HU226219B1 - Live attenuated rtx-producing bacteria of the family pasteurellaceae - Google Patents
Live attenuated rtx-producing bacteria of the family pasteurellaceae Download PDFInfo
- Publication number
- HU226219B1 HU226219B1 HU9700975A HUP9700975A HU226219B1 HU 226219 B1 HU226219 B1 HU 226219B1 HU 9700975 A HU9700975 A HU 9700975A HU P9700975 A HUP9700975 A HU P9700975A HU 226219 B1 HU226219 B1 HU 226219B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- rtx
- vaccine
- bacterium
- toxin
- virus
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 72
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims description 25
- 241000606752 Pasteurellaceae Species 0.000 title claims description 16
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 94
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 91
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 90
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 47
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 claims description 41
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 39
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 39
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 13
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 11
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 241001293418 Mannheimia haemolytica Species 0.000 claims description 6
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 claims description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 6
- 241000711895 Bovine orthopneumovirus Species 0.000 claims description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 3
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 claims description 2
- 241000702673 Bovine rotavirus Species 0.000 claims description 2
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 claims description 2
- 241000186810 Erysipelothrix rhusiopathiae Species 0.000 claims description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 claims description 2
- 241000606807 Glaesserella parasuis Species 0.000 claims description 2
- 241000606831 Histophilus somni Species 0.000 claims description 2
- 241000712003 Human respirovirus 3 Species 0.000 claims description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 2
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 claims description 2
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 claims description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000026721 nail disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 claims 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 30
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 18
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 7
- CSOJYIADHHNGRM-UHFFFAOYSA-N (+-)-6-(4-oxo-thiazolidin-2-yl)-hexanoic acid Natural products OC(=O)CCCCCC1NC(=O)CS1 CSOJYIADHHNGRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 5
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 5
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 5
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 5
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 4
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 4
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 3
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 3
- 101100379376 Caenorhabditis elegans apx-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 101150115143 shroom2 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 description 2
- 241000319052 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 1 str. 4074 Species 0.000 description 2
- 241001258963 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 7 Species 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 2
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 2
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 101150015540 apxIIC gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007382 columbia agar Substances 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 208000036169 Actinobacillus Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000034952 Pasteurellaceae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 1
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000008939 Pneumonic Pasteurellosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101150005224 SBH1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000194021 Streptococcus suis Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- -1 albumin or casein Chemical class 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 101150051095 apxIA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical class O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 108010033370 transcription factor AP-5 Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/21—Haemophilus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
A találmány tárgyát élő, legyengített (attenuált), Pasteurellaceae családba tartozó baktériumok, valamint ezen baktériumok termelésére vonatkozó eljárások képezik, továbbá a baktériumokat tartalmazó vakcina, és eljárások a vakcina előállítására. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti vakcinák alkalmazása a Pasteurellaceae családba tartozó, virulens, RTX-termelő baktériumok fertőzése elleni védettség kialakítására emberekben és állatokban.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható Pasteurellaceae családba tartozó baktériumok által kiváltott megbetegedések megelőzésére és kezelésére.
A Pasteurellaceae családba tartoznak a Haemophilus, Actinobacillus és Pasteurella nemzetségek. A család baktériumait gyakran említik, mint a HAP-csoport baktériumait. A szoros rokonságban levő nemzetségek több fajáról ismert, hogy homológ, kalciumfüggő, pórusformáló citotoxinokat expresszálnak, az úgy nevezett RTX-toxinokat. [az RTX azt jelenti: ismétlődés a toxinban (repeat in toxin)]. A család RTX-termelő baktériumai a legkülönbözőbb fertőző betegségeket okozzák mind emberben, mind állatokban.
Az RTX-toxinok más nemzetségbe tartozó baktériumokban is ismertek, amelyek nem tartoznak a HAPcsoportba, mint az Escherichia és a Bordetella. Ezek az RTX-toxinok sok tekintetben hasonlítanak a HAPcsoport RTX-toxinjaihoz.
Az RTX-toxinokról Braun és munkatársai részletes összefoglalást jelentettek meg [Critical Rév. in Microbiol. - 18(2), 115-158 (1991)], R. A. Welch a Gram-negatív törzsekről írt összefoglaló tanulmányt [Molecular Microbiology 5/3, 521-528 (1991), valamint Welch és munkatársai Inf. Agents and Disease 4, 254-272 (1995)].
Az RTX-toxinok jelenléte a Pasteurellaceae családba tartozó, RTX-termelő baktériumokban nagyban felelős ezen baktériumok patogén jellegéért mind emberben, mind állatokban. Minden RTX-toxin citotoxikus, vagy citolitikus aktivitást mutat. A toxinok célsejt-, illetve gazdaspecifitása eltérő, amit az acetilálás is befolyásol [McWhinney és munkatársai: J. Bact. 174, 291-297 (1992), valamint Hackett és munkatársai: J. Bioi. Chem. 270, 20 250-20 253 (1995)]. A célsejtek különbözősége alapján többféle toxin ismert az RTXtoxin családon belül, mint például a hemolizin, a citolizin vagy a citotoxin.
Bár a HAP-csoport RTX-termelő tagjai közül sok az ismert, néhány közülük gyakorta okoz gazdasági kárt.
Az Actinobacillus pleuropneumoniae által termelt RTX-toxinok citotoxikusak/citolitikusak a sertés, a ló, a szarvasmarha és az ember vörösvértestjeire, a nyúl és disznó neutrofil granulocitáira, valamint a disznó alveoláris makrofágjaira [Rosendal és munkatársai: Am. J. Vet. Rés. 49, 1053-1058 (1988), Maudsley J. R. és Kadis S.: Can. J. Microbiol. 32, 801-805 (1986), Frey J. és Nicolet J.: Inf. & Imm. 56, 2570-2575 (1988), Bendixon és munkatársai: Inf. & Imm. 33, 673-676 (1981), Kamp E. M. és van Leengoed L. A. M. G.: J. Clin. Microbiol. 27, 1187-1191 (1989)]. Sertések Actinobacillusfertőzése gazdasági károkat okoz a sertéstelepen, hirtelen elhalálozást okoz a fiatal disznóknál, míg az öregebb állatoknál a testsúlygyarapodás ütemének lassulását okozza.
A Pasteurella haemolytica RTX-toxin aktivitása főként a kérődzők neutrofil granulocitáira és a monocitákra (makrofágokra) irányul [Shewen és Willie: Inf. & Immun. 35, 91-94 (1982), Baluyutés munkatársai: Am. J. Vet. Rés. 42, 1920-1926 (1981), Hímmel és munkatársai: Am. J. Vet. Rés. 43, 764-767 (1982)]. A Pasteure//a-fertőzés különböző problémákat okoz a kérődzőkben, főként a szarvasmarhában és a juhban. Tőgygyulladás és tüdőgyulladás egyaránt megfigyelhető juhokban és szarvasmarhákon, míg a szállítási láz („shipping fever) további problémákat okoz szarvasmarháknál. A Pasteurella-lertözés okozta gazdasági károk nagyok. Más, nem a HAP-csoportba tartozó baktériumokról is ismert, hogy RTX-toxinokat termelnek. Az E. coli hemolizinje sok állatfaj sokféle sejtjére toxikus hatású. Pár perccel a kontaktus után a vörösvértesteket lizálja sok állatfajban [Cavalieri, S. J. és Snyder, I. S.: Inf. & Imm. 37, 966-974 (1982), Gadeberg és munkatársai: Inf & Imm. 41, 358-364 (1983), Keane és munkatársai: Am. J. Pathol. 126, 305-357 (1987), Bhadki és munkatársai: J. Exp. Med. 169, 737-754 (1989)]. A Bordetella pertussis hemolizinje szintén széles gazdasejt specifitást mutat. [Shattuck, R. L. és Storm, D. R.: Biochemistry 24, 6323-6328 (1985), Hewlett és munkatársai: Protein Bacterial Toxins, Rappuoli, R. és munkatársai (szerk.), Stuttgart, Fisher-Verlag könyvben 249-257 (1990)].
A Gram-negatív baktériumok RTX-toxinjainak szintézisét befolyásoló operonok genetikai szerveződéséről, az aktiválásról és transzportálásról részletes összefoglalót írt Coote, J. G. [FEMS Microbiology Reviews 88, 137-162 (1992)]. Általánosságban az RTXoperon négy génből áll: a toxin génből (A), az aktivátor génből (C) és két további génből [B és D (valamint a Bordetella pertussisban E)] amelyek a toxinnak a külső médiumba történő szállításáért felelős fehérjéket kódolják. A toxin gén (A) elsődleges transzlációs terméke egy nem toxikus fehérje.
Az aktivátor génnek (C) kiemelt fontossága van, mert a gén által kódolt géntermék aktiválja az RTX-toxin toxikus aktivitását egy poszttranszlációs módosítással. Ez az aktiválódás a toxin strukturális módosulását eredményezi. Például a Bordetella pertussis esetében a poszttranszlációs módosításkor az RTX-toxin egyik lizin oldallánca amidkötéssel palmitoilálódik [Hackett és munkatársai: Science 266, 433-435 (1994)]. Az E. coli RTX-toxinja in vitro aktiválható egy acilcsoportnak az acilszállító fehérjéről a prohemolizinre történő transzferével [Issartel és munkatársai: Natúré 351, 759-761 (1991)].
