KR100807844B1 - 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 파스튜렐라물토시다 감염증의 치료 또는 예방하는 방법 - Google Patents

약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 파스튜렐라물토시다 감염증의 치료 또는 예방하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100807844B1
KR100807844B1 KR1020060135391A KR20060135391A KR100807844B1 KR 100807844 B1 KR100807844 B1 KR 100807844B1 KR 1020060135391 A KR1020060135391 A KR 1020060135391A KR 20060135391 A KR20060135391 A KR 20060135391A KR 100807844 B1 KR100807844 B1 KR 100807844B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pasteurella multocida
strain
pasteurella
attenuated
immunogenic composition
Prior art date
Application number
KR1020060135391A
Other languages
English (en)
Inventor
정승기
김근영
김태중
김종수
이재일
장은진
고혁주
서자영
Original Assignee
주식회사 바이오리쏘스
광주과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 바이오리쏘스, 광주과학기술원 filed Critical 주식회사 바이오리쏘스
Priority to KR1020060135391A priority Critical patent/KR100807844B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100807844B1 publication Critical patent/KR100807844B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 파스튜렐라 물토시다 독소 (PMT)의 N 말단만을 발현하는 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주, 그를 포함하는 면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 파스튜렐라 물토시다 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
약독화 파스튜렐라 물토시다, N 말단 단편 단백질, 면역원성 조성물

Description

약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주, 그를 포함하는 면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 파스튜렐라 물토시다 감염증의 치료 또는 예방하는 방법{An attenuated Pasteurella multocida strain, an immunogenic composition comprising the strain and a method of treating or preventing Pasteurella multocida infection from mammals using the same}
도 1은 PMT (GenBank database: AF240778)의 아미노산 서열을 친수성도에 따라 4등분한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 pKD13 플라스미드로부터 KanR 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로서, 파스튜렐라 물토시다 균주 내에서 toxA 유전자의 친수성도에 따라 구분하였을 경우, 2-4번 영역을 상동 재조합에 의하여 제거하기 위한 프라이머의 구성을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 pKD13 헬퍼 플라스미드를 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 카나마이신 내성을 갖고 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2와 3의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 약독화 파스튜렐라 물토시다 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 생쥐에 접종하고, 접종된 생쥐의 안와로부터 혈액을 채취하여 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 pKD46의 벡터 지도이다.
본 발명은 파스튜렐라 물토시다 독소 (PMT)의 N 말단만을 발현하는 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주, 그를 포함하는 면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 파스튜렐라 물토시다 감염증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
돼지 파스튜렐라성 폐렴 (Pasteurellosis in swine)은 파스튜렐라 물토시다(P. multocida)에 의해 발생하며 증체지연, 활력저하, 폐사가 일어난다. 주요 증상은 급성형의 경우 복식호흡, 기침, 소량의 콧물 및 40~42℃의 발열을 보이고 입을 벌리고 호흡하는 개구호흡을 하며 사지에 청색증이 나타난다. 증상은 5~10일간 지속된 후 폐사되거나, 3~5주간 지속된 후 회복하는 경우도 있다. 보통 비육돈이나 종돈에서 밀사, 환기 불량등 부적절한 사양조건이나 합사, 체중측정 및 수송 등의 스트레스가 가해진 경우 많이 발생한다. 예방은 우리나라의 경우, 돼지 위축성 비염, 파스튜렐라 폐렴, 돼지 단독 및 대장균 설사병 등 4종 질병의 혼합백신이 개발되어 이용되고 있다.
최근 몇 년 동안의 국내의 병성감정 결과를 통하여 본 국내 돼지에서 세균성 호흡기 질병의 발생양상은 전체 병성감정건수 중 호흡기 질병이 차지하는 비율이 해마다 차이가 있기는 하지만 대략 5.0~31.0%까지 나타났으나 평균적으로 14.0%내외를 차지하는 것으로 나타났다. 그러나 흉막폐렴을 제외한 다른 호흡기 질병은 대체적으로 폐사율이 낮고, 단지 지속적인 증체율 감소만을 나타내어 가검물 의뢰 빈도가 낮기 때문에 사실상은 이보다 더 높은 발생률을 나타낼 것이라고 보고되었다.
