JP2023533000A

JP2023533000A - 遺伝子操作された、生きている細菌及びその構築方法

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Publication number: JP2023533000A
Application number: JP2023500411A
Authority: JP
Inventors: イェジン，
Original assignee: New Portal Ltd
Current assignee: New Portal Ltd
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2023-08-01
Also published as: CN115916959A; US20230321211A1; AU2021304144A1; EP4179068A1; WO2022006748A1; WO2022007741A1

Abstract

本発明は、医療エフェクターをコードする少なくとも一つのエフェクター遺伝子と、前記細菌の寿命を短縮する少なくとも一つの遺伝子改変とを含む、遺伝子操作された、生きている細菌に関する。被験者に投与された後、前記細菌は、前記医療エフェクターが少なくとも一つの医療的効果を果たすことを可能にするのに十分な時間内に生存しており、且つ前記被験者への発症メカニズムを最小化するのに十分な時間内で死滅する。前記細菌は、疾患に対する有効な処置又は病状の改善を提供するとともに、医療用途の生物学的安全性を確保する。

Description

配列表の参照

本出願は、コンピュータ可読形式の配列表を含み、前記配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、遺伝子操作された、生きている細菌及びその構築方法に関する。特に、本発明は、疾患又は病状を効果的に処置及び／又は予防できる遺伝子操作された、生きている細菌の提供に関する。

天然に存在するか、又は人工的に改変された細菌は、感染症および最近の癌などの様々な疾患に対するワクチン又は薬物として使用されてきた。効能に加えて、細菌を医療目的に利用する上で、最も重要な問題は安全性である。このため、標的細菌を殺滅するか、又は、細菌が病巣内で優先的又は選択的に増殖する能力を得るように細菌を遺伝子改変するために、多くの努力がなされてきた。

疾患の処置又は病状の改善に有効で生物学的安全性を確保するための新規な細菌の必要性が高い。

上記背景を鑑み、いくつかの例示的な実施例において、従来技術の欠点のうちの少なくとも一つの欠点を克服するために、代替可能な細菌を提供することを目的とする。

一態様では、遺伝子操作された、生きている細菌を提供し、前記遺伝子操作された、生きている細菌は、医療エフェクターをコードする少なくとも一つのエフェクター遺伝子と、細菌の寿命を短縮することによって、前記細菌が、被験者に投与された後、医療エフェクターが少なくとも一つの医療的効果を果たすことを可能にするのに十分な時間内に生存しており、且つ被験者への発症メカニズムを最小化するのに十分な時間内で死滅するようにする少なくとも一つの遺伝子改変とを含む。いくつかの実施例において、細菌は毒性株から派生したものである。

いくつかの例示的な実施例において、医療エフェクターは、被験者に対する、対象疾患又は病状を処置するのに十分な少なくとも一つの免疫応答を誘導し得る抗原である。

いくつかの例示的な実施例において、医療エフェクターは、対象疾患又は病状を処置するのに十分な程度に、被験者において、少なくとも一つの免疫応答を誘発し、及び／又は標的病巣の大きさを減少させ得る治療因子である。

いくつかの例示的な実施例において、免疫応答は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞により誘発される。

いくつかの例示的な実施例において、医療エフェクターは、抗原、又は細菌の相同遺伝子から発現された治療因子である。

いくつかの例示的な実施例において、医療エフェクターは抗原、又は異種遺伝子から発現された治療因子である。

いくつかの例示的な実施例において、異種遺伝子は、細菌における異種発現を改善するリーダー配列及び／又はターミネーター領域をさらに含む。

いくつかの例示的な実施例において、治療因子は、標的病巣において細胞溶解を引き起こす細胞毒素である。

いくつかの例示的な実施例において、対象疾患又は病状は、癌又は腫瘍であり、且つここで、医療エフェクターは、被験者において腫瘍抑制又は融解を引き起こす。

いくつかの例示的な実施例において、発症メカニズムを最小化するのに十分な時間は４８時間未満である。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は、被験者内でコピー又はコロニー形成することができない。

いくつかの例示的な実施例において、遺伝子改変は、少なくとも一つの必須遺伝子又は栄養要求性遺伝子の、細菌の染色体からの欠失又は突然変異である。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は、ジアミノピメリン酸における栄養要求体である。

いくつかの例示的な実施例において、遺伝子改変は、アスパラギン酸－セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）の細菌の染色体からの欠失である。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は、インビボ投与時に細菌の生存時間を調節する一つ又は複数の調節エフェクターへの前記細菌の曝露によって制御し得る生存時間を有する。

いくつかの例示的な実施例において、調節エフェクターは、ジアミノピメリン酸である。

いくつかの例示的な実施例において、医療エフェクターは、ｃｈｕＡ、ｙｊａＡ、ｔｓｐＥ４Ｃ２、ｓａｔ、ｓｆａ、ｐａｐＧ、ｆｙｕＡ、ｉｕｔＡ、ｈｌｙＡＣＢＤ、ｙｆｃＶ及びｐｋｓアイランドからなる群から選択される遺伝子により発現される相同ペプチドである。

いくつかの例示的な実施例において、医療エフェクターは、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）の非溶血性エンテロトキシン（Ｎｈｅ）、溶血素、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）の空胞化毒素、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞毒素である。

いくつかの例示的な実施例において、医療エフェクターは、ＣｐＧ、環状ジヌクレオチド及び腫瘍抗原からなる群から選択される抗癌因子である。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）又はラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）から派生したものである。

いくつかの例示的な実施例において、細菌派は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）から派生したものである。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣｈｉｎａＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ、ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３６の菌株ＳＨ３から派生したものである。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する配列を発現する。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３５の菌株ｍｐ１０７から派生したものである。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は静脈内投与される。いくつかの例示的な実施例において、細菌は、静脈内投与用に配合される。

いくつかの例示的な実施例において、静脈内投与時、発症メカニズムを最小化するのに十分な時間は４８時間未満である。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は局所投与される。いくつかの例示的な実施例において、細菌は、局所投与用に配合される。

いくつかの例示的な実施例において、注射部位で局所投与される場合、細菌は、注射部位で最大５日間生存するが、前記注射部位以外では４８時間以内に死滅する。いくつかの実施例において、細菌は、正常な組織と器官から除去される。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は、７．５×１０⁹ ｃｆｕ／ｋｇマウスの当量投与量で投与される。いくつかの例示的な実施例において、細菌は、７．５×１０⁹ ｃｆｕ／ｋｇマウスの当量投与量で静脈内投与される。

いくつかの例示的な実施例において、疾患は、癌又は腫瘍であり、且つ細菌は、腫瘍内投与される。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は、腫瘍１グラム（約１００－２００ｍｍ³）あたりに５×１０⁸ ｃｆｕの当量投与量で腫瘍内投与される。いくつかの例示的な実施例において、細菌は、腫瘍１グラム（約１００－２００ｍｍ³）あたりに４×１０⁹ ｃｆｕの当量投与量で腫瘍内投与される。いくつかの例示的な実施例において、細菌は、腫瘍１グラム（約１００－２００ｍｍ³）あたりに少なくとも５×１０⁸ ｃｆｕの当量投与量で腫瘍内投与される。

別の態様では、大腸菌属種の生きている細菌を提供し、前記生きている細菌は、アスパラギン酸－セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）の、細菌の染色体における遺伝子欠失を含み、ここで、前記細菌は毒性株から派生したものである。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は、医療エフェクターをコードする少なくとも一つのエフェクター遺伝子を発現する。

いくつかの例示的な実施例において、細菌は、シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）をコードする遺伝子をさらに含む。

いくつかの例示的な実施例において、遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％配列同一性を有する。

別の態様では、先行請求項のいずれか一項に記載の細菌を含む免疫原性組成物を提供した。

別の態様では、例示的な実施例のいずれか一項に記載の細菌と、任意選択的なアジュバントとを含む生きている細菌ワクチンを提供した。

別の態様では、有効量の例示的な実施例のいずれか一項に記載の細菌を含む組成物を被験者に投与することを含む、疾患又は病状を処置する方法を提供した。

いくつかの例示的な実施例において、疾患は、腫瘍又は癌である。

別の態様では、遺伝子操作された、生きている細菌を構築する方法を提供し、前記方法は、細菌を、前記細菌の寿命を短くするように遺伝子操作することによって、前記細菌が、被験者に投与された後、医療エフェクターが少なくとも一つの医療的効果を果たすことを可能にするのに十分な時間内に生存しており、且つ前記被験者への発症メカニズムを最小化するのに十分な時間内で死滅するようにするステップを含み、ここで、前記細菌は毒性株から派生したものである。

いくつかの例示的な実施例において、前記方法は、少なくとも一つの医療エフェクターを発現するように、前記細菌を遺伝子操作するステップをさらに含む。

本明細書では、他の例示的な実施例についても検討した。

本開示の内容には多くの利点がある。いくつかの実施例において、提供された細菌は、被験者インビボの生きている細菌であるため、そのエフェクター分子の完全性と機能性を維持することによって医療効能を確保する。

いくつかの例示的な実施例において、短寿命細菌は、より優れた医療的効果を果たすために投与後一定期間体内で生存することができるため、殺滅又は不活化された細菌よりも優れている。

いくつかの実施例において、提供された細菌は、毒性又は病原性菌株から派生したものであるとともに、医療エフェクターとして使用するために毒性因子のうちの全て又は少なくとも一部の毒性因子を維持するため、処置効能が非病原性菌株の処置効能よりも遙かに優れている。これらの毒性株の多くの抗原と毒性因子は、疾患に対する免疫力を誘発するか又は癌細胞を直接殺滅するなどの様々な処置可能性をもたらす。いくつかの実施例において、腫瘍進行を効果的に抑制するか又は腫瘍を治癒するには、腫瘍内又は静脈内注射された少量の短寿命細菌で十分である。

いくつかの実施例において、提供された細菌の寿命が短いため、遺伝子突然変異の潜在的なリスクが最小限にされるとともに、医療用途の生物学的安全性が確保された。

いくつかの実施例において、提供された細菌は、寿命が短く、且つ高い免疫原性と治療性効能を有するため、前記細菌は、静脈内投与時にも十分な治療効果を実現することができる。いくつかの実施例において、十分な腫瘍抑制を実現するためには、短寿命細菌の少量の静脈内投与又は全身投与で十分である。細菌は、腫瘍などのような標的を特異的に標的化するか又は前記標的にコロニー形成されるように設計される必要はなく、局所又は腫瘍内投与に限定される必要もないが、疾患の処置において依然として良好な効能を実現することができる。

いくつかの実施例において、短寿命細菌はその短期生存特性を失うように容易に突然変異しないが、病巣特異的細菌はその病巣標的化能力を失うように突然変異しやすいため、短寿命細菌は、遺伝子改変された、病巣特異的細菌よりも優れている。

いくつかの実施例において、短寿命細菌は、様々な疾患を処置又は予防するか又はいくつかの病状を改善するためのワクチン又は治療剤のベクター又は媒体として使用されてもよい。いくつかの実施例において、短寿命細菌は、診断目的に使用されてもよい。

