D-4。重新释放伯位羟基后，还原D-4上的叠氮基同时以叔丁氧羰基保护得到选择性保护的，用于与ABC三糖连接的D单糖单元化合物D-5。
另一种选择性保护的D单糖砌块(D-7)旨在D糖的4，6位羟基分别连接E单糖单元和ABC三糖单元。制备过程如实施例4图7所示，化合物D-3在樟脑磺酸催化下与苯甲醛二甲基缩醛反应，然后在氢化钠存在下与苄基溴进行苄基化反应得到化合物D-6。乙酸水溶液的水解脱去苄叉保护基，氯代叔丁基二甲基甲硅烷在咪唑存在下选择性地保护伯位羟基得到叔丁基二甲基硅基保护的化合物D-7。选择性保护的D单糖砌块D-7可以分别在4位和/或6位的进行糖链的延长。
单糖砌块E(化合物E-6)制备过程如实施例5图8所示。关键中间体E5包括LD-甘露庚糖(对应该脂多糖中的构型)以及6-羟基的异构体DD-甘露庚糖两种构型。D-甘露糖全乙酰化保护后经溴化氢/醋酸溶液处理转化为乙酰基保护的甘露糖溴苷。甘露糖溴苷经过四丁基溴化铵和碱N,N-二异丙基乙胺的反应转化为1，2原乙酸酯保护的甘露糖E-1。化合物E-1脱乙酰基后叔丁基二甲基硅基选择性地保护6位羟基得到化合物E-2，待其余位置羟基被苄基保护后脱除硅基得到化合物E-3。6-位选择性裸露的羟基经TEMPO氧化生成醛，经wittig烯烃化反应在6-位引入亚甲基得到化合物E-4。四氧化锇氧化烯烃双羟基化并进一步苄基保护得到一对非对映异构体组成的关键化合物E-5。酸性条件下原酸酯开环后，在此步进行了非对映异构体的分离，进一步在碱性条件下两种异构体分别与三氯乙腈反应得到相应的化合物E-6DD和化合物E-6LD。
合成带有连接臂的非还原端二糖AB(AB-6β,乙酰氨基葡萄糖基-α-(1-4)-2，3-二乙酰氨基甘露糖醛酸-β-连接臂)
AB二糖(化合物AB-6β)的制备过程如实施例6图9所示。选择性保护的A-10与B-5β经过二苯基亚砜、三叔丁基嘧啶和三氟甲磺酸酐的处理生成二糖。随后N-溴代丁二酰亚胺脱除端基的对甲苯硫基，以90％的优异产率得到化合物AB-2。在二苯基亚砜、三叔丁基嘧啶的存在下，连接臂前体经三氟甲磺酸酐引入二糖，生成相应的α/β两种构型经纯化后以58％产率的得到AB-3的β异构体。用锌粉硫酸铜把叠氮还原为氨基，并在醋酸酐作用下直接转化成乙酰氨基得到化合物AB-4β。与糖环上的苄基一起，把连接臂上的苄氧羰基催化氢化脱去并进一步引入马来酰亚胺基团得到化合物AB-6β。
如实施例7所述，AB-3的α异构体AB-3α作为副产物被分离出，并进一步按照上述相同的反应顺序进行转化，得到相应的化合物AB-6α。
合成带有连接臂的非还原端三糖ABC(ABC-6β，乙酰氨基葡萄糖-α-(1-4)-2，3-二乙酰氨基甘露糖醛酸-β-(1-3)-2-乙酰氨基-4-甲基氨基岩藻糖-β-连接臂)
ABC三糖(化合物ABC-6)的制备过程如实施例8图10所示。-30℃下选择性保护的二糖AB-2与糖基受体C-7在二苯基亚砜和三叔丁基嘧啶的存在下与三氟甲磺酸酐反应得到三糖ABC-1。间氯过氧苯甲酸氧化三糖硫苷，然后在-78℃下在三氟甲磺酸酐作用下引入连接臂，得到可分离的α/β异构体混合物。β异构体的四个叠氮基团在醋酸酐存在下用锌粉硫酸铜还原并乙酰化生成乙酰氨基，纯化后得到化合物ABC-4的β异构体。催化氢化脱除苄氧羰基及苄基并在连接臂上引入马来酰亚胺活性基团后得到目标化合物ABC-6β。
如实施例8、12所述，ABC-3的α异构体ABC-3α作为副产物被分离出，并进一步按照上述相同的反应顺序进行转化，得到相应的化合物ABC-6α。
合成带有连接臂的末端二糖DE(LD和DD异构体)(LD和DD-甘露庚糖-α-(1-4)-氨基葡萄糖-α-连接臂)
二糖(化合物DE-6LD)制备过程如实施例9图11所示，以E-6LD和D-7为原料在0℃用三氟甲磺酸三甲基硅酯处理制备得到。脱乙酰基并苄基化得到DE-2LD，然后脱除D-单元的叔丁基二甲基硅基。用氯化镍和硼氢化钠还原DE-3LD上的叠氮基为氨基，然后用叔丁氧羰基保护，得到的化合物DE-4LD可用于五糖ABCDE的合成。在Pd/C加氢条件下除去苄基和苄氧羰基后连接臂上引入马来酰亚胺基，最后脱叔丁氧羰基保护基得到DE-6LD。
二糖物质(化合物DE-6DD)的制备过程如实施例10，图11所表示，从E-6DD片段和D-7出发，按照与异构体DE-6LD相同的制备顺序得到化合物DE-6DD。
合成带有连接臂的ABCDE五糖衍生物(ABCDE-5，乙酰氨基葡萄糖-α-(1-4)-2,3-二乙酰氨基甘露糖醛酸-β-(1-3)-2-乙酰氨基-4-甲基氨基-岩藻糖-β-(1-6)-[LD-甘露庚糖-α-(1-4)]-氨基葡萄糖-α-连接臂)
如实施例11图12所示，-78℃下三糖供体ABC-2在三氟甲磺酸酐和三叔丁基嘧啶作用后与糖基受体DE-4反应，得到五糖衍生物ABCDE-1。ABCDE-1化合物中的四个叠氮基被还原同时乙酰化得到化合物ABCDE-2。Pd/C催化加氢脱除苄氧羰基及苄基保护基后，连接臂末端的氨基与马来酰亚胺基丙酸酯反应，得到化合物ABCDE-4。三氟乙酸脱除叔丁氧羰基保护基，得到带有连接臂的五糖ABCDE-5。
发现抗原决定簇
用全细胞百日咳疫苗给兔子和小鼠进行免疫，分离针对细胞膜中脂寡糖构象的免疫应答抗体，研究其与合成寡糖的牛血清白蛋白(BSA)载体偶合物之间的作用。
AB末端二糖与牛血清白蛋白(BSA)载体的偶合物，无论B片段是α还是β构型，都观察到对抗血清有很强的识别反应。含C片段不同构型的ABC三糖结构及ABCDE完全五糖结构对兔子、小鼠血清也有类似的强烈的免疫反应。A单糖或含有构型无论是DD或LD庚糖E片段的内部二糖DE中均未观察到免疫反应。
用两种最相关的BSA结合物ABβ-BSA和ABCβ-BSA对各个动物血清分别进行了进一步研究，结果表明它们之间存在差异。末端AB二糖对一组小鼠血清识别比ABC三糖更好。另一方面，如图14所示，少数几个小鼠(编号：3，9，11，13，15)的血清对AB二糖和ABC三糖呈现类似的识别。
就此而言，显然由全细胞诱导的抗脂寡糖的抗体识别位于末端五糖的ABC区的抗原表位。
为了进一步证实末端二糖AB和三糖ABC的重要作用，用末端单糖A、二糖AB和三糖ABC的牛血清白蛋白结合物来抑制抗全细胞百日咳的免疫血清。二糖AB和三糖ABC都降低了抗全细胞百日咳兔血清对末端三糖ABC和五糖ABCDE的识别程度。可是，单糖A不影响表位识别(图15)。
适合疫苗的合成片段
合成的AB-二糖，ABC-三糖和ABCDE-五糖与破伤风类毒素结合制备合适的疫苗。小鼠和兔的免疫接种显示出与合成寡糖相匹配的强烈的抗糖免疫应答，如图16所示。
此外，用AB-TT和ABC-TT缀合物在兔子上免疫诱导产生的抗体能够识别末端二糖AB和三糖ABC的牛血清白蛋白缀合物，无论B单元的构型是α或β。类似的强烈反应也在四糖ABCD，完整五糖ABCDE和百日咳全菌细胞上观察到。同样，任何抗血清都不能识别单糖A和内部二糖DE。
本发明的另一个目的是一种包含百日咳杆菌脂寡糖合成片段的糖缀合物，优选末端二糖或三糖通过合适的间隔臂分子与蛋白质载体偶联。
在这种典型的三组分糖缀合物组合物中，A-B-间隔臂-蛋白质载体或A-B-C-间隔臂-蛋白质载体中，阐明这种糖缀合物的每个成分的作用是重要的。
合成糖片段代表着能被抗脂多糖免疫应答识别的抗原表位，在此发明中起到至关重要的作用。其它的组合和/或成分要么是已知的，或就宿主对本发明的低聚寡糖免疫原反应性而言，无须被看作是关键部分。
间隔臂分子在关键的糖化合物和蛋白载体之间起连接作用。合适的间隔臂分子对业内人士是已知的并且可购买的，或者是可以根据化合物中的官能团按需求进行设计，并通过已知的方法制备。
合适的间隔臂包括，在其一端能够与载体的活性官能团(例如氨基、巯基或羧基)形成稳定的共价结合，另一端则含有能够与本发明中低聚糖的羟基形成稳定共价结合的基团。在这两个官能团之间，有一个长度在2至10个原子之间的生物相容性桥连分子，以适应其特定的辅助功能，例如低聚亚烷基二醇，亚烷基，杂亚烷基。
蛋白载体对其他非免疫原性寡糖具有诱导免疫反应的作用。适宜的蛋白质载体也是技术人员所共知的，并且在市场上可以买到的，或是已经用于现有的疫苗产品中的。包括但不限于细菌类毒素、毒素、外毒素及其去毒衍生物，例如破伤风类毒素、百日咳类毒素、白喉类毒素、破伤风毒素片段C、CRM 197、霍乱类毒素或其他。这里特殊糖缀合物的首选载体是破伤风类毒素或百日咳类毒素。
将寡糖连接到载体(例如载体蛋白)的方法是常规的，技术人员可以根据本发明内容使用常规方法制备偶合物。
在实施例方案中，本发明的碳水化合物抗原与破伤风类毒素(由芬莱疫苗研究所生产)偶合。这些糖缀合物具有易合成、易纯化和易表征的优点，并且具有很强的免疫原性。破伤风类毒素(TT)的活化如文献所述，通过赖氨酸侧链与N-羟基琥珀酰亚胺二硫代丙酸酯反应，然后再用二硫代苏糖醇还原来实现巯基化20。巯基化破伤风类毒素在偶合之前拥有15-30个巯基官能团。偶联需要在避免巯基氧化(氮气环境，EDTA)的条件下，在磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液中进行。抗原-破伤风类毒素(TT)偶联物可通过末端是马来酰亚胺基的抗原与巯基活化的破伤风类毒素(TT)反应来合成。
