MXPA97004061A - Bacterias productoras de rtx atenuadas vivas de la familia pasteurellaceae - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a bacterias productoras de toxina RTX atenuadas vivas de la familia Pasteurellaceae, de las cuales la atenuación se debe al hecho de que producen toxina RTX en una forma no activada. La invención también se refiere a vacunas para la protección de mamíferos contra infección con bacterias productoras de toxina RTX de la familia Pasteurellaceae y a métodos para al preparación de dichas bacterias atenuadas vivas y vacunas.

Description

BACTERIAS PRODUCTORAS DE RTX ATENUADAS VIVAS DE LA FAMILIA Pasteurellaceae. La presente invención se refiere a bacterias productoras de RTX atenuadas vivas de ia familia Pasteurellaceae, métodos para la producción de dichas bacterias, a vacunas que comprenden dichas bacterias, métodos para la producción de dichas vacunas y métodos para la protección del hombre y animales contra infección con bacterias productoras de RTX virulenta de la familia Pasteurellaceae. La familia de Pasteurellaceae comprende los géneros Haemophilus, Actinobacillus y pasterurella. Las bacterias de esta familia con frecuencia se denom inan bacterias del grupo HAP. Varias especies de estos géneros estrechamente relacionados se conocen por expresar citotoxinas homologas formadoras de poros que dependen del calcio, las así llamadas toxinas TRX (RTX representa repetición en toxina) . Las bacterias productoras de la toxina RTX de esta familia son la causa de una escala completa de enfermedades infecciosas, influenciando tanto al hombre como animales. Las toxinas RTX también son conocidas de otros géneros, no relacionados con el grupo HAP tales como Escherichia y Bordetella. Estas toxinas de RTX en algunos aspectos, se parecen a las toxinas RTX del grupo HAP. Las toxinas RTX han sido revisadas extensamente por Braun y otros (Critical Rev. in Microbiol. 18(2) : 1 15-158 (1991 ) también se han revisado cepas Gram negativas en Welch , R .A. (Molecular Microbiology 5/3: 521-528 (1991)) y en Welch y otros (Inf. Agents and Disease 4: 254-272 (1995)). La presencia de las toxinas de TRX en los miembros productores de RTX de la familia Pasteurellaceae de la bacteria, es la que contribuye ampliamente al carácter patogénico de estas bacterias tanto para hombres como para animales. Todas las toxinas RTX exhiben alguna clase de actividad citotóxica o citolítica. Sin embargo, la especifidad de célula blanco y huésped difieren dependiendo de la toxina y en las diferencias en acilación (McWhinney y otros; J. Bact. 174: 291-297 (1992) y Hackett y otros; J. Biol. Chem. 270: 20250-20253 (1995)). Como resultado de la diferencia en células blanco, se conocen diferentes toxinas de la familia de toxinas de RTX, v.gr., como hemolisina, citolisina o citotoxina. Aunque se conocen muchos miembros productores de RTX del grupo HAP, algunos de ellos son notorios por el daño económico que causan. El Actinobacillus pleuropneumoniae produce toxinas RTX que son citotóxicas/citolíticas para eritrocitos de puercos, caballos, bovinos y humanos, para neutrófilos de conejos y puercos y para macrófagos alveolares de porcinos. (Rosendal y otros; Am. J. Vet.

Res. 49: 1053-1058 (1988), Maudsley J.R., y Kadis S; Can. J.

Microbiol. 32: 801-805 (1996), Frey. J y Nicolet. J; Inf. & Imm. 56:2570-2575 (1988), Bendixon y otros; Inf. & Imm. 33: 673-676 (1981), Kamp, E.M. y van Leengoed, L.A.M.G.; J. Clin. Microbol. 27: 1187-1191 (1989)). La infección de Actinobacillus en puercos, ocasiona pérdidas económicas severas para la industria porcina debido a la moralidad en puercos jóvenes y aumento de peso reducido en animales de mayor edad. La actividad de la toxina RTX de Pasteurella haemolytica, principalmente se dirige contra neutrófilos y monocitos/macrófagos de rumiantes (She en y Wilie; Inf. & Immun. 35, 91-94 (1982), Baluyut y otros; A.J. Vet. Res. 42: 1920-1926 (1981), Himmel y otros; Am. J. Vet. Res. 43: 764-767 (1982)). Las infecciones con Pasteurella causan problemas severos en rumiantes, especialmente ganado y ovejas. Tanto en ovejas como en ganado se observan mastitis y neumonía, mientras que la Fiebre de Embarque causa problemas adicionales en ganado. Las pérdidas económicas debido a infecciones de Pasteurella son altas. También se conocen otras bacterias que no son del grupo HAP que producen toxinas RTX. La hemolisina de £. coli es tóxica para una gran variedad de células, de un gran número de diferentes especies de animales. Lisa eritrocitos de cualquier especie animal dentro de pocos minutos después del contacto. (Cavalieri, S.J. y Snyder, I.S.; Inf. & Imm. 37: 966-974 (1982), Gadeberg y otros; Inf. & Imm. 41: 358-364 (1983), Keane y otros; Am. J. Pathol. 126:305-357 (1987), Bhadki y otros; J. Exp. Med. 169: 737-754 (1989)).

La hemolisina de Bordetella pertussis, también exhibe una gran escala de células huésped . (Shattuck, R. L. y Storm . D. R . ; Biochemistry 24. 632328 (1985), Hewlett y otros, In protein Bacterial Toxins, Rappuoli , R. y otros. (Eds) , Stuttgart, Fisher-Verlag 249-257 ( 1990) . La organ ización genética de los operones implicados en la síntesis, activación y transportación de las toxinas de RTX en bacterias Gram-negativas ha sido revisada recientemente por Coote, J .G. (FEMS Microbiology reviews 88: 137-162 (1992)) . En general el operon RTX contiene cuatro genes: el gen de Toxina actual (A) , u n gen Activador (C) y dos genes (B y D) y E en Bordetella pertussis)) que codifica proteínas implicadas en la secreción de la toxina en el medio circundante. El producto de traslación primario del gen de Toxina (A) es una proteína no tóxica . El papel del gen Activador (C) es de importancia principal en cuanto a que el producto del gen codificado por este gen activa la actividad tóxica de la toxina RTX por modificación post-traslacional .

Los resultados de activan en una modificación estructural de la toxina. En v. gr. , Bordetella pertussis, la modificación post-traslacional en la toxina RTX se ocasiona por la palmitoilación ligada a amida de un residuo de lisina (Hackett y otros; Science 266: 433-435 (1994) . La toxina de RTX de E. coli podría activarse in vitro por transferencia de un grupo acilo graso de proteína portadora de acilo para prohemolisina (Issartel y otros , Nature 351 : 759-761 (1991 )) .

