CN115916959A

CN115916959A - 基因工程活细菌及其构建方法

Info

Publication number: CN115916959A
Application number: CN202180048666.2A
Authority: CN
Inventors: 金叶
Original assignee: Xinshi Co ltd
Current assignee: Xinshi Co ltd
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2023-04-04
Also published as: WO2022007741A1; EP4179068A1; JP2023533000A; AU2021304144A1; US20230321211A1; WO2022006748A1

Abstract

本发明涉及一种基因工程活细菌，所述基因工程活细菌包含编码医疗效应子的至少一种效应子基因以及缩短所述细菌的寿命的至少一种基因修饰。在施用于受试者之后，所述细菌在足以允许所述医疗效应子发挥至少一种医疗作用的时间内存活并且在足以使对所述受试者的发病机理最小化的时间内死亡。所述细菌提供对疾病的有效治疗或改善病症，同时确保医疗用途的生物安全性。

Description

基因工程活细菌及其构建方法

序列表的引用

本申请含有计算机可读形式的序列表，所述序列表通过援引以其全文并入本文。

技术领域

本发明涉及基因工程活细菌及其构建方法。尤其地，本发明涉及提供可以有效治疗和/或预防疾病或病症的基因工程活细菌。

背景技术

天然存在或人工修饰的细菌已经被用作疫苗或药物来针对比如传染病和最近的癌症等多种疾病。除了功效之外，在将细菌用于医疗目的方面，最重要的问题是安全性。为此，已经做出许多努力以杀灭目标细菌，或对细菌进行基因修饰以使它们获得在病灶中优先地或选择性地生长的能力。

非常需要一种用于有效治疗疾病或改善病症，同时确保生物安全性的新型细菌。

发明内容

鉴于前述背景，在某些示例实施例中，目的为提供一种可替代的细菌以克服现有技术的缺点中的至少一个缺点。

在一方面，提供了一种基因工程活细菌，所述基因工程活细菌包含编码医疗效应子的至少一种效应子基因；以及至少一种基因修饰，所述至少一种基因修饰缩短细菌的寿命，使得所述细菌在施用于受试者之后，在足以允许医疗效应子发挥至少一种医疗作用的时间内存活并且在足以使对受试者的发病机理最小化的时间内死亡。在一些实施例中，细菌衍生自毒性菌株。

在一些示例实施例中，医疗效应子为抗原，所述抗原可以引发对受试者的至少一种足以治疗目标疾病或病症的免疫应答。

在一些示例实施例中，医疗效应子为治疗因子，所述治疗因子可以在足以治疗目标疾病或病症的程度上，在受试者中引发至少一种免疫应答和/或减小靶病灶的大小。

在一些示例实施例中，免疫应答由CD4+和/或CD8+T细胞引发。

在一些示例实施例中，医疗效应子为抗原或从细菌的同源基因表达的治疗因子。

在一些示例实施例中，医疗效应子为抗原或从异源基因表达的治疗因子。

在一些示例实施例中，异源基因进一步包含在细菌中改善异源表达的前导序列和/或终止区。

在一些示例实施例中，治疗因子为在靶病灶中引起细胞裂解的细胞毒素。

在一些示例实施例中，目标疾病或病症为癌症或肿瘤，并且其中医疗效应子在受试者中引起肿瘤抑制或溶解。

在一些示例实施例中，足以使发病机理最小化的时间少于48小时。

在一些示例实施例中，细菌不能够在受试者内复制或定殖。

在一些示例实施例中，基因修饰为至少一种必需基因或营养缺陷型基因从细菌的染色体中的缺失或突变。

在一些示例实施例中，细菌为二氨基庚二酸中的营养缺陷体。

在一些示例实施例中，基因修饰为天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)从细菌的染色体中的缺失。

在一些示例实施例中，细菌具有能够通过将所述细菌暴露于一种或多种调节效应子来进行控制的存活时间，所述调节效应子在体内施用时调节细菌的存活时间。

在一些示例实施例中，调节效应子为二氨基庚二酸。

在一些示例实施例中，医疗效应子为由选自由以下组成的组的基因来表达的同源肽：chuA、yjaA、tspE4C2、sat、sfa、papG、fyuA、iutA、hlyACBD、yfcV和pks岛。

在一些示例实施例中，医疗效应子为选自由以下组成的组的细胞毒素：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外溶素A(ExlA)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的非溶血性肠毒素(Nhe)、溶血素和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的空泡毒素，以及其组合。

在一些示例实施例中，医疗效应子为选自由以下组成的组的抗癌因子：CpG、环状二核苷酸和肿瘤抗原。

在一些示例实施例中，细菌衍生自埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、李斯特菌属(Listeria)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)或乳球菌属(Lactococcus)。

在一些示例实施例中，细菌衍生自大肠杆菌(Escherichia coli)。

在一些示例实施例中，细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)、保藏号为19836的菌株SH3。

在一些示例实施例中，细菌表达与SEQ ID NO:35的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的序列。

在一些示例实施例中，细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为19835的菌株mp107。

在一些示例实施例中，细菌是静脉内施用的。在一些示例实施例中，细菌被配制为静脉内施用。

在一些示例实施例中，当静脉内施用时，足以使发病机理最小化的时间少于48小时。

在一些示例实施例中，细菌是局部施用的。在一些示例实施例中，细菌被配制为局部施用。

在一些示例实施例中，当在注射部位处局部施用时，细菌在注射部位中存活至多5天，但在注射部位外则在48小时内死亡。在一些实施例中，细菌被从正常组织和器官中清除。

在一些示例实施例中，细菌是以7.5×10⁹cfu/kg小鼠的当量剂量来施用。在一些示例实施例中，细菌是以7.5×10⁹cfu/kg小鼠的当量剂量来静脉内施用。

在一些示例实施例中，疾病为癌症或肿瘤，并且细菌是瘤内施用的。

在一些示例实施例中，细菌是以每克肿瘤(约100-200mm³)5×10⁸cfu的当量剂量来瘤内施用。在一些示例实施例中，细菌是以每克肿瘤(约100-200mm³)4x10⁹cfu的当量剂量来瘤内施用。在一些示例实施例中，细菌是以每克肿瘤(约100-200mm³)至少5×10⁸cfu的当量剂量来瘤内施用。

在另一方面，提供了一种大肠杆菌属物种的活细菌，所述活细菌包含天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)从细菌的染色体中的基因缺失；其中所述细菌衍生自毒性菌株。

在一些示例实施例中，细菌表达编码医疗效应子的至少一种效应子基因。

在一些示例实施例中，细菌进一步包含编码铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)的基因。

在一些示例实施例中，基因与SEQ ID NO:35的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。

在另一方面，提供了一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含如前述权利要求中任一项所述的细菌。

在另一方面，提供了一种活细菌疫苗，所述活细菌疫苗包含根据示例实施例中任一项所述的细菌以及任选的佐剂。

在另一方面，提供了一种治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用包含有效量的如示例实施例中任一项所述的细菌的组合物。

在一些示例实施例中，疾病为肿瘤或癌症。

在另一方面，提供了一种构建基因工程活细菌的方法，所述方法包括以下步骤：对细菌进行基因工程改造，使得所述细菌具有短的寿命，从而使得所述细菌在施用于受试者之后，在足以允许医疗效应子发挥至少一种医疗作用的时间内存活并且在足以使对所述受试者的发病机理最小化的时间内死亡，其中所述细菌衍生自毒性菌株。

在一些示例实施例中，所述方法进一步包括以下步骤：对所述细菌进行基因工程改造以表达至少一种医疗效应子。

本文还讨论了其他示例实施例。

本披露内容有许多优点。在某些实施例中，因为所提供的细菌为受试者体内的活细菌，所以通过保持其效应子分子的完整性和功能性来确保医疗功效。

在某些示例实施例中，短寿命细菌优于被杀灭或灭活的细菌，因为这些短寿命细菌在施用之后可以在身体内存活一段时间以发挥更好的医疗作用。

在某些实施例中，因为所提供的细菌衍生自毒性或致病性菌株，并且保持毒力因子中的所有或至少一些毒力因子以用作医疗效应子，所以治疗功效远优于非致病性菌株的治疗功效。这些毒性菌株的许多抗原和毒性因子带来了比如引发针对疾病的免疫力或直接杀灭癌症细胞等多种治疗潜力。在某些实施例中，瘤内或静脉内注射的仅少量的短寿命细菌就足以有效地抑制肿瘤进展或治愈肿瘤。

在某些实施例中，因为所提供的细菌寿命短，所以基因突变的潜在风险被降到最低并且确保了医疗用途的生物安全性。

在某些实施例中，因为所提供的细菌寿命短并且具有高免疫原性和治疗性功效，所以所述细菌即使在静脉内施用时也能实现令人满意的治疗效果。在某些实施例中，静脉内或全身性施用少量短寿命细菌就足以实现令人满意的肿瘤抑制。细菌不需要被设计为特异性地靶向比如肿瘤等靶标或定殖在所述靶标中，也不需要受限于局部或瘤内施用，但仍然可以在治疗疾病方面实现很好的功效。

在某些实施例中，短寿命细菌优于经基因修饰的、病灶特异性细菌，因为短寿命细菌不会轻易突变以致失去其短期存活特征，而病灶特异性细菌易于突变以致失去其病灶靶向能力。

在某些实施例中，短寿命细菌可以用作疫苗或治疗剂的载体或媒介物，以治疗或预防多种疾病或改善某些病症。在某些实施例中，短寿命细菌可以用于诊断目的。

附图说明

图1A示出了根据示例实施例的在LB培养基中体外生长0小时、24小时和48小时的短寿命细菌的有生存力的细胞的数量。

图1B示出了根据示例实施例的在补充有二氨基庚二酸(DAP)的LB培养基中体外生长0小时、24小时和48小时的短寿命细菌的有生存力的细胞的数量。

图1C示出了根据示例实施例的在均质化的混合器官悬浮液中离体生长0小时、24小时和48小时的短寿命细菌的有生存力的细胞的数量。

图1D示出了根据示例实施例的皮下注射在小鼠中1天、2天、5天和11天后的短寿命细菌的有生存力的细胞的数量。

图2A示出了根据示例实施例的短寿命细菌mp107和对照菌株MG1655对小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)的杀灭百分比。

图2B示出了根据示例实施例的短寿命细菌mp107和对照菌株MG1655分别对人肺癌细胞系(A549)的杀灭百分比。

图2C示出了根据示例实施例的通过瘤内(i.t.)注射对照菌株MG1655、短寿命细菌SH3和表达ExlA的短寿命细菌mp107(使用两种不同的剂量)对鼠肿瘤体积的抑制。(*P<0.05，***P<0.001)。误差条，SEM。

图3A示出了根据示例实施例的通过静脉内(i.v.)注射PBS和表达ExlA的短寿命细菌mp107(以7.5x10⁹cfu/kg小鼠的剂量)对鼠肺癌的抑制。(***P<0.001)。误差条，SEM。

图3B示出了根据示例实施例的用mp107或对照菌株MG1655处理的小鼠肿瘤内CD4+T细胞百分比的流式细胞术结果。(***P<0.001)。误差条，SEM。

图3C示出了根据示例实施例的用mp107或对照菌株MG1655处理的小鼠肿瘤内CD8+T细胞百分比的流式细胞术结果。(***P<0.001)。误差条，SEM。

图4示出了根据示例实施例的质粒pExlA的图谱示意图。

图5示出了根据示例实施例的质粒pExlA2的图谱示意图。

图6A示出了根据示例实施例的大肠杆菌菌株SH3和SH4的溶血分析。

图6B示出了根据示例实施例的大肠杆菌对照菌株MG1655和MG1655/pExlA2的溶血分析。

图7示出了根据示例实施例的以2x10⁸cfu/小鼠的剂量静脉内注射mp105、mp106或mp107之后小鼠体重减轻百分比。将PBS用作阴性对照。误差条，SEM。

图8示出了根据示例实施例的静脉内注射了mp105、mp106或mp107的携带皮下LLC肿瘤的小鼠的肿瘤体积(mm3)的增加。将PBS用作阴性对照。误差条，SEM。

图9示出了根据示例实施例的施用了静脉内注射mp105(iv)或者静脉内注射和瘤内注射mp105的组合(iv+it)的携带皮下LLC肿瘤的小鼠的肿瘤体积(mm3)的增加。将PBS用作阴性对照。误差条，SEM。

图10A和图10B分别示出了根据示例实施例的在皮下注射两剂mp105(以1x10⁸cfu/小鼠的剂量)或者PBS之后14天，肝脏和肺中鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的定量。通过对菌落形成单位进行计数来对器官中的细菌进行定量，并且通过菌落PCR来进行验证。

微生物保藏

细菌菌株SH2于2021年6月10日保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为22685。细菌菌株SH3于2020年5月18日保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为19836。细菌菌株mp107于2020年5月18日保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为19835。细菌菌株SH4于2021年5月18日保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为22557。细菌菌株mp105于2021年5月18日保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为22555。细菌菌株mp106于2021年5月18日保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为22556。

具体实施方式

如本文和权利要求中所使用的，“包含(comprising)”意指包括以下元素但不排除其他元素。

如本文和权利要求中所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指出。例如，如以上所使用的，“一个”基因意指一个或多个基因，其可以相同或者不同。

如本文所使用的，术语“约”被理解为在本领域的正常容差范围内，并且不超过规定值的±10％。仅通过举例，约50意指从45至55，包括中间的所有值。如本文所使用的，短语“约”特定值也包括所述特定值，例如，约50包括50。

如本文和权利要求中所使用的，“免疫原性组合物”为有效(例如，以合适的形式和量)引发针对疾病或病症的免疫(免疫学)应答的组合物。在一些实施例中，免疫原性组合物为有效预防癌症或肿瘤的疫苗。

如本文和权利要求中所使用的，“有效量”为这样的量，所述量有效实现至少可测量的量的所期望作用。例如，所述量可以有效引发免疫应答，和/或它可以有效引发保护性应答，以针对携带目标多肽的病原体。在一些实施例中，所述量可以有效引发针对癌症或肿瘤的免疫应答。

如本文和权利要求中所使用的，“受试者”是指比如哺乳动物等动物，包括，但不限于灵长类动物(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。

