JP2024515351A - 付着性侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対するバクテリオファージ療法 - Google Patents

付着性侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に対するバクテリオファージ療法 Download PDF

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Abstract

付着性侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＡＩＥＣ）に感染して溶解させるバクテリオファージが本明細書に記載される。バクテリオファージは、例えば、ＡＩＥＣに感染したか、若しくはＡＩＥＣによる感染のリスクのある対象の予防的若しくは治療的処置、又は対象の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、尿路感染症（ＵＴＩ）、新生児髄膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支炎、肺炎、及び肺癌を含むＡＩＥＣに関連する疾患及び症状の予防的若しくは治療的処置、並びに本明細書に記載される他の使用に有用である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１７８，１１９号明細書及び２０２１年７月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／２０３，５６０号明細書に対する優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的手段により提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年４月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、名称が０５２２０９－０５１６＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが２１１，０７３バイトである。
接着性侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＡＩＥＣ）を効果的に標的化する（例えば、感染して溶解させる）バクテリオファージ株及びそれらを含む組成物が本明細書に記載される。バクテリオファージは、例えば、ＡＩＥＣに感染したか、若しくはＡＩＥＣによる感染のリスクのある対象の予防的若しくは治療的処置、又は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含むＡＩＥＣに関連する疾患及び症状の予防的若しくは治療的処置、並びに本明細書に記載される他の使用に有用である。
バクテリオファージは、複製／溶解サイクルの一部として、細菌に感染し、それらを溶解するウイルスである。バクテリオファージ（又は、略して「ファージ」）は、その名称が「食べる」又は「バクテリアを食べるもの」という意味のギリシャ語「ｐｈａｇｏ」に由来するものであり、２０世紀の前半にフェリックス・デレーユによって発見された。ファージは標的化する細菌宿主に特異的であり、ヒト又は他の真核細胞に感染することはない。バクテリオファージは１９１９年以降、病原性細菌を標的化するために、ヒトにおいて治療的に使用されてきた。当初の熱意により、それらを細菌によって引き起こされる疾患の予防及び療法の両方として使用することにつながった。米国では、１９４０年代、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社によってブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、レンサ球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、及び他の呼吸器病原菌を標的化した製剤を含む、ヒト用途の６つのファージ製品が商業的に生産されている。抗生物質の出現と共に、ファージの治療的使用は米国及び西欧では次第に好まれなくなり、わずかな研究しか行われなくなった。しかしながら、バクテリオファージ療法は東欧で引き続き利用されていた。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、主に結腸及び小腸に発症する炎症性疾患のカテゴリーである。ＩＢＤの病因は未だ研究中ではあるものの、ＩＢＤは遺伝的、環境的、及び微生物的な要因を有する自己免疫疾患であると考えられている。ＩＢＤの最も一般的な形態は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）である。ＵＣは結腸の慢性炎症性疾患であり、急性期の感染症に類似している。ＵＣは結腸の粘膜の炎症を引き起こし、重症例では粘膜下層への拡大を伴う。通常、結腸だけではなく直腸も冒されるが、回腸に関与することは稀である。潰瘍の形成及びその拡大は、疾患の段階に伴って変化するが、多くの場合（例えば、Ｓ状結腸鏡検査及び結腸鏡検査によって）巨視的に測定することが可能である。ＣＤは、限局性腸炎又は肉芽腫性大腸炎としても公知であり、口から肛門に至る胃腸管のあらゆる部分に発症する可能性のある腸の炎症性疾患であり、様々な症状を引き起こす。主に腹痛、下痢、嘔吐、及び体重減少のうちの１つ以上を引き起こすが、皮膚発疹、関節炎、目の炎症、疲労感、及び集中力欠如などの、胃腸管の外部での合併症を引き起こすこともある。ＣＤは、小腸（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）（小腸（ｓｍａｌｌ ｂｏｗｅｌ））、特に回腸に最もよく見られるが、空腸、及び直腸を含む結腸の任意の部分に発症することもある。後者の場合、ＵＣとＣＤを区別するのが困難な場合がある。一般に、ＣＤの炎症は、粘膜よりも深い層まで進行し、上皮により低い程度で発症することにより、ＵＣの炎症とは異なる。
ＩＢＤの正確な原因は未だ不明ではあるが、環境因子と遺伝的素因との組み合わせが関与していると思われる。例えば、ＣＤは、身体の免疫系が胃腸管を攻撃し、炎症を引き起こす自己免疫疾患であると考えられている。ＣＤ患者では、回腸上皮の頂端膜側に、癌胎児性抗原関連細胞接着分子６（ＣＥＡＣＡＭ６）の異常発現が観察されている。加えて、ＣＤ回腸病変及びＵＣ潰瘍では、病原性の接着性侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＡＩＥＣ）がコロニー形成する場合がある。従って、ＡＥＩＣは、これらの疾患における病因の微生物因子であると理解されている。例えば、Ａｓｔｌｅｙ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．（２０２１）４０：１８１－９２を参照されたい。
ＵＣ及びＣＤの双方は、特に先進国では次第にありふれたものになってきている。一般的なＩＢＤも、特にＵＣ又はＣＤも、抗生物質（病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を標的化する抗生物質を含む）によって効果的に処置することは不可能である。従って、ＵＣ及びＣＤを含むＩＢＤの効果的な処置が依然として求められている。
ＡＩＥＣの感染は、結腸癌、尿路感染症、新生児髄膜炎、並びに呼吸器疾患及び症状を含む、他の疾患及び症状とも関連付けられている。例えば、Ａｓｔｌｅｙ（前掲）（結腸癌及びＵＴＩ）；Ｎａｓｈ ｅｔ．ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０１０）１１：６６７（ＵＴＩ及び新生児髄膜炎）；Ｗｙｐｙｃｈ ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０）２０；１２７９－９０（肺感染症並びに喘息を含む呼吸器疾患及び症状）；Ｒａｆｔｅｒｙ，ｅｔ．ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０２０）１１；Ａｒｔｉｃｌｅ ２１４４（慢性閉塞性肺疾患）を参照されたい。従って、ＡＥＩＣに関連する疾患及び症状を処置するのに使用される、ＡＥＩＣに対して効果的な処置が依然として求められている。
本発明は、付着性侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＡＩＥＣ）を標的化する（例えば、感染して溶解させる）バクテリオファージ株、及びＡＩＥＣに感染して溶解させる１つ以上の異なるそのような株（例えば、バクテリオファージ株の「カクテル」）を含む組成物を提供する。組成物は、一般用医薬品（ＯＴＣ）組成物又は医薬品組成物であり得る。バクテリオファージ及びそれらを含む組成物は、ＡＩＥＣの感染のリスクを低減し、ＡＩＥＣの感染を予防又は処置するため、並びにＣＤ及びＵＣを含むＩＢＤ、結腸癌、尿路感染症（ＵＴＩ）、新生児髄膜炎、並びに吸器疾患及び症状（喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支炎、肺炎、及び肺癌を含む）を含むＡＥＩＣに関連する疾患及び症状を処置するため、並びに本明細書に記載される他の方法及び使用のために有用である。
従って、付着性侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株に溶菌感染を生じさせることが可能なバクテリオファージ株、及び薬学的に許容される担体を含む組成物が提供され、バクテリオファージ株は、ＡＴＣＣにアクセッション番号ＰＴＡ－１２１４０８として寄託された株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対してそのゲノムにわたり少なくとも８０％の平均ヌクレオチド同一性（ｇＡＮＩ）を有するその変異株である。組成物は、パスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズム（Ｆｒｅｎｃｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）にアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４６９５として寄託された株Ｐ２、又は前記バクテリオファージ株Ｐ２に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異株；パスツール研究所のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムにアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４７００として寄託された株Ｐ８、又は前記バクテリオファージ株Ｐ８に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異株；パスツール研究所のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムにアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４６７５として寄託された株ＣＬＢ＿Ｐ２、又は前記バクテリオファージ株ＣＬＢ＿Ｐ２に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異株；ＡＴＣＣにアクセッション番号ＰＴＡ－８３５１として寄託された株ＥＣＭＬ－１１９、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１１９に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異株；ＡＴＣＣにアクセッション番号ＰＴＡ－１２１４０７として寄託された株ＥＣＭＬ－３６３、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３６３に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異株；及びＡＴＣＣにアクセッション番号ＰＴＡ－１２１４０６として寄託された株ＥＣＭＬ－３５９、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３５９に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異体から選択される１つ以上のバクテリオファージ株を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、組成物中に存在するバクテリオファージ株は、株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異株；株Ｐ２、又は前記バクテリオファージ株Ｐ２に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異株；株Ｐ８、又は前記バクテリオファージ株Ｐ８に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異株；株ＣＬＢ＿Ｐ２、又は前記バクテリオファージ株ＣＬＢ＿Ｐ２に対して少なくとも９０％のｇａＮＩを有するその変異株；株ＥＣＭＬ－１１９、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１１９に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異株；株ＥＣＭＬ－３６３、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３６３に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異株；及び株ＥＣＭＬ－３５９、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３５９に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異体を含むか又はこれらからなる。
いくつかの実施形態では、組成物中に存在するバクテリオファージ株は、株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；株Ｐ２、又は前記バクテリオファージ株Ｐ２に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；株Ｐ８、又は前記バクテリオファージ株Ｐ８に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；株ＣＬＢ＿Ｐ２、又は前記バクテリオファージ株ＣＬＢ＿Ｐ２に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；株ＥＣＭＬ－１１９、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１１９に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；株ＥＣＭＬ－３６３、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３６３に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；及び株ＥＣＭＬ－３５９、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３５９に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体を含むか又はこれらからなる。
いくつかの実施形態では、組成物中に存在するバクテリオファージ株は、株ＥＣＭＬ－１２３－２、Ｐ２、Ｐ８、ＣＬＢ＿Ｐ２、ＥＣＭＬ－１１９、ＥＣＭＬ－３６３、及びＥＣＭＬ－３５９の各々のバクテリオファージを含むか又はこれらからなる。
任意の実施形態では、組成物は、プロバイオティクス細菌及びプロバイオティクス酵母のうちの１つ以上を任意選択により更に含む。プロバイオティクス細菌は、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ブルガリクス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．パラカセイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・セルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びその任意の組み合わせのうちの１つ以上から選択され得る。プロバイオティクス酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ変種ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖａｒ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、イサチェンキア・オクシデンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ラチャンセア・サーモトレランス（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、メチニコウィア・ジジフィコラ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｚｉｚｉｐｈｉｃｏｌａ）、トルラスポラ・デルブリュッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、及びその任意の組み合わせのうちの１つ以上から選択され得る。