이처럼 파스튜렐라 물토시다(P. multocida)와 관련된 돼지의 호흡기 질병이 가장 주를 이루고 있으며 가장 심각하고 예방이 절실히 필요한 질병들이다. 파스튜렐라성 폐렴은 병원체인 파스튜렐라 물토시다(P. multocida)에 의해 발병하는 폐렴으로써 균체항원으로는 1~16까지의 형이 있으며 협막항원으로는 A, B, D, E의 4가지 형이 있다. 이중 A와 D형이 주로 돼지의 호흡기 질병에 관련되어 있다. 폐렴은 주로 A형에 의해 유발된다.
이 질병은 심급성형, 폐렴증세만을 보이는 급성형 및 만성형으로 구분할 수 있다. 심급성형은 갑작스런 고열, 호흡곤란, 전신출혈, 원기부족의 증상을 보이면서 폐사한다. 피부의 색깔이 자적색으로 변하는 전형적인 패혈증 형태를 보인다. 대부분의 경우 급성형이며 발열, 호흡곤란, 식욕부진, 원기부족 등의 증상을 보이면서 코에서 염증성 삼출물을 간혹 관찰할 수 있다. 치료하지 않고 방치하면 5~10일 경과후 폐사될 수 있지만 폐사율은 높지 않다. 만성형은 폐렴이 발생하는 농장에서 급성경과를 보이는 감염돈을 완전히 치료하지 못한 경우에 발생한다. 지속적인 습성 기침과 체중감소, 전신쇠약 등으로 인한 성장부진으로 위축돈이 되어 경제적인 가치가 없어지고 보균돈이 되어 전염원의 역할을 한다. 이 질병에 대한 예방 백신으로는 파스튜렐라 물토시다 (Pasturella multocida) 타입 A와 D형을 이용한 사균백신과 흉막 폐렴, 위축성 비염, 파스튜렐라 폐렴의 복합백신이 사용되고 있다. 하지만 여기서 가장 주목할 점은 파스튜렐라 물토시다(P. multocida)의 독성 (toxigenicity)은 균이 방출하는 PMT라는 독소에 있기 때문에 사균 백신의 경우 PMT의 생산이 없을 것이므로 사균 백신에 의한 파스튜렐라 물토시다(P. multocida) 감염의 예방은 절대로 기대하기 어렵다는 점이다. 이미 본 연구팀에서 실험을 실시한 바에 의하면 PMT를 생산하지 않는 파스튜렐라 물토시다 균주를 이용한 면역접종은 이후 PMT나 파스튜렐라 물토시다(P. multocida)에 의한 감염에 방어능력이 없음을 보였다.
본 발명자들은 놀랍게도 PMT의 N-말단 부분은 병원성은 없으면서 면역원성을 유지한다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은, 파스튜렐라 물토시다 독소의 N 말단만을 발현하는 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 파스튜렐라 물토시다 독소의 N 말단만을 발현하는 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주를 포함하는 파스튜렐라 물토시다 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 면역원성 조성물을 포유동물에 투여하여 상기 포유동물의 파스튜렐라 물토시다 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 파스튜렐라 물토시다 독소의 N 말단 단편만을 발현하는 약독화된 파스튜렐라 물토시다 (Pasteurella multocida)를 제공한다. 상기 약독화된 파스튜렐라 물토시다는 바람직하게는, 수탁번호 KCTC-11048BP인 것이다.