例示的な実施例による、ＬＢ培地で０時間、２４時間及び４８時間インビトロ増殖した短寿命細菌の生存能力のある細胞の数を示した。例示的な実施例による、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）が補充されたＬＢ培地で０時間、２４時間及び４８時間インビトロ増殖した短寿命細菌の生存能力のある細胞の数を示した。例示的な実施例による、均質化された混合器官懸濁液内で０時間、２４時間及び４８時間エクスビボ増殖した短寿命細菌の生存能力のある細胞の数を示した。例示的な実施例による、マウスに皮下注射された１日、２日、５日及び１１日後の短寿命細菌の生存能力のある細胞の数を示した。例示的な実施例による、マウスＬｅｗｉｓ肺癌細胞系（ＬＬＣ）に対する短寿命細菌ｍｐ１０７と対照菌株ＭＧ１６５５の殺滅率を示した。例示的な実施例による、ヒト肺癌細胞系（Ａ５４９）に対する短寿命細菌ｍｐ１０７と対照菌株ＭＧ１６５５のそれぞれの殺滅率を示した。例示的な実施例による、対照菌株ＭＧ１６５５、短寿命細菌ＳＨ３及びＥｘｌＡを発現する短寿命細菌ｍｐ１０７（二つの異なる投与量を使用する）の腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射によるマウス腫瘍体積に対する抑制を示した。（^*Ｐ＜０．０５、^***Ｐ＜０．００１）。エラーバー、ＳＥＭ。例示的な実施例による、ＰＢＳとＥｘｌＡを発現する短寿命細菌ｍｐ１０７（７．５×１０⁹ ｃｆｕ／ｋｇマウスの投与量で）の静脈内（ｉ．ｖ．）注射によるマウス肺癌に対する抑制を示した。（^***Ｐ＜０．００１）。エラーバー、ＳＥＭ。示的な実施例による、ｍｐ１０７又は対照菌株ＭＧ１６５５で処理されたマウス腫瘍内ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合のフローサイトメトリー結果を示した。（^***Ｐ＜０．００１）。エラーバー、ＳＥＭ。例示的な実施例による、ｍｐ１０７又は対照菌株ＭＧ１６５５で処理されたマウス腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合のフローサイトメトリー結果を示した。（^***Ｐ＜０．００１）。エラーバー、ＳＥＭ。例示的な実施例によるプラスミドｐＥｘｌＡのチャート概略図である。例示的な実施例によるプラスミドｐＥｘｌＡ２のチャート概略図である。例示的な実施例による大腸菌株ＳＨ３とＳＨ４の溶血分析を示した。例示的な実施例による大腸菌対照菌株ＭＧ１６５５とＭＧ１６５５／ｐＥｘｌＡ２の溶血分析を示した。例示的な実施例による、ｍｐ１０５、ｍｐ１０６又はｍｐ１０７を２×１０⁸ ｃｆｕ／マウスの投与量で静脈内注射した後のマウス体重減少率を示した。ＰＢＳは、陰性対照として用いられる。エラーバー、ＳＥＭ。例示的な実施例による、ｍｐ１０５、ｍｐ１０６又はｍｐ１０７を静脈内注射した、皮下ＬＬＣ腫瘍を運ぶマウスの腫瘍体積（ｍｍ３）の増加を示した。ＰＢＳは、陰性対照として用いられる。エラーバー、ＳＥＭ。例示的な実施例による、静脈内注射ｍｐ１０５（ｉｖ）又は静脈内注射と腫瘍内注射ｍｐ１０５との組み合わせ（ｉｖ＋ｉｔ）が投与された、皮下ＬＬＣ腫瘍を運ぶマウスの腫瘍体積（ｍｍ３）の増加を示した。ＰＢＳは、陰性対照として用いられる。エラーバー、ＳＥＭ。例示的な実施例による、ｍｐ１０５（１×１０⁸ ｃｆｕ／マウスの投与量で）又はＰＢＳを二剤皮下注射した後１４日目に、肝臓におけるサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の定量を示した。コロニー形成単位をカウントすることによって、器官における細菌を定量し、且つコロニーＰＣＲによって検証する。例示的な実施例による、ｍｐ１０５（１×１０⁸ ｃｆｕ／マウスの投与量で）又はＰＢＳを二剤皮下注射した後１４日目に、肺におけるサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の定量を示した。コロニー形成単位をカウントすることによって、器官における細菌を定量し、且つコロニーＰＣＲによって検証する。

微生物保蔵
細菌株ＳＨ２は、２０２１年６月１０日に、中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号（１００１０１）の中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が２２６８５である。細菌株ＳＨ３は、２０２０年５月１８日に、中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号（１００１０１）の中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が１９８３６である。細菌株ｍｐ１０７は、２０２０年５月１８日に、中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号（１００１０１）の中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が１９８３５である。細菌株ＳＨ４は、２０２１年５月１８日に、中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号（１００１０１）の中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が２２５５７である。細菌株ｍｐ１０５は、２０２１年５月１８日に、中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号（１００１０１）の中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が２２５５５である。細菌株ｍｐ１０６は、２０２１年５月１８日に、中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号（１００１０１）の中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が２２５５６である。

本明細書と請求項で使用されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、以下の要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味する。

本明細書と請求項で使用されるように、単数形「一つ／一種（ａ／ａｎ）」と「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。例えば、以上で使用されるように、「一つの」遺伝子は、一つ又は複数の遺伝子を意味し、それは同じであってもよく、異なってもよい。

本明細書で使用されるように、「約」という用語は、当該技術分野の通常の許容差の範囲内にあり、且つ規定値の±１０％を超えないと理解される。単なる例として、約５０は、４５～５５を意味し、その間の全ての値を含む。本明細書で使用されるように、「約」特定の値という語句は、前記特定の値をも含み、例えば、約５０は５０を含む。

本明細書と請求項で使用されるように、「免疫原性組成物」は、疾患又は病状に対する免疫（免疫学）応答を（例えば、適切な形と量で）効果的に誘発する組成物である。いくつかの実施例において、免疫原性組成物は、癌又は腫瘍を効果的に予防するワクチンである。

本明細書と請求項で使用されるように、「有効量」とは、少なくとも測定可能な量の所望の効果を効果的に実現する量である。例えば、前記量は、免疫応答を効果的に誘発することができ、及び／又はそれは、標的ポリペプチドを運ぶ病原体に対して、防御応答を効果的に誘発することができる。いくつかの実施例において、前記量は、癌又は腫瘍に対する免疫応答を効果的に誘発することができる。

本明細書と請求項で使用されるように、「被験者」は、霊長類動物（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むが、これらに限定されず、哺乳類などの動物を指す。

本明細書と請求項で使用されるように、細菌の「発症メカニズム」は、宿主又は被験者の罹患状態を引き起こす一つ又は複数の生物学的メカニズムである。

本明細書と請求項で使用されるように、「無毒」株（例えば、非侵襲的、片利共生又は相利共生）は、被験者に疾患を引き起こしたり、有害な病原性効果を有したりしない菌株である。このような細菌は、天然に存在する細菌、ＧＲＡＳ（「安全であると認められる」）細菌又はプロバイオティクスであってもよい。別の態様では、「毒性」菌株は、少なくとも一つの毒性因子を有し、疾患を引き起こすか又は被験者に対して有害な病原性効果を有する可能性があり、且つ通常、安全であるとは考えられない。

いくつかの例示的な実施例における「毒性」菌株は、それがいくつかの付加的毒性因子を保持しているか又は有する場合であっても、疾患を引き起こさないか、又は被験者又は宿主に対して有害な病原性効果を有しないように、被遺伝子改変され得る。

「毒性因子」は、宿主又は宿主内の細胞（例えば、宿主内の腫瘍）を傷害する細菌の能力を改善することができる、細菌により産生された分子である。毒性因子の例は、細胞毒素、毒素、溶血素、プロテアーゼ、破壊酵素、及び細菌のコロニー形成、細胞への出入りと栄養取得の能力に役立つ因子を含む。

本明細書で使用されるように、「処置（ｔｒｅａｔ）」、「処置（中）（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「処置すること（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患又は病状の症状を予防的及び／又は治療的に緩和、除去又は寛解し、別の症状を予防する方法と、症状の根底にある代謝の原因を寛解又は予防すると、疾患又は病状を抑制する方法と、疾患又は病状の発症を阻止する方法と、疾患又は病状を軽減する方法と、疾患又は病状の退行を引き起こす方法と、疾患又は病状によって引き起こされた病状を軽減する方法と、又は疾患又は病状の症状を終止する方法とを含む。

本明細書と請求項で使用されるように、「短寿命（ｓｈｏｒｔ－ｌｉｖｅｄ）」細菌又は「短い寿命（ｓｈｏｒｔｌｉｆｅｓｐａｎ）」を有する細菌は、被験者にインビボ投与された後に、短い期間、例えば、数時間（例えば、１時間～３時間）から数日（例えば１日～３日）しか生存しない細菌を指し、これは投与された細菌の数及び細菌の投与方式に依存する。いくつかの実施例において、「短寿命」細菌は、投与された後に、被験者内でインビボコピー又はコロニー形成することができない。

本明細書と請求項で使用されるように、細菌「死滅」は、細菌の生命が永久に停止することを意味する。

本明細書と請求項で使用されるように、「弱毒化」細菌は、親形態又は菌株に比べて、毒性又は感染性が低下した細菌を指す。

本明細書と請求項で使用されるように、「医療エフェクター」は、疾患又は病状に対して少なくとも一つの医療的効果を果たす薬剤を指す。医療エフェクターの例は、治療因子、抗原、ペプチド及び細胞毒素を含むが、これらに限定されない。

本明細書と請求項で使用されるように、被験者の疾患又は病状「医療的効果を果たす」とは、被験者の疾患又は病状を処置する生物学的変化を引き起こすことを意味する。医療的効果の例は、免疫応答の誘発、疾患病巣内の細胞溶解の誘発、生物学的経路の抑制、受容体への結合、受容体の抑制、標的細胞又は生体内での細胞プロセスの抑制、及び疾患又は病状を引き起こすか又は維持する一つ又は複数の因子の産生の抑制又は減少を含むが、これらに限定されない。細胞プロセスは、ＤＮＡコピー、ＲＮＡ翻訳、細胞分裂及び細胞恒常性の維持を含むが、これらに限定されない。

いくつかの例示的な実施例において、殺滅された細菌と生きている細菌の両方の利点を有するとともに、それぞれの短所を避ける新規な細菌を開発することが非常に必要である。

いくつかの例示的な実施例において、提供された細菌は短寿命細菌である。短寿命細菌をインビボ投与する場合、前記短寿命細菌は、数時間の時間スケールで生存する。特定の化合物又は分子で細菌懸濁液を補充することによって、短寿命細菌の寿命を人為的に変化させることができる。投与時に短寿命細菌が生きているため、それらにより産生されたエフェクター分子は完全性と機能性を維持する。投与後の数時間又は数日内に短寿命細菌が体内で死滅するため、発症メカニズムは最小限にされる。

いくつかの例示的な実施例において、遺伝子操作された細菌を含む薬物組成物を提供した。

いくつかの例示的な実施例において、短寿命細菌は、一つ又はいくつかの必須遺伝子を欠失させることによって生成され得る。代替的に、細菌の栄養要求体は、関連する栄養要求性遺伝子の突然変異又は欠失によって遺伝子的に構築され得る。得られた突然変異型細菌は、変化した、相対的に短い寿命を有する可能性がある。そのうちのいくつかの得られた突然変異型細菌は、体内で迅速に死滅する可能性があり、これは、それらが投与された増殖環境における栄養成分に依存する。増殖環境が、細菌が一時的に生存するために必要な栄養又は化合物の残留量を含めば、細菌はより長期間生存することができる。

番号付けされた実施例－第１組
１．遺伝子操作された、生きている細菌であって、
少なくとも一つの医療エフェクターをコードする少なくとも一つのエフェクター遺伝子と、
前記細菌が、被験者に投与された後、前記医療エフェクターが少なくとも一つの医療的効果を果たすことを可能にするのに十分な時間内に生存しており、且つ前記被験者への発症メカニズムを最小化するのに十分な時間内で死滅するように、前記細菌の寿命を短縮させる少なくとも一つの遺伝子改変とを含み、
ここで、前記細菌は毒性株から派生したものである、遺伝子操作された、生きている細菌。

２．前記医療エフェクターは、前記被験者において、対象疾患又は病状を処置するのに十分な少なくとも一つの免疫応答を誘発し得る抗原である、実施例１に記載の細菌。

３．前記医療エフェクターは、対象疾患又は病状を処置するのに十分な程度に、前記被験者において、少なくとも一つの免疫応答を誘発し、及び／又は標的病巣の大きさを減少させ得る治療因子である、実施例１に記載の細菌。

４．前記免疫応答は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞により誘発される、実施例２又は３に記載の細菌。

５．前記医療エフェクターは、抗原、又は前記細菌の相同遺伝子から発現された治療因子である、実施例１に記載の細菌。

６．前記医療エフェクターは、抗原、又は異種遺伝子から発現された治療因子である、実施例１に記載の細菌。

７．前記異種遺伝子は、前記細菌における異種発現を改善するリーダー配列及び／又はターミネーター領域をさらに含む、実施例６に記載の細菌。

８．前記治療因子は、前記標的病巣において細胞溶解を引き起こす細胞毒素である、実施例３又は６に記載の細菌。

９．前記対象疾患又は病状は、癌又は腫瘍であり、且つここで、前記医療エフェクターは、前記被験者において腫瘍抑制を引き起こす、実施例２又は３に記載の細菌。

１０．前記細菌は、前記被験者内でコピー又はコロニー形成することができない、実施例１に記載の細菌。

１１．前記遺伝子改変は、少なくとも一つの必須遺伝子又は栄養要求性遺伝子の、前記細菌の染色体からの欠失又は突然変異である、実施例１に記載の細菌。

１２．前記細菌は、ジアミノピメリン酸における栄養要求体である、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