Se sabe (ver v.gr., Coote, J.G.; FEMS Microbiology reviews 88: 137-162 (1991)), que las toxinas RTX son factores de virulencia importantes en bacterias que pertenecen a Pasterurellaceae. Esto se ha mostrado por v.gr., Actinobacillus pleuropneumoniae por Tascon y otros (Mol. Microbiol. 14: 207-216 (1994)) y por Jansen y otros (Inf. & Imm. 63: 27-37 (1995)). Los factores de virulencia son conocidos por ser los blancos principales para incorporación en vacunas. Por lo tanto, se han realizado varios intentos para usar toxinas RTX como vacunas con subunidades. Las toxinas RTX sintetizadas in vivo del grupo HAP. son producidas por sí mismas, en presencia de la proteína Activadora de RTX. Por lo tanto, las toxinas RTX siempre son modificadas post-traslacionalmente en proteínas altamente tóxicas. Dada su alta toxicidad, está claro que las toxinas RTX necesitan destoxificarse antes de que se puedan usar como un componente de vacunas. Las vacunas de subunidades basadas en las toxinas RT,X sintetizadas in vivo de A. pleuropnemoniae que pierden su toxicidad, han sido descritas antes, v.gr., en la Patente Europea EP No 0.354.628, en la cual se describen vacunas subunitarias basadas en hemolisina y una citotoxina de A. pleuropneumoniae y en la Patente Europea EP No 0.453.024, en la cual se describen las vacunas subunitarias de A. pleuropneumoniae basadas en hemolisinas, citotoxinas y otras proteínas de membranas.

Las vacunas de subunidades basadas en toxinas RTX de Pasteurella haemolytica, se han descrito también , v.gr. , en la Patente de E. U .A. No. 5,055, 400, Solicitud de Patente Canadiense CA 2 ,014, 033 y Solicitud de Patente Canadiense CA 2 , 081 , 950. Las toxinas de RTX como subunidades para usarse en vacunas son obtenidas fácilmente del sobrenadante de cultivos bacterianos de las cepas tipo silvestre. Otra forma de obtener la toxina RTX como una subunidad se ha propuesto en la Solicitud de Patente Canadiense CA 2 ,045,950, en la cual se ha descrito la expresión heteróloga de los genes que codifican la proteína RTX de A . pleuropneumoniae en la cepa bacteriana heteróloga de E. col i . Sin embargo, no se han mostrado experimentos con toxinas RTX así obtenidas. U n enfoque comparable para la producción de vacunas en subunidades, se ha propuesto en la Patente Europea EP 0.500.736.

En esta patente, se describe la secuencia del gen de Toxina RTX (A) y un gen activador (C) . También, se describe un sistema de expresión heterólogo para la expresión del gen A de Toxina en presencia o ausencia del gen Activador C. Sin embargo, no se describieron experimentos de vacunación con la subunidad de toxina.

Sin embargo, también se muestran tres desventajas im portantes para todas las vacunas en subunidades de toxina RTX: • se necesitan altas cantidades de material antigénico con el fin de activar adecuadamente el sistema inmune. • usualmente, sólo se activa la inmunidad de células B. • una bacteria patogénica viva tiene muchas moléculas inmunogénicas importantes, tales como Proteínas de Membrana Externa y polisacáridos capsulares, siendo importantes todos para protección. Por lo tanto, con el fin de producir una vacuna en subunidades eficiente, se debe incluir adicionalmente cuantos antígenos inmunogenicamente importantes como sea posible. Después de os problemas obvios mencionados bajo los puntos uno y dos, especialmente el tercero dificulta producir una vacuna en subunidades eficiente. Esto se ilustra, v.gr., por la vacuna en subunidades de A. pleuropneumoniae descrita en la Patente Europea EP No. 0.453.024 mencionada antes, en la cual cuatro subunidades diferentes (tres toxinas RTX y una proteína de membrana externa) se combinan en una vacuna. Está claro, que con el fin de superar las desventajas de las vacunas subunitarias contra infección con Pasteurellaceae, sería altamente conveniente una vacuna atenuada viva. Una vacuna atenuada viva tiene las siguientes ventajas: • puede administrarse en bajas dosis (es autoreplicante) • puede imitar estrechamente la infección de tipo natural/silvestre • provee todos los antígenos inmunológicamente importantes posibles al mismo tiempo.

Sin embargo, a pesar de las ventajas claras, las vacunas vivas basadas en bacterias del grupo HA P que producen una toxina de RTX menos activa no estuvieron disponibles antes de la presente invención. La razón para la falta de vacunas vivas atenuadas se ilustra claramente por la siguiente paradoja: • La primera característica de una cepa de vacuna atenuada viva , es, que no puede producir toxina RTX activa, dado que, como se mencionó antes, es esta toxina RTX la que forma cepas del grupo HAP tan virulento. • Una bacteria atenuada viva, atenuada mediante la incapacidad de expresar toxinas RTX, sin embargo podría carecer per se, del factor de virulencia más importante, es decir, las toxinas RTX y por lo tanto, no iniciará una respuesta inmune contra esta toxina. Como consecuencia , si el (los) gen(es) RTX es (son) suprimidos de las cepas del grupo HAP y dichas cepas atenuadas se usan como una base para una vacuna contra enfermedades causadas por cepas de tipo silvestre virulentas del grupo HAP, solo se logra protección parcial ; uno nunca podría obtener inmunidad protectora contra el factor de virulencia más importante de estas cepas de tipo silvestre, es decir, la toxina RTX. Por lo tanto, las vacunas basadas en bacterias con una supresión de la toxina RTX, posiblemente no puede esperarse que provea protección contra efectos dañinos de la toxina RTX después de la infección con cepas de tipo silvestre.

Las cepas que carecen del operon apxl se produjeron i. a. por Reimer y otros (Microbial Pathog. 18: 197.209 ( 1995)) , . quien suprimió todos los genes que juegan un papel en la síntesis y transportación de la Toxina Apxl de A. pleuropneumoniae. Dichas cepas son no virulentas como se esperaba, dado que no excretan más el factor de virulencia más importante; la toxina RTX, pero como una consecuencia, ningún anticuerpo, dejar solos los anticuerpos protectores, serán inducidos contra las toxinas RTX. La presente solicitud para el primer tiempo provee bacteria productora de toxina RTX atenuada viva de la familia Pasteurellaceae, que produce la toxina RTX-A, pero en una forma no activada . Esta bacteria tiene como una característica notoria, que por un lado son atenuadas, mientras que por otro lado, aún son capaces de producir la toxina RTX. Esto se logra modificando la bacteria en tal forma que no produzca una proteína activadora de RTX funcional. La expresión de la toxina RTX-A, sin embargo no se deteriora. La ventaja de cepas atenuadas vivas, de acuerdo con la presente invención sobre vacunas en subunidades, así como sobre cepas vivas de las cuales se suprimen los genes de toxina RTX, es q ue: • producen la toxina RTX de manera que se inducen los anticuerpos protectores contra esta toxina • sin embargo, son atenuadas en su virulencia dado que producen la Toxina RTX en una forma no tóxica • tienen adicionalmente los demás antígenos, que después de la Toxina RTX son necesarios para obtener una respuesta inmune eficiente. La toxina RTX-A en una forma no activada, se considera no tóxica, es decir, que no tiene el mismo efecto que la toxina activada .