Jól ismert, [lásd például Coote J. G.: FEMS Microbiology reviews 88, 137-162 (1992)], hogy az RTX-toxinok nagyon fontos virulenciafaktorok a Pasteurellaceae családba tartozó baktériumok számára. Ezt mutatják be például az Actinobacillus pleuropneumoniae esetében Tascon és munkatársai [Mól. Microbiol. 14,
HU 226 219 Β1
207-216 (1994)], valamint Jansen és munkatársai [Inf. & Imm. 63, 27-37(1995)].
Fontos cél, hogy a vakcinák tartalmazzák a virulenciafaktorokat. Ezért különféle próbálkozások történtek, hogy a vakcinák alkotórészei legyenek az RTX-toxinok is. A HAP-csoport in vivő szintetizált RTX-toxinjai per se termelődnek az RTX-aktivátor fehérje jelenlétében. így az RTX-toxinok poszttranszlációsan minden esetben nagyon toxikus fehérjékké alakulnak. A nagy toxicitásukat figyelembe véve világos, hogy az RTX-toxinokat detoxikálni kell, mielőtt vakcinaként felhasználnák.
Olyan vakcina-alkotórészt már korábban leírtak, amely az A. pleuropneumoniae in vivő szintetizált, majd toxicitását vesztett RTX-toxinját tartalmazta, mint például EP No. 0.354.628 szabadalmi leírásban, ahol a vakcina az A. pleuropneumoniae hemolizinjét és citotoxinját tartalmazta, valamint az EP No. 0.453.024 szabadalmi leírásban, ahol az A. pleuropneumoniae vakcina hemolizint, citotoxint és külső membránfehérjéket tartalmazott.
Pasteurella haemolytica RTX-toxint tartalmazó vakcinát írtak le például az U. S. Pat. No. 5,055,400, a CA 2,014,033 és a CA 2,081,950 szabadalmi leírásban.
Vakcinákban felhasználható RTX-toxinokat könnyű kinyerni a vad típusú törzsek kultúrájának felülúszójából. Az RTX-toxinok kinyerésére szolgáló másik eljárást a CA2,045,950 szabadalmi leírásban mutatták be, eszerint az A. pleuropneumoniae RTX-toxinját heterológ expressziós rendszerben E. coli heterológ baktériumtörzsben termeltették. Ugyanakkor nem számoltak be az így kinyert RTX-toxinnal végzett vakcinálási kísérletről. Hasonló megközelítést javasoltak vakcina-alkotórész termelésére az EP 0.500.736 szabadalmi leírásban. A szabadalomban mind az RTX-toxin- (A), mind az aktivátor fehérje génjét (C) bemutatták. Ugyancsak leírták a heterológ expressziós rendszerben a toxin gén (A) expresszióját az aktivátor gén (C) jelenlétében és hiányában. Ugyanakkor nem közöltek vakcinációs kísérleteket a toxinnal.
Az RTX-toxint tartalmazó vakcinák mindegyikének három fő hátránya van:
- nagy mennyiségű antigén szükséges az immunrendszer megfelelő szintű aktiválásához,
- általában csak a B-sejtes immunitás aktiválható,
- az élő, patogén baktérium nagyon sok immunogén molekulát tartalmaz, úgymint külső membránfehérjéket és a tokot alkotó poliszacharidokat, amelyek mind nagyon fontosak a védettség kialakításában. Ezért egy hatékony vakcinának annyi immunológiailag fontos antigént kell tartalmaznia, amennyit csak lehetséges.
Az első és második, de különösen a harmadik pontban említett szembeszökő problémák teszik nehézzé egy hatékony vakcina-alkotórész elkészítését. Ezt példázza az EP No. 0.453.024 szabadalmi leírásban bemutatott A. pleuropneumoniae vakcina, amelyben négy különböző alkotórészt (három RTX-toxint és egy külső membránfehérjét) kombináltak egy vakcinában.
Hogy a vakcina-alkotórészek hátrányait kiküszöbölhessék, a Pasteurellaceae-fertözés ellen élő, legyengített vakcinára volna szükség. Az élő, legyengített vakcina a következők miatt előnyös:
- alacsony dózisban kell beadni (mert önreproduktív),
- nagyon hasonló a természetes/vad típusú fertőzéshez,
- egyidejűleg tartalmaz minden lehetséges, immunológiailag fontos antigént.
A felsorolt előnyök ellenére olyan élő vakcinát, amely kevésbé aktív RTX-toxint termelő, HAP-csoportba tartozó baktériumon alapult volna, még nem sikerült a jelen találmány megalkotásáig létrehozni. Az élő, legyengített vakcina hiányának okát a következő paradoxon illusztrálja:
- Az élő, legyengített vakcinatörzs legjellemzőbb tulajdonsága, hogy nem termelhet aktív RTX-toxint, azt az RTX-toxint, ami virulenssé teszi a HAP-csoportba tartozó baktériumokat.
- Az olyan élő, legyengített baktérium, ami úgy lett legyengítve, hogy nem képes RTX-toxint termelni, tehát hiányzik belőle a legfontosabb virulenciafaktor, nem aktiválja a toxin ellen az immunrendszert.
Ezért, ha egy virulens, vad típusú, HAP-csoportba tartozó baktérium okozta betegség elleni vakcinaként HAP-csoportba tartozó, RTX-gén(ek)-re nézve deléciós törzset használnak, az lesz a következmény, hogy csak részleges védelmet nyújt: a vad típusú baktériumok legfontosabb virulenciafaktora, - az RTX-toxin ellen nem ad immunológiai védelmet.
Ezért RTX-toxinban deléciós baktériumot tartalmazó vakcina nem képes megadni a kívánt védelmet a vad típusú fertőzés után az RTX-toxin káros hatásai ellen. Reimer és munkatársai [Microbial. Pathog. 18, 197-209 (1995)] előállítottak egy olyan törzset, amelyből hiányzott az apxl-operon minden olyan génje, ami az A. pleuropneumoniae Apxl-toxin szintéziséhez és transzportjához szükséges. A törzs nem virulens, mint az várható volt, mivel nem exkretálja többet a legfontosabb virulenciafaktort, az RTX-toxint, és ennek következtében nem indukál az RTX-toxin ellen ellenanyagtermelést.
Ez a találmányi leírás az első, amelyben a Pasteurellaceae családba tartozó élő, legyengített, RTX-toxint termelő baktériumról számolunk be, amely termel RTXA-toxint, de nem aktív formában. Ezeknek a baktériumoknak megvan az a figyelemre méltó tulajdonságuk, hogy egyrészt legyengítettek, másrészt mégis képesek RTX-toxint termelni.
Ehhez az eredményhez úgy kellett módosítanunk a baktériumot, hogy ne termeljen RTX-aktivátor fehérjét. Ugyanakkor az RTX-A-toxin expressziója nem változott.
A találmány szerinti élő, legyengített törzsek vakcinaként történő felhasználásának előnyei az élő, RTXtoxin deléciós törzsekkel szemben a következők:
- termelnek RTX-toxint, így a toxin ellen ellenanyag-indukció történik,
- ezenfelül a virulenciájuk gyengített, mert az RTXtoxin nem toxikus formában termelődik,
HU 226 219 Β1
- minden más antigént tartalmaz, ami az RTX-toxinon kívül szükséges a hatékony immunválasz kiváltásához.
Az RTX-A-toxin nem aktivált formáját nem tartják toxikusnak, mert nincs meg az a toxikus hatása, mint az aktivált toxinnak. Mint feljebb említettük, ezt úgy értük el, hogy a baktériumokat úgy módosítottuk, hogy ne termeljenek funkcionális RTX-aktivátor fehérjét. Ugyanakkor az RTX-A-toxin expressziója nem változott.
Funkcionális „RTX-aktivátor fehérjeiként definiálunk minden olyan fehérjét, amely olyan jellegzetességekkel bír, mint egy vad típusú baktérium által termelt RTX-aktivátor fehérje, és a vad típus mennyiségével azonos szinten expresszálódik. így a nem funkcionáló RTX-aktivátor fehérje olyan fehérje, amelynek hiányzik néhány, vagy az összes olyan tulajdonsága, mint amilyennel egy vad típusú baktérium által termelt fehérje rendelkezik, és/vagy olyan mennyiségben termelődik, amely lehetetlenné teszi a vad típusú törzs aktivált RTX-toxin szintjének elérését. Itt a következőket kell hangsúlyoznunk: ha a nem funkcionális RTX-aktivátor fehérjének a vad típusú baktérium által termelt RTX-aktivátor fehérje tulajdonságainak mindegyike hiányzik, akkor a baktérium nem fog aktivált RTX-toxint termelni. Ugyanakkor, ha a nem funkcionális RTX-aktivátor fehérjének a vad típusú baktérium által expresszált RTXaktivátor fehérje tulajdonságainak csak egy része hiányzik, a baktérium által termelt RTX-toxin egy része aktív, másik része inaktív lesz. Ezt okozza például, ha egy mutáció következtében az aktivátor fehérje termelődik ugyan, de az aktiválás hatékonysága csökken. Az aktiválódás sebessége az a sebesség, amellyel az aktivátor fehérje aktiválja az RTX-toxint, azaz a nem aktivált RTX-toxin formából aktív forma lesz. Magától értetődik, hogy a baktériumok, amelyek által termelt RTXtoxin egy része nem aktivált formában, egy része pedig aktivált formában lesz jelen, szintén a találmány tárgyát képezik.