１３．前記遺伝子改変は、アスパラギン酸－セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）の、前記細菌の染色体からの欠失である、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

１４．前記細菌は、一つ又は複数の調節エフェクターへの前記細菌の曝露によって制御し得る生存時間を有し、前記調節エフェクターは、インビボ投与時に前記細菌の前記生存時間を調節する、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

１５．前記調節エフェクターは、ジアミノピメリン酸である、実施例１４に記載の細菌。

１６．前記医療エフェクターは、ｃｈｕＡ、ｙｊａＡ、ｔｓｐＥ４Ｃ２、ｓａｔ、ｓｆａ、ｐａｐＧ、ｆｙｕＡ、ｉｕｔＡ、ｈｌｙＡＣＢＤ、ｙｆｃＶ及びｐｋｓアイランドからなる群から選択される遺伝子により発現される相同ペプチドである、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

１７．前記医療エフェクターは、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）の非溶血性エンテロトキシン（Ｎｈｅ）、溶血素、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）の空胞化毒素、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞毒素である、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

１８．前記医療エフェクターは、ＣｐＧ、環状ジヌクレオチド及び腫瘍抗原からなる群から選択される抗癌因子である、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

１９．前記細菌は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）又はラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）から派生したものである、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

２０．前記細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）から派生したものである、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

２１．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３６の菌株ＳＨ３から派生したものである、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

２２．前記細菌は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する配列を発現する、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

２３．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３５の菌株ｍｐ１０７から派生したものである、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

２４．前記細菌は、静脈内投与用に配合される、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

２５．静脈内投与時、発症メカニズムを最小化するのに十分な時間は日又は４８時間未満である、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

２６．前記細菌は、局所投与用に配合される、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

２７．注射部位で局所投与される場合、前記細菌は、前記注射部位で最大５日間生存するが、前記注射部位以外では４８時間以内に死滅する、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

２８．前記細菌は、７．５×１０⁹ ｃｆｕ／ｋｇマウスの当量投与量で投与される、実施例２４に記載の細菌。

２９．前記疾患は、癌又は腫瘍であり、且つ細菌は、腫瘍内投与される、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

３０．前記細菌は、腫瘍１グラムあたりに少なくとも５×１０⁸ ｃｆｕの当量投与量で約１００－２００ｍｍ³投与される、実施例２９に記載の細菌。

３１．大腸菌属種の生きている細菌であって、前記生きている細菌は、
アスパラギン酸－セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）の、前記細菌の染色体における遺伝子欠失を含み、
ここで、前記細菌は毒性株から派生したものである、大腸菌属種の生きている細菌。

３２．前記細菌は、医療エフェクターをコードする少なくとも一つのエフェクター遺伝子を発現する、実施例３１に記載の細菌。

３３．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３６の菌株ＳＨ３から派生したものである、実施例３１に記載の細菌。

３４．前記細菌は、シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）をコードする遺伝子をさらに含む、実施例３１に記載の細菌。

３５．前記遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する、実施例３４に記載の細菌。

３６．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３５の菌株ｍｐ１０７から派生したものである、実施例３１に記載の細菌。

３７．先行実施例のいずれか一項に記載の細菌を含む、免疫原性組成物。

３８．先行実施例のいずれか一項に記載の細菌と、任意選択的なアジュバントとを含む、生きている細菌ワクチン。

３９．有効量の先行実施例のいずれか一項に記載の細菌を含む組成物を被験者に投与することを含む、疾患又は病状を処置する方法。

４０．前記疾患は、腫瘍又は癌である、実施例３９に記載の方法。

４１．遺伝子操作された、生きている細菌を構築する方法であって、
細菌を、前記細菌の寿命を短くするように遺伝子操作することによって、前記細菌が、被験者に投与された後、医療エフェクターが少なくとも一つの医療的効果を果たすことを可能にするのに十分な時間内に生存しており、且つ前記被験者への発症メカニズムを最小化するのに十分な時間内で死滅するようにするステップを含み、ここで、前記細菌は毒性株から派生したものである、方法。

４２．少なくとも一つの医療エフェクターを発現するように、前記細菌を遺伝子操作するステップをさらに含む、実施例４１に記載の方法。

番号付けされた実施例－第２組
１．遺伝子操作された、生きている細菌であって、
少なくとも一つの医療エフェクターをコードする少なくとも一つのエフェクター遺伝子と、
前記細菌の寿命を短縮することによって、前記生きている細菌が、被験者に投与された後、前記医療エフェクターが少なくとも一つの医療的効果を果たすことを可能にするのに十分な時間内に生存しており、且つ前記被験者への発症メカニズムを最小化する時間の後に死滅するようにする少なくとも一つの遺伝子改変とを含み、
ここで、前記細菌は毒性株から派生したものである、遺伝子操作された、生きている細菌。

２５．静脈内投与時、発症メカニズムを最小化するのに十分な時間は２日未満、５日未満又は１１日未満である、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

３１．前記少なくとも一つのエフェクター遺伝子は、細胞毒素遺伝子と、溶血素ＩＩＩコード遺伝子の一部のＤＮＡ断片とを含む、実施例１から２０のいずれか一項に記載の細菌。

３２．前記細胞毒素は、シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）である、実施例３１に記載の細菌。

３３．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５６の菌株ｍｐ１０６から派生したものである、実施例３１又は３２に記載の細菌。

３４．前記細菌の毒性を弱める少なくとも一つの毒性遺伝子改変をさらに含む、先行実施例のいずれか一項に記載の細菌。

３５．前記少なくとも一つの毒性遺伝子改変は、少なくとも一つの毒性遺伝子の、前記細菌の染色体からの欠失又は突然変異である、実施例３４に記載の細菌。

３６．前記毒性遺伝子改変は、ｈｌｙＣＡＢＤオペロンの、前記細菌の染色体からの欠失である、実施例３４又は３５に記載の細菌。

３７．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５７の菌株ＳＨ４から派生したものである、実施例３６に記載の細菌。

３８．前記細菌は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する配列を発現する、実施例３４から３７のいずれか一項に記載の細菌。

３９．前記細菌は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する第１の配列を発現し、及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：４２の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する第２の配列を発現する、実施例３４から３７のいずれか一項に記載の細菌。

４０．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５５の菌株ｍｐ１０５から派生したものである、実施例３８又は３９に記載の細菌。

４１．前記細菌は、２×１０⁸ ｃｆｕ／マウスの当量投与量で投与される、実施例３１から４０のいずれか一項に記載の細菌。

４２．前記細菌は、静脈内注射と腫瘍内注射との組み合わせで投与するように配合される、実施例３４から４０のいずれか一項に記載の細菌。

４３．前記腫瘍内注射は、７．５×１０⁷ ｃｆｕ／マウスの当量投与量を有し、且つ前記静脈内注射は、３×１０⁷ ｃｆｕ／マウスの当量投与量を有する、実施例４２に記載の細菌。

４４．大腸菌属種の生きている細菌であって、
アスパラギン酸－セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）の、前記細菌の染色体における遺伝子欠失を含み、
ここで、前記細菌は毒性株から派生したものである、大腸菌属種の生きている細菌。

４５．前記細菌は、医療エフェクターをコードする少なくとも一つのエフェクター遺伝子を発現する、実施例４４に記載の細菌。

４６．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３６の菌株ＳＨ３から派生したものである、実施例４４に記載の細菌。

４７．前記細菌は、シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）をコードする遺伝子をさらに含む、実施例４４に記載の細菌。

４８．前記遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％配列同一性を有する、実施例４７に記載の細菌。

４９．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３５の菌株ｍｐ１０７から派生したものである、実施例４４に記載の細菌。

５０．前記少なくとも一つのエフェクター遺伝子は、細胞毒素遺伝子と、溶血素ＩＩＩコード遺伝子の一部のＤＮＡ断片とを含む、実施例４４に記載の細菌。

５１．前記細胞毒素は、シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）である、実施例５０に記載の細菌。

５２．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５６の菌株ｍｐ１０６から派生したものである、実施例５０又は５１に記載の細菌。

５３．前記細菌の毒性を弱める少なくとも一つの毒性遺伝子改変をさらに含む、実施例４４から５２のいずれか一項に記載の細菌。

５４．前記少なくとも一つの毒性遺伝子改変は、少なくとも一つの毒性遺伝子の、前記細菌の染色体からの欠失又は突然変異である、実施例５３に記載の細菌。

５５．前記毒性遺伝子改変は、ｈｌｙＣＡＢＤオペロンの、前記細菌の染色体からの欠失である、実施例５３又は５４に記載の細菌。

５６．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５７の菌株ＳＨ４から派生したものである、実施例５５に記載の細菌。

５７．前記細菌は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する配列を発現する、実施例５３から５６のいずれか一項に記載の細菌。

５８．前記細菌は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する第１の配列を発現し、及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：４２の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する第２の配列を発現する、実施例５３から５６のいずれか一項に記載の細菌。

５９．前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５５の菌株ｍｐ１０５から派生したものである、実施例５７又は５８に記載の細菌。

６０．前記細菌は、２×１０⁸ ｃｆｕ／マウスの当量投与量で投与される、実施例５０から５９のいずれか一項に記載の細菌。

６１．前記細菌は、静脈内注射と腫瘍内注射との組み合わせで投与するように配合される、実施例５３から５９のいずれか一項に記載の細菌。

６２．前記腫瘍内注射は、７．５×１０⁷ ｃｆｕ／マウスの当量投与量を有し、且つ前記静脈内注射は、３×１０⁷ ｃｆｕ／マウスの当量投与量を有する、実施例６１に記載の細菌。

６３．先行実施例のいずれか一項に記載の細菌を含む、免疫原性組成物。

６４．先行実施例のいずれか一項に記載の細菌と、任意選択的なアジュバントとを含む、生きている細菌ワクチン。

６５．有効量の先行実施例のいずれか一項に記載の細菌を含む組成物を被験者に投与することを含む、疾患又は病状を処置する方法。

６６．前記疾患は、腫瘍又は癌である、実施例６５に記載の方法。

６７．遺伝子操作された、生きている細菌を構築する方法であって、
細菌を、前記細菌の寿命を短くするように遺伝子操作することによって、前記細菌が、被験者に投与された後、医療エフェクターが少なくとも一つの医療的効果を果たすことを可能にするのに十分な時間内に生存しており、且つ前記被験者への発症メカニズムを最小化するのに十分な時間内で死滅するようにするステップを含み、ここで、前記細菌は毒性株から派生したものである、方法。

６８．少なくとも一つの医療エフェクターを発現するように、前記細菌を遺伝子操作するステップをさらに含む、実施例６７に記載の方法。

６９．有効量の先行実施例のいずれか一項に記載の細菌を含む、組成物の、疾患又は病状を処置するための薬物の製造における用途。

７０．前記疾患は、腫瘍又は癌である、実施例６９に記載の用途。

いくつかの実施例において、遺伝子操作された、生きている細菌を提供し、該遺伝子操作された、生きている細菌は、医療エフェクターをコードする少なくとも一つのエフェクター遺伝子と、細菌の寿命を短縮することによって、細菌が、被験者に投与された後、医療エフェクターが少なくとも一つの医療的効果を果たすことを可能にするのに十分な時間内に生存しており、且つ被験者への発症メカニズムを最小化するのに十分な時間後に死滅するようにする少なくとも一つの遺伝子改変とを含む。前記細菌は、毒性株から派生したものである。

いくつかの実施例において、非病原性又は無毒性細菌に比べて、毒性株は、基礎レベルのより高い免疫原性と治療可能性を提供することができる。

いくつかの実施例において、前記時間は、医療エフェクターが少なくとも一つの疾患又は病状に対して少なくとも一つの医療的効果を果たすことを可能にするのに十分である。前記効果は、細菌が死滅し且つ被験者体内から除去された後にも長時間に存在し得る。