Como se mencionó antes, esto se logra modificando la bacteria en tal forma que o produzca una proteína actívadora de RTX funcional .

La expresión de la toxina de RTX-A sin embargo, no está dañada . Una prote ína activadora de RTX funcional , se considera una proteína que tiene todas las características de la proteína activadora de RTX como se expresa en una bacteria de tipo silvestre y se expresa en el nivel de tipo silvestre. Por lo tanto, una proteína activadora de RTX no funcional se considera una proteína que carece de alguna o todas las características de la proteína activadora de RTX como se expresa en una bacteria de tipo silvestre y/o se expresa en un nivel, insuficiente para obtener niveles de tipo silvestre de toxina RTX activada . En la presente se debe enfatizar los siguiente: si la proteína activadora de RTX no funcional carece de todas las características de la proteína activadora de RTX como se expresa en una bacteria de tipo silvestre, la bacteria producirá toxina RTX no activada del todo. Sin embargo, la proteína activadora de RTX no funcional solo carece de algunas de las características de la proteína activadora de RTX como se expresa en una bacteria de tipo silvestre , la bacteria puede producir parte de la toxina RTX en una forma activada y parte de la toxina RTX en una forma no activada. Esto v.gr. , es el caso si debido a una mutación , se expresa la proteína Activadora, pero se reduce la eficiencia de activación para la proteína Activadora. La velocidad de activación es la velocidad con la cual la proteína Activadora activa la toxina RTX, es decir, convierte la toxina RTX de su forma no activada a su forma activada. No hace falta decir que la bacteria que produce parte de al toxina RTX en un forma no activada y parte en una forma activada , también se modalizan en la presente invención . La incapacidad para obtener niveles de tipo silvestre de toxina RTX puede ser el resultado de una actividad disminuida de la prote ína activadora de RTX. También puede ser el resultado de un nivel de expresión de la proteína activadora de RTX o una combinación de las dos posibilidades. Como consecuencia, las proteínas activadoras de RTX con una actividad disminuida y/o un nivel de expresión disminuido están dentro del alcance de la invención. Alternativamente, es posible modificar el sitio blanco de la proteína Activadora de RTX, es decir, el sitio de acilación en la toxina RTX. Si este sitio se modifica al grado de que la acilación se disminuye o ausenta, esta también da como resultado la producción de una toxina RTX en una forma no activada. El sitio de acilación puede mutarse fácilmente usando técnicas de A D N recombi nante. La m utación , v. gr. , puede obtenerse borrando un fragmento de restricción que comprende el sitio de acilación o mediante mutagénesis dirigida a sitio del sitio de acilación Una bacteria atenuada viva con una proteína activadora de RTX no funcional se puede obtener en varias formar. Una posibilidad es introducir una m utación en el gen que codifica la proteína activadora de RTX, preferiblemente usando técnicas de ADN recombinante . Se entiende que una mutación es un cambio de la información genética en la región mencionada antes con respecto a la información genética presente en esta región del genoma de la bacteria de tipo silvestre. La mutación, por ejemplo, es una substitución , supresión inserción o inversión de ácidos nucleicos, o una combinación de los mismos que da como resultado una bacteria que no produce una proteína activadora de RTX funcional . Actualmente se sabe mucho acerca de la ubicación , patrón de restricción y con frecuencia aún la secuencia de nucleótidos de los genes activadores de RTX de las cepas productoras de toxina RTX del grupo HAP. Esta información , v. gr. , se puede encontrar en la revisión por Coote, J .G. (FEMS Microbiology reviews 88: 137-162 (1992)), quien hace una revisión de la relación estructural y funcional entre las diferentes toxinas de RTX. La información muy detallada acerca de las toxinas RTX específicas se puede encontrar en v. gr. , la patente de E. U .A. No. 5 , 055,400, que se refiere al gen de RTX de Pasteurella haemolytica, y en Frey y otros; J . Gen. Microbiol . 139: 1723- 1728 ( 1993) y Frey y otros; Proceedings of the HA P-conference U . K. , Edinburgh 1994, que se refiere a todos los genes que juegan un papel en la síntesis y transportación de toxinas RTX A. pleuropneumoniae. La mutación de la proteína actívadora de RTX o de las secuencia implicadas en la transcripción/traducción del gen que se va a obtener en varias formas. U na posibilidad es clonar las secuencias relevantes del gen activador de RTX en un vector, excisión de parte o todas las secuencias de RTX usando enzimas de restricción y reemplazo del gen de toxinas RTX del tipo silvestre con las secuencias mutadas . Dicho remplazo, v. gr. , se lleva a cabo mediante la técnica bien conocida de recombinación homologa. Otra posibilidad es el uso de mutagenesis dirigida a sitio para obtener la mutación deseada. Estas técnicas de ADN recombinante normal se describen , v. gr. , por Sambrook y otros en Molecular Cloning : a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) . Por lo tanto , en una modalidad preferida , la bacteria tiene una mutación en el gen que codifica la proteína activadora de RTX. Esta mutación puede conducir a una proteína activadora de RTX menos activa o completamente inactiva dependiendo del tamaño y carácter de la mutación . En una forma más preferida, la mutación en el gen que codifica la proteína activadora de RTX es una supresión . La supresión puede variar altamente en tamaño , v. gr. , puede ser tan pequeña como un nucleótido, ocasionando cambio de marco. Por otro lado, todo el gen que codifica la proteína activadora de RTX puede suprimi rse .