前述の組成物の任意の実施形態は、経口剤形で提供されてもよく、任意選択により腸溶性コーティングで提供されてもよく、任意選択により錠剤、ハードゲルカプセル剤、ソフトゲルカプセル剤、糖衣錠、散剤、粒剤、液剤、懸濁剤、分散剤、シロップ剤、及びマイクロゲル剤から選択される形態で提供されてもよい。任意のこのような組成物は、任意選択により胃酸中和剤及びプロトンポンプ阻害剤から選択される胃酸還元剤を、任意選択により更に含み得る。
或いは、前述の組成物の任意の実施形態は、直腸剤形、任意選択により坐剤、浣腸、直腸フォーム、ローション、又はゲル；膣剤形、任意選択により坐剤、クリーム膣フォーム、ローション、又はゲル；経肺剤形、任意選択により散剤、エアロゾル、ネブライザー、又は吸入器組成物；及び注射剤形から選択される剤形で提供され得る。
前述の任意の実施形態は、医薬組成物又は一般用医薬品組成物であってよい。前述の任意の実施形態は、栄養補助食品、機能性食品組成物、栄養補給剤、又はプロバイオティクス組成物であってよい。
また、本明細書に記載されるようなバクテリオファージ組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染のリスクを低減するか、若しくはＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染を予防若しくは処置する、又はそれを必要とする対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、尿路感染症（ＵＴＩ）、新生児髄膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支炎、肺炎、及び肺癌のうちの１つ以上を処置する、又はヒト対象のマイクロバイオームを調節するための方法が提供される。
また、それを必要とする対象におけるＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染のリスクを低減するか、若しくはＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染を予防若しくは処置する、又はそれを必要とする対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、尿路感染症（ＵＴＩ）、新生児髄膜炎、喘息、ＣＯＰＤ、気管支炎、肺炎、及び肺癌のうちの１つ以上を処置する、又はヒト対象のマイクロバイオームを調節するために使用される、本明細書に記載されるようなバクテリオファージ組成物も提供される。
また、それを必要とする対象におけるＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染のリスクを低減するか、若しくはＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染を予防若しくは処置するための、又はそれを必要とする対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、尿路感染症（ＵＴＩ）、新生児髄膜炎、喘息、ＣＯＰＤ、気管支炎、肺炎、及び肺癌のうちの１つ以上を処置するための、又はヒト対象のマイクロバイオームを調節するための医薬の調製における、本明細書に記載されるようなバクテリオファージ組成物の使用も提供される。
任意のそのような方法、使用される組成物、又は使用により、対象は、ＡＩＥＣによるコロニー形成若しくは感染のリスクがあり得るか、又はＡＩＥＣにコロニー形成されているか若しくは感染している可能性がある。いくつかの実施形態では、対象の小腸又は大腸のうちの１つ以上にＡＩＥＣが存在する。いくつかの実施形態では、ＡＩＥＣが対象の結腸に存在する。いくつかの実施形態では、ＡＩＥＣが対象の尿路に存在する。いくつかの実施形態では、ＡＩＥＣが対象の肺に存在する。いくつかの実施形態では、ＡＩＥＣは、ＬＦ８２、０７０８１、０７０８２、０７０７６及び０６０７５から選択される１つ以上の株であり、任意選択により、ＡＩＥＣが株ＬＦ８２であるか又は株ＬＦ８２を含む。
いくつかの実施形態では、方法、使用される組成物、又は使用は、対象の小腸、大腸、結腸、尿路、脳及び肺の１つ以上にＡＩＥＣがコロニー形成するのを低減又は防止するのに効果的である。
いくつかの実施形態では、対象は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患しており、任意選択により、対象はクローン病（ＣＤ）、若しくは潰瘍性大腸炎（ＵＣ）に罹患しており、又は術後、任意選択によりＣＤ患者の小腸の少なくとも一部を切除するための手術後の回腸病変の再発を患っている。
いくつかの実施形態では、バクテリオファージ組成物は経口投与される。このような実施形態は、任意選択により胃酸中和剤及びプロトンポンプ阻害剤から選択される胃酸還元剤を、対象に経口投与することを任意選択により更に含む。他の実施形態では、バクテリオファージ組成物は、直腸、膣内、肺、及び注射から選択される経路で投与される。
任意の実施形態では、方法又は使用は、対象にプロバイオティクスを投与することを更に含み得る。任意選択により、プロバイオティクスは、例えば口腔用組成物中でバクテリオファージが投与される場合、バクテリオファージと同じ組成物で提供され得る。
任意の実施形態では、対象は、便微生物移植により追加的に処置されてもよい。
また、ＡＴＣＣにアクセッション番号ＰＴＡ－１２１４０８として寄託された株ＥＣＭＬ－１２３－２の単離されたバクテリオファージ、及び前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその単離された変異株が提供され、任意選択により、変異株は、前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２の後代であり、並びに前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対して≧９０％、≧９５％、≧９８％又は≧９９．９％のｇＡＮＩを有するその単離された変異株である。また、このようなバクテリオファージ株のいずれかの単離された後代株も提供され、この後代株は、前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２と実質的に同等のＲＦＬＰ ＤＮＡプロファイルを有する。
また、バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前述の変異体若しくはその後代によって産生された溶菌酵素を含む組成物も提供される。
また、バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２の誘導産物、又は前述の変異体若しくはその後代を含む組成物も提供され、誘導産物が、ＡＩＥＣに対する活性を有するか、又はＡＩＥＣに対する活性を有する産物をコードし、任意選択により、誘導産物がＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ及び合成ポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、並びに抗σ因子遺伝子及びその発現産物から選択される１つ以上である。
また、バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前述の変異体若しくはその後代、又は任意のその溶菌酵素でＡＩＥＣ株を溶解させることによって得られるＡＩＥＣ溶菌液を含むワクチンも提供される。また、ＡＩＥＣの感染に対して対象をワクチン接種するために使用される、バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前述の変異体若しくはその後代、又は任意のその溶菌酵素でＡＩＥＣ株を溶解させることによって得られるＡＩＥＣ溶菌液も提供される。また、ＡＩＥＣの感染に対して対象をワクチン接種するための医薬の調製におけるＡＩＥＣ溶菌液の使用も提供され、ＡＩＥＣ溶菌液は、バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前述の変異体若しくはその後代、又は任意のその溶菌酵素でＡＩＥＣ株を溶解させることによって得られる。また、バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前述の変異体若しくはその後代、又は任意のその溶菌酵素でＡＩＥＣ株を溶解させることによって得られる溶菌液を対象に投与することを含む、ＡＩＥＣの感染に対して対象をワクチン接種するための方法も提供される。
また、バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前述の変異体若しくはその後代、又は任意のその溶菌酵素で試料を処置し、これによって測定可能なＡＩＥＣ細菌産物の放出を特異的に誘導し、放出されたＡＩＥＣ細菌産物を測定することを含む、試料中のＡＩＥＣ細菌を検出するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、放出されたＡＩＥＣ細菌産物は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びプロテインキナーゼ（ＡＫＴ）のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、試料は、対象から得られた便試料である。
本明細書に記載されるバクテリオファージの参照ＤＮＡ ＲＦＬＰプロファイルを示す。
上記で述べたように、ＡＩＥＣを標的化する（例えば、感染して溶解させる）バクテリオファージ株、及びＡＩＥＣに感染して溶解させる１つ以上の異なるそのような株を含む組成物が本明細書に記載される。組成物は、一般用医薬品（ＯＴＣ）組成物又は医薬品組成物であり得る。バクテリオファージ及びそれらを含む組成物は、ＡＩＥＣの感染のリスクを低減し、ＡＩＥＣの感染を予防又は処置するため、並びにＣＤ及びＵＣを含むＩＢＤ、結腸癌、尿路感染症（ＵＴＩ）、新生児髄膜炎、並びに吸器疾患及び症状（喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支炎、肺炎、及び肺癌を含む）を含むＡＥＩＣに関連する疾患及び症状を処置するため、並びに本明細書に記載される他の方法及び使用のために有用である。理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載されるバクテリオファージ及び組成物を使用する療法は、ＡＩＥＣの感染を特異的に標的化することで防止又は低減させることから安全且つ有効なものであり、それによって特異的にＡＩＥＣを標的化することにより健全なマイクロバイオームを維持し、広域スペクトルの抗生物質療法に関連する副作用を回避しながら、ＡＩＥＣの感染に対して有効であることが理解される。下記の実施例に例示されるように、本明細書に記載される７つのファージの各々は、多数の異なるＡＩＥＣ株に対して個々に及び合わせて有効であると同時に、付着性侵入性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に特異的であり、健康なヒトのマイクロバイオームの一般的な細菌を溶解しない。従って、抗生物質の無分別な活性とは対照的に、本明細書に記載されたファージは、健康なヒトのマイクロバイオームに及ぼす影響があったとしても最小限にしながらＡＩＥＣを標的化するために使用され得る。
定義
本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、別途定義されない限り、本発明に関連する当業者に一般に理解されている意味を有する。本明細書に提供されるガイダンスに鑑みて、本発明の実施にあたり当業者に公知の任意の適切な材料及び／又は方法を利用することができるが、しかしながら、例証の目的のために、特定の材料及び方法を記載する。下記の説明及び実施例で言及される材料、試薬などは、別途注記されない限り、商業的供給源から入手可能である。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、単数形のみを示すと明確に述べられていない限り、単数形及び複数形の両方を示す。
本明細書で使用される場合、数値と共に使用されるときの「約」は、明記された数値だけでなく、その数値のプラス又はマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０」は、「１０」及び「９～１１」の両方として理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「Ａ／Ｂ」の形態又は「Ａ及び／又はＢ」の形態の語句は、（Ａ）、（Ｂ）、又は（Ａ及びＢ）を意味し、「Ａ、Ｂ及びＣのうちの少なくとも１つ」の形態の語句は、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ａ及びＢ）、（Ａ及びＣ）、（Ｂ及びＣ）、又は（Ａ、Ｂ及びＣ）を意味する。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、記載される組成物、方法、又はキットが、少なくとも明記される要素を含み、且つ明記されない他の要素を含み得ることを意味する。
本明細書で使用される場合、「付着性侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＡＩＥＣ）株」とは、下記に記載するアッセイに従って試験した場合に、腸細胞株Ｉ－４０７の細胞培養物において０．１％以上の平均浸潤能力を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を指す。Ｄａｒｆｅｕｉｌｌｅ－Ｍｉｃｈａｕｄ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２７；４１２－４２１（２００４）も参照されたい。換言すれば、ＡＩＥＣ株は、下記に記載される浸潤アッセイに従って試験した場合に、Ｉ－４０７の腸細胞培養物に、元々の接種物の０．１％（これを１００％とみなす）と同等かそれ以上の浸潤指数で浸潤する能力を有する。
ＡＩＥＣ株の非限定的な例としては、パスツール研究所のＦｒｅｎｃｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎと共にオーベルニュ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄ’Ａｕｖｅｒｇｎｅ）によってアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４７２３として寄託された株ＬＦ８２、ＬＦ８２Ｓ（ストレプトマイシン耐性を有する株ＬＦ８２の遺伝子改変された変異株）及びＬＦ８２ＳＫ（ストレプトマイシン及びカナマイシン耐性を有する株ＬＦ８２の遺伝子改変された変異株）（どちらもＧａｌｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｒｏｈｎｓ Ｃｏｌｉｔｉｓ．１１（７）；８４０－４７（２０１７）で述べられている）；株ＬＦ３１、ＬＦ７１、ＬＦ１２３、ＬＦ１３８、ＬＦ９、ＬＦ１５、ＬＦ２８、ＬＦ５０、ＬＦ６５、ＬＦ１１９、ＬＦ１２８、ＬＦ１３０、ＬＦ７３、ＬＦ１００、ＬＦ１１０、ＬＦ１３４、ＬＦ１０５、ＬＦ４９－２、ＬＢ１１、及びＬＦ４５－２（例えば、Ｄａｒｆｅｕｉｌｌｅ－Ｍｉｃｈａｕｄ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２７：４１２－４２１（２００４）を参照されたい）、並びに下記の実施例１で述べられるＡＩＥＣ株である。
ＡＩＥＣの「コロニー形成」という用語は、本明細書では、対象にＡＩＥＣが存在することを指すものとして用いられるが、これが必ずしも対象の疾患の原因となるわけではない。
ＡＩＥＣの「感染」という用語は、本明細書では、対象の疾患の原因となっている対象の組織のＡＩＥＣの侵襲を指すものとして用いられる。本明細書で使用される場合、「予防する」とは、それを必要とする対象において、ＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染のリスクを低減するか、又はＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染を防止するか、又はＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染のレベルを低減することを意味する。
本明細書で使用される場合、「処置する」とは、それを必要とする対象において、ＡＩＥＣのコロニー形成又は感染のレベルを低減することを意味し、ＡＩＥＣのコロニー形成又は感染を検出不可能なレベルまで低減することを含む。このような処置により、ＩＢＤ（ＣＤ又はＵＣなど）、結腸癌、ＵＴＩ、新生児髄膜炎、又は呼吸器症状などの問題となっている疾患又は症状（もしあれば）に特徴的な１つ以上の症状の減少、疾患又は症状の進行速度の減少、疾患又は症状からの回復の促進、疾患又は症状の治癒、疾患又は症状の寛解の維持、及び疾患又は症状の再発の予防などの予防法をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、治療的活性剤（例えば、ファージ）と関連して用いられる「有効量」及び「治療有効量」という語句は、例えば、ＡＩＥＣの感染のリスクを低減し、ＡＩＥＣの感染を防止又は低減するために、このような処置を必要とする対象に薬剤が投与される場合に特定の薬理学的効果をもたらす量を意味する。治療有効量は、このような量が当業者によって治療有効量であるとみなされる場合であっても、所与の患者がＡＩＥＣに感染するのを防止又は低減するのに必ずしも有効であるとは限らないことが強調される。治療有効量は、特定の活性剤、投与経路及び剤形、対象の年齢及び体重、並びに／又はＡＩＥＣの感染のタイプ及び重症度を含む対象の症状に基づいて変動し得る。