いくつかの例示的な実施例において、医療的効果は、予防及び／又は治療効果である。

いくつかの例示的な実施例において、細菌の医療エフェクターが予防及び／又は治療効果を開始するのに十分な時間は４８時間未満である。

例１
材料と方法
（１）短寿命細菌を構築する方法
必須遺伝子又は栄養要求性遺伝子の欠失又は突然変異
短寿命細菌を産生するために、少なくとも一つの必須遺伝子又は栄養要求性遺伝子には欠失又は突然変異が発生し得る。いくつかの例示的な実施例において、毒性細菌株を突然変異に使用した。

該例示的な実施例において、健康なボランティアによって提供された糞便サンプルから大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＳＨ２を単離し且つ精製した。糞便サンプルをＰＢＳ緩衝液に再懸濁させ、且つ１ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）とＸ－ｇａｌ（０．０６ｍｇ／ｍｌ）が補充されたＬＢ寒天上に広げた。大腸菌は、青色のコロニーを形成し、且つ他の菌種と区別された。ＳＨ２は、糞便大腸菌分離株のうちの一つの分離株である。菌株ＳＨ２は、２０２１年６月１０日に、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が２２６８５である。

該例示的な実施例において、アスパラギン酸－セミアルデヒド脱水素酵素をコードする必須遺伝子として、ａｓｄ遺伝子は、大腸菌株ＳＨ２の染色体から欠失していた。ラムダ（λ）－Ｒｅｄ組換えシステムを使用して、ａｓｄ遺伝子を大腸菌の細菌染色体から欠失させた。二つのプライマーは欠失の産生に用いられ、
ａｓｄ－Ｆ（順方向プライマー）：

ａｓｄ－Ｒ（逆方向プライマー）：

クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）をテンプレートとして使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｌｏｘＰ－ｃａｔ－ｌｏｘＰクロラムフェニコール耐性カセットを含むＤＮＡ断片を増殖し、前記断片は、ａｓｄ遺伝子に直接隣接する領域と相同性（４５ｎｔ）を有する。プライマーａｓｄ－Ｆとａｓｄ－Ｒを該ＰＣＲに使用した。プラスミドｐＳｉｍ６を用いてエレクトロコンピテント大腸菌を形質転換し、前記プラスミド上においてλ組換えタンパク質の発現を４２℃で誘導した。エレクトロポレーションによって、ｐＳｉｍ６を運ぶ大腸菌に上記ＰＣＲ断片を導入した。λ－ｒｅｄを誘導した後、３７^oＣで一晩インキュベーションしてから、クロラムフェニコール耐性に対して組換えコロニーを選択した。耐性コロニーを単離し、且つａｓｄ遺伝子に隣接するように設計されるプライマーであるａｓｄ－Ｆ２（順方向）ＴＡＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）とＣｍ－Ｒ３（逆方向）ＣＣＴＣＴＴＡＣＧＴＧＣＣＧＡＴＣＡＡＣＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）を用いて、コロニーＰＣＲによって検証した。ＰＣＲの大きさは５０５ｂｐであると検証された。表現型試験によってａｓｄ欠失をさらに確認し、前記表現型試験では、正確なコロニーは、ＬＢ培地上で増殖していなかったが、ＤＡＰ（５０μｇ／ｍｌ）が補充されたＬＢ培地上で容易に増殖した。ａｓｄ欠失を確認した後、単一のコロニーを選択し、且つカナマイシン耐性遺伝子を運ぶ７０５Ｃｒｅプラスミドで形質転換した。前記プラスミドからのＣｒｅリコンビナーゼの発現は、３７℃で誘導され、且ついずれの抗生物質もない場合に、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天上に広げられた。そして、ＬＢ寒天とクロラムフェニコールが補充されたＬＢ寒天の両方で、単一のコロニーを線引きした。ＬＢ寒天上で増殖するが、クロラムフェニコールを有するＬＢ寒天上で増殖しない単一のコロニーを選択した。ａｓｄの遺伝子欠失を有するが、ｌｏｘｐ－ｃａｔ－ｌｏｘｐカセットを有しない該突然変異株を、ＳＨ３と命名した。菌株ＳＨ３は、２０２０年５月１８日に、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が１９８３６である。

突然変異株の毒性遺伝子同定
コロニーＰＣＲによってＳＨ３内の毒性遺伝子を検出した。プライマーを設計するために、まず、多重配列アラインメントに対する評価によって、異なる大腸菌株において保存配列領域を同定した。そして、プライマーは、保存領域に対して特異的であるように設計された。使用された全てのプライマーは、いずれも表１に一覧表示されている。

インビトロ細菌増殖アッセイ
１０μｌ細菌ＳＨ３の一晩培養物を、５０μｇ／ｍｌＤＡＰを有するか又は有しない１ｍｌのＬＢプロス培地で継代培養（時間０）した。２４時間と４８時間インキュベーションした後、細菌を連続的に希釈し、且つＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天と、５０μｇ／ｍｌＤＡＰが補充されたＬＢ寒天の両方上のコロニー形成単位をカウントすることによって、生存力のある細菌を定量した。

エクスビボ細菌生存アッセイ
生後六から八週間の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを安楽死させた。器官（肝臓、肺、心臓、腎臓と脾臓を含む）を除去し、且つそれぞれ均質化処理を行った。等体積の単独の器官懸濁液のうちの各懸濁液を混合して、混合器官懸濁液を形成した。懸濁液混合物をエクスビボ生存アッセイに使用した。５μｌ細菌の一晩培養物を５００μｌ器官懸濁液において継代培養（時間０）した。２４時間と４８時間後に、５０μｇ／ｍｌＤＡＰが補充されたＬＢ寒天上においてコロニー形成単位をカウントすることによって、生存力のある細菌を定量した。

インビボ細菌生存アッセイ
５μｇ／ｍｌＤＡＰを有するか又は有しない細菌懸濁液（約１×１０⁹ ｃｆｕ）を、生後六から八週間の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（平均体重は約２０ｇである）の脇腹に皮下注射した。そして、異なる時点のコロニー形成単位を確定するために、細菌注射部位及び肝心な器官（肝臓、肺、心臓、腎臓と脾臓を含む）からの組織を除去した。約１グラムの各組織に対して、１ｍｌのＰＢＳ緩衝液内で均質化処理を行った。得られた組織懸濁液を連続的に希釈し、５０μｇ／ｍｌＤＡＰが補充されたＬＢ寒天上に広げ、且つそれぞれ３７^oＣで一晩インキュベーションした。希釈された組織懸濁液のコロニー形成単位（ｃｆｕ）をそれぞれカウントし、且つ希釈倍率に基づいて組織における細菌の数を計算した。

以上と類似している方法を用いて同様なインビボ細菌生存アッセイを繰り返し、ここで、細菌懸濁液（約５×１０⁸ ｃｆｕ）を、生後六から八週間の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（平均体重は約２０ｇである）の尾静脈に注射した。そして、異なる時点のコロニー形成単位を確定するために、細菌注射部位及び肝心な器官（肝臓、肺、心臓、腎臓と脾臓を含む）からの組織を除去した。約１グラムの各組織に対して、１ｍｌのＰＢＳ緩衝液内で均質化処理を行った。得られた組織懸濁液を連続的に希釈し、５０μｇ／ｍｌＤＡＰが補充されたＬＢ寒天上に広げ、且つそれぞれ３７^oＣで一晩インキュベーションした。希釈された組織懸濁液のコロニー形成単位（ｃｆｕ）をそれぞれカウントし、且つ希釈倍率に基づいて組織における細菌の数を計算した。

例２
（２）短寿命細菌を医療エフェクターのベクターとして使用した
遺伝子クローニングによって細胞毒素を発現する短寿命細菌を構築した
プロモーターとターミネーターを有する、シュードモナス・エルギノーサＰＡ７のエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）（図４）をコードするｅｘｌＡ遺伝子（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＰ０００７４４．１）を合成し、且つメーカーの説明書に従ってＣｌｏｎｅＥＺシームレスクローニング技術（ジェンスクリプト社（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ））を利用して、それをｐＢＡＤ－ＤＥＳＴ４９プラスミド（米国インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号１２２８３－０１６）にクローニングした。配列決定分析によって組換えプラスミドｐＥｘｌＡを検証した。その後に、エレクトロポレーションによって組換えプラスミドｐＥｘｌＡをａｓｄ欠失の突然変異型ＳＨ３に導入し、且つプライマーｏｘｂ－Ｆ（順方向：ＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＣＴＣＴ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）とｅｘｌＡ－Ｒ（逆方向：ＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＴＣ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）を用いて、コロニーＰＣＲによって検証した。プラスミドの形質転換を確認した後に、単一のコロニーを選択した。得られた、組換えプラスミドを有する突然変異株はｍｐ１０７と命名された。菌株ｍｐ１０７は、２０２０年５月１８日に、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が１９８３５である。

インビトロ細胞毒性アッセイ
マウスＬｅｗｉｓ肺癌（ＬＬＣ）細胞系と人肺癌細胞系（Ａ５４９）をインビトロ細胞毒性アッセイに使用した。増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｇｌｎ＋１％Ｐ／Ｓ）において、各細胞系を、ウェルあたりに１×１０⁴個の細胞で、９６ウェルプレートに接種した。細胞が８０％の集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に増殖した後、それらと細菌ｍｐ１０７を、抗生物質の含まない培地で５μｇ／ｍｌＤＡＰを加えて、１００のｍｏｉ（即ち細胞あたりに１００個の細菌）で共培養した。大腸菌基準菌株ＭＧ１６５５を対照細菌として用いた。対照として、対照細菌も、１×リン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）緩衝液と共培養された。３時間インキュベーションした後、細菌細胞をＰＢＳで三回洗浄し、且つ１％のクリスタルバイオレットで５ｍｉｎ染色した。死細胞が洗浄により除去されたため、クリスタルバイオレット染色された細胞は、生存可能な細胞と見なされる。染色された細胞をＰＢＳで軽く洗浄し、そして９５％のエタノールで脱色した。脱色溶液におけるクリスタルバイオレット染色の量（５９５ｎｍ位置での光密度（ＯＤ））を、５９５ｎｍ位置でマイクロタイタープレートリーダーによって測定し、それは生存可能な癌細胞の数を示す。共培養された細菌により殺滅された細胞の割合（又は殺滅率（％））を、式（対照的ＯＤ₅₉₅－処理的ＯＤ₅₉₅）／対照的ＯＤ₅₉₅）×１００％を用いて計算した。

局所投与時の短寿命細菌に対するインビボ抗腫瘍評価
生後六から八週間の雌Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをマウスＬｅｗｉｓ肺癌細胞系（ＬＬＣ）の腫瘍移植に使用した。特に、癌細胞系の１×１０⁶個の細胞を各マウスの脇腹に皮下注射した。細胞系移植後の７日から１２日目に、腫瘍の平均体積が約１００－２００ｍｍ³に達した時、対照細菌ＭＧ１６５５、短寿命細菌ＳＨ３とｍｐ１０７を、１グラムの腫瘍あたりに５×１０⁸ ｃｆｕの投与量でそれぞれ各マウスの各腫瘍に注射した。ＰＢＳを注射することによって陰性対照を製造し、且つ一グラムの腫瘍に４×１０⁹ ｃｆｕ注射することによって高投与量のｍｐ１０７群を製造した。細菌腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射後、腫瘍の大きさを、デジタルノギスを用いて約週に二回（０日目から２０日目）測定した。処置群と対照の各々の間の腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）の違いを評価した。

５μｇ／ｍｌのＤＡＰが補充された短寿命細菌ＳＨ３とｍｐ１０７を用いて、医療エフェクターによるインビボでの短寿命細菌の生存時間に対する調節を評価した。

全身投与時の短寿命細菌のインビボ抗腫瘍評価
生後六から八週間の雌Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをマウスＬｅｗｉｓ肺癌細胞系（ＬＬＣ）の腫瘍移植に使用した。特に、癌細胞系の１×１０⁶個の細胞を各マウスの脇腹に皮下注射した。細胞系移植後の７日から１２日目に、腫瘍平均体積が約１００－２００ｍｍ³に達した時、７．５×１０⁹ ｃｆｕ／ｋｇマウスの投与量で各マウスの尾静脈にそれぞれ注射することによって、短寿命細菌ｍｐ１０７を全身注射した。ＰＢＳを注射することによって陰性対照を製造した。細菌静脈内（ｉ．ｖ．）注射後、腫瘍の大きさを、デジタルノギスを用いて約週に二回（０日目から２０日目）測定した。処置群と対照の各々の間の腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）の違いを評価した。