Csökkent aktivitású RTX-aktivátor fehérje nem képes a vad típusra jellemző aktivált RTX-toxin mennyiséget előállítani. Ugyancsak ezt eredményezi, ha az RTXaktivátor fehérje mennyisége kisebb, vagy a két lehetőség kombinálódik. Következésképpen a csökkent aktivitású és/vagy a csökkent expressziós szintű RTX-aktivátor fehérjék szintén találmányunkba tartoznak.
Egy alternatív megoldás, ha az RTX-aktivátor fehérje célpontját módosítjuk, tehát ha az RTX-toxin acilezési helyét megváltoztatjuk. Ha ez a helymódosítás olyan mértékű, hogy ennek hatására lecsökken vagy hiányzik az acilálás, ugyancsak nem aktív RTX-toxin keletkezik. Az acilálás helye rekombináns DNS technikával könnyen mutáltatható. Mutáció jöhet létre például egy olyan restrikciós fragmens deléciójával, ami magában foglalja az acilálás helyét, vagy az acilálás helyének helyspecifikus (site-directed) mutagenezisével.
A nem funkcionális RTX-aktivátor fehérje miatt legyengített, élő baktérium több eljárással is elkészíthető. Az egyik lehetőség az, hogy mutációt juttatunk be az RTX-aktivátor fehérjét kódoló génbe rekombináns DNS technikák felhasználásával. Mutáció alatt a genetikai információ megváltozását értjük, ami a vad típusú baktérium genomjának ezen régiójában kódolt genetikai információban történik. Mutáció lehet például egy nukleinsav-kicserélődés, deléció, inszerció vagy inverzió, vagy ezek kombinációja, amely azt eredményezi, hogy a baktérium funkcionális RTX-aktivátor fehérje termelése sérül.
A HAP-csoportba tartozó, RTX-toxint termelő törzsek RTX-aktivátor fehérje génjeinek lokalizációjáról, restrikciós mintázatáról és szekvenciájáról sokat tudunk. Ezen információk megtalálhatóak például Coote J. G. munkájában [FEMS Microbiology reviews 88, 137-162 (1992)], amely áttekintést ad a különböző RTX-toxinok strukturális és funkcionális összefüggéseiről. Nagyon részletes információk találhatók a specifikus RTX-toxinokról az U. S. Pat. No. 5,055,400 szabadalmi leírásban, ami a Pasteurella haemolytica RTXgénjét közli, valamint Frey és munkatársai: J. Gén. Microbiol. 139, 1723-1728 (1993) és Frey és munkatársai: Proceedings of the HAP-conference U. K., Edinburgh 1994 munkákban, amelyek az A. pleuropneumoniae RTX-toxinjának szintézisében és transzportjában részt vevő gének szerepét tárgyalják. Az RTX-aktivátor fehérjét kódoló gén, vagy a transzkripcióra, illetve transzlációra ható szekvenciák mutációja többféle eljárással idézhető elő. Az egyik lehetőség, hogy egy vektorba klónozzuk az RTX-aktivátor gén releváns szekvenciáit, majd a restrikciós enzimekkel kivágott, az RTX-szekvenciák egy részét, vagy a teljes szakaszt tartalmazó mutáltatott szekvenciákkal kicseréljük a vad típusú RTX-toxin gént. Ilyen kicserélődés megvalósítható például a jól ismert homológ rekombinációs technikával. Egy másik lehetőség a kívánt mutáció elérésére a helyspecifikus mutagenezis (site-directed mutagenesis). Az általánosan elfogadott technikai leírás megtalálható Sambrook és munkatársai „Molecular Cloning: a laboratory manual [Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] könyvben.
Tehát a találmány megvalósításának előnyös módja az, ha olyan baktériumot állítunk elő, amely mutáns RTX-aktivátor fehérjét kódoló gént hordoz. A mutáció lehetőséget adhat egy, a mutáció mértékétől és jellegétől függő, csökkent aktivitású, vagy teljesen inaktív RTX-aktivátor fehérje előállítására.
A találmány egy előnyösebb megvalósítási módja szerint az RTX-aktivátor fehérjét kódoló gént deléció bevitelével mutáltatjuk. A deléció nagyon változatos méretű lehet, lehet olyan kicsi, hogy csak egy nukleotid hiányzik, ami frame-shift mutációt okoz. Másrészt viszont a teljes RTX-aktivátor fehérjét kódoló gén is deletálódhat.
Egy másik lehetőség, hogy az RTX-aktivátor fehérjét kódoló gént épségben hagyjuk, de lecsökkentjük az RTX-aktivátor fehérje expressziójának szintjét. Mivel a toxin gén és az aktivátor gén egy közös promoterről policisztronos messenger RNS-ként transzkrlptálódik, így nem lehetséges a transzkripció szintjét úgy csökkenteni, hogy az RTX-toxin expressziójának szintje ne csökkenjen vele együtt. Ugyanakkor az RTX-aktivátor fehérje expressziójának a szintje módosítható azzal,
HU 226 219 Β1 ha rekombináns DNS technika felhasználásával az RTX-aktivátor fehérjét kódoló gén előtt 5’-irányban („upstream”) a riboszómakötő helyet mutációval megváltoztatjuk.
Tehát a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a baktérium az RTX-aktivátor mRNS transzlációs kontroll régiójában, tehát a riboszóma kötőhelyen hordoz mutációt. Az ilyen mutáció hatással van az RTXaktivátor fehérjét kódoló RNS-ről történő transzláció hatásfokára. A riboszóma kötőhely általában könnyen megtalálható a konszenzusszekvencia, illetve az elhelyezkedése alapján; a riboszóma kötőhely és a startkodon között 5-6 nukleotid távolság van. Számos esetben közöltek ilyen szekvenciát, például az A. pleuropneumoniae különböző RTX-aktivátor génjeinek esetében [Frey és munkatársai: Gene 142, 97-102 (1994)].
A találmány egy még előnyösebb megvalósítási módja szerint az RTX-aktivátor mRNS transzlációt szabályozó régiója deléciós mutációt tartalmaz. A deléció magában foglalhatja a riboszóma kötőhely egy vagy több nukleotidjának delécióját.
Egy további lehetőség arra, hogy élő, legyengített, funkcióképtelen RTX-aktivátor fehérjét termelő baktériumot állítsunk elő, ha antiszensz RNS-t kódoló nukleinsavszekvenciát juttatunk a baktériumba, amely képes megkötni az aktivátor fehérjét kódoló messenger RNS-t. A szekvencia expressziója így az aktivátor fehérje szintjének csökkenéséhez vezet. Az antiszensz RNS olyan RNS, amely részlegesen, vagy teljesen a komplementer szekvenciáját alkotja annak a messenger RNS-nek (mRNS), amelyre antiszensz.
A találmány legelőnyösebb megvalósítási módja esetén a találmány szerinti élő, legyengített baktérium az Actinobacillus pleuropneumoniae.
A találmány tárgyát képezik olyan vakcinák is, melyek védettséget biztosítanak állatok számára a Pasteurellaceae családba tartozó, RTX-toxinokat termelő baktériumok által okozott fertőzések ellen. A vakcina a találmány szerinti élő, legyengített, RTX-toxint termelő baktériumot és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
A találmány szerinti vakcina legalább immunológiailag hatékony mennyiségben tartalmazza az élő, legyengített, találmány szerinti RTX-toxint termelő baktériumokat. Az „immunológiailag hatékony mennyiség azt a mennyiséget jelenti az élő, legyengített, RTX-toxint termelő baktériumokból, amely a vakcinálás folyamán elegendő mértékben indukálja a gazdaszervezetet egy hatékony immunválasz kiváltására az RTX-toxint termelő, virulens baktériumok ellen.
A beadandó hatásos dózis nagyban függ a kortól, a súlytól és a vakcinálandó emlősállattól, a kivitelezés módjától és a patogén típusától, amire a vakcinálás irányul.