「個体」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、男性及び女性のヒト対象を含むヒト対象を含むあらゆる個々の哺乳類対象を指す。対象は、ＩＢＤ、結腸癌、ＵＴＩ、新生児髄膜炎、及び呼吸器疾患又は症状などの、ＡＩＥＣに関連する疾患又は症状に罹患するか及び／又はそのように診断され得る。
ＩＢＤの非限定的な例としては、ＣＤ、ＵＣ、及び他の慢性炎症性腸疾患（慢性ＩＢＤ）、例えば顕微鏡的大腸炎、セリアック病及び血管炎が挙げられる。従って、ＩＢＤはＣＤ又はＵＣであり得る。特定の実施形態では、ＩＢＤは、術後（ＣＤ患者の小腸の少なくとも一部を切除するための手術後など）の回腸病変の再発である。再発は、Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓスコアによって測定することができる。例えば、Ｃｈｏｎｇｔｈａｍｍａｋｕｎ，ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｐ（Ｏｘｆ）５；２７１－７６（２０１７）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ＩＢＤは細菌感染によって引き起こされるものではないが、細菌感染がＩＢＤに付随する可能性がある（ただし、必ずしも原因物質というわけではない）。いくつかの実施形態では、対象は、ＡＩＥＣに感染しているが、ＩＢＤには罹患していない。実際に、ＩＢＤ患者の家族の中には、病気に罹患せずにＡＩＥＣを保有していることがある。同様に、ＡＩＥＣ株は、ＩＢＤに罹患していても、ＩＢＤに罹患している対象に関連があったとしても、対象で発見されない可能性がある。
本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるバクテリオファージ株の「変異」株は、参照バクテリオファージ株に対して、そのゲノムにわたり少なくとも８０％の平均ヌクレオチド同一性（「ｇＡＮＩ」）を有する。ｇＡＮＩは、所与の一対のゲノムの間の類似度指数である。通常、学者であれば、ｇＡＮＩ≧９５％の生物を「同種」に属するものとして同定するであろう。Ｏｌｍ Ｍ．，“Ａｒｅ ｔｈｅｓｅ ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｔｈｅ’ｓａｍｅ’？” ｍｉｃｒｏＢＥｎｅｔ（２；２０１７）（ｍｉｃｒｏｂｅ．ｎｅｔ／２０１７／０２／１５／ａｒｅ－ｔｈｅｓｅ－ｍｉｃｒｏｂｅｓ－ｔｈｅ－ｓａｍｅ／にて利用可能）、及びＪａｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．９（１）：５１１４（２０１８）を参照されたい。参照株に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有する変異株は、前記参照バクテリオファージ株と同一の表現型特性を有するものと推定され、またそのようにみなされる。「変異」株は、参照株から独立して得てもよく、参照株の後代であってよく、又は参照株の組換え派生株（例えば、出発物質として参照株若しくはそのゲノム配列の１つ以上若しくは全てを使用して組換え作製されたもの）であってよい。
本明細書で使用される場合、バクテリオファージに関して用いられる「単離された」とは、バクテリオファージが自然発生する本来の環境、例えば、本来発見されたところから取り出されていることを意味する。「単離された」バクテリオファージは、それが自然に置かれた環境又は本来発見された環境から精製されていても、別々に培養されて（ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ）いても、又は別々に培養されて（ｃｕｌｔｕｒｅｄ）いてもよい。
バクテリオファージ株及びカクテル
２０１４年７月２５日にアクセッション番号ＰＴＡ １２１４０８としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された新規バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２の単離されたバクテリオファージ、及びこの寄託株に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株が本明細書に提供される。ＥＣＭＬ－１２３－２の配列は、配列番号１に記載されている。下記の実施例に示すように、株ＥＣＭＬ－１２３－２はＡＩＥＣを効果的に標的化する（感染して溶解させる）。
また、以下の（７つの）バクテリオファージ株（株ＥＣＭＬ－１２３－２を含む）及びこの寄託株に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体のうちの１つ以上の単離されたバクテリオファージを含み、２つ以上のその新規の組み合わせ（「カクテル」）を含む組成物も本明細書に提供される：
（ｉ）バクテリオファージ株ｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＬＦ８２＿Ｐ２（以下、「Ｐ２」）（国際公開第２０１４／１７７６２２号パンフレット及び米国特許第１１，０４０，０７８号明細書として承認された米国付与前公開第２０１６／０１４３９６５号明細書にすでに記載され、２０１２年１１月１５日にアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４６９５としてパスツール研究所のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムに寄託されている）；
（ｉｉ）バクテリオファージ株ｖＢ＿ＥｃｏＭ＿ＬＦ８２＿Ｐ８（以下、「Ｐ８」）（国際公開第２０１４／１７７６２２号パンフレット及び米国特許第１１，０４０，０７８号明細書として承認された米国付与前公開第２０１６／０１４３９６５号明細書にすでに記載され、２０１２年１１月１５日にアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４７００としてパスツール研究所のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムに寄託されている）；
（ｉｉｉ）バクテリオファージ株ＣＬＢ＿Ｐ２（国際公開第２０１４／１７７６２２号パンフレット及び米国特許第１１，０４０，０７８号明細書として承認された米国付与前公開第２０１６／０１４３９６５号明細書にすでに記載され、２０１２年９月２７日にアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４６７５としてパスツール研究所のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムに寄託されている）；
（ｉｖ）バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１１９（米国特許第７，６２５，５５６号明細書にすでに記載され、２００７年４月１９日にアクセッション番号ＰＴＡ－８３５１としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている）；
（ｖ）バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３５９（Ｃｉｅｐｌａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ９（５）；３９１－９９（２０１８）にすでに記載され、２０１４年７月２５日にアクセッション番号ＰＴＡ １２１４０６としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている）；
（ｖｉ）バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３６３（Ｃｉｅｐｌａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ９（５）；３９１－９９（２０１８）にすでに記載され、２０１４年７月２５日にアクセッション番号ＰＴＡ １２１４０７としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている）；並びに
（ｖｉｉ）バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２（２０１４年７月２５日にアクセッション番号ＰＴＡ １２１４０８としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている）。
現在の生物分類学では、株Ｐ２は、ｗＶ８バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のマイオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、株Ｐ８は、ＲＢ６９バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のマイオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、株ＣＬＢ＿Ｐ２は、ＪＳ９８バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のマイオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、株ＥＣＭＬ－１１９は、ＥＰＳ７バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のサイフォウイルス（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、株ＥＣＭＬ－１２３－２及びＥＣＭＬ－３６３は、ｗＶ７バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のマイオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、株ＥＣＭＬ－３５９は、ＳＰ１８バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のマイオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属する。
実施例に例示されているように、これらの株の各々は、１つ以上のＡＩＥＣの株を特異的に標的化し（感染して溶解させ）、１つ以上のＡＩＥＣの株による感染のリスクの低減、感染の予防、及び／又は感染の処置、並びにＣＤ又はＵＣなどのＩＢＤの処置を含む本明細書に記載される他の使用に有用である。特に、実施例に例示されているように、これらの株の各々は、以下のＡＩＥＣ株の１つ以上を特異的に標的化する（感染して溶解させる）：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＬＦ８２、０７０８１、０７０８２、０７０７６及び０６０７５。
寄託株及びそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株は、本明細書の記述において集合的に「本明細書に記載されるような」バクテリオファージ、ファージ、又は株と称される。
上記で述べたように、本明細書で使用される場合、「変異体」（又は「変異株」）には、以下の実施例に例示されるような、寄託されたバクテリオファージを培養することによって得られた後代が含まれる。バクテリオファージ株又はそれらの後代を同定するために、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を使用することができる。後代株は、Ｔｅｎｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３（９）；２２３３－３９（１９９５）に定義されているように、元のバクテリオファージ株のＤＮＡ ＲＦＬＰプロファイルと「実質的に同等な」ＤＮＡ ＲＦＬＰプロファイルを有し得る。Ｔｅｎｏｖｅｒにおいて報告されているように、同じように増殖させた生物のゲノムを制限酵素で消化した後に電気泳動分析した場合、ＲＦＬＰプロファイルに若干のばらつきが見られることがある。Ｔｅｎｏｖｅｒでは、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を使用した、染色体ＤＮＡ ＲＦＬＰプロファイルを解釈するためのシステムが記載されている。特に、Ｔｅｎｏｖｅｒでは、互いに「区別不能な」又は「近縁関係にある」生物を区別することを含む、様々なカテゴリーの遺伝学的及び疫学的関連性が説明されている。本明細書で使用される場合、バクテリオファージ株は、ＲＬＦＰプロファイルがＴｅｎｏｖｅｒ（前掲）の基準で「区別不能」又は「近縁関係にある」場合に、参照バクテリオファージ株と「実質的に同等」となる。
従って、「後代」株は、親の寄託されたバクテリオファージ株のＤＮＡ ＲＦＬＰプロファイルと実質的に同等なＤＮＡ ＲＦＬＰプロファイルを有し得る。後代は、親の寄託されたバクテリオファージに対して≧８０％のｇＡＮＩを有し得る。後代は、親の寄託されたバクテリオファージに対して≧９０％のｇＡＮＩを有し得る。後代は、親の寄託されたバクテリオファージに対して≧９５％のｇＡＮＩを有し得る。後代は、親の寄託されたバクテリオファージに対して≧９８％のｇＡＮＩを有し得る。後代は、親の寄託されたバクテリオファージに対して≧９９％のｇＡＮＩを有し得る。
上記で述べたように、参照バクテリオファージ株に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有する変異株は、参照バクテリオファージ株と同一の表現型特性を有するものと推定され、またそのようにみなされる。従って、本開示には、参照寄託株に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有する寄託株の変異体、及び寄託株と同一の表現型特性を有する他の変異体を含む組成物が含まれる。
本明細書に記載されるような所与の組成物に使用される、本明細書に記載される特定の単離されたバクテリオファージ株又は単離株の組み合わせは、ＡＩＥＣの標的株をベースとして選択することができる。例えば、組成物中の単離されたバクテリオファージ株を使用して特定の対象又は対象群を処置する前に、標的株に対する有効性を確認するため、本明細書に記載される単離されたバクテリオファージ株又は２つ以上の単離株の組み合わせをＡＩＥＣの標的株に対してインビトロで試験することができる。好適なスクリーニング方法は当技術分野において公知であり、本明細書の実施例に例示されている。このような試験で使用するために、ＡＩＥＣの標的株は、特定の対象若しくは対象群から得られた臨床検体から、特定の対象若しくは対象群の環境から得ることができるか、又は他の供給源から同定して得ることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなバクテリオファージ組成物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＬＦ８２、０７０８１、０７０８２、０７０７６及び０６０７５から選択される１つ以上のＡＩＥＣ株をまとめて特異的に標的化する（感染して溶解させる）１つ以上の単離されたバクテリオファージ株を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなバクテリオファージ組成物は、ＡＩＥＣ株ＬＦ８２を特異的に標的化する１つ以上の単離されたバクテリオファージ株を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなバクテリオファージ組成物は、単離されたバクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２又はＥＣＭＬ－１２３－２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなバクテリオファージ組成物は、単離されたバクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなバクテリオファージカクテルは、以下の株の各々の単離されたバクテリオファージを含む：（ｉ）Ｐ２又はＰ２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；（ｉｉ）Ｐ８又はＰ８に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；（ｉｉｉ）ＣＬＢ＿Ｐ２又はＣＬＢ＿Ｐ２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；（ｉｖ）ＥＣＭＬ－１１９又はＥＣＭＬ－１１９に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；（ｖ）ＥＣＭＬ－３５９又はＥＣＭＬ－３５９に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；（ｖｉ）ＥＣＭＬ－３６３又はＥＣＭＬ－３６３に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；及び（ｖｉｉ）ＥＣＭＬ－１２３－２又はＥＣＭＬ－１２３－２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなバクテリオファージカクテルは、株Ｐ２、Ｐ８、ＣＬＢ＿Ｐ２、ＥＣＭＬ－１１９、ＥＣＭＬ－３５９、ＥＣＭＬ－３６３及びＥＣＭＬ－１２３－２の各々の単離されたバクテリオファージを含む。下記の実施例に例示されるように、これら７つのファージは、宿主／標的の範囲が広く、重複する部分があり、これらのバクテリオファージが標的化するＡＩＥＣ細菌に暴露されているヒトの腸内、又は任意の他の臓器若しくは他の場所にバクテリオファージ非感受性変異体（ＢＩＭ）が出現するリスクを低減することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなバクテリオファージカクテルは、以下の株の各々の単離されたバクテリオファージを含む：（ｉ）ＥＣＭＬ－１２３－２又はＥＣＭＬ－１２３－２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；並びに（ｉｉ）本明細書に記載される他のバクテリオファージから選択される１つ以上、例えばＰ２、Ｐ８、ＣＬＢ＿Ｐ２、ＥＣＭＬ－１１９、ＥＣＭＬ－３５９、及びＥＣＭＬ－３６３のうちの１つ以上、並びにこの寄託株に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体。いくつかの実施形態では、カクテルは、（ｉ）ＥＣＭＬ－１２３－２、並びに（ｉｉ）Ｐ２、Ｐ８、ＣＬＢ＿Ｐ２、ＥＣＭＬ－１１９、ＥＣＭＬ－３５９、及びＥＣＭＬ－３６３のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなバクテリオファージカクテルは、（ｉ）Ｐ２、Ｐ８、ＣＬＢ＿Ｐ２から選択される１つ以上の株の単離されたバクテリオファージ、及びこの寄託株に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株、並びに（ｉｉ）ＥＣＭＬ－３５９、ＥＣＭＬ－３６３から選択される１つ以上の株の単離されたバクテリオファージ、及びこの寄託株に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株を含む。このようなカクテルは、任意選択により、株ＥＣＭＬ－１２３－２又はＥＣＭＬ－１２３－２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体のバクテリオファージを更に含み得る。いくつかの実施形態では、カクテルは、（ｉ）Ｐ２、Ｐ８、及びＣＬＢ＿Ｐ２から選択される１つ以上の株の単離されたバクテリオファージ、並びに（ｉｉ）ＥＣＭＬ－３５９及びＥＣＭＬ－３６３から選択される１つ以上の株の単離されたバクテリオファージを含む。このようなカクテルは、任意選択により、株ＥＣＭＬ－１２３－２のバクテリオファージを更に含み得る。
本明細書に記載されるバクテリオファージカクテルは、ＡＩＥＣのコロニー形成を予防するのに有効な、ＡＩＥＣの感染を予防するのに有効な、ＡＩＥＣのコロニー形成を処置するのに有効な、又はＡＩＥＣの感染を処置するのに有効な１つ以上又は２つ以上の単離されたバクテリオファージ株の量、例えば１用量当たり１０４～１０１１ＣＦＵの単離されたバクテリオファージ、例えば１用量当たり１０６～１０１０ＣＦＵの単離されたバクテリオファージを含み得る。バクテリオファージカクテルは、使用されるバクテリオファージの各々をほぼ同量で用いて調製してもよい。或いは、バクテリオファージカクテルは、全ての標的となるＡＩＥＣに対して全体的に広範な溶解活性を維持しながら、選択された「問題の」ＡＩＥＣ株に対して増強した有効性をもたらすような、異なる量のバクテリオファージを用いて調製してもよい。
他の活性成分
また、本明細書に記載されるような１つ以上又は２つ以上の単離されたバクテリオファージ株を含み、更に１つ以上のプロバイオティクスを含む組成物も提供される。本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」には、プロバイオティクス細菌及びプロバイオティクス酵母が含まれる。好適なプロバイオティクス細菌は、当技術分野において公知であり、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ブルガリクス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．パラカセイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、及びＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（例えば、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、及びＢ．アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ））、並びにストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・セルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｕｓ）、及びバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。好適なプロバイオティクス酵母は、当技術分野において公知であり、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ変種ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖａｒ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、イサチェンキア・オクシデンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ラチャンセア・サーモトレランス（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、メチニコウィア・ジジフィコラ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｚｉｚｉｐｈｉｃｏｌａ）、及びトルラスポラ・デルブリュッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）が挙げられる。
従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、本明細書に記載されるような１つ以上又は２つ以上の単離されたバクテリオファージ株と、１つ以上のプロバイオティクスとを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、本明細書に記載されるような１つ以上又は２つ以上の単離されたバクテリオファージ株と、１つ以上のプロバイオティクス細菌の株とを含む。他の特定の実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、本明細書に記載されるような１つ以上又は２つ以上の単離されたバクテリオファージ株と、１つ以上のプロバイオティクス酵母の株とを含む。更に他の特定の実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、本明細書に記載されるような１つ以上又は２つ以上の単離されたバクテリオファージ株と、１つ以上のプロバイオティクス細菌の株と、１つ以上のプロバイオティクス酵母の株とを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載されるＡＩＥＣバクテリオファージの健康に及ぼすプラスの影響は、プロバイオティクスと組み合わせるときに更に高めることができると考えられる。
１つの具体的な例として、本明細書に記載されるような組成物は、（Ａ）以下の株の各々の単離されたバクテリオファージ：（ｉ）Ｐ２又はＰ２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；（ｉｉ）Ｐ８又はＰ８に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；（ｉｉｉ）ＣＬＢ＿Ｐ２又はＣＬＢ＿Ｐ２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；（ｉｖ）ＥＣＭＬ－１１９又はＥＣＭＬ－１１９に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；（ｖ）ＥＣＭＬ－３５９又はＥＣＭＬ－３５９に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；（ｖｉ）ＥＣＭＬ－３６３又はＥＣＭＬ－３６３に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体；及び（ｖｉｉ）ＥＣＭＬ－１２３－２又はＥＣＭＬ－１２３－２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体、並びに（Ｂ）１つ以上のプロバイオティクスを含み得る。別の例として、本明細書に記載されるようなプロバイオティクスカクテル組成物は、（Ａ）単離株Ｐ２、Ｐ８、ＣＬＢ＿Ｐ２、ＥＣＭＬ－１１９、ＥＣＭＬ－３５９、ＥＣＭＬ－３６３及びＥＣＭＬ－１２３－２の各々、並びに（Ｂ）１つ以上のプロバイオティクスを含み得る。プロバイオティクスを含む任意の実施形態では、１つ以上のプロバイオティクスは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種（例えば、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ブルガリクス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．パラカセイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、及びＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（例えば、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、及びＢ．アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ））、並びにストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・セルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｕｓ）、及びバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から選択される１つ以上のプロバイオティクス細菌；サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ変種ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖａｒ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、イサチェンキア・オクシデンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ラチャンセア・サーモトレランス（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、メチニコウィア・ジジフィコラ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｚｉｚｉｐｈｉｃｏｌａ）、及びトルラスポラ・デルブリュッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）から選択される１つ以上のプロバイオティクス酵母、又はその任意の組み合わせであり得る。
任意の実施形態では、本明細書に記載されるような１つ以上又は２つ以上の単離されたバクテリオファージ株とプロバイオティクスとを含む組成物は、ＯＴＣ組成物又は医薬組成物であってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような１つ以上又は２つ以上の単離されたバクテリオファージ株とプロバイオティクスとを含む組成物は、下記でより詳細に述べられるように、経口投与用に製剤化される。
本明細書に記載されるバクテリオファージカクテルに関して上記で記載したように、本明細書に記載される組成物は、ＡＩＥＣのコロニー形成を予防するのに有効な、ＡＩＥＣの感染を予防するのに有効な、ＡＩＥＣのコロニー形成を処置するのに有効な、又はＡＩＥＣの感染を処置するのに有効な単離されたバクテリオファージ株の量、例えば１用量当たり１０４～１０１１ＣＦＵの単離されたバクテリオファージ株、例えば１用量当たり１０６～１０１０ＣＦＵの単離されたバクテリオファージ株を含み得る。
また、本明細書に記載されるようなバクテリオファージの誘導産物、及び１つ以上のこのような誘導産物を含む組成物も本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、本明細書に記載されるような１つ以上又は２つ以上のバクテリオファージ株を含み、更に１つ以上のこのような誘導産物を含む。
本明細書で使用される場合、「誘導産物」又は「ファージ誘導産物」とは、核酸、部分的又は完全な遺伝子、溶菌酵素及び他の遺伝子発現産物、並びにバクテリオファージの他の構造成分、例えば改変又は未改変のバクテリオファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ及び合成ポリヌクレオチド配列、並びにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含むポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチド、例えば、ＡＩＥＣに対して活性を有するか、又はＡＩＥＣに対して活性を有する産物をコードする誘導産物を含む（がこれらに限定されない）、本明細書に記載されるバクテリオファージのサブユニット又は発現産物を構成する物質を指す。従って、本明細書に記載されるバクテリオファージの１つ以上の誘導産物は、本明細書に記載される組成物中に含まれていてもよく、本明細書に記載される方法に使用されてもよい。
抗σ因子遺伝子及びその発現産物は、このような誘導産物の例である。本明細書に記載されるファージのうちの１つ以上は、宿主（標的）となるＡＩＥＣの細菌転写活性を阻害する抗σ因子遺伝子をコードし得る。例えば、Ｈｕｇｈｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２：２３１－８６（１９９８）を参照されたい。抗σ因子遺伝子は、このようなファージに標的（ＡＩＥＣ）細菌細胞内で転写を阻害する増強された能力を付与し、それによってファージが標的細菌細胞を溶解する能力が増強される。従って、抗σ因子遺伝子及びその発現産物は、本明細書に記載される組成物中に含まれ得る誘導産物の例であり、組成物の効力及び／又は方法の有効性を高めるように、本明細書に記載される予防的及び治療的処置方法に使用される。
溶菌酵素は、本明細書に記載されるファージ誘導産物の別の例である。本明細書に記載されるバクテリオファージは、宿主（標的）となるＡＩＥＣの溶解に関与する１つ以上の溶菌酵素をコードする。ファージの溶菌酵素は、局所的にペプチドグリカンを分解することによって細菌感染を促進するビリオンの一部として、又は溶解複製サイクルの最後に大規模な細胞溶解を誘導する可溶性タンパク質として、バクテリオファージによって産生される。例えば、Ｂｒｉｅｒｓ，Ｖｉｒｕｓｅｓ １１（２）；１１３（２０１９）を参照されたい。溶菌酵素は、それらが標的化する細菌の迅速な溶解を引き起こし、結果として、標的化する細菌のレベルが大幅に減少するか又は除去される。本明細書に記載される組成物並びに予防的及び治療的処置方法の効力又は有効性を高めることに加えて、溶菌酵素は、特定の細菌を迅速に同定するための検出アッセイに使用することができる。例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｕｓｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ ａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ．”Ｉｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ（２００２）を参照されたい。本明細書に記載される組成物及び方法に使用される溶菌酵素は、ファージ培養物から単離されてもよく、又は組換え技術によって調製されてもよい。従って、溶菌酵素は、本明細書に記載される組成物中に含まれてもよく、組成物の効力及び／若しくは処置方法の有効性を高めるため、又は特異的に標的となるＡＩＥＣ細菌を検出するなどのため、本明細書に記載される予防的及び治療的処置方法、並びに検出方法に使用されてもよい。
従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、１つ以上又は２つ以上のバクテリオファージ株と、１つ以上のこのようなファージ誘導産物、例えば１つ以上の溶菌酵素とを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、組成物中に製剤化されるバクテリオファージの１つ以上によって産生された１つ以上の溶菌酵素を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、追加的又は代替的に、１つ以上の抗σ因子遺伝子又は組成物中に製剤化されたバクテリオファージの１つ以上のその発現産物を含む。任意の実施形態では、１つ以上又は２つ以上のバクテリオファージ株と、ファージ誘導産物、例えばファージ溶菌酵素とを含む組成物は、ＯＴＣ組成物又は医薬組成物であり得る。任意のこのような組成物はまた、上記で述べたような１つ以上のプロバイオティクスを含み得る。
他の組成物特性
上記で述べたように、本明細書に記載されるバクテリオファージ株のうちの１つ以上又は２つ以上を含む組成物が本明細書に提供される。上記で述べたように、組成物はＯＴＣ組成物又は医薬組成物であり得る。例えば、組成物は、医薬組成物、栄養補助食品、機能性食品組成物、栄養補給剤、又はプロバイオティクス組成物であり得る。
本明細書に記載されるようなＯＴＣ組成物又は医薬組成物は、バクテリオファージ株（並びに、いくつかの実施形態では、プロバイオティクス及び／又はファージ誘導産物）と、１つ以上の薬学的に許容される担体と、任意選択により１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む。バクテリオファージに好適な担体及び賦形剤は、当技術分野において公知である。典型的には、薬学的に許容される担体は、薬学的に許容された、非毒性の担体、充填剤、又は希釈剤であり、標的患者（動物又はヒト）に意図された投与経路で投与される医薬組成物を製剤化するためのビヒクルとして使用するのに好適なものである。
薬学的に許容される賦形剤は、助剤又は副成分とも称され、標的患者（動物又はヒト）に意図された投与経路で投与される医薬組成物に従来使用されているものを包含し、マトリックス形成剤、増粘剤、結合剤、滑沢剤、ｐＨ調整剤、保護剤、粘度増強剤、ウィッキング剤、非発泡性崩壊剤及び発泡性崩壊剤を含む崩壊剤、界面活性剤、酸化防止剤、湿潤剤、着色剤、香味剤、矯味剤、甘味剤、保存剤などであるが、これらに限定されない。薬学的に許容されることに加えて、助剤は、典型的に、バクテリオファージ及びプロバイオティクス（存在する場合）を含む組成物の他の成分と適合するように選択される。
本明細書に記載されるＯＴＣ組成物及び医薬組成物は、任意の好適な投与経路（ＡＩＥＣがコロニー形成又は感染した部位に依存し得る）用に製剤化され得る。異なる投与経路用のファージ組成物が開示されている。例えば、Ｑａｄｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（２０１８）５４（１）を参照されたい。例えば、ファージは、経口、頬側、舌下、直腸、鼻腔、局所、耳、膣内、気管支、肺、若しくは非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、胸膜内、膀胱内及び髄腔内を含む）投与、又はインプラント、若しくは尿路リンス若しくはカテーテルを介した投与を含む投与経路用に製剤化することができる。組成物又は投与経路は、本明細書に記載される１つ以上のバクテリオファージの標的効果をもたらすように選択されてもよく、コロニー形成又は感染の部位に依存し得る。
ＯＴＣ組成物及び医薬組成物は、問題の剤形を製造するための任意の好適な方法によって調製されてもよく、このような方法は調剤の当技術分野においてよく知られている。このような方法は、典型的には、本明細書に記載されるような１つ以上のバクテリオファージ（並びに、任意選択により１つ以上のプロバイオティクス及び／又はファージ誘導産物）と、薬学的に許容される担体と、任意選択により１つ以上の薬学的に許容される助剤とを合わせる工程を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、経口投与用に製剤化されて経口投与される。経口投与に好適なＯＴＣ組成物及び医薬組成物の剤形は、当技術分野において公知であり、錠剤（チュアブル錠を含む）、乾燥ファージ含有組成物を含有するハードゲルカプセル剤、液体ファージ含有組成物を含有するソフトゲルカプセル剤、及び糖衣錠などの個別剤形、並びに散剤、粒剤、液剤、懸濁剤、分散剤、シロップ剤、マイクロゲル剤などのバルク剤形が挙げられる。
経口投与用に製剤化されたＯＴＣ組成物及び医薬組成物の剤形は、胃の酸性環境からファージを保護するように製剤化され得る。例えば、経口投与用に製剤化された組成物は、バクテリオファージ（並びに、任意選択によりプロバイオティクス及び／又は溶菌酵素などのファージ誘導産物）を保護し、胃の酸性環境を通過する際の生存率を維持するために、腸溶性コーティング若しくは遅延放出コーティング（コーティングされた錠剤若しくはカプセル剤、若しくはコーティングが施された粒剤の形態など）のようなコーティングが施され得るか、若しくはこのようなコーティングを含み得るか、又は（例えば、アルギン酸－キトサン微粒子内に）マイクロカプセル化され得る。好適なコーティング材料及びマイクロカプセル化材料は、当技術分野において公知である。追加的又は代替的に、経口投与用に製剤化された組成物は、胃酸中和剤（例えば、重炭酸ナトリウムなどの重炭酸塩）のような胃酸を還元する薬剤（例えば、胃酸還元剤）、又はプロトンポンプ阻害剤（例えば、オメプラゾール）と共に製剤化され得るか、又はこれらと共に投与され得る。
追加的又は代替的に、このような組成物は、小腸（例えば、ＣＤを処置するため）若しくは結腸（例えば、ＵＣを処置するため）、又は尿路（例えば、ＵＴＩを処置するため）のような所望の放出部位において、生存可能なファージ（並びに、任意選択によりプロバイオティクス及び／又は溶菌酵素などのファージ誘導産物）の放出をもたらすために、遅延放出コーティングが施され得るか、又は遅延放出コーティングを含み得る。追加的又は代替的に、このような組成物は、長期間にわたってファージ（など）の放出をもたらすように、徐放性コーティングが施され得るか、又は徐放性コーティングを含み得る。このようなコーティングに好適なコーティング材料は、当技術分野において公知である。
例えば、経口投与用に製剤化された本明細書に記載されるような組成物は、以下の成分の１つ以上を含み得る：脱イオン水、医薬品グレード水、又はミネラルウォーターなどの水；塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム；緩衝溶液（ｐＨ７．０～７．５のトリス－ＨＣｌなど）；スクロース（例えば、５％スクロース溶液）、トレハロース、マルトデキストリン、グリセロール、デキストラン、及びソルビトールなどの甘味剤、セルロース；タピオカ、デキストリン、ジェランガム、及びゼラチンなどの増粘剤；並びにヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ（アクリル酸）（「ＰＡＡ」）、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）、及びカゼインなどの他の賦形剤、並びにその任意の２つ以上の組み合わせ。
代替的な実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、直腸投与用に製剤化される。直腸投与に好適なＯＴＣ組成物及び医薬組成物の剤形は、当技術分野において公知であり、直腸投与用の坐剤、直腸フォーム、ローション、ゲル又は浣腸を含み得る。
代替的な実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、膣内投与用に製剤化される。膣内投与に好適なＯＴＣ組成物及び医薬組成物の剤形は、当技術分野において公知であり、膣内投与用の坐剤、クリーム、膣フォーム、ローション、ゲル、膣リンス、又はカテーテルを含み得る。
代替的な実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、胸膜内、膀胱内、及びくも膜下腔内注射を含む注入又は注射によるような非経口投与用に製剤化される。非経口投与に好適な組成物は、当技術分野において公知であり、注射又は注入用に製剤化された無菌水性組成物及び無菌非水性組成物を含み得る。このような組成物は、ユニットドーズ又はマルチドーズ容器、例えば、プレフィルドシリンジ、密封バイアル、密封アンプル、又は密封パウチ内で提供され得る。このような組成物は、すぐに使用できるものであってもよく、又は使用前に無菌液体担体、例えば水で再構成されるフリーズドライ（凍結乾燥）若しくは噴霧乾燥された組成物であってもよい。
代替的な実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、局所投与用に製剤化される。局所投与に好適なＯＴＣ組成物及び医薬組成物の剤形は、当技術分野において公知であり、液剤、乳剤、クリーム、ローション、ゲル、及びスプレーが含まれる。例えば、本明細書に記載されるような組成物を、局所投与用のゲルとして製剤化してもよい。
代替的な実施形態では、本明細書に記載されるような組成物は、経口吸入又は経鼻吸入によるような経肺投与又は気管支投与用に製剤化される。経肺投与に好適な組成物の剤形は、当技術分野において公知であり、散剤組成物及び微粒子製剤（例えば、粉剤又はミスト）が含まれ、これらは定量加圧エアロゾル、ネブライザー、吸入器などを介して生成され、投与され得る。
処置
本明細書に記載されるバクテリオファージ及び組成物は、ＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染のリスクを低減するため、又はＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染を防止するため、又はＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染を処置するため、又は（ＡＩＥＣによるコロニー形成を予防若しくは低減することなどによって）対象のマイクロバイオームを調節するための予防的及び治療的処置方法に使用することができ、或いはＡＩＥＣに関連する疾患若しくは症状（ＣＤ及びＵＣを含むＩＢＤ、結腸癌、ＵＴＩ、新生児髄膜炎、呼吸器疾患及び症状（喘息、ＣＯＰＤ、気管支炎、肺炎、及び肺癌を含む）などを処置するため、又は同様の効果のために使用することができる。
標的となるＡＩＥＣは、任意のＡＩＥＣの株であってよく、典型的には、組成物中に存在するファージのうちの１つ以上によって標的化される（感染して溶解される）ＡＩＥＣの株である。いくつかの実施形態では、標的となるＡＩＥＣは、ＬＦ８２、０７０８１、０７０８２、０７０７６及び０６０７５から選択される１つ以上である。特定の実施形態では、標的となるＡＩＥＣは、ＬＦ８２であるか又はそれを含む。
本明細書に記載されるバクテリオファージ及び組成物は、ＡＩＥＣの感染のリスクのある任意の対象又はＡＩＥＣに感染した任意の対象、例えば、ＣＤ若しくはＵＣを含むＩＢＤ、結腸癌、ＵＴＩ、新生児髄膜炎、又は呼吸器疾患若しくは症状、例えば、喘息、ＣＯＰＤ、気管支炎、肺炎、及び肺癌を含むＡＩＥＣに関連する疾患又は症状に罹患している対象を含む、それを必要とする任意の対象を処置するために予防的又は治療的に使用され得る。対象は、ＡＩＥＣによるコロニー形成のリスクがあるか、又はＡＩＥＣにコロニー形成されている可能性がある。対象は、ＡＩＥＣによる感染のリスクがあるか、又はＡＩＥＣに感染している可能性がある。感染した対象において、ＡＩＥＣは、小腸、大腸、回腸、結腸、尿路、脳、及び／又は肺の１つ以上を含むあらゆる組織に存在する可能性がある。
対象は、ＵＣ又はＣＤを含むいずれかのＩＢＤ、例えば顕微鏡的大腸炎、セリアック病、及び血管炎に罹患している可能性がある。特定の実施形態では、対象は、小腸の少なくとも一部を切除する手術の後にＣＤ患者に生じる可能性のあるような術後の回腸病変の再発を患っている。上記で述べたように、このような再発は、Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓスコアによって測定することができる。例えば、Ｃｈｏｎｇｔｈａｍｍａｋｕｎ，ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｒｅｐ（Ｏｘｆ）５；２７１－７６（２０１７）を参照されたい。
追加的又は代替的に、対象は、結腸癌、ＵＴＩ、新生児髄膜炎、並びに呼吸器疾患及び症状、例えば喘息及びＣＯＰＤなどのＡＩＥＣに関連する別の疾患又は症状に罹患している可能性がある。
本明細書に記載される予防的及び治療的処置方法のいずれかにより、本明細書に記載されるバクテリオファージ及び組成物を任意の有効な投与レジメンに従って投与することができ、この投与レジメンは、達成すべき予防的又は治療的効果（例えば、コロニー形成又は感染又は疾患の予防と処置）、使用される特定のバクテリオファージ、投与経路及び剤形、並びに患者の特徴、例えば、患者の年齢及び体重、患者の状態、並びにＡＩＥＣの感染又は病状のタイプ及び重症度のうちの１つ以上に基づいて変化し得る。例証のみの目的のために、例示的な用量を下記に記載する。
ヒト患者に対する典型的なバクテリオファージの用量は、１０４～１０１１、例えば１０６～１０１０を含む１０３～１０１２プラーク形成単位（ＰＦＵ）のバクテリオファージを含有すると考えられ、１日当たり１回以上、例えば１日当たり１回、２回、３回、４回、又は５回投与され得る。用量は、単一の個々の剤形（例えば、１つの錠剤若しくはカプセル剤）又は複数の個々の剤形（例えば、２つ、３つ、４つ、若しくはそれ以上の錠剤若しくはカプセル剤）で提供してもよく、又は好適な容量のバルク剤形（例えば、１ｍＬの液体組成物）で提供され得る。処置は、１日以上、例えば、１日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、又はそれ以上継続され得る。
適切な投与レジメンの一例は、各々１０８～１０１０ＰＦＵのバクテリオファージを含有する１～３個のカプセル剤又は錠剤であり、１日１～３回で１～４週間経口投与される。適切な投与レジメンの別の例は、１０８～１０１０ＰＦＵのバクテリオファージを含有する１ｍＬの液体組成物であり、１日１～３回で１～４週間経口投与される。実施例６に例示されているように、液体組成物は、摂取前に更なる液体組成物、例えば１５～５０ｍＬの重炭酸塩溶液中で希釈してもよい。このような実施形態では、重炭酸塩溶液はまた、胃酸を中和するように機能し得る。
上記で述べたように、本明細書に記載されるバクテリオファージ組成物及び方法は、胃酸を還元する薬剤と共に使用してもよい。例えば、処置を受けている対象は、プロトンポンプ阻害剤（例えば、オメプラゾール）で処置されてもよく、及び／又はバクテリオファージ組成物の用量を服用する直前に重炭酸塩（例えば、重炭酸ナトリウム）などの胃酸中和剤を摂取してもよい。
ＩＢＤの処置に関するいくつかの実施形態では、本明細書に記載されるバクテリオファージ組成物及び方法は、便微生物移植（ＦＭＴ）と共に使用される。ＦＭＴは治療的介入であり、患者の腸内マイクロバイオームを健康なドナーの結腸細菌で再コロニー化するために、便試料を健康なドナーから患者に移植するものである。ＦＭＴは、ドナーの便試料を移植するか、又はドナーの便試料から単離した微生物を移植することを含み得る。移植は、典型的には浣腸又は結腸鏡検査によって行われるが、上部胃腸管を介して行うことができる。ＦＭＴは現在、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を処置するために主に使用されているが、ＣＤ及びＵＣ患者を含むＩＢＤ患者の処置にも有用であり得る。
ＡＩＥＣの検出方法
本明細書に記載されるバクテリオファージ（又はその溶菌酵素）はまた、対象から入手した生体試料中の標的細菌（例えば、ＡＩＥＣ）を検出するため、例えば、対象がＡＩＥＣに感染しているかどうかを診断するため、及び／又は感染のレベルを評価するため、例えば本明細書に記載されるような処置の必要性若しくは有効性を評価するために、インビトロアッセイで使用することができる。理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載されるバクテリオファージ（又はそれらの溶菌酵素）は、特に、存在する可能性のある他の原核細胞又は真核細胞に影響を及ぼすことなく、標的とされる細菌（例えば、ＡＩＥＣ）を特異的に溶解し、それによって、標的となるＡＩＥＣに特異的なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び／又はプロテインキナーゼ（ＡＫＴ）などの標的細菌の測定可能な産物の放出を特異的に誘導するものと考えられる。従って、標的細菌のＡＴＰの検出に基づいて検出アッセイを実施することができる。
このようなアッセイの例示的な例は以下の通りである。分析すべき臨床材料の試料（例えば、便検体）を入手し、適切な緩衝液中に懸濁する。この懸濁液に１つ以上のバクテリオファージ（又はその溶菌酵素）を添加し、その結果、試料中に存在する任意の標的化された細菌細胞が溶解し、細菌細胞のＡＴＰが放出される。ＡＴＰを検出するために、ルシフェリンにルシフェラーゼ製剤を添加し、例えば照度計を使用して発光を測定する。照度計の測定値と溶解された標的となる細菌細胞の数とで検量線を作成することによって、定量的アッセイを展開することができる（一般に、細菌細胞当たりのＡＴＰの平均量は０．５～１．０ｆｇである）。発光がない場合、分析した試料に標的となる細菌細胞が存在しないことを示している。
ワクチン及びバクテリン
また、本明細書に記載されるバクテリオファージ（又はその溶菌酵素）を使用して調製されたワクチン及びバクテリンも提供される。例えば、本明細書に記載されるバクテリオファージ（寄託株の変異体を含む）又はその溶菌酵素を使用して、標的となる細菌（例えば、標的となるＡＩＥＣ）の特定の株を溶解し、細菌の免疫学的エピトープを含む溶菌液を得ることができ、次に、これを使用して標的となるＡＩＥＣに対するワクチン／バクテリンを調製することができる。最終的なワクチン／バクテリン製剤は、当技術分野において公知の方法によって調製することができる。バクテリンを得るために使用される場合、ファージを除去して最終的なワクチン／バクテリン製剤を得てもよい。或いは、ファージは、生存可能な活性状態で最終製剤中に保持されてもよい。このような実施形態では、ワクチン／バクテリン製剤中に存在するようなファージは、標的となる細菌（例えば、標的となるＡＩＥＣ）に対して製剤の有効性の別の作用機序をもたらす活性を維持してもよく、例えば、これによってワクチン接種を受けた対象に存在する標的細菌（ＡＩＥＣを含む）が溶解され得る。例えば、最終的なワクチン／バクテリン製剤は、ファージが１０３～１０１２ＰＦＵ／ｍｌの範囲のレベルで存在するように調製され得る。例えば、最終的なワクチン／バクテリン製剤は、ファージが１０６～１０１０ＰＦＵ／ｍｌの範囲のレベルで存在するように調製され得る。
特定の実施形態では、ワクチン／バクテリン製剤は、標的患者集団を感染から保護するのに最も関連する免疫学的エピトープを含むワクチン／バクテリン製剤を得るために、標的となる細菌が蔓延して問題となっている株に対して調製される。更に特定の実施形態では、バクテリオファージは、上記で説明したように、最終的なワクチン／バクテリン製剤中に未改変のままで保持される。
バクテリオファージをベースとしたワクチン及びバクテリンはまた、バクテリオファージの関連遺伝子（例えば、溶解活性に関連する遺伝子）を発現する組換え構築物を使用するか、又は上記に概説されたようなプロトコルにおいてファージそれ自体の代用として使用することが可能な、単離された若しくは組換え産生された溶菌酵素を使用することによって調製されてもよい。この一般的な方法論の例は、Ｐａｎｔｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．７１（１）：１０９－１６（２００３）に概説されている。
これらの実施形態のいずれかに従って、ＡＩＥＣによる感染に罹患しているか、若しくはＡＩＥＣによる感染のリスクがある対象、又はＩＢＤを発症しているか、若しくはＩＢＤに罹患するリスクがある対象などの、それを必要とする対象を免疫化するための、上記に記載されるようなバクテリンを含むワクチンの使用も提供される。好適なワクチン接種プロトコルは、本明細書に提供されるガイダンスに基づいて、当業者により発展させることができる。
キット
また、本明細書に記載される様々な実施形態を実施するためのキットも提供される。
本明細書に記載されるバクテリオファージを予防的又は治療的に使用するためのキットは、本明細書に記載されるような組成物を、本明細書に記載されるような組成物を予防的又は治療的に使用するための説明書と共に、任意選択により包装材料と共に含み得る。
ワクチン／バクテリンを予防的又は治療的に使用するためのキットは、本明細書に記載されるようなワクチン／バクテリンを、本明細書に記載されるようなワクチン／バクテリンを予防的又は治療的に使用するための説明書と共に、任意選択により包装材料と共に含み得る。
ＡＩＥＣ検出アッセイのためのキットは、本明細書に記載されるような１つ以上のバクテリオファージ（又は１つ以上のその溶菌酵素）を、本明細書に記載されるようなＡＩＥＣ検出アッセイでバクテリオファージ（又は酵素）を使用するための説明書と共に、任意選択により包装材料と共に含み得る。
以下の実施例において本発明を更に説明するが、いかなる形であっても特許請求の範囲を限定することを意図しない。
実施例１：ＡＩＥＣ株の単離
ＡＩＥＣ浸潤アッセイ
ＡＩＥＣは、Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｍｃ Ｌｅａｎ、ＶＡ）から市販されているヒト胎児空腸及び回腸に由来する、未分化の腸上皮細胞のモデルとして使用される腸細胞株、Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ－４０７（Ｉ－４０７）細胞株から得られたＩｎｔｅｓｔｉｎｅ－４０７細胞（Ｉ－４０７細胞）を使用する浸潤アッセイによって同定することができる。
例えば、４，１０５細胞／ウェルの密度でＩ－４０７細胞を２４ウェル組織培養プレート（Ｐｏｌｙｌａｂｏ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）に播種し、２０時間インキュベートする。細胞単層をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄する。細菌の上皮細胞の湿潤は、ゲンタマイシン保護アッセイ（Ｆａｌｋｏｗ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．９（Ｓｕｐｐ．５）；Ｓ４５０－５５（１９８７））を使用して測定する。上皮細胞当たり細菌１０個の感染多重度で、抗生物質を含まない細胞培養培地１ｍＬ中に各単層を播種する。５％のＣＯ２にて３７℃での３時間のインキュベーション期間の後、単層をＰＢＳで３回洗浄する。１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む新鮮な細胞培養培地を１時間かけて添加し、細胞外細菌を死滅させてから、脱イオン水中１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）で単層を溶解する。このＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の濃度は、少なくとも３０分間は細菌の生存率に影響を与えない濃度である。試料を希釈してミューラー・ヒントン寒天平板に蒔き、コロニー形成単位数を測定する。Ｉ－４０７細胞株で評価した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）浸潤能の結果を、初回接種物に対する細胞内細菌の割合として表す。
このようなプロトコルを使用して、米国付与前公開第２０１６／０１４３９６５号明細書（米国特許第１１，０４０，０７８号明細書）に記載されているように、ＣＤ患者、その家族、及び対照となる対象の新鮮な便から、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＬＦ８２を含む１６６株のＡＩＥＣ株を単離した。これらのＡＩＥＣ株を使用して、本明細書に記載されるファージの活性を、下記の実施例３で報告されているように評価した。
実施例２：ファージの単離及び特性評価
国際公開第２０１４／１７７６２２号パンフレットに記載されているように、ファージＰ２及びＰ８を下水から単離した。
ファージＰ２は、２０１２年１１月１５日にアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４６９５としてブダペスト条約の条項に基づきパスツール研究所のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムに寄託されたものであった。ファージＰ８は、２０１２年１１月１５日にアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４７００としてブダペスト条約の条項に基づきパスツール研究所のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムに寄託されたものであった。
ファージＣＬＢ＿Ｐ２は、Ｍａｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４（８）：１８４４－５４（２０１２）に記載されているように単離した。ファージＣＬＢ＿Ｐ２は、ＪＳ９８バクテリオファージファミリーに属しており、２０１２年９月２７日にアクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４６７５としてブダペスト条約の条項に基づきパスツール研究所のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムに寄託されたものであった。
ファージＥＣＭＬ－１１９、ＥＣＭＬ－１２３－２、ＥＣＭＬ－３５９、及びＥＣＭＬ－３６３を、当技術分野において一般的に公知のプラークアッセイ方法により、汽水（ＥＣＭＬ－１１９及びＥＣＭＬ－１２３－２）又は汚水（ＥＣＭＬ－３５９及びＥＣＭＬ－３６３）から単離した。ＥＣＭＬ－１１９の単離については、米国特許第７，６２５，５５６号明細書に記載されている。同様の方法で他の株を単離した。一般には、標的細菌に溶解特異性を有するバクテリオファージが存在することを示すプラークを細菌叢中に形成させるため、バクテリオファージ製剤を標的細菌（例えば、ＡＩＥＣ）の細菌叢と接触させてインキュベートする。バクテリオファージＤＮＡの安定的な制限断片長プロファイル（ＲＦＬＰ）によって測定するように、プラークを採取し、単一のバクテリオファージ種（モノファージ）が得られるまで連続濃縮プロセスにより希釈して細菌叢に再播種する。
ファージＥＣＭＬ－１１９は、２００７年４月１９日にアクセッション番号ＰＴＡ－８３５１としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたものであった。
ファージＥＣＭＬ－１２３－２は、２０１４年７月２５日にアクセッション番号ＰＴＡ １２１４０８としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたものであった。その配列は、配列番号１に記載されている。
ファージＥＣＭＬ－３５９は、ＳＰ１８バクテリオファージファミリーに属しており、２０１４年７月２５日にアクセッション番号ＰＴＡ １２１４０６としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたものであった。
ファージＥＣＭＬ－３６３は、ｗＶ７バクテリオファージファミリーに属しており、２０１４年７月２５日にアクセッション番号ＰＴＡ １２１４０７としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたものであった。
バクテリオファージの電子顕微鏡検査
精製したファージ粒子を透過型電子顕微鏡で検査することにより、ファージの形態を調査した。高力価（約１０９ＰＦＵ／ｍＬ）のファージ含有無細胞溶菌液（ｐＨ＝７）を、フォルムバール炭素膜（２００メッシュの銅グリッド）の表面に塗布した。試料を１％のリンタングステン酸でネガティブ染色し、次いで１００ｋＶで作動する株式会社日立製作所のＨ－７０００透過型電子顕微鏡下で調査した。ファージは、それらの形態的特徴に基づいて、国際ウイルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ：ＩＣＴＶ、１９５５）のガイドラインに従って分類した。現在の分類学では、バクテリオファージＰ２は、ｗＶ８バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のマイオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、バクテリオファージＰ８は、ＲＢ６９バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のマイオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、バクテリオファージＣＬＢ＿Ｐ２は、ＪＳ９８バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のマイオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、バクテリオファージＥＣＭＬ－１１９は、ＥＰＳ７バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のサイフォウイルス（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、バクテリオファージＥＣＭＬ－１２３－２及びＥＣＭＬ－３６３は、ｗＶ７バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のマイオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、バクテリオファージＥＣＭＬ－３５９は、ＳＰ１８バクテリオファージファミリー内のカウドウイルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目のマイオウイルス（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属する。
各ファージは、溶菌性であり、尾部を有する二本鎖ＤＮＡファージであることが特定された。ファージの配列決定から、任意の望ましくない毒素又は抗生物質耐性をコードする遺伝子の存在は示されなかった。特に、毒素及び他の望ましくない遺伝子（例えば、４０ ＣＦＲ ７２５．４２１に列挙されている遺伝子）のデータベースと対照してファージ配列を分析すると、本明細書に記載される７つのファージは、それらの「望ましくない」遺伝子をいずれも含んでいないことが確認された。
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プロファイル
本明細書に記載されるバクテリオファージの参照ＤＮＡ ＲＦＬＰプロファイルを図１に示す。Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ又はＭｉｄｉｐｒｅｐキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、製造業者の指示に従ってバクテリオファージからＤＮＡを単離した。２６０ｎｍの吸光度を測定することによってＤＮＡを定量化した。約０．５～１．０μｇのＤＮＡを、図中に示されるような適切な制限酵素で消化し、臭化エチジウムで染色した後に、１％アガロースゲル上でＲＦＬＰプロファイルを決定した。
実施例３：ファージ活性－インビトロスクリーニング
本明細書に記載されるバクテリオファージを、インビトロスポットテストアッセイにおいてＡＩＥＣに対する活性についてスクリーニングした。
２種類の濃度のモノファージのバクテリオファージ溶液（約２×１０４ＰＦＵ／ｍＬ及び約１×１０９ＰＦＵ／ｍＬ）を、１株のＡＩＥＣ細菌で被覆したペトリ皿の表面に塗布することによって、スポットテストアッセイを実施した。３０℃で一晩インキュベートした後、プラークの溶解領域を調査すると、試験したＡＩＥＣがバクテリオファージに感受性であったことを示した。表２は、米国付与前公開第２０１６／０１４３９６５号明細書（米国特許第１１，０４０，０７８号明細書）で同定された１６６株のＡＩＥＣ株のうちの３８株に対して、本明細書に記載される寄託された７つのファージを試験した結果を示す（実施例１を参照されたい）。下記の表において、（＋＋）という結果は、両方の濃度でＡＩＥＣがバクテリオファージに感受性であったことを示し、（＋）という結果は、高い方の濃度でのみＡＩＥＣがバクテリオファージに感受性であったことを示し、（－）という結果は、ＡＩＥＣがバクテリオファージに抵抗性であったことを示している。
以下の表は、本明細書に記載される７つのファージの各々に標的化された（感染して溶解された）ＡＩＥＣ株の数を示す。
それとは別に、欧州及び米国のコレクションから入手した２１０株のＡＩＥＣ株における７つのファージの各々の溶解範囲を、２×１０４ＰＦＵ／ｍＬ及び１×１０９ＰＦＵ／ｍＬの２種類の濃度で評価した。以下の表にまとめたように、２１０株の単離株のうち１４９株（７１％）が、７つのモノファージの少なくとも１つに対して２×１０４ＰＦＵ／ｍＬで感受性であったが、９５％はスポットテストアッセイでより一般的に使用される濃度である、より高いファージ濃度（１×１０９ＰＦＵ／ｍＬ）で感受性であった。
本明細書で報告される実験では、最初に、各構成成分のバクテリオファージを、２×１０－４～１×１０－１の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）で、対応する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株内で３７℃で別々に増殖させることによって、７つのファージカクテルを調製した。増殖させた後、各ファージを０．２ミクロンのフィルターを通して濾過することにより採取し、濃縮／０．９％の生理食塩水中で緩衝液交換した。次いで、７つのファージをほぼ等しい濃度で混ぜ合わせてファージカクテルを生成し、これを使用するまで２～８℃で保存した。
加えて、ファージの特異性を評価するために、健康なヒトのマイクロバイオームに通常関連する以下の最も一般的な１２種の属を用いた４３株の非大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）単離株のパネル：バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（１１）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（７）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（１）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（９）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（１）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（１）、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（１）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）（２）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（１）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（５）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（２）、及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（２）に対し、（ほぼ同量の各ファージによって調製された）７つのファージカクテルの活性を評価した。これらの非大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、多様な健康な個体を比較した研究に基づく種の「コアマイクロバイオーム」を代表するものである。注目すべきことに、ＣＤ患者に一般的に処方されるシプロフロキサシンによって、試験した非大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の５８％が標的化された。各単離株を２×１０４ＰＦＵ／ｍＬ又は１×１０９ＰＦＵ／ｍＬの７つのファージカクテルに対してスクリーニングし、また、最も一般的に処方される抗生物質のうちの７つに対してスクリーニングした。パネルにおける４３株の非大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株はどれも、７つのファージカクテルによっていずれの濃度でも溶解されたが、抗生物質では、試験された単離株の１６～８４％を無差別に溶解した。
まとめると、この結果は、本明細書に記載される７つのファージが、多数の異なるＡＩＥＣ株に対して個々に及び合わせて有効であると同時に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に特異的であり、健康なヒトのマイクロバイオームの一般的な細菌を溶解しないことを示している。従って、抗生物質の無分別な活性とは対照的に、本明細書に記載されたファージは、健康なヒトのマイクロバイオームに及ぼす影響があったとしても最小限にしながらＡＩＥＣを標的化するために使用することができる。
実施例４Ａ：安全性－インビボ試験
本明細書に記載されるような７つのファージカクテル（ほぼ同量のファージＥＣＭＬ－１２３－２、ＥＣＭＬ－１１９、ＥＣＭＬ－３５９、ＥＣＭＬ－３６３、ＣＬＢ＿Ｐ２、Ｐ２、及びＰ８のカクテル）が、健康なＢＡＬＢ／ｃＹＪマウスの正常な微生物叢に及ぼす影響を評価した。特に、バクテリオファージ（２×１０９ＣＦＵ／用量、１日２回）又はプラセボ（各群ｎ－１０）によって処置された、（ｉ）処置前、（ｉｉ）１５日間の処置期間の終了時、及び（ｉｉｉ）２８日間の休薬期間後の健康なマウスの便にメタゲノム解析を行った。細菌群集の構造プロファイルを混乱させ、結果の解釈を複雑にする可能性のある任意の抗菌圧又は硫酸デキストラン酸（ＤＳＳ）に晒すことなく、実験を実施した。
この結果により、日常的な変動を除いては、ファージで処置されたマウスの腸内細菌叢の動的構成はプラセボ群のものと有意差がないことが示され、ファージの標的特異性が明確となった。注目すべきことに、健康な未処置マウスにバクテリオファージを投与しても、プラセボ群と比較して、処置群に任意の臨床的変化（即ち、体重減少又は下痢）が生じなかった。これらの結果は、これらの溶菌性ファージの安全性を確実にするものであり、バクテリオファージを長期投与しても、健康な個体の全体的な便微生物叢の構造に影響を与えないことを示している。
実施例４Ｂ：ファージ活性－インビボ試験
本明細書に記載されるようなバクテリオファージカクテル（ほぼ同量のファージＥＣＭＬ－１２３－２、ＥＣＭＬ－１１９、ＥＣＭＬ－３５９、ＥＣＭＬ－３６３、ＣＬＢ＿Ｐ２、Ｐ２、及びＰ８のカクテル）のＡＩＥＣを標的化する能力を、以下のようなインビボ動物モデルで評価した。
ＡＩＥＣ株ＬＦ８２を、それぞれストレプトマイシン及びカナマイシンに対する耐性を付与する２つの抗生物質耐性遺伝子を保有するように改変した。この細菌株をＬＦ８２ＳＫと命名し、その湿潤特性が株ＬＦ８２と類似していることを確認した。
２８匹のＢＡＬＢ／ｃＹＪマウスを以下のような３つの群に分けた：
第１群：ＬＦ８２ＳＫコロニーマウス（１０匹のマウス）
第２群：ＬＦ８２ＳＫコロニーマウス＋ファージカクテル（単回投与）（１２匹のマウス）
第３群：ＬＦ８２ＳＫコロニーマウス＋ファージカクテル（１５日間で１日２回）（６匹のマウス）
０日目の３日前から３日目までに、全てのマウスの飲料水に硫酸ストレプトマイシン（５ｇ／Ｌ）を導入した。０日目、腸内でＬＦ８２ＳＫをコロニー形成させるため、マウスにＬＦ８２ＳＫをＰＢＳ中で強制経口により投与した。デキストラン硫酸（ＤＳＳ）２％及びストレプトマイシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を０日目に飲料水に導入し、それぞれ１０日間及び２２日間飼育した。
８日目、（１）０．９％の生理食塩水を強制経口により第１群の各マウスに１回投与し、（２）ファージカクテル（２×１０７ＰＦＵ／ｍＬの各ファージ）を０．９％の生理食塩水中で強制経口により第２群の各マウスに１回投与し、（３）ファージカクテル（２．８６×１０８ＰＦＵ／ｍＬの各ファージ）を０．９％生理食塩水中で強制経口により第３群の各マウスに投与した。第３群のみ、この投与を１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）１５日間（２２日目まで）継続した。体重及び疾患活動性指数（ＤＡＩ）を毎日観察した。２４日目に、第１群、第２群、及び第３群のマウスを屠殺して回腸、結腸、及び末梢臓器の細菌数を評価し、結腸の重量及び長さを測定し、組織学的評価を行った。結腸を外科的に取り出し、長さ及び重量の測定を行った。４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン内に包埋し、４μｍの薄片に切断し、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色した試料の組織学的評価を、大腸炎の重症度について格付けした。下記に結果を報告するが、報告値は、マウス群毎に得られた平均値±標準偏差を表す。
便及び臓器中のＬＦ８２ＳＫの検出
ＬＦ８２ＳＫのコロニー形成及びファージの存在の両方を、便試料によって観察した。以下の表に示すように、処置前の細菌量は３つの群の間で類似しており、便の約９ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇに達していた。ファージによる処置の間、便中のＬＦ８２ＳＫの存在量は２つの処置群で減少し、第１群と比較して第２群（Ｐ＝０．０１４）及び第３群（Ｐ＝０．００５）でそれぞれ１．４６ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇ及び１．７６ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇの有意な減少を示した。２４日目、ＬＦ８２ＳＫの自然排泄量は全ての群で同等であり、有意差はなかった。
ファージを定量化すると、第１群（４．７６±１．０４ ｌｏｇ ＰＦＵ／ｇ）と比較して、８日目の第３群では便中により高い放出が確認された（６．５１±１．３７ ｌｏｇ ＰＦＵ／ｇ）。しかしながら、定期的な採取によるファージの存在量の評価には一貫性がなく、検出限界のために群間で区別することができなかった。この結果から、いかなるマウスの困難な臨床症状も末梢臓器への転移もなく、含有されたファージが腸を通過することが示され、このことは、本明細書に記載されたバクテリオファージ及びカクテルの安全な使用を更に裏付けるものであった。
ＬＦ８２ＳＫの負荷量を、剖検時（２４日目）にマウスの消化管の異なる部分で定量化し、回腸末端又は結腸中央の管腔試料及び粘膜試料の両方を調査すると、以下の表で報告されるように、処置（ファージ又はプラセボ）に関わらず、便中のＬＦ８２ＳＫの数又は管腔及び付着細菌叢における差異は、この時点ではどのセグメントでも認められなかった。
２４日目に、（１）第１群の生存マウス５匹のうち２匹の腎臓、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）、脾臓、及び心臓にＬＦ８２ＳＫ（ＡＩＥＣ株）が検出され、（２）第２群の生存マウス５匹のうち１匹のＭＬＮのみにＬＦ８２ＳＫが検出され、（３）第３群の生存マウス６匹のいずれかのＭＬＮ、血液、脾臓、肝臓、腎臓、又は心臓にはＬＦ８２ＳＫが検出されなかった。
マウスの生存率及び体重増加
２４日目、第１群では５／１０匹のマウスが死亡し、第２群では７／１２匹のマウスが死亡し、第３群では０／６匹のマウスが死亡した。従って、第１群及び第２群は死亡率に明確な区別はなかったが、第３群のファージによる処置では、対照の第１群と比較して明確な効果があったことが示された（第１群における死亡率が５０％であるのに対し、第３群における死亡率はゼロ）。
１２日目、第１群及び第２群のマウスの体重が減少し始めた。１５日目、第１群及び第２群の体重減少が最大に達した。２１日目に、第１群のマウスが初期体重まで回復した。第３群のマウスは、０日目から２４日目まで体重を維持したか又は増加した。２４日目に、第１群のマウスは初期体重の約９７％（予想外というわけではないが、生存動物が回復したことを示している）、第２群のマウスは初期体重の約１０８％であり、第３群のマウスは初期体重の約１１５％であった。
結腸炎症
７日目に、第１群のマウスのＤＡＩが増加し始め、１６日目に最大４．２５（±０．９４）まで増加した。１２日目に、第２群のマウスのＤＡＩが増加し始め、１５日目に最大の３．４５（＋／－１．９７）まで増加した。第３群のマウスのＤＡＩは、０．７＋／－０．５を決して超えることはなかった。第３群のマウスのＤＡＩは、１４日目から１７日目の間に便の硬さがわずかに軟らかくなったことに主に起因するものであったが、第１群及び第２群のマウスは、体重減少、下痢、及び若干の出血を示した。
第２群及び第３群のマウスは、ＤＡＩで測定した場合、第１群のマウスと比較して結腸炎症が減少したことを示した。ＤＡＩは、ファージ投与のレベルが増加するにつれて減少した。
２４日目、第１群、第２群、及び第３群のマウスの結腸の重量／サイズの比は、それぞれ４１．４±３．７、３１．８±２．８、及び１９．２±１．１であった。第２群及び第３群のマウスは、結腸のサイズ及び重量で測定した場合、第１群のマウスと比較して結腸炎症が減少したことを示した。結腸の重量：サイズの比は、ファージ投与のレベルが増加するにつれて減少した。
２４日目、第１群、第２群、及び第３群のマウスの炎症の組織学的スコアは、それぞれ８．２±２．２、６．４±１．８、及び２．７±０．３であった。第２群及び第３群のマウスは、組織構造で測定した場合、第１群のマウスと比較して結腸炎症が減少したことを示した。炎症の組織学的スコアは、ファージ投与のレベルが増加するにつれて減少した。
この実施例は、インビボにおけるＡＩＥＣの感染に対して、本明細書に記載されるようなファージカクテルが有効であることを立証するものである。
実施例５：ファージ製剤の生成
本明細書に記載されるＡＩＥＣバクテリオファージは、本明細書に例示されるように同定して増殖させることができる。
同定のために、標的細菌（例えば、ＡＩＥＣ）の栄養ブロス培養物と推定上のバクテリオファージ製剤とを混合し、次いで、例えば栄養ブロス中に溶解させた寒天に添加し、その混合物を寒天で固化した栄養ブロスを含むペトリ皿に注ぎ入れ、３７℃で一晩インキュベートする。一晩インキュベートする間に、ＡＩＥＣが寒天中で増殖し、バクテリオファージに感染した一部のＡＩＥＣ細胞によってコンフルエントな菌叢が形成される。ファージが複製され、最初に感染細胞を溶解し、続いてその付近の細菌に感染して溶解する。寒天はファージがプレート全体に広がるのを物理的に制限し、その結果、増殖したＡＩＥＣのコンフルエントな菌叢内でバクテリオファージがＡＩＥＣを崩壊させている、プラークと呼ばれる小さな視覚的に透明な領域が、プレート上に生じる。異なる形態の１つのプラークは、細菌叢のその領域のＡＩＥＣ内で複製された１つのファージを示す。従って、そのプラーク内の物質をピペットにより取り出し（「プラークピック」と称する）、この物質をそのファージの更なる増殖サイクルのために接種物として使用することにより、純粋なバクテリオファージ製剤を得ることができる。この手法の後に、安定的なＤＮＡ ＲＦＬＰプロファイルによって測定することができるように、プラークを採取し、単一のバクテリオファージ種（モノファージ）が得られるまで連続濃縮プロセスにより希釈して細菌叢に再播種する。
増殖のために、バクテリオファージが増殖可能な標的細菌（例えば、ＡＩＥＣ）又は他の近縁関係にある細菌種の株を、適切な増殖培地（例えば、ＢＨＩブロス）を使用して回分培養で培養し、所定の感染多重度（ＭＯＩ）のバクテリオファージを接種する。インキュベートして細菌を溶解した後に、バクテリオファージを採取して精製及び／又は濃縮すると、本明細書に記載される用途に好適なファージの後代が得られる。
好適な精製及び濃縮手順としては、濾過、遠心分離（連続流遠心分離を含む）、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、並びに他の公知のバクテリオファージ精製及び濃縮技術のうちの１つ以上が挙げられる。例えば、Ａｄａｍｓ ＭＨ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．４４３－５１９（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌｔｄ，Ｌｏｎｄｏｎ）（１９５９）を参照されたい。ファージ製剤の純度は、電子顕微鏡、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＤＮＡ制限消化、及び分析用超遠心のうちの１つ以上によって評価することができる。
製剤のバクテリオファージ濃度は、ファージ滴定プロトコルを使用して調整することができる。例えば、製剤のバクテリオファージ濃度を測定する。より濃縮されたファージ製剤が所望される場合は、濾過、遠心分離、又は他の手段のうちの１つ以上によって濃度を上昇させる。より濃度の低いファージ製剤が所望される場合は、水又は他の薬学的に許容される希釈剤（薬学的に許容される緩衝液など）で希釈することにより濃度を低下させる。典型的な医薬品組成物又はＯＴＣ組成物は、１０６～１０１２ＰＦＵ／ｍＬのファージ力価、例えば１０９～１０１１ＰＦＵ／ｍＬのファージ力価を含む。
バクテリオファージ製剤は、２～８℃で保存してもよい。或いは、ファージ製剤は、保存のために凍結乾燥若しくは噴霧乾燥することができるか、又は、タンパク質、脂質、及び多糖類のうちの１つ以上を用いるような当技術分野において公知の手法によってカプセル化して安定化させることができる。再構成時に、ファージ滴定プロトコル、宿主細菌アッセイ、又は他の広く知られているバクテリオファージアッセイ技術を使用してファージ力価を確認することができる。例えば、Ａｄａｍｓ（前掲）を参照されたい。
実施例６：第Ｉ／ＩＩａ相臨床試験
本明細書に記載されるようなバクテリオファージカクテル（ファージＥＣＭＬ－１２３－２、ＥＣＭＬ－１１９、ＥＣＭＬ－３５９、ＥＣＭＬ－３６３、ＣＬＢ＿Ｐ２、Ｐ２、及びＰ８のカクテル）の安全性及び忍容性、並びに非活動性ＣＤを有する対象の便のＡＩＥＣレベルに及ぼす影響を評価するために、第Ｉ／ＩＩａ相二重盲検無作為化プラセボ対照臨床試験が進行中である。
適格となる対象は、≧１８歳の男性又は女性であり、Ｈａｒｖｅｙ－Ｂｒａｄｓｈａｗ指数（ＨＢＩ）が＜４であり、便にＡＥＩＣが検出された、臨床的及び客観的な寛解期の非活動性のクローン病を有する対象である。ＵＣ、結腸直腸腫瘍、消化管出血、活動性の悪性腫瘍、又は直近で悪性疾患を有する対象は除外される。
対象をファージによる処置か、又はプラセボに無作為化した。ファージカクテルを１５日間で１日２回、少なくとも食事の１時間前に経口投与する。カクテルの各用量には、１ｍＬの０．９％塩化ナトリウム溶液中に約１×１０１０ＰＦＵのファージが含有される。（プラセボは１ｍＬの０．９％塩化ナトリウム溶液である）。投与直前に、摂取のためこの用量を３０ｍＬの重炭酸水と混合する。
治療を開始する１週間前に、対象は、胃酸を還元するため、対象の毎日の最初の食事の３０分前に１日２０ｍｇの用量のプロトンポンプ阻害薬（オメプラゾール）の服用を開始する。プロトンポンプ阻害剤による処置は、治療期間全体を通して継続する。加えて、各用量を摂取する数分前に、対象は胃酸を中和するために１２０ｍＬの重炭酸水を摂取する。
研究の主要評価項目は、治療下で発現した有害事象及び重篤な有害事象の発生率及び重篤度である。副次的評価項目には、全てのＡＩＥＣ及びファージに感受性のあるＡＩＥＣを含む、便中に存在するＡＩＥＣのレベルが含まれる。

Claims (44)

  1. 付着性侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株に溶菌感染を生じさせることが可能なバクテリオファージ株、及び薬学的に許容される担体を含む組成物であって、前記バクテリオファージ株は、ＡＴＣＣにアクセッション番号ＰＴＡ－１２１４０８として寄託された株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対してそのゲノムにわたり少なくとも８０％の平均ヌクレオチド同一性（ｇＡＮＩ）を有するその変異株である組成物。
  2. 請求項１に記載の組成物であって、
    アクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４６９５としてパスツール研究所のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムに寄託された株Ｐ２又は前記バクテリオファージ株Ｐ２に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    アクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４７００としてパスツール研究所のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムに寄託された株Ｐ８又は前記バクテリオファージ株Ｐ８に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    アクセッション番号ＣＮＣＭ Ｉ－４６７５としてパスツール研究所のフレンチ・ナショナル・コレクション・オブ・マイクロオーガニズムに寄託された株ＣＬＢ＿Ｐ２又は前記バクテリオファージ株ＣＬＢ＿Ｐ２に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    アクセッション番号ＰＴＡ－８３５１としてＡＴＣＣに寄託された株ＥＣＭＬ－１１９又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１１９に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    アクセッション番号ＰＴＡ－１２１４０７としてＡＴＣＣに寄託された株ＥＣＭＬ－３６３又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３６３に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異株；及び
    アクセッション番号ＰＴＡ－１２１４０６としてＡＴＣＣに寄託された株ＥＣＭＬ－３５９又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３５９に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有するその変異体
    から選択される１つ以上のバクテリオファージ株を更に含む組成物。
  3. 請求項２に記載の組成物であって、存在する前記バクテリオファージ株が、
    株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    株Ｐ２、又は前記バクテリオファージ株Ｐ２に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    株Ｐ８、又は前記バクテリオファージ株Ｐ８に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    株ＣＬＢ＿Ｐ２、又は前記バクテリオファージ株ＣＬＢ＿Ｐ２に対して少なくとも９０％のｇａＮＩを有するその変異株；
    株ＥＣＭＬ－１１９、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１１９に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    株ＥＣＭＬ－３６３、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３６３に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異株；及び
    株ＥＣＭＬ－３５９、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３５９に対して少なくとも９０％のｇＡＮＩを有するその変異体
    を含むか又はそれからなる組成物。
  4. 請求項２に記載の組成物であって、存在する前記バクテリオファージ株が、
    株ＥＣＭＬ－１２３－２、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    株Ｐ２、又は前記バクテリオファージ株Ｐ２に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    株Ｐ８、又は前記バクテリオファージ株Ｐ８に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    株ＣＬＢ＿Ｐ２、又は前記バクテリオファージ株ＣＬＢ＿Ｐ２に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    株ＥＣＭＬ－１１９、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１１９に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；
    株ＥＣＭＬ－３６３、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３６３に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異株；及び
    株ＥＣＭＬ－３５９、又は前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－３５９に対して少なくとも９５％のｇＡＮＩを有するその変異体
    を含むか又はそれからなる組成物。
  5. 請求項２に記載の組成物であって、存在する前記バクテリオファージ株が、株ＥＣＭＬ－１２３－２、Ｐ２、Ｐ８、ＣＬＢ＿Ｐ２、ＥＣＭＬ－１１９、ＥＣＭＬ－３６３、及びＥＣＭＬ－３５９の各々のバクテリオファージを含むか又はそれからなる組成物。
  6. 前記組成物が、プロバイオティクス細菌及びプロバイオティクス酵母のうちの１つ以上を更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記組成物が、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ブルガリクス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．パラカセイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ラクティス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・セルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びその任意の組み合わせのうちの１つ以上から選択されるプロバイオティクス細菌を含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記組成物が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ変種ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｖａｒ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、イサチェンキア・オクシデンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ラチャンセア・サーモトレランス（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、メチニコウィア・ジジフィコラ（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｚｉｚｉｐｈｉｃｏｌａ）、トルラスポラ・デルブリュッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、及びその任意の組み合わせのうちの１つ以上から選択されるプロバイオティクス酵母を含む、請求項６又は７に記載の組成物。
  9. 前記組成物が、経口剤形で提供され、任意選択により腸溶性コーティングで提供され、任意選択により錠剤、ハードゲルカプセル剤、ソフトゲルカプセル剤、糖衣錠、散剤、粒剤、液剤、懸濁剤、分散剤、シロップ剤、及びマイクロゲル剤から選択される形態で提供される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 任意選択により胃酸中和剤及びプロトンポンプ阻害剤から選択される胃酸還元剤を更に含む、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記組成物が、
    直腸剤形、任意選択により座薬、浣腸、直腸フォーム、ローション、又はゲル；
    膣剤形、任意選択により座薬、クリーム膣フォーム、ローション、又はゲル；
    経肺剤形、任意選択により散剤、エアロゾル、ネブライザー、又は吸入器組成物；及び
    注射剤形
    から選択される剤形で提供される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記組成物が、医薬組成物又は一般用医薬品組成物である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記組成物が、栄養補助食品、機能性食品組成物、栄養補給剤、又はプロバイオティクス組成物である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. それを必要とする対象におけるＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染のリスクを低減するか、若しくはＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染を予防若しくは処置する、又はそれを必要とする対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、尿路感染症（ＵＴＩ）、新生児髄膜炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支炎、肺炎、及び肺癌のうちの１つ以上を処置する、又はヒト対象のマイクロバイオームを調節するための方法であって、請求項１～１３のいずれか一項に記載のバクテリオファージ組成物を前記対象に投与することを含む方法。
  15. それを必要とする対象におけるＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染のリスクを低減するか、若しくはＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染を予防若しくは処置する、又はそれを必要とする対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、尿路感染症（ＵＴＩ）、新生児髄膜炎、喘息、ＣＯＰＤ、気管支炎、肺炎、及び肺癌のうちの１つ以上を処置する、又はヒト対象のマイクロバイオームを調節するために使用される、請求項１～１３のいずれか一項に記載のバクテリオファージ組成物。
  16. それを必要とする対象におけるＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染のリスクを低減するか、若しくはＡＩＥＣのコロニー形成若しくは感染を予防若しくは処置するための、又はそれを必要とする対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、尿路感染症（ＵＴＩ）、新生児髄膜炎、喘息、ＣＯＰＤ、気管支炎、肺炎、及び肺癌のうちの１つ以上を処置するための、又はヒト対象のマイクロバイオームを調節するための医薬の調製における、請求項１～１３のいずれか一項に記載のバクテリオファージ組成物の使用。
  17. 前記対象が、ＡＩＥＣによるコロニー形成若しくは感染のリスクがあるか、又はＡＩＥＣにコロニー形成されているか若しくは感染している、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  18. 前記ＡＩＥＣが、前記対象の小腸又は大腸のうちの１つ以上に存在する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  19. 前記ＡＩＥＣが、前記対象の結腸に存在する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  20. 前記ＡＩＥＣが、前記対象の尿路に存在する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  21. 前記ＡＩＥＣが、前記対象の肺に存在する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  22. 前記ＡＩＥＣが、ＬＦ８２、０７０８１、０７０８２、０７０７６及び０６０７５から選択される１つ以上の株であり、任意選択により、前記ＡＩＥＣが株ＬＦ８２であるか又は株ＬＦ８２を含む、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  23. 前記方法又は使用が、前記対象の小腸、大腸、結腸、尿路、脳及び肺の１つ以上にＡＩＥＣがコロニー形成するのを低減又は防止するのに効果的である、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  24. 前記対象が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患しており、任意選択により、前記対象がクローン病（ＣＤ）、若しくは潰瘍性大腸炎（ＵＣ）に罹患しているか、又は術後、任意選択によりＣＤ患者の小腸の少なくとも一部を切除するための手術後の回腸病変の再発を患っている、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  25. 前記バクテリオファージ組成物が経口投与される、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  26. 任意選択により胃酸中和剤及びプロトンポンプ阻害剤から選択される胃酸還元剤を、前記対象に経口投与することを更に含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記バクテリオファージ組成物が、直腸、膣内、経肺、及び注射から選択される経路によって投与される、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  28. 前記方法又は使用が、プロバイオティクスを前記対象に投与することを更に含み、任意選択により、前記プロバイオティクスが前記バクテリオファージと同一の組成物中で提供され、任意選択により、前記組成物が経口投与される、請求項１４～２７のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  29. 前記対象が、便微生物移植で追加的に処置される、請求項１４～２８のいずれか一項に記載の方法、使用される組成物、又は使用。
  30. アクセッション番号ＰＴＡ－１２１４０８としてＡＴＣＣに寄託された、株ＥＣＭＬ－１２３－２の単離されたバクテリオファージ。
  31. 請求項３０に記載のバクテリオファージの単離された変異株であって、前記変異株が前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対して少なくとも８０％のｇＡＮＩを有し、任意選択により、前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２の後代である、単離された変異株。
  32. 請求項３１に記載の単離された変異株であって、前記変異株が、前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対して≧９０％のｇＡＮＩを有する、単離された変異株。
  33. 請求項３１に記載の単離された変異株であって、前記変異株が前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対して≧９５％のｇＡＮＩを有する、単離された変異株。
  34. 請求項３１に記載の単離された変異株であって、前記変異株が前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２に対して≧９８％又は≧９９．９％のｇＡＮＩを有する、単離された変異株。
  35. 請求項３０～３４のいずれか一項に記載のバクテリオファージ株の単離された後代株であって、この後代株が前記バクテリオファージ株ＥＣＭＬ－１２３－２と実質的に同等のＲＦＬＰ ＤＮＡプロファイルを有する、単離された後代株。
  36. 請求項３０～３５のいずれか一項に記載のバクテリオファージ株によって産生された溶菌酵素を含む組成物。
  37. 請求項３０～３５のいずれか一項に記載のバクテリオファージ株の誘導産物を含む組成物であって、前記誘導産物が、ＡＩＥＣに対する活性を有するか、又はＡＩＥＣに対する活性を有する産物をコードし、任意選択により、前記誘導産物がＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ及び合成ポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、並びに抗σ因子遺伝子及びその発現産物から選択される１つ以上である組成物。
  38. 請求項３０～３５のいずれか一項に記載のバクテリオファージ株又はその溶菌酵素でＡＩＥＣ株を溶解させることによって得られるＡＩＥＣ溶菌液を含むワクチン。
  39. ＡＩＥＣの感染に対して対象をワクチン接種するために使用される、請求項３０～３５のいずれか一項に記載のバクテリオファージ株又はその溶菌酵素でＡＩＥＣ株を溶解させることによって得られるＡＩＥＣ溶菌液。
  40. ＡＩＥＣの感染に対して対象をワクチン接種するための医薬の調製におけるＡＩＥＣ溶菌液の使用であって、前記ＡＩＥＣ溶菌液が、請求項３０～３５のいずれか一項に記載のバクテリオファージ株又はその溶菌酵素でＡＩＥＣ株を溶解させることによって得られる使用。
  41. ＡＩＥＣの感染に対して対象をワクチン接種するための方法であって、請求項３０～３５のいずれか一項に記載のバクテリオファージ株でＡＩＥＣ株を溶解させることによって得られた溶菌液を、前記対象に投与することを含む方法。
  42. 試料中のＡＩＥＣ細菌を検出するための方法であって、請求項３０～３５のいずれか一項に記載のバクテリオファージ又はその溶菌酵素で前記試料を処置し、これによって測定可能なＡＩＥＣ細菌産物の放出を特異的に誘導し、前記放出されたＡＩＥＣ細菌産物を測定することを含む方法。
  43. 前記放出されたＡＩＥＣ細菌産物が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びプロテインキナーゼ（ＡＫＴ）のうちの１つ以上である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記試料が、対象から入手した便試料である、請求項４２又は４３に記載の方法。
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