본 발명의 약독화된 파스튜렐라 물토시다는 toxA 유전자에 의하여 코딩되는 독소인 PMT의 N 말단만을 발현하는 균주이다. 상기 N 말단은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열 (PMT의 1 내지 390번 아미노산에 해당)을 갖는 것이다. 상기 toxA 유전자는 야생형뿐만 아니라, 독성을 유지하는 돌연변이가 일어난 대립형질 유전자도 포함한다. 상기 파스튜렐라 물토시다 독소는 일반적으로 독성을 유발하지만, 그 전체로서는 면역원성이 없는 것으로 알려진 단백질이다. 놀랍게도, 본 발명자들은 상기 파스튜렐라 물토시다 독소의 N 말단 단편이 면역원성이 있음을 발견하고, 이 부분만을 발현하는 파스튜렐라 물토시다가 독성은 없거나 약화되어 있으면서도, 면역원성이 있다는 것을 확인하였다.
본 발명은 또한, 파스튜렐라 물토시다 독소의 N 말단 단편만을 발현하는 약독화된 파스튜렐라 물토시다 (Pasteurella multocida) 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아주반트를 포함하는, 포유동물의 파스튜렐라 물토시다 감염증의 치료 또는 예방용 면역원성 조성물을 제공한다.
상기 약독화된 파스튜렐라 물토시다는 상기한 바와 같다. 바람직하게는, 상기 파스튜렐라 물토시다는 수탁번호 KCTC-11048BP인 것이다.
본 발명의 면역원성 조성물은 유효한 양으로 투여될 수 있다. "유효한 양"이 란 치료 또는 예방하고자 하는 증상을 완화 또는 제거하는데 요구되는 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 상기 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은, 상기 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주를 1일 1x106 내지 1x 1010 cfu/mL (colony forming unit), 바람직하게는 1일 1x107 내지 1x109 CFU, 더욱 바람직하게는, 1일 1x107 내지 1x108 CFU의 범위일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 면역원성 조성물은, 상기 파스튜렐라 물토시다 독소의 N 말단 단편에 더하여, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아주반트를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물에 있어서, 상기 담체는 희석제, 완충제, 보존제 등을 포함하는 의미로서 사용된다. 상기 담체에는 당업계에 알려진 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 성분이 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 어주반트는 항원의 면역원성을 증진시키기 위하여 사용되는 물질로서, 예를 들면, 프로인트 완전 또는 불완전 어주반트 등이 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 면역원성 조성물은 당업계에 알려진 임의의 형태 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 액제 또는 주사에의 경우, 필요시 10∼40%의 프로필렌 글리콜, 및 용혈현상을 방지하는데 충분한 양 (예 : 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다. 상기 액제 또는 주사제에는 당업계에 알려진 임의의 희석제 또는 완충제가 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물은, 상기 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주를 동결건조하여 바이알과 같은 용기에 보존하고, 사용하기 전에 주사제에 필요한 담체 또는 아주반트, 식염수 등을 부가함으로서, 사용 직전에 조제될 수도 있다.
본 발명의 면역원성 조성물에 있어서, 상기 포유동물에는 인간, 소, 돼지, 염소 및 양으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 돼지이다.
본 발명의 면역원성 조성물에 있어서, 상기 파스튜렐라 물토시다 감염증에는, 파스튜렐라 물토시다 감염에 의하여 야기되는 임의의 증상일 수 있으며, 예를 들면, 폐렴이 포함된다.