Otra posibilidad es dejar intacto al gen que codifica la proteína activadora de RTX, pero que disminuya el nivel de expresión de la proteína activadora de RTX. Dado que el gen de la toxina y el gen Activador se transcriben desde el mismo promotor en un ARN mensajero polisincrónico, no es posible disminuir el nivel de transcripción sin disminuir concomitantemente el nivel de expresión de la toxina RTX. Sin embargo, la modificación del nivel de expresión de la proteína activadora de RTX se puede lograr introduciendo una mutación en el sitio de unión de ribosomas corriente arriba del gen que codifica la proteína activadora de RTX, preferiblemente usando técnicas de ADN recombinante. Por lo tanto, en otra modalidad preferida, la bacteria tiene una mutación en la región que controla la traslación del ARNm activador de RTX, tal como el sitio de unión de ribosoma. Dicha mutación influencia la eficiencia de traducción del ARN que codifica la proteína activadora de RTX. Los sitios de unión del ribosoma en general, se detectan fácilmente sobre la base de su motivo general y la distancia relativa de aproximadamente 5-6 nucleótidos entre el sitio de unión del ribosoma y el codón de partida. En muchos casos, v.gr., para varios genes activadores de RTX de un A. pleuropneumoniae se publicaron (Frey y otros, Gene 142: 97-102 (1994)). En una forma más preferida de esta modalidad, la mutación en la región que controla la traducción del ARNm activador de RTX. La supresión puede comprender, v.gr. , una supresión de uno o más nucleótidos en el sitio de unión del ribosoma. Aún otros posibilidad de obtener una bacteria atenuada viva con una proteína activadora de RTX no funcional es añadir una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ARN de contrasentido, que se puede unir al ARN mensajero que codifica la proteína Activadora. La expresión de dicha secuencia que conduce a una disminución en el nivel de proteína activadora. El ARN de contrasentido es ARN que tiene una secuencia que es parcial o completamente complementaria a la secuencia del ARN mensajero (ARN m) para la cual está en contrasentido. En la modalidad más preferida , la bacteria atenuada viva de acuerdo con la presente invención es Actinobacillus pleuropneumonie. La presente invención también se refiere a vacunas para la protección de animales contra infección con una bacteria productora de toxina RTX de la familia Pasteurellaceae. Dichas vacunas están basadas en una bacteria productora de toxina RTX de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas vacunas comprenden , por lo menos , una cantidad inmunogénicamente efectiva de la bacteria productora de toxina RTX atenuada viva de acuerdo con la invención . Inmunogénicamente efectivo significa que la cantidad de bacteria productora de toxina RTX atenuada viva administrada en vacunación , es suficiente para inducir en el huésped una respuesta inmune efectiva para formas virulentas de al bacteria productora de toxina RTX. La dosis útil que será administrada, variará dependiendo de la edad, peso y mamífero vacunado, el modo de administración y el tipo de patógeno contra el cual se busca la vacuna. La vacuna puede comprender cualquier dosis de bacterias, suficiente para evocar una respuesta inmune. Las dosis que varían entre 103 y 1010 bacterias son, v.gr., dosis muy adecuadas. Además de una cantidad inmunogénicamente efectiva de la bacteria productora de toxina RTX atenuada viva descrita antes, una vacuna de acuerdo con la presente invención también contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo puede ser tan sencillo como agua, pero también puede, v.gr., comprender fluido de cultivos en el cual se cultivaron las bacterias. Otro vehículo adecuado es v.gr., una solución de concentración de sal fisiológica. Otros ejemplos de vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables útiles en la presente invención, incluyen estabilizadores tales como SPGA, carbohidratos (v.gr., sorbítol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas tales como albúmina o caseína, poteína que contiene agentes tales como suero de bovinos o leche descremada y soluciones reguladoras de pH (v.gr., solución reguladora de pH de fosfato). Opcionalmente, se pueden añadir a la vacuna uno o más compuestos que tienen actividad auxiliar. Los auxiliares no son estimuladores específicos del sistema inmune. Aumentan la respuesta inmune del huésped al patógeno invasor. Ejemplos de auxiliares conocidos en la materia son auxiliares Completos e Incompletos de Freunds, vitamina E, polímeros de bloque no iónicos , dipéptidos de muramilo, COMEIs (complejos de estimulación inmunes, cf. por ejemplo Patente Europea EP 1099942) , Saponinas , aceite minera, aceite vegetal y Carbopol (un homopol ímero). Los auxiliares, especialmente adecuados para aplicación mucosal son v. gr. , la toxina lábil (TL) al calor de E. coli o toxina del Cólera (TC). Otros auxiliares adecuados son, por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato u óxido, emulsiones oleosas (v.gr. , de Bayol F ® o Marcol 52 (R), saponinas o solubilisato de vitamina E. Por lo tanto, en una forma preferida, las vacunas de acuerdo con la presente invención comprenden un adyuvante. Para la administración a animales, la vacuna de acuerdo con la presentación se puede dar, entre otros , intranasalmente, intradérmicamente, subcutáneamente, mediante aerosol o intramuscularmente . En una modalidad más preferida, la vacuna de acuerdo con la presente invención, comprende adicionalmente uno o más antígenos seleccionados de otros m icroorganismos y virus patogénicos. Dicha vacuna se puede obtener añadiendo uno o más antígenos seleccionados de otras bacterias patogénicas o virus para la bacteria productora de toxina de RTX atenuada viva de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable como se descrito antes. Desde luego, es posible añadir no solo uno o más antígenos, sino también uno o más de los patógenos completos como tales en una forma ¡nactivada o viva. Alternativamente se puede obtener clonando la información genética que codifica uno o más antígenos seleccionados de otros microorganismos o virus patogénicos en la bacteria productora de toxina de RTX atenuada, usando tecnología conocida de ADN recombinante . Las bacterias de acuerdo con la presente invención son muy adecuadas como vehículos, es decir, vectores , para dicha i nformación genética , debido a su carácter atenuado. Las vacunas basadas en bacterias de acuerdo con la presente invención que portan adicionalmente información genética codificando uno o más antígenos seleccionados de otros microorganismos o virus patogénicos, son capaces de inmunizarse contra dos o más enfermedades al mismo tiempo. Desde luego, esto es menos fatigante para el animal que será vacunado que las vacunas separadas con cada uno de los patógenos, tanto desde un punto de vista médico como físico. En una modalidad aún más preferida, la vacuna de acuerdo con la presente invención comprende una bacteria productora de toxina RTX atenuada viva que pertenece al género Actinobacillus peí u rop neu moni ae.

En aún una forma más preferida, estos antígenos se seleccionan de, pero no están limitados al gru po que consiste de virus de Síndrome Respiratorio Reproductor de Porcinos (SRRP) , virus Pseudorabies , virus de Influenza en Porcinos, Eryspelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetlla bronchiseptica, Haemophilus parasuis y Streptococcus suis. En otra forma de la modalidad aún mas preferida, la vacuna de acuerdo con la presente invención comprenden bacteria productora de toxina RTX atenuada viva que pertenece al género Pasteurella haemolytica. En aún otra forma más preferida de esta modalidad , los antígenos seleccionados de otros micro-organismos o virus patogénicos se eligen del grupo de patógenos de ganado, que consisten de Rotavirus de Bovinos, virus de Diarrea Viral de Bovinos, virus de parainfluenza tipo 3, Paramixovirus de Bovinos , virus de Enfermedad de Pies y Boca, Pasteruella multocida, Haemophilus somnus, Brucella abortus, Staphilococcus aureus, Streptococcus spp. Mycoplasm spp. y Virus Sincicial Respiratorio de Bovinos. Hay varias formas de almacenar organismos vivos. El almacenamiento en un refrigerador, v. gr. , es un método bien conocido . También con frecuencia se usa el almacenamiento a -70°C en una solución reguladora de p H que contiene glicerol . Las bacterias también se pueden mantener en nitrógeno líq uido. El secado por congelación es otra forma de conservación. Las bacterias secadas por congelamiento se pueden almacenar y mantener viables durante muchos años. Las temperaturas de almacenamiento para bacterias secadas por congelación pueden estar bien por arriba de cero grados, sin ser perjudicial para la viabilidad. El secado por congelación se puede realizar de acuerdo con todos los procedimientos de secado normales bien conocidos. Los aditivos benéficos opcionales, tales como v.gr., leche descremada, trehalosa, gelatina o albúmina de suero de bovinos se pueden adicionar en el proceso de secado por congelación. Por lo tanto, en una modalidad preferida, la vacuna está en una forma secada por congelación. Esta invención también se refiere al uso de vacunas de acuerdo con la presente invención para la protección de animales susceptibles contra infección con bacterias de la familia Pasteurellaceae. En una modalidad preferida, las vacunas de acuerdo con la presente invención se usan para la protección de un animal susceptible contra infección por Actinobacillus pleuropneumoniae. También, la presente invención se refiere a método para la preparación de bacterias productoras de toxina de RTX atenuadas vivas de la familia Pasteurellaceae. Dichos métodos comprenden la introducción de una mutación en el gen que codifica la proteína activadora de RTX.