破伤风类毒素(TT)-缀合物可以通过分子体积排阻色谱来除去未反应的碳水化合物。MBTH(专门针对GlNAc残基)和Bradford分析可分别用于确定碳水化合物蛋白质比率和蛋白质含量。在优选实施方案中，每个缀合物的最小碳水化合物含量约为10％(按重量计)。通常，在一个糖缀合物中，每个蛋白质载体可包括大约4-15个抗原。
减少百日咳细菌定植和传播的糖偶合疫苗
本发明的另一方面是药物组合物，其包含根据本发明的糖缀合物和药学上可接受的载体。
本发明的另一个目的是疫苗组合物，其包含根据本发明的糖缀合物，药学上可接受的载体和任选的佐剂。
包含本发明糖缀合物的疫苗组合物可用于引发免疫应答，该免疫应答可减少百日咳博德特菌在疫苗接种人群的鼻咽腔中定植。
本发明的另一方面是，把现有的全细胞百日咳疫苗辅以根据本发明的糖缀合物，其特征在于减少百日咳博德特菌在疫苗接种人群鼻咽腔中的定植。
本发明的另一方面是一种组合疫苗，把根据本发明的糖缀合物作为一种现有全细胞百日咳疫苗的补充，用于减少百日咳博德特菌在疫苗接种人群鼻咽腔中的定植。
本发明的另一方面是一种组合疫苗，把根据本发明的糖缀合物作为一种现有全细胞百日咳疫苗的补充，用于预防和治疗百日咳博德特氏菌引起的疾病。
本发明的另一方面是用现有的无细胞百日咳疫苗，辅以根据本发明的糖缀合物，其特征在于减少百日咳博德特菌在疫苗接种人群鼻咽腔中的定植。
本发明的另一方面是一种组合疫苗，其含有一种现有的无细胞百日咳疫苗，以及根据本发明中的糖缀合物，其特征在于减少百日咳博德特菌在疫苗接种者鼻咽腔中的定植。
附图说明
图1.百日咳博德特菌十二糖(脂寡糖)
图2.百日咳博德特菌脂寡糖的末端五糖
表1.百日咳脂寡糖AB、ABC和ABCDE寡糖片段的合成结构
图3.带链接臂的寡糖衍生物AB-6β、ABC-6β和ABCDE-5
图4.单糖砌块B(B-5)的合成
图5.单糖砌块C(C-7)的合成
图6.单糖砌块D(D-5)的合成
图7.单糖砌块D(D-7)的合成
图8.单糖砌块E(E-6DD和E-6LD)的合成
图9.合成AB二糖衍生物AB-6β和AB-6α
图10.合成ABC三糖衍生物ABC-6β
图11.合成二糖化合物DE-6LD和DE-6DD
图12.合成五糖化合物ABCDE-5
图13.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测合成寡糖－牛血清白蛋白缀合物对百日咳杆菌免疫血清的特异性识别。(A):小鼠血清混合物,(B):兔子血清混合物
图14.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测合成寡糖－牛血清白蛋白缀合物和百日咳博德特菌脂寡糖对16只小鼠百日咳杆菌免疫血清的的特异性识别
图15.双糖AB和三糖ABC对全细胞百日咳杆菌免疫兔血清的抑制实验。A：涂有ABCβ-牛血清白蛋白偶联物检测板，B:涂有ABCDE-牛血清白蛋白偶联物检测板。
图16.抗AB-破伤风类毒素(TT)(1)和抗ABC-破伤风类毒素TT)(2)的兔免疫血清的斑点印迹试验。wP：百日咳杆菌的全细胞。
图17.ABβ-破伤风类毒素(TT)和ABCβ-破伤风类毒素(TT)结合物的免疫原性。A)BALB/c小鼠体内免疫原性；B)新西兰兔体内免疫原性；C)兔血清稀释1/100和1/400对百日咳全细胞的应答反应。
图18.全细胞百日咳免疫增强前后，经ABβ-TT和ABCβ-TT缀合物免疫的小鼠体内的抗寡糖免疫球蛋白G(IgG)免疫响应(如箭头所示)。
图19.抗缀合物血清对鼻腔定植的抑制作用，横线表示检测的下限。
实施例
实施例1合成单糖砌块B片段:
对甲苯基2,3-二叠氮-2,3-二脱氧-1-硫代-β-D-甘露糖苷酸苄酯(B-5)
α-D-吡喃葡萄糖甲苷(B-1,110g,567mmol)、苯甲醛二甲缩醛(103g，680mmol)和对甲苯磺酸(9.75g，56.7mmol)溶于700ml的N,N-二甲基甲酰胺中，加热至60℃搅拌过夜。三乙胺淬灭反应体系，减压蒸出N,N-二甲基甲酰胺，剩余的部分用乙酸乙酯稀释后用水和盐水洗涤。除去溶剂后的粗品进行重结晶，得到白色固体4,6-O-苯亚甲基-α-D-吡喃葡萄糖甲苷(148g)。上述固体(148g，525mmol)溶解在吡啶中，在0℃下加入甲磺酰氯(126g,1.10mol)，反应在室温下搅拌过夜。减压条件下去除溶剂，加入乙酸乙酯和水分液萃取，有机相用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，并真空条件下浓缩，得4,6-O-苯亚甲基-1,3-二-O-甲磺酰基-α-D-吡喃葡萄糖甲苷(220g)白色固体粗品。上述粗品(502mmol)溶于四氢呋喃/甲醇溶液(500mL,2:3)中，然后加入氢氧化钾(84g,1.51mol)回流过夜，反应完毕后加入乙酸乙酯和水，分离有机相并用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，真空条件下浓缩，再用乙酸乙酯/石油醚进行重结晶，得白色固体甲基2,3-环氧-4,6-O-苯亚甲基-α-D-吡喃阿洛糖苷(B-2)(71g,47％)。
甲基2,3-环氧-4,6-O-苯亚甲基-α-D-吡喃阿洛糖苷(B-2,71g,269mmol)溶解在1.5L的N,N-二甲基甲酰胺中，加入叠氮化钠(52.4g,807mmol)和氯化铵(174g,3.23mol)，在80℃下搅拌过夜，反应液用乙酸乙酯稀释，盐水洗涤，浓缩，硅胶柱纯化，得到42g无色糖浆状化合物甲基2-叠氮-4,6-O-苯亚甲基-2-脱氧-α-D-吡喃阿卓糖苷。上述化合物溶解在900mL的二氯甲烷中，搅拌，加入吡啶(213g,2.7mol)和三氟甲磺酸酐(87.7g,311mmol)在-30℃,搅拌30分钟，再向反应体系中加入5mL的水。浓缩反应体系，粗品中加入350mL的N,N-二甲基甲酰胺，再加入叠氮化钠(52.7g,810mmol)和氯化铵(27.4g,507mmol)在80℃搅拌过夜。向反应体系中加入乙酸乙酯和水，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱法纯化得白色无定形固体化合物甲基2,3-二叠氮-4,6-O-苯亚甲基-2,3-二脱氧-α-D-吡喃甘露糖苷(B-3)(28g，62％)。
在0℃下，向甲基2,3-二叠氮-4,6-O-苯亚甲基-2,3二脱氧-α-D-吡喃甘露糖苷(B-3,28g,62.7mmol)的醋酸酐(110mL)溶液中加入0.90mL的浓硫酸进行乙酰化反应，反应体系用乙酸乙酯稀释用饱和碳酸氢钠水溶液中和后，浓缩，纯化，得褐色油状物1,4,6-三-O-乙酰基-2,3-二叠氮基-2,3-二脱氧-α/β-D-吡喃甘露糖(27g)。上述油状物(27g,75.8mmol)和对甲苯硫酚(10.3g,83.4mmol)溶解在270mL的二氯甲烷中，加入三氟化硼乙醚溶液(38.0mL,303mmol)，在35℃下搅拌过夜。向反应体系中加入饱和碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯，分离有机相，干燥，纯化，得黄色固体对甲苯基4,6-二-O-乙酰基-2,3-二叠氮基-2,3-二脱氧-1-硫代-α/β-D-吡喃甘露糖苷(22g,70％,a/β＝1:2.1)。将上述β-D-甘露糖对甲苯硫苷(15.2g,36.2mmol)溶于180mL的甲醇，加入甲醇钠(586mg,10.9mmol)，搅拌2h。酸性阳离子树脂中和反应，浓缩，残余物用硅胶柱色谱法纯化得黄色固体对甲苯基2,3-二叠氮-2,3-二脱氧-1-硫代-β-D-甘露糖苷(B-4)(11.3g，产率93.4％)。
二羟基化合物B-4(11.3g,33.6mmol)溶于乙酸乙酯和水，在0℃向体系中加入2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(1.05g,6.72mmol)和碘苯二乙酸(27.0g,84.0mmol)，反应从零度至室温搅拌2小时。用硫代硫酸钠淬灭反应体系，分液得到的有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，得粗品，粗品溶解在330mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺，再加入溴化苄(17.2g,101mmol)和碳酸钾(14g,101mmol)，室温下搅拌过夜。反应液中加入乙酸乙酯和水分液，有机相浓缩，硅胶柱色谱法纯化后得到相应的合成砌块B：黄色固体化合物，对甲苯基2,3-二叠氮-2,3-脱氧-1-硫代-β-D-甘露糖苷酸苄酯(B-5)(图4)(13.4g,90.5％)。
(c 0.104,DCM)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.44–7.37(m,7H),6.98(d,J＝8.0Hz,2H),5.29(d,J＝8.5Hz,1H),5.19(d,J＝12.1Hz,1H),4.73(d,J＝0.9Hz,1H,H-1),4.28(td,J＝9.6,2.4Hz,1H,H-4),4.06(dd,J＝3.3,0.9Hz,1H,H-2),3.77(d,J＝9.5Hz,1H,H-5),3.69(dd,J＝9.7,3.6Hz,1H,H-3),3.43(d,J＝2.6Hz,1H,-OH),2.31(s,3H).LC-MS:[M+NH4]+Calcd 458.16,Found458.2.
实例2合成单糖砌块C:
对甲苯基4-脱氧-4-甲基氨基-4-N-苄氧羰基-2-脱氧-2-叠氮-1-硫代-α-L-岩藻糖苷(C-7)
L-鼠李糖单水合物(C-1,18.2g,100mmol)溶于500mL吡啶中，搅拌加入醋酸酐(61.3g,600mol)，在室温下搅拌12小时。减压旋蒸移除溶剂，用柱层析纯化得29.8g白色固体1,2,3,4-O-四乙酰基-α，β-L-鼠李糖。全乙酰化鼠李糖(29.8g,90mmol)和4-甲苯硫酚(13.4g,108mmol)溶于200mL的干燥二氯甲烷，再在0℃下加入三氟化硼乙醚溶剂(36mL,300mmol)，反应体系在室温下搅拌18小时。用碳酸氢钠饱和溶液淬灭反应体系，分液后有机相浓缩，硅胶柱色谱法纯化(3:1石油醚/乙酸乙酯)得到白色固体2,3,4-O-三乙酰基-L-鼠李糖对甲苯硫苷(C-2，30.2g,两步产率77％)。
2,3,4-O-三乙酰基-α-L-鼠李糖对甲苯硫苷(C-2)溶于干燥甲醇中，加入催化量的甲醇钠搅拌1小时，然后加入阳离子交换树脂IR120中和反应，过滤，滤液浓缩，得白色固体α-L-鼠李糖对甲苯硫苷。上述粗品(20.6g,66.5mmol)溶于二氯甲烷中，加入樟脑-10-磺酸(1.54g,6.6mmol)和二甲氧基丙烷(38g,380mmol)，氮气保护下室温搅拌4h。用2mL的三乙胺淬灭反应，反应液浓缩，石油醚/乙酸乙酯进行重结晶，得白色固体2,3-O-异亚丙基-α-L-鼠李糖对甲苯硫苷(C-3)(18.3g,77％)。
将2,3-O-异亚丙基-α-L-鼠李糖对甲苯硫苷(C-3,18.3g,59mmol)溶解在250mL的干燥二氯甲烷中，在0℃至室温条件用戴斯-马丁氧化剂处理两个小时。混悬液过滤，滤液浓缩，短硅胶柱纯化(3:1石油醚/乙酸乙酯)得到18g白色固体化合物6-脱氧-2,3-O-异亚丙基-α-L-来苏吡喃己-4-酮糖对甲苯硫苷。将上述酮糖(18g，59mmol)、盐酸羟胺(12.6g,180mmol)和三水乙酸钠(14.7g,180mmol)混合溶解在180mL水和200mL乙醇中，回流反应2小时，减压移除有机溶剂，水相用乙酸乙酯萃取三次。有机相浓缩，硅胶柱(4:1石油醚/乙酸乙酯)纯化，得白色固体6-脱氧-2,3-O-异亚丙基-4-羟肟基-α-L-来苏吡喃己糖对甲苯硫苷(C-4)(16.5g,90％)。
将6-脱氧-2,3-O-异亚丙基-4-羟肟基-α-L-来苏吡喃己糖对甲苯硫苷(C-4,16.5g,50mmol)溶于甲醇和四氢呋喃混合溶液中(5:1,200ml)，加入三氧化钼(21.6g，150mmol)和硼氢化钠(19g，500mmol)。反应30分钟后，将氢氧化钠溶液(2N，50mL)加入反应体系中，再搅拌12小时，过滤。滤液减压旋蒸至100mL，将其倒入冰水中，用二氯甲烷萃取三次。合并有机相，浓缩，硅胶色谱柱(1:5石油醚/乙酸乙酯)纯化得白色固体6-脱氧-4-氨基-4-脱氧-2,3-O-异亚丙基-α-L-塔罗吡南糖对甲苯硫苷(12.3g,79.2％)。溶解上述糖胺(12.3g,40mmol)在100ml甲醇中，在0℃-室温条件下用盐酸二氧六环溶液(4M,44ml)处理2小时，浓缩体系，得粗品6-脱氧-4-氨基-4-脱氧-α-L-塔罗糖对甲苯硫苷。将上述粗品溶解在乙腈/水(100ml,3:1)混合溶液中，再加入100ml的饱和碳酸氢钠水溶液，在0℃下分批加入三光气(13g,44mmol)，在室温下搅拌反应2小时。反应液用100ml的乙酸乙酯萃取三次。有机相浓缩，用石油醚/乙酸乙酯重结晶，得白色固体6-脱氧-4-N,3-O-碳酰基-4-脱氧-a-L-塔罗糖对甲苯硫苷(C-5)(11.2g,90.4％)。
将6-脱氧-4-N,3-O-碳酰基-4-脱氧-a-L-塔罗糖对甲苯硫苷(C-5,11.2g,36mmol)溶于200毫升的二氯甲烷中，在室温下加入叔丁基二甲基氯硅烷(6.5g,43.2mmol)和咪唑(2.94g,43.2mmol)反应16小时，除去溶剂，固体用水洗涤三次，得到6-脱氧-4-N,3-O-碳酰基-4-脱氧-2-O-叔丁基二甲基硅-a-L-塔罗糖对甲苯硫苷(11.2g,90.4％)的粗品。溶解上述粗品(11.2g,32.5mmol)在200毫升干燥的四氢呋喃中，再在0℃加入氢化钠(1.56g,60％分散在矿物油中，39mmol)和碘甲烷(5.5g,39mmol)升至室温下反应16小时。用饱和氯化铵溶液淬灭反应，有机相用水洗涤，浓缩，得白色固体6-脱氧-4-脱氧-4-甲基氨基-4-N,3-O-碳酰基-2-O-叔丁基二甲基硅-a-L-塔罗糖对甲苯硫苷(11.6g,32.5mmol)。将上述产品溶解在100毫升的80％乙酸水溶液中，在85℃下反应2小时，减压除去溶剂，剩余部分溶解在乙酸乙酯溶液中过滤，浓缩滤液，硅胶柱纯化(1:4石油醚/乙酸乙酯)得到无色糖浆状化合物6-脱氧-4-脱氧-4-氨基-4-N-甲基-4-N,3-O-碳酰基-a-L-塔罗糖对甲苯硫苷(C-6)(9.6g,91.1％)。
把6-脱氧-4-脱氧-4-甲基氨基-4-N,3-O-碳酰基-α-L-塔罗糖对甲苯硫苷(9.6g,29.6mmol)和三苯基膦(11.63g,44.4mmol)溶解在干燥的四氢呋喃(300mL)溶液中，在0℃下加入偶氮二甲酸二异丙酯(8.97g,44.4mmol)和叠氮磷酸二苯酯(9.8g,35.5mmol)，室温下搅拌2小时，然后回流反应16小时。反应液冷却至室温，浓缩，用柱色谱法纯化(2:1石油醚/乙酸乙酯)得到黄色糖浆状的4-脱氧4-甲基氨基-4-N,3-O-碳酰基-2-脱氧-2-叠氮-α-L-岩藻糖对甲苯硫苷和三苯基氧化膦的混合物直接进行下一步反应。溶解上述粗品在100毫升的二氧六环中，加入40毫升1N的氢氧化钾水溶液，在75℃下搅拌16小时，将反应液冷却至室温，用1N盐酸水溶液中和。用乙酸乙酯萃取水相，有机相浓缩得粗品。上述粗品再次溶解在50毫升的四氢呋喃中，在0℃下加入50毫升的碳酸氢钠水溶液(5.0g,59.2mmol)和氯甲酸苄酯(5.55g,32.56m mol)，室温下反应1小时，用乙酸乙酯萃取体系三次，有机相用饱和的食盐水洗涤，浓缩，用硅胶柱纯化(8:1石油醚/乙酸乙酯)得到白色固体4-脱氧-4-甲基氨基-4-N-苄氧羰基-2-脱氧-2-叠氮-α-L-岩藻糖对甲苯硫苷(C-7)(图5)(9g,三步合计产率70.3％)。
(c 0.210,DCM)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40–7.33(m,9H),7.14(d,J＝7.9Hz,2H),5.57(d,J＝5.7Hz,1H,H-1),5.17(s,2H,BnCH2),4.80(qd,J＝6.5,3.5Hz,1H,H-5),4.58(dd,J＝5.3,3.4Hz,1H,H-4),4.22(ddd,J＝10.8,5.4,1.9Hz,1H),4.07(dd,J＝10.9,5.7Hz,1H,H-2),3.18(s,3H),3.00(d,J＝1.9Hz,-OH),233(s,3H),1.26(d,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ158.49,137.16,135.32,132.04,128.92,128.56,127.53,127.07,126.65,86.91,69.61,66.85,64.95,60.19,56.77,32.35,20.12,15.63.ESI-MS m/z:443.2(M+H)+.
实施例3合成单糖砌块D:
2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基-3,4-O-二-苄基-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-5)
化合物1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖溶解在四氢呋喃(350mL)溶液中，在0℃下加入氨气的甲醇溶液(7M,50ml)，搅拌30分钟后向反应体系中鼓氮气15分钟。减压浓缩、干燥、得糖浆状的3,4,6-三-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖粗品，无需纯化直接用于下一步反应。上述粗品(34.2g,0.1mol)二氯甲烷溶液(300mL)在室温下经碳酸铯(65.2g,0.2mol)和三氯乙腈(72.2g,0.5mol)处理2小时，悬浊液过滤，滤液浓缩，石油醚/乙酸乙酯重结晶得到白色固体3,4,6-三-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖三氯亚胺酯供体(D-2)(35g,74％)。
溶解3,4,6-三-O-乙酰基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖三氯亚胺酯供体(D-2,35g,74mmol)和2-(2-羟基乙氧基)-1-N-苄氧羰基乙胺(35.3g,150mmol)在干燥的二氯甲烷(300mL)溶液中，加入10克活化的
分子筛和三甲基甲硅基三氟甲磺酸酯(820mg,3.5mmol)，室温下搅拌2小时。反应液用三乙胺淬灭，硅藻土过滤，合并滤液旋蒸，得残留物，用硅胶柱色谱法纯化，得2-[2-(苄氧碳酰氨基)乙氧基]乙基3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-2-叠氮-α/β-D-吡喃葡萄糖苷(30g,74％，α/β1:1)。将α-吡喃葡萄糖苷(14.9g,54mmol)溶解在在100毫升干燥的甲醇中，在0℃加入催化量甲醇钠反应4小时。反应液用阳离子交换树脂IR-120(H+)中和，过滤，浓缩，得无色糖浆状粗品2-[2-(苄氧碳酰氨基)乙氧基]乙基2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-3):(10.5g,91.3％)。
将2-[2-(苄氧碳酰氨基)乙氧基]乙基2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-3):(4.26g,10mmol)溶于50毫升干燥的二氯甲烷中，加入叔丁基二甲基硅氯(1.64g,11.0mmol)和咪唑(1.10g,20mmol)，在0℃下反应2小时。用2ml饱和的碳酸钠溶液淬灭反应，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱纯化(2:1，石油醚/乙酸乙酯)，得无色糖浆状的2-[2-(苄氧碳酰氨基)乙氧基]乙基-6-O-叔丁基二甲基硅烷基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(4.12g,76.3.％)。将上述糖浆状物质(4.12g,7.63mmol)溶于70毫升干燥的乙腈中，0℃下加入氢化钠(1.10g,60％分散在矿物油中，27.48mmol)和苄溴(4.70g,27.48mmol)，室温下反应12小时。用冰水淬灭反应体系，乙酸乙酯萃取，浓缩有机相，硅胶柱(5:1petrol ether/EtOAc)纯化得到无色糖浆状的化合物2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基6-O-叔丁基二甲基硅烷基-3,4-O-二-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-4):(4.35g,87.8％)。
溶解2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基6-O-叔丁基二甲基硅烷基-3,4-O-二-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(4.35g,5.37mmol)在50毫升80％乙酸水溶液中，在85℃下搅拌2小时，加入水和乙酸乙酯分液萃取。浓缩有机相，用硅胶柱色谱法纯化(3:1石油醚/乙酸乙酯)得到无色糖浆状的2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基-3,4-O-二-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(3.60g,96％)。将上述化合物(3.60g,5.17mmol)溶于干燥的50毫升甲醇中，在0℃下加入六水合氯化镍(148mg,0.52mmol)、硼氢化钠(392.9mg,10.34mmol)和二碳酸二叔丁酯(1.69g,溶于10mL甲醇溶液中，7.76mmol)反应2小时。旋蒸浓缩后的残留物用硅胶柱(3:1石油醚/乙酸乙酯)纯化得到化合物2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基3,4-O-二-苄基-2-[(叔丁氧羰基)氨基]-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-5)(3.74g,94％)(图6)。
(c 0.115,DCM)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32–7.14(m,19H),7.09(d,J＝6.2Hz,1H),5.12(s,1H),5.08(s,1H),4.86–4.61(m,5H),4.59–4.49(m,3H,H-1),3.85(td,J＝10.2,3.0Hz,1H),3.74–3.58(m,5H),3.55–3.38(m,7H),3.33(d,J＝4.0Hz,1H),1.33(s,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ155.59,155.29,154.36,137.39,137.01,136.85,136.81,135.70,135.54,127.51,127.45,127.26,127.06,126.92,126.85,126.54,126.26,97.46,80.01,78.57,77.14,74.17,74.00,70.51,68.85,68.79,68.68,68.39,66.30,66.13,65.97,59.37,53.37,50.57,50.53,45.81,44.71,27.36.LC-MS:[M+Na]+Calcd 793.37,Found 793.3.
实施例4合成另一种单糖砌块D:
2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基6-叔丁基二甲基硅烷基-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-7)
溶解2-[2-(苄氧碳酰氨基)乙氧基]乙基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-3,5.0g,11.7mmol)于100毫升干燥的乙腈中，加入樟脑-10-磺酸(544mg,2.34mmol)和苯甲醛二甲缩醛(2.667g,17.55mmol)，反应体系在室温下反应过夜。用三乙胺淬灭反应，浓缩，用硅胶柱色谱法纯化得无色糖浆状化合物2-[2-(苄氧碳酰氨基)乙氧基]乙基-4,6-O-苯亚甲基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(6.0g,99％)。溶解上述化合物(6.0g,11.6mmol)在20毫升干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，在0℃下向反应体系中加入氢化钠(696mg,17.4mmol，60％分散于矿物油中)和苄溴(2.38g,13.92mmol)。在室温下搅拌过夜，反应体系用饱和氯化铵水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取。有机相减压浓缩，硅胶柱纯化(3:1石油醚/乙酸乙酯)，得无色糖浆状化合物2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基4,6-O-苯亚甲基-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-6)(7.0g,86.4％)。
2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基4,6-O-苯亚甲基-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-6,7.0g,10.08mmol)溶解在50毫升的80％乙酸溶液中，在70℃下搅拌2小时，减压蒸去溶剂，得到粗品用硅胶柱纯化，得无色糖浆状化合物2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(5.3g,86.7％)。溶解上述糖浆(5.3g,8.74mmol)在150毫升干燥二氯甲烷中，在0℃下加入咪唑(1.78g,26.22mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(1.57g,10.48mmol)，室温下反应1小时。用100毫升水淬灭反应，分液，有机相浓缩，硅胶柱纯化得到无色糖浆状化合物2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基6-叔丁基二甲基硅烷基-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-7)(4.8g,76.1％)(图7)。
(c 0.261,DCM)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45–7.25(m,14H),7.20(d,J＝6.8Hz,1H),5.22(s,1H),5.17(s,1H),4.92(d,J＝3.1Hz,1H,H-1),4.87(d,J＝11.8Hz,2H),4.62(d,J＝9.6Hz,2H),3.92–3.77(m,4H),3.74–3.54(m,7H),3.52–3.46(m,1H),3.43(d,J＝5.0Hz,1H),3.27(brs,J＝6.5Hz,1H),3.07(brs,1H),0.91(s,9H),0.09(s,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ155.75,155.32,137.20,136.90,136.76,135.69,135.48,127.50,127.41,127.07,126.94,126.86,126.79,126.29,97.18,96.91,78.74,78.58,74.02,71.95,70.07,69.04,68.83,68.52,66.32,66.22,62.81,61.66,50.41,50.36,45.92,44.65,24.87,17.31,-6.43.LC-MS:[M+Na]+Calcd 743.35,Found743.2.