マウスにおける短寿命細菌の体内分布
インビボ抗腫瘍評価の後、マウスを安楽死させた。そして、異なる時点のコロニー形成単位を確定するために、腫瘍組織及び肝心な器官（肝臓、肺、心臓、腎臓と脾臓を含む）からの組織を除去した。約１グラムの各組織に対して、１ｍｌのＰＢＳ緩衝液内で均質化処理を行った。得られた組織懸濁液を連続的に希釈し、５０μｇ／ｍｌＤＡＰが補充されたＬＢ寒天上に広げ、且つそれぞれ３７^oＣで一晩インキュベーションした。希釈された組織懸濁液のコロニー形成単位（ｃｆｕ）をそれぞれカウントし、且つ希釈倍率に基づいて組織における細菌の数を計算した。

フローサイトメトリー
３７．５μｇ／ｍＬＬｉｂｅｒａｓｅＴＭ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））と８，０００Ｕ／ｍＬＤＮａｓｅＩ、牛膵臓（メルクミリポア社（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ））で、腫瘍組織を分解した。細胞懸濁液を２００μＭ細胞濾過網で濾過し、且つＰＢＳで洗浄した。そして、以下の抗体でマーカーに対して細胞を染色し、ＢＢ７００ラット抗マウスＣＤ４クローニングＲＭ４－５（ＲＵＯ）（ＢＤ）、ＭｓＣＤ３ｅＦＩＴＣ１４５－２Ｃ１１（ＢＤ）、ＭｓＣＤ４ＢＶ５１０ＲＭ４－５（ＢＤ）、ＭｓＣＤ８ａＡＰＣ－Ｃｙ７５３－６．７（ＢＤ）及びＢＶ５１０ラット抗マウスＣＤ４５ＲＢ（ＢＤ）。メーカーの説明書に従って、染色された細胞を、フローサイトメーターＬｉｆｅＡｔｔｕｎｅＮｘＴ（ライフテクノロジーズ社（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で分析した。

結果
例３
短寿命細菌の構築
例１に記載の方法に基づいて染色体における遺伝子欠失を含む突然変異株を製造し、且つＳＨ３と命名した。大腸菌株の四つの系統発生グループ（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｇｒｏｕｐ）（Ａ、Ｂ１、Ｂ２とＤ）が存在し、且つ大腸菌の染色体におけるｃｈｕＡとｙｊａＡ遺伝子及びＤＮＡ断片ＴＳＰＥ４．Ｃ２に対してＰＣＲ検出を行うことによって系統発生タイプを確定することができる。使用されたプライマーペアは、ｃｈｕＡ－Ｆ（ＧＡＣＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＴＣＡＧＧＡＴ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）とｃｈｕＡ－Ｒ（ＴＧＣＣＧＣＣＡＧＴＡＣＣＡＡＡＧＡＣＡ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）、ｙｊａＡ－Ｆ（ＴＧＡＡＧＴＧＴＣＡＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）とｙｊａＡ－Ｒ（ＡＴＧＧＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＣＴＣＡＡＣ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）及びＴｓｐＥ４Ｃ２－Ｆ（ＧＡＧＴＡＡＴＧＴＣＧＧＧＧＣＡＴＴＣＡ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）とＴｓｐＥ４Ｃ２－Ｒ（ＣＧＣＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＴＡＴＴＡＣＧ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）である。得られたＰＣＲ産物の大きさは、それぞれ２７９-、２１１-、及び１５２ｂｐである。大腸菌株がｃｈｕＡとｙｊａＡの両方に対していずれも陽性である場合、前記菌株を系統発生Ｂ２グループと確定する。系統発生タイピングは、ＳＨ３が系統発生タイプＢ２大腸菌に属することを示した。大腸菌毒性遺伝子に対するさらなるＰＣＲ検出により、ＳＨ３がポリケチド合成酵素ゲノムアイランド（ｐｋｓアイランド）（前記アイランドは、巨大モジュール化非リボソームペプチドとポリケチド合成酵素をコードする病原性アイランドである）及びｃｈｕＡ、ｙｊａＡ、ｔｓｐＥ４Ｃ２、ｓａｔ、ｓｆａ、ｐａｐＧ、ｆｙｕＡ、ｉｕｔＡ、ｈｌｙＡＣＢＤとｙｆｃＶなどのような他の毒性遺伝子又はオペロンンに対して陽性であることが示された。結果によれば、ＳＨ３は、複数の毒性因子を有するため、非病原性又は無毒株からエンジニアリングされた菌株に比べて、より高い基礎レベルの免疫原性と治療性効能を提供する大腸菌株である。

短寿命細菌のインビトロ細菌増殖アッセイの結果
ここで図１Ａと図１Ｂを参照すると、インビトロ増殖アッセイは、ａｓｄ欠失の突然変異型ＳＨ３が、ＤＡＰを補充しない増殖培地（ＬＢ）で生存できないが（図１Ａ）、増殖培地にＤＡＰが補充された場合、増殖しやすい（２４時間後に約８×１０⁷ ｃｆｕであり、且つ４８時間後に約５×１０⁷ ｃｆｕである）（図１Ｂ）ことを示した。これらの結果により、必須な補充がない場合、必須遺伝子欠失を有する、遺伝子改変された短寿命細菌はインビトロ生存できないことが示された。

短寿命細菌のエクスビボ細菌生存アッセイの結果
ここで図１Ｃを参照すると、ａｓｄ突然変異型ＳＨ３は、エクスビボ研究においても生存不良（２４時間又は４８時間後に増殖しない）が観察され、前記研究において、ａｓｄ突然変異型ＳＨ３を、均質化された混合器官懸濁液内でインキュベーションし、そしてＤＡＰ（５０μｇ／ｍｌ）が補充されたＬＢ寒天上で、コロニー形成単位をカウントすることによって、生存可能な細菌を定量した（図１Ｃ）。結果により、必須な補充がない場合、必須遺伝子欠失を有する、遺伝子改変された短寿命細菌はエクスビボ生存できないことが示された。

短寿命細菌のインビボ細菌生存アッセイの結果
ａｓｄ突然変異型ＳＨ３が短時間インビボ生存できるか否かを確定するために、ａｓｄ突然変異型ＳＨ３（約１×１０⁹ ｃｆｕ）をマウスに皮下注射した。

ここ図１Ｄを参照すると、ＤＡＰが補充されない場合、注射後の２日目に、ＳＨ３の生きている細菌カウントは約１×１０⁹ ｃｆｕから約２．７×１０⁸に下降し、ここで、依然として約２７％のＳＨ３は注射部位に生存していた。５日後に、生きている細菌カウントは大幅に低下し続けた。１１日後に、生きている細菌カウントを検出できず、これにより、必須遺伝子欠失を有する、遺伝子改変された細菌は寿命が短く、且つインビボコピー又はコロニー形成が不可能であることが示された。

短寿命細菌のインビボ細菌生存アッセイの結果
インビボ細菌生存アッセイの結果により、さらに、注射後の２日、５日と１１日目に、細菌懸濁液におけるＤＡＰが補充されたか否かにかかわらず、ＳＨ３は、皮下注射部位のみに存在し且つ最大５日生存できるが、他の全ての試験された器官（肝臓、肺、心臓、腎臓と脾臓を含む）にはいずれも存在しないことが示された。

結果により、短寿命細菌は、皮下注射部位内に局在するため、局所投与時に安全に使用し得ることが示された。

全身投与時の短寿命細菌の安全性をさらに評価するように、短寿命細菌ＳＨ３（約５×１０⁸ ｃｆｕ）を生後六から八週間の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾静脈に注射した。静脈内注射後に、短寿命細菌で処理したマウスは死滅していなかった。それに比べて、用野生型細菌で処理されたマウスの１００％は４８時間内に死滅した。なお、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の６目に検査する時、短寿命細菌で処理されるいずれのマウスのいずれの器官からもＳＨ３を検出しなかった。

注意すべきこととして、全てのこれらのインビボ評価において、ａｓｄ欠失の突然変異型ＳＨ３の突然変異率は０％である。即ち、注射部位から単離されたＳＨ３の細胞の１００％は、生存と増殖のために、そのＤＡＰへの依存性を維持し、これは、遺伝子改変された細菌がそれらの毒性因子を保持していても、前記細菌が、局所投与又は全身投与のいずれにおいても安全に使用できることを示している。

要するに、これらのデータは、局所投与又は全身投与の場合、毒性因子を有する短寿命細菌は、インビボ使用時に、驚くほど安全であることを示した。いかなる理論にも拘束されることなく、細菌が複数の毒性因子を有しても、全身感染又は疾患が発生しないように、短寿命細菌は、被験者又は宿主内で一時的に生存する。そのため、前記細菌は、様々な疾患を処置又は予防するか又はいくつかの病状を改善するためのワクチン又は治療剤を製造するための安全で高効能なベクター又は媒体として使用することができる。例えば、ＳＨ３などの短寿命突然変異型細菌は、活性治療薬を開発するためのプラットフォームとして使用され得る。

短寿命細菌の生存時間の調節
依然として図１Ｄを参照すると、最終濃度が５μｇ／ｍｌである、ＤＡＰが補充された細菌懸濁液を用い、且つインビボ細菌生存アッセイを行った。ＤＡＰが補充された場合、注射後の２日目に、ＳＨ３の生きている細菌カウントは、約１×１０⁹ ｃｆｕから約６．２７×１０⁸ ｃｆｕにのみ低下した。言い換えれば、注射後、ａｓｄ突然変異型ＳＨ３の約６２．７％は、注射部位で２日間生存した（図１Ｄ）。該割合は、ＤＡＰがない場合のＳＨ３の割合よりも遙かに高かった。そのため、結果により、調節エフェクターの補充によって短寿命細菌の生存時間を調節し得ることが示された。有利には、突然変異型短寿命細菌の生存時間は、調節エフェクターによって制御され得る。注射部位ＳＨ３の生存時間が５μｇ／ｍｌＤＡＰの添加で増加したが、注射後２日、５日と１１日に検査する時、ＳＨ３は、いずれのマウスのいずれの肝心な器官にも存在しなかった。

例４
異種毒性因子を発現する短寿命細菌の構築結果
該例示的な実施例において、構成的プロモーターｏｘｂ１８の制御で、細胞毒素、シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）を発現するプラスミドを用いて、例２から得られた短寿命細菌ＳＨ３をさらに形質転換した。ｏｘｂ１８プロモーターと、ｐｅｌＢリーダー配列と、シュードモナス・エルギノーサＰＡ７のｅｘｌＡ遺伝子と、ターミネーター（ｒｒｎＢ転写ターミネーター領域）とを含む配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５に示されるとおりであり、且つ組換えプラスミドｐＥｘｌＡを形成するように、プラスミドｐＢＡＤ－ＤＥＳＴ４９にクローニングされた（図４）。精製され検証された組換え菌株は、ｍｐ１０７と命名された。

細胞毒素を発現する短寿命細菌のインビトロ細胞毒性アッセイの結果
ここで図２Ａを参照すると、ｍｐ１０７の細胞毒性をインビトロ評価した。ＤＡＰ（５μｇ／ｍｌ）を添加した増殖培地で細胞系と細菌を３時間共培養した後に殺滅率を確定した。両者はいずれもＰ＜０．００１（独立ｔ検定）である。データによると、ＬＬＣ細胞に対する短寿命細菌ｍｐ１０７の殺滅率は驚くほど高い（約９２％）が、対照細菌ＭＧ１６５５の殺滅率は約１３％に過ぎなかった（図２Ａ）。データによると、さらに、Ａ５４９細胞に対するｍｐ１０７の殺滅率は驚くほど高い（約９０％）が、対照細菌ＭＧ１６５５の殺滅率は約３０％に過ぎなかった（図２Ｂ）。これらの結果は、ｍｐ１０７がマウス肺癌細胞とヒト肺癌細胞に対して毒性又は致死性を有することを示し、これは、例えば、細胞毒素などの異種毒性因子を発現する短寿命細菌が、例えば、肺癌などの癌を処置するための高効能を有し得ることを示した。