A vakcina bármely olyan dózisban tartalmazhatja a baktériumot, amekkora elegendő az immunválasz kiváltásához. A 103 és 101° közötti baktériumot tartalmazó dózisok például nagyon alkalmasak. A találmány szerint az immunológiailag hatékony mennyiségű élő, legyengített, RTX-toxint termelő baktériumok mellett a vakcina még gyógyászatilag elfogadható hordozót is tartalmaz. A hordozó lehet olyan egyszerű, mint a víz, de tartalmazhat például a baktériumkultúra-tápfolyadékot is. További használható hordozó lehet például a fiziológiás sóoldat. A találmány szerint más gyógyászatilag elfogadható hordozók, oldószerek is felhasználhatók, beleértve a stabilizátorokat, mint az SPGA, szénhidrátokat (például szorbitol, mannitol, keményítő, szacharóz, glükóz, dextrán), proteineket, mint az albumin vagy kazein, valamint fehérjetartalmú anyagokat, mint a szarvasmarhaszérum, vagy fölözött tej, továbbá puffereket (például foszfátpuffer).
A vakcinához adott esetben egy vagy több adjuváns aktivitással rendelkező komponens adható. Az adjuvánsok nemspecifikusan stimulálják az immunrendszert, ezáltal felerősítik a gazdaszervezet immunválaszát a támadó patogén ellen. Ismert példák az adjuvánsra a Freund komplett és nem komplett adjuváns, az E-vitamin, a nemionos blokkpolimerek, a muramildipeptidek, az immunstimuláló komplexek (ISCOM, például EP109942 szabadalmi leírás), a szaponinok, az ásványi olajok, a növényi olajok és a karbopol (egy homopolimer). Speciálisan mucinózus anyagok esetén használható adjuvánsok például az E. coli hőérzékeny toxinja (LT), vagy a koleratoxin (CT). Más, alkalmas adjuvánsok, például az alumínium-hidroxid, -foszfát vagy -oxid, az olajemulziók (például Bayol F<R> vagy Marcol 52<r)), a szaponinok vagy E-vitamin, szolubilizálnak.
A találmány szerinti vakcina előnyösen tartalmaz adjuvánst is. A találmány szerinti a vakcinával többek között intranazálisan, intradermálisan, szubkután, aeroszolként vagy intramuszkulárisan kezelhetjük az állatokat.
A találmány megvalósításának különösen előnyös módja, ha a vakcina más patogén mikroorganizmusok vagy vírusok egy vagy több kiválasztott antigénjét is tartalmazza. A vakcina a találmány tárgyát képező, élő, legyengített, RTX-toxint termelő baktériumok mellett más patogén mikroorganizmusok vagy vírusok egy vagy több kiválasztott antigénjét és a gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz. Természetesen lehetőség van nemcsak egy vagy több antigén, hanem egy vagy több teljes patogén alkalmazására is, amelyek inaktivált és élő formában is lehetnek. Alternatív lehetőség, hogy más patogén mikroorganizmusok vagy vírusok kiválasztott egy vagy több antigént kódoló genetikai információját az élő, legyengített, RTX-toxint termelő baktériumokba klónozzuk az ismert rekombináns DNS technikák felhasználásával. A találmány szerinti baktériumok legyengített jellegüknél fogva széleskörűen felhasználhatók hordozóként, úgymint vektorai ezen genetikai információknak. A vakcinában lévő, a találmány szerinti baktériumok olyan genetikai információkkal ruházhatók fel, amelyek más patogén mikroorganizmusok vagy vírusok egy vagy több kiválasztott antigénjét kódolják, így egyidejűleg két vagy több betegség elleni immunizálás végezhető el. Az így elvégzett vakcinálás mind gyógyászati, mind fizikai szempontból kisebb stresszt okoz az állatnak, mint ha minden egyes patogénnel elkülönülten vakcinálnák.
HU 226 219 Β1
A találmány megvalósításának különösen előnyös módja az, ha a vakcina a találmány szerinti élő, legyengített, RTX-toxint termelő, Actinobacillus pleuropneumoniaa genusba tartozó baktériumot tartalmaz.
A találmány egy mégelőnyösebb megvalósítási módja szerint a vakcina az elmondottakon túl tartalmaz
- például az alábbi patogének bármelyikéből származó
- további antigéneket is: sertés reproduktív légzőszervi szindróma vírus [Porcine Reproductive Respiratory Syndrome (PRRS)], az Aujeszki (Pseudorabies) vírus, a sertésinfluenza-vírus, a sertés parvovírus, a fertőző Gastroenteritis-vírus, a rotavírus, az Escherichia coli, az Erysipelothrix rhusiopathiae, a Pasteurella múltoddá, a Bordetella bronchiseptica, a Haemophilus parasuis és a Streptococcus suis.
A találmány megvalósításának másik, mégelőnyösebb módja az, hogy a vakcina a találmány szerinti élő, legyengített, RTX-toxint termelő, a Pasteurella haemolytica genusba tartozó baktériumot tartalmaz.
Még előnyösebb a találmány megvalósításának szempontjából, ha ez a vakcina ezenkívül tartalmazza más, szarvasmarha-patogén mikroorganizmusok és vírusok - a szarvasmarha-rotavírus, a szarvasmarha vírusos Diarrhoea-vírus, a 3-as típusú parainfluenzavírus, a szarvasmarha-paramyxovírus, a száj- és körömfájás vírus, a Pasteurella múltoddá, a Haemophilus somnus, a Brucella abortus, a Staphilococcus aureus, a Streptococcus spp., a Mycoplasma spp. és a szarvasmarha respirator szincícium vírus (Bovine Respiratory Syncytial Vírus) - kiválasztott antigénjeit is.
Az élő organizmusok tárolására különböző eljárások vannak. A hűtőszekrényben tartás például egy jól ismert eljárás. Ugyancsak gyakran használt eljárás a glicerintartalmú pufferben -70 °C-on való tárolás. A baktériumok folyékony nitrogénben is tarthatók. A fagyasztva szárítás egy másik módszer a tárolásra. A fagyasztva szárított baktériumok sok évig is tárolhatók életképesen. A fagyasztva szárított baktériumok akár 0 °C feletti tárolási hőmérsékleten sem veszítik el az életképességüket. A fagyasztva szárítást az általánosan használt fagyasztva szárítási eljárásoknak megfelelően kell elvégezni. A fagyasztva szárítási eljárás során tetszőleges, a hatékonyságot javító adalékok adhatóak, mint például a fölözött tej, a trehalóz, a zselatin vagy a szarvasmarha-szérumalbumin. A találmány megvalósításának előnyös módja szerint a vakcina fagyasztva szárított formában van.
A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti vakcinák alkalmazása védettség kialakítására, a Paseurellaceae családba tartozó baktériumok általi fertőzésre fogékony állatokban.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti vakcinával fogékony állatokban védettséget hozunk létre az Actinobacillus pleuropneumoniae fertőzés ellen.
A találmány tárgyát képezik eljárások is Pasteurellaceae családba tartozó élő, legyengített, RTX-toxint termelő baktériumok előállítására. A találmány szerinti eljárások szerint az RTX-aktivátor fehérjét kódoló gént elmutálta tjük.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a kialakítandó mutáció az RTX-aktivátor fehérje génjében végrehajtott deléció.
A találmány tárgyát képezik végül eljárások is olyan vakcinák előállítására, melyekkel állatokban védettség alakítható ki az RTX-toxint termelő, Pasteurellaceae családba tartozó baktériumok fertőzése ellen. Az egyik találmány szerinti eljárás végrehajtásakor a találmány szerinti baktériumokat gyógyászatilag elfogadható hordozóval keverjük össze.
1. példa
Élő, legyengített Actinobacillus pleuropneumoniae törzs előállítása A pApxl-D11 konstruálása A találmány szerinti élő, legyengített baktériumok megvalósíthatóságának szemléltetésére Actinobacillus pleuropneumoniae AapxlC mutánst konstruáltunk. A mutáció bevitelére elsőként egy olyan plazmidot állítottunk elő, amely az RTX-aktivátor gén deléciós változatát tartalmazta. Az 1. ábrán látható a konstruálás vázlata. Az A. pleuropneumoniae apxl operon szekvenciája a GenBank X52899 száma alatt található. pJFF750 plazmidból [Gygi és munkatársai: Infect. Immun. 60, 3059-3064, (1992)] az apxlC és apxl A géneket és a promoterrégiót tartalmazó 4481 bp hosszúságú Bglll/Pstl fragmenst a BamHI- és Pstl-enzimekkel emésztett pGEM3Z plazmidba (Promega Co., Leiden NL) klónoztuk át. Az így kapott plazmidot pApxl-D1ként jelöltük. Xhol restrikciós enzimmel emésztve, egy 407 bp hosszúságú fragmenst kivágtunk, amely az ApxlC kódolórégiójának nagy részét tartalmazta, majd Sspl restrikciós enzimmel részlegesen emésztettük a plazmidot. A túlnyúló ragadós véget S1-nukleázzal tompa végűre alakítottuk, és a megközelítőleg 6800 bp méretű fragmenst agarózgélből izoláltuk, és visszazártuk. A kapott plazmidot pApxl-D2-ként jelöltük. Az Xhol/Sspl deléció szekvenciáját nukleinsavszekvenciaanalízissel ellenőriztük le. Ezt követően az ApxIA kódolórégiók nagy részét kivágtuk Afllll/Smal emésztéssel, S1-nukleázzal tompa véget alakítottunk ki, majd visszaligáltuk. Az allélikus cseréhez szükséges kazettát a pApxl-D3 plazmidból Pstl és Sacl enzimmel egy 1454 bp hosszú fragmensen kivágtuk, és átklónoztuk az ugyanezen enzimekkel emésztett pJQ200KS plazmidba [Quandt és munkatársai: Gene 127, 15-21, (1993)]. A így kapott plazmidot pApxl-D4-ként jelöltük. A pApxl-D4 plazmidból a sacB gén 3’-végét Hpal emésztéssel eltávolítottuk, és kicseréltük a pAP13 plazmidból [Prentki és munkatársai: Gene 103, 17-23, (1991)] EcoR V enzimmel kivágott 540 bp hosszú rpsL génnel. Az így kapott plazmidot pAPxl-D11 plazmidnak neveztük el.