En una modalidad preferida de este método, la mutación que será introducida es una supresión en el gen de proteína activadora de RTX. Finalmente , la presente invención se refiere a métodos para la preparación de una vacuna para la protección de animales contra infección con una bacteria productora de toxina RTX de la fam ilia Pasteurellaceae. Un método comprende mezclar bacterias de acuerdo con la presente invención con un veh ículo farmacéutica mente aceptable como se describió antes. Ejemplos Ejem pl o 1 : Preparación de una cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae atenuada viva. Construcción de pApxl-D1 1 : La viabilidad de las bacterias atenuadas vivas de acuerdo con la presente invención se ejemplifica por la construcción de una mutante ?apxIC de Actinobcillus pleuropneumoniae. Con el fin de obtener esta mutante, primero se produjo un plásmido que comprende una supresión en el gen activador de RTX. La En la figura 1 se da la descripción de la construcción . La secuencia del operon apxl de un A. pleuropneumoniae se depositó en GenBank con el número de acceso X52899. De pJ FF750 (Gygi y otros, Infect. Immun . 60: 3059-3064 , 1992) , los genes apxIC y apxIA y la región promotora se sacaron como un fragmento de Bgl ll/Pstl de 4481 pb y se clonó en pGEM3Z de plásmidos (Promega Co., Leiden NL), se digirió con las enzimas BamHI y Pstl. El plásmido resultante se designó pApxl-D1. Un fragmento de ADN de 407 pb que comprende la mayoría de la región que codifica ApxIC se cortó por digestión con la enzima de restricción Xhol, seguido por la digestión parcial con la enzima de restricción Sspl. Las proyecciones de extremo pegajoso se convirtieron en extremos romos con S1-nucleasa y un fragmento de aproximadamente 6600 pb se aisló de gel de agarosa y se religó. El plásmido resultante se designó pApxl-D2. La secuencia a través de la unión de supresión Xhol/Sspl se verificó por el análisis de secuencia de nucleótidos. Subsecuentemente, la mayoría de la región de codificación de ApxIC se suprimió por digestión de AF1II/Smal, enromado de nucleasa S1 y religación El cásete de intercambio de 1454 pb para reemplazo alélico se cortó de pApx-l-D3 con enzimas de restricción Pstl y Sacl y se clonó en el vector pJQ200KS (Quandt y otros; Gene 127:15-21, 1993), se digirió con las mismas enzimas. El plásmido resultante se designó pApxl-D4. El extremo 3' del gen sacB y pApxl-D4 se removió por digestión de Hpal y se reemplazó por el gen rpsL cortado de pAP13 (Prentki y otros; Gene 103:17-23, 1991) como un fragmento de EcoRV de 540 pb. El plásmido resultante se nombró pApx1-D11. Resultados: La estructura del plásmido resultante pApx1-D11 se revisó por digestión con varias enzimas de restricción. Los patrones de digestión mostraron realmente que se obtuvo el plásmido deseado.

Este plásmido además se usó para la construcción de una mutante de ?apxIC. Construcción de la mutante ?apxIC de la cepa HV211 Actinobacillus pleuropneumoniae. Se usó el plásmido pApxl-D11 para el reemplazo alélico. Se introdujo a este extremo en A. pleuropneumoniae mediante conjugación de E. coli mediante técnica de igualación de filtro normal (De Lorenzo y Timmis, Methods Enzymol. 235:386-405, 1994). El donador de E. coli, designado MBHPP101 se construyó por transformación de la cepa SM10 ?pir (Miller y Mekalanos, J. Bacteriol. 170:2575-2583 1988) con el plásmido pApx1-D11. La cepa aceptora MBHPP105 de A. pleuropneumoniae se aisló después de cultivación del HV211 aislado de campo de serotipo 10 (una de las cepas probadas por Beck y otros, J. Clin. Microbiol. 32:2749-2754, 1994) en presencia de estreptomicina y subsecuentemente en presencia tanto de estreptomicina como ácido naladixico (Cepa R). Después de la conjugación, se obtuvo un exconjugado de A. pleuropneumoniae resistente a ácido naladíxico y gentamicina después de seleccionarse en medio sólido. La cepa resultante (I) contuvo el ADN pApx1-D11 tanto como plásmido circular como integrado en el operón Apxl, como se aprecia del análisis por secado de Southern. Este se puede observar en la figura 2, panel izquierdo, en donde el ADN de las cepas indicadas se hibridizó al fragmento de Sa1l/Sac1 de 1.478 kB de pApxl-D11.

Después de cultivo adicional en presencia de ácido naladíxico, la cepa se sembró en placa en agar sanguíneo con ácido naladíxico un una colonia de A. pleuropneumoniae sin que se haya identificado una zona hemolítica. Resultados. Esta cepa resultante, designada MBHPP113, se confirmó para ser una mutante negativa de ApxIC de serotipo 10 de A. pleuropneumoniae por análisis de secado de Southern (ver fig. 2). Como se esperaba, en el ADN cromosomal digerido de Sspl de la cepa MBHPP113, solo se hibridizó una banda con la sonda restringiendo la región suprimida (figura 2, panel izquierdo). El tamaño de la banda (aproximadamente 4.4 kB) corresponde a las dimensiones combinadas de dos bandas hibridizantes en el ADN cromosomal de la cepa madre, menos la supresión de 407 pb. Además, se muestra une la estructura de la base del plásmido ya no está presente en MBHPP113 (figura 2, panel medio). De manera más importante, se mostró que el fragmento Sspl/Xhol que comprende el gen apxIC ya no está presente en MBHPP113 (fig. 2, panel derecho). Ejemplo 2: Pruebas sobre expresión, excreción y carencia de actividad hemolítica de toxina RTX de la mutante MBHPP113 de. ?apxIC. Falta de actividad hemolítica de la mutante MBHPP113 de ?px 1C de A. pleuropneumoniae.