局所投与時の短寿命細菌に対するインビボ抗腫瘍評価の結果
ここで図２Ｂを参照すると、マウスがＬｅｗｉｓ肺癌細胞（ＬＬＣ）から形成された皮下腫瘍を運ぶ同遺伝子マウス癌モデルを構築した。短寿命細菌のインビボ腫瘍内での生存時間を改善するために、マウスにおける腫瘍に投与する前に、ＤＡＰが５μｇ／ｍｌの投与量で補充された細菌懸濁液でインビボ抗腫瘍評価を行った。対照菌株ＭＧ１６５５、短寿命細菌ＳＨ３及びｅｘｌＡのエキソリシンを発現する短寿命細菌ｍｐ１０７の群について、これらの細菌は、腫瘍１グラムあたりに５×１０⁸ ｃｆｕの投与量で注射され、ｍｐ１０７（高投与量）の群について、注射投与量は腫瘍１グラムあたりに４×１０⁹ ｃｆｕである。図２Ｂに示すように、処置期間（３日目から２０日目）にわたって、対照ＭＧ１６５５群とＰＢＳ群（无細菌注射）に比べると、ＳＨ３群の腫瘍増殖は著しく抑制された。基準菌株ＭＧ１６５５（ｐ＝０．０００２）に比べて、短寿命細菌ＳＨ３はより高い腫瘍抑制レベルを示し、毒性因子を有するＳＨ３細菌が対照細菌に比べてより高い抗癌効能を有することを示した。データにより、さらに、処置期間（３日目から２０日目）にわたって、ＳＨ３群に比べると、ｍｐ１０７群の腫瘍増殖が著しく抑制されたことが示されたデータは、自体では、短寿命細菌ＳＨ３に比べて、別の細胞毒素を発現する短寿命細菌ｍｐ１０７による腫瘍増殖への抑制がより有効であり（ｐ＝０．０３）ことを示し、ｅｘｌＡによりコードされた細胞毒素が、短寿命細菌に追加の抗癌能力を付与することを示している。注射投与量が腫瘍１グラムあたりに４×１０⁹ ｃｆｕ（より高い投与量）に増加した時、それに応じてｍｐ１０７の抗癌効能も増加した。細菌を腫瘍内に２０日間注射した後、高投与量のｍｐ１０７の競合応答率は７５％（８匹のマウスのうちの６匹のマウス）に達し、例えば、細胞毒素ＥｘｌＡなどをさらに発現する異種毒性因子の短寿命細菌ＳＨ３（即ちｍｐ１０７の処置群）の抗癌効能における相加効果又は相乗効果を示した。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）の比較は、処置群と対照群の各々の間の著しい違いを示した。

全身投与時の短寿命細菌に対するインビボ抗腫瘍評価の結果
ここで図３Ａを参照すると、短寿命細菌ｍｐ１０７をマウスの尾静脈に静脈内注射（７．５×１０⁹ ｃｆｕ／ｋｇマウス）した。処置期間（２日目から３０日目）にわたって、ＰＢＳ対照群の腫瘍増殖に比べて、静脈内注射された短寿命細菌は、腫瘍増殖を著しく抑制した。ｍｐ１０７処置されたマウスの４４．４％（９匹のマウスのうちの４匹のマウス）は、第３０日目の腫瘍が治癒され、これは、７．５×１０⁹ ｃｆｕ／ｋｇマウスの単回投与量で全身投与された時、これらの短寿命細菌が癌を効果的に処置し得ることを示した。

マウスにおける短寿命細菌の体内分布結果
実験終了時、細菌により処理されたマウスの細菌体内分布を分析した。腫瘍又はいずれの肝心な器官（肝臓、肺、心臓、腎臓と脾臓を含む）からいずれも短寿命細菌ｍｐ１０７を検出していなかったことは、これらの短寿命細菌が腫瘍組織又は被験者にコロニー形成しないことを示した。腫瘍が細菌を含まないため、データは、これらの短寿命細菌を静脈内注射した後に観察された腫瘍抑制が、例えば、免疫メカニズムなどの間接的なメカニズムによるものであることを示した。

フローサイトメトリーの結果
現在図３Ｂと図３Ｃを参照すると、フローサイトメトリーによって腫瘍内リンパ球を分析した。データは、短寿命細菌ｍｐ１０７で処理されたマウスの腫瘍におけるＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞が、対照細菌ＭＧ１６５５で処理されたマウスの細胞に比べて、それぞれ１９倍と１２倍増加したことを示し、これは、これらの短寿命細菌が、処理されたマウスにおいてＴ細胞応答を誘発することを示した。これらのデータにより、異種タンパク質ＥｘｌＡを発現する短寿命細菌ｍｐ１０７は、抗癌免疫を誘発することによって、腫瘍増殖を抑制することが示された。

これらのデータにより、いくつかの抗原を発現する短寿命細菌は、例えば、癌などの疾患の進行に対するワクチンとしても使用できることが示された。

例５
材料と方法
（３）短寿命細菌を構築する方法
毒性遺伝子の欠失又は突然変異
短寿命細菌の使用上の安全性をさらに改善するために、短寿命細菌の毒性は、さらなる遺伝子改変によってさらに弱められ得る。該例示的な実施例において、細菌（大腸菌）菌株ＳＨ３のα溶血素をコードするｈｌｙＣＡＢＤオペロンを欠失又は突然変異させて、新規細菌株ＳＨ４を生成した。

該例示的な実施例において、ラムダ（λ）－Ｒｅｄ組換えシステムを使用して、ｈｌｙＣＡＢＤオペロンを大腸菌株ＳＨ３の細菌染色体から欠失させた。二つのプライマーは欠失の産生に用いられ、
Ｍ－ｈｌｙ－Ｆ（順方向）：

Ｍ－ｈｌｙ－Ｒ（逆方向）：

Ｍ－ｈｌｙ－ＦとＭ－ｈｌｙ－Ｒプライマーを用いて、ＰＣＲによってクロラムフェニコール耐性カセットを増殖した。クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）をテンプレートとして使用し、ＰＣＲによって、ｌｏｘＰ－ｃａｔ－ｌｏｘＰクロラムフェニコール耐性カセットを含むＤＮＡ断片を増殖し、前記クロラムフェニコール耐性カセットは、ｈｌｙＣＡＢＤオペロンに直接隣接する領域と相同性（４５ｎｔ）を有する。プライマーＭ－ｈｌｙ－ＦとＭ－ｈｌｙ－Ｒを該ＰＣＲに使用した。プラスミドｐＳｉｍ６を用いて細菌株ＳＨ３を形質転換し、前記プラスミド上においてλ組換えタンパク質の発現を４２℃で誘導した。エレクトロポレーションによって、ｐＳｉｍ６を運ぶＳＨ３に上記ＰＣＲ断片を導入した。λ－ｒｅｄを誘導した後、クロラムフェニコール耐性に対して組換え体を選択し、且つコロニーＰＣＲによって前記組換え体を検証した。そして、メーカーの説明書（ジーンブリッジ社（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）、ドイツ）に従って、７０５Ｃｒｅ方法でクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。つまり、形質転換体におけるプラスミドからのＣｒｅリコンビナーゼの発現を３７℃で誘導し、そしていずれの抗生物質もないＬＢ寒天上に細菌を広げた。３７℃で一晩培養した後、ＬＢ寒天とクロラムフェニコールが補充されたＬＢ寒天の両方で、単一のコロニーを線引きした。ＬＢ寒天上で増殖するが、クロラムフェニコールを有するＬＢ寒天上で増殖しない単一のコロニーを選択した。ｈｌｙＣＡＢＤオペロン欠失とａｓｄ遺伝子欠失の両方を有するが、ｌｏｘｐ－ｃａｔ－ｌｏｘｐカセットを有する該突然変異株は、ＳＨ４と命名された。細菌株ＳＨ４は、２０２１年５月１８日に、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が２２５５７である。

例６
（４）短寿命細菌を医療エフェクターのベクターとして使用する
遺伝子クローニングによって細胞毒素と溶血素ＩＩＩの一部の断片を発現する短寿命細菌を構築する
シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡをコードするｅｘｌＡ遺伝子（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）及び溶血素ＩＩＩをコードするｈｌｙＩＩＩ遺伝子の一部のＤＮＡ断片（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）を合成し、且つメーカーの説明書に従ってＣｌｏｎｅＥＺシームレスクローニング技術（ジェンスクリプト社）を利用して、組換えプラスミドｐＥｘｌＡ２を形成するように、それをｐＢＡＤ－ＤＥＳＴ４９プラスミド（米国インビトロジェン社、カタログ番号１２２８３－０１６）にクローニングした（図５）。配列決定分析によって組換えプラスミドｐＥｘｌＡ２を検証した。その後に、エレクトロポレーションによって組換えプラスミドｐＥｘｌＡ２を細菌株ＳＨ４とＳＨ３にそれぞれ導入し、且つコロニーＰＣＲによって検証した。形質転換を確認した後、各細菌株に対して単一のコロニーを選択した。組換えプラスミドｐＥｘｌＡ２形質転換で得られた突然変異株ＳＨ４とＳＨ３は、それぞれｍｐ１０５とｍｐ１０６命名された。菌株ｍｐ１０５は、２０２１年５月１８日に、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が２２５５５である。菌株ｍｐ１０６は、２０２１年５月１８日に、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、寄託番号が２２５５６である。

例７
溶血アッセイ
エレクトロポレーションによって組換えプラスミドｐＥｘｌＡ２を対照細菌株ＭＧ１６５５に導入し、且つコロニーＰＣＲによって検証した。形質転換を確認した後、単一のコロニーを選択した。プラスミドｐＥｘｌＡ２形質転換で得られたＭＧ１６５５は、ＭＧ１６５５／ｐＥｘｌＡ２と命名された。

細菌株ＳＨ３、ＳＨ４、対照細菌株ＭＧ１６５５及びＭＧ１６５５／ｐＥｘｌＡ２の一晩培養物を、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ、５０μｇ／ｍｌ）と１０％（ｖ／ｖ）ウサギ血が補充されたＬＢ寒天上にそれぞれ滴下し、そして３７^oＣで８時間から１０時間インキュベーションした。終点では、対応細菌株の溶血能力を観察した。寒天の清澄化が観察されたことにより、赤血球の破裂による溶血が示された。

例８
短寿命細菌注射後の安全性と抗癌効能に対するインビボ評価
生後六から八週間の雌Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをマウスＬｅｗｉｓ肺癌細胞系（ＬＬＣ）の腫瘍移植に使用した。具体的には、ＬＬＣ細胞系の１×１０⁶個の細胞を各マウスの脇腹に皮下注射した。細胞系移植後の７日目から１２日目に、腫瘍平均体積が約５０－２００ｍｍ³に達した時、細菌株（ｍｐ１０５、ｍｐ１０６及び／又はｍｐ１０７）を各マウスの尾静脈にそれぞれ静脈内注射（ｉｖ）するか、又は各マウスに対して静脈内注射と腫瘍内注射との組み合わせ（ｉｖ＋ｉｔ）を行った。陰性対照として、同様な方式でＰＢＳ緩衝液を注射した。細菌注射後の４日目、６日目、８日目と１１日目に体重を測定した。細菌注射後に、デジタルノギスを用いて腫瘍の大きさを週に２～３回測定した。

例９
属種同定
同定対象の細菌を組織から単離し、且つ継代培養によって精製した。そして、メーカーの説明書に従って、天根（Ｔｉａｎｇｅｎ）ゲノムＤＮＡキット（天根生物化学科技（北京）株式会社（ＴｉａｎｇｅｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｉｊｉｎｇ））を用いて、各細菌株からゲノムＤＮＡを単離し、且つ１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配列分析によって種属同定を確定した。具体的には、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、プライマー２７Ｆと１４９２ＲでＰＣＲ増殖を実行した。そしてＰＣＲ産物に対して配列決定を行い、且つＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＬＡＳＴアラインメント（ｂｌａｓｔｅｄ）を行った。
２７Ｆ（順方向）：

１４９２Ｒ（逆方向）：

例１０
治療ワクチンと予防ワクチンとしての短寿命細菌に対する評価
該例では、細菌感染が存在する雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いて、細菌感染の軽減におけるｍｐ１０５の能力を証明且つ評価した。種属同定を行うように、例９に記載の方法に基づいて、マウスの器官（肝臓と肺とを含む）から単離した細菌を分析した。１６ＳｒＤＮＡ配列決定は、マウスがネズミチフス菌に自然に感染したことを示した。ｍｐ１０５が従来のネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）感染を処置し、及び／又はその後の細菌感染を予防することができるか否かを調べるために、マウスにｍｐ１０５（１×１０⁸ ｃｆｕ／マウス）又はＰＢＳを、１４日の間隔で、二回皮下注射した。注射後の１４日目に、２×１０⁷ ｃｆｕ／マウスの投与量で、病原性大腸菌株ＣＦＴ０７３でマウスをチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）して、追加の感染を確立した。チャレンジ後の５日目に、マウスを安楽死させ、且つコロニー形成単位（ＣＦＵ）に対するプレートカウントとコロニーに対するＰＣＲ検証によって、例えば、肝臓、肺、心臓、腎臓と脾臓などの肝心な器官の細菌感染状況を分析した。ネズミチフス菌がｈｌｙＣＡＢＤオペロンに対して陰性であるが、ＣＦＴ０７３がオペロンを運ぶため、ＰＣＲを用いて二つのタイプの細菌を区別してもよい。ＰＣＲに用いられるプライマーは、ｈｌｙ－Ｆとｈｌｙ－Ｒである。
ｈｌｙ－Ｆ（順方向）：

ｈｌｙ－Ｒ（逆方向）：

結果
例１１
弱毒化された短寿命細菌の構築結果
例５に記載の方法に基づいて、ｈｌｙＣＡＢＤオペロンのＳＨ３の染色体における遺伝子欠失を有する突然変異株を製造し、且つＳＨ４と命名した。α溶血素をコードするｈｌｙＣＡＢＤオペロンの欠失は、例えば、癌療法と微生物感染のためのワクチンなどの複数の用途のための短寿命細菌の例としてのＳＨ４の使用の安全性を改善し得る。

例１２
細胞毒素を発現する、弱毒化された短寿命細菌の構築結果
例６に記載の方法に基づいて、例５から得られた短寿命細菌ＳＨ４と、例２から得られたＳＨ３を細胞毒素、シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）及び溶血素ＩＩＩをコードするｈｌｙＩＩＩ遺伝子の一部のＤＮＡ断片（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）を発現するプラスミドを用いて、それぞれさらに形質転換した。ｏｘｂ１８プロモーターと、ｐｅｌＢリーダー配列と、シュードモナス・エルギノーサＰＡ７のｅｘｌＡ遺伝子と、溶血素ＩＩＩコード遺伝子の一部のＤＮＡ断片と、ターミネーター（ｒｒｎＢ転写ターミネーター領域）とを含む配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０に示されるとおりであり、且つ組換えプラスミドｐＥｘｌＡ２を形成するように、プラスミドｐＢＡＤ－ＤＥＳＴ４９にクローニングされた。組換えプラスミドｐＥｘｌＡ２形質転換から得られた突然変異株ＳＨ４とＳＨ３は、それぞれｍｐ１０５とｍｐ１０６に命名された。

例１３
溶血アッセイの結果
ここで図６Ａを参照すると、その結果、α溶血素をコードするｈｌｙＣＡＢＤオペロンがＳＨ３ゲノムから欠失した後、ＳＨ４が溶血を起こす能力を失っていることが示され、これは、ＳＨ４がα溶血素を産生する能力を失っていることを示した。これに対して、ＳＨ３は、依然として溶血を引き起こす能力を維持している。

ここで図６Ｂを参照すると、溶血アッセイ結果により、ＭＧ１６５５とＭＧ１６５５／ｐＥｘｌＡ２の両方はいずれも溶血を引き起こしていないことが示された。結果により、溶血素ＩＩＩコード遺伝子の一部のＤＮＡ断片が存在するが、プラスミドから溶血素ＩＩＩが産生されないことが明らかになった。驚くべきこととして、腫瘍療法に対するインビボ評価の結果（以下の例１５に詳細を示す）は、該断片の発現が抗癌効能を増強したことを示した。

以上のように、ｍｐ１０５が、ｐＥｘｌＡ２で形質転換されたＳＨ４から得られたものであり、例示的な短寿命細菌ｍｐ１０５も溶血素産生能力を欠いているため、該短寿命細菌は、癌療法などの複数の用途で被験者体内に使用される場合により安全であると推測される。

例１４
短寿命細菌注射後の安全性と抗癌効能に対するインビボ評価の結果
ここで図７を参照すると、マウスがＬｅｗｉｓ肺癌細胞（ＬＬＣ）から形成された皮下腫瘍を運ぶ同遺伝子マウス癌モデルを確立した。例８に記載の方法に基づいて、それぞれ細菌ｍｐ１０５、ｍｐ１０６及びｍｐ１０７で処理された各マウスの体重減少率変化を示した。各細菌株を２×１０⁸ ｃｆｕ／マウスの投与量で静脈内注射した。一般的には、細菌で処理された全てのマウスは、静脈内注射後にいずれも体重がある程度軽減するが、ｍｐ１０５で処理されたマウス体重は、ｍｐ１０６又はｍｐ１０７で処理されたマウスより有意に体重減少が少なかった。特に、ｍｐ１０５で処理されたマウスとｍｐ１０６で処理されたマウスとの間で、４日目と８日目の体重減少の差は統計的有意性に達した（独立ｔ検定、Ｐ＜０．０５）。これらの結果により、さらに、少なくともｈｌｙＣＡＢＤオペロンが欠失したため、ｍｐ１０６又はｍｐ１０７に比べて、例示的な短寿命細菌ｍｐ１０５は、より良好な抗癌効能を有し、且つ被験者体内でインビボ使用される時により安全であることが明らかになった。

例１５
短寿命細菌により媒介された腫瘍療法に対するインビボ評価の結果
ここで図８を参照すると、例８に記載の方法に基づいて、ｍｐ１０５、ｍｐ１０６及びｍｐ１０７の抗癌効能を比較した。インビボ数据は、ｍｐ１０６の腫瘍体積の増加が、特に処置後２１日目に、ｍｐ１０７の腫瘍体積の増加よりも著しく遅いことを示し、これは、ｍｐ１０７に比べて、ｍｐ１０６が抗癌効能において適度な改善を示すことを示した。これらの結果は、に比べて、ｐＥｘｌＡ２が、ｐＥｘｌＡよりも優れた抗癌能力を細菌に付与することを示した。驚くべきこととして、ｍｐ１０５は、腫瘍増殖の抑制において、ｍｐ１０６（ｐ＝０．０４）とｍｐ１０７（ｐ＝０．０３１）の両方よりも著しく優れていた。実験の終了時に、ｍｐ１０５で処理されたマウスの腫瘍の３７．５％は治癒された。ｍｐ１０６で処理された群とｍｐ１０７で処理された群の治癒率は、それぞれ１２．５％と１１．１％であり、ｍｐ-１０５で処理されたマウスの治癒率よりも低かった。これらの結果は、ｍｐ１０６とｍｐ１０７に比べて、例示的な短寿命細菌ｍｐ１０５が、より安全であるだけでなく、癌に対してより有効であることをまとめて示した。

例１６
異なる経路で投与された短寿命細菌により媒介された抗癌効能のインビボ評価の結果
ここで図９を参照すると、例８に記載の方法に基づいて、ｍｐ１０５の異なる投与経路を比較した。癌療法におけるｍｐ１０５の腫瘍内注射と静脈内注射との組み合わせを単独の静脈内注射と比較した。腫瘍内注射と静脈内注射の投与量は、それぞれ７．５×１０⁷ ｃｆｕ／マウスと３×１０⁷ ｃｆｕ／マウスである。図９は、ｍｐ１０５の静脈内注射（ｉｖ）のみが行われたマウスに比べて、皮下ＬＬＣ腫瘍を運び且つｍｐ１０５の静脈内注射と腫瘍内注射との組み合わせ（ｉｖ＋ｉｔ）を行ったマウスにおいて、処置後の１２日目に腫瘍体積が驚くほど減少したことを示した。結果により、単独の静脈内注射に比べて、二つの投与経路（即ち静脈内注射と腫瘍内注射）の組み合わせが、例示的な短寿命細菌ｍｐ１０５の抗癌効能を著しく改善したことを示した。これは、臨床用途のために、例示的な短寿命細菌ｍｐ１０５を、原発性癌病巣に直接注射し、且つそれと同時に、静脈内注射を行って転移病巣を制御することが可能であることを示した。

例１７
治療ワクチンと予防ワクチンとしての短寿命細菌に対する評価の結果
ここで図１０Ａと図１０Ｂを参照すると、微生物感染に対するワクチンとしての例示的な短寿命細菌ｍｐ１０５の能力を評価した。ｍｐ１０５は、複数の毒性因子と抗原を有するＢ２型大腸菌の遺伝子操作によって改造された短寿命細菌であり、先行例において高い免疫原性を示した。これは、ｅｘｌＡの異種発現、及びｈｌｙＣＡＢＤ欠失によるさらなる弱毒化と共に、ｍｐ１０５を被験者体内で安全な生ワクチンとして使用することを可能にした。図１０Ａと図１０Ｂにおける結果は、ｍｐ１０５の二回の皮下注射が、試験された器官（肝臓と肺とを含む）におけるネズミチフス菌を著しく減少させたことを示した。ＰＢＳに比べて、ｍｐ１０５は、ネズミチフス菌の肝臓における数を７３．６％減少させ（図１０Ａ）、且つ肺における数を６４．６％減少させた（図１０Ｂ）。これは、例示的な短寿命細菌ｍｐ１０５が、従来の細菌感染に対する有効な治療ワクチンとして効果を果たすことを示した。なお、ＰＢＳで処理されたマウスの肝臓（１００ＣＦＵ／１０ｍｇの肝臓組織）、ＰＢＳで処理されたマウス心臓（３ＣＦＵ／１０ｍｇの心臓組織）、及びＰＢＳで処理されたマウスの肺（１５ＣＦＵ／１０ｍｇの肝臓組織）からＣＦＴ０７３を検出した。換言すれば、ＰＢＳで処理されたマウスの５０％は、ＣＦＴ０７３に感染された。逆に、ｍｐ１０５で処理された群におけるいずれのマウスからもＣＦＴ０７３を検出していなかった（カイ二乗検定、Ｐ＝０．０４６）。これは、例示的な短寿命細菌ｍｐ１０５が、潜在的な細菌感染に対する予防ワクチンとして効果を果たし得ることを示した。

本開示の内容の例示的な実施例は、これにより完全に説明された。記述が特定の実施例を参照したが、本発明はこれらの具体的な詳細の変形によって実施され得ることが当業者には明らかであろう。そのため、本開示の内容は、本明細書に記載される実施例に限定されるものとして解釈されるべきではない。

例えば、明らかに、被験者の疾患又は病状の処置に用いられ得る医療エフェクターは、選択された細菌株の内在性エフェクターであってもよい。これらの医療エフェクターは、遺伝子改変の特定の設計に応じて過剰発現又は抑制され得る。他の菌株又は供給源から派生した医療エフェクターの異種発現も使用され得る。

例えば、必須遺伝子であるアスパラギン酸－セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）の染色体における遺伝子欠失は以上に記載のとおりであるが、他の必須遺伝子又は栄養要求性遺伝子も欠失又は突然変異して短寿命細菌を産生することができる。これらの必須遺伝子は、ａｓｄ、ｃｓｒＡ、ｔｈｙＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｒｉｂＦ、ｉｓｐＨ、ｆｏｌＡ、ｆｔｓＬ、ｍｕｒＥ、ｍｒａＹ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｈｅｍｌ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ及びｔｓｆであってもよいが、これらに限定されない。関連する遺伝子に応じて適切なプライマー配列を設計することができる。

例えば、上述した染色体における遺伝子欠失は、ラムダ（λ）－Ｒｅｄ組換えシステムによって達成されたが、また制限エンドヌクレアーゼクローニングなどの当分野で既知の他の遺伝子改変技術を用いてもよい。

例えば、以上で使用される細菌株は大腸菌株であるが、グラム陽性菌及びグラム陰性菌を含む他の細菌株も使用可能である。例は、バチルス属、エシェリキア属、サルモネラ、シゲラ属、リステリア属を含むが、これらに限定されない。また、例えば、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、ラクトバチルス属及びラクトコッカス属などの他の細菌を用いてもよい。

例えば、上記のような遺伝子改変は遺伝子欠失であるが、例えば、遺伝子突然変異などの他の遺伝子改変を用いてもよい。二つ以上の遺伝子改変を導入して短寿命細菌を産生することができる。