A kapott pAPxl-D11 plazmid struktúráját különböző restrikciós enzimek emésztésével ellenőriztük le. A emésztési mintázat szerint a kívánt plazmidot állítottuk elő. A plazmidot a továbbiakban a AapxlC mutáns előállításához használtuk fel.
HU 226 219 Β1
A ÁapxlC mutáns Actinobacillus pleuropneumoniae
HV211-törzs előállítása
A pApxl-D11 plazmidot használtuk fel az allélikus kicseréléshez. Ennek érdekében E. coliból a standard „filter mating technikát [De Lorenzo és Timmis, Methods Enzymol. 235, 386-405, (1994)] felhasználva konjugációval juttattuk át az A. pleuropneumoniaebe a konstrukciót. Az MBHPP101 jelű E. coli donor úgy készült, hogy a pApxl-D11 plazmiddal SM10 λρϊτ sejtet [Miller és Mekalanos: J. Bacteriol. 170, 2575-2583, (1988)] transzformáltunk. Az MBHPP105 jelű A. pleuropneumoniae akceptortörzset a 10-es szerotípus mezőn izolált HV211 [egyike a tesztelt törzseknek Beck és munkatársai: J. Clin. Microbiol 32, 2749-2754, (1994)] sztreptomicin, majd ezt követően sztreptomicin és naladixinsav jelenlétében növesztett kultúrájából (R-törzs) izoláltuk. A konjugáció után a naladixinsavés gentamicinrezisztens A. pleuropneumoniae exkonjugánsokat a szelekció után a szilárd táptalajon kaptuk meg. A cirkuláris plazmidként, vagy az Apxl-operonban integrálódott formában pApxl-D11-DNS-t hordozó telepeket Southern-hibridizációval azonosítottuk. Ennek eredményét mutatja be a 2. ábra bal oldali panelje, ahol a feltüntetett törzs DNS-e a pAPxl-D 11-plazmid 1,478 kb Sall/Sacl-fragmensével hibridizál. További naladixinsav jelenlétében történt növesztés után a törzs naladixinsavtartalmú véragarra lett kikenve, és egy, a hemolitikus zónán kívüli A. pleuropneumoniae telepet azonosítottunk.
A kapott törzset MBHPP113-ként jelöltük, Southern-hibridizációval igazoltuk, hogy az 10-es szerotlpusú A. pleuropneumoniae ApxlC negatív mutáns (2. ábra). A terveinknek megfelelően az MBHPP113-as törzs Sspl emésztett kromoszomális DNS-e csak egy „band”-ben hibridizált a próbához a deléciós régió széli szekvenciáin (2. ábra bal oldali panel). A „bánd” mérete (körülbelül 4,4 kb) megfelel a kiindulási törzs 2 hibridizáló „band'-jéből számítottnak, levonva belőle a 407 bp deléciót. Mindezen túl a Southern-hibridizáció eredménye szerint a plazmid nem maradt fent az MBHPP113-as törzsben (2. ábra, középső panel). A legfontosabb, hogy az MBHPP113-as törzsben nincs jelen az apxlC gént tartalmazó Sspl/Xhol fragmens (2. ábra, jobb oldali panel).
2. példa
Vizsgálatok a ÁapxlC mutáns MBHPP113-as RTXtoxin expressziójára, exkréciójára és a hemolitikus aktivitás hiányára
A hemolitikus aktivitás hiánya ÁapxlC mutáns MBHPP113-as A. pleuropneumoniae törzsben
Az MBHPP113-as törzs ÁapxlC deléció hatásának demonstrálására a ÁapxlC MBHPP113-as törzs hemolitikus aktivitását a vad típusú kiindulási törzsével hasonlítottuk össze, véragaron növesztve. Az összehasonlításba bevontuk a 7-es szerotípusba tartozó A. pleuropneumoniae referenciatörzset is, amely csak az Apxll-t termeli. Az Apxll moderált hemolitikus aktivitása miatt ez a törzs egy intermedier hemolízís értéket mutat. Az egyedi kolóniákat steril fogpiszkálóval 0,1%
NAD és 2% birkavörösvértest-tartalmú Columbia-agarlemezre szúrtuk át.
Ahogy a 3. ábra mutatja, 8 óra 37 °C-on történő növesztés után a vad típusú HV211-es, az MBHPP 105-ös (R, mint rezisztens törzs) és a plazmid-integrációs mutáns (I) körül az elvártaknak megfelelően kialakult egy hemolitikus zóna. A 7-es szerotípusba tartozó A. pleuropneumoniae referencia törzs (amely csak az Apxll-t termeli) intermedier hemolízís értéket mutatott. A vártnak megfelelően nem mutatható ki hemolitikus zóna a ÁapxlC MBHPP 113-as törzs körül (Á-ként jelölve a
3. ábrán). A kísérlet egyértelműen igazolta, hogy a ÁapxlC MBHPP113-as törzs nem termel aktivált Apx-toxint.
A ÁapxlC MBHPP113-as törzs apxIA expressziója és exkréciója
Az ApxIA fehérje exkrécióját monospecifikus antiApxIA ellenanyaggal a különböző A. pleuropneumoniae törzsek folyékony kultúrájának felülúszójából a leírtak szerint [Beck és munkatársai: J. Clin. Microbiol., 32, 2749-2754 (1994)] vizsgáltuk, összehasonlításul anti-ApxllA szérumot és különböző szerotípusba tartozó vad típusú törzseket használtunk. Az A. pleuropneumoniae telepeket csokoládé-agarlemezről („chocolate agar”) 5 ml 0,1% NAD-tartalmú Columbia Broth táptalajba oltottuk, és 6 órán keresztül, 37 °C-on 200 ford./perccel rázatva inkubáltuk. A sejtmentes táptalaj-felülúszót 30 perc 10 000 g-n történt centrifugálás után nyertük. Az ApxIA fehérjét Centricon-100 (Milllpore Co., Etten-Leur, NL) koncentrálószűrőn a gyár utasításainak megfelelően 20-szorosára töményítettük. A poliakrilamid-gélen történt elektroforézis után a fehérjéket átblottoltuk, majd monospecifikus anti-ApxIA és anti-ApxllA szérummal reagáltattuk. A csokoládéagar összetétele: KH2PO4 (1 9). K2HPO4 (4 g), NaCI (5 g), proteóz pepton No 3 (15 g), keményítő (1 g), Bacto agar (15 g), steril víz (1000 ml végtérfogatra feltöltve), birkavér (100 ml), lószérum (100 ml) és Isovitalex-oldat (12 ml).
A koncentrált kultúra-felülúszókat parallel poliakrilamid-gélen elektroforetizáltuk és Immobilion-P membránra elektroblottoltuk, amit a 4. ábra mutat. A kapott „blot”-ot az A panel esetében monospecifikus anti-ApxlA szérummal reagáltattuk, míg a B panel esetében anti-ApxllA szérumot használtunk. A vizsgálatban HV211-es (vad típus), MBHPP105 (R, rezisztens törzs), plazmid-integrációs mutáns (I), MBHPP113-as (Á) (lásd a ÁapxlC mutáns kialakítása Actinobacillus pleuropneumoniae HV211-es törzsből) és vad típusú, 6-os, 5a és 5b szerotípusba tartozó referenciatörzseket használtunk. A vad típusú 6-os szerotípusba tartozó referenciatörzs ApxllA toxint termel, de nem termel ApxIA-t.
Amint az a 4. ábrán látható, a WT, R, I és Λ mezőkben megjelenő 105 kD méretű „bánd mutatja, hogy a vad típushoz hasonlóan az R-törzs, az l-törzs és az MBHPP113-as törzs is termeli és exportálja az ApxIA fehérjét.
A 2. példa kísérleti eredményeiből következik, hogy az A. pleuropneumoniae MBHPP113-as törzse képes expresszálni és exportálni az RTX-toxint nem aktivált formában.