如本文和权利要求中所使用的，细菌的“发病机理”为导致宿主或受试者的患病状态的一种或多种生物学机制。

如本文和权利要求中所使用的，“无毒”菌株(例如，非侵入性、共栖性或共生性)为不会对受试者导致疾病或具有有害致病作用的菌株。此类细菌可以为天然存在的细菌、GRAS(“公认为安全的”)细菌或益生菌。在另一方面，“毒性”菌株具有至少一种毒力因子，可能导致疾病或对受试者具有有害致病作用，并且通常并不被认为是安全的。

某些示例实施例中的“毒性”菌株能够被基因修饰，使得即使它保留或具有某些附加的毒力因子，也不会导致疾病，或对受试者或宿主没有有害致病作用。

“毒力因子”为由细菌产生的分子，所述分子可以改善细菌伤害宿主或宿主内细胞(例如宿主内的肿瘤)的能力。毒力因子的示例包括细胞毒素、毒素、溶血素、蛋白酶、破坏性酶，以及有助于细菌进行定殖、进出细胞和获得营养的能力的因子。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“(进行)治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指以下的方法：在预防上和/或治疗上缓解、消除或改善疾病或病症症状，预防另外的症状，改善或预防症状的基础代谢病因，抑制疾病或病症，阻滞疾病或病症的发展，减轻疾病或病症，引起疾病或病症的消退，减轻由疾病或病症引起的状况，或终止疾病或病症的症状。

如本文和权利要求中所使用的，“短寿命(short-lived)”细菌或具有“短的寿命(short lifespan)”的细菌是指在体内施用于受试者之后仅能存活短暂时间段的细菌，例如，在几小时(比如1小时至3小时)至几天(比如1天至3天)内，这取决于所施用的细菌的数量以及细菌的施用方式。在某些实施例中，“短寿命”细菌在施用之后不能在受试者内体内复制或定殖。

如本文和权利要求中所使用的，细菌“死亡”是指细菌的生命永久停止。

如本文和权利要求中所使用的，“减毒”细菌是指与亲本形式或菌株相比，具有降低的毒力或感染性的细菌。

如本文和权利要求中所使用的，“医疗效应子”是指对疾病或病症发挥至少一种医疗作用的药剂。医疗效应子的示例包括但不限于治疗因子、抗原、肽和细胞毒素。

如本文和权利要求中所使用的，对受试者的疾病或病症“发挥医疗作用”是指引起治疗受试者的疾病或病症的生物学变化。医疗作用的示例包括但不限于引发免疫应答、引起疾病病灶内的细胞裂解、抑制生物学通路、与受体结合、抑制受体、抑制靶细胞或生物体中的细胞过程，以及抑制或减少引起或维持疾病或病症的一种或多种因子的产生。细胞过程包括但不限于DNA复制、RNA翻译、细胞分裂和维持细胞稳态。

在某些示例实施例中，非常需要开发一种新型细菌，所述新型细菌具有被杀灭的细菌和活细菌两者的优点，同时避开它们各自的短处。

在某些示例实施例中，提供的细菌为短寿命细菌。当体内施用短寿命细菌时，所述短寿命细菌以数小时的时间尺度存活。通过用特定化合物或分子补充细菌悬浮液，可以人为地改变短寿命细菌的寿命。因为短寿命细菌在施用时是活的，所以由它们产生的效应子分子保持完整性和功能性。因为短寿命细菌在施用之后数小时或数天内在身体内死亡，所以发病机理被最小化。

在某些示例实施例中，提供了包含基因工程细菌的药物组合物。

在某些示例实施例中，可以通过使一种或某些必需基因缺失来生成短寿命细菌。替代性地，可以通过使相关的营养缺陷型基因发生突变或缺失来在基因方面构建细菌的营养缺陷体。所得突变型细菌可能具有变化的、相对较短的寿命。其中一些所得突变型细菌可能会在身体内迅速死亡，这取决于它们所施用的生长环境中的营养成分。即使生长环境包含残留量的细菌暂时赖以生存的营养或化合物，那么所述细菌也可以存活更长时间。

编号的实施例-第1组

1.一种基因工程活细菌，其包含

至少一种效应子基因，其编码至少一种医疗效应子；以及

至少一种基因修饰，其缩短所述细菌的寿命，使得所述细菌在施用于受试者之后，在足以允许所述医疗效应子发挥至少一种医疗作用的时间内存活并且在足以使对所述受试者的发病机理最小化的时间内死亡；

其中所述细菌衍生自毒性菌株。

2.如实施例1所述的细菌，其中所述医疗效应子为抗原，所述抗原可以在所述受试者中引发足以治疗目标疾病或病症的至少一种免疫应答。

3.如实施例1所述的细菌，其中所述医疗效应子为治疗因子，所述治疗因子可以在足以治疗目标疾病或病症的程度上，在所述受试者中引发至少一种免疫应答和/或减小靶病灶的大小。

4.如实施例2或3所述的细菌，其中所述免疫应答由CD4+和/或CD8+T细胞引发。

5.如实施例1所述的细菌，其中所述医疗效应子为抗原或从所述细菌的同源基因表达的治疗因子。

6.如实施例1所述的细菌，其中所述医疗效应子为抗原或从异源基因表达的治疗因子。

7.如实施例6所述的细菌，其中所述异源基因进一步包含在所述细菌中改善异源表达的前导序列和/或终止区。

8.如实施例3或6所述的细菌，其中所述治疗因子为在所述靶病灶中引起细胞裂解的细胞毒素。

9.如实施例2或3所述的细菌，其中所述目标疾病或病症为癌症或肿瘤，并且其中所述医疗效应子在所述受试者中引起肿瘤抑制。

10.如实施例1所述的细菌，其中所述细菌不能够在所述受试者内复制或定殖。

11.如实施例1所述的细菌，其中所述基因修饰为至少一种必需基因或营养缺陷型基因从所述细菌的染色体中的缺失或突变。

12.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述细菌为二氨基庚二酸中的营养缺陷体。

13.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述基因修饰为天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)从所述细菌的染色体中的缺失。

14.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述细菌具有能够通过将所述细菌暴露于一种或多种调节效应子来进行控制的存活时间，所述调节效应子在体内施用时调节所述细菌的所述存活时间。

15.如实施例14所述的细菌，其中所述调节效应子为二氨基庚二酸。

16.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述医疗效应子为由选自由以下组成的组的基因来表达的同源肽：chuA、yjaA、tspE4C2、sat、sfa、papG、fyuA、iutA、hlyACBD、yfcV和pks岛。

17.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述医疗效应子为选自由以下组成的组的细胞毒素：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外溶素A(ExlA)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的非溶血性肠毒素(Nhe)、溶血素和幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的空泡毒素，以及其组合。

18.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述医疗效应子为选自由以下组成的组的抗癌因子：CpG、环状二核苷酸和肿瘤抗原。

19.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、李斯特菌属(Listeria)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)或乳球菌属(Lactococcus)。

20.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自大肠杆菌(Escherichia coli)。

21.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为19836的菌株SH3。

22.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达与SEQ ID NO:35的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的序列。

23.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为19835的菌株mp107。

24.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述细菌被配制为静脉内施用。

25.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中当静脉内施用时，足以使发病机理最小化的时间少于48小时。

26.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述细菌被配制为局部施用。

27.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中当在注射部位处局部施用时，所述细菌在所述注射部位中存活至多5天，但在所述注射部位外则在48小时内死亡。

28.如实施例24所述的细菌，其中所述细菌是以7.5x10⁹cfu/kg小鼠的当量剂量来施用。

29.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中所述疾病为癌症或肿瘤，并且细菌是瘤内施用的。

30.如实施例29所述的细菌，其中所述细菌是以约100-200mm³的每克肿瘤至少5x10⁸cfu的当量剂量来施用。

31.一种大肠杆菌属物种的活细菌，所述活细菌包含

天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)从所述细菌的染色体中的基因缺失；

其中所述细菌衍生自毒性菌株。

32.如实施例31所述的细菌，其中所述细菌表达编码医疗效应子的至少一种效应子基因。

33.如实施例31所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为19836的菌株SH3。

34.如实施例31所述的细菌，其中所述细菌进一步包含编码铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)的基因。

35.如实施例34所述的细菌，其中所述基因与SEQ ID NO:35的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。

36.如实施例31所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为19835的菌株mp107。

37.一种免疫原性组合物，其包含如前述实施例中任一项所述的细菌。

38.一种活细菌疫苗，其包含如前述实施例中任一项所述的细菌以及任选的佐剂。

39.一种治疗疾病或病症的方法，其包括向受试者施用包含有效量的如前述实施例中任一项所述的细菌的组合物。

40.如实施例39所述的方法，其中所述疾病为肿瘤或癌症。

41.一种构建基因工程活细菌的方法，所述方法包括以下步骤：

对细菌进行基因工程改造，使得所述细菌具有短的寿命，从而使得所述细菌在施用于受试者之后，在足以允许医疗效应子发挥至少一种医疗作用的时间内存活并且在足以使对所述受试者的发病机理最小化的时间内死亡，其中所述细菌衍生自毒性菌株。

42.如实施例41所述的方法，其进一步包括以下步骤：

对所述细菌进行基因工程改造以表达至少一种医疗效应子。

编号的实施例-第2组

1.一种基因工程活细菌，其包含

至少一种效应子基因，其编码至少一种医疗效应子；以及

至少一种基因修饰，其缩短所述细菌的寿命，使得所述活细菌在施用于受试者之后，在允许所述医疗效应子发挥至少一种医疗作用的足够长的时间内存活并且在使对所述受试者的发病机理最小化的时间之后死亡；

其中所述细菌衍生自毒性菌株。

25.如前述实施例中任一项所述的细菌，其中当静脉内施用时，足以使发病机理最小化的时间少于2天、5天或11天。

31.如实施例1至20中任一项所述的细菌，其中所述至少一种效应子基因包含细胞毒素基因以及溶血素III编码基因的部分DNA片段。

32.如实施例31所述的细菌，其中所述细胞毒素为铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)。

33.如实施例31或32中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22556的菌株mp106。

34.如前述实施例中任一项所述的细菌，其进一步包含减弱所述细菌的毒力的至少一种毒力基因修饰。

35.如实施例34所述的细菌，其中所述至少一种毒力基因修饰为至少一种毒力基因从所述细菌的染色体中的缺失或突变。

36.如实施例34或35中任一项所述的细菌，其中所述毒力基因修饰为hlyCABD操纵子从所述细菌的染色体中的缺失。

37.如实施例36中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22557的菌株SH4。

38.如实施例34至37中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达与SEQ ID NO:40的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的序列。

39.如实施例34至37中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达与SEQ ID NO:41的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的第一序列和/或与SEQID NO:42的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的第二序列。

40.如实施例38或39中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22555的菌株mp105。

41.如实施例31至40中任一项所述的细菌，其中所述细菌是以2x10⁸cfu/小鼠的当量剂量来施用。

42.如实施例34至40中任一项所述的细菌，其中所述细菌配制为以静脉内注射和瘤内注射的组合来施用。

43.如实施例42所述的细菌，其中所述瘤内注射具有7.5x10⁷cfu/小鼠的当量剂量，并且所述静脉内注射具有3x10⁷cfu/小鼠的当量剂量。

44.一种大肠杆菌属物种的活细菌，所述活细菌包含

其中所述细菌衍生自毒性菌株。

45.如实施例44所述的细菌，其中所述细菌表达编码医疗效应子的至少一种效应子基因。

46.如实施例44所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为19836的菌株SH3。

47.如实施例44所述的细菌，其中所述细菌进一步包含编码铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)的基因。

48.如实施例47所述的细菌，其中所述基因与SEQ ID NO:35的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。

49.如实施例44所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为19835的菌株mp107。

50.如实施例44所述的细菌，其中所述至少一种效应子基因包含细胞毒素基因以及溶血素III编码基因的部分DNA片段。

51.如实施例50所述的细菌，其中所述细胞毒素为铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)。

52.如实施例50或51中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22556的菌株mp106。

53.如实施例44至52中任一项所述的细菌，其进一步包含减弱所述细菌的毒力的至少一种毒力基因修饰。

54.如实施例53所述的细菌，其中所述至少一种毒力基因修饰为至少一种毒力基因从所述细菌的染色体中的缺失或突变。

55.如实施例53或54中任一项所述的细菌，其中所述毒力基因修饰为hlyCABD操纵子从所述细菌的染色体中的缺失。

56.如实施例55所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22557的菌株SH4。

57.如实施例53至56中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达与SEQ ID NO:40的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的序列。

58.如实施例53至56中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达与SEQ ID NO:41的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的第一序列和/或与SEQID NO:42的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的第二序列。

59.如实施例57或58中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22555的菌株mp105。

60.如实施例50至59中任一项所述的细菌，其中所述细菌是以2x10⁸cfu/小鼠的当量剂量来施用。

61.如实施例53至59中任一项所述的细菌，其中所述细菌配制为以静脉内注射和瘤内注射的组合来施用。

62.如实施例61所述的细菌，其中所述瘤内注射具有7.5x10⁷cfu/小鼠的当量剂量，并且所述静脉内注射具有3x10⁷cfu/小鼠的当量剂量。

63.一种免疫原性组合物，其包含如前述实施例中任一项所述的细菌。

64.一种活细菌疫苗，其包含如前述实施例中任一项所述的细菌以及任选的佐剂。

65.一种治疗疾病或病症的方法，其包括向受试者施用包含有效量的如前述实施例中任一项所述的细菌的组合物。

66.如实施例65所述的方法，其中所述疾病为肿瘤或癌症。

67.一种构建基因工程活细菌的方法，所述方法包括以下步骤：

68.如实施例67所述的方法，其进一步包括以下步骤：

对所述细菌进行基因工程改造以表达至少一种医疗效应子。

69.包含有效量的如前述实施例中任一项所述的细菌的组合物在制造用于治疗疾病或病症的药物中的用途。

70.如实施例69所述的用途，其中所述疾病为肿瘤或癌症。

在一些实施例中，提供了一种基因工程活细菌，其包含编码医疗效应子的至少一种效应子基因；以及至少一种基因修饰，其缩短细菌的寿命，使得细菌在施用于受试者之后，在足以允许医疗效应子发挥至少一种医疗作用的时间内存活并且在足以使对受试者的发病机理最小化的时间之后死亡。所述细菌衍生自毒性菌株。

在某些实施例中，与非致病性或无毒细菌相比，毒性菌株可以提供更高基础水平的免疫原性和治疗潜力。

在某些实施例中，所述时间足以允许医疗效应子针对至少一种疾病或病症发挥至少一种医疗作用。所述作用可能在细菌死亡并且从受试者身体内清除很久之后继续存在。

在一些示例实施例中，医疗作用为预防和/或治疗作用。

在一些示例实施例中，足以使细菌的医疗效应子启动预防和/或治疗作用的时间少于48小时。

实例1

材料和方法

(1)构建短寿命细菌的方法

必需基因或营养缺陷型基因的缺失或突变

为了产生短寿命细菌，至少一种必需基因或营养缺陷型基因可能发生缺失或突变。在某些示例实施例中，将毒性细菌菌株用于突变。

在该示例实施例中，从健康志愿者提供的粪便样品中分离并纯化了大肠杆菌(E.coli)菌株SH2。将粪便样品重新悬浮在PBS缓冲液中，并且铺展在补充有1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和X-gal(0.06mg/ml)的LB琼脂上。大肠杆菌形成蓝色菌落并且与其他菌种区分开来。SH2为粪便大肠杆菌分离株中的一种分离株。菌株SH2于2021年6月10日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为22685。

在该示例实施例中，作为针对天冬氨酸-半醛脱氢酶进行编码的必需基因，asd基因从大肠杆菌菌株SH2的染色体中缺失。使用兰姆达(λ)-Red重组系统来使asd基因从大肠杆菌的细菌染色体中缺失。将两种引物用于产生缺失：

asd-F(正向引物)：

TCACTTGCGACTTTGGCTGCTTTTTGTATGGTGAAAGATGTGCCAAATAGGCGTATCACGAGGC(SEQID NO:1)

asd-R(反向引物)：

GCACTAGCAGGGGCGGCATCGCGCCCCAGATTTAATGAATAAAGATAGTGAACCTCTTCGAGGGAC(SEQ ID NO:2)

使用氯霉素抗性基因(cat)作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增包含loxP-cat-loxP氯霉素抗性盒的DNA片段，所述片段与直接侧接asd基因的区域具有同源性(45nt)。将引物asd-F和asd-R用于该PCR。用质粒pSim6来转化电转感受态大肠杆菌，在所述质粒上在42℃诱导λ重组蛋白的表达。通过电穿孔将上述PCR片段引入携带pSim6的大肠杆菌中。在诱导λ-red之后，在37℃下温育过夜后，针对氯霉素抗性来选择重组菌落。将抗性菌落进行分离，并且使用引物asd-F2(正向)TAGGTTTCCGAGCGGATCCA(SEQ ID NO:3)和Cm-R3(反向)CCTCTTACGTGCCGATCAACG(SEQ ID NO:4)，通过菌落PCR来进行验证，这些引物被设计为侧接asd基因。验证PCR的大小为505bp。通过表型测试进一步确认了asd缺失，在所述表型测试中，正确的菌落未在LB培养基上生长，但易于在补充有DAP(50μg/ml)的LB培养基上生长。在确认asd缺失之后，选择单个菌落并且用携带卡那霉素抗性基因的705Cre质粒来进行转化。来自所述质粒的Cre重组酶的表达在37℃被诱导，并且在无任何抗生素的情况下铺展在Luria-Bertani(LB)琼脂上。然后将单个菌落在LB琼脂和补充有氯霉素的LB琼脂两者上划线。选择在LB琼脂上生长但不在具有氯霉素的LB琼脂上生长的单个菌落。具有asd的基因缺失但不具有loxp-cat-loxp盒的该突变株被命名为SH3。菌株SH3于2020年5月18日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为19836。

突变株的毒力基因鉴定

通过菌落PCR来检测SH3内的毒力基因。为了设计引物，首先通过对多重序列比对的评估而在不同的大肠杆菌菌株中鉴定保守序列区域。然后，引物被设计为对保守区域具有特异性。所有使用的引物均在表1中列出。

表1.用于检测SH3中的毒力基因的引物

体外细菌生长测定

将10μl细菌SH3的过夜培养物在具有或不具有50μg/ml DAP的1ml的LB肉汤培养基中进行继代培养(时间0)。温育24小时和48小时后，连续稀释细菌并且通过对Luria-Bertani(LB)琼脂和补充有50μg/ml DAP的LB琼脂两者上的菌落形成单位进行计数来对有生存力的细菌进行定量。

离体细菌存活测定

将六至八周大的雌性C57BL/6J小鼠安乐死。将器官(包括肝脏、肺、心脏、肾脏和脾脏)移除并且分别进行均质处理。将等体积的单独器官悬浮液中的每种悬浮液混合在一起以形成混合器官悬浮液。将悬浮液混合物用于离体存活测定。将5μl细菌的过夜培养物在500μl器官悬浮液中进行继代培养(时间0)。在24小时和48小时后，通过在补充有50μg/mlDAP的LB琼脂上对菌落形成单位进行计数来对有生存力的细菌进行定量。

体内细菌存活测定

将具有或不具有5μg/ml DAP的细菌悬浮液(约1x10⁹cfu)皮下注射至六至八周大的雌性C57BL/6J小鼠(平均体重为约20g)的胁腹。然后将来自细菌注射部位以及关键器官(包括肝脏、肺、心脏、肾脏和脾脏)的组织移除，以用于确定不同时间点的菌落形成单位。将约1克的每种组织在1ml的PBS缓冲液中进行均质处理。将所得组织悬浮液连续稀释，铺在补充有50μg/ml DAP的LB琼脂上，并且分别在37℃温育过夜。分别对经稀释的组织悬浮液的菌落形成单位(cfu)进行计数，并且根据稀释倍数来计算组织中的细菌数量。

使用与上文类似的方法重复相同的体内细菌存活测定，其中将细菌悬浮液(约5x10⁸cfu)注射至六至八周大的雌性C57BL/6J小鼠(平均体重为约20g)的尾静脉中。然后将来自细菌注射部位以及关键器官(包括肝脏、肺、心脏、肾脏和脾脏)的组织移除，以用于确定不同时间点的菌落形成单位。将约1克的每种组织在1ml的PBS缓冲液中进行均质处理。将所得组织悬浮液连续稀释，铺在补充有50μg/ml DAP的LB琼脂上，并且分别在37℃温育过夜。分别对经稀释的组织悬浮液的菌落形成单位(cfu)进行计数，并且根据稀释倍数来计算组织中的细菌数量。

实例2

(2)短寿命细菌用作医疗效应子的载体

通过基因克隆来构建表达细胞毒素的短寿命细菌

合成了具有启动子和终止子的编码铜绿假单胞菌PA7的外溶素A(ExlA)(图4)的exlA基因(SEQ ID NO:35)(Genbank：CP000744.1)，并且根据制造商的说明书使用CloneEZ无缝克隆技术(金斯瑞公司(GenScript))将其克隆在pBAD-DEST49质粒(美国英杰公司(Invitrogen)，目录号12283-016)中。通过测序分析来验证重组质粒pExlA。随后将重组质粒pExlA通过电穿孔引入asd缺失的突变型SH3中，并且使用引物oxb-F(正向：CTGTTGTGACCGCTTGCTCT)(SEQ ID NO:33)和exlA-R(反向：GAGGTGGAAGACAGGATTGTC)(SEQID NO:34)，通过菌落PCR来进行验证。确认质粒的转化后，选择单个菌落。具有重组质粒的所得突变株被命名为mp107。菌株mp107于2020年5月18日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为19835。

体外细胞毒性测定

将小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞系和人肺癌细胞系(A549)用于体外细胞毒性测定。在生长培养基(DMEM+10％ FBS+1％ Gln+1％ P/S)中以每孔1x10⁴个细胞将每个细胞系接种在96孔板中。当细胞生长到80％汇合度(confluency)时，将它们与细菌mp107以100的moi(即每个细胞100个细菌)在不含抗生素的培养基加5μg/ml DAP中进行共培养。将大肠杆菌参考菌株MG1655用作对照细菌。作为对照，对照细菌也与1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液进行共培养。温育3小时后，用PBS洗涤细菌细胞三次，并且用1％结晶紫染色5min。经结晶紫染色的细胞将被视为有生存力的细胞，因为死细胞已经通过洗涤而被去除。将经染色的细胞用PBS轻轻洗涤，然后用95％乙醇脱色。用微量滴定板读数器在595nm处测量脱色溶液中结晶紫染色的量(在595nm处的光密度(OD))，其反映有生存力的癌细胞的数量。使用以下公式来计算由共培养的细菌杀灭的细胞的百分比(或杀灭百分比(％))：(对照的OD₅₉₅-处理的OD₅₉₅)/对照的OD₅₉₅)×100％。

对局部施用时的短寿命细菌的体内抗肿瘤评定

将六至八周大的雌性C57BL/6J小鼠用于鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)的肿瘤植入。尤其是，将癌细胞系的1×10⁶个细胞皮下注射至每只小鼠的胁腹中。在细胞系植入后7天至12天，当肿瘤的平均体积达到约100-200mm³时，将对照细菌MG1655、短寿命细菌SH3和mp107以每克肿瘤5x10⁸cfu的剂量分别注射至每只小鼠的每个肿瘤中。通过注射PBS来制备阴性对照，并且通过每克肿瘤注射4x10⁹cfu来制备高剂量mp107组。在细菌瘤内(i.t.)注射后，每周约两次(从第0天至第20天)使用数显卡尺来测量肿瘤大小。评估治疗组和对照中的每一者之间的肿瘤生长抑制率(TGI)的差异。

使用补充有5μg/ml的DAP的短寿命细菌SH3和mp107来评估由医疗效应子在体内对短寿命细菌的存活时间的调节。

对全身性施用时的短寿命细菌的体内抗肿瘤评定

将六至八周大的雌性C57BL/6J小鼠用于鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)的肿瘤植入。尤其是，将癌细胞系的1×10⁶个细胞皮下注射至每只小鼠的胁腹中。在细胞系植入后7天至12天，当肿瘤平均体积达到约100-200mm³时，将短寿命细菌mp107通过以7.5x10⁹cfu/kg小鼠的剂量分别注射至每只小鼠的尾静脉中来进行全身性注射。通过注射PBS来制备阴性对照。在细菌静脉内(i.v.)注射后，每周约两次(从第0天至第20天)使用数显卡尺来测量肿瘤大小。评估治疗组和对照中的每一者之间的肿瘤生长抑制率(TGI)的差异。

小鼠中短寿命细菌的生物分布

在体内抗肿瘤评定之后，将小鼠安乐死。然后将肿瘤组织以及来自关键器官(包括肝脏、肺、心脏、肾脏和脾脏)的组织移除，以用于确定不同时间点的菌落形成单位。将约1克的每种组织在1ml的PBS缓冲液中进行均质处理。将所得组织悬浮液连续稀释，铺在补充有50μg/ml DAP的LB琼脂上，并且分别在37℃温育过夜。分别对经稀释的组织悬浮液的菌落形成单位(cfu)进行计数，并且根据稀释倍数来计算组织中的细菌数量。

流式细胞术

用37.5μg/mL Liberase TM(罗氏公司(Roche))和8,000U/mL DNase I、牛胰腺(默克密理博公司(Merck Millipore))来分解肿瘤组织。将细胞悬浮液用200μM细胞过滤网进行过滤并且用PBS冲洗。然后用以下抗体来针对标志物对细胞进行染色：BB700大鼠抗小鼠CD4克隆RM4-5(RUO)(BD)、Ms CD3e FITC 145-2C11(BD)、Ms CD4 BV510 RM4-5(BD)、MsCD8a APC-Cy7 53-6.7(BD)和BV510大鼠抗小鼠CD45RB(BD)。根据制造商的说明书，用流式细胞仪Life Attune NxT(生命科技公司(Life Technologies))来分析经染色的细胞。

结果

实例3

短寿命细菌的构建

根据实例1中所述的方法来制备具有从染色体的基因缺失的突变株并且命名为SH3。存在大肠杆菌菌株的四个系统发育组(phylogenetic group)(A、B1、B2和D)，并且可以通过对大肠杆菌的染色体中的chuA和yjaA基因以及DNA片段TSPE4.C2进行PCR检测来确定系统发育类型。所使用的引物对为chuA-F(GACGAACCAACGGTCAGGAT)(SEQ ID NO:23)和chuA-R(TGCCGCCAGTACCAAAGACA)(SEQ ID NO:24)、yjaA-F(TGAAGTGTCAGGAGACGCTG)(SEQID NO:25)和yjaA-R(ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC)(SEQ ID NO:26)以及TspE4C2-F(GAGTAATGTCGGGGCATTCA)(SEQ ID NO:27)和TspE4C2-R(CGCGCCAACAAAGTATTACG)(SEQ IDNO:28)。所得PCR产物的大小分别为279bp、211bp和152bp。如果大肠杆菌菌株对chuA和yjaA两者均呈阳性，则将所述菌株确定为系统发育B2组。系统发育分型显示SH3属于系统发育类型B2大肠杆菌。对大肠杆菌毒力基因的进一步PCR检测表明SH3对聚酮合酶基因组岛(pks岛)(所述岛为编码巨型模块化非核糖体肽和聚酮合酶的致病性岛)以及比如chuA、yjaA、tspE4C2、sat、sfa、papG、fyuA、iutA、hlyACBD和yfcV等其他毒力基因或操纵子呈阳性。结果显示，SH3为这样的大肠杆菌菌株，其具有多种毒力因子，由此与从非致病性或无毒菌株工程改造的那些菌株相比，提供更高基础水平的免疫原性和治疗性功效。

短寿命细菌的体外细菌生长测定的结果

现在参考图1A和图1B，体外生长测定显示asd缺失的突变型SH3无法在不补充DAP的生长培养基(LB)中存活(图1A)，但是当在生长培养基中补充了DAP时则易于生长(24小时后约8x10⁷cfu并且48小时后约5x10⁷cfu)(图1B)。这些结果表明，在缺乏必需补充的情况下，具有必需基因缺失的基因修饰的短寿命细菌无法在体外存活。

短寿命细菌的离体细菌存活测定的结果

现在参考图1C，在离体研究中也观察到asd突变型SH3的存活不佳(24小时或48小时之后没有生长)，在所述研究中将asd突变型SH3在均质化的混合器官悬浮液中进行温育，然后通过在补充有DAP(50μg/ml)的LB琼脂上对菌落形成单位进行计数来对有生存力的细菌进行定量(图1C)。结果表明，在缺乏必需补充的情况下，具有必需基因缺失的基因修饰的短寿命细菌无法离体存活。

短寿命细菌的体内细菌存活测定的结果

为了确定asd突变型SH3是否可以在体内存活短暂的时间段，将asd突变型SH3(约1x10⁹cfu)皮下注射在小鼠中。

现在参考图1D，在没有DAP补充的情况下，从注射起2天之后，SH3的活菌计数从约1x10⁹cfu下降至约2.7x10⁸，其中在注射部位中仍有约27％的SH3存活。在5天后，活菌计数继续大幅下降。在11天后无法检测到活菌计数，这表明具有必需基因缺失的基因修饰的细菌寿命短并且无法在体内复制或定殖。

短寿命细菌的体内细菌存活测定的结果

体内细菌存活测定结果还显示，从注射起2天、5天和11天之后，无论细菌悬浮液中DAP得到补充或不存在，SH3仅存在于皮下注射部位中并且可以存活至多5天，但在所有其他所测试的器官(包括肝脏、肺、脾脏、心脏和肾脏)中均不存在。

结果表明，短寿命细菌定位在皮下注射部位内，因此在局部施用时可以安全使用。

将短寿命细菌SH3(约5x10⁸cfu)进一步注射至六至八周大的雌性C57BL/6J小鼠的尾静脉中，以进一步评估当全身性施用时短寿命细菌的安全性。在静脉内注射后，用短寿命细菌处理的小鼠未死亡。相比之下，100％的用野生型细菌处理的小鼠在48小时内死亡。此外，当静脉内(i.v.)注射后6天进行检查时，在用短寿命细菌处理的任何小鼠的任何器官中均未检测到SH3。

值得注意的是，在所有这些体内评定中，asd缺失的突变型SH3的突变率为0％。即，100％的从注射部位分离的SH3的细胞保持它们对DAP的依赖性，以便存活和生长，这表明即使基因修饰的细菌保留了它们的毒性因子，无论局部施用还是全身性施用所述细菌，这些细菌均可以安全使用。

总之，这些数据表明，当局部施用或全身性施用时，具有毒力因子的短寿命细菌在体内使用时具有令人惊讶的安全性。不受任何理论的束缚，短寿命细菌在受试者或宿主内暂时存活，使得即使细菌具有多种毒力因子，也不会发展全身性感染或疾病。因此，所述细菌可以用作安全而高功效的载体或媒介物以用于制备疫苗或治疗剂，用来治疗或预防多种疾病或改善某些病症。比如SH3等短寿命突变型细菌可以用作开发活治疗剂的平台。

调节短寿命细菌的存活时间

仍参考图1D，用最终浓度为5μg/ml的DAP补充细菌悬浮液，并且进行了体内细菌存活测定。在补充DAP的情况下，从注射起2天后，SH3的活菌计数仅从约1x10⁹cfu下降至约6.27x10⁸cfu。换句话说，在注射后，约62.7％的asd突变型SH3在注射部位中存活了2天(图1D)。该百分比显著高于无DAP的情况下SH3的百分比。因此，结果表明可以通过补充调节效应子来调节短寿命细菌的存活时间。有利的是突变型短寿命细菌的存活时间能够由调节效应子来控制。尽管注射部位SH3的存活时间因添加5μg/ml DAP而增加，但从注射起2天、5天和11天之后进行检查时，SH3在任何小鼠的任何关键器官中均不存在。

实例4

表达异源毒性因子的短寿命细菌的构建结果

在该示例实施例中，在组成型启动子oxb18的控制下，用表达细胞毒素、铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)的质粒进一步转化从实例2获得的短寿命细菌SH3。包含oxb 18启动子、pelB前导序列、铜绿假单胞菌PA7的exlA基因以及终止子(rrnB转录终止区)的序列如SEQ ID NO:35所示且被克隆至质粒pBAD-DEST49中以形成重组质粒pExlA(图4)。经纯化和验证的重组菌株被命名为mp107。

表达细胞毒素的短寿命细菌的体外细胞毒性测定的结果

现在参考图2A，在体外评估了mp107的细胞毒性。在将细胞系与细菌在加有DAP(5μg/ml)的生长培养基中共培养3小时后确定了杀灭百分比。两者均为P<0.001(独立t检验)。数据显示，短寿命细菌mp107对LLC细胞的杀灭百分比令人惊讶地高(约92％)，而对照细菌MG1655具有仅约13％的杀灭百分比(图2A)。数据还显示，mp107对A549细胞的杀灭百分比令人惊讶地高(约90％)，而对照细菌MG1655具有仅约30％的杀灭百分比(图2B)。这些结果显示，mp107对鼠肺癌细胞和人肺癌细胞具有毒性或致死性，这表明表达比如细胞毒素等异源毒力因子的短寿命细菌可能具有用于治疗比如肺癌等癌症的高功效。

对局部施用时的短寿命细菌的体内抗肿瘤评定的结果

现在参考图2B，构建了同基因鼠癌症模型，在所述模型中小鼠携带由Lewis肺癌细胞(LLC)形成的皮下肿瘤。为了改善短寿命细菌在体内肿瘤内的存活时间，在施用于小鼠中的肿瘤之前，用补充有剂量为5μg/ml的DAP的细菌悬浮液来进行体内抗肿瘤评定。对于对照菌株MG1655、短寿命细菌SH3和表达exlA的外溶素的短寿命细菌mp107的组，这些细菌以每克肿瘤5x10⁸cfu的剂量来进行注射；对于mp107(高剂量)的组，注射剂量为每克肿瘤4x10⁹cfu。图2B示出，在整个治疗期间(从第3天至第20天)，当与对照MG 1655组和PBS组(无细菌注射)相比时，SH3组的肿瘤生长受到显著抑制。与参考菌株MG1655(p＝0.0002)相比，短寿命细菌SH3显示出更高的肿瘤抑制水平，这表明具有毒力因子的SH3细菌与对照细菌相比具有更高的抗癌功效。数据还显示，在整个治疗期间(从第3天至第20天)，当与SH3组相比时，mp107组的肿瘤生长受到显著抑制。数据进一步显示，从本身来讲，与短寿命细菌SH3相比，表达另外的细胞毒素的短寿命细菌mp107对肿瘤生长的抑制更有效(p＝0.03)，这表明exlA编码的细胞毒素赋予短寿命细菌额外的抗癌能力。当注射剂量增加至每克肿瘤4x10⁹cfu(更高剂量)时，mp107的抗癌功效也相应地增加。在瘤内注射细菌20天后，高剂量mp107的竞争应答率达到了75％(8只小鼠中的6只小鼠)，这表明进一步表达比如细胞毒素ExlA等的异源毒力因子的短寿命细菌SH3(即mp107的治疗组)在抗癌功效方面的加性效应或甚至协同效应。肿瘤生长抑制率(TGI)的比较显示治疗组和对照组中的每一者之间的显著差异。

对全身性施用时的短寿命细菌的体内抗肿瘤评定的结果

现在参考图3A，将短寿命细菌mp107静脉内注射内至小鼠的尾静脉中(7.5x10⁹cfu/kg小鼠)。在整个治疗期间(从第2天至第30天)，与PBS对照组的肿瘤生长相比，静脉内注射短寿命细菌使得肿瘤生长受到显著抑制。44.4％(9只小鼠中的4只小鼠)的经mp107处理的小鼠在第30天肿瘤得到治愈，这表明当以7.5x10⁹cfu/kg小鼠的单剂量全身性施用时，这些短寿命细菌可以有效治疗癌症。

小鼠中短寿命细菌的生物分布结果

在实验结束时，分析了经细菌处理的小鼠的细菌生物分布。在肿瘤或任何关键器官(包括肺、肝脏、脾脏、心脏或肾脏)中均未检测到短寿命细菌mp107，这表明这些短寿命细菌不会定殖在肿瘤组织或受试者中。由于肿瘤不含细菌，因此数据表明，静脉内注射这些短寿命细菌后观察到的肿瘤抑制是由比如免疫机制等间接机制引起的。

流式细胞术的结果

现在参考图3B和图3C，通过流式细胞术来分析瘤内淋巴细胞。数据显示，用短寿命细菌mp107处理的小鼠的肿瘤中的CD4+T细胞和CD8+T细胞与用对照细菌MG1655处理的小鼠的那些细胞相比，分别增加了19倍和12倍，这表明这些短寿命细菌在经处理的小鼠中引发T细胞应答。这些数据表明，表达异源蛋白ExlA的短寿命细菌mp107引发抗癌免疫性，从而抑制肿瘤生长。

这些数据表明，表达某些抗原的短寿命细菌也可以用作针对比如癌症等疾病的发展的疫苗。

实例5

材料和方法

(3)构建短寿命细菌的方法

毒力基因的缺失或突变

为了进一步改善使用短寿命细菌的安全性，可以通过额外的基因修饰来进一步减弱短寿命细菌的毒力。在该示例实施例中，针对细菌(大肠杆菌)菌株SH3的α溶血素进行编码的hlyCABD操纵子发生缺失或突变，以生成新的细菌菌株SH4。

在该示例实施例中，使用兰姆达(λ)-Red重组系统来使hlyCABD操纵子从大肠杆菌菌株SH3的细菌染色体中发生缺失。将两种引物用于产生缺失：

M-hly-F(正向)：

TTGGTTTGCTTTTTTTTACCTGCCACCGCAATGAATGCTTTTTTTAATAGGCGTATCACGAGGC(SEQID NO:36)

M-hly-R(反向)：

TTAACGCTCATGTAAACTTTCTGTTACAGACTCTTCCAGAGGACTTAGTGAACCTCTTCGAGGGAC(SEQ ID NO:37)

将M-hly-F和M-hly-R引物用于通过PCR来扩增氯霉素抗性盒。使用氯霉素抗性基因(cat)作为模板，通过PCR来扩增包含loxP-cat-loxP氯霉素抗性盒的DNA片段，所述氯霉素抗性盒与直接侧接hlyCABD操纵子的区域具有同源性(45nt)。将引物M-hly-F和M-hly-R用于该PCR。用质粒pSim6来转化细菌菌株SH3，在所述质粒上在42℃诱导λ重组蛋白的表达。通过电穿孔将上述PCR片段引入携带pSim6的SH3中。在诱导λ-red之后，针对氯霉素抗性选择重组体并且通过菌落PCR来验证所述重组体。然后根据制造商的说明书(基因桥公司(Gene Bridges)，德国)，使用705Cre方法来移除氯霉素抗性盒。简而言之，在37℃诱导转化体中来自质粒的Cre重组酶的表达，然后将细菌铺展在不含任何抗生素的LB琼脂上。在37℃过夜培养后，将单个菌落在LB琼脂和补充有氯霉素的LB琼脂两者上划线。选择在LB琼脂上生长但不在具有氯霉素的LB琼脂上生长的单个菌落。具有hlyCABD操纵子缺失和asd基因缺失两者但不具有loxp-cat-loxp盒的该突变株被命名为SH4。细菌菌株SH4于2021年5月18日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为22557。

实例6

(4)短寿命细菌用作医疗效应子的载体

通过基因克隆来构建表达细胞毒素和溶血素III部分片段的短寿命细菌

合成了编码铜绿假单胞菌的外溶素A的exlA基因(SEQ ID NO:41)以及编码溶血素III的hly III基因的部分DNA片段(SEQ ID NO:42)，并且根据制造商的说明书使用CloneEZ无缝克隆技术(金斯瑞公司)将其克隆在pBAD-DEST49质粒(美国英杰公司，目录号12283-016)中，以形成重组质粒pExlA2(图5)。通过测序分析来验证重组质粒pExlA2。随后将重组质粒pExlA2通过电穿孔分别引入细菌菌株SH4和SH3中，并且通过菌落PCR来进行验证。确认转化后，针对各细菌菌株来选择单个菌落。用重组质粒pExlA2转化的所得突变株SH4和SH3分别被命名为mp105和mp106。菌株mp105于2021年5月18日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为22555。菌株mp106于2021年5月18日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为22556。

实例7

溶血测定

将重组质粒pExlA2通过电穿孔引入对照细菌菌株MG1655中，并且通过菌落PCR来进行验证。确认转化后，选择单个菌落。用质粒pExlA2转化的所得MG1655被命名为MG1655/pExlA2。

将细菌菌株SH3、SH4，对照细菌菌株MG1655和MG1655/pExlA2的过夜培养物分别滴在补充有二氨基庚二酸(DAP，50μg/ml)和10％(v/v)兔血的LB琼脂上，然后在37℃温育8小时至10小时。在终点时，观察了对应细菌菌株的溶血能力。通过观察到琼脂变澄清而表明了由于红细胞破裂而导致的溶血。

实例8

对注射短寿命细菌后的安全性和抗癌功效的体内评定

将六至八周大的雌性C57BL/6J小鼠用于鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)的肿瘤植入。具体地，将LLC细胞系的1x10⁶个细胞皮下注射至每只小鼠的胁腹中。在细胞系植入后7天至12天，当肿瘤平均体积达到约50-200mm³时，将细菌菌株(mp105、mp106和/或mp107)分别静脉内注射(iv)至每只小鼠的尾静脉中或者对每只小鼠进行静脉内注射和瘤内注射的组合(iv+it)。以相同的方式注射PBS缓冲液以用作阴性对照。在细菌注射后第4天、第6天、第8天和第11天测量体重。在细菌注射后，每周使用数显卡尺来测量肿瘤大小2次至3次。

实例9

种属鉴定

将待鉴定的细菌从组织中分离并且通过继代培养来进行纯化。然后根据制造商的说明书，使用天根(Tiangen)基因组DNA试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司(TiangenBiotech,Beijing))从各细菌菌株中分离基因组DNA，并且通过16S核糖体DNA(rDNA)序列分析来确定种属鉴定。具体地，将基因组DNA用作模板，以使用引物27F和1492R来执行PCR扩增。然后对PCR产物进行测序并且在GenBank中进行BLAST比对(blasted)。

27F(正向)：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO:38)

1492R(反向)：

TACGGCTACCTTGTACGACTT(SEQ ID NO:39)

实例10

对短寿命细菌作为治疗性疫苗和预防性疫苗的评定

在该实例中，使用存在细菌感染的雌性C57BL/6J小鼠来证明并且评估mp105在减轻细菌感染方面的能力。根据实例9中所述的方法来分析从小鼠的器官(包括肝脏和肺)分离的细菌以进行种属鉴定。16S rDNA测序表明小鼠已经自然感染了鼠伤寒沙门氏菌。为了检查mp105是否可以治疗现有的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)感染和/或预防随后的细菌感染，对小鼠皮下注射两剂mp105(1x10⁸cfu/小鼠)或者PBS，间隔14天。注射后14天，以2x10⁷cfu/小鼠的剂量用致病性大肠杆菌菌株CFT073对小鼠进行攻击(challenge)，以建立额外的感染。攻击后5天，将小鼠安乐死，并且通过对菌落形成单位(CFU)的平板计数和对菌落的PCR验证来分析比如肝脏、肺、心脏、肾脏和脾脏等关键器官的细菌感染情况。由于鼠伤寒沙门氏菌菌株对hlyCABD操纵子呈阴性，而CFT073携带操纵子，因此PCR可以用于区分这两种类型的细菌。用于PCR的引物为hly-F和hly-R。

hly-F(正向)：

ACTCAGCAGGACAAAGCACG(SEQ ID NO:5)

hly-R(反向)：

GAGGCCAATGAGTTTCTCTG(SEQ ID NO:6)。

结果

实例11

减毒的短寿命细菌的构建结果

根据实例5中所述的方法来制备具有hlyCABD操纵子从SH3的染色体中的基因缺失的突变株并且将其命名为SH4。针对α溶血素进行编码的hlyCABD操纵子的缺失可以改善使用SH4作为用于比如癌症疗法和针对微生物感染的疫苗等多种应用的短寿命细菌的实例的安全性。

实例12

表达细胞毒素的减毒的短寿命细菌的构建结果

根据实例6中所述的方法，将从实例5获得的短寿命细菌SH4和从实例2获得的SH3分别用表达细胞毒素、铜绿假单胞菌的外溶素A(SEQ ID NO:41)以及编码溶血素III的hlyIII基因的部分DNA片段(SEQ ID NO:42)的质粒来进行进一步转化。包含oxb 18启动子、pelB前导序列、铜绿假单胞菌PA7的exlA基因、溶血素III编码基因的部分DNA片段以及终止子(rrnB转录终止区)的序列如SEQ ID NO:40所示且被克隆至质粒pBAD-DEST49中，以形成重组质粒pExlA2。用重组质粒pExlA2转化的所得突变株SH4和SH3分别被命名为mp105和mp106。

实例13

溶血测定的结果

现在参考图6A，结果显示，在针对α溶血素进行编码的hlyCABD操纵子从SH3的基因组中发生缺失后，SH4失去了引起溶血的能力，这表明SH4缺乏产生α溶血素的能力。相比之下，SH3仍维持引起溶血的能力。

现在参考图6B，溶血测定结果显示，MG1655和MG1655/pExlA2两者均未引起溶血。结果表明，尽管存在溶血素III编码基因的部分DNA片段，但并未从质粒中产生溶血素III。令人惊讶的是，对肿瘤疗法的体内评定的结果(如下文实例15中详细所示)表明该片段的表达增强了抗癌功效。

综上所述，由于mp105是从用pExlA2转化的SH4获得的，示例短寿命细菌mp105也缺乏生产溶血素的能力，因此推测该短寿命细菌在受试者身体内用于比如癌症疗法等多种应用时更安全。

实例14

对注射短寿命细菌后的安全性和抗癌功效的体内评定的结果

现在参考图7，建立了同基因鼠癌症模型，在所述模型中小鼠携带由Lewis肺癌细胞(LLC)形成的皮下肿瘤。根据实例8中所述的方法，示出分别用细菌mp105、mp106和mp107处理的每只小鼠的体重减轻百分比变化。以2x10⁸cfu/小鼠的剂量静脉内注射各细菌菌株。一般来说，尽管所有用细菌处理的小鼠在静脉内注射后体重均一定程度上减轻，但经mp105处理的小鼠减轻的体重显著少于用mp106或mp107处理的小鼠。尤其地，在经mp105处理的小鼠与经mp106处理的小鼠之间，第4天和第8天的体重减轻差异达到了统计学显著性(独立t检验，P<0.05)。这些结果进一步表明，由于至少缺失了hlyCABD操纵子，因此与mp106或mp107相比，示例短寿命细菌mp105具有更好的抗癌功效，并且在受试者身体内进行体内使用时更安全。

实例15

对由短寿命细菌所介导的肿瘤疗法的体内评定的结果

现在参考图8，根据实例8中所述的方法比较了mp105、mp106和mp107的抗癌功效。体内数据显示，mp106的肿瘤体积的增长显著慢于mp107的肿瘤体积的增长，尤其是在治疗后第21天，这表明与mp107相比，mp106在抗癌功效方面显示出适度的改善。这些结果表明，与pExlA相比，pExlA2赋予细菌甚至更优的抗癌能力。令人惊讶的是，mp105在抑制肿瘤生长方面显著优于mp106(p＝0.04)和mp107(p＝0.031)两者。实验结束时，37.5％的经mp105处理的小鼠的肿瘤得到治愈。经mp106处理的组和经mp107处理的组的治愈率分别为12.5％和11.1％，低于经mp105处理的小鼠的治愈率。这些结果共同表明，与mp106和mp107相比，示例短寿命细菌mp105不仅更安全，而且针对癌症甚至更有效。

实例16

对通过不同途径施用的短寿命细菌所介导的抗癌功效的体内评定的结果

现在参考图9，根据实例8中所述的方法比较了mp105的不同施用途径。将癌症疗法中mp105的瘤内注射和静脉内注射的组合与单独静脉内注射进行了比较。瘤内注射和静脉内注射的剂量分别为7.5x10⁷cfu/小鼠和3x10⁷cfu/小鼠。图9示出，与仅进行mp105的静脉内注射(iv)的小鼠相比，携带皮下LLC肿瘤并且进行mp105的静脉内注射和瘤内注射的组合(iv+it)的小鼠在治疗后第12天肿瘤体积的降幅令人惊讶。结果表明，与单独静脉内注射相比，两种施用途径(即静脉内注射和瘤内注射)的组合显著改善示例短寿命细菌mp105的抗癌功效。这表明，对于临床应用，可以将示例短寿命细菌mp105直接注射至原发性癌症病灶中，并且同时进行静脉内注射以控制转移性病灶。

实例17

对短寿命细菌作为治疗性疫苗和预防性疫苗的评定的结果

现在参考图10A和图10B，评定了示例短寿命细菌mp105用作针对微生物感染的疫苗的能力。mp105为由具有多种毒力因子和抗原的B2型大肠杆菌基因工程改造而来的短寿命细菌，其在先前实例中已经显示出具有高免疫原性。这连同exlA的异源表达，以及由于hlyCABD缺失而引起的进一步减毒，使mp105可以用作受试者身体内的安全活疫苗。图10A和图10B中的结果表明，两剂mp105的皮下注射显著减少了所测试的关键器官(包括肝脏和肺)中的鼠伤寒沙门氏菌。与PBS相比，mp105使鼠伤寒沙门氏菌在肝脏中的数量减少了73.6％(图10A)，并且在肺中的数量减少了64.6％(图10B)。这表明示例短寿命细菌mp105作为针对现有细菌感染的有效治疗性疫苗发挥作用。此外，在一只经PBS处理小鼠的肝脏中(100CFU/10mg肝脏组织)、在一只经PBS处理小鼠的心脏中(3CFU/10mg心脏组织)和一只经PBS处理的小鼠的肺中(15CFU/10mg肝脏组织)检测到CFT073。换句话说，50％的经PBS处理小鼠被CFT073感染。相反，在经mp105处理的组中的任何小鼠中均未检测到CFT073(卡方检验，P＝0.046)。这表明示例短寿命细菌mp105也可以作为针对潜在细菌感染的预防性疫苗发挥作用。

本披露内容的示例性实施例由此得到了充分描述。尽管描述参考了特定的实施例，但是本领域的技术人员将会清楚，本发明可以通过这些具体细节的变化来实施。因此，本披露内容不应被解释为局限于本文阐述的实施例。

例如，很明显，可用于治疗受试者的疾病或病症的医疗效应子可以为所选择的细菌菌株的内在效应子。这些医疗效应子可能会根据基因修饰的特定设计而被过表达或被抑制。也可以使用衍生自其他菌株或来源的医疗效应子的异源表达。

例如，必需基因天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)从染色体的基因缺失如上所述，但其他必需基因或营养缺陷型基因也可以发生缺失或突变以产生短寿命细菌。这些必需基因可以为但不限于asd、csrA、thyA、dapA、dapB、ribF、ispH、folA、ftsL、murE、mraY、lpxC、secA、can、heml、map、rpsB和tsf。可以根据所涉及的相关基因来设计适当的引物序列。

例如，如上所述的从染色体的基因缺失是通过兰姆达(λ)-Red重组系统完成的，但也可以使用比如限制性内切酶克隆等本领域已知的其他基因修饰技术。

例如，如上文所用的细菌菌株为大肠杆菌菌株，但也可以使用包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在内的其他细菌菌株。实例包括但不限于芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、李斯特菌属。也可以使用比如拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、乳杆菌属和乳球菌属等其他细菌。

例如，如上所述的基因修饰为基因缺失，但也可以使用比如基因突变等其他基因修饰。可以引入两种或更多种基因修饰以产生短寿命细菌。

例如，上述调节效应子为DAP。然而，根据所采用的相关基因修饰，可以使用其他调节效应子。在某些实施例中，调节效应子为无毒的并且可以在受试者中安全使用。

例如，细胞毒素ExlA的表达的示例实施例如上所述，但也可以使用异源表达具有治疗效果的其他蛋白质或细胞毒素的短寿命细菌的其他构建。其他蛋白质可以为抗癌效应子或其可用于癌症疗法的组合。示例抗癌效应子可以为但不限于选自由以下组成的组的一种或多种基因的表达：铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)、蜡样芽孢杆菌的非溶血性肠毒素(Nhe)、溶血素和幽门螺杆菌的空泡毒素。

例如，来自铜绿假单胞菌的ExlA在大肠杆菌中的异源表达的示例实施例如上所述，但也可以使用其他医疗效应子的一种或多种同源基因或异源基因的表达。

例如，组成型启动子oxb18如上所述，但医疗效应子的表达可以由其他组成型启动子或诱导型启动子来进行驱动。示例诱导型启动子可以能够根据比如缺氧或低葡萄糖条件等肿瘤特异性微环境来进行诱导。

例如，可以将其他适当的前导序列和终止区或者其他序列或基序引入医疗效应子基因序列，以改善蛋白质在细菌中的表达。

例如，如上所述的基因exlA在质粒pBAD中进行表达，但也可以使用其他合适的质粒，并且可以将基因并入染色体中而不是在质粒中进行表达。医疗效应子基因可以在质粒中进行表达，但如果将所述基因插入细菌染色体中，则所述医疗效应子基因也可以进行染色体表达。

例如，上述示例实施例中的比如SH3、SH4、mp107、mp105和mp106等短寿命细菌可用于治疗受试者的疾病或病症。然而，短寿命细菌也可以用作用于预防癌症或传染病的疫苗，或可用于诊断。

例如，用于治疗癌症的短寿命细菌的基因表达可以为其他医疗效应子或比如CpG、环状二核苷酸、抗原等抗癌因子，或者比如蜡样芽孢杆菌的非溶血性肠毒素(Nhe)、溶血素和幽门螺杆菌的空泡毒素等其他细胞毒素，或者这些抗癌因子的组合。

序列表

<110> 新实有限公司（New Portal Limited）

<120> 基因工程活细菌及其构建方法

<130> N026.004.PCTCN

<150> PCT/CN2020/100695

<151> 2020-07-07

<160> 42

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(64)

<223> Asd-F引物

<400> 1

tcacttgcga ctttggctgc tttttgtatg gtgaaagatg tgccaaatag gcgtatcacg 60

aggc 64

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(66)

<223> Asd-R引物

<400> 2

gcactagcag gggcggcatc gcgccccaga tttaatgaat aaagatagtg aacctcttcg 60

agggac 66

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> asd-F2

<400> 3

taggtttccg agcggatcca 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(21)

<223> Cm-R3（反向）

<400> 4

cctcttacgt gccgatcaac g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> hly操纵子-F

<400> 5

actcagcagg acaaagcacg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> hly操纵子-R

<400> 6

gaggccaatg agtttctctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> vat-F

<400> 7

gaactagccc gaagggtatg 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(23)

<223> vat-R

<400> 8

tggagatcag atgaactgtg ttc 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> pks-左-F

<400> 9

aatcaaccca gctgcaaatc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> pks-左-R

<400> 10

cacccccatc attaaaaacg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> pks-右-F

<400> 11

agccgtatcc tgctcaaaac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> pks-右-R

<400> 12

tcggtatgtc cggttaaagc 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(22)

<223> papG-F

<400> 13

gcgctaataa tcattatgcg gc 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(21)

<223> papG-R

<400> 14

caatatcatg agcagcgttg c 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(22)

<223> sat-F

<400> 15

ggataaggac tttaatccgc tg 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(21)

<223> sat-R

<400> 16

ttgatcgcgt tatccacgtt g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> fyrA-F

<400> 17

tgacacggct ttatcctctg 20

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(19)

<223> fyrA-R

<400> 18

gttgttggct gatgccgag 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> iutA-F

<400> 19

aagctggaag gcgtgaaagt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> iutA-R

<400> 20

taacccgggc tgtagtacag 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(22)

<223> yfcV-F

<400> 21

gagtaagttt gccaaaacag cc 22

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(21)

<223> yfcV-R

<400> 22

ctggaaatct ttcggtgtgg t 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> chuA-F

<400> 23

gacgaaccaa cggtcaggat 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> chuA-R

<400> 24

tgccgccagt accaaagaca 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> yjaA-F

<400> 25

tgaagtgtca ggagacgctg 20

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(21)

<223> yjaA-R

<400> 26

atggagaatg cgttcctcaa c 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> TspE4C2-F

<400> 27

gagtaatgtc ggggcattca 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> TspE4C2-R

<400> 28

cgcgccaaca aagtattacg 20

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(23)

<223> sfa-F

<400> 29

ccctcgtgga gcctttttta tat 23

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(21)

<223> sfa-R

<400> 30

cactgttaac ctcttctggt c 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> iutA-F

<400> 31

aagctggaag gcgtgaaagt 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> iutA-R

<400> 32

taacccgggc tgtagtacag 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> oxb-F

<400> 33

ctgttgtgac cgcttgctct 20

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> .

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(21)

<223> exlA-R

<400> 34

gaggtggaag acaggattgt c 21

<210> 35

<211> 5567

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(286)

<223> OXB18启动子和核糖体结合位点

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (287)..(352)

<223> 起始密码子ATG，接着是pelB前导序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (353)..(5387)

<223> 不具有起始密码子的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PA7的exlA基因

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5388)..(5545)

<223> rrnB转录终止区

<400> 35

atctaagctg ttgtgaccgc ttgctctagc cagctatcga gttgtgaacc gatccatcta 60

gcaattggtc tcgatctagc gataggcttc gatctagcta tgtagaaacg ccgtgtgctc 120

gatcgcttta taaggtccac agtagctgct ataattgctt caacagaaca tattgactat 180

ccggtattac ccggcagatc tttgtcgatc ctaccatcca ctcgacacac ccgccagcgg 240

ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaattc aaaggaggta cccaccatga aatacctgct 300

gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag ccggcgatgg cccatagaga 360

caatcctgtc ttccacctct ccccccgggg aaaactccgt tgcctgatcg ccggcctgct 420

gctggcgccc cacctgcccc aggctttcgc cggcgggctg gaggcggccg gcgggccggg 480

cggcacgccg caactgctca accagggcgg cgtgcccatc gtcaatatcg tcgcgccgaa 540

cgccgccggc ctgtcgcaca accagttcct cgactacaac gtcgaccgcc agggcctggt 600

cctcaacaat gcgctgcaag ccggcgcctc gcagctcgcc ggacaactgg cggccaaccc 660

gcagctgcgc ggcgacgccg ccagtgccat cctcaacgaa gtgatcagcc gcaacgcctc 720

ggcgatcaac ggcccgcagg aaatcttcgg ccaggccgcc gactacatcc tggccaaccc 780

caacggcatc tcggtgaacg gcggcagctt catcaacacg ccccatgcca gcctgctggt 840

cggccgtccg gaactggccg acggcaagct gcaggcgctg aacaccaacg acgccgtcgg 900

cgccctgcag atccagggcc agggcctgag caaccgggat ggcagcatcg ccctgctggc 960

gccgcgagtc gacagccaag gcaagatcga ggcgtcggcc gagctcgacc tgaccgtcgg 1020

tcgcaaccgc atcgactacc cgagcggcaa ggtcgagcgc gacccgtccg gcgacgtccg 1080

tccgggcgag cggcgcatcg acgccagcct gttcggcgcc atgcaggccg gacgcatcaa 1140

catcctcagc accgccgagg gcgccggcgt gcgcgtcggc ccggtcggga tcgacggcag 1200

ggacggcgtc gacctgcgct ccgccggcga cctgtcgatc agcggccagg cgcttcccga 1260

caacagcctg aacgccttgc gcgcggcgat ccgcagcgac agcggcaacg tcggcctgca 1320

tgcccgcggc gacctgagcc tggccgccgc cgacgtcagc ggcggcaggg tcgacctcaa 1380

gtccgggcgc aacctgaccc tgggcagcgt ggaaagccgc aacctgcggg aaagccgcga 1440

gcgctggagc aacagcacca tcggcatcac ctgggaaacc tacgaccgca cgcgtaccgt 1500

caccgattcg aagcagcacg gcagccggat cgatgcccgc gccgacgcga gcctggccgc 1560

gcggggcgac agcgaactga gggcggcgac ggtcaaggcc ggcgctaccc tgaaagtctc 1620

cagcggcggc gatacccgtc ttctcgccgc caccgagacc cgcaccgaac gcgaccaggg 1680

cgcgcaccgc aagcacctgt ggaaagccaa ctgggacaag ggcagcagcg agcaacgcag 1740

cgtggccagc agcctcgaag gcgcgcgggt cgaactcggc ggcggccggc gcctgaatct 1800

ggaaggcgcc gacgtggcca gccgcggcga cctcgacctg caagccaaga gcgtcgacat 1860

cggcagcgcc agccgcagcc acagcagccg cgacaacagc tactccggcg acctggtcgg 1920

cggcagcttc ttcggcagcc acggcgatgg cgacagcggc aagaccctgc aacagggcag 1980

ccgggtcaag gccgacggcg cactgacggt gaccgccgat gcggtcgagg tgcgcggcag 2040

ccaggtacgc ggcgcgcgca aggccgaggt agtcagcggg aaaggctcgc tgcgcatcga 2100

cggcgtggag gaaaccgccc acagcaacag ctacagcaag gacagcaagt tcttcggcat 2160

cgccaaggac gagagtcgcc agcgcagcaa ggacagcagc aaccgcgcca gcgaagtacg 2220

ctcggacagc aacctgaccc tgcgcagcgc cgccgacatc gccattcgcg gctcccgggt 2280

cgaggctggc ggcgccctcg ccgccgaggc caagggcaac ctggagatag cctcggcgca 2340

ggagcgccac gacggcaacg acagccgcca cacccgcggc ttcgacgcct atgccggcga 2400

gcagacccca ggcagccgcc aataccgcgc cggggtgcgc taccaggacc agcggaccag 2460

cgtccgccgc gaggaaaccc gcaacagcgg ctccagcctg ggcggcgcct ccctggccgt 2520

gaaggccggc ggcgatctca ccgtgaaggg ggccgagctg aaggccagcg cgggcgacgc 2580

cagcctctcc gggaagaacg tcgccctgct cgccgagcag gacagcaaga cccgcagcag 2640

cgaacagacc accaccggcg gcggcttcta ctataccggc ggcctggacc gtgccggcag 2700

cggtatcgaa gtcggccacc agcggatcga cgagaacgac gccgaaagcc atgcgcgcac 2760

cagccaggtg aacgcgacgg gcaatctcag gatcgacgcc gcccagggca gcctgacgac 2820

gcagggcgcg cgcctggagg ccggcgacag cctggcggtc gccgccggca cggtcgacaa 2880

ccaggccgcc cgcgacagcc agagcagcca gcgccacgac agcggctgga gcggcgacat 2940

cggcgccaac ctcgagtacc gcggcatcgc ccggccgatc gagaaggcgg tcgaaggcgt 3000

cgcccagcgc aaggtccacc agcccggcct gctcgacaac ctggagcagc cgaacgtcgg 3060

cgtcgacctc gagatcagcc accgcgacag ccgcggcgag caacaggcga gccaggcgca 3120

ggtcagcagc ttcgcgggcg gccaggtcga actgaaggtc ggcgacgccc tgcgggacga 3180

gggcacccgt taccaggctc gcagcggagg cctcctcatc gacgccgcca ggcatgacgc 3240

cagggcggcg gagaacacct ccggcagcca tgagcagagc ctcgacgcca aggtcggcgg 3300

gcgcctctac accaccaccg gccaggacct gaacctgcgc ctgagcggca ttggcggcag 3360

cagcgagaac agcgccagcc agaccaccgc ggtggtcggc gaatacgccg cgaagcaggg 3420

cgtcgagatc cgcctcggcg gagacggcct ctaccagggc agccgcttcg acggcggcga 3480

agccggggtc aggctcagcg ccggcggcaa cctggccctg gaacaggcca acgaccggca 3540

gagcgccagc agcgccagcc tgcgtggcga cgccgcgttg agcggcggca tggcccccag 3600

cgccaacggc aaagggctga acgccagcgc cggcctgcaa ctcgaccaca aggccggcga 3660

cagccgggac agccaggcgc gggtcgccga catccaggcc aagggcgcgg tggagctgcg 3720

cagcggcggc gatctggtcc tgcaaggcag caatatcggc agcgcggcag cgaagaccgg 3780

cgacatagtc ctggccgccg gcggcaagct cgacctgcag gccgcccgcg atagccaccg 3840

ggccggggga aacaacctcg gcggcggctt cagcctaggc ggcggcagcg ttcgcgacgc 3900

cgaaacgagc agcaagaacg gcagcgtcag cggcaacttc aacatcggcc gggtcgacga 3960

ggaacgtcac gcgctgaacg gcggcaacct gcacagcgcg accaaggcca gcctttccag 4020

cgccgcagac gacgccaccg cggtacgcct gcaaggcact cgcatcgaag ccgcccaggt 4080

cagcctcgaa gccggcaacg gcggcattct ccaggagtcc gccgaatcca gcgagcggcg 4140

cgacaactgg ggcgtgctgc tcggtgccgg ggccaacggc ggcaagacca ccggcgcgcc 4200

gagcgactac cggagcgact atgccgtcca ggcccgcgcc aaggtcgatg tcgatgtcct 4260

gcgcagccag acccagggcg acagcgtcat ccaggccgac cgggtaatcc tggcgagcca 4320

gggcgacacc cgcctggagg gcgcgcgcat cgacgcggca caggtggacg ggcgcatcgg 4380

cggcgacctg cgggtggaga gccgccagga ccgcgcggag ggcgtgaagg tcaacgtcga 4440

cgcgcgcctg ggcgtggaga agaaccagcc cggcctggtg aacaagctgg cgagcaagac 4500

cggaccgttg aaggacaagc tggaaaccaa ggccgagaat gctttcgaca agcaccgcgg 4560

caagttggag aacggcatcg accgtaatgt cgagcggctc ggcaaggccg gggacaacct 4620

cctcgccaaa gccgaaaagg ccaaggagcg cctgggcgag aagctggtcc gcagcggcag 4680

ctacgaggtc aacccggagc cgcgcggcgc cttcgccagc aagctggaca gggccagggg 4740

ctatctggcg gagaaaggcg aagcgctcgg cgaccggctg tccggcctca agcagcgcct 4800

gtcgccgaac aagaccggta gctatgtggt gaacgacaag cagacggccg gcgccaaggt 4860

cggcaatgcc gccgagaacg tgctgttcgg cgacaagagc ggcgaagcct cggtaacccc 4920

gacgctgtac ctggacgtca gccacgtcag ccgcaactac gtcaccgagg cctccggcat 4980

caccggcagg cagggcgtga acctgcaggt gggcgcagcg acccagctga ccggcgcacg 5040

gatcagcgcc agcgacggca aggtcgacct cggcggctcg cgcgtggaaa cccgcgccct 5100

ggccggcaag gactaccgcg ccgatctcgg cctgaacgtc tccaggtcgc cggtggacct 5160

ggccttcggt atcaaggacg agttcagcca ggagcacgac caggcgaccc gcgacgacca 5220

ggccttcaac ctcggcgccc tgcgcgtcgg cggacgcaac cgcgaccagc agttgcaggc 5280

cggcatcgag cagaaggccg actaatgagt ttaaacggtc tccagcttag gtaacagcct 5340

gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag 5400

tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga 5460

tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa 5520

aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcg 5567

<210> 36

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(64)

<223> M-hly-F

<400> 36

ttggtttgct tttttttacc tgccaccgca atgaatgctt tttttaatag gcgtatcacg 60

aggc 64

<210> 37

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(66)

<223> M-hly-R

<400> 37

ttaacgctca tgtaaacttt ctgttacaga ctcttccaga ggacttagtg aacctcttcg 60

agggac 66

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(20)

<223> 27F

<400> 38

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(21)

<223> 1492R

<400> 39

tacggctacc ttgtacgact t 21

<210> 40

<211> 6305

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(286)

<223> OXB18启动子和核糖体结合位点

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (287)..(352)

<223> 起始密码子ATG，接着是pelB前导序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (353)..(5355)

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5356)..(5421)

<223> 起始密码子ATG，接着是pelB前导序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (5422)..(6125)

<223> 不具有起始密码子的溶血素III编码基因的部分DNA片段

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (6126)..(6305)