例えば、上記調節エフェクターはＤＡＰである。しかしながら、用いた関連遺伝子改変に応じて、他の調節エフェクターを用いてもよい。いくつかの実施例において、調節エフェクターは、非毒性であり、且つ被験者において安全に使用され得る。

例えば、細胞毒素ＥｘｌＡの発現の例示的な実施例は、上記に記載されているが、治療効果を有する他のタンパク質又は細胞毒素を異種発現する短寿命細菌の他の構築を用いてもよい。他のタンパク質は、抗癌エフェクター又は癌療法に用いられ得る組み合わせであってもよい。例示的な抗癌エフェクターは、シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）、セレウス菌の非溶血性エンテロトキシン（Ｎｈｅ）、溶血素及びヘリコバクター・ピロリの空胞化毒素からなる群から選択された一つ又は複数の遺伝子の発現であってもよいが、これらに限定されない。

例えば、シュードモナス・エルギノーサからのＥｘｌＡの大腸菌における異種発現の例示的な実施例は、上記に記載されているが、他の医療エフェクターの一つ又は複数の相同遺伝子又は異種遺伝子の発現を用いてもよい。

例えば、構成的プロモーターｏｘｂ１８は、上記に記載されているが、医療エフェクターの発現は、他の構成的プロモーター又は誘導性プロモーターによって駆動されてもよい。例示的な誘導性プロモーターは、低酸素又は低グルコース条件などの腫瘍特異的微小環境に応じて誘導することができる。

例えば、他の適切なリーダー配列とターミネーター領域又は他の配列又はモチーフを医療エフェクター遺伝子配列に導入して、細菌におけるタンパク質の発現を改善することができる。

例えば、上記の遺伝子ｅｘｌＡは、プラスミドｐＢＡＤ中で発現されるが、他の適切なプラスミドを用いてもよく、且つ遺伝子を、プラスミド中ではなく、染色体に組み込んで発現してもよい。医療エフェクター遺伝子は、プラスミド中で発現され得るが、前記遺伝子が細菌染色体に挿入すれば、前記医療エフェクター遺伝子は染色体発現を行うこともできる。

例えば、上記例示的な実施例におけるＳＨ３、ＳＨ４、ｍｐ１０７、ｍｐ１０５及びｍｐ１０６などのような短寿命細菌は、被験者の疾患又は病状の処置に用いられてもよい。しかしながら、短寿命細菌は、癌又は感染症を予防するためのワクチンとしても、又は診断用としても使用され得る。

例えば、癌を処置するための短寿命細菌の遺伝子発現は、他の医療エフェクター又はＣｐＧ、環状ジヌクレオチド、抗原などのような抗癌因子、又はセレウス菌の非溶血性エンテロトキシン（Ｎｈｅ）、溶血素、及びヘリコバクター・ピロリの空胞化毒素などのような他の細胞毒素、又はこれらの抗癌因子の組み合わせであってもよい。

Claims

遺伝子操作された、生きている細菌であって、
少なくとも一つの医療エフェクターをコードする少なくとも一つのエフェクター遺伝子と、
前記細菌の寿命を短縮することによって、前記生きている細菌が、被験者に投与された後、前記医療エフェクターが少なくとも一つの医療的効果を果たすことを可能にするのに十分な時間内に生存しており、且つ前記被験者への発症メカニズムを最小化する時間の後に死滅するようにする少なくとも一つの遺伝子改変とを含み、
ここで、前記細菌は毒性株から派生したものである、遺伝子操作された、生きている細菌。
前記医療エフェクターは、前記被験者において、対象疾患又は病状を処置するのに十分な少なくとも一つの免疫応答を誘発し得る抗原である、請求項１に記載の細菌。
前記医療エフェクターは、対象疾患又は病状を処置するのに十分な程度に、前記被験者において、少なくとも一つの免疫応答を誘発し、及び／又は標的病巣の大きさを減少させ得る治療因子である、請求項１に記載の細菌。
前記免疫応答は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞により誘発される、請求項２又は３に記載の細菌。
前記医療エフェクターは、抗原、又は前記細菌の相同遺伝子から発現された治療因子である、請求項１に記載の細菌。
前記医療エフェクターは、抗原、又は異種遺伝子から発現された治療因子である、請求項１に記載の細菌。
前記異種遺伝子は、前記細菌における異種発現を改善するリーダー配列及び／又はターミネーター領域をさらに含む、請求項６に記載の細菌。
前記治療因子は、前記標的病巣において細胞溶解を引き起こす細胞毒素である、請求項３又は６に記載の細菌。
前記対象疾患又は病状は、癌又は腫瘍であり、且つここで、前記医療エフェクターは、前記被験者において腫瘍抑制を引き起こす、請求項２又は３に記載の細菌。
前記細菌は、前記被験者内でコピー又はコロニー形成することができない、請求項１に記載の細菌。
前記遺伝子改変は、少なくとも一つの必須遺伝子又は栄養要求性遺伝子の、前記細菌の染色体からの欠失又は突然変異である、請求項１に記載の細菌。
前記細菌は、ジアミノピメリン酸における栄養要求体である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細菌。
前記遺伝子改変は、アスパラギン酸－セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）の、前記細菌の染色体からの欠失である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、一つ又は複数の調節エフェクターへの前記細菌の曝露によって制御し得る生存時間を有し、前記調節エフェクターは、インビボ投与時に前記細菌の前記生存時間を調節する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細菌。
前記調節エフェクターは、ジアミノピメリン酸である、請求項１４に記載の細菌。
前記医療エフェクターは、ｃｈｕＡ、ｙｊａＡ、ｔｓｐＥ４Ｃ２、ｓａｔ、ｓｆａ、ｐａｐＧ、ｆｙｕＡ、ｉｕｔＡ、ｈｌｙＡＣＢＤ、ｙｆｃＶ及びｐｋｓアイランドからなる群から選択される遺伝子により発現される相同ペプチドである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の細菌。
前記医療エフェクターは、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）の非溶血性エンテロトキシン（Ｎｈｅ）、溶血素、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）の空胞化毒素、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞毒素である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細菌。
前記医療エフェクターは、ＣｐＧ、環状ジヌクレオチド及び腫瘍抗原からなる群から選択される抗癌因子である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）又はラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）から派生したものである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）から派生したものである、請求項１から１９のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３６の菌株ＳＨ３から派生したものである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する配列を発現する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３５の菌株ｍｐ１０７から派生したものである、請求項１から２２のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、静脈内投与用に配合される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の細菌。
静脈内投与時、発症メカニズムを最小化するのに十分な時間は２日未満、５日未満又は１１日未満である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、局所投与用に配合される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の細菌。
注射部位で局所投与される場合、前記細菌は、前記注射部位で最大５日間生存するが、前記注射部位以外では４８時間以内に死滅する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、７．５×１０⁹ ｃｆｕ／ｋｇマウスの当量投与量で投与される、請求項２４に記載の細菌。
前記疾患は、癌又は腫瘍であり、且つ前記細菌は、腫瘍内投与される、請求項１から２８のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、腫瘍１グラムあたりに少なくとも５×１０⁸ ｃｆｕの当量投与量で約１００－２００ｍｍ³投与される、請求項２９に記載の細菌。
前記少なくとも一つのエフェクター遺伝子は、細胞毒素遺伝子と、溶血素ＩＩＩコード遺伝子の一部のＤＮＡ断片とを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の細菌。
前記細胞毒素は、シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）である、請求項３１に記載の細菌。
前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５６の菌株ｍｐ１０６から派生したものである、請求項３１又は３２に記載の細菌。
前記細菌の毒性を弱める少なくとも一つの毒性遺伝子改変をさらに含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の細菌。
前記少なくとも一つの毒性遺伝子改変は、少なくとも一つの毒性遺伝子の、前記細菌の染色体からの欠失又は突然変異である、請求項３４に記載の細菌。
前記毒性遺伝子改変は、ｈｌｙＣＡＢＤオペロンの、前記細菌の染色体からの欠失である、請求項３４又は３５に記載の細菌。
前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５７の菌株ＳＨ４から派生したものである、請求項３６に記載の細菌。
前記細菌は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する配列を発現する、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する第１の配列を発現し、及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：４２の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する第２の配列を発現する、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５５の菌株ｍｐ１０５から派生したものである、請求項３８又は３９に記載の細菌。
前記細菌は、２×１０⁸ ｃｆｕ／マウスの当量投与量で投与される、請求項３１から４０のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、静脈内注射と腫瘍内注射との組み合わせで投与するように配合される、請求項３４から４０のいずれか一項に記載の細菌。
前記腫瘍内注射は、７．５×１０⁷ ｃｆｕ／マウスの当量投与量を有し、且つ前記静脈内注射は、３×１０⁷ ｃｆｕ／マウスの当量投与量を有する、請求項４２に記載の細菌。
大腸菌属種の生きている細菌であって、
アスパラギン酸－セミアルデヒド脱水素酵素（ａｓｄ）の、前記細菌の染色体における遺伝子欠失を含み、
ここで、前記細菌は毒性株から派生したものである、大腸菌属種の生きている細菌。
前記細菌は、医療エフェクターをコードする少なくとも一つのエフェクター遺伝子を発現する、請求項４４に記載の細菌。
前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３６の菌株ＳＨ３から派生したものである、請求項４４に記載の細菌。
前記細菌は、シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）をコードする遺伝子をさらに含む、請求項４４に記載の細菌。
前記遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する、請求項４７に記載の細菌。
前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号１９８３５の菌株ｍｐ１０７から派生したものである、請求項４４に記載の細菌。
前記少なくとも一つエフェクター遺伝子は、細胞毒素遺伝子と、溶血素ＩＩＩコード遺伝子の一部のＤＮＡ断片とを含む、請求項４４に記載の細菌。
前記細胞毒素は、シュードモナス・エルギノーサのエキソリシンＡ（ＥｘｌＡ）である、請求項５０に記載の細菌。
前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５６の菌株ｍｐ１０６から派生したものである、請求項５０又は５１に記載の細菌。
前記細菌の毒性を弱める少なくとも一つの毒性遺伝子改変をさらに含む、請求項４４から５２のいずれか一項に記載の細菌。
前記少なくとも一つの毒性遺伝子改変は、少なくとも一つの毒性遺伝子の、前記細菌の染色体からの欠失又は突然変異である、請求項５３に記載の細菌。
前記毒性遺伝子改変は、ｈｌｙＣＡＢＤオペロンの、前記細菌の染色体からの欠失である、請求項５３又は５４に記載の細菌。
前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５７の菌株ＳＨ４から派生したものである、請求項５５に記載の細菌。
前記細菌は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４０の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する配列を発現する、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する第１の配列を発現し、及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：４２の全て又は断片と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性を有する第２の配列を発現する、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、中国普通微生物菌種保蔵管理センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された寄託番号２２５５５の菌株ｍｐ１０５から派生したものである、請求項５７又は５８に記載の細菌。
前記細菌は、２×１０⁸ ｃｆｕ／マウスの当量投与量で投与される、請求項５０から５９のいずれか一項に記載の細菌。
前記細菌は、静脈内注射と腫瘍内注射との組み合わせで投与するように配合される、請求項５３から５９のいずれか一項に記載の細菌。
前記腫瘍内注射は、７．５×１０⁷ ｃｆｕ／マウスの当量投与量を有し、且つ前記静脈内注射は、３×１０⁷ ｃｆｕ／マウスの当量投与量を有する、請求項６１に記載の細菌。
請求項１から６２のいずれか一項に記載の細菌を含む、免疫原性組成物。
請求項１から６２のいずれか一項に記載の細菌と、任意選択的にアジュバントとを含む、生きている細菌ワクチン。
有効量の請求項１から６２のいずれか一項に記載の細菌を含む組成物を被験者に投与することを含む、疾患又は病状を処置する方法。
前記疾患は、腫瘍又は癌である、請求項６５に記載の方法。
遺伝子操作された、生きている細菌を構築する方法であって、
細菌を、前記細菌の寿命を短くするように遺伝子操作することによって、前記細菌が、被験者に投与された後、医療エフェクターが少なくとも一つの医療的効果を果たすことを可能にするのに十分な時間内に生存しており、且つ前記被験者への発症メカニズムを最小化するのに十分な時間内で死滅するようにするステップを含み、ここで、前記細菌は毒性株から派生したものである、方法。
少なくとも一つの医療エフェクターを発現するように、前記細菌を遺伝子操作するステップをさらに含む、請求項６７に記載の方法。