HU 226 219 Β1
3. példa
A ÁapxlC/AapxllC mutáns Actinobacillus pleuropneumoniae 4074-es törzsének előállítása A AapxlC mutáns 4074-es törzs konstruálása az 1.
példa szerint történt. Az MBHPP104-es A. pleuropneumoniae akceptortörzset az 1-es szerotípusú 4074-es referenciatörzsből [Frey és Nicolet: J. Clin. Microbiol. 28, 232-236 (1990)] sztreptomicin, majd sztreptomicin és naladixinsav jelenlétében történt növesztésével hoztuk létre. Az MBHPP104-es és MBHPP101-es törzsek konjugációja után (1. példa leírása) naladixinsav- és gentamicinrezisztens A. pleuropneumoniae exkonjugánsokat kaptunk. A telepeket 2%-os birka-vörösvértest, 0,1 %-os NAD és naladixinsav jelenlétében CBM-lemezekre kikenve, néhány kolónia kisebb hemolitikus zónát képzett. Ezek közül az egyiknél, az MBHPP111-es jelű esetében Southern-hibridizációval igazoltuk, hogy az egy AapxlC negatív mutáns A. pleuropneumoniae 4074-es törzs. Az apxllC deléciót az apxlC delécióhoz hasonló módon végeztük el az MBHPP111 törzsben, amihez a pApxll-D2 konstrukciót (a pApxl-D11 helyett) konjugációval juttattuk be a donorként használt MBHPP142-es törzsből. A pApxll-D2 plazmid konstruálását az 5. ábra mutatja. A pJFFapxllCU15 plazmid konstruálásához a 4074-es törzs kromoszomális DNS-ének parciális Sau3AI emésztéséből származó, 4,3 kb hosszúságú fragmenst, amely az apxllC és apxllA géneket tartalmazta, λΖΑΡ Express (Stratagene Co.) vektorba klónoztuk, majd „helper-fág felhasználásával a pBK-CMV vektorként (Stratagene Co.) kivágtuk onnan. A kódolórégió „frame”-be történő deléciójához az APXIIC-OL (5'-CAATACCTTAAGATCATTTTTTAGCATCATCCC) és APXIIC-OR (5’-ACATTTCTTAAGTATGAGCAAGAGTTAATAACAGC) oligonukleotidok felhasználásával polimeráz-láncreakciót (PCR) végeztünk, a pJFFapxllCU15 plazmidot használva templátként. A kapott 8,5 kb méretű PCR-fragmenst Aflll enzimmel emésztettük, és visszaligáltuk. Az így kapott plazmidot pApxll-D 1-nek jelöltük és a deléció környezetét szekvenciaanalízissel ellenőriztük. A pApxll-D1 plazmidból az inszertet Spel/Bglll fragmensen kivágtuk, és az Xbal és BamHI emésztett pAppEX-KG1 plazmidba klónoztuk. Az így kapott plazmidot neveztük el pApxll-D2-nek, E. coli S17-1 Xpir [Simon és munkatársai: Biotechnology 1, 784-791 (1983)] sejtekbe juttattuk be. A konjugációs donorként használt törzset jelöltük MBHPP142-nek. Az MBHPP111-es és MBHPP142-es törzsek konjugációja után a kapott naladixinsav- és gentamicinrezisztens A. pleuropneumoniae exkonjugánsokat 0,1% NAD, 2% birka-vörösvértest és 20 pg/ml naladixinsavtartalmú CBM agarlemezekre kentük ki. A hemolitikus aktivitással nem rendelkező A. pleuropneumoniae telepeket azonosítottuk. Közülük az egyiken, amelyet MBHPP147-esként jelöltünk, Southern-hibridizációval ellenőriztük, hogy valóban apxlC, apxllC deléciós A. pleuropneumoniae 4074-es törzs mutánsok.
A konstruálás! lépésekkel létrehozott MBHPP147-es törzs mind az apxlC, mind az apxllC génekre deléciós mutáns.
A AapxC mutáns 1-es szerotípusba tartozó A. pleuropneumoniae hemolitikus aktivitásai
A hemolitikus aktivitás vizsgálatához összehasonlítottuk a AapxlC MBHPP11-es, a AapxlC AapxllC duplán deléciós mutáns MBHPP147-es és a vad típusú, kiindulási MBHPP104-es törzseket véragaron növesztve (a 2. példán leírt módon). Az egyedi kolóniákat steril fogpiszkálóval 0,1% NAD és 2% birkavörösvértest-tartalmú CBM-lemezre szúrtuk át. Nyolc óra 37 °C-os növesztés után a vad típusú, MBHPP104-es telepek körül 2 mm β-hemolitÍkus zóna alakult ki. Az MBHPP111-es törzs körülbelül 1 mm-es, sokkal diffúzabb hemolitikus zónát alkotott (amely nagyjából azonos méretű a 7-es és 12-es szerotípusú A. pleuropneumoniae referenciatörzs körül kialakuló hemolitikus zónával, amelyekről tudott, hogy csak Apxll-t termelnek). A kettős deléciós mutáns MBHPP147 nem mutatott hemolitikus aktivitást.
Az ApxlC deléció az erős, Apxl hemolizinre jellemző hemolitikus aktivitás elvesztésével jár. A hozzáadódó apxllC deléció hatására teljesen eltűnik a hemolitikus aktivitás. Az eredményeket az 1. táblázat foglalja össze.
1. táblázat
A hemolízis és Western-blot-vizsgálatok eredményének összefoglalása. A hemolitikus zóna mm-ben lett jelölve, míg a (d) a diffúz hemolízist jelenti. A az ellenanyag - körülbelül 105 kD antigén „Western-blot”-ban történt reakcióját jelenti. A a reakció elmaradását jelenti.
| Törzs | Hemolitikus zóna (mm) véragaron | Westem-blot-reakció | |
| AntiApxIA ellenanyag | Anti- ApxllA ellenanyag | ||
| MBHPP104 | 2 | + | + |
| MBHPP111 | 1(d) | + | + |
| MBHPP147 | 0 | + | + |
| 10-es szerotípus | 2 | + | - |
| 12-es szerotípus | 1 (d) | - | + |
Az 1-es szerotípusú 4074-es törzs eredetű AapxC törzs ApxIA és ApxllA expressziója és exkréciója
Az ApxIA fehérje exkréciójának vizsgálatát a különböző A. pleuropneumoniae törzsek koncentrált tápfolyadék felülúszójából Western-blot-eljárással [Beck és munkatársai: J. Microbiol. 32, 2749-2754 (1994), mint a 2. példában] monospecifikus anti-ApxIA és antiApxllA szérummal végeztük.
Az 1-es szerotípusú törzsek mindegyike (MBHPP104-es, MBHPP111-es és MBHPP147-es) expresszálja és exkretálja mind az ApxIA, mind az ApxllA toxinokat. Kontrollként a 10-es szerotípusú törzset (amely csak Apxl-et expresszál) és a 12-es szerotípusú törzset (amely csak az Apxll-t expresszálja) használtuk. Az eredmények összefoglalása az 1. táblázatban található.
HU 226 219 Β1
4. példa
A AapxC mutáció hatása A. pleuropneumoniae virulenciájára egérben
Az apxlC és/vagy apxllC deléciónak az A. pleuropneumoniae virulenciájára gyakorolt hatását vizsgálva 5 hét egérből álló csoportokat (6-7 hetes korban) intraperitoniális injektálással, 3 különböző dózisban, 5 különböző törzzsel fertőztünk (2. táblázat). A baktériumokat 0,1% NAD-tartalmú CBM-táptalajon frissen növesztettük, és egyszer 0,9 (m/v)%-os NaCI-oldatban meg- 10 mostuk, majd ugyanabban a pufferben 0,8 OD600 (ami körülbelül 3χ109 cfu/ml-t jelent) töménységben felszuszpendáltuk. Ezt követően 10-szeres és 100-szoros hígítást készítettünk ugyanabban a pufferben. Minden egyes egércsoportot valamelyik törzs egyik hígításából származó 0,5 ml-nyi szuszpenzióval intraperitoniálisan injektáltuk. A felhasználandó kultúrák valós baktériumtartalmának megállapítására a sorozatosan felhasznált kultúrákból 0,1% NAD-tartalmú CBM-lemezre szélesztettünk.
Az adatok arra utalnak, hogy a HV211 törzs LD50 értéke a 20-szorosára növekedett az apxlC deléció hatására. A 4074-es törzs LD 50 értéke egy egyedi AapxlC deléció hatására 10-szeresére növekedett. Ha ehhez még a AapxllC deléció is társult, úgy az LD50 további 9-szeresére nőtt, azaz a teljes változást összegezve a virulencia a 90-ed részére csökkent. Az eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.
2. táblázat apxC-delécióval történt legyengítés A. pleuropneumoniae baktériumban. Az MBHPP105-ÖS törzs a 10-es szerotípusba tartozó HV211 naladixinsav- és sztreptomicinrezisztens derivátja; az MBHPP113-as apxlC deléciós mutáns az MBHPP105-ösből származik; az MBHPP104-es az 1-es szerotípusba tartozó 4074-es törzs naladixinsavés sztreptomicinrezisztens derivátja; az MBHPP111-es apxlC deléciós mutáns az MBHPP104-esből származik; az MBHPP147-es apxlC apxllC duplán deléciós mutáns az MBHPP111-esből származik.
| Csoport | Törzs | Dózis | Összes elpusztult egér száma | LD50 megközelítőleg (cfu) |
| 1. | MBHPP105 | 0,4x107 | 7 | <0,4x107 |
| 2. | MBHPP105 | 0,4x108 | 7 | |
| 3. | MBHPP105 | 0,4x109 | 7 | |
| 4. | MBHPP113 | 0,7χ107 | 0 | 0,8x108 |
| 5. | MBHPP113 | 0,7x108 | 2 | |
| 6. | MBHPP113 | 0,7x109 | 7 | |
| 7. | MBHPP104 | 2x107 | 7 | <2x107 |
| 8. | MBHPP104 | 2*10® | 7 | |
| 9. | MBHPP104 | 2x109 | 7 | |
| 10. | MBHPP111 | 2x107 | 0 | 2x10® |
| 11. | MBHPP111 | 2x108 | 3 | |
| 12. | MBHPP111 | 2x109 | 7 | |
| 13. | MBHPP147 | 1,8x107 | 0 | 1,8x109 |
| 14. | MBHPP147 | 1,8χ108 | 0 | |
| 15. | MBHPP147 | 1,8x109 | 4 |
Védettség kialakítása A. pleuropneumoniae fertőzés ellen élő MBHPP147 vakcina felhasználásával 50
A vizsgálathoz 4,10 egérből álló csoportot használtunk fel (3. táblázat). Két csoportot 7 hetes korban vakcináltunk intraperitoniálisan injektálva, 1,5x10® MBHPP147 sejtet tartalmazó vakcinával. Négy héttel később az egerek emlékeztető oltást kaptak. Az emlé- 55 keztető oltás után 2 héttel egy vakcináit és egy nem vakcináit csoportot intraperitoniális injekcióval 10® cfu MBHPP104-es (1-es szerotípusba tartozó virulens törzs, amelyből az MBHPP147 törzs is származott) törzzsel fertőztük. A másik két csoportot 10® 60
MBHPP105-ös (a 10-es szerotípusba tartozó virulens törzs) törzzsel fertőztük.
A kontrollcsoportból az összes egér elpusztult, míg a 10 vakcináit egérből 9 rezisztensnek mutatkozott a homológ 1-es szerotípusú MBHPP104 fertőzésre (p=0,0001 Fisher exakt teszt) és a 10 vakcináit egér közül 4 esetben védettség alakult ki a heterológ, 10-es szerotípusba tartozó MBHPP105 törzs ellen is (p=0,0433 Fisher exakt teszt). Az MBHPP147 törzs felhasználható élő vakcinaként, mint ami mind homológ, mind heterológ fertőzés ellen védettséget biztosít. Az eredmények a 3. táblázatban találhatók.
HU 226 219 Β1
3. táblázat
MBHPP147-tel történő vakcinálást követő védettség egerekben virulens 1-es (MBHPP104) és 10-es (MBHPP105) szerotípusba tartozó bakteriális fertőzés ellen.
| Csoport | Vakcinálás 7 hetes korban MBHPP147 | Emlékeztető vakcinálás 11 hetes korban MBHPP147 | Fertőzés 13 hetes korban | Túlélés 7 nappal a fertőzés után | Védettségi szignifikancia (p) |
| 1. | 1,5*10® cfu | 1,5*10® cfu | 10® cfu MBHPP104 | 9 | 0,0001 |
| 2. | 10® cfu MBHPP104 | 0 | |||
| 3. | 1,5*10® cfu | 1,5*10® cfu | 10® cfu MBHPP105 | 4 | 0,0433 |
| 4. | 10® cfu MBHPP105 | 0 |
Ábraaláírások
1. ábra: A pApxl-D11 plazmid konstrukciója. 20
A plazmid felhasznált nagyobb jellemző genetikai egységeit, valamint az összes használt restrikciós helyet jelöltük. Azt a pontot, ahol az Xhol és Sspl restrikciós helyeket összekapcsoltuk X/S-ként, az Apxl 25 operon transzkripciós startpontját, ahogy Frey és munkatársai [Gene 142, 97-102 (1994)] meghatározták, „tsp’’-ként jelöltük.
2. ábra: Sspl emésztett kromoszomális DNS
Southem-blot-analízise HV211 vad típusú 30 törzs (Wt), az ebből származó sztreptomicin- és naladixinsavrezisztens MBHPP105 törzs (R), az intermedier integrációs (I) és végül a deléciós mutáns MBHPP113 (D) esetében. Összehasonlításul felvittük a 35 pApx-D1 (Dl) és a pApx.D11 plazmidokat is. A bal oldali panelben próbaként a pApxlD11 1,487 kb hosszúságú Sall/Sacl fragmensét használtuk (amely a deléció széli szekvenciáit tartalmazza). A középső pa- 40 nelben próbaként a pApxl-D11 üres vektor szekvenciáit használtuk fel (Sall/Sacl 5004 bp fragmens). A jobb oldali panel esetében próbaként a paxlC deletált, PCRamplifikációval előállított, 369 bp fragmen- 45 sét használtuk.
3. ábra: Hemolizin lemez vizsgálat. A különböző törzseket steril fogpiszkálóval szúrtuk ki a 0,1% NAD és 2% birkavörösvértest-tartalmú Columbia-agarlemezre. A lemezt ezt 50 követően 8 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. Balról jobbra haladva: vad típusú HV211 törzs (Wt), naladixinsav- és sztreptomicinrezisztens MBHPP105 törzs (R), inszerciós mutáns (I), deléciós mutáns 55 MBHPP113 (D) és 7-es szerotípusú A. pleuropneumoniae referenciatörzset inokuláltunk.
4. ábra: Az ApxIA és ApxllA expressziója. A bekoncentrált kultúra-felülúszót parallel poli- 60 akrilamid-gélen történt elektroforézis után Immobilion-P-re elektroblottoltuk. A kapott „blot-ot az A panel esetében anti-ApxIA szérummal, a B panel esetében anti-ApxllA szérummal reagáltattuk. A tesztelt törzsek: HV211 (WT), MBHPP105 (R), plazmid-integrációs mutáns (I), MBHPP113 (D) és vad típusú, 6-os, 5a és 5b szerotípusú törzsek. A vad típusú, 6-os szerotípusú referenciatörzs ApxllA toxint termel, de ApxIA-t nem.
5. ábra: A pApxll-D2 plazmid konstruálása. A felhasznált nagyobb genetikai egységeket és a felhasznált restrikciós helyeket tüntettük fel.
Claims (16)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. A Pasteurellaceae családba tartozó élő, legyengített, RTX-toxint termelő baktérium, azzal jellemezve, hogy nem termei olyan működőképes RTX-aktivátor fehérjét, amely képes lenne aktiválni az RTX-toxint.
- 2. Az 1. igénypont szerinti baktérium, azzal jellemezve, hogy az RTX-aktivátor fehérjét kódoló génben az RTX-toxin aktiválását lehetetlenné tévő mutációt hordoz.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti baktérium, azzal jellemezve, hogy az RTX-aktivátor fehérje mRNS-ének transzlációs szabályozórégiója az RTX-toxin aktiválását lehetetlenné tévő mutációt hordoz.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti baktérium, azzal jellemezve, hogy a hordozott mutáció típusa deléció.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti baktérium, azzal jellemezve, hogy Actinobacillus pleuropneumoniae fajba tartozik.
- 6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti baktérium, azzal jellemezve, hogy Pasteurella haemolytica fajba tartozik.
- 7. Vakcina az RTX-toxint termelő Pasteurellaceae családba tartozó baktérium által okozott állati fertőzésHU 226 219 Β1 ellen, azzal jellemezve, hogy 1-4. igénypontok bármelyike szerinti baktériumot és gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.
- 8. A 7. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy adjuvánst is tartalmaz.
- 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy fagyasztva szárított formában van.
- 10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy az élő, legyengített baktérium az Actinobacillus pleuropneumoniae genusba tartozik.
- 11. A 10. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy további egy vagy több kiválasztott antigént is tartalmaz a következő kórokozók antigénjei közül: sertés reproduktív légzőszervi szindróma vírus [Porcine Reproductive Respiratory Syndrome (PRRS)], az Aujeszki (Pseudorabies) vírus, a sertésinfluenza-vírus, a sertés-parvovírus, a fertőző Gastroenteritls-vínis, a rotavírus, az Escherichia coli, az Erysipelothrix rhusiopathiae, a Pasteurella múltoddá, a Bordetella bronchiseptica, a Haemophilus parasuis és a Streptococcus suis.
- 12. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy a Pasteurella haemolytica genusba tartozó baktériumot tartalmaz.