<223> rrnB转录终止区

<400> 40

atctaagctg ttgtgaccgc ttgctctagc cagctatcga gttgtgaacc gatccatcta 60

gcaattggtc tcgatctagc gataggcttc gatctagcta tgtagaaacg ccgtgtgctc 120

gatcgcttta taaggtccac agtagctgct ataattgctt caacagaaca tattgactat 180

ccggtattac ccggcagatc tttgtcgatc ctaccatcca ctcgacacac ccgccagcgg 240

ccgctgccaa gcttccgagc tctcgaattc aaaggaggta cccaccatga aatacctgct 300

gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag ccggcgatgg cccatagaga 360

caatcctgtc ttccacctct ccccccgggg aaaactccgt tgcctgatcg ccggcctgct 420

gctggcgccc cacctgcccc aggctttcgc cggcgggctg gaggcggccg gcgggccggg 480

cggcacgccg caactgctca accagggcgg cgtgcccatc gtcaatatcg tcgcgccgaa 540

cgccgccggc ctgtcgcaca accagttcct cgactacaac gtcgaccgcc agggcctggt 600

cctcaacaat gcgctgcaag ccggcgcctc gcagctcgcc ggacaactgg cggccaaccc 660

gcagctgcgc ggcgacgccg ccagtgccat cctcaacgaa gtgatcagcc gcaacgcctc 720

ggcgatcaac ggcccgcagg aaatcttcgg ccaggccgcc gactacatcc tggccaaccc 780

caacggcatc tcggtgaacg gcggcagctt catcaacacg ccccatgcca gcctgctggt 840

cggccgtccg gaactggccg acggcaagct gcaggcgctg aacaccaacg acgccgtcgg 900

cgccctgcag atccagggcc agggcctgag caaccgggat ggcagcatcg ccctgctggc 960

gccgcgagtc gacagccaag gcaagatcga ggcgtcggcc gagctcgacc tgaccgtcgg 1020

tcgcaaccgc atcgactacc cgagcggcaa ggtcgagcgc gacccgtccg gcgacgtccg 1080

tccgggcgag cggcgcatcg acgccagcct gttcggcgcc atgcaggccg gacgcatcaa 1140

catcctcagc accgccgagg gcgccggcgt gcgcgtcggc ccggtcggga tcgacggcag 1200

ggacggcgtc gacctgcgct ccgccggcga cctgtcgatc agcggccagg cgcttcccga 1260

caacagcctg aacgccttgc gcgcggcgat ccgcagcgac agcggcaacg tcggcctgca 1320

tgcccgcggc gacctgagcc tggccgccgc cgacgtcagc ggcggcaggg tcgacctcaa 1380

gtccgggcgc aacctgaccc tgggcagcgt ggaaagccgc aacctgcggg aaagccgcga 1440

gcgctggagc aacagcacca tcggcatcac ctgggaaacc tacgaccgca cgcgtaccgt 1500

caccgattcg aagcagcacg gcagccggat cgatgcccgc gccgacgcga gcctggccgc 1560

gcggggcgac agcgaactga gggcggcgac ggtcaaggcc ggcgctaccc tgaaagtctc 1620

cagcggcggc gatacccgtc ttctcgccgc caccgagacc cgcaccgaac gcgaccaggg 1680

cgcgcaccgc aagcacctgt ggaaagccaa ctgggacaag ggcagcagcg agcaacgcag 1740

cgtggccagc agcctcgaag gcgcgcgggt cgaactcggc ggcggccggc gcctgaatct 1800

ggaaggcgcc gacgtggcca gccgcggcga cctcgacctg caagccaaga gcgtcgacat 1860

cggcagcgcc agccgcagcc acagcagccg cgacaacagc tactccggcg acctggtcgg 1920

cggcagcttc ttcggcagcc acggcgatgg cgacagcggc aagaccctgc aacagggcag 1980

ccgggtcaag gccgacggcg cactgacggt gaccgccgat gcggtcgagg tgcgcggcag 2040

ccaggtacgc ggcgcgcgca aggccgaggt agtcagcggg aaaggctcgc tgcgcatcga 2100

cggcgtggag gaaaccgccc acagcaacag ctacagcaag gacagcaagt tcttcggcat 2160

cgccaaggac gagagtcgcc agcgcagcaa ggacagcagc aaccgcgcca gcgaagtacg 2220

ctcggacagc aacctgaccc tgcgcagcgc cgccgacatc gccattcgcg gctcccgggt 2280

cgaggctggc ggcgccctcg ccgccgaggc caagggcaac ctggagatag cctcggcgca 2340

ggagcgccac gacggcaacg acagccgcca cacccgcggc ttcgacgcct atgccggcga 2400

gcagacccca ggcagccgcc aataccgcgc cggggtgcgc taccaggacc agcggaccag 2460

cgtccgccgc gaggaaaccc gcaacagcgg ctccagcctg ggcggcgcct ccctggccgt 2520

gaaggccggc ggcgatctca ccgtgaaggg ggccgagctg aaggccagcg cgggcgacgc 2580

cagcctctcc gggaagaacg tcgccctgct cgccgagcag gacagcaaga cccgcagcag 2640

cgaacagacc accaccggcg gcggcttcta ctataccggc ggcctggacc gtgccggcag 2700

cggtatcgaa gtcggccacc agcggatcga cgagaacgac gccgaaagcc atgcgcgcac 2760

cagccaggtg aacgcgacgg gcaatctcag gatcgacgcc gcccagggca gcctgacgac 2820

gcagggcgcg cgcctggagg ccggcgacag cctggcggtc gccgccggca cggtcgacaa 2880

ccaggccgcc cgcgacagcc agagcagcca gcgccacgac agcggctgga gcggcgacat 2940

cggcgccaac ctcgagtacc gcggcatcgc ccggccgatc gagaaggcgg tcgaaggcgt 3000

cgcccagcgc aaggtccacc agcccggcct gctcgacaac ctggagcagc cgaacgtcgg 3060

cgtcgacctc gagatcagcc accgcgacag ccgcggcgag caacaggcga gccaggcgca 3120

ggtcagcagc ttcgcgggcg gccaggtcga actgaaggtc ggcgacgccc tgcgggacga 3180

gggcacccgt taccaggctc gcagcggagg cctcctcatc gacgccgcca ggcatgacgc 3240

cagggcggcg gagaacacct ccggcagcca tgagcagagc ctcgacgcca aggtcggcgg 3300

gcgcctctac accaccaccg gccaggacct gaacctgcgc ctgagcggca ttggcggcag 3360

cagcgagaac agcgccagcc agaccaccgc ggtggtcggc gaatacgccg cgaagcaggg 3420

cgtcgagatc cgcctcggcg gagacggcct ctaccagggc agccgcttcg acggcggcga 3480

agccggggtc aggctcagcg ccggcggcaa cctggccctg gaacaggcca acgaccggca 3540

gagcgccagc agcgccagcc tgcgtggcga cgccgcgttg agcggcggca tggcccccag 3600

cgccaacggc aaagggctga acgccagcgc cggcctgcaa ctcgaccaca aggccggcga 3660

cagccgggac agccaggcgc gggtcgccga catccaggcc aagggcgcgg tggagctgcg 3720

cagcggcggc gatctggtcc tgcaaggcag caatatcggc agcgcggcag cgaagaccgg 3780

cgacatagtc ctggccgccg gcggcaagct cgacctgcag gccgcccgcg atagccaccg 3840

ggccggggga aacaacctcg gcggcggctt cagcctaggc ggcggcagcg ttcgcgacgc 3900

cgaaacgagc agcaagaacg gcagcgtcag cggcaacttc aacatcggcc gggtcgacga 3960

ggaacgtcac gcgctgaacg gcggcaacct gcacagcgcg accaaggcca gcctttccag 4020

cgccgcagac gacgccaccg cggtacgcct gcaaggcact cgcatcgaag ccgcccaggt 4080

cagcctcgaa gccggcaacg gcggcattct ccaggagtcc gccgaatcca gcgagcggcg 4140

cgacaactgg ggcgtgctgc tcggtgccgg ggccaacggc ggcaagacca ccggcgcgcc 4200

gagcgactac cggagcgact atgccgtcca ggcccgcgcc aaggtcgatg tcgatgtcct 4260

gcgcagccag acccagggcg acagcgtcat ccaggccgac cgggtaatcc tggcgagcca 4320

gggcgacacc cgcctggagg gcgcgcgcat cgacgcggca caggtggacg ggcgcatcgg 4380

cggcgacctg cgggtggaga gccgccagga ccgcgcggag ggcgtgaagg tcaacgtcga 4440

cgcgcgcctg ggcgtggaga agaaccagcc cggcctggtg aacaagctgg cgagcaagac 4500

cggaccgttg aaggacaagc tggaaaccaa ggccgagaat gctttcgaca agcaccgcgg 4560

caagttggag aacggcatcg accgtaatgt cgagcggctc ggcaaggccg gggacaacct 4620

cctcgccaaa gccgaaaagg ccaaggagcg cctgggcgag aagctggtcc gcagcggcag 4680

ctacgaggtc aacccggagc cgcgcggcgc cttcgccagc aagctggaca gggccagggg 4740

ctatctggcg gagaaaggcg aagcgctcgg cgaccggctg tccggcctca agcagcgcct 4800

gtcgccgaac aagaccggta gctatgtggt gaacgacaag cagacggccg gcgccaaggt 4860

cggcaatgcc gccgagaacg tgctgttcgg cgacaagagc ggcgaagcct cggtaacccc 4920

gacgctgtac ctggacgtca gccacgtcag ccgcaactac gtcaccgagg cctccggcat 4980

caccggcagg cagggcgtga acctgcaggt gggcgcagcg acccagctga ccggcgcacg 5040

gatcagcgcc agcgacggca aggtcgacct cggcggctcg cgcgtggaaa cccgcgccct 5100

ggccggcaag gactaccgcg ccgatctcgg cctgaacgtc tccaggtcgc cggtggacct 5160

ggccttcggt atcaaggacg agttcagcca ggagcacgac caggcgaccc gcgacgacca 5220

ggccttcaac ctcggcgccc tgcgcgtcgg cggacgcaac cgcgaccagc agttgcaggc 5280

cggcatcgag cagaaggccg actaatgagt ttaaacggtc tccagcttag attttcagga 5340

gctaaggaag ctaaaatgaa atacctgctg ccgaccgctg ctgctggtct gctgctcctc 5400

gctgcccagc cggcgatggc caatacttat gtaagggaac cagttaatgc atttactcac 5460

ttaggtggag cgatattatc atttattgcg ttattagcta tgcttgtgaa agtttctatc 5520

aagatgccat catttgctgc aattacagct gttattttgt ttggtattgg aatgatggtc 5580

ctttatacgg cgtcagctgt atatcatagt gttgtggcca atgaacgtgt tatatacttc 5640

tttaggaagc tagatcattc tatgattttt atattaattg caggtacata tgcacccttt 5700

tgcttaatta cattaaattc agcaagtggt ttgctattat tttgtttagt ctatgcaact 5760

gcgatttgtg gcattgtatt taaaatgttt tggtttaatt gtccaaggtg gttatcgaca 5820

gcaatttata ttacgatggg ttggttaatt gttttattct ttgcaccgtt agctgagaat 5880

ttaagtacag gaggcattat tttcttagta cttggtggca ttttttatac aattggtgga 5940

tttatttatg gaacaaagcc aaaatggtta gagtttaaat atatggggca tcatgaaatt 6000

tttcatgttt ttgtattatt aggtagtctt gcgcattttc taagtgtata ttgttacgta 6060

atttaaaggt aacagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca 6120

gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt 6180

gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca 6240

ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt 6300

tgtcg 6305

<210> 41

<211> 5019

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(66)

<223> 起始密码子ATG，接着是pelB前导序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (67)..(5019)

<400> 41

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggcccata gagacaatcc tgtcttccac ctctcccccc ggggaaaact ccgttgcctg 120

atcgccggcc tgctgctggc gccccacctg ccccaggctt tcgccggcgg gctggaggcg 180

gccggcgggc cgggcggcac gccgcaactg ctcaaccagg gcggcgtgcc catcgtcaat 240

atcgtcgcgc cgaacgccgc cggcctgtcg cacaaccagt tcctcgacta caacgtcgac 300

cgccagggcc tggtcctcaa caatgcgctg caagccggcg cctcgcagct cgccggacaa 360

ctggcggcca acccgcagct gcgcggcgac gccgccagtg ccatcctcaa cgaagtgatc 420

agccgcaacg cctcggcgat caacggcccg caggaaatct tcggccaggc cgccgactac 480

atcctggcca accccaacgg catctcggtg aacggcggca gcttcatcaa cacgccccat 540

gccagcctgc tggtcggccg tccggaactg gccgacggca agctgcaggc gctgaacacc 600

aacgacgccg tcggcgccct gcagatccag ggccagggcc tgagcaaccg ggatggcagc 660

atcgccctgc tggcgccgcg agtcgacagc caaggcaaga tcgaggcgtc ggccgagctc 720

gacctgaccg tcggtcgcaa ccgcatcgac tacccgagcg gcaaggtcga gcgcgacccg 780

tccggcgacg tccgtccggg cgagcggcgc atcgacgcca gcctgttcgg cgccatgcag 840

gccggacgca tcaacatcct cagcaccgcc gagggcgccg gcgtgcgcgt cggcccggtc 900

gggatcgacg gcagggacgg cgtcgacctg cgctccgccg gcgacctgtc gatcagcggc 960

caggcgcttc ccgacaacag cctgaacgcc ttgcgcgcgg cgatccgcag cgacagcggc 1020

aacgtcggcc tgcatgcccg cggcgacctg agcctggccg ccgccgacgt cagcggcggc 1080

agggtcgacc tcaagtccgg gcgcaacctg accctgggca gcgtggaaag ccgcaacctg 1140

cgggaaagcc gcgagcgctg gagcaacagc accatcggca tcacctggga aacctacgac 1200

cgcacgcgta ccgtcaccga ttcgaagcag cacggcagcc ggatcgatgc ccgcgccgac 1260

gcgagcctgg ccgcgcgggg cgacagcgaa ctgagggcgg cgacggtcaa ggccggcgct 1320

accctgaaag tctccagcgg cggcgatacc cgtcttctcg ccgccaccga gacccgcacc 1380

gaacgcgacc agggcgcgca ccgcaagcac ctgtggaaag ccaactggga caagggcagc 1440

agcgagcaac gcagcgtggc cagcagcctc gaaggcgcgc gggtcgaact cggcggcggc 1500

cggcgcctga atctggaagg cgccgacgtg gccagccgcg gcgacctcga cctgcaagcc 1560

aagagcgtcg acatcggcag cgccagccgc agccacagca gccgcgacaa cagctactcc 1620

ggcgacctgg tcggcggcag cttcttcggc agccacggcg atggcgacag cggcaagacc 1680

ctgcaacagg gcagccgggt caaggccgac ggcgcactga cggtgaccgc cgatgcggtc 1740

gaggtgcgcg gcagccaggt acgcggcgcg cgcaaggccg aggtagtcag cgggaaaggc 1800

tcgctgcgca tcgacggcgt ggaggaaacc gcccacagca acagctacag caaggacagc 1860

aagttcttcg gcatcgccaa ggacgagagt cgccagcgca gcaaggacag cagcaaccgc 1920

gccagcgaag tacgctcgga cagcaacctg accctgcgca gcgccgccga catcgccatt 1980

cgcggctccc gggtcgaggc tggcggcgcc ctcgccgccg aggccaaggg caacctggag 2040

atagcctcgg cgcaggagcg ccacgacggc aacgacagcc gccacacccg cggcttcgac 2100

gcctatgccg gcgagcagac cccaggcagc cgccaatacc gcgccggggt gcgctaccag 2160

gaccagcgga ccagcgtccg ccgcgaggaa acccgcaaca gcggctccag cctgggcggc 2220

gcctccctgg ccgtgaaggc cggcggcgat ctcaccgtga agggggccga gctgaaggcc 2280

agcgcgggcg acgccagcct ctccgggaag aacgtcgccc tgctcgccga gcaggacagc 2340

aagacccgca gcagcgaaca gaccaccacc ggcggcggct tctactatac cggcggcctg 2400

gaccgtgccg gcagcggtat cgaagtcggc caccagcgga tcgacgagaa cgacgccgaa 2460

agccatgcgc gcaccagcca ggtgaacgcg acgggcaatc tcaggatcga cgccgcccag 2520

ggcagcctga cgacgcaggg cgcgcgcctg gaggccggcg acagcctggc ggtcgccgcc 2580

ggcacggtcg acaaccaggc cgcccgcgac agccagagca gccagcgcca cgacagcggc 2640

tggagcggcg acatcggcgc caacctcgag taccgcggca tcgcccggcc gatcgagaag 2700

gcggtcgaag gcgtcgccca gcgcaaggtc caccagcccg gcctgctcga caacctggag 2760

cagccgaacg tcggcgtcga cctcgagatc agccaccgcg acagccgcgg cgagcaacag 2820

gcgagccagg cgcaggtcag cagcttcgcg ggcggccagg tcgaactgaa ggtcggcgac 2880

gccctgcggg acgagggcac ccgttaccag gctcgcagcg gaggcctcct catcgacgcc 2940

gccaggcatg acgccagggc ggcggagaac acctccggca gccatgagca gagcctcgac 3000

gccaaggtcg gcgggcgcct ctacaccacc accggccagg acctgaacct gcgcctgagc 3060

ggcattggcg gcagcagcga gaacagcgcc agccagacca ccgcggtggt cggcgaatac 3120

gccgcgaagc agggcgtcga gatccgcctc ggcggagacg gcctctacca gggcagccgc 3180

ttcgacggcg gcgaagccgg ggtcaggctc agcgccggcg gcaacctggc cctggaacag 3240

gccaacgacc ggcagagcgc cagcagcgcc agcctgcgtg gcgacgccgc gttgagcggc 3300

ggcatggccc ccagcgccaa cggcaaaggg ctgaacgcca gcgccggcct gcaactcgac 3360

cacaaggccg gcgacagccg ggacagccag gcgcgggtcg ccgacatcca ggccaagggc 3420

gcggtggagc tgcgcagcgg cggcgatctg gtcctgcaag gcagcaatat cggcagcgcg 3480

gcagcgaaga ccggcgacat agtcctggcc gccggcggca agctcgacct gcaggccgcc 3540

cgcgatagcc accgggccgg gggaaacaac ctcggcggcg gcttcagcct aggcggcggc 3600

agcgttcgcg acgccgaaac gagcagcaag aacggcagcg tcagcggcaa cttcaacatc 3660

ggccgggtcg acgaggaacg tcacgcgctg aacggcggca acctgcacag cgcgaccaag 3720

gccagccttt ccagcgccgc agacgacgcc accgcggtac gcctgcaagg cactcgcatc 3780

gaagccgccc aggtcagcct cgaagccggc aacggcggca ttctccagga gtccgccgaa 3840

tccagcgagc ggcgcgacaa ctggggcgtg ctgctcggtg ccggggccaa cggcggcaag 3900

accaccggcg cgccgagcga ctaccggagc gactatgccg tccaggcccg cgccaaggtc 3960

gatgtcgatg tcctgcgcag ccagacccag ggcgacagcg tcatccaggc cgaccgggta 4020

atcctggcga gccagggcga cacccgcctg gagggcgcgc gcatcgacgc ggcacaggtg 4080

gacgggcgca tcggcggcga cctgcgggtg gagagccgcc aggaccgcgc ggagggcgtg 4140

aaggtcaacg tcgacgcgcg cctgggcgtg gagaagaacc agcccggcct ggtgaacaag 4200

ctggcgagca agaccggacc gttgaaggac aagctggaaa ccaaggccga gaatgctttc 4260

gacaagcacc gcggcaagtt ggagaacggc atcgaccgta atgtcgagcg gctcggcaag 4320

gccggggaca acctcctcgc caaagccgaa aaggccaagg agcgcctggg cgagaagctg 4380

gtccgcagcg gcagctacga ggtcaacccg gagccgcgcg gcgccttcgc cagcaagctg 4440

gacagggcca ggggctatct ggcggagaaa ggcgaagcgc tcggcgaccg gctgtccggc 4500

ctcaagcagc gcctgtcgcc gaacaagacc ggtagctatg tggtgaacga caagcagacg 4560

gccggcgcca aggtcggcaa tgccgccgag aacgtgctgt tcggcgacaa gagcggcgaa 4620

gcctcggtaa ccccgacgct gtacctggac gtcagccacg tcagccgcaa ctacgtcacc 4680

gaggcctccg gcatcaccgg caggcagggc gtgaacctgc aggtgggcgc agcgacccag 4740

ctgaccggcg cacggatcag cgccagcgac ggcaaggtcg acctcggcgg ctcgcgcgtg 4800

gaaacccgcg ccctggccgg caaggactac cgcgccgatc tcggcctgaa cgtctccagg 4860

tcgccggtgg acctggcctt cggtatcaag gacgagttca gccaggagca cgaccaggcg 4920

acccgcgacg accaggcctt caacctcggc gccctgcgcg tcggcggacg caaccgcgac 4980

cagcagttgc aggccggcat cgagcagaag gccgactaa 5019

<210> 42

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(66)

<223> 起始密码子ATG，接着是pelB前导序列

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (67)..(711)

<223> 不具有起始密码子的溶血素III编码基因的部分DNA片段

<400> 42

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggccaata cttatgtaag ggaaccagtt aatgcattta ctcacttagg tggagcgata 120

ttatcattta ttgcgttatt agctatgctt gtgaaagttt ctatcaagat gccatcattt 180

gctgcaatta cagctgttat tttgtttggt attggaatga tggtccttta tacggcgtca 240

gctgtatatc atagtgttgt ggccaatgaa cgtgttatat acttctttag gaagctagat 300

cattctatga tttttatatt aattgcaggt acatatgcac ccttttgctt aattacatta 360

aattcagcaa gtggtttgct attattttgt ttagtctatg caactgcgat ttgtggcatt 420

gtatttaaaa tgttttggtt taattgtcca aggtggttat cgacagcaat ttatattacg 480

atgggttggt taattgtttt attctttgca ccgttagctg agaatttaag tacaggaggc 540

attattttct tagtacttgg tggcattttt tatacaattg gtggatttat ttatggaaca 600

aagccaaaat ggttagagtt taaatatatg gggcatcatg aaatttttca tgtttttgta 660

ttattaggta gtcttgcgca ttttctaagt gtatattgtt acgtaattta a 711

Claims

1.一种基因工程活细菌，其包含

至少一种效应子基因，其编码至少一种医疗效应子；以及

其中所述细菌衍生自毒性菌株。

2.如权利要求1所述的细菌，其中所述医疗效应子为抗原，所述抗原可以在所述受试者中引发足以治疗目标疾病或病症的至少一种免疫应答。

3.如权利要求1所述的细菌，其中所述医疗效应子为治疗因子，所述治疗因子可以在足以治疗目标疾病或病症的程度上，在所述受试者中引发至少一种免疫应答和/或减小靶病灶的大小。

4.如权利要求2或3所述的细菌，其中所述免疫应答由CD4+和/或CD8+T细胞引发。

5.如权利要求1所述的细菌，其中所述医疗效应子为抗原或从所述细菌的同源基因表达的治疗因子。

6.如权利要求1所述的细菌，其中所述医疗效应子为抗原或从异源基因表达的治疗因子。

7.如权利要求6所述的细菌，其中所述异源基因进一步包含在所述细菌中改善异源表达的前导序列和/或终止区。

8.如权利要求3或6所述的细菌，其中所述治疗因子为在所述靶病灶中引起细胞裂解的细胞毒素。

9.如权利要求2或权利要求3所述的细菌，其中所述目标疾病或病症为癌症或肿瘤，并且其中所述医疗效应子在所述受试者中引起肿瘤抑制。

10.如权利要求1所述的细菌，其中所述细菌不能够在所述受试者内复制或定殖。

11.如权利要求1所述的细菌，其中所述基因修饰为至少一种必需基因或营养缺陷型基因从所述细菌的染色体中的缺失或突变。

12.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述细菌为二氨基庚二酸中的营养缺陷体。

13.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述基因修饰为天冬氨酸-半醛脱氢酶(asd)从所述细菌的染色体中的缺失。

14.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述细菌具有能够通过将所述细菌暴露于一种或多种调节效应子来进行控制的存活时间，所述调节效应子在体内施用时调节所述细菌的所述存活时间。

15.如权利要求14所述的细菌，其中所述调节效应子为二氨基庚二酸。

16.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述医疗效应子为由选自由以下组成的组的基因来表达的同源肽：chuA、yjaA、tspE4C2、sat、sfa、papG、fyuA、iutA、hlyACBD、yfcV和pks岛。

17.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述医疗效应子为选自由以下组成的组的细胞毒素：铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)、蜡样芽孢杆菌的非溶血性肠毒素(Nhe)、溶血素和幽门螺杆菌的空泡毒素，以及其组合。

18.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述医疗效应子为选自由以下组成的组的抗癌因子：CpG、环状二核苷酸和肿瘤抗原。

19.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、李斯特菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、乳杆菌属或乳球菌属。

20.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自大肠杆菌。

21.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为19836的菌株SH3。

22.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达与SEQ ID NO:35的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的序列。

23.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为19835的菌株mp107。

24.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述细菌被配制为静脉内施用。

25.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中，当静脉内施用时，足以使发病机理最小化的时间少于2天、5天或11天。

26.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述细菌被配制为局部施用。

27.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中当在注射部位处局部施用时，所述细菌在所述注射部位中存活至多5天，但在所述注射部位外则在48小时内死亡。

28.如权利要求24所述的细菌，其中所述细菌是以7.5×10⁹cfu/kg小鼠的当量剂量来施用。

29.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其中所述疾病为癌症或肿瘤，并且所述细菌是瘤内施用的。

30.如权利要求29所述的细菌，其中所述细菌是以约100-200mm³的每克肿瘤至少5x10⁸cfu的当量剂量来施用。

31.如权利要求1至20中任一项所述的细菌，其中所述至少一种效应子基因包含细胞毒素基因以及溶血素III编码基因的部分DNA片段。

32.如权利要求31所述的细菌，其中所述细胞毒素为铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)。

33.如权利要求31或32中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22556的菌株mp106。

34.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其进一步包含减弱所述细菌的毒力的至少一种毒力基因修饰。

35.如权利要求34所述的细菌，其中所述至少一种毒力基因修饰为至少一种毒力基因从所述细菌的染色体中的缺失或突变。

36.如权利要求34或35中任一项所述的细菌，其中所述毒力基因修饰为hlyCABD操纵子从所述细菌的染色体中的缺失。

37.如权利要求36中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22557的菌株SH4。

38.如权利要求34至37中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达与SEQ ID NO:40的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的序列。

39.如权利要求34至37中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达与SEQ ID NO:41的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的第一序列和/或与SEQ IDNO:42的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的第二序列。

40.如权利要求38或39中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22555的菌株mp105。

41.如权利要求31至40中任一项所述的细菌，其中所述细菌是以2x 10⁸cfu/小鼠的当量剂量来施用。

42.如权利要求34至40中任一项所述的细菌，其中所述细菌配制为以静脉内注射和瘤内注射的组合来施用。

43.如权利要求42所述的细菌，其中所述瘤内注射具有7.5x 10⁷cfu/小鼠的当量剂量，并且所述静脉内注射具有3x 10⁷cfu/小鼠的当量剂量。

44.一种大肠杆菌属物种的活细菌，所述活细菌包含

其中所述细菌衍生自毒性菌株。

45.如权利要求44所述的细菌，其中所述细菌表达编码医疗效应子的至少一种效应子基因。

46.如权利要求44所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为19836的菌株SH3。

47.如权利要求44所述的细菌，其中所述细菌进一步包含编码铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)的基因。

48.如权利要求47所述的细菌，其中所述基因与SEQ ID NO:35的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性。

49.如权利要求44所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为19835的菌株mp107。

50.如权利要求44所述的细菌，其中所述至少一种效应子基因包含细胞毒素基因以及溶血素III编码基因的部分DNA片段。

51.如权利要求50所述的细菌，其中所述细胞毒素为铜绿假单胞菌的外溶素A(ExlA)。

52.如权利要求50或51中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22556的菌株mp106。

53.如权利要求44至52中任一项所述的细菌，其进一步包含减弱所述细菌的毒力的至少一种毒力基因修饰。

54.如权利要求53所述的细菌，其中所述至少一种毒力基因修饰为至少一种毒力基因从所述细菌的染色体中的缺失或突变。

55.如权利要求53或54中任一项所述的细菌，其中所述毒力基因修饰为hlyCABD操纵子从所述细菌的染色体中的缺失。

56.如权利要求55所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22557的菌株SH4。

57.如权利要求53至56中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达与SEQ ID NO:40的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的序列。

58.如权利要求53至56中任一项所述的细菌，其中所述细菌表达与SEQ ID NO:41的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的第一序列和/或与SEQ IDNO:42的全部或片段具有至少约80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的第二序列。

59.如权利要求57或58中任一项所述的细菌，其中所述细菌衍生自保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、保藏号为22555的菌株mp105。

60.如权利要求50至59中任一项所述的细菌，其中所述细菌是以2x 10⁸cfu/小鼠的当量剂量来施用。

61.如权利要求53至59中任一项所述的细菌，其中所述细菌配制为以静脉内注射和瘤内注射的组合来施用。

62.如权利要求61所述的细菌，其中所述瘤内注射具有7.5x 10⁷cfu/小鼠的当量剂量，并且所述静脉内注射具有3x 10⁷cfu/小鼠的当量剂量。

63.一种免疫原性组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的细菌。

64.一种活细菌疫苗，其包含如前述权利要求中任一项所述的细菌以及任选的佐剂。

65.一种治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用包含有效量的如前述权利要求中任一项所述的细菌的组合物。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述疾病为肿瘤或癌症。

68.如权利要求67所述的方法，其进一步包括以下步骤：

对所述细菌进行基因工程改造以表达至少一种医疗效应子。