Con el fin de demostrar el efecto de la supresión de ?apxIC en MBHPP113, las actividades hemolíticas de la cepa MBHPP113 de ?apxIC y la cepa madre de tipo silvestre se compararon después en una placa sanguínea. La cepa de referencia de A. Pleuropneumoniae que pertenece al serotipo 7 (solo produciendo Apxll) se incluyó también por comparación. Esta cepa muestra un nivel de hemolisis intermedio debido al hecho de que Apxll tiene una actividad hemolítica moderada. Las colonias individuales se transfirieron a una placa de agar Columbia con 0.1% NAD y 2% de glóbulos rojos de ovejas con un palillo estéril. Resultados: Como se puede observar en la figura 3, después de 8 horas de crecimiento a 37°C, el HV211 (tipo silvestre), MBHPP105 (R, es decir, la cepa resistente) y la mutante (I) de integración del plásmido, se rodean por una zona hemolítica como se espera. La cepa de referencia de A. pleuropneumoniae para el serotipo 7 (solo produciendo Apxll) muestra un nivel intermedio de hemolisis. También como se espera, ninguna zona hemolítica puede detectarse alrededor de MBHPPP113 cepa ?apxIC (descrito como ? en la figura 3). Este experimento muestra claramente que MBHPP113 de la cepa ?apxIC realmente produce toxina Apx no activada.

Expresión y excreción de apxIA mediante MBHPP113 de la cepa ?apxIC. La cepa ?apxIC de acuerdo con la presente invención se supone une expresa y excreta una toxina RTX, pero en una forma no hemolítica. La expresión y excreción se probaron en este experimento. La excreción de la proteína ApxIA se investigó por la reacción de sobrenadante de cultivo concentrado de varías cepas de A. pleuropneumoniae con anti-ApxIA monoespecífico como se describió (Beck y otros, J. Clin. Microbiol, 32;2749-2754, 1994). Suero de Anti-ApxIlA y cepas de tipo silvestre de otros serotipos, se usaron principalmente por comparación. Se inoculó A. pleuropneumoniae de placas de agar de chocolate en 5 ml de medio de cultivo de Caldo Columbia conteniendo 0.1% de NAD e incubado durante 6 horas a 37°C, mientras que se agitó a 200 rpm. Los sobrenadantes de cultivos sin células se recogieron después de la centrifugación durante 30 minutos a 10,000 xg. Las proteínas de ApxIA se concentraron 20 veces en un filtro de concentración "Centricon-100" (Millipore Co., Etten-Leur, NL) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Después de la electroforesis en un gel de poliacrilamida, se secaron las proteínas y se hicieron reaccionar con suero anti-ApxIA y suero anti-ApxIlA.

Las placas de agar de chocolate conteniendo KH2PO4 (1g), K2HPO4 (4g), MaCI (5g), Peptona de Proteose No. 3 (15 g), almidón (1 g), agar Bacto (15g), agua estéril (a volumen total de 1000 ml), sangre de oveja (100 ml), suero de caballo (100 ml) y solución Isovitalex (12 ml). Resultados: Los sobrenadantes de cultivos concentrados se electroforaron en geles de poliacrilamida paralelos y se electrosecaron sobre "Immobilon-P" como se describe en la figura 4. Las manchas resultantes se hicieron reaccionar con suero anti-ApxIA monoespecífico en el panel A, y con suero anti-ApxIlA monoespecífico en el panel B. Las cepas probadas son HV211 (tipo silvestre), MBHPP105 (R, es decir, la cepa resistente), la mutante de integración de plásmidos (I), MBHPP113 (?) (ver bajo: Construction of the ?ApxIC mutant from Actinobacillus pleuropneumoniae strain HV211) y cepas de referencia de tipo silvestre de los serotipos 6, 5a y 5b. La cepa de referencia de tipo silvestre del serotipo 6 produce ApxMA, pero no ApxIA. De las bandas de 105 kD en las líneas WT, R, I y ? en la figura 4A es claro que la cepa WT así como la cepa R, la cepa I y la cepa MBHPP113 es realmente capaz de expresar y exportar la toxina TRX en una forma no activada.

Los resultados de los exprimentos en el Ejemplo 2 prueban que la cepa MBHPP113 de A. pleuropneumoniae realmente es capaz de expresar y exportar la toxina RTX en una forma no activada. EJEMPLO 3: CONSTRUCCIÓN DE UNA MUTANTE ?apxIC?apxIlC DE LA CEPA 4074 DE Actinobacillus pleuropneumoniae La construcción de la mutación de AapxIC en la cepa 4074 se realizó como se describió en el ejemplo 1. La cepa aceptora MBHPP104 de A. pneumoniae se aisló después del cultivo de la cepa 4074 de referencia del serotipo 1 (Frey y Nicolet, J. Clin. Microbiol. 28:232-236, 1990) en presencia de estreptomicina y subsecuentemente en presencia de tanto estreptomicina como ácido naladíxico. Después de la conjugación de MBHPP104 con MBHPP101 (descrita en el ejemplo 1), se obtuvo un exconjugante de A. pleuropneumoniae resistente a ácido naladíxico y gentamicina. Después de sembrar en placas esta cepa en placas de CBM con 2% de eritrocitos de oveja, 0.1% de NAD y ácido naladíxico, se identificaron varias colonias con una zona hemolítica más pequeña., Se confirmó que una de estas, designada MBHPP111, es una mutante negativa de apxIC de la cepa 4074 de A. pleuropneumoniae por análisis de secado Southern. La supresión de apxIlC se llevó a cabo en la cepa MBHPP111 en una forma similar a la supresión de apxIC, usando la construcción de pApxll-D2 (en lugar de pApx1-D11) en MBHPP142 de la cepa donadora de conjugación. La construcción de pApxll-D2 se da en la figura 5. En resumen, el plásmido pJFFapxllCu15 se construyó por inserción de un fragmento de 4.3 kb contiendo los genes de apxIlC y apxIlA (derivados por la digestión parcial de Saw3A1 de ADN cromosomal de la cepa 4074) en el vector ?ZAP Express (Stratagene Con.) y se cortó usando el fago auxiliar en el vector pBK-CMV (Stratagene Con.). Una supresión en marco de la región de codificación de apxIlC se formó por amplificación de PCR con oligo-APXHC-OL (5'- CAATACCTTAAGATCATTTTTTAGCATCATCCC) y APXIIC-OR (5'-ACATTTCTTAAGTATGAGCAAGAGTTAATAACAGC) usando pJFFapxllCU15 como un patrón. El fragmento de PCR resultante de 8.5 kb se digirió con AflW y se religó. El plásmido resultante se designó pApxll-D1 y la secuencia a través del sitio de supresión se verificó por análisis de secuencia. El inserto de pApxll-D1 se cortó como un fragmento de Spe\/Bgl\\ y se ligó en pAppEX-KG1 digerido con Xj al y Sa HI. El plásmido resultante se designó pApxll-D2 y se transfirió a E. coli S17-1 ?pir (Simón y otros, Biotechnology 1;784-791, 1983). Esta cepa donadora de conjugación se designó MBHPP142. Después de la conjugación de MBHPP111 con. MBHPP142, se obtuvo un exconjugante de A. pleuropneumoniae resistente a ácido naladíxico y gentamicina, el cual se sembró en placa en placas de agar de CBM conteniendo 0.1% de NAD, 2% de eritrocitos de oveja y 20 µg/ml de ácido naladíxico. Se pudieron identificar colonias de A. pleropneumoniae no hemolíticas. Se confirmó que una de ellas, designada MBHPP147, es una mutante de supresión de apxICapxIlC de una cepa 4074 de A. pleuropneumoniae por análisis de secado de Southern. Resultados: Los pasos de construcción dieron como resultado la cepa MBHPP147, teniendo supresiones en ambos genes apxIC y apxIlC. ACTIVIDADES HEMOLITICAS DE LOS MUTANTES DE AapxC del SEROTIPO 1 DE A. pleuropneumoniae. Las actividades hemolíticas del MBHPP111 de la cepa ?apxIC, el MBHPP147 de la mutante de supresión doble de AapxIC?apxIlC y MBHPP104 de la cepa madre de tipo silvestre, se compararon después del crecimiento en una placa sanguínea (como se describió en el ejemplo 2). Las colonias individuales se transfirieron a una placa de CBM con 0.1% de NAD y 2% de los glóbulos rojos de oveja con un palillo estéril. Después de 8 horas de desarrollo a 37°C la cepa MBHPP104 de tipo silvestre se rodeo por una zona ß-hemolítica de 2 mm. La cepa MBHPP111, aún produciendo ApxIlA activado, produjo una zona hemolítica más difusa de aproximadamente 1 mm (comparable con la zona hemolítica que rodea la cepa de referencia A. pleuropneumoniae para serotipos 7 y 12, que se sabe que producen solamente Apxll). La mutante de supresión doble MBHPP147 fue no hemolítica. Resultados: La supresión de apxIC dio como resultado la pérdida de actividad hemolítica fuerte, que es normal para la hemolisina de Apx1 . La supresión de apxIlC subsecuente, dio como resultado pérdida completa de actividad hemolítica. Los resultados se resumen en la tabla 1 .