본 발명의 면역원성 조성물은, 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 로 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 파스튜렐라 물토시다 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 포유 동물은 소, 돼지, 개, 염소 및 양으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 포유 동물은 돼지이다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 파스튜렐라 물토시다 감염증은 파스튜렐라 물토시다 감염에 의하여 야기되는 임의의 증상일 수 있으며, 예를 들면, 파스튜렐로시스 및 폐렴이 포함된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 투여는 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 로 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 본 발명의 조성물은 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 투여되는 것이다. 상기 "치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양"은 당업자라면, 증상의 경중, 개체의 성별, 나이 및 체중 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있다. 바람직하게는, 상기 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은, 상기 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주를 1일 1x106 내지 1x 1010 cfu/mL (colony forming unit), 바람직하게는 1일 1x107 내지 1x109 CFU, 더욱 바람직하게는, 1일 1x107 내지 1x108 CFU의 범위일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
이하의 실시예에서는, 돼지 호흡기 질병인 파스튜렐라 폐렴 (pasteurellosis)의 병원체인 파스튜렐라 물토시다(P. multocida)의 독성 인자인 PMT를 코딩하는 유전자좌인 toxA 유전자 부위 중 면역원성이 있는 것으로 N-말단 부분(서열번호 1: 1-390번 아미노산 영역)만을 남기고, 나머지 부분은 상동 재조합 (homologous recombination)에 의하여 녹아웃 (knock out)된 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주를 제조하고, 이들의 면역원성 조성물로서의 활성을 조사하였다.
실시예 1: 파스튜렐라 물토시다 독소의 N 말단만을 발현하는 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주의 제조
(1) 공시균주 및 플라스미드
Red 헬퍼 플라스미드 pKD46 (서열버호 5 또는 Genbank #AY048746)은 pBAD 프로모터를 이용하여, gam, exo 와 gam 단백질을 생산하는 벡터로서 균체내로 외부 DNA가 유입되는 경우, 상동 재조합을 유도하는 작용을 하는 벡터이다. 즉, Red recombinase를 포함하고 있는 벡터이다. 도 6은 pKD46의 벡터 지도이다.
전기천공 감응성을 부여하기 위하여 사용되는, 파스튜렐라 물토시다(P. multocida) 타입 D 표준 균주는 국립수의과학 검역원에서 분양받아 사용하였다.
(2) toxA 유전자 및 카나마이신 저항성 유전자 ( kan R ) 유전자 클로닝
PCR 프라이머의 구성은 다음과 같다. 즉, 기존의 toxA 유전자 정보를 이용하여 (GenBank database: AF240778), toxA를 친수성도에 따라 4등분 (이하 각 분획을단순히 각각, 1, 2, 3 또는 4번 영역이라 칭한다)하였을 때, 1번 영역의 말단 40머(40mer) 및 pKD13 헬퍼 플라스미드 (서열번호 4 또는 Genbank #AY048744)의 FRT 부위를 포함하는 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포워드 프라이머로 사용하였다. 또한, 파스튜렐라 물토시다의 toxA를 친수성도에 따라 4등분하였을 때, 4번 영역의 말단 40머(40mer) 및 pKD13 헬퍼 플라스미드의 FRT 부위를 포함하는 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드를 리버스 프라이머로 사용하였다.
pKD13 헬퍼 플라스미드를 주형으로 하고, 서열번호 2와 3의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭산물은 0.8% (w/v) 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 겔 용출을 수행하여, 회수하였다. 회수된 PCR 산물은 상동 재조합을 위한 삽입체로서 바로 사용하였다.
도 1은 PMT (GenBank database: AF240778)의 아미노산 서열을 친수성도에 따라 4 등분한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 pKD13 플라스미드로부터 KanR 유전자를 증폭하기 위한 프라이머로서, 파스튜렐라 물토시다 균주 내에서 toxA 유전자의 친수성도에 따라 구분하였을 경우, 2-4번 영역을 상동 재조합에 의하여 제거하기 위한 프라이머의 구성을 도식적 으로 나타낸 도면이다. 도 2에 있어서, toxA#1-R과 FRT가 서열번호 2의올리고뉴클레오티드에 해당하는 것이고, FRT와 toxA#4-R는 서열번호 3의올리고뉴클레오티드에 해당하는 것이다.