- 13. A 12. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve, hogy további egy vagy több kiválasztott antigént tartalmaz a következő szarvasmarha-patogének antigénjei közül: szarvasmarha-rotavírus, szarvasmarha vírusos Diarrhoea-vírus, 3-as típusú parainfluenzavírus, szarvasmarha-paramyxovírus, száj- és körömfájás vírusa, Pasteurella múltoddá, Haemophilus somnus, Brucella abortus, Staphilococcus aureus, Streptococcus spp., Mycoplasma spp. és szarvasmarha légzőszervi szincíciumvírus (Bovine Respiratory Syncytial Vírus).
- 16. Eljárás a Pasteurellaceae családba tartozó, élő, legyengített, RTX-toxint nem aktivált formában termelő baktérium előállítására, azzal jellemezve, hogy az eljárás során az RTX-aktivátor fehérjét kódoló génbe mutációt viszünk be.
- 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mutációt deléció bejuttatásával visszük be.
- 18. Eljárás állatokban a Pasteurellaceae családba tartozó, RTX-toxint termelő baktériumok okozta fertőzés elleni védettség kialakítására alkalmas vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy 1-6. igénypontok bármelyike szerinti baktériumokat gyógyászatilag elfogadható hordozóval összekeverünk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96201557 | 1996-05-31 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9700975D0 HU9700975D0 (en) | 1997-07-28 |
| HUP9700975A2 HUP9700975A2 (hu) | 1998-05-28 |
| HUP9700975A3 HUP9700975A3 (en) | 2007-05-29 |
| HU226219B1 true HU226219B1 (en) | 2008-06-30 |
Family
ID=8224047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9700975A HU226219B1 (en) | 1996-05-31 | 1997-05-30 | Live attenuated rtx-producing bacteria of the family pasteurellaceae |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6770275B1 (hu) |
| JP (1) | JPH1075774A (hu) |
| KR (1) | KR970074928A (hu) |
| CN (1) | CN1117862C (hu) |
| AU (1) | AU720156B2 (hu) |
| CA (1) | CA2206575A1 (hu) |
| HU (1) | HU226219B1 (hu) |
| MX (1) | MX9704061A (hu) |
| NZ (1) | NZ314987A (hu) |
| TW (1) | TW546147B (hu) |
| ZA (1) | ZA974809B (hu) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20060134225A (ko) * | 1999-04-09 | 2006-12-27 | 파마시아 앤드 업존 캄파니 엘엘씨 | 항균성 백신 조성물 |
| US7449178B2 (en) * | 2002-04-05 | 2008-11-11 | Merial Limited | Attenuated gram negative bacteria |
| KR100807844B1 (ko) * | 2006-12-27 | 2008-02-27 | 주식회사 바이오리쏘스 | 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 파스튜렐라물토시다 감염증의 치료 또는 예방하는 방법 |
| ES2434829T3 (es) * | 2007-09-05 | 2013-12-17 | Genentech, Inc. | Péptidos que contienen arginina C-terminal biológicamente activos |
| WO2015066292A1 (en) | 2013-11-01 | 2015-05-07 | Merial Limited | Attenuated pasteurella multocidavaccines & methods of making & use thereof |
| EP3689373A1 (en) * | 2019-01-30 | 2020-08-05 | IDT Biologika GmbH | Inactivated apxia, apxiia and apxiiia toxins |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4963487A (en) * | 1985-01-03 | 1990-10-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for deletion of a gene from a bacteria |
| US5165924A (en) | 1986-01-22 | 1992-11-24 | University Of Guelph | Serum-free, cell-free vaccine effective against pneumonic pasteurellosis in cattle |
| GB8611832D0 (en) * | 1986-05-15 | 1986-06-25 | Holland I B | Polypeptide |
| US5256415A (en) | 1989-03-20 | 1993-10-26 | Louisiana State University | Vaccine against bovine respiratory disease (pasteurellosis) |
| GB8912330D0 (en) | 1989-05-30 | 1989-07-12 | Wellcome Found | Live vaccines |
| US5641653A (en) | 1989-10-31 | 1997-06-24 | The Texas A&M University System | DNA encoding Actinobacillus pleuropneumoniae hemolysin |
| CA2045950C (en) * | 1991-06-28 | 2004-05-11 | Elbarte M. Kamp | Recombinant vaccine for prevention and/or treatment of pleuropneumonia infections |
| US5422110A (en) * | 1991-10-16 | 1995-06-06 | University Of Saskatchewan | Enhanced immunogenicity using leukotoxin chimeras |
| US5587305A (en) * | 1993-12-06 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Agriculture | Pasteurella haemolytica transformants |
| WO1995025742A1 (en) * | 1994-03-22 | 1995-09-28 | Pfizer Inc. | Pasteurellaceae antigens and related vaccines |
| AUPN631495A0 (en) * | 1995-11-02 | 1995-11-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vaccine and biological vector(I) |
| AU717773B2 (en) * | 1995-11-02 | 2000-03-30 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Immunity against pasteurella haemolytica leukotoxin |
| AUPN631395A0 (en) * | 1995-11-02 | 1995-11-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vaccine and biological vector(II) |
-
1997
- 1997-05-30 US US08/866,198 patent/US6770275B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-30 CA CA002206575A patent/CA2206575A1/en not_active Abandoned
- 1997-05-30 HU HU9700975A patent/HU226219B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-05-30 ZA ZA9704809A patent/ZA974809B/xx unknown
- 1997-05-30 JP JP9178792A patent/JPH1075774A/ja active Pending
- 1997-05-30 CN CN97114993A patent/CN1117862C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-31 KR KR1019970022351A patent/KR970074928A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-06-02 AU AU24643/97A patent/AU720156B2/en not_active Ceased
- 1997-06-02 MX MX9704061A patent/MX9704061A/es not_active IP Right Cessation
- 1997-06-03 NZ NZ314987A patent/NZ314987A/en unknown
- 1997-12-03 TW TW086118161A patent/TW546147B/zh active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW546147B (en) | 2003-08-11 |
| CN1173540A (zh) | 1998-02-18 |
| AU2464397A (en) | 1997-12-04 |
| CN1117862C (zh) | 2003-08-13 |
| MX9704061A (es) | 1998-04-30 |
| AU720156B2 (en) | 2000-05-25 |
| CA2206575A1 (en) | 1997-11-30 |
| ZA974809B (en) | 1998-01-23 |
| KR970074928A (ko) | 1997-12-10 |
| NZ314987A (en) | 2000-02-28 |
| US6770275B1 (en) | 2004-08-03 |
| HUP9700975A2 (hu) | 1998-05-28 |
| HUP9700975A3 (en) | 2007-05-29 |
| HU9700975D0 (en) | 1997-07-28 |
| JPH1075774A (ja) | 1998-03-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7125548B2 (en) | Streptococcus suis vaccines and diagnostic tests | |
| EP1828230A2 (en) | Novel efficient process for production of capsular polysaccharides of pathogenic gram-positive bacteria by heterologous expression and secretion of complex polysaccharides in non-pathogenic, non-invasive gram-positive bacteria | |
| EP0626452B1 (en) | Vaccine against Streptococcus suis infection | |
| JP6329544B2 (ja) | 新規生弱毒化赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ワクチン | |
| US5840312A (en) | Recombinant Bacillus anthracis strains unable to produce the lethal factor protein or edema factor protein | |
| KR100448225B1 (ko) | 악티노바실러스 플루로뉴모니아의 rtx 톡신 apx에 대한 면역 | |
| EP0810283A2 (en) | Live attenuated RTX-procucing bacteria of the family Pasteurellaceae | |
| DE69836520T2 (de) | Clostridium perfringens Impfstoff | |
| EP1017822B1 (en) | Lkta deletion mutant of p. haemolytica | |
| KR100510906B1 (ko) | 악티노 바실러스 플루로뉴모니아종의 약독화 생박테리아 | |
| EP0862615B1 (en) | Immunity against pasteurella haemolytica leukotoxin | |
| HU226219B1 (en) | Live attenuated rtx-producing bacteria of the family pasteurellaceae | |
| Kreft et al. | Virulence gene clusters and putative pathogenicity islands in listeriae | |
| MXPA97004061A (es) | Bacterias productoras de rtx atenuadas vivas de la familia pasteurellaceae | |
| CN1092069C (zh) | 用于预防荚膜生物所致疾病的重组疫苗 | |
| US6783764B1 (en) | Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine | |
| JPH09500537A (ja) | Ｂ型インフルエンザウイルス由来のタンパク質ｐ２の発現および精製方法 | |
| EP1015579B1 (fr) | Toxine de clostridium et procede de preparation de compositions immunogenes | |
| EP0520011A1 (en) | Vaccines for vaccination against furious animals in fish. | |
| JPH04502018A (ja) | ブタのヘモフィロシス予防ワクチン | |
| WO2003046183A2 (en) | Streptococcus suis avirulent vaccine and uses in antibiotic design | |
| Idris | Characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae hemolysin and its role in porcine Actinobacillus pleuropneumonia | |
| WO2002077020A2 (en) | Virulence genes in h. influenzae |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: INTERVET INTERNATIONAL B.V., NL Free format text: FORMER OWNER(S): AKZO NOBEL N.V., NL |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |