JP5339243B2 - ストレプトコッカス・スイス感染症予防用ワクチン - Google Patents
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Description
S. suis 9334株を製造用寒天培地(ポアメディア羊血液寒天培地/栄研化学)に接種し、37℃で24時間培養する。発育した集落5〜10個を釣菌して製造用液体培地(BRAIN HEART INFUSION PORCINE: 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)に移植し、37℃で18〜24時間静置培養したものを元培養菌液とした。次に、製造用培地(BRAIN HEART INFUSION PORCINE)に元培養菌液を1〜2 vol% の割合で接種し、37℃で18〜24時間静置培養し、菌数が1012.5以上に達したものを本培養菌液とした。
本培養菌液にホルマリン(ホルムアルデヒド)を0.2 vol%加え、37℃、48時間感作した。感作後、菌数を108または1012CFU/mLとなるようPBSで適宜調整し、実施例2に供した。
本培養菌液を冷却遠心分離(12,800G)により集菌し、沈渣を0.01 mol/L NaOH水溶液を用いて本培養菌液量の1/50〜1/100になるように浮遊した。この浮遊液を2〜5℃で1晩撹拌後、冷却遠心(12,800G)して採取した上清を抽出抗原液とした。抽出抗原液に塩酸を加えてpHを7.0に調整後、ホルマリンを0.2vol%の割合で添加し、さらに 37℃で1晩感作後、原液として-20℃の条件下で保存した。原液の蛋白量は800μg/mLであった。高濃度抽出抗原液は、別途、増量した沈渣を0.05 mol/L NaOH水溶液に浮遊し、2〜5℃で2晩撹拌して求めた。各上清の蛋白量をそれぞれ100および4000μg/mLに調整し実施例3に供した。
実施例1で調製した2種の不活化全菌体ワクチンを用いて豚感染防御試験を実施し、その効果を比較した。免疫方法は以下の通りである。約3週齢のSPF豚15頭を3グループに分け、試験群1の5頭には1012CFU/mL の不活化全菌体ワクチンを 1mL 頸部に筋肉注射し、2週間後さらに 1mL を注射した。同様に試験グループ2の豚5頭に108CFU/mL の不活化全菌体ワクチンを各 1mL 2回注射し、残り5頭はコントーロールとした。攻撃試験として、最終免疫2週間後、全頭にS. suis2型病原株を109CFU/0.5mL 静脈注射した。攻撃後の2週間、発熱、跛行の有無を観察し、採血した血中の菌数を測定した。攻撃後14日目に生残した供試豚を剖検し、採材した主要臓器及び関節液から回収された攻撃菌数を測定した。各試験成績は下記の基準で数値化又はスコア化した。結果を表1に示す。 抗原量の異なる両ワクチンは、S. suis感染症の特徴的な臨床症状(発熱、跛行)及び菌血症を軽減させたが、発症を完全に抑えることはできず、両ワクチンのワクチン効果に有意差は認められなかった。
S. suisの不活化全菌体ワクチンの免疫投与数を増やした場合、ワクチン効果が高くなるかを検討した。実施例1で調製した不活化全菌体ワクチン(不活化前生菌数:108 CFU/mL)を2回(2週間隔)または10回(3または4日間隔)免疫投与し、感染防御試験を実施した。攻撃試験及び臨床観察の方法は実施例2と同じである。表2に結果を示す。この結果、投与回数を5倍に増やしてもワクチン効果に有意差が生じないことが明らかになった。以上の結果から、不活化全菌体ワクチンの抗原を増量しても、あるいは投与回数を増やしても、確実に予防効果のあるワクチンは得られないことが示唆された。
実施例1で調製した蛋白量の異なる2種のNaOH抽出抗原ワクチンを用いて、豚感染防御試験を試みた。群5に蛋白量4000μg/mLのNaOH抽出抗原、群6に蛋白量 100μg/mLのNaOH抽出抗原をそれぞれ投与した。投与回数、接種方法、攻撃方法および観察方法は実施例2に準ずる。結果を表3に示す。NaOH抽出抗原のワクチン効果は、不活化全菌体より劣るものの、特徴的な臨床症状(発熱、関節炎による跛行)及び菌血症を軽減させていた。また、抗原量の多寡による有意差は認められなかった。
実施例1で調製した蛋白量 100μg/mL のNaOH抽出抗原ワクチンを用いて、投与回数とワクチン効果の関係を検討した。投与方法、攻撃方法および観察方法は、実施例3に準ずる。結果は、表4に示したように、投与回数を5倍にしても、ワクチン効果に有意差は認められなかった。
以上、実施例2〜5により、S. suisの不活化全菌体抗原においてもNaOH抽出抗原においても単味では、予防効果のある実用的なワクチンが得られないことが明らかになった。
実施例1で調製した不活化抗原原液とNaOH抽出抗原原液を用いて、不活化全菌体とNaOH抽出抗原との混合ワクチンを調製した。実施例2,4の結果から、どちらも抗原量とワクチン効果に有意差のないことが示めされたため、不活化抗原の抗原量は 108CFU/mL また抽出抗原の抗原量は蛋白濃度で100μg/mL とした。
実施例6で調製した混合ワクチンを、実施例2の全菌体抗原単味及び実施例4のNaOH抽出抗原単味と共にそれぞれ5頭のSPF豚へ2週間隔2回投与し、ワクチン効果を比較した。免疫材料は、実施例6で調製した混合ワクチンを群9に、実施例1で調製した不活化全菌体抗原(108CFU/mL)を群10に、実施例1で調製したNaOH抽出抗原(蛋白量 100μg/mL)を群11にそれぞれ使用した。攻撃方法及び観察方法は、実施例2〜5と同じである。結果を表5に示す。その結果、本発明のワクチンは、特徴的な臨床症状である発熱を予防し、関節炎による跛行を軽減させること及び菌血症を予防できることが明らかになった。
Claims (6)
- 血清型2型の病原性ストレプトコッカス・スイスの不活化全菌体及び血清型2型の病原性ストレプトコッカス・スイス菌体からアルカリ抽出した抗原を含むことを特徴とするストレプトコッカス・スイス感染症予防用ワクチン。
- 不活化がホルマリンによることを特徴とする請求項1に記載のワクチン。
- アルカリ抽出が水酸化ナトリウム抽出であることを特徴とする請求項1〜2のいずれか1項に記載のワクチン。
- 血清型2型の病原性ストレプトコッカス・スイスの不活化全菌体の不活化前生菌数が108〜1012の範囲から選択されることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載のワクチン。
- 血清型2型の病原性ストレプトコッカス・スイスのアルカリ抽出抗原の蛋白量が少なくとも100μg/mLであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載のワクチン。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のワクチンを豚に投与してストレプトコッカス・スイスの感染症状を軽減または感染を予防する方法。
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