实施例5合成单糖砌块E:
3,4,6,7-四-O-苄基-2-O-乙酰基-D/L-甘油-D-吡喃甘露庚糖三氯亚胺酯(E-6,DD和异构体E-6LDα及LDβ)
D-甘露糖(50g,277.7mmol)溶于200毫升的吡啶和100毫升的醋酸酐中，反应过夜。减压移除溶剂得到的粗品用乙酸乙酯复溶后依次用2％盐酸和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗品用硅胶柱纯化(3:1石油醚/乙酸乙酯)得到无色糖浆状全乙酰化甘露糖(118g,90％)。全乙酰化甘露糖(45g,115.4mmol)溶于250毫升二氯甲烷中，在0℃加入10毫升醋酸酐和溴化氢(250mL,30％醋酸溶液)，室温下反应4小时。将反应液倒入冰的饱和碳酸氢钠水溶液中，乙酸乙酯萃取。真空下浓缩有机相，得2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-甘露糖基溴苷粗品，未纯化的上述粗品直接用于下步反应。溶解甘露糖溴苷粗品(48g)于300mL N，N-二甲基甲酰胺和甲醇(3:1)的混合溶液中，在0℃下，再加入四丁基溴化铵(43g,116.7mmol)和N,N-二异丙基乙胺(30.1g,233.4mmol)，反应体系在室温下反应过夜。除去溶剂，加入200mL乙酸乙酯萃取反应体系，并用饱和食盐水洗涤，硫酸钠干燥，浓缩有机相，石油醚/乙酸乙酯重结晶得白色固体3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-吡喃甘露糖(E-1)(38g,两步合并收率77％)。
3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-吡喃甘露糖(E-1,24g,66.3mmol)溶于200毫升甲醇溶剂中，加入催化量的甲醇钠，在0℃下反应1小时。阳离子交换树脂中和反应体系，混合溶液过滤，滤液旋蒸，得残留物1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-吡喃甘露糖，无需纯化直接用于下步反应。上述粗产品(15g,63.5mmol)溶于100毫升N,N-二甲基甲酰胺中，在0℃加入叔丁基二甲基氯硅烷(11.5g,76.2mmol)和咪唑(6.5g,95.3mmol)，反应体系于室温下反应2小时，混合液用乙酸乙酯/水体系分液萃取。有机相旋蒸，硅胶柱纯化(2:1石油醚/乙酸乙酯)得无色糖浆状化合物6-O-叔丁基二甲基硅烷基-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-甘露吡喃糖(E-2)(21.6g,两步合并收率68.7％)。
将6-O-叔丁基二甲基硅烷基-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-甘露吡喃糖(E-2,21.6g,45.5mmol)溶于200毫升干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，在0℃下加入氢化钠(4.56g，60％分散于矿物油中，136.7mmol)和苄溴(18.7g，109.2mmol)，反应混合物在室温下搅拌24小时，100毫升冰水加入反应体系中，用乙酸乙酯萃取。有机相在真空旋蒸下浓缩，用硅胶柱纯化(4:1石油醚/乙酸乙酯)得到无色油状化合物3,4-二-O-苄基-6-O-叔丁基二甲基硅烷基-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-甘露吡喃糖(21.1g,71％)。将上述化合物(10.2g,15.06mmol)溶解在100毫升的四氢呋喃中，加入四丁基氟化铵((18.07mL,18.07mmol,1M呋喃溶液)，反应过夜。除去溶剂，得残余物，残余物溶解在乙酸乙酯中，过滤，浓缩，用硅胶柱纯化，得到无色糖浆状化合物3,4-二-O-苄基-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-甘露吡喃糖(E-3)(6.0g,96％)。
3,4-二-O-苄基-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-甘露吡喃糖(E-3,21g,50.4mmol)和吡啶(10g,25.2mmol)溶于100毫升二氯甲烷中，加入戴斯-马丁氧化剂(23.5g,55.5mmol)，反应体系在室温下搅拌3小时。向混合物中加入500毫升乙酸乙酯，过滤，滤液用饱和亚硫酸钠(50毫升)和饱和碳酸氢钠水溶液依次洗涤，浓缩有机相，得粗品6-醛基-3,4-二-O-苄基-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-甘露吡喃糖(20.1g,96.3％)。甲基三苯基溴化膦(29.4g,72.75mmol)溶于350毫升干燥的四氢呋喃中，在-40℃加入正丁基锂(18mL,72.75mmol,4M正己烷溶液)处理后，于反应液中滴加醛基甘露糖的干燥四氢呋喃溶液，反应体系于室温下反应8小时。用150毫升饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取体系。减压旋蒸溶剂，硅胶柱(7:1石油醚/乙酸乙酯)纯化得白色固体3,4-二-O-苄基-6,7-二脱氧-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-6-吡喃甘露庚烯糖(E-4)(8.4g,两步合并收率40.5％)。
3,4-二-O-苄基-6,7-二脱氧-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-6-吡喃甘露庚烯糖(E-4,8.4g,20.4mmol)溶于120毫升丙酮/水(9:1)溶液中，在0℃加入N-甲基吗啉氮氧化物(4.7mg,40.8mmol)和4wt％的四氧化锇水溶液(12.5mL,2.04mmol)，升至室温下反应5小时后，将反应液倒入100毫升饱和亚硫酸钠溶液中。除去丙酮，用100毫升的乙酸乙酯萃取反应体系3次，合并有机相，硅胶柱纯化(2:1石油醚/乙酸乙酯)得到一对非对映异构体混合物3,4-二-O-苄基-(D,L)-甘油-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-吡喃甘露庚糖(8.6g,94.5％)(1.6:1)。上述双羟基混合物(8.5g,19.1mmol)溶于50毫升干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，在0℃时加入氢化钠(2.3g,60％分散于矿物油中,57.3mmol)和苄溴(9.8g,57.3mmol)。升至室温搅拌24小时，加入50毫升冰水，用乙酸乙酯萃取。真空旋蒸浓缩有机相，硅胶柱纯化(4:1石油醚/乙酸乙酯)，得到无色糖浆状化合物3,4,6,7-四-O-苄基-(D,L)-甘油-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-吡喃甘露庚糖(E-5)(8.5g,71.2％)。
3,4,6,7-四-O-苄基-(D,L)-甘油-1,2-O-(外-1-甲氧基亚乙基)-β-D-吡喃甘露庚糖(E-5,8.5g,13.6mmol)溶于20毫升80％乙酸水溶液，在室温下搅拌2小时，饱和碳酸氢钠水溶液淬灭体系，用50毫升乙酸乙酯萃取。浓缩，硅胶柱纯化(3:1石油醚/乙酸乙酯)，分别得到化合物3,4,6,7-四-O-苄基-2-O-乙酰基-(D/L)-甘油-β-D-甘露庚糖的D,D-甘油-庚糖(5.4g,63.9％)和L,D-甘油-庚糖(2.86g,33.8％)。将化合物3,4,6,7-四-O-苄基-2-O-乙酰基-D-甘油-β-D-甘露庚糖(4.36g,7.13mmol)溶于50毫升的二氯甲烷中，加入碳酸铯(5.12g,14.26mmol)和三氯乙腈(4.65g,35.65mmol)在室温下反应1小时，混合物用硅藻土过滤，浓缩后得到的粗品用硅胶柱纯化(85:15石油醚/乙酸乙酯)，得α构型的供体化合物3,4,6,7-四-O-苄基-2-O-乙酰基-D-甘油-α-D-甘露庚糖三氯亚胺酯(E-6-DD)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(s,1H),7.39–7.26(m,18H),7.19(dd,J＝7.1,2.3Hz,2H),6.27(d,J＝2.0Hz,1H),5.50–5.44(m,1H),4.86(d,J＝10.6Hz,1H),4.81–4.66(m,3H),4.64–4.54(m,2H),4.52–4.41(m,2H),4.17–4.07(m,2H),4.07–4.00(m,2H),3.76–3.64(m,2H),2.14(d,J＝4.7Hz,3H).
将L,D-甘油-庚糖(2.86g,4.67mmol)溶于50毫升的二氯甲烷中，加入碳酸铯(3.36g,9.35mmol)和三氯乙腈(3.05g,23.4mmol)，在室温下反应1小时，混合物用硅藻土过滤，得残余物，残余物用硅胶柱纯化(85:15石油醚/乙酸乙酯)得到3,4,6,7-四-O-苄基-2-O-乙酰基-D-甘油-α/β-甘露庚糖三氯亚胺酯(E-6-LD)(2.91g,83％)(图8)。
E-6-LD-α:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(s,1H),7.37–7.26(m,17H),7.22(d,J＝7.8Hz,3H),6.31(d,J＝1.6Hz,1H),5.53–5.46(m,1H),4.93–4.81(m,2H),4.72(d,J＝11.1Hz,1H),4.59–4.45(m,4H),4.35(d,J＝10.9Hz,1H),4.19–4.10(m,2H),4.06(dd,J＝9.4,3.1Hz,1H),4.03–3.98(m,1H),3.81(dd,J＝9.9,6.4Hz,1H),3.65(dd,J＝9.9,5.7Hz,1H),2.19(s,3H).
E-6-LD-β:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(s,1H),7.37–7.26(m,18H),7.18(dd,J＝7.1,2.3Hz,2H),6.27(d,J＝2.0Hz,1H),5.52–5.44(m,1H),4.86(d,J＝10.6Hz,1H),4.77(d,J＝11.9Hz,1H),4.72(d,J＝11.4Hz,1H),4.67(s,1H),4.61(d,J＝10.7Hz,1H),4.56(d,J＝11.2Hz,1H),4.48(d,J＝12.1Hz,1H),4.44(d,J＝12.0Hz,1H),4.15–4.02(m,4H),3.74–3.65(m,2H),2.14(s,3H).
实施例6合成带有连接臂的末端二糖ABβ
(2-脱氧-2-乙酰胺基-α-D-葡萄糖基)-(1→4)-2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰胺基-β-D-甘露吡喃糖苷酸(AB-6β)
如图9所示，将3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-叠氮-α-D-吡喃葡萄糖(A-10)(4.00g,8.4mmol)、二苯基亚砜(4.76g,23.6mmol)和三叔丁基嘧啶(4.81g,25.2mmol)溶于40毫升干燥的二氯甲烷中，-20℃下加入三氟甲磺酸酐(3.32g,11.8mmol)搅拌1小时后再加入对甲苯基2,3-二叠氮-2,3-脱氧-1-硫代-β-D-甘露糖苷酸苄酯(B-5β)(3.07g,7.0mmol)，继续搅拌2小时升至室温。三乙胺淬灭反应，过滤并浓缩滤液，用硅胶柱纯化，得白色固体粗品(3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-叠氮-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-对甲苯基2,3-二脱氧-2,3-二-叠氮-1-硫代-β-D-吡喃甘露糖苷酸苄酯(AB-1)(4.40g,70％)。
(3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-叠氮-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-对甲苯基2,3-二脱氧-2,3-二-叠氮-1-硫代-β-D-吡喃甘露糖苷酸苄酯(AB-1)(160mg,0.18mmol)溶于10毫升丙酮中，加入N-溴代丁二酰亚胺(47.6mg,0.27mmol)室温下搅拌1小时，用等量的硫代硫酸钠溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到的粗品用硅胶柱纯化，得无色糖浆状化合物(3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-叠氮-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-叠氮-D-吡喃甘露糖醛酸苄酯(AB-2)(130mg,90％)。
溶解AB-2(860mg,1.25mmol)、二苯基亚砜(700mg,3.5mmol)和三叔丁基嘧啶(930mg,3.75mmol)于25毫升干燥二氯甲烷溶液中，再加入分子筛，-40℃下加入三氟甲磺酸酐(500mg,1.75mmol)，体系反应1小时，加入糖基受体(450mg,1.87mmol)，升至室温反应4小时。滴加数滴三乙胺淬灭其反应，过滤后浓缩得到的粗品用硅胶柱纯化得到化合物(3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-叠氮-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-2-[2-(苄氧碳酰胺基)乙氧基]乙基2,3-二脱氧-2,3-二-叠氮-β-D-吡喃甘露糖苷酸苄酯(AB-3)(650mg,58.5％)。
AB-3(830mg,0.82mmol)的四氢呋喃(30mL)溶液中加入少量醋酸和醋酸酐、4克锌粉和2毫升饱和硫酸铜溶液。搅拌2小时后，反应液过滤，旋蒸后得到得混合物，用硅胶柱纯化，得无色糖浆状化合物(3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-乙酰胺基-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-2-[2-(苄氧碳酰胺基)乙氧基]乙基2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰胺基-β-D-吡喃甘露糖苷酸苄酯(AB-4)(410mg,49％)。
在AB-4(300mg,0.283mmol)在80％乙酸水溶液(16mL)中加入Pd/C(200mg,含10％Pd)，在氢气环境下室温催化氢化12小时，硅藻土过滤，减压旋蒸，得白色固体化合物2-脱氧-2-乙酰胺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2-(2-氨基乙氧基)乙基2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰胺基-β-D-吡喃甘露糖苷酸(AB-5)(151mg,94％)。搅拌溶解AB-5(30mg,0.05mmol)于5毫升磷酸盐缓冲液中(pH＝7.4)，加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(14mg,0.05mmol)的乙腈溶液(1mL)，反应1小时后，混合物冻干，用C18反相硅胶纯化，得白色固体化合物(2-脱氧-2-乙酰胺基-α-D-葡萄糖基)-(1→4)-2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰胺基-β-D-甘露吡喃糖苷酸(AB-6β)(28mg,73％)(图9)。1H NMR(400MHz,D2O)δ6.85(s,2H),5.12(d,J＝3.8Hz,1H),4.89(brs,1H),4.33(d,J＝2.7Hz,1H),4.24(dd,J＝9.9,3.7Hz,1H),3.99–3.89(m,2H),3.88–3.70(m,8H),3.69–3.61(m,3H),3.49(dt,J＝19.0,7.4Hz,3H),3.38–3.25(m,2H),2.55–2.40(m,2H),2.05(s,3H),1.98(s,3H),1.88(s,3H).LC-MS:[M+H]+Calcd 718.28,Found 718.2.
