JP5144613B2 - ワクチンとしてまたは結合体ワクチンとしてタンパク質に連結して使用するための細菌莢膜多糖の抽出および単離法 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、グラム陰性およびグラム陽性細菌両方から、莢膜多糖(capsular polysaccharides:CPS)を抽出し、そして単離するための方法に関する。抽出された多糖は、多糖を単独で含むまたはタンパク質と結合している(conjugated)ワクチンを産生するのに有用である。
連鎖球菌属(Streptococcus)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、腸球菌属(Enterococcus)、バチルス属(Bacillus)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、リステリア属(Listeria)、エリジペロトリックス属(Erysipelothrix)、およびクロストリジウム属(Clostridium)などのグラム陽性菌、ならびにヘモフィルス属(Haemophilus)、赤痢菌属(Shigella)、コレラ菌(Vibro cholerae)、ナイセリア属(Neisseria)および特定の種類の大腸菌(Escherichia coli)などのグラム陰性細菌により引き起こされる細菌感染は、世界中に深刻な罹患率(morbidity)を引き起こしている。これは、細菌が示す抗生物質に対する耐性が明らかになりつつあることと合わせ、細菌ワクチン開発の必要性を示唆する。例えば、連鎖球菌属は、グラム陽性細菌の大きくそして多様な属であり、抗原性およびその細胞壁多糖の構造に基づき、いくつかの群に分けられてきている(26、27)。これらの群のうち2つは、深刻なヒト感染と関連付けられてきている。A群連鎖球菌は、「連鎖球菌咽頭炎(strep throat)」、リウマチ熱、連鎖球菌膿痂疹(impetigo)、および敗血症を含む、多様な感染性障害を引き起こす。
本発明は、グラム陰性およびグラム陽性細菌両方の細胞構成要素から、莢膜多糖(CPS)を抽出するための方法を提供する。CPSは、本発明にしたがい、細菌上清または細菌細胞のどちらからでも、CPSを他の細胞構成要素に連結している塩基不安定性結合の加水分解により、抽出することが可能である。本発明により提供される抽出法の利点は、抽出されるCPSが大部分損なわれていない(intact)ことである。
本発明は、グラム陰性およびグラム陽性細菌から、CPSを細胞構成要素に付着させる塩基不安定性結合の塩基加水分解を用いることにより、莢膜多糖を得るための方法を提供する。本発明の方法は、グラム陽性およびグラム陰性細菌両方のCPSを、細菌または細菌断片を含む溶液を塩基と接触させることにより、抽出することを含む。CPSをその後、多様な方法により塩基から回収してもよい。本発明にしたがい使用するための限定されないグラム陽性細菌の例は、連鎖球菌属、ブドウ球菌属、腸球菌属、バチルス属、コリネバクテリウム属、リステリア属、エリジペロトリックス属、およびクロストリジウム属である。特に、連鎖球菌の使用がより好ましく、そしてB群連鎖球菌Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VIIおよびVIII型の使用が最も好ましい。本発明に使用するための限定されないグラム陰性細菌の例には、インフルエンザ菌、髄膜炎菌および大腸菌が含まれる。特に、インフルエンザ菌b型、髄膜炎菌B、C、YおよびW135型ならびに大腸菌K1の使用がより好ましい。
A. 莢膜多糖の調製
細菌多糖の細胞構成要素からの単離および精製は、本発明にしたがい、4つの段階:塩基抽出、クロマトグラフィー分離、N−アシル化、およびクロマトグラフィー精製で達成してもよい。
CPSを抽出するための材料は、ホモジナイズした細菌細胞からの濃縮細菌上清または馴化培地(conditioned medium)由来であってもよい。細胞を、遠心分離または微量濾過により分離してもよく、そして上清(supernate)は典型的には10−15倍に濃縮される。好ましくは、細菌上清および馴化培地は、CPSが約5−20mg/mlの濃度で存在するよう濃縮される。さらに、沈澱細胞から直接抽出してもよい。
濃縮細菌上清または馴化培地を、多様な塩基と接触させ、CPSを抽出してもよい。あるいは、単離細菌細胞をさらに、多様な塩基と接触させ、CPSを抽出してもよい。本発明にしたがい用いてもよい塩基の、限定されない例は、NaOH、KOH、LiOH、NaHCO3、Na2CO3、K2CO3、KCN、Et3N、NH3、H2N2H2、NaH、NaOMe、NaOEt、またはKOtBuである。NaOH、KOH、LiOH、NaH、NaOMeまたはKOtBuなどの塩基は、0.5 N−5.0 Nの範囲で用いるのが最も効果的である。NaHCO3、Na2CO3、K2CO3およびKCNなどの塩基は、溶解度が許す限り高い濃度で用いてもよい。Et3Nなどの有機塩基は、加水分解を達成する水またはアルコールなどの剤が存在する限り、中程度の濃度ないし高濃度(50−100%)で用いてもよい。NH3、H2N2H2などの塩基は、100%を含め、ほとんどいかなる濃度で使用してもよい。水、アルコール(好ましくはC1−C4)、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドまたはこれらの混合物などの溶媒および他の有機溶媒を使用してもよい。水を含む塩基抽出溶液が最も好ましい。
塩基抽出試薬中に存在する抽出CPSを、クロマトグラフィーにより、細胞構成要素から生じた不純物から分離してもよい。クロマトグラフィー分離法の限定されない例は、イオン交換(陽イオン性または陰イオン性)、親水性相互作用、疎水性相互作用またはゲル浸透クロマトグラフィーである。好ましい方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)である。より好ましいのは、フェニル・セファロース上の疎水性相互作用クロマトグラフィーであり、該クロマトグラフィーは、塩基抽出物から高分子量のUV活性がある(uv−active)汚染物質のほとんどを除去するであろう。莢膜多糖は、高pH(pH 10ないしpH 8)高塩(2 Nないし1 N)溶出の始めに溶出するであろうが、より疎水性であるタンパク質および核酸は保持されるであろう。疎水性相互作用クロマトグラフィー法の限定されない例は、アルキルアガロースまたはセファロース樹脂であり、フェニル・セファロースHP(Pharmacia Biotech;ニュージャージー州ピスカタウェイ)が好ましい樹脂である。カラムは、0.5−5.0 N NaHCO3であらかじめ平衡化し、そして0.5−50 ml/分の流速で1カラム体積で溶出してもよい。約1カラム体積のNaHCO3で溶出した後、水約1ないし10カラム体積を用い、カラムから溶出してもよい。分画をその後、当業者に知られる手段により、多糖に関しアッセイしてもよい。シアル酸含有多糖を検出するための好ましい方法は、実施例に記載される微量規模オルシノールアッセイである。
塩基性条件下での抽出莢膜多糖の分離は、抽出中、そうでなければ塩基安定性である莢膜多糖の、シアル酸およびアミノ糖残基からN−アセチル基を除去することにより促進される。
再アセチル化CPSの精製を、その後達成し、抗原、およびワクチンなどの免疫学的試薬を調製するのに使用するCPSを得てもよい。クロマトグラフィー精製の多様な例が、本発明で使用するのに適している。たとえば、イオン交換(陽イオン性または陰イオン性)、疎水性相互作用、親水性相互作用、またはゲル浸透クロマトグラフィーはすべて、再アセチル化CPSの反応構成要素からの分離を達成するのに用いてもよい。好ましい方法は、スーパーデックス(Superdex)(アガロースおよびデキストランを架橋したもの)上のゲル浸透クロマトグラフィーの使用であり、該クロマトグラフィーは、残渣汚染物質を除去し、そして精製CPSを生じるであろう。特に好ましいのは、1,000−100,000のデキストランに関する分画範囲(MW)を有するスーパーデックス200 PGである。PBSを溶離液として用いた流速は、好ましくは約0.1ないし10 ml/分である。
B. 抽出CPSの構造
本発明の方法により抽出された莢膜多糖は、先行技術の方法により抽出されたCPSに比べ、特有の構造を有する。該CPSは、莢膜多糖をポリラムノースに連結しているホスホジエステル結合の塩基触媒加水分解により、そしてポリラムノースをペプチドグリカンに連結しているホスホジエステル結合の塩基触媒加水分解により、得られる(図11を参照されたい)。細菌細胞壁構造の代替モデルにしたがい、同じく特有の構造を持つCPSが、莢膜多糖をペプチドグリカンに連結しているホスホジエステル結合の塩基触媒加水分解により、そしてポリラムノースをペプチドグリカンに連結しているホスホジエステル結合の塩基触媒加水分解により、得られる(図12を参照されたい)。先行技術の方法は、異なる結合を切断する酵素を使用する。例えば、N−アセチルグルコサミン/N−アセチルムラミン酸ポリマーを加水分解するのにリゾチームが用いられてきている。N−アセチルグルコサミン/N−アセチルムラミン酸ポリマーおよびペプチド部分の間の連結を加水分解するのにミュータノリシンが用いられてきており、そして細菌細胞壁のペプチド部分を加水分解するのにリソスタフィンが用いられてきている。
C. ワクチン
本発明はまた、ワクチン調製にも向けられる。本発明にしたがい、上述の単離CPSを抗原として用い、CPSに対し反応性である、そしてしたがって該CPSが単離された生物に対し反応性である抗体を生成してもよい。
上述のCPS抽出および単離のための技術は、豊富な量の本発明のCPSを提供する。これは、該CPSに対し反応性である抗体生成を容易にする。
本発明のCPSを、単独で、あるいはポリペプチドまたはタンパク質などの別の免疫原性分子に結合して用い、個体において、多様なグラム陰性およびグラム陽性細菌に対する抗体反応を引き出してもよい。CPSのポリペプチドへの結合は、典型的にはT細胞独立性であるCPSに対する免疫応答を、T細胞依存性の応答に変換する。したがって、ポリペプチドの大きさは、好ましくは、T細胞独立性からT細胞依存性の応答への変換を引き起こすのに十分なものである。第二の免疫原を提供する目的には、より小さいポリペプチドを使用するのが有用である可能性がある。
本発明の薬剤組成物は、CPSまたは結合体分子を含んでもよく、CPSおよび薬理学的に許容しうるキャリアー、例えば生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたはそれらに匹敵するものを含む。別の態様において、該薬剤組成物は、例えばペプチドなどの別の免疫原性部分、または本発明のCPSの1つにより引き出される抗体を含む組成物を含む。該組成物はまた、レシピエントの免疫学的応答を亢進するため、アジュバントも含んでもよい。こうしたアジュバントは、アルミニウムに基づく、例えばミョウバン、または長鎖アルキルアジュバント、例えばステアリルチロシンであってもよい(9/17/90に提出された、米国特許出願第583,372号;欧州特許EP 0 549 617 B1;Moloneyら、米国特許第4,258,029号を参照されたい)。また、Jenningsら、米国特許第5,683,699号およびPaolettiら,J. Infectious Diseases 1997;175:1237−9も参照されたい。これらの薬剤組成物は、ワクチンとして特に有用である。
D. 診断用キット
別の態様において、本発明のCPSあるいはその誘導体または断片を用い、肺剥離(pneumolysis)毒素などの毒素を含まないが、なおグラム陰性またはグラム陽性細菌に対して向けられる抗体の存在を示すことが可能である、より安全な診断用キットを産生することが可能である。こうした抗体の存在は、該病原体に以前曝露されたことを示し、そして感染に耐性である可能性がある個体を予測することが可能である。グラム陰性またはグラム陽性細菌に対して向けられる抗体を含む試料と、修飾CPSあるいは誘導体または断片が混合された際、抗体反応を検出するため、診断用キットは、少なくとも1つの本発明のCPSあるいはその誘導体または断片および適切な試薬を含んでもよい。抗体反応は、当業に記載されるいかなる方法により同定してもよく、限定されるわけではないが、ELISAアッセイを含む。こうした知識は重要であり、そして該知識により不必要なワクチン接種を避けることが可能である。