TABLA 1 : Resumen de hemolisis y resultados de secado Western . La zona hemol ítica se indica en mm y "(d)" indica hemoslisis difusa. Una "+" indica una reacción en secado western de anticuerpos con un antígeno de aproximadamente 105 kDa. Una "-" indica la ausencia de dicha reacción . EXPRESIÓN Y EXCRECIÓN DE ApxIA y ApxI lA POR CEPAS AaoxC DERIVADAS DE LA CEPA 4074 DE SEROTI PO 1 .

La excreción de la proteína ApxIA se investigó por la reacción de sobrenadante de cultivos concentrado de varias cepas de A. pleuropneumoniae con anti-Apx1A monoespecífico y suero anti-ApxIlA en un procedimiento de secado Western como se describe (Beck y otros, J. Clin. Microbiol, 32:2749-2754, 1994 y ejemplo 2). Resultados: Todas las cepas de serotipo 1 (MBHPP104, MBHPP111 y MBHPP147) se mostraron para expresar y excretar aún ambos ApxIA y Apx11A. Como controles, los sobrenadantes concentrados de una cepa de serotipo 10 (expresando solo Apxl) y una cepa de serotipo 12 (expresando solo Apxü) se incluyeron. Los resultados se resumen en la tabla 1. EJEMPLO 4: EFECTO DE MUTACIONES ?aoxC SOBRE VIRULENCIA DE A. pleuropneumoniae EN RATONES Para determinar el efecto de supresiones apxIC y/o apxIlC sobre la virulencia de A. pleuropneumoniae, a grupos de siete ratones (entre 6 y 7 semanas de edad) se les inyectó intraperitonealmente con tres dosis diferentes de cinco cepas diferentes (ver tabla 2). Las cepas fueron recién desarrolladas en medio CBM con 0.1% de NAD y se lavaron una vez con una solución de 0.9% (p/v) de NaCI y se resuspendieron en la misma solución reguladora de pH a un OD600 de 0.8 (representando aproximadamente 3. 109 cfu/ml). Subsecuentemente, se hicieron diluciones de 10 a 100 veces en la misma solución reguladora de pH. Cada grupo de ratones se inyectó intraperitonealmente con 0.5 ml de una de las diluciones de una de las cepas. Se sembraron en placas diluciones en serie de los cultivos probados en placas de CBM conteniendo 0.1% de NAD y se calculó el contenido real de cfu de los cultivos probados. Resultados: A partir de los datos, se puede concluir que la DL50 de la cepa HV2111 se incrementó por o menos 20 veces por al supresión de apxIC. Para la cepa 4074, una sola supresión de AapxIlC adicional, dio como resultado otro incremento de 9 veces, añadiendo un total de por lo menos una disminución de 90 veces en virulencia. Los resultados se dan en la tabla 2.