实施例7合成带有连接臂的末端二糖ABα：
(2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-葡萄糖基)-(1→4)-2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰胺基-α-D-甘露吡喃糖苷酸(AB-6α)
如图9所示，化合物AB-6α的合成是从AB-3的α-异构体出发，采用与制备AB-6β类似的合成方法得到的。该异构体原料是在AB-3的纯化过程中作为副产物分离得到的。1H NMR(400MHz,D2O)δ6.87(s,2H),5.12(d,J＝3.9Hz,1H),4.80(brs,1H),4.42(dd,J＝10.2,3.9Hz,1H),4.25(dd,J＝3.8,1.1Hz,1H),4.07(d,J＝9.7Hz,1H),3.98(t,J＝9.9Hz,1H),3.87–3.65(m,11H),3.59(t,J＝5.2Hz,2H),3.47(t,J＝9.5Hz,1H),3.34(t,J＝5.2Hz,2H),2.57–2.46(m,2H),2.04(s,3H),1.99(s,3H),1.88(s,3H).LC-MS:[M+H]+Calcd 718.28,Found 718.2.
实施例8合成带有连接臂的末端三糖ABC:
2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基2-脱氧-2-乙酰胺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰氨基-β-D-吡喃甘露糖醛酸-(1→3)-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-L-吡喃岩藻糖苷(ABC-6β)
如图10所示，3,4,6-O-三苄基-2-脱氧-2-叠氮-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-叠氮-D-吡喃甘露糖醛酸苄酯(AB-2)(416mg,0.53mmol)、Ph2SO(319.2mg,1.58mmol)和三叔丁基嘧啶(365.7mg,1.47mmol)溶于10毫升干燥的二氯甲烷中，在-30℃下加入三氟甲磺酸酐(207mg,0.74mmol)反应1小时，随后加入4-脱氧-4-甲基氨基-4-N-苄氧羰基-2-脱氧-2-叠氮-α-L-岩藻糖对甲苯硫苷(C7)(341mg,0.79mmol)，搅拌1小时后，恢复至室温反应过夜，滴加三乙胺淬灭反应，过滤，浓缩滤液，硅胶柱纯化得到(ABC-1)(407mg,63.7％)。
溶解上述化合物ABC-1(780mg,0.64mmol)和间氯过氧苯甲酸(220.2mg,1.28mmol)在6毫升二氯甲烷中，反应液在-78℃下搅拌30分钟。反应体系用硫代硫酸钠水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取。浓缩，硅胶柱色谱法纯化得对甲苯基3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-叠氮-α-D-葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-叠氮-β-D-吡喃甘露糖基醛酸苄酯-(1→3)-4-N-苄氧羰基-4-脱氧-4-甲基氨基-2-脱氧-2-叠氮-l-亚砜-α-L-吡喃岩藻糖苷(ABC-2)(407mg,63.7％)。
化合物ABC-2(300mg,0.25mmol)和三叔丁基嘧啶(150mg,0.60mmol)溶于15毫升干燥的二氯甲烷中，加入分子筛后加入三氟甲磺酸酐(77mg,0.27mmol)在-70℃下处理1小时，加入苄基2-(2-羟基乙氧基)氨基甲酸乙酯(139mg,1mmol)，反应体系回温至室温下反应6小时。滴加三乙胺淬灭反应体系，过滤，浓缩，残余物用硅胶柱色谱法纯化得到化合物2-[2-(苄氧羰基氨基)乙氧基]乙基3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-叠氮-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二叠氮-β-D-吡喃甘露糖基醛酸苄酯-(1→3)-4-N-(苄氧羰基)-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-叠氮-β-L-吡喃岩藻糖苷(ABC-3)(143mg,43％)。
ABC-3(150mg,0.113mmol)溶于10毫升四氢呋喃中，加入少量的醋酸、醋酸酐、50毫克锌粉和0.5毫升饱和硫酸铜水溶液。反应体系搅拌2小时，反应混合物过滤，旋蒸得到的粗品用硅胶柱纯化(10％甲醇的乙酸乙酯溶液)，得到2-[2-(苄氧羰基氨基)乙氧基]乙基3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二乙酰氨基-β-D-吡喃甘露糖基醛酸苄酯-(1→3)-4-N-(苄氧羰基)-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-L-吡喃岩藻糖苷(ABC-4)(110mg,70.2％)。
上述ABC-4(110mg,0.079mmol)溶于3毫升80％的醋酸中，加入Pd/C(20mg,含10％Pd)，氢气环境中催化加氢，室温下搅拌16小时，硅藻土过滤，减压旋蒸，得白色固体化合物2-(2-氨基乙氧基)乙基2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二乙酰氨基-β-D-吡喃甘露糖基醛酸-(1→3)-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-L-吡喃岩藻糖苷(ABC-5)(44mg,72.7％)。将上述化合物ABC-5溶于3毫升pH＝7.4磷酸盐缓冲液中，不断搅拌下向反应体系中加入0.5毫升3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(17mg,0.063mmol)的乙腈溶液，反应1小时后反液冻干，用C18的层析柱纯化得白色固体2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基2-脱氧-2-乙酰胺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰氨基-β-D-吡喃甘露糖醛酸-(1→3)-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-L-吡喃岩藻糖苷(ABC-6β)(26mg,72.3％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ6.84(s,1H),6.29(d,J＝12.3Hz,1H),5.90(d,J＝12.4Hz,1H),5.09(d,J＝2.9Hz,1H),4.94(s,1H),4.87(d,J＝1.4Hz,1H),4.29–4.17(m,3H),4.02(dd,J＝11.4,2.6Hz,1H),393(t,J＝9.5Hz,1H),3.81–3.72(m,7H),3.68–3.64(m,4H),3.60(t,J＝4.8Hz,2H),3.54(t,J＝5.2Hz,1H),3.47–3.42(m,2H),3.30(dt,J＝24.4,12.3Hz,1H),2.60(s,1H),2.60(s,2H),2.43–2.35(m,2H),2.02(s,3H),1.99(s,3H),1.97.(s,3H),1.87(s,3H),1.21(d,3H).LC-MS:[M+H]+Calcd918.4,Found 918.4.
实施例9合成带有连接臂的末端二糖DE(LD-异构体):
2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(DE-6LD)
如图11所示，L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖三氯亚胺酯供体(E-6LD)(2.4g,3.17mmol)和2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基6-叔丁基二甲基硅烷基-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-7)(2.3g,3.17mmol)溶于30毫升干燥的二氯甲烷中，加入
分子筛处理后在0℃加入催化量的三氟甲磺酸三甲基甲硅酯，升至室温搅拌2小时，三乙胺淬灭反应，过滤，减压浓缩，得到的粗品用硅胶柱纯化(4:1石油醚/乙酸乙酯)得到无色糖浆状的化合物2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基2-O-乙酰基-3,4,6,7-四-O-苄基-L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)-6-O-叔丁基二甲基硅基-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(DE-1LD)(3.5g,83.1％)。
将2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基2-O-乙酰基-3,4,6,7-四-O-苄基-L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)-6-O-叔丁基二甲基硅基-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(DE-1LD,3.3g,2.50mmol)溶于25毫升干燥的甲醇溶剂中，加入催化量的甲醇钠，室温下反应3小时。用阳离子交换树脂IR120中和反应体系，溶液过滤，真空浓缩，得无色糖浆状的粗品化合物2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基3,4,6,7-四-O-苄基-L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)-6-O-叔丁基二甲基硅基-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(3.18g,98.3％)。将上述二糖化合物的粗品(3.18g,2.5mmol)溶于25毫升干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，在0℃下分别加入氢化钠(150mg,60％在矿物油中,3.75mmol)和苄溴(513mg,3.0mmol)，反应液在室温下搅拌16小时。用冰水淬灭反应混合物，乙酸乙酯萃取体系，合并有机相，真空浓缩，硅胶柱纯化(5:1石油醚/乙酸乙酯)得到无色糖浆状的化合物2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基2,3,4,6,7-五-O-苄基-L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)-6-O-叔丁基二甲基硅基-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(2.8g,82.2％)。将硅基保护的二糖化合物(2.8g,2.0mmol)溶解于20毫升80％的乙酸溶液中，在75℃下搅拌2小时，旋蒸，硅胶柱纯化(3:1石油醚/乙酸乙酯)得无色糖浆状化合物2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基2,3,4,6,7-五-O-苄基-L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(DE-3-LD)(2.2g,85.9％)。
上述化合物DE-3LD(2.2g，1.76mmol)溶解在50毫升干燥的甲醇中，在0℃下分别加入氯化镍(II)六水合物(502mg,1.76mmol)和硼氢化钠(334.4mg,5.02mmol)，搅拌30分钟，再向反应体系中加入二碳酸二叔丁酯(768.1g,3.52mmol)，在室温下搅拌2小时。除去溶剂，得残余物，用硅胶柱色谱法纯化(3:1石油醚/乙酸乙酯)得到无色糖浆状化合物2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基2,3,4,6,7-五-O-苄基-L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)-3-O-苄基-2-叔丁氧碳酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(DE-4LD)(1.76g,75.6％)。
将苄基保护的二糖DE-4LD(350mg,0.26mmol)溶于5毫升80％乙酸水溶液中，加入Pd/C(20mg,含10％Pd)催化加氢，室温下搅拌16小时，硅藻土过滤，滤液冻干，得到白色固体的化合物2-(2-氨基乙氧基]-乙基L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)-2-叔丁氧碳酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(DE-5LD)(148mg)。溶解二糖(65mg,0.10mmol)在3毫升PH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，再加入3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(30mg,0.11mmol,溶于0.5mL乙腈中)，反应液在室温下搅拌1小时。冻干，叔丁氧羰基保护的二糖粗品溶于3毫升的三氟乙酸/水(1:1)混合溶液中室温下搅拌4小时，用10毫升水稀释反应液，冻干，C18反相硅胶纯化(100％～90％,0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈)纯化得到白色固体化合物2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(DE-6LD)(31mg,三步合计产率42％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ6.79(s,2H),5.27(d,J＝1.3Hz,1H,H-1E),5.09(d,J＝3.6Hz,1H,H-1D),4.00(dd,J＝10.6,8.7Hz,1H),3.97–3.91(m,2H),3.85–3.76(m,3H),3.75–3.69(m,5H),3.69–3.60(m,6H),3.57–3.53(m,1H),3.51(t,J＝5.5Hz,2H),3.30(dd,J＝10.7,3.6Hz,1H),3.26(t,J＝5.5Hz,2H),2.45(t,J＝6.5Hz,2H).LC-MS:[M+H]+Calcd 610.2,Found610.3.
实施例10合成带有连接臂末端二糖DE(DD-异构体):
如图11所示，从化合物D-甘油-α-D-甘露庚糖三氯亚胺酯供体(E-6DD)与糖基受体2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基6-叔丁基二甲基硅烷基-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡糖苷(D-7)出发，采用与合成DE-6LD相同的合成方法合成了化合物2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基D-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷DE-6DD。1H NMR(400MHz,D2O)δ6.82(s,2H),5.23(s,1H,H-1E),5.11(d,J＝3.1Hz,1H,H-1D),4.02(dd,J＝19.3,9.5Hz,3H),3.87–3.80(m,3H),3.78–3.73(m,4H),3.73–3.64(m,8H),3.54(t,J＝5.3Hz,2H),3.33(dd,J＝10.9,2.6Hz,1H),3.31–3.26(t,J＝4.8Hz,1H),2.48(t,J＝6.4Hz,2H).
实施例11合成带有连接臂的五糖化合物ABCDE:
2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰氨基-β-D-吡喃甘露糖基醛酸-(1→3)-4-脱氧-4-甲基氨基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-L-吡喃岩藻糖基-(1→6)-[L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)]-2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(ABCDE-5)
将对甲苯基3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-叠氮-α-D-葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-叠氮-β-D-吡喃甘露糖基醛酸苄酯-(1→3)-4-N-苄氧羰基-4-脱氧-4-甲基氨基-2-脱氧-2-叠氮-l-亚砜-α-L-吡喃岩藻糖苷(ABC-2)(850mg,0.69mmol)和三叔丁基嘧啶(428.4mg,1.72mmol)溶于10毫升二氯甲烷中，加入分子筛处理后，在-78℃下加入三氟甲磺酸酐(31.1mg,0.11mmol)反应1小时，再加入化合物2-[2-(N,N'-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基2,3,4,6,7-五-O-苄基-L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)-3-O-苄基-2-叠氮-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(DE-3LD)(1.09g,0.83mmol)，经过3小时反应缓慢升至室温。滴加三乙胺淬灭反应，过滤，浓缩得到混合物，硅胶柱纯化，得2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-叠氮-α-D-葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-叠氮-β-D-吡喃甘露糖基醛酸苄酯-(1→3)-4-N-苄氧羰基-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-叠氮-β-L-吡喃岩藻糖基-(1→6)-[2,3,4,6,7-五-O-苄基-L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)]-3-O-苄基-2-叔丁氧碳酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(ABCDE-1)(770mg,46.2％).
将化合物ABCDE-1(720mg,0.3mmol)溶于30毫升的四氢呋喃中，分别加入少量的乙酸和醋酸酐，再加入1.90克的锌粉和1.0毫升的饱和硫酸铜水溶液。室温下搅拌4小时后，反应液过滤，旋蒸后得到的粗品用硅胶柱纯化(甲醇/乙酸乙酯1:6)得到化合物2-[2-(N-苄基-苄氧碳酰氨基)乙氧基]-乙基3,4,6-O-三-苄基-2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰氨基-β-D-吡喃甘露糖基醛酸苄酯-(1→3)-4-N-苄氧羰基-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-L-吡喃岩藻糖基-(1→6)-[2,3,4,6,7-五-O-苄基-L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)]-3-O-苄基-2-叔丁氧碳酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(ABCDE-2)(443mg,59.6％).
上述化合物ABCDE-2(165mg,0.066mmol)溶解在3毫升80％乙酸水溶液中，加入Pd/C(20mg,10％Pd)氢气环境下催化加氢，反应液在室温下搅拌16小时，硅藻土过滤，减压条件下冻干后得到化合物2-(2-氨基乙氧基)-乙基2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰氨基-β-D-吡喃甘露糖基醛酸-(1→3)-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-L-吡喃岩藻糖基-(1→6)-[L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)]-2-叔丁氧碳酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(ABCDE-3,76mg,93.6％)。将上述化合物ABCDE-3溶于3毫升PH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，不断搅拌下加入0.5毫升乙腈溶解的3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(39mg,0.032mmol)，反应1小时，混合液冻干，C18硅胶柱纯化，得到白色固体化合物2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰氨基-β-D-吡喃甘露糖基醛酸-(1→3)-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-L-吡喃岩藻糖基-(1→6)-[L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)]-2-叔丁氧碳酰胺基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(ABCDE-4)(30mg,68.8％)。直接将化合物溶解在3毫升三氟乙酸/水(3:1)溶剂中，在室温下反应1小时，除去三氟乙酸后冻干反应液，粗品用C18硅胶柱纯化(100～90％,水/乙腈)得到化合物2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰氨基-β-D-吡喃甘露糖基醛酸-(1→3)-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-乙酰氨基-β-L-吡喃岩藻糖基-(1→6)-[L-甘油-α-D-吡喃甘露庚糖基-(1→4)]-2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(ABCDE-5)(25.4mg,90.8％)(图12)。
1H NMR(400MHz,D2O)δ6.82(s,2H),5.22(d,J＝0.9Hz,1H,H-1E),5.10(d,J＝4.0Hz,1H,H-1A),5.08(d,J＝3.5Hz,1H,H-1B),5.04(s,1H,H-1D),4.57(d,J＝8.4Hz,1H,H-1C),4.39(d,J＝2.9Hz,1H),4.31–4.23(m,1H),4.12–4.08(m,1H),4.03–3.92(m,5H),3.87–3.52(m,25H),3.48(d,J＝5.3Hz,1H),3.31–3.22(m,3H),2.81(s,3H),2.48(t,J＝6.5Hz,2H),2.03(s,3H),1.96(d,J＝3.2Hz,6H),1.87(s,3H),1.40(d,J＝6.6Hz,3H).
实施例12合成带有连接臂的AΒX-α化合物：
2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰氨基-β-D-吡喃甘露糖醛酸-(1→3)-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-乙酰氨基-α-L-吡喃岩藻糖苷(ABC-6α)
使用实施例8相似的制备方法来制备得到白色固体化合物2-(2-β-马来酰亚胺基丙酰胺基乙氧基)乙基2-脱氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2,3-二脱氧-2,3-二-乙酰氨基-β-D-吡喃甘露糖醛酸-(1→3)-4-脱氧-4-甲氨基-2-脱氧-2-乙酰氨基-α-L-吡喃岩藻糖苷(ABC-6α，26.8mg)。1H NMR(400MHz,D2O)δ6.76(s,1H),6.22(d,J＝12.3Hz,1H),5.82(d,J＝12.3Hz,1H),5.01(d,J＝3.9Hz,1H),4.88(s,1H),4.83(d,J＝3.6Hz,1H),4.21(dt,J＝10.2,7.6Hz,3H),3.95(dd,J＝11.3,3.7Hz,1H),3.90–3.83(m,1H),3.76–3.67(m,7H),3.63–3.52(m,7H),3.47(s,1H),3.42–3.36(m,2H),3.31–3.27(m,1H),3.25–3.20(m,1H),2.67(s,1.5H),2.65(s,1.5H),2.41(dt,J＝13.2,6.6Hz,2H),1.95(s,3H),1.93(s,3H),1.89(s,3H),1.80(s,3H),1.26(d,J＝6.3Hz,3H).LC-MS:[M+H]+Calcd 918.4,Found918.4.