도 3은 pKD13 헬퍼 플라스미드를 주형으로 하고, 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 약 1.4kb의 증폭산물을 확인하였다. 이 증폭산물은 양 말단에 toxA의 1번 영역 말단과 4번 영역 말단에 상보적인 서열을 가지고 있기 때문에, toxA 유전자와 상동 재조합을 유도할 수 있다.
(3) 상동 재조합에 의하여 toxA 의 2번 내지 4번 영역이 제거된 파스튜렐라 물토시다 균주의 선발
일반 초콜렛 배지 중에서 신선하게 준비된 파스튜렐라 물토시다(P. multocida) 배양액 5ml을 500 ml BHI 브로쓰 (BBL™, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD)에 접종하여, OD600값이 0.5가 될 때까지, 37 ℃ (pH 7.3)에서 배양하고, 배양 후 얻어진 배양물은 얼음 위에서 20분간 냉각 후 4000xg로 15분 동안 원심분리하여 파스튜렐라 물토시다 균체를 펠렛의 형태로 회수하였다.
얻어진 균체 펠렛을 2.5ml의 냉각된 10% 글리세롤 용액으로 재부유하며, 전기천공용 감응성 (electroporation competent) 파스튜렐라 물토시다 균체를 준비하였다. 이 균체에서 λ Red recombinase를 발현하기 위해, pKD46 플라스미드를 Gene Pulser Xcell™ electroporation system (Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 상기 파스튜렐라 물토시다 균체에 형질전환시키고, 암피실린과 L-아라비노즈 (최종 각 10 mM)가 첨가된 250ml SOB 배지 (BBL™, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD)에서 37℃ (pH 7.3)에서 배양하여 형질전환된 균체를 선택 후, 30℃에서 OD600 값이 0.5가 될 때까지 배양 후 다시 2.5ml의 냉각된 10% 글리세롤 용액으로 재부시켰다.
다음으로, 상기한 바와 같이 얻어진 pKD46 플라스미드로 형질전환되고 전기천공 감응성 상태로 된 파스튜렐라 물토시다 균체 40㎕에, 상기 (2)에 준비된 증폭산물, 즉 상동 재조합용의 1.4kb 크기의 선형 DNA 1 ㎕ (100 ng)를 전기천공법으로 형질전환하고 50㎍/ml 카나마이신이 첨가된 LB 배지에서 선택하여 toxA의 2번 내지 4번 영역이 제거되고, 상동 재조합에 의해 카나마이신 내성을 갖는 파스튜렐라 물토시다 균주를 선발하였다.
(4) 선발된 카나마이신 내성 약독화 균주의 확인 검정
카나마이신 선택 배지에서 생존한 콜로니는, 카나마이신 내성 유전자 (kanR)가 파스튜렐라 물토시다 균주의 게놈 내에 삽입된 것으로 추정되는 것이지만, 다시 한 번 분자생물학적 방법으로 검증을 하기 위해서 PCR을 수행하였다. 즉, toxA 유전자 좌 중에서 N-말단 (1번 영역)을 제외한 나머지 부분인 2,3,4 번 영역의 위치에 kanR이 삽입되었는지 확인하기 위해 다음과 같이 PCR을 실시하였다.
즉, 상동 재조합을 유도하기 위한 삽입체를 증폭하기 위하여 사용되었던 프 라이머와 동일한 프라이머인. 서열번호 2 및 3의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트를 프라이머로 하고, 상기에서 선발된 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 1.4 kb의 PCR 산물을 생산하는 경우에는, 상동 재조합이 일어난 것으로 판단할 수 있다. 반면, 상동 재조합이 이루어 지지 않았다면 카나마이신 선택 배지에서 생존할 수 없을 뿐 아니라, PCR 산물의 크기도 toxA 전체의 크기인 3.9kb에서 1번 분획을 뺀 나머지 부분, 즉 분획 2, 3, 4의 크기인 2.5 kb가 생성되어야 한다.