TABLA 2: Atenuación de A. pleuropneumoniae por supresiones de genes apxC. La cepa MBHPP105 es el derivado resistente a ácido naladíxico y estreptomicina del HV211 :MBHPP113 aislado de campo del serotipo 10 es una mutante de supresión de apxIC derivada de MBHPP105; MBHPP104 es un derivado resistente a ácido naladíxico y estreptomicina de la cepa 4074; de referencia del serotipo 1; MBHPP111 es una mutante de supresión de apxIC, derivada de MBHPP111. PROTECCIÓN DE RATONES CONTRA TRATAMIENTO DE A. pleuropneumoniae. USANDO MBHPP147 VIVO COMO UNA VACUNA Se usaron cuatro grupos de 10 ratones (ver tabla 3). Dos grupos se vacunaron a las 7 semanas de edad con una inyección intraperitoneal conteniendo 1.5 108 células de cepa MBHPP147. Estos ratones se reforzaron con una inyección similar 4 semanas después. Dos semanas después del reforzador, un grupo vacunado y uno no vacunado se trataron con una inyección intraperitoneal de 108 cfu de la cepa MBHPP104 (la cepa de serotipo 1 virulenta, de la cual se derivó MBHPP147). Los otros dos grupos se trataron con 106 cfu de la cepa MBHPP105 (una cepa de serotipo 10 virulenta). Resultados: En los grupos de control, todos los ratones murieron mientras que 0 de 10 vacunados resistieron el tratamiento homólogo con la cepa MBHPP104 de serotipo 1 (prueba exacta de Fisher de p = 0.0001) y 4 de los 10 vacunados se protegieron contra la cepa MBHP105 de serotipo 10 (prueba exacta de Fisher con p = 0.0433). La cepa MBHPP147 se puede usar como una vacuna viva que confiere protección homologa y heteróloga significativa. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3: Protección de ratones después de vacunación con MBHPP147 contra tratamiento con serotipo 1 virulento (MBHPP104) y cepas (MBHPP105) de serotipo 10. Leyenda de las figuras: Figura 1: Construcción de pApxl-C11 (buscar explicación en el texto). Las características genéticas principales de los plásmidos usados se indican así como todos los sitios de restricción usados. El sitio en donde se unieron los primeros sitios de restricción Xho\ y Sspl se indican como "X/S", el punto de partida de transcripción del operon Apxl, como se determina por Frey y otros, Gene 142;97-102 (1994), se indica como "tsp". Figura 2: El análisis de secado de Southern de digestiones Sspl del ADN cromosomal de la cepa tipo silvestre HV211 (Wt), la cepa derivada MBHPP105 (R ) resistente a estreptomicina y ácido naladixico, la integración intermedia (I) y MBHPP113 (D) de construcción de supresión final. Para comparar, también se incluyeron los plásmidos pApxl-D1 (D1) y pApxl-D11 (D11). En el panel izquierdo, se hibridizó la mancha con el fragmento de 1.487 kB Sa/I/Sacl de pApxl-D11 (conteniendo las regiones delimitando la supresión. En el panel de en medio, la mancha se hibridizó con la estructura de la base del vector pApxl-D11 (aislado como un fragmento de Sa/I/Sacl de 5004 pb). En el panel derecho, la mancha se hibridizó con un fragmento de 369 pb (generado por amplificación de PCR) localizado dentro de la parte suprimida de apxIC. Figura 3: Análisis en placa de hemolisina. Se picaron varias cepas con un palillo estéril en una placa de agar Columbia conteniendo 0.1% de NAD y 2% de glóbulos rojos de oveja. La placa se incubó subsecuentemente durante 8 horas a 37°C. De izquierda a derecha, la cepa HV211 tipo silvestre (Wt), la cepa MBHPP105 (R ) resistente a ácido naladíxico y estreptomicina, la mutante de inserción (I), la mutante MBHPP113 de supresión (D) y la cepa de referencia de serotipo 7 A. pleuropneumoniae, también se inocularon.

Figura 4: Expresión de ApxIA y ApxIlA. Los sobrenadantes de cultivos concentrados se electroforaron en geles de poliacrilamída paralela y se electrosecaron en Immobilon-P. Las mancha resultantes se hicieron reaccionar con suero anti-ApxIA monoespecífico en el panel A y con suero anti-ApxIlA monoespecífico en el panel B. Las cepas probadas fueron HV211 (WT), MGHPP105 (R ), la mutante de integración de plásmido (I), MGHPP113 (D) y cepas de referencia de tipo silvestre de serotipos 6, 5a y 5b. La cepa de referencia de tipo silvestre de serotipo 6 produce Apxlla, pero no ApxIA. Figura 5: Construcción de pApxll-D2. Se indican las características genéticas principales de los plásmidos usados, así como los sitios de restricción usados.

Claims (11)

1. REIVI N DICACION ES 1 . Bacteria productora de toxina RTX atenuada viva de la familia Pasteurellaceae, caracterizada porque dicha bacteria produce toxina RTX en una forma no activada.
2. 2. Bacteria productora de toxina RTX atenuada viva, de acuerdo con la reivindicación 1 , caracterizada porque tiene una mutación en el gen que codifica la proteína activadora de RTX.
3. 3. Bacteria productora de toxina RTX atenuada viva de acuerdo con a reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque tiene una mutación en una región que controla la traducción del ARNm activador de RTX.
4. 4. Bacteria productora de toxina RTX atenuada viva de acuerdo con las reivindicaciones 1 -3, caracterizada porque dicha mutación es una supresión .
5. 5. Bacteria productora de toxina RTX atenuada viva de acuerdo con las reivindicaciones 1 -4 , caracterizada porque la bacteria es Actinobacillus pleuropneumoniae.
6. 6. Bacteria productora de toxina RTX atenuada viva de acuerdo con las reivindicaciones 1 -4, caracterizada porque la bacteria es Pasteurella haemolytica.
7. 7. Vacuna para la protección de animales contra infección con una bacteria productora de toxina RTX de la familia Pasteurellaceae, caracterizada porque dicha vacuna comprende una bacteria productora de toxina RTX atenuada viva de acuerdo con las reivindicaciones 1 -2 y un veh ículo farmacéuticamente aceptable.
8. 8. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende un auxiliar.
9. 9. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizada porque la vacuna está en forma congelada-seca.
10. 10. Vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 7-9, caracterizada porque dicha bacteria productora de toxina RTX atenuada viva pertenece al género Actinobacillus pleuropneuoniae. 1 1 . Vacuna de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende adicionalmente uno o más antígenos seleccionados del grupo que consiste del virus del Síndrome Respiratorio Reproductor de Porcinos (SRR P) , virus Pseudorabies, virus de I nfluenza en Porcinos , Eryspelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetlla bronchiseptica, Haemophilus parasuis y Streptococcus suis. 12. Vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 7-9, caracterizado porque dicha bacteria productora de toxina RTX atenuada viva que pertenece al género Pasteurella haemolytica. 13. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende adicionalmente uno o más antígenos seleccionados del grupo que consiste de patógenos de ganado, que consisten de Rotavirus de Bovinos, virus de Diarrea Viral de Bovinos, virus de parainfluenza tipo 3, Paramixovírus de Bovinos, virus de Enfermedad de Pies y Boca, Pasteruella multocida, Haemophilus somnus, Brucella abortus, Staphilococcus aureus, Streptococcus spp. Mycoplasm spp. y Virus Sincicial Respiratorio de Bovinos. 14. Método para la protección de un animal susceptible contra infección de Actinobacillus pleuropneumoniae, dicho método comprendiendo administrar una vacuna de acuerdo con la reivindicación 10 u 1 1 . 15. Método para la protección de un animal susceptible contra infección de Pasteurella haemolytica, dicho método comprendiendo administrar una vacuna de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13. 16. Método para la preparación de una bacteria productora de toxina RTX atenuada viva de la familia Pasteurellaceae que produce toxina RTX en una forma no activada, caracterizada porque dicho método comprende la introducción de una mutación en el gen que codifica proteína activadora de RTX. 17. Método de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque dicha mutación se obtiene introduciendo una supresión . 18. Método para la preparación de una vacuna para la protección de animales contra infección con una bacteria productora de toxina RTX de la familia Pasterurellaceae, dicho método comprendiendo mezclar bacterias de acuerdo con las reivindicaciones 1 -6 con un vehículo farmacéuticamente aceptable. R ESUM EN La presente invención se refiere a bacterias productoras de toxina RTX atenuadas vivas de la familia Pasteurellaceae, de las cuales la atenuación se debe al hecho de que producen toxina RTX en una forma no activada. La invención también se refiere a vacu nas para la protección de mamíferos contra infección con bacterias productoras de toxina RTX de la familia Pasteurellaceae y a métodos para la preparación de dichas bacterias atenuadas vivas y vacunas .