实施例13合成牛血清白蛋白(ΒΣA)和破伤风类毒素(TT)糖缀合物
在氮气保护条件下，往二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯(DSP)的二甲基亚砜(DMSO)溶液中，加入含有5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素(TT)和0.93mg/mL乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲液(PBS)中(PH为8.1)。在4℃，培养2小时后，再向体系中加入3.856mg/ml(25mM)二硫代苏糖醇(DTT),继续孵育1小时。反应液经过10kDa(针对BSA)以及30kDa(针对TT)滤膜过滤并与磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)进行对比。埃尔曼比色法监测反应。合成的5mg寡糖溶解在0.5mL的pH为7.4磷酸盐缓冲液(添加乙二胺四乙酸(EDTA)),并将上述已被修饰的蛋白质(含0.5mL,31-44mol巯基)加至反应溶液中。将混合物在4℃培养18小时，所得产品在pH为7磷酸盐缓冲液(PBS)中通过10kDa滤膜过滤。溶液在无菌条件下过滤，并在4-8℃下保存。该产品用碳水化合物与蛋白质结合比例进行表征。
碳水化合物与蛋白质结合如下：
| 糖结合物 | CHO-protein(重量) |
| ABβ-TT | 1/7.5 |
| ABCβ-TT | 1/4.7 |
| ABCDE-TT | 1/6 |
实施例14合成寡糖-牛血清白蛋白缀合物对抗全细胞百日咳血清的特异性
用100UO全细胞百日咳疫苗在300μL完全氟氏佐剂中皮下注射免疫新西兰兔。间隔2周后，第二剂用100UO全细胞百日咳疫苗在300μL的不完全氟氏佐剂中进行免疫。分别在第35天和第42天抽取血清。
用32UO全细胞百日咳在100μL完全弗氏佐剂中皮下免疫雌性Balb/c小鼠。再用32UO全细胞百日咳疫苗在100μL不完全弗氏佐剂中，进行第二和第三次免疫，时间间隔都为2周。在第35和42天提取血清。
ELISA板分别用用一种下列缀合物包被进行免疫原性研究：ABα-牛血清白蛋白(BSA)，ABβ-牛血清白蛋白(BSA)，ABCα-牛血清白蛋白(BSA)，ABCβ-牛血清白蛋白(BSA)，D(DD)E-牛血清白蛋白(BSA)，D(LD)E-牛血清白蛋白(BSA)和ABCDE-牛血清白蛋白(BSA)。全细胞百日咳(1个乳色单位)和脂寡糖(LOS)(10μg/mL)用作对照。将牛血清白蛋白(BSA)的缀合物溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中得到1μg/ml(基于碳水化合物，CHO)溶液并在37℃下培养过夜。之后，将板用0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液洗涤四次。用1％脱脂乳的磷酸盐缓冲液(PBS)在37℃温育30分钟封闭平板。将孔洗涤四次，并加入用含有0.3％吐温20,10mM EDTA和1％脱脂乳的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液按照1：100或1：400比例稀释后的血清样品(小鼠或兔子)，在室温下孵育90分钟。然后将孔冲洗四次，并向每个孔中加入相应的抗免疫球蛋白G(小鼠或兔)全分子辣根过氧化物酶偶合物。在室温下孵育90分钟后再次洗涤平板，并加入TMB/H2O2底物溶液的柠檬酸盐缓冲液(pH＝5)。在避光20分钟后，用2.5M H2SO4终止反应，并在450nm处读取平板。(图13和图14)。
抑制性研究试验，分别用不同量的末端单糖A、双糖AB或三糖ABC(100-0.195μg/ml的系列二倍稀释液)与抗全细胞百日咳兔血清在37℃单独培养1小时。用末端三糖ABC或五糖ABCDE包被平板，并按照前面所述的酶联免疫吸附测定步骤进行(图15)。
免疫印迹：将以下缀合物0.5μg(基于CHO)置于硝酸纤维素膜上：ABα-牛血清白蛋白(BSA)，ABβ-牛血清白蛋白(BSA)，ABCα-牛血清白蛋白(BSA)，ABCβ-牛血清白蛋白(BSA)，D(DD)E-牛血清白蛋白(BSA)和ABCDE-牛血清白蛋白(BSA)。全细胞百日咳(5个乳光单位)用作阳性对照，牛血清白蛋白(BSA)(1μg)用作阴性对照。用含1％脱脂乳的磷酸盐缓冲液(PBS)封闭膜，在37℃下孵育30分钟并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤4次。之后，将膜在37℃下与用含有0.3％吐温20的磷酸盐缓冲(PBS)溶液按1/100稀释的抗ABβ-TT和抗ABCβ-TT兔血清孵育1小时。再次用PBS-吐温溶液洗涤膜。使用抗兔免疫球蛋白G全分子的辣根过氧化物酶缀合物和二氨基联苯胺作为底物来形成印迹(图16)。
实施例15ABβ-破伤风类毒素(TT),ABCβ-破伤风类毒素(TT)和ABCDE-破伤风类毒素(TT)的免疫原性：
用一种下列疫苗皮下接种免疫新西兰兔：在氟式完全佐剂中的ABβ-破伤风类毒素(TT)、ABCβ-破伤风类毒素(TT)、全细胞百日咳疫苗和50μg脂多糖。间隔2周后，使用在氟氏不完全佐剂中的相同的疫苗进行第二次剂量免疫。在第35天和第42天提取血清。
用一种下列疫苗皮下接种免疫C57BL/C小鼠：ABβ-破伤风类毒素(TT)、ABCβ-破伤风类毒素(TT)、ABCDE-破伤风类毒素(TT)和全细胞百日咳疫苗。用2.5μg/100μl的磷酸盐缓冲液(PBS)给动物注射3次(每次间隔2周)。在42天时提取血清。
如实施例14所示进行酶联免疫吸附试验。板上涂有牛血清白蛋白(BSA)偶合物。使用全细胞百日咳(1个乳光单位)和脂寡糖(10μg/ml)作为对照(图17A、B和C)。
实施例16百日咳全细胞疫苗增强的抗体持续性和记忆诱导
在实施例14中所述的酶联免疫吸附试验(ELISA)在几个时间点来分析用ABβ-破伤风类毒素(TT)、ABCβ-破伤风类毒素(TT)或PBS(安慰剂)免疫的小鼠的抗寡糖(AB或ABC)免疫球蛋白(IgG)响应。在第一次计划免疫后的近一年，这些动物接受了一剂1OU的全细胞百日咳疫苗的免疫增强。通过实施例14中所述的酶联免疫吸附试验(ELISA)在免疫增强15天后分析对ABβ或ABCβ的G免疫球蛋白(IgG)响应(图18)。
实施例17抗缀合物血清对鼻腔定植的抑制：
将几组C57BL/C老鼠经鼻内接种由含有105-106个细菌菌落总数(CFU)的百日咳杆菌混悬液和实施例15中获得的抗ABβ-破伤风类毒素(TT)或失活全细胞(WP)兔血清形成的混合物(1:1)。以同一家兔免疫前血清与细菌的混合液作为对照。所有混合物在注入前在37℃培养1小时。
小鼠接种18-24小时后进行安乐死，无菌取出鼻腔，用1％的卡沙胺酸肉汤匀浆。在Bordet Gengou琼脂培养基上涂上适宜的稀释液。用细菌菌落总数的log10表示结果(图19)。
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Claims (17)
1.用简式ABXSY表示的化合物，其中AB为源自于合成的N-乙酰基-氨基葡萄糖α-(1-4)-2,3-二-N-乙酰氨基-2,3-二脱氧-甘露糖醛酸β-；X可以是基团CH2,NH,O,S,PH,Se或者SiH2；S是一种拥有将ABX与大分子Y分开功能的分子，Y是一个具有载体蛋白功能的分子：
2.用简式ABCXSY表示的化合物，其中ABC为N-乙酰-氨基葡萄糖α-(1-4)-2,3-二-N-乙酰氨基-2,3-二脱氧-甘露糖醛酸-β-(1-3)-2-乙酰氨基-4-甲胺基-3,4,6-三-脱氧-L-半乳糖β-,α-或二者的混合物；X可以是基团CH2,NH,O,S,PH,Se或者SiH2；S是一种拥有将ABCX与大分子Y分开功能的分子，Y是一个具有载体蛋白功能的分子：
3.用简式ABCDEXSY表示的化合物，其中ABCDE为合成来源的N-乙酰-氨基葡萄糖α-(1-4)-2，3-二-N-乙酰氨基-2,3-二脱氧-甘露糖醛酸β-(1-3)-2-乙酰氨基-4-甲胺基-2,4,6-三脱氧-L-半乳糖-β-(1-6)-[L-甘油基-D-甘露庚糖α-(1-4)-氨基葡萄糖]β-，X可以是基团CH2,NH,O,S,PH,Se或者SiH2；S是一种拥有将ABCDEX与大分子Y分开功能的分子，Y是一个具有载体蛋白功能的分子：
4.根据权利要求1-3中任一所述的化合物，其中所述X为特指氧原子，通过α构型、β构型或混合构型使之与B、C或D连接。
5.根据权利要求1-4中任一所述的化合物，其中S作为能将大分子Y与前面化合物分开的间隔臂分子，其组成为分散插入0-5个杂原子和/或一个芳环的任何脂肪族链,在与大分子Y连接的一端具有NH2,COOR,CHO,SH或任何它们的前体官能团。
6.根据权利要求1-5中任一所述的化合物，其中大分子Y可以是蛋白质、肽类、脂类、聚合物、树状大分子、病毒颗粒和病毒样颗粒中的任何一种或它们的组合物，以保证增进针对AB、ABC或ABCED的免疫反应。
7.权利要求1所述分子ABXSY的前体化合物ABXS的制备方法，其特征在于在简式表示为AB-2的分子结构中引入了间隔物S，并以作为乙酰氨基前体的叠氮基以及苄基作为保护基团：
8.化合物AB-2的制备方法，采用了简式中所示的合成前体A10和B5β：
9.权利要求2所述分子ABCXSY的前体化合物ABCXS的制备方法，其特征在于在公式表示为ABC-2的分子结构中引入了间隔物S，并以作为乙酰氨基前体的叠氮基、苄基和苄氧羰基共同作为保护基团：
10.采用简式AB-2和C-7所示合成前体制备化合物ABC-2的制备方法：
11.权利要求3所述的化合物ABCEDXSY的前体化合物ABCEDXS的制备方法，使用了简式为ABC-2和DE-6的前体化合物制备得到：
12.根据权利要求1-5中任一所述化合物，其中所述大分子Y选自于破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197或百日咳类毒素。
13.一种药物组合物，其包含至少一种根据权利要求12所述的化合物，所用量能有效刺激抗原特异的免疫应答反应。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，外加一种佐剂。
15.权利要求13和权利要求14所述的药物组合物作为抵抗由百日咳博德特氏菌引起感染的疫苗。
16.权利要求13和权利要求14所述的药物组合物与任何已知的全细胞百日咳博德特氏杆菌疫苗结合，以及与一种或多种抗原结合，所述抗原含有：白喉类毒素、破伤风类毒素、乙型肝炎病毒表面抗原、b型流感嗜血杆菌与聚核糖醇磷酸酯(PRP)的结合物，和1型、2型、3型灭活脊髓灰质炎病毒。
17.权利要求13和权利要求14所述的药物组合物与已知的无细胞百日咳博德特氏杆菌疫苗结合，以及与一种或多种抗原结合，所述抗原含有：白喉类毒素、破伤风类毒素、乙型肝炎病毒表面抗原、b型流感嗜血杆菌与聚核糖醇磷酸酯(PRP)的结合物，和1型、2型、3型灭活脊髓灰质炎病毒。
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