도 4는 카나마이신 내성을 갖고 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 2와 3의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 수행한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 약 1.4kb의 PCR 산물이 존재하는 것으로 보아, 상동 재조합이 이루어진 것이 확인되었다.
준비된 약독화 균주내의 항생제 내성 유전자를 제거하기 위하여 균주를 일반 쵸코렛 배지 중에서 신선하게 준비하고, 콜로니를 BHI 브로쓰 (BBL™, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) 5ml에 37℃ (pH 7.3)에서 배양하고 다시 500 ml BHI 브로쓰에 접종하여, OD600값이 0.5가 될 때까지, 37℃ (pH 7.3)에서 배양하였다. 배양 후 얻어진 배양물은 얼음 위에서 20분간 냉각 후 4000xg로 15분 동안 원심분리하여 약독화 파스튜렐라 물토시다 균체를 펠렛의 형태로 회수하였다.
얻어진 균체 펠렛을 2.5ml의 냉각된 10% 글리세롤 용액으로 재부유하여, 전 기천공용 감응성 (electroporation competent) 파스튜렐라 물토시다 균체를 준비하였다. 이 균체 100㎕에, FRP 단백질을 발현하여 FRT 부위 내의 유전자를 제거하는 기능이 있는 자살벡터인 pCP20 플라스미드 (Cherepanov, P. P., and Wackernagel, W. 1995. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158:9-14) 1㎕를 Gene Pulser Xcell™ electroporation system (Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 형질전환시키고, 암피실린이 첨가된 1 ml SOB 배지(BBL™, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD)에서 30℃ (pH 7.3)에서 배양하여 형질전환된 균체를 선택하였다. 이 형질전환 균체는 이전에 준비된 약독화 균주와는 달리 KanR 유전자가 없어진 것인데, 그 이유는 kanR 양단에 있는 FRT 부위를 pCP20에서 발현된 FRP recombinase가 재조합을 시켜서 FRT 부위 가운데 끼인 유전자를 제거해 줌으로써 kanR이 제거된 균주이다. 또한, 이 균주 내에 남아있는 자살 벡터인 pCP20은 온도에 민감함을 이용하여 균주를 다시 암피실린이 첨가된 초코렛 배지에서 43℃에서 배양을 함으로써 자살벡터인 pCP20가 제거되었다.
실시예 2 : 파스튜렐라 물토시다 독소의 N 말단만을 발현하는 약독화 파스튜렐라 물토시다 균주의 면역원성의 확인
실시예 1에서 제조된 PMT N 말단만을 발현하는 약독화 파스튜렐라 물토시다 균주를 PBS에 1x108cfu/ml의 농도로 포함하는 면역원성 용액을 준비하였다. 다음으 로, 8주령 생쥐에 상기 용액 100 ㎕씩 복강으로 접종하였다. 접종 후, 2 주 동안 생쥐의 사망률을 모니터링한 후 다시 동량의 용액을 같은 방법으로 접종하고, 마찬가지로 시간에 따라 사망률을 모니터링하였다. 이 후 다시 2주 후 같은 방법으로 한번 더 부스팅 면역접종을 실시하였다. 대조군으로는 동일한 양의 PBS만을 접종하였다. 실험군과 대조군은 각각 10마리의 생쥐로 이루어진다.
최종 부스팅 면역접종 후 7일 경과 후, 생존한 생쥐의 안와에서 혈액을 채취하고 혈청을 분리하여 생쥐에서 PMT N 말단에 대한 항체가 생성되었는지를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.
웨스턴 블롯팅은 항원은 PMT의 1-390번 아미노산으로 이루어진 N 말단 재조합 단백질 (분자량 약 45 KDa)을 이용하고, 1차 항체로는 생쥐 안와에서 채혈하여 얻은 혈청을, 2차 항체로는 항-생쥐 IgG 염소 항체-HRP 접합체 (Serotec, Oxford, UK)를 사용하였다.