Ib型B群連鎖球菌株H36b(ATCC12401)はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(Rockville、MD)から入手した。用いた他の株、090(Ia型)、18RS21(II型)、M781(III型)、及び1169−NTI(V型)は、ハーバード医学校(Harvard Medical School)の D.L. Kasper のご厚意により提供を受けた。髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)B、C、Y及びW135型はFDA、CBERの Carl Frasch のご厚意により提供を受け、大腸菌(Escherichia coli)KlはFDA、CBERの Willie Vann のご厚意により提供を受けた。
B.莢膜多糖を生成するための一般的な方法
1.抽出及び疎水性相互作用クロマトグラフィー
ペレットを、グラム湿潤重量の細胞ペーストを1容積として用いて4容積の1N NaOHに懸濁させた。この懸濁液を37℃で一晩インキュベートした。Sorvall GSA ローターにおいて12,000rpmで30分間遠心することにより細胞残滓を除去した。濃HCl(J.T. Baker、Phillipsburg、NJ)で中和した後、上清を Pellicon 10,000 NMWL 膜を用いて2N NaHCO3(pH9.6)に対してダイアフィルトレート(diafiltered)した。次に、得られたリテンテート(retentate)を、Phenyl Sepharose HP(Pharmacia Biotech;Piscataway、NJ)を充填し、2N NaHCO3で予め平衡化した、下記 Pharmacia クロマトグラフィーシステムを用いる Pharmacia XK 26/60 カラムにかけた。このカラムをまず1カラム容積の2N NaHCO3を用いて、次に2カラム容積の水を用いて4ml/分で溶出した。画分を多糖について検定し(下記参照)、莢膜多糖を含むものをプールした。
多糖を前に記述される抽出条件に晒すと多糖からN−アセチル基が放出されるため、無水酢酸(Aldrich Chemical Co.、Milwaukee、WI)をプールした画分に最終濃度0.8Mになるまで滴下により添加することによって多糖を再N−アセチル化した。この反応混合物を室温で1時間攪拌し、10N NaOHを添加することでpH9に維持した。次に、反応のpHを13に上昇させ、反応をさらに30分間継続した。再N−アセチル化莢膜多糖を含むその溶液を Minitan カセットシステム(10,000 NMWL 膜、Millipore)を用いて水に対してダイアフィルトレートし、リテンテートを凍結乾燥した。その凍結乾燥体をPBS(pH7.4)に溶解し、Superdex 200 PG でのゲル浸透クロマトグラフィーによって精製した(下記参照)。莢膜多糖を含む画分をプールし、水に対してダイアフィルトレートし(前記参照)、リテンテートを凍結乾燥して精製CPSを得た。
分析用ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)は、Pharmacia UV-1 紫外線検出器(280nmフィルター装備)、Waters 社(Milford、MA) R401 示差屈折計、及び Pharmacia Superose 6 HR 10/30 (高度に架橋したビーズ化アガロース)カラムを備える Pharmacia FPLC システムで行った。カラムはPBS、pH7.4を用いて0.5ml/分で溶出した。デキストラン(分子量約2×106;Sigma Chem Co.、St. Louis、MO)を空隙容積(Vo)を決定するのに用い、ナトリウムアジドを総床容積(Vt)を決定するのに用いた。相対溶出容積はKav=(Ve−Vo)/(Vt−Vo)で表し、ここでVeはRIプロフィールからの溶出容積である。分離用GPCは、上記検出器、P-50 ポンプ、FRAC-100 画分コレクター、GP-250 Plus コントローラー、及び Superdex 200 PG を充填した XK 26/100 カラム(Pharmacia)を含む Pharmacia システムで行った。カラムはPBSを用いて1ml/分で溶出した。
C.多糖の分析
1.モル質量の決定
多糖の絶対モル質量を、インライン多角度レーザー光散乱光度計及び示差屈折計による検出を備える分析用GPC(GPC−MALLS/RI)によって決定した。この方法は、Jasco PU-980 HPLC ポンプ(Easton、MD)、Rheodyne モデル7125注入弁(Cotati、CA)、及びPBSで平衡化した Superose 6 HR 10/30 カラムからなる液体クロマトグラフィーシステムを用いて、0.5ml/mlの流速で行った。移動相は超高純度水(Stephens Scientific、Riverdale、NJ)中に調製し、Millipore GV 型0.22mm膜を備える25mm径インラインフィルター(Millipore)を通して濾過した。多糖試料(1−2mg)を移動相中に10mg/mlの濃度で溶解し、注入する前に得られた溶液を微量遠心機において14,000rpmで2ないし3分間遠心して粒体を除去した。カラム流出液を、Hewlett-Packard モデル 1047A 示差屈折計に連結させたインライン miniDAWN 固定三角度レーザー光散乱光度計(Wyatt Technology Corp.、Santa Barbara、CA)で直接分析した。屈折計のアナログ信号出力は補助入力チャンネルを介して miniDAWN に連結した。光散乱データを得、Wyatt's ASTRette 及び EASI ソフトウェアで処理した。ピーク面積を Wyatt ソフトウェアにより、ピークの全範囲にわたる200−300の台形状区画、すなわち"スライス"の面積の合計として算出した。このようにして得られた面積から、所定のピークにおいて溶出した多糖の重量平均及び数平均モル質量(それぞれMw及びMn)を算出した。比屈折率増分(dn/dc)は、オンライン HP 1047A 屈折計を用いて、全ての多糖について0.140ml/gであると決定された。この値は他の多糖について従来得られている値(7、8、38)に匹敵した。
D2O(Aldrich)中の多糖試料(4−5mg/ml)の一次元1H NMRスペクトルを、Bruker Instruments AMX 500 分光計(Billerica、MA)を用いて500MHzで記録した。スペクトルデータは50℃で得、化学シフトはD2O中の外部2,2,3,3−テトラジューテリオ−3−(トリメチルシリル)プロピオネート(Aldrich)を参照した。
分離用カラム流出液及び精製多糖中の多糖含量を、シアル酸についての Reuter 及び Schauer (35)のマイクロスケール・オルシノール検定を修正することによって決定した。簡単に述べると、1−1.5μgのNeuAc標準又は300μg/mlまでの精製莢膜多糖を含む試料又は対照100μlを1.5ml微量遠心管中のオルシノール試薬(35)100μlに添加した。試料を十分混合し、沸騰水浴中で15分間加熱した。試料を氷水中で5分間冷却した後、500μlのイソアミルアルコール(Fluka Chemical Co.、Ronkonkoma、NY)を各々の試料に添加した。その試料を完全に混合し、微量遠心機において3000rpmで2−3分間遠心した。この手順を繰り返し、アルコールへの発色団の完全な抽出を確実なものとした。各試料のアルコール相から200μlを96ウェル平底低結合性ポリスチレンマイクロタイタープレート(Coming Costar Corp.、Cambridge、MA)に移し、Molecular Devices Emax マイクロプレート・リーダー(Menlo Park、CA)において560nmで読み取った。最終多糖調製品の純度はシアル酸含量から以下の式量を用いて導き出した;末端NeuAc残基について314.3g/モル;Ia、Ib、又はIII型CPSの反復単位について1004g/モル;II又はV型CPSの反復単位について1328g/モル。
D.収量
様々なB群連鎖球菌血清型から得られた莢膜多糖の収量を表1に示す。全ての血清型について、細胞ペレットから精製された多糖は培養上清から精製されたものを上回り、その範囲はII型についての4倍高い収量からIb型についての60倍までであった。比較のため、細胞からの収量の他に上清からの収量を培養のリットル当たりの多糖のミリグラム(mg/L)として表1に示す。したがって、14リットルの発酵を考えたとき、細胞からの総収量はIa型についての1.1gからII型についての0.6gまでの範囲をとり、これに対して上清からの総収量はII型についての150mgからIb型についての14mgまでの範囲をとっていた。III型の発酵からの細胞及び上清を一緒に処理したとき、その収量、合計63mg/L、すなわち0.9gは細胞ペレット単独から得られるものに類似していた。研究したB群連鎖球菌株の間での細胞に由来する莢膜多糖の分離収量対上清に由来するものの比における変動は、血清型の間での、本発明の成長条件下で莢膜多糖を放出する異なる傾向を示唆するものである。この手順によって精製した細胞関連莢膜多糖の量は、Hunoistein ら(39)によって報告されるように、(莢膜多糖のマーカーとして用いられる)細胞結合シアル酸のレベルから推定し得る、Ia、III、IV、V、及びVI型のB群連鎖球菌株のバッチ発酵から入手可能であることが見出されている量にほぼ等しい。より強力な抽出条件(例えば、より強い塩基、より高い温度、又は抽出混合物の攪拌)により細胞結合莢膜多糖の収量が改善されることが期待される。
A.精製多糖の分析
研究したB群連鎖球菌血清型の各々について、両源からの多糖調製品の一次元1H NMR分光法により、それぞれの型の多糖について従来公開されているスペクトルデータ(41、44)とのそれらの同一性が確認された。さらに、これらの調製品全てのNMRスペクトルデータは非常に低いレベルの汚染を示した。5つのB群連鎖球菌多糖の代表的なNMRスペクトルを図1−5に示す。260nmでの直接UV光度測定による検出で核酸レベルは1質量%を超えることがなく、これに対して Bradford 法(9)による検定でタンパク質はいかなる多糖調製品においてもこの検定の検出下限(1μg/ml)より上で検出することができなかった。修正マイクロスケール・オルシノール検定(35)によって推定されるシアル酸含量から算出される多糖の純度は、全て約100%であった。したがって、上述の手順によって得られる全ての多糖調製品について、スペクトル及び光度測定データはタンパク質又は核酸による汚染が最小に留まる非常に純粋な莢膜多糖と一致する。
B.多糖の分子サイズ
RI検出GPCプロフィールのピーク最大から得た、Superose 6 での精製多糖の(KAVとしての)相対溶出容積を表2に示す。
A.競合阻害ELISA
マイクロタイタープレート(NUNC Polysorp)を、PBS(50nMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH=7.4)で希釈したGBSPIa−HSA、GBSPIb−HSA、GBSPII−HSA、GBSPIII−HSA、又はGBSPV−HSA(各々のウェルに対して100μL中100ngの多糖)のいずれかを用いて37℃で1時間受動的にコートした。これらのプレートをPBS+0.05% Tween20(PBS−Tween、pH=7.4)で洗浄した後、150μL/ウェルのPBS+0.1%ウシ血清アルブミンでブロックした。後コートの後、プレートを再度洗浄して用いるまで4℃で保存した。
B.結果
特異的GBS抗血清Ia、Ib、II、III、Vの各々の、それらの相同莢膜PS抗原での結合阻害曲線をそれぞれ図5−10に表す。これらの曲線によって立証されるように、培養上清から抽出されたものであろうとブロスから抽出されたものであろうと、各々のPS抗原は同様の阻害特性を有し、これらはそれらの抗原的な等価性を示す。したがって、これらの莢膜多糖の生成に用いられる手順はそれらの抗原性に影響を与えない。
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Claims (18)
- グラム陰性およびグラム陽性細菌の細胞構成要素から莢膜多糖を精製する方法であって、
単離された細菌細胞の抽出液、ホモジナイズした細菌細胞からの濃縮細菌上清、馴化培地、または細胞ペレットを提供すること、
前記単離された細菌細胞の抽出液、ホモジナイズした細菌細胞からの濃縮細菌上清、馴化培地、または細胞ペレットをNaOH、KOH、LiOH、NaH、NaOMe、またはKOtBuの塩より選ばれる塩基試薬とpH12〜14で接触させることにより、細胞構成要素から莢膜多糖を抽出すること[ここで、前記細胞構成要素はタンパク質および核酸を含み、そして前記塩は0.5N〜5.0Nで使われ、それにより細菌のDNAおよびRNAが分解される]、そして
タンパク質および核酸を含有する前記細胞構成要素に由来する不純物から抽出された莢膜多糖を分離し、精製された莢膜多糖を回収すること
を含む、前記方法。 - 莢膜多糖上に存在するN−アセチル基の一部が抽出中に加水分解され、その後、精製後に回収された再−N−アセチル化された莢膜多糖が天然の莢膜多糖と交差反応性である抗体の産生を引き出すように再−N−アセチル化される、請求項1の方法。
- 請求項1の方法であって、さらに:
(a)クロマトグラフィーにより、不純物から莢膜多糖を分離し;
(b)段階(a)由来の莢膜多糖をアシル化剤と反応させ;そして
(c)段階(b)由来の莢膜多糖をクロマトグラフィーにより精製する
段階を含む、前記方法。 - pHが12である、請求項1の方法。
- 莢膜多糖が連鎖球菌(Streptococci)属のいずれかの細菌に由来する、請求項1の方法。
- 莢膜多糖がB群連鎖球菌に由来する、請求項1の方法。
- 莢膜多糖がB群連鎖球菌Ia、Ib、II、III、V、VI、およびVIII型に由来する、請求項1の方法。
- 塩基試薬がNaOH、KOHまたはLiOHを含む、請求項3の方法。
- クロマトグラフィーにより分離する段階が、疎水性相互作用クロマトグラフィーである、請求項3の方法。
- アシル化剤が無水酢酸、塩化アセチル、酢酸ペンタフルオロフェニル、または4−酢酸ニトロフェニルである、請求項3の方法。
- クロマトグラフィーにより莢膜多糖を精製する段階が、ゲル浸透クロマトグラフィーである、請求項3の方法。
- 塩基試薬が無機塩基を含み、クロマトグラフィーにより分離する段階が疎水性クロマトグラフィーであり、アシル化試薬が無水酢酸、塩化アセチル、酢酸ペンタフルオロフェニルまたは4−酢酸ニトロフェニルであり、そしてクロマトグラフィーにより莢膜多糖を精製する段階がゲル浸透クロマトグラフィーである、請求項3の方法。
- 塩基試薬がNaOHを含み、クロマトグラフィーにより分離する段階がフェニル・セファロース(Sepharose)(登録商標)を伴い、アシル化試薬が無水酢酸であり、そしてクロマトグラフィーにより莢膜多糖を精製する段階がスーパーデックス(Superdex)(登録商標)を伴う、請求項3の方法。
- 莢膜多糖がナイセリア(Neisseria)属のいずれかの細菌に由来する、請求項1に記載の方法。
- 莢膜多糖が髄膜炎菌(N. meningitidis)C型に由来する、請求項1に記載の方法。
- 分離段階がクロマトグラフィーによる分離である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 精製された多糖をポリペプチドまたはタンパク質に結合させ、それにより多糖結合ワクチンを製造することを更に含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 莢膜多糖中の近接ジオールの酸化切断を介して莢膜多糖に末端アルデヒド基を導入し、そして還元性アミノ化を介して前記末端アルデヒド基をポリペプチドのアミノ基に結合させることによって結合を行う、請求項17に記載の方法。
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