도 5는 약독화 파스튜렐라 물토시다 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 생쥐에 접종하고, 접종된 생쥐의 안와로부터 혈액을 채취하여 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타내는 도면이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주를 포함하는 면역원성 조성물로 면역접종된 생쥐에서, PMT의 1-390번 아미노산으로 이루어진 N 말단 재조합 단백질 (분자량 약 45 KDa)에 대한 항체가 생산되었음을 확인하였다.
실시예 3 : 약독화 파스튜렐라 물토시다 균주로 면역접종된 생쥐에 대한 야 외형 파스튜렐라 물 토시다를 이용한 챌린지 시험
파스튜렐라 물토시다(P. multocida) 타입 D 야외 균주를 PBS 중에 1x 108/ml의 농도로 준비하였다. 다음으로, 이 용액 100 ㎕ (LD100)씩을, 실시예 2에서 얻어진 바와 같은, 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주를 포함하는 면역원성 조성물로 면역 접종된 생쥐로서 PMT N 말단에 대한 항체가 생성되는 것으로 확인된 생쥐에, 복강을 통하여 접종하였다. 대조군으로는 약독화 파스튜렐라 물토시다 균주로 면역접종되지 않은, 생쥐를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실험하였다. 상기 야외형 파스튜렐라 물토시다 균주를 접종한 후, 2주간 생쥐의 사망률을 모니터링하였다.
그 결과, 대조군에서 100% 사망률을 나타내었으나, 실험군에는 50%의 사망률을 보였다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물을 생쥐에 투여함으로써, 파스튜렐라 물토시다 독소로부터 상기 생쥐를 보호하는 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명자들은 상기한 바와 같은 실시예로부터 얻어진 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주를 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자 은행에 2006년 12월 14일 기탁하였다 (수탁번호 KCTC-11048BP).
본 발명의 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주에 의하면, 면역원성은 있으나 독성은 약화되어 백신으로 사용될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물에 의하면, 포유동물 내에 투여되는 경우 파스튜렐라 물토시다 독소에 대한 항체 생산을 유도할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 인간을 제외한 포유동물을 파스튜렐라 물토시다 독소 또는 파스튜렐라 물토시다로부터 상기 포유동물을 보호할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 파스튜렐라 물토시다 독소의 N 말단 단편만을 발현하는 약독화된 파스튜렐라 물토시다 (Pasteurella multocida)(수탁번호 KCTC-11048BP) 균주.
  2. 파스튜렐라 물토시다 독소의 N 말단 단편만을 발현하는 약독화된 파스튜렐라 물토시다 (Pasteurella multocida)(수탁번호 KCTC-11048BP) 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아주반트를 포함하는, 포유동물의 파스튜렐라 물토시다 감염증의 치료 또는 예방용 면역원성 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 포유동물은 돼지인, 파스튜렐라 물토시다 감염증의 치료 또는 예방용 면역원성 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 감염증은 폐렴인 파스튜렐라 물토시다 감염증의 치료 또는 예방용 면역원성 조성물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 파스튜렐라 물토시다 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 동물은 돼지이고, 상기 감염증은 폐렴인 것인 방법.
KR1020060135391A 2006-12-27 2006-12-27 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 파스튜렐라물토시다 감염증의 치료 또는 예방하는 방법 KR100807844B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060135391A KR100807844B1 (ko) 2006-12-27 2006-12-27 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 파스튜렐라물토시다 감염증의 치료 또는 예방하는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060135391A KR100807844B1 (ko) 2006-12-27 2006-12-27 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 파스튜렐라물토시다 감염증의 치료 또는 예방하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100807844B1 true KR100807844B1 (ko) 2008-02-27

Family

ID=39383490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060135391A KR100807844B1 (ko) 2006-12-27 2006-12-27 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 파스튜렐라물토시다 감염증의 치료 또는 예방하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100807844B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR970074928A (ko) * 1996-05-31 1997-12-10 에프, 지. 엠. 헤르만스; 이. 에이치. 리링크 파스퇴렐라 과의 약독화된 rtx 독소 생성 생 박테리아
JP2004242608A (ja) 2003-02-17 2004-09-02 Nitsuseiken Kk 無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素とその遺伝子および製法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR970074928A (ko) * 1996-05-31 1997-12-10 에프, 지. 엠. 헤르만스; 이. 에이치. 리링크 파스퇴렐라 과의 약독화된 rtx 독소 생성 생 박테리아
JP2004242608A (ja) 2003-02-17 2004-09-02 Nitsuseiken Kk 無毒変異型パスツレラ・ムルトシダ毒素とその遺伝子および製法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Infect Immun., Vol. 67(1), pp. 80-87 (1999)
NCBI GenBank Accession No. CAA82233

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20080254062A1 (en) Use of an avirulent bordetella mutant as a live vaccine vector
KR102071743B1 (ko) 신규의 약독화된 시겔라 생백신
US10603371B2 (en) Attenuated Pasteurella multocida vaccines and methods of making and use thereof
US11707515B2 (en) Modified Brucella vaccine strain for the treatment of brucellosis
JP3905128B2 (ja) アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエｒｔｘ毒素ａｐｘに対する免疫
EP2597151A2 (en) Recombinant microorganisms, methods for preparing vaccine strains, antigens, and vector vaccine compositions of same, uses thereof, and related antibodies, diagnostic kit, and treatment and/or prophylactic methods
KR101151004B1 (ko) 소의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 소의 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신조성물
US5703219A (en) Nucleic acid encoding helicobacter pylori enolase
EP2424974B1 (en) Mutants of francisella tularensis and uses thereof
JP3905127B2 (ja) パスツレラ・ヘモリチカ白血球毒素に対する免疫
EP2916863B1 (en) Attenuated mannheimia haemolytica vaccines and methods of making and use
KR100807844B1 (ko) 약독화된 파스튜렐라 물토시다 균주, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 그를 이용한 포유동물의 파스튜렐라물토시다 감염증의 치료 또는 예방하는 방법
JP4716542B2 (ja) ワクチンに使用するための生きた弱毒細菌
JP5257939B2 (ja) 豚丹毒・豚マイコプラズマ肺炎経口投与型多価ワクチン
JP5547657B2 (ja) パスツレラ・ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）のｆｕｒ細胞およびその外膜タンパク質の抽出物によるパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）に対する異種性の防御
ES2346915T3 (es) Bacterias gram negativas atenuadas.
CN113046384A (zh) 一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法
WO1998046260A1 (en) Pasteurella haemolytica vaccine
KR100465347B1 (ko) 효모에서 악티노바실러스 플루로뉴모니애의 재조합ＡｐｘⅡＡ 독소 단백질을 제조하는 방법 및사료첨가제로서의 이의 용도
KR100889375B1 (ko) 이종 항원 단백질을 발현하는 약독화된 보르데텔라브론키셉티카 균주 및 그의 제조 방법, 그를 포함하는면역원성 조성물 및 그를 이용하여 발현되는 이종단백질해당 병원체의 감염증을 치료 또는 예방하는 방법
JPH1075774A (ja) パスツレラ科の弱毒化ｒｔｘ産生細菌
WO2014174257A2 (en) Methods
KR100886358B1 (ko) 파스튜렐라 멀토시다의 비병원성 약독화 균주 및 이를함유하는 백신
KR20080082883A (ko) 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 (ｂｂｓ) 균주 및 그의제조 방법, 그를 포함하는 면역원성 조성물 및 그를 이용한포유동물의 ｂｂｓ 감염증을 치료 또는 예방하는 방법
JP2023533000A (ja) 遺伝子操作された、生きている細菌及びその構築方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20110211

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140219

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150213

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160218

Year of fee payment: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee