CN107636146A - 被工程化为治疗受益于降低的消化道炎症和/或收紧的消化道粘膜屏障的疾病的细菌 - Google Patents

被工程化为治疗受益于降低的消化道炎症和/或收紧的消化道粘膜屏障的疾病的细菌 Download PDF

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文森特·M·伊莎贝拉
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Abstract

公开了遗传工程化的细菌、其药物组合物，以及治疗或预防自身免疫性紊乱、抑制消化道中炎性机制和/或收紧消化道粘膜屏障功能的方法。

Description

被工程化为治疗受益于降低的消化道炎症和/或收紧的消化 道粘膜屏障的疾病的细菌
本申请通过引用在此并入2015年3月2日提交的美国临时申请第62/127,097号；2015年10月30日提交的美国申请第62/248,814号；2015年11月16日提交的美国临时申请第62/256,042号；2016年2月4日提交的美国临时申请第62/291,461号；2015年3月2日提交的美国临时申请第62/127,131号；2015年10月30日提交的美国临时申请第62/248,825号；日期为2015年11月16日的美国临时申请62/256,044号；2016年2月4日提交的美国临时申请第62/291,470号；2015年6月25日提交的美国临时申请62/184,770；2015年10月30日提交的美国临时申请第62/248,805号；2015年11月16日提交的美国临时申请第62/256,048号；2016年2月4日提交的美国临时申请第62/291,468号；日期为2015年12月22日的美国申请第14/998,376号，其各自的全部内容通过引用以其整体明确并入本文。
本公开内容涉及用于抑制消化道中炎性机制、恢复和收紧消化道粘膜屏障功能、和/或治疗和预防自身免疫性紊乱的组合物和治疗方法。在某些方面，本公开内容涉及能够降低消化道中的炎症和/或增强肠消化道屏障功能的遗传工程化的细菌。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够降低消化道炎症和/或增强消化道屏障功能，从而改善或预防自身免疫性紊乱。在一些方面，本文公开的组合物和方法可以用于治疗或预防自身免疫性紊乱以及与消化道炎症和/或受损的消化道屏障功能相关的疾病和状况，例如，腹泻疾病、炎性肠病和相关疾病。
炎性肠病(IBD)为由胃肠道中通常由T细胞和活化的巨噬细胞驱动的显著局部炎症以及受损的上皮屏障(将消化道的腔内含物与宿主循环系统分开)功能为特征的一组疾病(Ghishan等，2014)。IBD发病机制与遗传因素和环境因素两者均相关，并且可能由消化道微生物和肠免疫系统之间改变的相互作用引起。目前治疗IBD的方法集中于调节免疫系统和抑制炎症的治疗剂。这些疗法包括类固醇，诸如泼尼松，和肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂，诸如(Cohen等，2014)。该方法的缺点与全身免疫抑制相关，这包括对感染性疾病和癌症的更大的易感性。
其他方法集中于通过经由灌肠剂供应短链脂肪酸丁酸(butyrate)来治疗受损的屏障功能。最近，几个组已经证明了通过共生细菌的短链脂肪酸产生在调节消化道免疫系统中的重要性(Smith等，2013)，显示丁酸在诱导调节性T细胞的分化和抑制与IBD中的炎症相关的免疫应答中发挥直接作用(Atarashi等，2011；Furusawa等，2013)。丁酸通常由膳食纤维的微生物发酵产生，并且在维持结肠上皮细胞稳态和屏障功能中发挥核心作用(Hamer等，2008)。对丁酸灌肠剂的研究已经显示出对患者的一些益处，但该治疗对于长期疗法是不现实的。最近，患有IBD的患者已经用来自健康患者的粪便转移进行治疗，并取得了一些成功(Ianiro等，2014)。该成功说明消化道微生物在疾病病理学中发挥的核心作用，并表明某些微生物功能与改善IBD疾病过程相关。然而，该方法引起了对感染性疾病从供体传播至接受者(recipient)的安全性关注。此外，该治疗的性质具有负面污名，并且因此不可能被广泛接受。
受损的消化道屏障功能也在自身免疫性疾病发病机制中发挥核心作用(Lerner等，2015a；Lerner等，2015b；Fasano等，2005；Fasano,2012)。单层上皮细胞将消化道腔与体内的免疫细胞分开。上皮由细胞间紧密连接(tight junction)调节，并控制对非自身抗原的耐受性和免疫性之间的平衡(Fasano等，2005)。破坏上皮层可以导致高度免疫反应性上皮下层(subepithelium)病理性暴露于腔中的大量外来抗原(Lerner等，2015a)，导致易感性增加，并且肠和肠外自身免疫性紊乱均可发生”(Fasano等，2005)。一些外来抗原被假定为类似于自身抗原，并且可以诱导表位特异性交叉反应性，其加速了先前存在的自身免疫性疾病的进展或引发自身免疫性疾病(Fasano,2012)。例如，类风湿性关节炎和乳糜泻为被认为牵涉增加的肠通透性的自身免疫性紊乱(Lerner等，2015b)。在对自身免疫性紊乱遗传易感的个体中，细胞间紧密连接的异常调节可以导致疾病发作(Fasano,2012)。事实上，与环境相互作用的粘膜屏障的保护功能的损失对于自身免疫发展是必需的(Lerner等，2015a)。
消化道微生物的变化可以改变宿主的免疫应答(Paun等，2015；Sanz等，2014；Sanz等，2015；Wen等，2008)。例如，在具有1型糖尿病高遗传风险的儿童中，发展自身免疫性而患病的儿童和保持健康的儿童之间的消化道微生物组(microbiome)存在显著差异(Richardson等，2015)。其他已经表明，消化道细菌为预防哮喘的潜在治疗靶并且在肺部炎症方面表现出强烈的免疫调节能力……(Arrieta等，2015)。因此，增强胃肠道中的屏障功能和降低胃肠道中的炎症为用于治疗或预防自身免疫性紊乱的潜在治疗机制。
最近，已经努力设计产生抗炎分子诸如IL-10的微生物，并且将其口服施用至患者以将治疗剂直接递送至消化道中的炎症部位。该方法的优点为避免了免疫抑制药物的全身施用并将治疗剂直接递送至胃肠道。然而，虽然这些工程化微生物已经在一些临床前模型中显示出功效，但尚未观察到对患者的功效。在治疗患者方面缺乏成功的一个原因为由于大量非天然蛋白(例如，人类白细胞介素)的组成型产生，微生物的存活力和稳定性受损。因此，对降低消化道炎症、增强消化道屏障功能和/或治疗自身免疫性紊乱、并且避免不期望的副作用的另外的疗法仍存在极大需求。
本文公开的遗传工程化的细菌能够产生治疗性抗炎分子和/或消化道屏障增强分子(gut barrier enhancer molecule)。遗传工程化的细菌是功能上沉默的，直至它们到达诱导治疗性分子的表达的诱导环境，例如，哺乳动物消化道。在某些实施方案中，遗传工程化的细菌为天然非病原性的，并且可以被引入到消化道中以降低消化道炎症和/或增强消化道屏障功能，并且可以从而进一步改善或预防自身免疫性紊乱。在某些实施方案中，抗炎分子和/或消化道屏障增强分子由遗传工程化的细菌稳定产生，和/或遗传工程化的细菌被稳定维持在体内和/或体外。本发明还提供了包含遗传工程化的细菌的药物组合物、以及治疗受益于降低的消化道炎症和/或收紧的消化道粘膜屏障功能的疾病(例如，炎性肠病或自身免疫性紊乱)的方法。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌在由环境条件，例如哺乳动物消化道中发现的环境条件，诸如炎性条件或低氧条件诱导的一个或更多个启动子的控制下产生一个或更多个治疗性分子。因此，在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌在氧水平依赖性启动子、活性氧类(reactive oxygen species)(ROS)依赖性启动子或活性氮类(reactive nitrogen species)(RNS)依赖性启动子及相应的转录因子的控制下产生一个或更多个治疗性分子。在一些实施方案中，治疗性分子为丁酸；在诱导环境中，丁酸生物合成基因盒被活化，并且丁酸被产生。丁酸的局部产生诱导消化道中的调节性T细胞的分化和/或促进结肠上皮细胞的屏障功能。本发明的遗传工程化的细菌仅在诱导环境诸如消化道中产生其治疗效果，从而降低与全身暴露相关的安全性问题。
附图简述
图1描绘了用于丁酸产生的来自艰难梭菌(C.difficile)的8基因途径的示意图。pLogic031包含在Tet诱导型启动子的控制下合成的来自艰难梭菌的8基因途径bcd2-etfB3-etfA3-thiA1-hbd-crt2-pbt-buk(pBR322骨架)。pLogic046用来自齿垢密螺旋体(Treponema denticola)的单个基因ter(反式-烯酰-2-还原酶)替代BCD/ETF复合物，并且包含ter-thiA1-hbd-crt2-pbt-buk。
图2描绘了丁酸产生途径的示意图，其中可以缺失圆圈里的基因(buk和pbt)，并用tesB替代，该tesB从丁酰-辅酶A裂解CoA。
图3描绘了本发明的示例性重组细菌的基因组构(gene organization)及其在一氧化氮(NO)的存在下的去阻遏。在上图中，在NO的不存在下，NsrR转录因子(灰色圆圈“NsrR”)结合并阻遏相应的调节区域。因此，没有丁酸生物合成酶(bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、buk；黑色盒)表达。在下图中，在NO的存在下，NsrR转录因子与NO相互作用，并且不再与调节序列结合或阻遏调节序列。这导致丁酸生物合成酶的表达(由灰色箭头和黑色单线涂鸦表示)，并且最终导致丁酸的产生。
图4描绘了本发明的另一个示例性重组细菌的基因组构及其在NO的存在下的去阻遏。在上图中，在NO的不存在下，NsrR转录因子(灰色圆圈，“NsrR”)结合并阻遏相应的调节区域。因此，没有丁酸生物合成酶(ter、thiA1、hbd、crt2、pbt、buk；黑色盒)表达。在下图中，在NO的存在下，NsrR转录因子与NO相互作用，并且不再与调节序列结合或阻遏调节序列。这导致丁酸生物合成酶的表达(由灰色箭头和黑色单线涂鸦表示)，并且最终导致丁酸的产生。
图5描绘了本发明的示例性重组细菌的基因组构及其在H2O2的存在下的诱导。在上图中，在H2O2的不存在下，OxyR转录因子(灰色圆圈，“OxyR”)与oxyS启动子结合，但不诱导oxyS启动子。因此，没有丁酸生物合成酶(bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、buk；黑色盒)表达。在下图中，在H2O2的存在下，OxyR转录因子与H2O2相互作用，并且然后能够诱导oxyS启动子。这导致丁酸生物合成酶的表达(由灰色箭头和黑色单线涂鸦表示)，并且最终导致丁酸的产生。
图6描绘了本发明的另一个示例性重组细菌的基因组构及其在H2O2的存在下的诱导。在上图中，在H2O2的不存在下，OxyR转录因子(灰色圆圈，“OxyR”)与oxyS启动子结合，但不诱导oxyS启动子。因此，没有丁酸生物合成酶(ter、thiA1、hbd、crt2、pbt、buk；黑色盒)表达。在下图中，在H2O2的存在下，OxyR转录因子与H2O2相互作用，并且然后能够诱导oxyS启动子。这导致丁酸生物合成酶的表达(由灰色箭头和黑色单线涂鸦表示)，并且最终导致丁酸的产生。
图7描绘了本发明的示例性重组细菌的基因组构及其在低氧条件下的诱导。在上图中，在需氧条件下相对低的丁酸产生，其中氧气(O2)阻止(由“X”表示)FNR(灰色加框的“FNR”)二聚化和活化FNR响应性启动子(“FNR启动子”)。因此，没有丁酸生物合成酶(bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、和buk；黑色盒)表达。在下图中，在低氧条件下增加的丁酸产生是由于FNR二聚化(两个灰色加框的“FNR”)、与FNR响应性启动子结合、并诱导丁酸生物合成酶的表达，这导致丁酸的产生。
图8描绘了本发明的示例性重组细菌的基因组构及其在低氧条件下的诱导。在上图中，在需氧条件下相对低的丁酸产生，其中氧气(O2)阻止(由“X”表示)FNR(灰色加框的“FNR”)二聚化和活化FNR响应性启动子(“FNR启动子”)。因此，没有丁酸生物合成酶(ter、thiA1、hbd、crt2、pbt、和buk；黑色盒)表达。在下图中，在低氧条件下增加的丁酸产生是由于FNR二聚化(两个灰色加框的“FNR”)、与FNR响应性启动子结合、并诱导丁酸生物合成酶的表达，这导致丁酸的产生。
图9描绘了本发明的示例性重组细菌的基因组构及其在低氧条件下的诱导。在上图中，在需氧条件下相对低的丙酸产生，其中氧气(O2)阻止(由“X”表示)FNR(灰色加框的“FNR”)二聚化和活化FNR响应性启动子(“FNR启动子”)。因此，没有丙酸生物合成酶(pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、acrC；黑色盒)表达。在下图中，在低氧条件下增加的丙酸产生是由于FNR二聚化(两个灰色加框的“FNR”)、与FNR响应性启动子结合、并诱导丙酸生物合成酶的表达，这导致丙酸的产生。
图10描绘了示例性丙酸生物合成基因盒。
图11描绘了本发明的示例性重组细菌的基因组构及其在低氧条件下的诱导。在上图中，在需氧条件下相对低的丙酸产生，其中氧气(O2)阻止(由“X”表示)FNR(灰色加框的“FNR”)二聚化和活化FNR响应性启动子(“FNR启动子”)。因此，没有丙酸生物合成酶(thrA、thrB、thrC、ilvA、aceE、aceF、lpd；黑色盒)表达。在下图中，在低氧条件下增加的丙酸产生是由于FNR二聚化(两个灰色加框的“FNR”)、与FNR响应性启动子结合、并诱导丙酸生物合成酶的表达，这导致丙酸产生。
图12描绘了示例性丙酸生物合成基因盒。
图13描绘了本发明的示例性重组细菌的基因组构及其在低氧条件下的诱导。在上图中，在需氧条件下相对低的丙酸产生，其中氧气(O2)阻止(由“X”表示)FNR(灰色加框的“FNR”)二聚化和活化FNR响应性启动子(“FNR启动子”)。因此，没有丙酸生物合成酶(thrA、thrB、thrC、ilvA、aceE、aceF、lpd、tesB；黑色盒)表达。在下图中，在低氧条件下增加的丙酸产生，这是由于FNR二聚化(两个灰加框的“FNR”)、与FNR响应性启动子结合、并诱导丙酸生物合成酶的表达，这导致丙酸产生。
图14描绘了示例性丙酸生物合成基因盒。
图15描绘了包含8基因丁酸盒的丁酸基因盒pLogic031的示意图。
图16描绘了包含ter取代(椭圆形)的丁酸基因盒pLogic046的示意图。
图17描绘了丁酸基因盒pLogic046的线性示意图。
图18描绘了丁酸产生的图。pLOGIC031(bcd)/+O2为需氧生长的包含质粒pLOGIC031的Nissle。pLOGIC046(ter)+O2为需氧生长的包含质粒pLOGIC046的Nissle。pLOGIC031(bcd)/-O2为厌氧生长的包含质粒pLOGIC031的Nissle。pLOGIC046(ter)/-O2为厌氧生长的包含质粒pLOGIC046的Nissle。ter构建体导致较高的丁酸产生。
图19描绘了使用包含nuoB基因缺失的大肠杆菌BW25113丁酸产生回路的丁酸产生的图，其与野生型亲本对照相比导致更大水平的丁酸产生。nuoB为参与呼吸生长期间NADH氧化的主要蛋白复合物。在一些实施方案中，阻止NADH氧化与电子传递偶联增加了用于支持丁酸产生的NADH的量。
图20描绘了pLogic046-tesB的示意图，其中buk和pbt被缺失并且tesB被取代。
图21描绘了丁酸基因盒pLogic046-Δptb-buk-tesB+的线性示意图。
图22描绘了丁酸产生，该丁酸产生使用pLOGIC046(包含质粒pLOGIC046的Nissle菌株，质粒pLOGIC046是包含ATC诱导型ter的丁酸构建体)和pLOGIC046-Δpbt-buk/tesB+(包含质粒pLOGIC046-Δpbt.buk/tesB+的Nissle菌株，质粒pLOGIC046-Δpbt.buk/tesB+是包含ATC诱导型ter的丁酸构建体，其中pbt-buk基因中被缺失并被tesB基因替代的)。tesB构建体导致较大的丁酸产生。
图23描绘了包含ter取代的丁酸基因盒ydfZ-丁酸的示意图。
图24描绘了在体外在葡萄糖和氧的存在和不存在下的SYN363。SYN363包含丁酸基因盒，所述丁酸基因盒包含在ydfZ启动子的控制下的ter-thiA1-hbd-crt2-tesB基因。
图25描绘了测量在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的IBD小鼠模型中的消化道屏障功能的图。测量在被施用不同浓度的DSS的小鼠的血浆中发现的FITC葡聚糖的量作为消化道屏障功能的指征(indicator)。
图26描绘了通过分光光度法分析的FITC-葡聚糖的血清水平。FITC-葡聚糖为DSS诱导的IBD小鼠模型中消化道屏障功能的读出。
图27描绘了在IBD的体内模型中使用粪便样品通过ELISA定量的小鼠脂质运载蛋白2和钙防卫蛋白的水平。与对照SYN94相比，SYN363降低炎症和/或保护消化道屏障功能。
图28描绘了ATC或一氧化氮诱导型报告物构建体。当由这些构建体的同源诱导物诱导时，这些构建体导致GFP的表达。携带具有对照ATC诱导型Ptet-GFP报告物构建体或一氧化氮诱导型PnsrR-GFP报告物构建体的质粒的Nissle细胞在一系列浓度内被诱导。启动子活性被表示为相对荧光单位。
图29描绘了携带表达在组成型启动子的控制下的NsrR和在NsrR诱导型启动子的控制下的报告物基因gfp(绿色荧光蛋白)的质粒的细菌斑点印迹。通过补充具有2％-3％葡聚糖硫酸钠(DSS)的饮用水，在小鼠中诱导IBD。显示了对于在DSS处理的小鼠中诱导的NsrR调节的启动子的化学发光。
图30描绘了包含编码NsrR的基因、来自norB的调节序列和产丁酸基因盒(butyrogenic gene cassette)的示例性质粒的构建和基因组构(pLogic031-nsrR-norB-丁酸构建体)。
图31描绘了包含编码NsrR的基因、来自norB的调节序列和产丁酸基因盒的另一个示例性质粒的构建和基因组构(pLogic046-nsrR-norB-产丁酸基因盒)。
图32描绘了使用以下的丁酸产生：SYN001+tet(不含质粒的对照野生型Nissle)、SYN067+tet(包含pLOGIC031ATC诱导型丁酸质粒的Nissle)和SYN080+tet(包含pLOGIC046ATC诱导型丁酸质粒的Nissle)。
图33描绘了包含pLogic031-nsrR-norB-丁酸构建体(SYN133)或pLogic046-nsrR-norB-丁酸构建体(SYN145)的遗传工程化的Nissle的丁酸产生，所述遗传工程化的Nissle与野生型Nissle(SYN001)相比产生更多丁酸。
图34描绘了包含oxyS启动子和产丁酸基因盒的示例性质粒的构建和基因组构(pLogic031-oxyS-产丁酸基因盒)。
图35描绘了包含oxyS启动子和产丁酸基因盒的另一个示例性质粒的构建和基因组构(pLogic046-oxyS-产丁酸基因盒)。
图36描绘了被遗传工程化为表达必需基因tnaB、5-甲基四氢叶酸-高半胱氨酸甲基转移酶(mtr)、色氨酸转运蛋白和酶IDO和TDO以将色氨酸转化为犬尿氨酸的大肠杆菌的示意图。
图37描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达白细胞介素并且还包含TAT分泌系统的大肠杆菌的示意图。
图38描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达SOD并且还包含TAT分泌系统的大肠杆菌的示意图。
图39描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达GLP-2并还且包含TAT分泌系统的大肠杆菌的示意图。
图40描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达丙酸基因盒的大肠杆菌的示意图。
图41描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达丁酸基因盒的大肠杆菌的示意图。
图42描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达犬尿氨酸、白细胞介素、SOD、GLP-2、丙酸基因盒和丁酸基因盒并且还包含TAT分泌系统的大肠杆菌的示意图。
图43描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达白细胞介素、OSD、GLP-2、丙酸基因盒、和丁酸基因盒并且还包含TAT分泌系统的大肠杆菌的示意图。
图44描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达SOD、丙酸基因盒、和丁酸基因盒并且还包含TAT分泌系统的大肠杆菌的示意图。
图45描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达白细胞介素、丙酸基因盒、和丁酸基因盒并且还包含TAT分泌系统的大肠杆菌的示意图。
图46描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达白细胞介素-10(IL-10)、丙酸基因盒、和丁酸基因盒并且还包含TAT分泌系统的大肠杆菌的示意图。
图47描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达IL-2、IL-10、丙酸基因盒、和丁酸基因盒并且还包含TAT分泌系统的大肠杆菌的示意图。
图48描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达IL-2、IL-10、丙酸基因盒、丁酸基因盒、和SOD并且还包含TAT分泌系统的大肠杆菌的示意图。
图49描绘了被遗传工程化为在FNR响应性启动子的控制下表达IL-2、IL-10、丙酸基因盒、丁酸基因盒、SOD和GLP-2并且还包含TAT分泌系统的大肠杆菌的示意图。
图50描绘了大肠杆菌1917Nissle染色体内的示例性整合位点的图谱。这些位点表示可以将回路组件(circuit components)插入到染色体而不干扰必需基因表达的区域。反斜杠(/)用于表明插入将发生在趋异(divergently)或趋同(convergently)表达的基因之间。生物合成基因(诸如thyA)内的插入可用于产生营养物质营养缺陷型。在一些实施方案中，将单独的回路组件插入到指定位点中的多于一个位点。
图51描绘了包括多种作用机制(MoA)的大肠杆菌1917Nissle染色体的示例性示意图。
图52描绘了包括多种作用机制以用于产生IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、丙酸、和丁酸的大肠杆菌1917Nissle染色体的示例性示意图。
图53描绘了包括多种作用机制以用于产生IL-10、IL-27、GLP-2、和丁酸的大肠杆菌1917Nissle染色体的示例性示意图。
图54描绘了包括多种作用机制以用于产生GLP-2、IL-10、IL-22、SOD、丁酸、和丙酸的大肠杆菌1917Nissle染色体的示例性示意图。
图55描绘了包括多种作用机制以用于产生GLP-2、IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、SOD、丁酸、和丙酸的大肠杆菌1917Nissle染色体的示例性示意图。
图56描绘了说明如在管饲后24小时和48小时检测的小鼠消化道中多种氨基酸营养缺陷型存活的表格。这些营养缺陷型使用大肠杆菌的非Nissle菌株BW25113产生。
图57描绘了基于阻遏的杀死开关(kill-switch)的示意图。在基于毒素的系统中，AraC转录因子在阿拉伯糖的存在下被活化并诱导TetR和抗毒素的表达。TetR阻止毒素的表达。当阿拉伯糖被去除时，TetR和抗毒素不被获得，且毒素被产生，该毒素杀死细胞。在基于必需基因的系统中，AraC转录因子在阿拉伯糖的存在下被活化并诱导必需基因的表达。
图58描绘了本公开内容的另一个非限制性实施方案，其中异源基因的表达由外源环境信号例如低氧条件活化。在阿拉伯糖的不存在下，AraC转录因子采用阻遏转录的构象。在阿拉伯糖的存在下，AraC转录因子经历构象变化，这允许AraC转录因子结合并活化araBAD启动子，该araBAD启动子诱导TetR(tet阻遏物)和抗毒素的表达。抗毒素在重组细菌细胞中形成，同时TetR阻止毒素(其在具有TetR结合位点的启动子控制下)的表达。然而，当不存在阿拉伯糖时，抗毒素和TetR两者不被表达。由于阻遏毒素表达的TetR不存在，所以毒素被表达并杀死细胞。图58还描绘了本公开内容的另一个非限制性实施方案，其中在重组细菌中未发现的必需基因的表达由外源环境信号活化。在阿拉伯糖的不存在下，AraC转录因子采用阻遏在araBAD启动子控制下的必需基因的转录的构象，且细菌细胞不能存活。在阿拉伯糖的存在下，AraC转录因子经历构象变化，这允许AraC转录因子结合并活化araBAD启动子，该araBAD启动子诱导必需基因的表达并维持细菌细胞的存活力。
图59描绘了本公开内容的非限制性实施方案，其中抗毒素由组成型启动子表达，且异源基因的表达由外源环境信号活化。在阿拉伯糖的不存在下，AraC转录因子采用阻遏转录的构象。在阿拉伯糖的存在下，AraC转录因子经历构象变化，这允许AraC转录因子结合并活化araBAD启动子，该araBAD启动子诱导TetR的表达，从而阻止毒素的表达。然而，当不存在阿拉伯糖时，TetR不表达，且毒素被表达，最终克服抗毒素并杀死细胞。调节抗毒素表达的组成型启动子应该是比驱动毒素表达的启动子更弱的启动子。araC基因在该回路中在组成型启动子的控制下。
图60描绘了基于阻遏的杀死开关的示意图，其中AraC转录因子在阿拉伯糖的存在下被活化并诱导TetR和抗毒素的表达。TetR阻止毒素的表达。当阿拉伯糖被去除时，TetR和抗毒素不被获得，且毒素被产生，该毒素杀死细胞。
图61描绘了本公开内容的另一个非限制性实施方案，其中异源基因的表达由外源环境信号活化。在阿拉伯糖的不存在下，AraC转录因子采用阻遏转录的构象。在阿拉伯糖的存在下，AraC转录因子经历构象变化，这允许AraC转录因子结合并活化araBAD启动子，该araBAD启动子诱导TetR(tet阻遏物)和抗毒素的表达。抗毒素在重组细菌细胞中形成，同时TetR阻止毒素(其在具有TetR结合位点的启动子控制下)的表达。然而，当不存在阿拉伯糖时，抗毒素和TetR两者不被表达。由于阻遏毒素表达的TetR不存在，所以毒素被表达并杀死细胞。araC基因在该回路中在组成型启动子的控制下。
图62描绘了本公开内容的一个非限制性实施方案，其中外源环境条件例如低氧条件或一个或更多个环境信号活化异源基因和至少一个重组酶由一个诱导型启动子或更多个诱导型启动子的表达。重组酶然后将毒素基因翻转(flip)为活化的构象，并且重组酶的天然动力学产生毒素表达的时间延迟，允许异源基因被完全表达。在毒素被表达后，它杀死细胞。
图63描绘了本公开内容的另一个非限制性实施方案，其中外源环境条件例如低氧条件或一个或更多个环境信号活化异源基因、抗毒素和至少一个重组酶由一个诱导型启动子或更多个诱导型启动子的表达。重组酶然后将毒素基因翻转为活化的构象，但积累的抗毒素的存在抑制毒素的活性。在外源环境条件或信号(cue(s))不再存在后，就会关闭抗毒素的表达。毒素被组成型表达，继续积累，并杀死细菌细胞。
图64描绘了本公开内容的另一个非限制性实施方案，其中外源环境条件例如低氧条件或一个或更多个环境信号活化异源基因和至少一个重组酶由一个诱导型启动子或更多个诱导型启动子的表达。重组酶然后将至少一个切除酶翻转为活化的构象。至少一个切除酶然后切除一个或更多个必需基因，导致衰老和最终的细胞死亡。重组酶和切除基因的天然动力学引起时间延迟，其动力学可以根据待切除的必需基因的数目和选择进行改变和优化，允许在大约数小时或数天内发生细胞死亡。多个嵌套重组酶(nested recombinase)的存在可用于进一步控制细胞死亡的时机。
图65描绘了基于活化的杀死开关的示意图，其中Pi为任何诱导型启动子，例如，FNR响应性启动子。当治疗剂被诱导时，抗毒素和重组酶被打开，这导致毒素在4-6小时之后被‘翻转’至ON位置，这导致抗毒素在毒素被表达之前产生。在诱导信号的不存在下，仅毒素被产生并且细胞死亡。
图66描绘了本公开内容的一个非限制性实施方案，其中遗传工程化的细菌产生相等量的Hok毒素和短寿命的(short-lived)Sok抗毒素。当细胞损失质粒时，抗毒素衰变，且细胞死亡。在上图中，细胞产生相等量的毒素和抗毒素并且是稳定的。在中心图中，细胞损失质粒，且抗毒素开始衰变。在下图中，抗毒素完全衰变，且细胞死亡。
图67描述了GeneGuard作为工程化安全性组件的使用。所有工程化DNA存在于可以被有条件地破坏的质粒上。参见，例如，Wright等，2015。
图68描绘了允许细菌将分泌的治疗性蛋白注射到消化道腔中的修改的3型分泌系统(T3SS)。诱导型启动子(小箭头，顶部)，例如FNR响应性启动子驱动T3分泌系统基因盒(3个大箭头，顶部)的表达，其产生将加标签的肽分泌出细胞的装置。诱导型启动子(小箭头，底部)(例如FNR响应性启动子)驱动调节因子(例如，T7聚合酶)的表达，其然后活化加标签的治疗性肽(六边形)的表达。
图69描绘了基于鞭毛III型分泌的分泌系统的示意图，其中不完全鞭毛用于通过将肽与天然鞭毛组分的N末端鞭毛分泌信号重组融合来分泌感兴趣的治疗性肽(星形)，使得细胞内表达的嵌合肽可以跨越内膜和外膜移动到周围的宿主环境中。
图70描绘了重组蛋白的细胞外产生的V型分泌系统的示意图，其中治疗性肽(星形)可以与自身转运蛋白(autotransporter)的N末端分泌信号、接头和β结构域融合。在该系统中，N末端信号序列将蛋白质导向SecA-YEG机器(machinery)，该SecA-YEG机器将蛋白跨越内膜移动到周质中，随后信号序列被裂解。β结构域被募集至Bam复合物，其中β结构域被折叠并作为β桶状结构被插入到外膜中。治疗性肽然后穿过在接头序列之前的β桶状结构的中空孔。治疗性肽通过自身催化裂解或通过将膜缔合肽酶(剪刀)靶向接头中的互补蛋白酶切割位点而从接头系统中释放。
图71描绘了I型分泌系统的示意图，其使用HlyB(ATP结合盒转运蛋白)；HlyD(膜融合蛋白)；和形成通过内膜和外膜两者的通道的TolC(外膜蛋白)将乘客肽(passengerpeptide)直接从细胞质易位至细胞外空间。HlyA的包含分泌信号的C末端部分与治疗性肽(星形)的C末端部分融合以介导该肽的分泌。
图72描绘了野生型clbA构建体的示意图(上图)和clbA敲除构建体的示意图(下图)。
图73描绘了野生型clbA构建体和clbA敲除构建体的示例性序列。
图74描绘了炎性肠病(IBD)疗法的示意图，该炎性肠病(IBD)疗法靶向促炎性嗜中性粒细胞和巨噬细胞和调节性T细胞(Treg)，恢复上皮屏障完整性，并维持粘膜屏障功能。减少嗜中性粒细胞和巨噬细胞的促炎作用和增加Treg恢复上皮屏障完整性和粘膜屏障。
图75描绘了设计和产生本公开内容的遗传工程化的细菌的非限制性方法的示意图：使用生物信息学基于微生物生理学和疾病生物学鉴定多种候选者方法，以确定候选者代谢途径、确定优化的工程化合成生物(biotics)所需性能靶的前瞻性工具(A)；切割边缘DNA组件(assembly)以能够实现途径组构的组合测试，数学模型以预测途径效率，专有开关和部件的内部稳定性以允许工程化回路的控制和调谐(B)；建立核心结构(“底架(chassis)”)，将工程化的回路稳定整合到最佳染色体位置以有效表达，采用独特的功能测定以评价遗传回路的保真度和活性(C)；染色体标志使得能够实现动物模型中合成生物定位和运送时间的监测，专家微生物网络和生物信息学支持扩大对具体疾病状态如何影响GI微生物菌群(flora)和合成生物在该环境中的行为的理解，发现阶段期间内部(in-house)活化方法开发研究和优化使得能够将开发的候选者快速、无缝地过渡至临床前进展，专业的疾病动物模型细化的广泛经验支持候选者合成生物的审慎、高质量测试(D)。
图76描绘了本公开内容的遗传工程化的细菌的上游和下游产生的非限制性制备方法的示意图。A描绘了用于开始培养物1(starter culture 1)(SC1)的参数：环全甘油储备液(loop full–glycerol stock)，持续时间过夜，温度37℃，以250rpm震摇。B描绘了用于开始培养物2(SC2)的参数：来自SC1的1/100稀释，持续时间1.5小时，温度37℃，以250rpm震摇。C描绘了用于生产生物反应器的参数：接种物-SC2，温度37℃，pH设定点7.00，pH死区(dead band)0.05，溶解氧设定点50％，溶解氧级联搅拌/气体FLO，搅拌限值300-1200rpm，气体FLO限值每分钟0.5-20标准升，持续时间24小时。D描绘了用于收获的参数：以速度4000rpm和持续时间30分钟离心，1×10％甘油/PBS洗涤，离心，10％甘油/PBS重悬。E描绘了用于小瓶填充/储存的参数：1-2mL等分试样，-80℃。
具体实施方式
本公开内容包括遗传工程化的细菌、其药物组合物，以及降低消化道炎症、增强消化道屏障功能和/或治疗或预防自身免疫性紊乱的方法。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于产生非天然抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的至少一个非天然基因和/或基因盒。至少一个基因和/或基因盒被进一步可操作地连接至由转录因子控制的调节区域，该转录因子能够感测诱导条件，例如，低氧环境、ROS的存在或RNS的存在。遗传工程化的细菌能够在诱导环境，例如，在消化道中，产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子。因此，遗传工程化的细菌和包含这些细菌的药物组合物可以用于治疗或预防自身免疫性紊乱和/或与消化道炎症和/或受损的消化道屏障功能相关的疾病或状况，包括IBD。
为使本公开内容可以更容易地理解，首先定义某些术语。这些定义应该根据本公开内容的剩余部分并且如本领域普通技术人员所理解的进行阅读。除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与由本领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在整个详细描述中陈述另外的定义。
如本文使用的，“与消化道炎症和/或受损的消化道屏障功能相关的疾病和状况”包括，但不限于，炎性肠病、腹泻疾病和相关疾病。“炎性肠病”和“IBD”在本文中可互换使用，指与消化道炎症相关的一组疾病，其包括但不限于，克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、转移性结肠炎、白塞氏疾病(Behcet’s disease)和不确定性结肠炎。如本文使用的，“腹泻疾病”包括，但不限于，急性水样腹泻，例如，霍乱；急性血性腹泻(acute bloody diarrhea)，例如，痢疾；和持续性腹泻。如本文使用的，相关疾病包括，但不限于，短肠综合征、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎(proctosigmoiditis)、左侧结肠炎(left-sided colitis)、全结肠炎和暴发性结肠炎(fulminant colitis)。
与以上提及的疾病和状况相关的症状包括，但不限于以下的一种或更多种：腹泻、血便、口疮、肛周疾病、腹痛、腹部痉挛(abdominal cramping)、发热、疲劳、体重减轻(weight loss)、缺铁、贫血、食欲不振(appetite loss)、体重减轻、厌食、延迟生长、青春期延迟发育、皮肤的炎症、眼睛的炎症、关节的炎症、肝脏的炎症和胆管的炎症。
与消化道炎症和/或受损的消化道屏障功能相关的疾病或状况可以是自身免疫性紊乱。与消化道炎症和/或受损的消化道屏障功能相关的疾病或状况可以与自身免疫性紊乱并发。如本文使用的，“自身免疫性紊乱”包括，但不限于，急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性脑炎、阿狄森氏病(Addison’s disease)、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经异常、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突&神经元神经病变、巴洛疾病(Balo disease)、白塞氏综合征(Behcet’s disease)、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯特尔曼病(Castleman disease)、乳糜泻(celiac disease)、南美洲锥虫病(Chagasdisease)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多发性骨髓炎(chronicrecurrent multifocal ostomyelitis，CRMO)、Churg-Strauss综合征(Churg-Strausssyndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜性类天疱疮、克罗恩病(Crohn’s disease)、耳蜗前庭综合征(Cogan’s syndrome)、冷凝集素疾病(cold agglutinin disease)、先天性心脏传导阻滞(congenital heart block)、柯萨奇心肌炎(coxsackie myocarditis)、CREST疾病、特发性混合型冷球蛋白血症(essential mixed cryoglobulinemia)、脱髓鞘性神经病变(demyelinating neuropathies)、疱疹样皮炎、皮肌炎、Devic氏病(Devic’s disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、Dressler综合征(Dressler’ssyndrome)、子宫内膜异位、嗜酸粒细胞性食管炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎、结节性红斑(erythema nodosum)、实验性变态反应性脑脊髓炎、伊文思综合征(Evans syndrome)、纤维性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、肺出血-肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、肉芽肿性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis)(GPA)、格雷夫斯病(Graves’disease)、吉兰巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏脑炎(Hashimoto’s encephalitis)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性贫血、过敏性紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、妊娠疱疹(herpes gestationis)、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关性硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白、包含体肌炎(inclusion bodymyositis)、间质性膀胱炎、幼年型关节炎(juvenile arthritis)、幼年型特发性关节炎、幼年型肌炎、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eatonsyndrome)、白细胞破裂性脉管炎(leukocytoclastic vasculitis)、扁平苔藓(lichenplanus)、硬化苔藓(lichen sclerosus)、木样结膜炎(ligneous conjunctivitis)、线性IgA疾病(LAD)、狼疮(系统性红斑狼疮)、慢性莱姆病、梅尼埃病(Meniere’s disease)、微血管性多血管炎(microscopic polyangiitis)、混合性结缔组织病(MCTD)、蚕蚀性角膜炎(Mooren’s ulcer)、Mucha-Habermann疾病(Mucha-Habermann disease)、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)(Devic’s)、中性粒细胞减少(Neutropenia)、眼瘢痕性类天疱疮(Ocular cicatricial pemphigoid)、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌(Streptococcus)相关的儿童自身免疫性神经精神紊乱((Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated withStreptococcus))、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、Parry Romberg综合征(Parry Romberg syndrome)、Parsonnage-Turner综合征(Parsonnage-Turnersyndrome)、扁平部睫状体炎(Pars planitis)(外周葡萄膜炎(peripheral uveitis))、天疱疮、外周神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型&III型自身免疫性多内分泌腺综合征、风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatic)、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病(pyodermagangrenosum)、纯红细胞再生障碍(pure red cell aplasia)、雷诺现象(Raynaud’sphenomenon)、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、莱特尔综合征(Reiter’ssyndrome)、复发性多软骨炎、下肢不宁综合征(restless legs syndrome)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、精子&睾丸自身免疫(sperm&testicular autoimmunity)、僵硬人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征(Susac’s syndrome)、交感性眼炎、大动脉炎(Takayasu’sarteritis)、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt综合征(Tolosa-Hunt syndrome)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、哮喘、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱皮肤病(vesiculobullous dermatosis)、白癜风和韦氏肉芽肿病。
如本文使用的，“抗炎分子”和/或“消化道屏障功能增强分子”包括，但不限于，短链脂肪酸、丁酸(butyrate)、丙酸(propionate)、乙酸(acetate)、IL-2、IL-22、超氧化物歧化酶(SOD)、犬尿氨酸、GLP-2、GLP-1、IL-10、IL-27、TGF-β1、TGF-β2、N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)、弹性蛋白酶抑制剂(elafin)(也称为肽酶抑制剂3和SKALP)、三叶因子、褪黑激素、PGD2和犬尿烯酸、以及本文公开的其他分子。此类分子还可以包括抑制促炎分子的化合物，例如，中和TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17和/或趋化因子(例如，CXCL-8和CCL2)的单链可变片段(scFv)、反义RNA、siRNA或shRNA。分子可以主要为抗炎的，例如，IL-10，或主要为增强消化道屏障功能的，例如，GLP-2。分子可以为既抗炎又增强消化道屏障功能的。抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子可以由单个基因编码，例如，弹性蛋白酶抑制剂由PI3基因编码。可选地，抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子可以通过需要多个基因的生物合成途径来合成，例如，丁酸。这些分子也可以被称为治疗性分子。
如本文使用的，术语“基因”或“基因序列”意图指编码本文描述的任何抗炎分子和消化道屏障功能增强分子的核酸序列，本文描述的任何抗炎分子和消化道屏障功能增强分子例如，IL-2、IL-22、超氧化物歧化酶(SOD)、犬尿氨酸、GLP-2、GLP-1、IL-10、IL-27、TGF-β1、TGF-β2、N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)、弹性蛋白酶抑制剂和三叶因子以及其他分子。核酸序列可以包含编码功能分子的完整基因序列或部分基因序列。核酸序列可以是天然序列或合成序列。核酸序列可以包含天然或野生型序列，或者可以包含具有一个或更多个插入、缺失、取代或其他修饰的修饰序列，例如，核酸序列可以是密码子优化的。
如本文使用的，编码生物合成途径的“基因盒”或“操纵子”指产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子，例如丁酸、丙酸和乙酸，所需的两个或更多个基因。除了编码能够产生所述分子的一组基因以外，基因盒或操纵子还可以包含另外的转录元件和翻译元件，例如，核糖体结合位点。
如本文使用的，“产丁酸基因盒”和“丁酸生物合成基因盒”可互换使用，指能够在生物合成途径中产生丁酸的一组基因。能够经由内源丁酸生物合成途径产生丁酸的未修饰的细菌包括，但不限于，梭菌属(Clostridium)、Peptoclostridium、梭形杆菌属(Fusobacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、真杆菌属(Eubacterium)和密螺旋体(Treponema)，并且这些内源丁酸生物合成途径可以是用于本发明的遗传工程化的细菌的基因的来源。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的丁酸生物合成基因，或者来自细菌的不同物种、菌株或亚株的丁酸生物合成基因的组合。产丁酸基因盒可以包含例如来自Peptoclostridium difficile(也称为艰难梭菌(Clostridiumdifficile))的丁酸产生途径的8个基因：bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、和buk，其分别编码丁酰-CoA脱氢酶亚基、电子转移黄素蛋白β亚基、电子转移黄素蛋白α亚基、乙酰-CoA-酰基转移酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、磷酸丁酰转移酶和丁酸激酶(butyratekinase)(Aboulnaga等，2013)。一个或更多个丁酸生物合成基因可以功能上被替代或修饰，例如，密码子优化。Peptoclostridium difficile菌株630和菌株1296均能够产生丁酸，但包含不同的etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、和buk核酸序列。产丁酸基因盒可以包含来自Peptoclostridium difficile菌株630的bcd2、etfB3、etfA3、和thiA1，以及来自Peptoclostridium difficile菌株1296的hbd、crt2、pbt、和buk。可选地，来自齿垢密螺旋体的单个基因(ter，编码反式-2-烯酰-CoA还原酶)能够功能上替代来自Peptoclostridiumdifficile的所有3个bcd2、etfB3、和etfA3基因。因此，产丁酸基因盒可以包含来自Peptoclostridium difficile的thiA1、hbd、crt2、pbt、和buk和来自齿垢密螺旋体的ter。可选地，添加来自大肠杆菌(Escherichia Coli)的tesB基因能够功能上替代来自Peptoclostridium difficile的pbt和buk基因。因此，产丁酸基因盒可以包含来自Peptoclostridium difficile的thiA1、hbd、和crt2，来自齿垢密螺旋体的ter和来自大肠杆菌的tesB，例如，来自Peptoclostridium difficile菌株630的thiA1，来自Peptoclostridium difficile菌株1296的hbd和crt2，来自齿垢密螺旋体的ter以及来自大肠杆菌的tesB。产丁酸基因盒可以包含用于丁酸的需氧生物合成的基因和/或丁酸的厌氧或微需氧生物合成的基因。一个或更多个丁酸生物合成基因可以功能上被替代或修饰，例如，密码子优化。示例性丁酸基因盒示于图1、3、4、5、6、7、和8中。
如本文使用的，“丙酸基因盒”和“丙酸生物合成基因盒”指能够在生物合成途径中产生丙酸的一组基因。能够经由内源丙酸生物合成途径产生丙酸的未修饰的细菌包括，但不限于，丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、和Prevotella ruminicola，并且这些内源丙酸生物合成途径可以是用于本发明的遗传工程化的细菌的基因的来源。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的丙酸生物合成基因，或者来自细菌的不同物种、菌株或亚株的丙酸生物合成基因的组合。在一些实施方案中，丙酸基因盒包含丙烯酸途径丙酸生物合成基因，例如，pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、和acrC，其分别编码丙酸CoA-转移酶、乳酰基-CoA脱水酶A、乳酰基-CoA脱水酶B、乳酰基-CoA脱水酶C、电子转移黄素蛋白A亚基，丙烯酰-CoA还原酶B和丙烯酰-CoA还原酶C(Hetzel等，2003,Selmer等，2002)。在替代实施方案中，丙酸基因盒包含丙酮酸途径丙酸生物合成基因(参见，例如，Tseng等，2012)，例如，thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、和lpd，其分别编码高丝氨酸脱氢酶1、高丝氨酸激酶、L-苏氨酸合酶、L-苏氨酸脱水酶、丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶和二氢硫辛酸脱氢酶。在一些实施方案中，丙酸基因盒还包含编码酰基-CoA硫酯酶的tesB。丙酸基因盒可以包含用于丙酸的需氧生物合成的基因和/或丙酸的厌氧或微需氧生物合成的基因。一个或更多个丙酸生物合成基因可以功能上被替代或修饰，例如，密码子优化。示例性丙酸基因盒示于图9、11、和13中。
如本文使用的，“乙酸基因盒”和“乙酸生物合成基因盒”指能够在生物合成途径中产生乙酸的一组基因。细菌由许多碳源和能源(包括多种底物诸如纤维素、木质素和无机气体)合成乙酸，并利用本领域已知的不同的生物合成机制和基因(Ragsdale,2008)。能够经由内源乙酸生物合成途径产生乙酸的未修饰的细菌可以是用于本发明的遗传工程化的细菌的乙酸生物合成的基因的来源。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的乙酸生物合成基因，或者来自细菌的不同物种、菌株或亚株的乙酸生物合成基因的组合。大肠杆菌在需氧生长期间能够消耗葡萄糖和氧气以产生乙酸和二氧化碳(Kleman等，1994)。几种细菌，诸如Acetitomaculum、厌氧醋菌属(Acetoanaerobium)、醋盐杆菌属(Acetohalobium)、醋丝菌属(Acetonema)、Balutia、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、梭菌属、Moorella、产醋杆菌属(Oxobacter)、鼠孢菌属(Sporomusa)、和Thermoacetogenium，为能够例如使用Wood-Ljungdahl途径将CO或CO2+H2转化为乙酸的产乙酸(acetogenic)厌氧菌(Schiel-Bengelsdorf等，2012)。多种细菌物种的Wood-Ljungdahl途径中的基因是本领域已知的。乙酸基因盒可以包含用于乙酸的需氧生物合成的基因和/或乙酸的厌氧或微需氧生物合成的基因。一个或更多个乙酸生物合成基因可以功能上被替代或修饰，例如，密码子优化。本文描述了乙酸基因盒的实例。
每一个基因序列和/或基因盒可以存在于质粒或细菌染色体上。在其中工程化的细菌包含一个或更多个基因序列和一个或更多个基因盒的实施方案中，基因序列可以存在于一个或更多个质粒上，并且基因盒可以存在于细菌染色体中，且反之亦然。另外，任何基因、基因盒或调节区域的多个拷贝可以存在于细菌中，其中基因、基因盒或调节区域的一个或更多个拷贝可以如本文描述被突变或以其他方式改变。在一些实施方案中，将遗传工程化的细菌工程化为包含相同基因、基因盒或调节区域的多个拷贝以增强拷贝数。在一些实施方案中，将遗传工程化的细菌工程化为包含进行多种不同功能的基因盒的多种不同组件。在一些实施方案中，将遗传工程化的细菌工程化为包含不同基因、基因盒或调节区域的一个或更多个拷贝，以产生表达多于一种治疗性分子和/或进行多于一种功能的工程化的细菌。
每一种基因或基因盒可以被可操作地连接至诱导型启动子，例如，FNR响应性启动子、ROS响应性启动子和/或RNS响应性启动子。“诱导型启动子”指被可操作地连接至一个或更多个基因的调节区域，其中基因的表达在所述调节区域的诱导物存在下被增加。
如本文使用的，“直接诱导型启动子”指调节区域，其中调节区域被可操作地连接至编码用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子例如丁酸的生物合成途径的基因或基因盒。在所述调节区域的诱导物的存在下，抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子被表达。“间接诱导型启动子”指包含两个或更多个调节区域的调节系统，例如，被可操作地连接至编码第一分子的基因的第一调节区域，例如，转录因子，其能够调节被可操作地连接至编码用于产生抗炎分子和/或消化道屏障增强分子，例如丁酸(或其他抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子)的生物合成途径的基因或基因盒的第二调节区域。在第一调节区域的诱导物的存在下，第二调节区域可以被活化或阻遏，从而活化或阻遏丁酸(或其他抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子)的产生。直接诱导型启动子和间接诱导型启动子两者均被“诱导型启动子”所包含。
如本文使用的，“可操作地连接”指核酸序列，例如，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的基因或基因盒，以允许该核酸序列表达的方式(例如以顺式作用)连接至调节区域序列。调节区域为可以指导感兴趣的基因的转录的核酸，并且可以包含启动子序列、增强子序列(enhancer sequence)、响应性元件、蛋白识别位点、诱导型元件、启动子控制元件、蛋白结合序列、5'和3'非翻译区域、转录开始位点、终止序列、聚腺苷酸化序列和内含子。
如本文使用的，“外源环境条件”指在其下本文描述的启动子被直接或间接诱导的设置或情形。措辞“外源环境条件”意图指环境条件对于细菌为外部的，但对于哺乳动物受试者为内源或天然的。因此，“外源”和“内源”可以互换使用以指环境条件，其中该环境条件对于哺乳动物身体为内源的，但对于细菌细胞为外部的或外源的。在一些实施方案中，外源环境条件是哺乳动物的消化道特异性的。在一些实施方案中，外源环境条件是哺乳动物的上胃肠道特异性的。在一些实施方案中，外源环境条件是哺乳动物的下胃肠道特异性的。在一些实施方案中，外源环境条件是哺乳动物的小肠特异性的。在一些实施方案中，外源环境条件为其中存在ROS的环境。在一些实施方案中，外源环境条件为其中存在RNS的环境。
在一些实施方案中，外源环境条件为低氧或厌氧条件，诸如哺乳动物消化道的环境。在一些实施方案中，外源环境条件指对健康或疾病状态中的哺乳动物消化道为特异性的分子或代谢物(例如丙酸)的存在。在一些实施方案中，用于产生治疗性分子的基因或基因盒被可操作地连接至氧水平依赖性启动子。细菌已经演化出能够感测氧水平的转录因子。不同的信号传导途径可以由不同的氧水平触发并且以不同的动力学发生。如本文使用的，“氧水平依赖性启动子”或“氧水平依赖性调节区域”指一个或更多个氧水平感测转录因子能够结合的核酸序列，其中相应的转录因子的结合和/或活化活化下游基因表达。
在一些实施方案中，用于产生治疗性分子的基因或基因盒被可操作地连接至氧水平依赖性调节区域，使得治疗性分子在低氧、微需氧或厌氧条件下被表达。例如，氧水平依赖性调节区域被可操作地连接至产丁酸或其他基因盒或基因序列(例如，本文描述的任何基因)；在低氧条件下，氧水平依赖性调节区域被相应的氧水平感测转录因子活化，从而驱动产丁酸或其他基因盒或基因序列的表达。氧水平依赖性转录因子的实例包括但不限于FNR、ANR和DNR。相应的FNR响应性启动子、ANR响应性启动子和DNR响应性启动子是本领域已知的(参见，例如，Castiglione等，2009；Eiglmeier等，1989；Galimand等，1991；Hasegawa等，1998；Hoeren等，1993；Salmon等，2003)，且非限制性实例示于表1中。
表1.表1.转录因子和响应性基因和调节区域的实例
如本文使用的，“活性氮类”和“RNS”可互换使用以指来源于分子氮的高活性分子、离子和/或自由基。RNS可以引起有害的细胞效应，诸如亚硝化应激。RNS包括，但不限于，一氧化氮(NO·)、过氧亚硝酸根或过氧亚硝酸根阴离子(ONOO-)、二氧化氮(·NO2)、三氧化二氮(N2O3)、过氧亚硝酸(ONOOH)、和硝基过氧碳酸根(ONOOCO2 -)(未成对电子由·表示)。细菌已经演化出能够感测RNS水平的转录因子。不同的RNS信号转导途径由不同的RNS水平触发并且以不同的动力学发生。
如本文使用的，“RNS诱导型调节区域”指一个或更多个RNS感测转录因子能够结合的核酸序列，其中相应的转录因子的结合和/或活化活化下游基因表达；在RNS的存在下，转录因子结合和/或活化调节区域。在一些实施方案中，RNS诱导型调节区域包含启动子序列。在一些实施方案中，转录因子感测RNS并随后与RNS诱导型调节区域结合，从而活化下游基因表达。在替代实施方案中，在RNS的不存在下，转录因子与RNS诱导型调节区域结合；在RNS的存在下，转录因子经历构象变化，从而活化下游基因表达。RNS诱导型调节区域可以被可操作地连接至基因或基因盒，例如，产丁酸或其他基因盒或基因序列，例如，本文描述的任何基因。例如，在RNS的存在下，转录因子感测RNS并活化相应的RNS诱导型调节区域，从而驱动被可操作地连接的基因序列或基因盒的表达。因此，RNS诱导基因或基因盒的表达。
如本文使用的，“RNS去阻遏型调节区域”指一个或更多个RNS感测转录因子能够结合的核酸序列，其中相应的转录因子的结合阻遏下游基因表达；在RNS的存在下，转录因子不结合并且不阻遏调节区域。在一些实施方案中，RNS去阻遏型调节区域包含启动子序列。RNS去阻遏型调节区域可以被可操作地连接至基因或基因盒，例如，产丁酸或其他基因盒或基因序列。例如，在RNS的存在下，转录因子感测RNS并且不再结合和/或阻遏调节区域，从而使被可操作地连接的基因序列或基因盒去阻遏。因此，RNS使基因或基因盒的表达去阻遏。
如本文使用的，“RNS阻遏型调节区域”指一个或更多个RNS感测转录因子能够结合的核酸序列，其中相应的转录因子的结合阻遏下游基因表达；在RNS的存在下，转录因子结合并且阻遏调节区域。在一些实施方案中，RNS阻遏型调节区域包含启动子序列。在一些实施方案中，感测RNS的转录因子能够结合与部分启动子序列重叠的调节区域。在替代实施方案中，感测RNS的转录因子能够与在启动子序列的上游或下游的调节区域结合。RNS阻遏型调节区域可以被可操作地连接至基因序列或基因盒。例如，在RNS的存在下，转录因子感测RNS并与相应的RNS阻遏型调节区域结合，从而阻断被可操作地连接的基因序列或基因盒的表达。因此，RNS阻遏基因或基因盒的表达。
如本文使用的，“RNS响应性调节区域”指RNS诱导型调节区域、RNS阻遏型调节区域和/或RNS去阻遏型调节区域。在一些实施方案中，RNS响应性调节区域包含启动子序列。每一个调节区域能够结合至少一个相应的RNS感测转录因子。感测RNS的转录因子及其相应的RNS响应性基因、启动子和/或调节区域的实例包括，但不限于，表2中示出的那些。
表2.RNS感测转录因子和RNS响应性基因的实例
如本文使用的，“活性氧类”和“ROS”可互换使用以指来源于分子氧的高活性分子、离子和/或自由基。ROS可以作为需氧呼吸或金属催化氧化的副产物产生，并可以引起有害的细胞效应，诸如氧化性损伤。ROS包括，但不限于，过氧化氢(H2O2)、有机过氧化物(ROOH)、羟基离子(OH-)、羟基自由基(·OH)、超氧化物或超氧化物阴离子(·O2 -)、单线态氧(1O2)、臭氧(O3)、碳酸根自由基(carbonate radical)、过氧化物或过氧化物自由基(·O2 -2)、次氯酸(HOCl)、次氯酸根离子(OCl-)、次氯酸钠(NaOCl)、一氧化氮(NO·)、和过氧亚硝酸根或过氧亚硝酸根阴离子(ONOO-)(未成对电子由·表示)。细菌已经演化出能够感测ROS水平的转录因子。不同的ROS信号传导途径由不同的ROS水平触发并且以不同的动力学发生(Marinho等，2014)。
如本文使用的，“ROS诱导型调节区域”指一个或更多个ROS感测转录因子能够结合的核酸序列，其中相应的转录因子的结合和/或活化活化下游基因表达；在ROS的存在下，转录因子结合和/或活化调节区域。在一些实施方案中，ROS诱导型调节区域包含启动子序列。在一些实施方案中，转录因子感测ROS并随后与ROS诱导型调节区域结合，从而活化下游基因表达。在替代实施方案中，在ROS的不存在下，转录因子与ROS诱导型调节区域结合；在ROS的存在下，转录因子经历构象变化，从而活化下游基因表达。ROS诱导型调节区域可以被可操作地连接至基因序列或基因盒，例如，产丁酸基因盒。例如，在ROS的存在下，转录因子，例如，OxyR感测ROS并活化相应的ROS诱导型调节区域，从而驱动被可操作地连接的基因序列或基因盒的表达。因此，ROS诱导基因或基因盒的表达。
如本文使用的，“ROS去阻遏型调节区域”指一个或更多个ROS感测转录因子能够结合的核酸序列，其中相应的转录因子的结合阻遏下游基因表达；在ROS的存在下，转录因子不结合并且不阻遏调节区域。在一些实施方案中，ROS去阻遏型调节区域包含启动子序列。ROS去阻遏型调节区域可以被可操作地连接至基因或基因盒，例如，本文描述的产丁酸或其他基因盒或基因序列。例如，在ROS的存在下，转录因子，例如，OhrR感测ROS并且不再结合和/或阻遏调节区域，从而使被可操作地连接的基因序列或基因盒去阻遏。因此，ROS使基因或基因盒的表达去阻遏。
如本文使用的，“ROS阻遏型调节区域”指一个或更多个ROS感测转录因子能够结合的核酸序列，其中相应的转录因子的结合阻遏下游基因表达；在ROS的存在下，转录因子结合并且阻遏调节区域。在一些实施方案中，ROS阻遏型调节区域包含启动子序列。在一些实施方案中，感测ROS的转录因子能够结合与部分启动子序列重叠的调节区域。在替代实施方案中，感测ROS的转录因子能够与在启动子序列的上游或下游的调节区域结合。ROS阻遏型调节区域可以被可操作地连接至基因序列或基因盒。例如，在ROS的存在下，转录因子，例如，PerR感测ROS并结合相应的ROS阻遏型调节区域，从而阻断被可操作地连接的基因序列或基因盒的表达。因此，ROS阻遏基因或基因盒的表达。
如本文使用的，“ROS响应性调节区域”指ROS诱导型调节区域、ROS阻遏型调节区域和/或ROS去阻遏型调节区域。在一些实施方案中，ROS响应性调节区域包含启动子序列。每一个调节区域能够结合至少一个相应的ROS感测转录因子。感测ROS的转录因子及其相应的ROS响应性基因、启动子和/或调节区域的实例包括，但不限于，表3中示出的那些。
表3.ROS感测转录因子和ROS响应性基因的实例
如本文使用的，“可调谐型调节区域(tunable regulatory region)”指在转录因子的直接或间接控制下，并且能够相对于诱导物的水平活化、阻遏、去阻遏或以其他方式控制基因表达的核酸序列。在一些实施方案中，可调谐型调节区域包含启动子序列。诱导物可以是RNS或本文描述的其他诱导物，并且可调谐型调节区域可以是RNS响应性调节区域或本文描述的其他响应性调节区域。可调谐型调节区域可以被可操作地连接至基因序列或基因盒，例如，产丁酸或其他基因盒或基因序列。例如，在一个具体实施方案中，可调谐型调节区域为RNS去阻遏型调节区域，并且当存在RNS时，RNS感测转录因子不再结合和/或不再阻遏调节区域，从而允许被可操作地连接的基因或基因盒的表达。在这种情况下，可调谐型调节区域相对于RNS水平使基因或基因盒表达去阻遏。每一个基因或基因盒可以被可操作地连接至由能够感测至少一个RNS的转录因子直接或间接控制的可调谐型调节区域。
如本文使用的，“非天然”核酸序列指细菌中通常不存在的核酸序列，例如内源序列的额外拷贝，或异源序列，诸如来自细菌的不同物种、菌株或亚株的序列，或与来自相同亚型的细菌的未修饰序列相比被修饰和/或突变的序列。在一些实施方案中，非天然核酸序列为合成的、非天然存在的序列(参见，例如，Purcell等，2013)。非天然核酸序列可以是调节区域、启动子、基因和/或基因盒中的一个或更多个基因。在一些实施方案中，“非天然”指不是以与在自然界中彼此间的关系相同的关系被发现的两种或更多种核酸序列。非天然核酸序列可以存在于质粒或染色体上。另外，任何调节区域、启动子、基因、和/或基因盒的多个拷贝可以存在于细菌中，其中调节区域、启动子、基因、和/或基因盒的一个或更多个拷贝可以如本文描述被突变或以其他方式改变。在一些实施方案中，将遗传工程化的细菌工程化为包含相同调节区域、启动子、基因、和/或基因盒的多个拷贝以增强拷贝数或者以包含进行多种不同功能的基因盒的多种不同组件或者以包含不同调节区域、启动子、基因、和/或基因盒的一个或更多个拷贝以产生表达多于一个治疗性分子和/或进行多于一种功能的工程化的细菌。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含这样的基因盒，所述基因盒被可操作地连接至在自然界中与所述基因盒不相关的直接或间接诱导型启动子，例如，被可操作地连接至产丁酸基因盒的FNR响应性启动子。
“组成型启动子”指能够促进在其控制下和/或被可操作地连接至其的编码序列或基因的连续转录的启动子。组成型启动子和功能变体是本领域熟知的，并且包括，但不限于，组成型大肠杆菌σS启动子BBa_J23100(例如，osmY启动子(国际遗传工程机器(iGEM)标准生物部件注册表名称BBa_J45992；BBa_J45993))、组成型大肠杆菌σ32启动子(例如，htpG热休克启动子(BBa_J45504))、组成型大肠杆菌σ70启动子(例如，lacq启动子(BBa_J54200；BBa_J56015)、大肠杆菌CreABCD磷酸感测操纵子启动子(BBa_J64951)、GlnRS启动子(BBa_K088007)、lacZ启动子(BBa_K119000；BBa_K119001)；M13K07基因I型启动子(BBa_M13101)；M13K07基因II型启动子(BBa_M13102)、M13K07基因III型启动子(BBa_M13103)、M13K07基因IV型启动子(BBa_M13104)、M13K07基因V型启动子(BBa_M13105)、M13K07基因VI型启动子(BBa_M13106)、M13K07基因VIII型启动子(BBa_M13108)、M13110(BBa_M13110))、组成型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)σA启动子(例如，启动子veg(BBa_K143013)、启动子43(BBa_K143013)、PliaG(BBa_K823000)、PlepA(BBa_K823002)、Pveg(BBa_K823003))、组成型枯草芽孢杆菌σB启动子(例如，启动子ctc(BBa_K143010)、启动子gsiB(BBa_K143011))、沙门氏菌属(Salmonella)启动子(例如，来自沙门氏菌属的Pspv2(BBa_K112706)、来自沙门氏菌属的Pspv(BBa_K112707))、噬菌体T7启动子(例如，T7启动子(BBa_I712074；BBa_I719005；BBa_J34814；BBa_J64997；BBa_K113010；BBa_K113011；BBa_K113012；BBa_R0085；BBa_R0180；BBa_R0181；BBa_R0182；BBa_R0183；BBa_Z0251；BBa_Z0252；BBa_Z0253))和噬菌体SP6启动子(例如，SP6启动子(BBa_J64998))。
“消化道(gut)”指负责食物转移和消化、营养物质吸收和废弃物排泄的器官、腺体、管道和系统。在人类中，消化道包括起于口并终于肛门的胃肠(GI)道，并且还包括食道、胃、小肠和大肠。消化道还包括辅助器官(accessory organ)和腺体，诸如脾脏、肝脏、胆囊和胰腺。上胃肠道包括食道、胃和小肠的十二指肠。下胃肠道包括小肠的剩余部分，即空肠和回肠，以及所有大肠，即盲肠、结肠、直肠和肛管。细菌可以在整个消化道中，例如在胃肠道，且特别是在肠中被发现。
“非病原性细菌”指不能在宿主中引起疾病或有害响应的细菌。在一些实施方案中，非病原性细菌为革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，非病原性细菌为革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，非病原性细菌为共生细菌，其存在于消化道的固有微生物群(indigenous microbiota)中。非病原性细菌的实例包括，但不限于，芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短杆菌属(Brevibacteria)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、酵母属(Saccharomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)，例如凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、枯草拟杆菌(Bacteroides subtili)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、约翰逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和鲍氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)(Sonnenborn等，2009；Dinleyici等，2014；美国专利第6,835,376号；美国专利第6,203,797号；美国专利第5,589,168号；美国专利第7,731,976号)。非病原性细菌还包括共生细菌，其存在于消化道的固有微生物群中。天然病原性细菌可以被遗传工程化以降低或消除致病性。
“益生菌”用于指活的、非病原性微生物，例如，细菌，其可以对包含适当量该微生物的宿主生物体赋予健康益处。在一些实施方案中，宿主生物体为哺乳动物。在一些实施方案中，宿主生物体为人类。目前，非病原性细菌的一些物种、菌株和/或亚型被认为是益生菌。益生细菌的实例包括但不限于双歧杆菌属(Bifidobacteria)、埃希氏菌属、乳杆菌属和酵母属，例如两歧双歧杆菌、屎肠球菌、大肠杆菌、大肠杆菌菌株Nissle、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌和鲍氏酵母菌(Dinleyici等，2014；美国专利第5,589,168号；美国专利第6,203,797号；美国专利6,835,376)。益生菌可以是细菌的变体或突变菌株(Arthur等，2012；Cuevas-Ramos等，2010；Olier等，2012；Nougayrede等，2006)。非病原性菌可以被遗传工程化为增强或改善所需的生物学特性，例如存活力(survivability)。非病原性细菌可以被遗传工程化为提供益生菌特性。益生细菌可以被遗传工程化为增强或改善益生菌特性。
如本文使用的，“稳定维持的”、“稳定表达的”或“稳定的”细菌用于指携带非天然遗传物质例如产丁酸或其他基因盒或基因序列的细菌宿主细胞，所述非天然遗传物质被掺入到宿主基因组中或在自身复制的染色体外质粒上繁殖，使得非天然遗传物质被保留、表达和繁殖。稳定的细菌能够在体外例如在培养基，和/或在体内例如在消化道中存活和/或生长。例如，稳定的细菌可以是包含产丁酸或其他基因盒或基因序列的遗传修饰的细菌，其中携带产丁酸或其他基因盒或基因序列的质粒或染色体被稳定地维持在宿主细胞中，使得基因盒或基因序列可以在宿主细胞中被表达，且宿主细胞能够在体外和/或在体内存活和/或生长。在一些实施方案中，拷贝数影响非天然遗传物质的表达的稳定性。在一些实施方案中，拷贝数影响非天然遗传物质的表达的水平。
如本文使用的，术语“治疗”及其同源词指疾病或紊乱或其至少一种可辨别的症状的改善。在另一个实施方案中，“治疗”指至少一个可测量的物理参数的改善(不必由患者可辨别)。在另一个实施方案中，“治疗”指物理地(例如，可辨别症状的稳定)、生理上(例如，物理参数的稳定)或两者抑制疾病或紊乱的进展。在另一个实施方案中，“治疗”指减缓疾病或紊乱的进展或者逆转疾病或紊乱的进展。如本文使用的，“预防”及其同源词指延迟给定疾病或紊乱的发作或降低获得给定疾病或紊乱的风险。
需要治疗的个体可包括已具有特定医学紊乱的个体，以及处于具有该紊乱的风险的个体或可最终获得该紊乱的个体。通过以下评价治疗需要：例如，与紊乱的发展相关的一种或更多种危险因素的存在、紊乱的存在或进展或具有该紊乱的受试者对治疗的可能接受性。治疗自身免疫性紊乱和/或与消化道炎症和/或受损的消化道屏障功能相关的疾病和状况可以包括降低或消除过量的炎症和/或相关症状，并且不一定包括消除潜在的疾病或紊乱。在一些情况下，“新生肠的初始定殖与宿主的免疫和代谢功能的适当发展以及早期和后期生活中确定疾病风险特别相关”(Sanz等，2015)。在一些实施方案中，使用本发明的遗传工程化的细菌的早期干预(例如，产前、围产期、新生儿)可以足以预防或延缓疾病或紊乱的发作。
如本文使用的，“药物组合物”指本发明的遗传工程化的细菌与其他组分诸如生理上合适的载体和/或赋形剂的制剂。
可以互换使用的措辞“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”指不会对生物体引起显著刺激并且不会消除所施用的细菌化合物的生物学活性和特性的载体或稀释剂。这些措辞包括佐剂(adjuvant)。
术语“赋形剂”指被添加至药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。实例包括，但不限于，碳酸氢钙、磷酸钙、多种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂，包括例如聚山梨醇酯20。
术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”用于指导致状况(例如，炎症、腹泻)的症状发作的阻止、延迟或者状况的症状改善的化合物的量。治疗有效量可以，例如，足以对自身免疫性紊乱和/或与消化道炎症和/或受损的消化道屏障功能相关的疾病或状况进行治疗、预防、降低其严重程度、延迟其发作和/或降低发生其一种或更多种症状的风险。治疗有效量以及治疗有效的施用频率可以通过本领域已知的并在以下讨论的方法来确定。
除非有明确相反指示，否则如本文使用的冠词“一(a)”和“一(an)”应该被理解为意指“至少一个”。
当在列表中的要素之间使用时，措辞“和/或”旨在意指(1)仅存在单个列出的要素，或(2)存在多于一个的列表的要素。例如，“A、B和/或C”表示，选择可以为单独的A；单独的B；单独的C；A和B；A和C；B和C；或A、B和C。措辞“和/或”可以与列表要素中的“至少一个”或“一个或更多个”互换使用。
细菌
本发明的遗传工程化的细菌能够产生一个或更多个非天然抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为天然非病原性细菌。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为共生细菌。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为益生细菌。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为经修饰或突变为降低或消除致病性的天然病原性细菌。在一些实施方案中，非病原性细菌为革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，非病原性细菌为革兰氏阳性细菌。示例性细菌包括，但不限于，芽孢杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、短杆菌属、梭菌属、肠球菌属、大肠杆菌、乳杆菌属、乳球菌属、酵母属和葡萄球菌属，例如凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、枯草拟杆菌、多形拟杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、丁酸梭菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、约翰逊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌和鲍氏酵母菌、厚壁菌门的梭菌属IV和XIVa簇(Clostridium clusters IV and XIVaof Firmicutes)(包括真细菌属(Eubacterium)的种)、罗氏菌属(Roseburia)、Faecalibacterium、肠杆菌属(Enterobacter)、普氏粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、艰难梭菌、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、化糖梭菌(Clostridiumsaccharolyticum)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、和瘤胃球菌属(Ruminococcus)。在某些实施方案中，遗传工程化的细菌选自以下组成的组：脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、丁酸梭菌、大肠杆菌Nissle、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊乳杆菌、和乳酸乳球菌。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为革兰氏阳性细菌，例如，梭菌属，其天然能够产生高水平的丁酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌选自由以下组成的组：丁酸梭菌ZJUCB、丁酸梭菌S21、嗜热丁酸梭菌(C.Thermobutyricum)ATCC 49875、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、包氏梭菌(C.populeti)ATCC 35295、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)JM1、酪丁酸梭菌CIP 1-776、酪丁酸梭菌ATCC 25755,酪丁酸梭菌CNRZ 596、和酪丁酸梭菌ZJU 8235。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为丁酸梭菌CBM588，一种高度适用于蛋白分泌并且已经证明在治疗IBD中的功效的益生细菌(Kanai等，2015)。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为芽孢杆菌属，一种高度遗传易处理并且已经为用于工业蛋白产生的受欢迎底架(chassis)的益生细菌；在一些实施方案中，细菌具有高度活性的分泌和/或无毒副产物(Cutting,2011)。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为大肠杆菌菌株Nissle 1917(E.coliNissle)，一种已演化为最佳表征的益生菌之一(Ukena等，2007)的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的革兰氏阴性细菌。该菌株的特征在于其完全无害(Schultz，2008)，并且具有GRAS(通常认为是安全的(generally recognized as safe)状态(Reister等，2014，加了着重)。基因组测序证实，大肠杆菌Nissle缺乏突出的毒力因子(例如，大肠杆菌α-溶血素、P-菌毛粘附素(P-fimbrial adhesin))(Schultz，2008)。另外，已经显示大肠杆菌Nissle不携带病原性粘附因子，不产生任何肠毒素或细胞毒素，不是侵入性的，而且不是尿道病原性的(uropathogenic)。(Sonnenborn等，2009)。早在1917年，大肠杆菌Nissle被包装为药物胶囊(称为Mutaflor)用于治疗用途。从那时起，大肠杆菌Nissle已被用于体内治疗人类中的溃疡性结肠炎(Rembacken等，1999)，用于体内治疗人类炎性肠病、克罗恩病和储袋炎(Pouchitis)(Schultz，2008)，并用于在体外抑制肠侵入性沙门氏菌属、军团菌属(Legionella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)和志贺氏菌属(Shigella)(Altenhoefer等，2004)。普遍认为，大肠杆菌Nissle的治疗功效和安全性已得到令人信服的证实(Ukena等，2007)。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为大肠杆菌Nissle，并且天然能够促进紧密连接和消化道屏障功能。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为大肠杆菌，并且高度适用于重组蛋白技术。
本领域普通技术人员将理解，本文公开的遗传修饰可以被修改用于细菌的其他物种、菌株和亚型。例如，已知梭菌产丁酸途径基因在基因组测序的梭菌属(clostridia)和相关物种中广泛存在(Aboulnaga等，2013)。此外，来自一种或更多种不同的细菌物种的基因可以被彼此引入，例如，来自Peptoclostridium difficile的产丁酸基因已经被表达于大肠杆菌中(Aboulnaga等，2013)。
未修饰的大肠杆菌Nissle和本发明的遗传工程化的细菌可以在施用之后几小时或几天内被破坏，例如被消化道或血清中的防御因子破坏(Sonnenborn等，2009)，或者通过活化杀死开关破坏。因此，遗传工程化的细菌可需要连续的施用。可以计算遗传工程化的细菌的体内停留时间。在一些实施方案中，为人类受试者计算停留时间。
抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子
遗传工程化的细菌包含用于产生非天然抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的一个或更多个基因序列和/或基因盒。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于产生非天然抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的一个或更多个基因序列。例如，遗传工程化的细菌可以包含用于产生非天然抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的两个或更多个基因序列。在一些实施方案中，两个或更多个基因序列为相同基因的多个拷贝。在一些实施方案中，两个或更多个基因序列为编码不同基因的序列。在一些实施方案中，两个或更多个基因序列为编码一个或更多个不同基因的多个拷贝的序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于产生非天然抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的一个或更多个基因盒。例如，遗传工程化的细菌可以包含用于产生非天然抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的两个或更多个基因盒。在一些实施方案中，两个或更多个基因盒为相同基因盒的多个拷贝。在一些实施方案中，两个或更多个基因盒为用于产生相同或不同抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的不同基因盒。在一些实施方案中，两个或更多个基因盒为用于产生一种或更多种不同抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的多个拷贝的基因盒。在一些实施方案中，抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子选自由以下组成的组：短链脂肪酸、丁酸、丙酸、乙酸、IL-2、IL-22、超氧化物歧化酶(SOD)、GLP-2、GLP-1、IL-10、IL-27、TGF-β1、TGF-β2、N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)、弹性蛋白酶抑制剂(也称为肽酶抑制剂3或SKALP)、三叶因子、褪黑激素、PGD2、犬尿烯酸、和犬尿氨酸。分子可以主要为抗炎的，例如，IL-10，或主要为增强消化道屏障功能的，例如，GLP-2。可选地，分子可以为既抗炎又增强消化道屏障功能的。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌表达由单个基因编码的一种或更多种抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子，例如，分子为弹性蛋白酶抑制剂并由PI3基因编码，或分子为白细胞介素-10并由IL10基因编码。在替代实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌编码一种或更多种抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子，例如，丁酸，其通过需要多个基因的生物合成途径来合成。
一个或更多个基因序列和/或基因盒可以在高拷贝质粒、低拷贝质粒或染色体上表达。在一些实施方案中，由质粒的表达可用于增加抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的表达。在一些实施方案中，由染色体的表达可用于增加抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的表达的稳定性。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因序列或基因盒在遗传工程化的细菌中在一个或更多个整合位点整合到细菌染色体中。例如，可以将丁酸生物合成基因盒的一个或更多个拷贝整合到细菌染色体中。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因序列或基因盒在遗传工程化的细菌中由质粒表达。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因序列或基因盒在大肠杆菌Nissle的以下插入位点中的一个或更多个插入位点插入到细菌染色体中：malE/K、araC/BAD、lacZ、thyA、malP/T。可以使用任何合适的插入位点(对于示例性插入位点，参见例如图51)。插入位点可以是基因组中的任何地方，例如在存活和/或生长所需的基因中，诸如thyA(以产生营养缺陷型)；在基因组的活跃区域，诸如基因组复制位点附近；和/或在趋异的启动子之间以便降低非预期转录的风险，诸如在阿拉伯糖操纵子的AraB和AraC之间。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含一个或更多个产丁酸基因盒，并且能够产生丁酸。遗传工程化的细菌可以包含任何合适的一组产丁酸基因(参见，例如，表4)。包含丁酸生物合成基因的未修饰的细菌是已知的，并且包括，但不限于，Peptoclostridium、梭菌属、梭形杆菌属、丁酸弧菌属、真杆菌属和密螺旋体，并且这些内源丁酸生物合成途径可以是用于本发明的遗传工程化的细菌的基因的来源。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的丁酸生物合成基因。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自Peptoclostridium difficile，例如Peptoclostridium difficile菌株630的丁酸生物合成途径的8个基因：bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、和buk(Aboulnaga等，2013)，并且能够在诱导条件下产生丁酸。Peptoclostridium difficile菌株630和菌株1296均能够产生丁酸，但包含不同的etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、和buk核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株和/或亚株的产丁酸基因的组合，并且能够在诱导条件下产生丁酸。例如，在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自Peptoclostridium difficile菌株630的bcd2、etfB3、etfA3、和thiA1，以及来自Peptoclostridium difficile菌株1296的hbd、crt2、pbt、和buk。
艰难梭菌中bcd2、etfA3、和etfB3基因的基因产物形成将巴豆酰-CoA转化为丁酰-CoA的复合物，丁酰-CoA可以用作氧依赖性辅助氧化剂(co-oxidant)。在一些实施方案中，由于本发明的遗传工程化的细菌被设计为在微需氧或氧限制性环境(例如，哺乳动物消化道)中产生丁酸，氧依赖性可能对消化道中的丁酸产生具有负面影响。已经表明，来自齿垢密螺旋体的单个基因(ter，编码反式-2-烯酰-CoA还原酶)可以以不依赖于氧的方式功能上替代该3基因复合物。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含例如，来自齿垢密螺旋体的ter基因，其可以功能上替代例如，来自Peptoclostridium difficile的所有3个bcd2、etfB3、和etfA3基因。在该实施方案中，遗传工程化的细菌包含例如，来自Peptoclostridium difficile的thiA1、hbd、crt2、pbt、和buk，以及例如，来自齿垢密螺旋体的ter，并且能够在低氧条件下产生丁酸(参见，例如，表4)。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于需氧丁酸生物合成的基因和/或用于厌氧或微需氧丁酸生物合成的基因。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含例如，来自Peptoclostridiumdifficile的thiA1、hbd、crt2、pbt、和buk；例如，来自齿垢密螺旋体的ter；例如，来自Peptoclostridium difficile的bcd2、etfB3、和etfA3中的一个或更多个；并且在诱导条件下产生丁酸。可选地，来自大肠杆菌的tesB基因能够功能上替代来自Peptoclostridiumdifficile的pbt和buk基因。因此，在一些实施方案中，产丁酸基因盒可以包含来自Peptoclostridium difficile的thiA1、hbd和crt2，来自齿垢密螺旋体的ter，以及来自大肠杆菌的tesB。在一些实施方案中，一个或更多个丁酸生物合成基因可以功能上被替代或修饰，例如，密码子优化。在一些实施方案中，产丁酸基因盒包含用于丁酸的需氧生物合成的基因和/或丁酸的厌氧或微需氧生物合成的基因。在一些实施方案中，一个或更多个丁酸生物合成基因功能上被替代、修饰和/或突变，以在低氧条件下增强稳定性和/或增加丁酸产生。在一些实施方案中，丁酸的局部产生诱导消化道中的调节性T细胞的分化和/或促进结肠上皮细胞的屏障功能。示例性丁酸基因盒示于图1、3、4、5、6、7、和8中。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下表达丁酸生物合成盒并产生丁酸。这些基因可以是密码子优化的，并且可以添加翻译和转录元件。表4描绘了丁酸生物合成基因盒中示例性基因的核酸序列。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含SEQ ID NO:1-10中的任一个或其功能性片段的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含除了冗余的遗传密码以外，与SEQ ID NO:1-10中的任一个或其功能性片段编码相同的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含编码SEQ ID NO:11-20中的任一个或其功能性片段的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与SEQ ID NO:1-10中的任一个或其功能性片段的DNA序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与编码SEQ ID NO:11-20中的任一个或其功能性片段的多肽的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸。
表4
表5
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含丙酸基因盒，并且能够产生丙酸。遗传工程化的细菌可以表达任何合适的一组丙酸生物合成基因(参见，例如，表6)。能够经由内源丙酸生物合成途径产生丙酸的未修饰的细菌包括，但不限于，丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、和Prevotellaruminicola，并且这些内源丙酸生物合成途径可以是用于本发明的遗传工程化的细菌的基因的来源。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的丙酸生物合成基因。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包括来自丙酸梭菌的基因pct、lcd和acr。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于丙酸生物合成的丙烯酸途径基因，例如，pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、和acrC。在替代实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于丙酸生物合成的丙酮酸途径基因，例如，thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、和lpd，并且任选地还包含tesB。这些基因可以是密码子优化的，并且可以添加翻译和转录元件。表6描绘了丙酸生物合成基因盒中示例性基因的核酸序列。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含SEQ ID NO:21-34和10中的任一个或其功能性片段的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含编码SEQ ID NO:35-48和20中的任一个或其功能性片段的多肽的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与SEQ ID NO:21-34和10中的任一个的DNA序列或其功能性片段至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与编码SEQ ID NO:35-48和20中的任一个或其功能性片段的多肽的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸。
表6
表7
在一些实施方案中，一个或更多个丙酸生物合成基因为合成的丙酸生物合成基因。在一些实施方案中，一个或更多个丙酸生物合成基因为大肠杆菌丙酸生物合成基因。在一些实施方案中，一个或更多个丙酸生物合成基因为谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)丙酸生物合成基因。在一些实施方案中，一个或更多个丙酸生物合成基因为丙酸梭菌(C.propionicum)丙酸生物合成基因。丙酸基因盒可以包含用于丙酸的需氧生物合成的基因和/或丙酸的厌氧或微需氧生物合成的基因。一个或更多个丙酸生物合成基因可以功能上被替代或修饰，例如，密码子优化。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株和/或亚株的丙酸生物合成基因的组合，并且能够在诱导条件下产生丙酸。在一些实施方案中，一个或更多个丙酸生物合成基因功能上被替代、修饰和/或突变，以在诱导条件下增强稳定性和/或增加丙酸产生。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下表达丙酸生物合成盒并产生丙酸。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含乙酸基因盒，并且能够产生乙酸。遗传工程化的细菌可以包含任何合适的一组乙酸生物合成基因。包含乙酸生物合成基因的未修饰的细菌是本领域已知的，并且能够在需氧和/或厌氧条件下消耗多种底物以产生乙酸(参见，例如，Ragsdale，2008)，并且这些内源乙酸生物合成途径可以是用于本发明的遗传工程化的细菌的基因的来源。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的乙酸生物合成基因。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌中的天然乙酸生物合成基因被增强。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含例如，来自大肠杆菌的需氧乙酸生物合成基因。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包括来自例如以下的厌氧乙酸生物合成基因：Acetitomaculum、厌氧醋菌属、醋盐杆菌属、醋丝菌属、Balutia、丁酸杆菌属、梭菌属、Moorella、产醋杆菌属、鼠孢菌属、和/或Thermoacetogenium。遗传工程化的细菌可以包含用于需氧乙酸生物合成的基因或用于厌氧或微需氧乙酸生物合成的基因。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含需氧和厌氧或微需氧乙酸生物合成基因两者。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株和/或亚株的乙酸生物合成基因的组合，并且能够产生乙酸。在一些实施方案中，一个或更多个乙酸生物合成基因功能上被替代、修饰和/或突变，以增强稳定性和/或乙酸产生。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下表达乙酸生物合成盒并产生乙酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生旁路短链脂肪酸(alternateshort-chain fatty acid)。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌能够产生IL-10。白细胞介素-10(IL-10)为2类细胞因子，其范畴包括细胞因子、干扰素和干扰素样分子，诸如IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26、IL-28A、IL-28B、IL-29、IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ε、IFN-κ、IFN-τ、IFN-ω和限制素(limitin)。IL-10为通过两个受体IL-10R1和IL-10R2传导信号的抗炎细胞因子。IL-10和/或其受体的缺陷与IBD和肠敏感性相关(Nielsen,2014)。表达IL-10或蛋白酶抑制剂的细菌可以改善状况诸如克罗恩病和溃疡性结肠炎(Simpson等，2014)。遗传工程化的细菌可以包含编码IL-10，例如，人类IL-10的任何合适的基因。在一些实施方案中，编码IL-10的基因被修饰和/或突变，例如，以在诱导条件下增强稳定性、增加IL-10产生和/或增加抗炎效力。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下，例如，在与炎症相关的条件下产生IL-10。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在低氧条件下产生IL-10。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含编码IL-10的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含含SEQ ID NO:49或其功能性片段的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与含SEQ ID NO:49或其功能性片段的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸序列。
IL-10(SEQ ID NO:49):
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生IL-2。白细胞介素2(IL-2)通过保留调节性T细胞(Treg)的健康来介导自身免疫。Treg细胞，包括表达Foxp3的那些细胞，通常抑制针对自身抗原有活性的效应T细胞，并且这样做可以抑制自身免疫活性。IL-2作为细胞因子起增强Treg细胞分化和活性的作用，而IL-2活性减退可以促进自身免疫事件。IL-2由活化的CD4+ T细胞和其他免疫介质，包括活化的CD8+ T细胞、活化的树突状细胞、自然杀伤细胞和NK T细胞产生。IL-2结合IL-2R，IL-2R包含三条链(包括CD25、CD122和CD132)。IL-2促进胸腺中Treg细胞的生长，同时保留其在全身循环中的功能和活性。Treg细胞活性在IBD环境中发挥复杂的作用，鼠(murine)研究表明其在疾病发病机制中发挥保护作用。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含编码SEQ ID NO:50或其功能性片段的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与编码SEQ ID NO:50或其功能性片段的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下，例如，在与炎症相关的条件下产生IL-2。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在低氧条件下产生IL-2。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生IL-22。白细胞介素22(IL-22)细胞因子可以由树突状细胞、淋巴组织诱导物样细胞、自然杀伤细胞产生，并且被表达于适应性淋巴细胞上。通过启动Jak-STAT信号传导途径，IL-22表达可以触发抗微生物化合物的表达以及一系列细胞生长相关途径，这两者均增强组织修复机制。IL-22在促进肠屏障保真和愈合方面至关重要，同时调节炎症状态。鼠模型已经证明在施用Il-22之后改善肠炎症状态。另外，IL-22活化STAT3信号传导以促进增强的粘液产生以保留屏障功能。IL-22与IBD易感基因的关联也可能调节疾病的表型表达。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含编码SEQ ID NO:51或其功能性片段的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与编码SEQ ID NO:51或其功能性片段的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下，例如，在与炎症相关的条件下产生IL-22。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在低氧条件下产生IL-22。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生IL-27。白细胞介素27(IL-27)细胞因子主要由活化的抗原呈递细胞表达，而IL-27受体在一系列细胞(包括T细胞、NK细胞以及其他)上被发现。特别地，IL-27抑制在IBD发病机理中发挥关键作用的促炎辅助T细胞17(Th17)细胞的发育。此外，IL-27可以促进产生IL-10的Tr1细胞的分化并增强IL-10的输出，这两者均具有抗炎作用。IL-27经由肠上皮细胞内MAPK和STAT信号传导的活化对上皮屏障功能具有保护作用。另外，IL-27增强抑制细菌生长的抗细菌蛋白的产生。屏障功能的改善和细菌生长的降低表明IL-27在IBD发病机制中的有利作用。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含编码SEQ ID NO:52或其功能性片段的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与编码SEQ ID NO:52或其功能性片段的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下，例如，在与炎症相关的条件下产生IL-27。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在低氧条件下产生IL-27。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌能够产生SOD。增加的ROS水平有助于炎性肠病的病理生理学。增加的ROS水平可以导致增强的血管细胞粘附分子1(VCAM-1)的表达，这可以促进炎性介质易位至受疾病影响的组织，并且导致更大程度的炎症负担。包括超氧化物歧化酶(SOD)的抗氧化系统可以起到减轻总体ROS负担的作用。然而，研究表明，在IBD的背景中SOD的表达可受损，例如，在IBD中以较低水平产生，因此允许疾病病理学发生。另外的研究已经表明，在结肠炎模型中对大鼠补充SOD与降低的结肠脂质过氧化和内皮VCAM-1表达以及炎症环境的总体改善相关。因此，在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含编码SEQ ID NO:52或其功能性片段的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与编码SEQ ID NO:53或其功能性片段的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下，例如，在与炎症相关的条件下产生SOD。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在低氧条件下产生SOD。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生GLP-2或胰高血糖素原(proglucagon)。胰高血糖素样肽2(GLP-2)由肠内分泌细胞产生并刺激肠生长和增强消化道屏障功能。GLP-2施用具有在治疗IBD、短肠综合征和小肠肠炎方面的治疗潜力(Yazbeck等，2009)。遗传工程化的细菌可以包含编码GLP-2或胰高血糖素原，例如，人类GLP-2或胰高血糖素原的任何合适的基因。在一些实施方案中，蛋白酶抑制剂，例如二肽基肽酶的抑制剂还被施用以降低GLP-2降解。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌表达降解耐受的GLP-2类似物，例如替度鲁肽(Teduglutide)(Yazbeck等，2009)。在一些实施方案中，编码GLP-2或胰高血糖素原的基因被修饰和/或突变，例如，以在诱导条件下增强稳定性、增加GLP-2产生和/或增加消化道屏障增强效力。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌能够在诱导条件下产生GLP-2或胰高血糖素原。IBD鼠模型中的GLP-2施用与降低的粘膜损伤和炎症，以及炎性介质诸如TNF-α和IFN-γ的降低相关。此外，GLP-2补充还可以导致结肠炎/回肠炎模型中降低的粘膜髓过氧化物酶。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含编码SEQ IDNO:54或其功能性片段的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与编码SEQID NO:54或其功能性片段的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下，例如，在与炎症相关的条件下产生GLP-2。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在低氧条件下产生GLP-2。
SEQ ID NO：54
HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生犬尿氨酸。犬尿氨酸为在色氨酸分解代谢的第一个限速步骤中产生的代谢产物。该步骤牵涉将色氨酸转化为犬尿氨酸，并且可以通过广泛表达的酶吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO-1)或主要定位于肝脏的酶色氨酸双加氧酶(TDO)催化(Alvarado等，2015)。来自患有IBD的人类患者的活检与来自健康个体活检相比显示升高的IDO-1表达水平，特别是在靠近溃疡部位(Ferdinande等，2008；Wolf等，2004)。IDO-1酶表达在三硝基苯磺酸诱导的和葡聚糖硫酸钠诱导的IBD小鼠模型中类似地被上调；IDO-1的抑制显著增加了由每种诱导物引起的炎症响应(Ciorba等，2010；Gurtner等，2003；Matteoli等，2010)。也已经显示犬尿氨酸直接诱导嗜中性粒细胞的凋亡(El-Zaatari等，2014)。总之，这些观察结果表明，IDO-1和犬尿氨酸在限制炎症方面发挥作用。遗传工程化的细菌可以包含用于产生犬尿氨酸的任何合适的基因。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌可以包含用于产生色氨酸转运蛋白的基因或基因盒、用于产生IDO-1的基因或基因盒、以及用于产生TDO的基因或基因盒。在一些实施方案中，用于产生犬尿氨酸的基因被修饰和/或突变，例如，以在诱导条件下增强稳定性、增加犬尿氨酸产生和/或增加抗炎效力。在一些实施方案中，工程化的细菌具有增强的色氨酸吸收或输入，例如，包含用于增加将色氨酸吸收到细菌细胞的转运蛋白或其他机制。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下，例如，在与炎症相关的条件下产生犬尿氨酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在低氧条件下产生犬尿氨酸。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生犬尿烯酸。犬尿烯酸由酶犬尿氨酸-氧戊酸转氨酶催化的反应中的犬尿氨酸的不可逆转氨产生。犬尿烯酸充当离子型谷氨酸受体的拮抗剂(Turski等，2013)。虽然已知谷氨酸为中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质，但现在有证据表明谷氨酸在外周神经系统中起另外的作用。例如，在至GI道的主要神经供应(即，肌间神经丛)中的NMDA谷氨酸受体的活化导致消化道运动性增加(Forrest等，2003)，但用犬尿烯酸处理的大鼠在急性结肠炎早期阶段表现出减少的消化道运动性和炎症(Varga等，2010)。因此，IBD患者中报告的升高的犬尿烯酸水平可以代表对增加的肠神经元活化的补偿性响应(Forrest等，2003)。遗传工程化的细菌可以包含用于产生犬尿烯酸的任何合适的基因。在一些实施方案中，用于产生犬尿烯酸的基因被修饰和/或突变，例如，以在诱导条件下增强稳定性、增加犬尿烯酸产生和/或增加抗炎效力。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下，例如，在与炎症相关的条件下产生犬尿烯酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在低氧条件下产生犬尿烯酸。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生IL-19、IL-20、和/或IL-24。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在诱导条件下，例如，在与炎症相关的条件下产生IL-19、IL-20、和/或IL-24。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够在低氧条件下产生IL-19、IL-20、和/或IL-24。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌能够产生能够抑制促炎分子的分子。遗传工程化的细菌可以表达任何合适的抑制分子，例如，能够中和一个或更多个促炎分子，例如TNF、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-26、IL-32、花生四烯酸、前列腺素类(例如，PGE2)、PGI2、血清素、凝血噁烷类(例如，TXA2)、白三烯类(例如，LTB4)、肝氧蛋白A3、或趋化因子的单链可变片段(scFv)、反义RNA、siRNA、或shRNA(Keates等，2008；Ahmad等，2012)。遗传工程化的细菌可以抑制一个或更多个促炎分子，例如，TNF、IL-17。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够调节在表8中示出的一个或更多个分子。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够抑制、去除、降解和/或代谢一个或更多个炎性分子。
表8
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生抗炎分子和/或消化道屏障增强分子，并且还产生能够抑制炎性分子的分子。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌能够产生抗炎分子和/或消化道屏障增强分子，并且还产生能够降解炎性分子的酶。例如，本发明的遗传工程化的细菌能够表达用于产生丁酸的基因盒，以及用于抑制、去除、降解和/或代谢炎性分子例如PGE2的分子或生物合成途径。
RNA干扰(RNAi)为植物和动物中的转录后基因沉默机制。当微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)或短发夹RNA(shRNA)被加工为短干扰RNA(siRNA)双链体时，RNAi被活化(Keates等，2008)。RNAi可以“在体外和体内通过被工程化为产生shRNA并将其递送至靶细胞诸如哺乳动物细胞的非病原性细菌活化”(Keates等，2008)。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌在低氧条件下诱导一个或更多个促炎分子的RNAi介导的基因沉默。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌在低氧条件下产生靶向TNF的siRNA。
单链可变片段(scFv)为“广泛使用的在原核生物中产生的……抗体片段”(Frenzel等，2013)。scFv缺乏传统抗体的恒定结构域，并将抗原结合结构域表达为单肽。细菌诸如大肠杆菌能够产生靶向促炎细胞因子，例如，TNF的scFv(Hristodorov等，2014)。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌在低氧条件下表达用于中和一个或更多个促炎分子的结合蛋白。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌在低氧条件下产生靶向TNF的scFv。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌在低氧条件下产生靶向一个或更多个促炎分子的scFv和siRNA两者(参见，例如，Xiao等，2014)。
本领域技术人员将理解，能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的另外的基因和基因盒是本领域已知的，并且可以由本发明的遗传工程化的细菌表达。在一些实施方案中，用于产生治疗性分子的基因或基因盒还包含另外的转录和翻译元件，例如，核糖体结合位点，以增强治疗性分子的表达。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌产生两种或更多种抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子。在某些实施方案中，两个或更多个分子协同作用以降低消化道炎症和/或增强消化道屏障功能。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌表达至少一种抗炎分子和至少一种消化道屏障功能增强分子。在某些实施方案中，遗传工程化的细菌表达IL-10和GLP-2。在替代实施方案中，遗传工程化的细菌表达IL-10和丁酸。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、丙酸和丁酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生IL-10、IL-27、GLP-2和丁酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生GLP-2、IL-10、IL-22、SOD、丁酸和丙酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生GLP-2、IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、SOD、丁酸和丙酸。治疗性分子的任何合适的组合可以由遗传工程化的细菌产生。
诱导型调节区域
氧水平依赖性调节
本发明的遗传工程化的细菌包含由外源环境条件直接或间接诱导的启动子。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒被可操作地连接至氧水平依赖性启动子或包含所述启动子的调节区域。在一些实施方案中，基因或基因盒被可操作地连接至氧水平依赖性启动子，使得治疗性分子在低氧、微需氧或厌氧条件下被表达。例如，在低氧条件下，氧水平依赖性启动子由相应的氧水平感测转录因子活化，从而驱动治疗性分子的产生。
在某些实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于在富马酸和硝酸还原酶调节物(FNR)响应性启动子、精氨酸脱亚氨酶(deiminiase)和硝酸还原酶的厌氧调节(ANR)响应性启动子或异化硝酸盐呼吸调节物(dissimilatory nitrate respiration regulator)(DNR)响应性启动子的控制下产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒，其能够分别由转录因子FNR、ANR、或DNR来调节。
在某些实施方案中，遗传工程化的细菌包含FNR响应性启动子。在大肠杆菌中，FNR为控制从需氧至厌氧代谢开关的主要转录活化物(Unden等，1997)。在厌氧状态下，FNR二聚化为活性DNA结合蛋白，其活化数百个负责适应厌氧生长的基因。在需氧状态下，FNR被氧阻止二聚化并且为失活的。在一些实施方案中，将多个不同的FNR核酸序列插入于遗传工程化的细菌中。
在替代实施方案中，启动子为旁路氧水平依赖性启动子，例如，DNR(Trunk等，2010)或ANR(Ray等，1997)。在铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)中，ANR的厌氧调节是“在氧限制或厌氧条件下可诱导的生理功能的表达所必需的”(Sawers,1991；Winteler等，1996)。铜绿假单胞菌ANR与大肠杆菌FNR同源，且“共有FNR位点(TTGAT----ATCAA)被ANR和FNR有效识别”(Winteler等，1996)。像FNR一样，在厌氧状态下，ANR活化许多负责适应厌氧生长的基因。在需氧状态下，ANR是失活的。荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)都具有ANR的功能类似物(Zimmermann等，1991)。由ANR调节的启动子是本领域已知的，例如，arcDABC操纵子的启动子(参见，例如，Hasegawa等，1998)。
FNR家族还包括异化硝酸盐呼吸调节物(DNR)(Arai等，1995)，异化硝酸盐呼吸调节物(DNR)与ANR联合是“铜绿假单胞菌厌氧硝酸盐呼吸”所需的转录调节物(Hasegawa等，1998)。对于某些基因，FNR结合基序可能仅被DNR识别”(Hasegawa等，1998)。在一些实施方案中，通过本领域已知的方法进一步优化基因表达，例如，通过优化核糖体结合位点和/或增加mRNA稳定性。
FNR启动子序列是本领域已知的，并且任何合适的FNR启动子序列可以用于本发明的遗传工程化的细菌中。任何合适的FNR启动子可以与任何合适的基因或基因盒组合，以用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子。非限制性FNR启动子序列在图9中提供。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含以下的一个或更多个：SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、nirB1启动子(SEQ ID NO:57)、nirB2启动子(SEQ ID NO:58)、nirB3启动子(SEQ ID NO:59)、ydfZ启动子(SEQ ID NO:60)、融合至强核糖体结合位点的nirB启动子(SEQ ID NO:61)、融合至强核糖体结合位点的ydfZ启动子(SEQ ID NO:62)、fnrS，一种厌氧诱导的小RNA基因(fnrS1启动子SEQ ID NO:63或fnrS2启动子SEQ ID NO:64)、融合至crp结合位点的nirB启动子(SEQ ID NO:65)、和融合至crp结合位点的fnrS(SEQ ID NO:66)。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与SEQ ID NO:55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、或66或其功能性片段的DNA序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸序列。
表9
在其他实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒在融合至转录活化物，例如，CRP的结合位点的氧水平依赖性启动子的控制下表达。CRP(环状AMP受体蛋白或分解代谢活化物蛋白或CAP)通过当存在可快速代谢的碳水化合物诸如葡萄糖时阻遏负责吸收、代谢和同化较不利的碳源的基因，在细菌中发挥主要的调节作用(Wu等，2015)。对葡萄糖的这种偏好被称为葡萄糖阻遏，以及碳分解代谢阻遏(Deutscher，2008；和Stülke，2008)。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒由融合至CRP结合位点的氧水平依赖性启动子控制。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒由融合至CRP结合位点的FNR启动子控制。在这些实施方案中，当环境中不存在葡萄糖时，环状AMP与CRP结合。这种结合引起CRP的构象变化，并允许CRP与其结合位点紧密结合。CRP结合然后通过经由直接的蛋白-蛋白相互作用将RNA聚合酶募集至FNR启动子来活化基因或基因盒的转录。在葡萄糖的存在下，环状AMP不与CRP结合，并且用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒的转录被阻遏。在一些实施方案中，融合至转录活化物的结合位点的氧水平依赖性启动子(例如，FNR启动子)用于确保当存在足够量的葡萄糖时(例如通过在体外向生长培养基中添加葡萄糖)，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒在厌氧条件下不表达。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的氧水平依赖性启动子。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的氧水平感测转录因子，例如，FNR、ANR或DNR。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的氧水平感测转录因子和相应的启动子。在相同条件下与细菌中的天然转录因子和启动子相比，异源氧水平依赖性转录因子和/或启动子可以在低氧条件下增加抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的产生。在某些实施方案中，非天然氧水平依赖性转录因子为来自淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)的FNR蛋白(参见，例如，Isabella等，2011)。在一些实施方案中，相应的野生型转录因子被缺失或突变为降低或消除野生型活性。在替代实施方案中，相应的野生型转录因子保持完整并保留野生型活性。在一些实施方案中，异源转录因子使对遗传工程化的细菌中的内源调节区域和基因的脱靶效应最小化或消除脱靶效应。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含编码氧水平依赖性转录因子诸如，FNR、ANR或DNR的野生型基因，以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型启动子被突变的相应启动子。在相同条件下与野生型启动子相比，突变的启动子在低氧条件下增加了抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的产生。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含野生型氧水平依赖性启动子，例如，FNR响应性启动子、ANR响应性启动子或DNR响应性启动子，以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型转录因子被突变的相应的转录因子。在相同条件下与野生型转录因子相比，突变体转录因子在低氧条件下增加了抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的表达。在某些实施方案中，突变体氧水平依赖性转录因子为包含增强二聚化和FNR活性的氨基酸取代的FNR蛋白(参见，例如，Moore等，2006)。在一些实施方案中，氧水平感测转录因子和相应的启动子两者均相对于来自相同亚型的细菌的野生型序列被突变，以增加抗炎分子和/或消化道屏障增强分子在低氧气条件下的表达。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含编码由其天然启动子、诱导型启动子、比天然启动子更强的启动子，例如，GlnRS启动子、P(Bla)启动子，或组成型启动子控制的氧水平感测转录因子例如，FNR、ANR或DNR的基因。在一些情况下，在诱导型启动子的控制下表达氧水平依赖性转录因子以增强表达稳定性可以是有利的。在一些实施方案中，氧水平依赖性转录因子的表达由与控制治疗性分子表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方案中，氧水平依赖性转录因子的表达由控制治疗性分子表达的相同启动子控制。在一些实施方案中，氧水平依赖性转录因子和治疗性分子由启动子区域趋异转录。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含编码氧水平感测转录因子的内源基因，例如，fnr基因的多个拷贝。在一些实施方案中，编码氧水平感测转录因子的基因存在于质粒上。在一些实施方案中，编码氧水平感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于不同的质粒上。在一些实施方案中，编码氧水平感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于相同的质粒上。在一些实施方案中，编码氧水平感测转录因子的基因存在于染色体上。在一些实施方案中，编码氧水平感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于不同的染色体上。在一些实施方案中，编码氧水平感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于相同的染色体上。
在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于质粒上并且被可操作地连接至由低氧条件诱导的启动子。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于染色体中并且被可操作地连接至由低氧条件诱导的启动子。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于染色体上并且被可操作地连接至由暴露于四环素诱导的启动子。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于质粒上并且被可操作地连接至由暴露于四环素诱导的启动子。在一些实施方案中，通过本领域已知的方法进一步优化表达，例如，通过优化核糖体结合位点、操作转录调节物和/或增加mRNA稳定性。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含携带能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒的稳定维持的质粒或染色体，使得基因或基因盒可以在宿主细胞中表达，并且宿主细胞能够在体外例如在培养基中和/或在体内例如消化道中存活和/或生长。在一些实施方案中，细菌可以包含用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒的多个拷贝。在一些实施方案中，基因或基因盒在低拷贝质粒上表达。在一些实施方案中，低拷贝质粒可用于增加表达的稳定性。在一些实施方案中，低拷贝质粒可用于减少在非诱导条件下的渗漏表达(leaky expression)。在一些实施方案中，基因或基因盒在高拷贝质粒上表达。在一些实施方案中，高拷贝质粒可用于增加基因或基因盒表达。在一些实施方案中，基因或基因盒在染色体上表达。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌可以包含能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒的多个拷贝。在一些实施方案中，能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于质粒上并且被可操作地连接至氧水平依赖性启动子。在一些实施方案中，能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于染色体中并且被可操作地连接至氧水平依赖性启动子。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌在低氧条件下产生至少一种抗炎分子和/或消化道屏障增强分子以在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比将局部消化道炎症降低了至少约1.5倍、至少约2倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍或至少约1,500倍。炎症可以通过本领域已知的方法来测量，例如，使用内窥镜检查计数疾病病变；检测外周血中的调节性T细胞分化，例如，通过荧光活化分选；测量调节性T细胞水平；测量细胞因子水平；测量粘膜损伤面积；测定炎性生物标志，例如，通过qPCR；PCR阵列；转录因子磷酸化测定；免疫测定；和/或细胞因子测定试剂盒(Mesoscale,Cayman Chemical,Qiagen)。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比在低氧条件下产生至少约1.5倍、至少约2倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍或至少约1,500倍更多的抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。某些未修饰的细菌将不具有可检测水平的抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。在使用这些细菌的遗传修饰形式的实施方案中，抗炎分子和/或消化道屏障增强分子在低氧条件下将是可检测的。
在某些实施方案中，抗炎分子和/或消化道屏障增强分子为丁酸。测量丁酸水平的方法，例如，通过质谱法、气相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)，是本领域已知的(参见，例如，Aboulnaga等，2013)。在一些实施方案中，丁酸以丁酸水平/细菌光密度(OD)来测量。在一些实施方案中，测量产丁酸基因盒中的一种或更多种基因产物的活性和/或表达用作用于丁酸产生的代表测量。在一些实施方案中，将本发明的细菌细胞收获并裂解以测量丁酸产生。在替代实施方案中，在细菌细胞培养基中测量丁酸的产生。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌在低氧条件下产生至少约1nM/OD、至少约10nM/OD、至少约100nM/OD、至少约500nM/OD、至少约1μM/OD、至少约10μM/OD、至少约100μM/OD、至少约500μM/OD、至少约1mM/OD、至少约2mM/OD、至少约3mM/OD、至少约5mM/OD、至少约10mM/OD、至少约20mM/OD、至少约30mM/OD、或至少约50mM/OD的丁酸。
在某些实施方案中，抗炎分子和/或消化道屏障增强分子为丙酸。测量丙酸水平的方法，例如，通过质谱法、气相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)，是本领域已知的(参见，例如，Hillman,1978；Lukovac,2014)。在一些实施方案中，测量丙酸基因盒中的一种或更多种基因产物的活性和/或表达用作用于丙酸产生的代表测量。在一些实施方案中，将本发明的细菌细胞收获并裂解以测量丙酸产生。在替代实施方案中，在细菌细胞培养基中测量丙酸的产生。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌在低氧条件下产生至少约1μM、至少约10μM、至少约100μM、至少约500μM、至少约1mM、至少约2mM、至少约3mM、至少约5mM、至少约10mM、至少约15mM、至少约20mM、至少约30mM、至少约40mM、或至少约50mM的丙酸。
RNS依赖性调节
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含由能够感测至少一种活性氮类的转录因子直接或间接控制的可调谐型调节区域。可调谐型调节区域被可操作地连接至能够直接或间接驱动抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的表达的基因或基因盒，因此相对于RNS水平控制分子的表达。例如，可调谐型调节区域为RNS诱导型调节区域，且分子为丁酸；当RNS存在于例如发炎组织中时，RNS感测转录因子结合和/或活化调节区域并驱动产丁酸基因盒的表达，从而产生丁酸，其施加抗炎作用和/或消化道屏障增强作用。随后，当炎症被改善时，RNS水平降低，且丁酸产生被减少或消除。
在一些实施方案中，可调谐型调节区域为RNS诱导型调节区域；在RNS的存在下，转录因子感测RNS并活化RNS诱导型调节区域，从而驱动被可操作地连接的基因或基因盒的表达。在一些实施方案中，转录因子感测RNS并随后与RNS诱导型调节区域结合，从而活化下游基因表达。在替代实施方案中，在RNS的不存在下，转录因子与RNS诱导型调节区域结合；当转录因子感测RNS时，转录因子经历构象变化，从而诱导下游基因表达。
在一些实施方案中，可调谐型调节区域为RNS诱导型调节区域，并且感测RNS的转录因子为NorR。NorR“为NO响应性转录活化物，其调节编码flavorubredoxin和相关黄素蛋白的norVW基因的表达，这将NO还原为一氧化二氮”(Spiro 2006)。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自由NorR活化的基因的任何合适的RNS响应性调节区域。能够由NorR活化的基因是本领域已知的(参见，例如，Spiro，2006；Vine等，2011；Karlinsey等，2012；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含被可操作地连接至基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒的来自norVW的RNS诱导型调节区域。在RNS的存在下，NorR转录因子感测RNS并活化norVW调节区域，从而驱动被可操作地连接的产丁酸基因盒的表达并产生丁酸。
在一些实施方案中，可调谐型调节区域为RNS诱导型调节区域，并且感测RNS的转录因子为DNR。DNR(异化硝酸盐呼吸调节物)在一氧化氮存在下“促进nir、nor和nos基因的表达”(Castiglione等，2009)。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自由DNR活化的基因的任何合适的RNS响应性调节区域。能够由DNR活化的基因是本领域已知的(参见，例如，Castiglione等，2009；Giardina等，2008)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含被可操作地连接至基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒的来自norCB的RNS诱导型调节区域。在RNS的存在下，DNR转录因子感测RNS并活化norCB调节区域，从而驱动被可操作地连接的产丁酸基因盒的表达并产生丁酸。在一些实施方案中，DNR为铜绿假单胞菌DNR。
在一些实施方案中，可调谐型调节区为RNS去阻遏型调节区域，并且相应的转录因子的结合阻遏下游基因表达；在RNS的存在下，转录因子不再与调节区域结合，从而使被可操作地连接的基因或基因盒去阻遏。
在一些实施方案中，可调谐型调节区域为RNS去阻遏型调节区域，并且感测RNS的转录因子为NsrR。NsrR为“Rrf2型转录阻遏物，[其]可以感测NO并控制负责NO代谢的基因的表达”(Isabella等，2009)。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自由NsrR阻遏的基因的任何合适的RNS响应性调节区域。在一些实施方案中，NsrR为淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)NsrR。能够由NsrR阻遏的基因是本领域已知的(参见，例如，Isabella等，2009；Dunn等，2010；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含被可操作地连接至基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒的来自norB的RNS去阻遏型调节区域。在RNS的存在下，NsrR转录因子感测RNS并且不再与norB调节区域结合，从而使被可操作地连接的产丁酸基因盒去阻遏并产生丁酸。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌表达不调节细菌中大量天然基因的表达的RNS感测转录因子是有利的。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌表达来自细菌的不同物种、菌株或亚株的RNS感测转录因子，其中转录因子不与本发明的遗传工程化的细菌中的调节序列结合。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌为大肠杆菌，且RNS感测转录因子为NsrR，例如，来自淋病奈瑟氏菌的NsrR，其中大肠杆菌不包含所述NsrR的结合位点。在一些实施方案中，异源转录因子使对遗传工程化的细菌中的内源调节区域和基因的脱靶效应最小化或消除脱靶效应。
在一些实施方案中，可调谐型调节区为RNS阻遏型调节区域，并且相应的转录因子的结合阻遏下游基因表达；在RNS的存在下，转录因子感测RNS并且与RNS阻遏型调节区域结合，从而阻遏被可操作地连接的基因或基因盒的表达。在一些实施方案中，RNS感测转录因子能够结合与部分启动子序列重叠的调节区域。在替代实施方案中，RNS感测转录因子能够与在启动子序列的上游或下游的调节区域结合。
在这些实施方案中，遗传工程化的细菌可以包含两个阻遏物活化调节回路，其用于表达抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子。两个阻遏物活化调节回路包含第一RNS感测阻遏物和第二阻遏物，第二阻遏物被可操作地连接至基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒。在这些实施方案的一个方面，RNS感测阻遏物抑制第二阻遏物的转录，第二阻遏物抑制基因或基因盒的转录。可用于这些实施方案中的第二阻遏物的实例包括，但不限于，TetR、C1和LexA。在由第一阻遏物的结合(其在RNS的不存在下发生)的不存在下，第二阻遏物被转录，第二阻遏物阻遏基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒的表达。在由第一阻遏物的结合(其在RNS的存在下发生)的存在下，第二阻遏物的表达被阻遏，并且基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒被表达。
取决于在遗传工程化的细菌中使用的调节区域序列，RNS响应性转录因子可以诱导、去阻遏或阻遏基因表达。一种或更多种类型的RNS感测转录因子及相应的调节区域序列可以存在于遗传工程化的细菌中。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含一种类型的RNS感测转录因子，例如，NsrR，以及一种相应的调节区域序列，例如来自norB的调节区域序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含一种类型的RNS感测转录因子，例如，NsrR，以及两种或更多种不同的相应的调节区域序列，例如来自norB和aniA的调节区域序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含两种或更多种类型的RNS感测转录因子，例如，NsrR和NorR，以及两种或更多种相应的调节区域序列，例如分别来自norB和norR的调节区域序列。一个RNS响应性调节区域可以能够结合多于一个转录因子。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含两种或更多种类型的RNS感测转录因子、以及一种相应的调节区域序列。几种RNS调节的调节区域的核酸序列是本领域已知的(参见，例如，Spiro,2006；Isabella等，2009；Dunn等，2010；Vine等，2011；Karlinsey等，2012)。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含编码由其天然启动子、诱导型启动子、比天然启动子更强的启动子(例如，GlnRS启动子或P(Bla)启动子)或组成型启动子控制的RNS感测转录因子，例如，nsrR基因。在一些情况下，在诱导型启动子的控制下表达RNS感测转录因子以增强表达稳定性可以是有利的。在一些实施方案中，RNS感测转录因子的表达由与控制治疗性分子表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方案中，RNS感测转录因子的表达由控制治疗性分子表达的相同启动子控制。在一些实施方案中，RNS感测转录因子和治疗性分子由启动子区域趋异转录。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的RNS感测转录因子的基因。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的RNS响应性调节区域。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的RNS感测转录因子及相应的RNS响应性调节区域。异源RNS感测转录因子和调节区域可以在相同条件下与来自相同亚型的细菌的天然转录因子和调节区域相比在RNS的存在下增加被可操作地连接至所述调节区域的基因的转录。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自淋病奈瑟氏菌的RNS感测转录因子，NsrR，以及相应的调节区域序列，nsrR。在一些实施方案中，天然RNS感测转录因子，例如，NsrR保持完整并保留野生型活性。在替代实施方案中，天然RNS感测转录因子，例如，NsrR被缺失或突变为降低或消除野生型活性。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含编码RNS感测转录因子的内源基因，例如，nsrR基因的多个拷贝。在一些实施方案中，编码RNS感测转录因子的基因存在于质粒上。在一些实施方案中，编码RNS感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于不同的质粒上。在一些实施方案中，编码RNS感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于相同的质粒上。在一些实施方案中，编码RNS感测转录因子的基因存在于染色体上。在一些实施方案中，编码RNS感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于不同的染色体上。在一些实施方案中，编码RNS感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于相同的染色体上。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含编码RNS感测转录因子的野生型基因，例如，NsrR基因，以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型调节区域被突变的相应的调节区域，例如，norB调节区域。突变的调节区域在相同条件下与野生型调节区域相比在RNS的存在下增加抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的表达。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含野生型RNS响应性调节区域，例如，norB调节区域，以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型转录因子被突变的相应的转录因子，例如，NsrR。突变体转录因子在相同条件下与野生型转录因子相比在RNS的存在下增加抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的表达。在一些实施方案中，RNS感测转录因子和相应的调节区域两者均相对于来自相同亚型的细菌的野生型序列被突变，以增加抗炎分子和/或消化道屏障增强分子在RNS的存在下的表达。
包含编码NsrR的基因和norB启动子的示例性RNS调节构建体的核酸序列示于表10和表11中。表10描绘了包含编码nsrR的基因、norB的调节区域和产丁酸基因盒的示例性RNS调节构建体的核酸序列(pLogic031-nsrR-norB-丁酸构建体；SEQ ID NO:67)。编码NsrR的序列被加下划线和加粗，并且NsrR结合位点，即norB的调节区域被表11描绘了包含编码nsrR的基因、norB的调节区域和产丁酸基因盒的示例性RNS调节构建体的核酸序列(pLogic046-nsrR-norB-丁酸构建体；SEQ ID NO:68)。编码NsrR的序列被加下划线和加粗，并且NsrR结合位点，即norB的调节区域被包含tet启动子的四环素调节构建体的核酸序列示于表12和表13中。表12描绘了包含tet启动子和产丁酸基因盒的示例性四环素调节构建体的核酸序列(pLogic031-tet-丁酸构建体；SEQ ID NO:69)。编码TetR的序列被加 下划线，且重叠的tetR/tetA启动子被表13描绘了包含tet启动子和产丁酸基因盒的示例性四环素调节构建体的核酸序列(pLogic046-tet-丁酸构建体；SEQ ID NO:70)。编码TetR的序列被加下划线，且重叠的tetR/tetA启动子被在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与SEQ ID NO:67、68、69、或70或其功能性片段的DNA序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸序列。
表10
表11
表12
表13
在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于质粒上并且被可操作地连接至由RNS诱导的启动子。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于染色体中并且被可操作地连接至由RNS诱导的启动子。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于染色体上并且被可操作地连接至由暴露于四环素诱导的启动子。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于质粒上并且被可操作地连接至由暴露于四环素诱导的启动子。在一些实施方案中，通过本领域已知的方法进一步优化表达，例如，通过优化核糖体结合位点、操作转录调节物和/或增加mRNA稳定性。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含携带能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒的稳定维持的质粒或染色体，使得基因或基因盒可以在宿主细胞中表达，并且宿主细胞能够在体外例如在培养基中和/或在体内例如消化道中存活和/或生长。在一些实施方案中，细菌可以包含用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒的多个拷贝。在一些实施方案中，基因或基因盒在低拷贝质粒上表达。在一些实施方案中，低拷贝质粒可用于增加表达的稳定性。在一些实施方案中，低拷贝质粒可用于减少在非诱导条件下的渗漏表达。在一些实施方案中，基因或基因盒在高拷贝质粒上表达。在一些实施方案中，高拷贝质粒可用于增加基因或基因盒表达。在一些实施方案中，基因或基因盒在染色体上表达。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌可以包含能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒的多个拷贝。在一些实施方案中，能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于质粒上并且被可操作地连接至RNS响应性调节区域。在一些实施方案中，能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于染色体中并且被可操作地连接至RNS响应性调节区域。
在一些实施方案中，本公开内容的任何基因或基因盒可以在一个或更多个整合位点整合到细菌染色体中。例如，可以将产丁酸基因盒的一个或更多个拷贝整合到细菌染色体中。具有整合到染色体中的产丁酸基因盒的多个拷贝允许更大量的丁酸的产生，并且还允许微调表达水平。可选地，除了治疗基因或基因盒以外，本文描述的不同回路，诸如任何杀死开关回路可以在一个或更多个不同的整合位点整合到细菌染色体中，以进行多种不同的功能。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌在RNS的存在下产生至少一种抗炎分子和/或消化道屏障增强分子以在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比将局部消化道炎症降低了至少约1.5倍、至少约2倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍或至少约1,500倍。炎症可以通过本领域已知的方法来测量，例如，使用内窥镜检查计数疾病病变；检测外周血中的调节性T细胞分化，例如，通过荧光活化分选；测量调节性T细胞水平；测量细胞因子水平；测量粘膜损伤面积；测定炎性生物标志，例如，通过qPCR；PCR阵列；转录因子磷酸化测定；免疫测定；和/或细胞因子测定试剂盒(Mesoscale,Cayman Chemical,Qiagen)。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比在RNS的存在下产生至少约1.5倍、至少约2倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍或至少约1,500倍更多的抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。某些未修饰的细菌将不具有可检测水平的抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。在使用这些细菌的遗传修饰形式的实施方案中，抗炎分子和/或消化道屏障增强分子在RNS的存在下将是可检测的。
在某些实施方案中，抗炎分子和/或消化道屏障增强分子为丁酸。测量丁酸水平的方法，例如，通过质谱法、气相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)，是本领域已知的(参见，例如，Aboulnaga等，2013)。在一些实施方案中，丁酸以丁酸水平/细菌光密度(OD)来测量。在一些实施方案中，测量产丁酸基因盒中的一种或更多种基因产物的活性和/或表达用作用于丁酸产生的代表测量。在一些实施方案中，将本发明的细菌细胞收获并裂解以测量丁酸产生。在替代实施方案中，在细菌细胞培养基中测量丁酸的产生。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌在RNS的存在下产生至少约1nM/OD、至少约10nM/OD、至少约100nM/OD、至少约500nM/OD、至少约1μM/OD、至少约10μM/OD、至少约100μM/OD、至少约500μM/OD、至少约1mM/OD、至少约2mM/OD、至少约3mM/OD、至少约5mM/OD、至少约10mM/OD、至少约20mM/OD、至少约30mM/OD、或至少约50mM/OD的丁酸。
ROS依赖性调节
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含由能够感测至少一种活性氧类的转录因子直接或间接控制的可调谐型调节区域。可调谐型调节区域被可操作地连接至能够直接或间接驱动抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的表达的基因或基因盒，因此相对于ROS水平控制分子的表达。例如，可调谐型调节区域为ROS诱导型调节区域，且分子为丁酸；当ROS存在于例如发炎组织中时，ROS感测转录因子结合和/或活化调节区域并驱动产丁酸基因盒的表达，从而产生丁酸，其施加抗炎作用和/或消化道屏障增强作用。随后，当炎症被改善时，ROS水平降低，且丁酸产生被减少或消除。
在一些实施方案中，可调谐型调节区域为ROS诱导型调节区域；在ROS的存在下，转录因子感测ROS并活化ROS诱导型调节区域，从而驱动被可操作地连接的基因或基因盒的表达。在一些实施方案中，转录因子感测ROS并随后与ROS诱导型调节区域结合，从而活化下游基因表达。在替代实施方案中，在ROS的不存在下，转录因子与ROS诱导型调节区域结合；当转录因子感测ROS时，转录因子经历构象变化，从而诱导下游基因表达。
在一些实施方案中，可调谐型调节区域为ROS诱导型调节区域，并且感测ROS的转录因子为OxyR。OxyR“主要作为过氧化物应激响应的全局调节物起作用”，并且能够调节数十种基因，例如，“参与以下的基因：H2O2解毒(katE、ahpCF)、血红素生物合成(hemH)、还原剂供应(grxA、gor、trxC)、硫醇二硫化物异构化(dsbG)、Fe-S中心修复(sufA-E、sufS)、铁结合(yaaA)、铁输入系统的阻遏(fur)”和“OxyS，小调节RNA”(Dubbs等，2012)。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自由OxyR活化的基因的任何合适的ROS响应性调节区域。能够由OxyR活化的基因是本领域已知的(参见，例如，Zheng等，2001；Dubbs等，2012；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含被可操作地连接至基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒的来自oxyS的ROS诱导型调节区域。在ROS，例如，H2O2的存在下，OxyR转录因子感测ROS并活化oxyS调节区域，从而驱动被可操作地连接的产丁酸基因盒的表达并产生丁酸。在一些实施方案中，OxyR由大肠杆菌oxyR基因编码。在一些实施方案中，oxyS调节区域为大肠杆菌oxyS调节区域。在一些实施方案中，ROS诱导型调节区域选自katG、dps、和ahpC的调节区域。
在替代实施方案中，可调谐型调节区域为ROS诱导型调节区域，并且感测ROS的相应的转录因子为SoxR。当SoxR“由其[2Fe-2S]簇的氧化活化时，SoxR增加SoxS的合成，SoxS然后活化其靶基因表达”(Koo等，2003)。“已知SoxR主要响应于超氧化物和一氧化氮”(Koo等，2003)，并且还能够响应于H2O2。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自由SoxR活化的基因的任何合适的ROS响应性调节区域。能够由SoxR活化的基因是本领域已知的(参见，例如，Koo等，2003；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含被可操作地连接至基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒的来自soxS的ROS诱导型调节区域。在ROS的存在下，SoxR转录因子感测ROS并活化soxS调节区域，从而驱动被可操作地连接的产丁酸基因盒的表达并产生丁酸。
在一些实施方案中，可调谐型调节区为ROS去阻遏型调节区域，并且相应的转录因子的结合阻遏下游基因表达；在ROS的存在下，转录因子不再与调节区域结合，从而使被可操作地连接的基因或基因盒去阻遏。
在一些实施方案中，可调谐型调节区域为ROS去阻遏型调节区域，并且感测ROS的转录因子为OhrR。OhrR“结合一对与ohrA启动子位点重叠的反向重复DNA序列，并且从而阻遏转录事件”，但氧化的OhrR“不能结合其DNA靶”(Duarte等，2010)。OhrR为“转录阻遏物，[其]...感测有机过氧化物和NaOCl两者”(Dubbs等，2012)，并且“由H2O2弱活化，但其显示对有机氢过氧化物高得多的反应性”(Duarte等，2010)。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自由OhrR阻遏的基因的任何合适的ROS响应性调节区域。能够由OhrR阻遏的基因是本领域已知的(参见，例如，Dubbs等，2012；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含被可操作地连接至基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒的来自ohrA的ROS去阻遏型调节区域。在ROS，例如，NaOCl的存在下，OhrR转录因子感测ROS并且不再与ohrA调节区域结合，从而使被可操作地连接的产丁酸基因盒去阻遏并产生丁酸。
OhrR为ROS响应性调节物的MarR家族的成员。“MarR家族的大多数成员为转录阻遏物，并且通常与启动子中的-10或-35区域结合，引起RNA聚合酶结合的空间位阻(stericinhibition)”(Bussmann等，2010)。该家族的其他成员是本领域已知的，并且包括，但不限于，OspR、MgrA、RosR和SarZ。在一些实施方案中，感测ROS的转录因子为OspR、MgRA、RosR和/或SarZ，并且本发明的遗传工程化的细菌包含来自由OspR、MgRA、RosR和/或SarZ阻遏的基因的一个或更多个相应的调控区域序列。能够由OspR、MgRA、RosR、和/或SarZ阻遏的基因是本领域已知的(参见，例如，Dubbs等，2012)。
在一些实施方案中，可调谐型调节区域为ROS去阻遏型调节区域，并且感测ROS的相应的转录因子为RosR。RosR为“MarR型转录调节物”，其与“具有共有序列TTGTTGAYRYRTCAACWA的18-bp反向重复”结合，并由“氧化剂H2O2可逆地抑制”(Bussmann等，2010)。RosR能够阻遏许多基因和推定的基因，包括但不限于“推定的聚异戊二烯类(polyisoprenoid)结合蛋白(cg1322，在rosR上游并与rosR趋异的基因)、感觉组氨酸激酶(cgtS9)、Crp/FNR家族的推定的转录调节物(cg3291)、谷胱甘肽S-转移酶家族的蛋白(cg1426)、两个推定的FMN还原酶(cg1150和cg1850)和四个推定的单加氧酶(cg0823、cg1848、cg2329、和cg3084)”(Bussmann等，2010)。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自由RosR阻遏的基因的任何合适的ROS响应性调节区域。能够由RosR阻遏的基因是本领域已知的(参见，例如，Bussmann等，2010；表1)。在某些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含被可操作地连接至基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒的来自cgtS9的ROS去阻遏型调节区域。在ROS，例如，H2O2的存在下，RosR转录因子感测ROS并且不再与cgtS9调节区域结合，从而使被可操作地连接的产丁酸基因盒去阻遏并产生丁酸。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌表达不调节细菌中大量天然基因的表达的ROS感测转录因子是有利的。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌表达来自细菌的不同物种、菌株或亚株的ROS感测转录因子，其中转录因子不与本发明的遗传工程化的细菌中的调节序列结合。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌为大肠杆菌，且ROS感测转录因子为RosR，例如，来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的RosR，其中大肠杆菌不包含所述RosR的结合位点。在一些实施方案中，异源转录因子使对遗传工程化的细菌中的内源调节区域和基因的脱靶效应最小化或消除脱靶效应。
在一些实施方案中，可调谐型调节区为ROS阻遏型调节区域，并且相应的转录因子的结合阻遏下游基因表达；在ROS的存在下，转录因子感测ROS并且与ROS阻遏型调节区域结合，从而阻遏被可操作地连接的基因或基因盒的表达。在一些实施方案中，ROS感测转录因子能够结合与部分启动子序列重叠的调节区域。在替代实施方案中，ROS感测转录因子能够与在启动子序列的上游或下游的调节区域结合。
在一些实施方案中，可调谐型调节区域为ROS阻遏型调节区域，并且感测ROS的转录因子为PerR。在枯草芽孢杆菌中，PerR“当与DNA结合时，阻遏编码参与以下的蛋白的基因：氧化应激响应(katA、ahpC、和mrgA)、金属稳态(hemAXCDBL、fur、和zoaA)及其自身合成(perR)”(Marinho等，2014)。PerR为“主要响应于H2O2的全局调节物”(Dubbs等，2012)，并且“在per盒与DNA相互作用，per盒为特定的回文共有序列(TTATAATNATTATAA)，其位于PerR控制的基因的启动子序列内和附近”(Marinho等，2014)。PerR能够结合“与部分启动子重叠或紧靠其的下游”的调节区域(Dubbs等，2012)。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自由PerR阻遏的基因的任何合适的ROS响应性调节区域。能够由PerR阻遏的基因是本领域已知的(参见，例如，Dubbs等，2012；表1)。
在这些实施方案中，遗传工程化的细菌可以包含两个阻遏物活化调节回路，其用于表达抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子。两个阻遏物活化调节回路包含第一ROS感测阻遏物，例如，PerR，和第二阻遏物，例如，TetR，第二阻遏物被可操作地连接至基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒。在这些实施方案的一个方面，ROS感测阻遏物抑制第二阻遏物的转录，第二阻遏物抑制基因或基因盒的转录。可用于在这些实施方案中的第二阻遏物的实例包括，但不限于，TetR、C1和LexA。在一些实施方案中，ROS感测阻遏物为PerR。在一些实施方案中，第二阻遏物为TetR。在该实施方案中，PerR阻遏型调节区域驱动TetR的表达，并且TetR阻遏型调节区域驱动基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒的表达。在PerR结合(其在ROS的不存在下发生)的不存在下，tetR被转录，并且TetR阻遏基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒的表达。在PerR结合(其在ROS的存在下发生)的存在下，tetR表达被阻遏，并且基因或基因盒，例如，产丁酸基因盒被表达。
取决于在遗传工程化的细菌中使用的调节区域序列，ROS响应性转录因子可以诱导、去阻遏或阻遏基因表达。例如，尽管“OxyR主要被认为是在氧化条件下的转录活化物...OxyR还可以在氧化和还原两种条件下作为阻遏物或活化物起作用”(Dubbs等，2012)，并且OxyR“已经显示出为其自身表达的阻遏物以及fhuF(编码铁离子还原酶)和flu(编码抗原43外膜蛋白)的阻遏物”(Zheng等，2001)。本发明的遗传工程化的细菌可以包含来自由OxyR阻遏的基因的任何合适的ROS响应性调节区域。在一些实施方案中，如以上描述的，OxyR用于两个阻遏物活化调节回路中。能够由OxyR阻遏的基因是本领域已知的(参见，例如，OxyR等，2001；表1)。或者，例如，尽管RosR能够阻遏许多基因，但它也能够活化某些基因，例如，narKGHJI操纵子。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自由RosR活化的基因的任何合适的ROS响应性调节区域。另外，“PerR介导的阳性调节也被观察到...并且似乎牵涉PerR结合远距离的上游位点”(Dubbs等，2012)。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自由PerR活化的基因的任何合适的ROS响应性调节区域。
一种或更多种类型的ROS感测转录因子及相应的调节区域序列可以存在于遗传工程化的细菌中。例如，“OhrR被发现于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两者中，并且可以以OxyR或PerR或两者为核心侧(coreside)”(Dubbs等，2012)。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含一种类型的ROS感测转录因子，例如，OxyR，以及一种相应的调节区域序列，例如来自oxyS的调节区域序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含一种类型的ROS感测转录因子，例如，OxyR，以及两种或更多种不同的相应的调节区域序列，例如来自oxyS和katG的调节区域序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含两种或更多种类型的ROS感测转录因子，例如，OxyR和PerR，以及两种或更多种相应的调节区域序列，例如分别来自oxyS和katA的调节区域序列。一个ROS响应性调节区域可以能够结合多于一个转录因子。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含两种或更多种类型的ROS感测转录因子、以及一种相应的调节区域序列。
几个示例性OxyR调节的调节区域的核酸序列示于表14中。OxyR结合位点被加下划 线和加粗。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含与SEQ ID NO:71、72、73、或74或其功能性片段的DNA序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％同源的核酸序列。
表14：示例性OxyR调节的调节区域的核苷酸序列
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含编码由其天然启动子、诱导型启动子、比天然启动子更强的启动子(例如，GlnRS启动子或P(Bla)启动子)或组成型启动子控制的ROS感测转录因子，例如，oxyR基因。在一些情况下，在诱导型启动子的控制下表达ROS感测转录因子以增强表达稳定性可以是有利的。在一些实施方案中，ROS感测转录因子的表达由与控制治疗性分子表达的启动子不同的启动子控制。在一些实施方案中，ROS感测转录因子的表达由控制治疗性分子表达的相同启动子控制。在一些实施方案中，ROS感测转录因子和治疗性分子由启动子区域趋异转录。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的ROS感测转录因子的基因。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的ROS响应性调节区域。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自细菌的不同物种、菌株或亚株的ROS感测转录因子及相应的ROS响应性调节区域。异源ROS感测转录因子和调节区域在相同条件下与来自相同亚型的细菌的天然转录因子和调节区域相比可以在ROS的存在下增加被可操作地连接至所述调节区域的基因的转录。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含来自大肠杆菌的ROS感测转录因子，OxyR，以及相应的调节区域序列，oxyS。在一些实施方案中，天然ROS感测转录因子，例如，OxyR保持完整并保留野生型活性。在替代实施方案中，天然ROS感测转录因子，例如，OxyR被缺失或突变为降低或消除野生型活性。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含编码ROS感测转录因子的内源基因，例如，oxyR基因的多个拷贝。在一些实施方案中，编码ROS感测转录因子的基因存在于质粒上。在一些实施方案中，编码ROS感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于不同的质粒上。在一些实施方案中，编码ROS感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于相同的质粒上。在一些实施方案中，编码ROS感测转录因子的基因存在于染色体上。在一些实施方案中，编码ROS感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于不同的染色体上。在一些实施方案中，编码ROS感测转录因子的基因和用于产生治疗性分子的基因或基因盒存在于相同的染色体上。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含编码ROS感测转录因子的野生型基因，例如，soxR基因，以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型调节区域被突变的相应的调节区域，例如，soxS调节区域。突变的调节区域在相同条件下与野生型调节区域相比在ROS的存在下增加了抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的表达。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含野生型ROS响应性调节区域，例如，oxyS调节区域，以及相对于来自相同亚型的细菌的野生型转录因子被突变的相应的转录因子，例如，OxyR。突变体转录因子在相同条件下与野生型转录因子相比在ROS的存在下增加抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的表达。在一些实施方案中，ROS感测转录因子和相应的调节区域两者相对于来自相同亚型的细菌的野生型序列均被突变，以增加抗炎分子和/或消化道屏障增强分子在ROS的存在下的表达。
包含oxyS启动子的示例性ROS调节构建体的核酸序列示于表15和表16中。编码OxyR的示例性构建体的核酸序列示于表17中。包含tet启动子的四环素调节构建体的核酸序列示于表18和表19中。表15描绘了包含oxyS启动子和产丁酸基因盒的示例性ROS调节构建体的核酸序列(pLogic031-oxyS-丁酸构建体；SEQ ID NO:75)。表16描绘了包含oxyS启动子和产丁酸基因盒的示例性ROS调节构建体的核酸序列(pLogic046-oxyS-丁酸构建体；SEQID NO:76)。表17描绘了编码OxyR的示例性构建体的核酸序列(pZA22-oxyR构建体；SEQ IDNO:77)。表18描绘了包含tet启动子和产丁酸基因盒的示例性四环素调节构建体的核酸序列(pLogic031-tet-丁酸构建体；SEQ ID NO:78)。编码TetR的序列被加下划线，且重叠的tetR/tetA启动子被表19描绘了包含tet启动子和产丁酸基因盒的示例性四环素调节构建体的核酸序列(pLogic046-tet-丁酸构建体；SEQ ID NO:79)。编码TetR的序列被加 下划线，且重叠的tetR/tetA启动子被
表15
表16
表17
表18
表19
在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于质粒上并且被可操作地连接至由ROS诱导的启动子。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于染色体中并且被可操作地连接至由ROS诱导的启动子。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于染色体上并且被可操作地连接至由暴露于四环素诱导的启动子。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于质粒上并且被可操作地连接至由暴露于四环素诱导的启动子。在一些实施方案中，通过本领域已知的方法进一步优化表达，例如，通过优化核糖体结合位点、操作转录调节物和/或增加mRNA稳定性。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含携带能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒的稳定维持的质粒或染色体，使得基因或基因盒可以在宿主细胞中表达，并且宿主细胞能够在体外例如在培养基中和/或在体内例如消化道中存活和/或生长。在一些实施方案中，细菌可以包含用于产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒的多个拷贝。在一些实施方案中，基因或基因盒在低拷贝质粒上表达。在一些实施方案中，低拷贝质粒可用于增加表达的稳定性。在一些实施方案中，低拷贝质粒可用于减少在非诱导条件下的渗漏表达。在一些实施方案中，基因或基因盒在高拷贝质粒上表达。在一些实施方案中，高拷贝质粒可用于增加基因或基因盒表达。在一些实施方案中，基因或基因盒在染色体上表达。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌可以包含能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒的多个拷贝。在一些实施方案中，能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于质粒上并且被可操作地连接至ROS响应性调节区域。在一些实施方案中，能够产生抗炎分子和/或消化道屏障功能增强分子的基因或基因盒存在于染色体中并且被可操作地连接至ROS响应性调节区域。
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌在ROS的存在下产生至少一种抗炎分子和/或消化道屏障增强分子以在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比将局部消化道炎症降低了至少约1.5倍、至少约2倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍或至少约1,500倍。炎症可以通过本领域已知的方法来测量，例如，使用内窥镜检查计数疾病病变；检测外周血中的调节性T细胞分化，例如，通过荧光活化分选；测量调节性T细胞水平；测量细胞因子水平；测量粘膜损伤面积；测定炎性生物标志，例如，通过qPCR；PCR阵列；转录因子磷酸化测定；免疫测定；和/或细胞因子测定试剂盒(Mesoscale,Cayman Chemical,Qiagen)。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌在相同条件下与相同亚型的未修饰细菌相比在ROS的存在下产生至少约1.5倍、至少约2倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、至少约600倍、至少约700倍、至少约800倍、至少约900倍、至少约1,000倍或至少约1,500倍更多的抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。某些未修饰的细菌将不具有可检测水平的抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。在使用这些细菌的遗传修饰形式的实施方案中，抗炎分子和/或消化道屏障增强分子在ROS的存在下将是可检测的。
在某些实施方案中，抗炎分子和/或消化道屏障增强分子为丁酸。测量丁酸水平的方法，例如，通过质谱法、气相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)，是本领域已知的(参见，例如，Aboulnaga等，2013)。在一些实施方案中，丁酸以丁酸水平/细菌光密度(OD)来测量。在一些实施方案中，测量产丁酸基因盒中的一种或更多种基因产物的活性和/或表达用作用于丁酸产生的代表测量。在一些实施方案中，将本发明的细菌细胞收获并裂解以测量丁酸产生。在替代实施方案中，在细菌细胞培养基中测量丁酸的产生。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌在ROS的存在下产生至少约1nM/OD、至少约10nM/OD、至少约100nM/OD、至少约500nM/OD、至少约1μM/OD、至少约10μM/OD、至少约100μM/OD、至少约500μM/OD、至少约1mM/OD、至少约2mM/OD、至少约3mM/OD、至少约5mM/OD、至少约10mM/OD、至少约20mM/OD、至少约30mM/OD、或至少约50mM/OD的丁酸。
多种作用机制
在一些实施方案中，细菌被遗传工程化为包括多种作用机制(MOA)，例如，产生相同产物的多个拷贝(以增强拷贝数)的回路或进行多种不同功能的回路。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、丙酸和丁酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生IL-10、IL-27、GLP-2和丁酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生GLP-2、IL-10、IL-22、SOD、丁酸和丙酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生GLP-2、IL-2、IL-10、IL-22、IL-27、SOD、丁酸和丙酸。治疗性分子的任何合适的组合可以由遗传工程化的细菌产生。插入位点的实例包括，但不限于，malE/K、insB/I、araC/BAD、lacZ、dapA、cea、及图51示出的其他插入位点。例如，遗传工程化的细菌可以包括插入在四个不同插入位点，例如，malE/K、insB/I、araC/BAD、和lacZ的四个拷贝的GLP-2。可选地，遗传工程化的细菌可以包括插入在三个不同插入位点，例如，malE/K、insB/I、和lacZ的GLP-2的三个拷贝，以及插入在三个不同的插入位点，例如，dapA、cea、和araC/BAD的丁酸基因盒的三个拷贝。
分泌
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含能够从细菌细胞质分泌抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的天然分泌机制(例如，革兰氏阳性细菌)或非天然分泌机制(例如，革兰氏阴性细菌)。许多细菌已经演化出复杂的分泌系统，以跨越细菌细胞包膜转运物质(substrate)。物质，诸如小分子、蛋白和DNA可以被释放到细胞外空间或周质(诸如，消化道腔或其他空间)中，注射到靶细胞中或与细菌膜缔合。
在革兰氏阴性细菌中，分泌机制可以跨越内膜和外膜中的一个或两个。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含非天然跨双膜分泌系统。跨双膜分泌系统包括，但不限于，I型分泌系统(T1SS)、II型分泌系统(T2SS)、III型分泌系统(T3SS)、IV型分泌系统(T4SS)、VI型分泌系统(T6SS)和抗性-结瘤-分裂(RND)家族的多药物外排泵(theresistance-nodulation-division(RND)family of multi-drug efflux pumps)(Pugsley,1993；Gerlach等，2007；Collinson等，2015；Costa等，2015；Reeves等，2015；WO2014138324A1，通过引用并入本文)。此类分泌系统的实例示于图68-71。具有革兰氏阴性样细胞包膜的分枝杆菌(Mycobacteria)也可以编码VII型分泌系统(T7SS)(Stanley等，2003)。除了T2SS以外，跨双膜分泌通常将物质从细菌细胞质直接转运到细胞外空间或靶细胞中。相比之下，T2SS和仅跨越外膜的分泌系统可以使用两步机制，其中物质首先由跨内膜转运蛋白(inner membrane-spanning transporters)易位至周质，并且然后转移至外膜或分泌到细胞外空间。跨外膜分泌系统包括，但不限于，V型分泌或自身转运蛋白系统(autotransporter system)(T5SS)、curli分泌系统和用于菌毛蛋白组装的伴侣引领蛋白途径(chaperone-usher pathway)(Saier,2006；Costa等，2015)
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌还包含来自志贺氏菌属、沙门氏菌属、大肠杆菌、Bivrio、伯克氏菌属(Burkholderia)、耶尔森氏菌属、衣原体属(Chlamydia)、或假单胞菌属(Pseudomonas)的III型或III型样分泌系统(T3SS)。T3SS能够通过针状复合物(needle complex)将蛋白从细菌细胞质转运至宿主细胞质。T3SS可以被修饰为从细菌细胞质分泌分子，但不将分子注射到宿主细胞质。因此，分子被分泌到消化道腔或其他细胞外空间中。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含所述修饰的T3SS并且能够从细菌细胞质分泌抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。在一些实施方案中，分泌的分子包含允许分子从细菌分泌的III型分泌序列。
在一些实施方案中，鞭毛III型分泌途径用于分泌抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。在一些实施方案中，通过将分子重组融合至天然鞭毛组分的N末端鞭毛分泌信号，使用不完全鞭毛来分泌治疗性分子。以这种方式，细胞内表达的嵌合分子可以跨越内膜和外膜移动到周围的宿主环境中。
在一些实施方案中，V型自身转运蛋白分泌系统用于分泌抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。由于机器(machinery)的简单性和处理相对大的蛋白通量的能力，V型分泌系统对于重组蛋白的细胞外产生是有吸引力的。如图69中示出的，治疗性肽(星形)可以与自身转运蛋白的N末端分泌信号、接头和β结构域融合。N末端信号序列将蛋白质导向SecA-YEG机器，该SecA-YEG机器将蛋白跨越内膜移动到周质中，随后信号序列被裂解。β结构域被募集至Bam复合物(‘β桶状组装机器’)，其中β结构域被折叠作为β桶状结构并被插入到外膜中。治疗性肽在接头序列之前被穿过β桶状结构的中空孔。在暴露于细胞外环境后，治疗性肽可以通过自身催化裂解(Bam复合物的左侧)或通过将膜缔合肽酶(黑色剪刀；Bam复合物的右侧)靶向接头中的互补蛋白酶切割位点而从接头系统中释放。因此，在一些实施方案中，分泌的分子，诸如，异源蛋白或肽包含自身转运蛋白的N末端分泌信号、接头和β结构域，以允许分子从细菌分泌。
在一些实施方案中，基于溶血素的分泌系统用于分泌抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。I型分泌系统提供将它们的乘客肽直接从细胞质易位至细胞外空间，避免了其他分泌类型的两步法的优点。图71示出了尿路致病性大肠杆菌的α-溶血素(HlyA)。该途径使用HlyB，一种ATP结合盒转运蛋白；HlyD，一种膜融合蛋白；和TolC，一种外膜蛋白。这三种蛋白的组装形成通过内膜和外膜两者的通道。本来，该通道用于分泌HlyA，然而，为了分泌本公开内容的治疗性分子，HlyA的含分泌信号的C末端部分与治疗性分子(星形)的C末端部分融合以介导该分子的分泌。
在替代实施方案中，遗传工程化的细菌还包含非天然跨单膜分泌系统。跨单膜转运蛋白可以充当分泌系统的组件，或者可以独立地输出物质。此类转运蛋白包括，但不限于，ATP结合盒易位酶、鞭毛/毒力相关的易位酶、接合(conjugation)相关的易位酶、一般分泌系统(例如，大肠杆菌中的SecYEG复合物)、分枝杆菌和几种革兰氏阳性细菌(例如，炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、约翰逊氏乳杆菌、谷氨酸棒状杆菌、戈登链球菌(Streptococcus gordonii)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))中的辅助分泌系统和双精氨酸易位(TAT)系统(twin-arginine translocation(TAT)system)(Saier,2006；Rigel和Braunstein,2008；Albiniak等，2013)。已知一般分泌系统和TAT系统均可以将具有可切割的N末端信号肽的物质输出到周质中，并且已在生物制药生产的背景下进行了探索。然而，TAT系统可以提供特别的优点，因为它能够转运折叠的物质，因此消除过早(premature)或不正确折叠的可能性。在某些实施方案中，遗传工程化的细菌包含TAT或TAT样系统并且能够从细菌细胞质分泌抗炎分子和/或消化道屏障增强分子。本领域普通技术人员将理解，本文公开的分泌系统可以被修饰为在细菌的不同物种、菌株和亚型中起作用，和/或适用于递送不同的效应物分子。
必需基因和营养缺陷型
如本文使用的，术语“必需基因”指对细胞生长和/或存活所必需的基因。细菌必需基因是本领域普通技术人员所熟知的，并且可以通过基因的定向缺失和/或随机诱变和筛选来鉴定(参见，例如，Zhang和Lin，2009,DEG 5.0,a database of essential genes inboth prokaryotes and eukaryotes,Nucl.Acids Res.,37:D455-D458和Gerdes等，Essential genes on metabolic maps,Curr.Opin.Biotechnol.,17(5):448-456，其各自的全部内容通过引用明确地并入本文)。
“必需基因”可取决于生物体在其内生活的情形和环境。例如，必需基因的突变、修饰或切除可以导致本公开内容的遗传工程化的细菌变为营养缺陷型。营养缺陷型修饰旨在使细菌在对存活或生长所必需的外源添加营养物质的不存在下死亡，因为它们缺乏产生该必需营养物质所必需的基因。
营养缺陷型修饰旨在使细菌在对存活或生长所必需的外源添加营养物质的不存在下死亡，因为它们缺乏产生该必需营养物质所必需的基因。在一些实施方案中，本文描述的任何遗传工程化的细菌还包含对细胞存活和/或生长所需的基因中的缺失或突变。在一个实施方案中，必需基因为DNA合成基因，例如，thyA。在另一个实施方案中，必需基因为细胞壁合成基因，例如，dapA。在又另一个实施方案中，必需基因为氨基酸基因，例如，serA或MetA。可靶向细胞存活和/或生长所需的任何基因，包括但不限于，cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、thyA、uraA、dapA、dapB、dapD、dapE、dapF、flhD、metB、metC、proAB、和thi1，只要在细菌中不产生相应的野生型基因产物。例如，胸腺嘧啶为细菌细胞生长所需的核酸；在它的不存在下，细菌经历细胞死亡。thyA基因编码胸苷酸(thimidylate)合成酶，一种通过将dUMP转化为dTMP来催化胸腺嘧啶合成中的第一步的酶(Sat等，2003)。在一些实施方案中，本公开内容的细菌细胞为thyA营养缺陷型，其中thyA基因被缺失和/或被不相关基因替代。仅当例如通过在体外向生长培养基中添加胸腺嘧啶而存在足够量的胸腺嘧啶时，或者在体内人类消化道中天然存在的高胸腺嘧啶水平存在下，thyA营养缺陷型才能生长。在一些实施方案中，本公开内容的细菌细胞为在当细菌存在于哺乳动物消化道中时被补充的基因的营养缺陷型。在没有足够量的胸腺嘧啶的情况下，thyA营养缺陷型死亡。在一些实施方案中，营养缺陷型修饰用于确保细菌细胞在营养缺陷型基因产物的不存在下(例如，消化道外)不能存活。
二氨基庚二酸(DAP)为在赖氨酸生物合成途径内合成的氨基酸，并且为细菌细胞壁生长所需的(Meadow等，1959；Clarkson等，1971)。在一些实施方案中，本文描述的任何遗传工程化的细菌为dapD营养缺陷型，其中dapD被缺失和/或被不相关基因替代。仅当例如通过在体外向生长培养基中添加DAP而存在足够量的DAP时，dapD营养缺陷型才能生长。在没有足够量的DAP的情况下，dapD营养缺陷型死亡。在一些实施方案中，营养缺陷型修饰用于确保细菌细胞在营养缺陷型基因产物的不存在下(例如，消化道外)不能存活。
在其他实施方案中，本公开内容的遗传工程化的细菌为uraA营养缺陷型，其中uraA被缺失和/或被不相关基因替代。uraA基因编码UraA，一种促进嘧啶尿嘧啶吸收和随后代谢的膜结合转运蛋白(Andersen等，1995)。仅当例如通过在体外向生长培养基中添加尿嘧啶而存在足够量的尿嘧啶时，uraA营养缺陷型才能生长。在没有足够量的尿嘧啶的情况下，uraA营养缺陷型死亡。在一些实施方案中，营养缺陷型修饰用于确保细菌在营养缺陷型基因产物的不存在下(例如，消化道外)不能存活。
在复杂的群落中，细菌共有DNA是可能的。在非常罕见的情形下，营养缺陷型细菌菌株可以从非营养缺陷型菌株接受DNA，这修复基因组缺失并永久拯救营养缺陷型。因此，将细菌菌株工程化为具有多于一种营养缺陷型可以大大减少DNA转移将发生足够多次来拯救营养缺陷型的可能性。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌包含细胞存活和/或生长所需的两种或更多种基因中的缺失或突变。
必需基因的其他实例包括，但不限于yhbV、yagG、hemB、secD、secF、ribD、ribE、thiL、dxs、ispA、dnaX、adk、hemH、lpxH、cysS、fold、rplT、infC、thrS、nadE、gapA、yeaZ、aspS、argS、pgsA、yefM、metG、folE、yejM、gyrA、nrdA、nrdB、folC、accD、fabB、gltX、ligA、zipA、dapE、dapA、der、hisS、ispG、suhB、tadA、acpS、era、rnc、ftsB、eno、pyrG、chpR、lgt、fbaA、pgk、yqgD、metK、yqgF、plsC、ygiT、pare、ribB、cca、ygjD、tdcF、yraL、yihA、ftsN、murI、murB、birA、secE、nusG、rplJ、rplL、rpoB、rpoC、ubiA、plsB、lexA、dnaB、ssb、alsK、groS、psd、orn、yjeE、rpsR、chpS、ppa、valS、yjgP、yjgQ、dnaC、ribF、lspA、ispH、dapB、folA、imp、yabQ、ftsL、ftsI、murE、murF、mraY、murD、ftsW、murG、murC、ftsQ、ftsA、ftsZ、lpxC、secM、secA、can、folK、hemL、yadR、dapD、map、rpsB、infB,nusA、ftsH、obgE、rpmA、rplU、ispB、murA、yrbB、yrbK、yhbN、rpsI、rplM、degS、mreD、mreC、mreB、accB、accC、yrdC、def、fmt、rplQ、rpoA、rpsD、rpsK、rpsM、entD、mrdB、mrdA、nadD、hlepB、rpoE、pssA、yfiO、rplS、trmD、rpsP、ffh、grpE、yfjB、csrA、ispF、ispD、rplW、rplD、rplC、rpsJ、fusA、rpsG、rpsL、trpS、yrfF、asd、rpoH、ftsX、ftsE、ftsY、frr、dxr、ispU、rfaK、kdtA、coaD、rpmB、dfp、dut、gmk、spot、gyrB、dnaN、dnaA、rpmH、rnpA、yidC、tnaB、glmS、glmU、wzyE、hemD、hemC、yigP、ubiB、ubiD、hemG、secY、rplO、rpmD、rpsE、rplR、rplF、rpsH、rpsN、rplE、rplX、rplN、rpsQ、rpmC、rplP、rpsC、rplV、rpsS、rplB、cdsA、yaeL、yaeT、lpxD、fabZ、lpxA、lpxB、dnaE、accA、tilS、proS、yafF、tsf、pyrH、olA、rlpB、leuS、lnt、glnS、fldA、cydA、infA、cydC、ftsK、lolA、serS、rpsA、msbA、lpxK、kdsB、mukF、mukE、mukB、asnS、fabA、mviN、rne、yceQ、fabD、fabG、acpP、tmk、holB、lolC、lolD、lolE、purB、ymfK、minE、mind、pth、rsA、ispE、lolB、hemA、prfA、prmC、kdsA、topA、ribA、fabI、racR、dicA、ydfB、tyrS、ribC、ydiL、pheT、pheS、yhhQ、bcsB、glyQ、yibJ、和gpsA。其他必需基因是本领域普通技术人员已知的。
在一些实施方案中，本公开内容的遗传工程化的细菌为合成的配体依赖性必需基因(SLiDE)细菌细胞。SLiDE细菌细胞为在一种或更多种必需基因中具有突变的合成的营养缺陷型，其仅在特定配体存在下生长(参见Lopez和Anderson“Synthetic Auxotrophs withLigand-Dependent Essential Genes for a BL21(DE3Biosafety Strain,”ACSSynthetic Biology(2015)DOI:10.1021/acssynbio.5b00085，其全部内容通过引用明确地并入本文)。
在一些实施方案中，SLiDE细菌细胞包含必需基因的突变。在一些实施方案中，必需基因选自由以下组成的组：pheS、dnaN、tyrS、metG、和adk。在一些实施方案中，必需基因为包含一个或更多个以下突变的dnaN：H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I、和S345C。在一些实施方案中，必需基因为包含突变H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I、和S345C的dnaN。在一些实施方案中，必需基因为包含一个或更多个以下突变的pheS：F125G、P183T、P184A、R186A、和I188L。在一些实施方案中，必需基因为包含突变F125G、P183T、P184A、R186A、和I188L的pheS。在一些实施方案中，必需基因为包含一个或更多个以下突变的tyrS：L36V、C38A、和F40G。在一些实施方案中，必需基因为包含突变L36V、C38A、和F40GL的tyrS。在一些实施方案中，必需基因为包含一个或更多个以下突变的metG：E45Q、N47R、I49G、和A51C。在一些实施方案中，必需基因为包含突变E45Q、N47R、I49G、和A51C的metG。在一些实施方案中，必需基因为包含一个或更多个以下突变的adk：I4L、L5I、和L6G。在一些实施方案中，必需基因为包含突变I4L、L5I、和L6G的adk。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌被配体补充。在一些实施方案中，配体选自由以下组成的组：苯并噻唑、吲哚、2-氨基苯并噻唑、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸和L-组氨酸甲酯。例如，包含metG中的突变(E45Q、N47R、I49G和A51C)的细菌细胞被苯并噻唑、吲哚、2-氨基苯并噻唑、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸或L-组氨酸甲酯补充。包含dnaN中的突变(H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I和S345C)的细菌细胞被苯并噻唑、吲哚或2-氨基苯并噻唑补充。包含pheS中的突变(F125G、P183T、P184A、R186A和I188L)的细菌细胞被苯并噻唑或2-氨基苯并噻唑补充。包含tyrS中的突变(L36V、C38A和F40G)的细菌细胞被苯并噻唑或2-氨基苯并噻唑补充。包含adk中的突变(I4L、L5I和L6G)的细菌细胞被苯并噻唑或吲哚补充。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含使其对配体为营养缺陷型的多于一种的突变必需基因。在一些实施方案中，细菌细胞包含两种必需基因中的突变。例如，在一些实施方案中，细菌细胞包含tyrS中的突变(L36V、C38A和F40G)和metG中的突变(E45Q、N47R、I49G和A51C)。在其他实施方案中，细菌细胞包括三种必需基因中的突变。例如，在一些实施方案中，细菌细胞包含tyrS中的突变(L36V、C38A和F40G)、metG中的突变(E45Q、N47R、I49G和A51C)和pheS中的突变(F125G、P183T、P184A、R186A和I188L)。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为其必需基因使用图57-61示出的阿拉伯糖系统替代的条件营养缺陷型。
在一些实施方案中，本公开内容的遗传工程化的细菌为营养缺陷型，并且还包含杀死开关回路，诸如本文描述的杀死开关成分和系统中的任何一种。例如，遗传工程化的细菌可以包含细胞存活和/或生长所需的必需基因中的缺失或突变，所述必需基因例如DNA合成基因例如thyA，细胞壁合成基因例如dapA和/或氨基酸基因例如serA或MetA，并且还可以包含毒素基因，所述毒素基因由响应于环境条件和/或信号(诸如描述的阿拉伯糖系统)表达的一种或更多种转录活化物调节，或所述毒素基因由在感测外源环境条件和/或信号后表达的一种或更多种重组酶(诸如本文描述的重组酶系统)调节。其他实施方案被描述于以下中：Wright等，“GeneGuard:A Modular Plasmid System Designed for Biosafety,”ACSSynthetic Biology(2015)4:307-316，其全部内容通过引用明确地并入本文)。在一些实施方案中，本公开内容的遗传工程化的细菌为营养缺陷型，并且还包含杀死开关回路，诸如本文描述的杀死开关组件和系统中的任何一种、以及另一种生物安全系统，诸如条件性复制起点(conditional origin of replication)(Wright等，2015)。在其他实施方案中，营养缺陷型修饰也可用于筛选产生抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的突变体细菌。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含抗生素抗性基因。
遗传调节回路
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于表达本文描述的构建体的多层遗传调节回路(参见，例如，美国临时申请第62/184,811号，其通过引用以其整体并入本文)。遗传调节回路可用于筛选产生抗炎分子和/或消化道屏障增强分子或拯救营养缺陷型的突变体细菌。在某些实施方案中，本发明提供了用于选择产生感兴趣的一种或更多种基因的遗传工程化的细菌的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了包含用于产生治疗性分子(例如，丁酸)的基因或基因盒和T7聚合酶调节的遗传调节回路的遗传工程化的细菌。例如，遗传工程化的细菌包含编码T7聚合酶的第一基因，其中第一基因被可操作地连接至FNR响应性启动子；用于产生治疗性分子(例如，丁酸)的第二基因或基因盒，其中第二基因或基因盒被可操作地连接至由T7聚合酶诱导的T7启动子；以及编码能够抑制T7聚合酶的抑制因子lysY的第三基因。在氧的存在下，FNR不结合FNR响应性启动子，并且治疗性分子(例如，丁酸)不被表达。LysY被组成型(P-lac组成型)表达，并且进一步抑制T7聚合酶。在氧的不存在下，FNR二聚化并与FNR响应性启动子结合，T7聚合酶以足以克服lysY抑制的水平表达，并且治疗性分子(例如，丁酸)被表达。在一些实施方案中，lysY基因被可操作地连接至另外的FNR结合位点。在氧的不存在下，FNR如以上描述的二聚化以活化T7聚合酶表达，并且还抑制lysY表达。
在一些实施方案中，本发明提供了包含用于产生治疗性分子(例如，丁酸)的基因或基因盒和蛋白酶调节的遗传调节回路的遗传工程化的细菌。例如，遗传工程化的细菌包含编码mf-lon蛋白酶的第一基因，其中第一基因被可操作地连接至FNR响应性启动子；用于产生治疗性分子的第二基因或基因盒，被可操作地连接至Tet调节区域(TetO)；和编码mf-lon降解信号的第三基因，被连接至Tet阻遏物(TetR)，其中TetR能够与Tet调节区域结合并阻遏第二基因或基因盒的表达。mf-lon蛋白酶能够识别mf-lon降解信号并降解TetR。在氧的存在下，FNR不结合FNR响应性启动子，阻遏物不被降解，并且治疗性分子不被表达。在氧的不存在下，FNR二聚化并结合FNR响应性启动子，从而诱导mf-lon蛋白酶的表达。mf-lon蛋白酶识别mf-lon降解信号并降解TetR，且治疗性分子被表达。
在一些实施方案中，本发明提供了包含用于产生治疗性分子的基因或基因盒和阻遏物调节的遗传调节回路的遗传工程化的细菌。例如，遗传工程化的细菌包含编码第一阻遏物的第一基因，其中第一基因被可操作地连接至FNR响应性启动子；用于产生治疗性分子的第二基因或基因盒，被可操作地连接至包含组成型启动子的第一调节区域；和编码第二阻遏物的第三基因，其中第二阻遏物能够与第一调节区域结合并阻遏第二基因或基因盒的表达。第三基因被可操作地连接至包含组成型启动子的第二调节区域，其中第一阻遏物能够与第二调节区域结合并抑制第二阻遏物的表达。在氧的存在下，FNR不结合FNR响应性启动子，第一阻遏物不被表达，第二阻遏物被表达，并且治疗性分子不被表达。在氧的不存在下，FNR二聚化并结合FNR响应性启动子，第一阻遏物被表达，第二阻遏物不被表达，并且治疗性分子被表达。
可用于这些实施方案中的阻遏物的实例包括，但不限于，ArgR、TetR、ArsR、AscG、LacI、CscR、DeoR、DgoR、FruR、GalR、GatR、CI、LexA、RafR、QacR、和PtxS(US20030166191)。
在一些实施方案中，本发明提供了包含用于产生治疗性分子的基因或基因盒和调节性RNA调节的遗传调节回路的遗传工程化的细菌。例如，遗传工程化的细菌包含编码调节性RNA的第一基因和用于产生治疗性分子的第二基因或基因盒，其中第一基因被可操作地连接至FNR响应性启动子。第二基因或基因盒被可操作地连接至组成型启动子，并被进一步连接至能够产生抑制治疗性分子翻译的mRNA发夹的核苷酸序列。调节性RNA能够经由核糖体结合位点消除mRNA发夹并诱导翻译。在氧的存在下，FNR不结合FNR响应性启动子，调节性RNA不被表达，并且mRNA发夹阻止治疗性分子翻译。在氧的不存在下，FNR二聚化并结合FNR响应性启动子，调节性RNA被表达，mRNA发夹被消除，并且治疗性分子被表达。
在一些实施方案中，本发明提供了包含用于产生治疗性分子的基因或基因盒和CRISPR调节的遗传调节回路的遗传工程化的细菌。例如，遗传工程化的细菌包含Cas9蛋白；编码CRISPR指导RNA(CRISPR guide RNA)的第一基因，其中第一基因被可操作地连接至FNR响应性启动子；用于产生治疗性分子的第二基因或基因盒，其中第二基因或基因盒被可操作地连接至包含组成型启动子的调节区域；和被可操作地连接至组成型启动子的编码阻遏物的第三基因，其中该阻遏物能够与调节区域结合并阻遏第二基因或基因盒的表达。第三基因被进一步连接至能够与CRISPR指导RNA结合的CRISPR靶序列，其中与CRISPR指导RNA的所述结合诱导由Cas9蛋白的裂解并抑制阻遏物的表达。在氧的存在下，FNR不结合FNR响应性启动子，指导RNA不被表达，阻遏物被表达，并且治疗性分子不被表达。在氧的不存在下，FNR二聚化并结合FNR响应性启动子，指导RNA被表达，阻遏物不被表达，并且治疗性分子被表达。
在一些实施方案中，本发明提供了包含用于产生治疗性分子的基因或基因盒和重组酶调节的遗传调节回路的遗传工程化的细菌。例如，遗传工程化的细菌包含编码重组酶的第一基因和用于产生治疗性分子的第二基因或基因盒，其中第一基因被可操作地连接至FNR响应性启动子，第二基因或基因盒被可操作地连接至组成型启动子。第二基因或基因盒在取向上反向(3'至5')并且侧翼为重组酶结合位点，并且重组酶能够与重组酶结合位点结合以通过恢复其取向(5'至3')而诱导第二基因或基因盒的表达。在氧的存在下，FNR不结合FNR响应性启动子，重组酶不被表达，基因或基因盒保持在3'至5’取向，并且没有功能性治疗性分子被产生。在氧的不存在下，FNR二聚化并结合FNR响应性启动子，重组酶被表达，基因或基因盒被反向为5'至3’取向，并且功能性治疗性分子被产生。
在一些实施方案中，本发明提供了包含用于产生治疗性分子的基因或基因盒以及聚合酶调节的和重组酶调节的遗传调节回路的遗传工程化的细菌。例如，遗传工程化的细菌包含编码重组酶的第一基因，其中第一基因被可操作地连接至FNR响应性启动子；用于产生治疗性分子的第二基因或基因盒，被可操作地连接至T7启动子；编码T7聚合酶的第三基因，其中T7聚合酶能够与T7启动子结合并诱导治疗性分子的表达。编码T7聚合酶的第三基因在取向上反向(3'至5')并且侧翼为重组酶结合位点，并且重组酶能够与重组酶结合位点结合以通过恢复其取向(5'至3')而诱导T7聚合酶的表达。在氧的存在下，FNR不结合FNR响应性启动子，重组酶不被表达，T7聚合酶基因保持在3'至5’取向，并且治疗性分子不被表达。在氧的不存在下，FNR二聚化并结合FNR响应性启动子，重组酶被表达，T7聚合酶基因被反向为5'至3’取向，并且治疗性分子被表达。
在质粒上表达的合成基因回路可以在短期内良好起作用，但在长期损失能力和/或功能(Danino等，2015)。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于在长时间内表达感兴趣的基因的稳定回路。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生治疗性分子，并且还包含同时产生毒素(hok)和短寿命抗毒素(sok)的毒素-抗毒素系统，其中质粒的损失引起细胞被长寿命(long-lived)的毒素杀死(Danino等，2015)。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含来自枯草芽孢杆菌质粒pL20的alp7，并且产生能够将质粒向细胞极推进的细丝(filaments)，以确保在细胞分裂期间相等的分离(Danino等，2015)。
宿主-质粒相互依赖性
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌还包含已被修饰为产生宿主-质粒相互依赖性的质粒。在某些实施方案中，相互依赖的宿主-质粒平台为GeneGuard(Wright等，2015)。在一些实施方案中，GeneGuard质粒包含(i)条件性复制起点，其中必需的复制引发蛋白以反式提供；(ii)由宿主经由基因组易位拯救并且还与丰富培养基相容的营养缺陷型修饰；和/或(iii)编码广谱毒素的核酸序列。通过使质粒DNA本身对不表达抗毒素的菌株(例如，野生型细菌)不利，毒素基因可以用于选择而防止质粒扩散。在一些实施方案中，GeneGuard质粒在没有抗生素选择的情况下稳定至少100代。在一些实施方案中，GeneGuard质粒不破坏宿主的生长。GeneGuard质粒用于大大降低本发明的遗传工程化的细菌中无意的质粒繁殖。
相互依赖的宿主-质粒平台可以单独使用或与其他生物安全机制诸如本文描述的那些(例如，杀死开关、营养缺陷型)组合使用。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含GeneGuard质粒。在其他实施方案中，遗传工程化的细菌包含GeneGuard质粒和/或一种或更多种杀死开关。在其他实施方案中，遗传工程化的细菌包含GeneGuard质粒和/或一种或更多种营养缺陷型。在又其他实施方案中，遗传工程化的细菌包含GeneGuard质粒、一种或更多种杀死开关和/或一种或更多种营养缺陷型。
在质粒上表达的合成基因回路可以在短期内良好起作用，但在长期损失能力和/或功能(Danino等，2015)。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于在长时间内表达感兴趣的基因的稳定回路。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌能够产生抗炎分子和/或消化道增强分子，并且还包含同时产生毒素(hok)和短寿命抗毒素(sok)的毒素-抗毒素系统，其中质粒的损失引起细胞被长寿命的毒素杀死(Danino等，2015；图66)。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含来自枯草芽孢杆菌质粒pL20的alp7，并且产生能够将质粒向细胞极推进的细丝，以确保在细胞分裂期间相等的分离(Danino等，2015)。
杀死开关
在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌还包含杀死开关(参见，例如，美国临时申请第62/183,935号、第62/263,329号和第62/277,654号，其各自通过引用以其整体并入本文)。杀死开关旨在响应于外部刺激主动杀死工程化的细菌。与营养缺陷型突变不同，在营养缺陷型突变中细菌死亡是因为它们缺乏存活必需的营养物质，杀死开关由环境中诱导微生物内引起细胞死亡的毒性分子产生的特定因素触发。
包含杀死开关的细菌已被设计用于体外研究目的，例如，以限制产生生物燃料的微生物在实验室环境外的扩散。为了体内施用以治疗疾病而工程化的细菌也可被编程为在一种异源基因或更多种异源基因例如抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的表达和递送之后的特定时间死亡，或者在受试者经历了治疗效果之后死亡。例如，在一些实施方案中，杀死开关在抗炎分子和/或消化道屏障增强分子例如GLP-1表达之后的一定时间段之后被活化以杀死细菌。在一些实施方案中，杀死开关在抗炎分子和/或消化道屏障增强分子表达之后以延迟方式被活化。可选地，细菌可以被工程化为在细菌扩散到疾病部位外之后死亡。具体地，杀死开关可以用于以下：防止微生物长期定殖于受试者，防止微生物扩散到受试者内的感兴趣区域外(例如，消化道外)，或防止微生物扩散到受试者外进入环境(例如，通过受试者的粪便扩散到环境中)。可以用于杀死开关中的此类毒素的实例包括，但不限于，细菌素、细胞溶素和通过裂解细胞膜、降解细胞DNA或其他机制引起细胞死亡的其他分子。此类毒素可以单独使用或组合使用。控制其产生的开关可以基于例如转录活化(拨动开关(toggle switch)；参见，例如，Gardner等，2000)、翻译(核糖核酸调节物(riboregulator))或DNA重组(基于重组酶的开关)，并且可以感测环境刺激诸如厌氧或活性氧类。这些开关可以被单环境因素活化，或者可需要以AND、OR、NAND和NOR逻辑配置的数种活化物来诱导细胞死亡。例如，通过四环素、异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和阿拉伯糖来活化AND核糖核酸调节物开关，以诱导细胞溶素的表达，这使细胞膜透化并杀死细胞。IPTG诱导内溶素(endolysin)和穿孔素(holin)mRNA的表达，然后通过添加阿拉伯糖和四环素使内溶素和穿孔素去阻遏。所有三种诱导物必须都存在才能引起细胞死亡。杀死开关的实例是本领域中已知的(Callura等，2010)。
杀死开关可以被设计为使得毒素响应于环境条件或外部信号而产生(例如，细菌响应于外部信号而被杀死)，或者可选地设计为使得在环境条件不再存在或外部信号停止后产生毒素。
因此，在一些实施方案中，本公开内容的遗传工程化的细菌还被编程为在感测到例如在低氧环境中、在ROS的存在下或在RNS的存在下的外源环境信号之后死亡。在一些实施方案中，本公开内容的遗传工程化的细菌包含编码一种或更多种重组酶的一个或更多个基因，所述基因的表达响应于环境条件或信号而被诱导，且引起最终导致杀死细胞的毒素的表达的一个或更多个重组事件。在一些实施方案中，至少一个重组事件为翻转编码细菌毒素的反向异源基因(inverted heterologous gene)，然后所述基因在被第一重组酶翻转之后被组成型表达。在一个实施方案中，细菌毒素的组成型表达杀死遗传工程化的细菌。在这些类型的杀死开关系统中，在工程化的细菌细胞感测到外源环境条件并表达感兴趣的异源基因后，重组细菌细胞不再存活。
在其中本公开内容的遗传工程化的细菌响应于环境条件或信号表达一种或更多种重组酶，引起至少一个重组事件的另一个实施方案中，遗传工程化的细菌还响应于外源环境条件或信号表达编码抗毒素的异源基因。在一个实施方案中，至少一个重组事件为通过第一重组酶翻转编码细菌毒素的反向异源基因。在一个实施方案中，编码细菌毒素的反向异源基因位于第一正向重组酶识别序列和第一反向重组酶识别序列之间。在一个实施方案中，编码细菌毒素的异源基因在其被第一重组酶翻转之后被组成型表达。在一个实施方案中，抗毒素抑制毒素的活性，从而延迟遗传工程化的细菌的死亡。在一个实施方案中，当外源环境条件不再存在时，编码抗毒素的异源基因不再表达，遗传工程化的细菌被细菌毒素杀死。
在另一个实施方案中，至少一个重组事件为通过第一重组酶翻转编码第二重组酶的反向异源基因，随后通过第二重组酶翻转编码细菌毒素的反向异源基因。在一个实施方案中，编码第二重组酶的反向异源基因位于第一正向重组酶识别序列和第一反向重组酶识别序列之间。在一个实施方案中，编码细菌毒素的反向异源基因位于第二正向重组酶识别序列和第二反向重组酶识别序列之间。在一个实施方案中，编码第二重组酶的异源基因在其被第一重组酶翻转之后被组成型表达。在一个实施方案中，编码细菌毒素的异源基因在其被第二重组酶翻转之后被组成型表达。在一个实施方案中，遗传工程化的细菌被细菌毒素杀死。在一个实施方案中，遗传工程化的细菌还响应于外源环境条件表达编码抗毒素的异源基因。在一个实施方案中，当外源环境条件存在时，抗毒素抑制毒素的活性，从而延迟遗传工程化的细菌的死亡。在一个实施方案中，当外源环境条件不再存在时，编码抗毒素的异源基因不再表达，遗传工程化的细菌被细菌毒素杀死。
在一个实施方案中，至少一个重组事件为通过第一重组酶翻转编码第二重组酶的反向异源基因，随后通过第二重组酶翻转编码第三重组酶的反向异源基因，随后通过第三重组酶翻转编码细菌毒素的反向异源基因。
在一个实施方案中，至少一个重组事件为通过第一重组酶翻转编码第一切除酶的反向异源基因。在一个实施方案中，编码第一切除酶的反向异源基因位于第一正向重组酶识别序列和第一反向重组酶识别序列之间。在一个实施方案中，编码第一切除酶的异源基因在其被第一重组酶翻转之后被组成型表达。在一个实施方案中，第一切除酶切除第一必需基因。在一个实施方案中，编程的重组细菌细胞在切除第一必需基因之后为不存活的。
在一个实施方案中，第一重组酶还翻转编码第二切除酶的反向异源基因。在一个实施方案中，编码第二切除酶的反向异源基因位于第二正向重组酶识别序列和第二反向重组酶识别序列之间。在一个实施方案中，编码第二切除酶的异源基因在其被第一重组酶翻转之后被组成型表达。在一个实施方案中，当第一必需基因和第二必需基因均被切除时，遗传工程化的细菌死亡或不再存活。在一个实施方案中，当第一必需基因被切除或第二必需基因被第一重组酶切除时，遗传工程化的细菌死亡或不再存活。
在一个实施方案中，遗传工程化的细菌在至少一个重组事件发生之后死亡。在另一个实施方案中，遗传工程化的细菌在至少一个重组事件发生之后不再存活。
在这些实施方案中的任一个中，重组酶可以是选自由以下组成的组的重组酶：BxbI、PhiC31、TP901、BxbI、PhiC31、TP901、HK022、HP1、R4、Int1、Int2、Int3、Int4、Int5、Int6、Int7、Int8、Int9、Int10、Int11、Int12、Int13、Int14、Int15、Int16、Int17、Int18、Int19、Int20、Int21、Int22、Int23、Int24、Int25、Int26、Int27、Int28、Int29、Int30、Int31、Int32、Int33、和Int34、或其生物学活性片段。
在以上描述的杀死开关回路中，毒素在环境因素或信号的存在下被产生。在杀死开关回路的另一个方面，毒素可以在环境因素的存在下被阻遏(不被产生)，且然后在环境条件或外部信号不再存在后被产生。此类杀死开关被称为基于阻遏的杀死开关，并且表示其中细菌细胞仅在外部因素或信号诸如阿拉伯糖或其他糖的存在下存活的系统。在其中毒素在外部因素或信号的存在下被阻遏(并且在外部信号被去除后被活化)的示例性杀死开关示于图57、60、65中。本公开内容提供了重组细菌细胞，所述重组细菌细胞在感测到外源环境中的阿拉伯糖或其他糖后表达一个或更多个异源基因。在这方面，重组细菌细胞包含编码AraC转录因子的araC基因、以及在araBAD启动子控制下的一个或更多个基因。在阿拉伯糖的不存在下，AraC转录因子采用阻遏在araBAD启动子控制下的基因转录的构象。在阿拉伯糖的存在下，AraC转录因子经历构象变化，这允许AraC转录因子结合并活化araBAD启动子，该araBAD启动子诱导期望的基因，例如TetR的表达，TetR阻遏毒素基因的表达。在该实施方案中，毒素基因在阿拉伯糖或其他糖的存在下被阻遏。在不存在阿拉伯糖的环境中，tetR基因不被活化并且毒素被表达，从而杀死细菌。阿拉伯糖系统也可以用于表达必需基因，其中必需基因仅在阿拉伯糖或其他糖的存在下被表达，并且当阿拉伯糖或其他糖不存在于环境中时，其不被表达。
因此，在其中一个或更多个异源基因在感测到外源环境中的阿拉伯糖后表达的一些实施方案中，该一个或更多个异源基因直接或间接在araBAD启动子(ParaBAD)的控制下。在一些实施方案中，表达的异源基因选自以下的一种或更多种：异源治疗性基因、编码抗毒素的异源基因、编码阻遏物蛋白或多肽例如TetR阻遏物的异源基因、编码在细菌细胞中未发现的必需蛋白的异源基因、和/或编码调节性蛋白或多肽的异源基因。
阿拉伯糖诱导型启动子是本领域已知的，包括Para、ParaB、ParaC、和ParaBAD。在一个实施方案中，阿拉伯糖诱导型启动子来自大肠杆菌。在一些实施方案中，ParaC启动子和ParaBAD启动子作为双向启动子起作用，其中ParaBAD启动子在一个方向上控制异源基因的表达，并且ParaC(非常接近于ParaBAD启动子并且在ParaBAD启动子的相对链上)在另一个方向上控制异源基因表达。在阿拉伯糖的存在下，诱导两个异源基因自两个启动子的转录。然而，在阿拉伯糖的不存在下，不诱导两个异源基因自两个启动子的转录。
在本公开内容的一个示例性实施方案中，本公开内容的遗传工程化的细菌包含具有至少以下序列的杀死开关：被可操作地连接至编码四环素阻遏物蛋白(TetR)的异源基因的ParaBAD启动子、被可操作地连接至编码AraC转录因子的异源基因的ParaC启动子、以及被可操作地连接至由四环素阻遏物蛋白阻遏的启动子(PTetR)的编码细菌毒素的异源基因。在阿拉伯糖的存在下，AraC转录因子活化ParaBAD启动子，这活化TetR蛋白的转录，TetR蛋白继而阻遏毒素的转录。然而，在阿拉伯糖的不存在下，AraC抑制由ParaBAD启动子的转录，并且TetR蛋白不被表达。在这种情况下，异源毒素基因的表达被活化，并且毒素被表达。毒素在重组细菌细胞中形成，且重组细菌细胞被杀死。在一个实施方案中，编码AraC转录因子的araC基因在组成型启动子的控制下，并且因此被组成型表达。
在本公开内容的一个实施方案中，遗传工程化的细菌还包含在组成型启动子控制下的抗毒素。在这种情况下，在阿拉伯糖的存在下，毒素由于TetR蛋白的阻遏不被表达，且抗毒素蛋白在细胞中形成。然而，在阿拉伯糖的不存在下，TetR蛋白不被表达，并且毒素的表达被诱导。毒素开始在重组细菌细胞内形成。在毒素蛋白以与细胞中抗毒素蛋白相等或比其更高的量存在后，重组细菌细胞不再存活，并且重组细菌细胞将被毒素杀死。
在本公开内容的另一个实施方案中，遗传工程化的细菌还包含在ParaBAD启动子控制下的抗毒素。在这种情况下，在阿拉伯糖的存在下，TetR和抗毒素被表达，抗毒素在细胞中形成，且毒素由于被TetR蛋白阻遏不被表达。然而，在阿拉伯糖的不存在下，TetR蛋白和抗毒素两者都不被表达，并且毒素的表达被诱导。毒素开始在重组细菌细胞内形成。在毒素蛋白被表达后，重组细菌细胞不再存活，且重组细菌细胞将被毒素杀死。
在本公开内容的另一个示例性实施方案中，本公开内容的遗传工程化的细菌包含具有至少以下序列的杀死开关：被可操作地连接至编码重组细菌细胞中未发现(和存活所需)的必需多肽的异源基因的ParaBAD启动子、和被可操作地连接至编码AraC转录因子的异源基因的ParaC启动子。在阿拉伯糖的存在下，AraC转录因子活化ParaBAD启动子，这活化编码必需多肽的异源基因的转录，允许重组细菌细胞存活。然而，在阿拉伯糖的不存在下，AraC抑制由ParaBAD启动子的转录，并且存活所需的必需蛋白不被表达。在这种情况下，重组细菌细胞在阿拉伯糖的不存在下死亡。在一些实施方案中，被可操作地连接至编码重组细菌细胞中未发现的必需多肽的异源基因的ParaBAD启动子的序列可以与以上紧接着描述的TetR/毒素杀死开关系统联合存在于细菌细胞中。在一些实施方案中，被可操作地连接至编码重组细菌细胞中未发现的必需多肽的异源基因的ParaBAD启动子的序列可以与以上紧接着描述的TetR/毒素/抗毒素杀死开关系统联合存在于细菌细胞中。
在又其他实施方案中，细菌可以包含质粒稳定系统，所述质粒稳定系统具有产生短寿命抗毒素和长寿命毒素两者的质粒。在该系统中，细菌细胞产生相等量的毒素和抗毒素以中和毒素。然而，如果/当细胞损失质粒时，短寿命抗毒素开始衰变。当抗毒素完全衰变时，细胞因长寿命毒素将其杀死而死亡。
在一些实施方案中，本公开的工程化的细菌还包含编码任何以上描述的杀死开关回路的组件的基因。
在任何以上描述的实施方案中，细菌毒素可以选自由以下组成的组：细胞溶素、Hok、Fst、TisB、LdrD、Kid、SymE、MazF、FlmA、Ibs、XCV2162、dinJ、CcdB、MazF、ParE、YafO、Zeta、hicB、relB、yhaV、yoeB、chpBK、hipA、小菌素B、小菌素B17、小菌素C、小菌素C7-C51、小菌素J25、小菌素ColV、小菌素24、小菌素L、小菌素D93、小菌素L、小菌素E492、小菌素H47、小菌素I47、小菌素M、大肠杆菌素A、大肠杆菌素E1、大肠杆菌素K、大肠杆菌素N、大肠杆菌素U、大肠杆菌素B、大肠杆菌素Ia、大肠杆菌素Ib、大肠杆菌素5、大肠杆菌素10、大肠杆菌素S4、大肠杆菌素Y、大肠杆菌素E2、大肠杆菌素E7、大肠杆菌素E8、大肠杆菌素E9、大肠杆菌素E3、大肠杆菌素E4、大肠杆菌素E6、大肠杆菌素E5、大肠杆菌素D、大肠杆菌素M和阴沟肠道菌素(cloacin)DF13、或其生物学活性片段。
在任何以上描述的实施方案中，抗毒素可以选自由以下组成的组：抗细胞溶素、Sok、RNAII、IstR、RdlD、Kis、SymR、MazE、FlmB、Sib、ptaRNA1、yafQ、CcdA、MazE、ParD、yafN、Epsilon、HicA、relE、prlF、yefM、chpBI、hipB、MccE、MccECTD、MccF、Cai、ImmE1、Cki、Cni、Cui、Cbi、Iia、Imm、Cfi、Im10、Csi、Cyi、Im2、Im7、Im8、Im9、Im3、Im4、ImmE6、阴沟肠道菌素免疫蛋白(Cim)、ImmE5、ImmD和Cmi、或其生物学活性片段。
在一个实施方案中，细菌毒素对遗传工程化的细菌为杀细菌的。在一个实施方案中，细菌毒素对遗传工程化的细菌为抑细菌的。
在一些实施方案中，本文提供的遗传工程化的细菌为营养缺陷型。在一个实施方案中，遗传工程化的细菌为选自以下的营养缺陷型：cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、thyA、uraA、dapA、dapB、dapD、dapE、dapF、flhD、metB、metC、proAB、和thi1营养缺陷型。在一些实施方案中，工程化的细菌具有多于一种营养缺陷型，例如，它们可以是ΔthyA和ΔdapA营养缺陷型。
在一些实施方案中，本文提供的遗传工程化的细菌还包含杀死开关回路，诸如本文提供的任何杀死开关回路。例如，在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含在诱导型启动子控制下的编码一种或更多种重组酶的一个或更多个基因和反向毒素序列。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含编码抗毒素的一个或更多个基因。在一些实施方案中，工程化的细菌还包含在诱导型启动子控制下的编码一种或更多种重组酶的一个或更多个基因和一个或更多个反向切除基因，其中切除基因编码缺失必需基因的酶。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含编码抗毒素的一个或更多个基因。在一些实施方案中，工程化的细菌还包含在具有TetR阻遏物结合位点的启动子控制下的编码毒素的一个或更多个基因和在由阿拉伯糖诱导的诱导型启动子(诸如ParaBAD)控制下的编码TetR的基因。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含编码抗毒素的一个或更多个基因。
在一些实施方案中，遗传工程化的细菌为包含治疗载量(payload)的营养缺陷型，并且还包含杀死开关回路，诸如本文描述的任何杀死开关回路。
在以上描述的遗传工程化的细菌的一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的基因或基因盒存在于细菌中的质粒上并且被可操作地连接至在质粒上的诱导型启动子。在其他实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的基因或基因盒存在于细菌染色体中并且被可操作地连接至在染色体中的诱导型启动子。
诱变
在一些实施方案中，诱导型启动子被可操作地连接至可检测的产物，例如，GFP，并且可以用于筛选突变体。在一些实施方案中，诱导型启动子被诱变，并且突变体基于可检测产物的水平，例如当可检测产物发荧光时通过流式细胞术荧光活化细胞分选(FACS)来选择。在一些实施方案中，一个或更多个转录因子结合位点被诱变以增加或减少结合。在替代实施方案中，野生型结合位点保持完整，并且调节区域的剩余部分经历诱变。在一些实施方案中，将突变的启动子插入到本发明的遗传工程化的细菌中以在相同条件下与相同亚型的未突变细菌相比在诱导条件下增加抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的表达。在一些实施方案中，诱导型启动子和/或相应的转录因子为合成的、非天然存在的序列。
在一些实施方案中，编码抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的基因被突变以在相同条件下与相同亚型的未突变细菌相比在诱导条件下增加所述分子的表达和/或稳定性。在一些实施方案中，用于产生抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的基因盒中的一个或更多个基因被突变以在相同条件下与相同亚型的未突变细菌相比在诱导条件下增加所述分子的表达。
药物组合物和制剂
包含本文描述的遗传工程化的细菌的药物组合物可以用于抑制消化道中的炎症机制、恢复和收紧消化道粘膜屏障功能、和/或治疗或预防自身免疫性紊乱。提供了药物组合物，所述药物组合物包含单独或与预防剂、治疗剂和/或药学上可接受的载体组合的一种或更多种遗传工程化的细菌。在某些实施方案中，药物组合物包含被工程化为包含本文描述的遗传修饰例如以产生抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的细菌的一种物种、菌株或亚型。在替代实施方案中，药物组合物包含各自被工程化为包含本文描述的遗传修饰例如以产生抗炎分子和/或消化道屏障增强分子的细菌的两种或更多种物种、菌株和/或亚型。
本文描述的药物组合物可以使用一种或更多种生理学上可接受的载体(包括赋形剂和辅剂)以常规方式来配制，该载体有利于将活性成分加工为用于药物使用的组合物。配制药物组合物的方法是本领域已知的(参见，例如，“Remington's PharmaceuticalSciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA)。在一些实施方案中，将药物组合物经历压片、冻干、直接压制、常规混合、溶解、制粒、研磨、乳化、包封、包埋或喷雾干燥以形成片剂、粒剂、纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊、微片剂、小药丸(pellets)、或粉末，其可以是肠溶包衣或未包衣的。适当的制剂取决于施用途径。
本文描述的遗传工程化的细菌可以被配制为以任何合适的剂型(例如，用于口服施用的液体、胶囊、小药囊(sachet)、硬胶囊、软胶囊、片剂、肠溶包衣片剂、悬浮粉末、粒剂或基质持续释放制剂)和任何合适类型的施用(例如，口服、局部、可注射、立即释放、脉冲释放、延迟释放或持续释放)的药物组合物。遗传工程化的细菌的合适剂量量可以范围为从约105个至1012个细菌，例如，约105个细菌、约106个细菌、约107个细菌、约108个细菌、约109个细菌、约1010个细菌、约1011个细菌、或约1011个细菌。组合物可以每天、每周或每月一次或更多次被施用。组合物可以在用餐之前、期间或之后被施用。在一个实施方案中，药物组合物在受试者进餐之前被施用。在一个实施方案中，药物组合物与用餐同时被施用。在一个实施方案中，药物组合物在受试者进餐之后被施用。
遗传工程化的细菌可以被配制为包含一种或更多种药学上可接受的载体、增稠剂、稀释剂、缓冲液、缓冲剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、脂质体、渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或剂的药物组合物。例如，药物组合物可以包括添加，但不限于，碳酸氢钙、碳酸氢钠、磷酸钙、多种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和表面活性剂，包括例如聚山梨醇酯20。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌可以被配制于碳酸氢钠溶液，例如，1M碳酸氢钠溶中(例如，以缓冲酸性细胞环境，诸如胃环境)。遗传工程化的细菌可以作为中性或盐形式被施用和配制。药学上可接受的盐包括由阴离子形成的盐，诸如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由阳离子形成的那些，诸如来源于钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
本文公开的遗传工程化的细菌可以被局部施用并且被配制为呈软膏、乳膏、经皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳状液的形式或本领域技术人员熟知的其他形式。参见，例如，“Remington's Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA。在一个实施方案中，对于不可喷雾的局部剂型，采用包含与局部应用相容并且具有大于水的动态粘度的载体或一种或更多种赋形剂的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括，但不限于，可以与用于影响多种特性例如渗透压的辅剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲液或盐)一起灭菌或混合的溶液、悬浮液、乳状液、乳膏、软膏剂、粉末、搽剂(liniments)、油膏(salves)等。其他合适的局部剂型包括可喷雾气雾剂制剂，其中活性成分与固体或液体惰性载体组合，被包装于具有加压的挥发物(例如，气态推进剂诸如氟利昂)的混合物或挤压瓶中。保湿剂或湿润剂也可被添加至药物组合物和剂型中。此类另外的成分的实例是本领域熟知的。在一个实施方案中，包含本发明的重组细菌的药物组合物可以被配制为卫生产品。例如，卫生产品可以是抗细菌制剂、或发酵产品诸如发酵液。卫生产品可以是，例如，洗发剂、调理剂(conditioner)、乳膏、糊剂、洗剂和唇膏。
本文公开的遗传工程化的细菌可以被口服施用并且被配制为片剂、丸剂、糖衣丸(dragees)、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂(syrup)、浆体、悬浮液等。用于口服使用的药物组合物可以使用固体赋形剂制造，任选地研磨所得的混合物，和(如果需要)在添加合适的辅剂之后，加工颗粒的混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。适合的赋形剂包括，但不限于，填充剂诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素组合物诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙二醇(PEG)。还可以添加崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐诸如藻酸钠。
片剂或胶囊可以用药学上可接受的赋形剂通过常规方法一起制备，所述药学上可接受的赋形剂诸如结合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、树胶、高岭土和黄蓍胶)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，钙、铝、锌、硬脂酸、聚乙二醇、月桂基硫酸钠、淀粉、苯甲酸钠、L-亮氨酸、硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，淀粉、马铃薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、糖类、纤维素衍生物、二氧化硅粉末)；或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。片剂可通过本领域熟知的方法包衣。可存在包衣壳，且常见的膜包括，但不限于，聚丙交酯、聚乙醇酸、聚酸酐、其他可生物降解聚合物、藻酸盐-聚赖氨酸-藻酸盐(alginate-polylysine-alginate)(APA)、藻酸盐-聚亚甲基-共-胍-藻酸盐(A-PMCG-A)、羟基甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯(hydroxymethyl acrylate-methyl methacrylate)(HEMA-MMA)、多层HEMA-MMA-MAA、聚丙烯腈氯乙烯(polyacrylonitrilevinylchloride)(PAN-PVC)、丙烯腈/甲代烯丙基磺酸钠(acrylonitrile/sodium methallylsulfonate)(AN-69)、聚乙二醇/聚五甲基环五硅氧烷/聚二甲基硅氧烷(PEG/PD5/PDMS)、聚N,N-二甲基丙烯酰胺(PDMAAm)、硅质包封物、硫酸纤维素/藻酸钠/聚亚甲基-共-胍(CS/A/PMCG)、邻苯二甲酸乙酸纤维素、藻酸钙、k-卡拉胶-槐豆胶凝胶珠、结冷胶(gellan)-黄原胶珠、聚(丙交酯-共-乙交酯)、卡拉胶、淀粉聚酸酐、淀粉聚甲基丙烯酸酯、聚氨基酸和肠溶包衣聚合物。
在一些实施方案中，将遗传工程化的细菌肠溶包衣以释放到消化道或消化道的特定区域，例如，大肠。从胃至结肠的典型pH曲线是约1-4(胃)、5.5-6(十二指肠)、7.3-8.0(回肠)和5.5-6.5(结肠)。在一些疾病中，pH曲线可以被修改。在一些实施方案中，包衣在特定pH环境中降解以指定释放部位。在一些实施方案中，使用至少两种包衣。在一些实施方案中，外部包衣和内部包衣在不同的pH水平降解。
用于口服施用的液体制剂可以采用溶液、糖浆剂、悬浮液或在使用之前用水或其他合适的媒介物构成的干燥产品的形式。此类液体制剂可以用药学上可接受的剂通过常规方法一起制备：所述药学上可接受的剂诸如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆剂、纤维素衍生物或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分级的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制剂还可以适当地包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服施用的制剂可以适当地被配制用于本文描述的遗传工程化的细菌的缓慢释放、控制释放或持续释放。
在一个实施方案中，本公开内容的遗传工程化的细菌可以被配制为适于施用至儿童受试者的组合物。如本领域熟知的，儿童在许多方面与成人不同，包括不同的胃排空率、pH值、胃肠通透性等(Ivanovska等，Pediatrics,134(2):361-372,2014)。此外，儿童制剂的可接受性和偏好，诸如施用途径和味道属性，对于达到可接受的儿童依从性至关重要。因此，在一个实施方案中，适于施用至儿童受试者的组合物可以包括易吞咽或可溶性剂型或更可口的组合物，诸如具有添加的调味剂(flavor)、甜味剂或味道阻滞剂的组合物。在一个实施方案中，适于施用至儿童受试者的组合物也可以适于施用至成人。
在一个实施方案中，适于施用至儿童受试者的组合物可以包括溶液、糖浆、悬浮液、酏剂、用于重构为悬浮液或溶液的粉末、可分散片/泡腾片、咀嚼片、胶糖(gummycandy)、棒糖、冰棒(freezer pop)、锭剂、口香糖、口服薄带、口腔崩解片、小药囊、软明胶胶囊、撒布口服粉末或粒剂。在一个实施方案中，组合物为胶糖，其由明胶基质制成，赋予糖果弹性、期望的耐嚼稠度和更长的货架期。在一些实施方案中，胶糖还可以包含甜味剂或调味剂。
在一个实施方案中，适于施用至儿童受试者的组合物可以包含调味剂。如本文使用的，“调味剂”是为制剂提供不同的味道和香气的物质(液体或固体)。调味剂也有助于改善制剂的适口性。调味剂包括，但不限于，草莓、香草、柠檬、葡萄、泡泡糖和樱桃。
在某些实施方案中，遗传工程化的细菌可以例如与惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起口服施用。化合物也可以被封闭在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制为片剂，或直接掺入到受试者的饮食中。对于口服治疗施用，化合物可以与赋形剂混合并以可摄入片剂、含服片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄饼(wafers)等形式使用。为了通过除了肠胃外施用以外的方式施用化合物，可能需要将化合物用材料包衣或将化合物与材料共同施用，以防止其失活。
在另一个实施方案中，包含本发明的重组细菌的药物组合物可以是可食的产品(comestible product)，例如，食物产品。在一个实施方案中，食物产品为乳、浓缩乳、发酵乳(酸乳酪(yogurt)、酸乳(sour milk)、冷冻酸乳酪、乳酸菌发酵饮料(lactic acidbacteria-fermented beverages))、乳粉、冰淇淋、奶油奶酪(cream cheeses)、干奶酪、豆乳、发酵豆乳、蔬菜果汁、果汁、运动饮料、糖果糕点(confectionery)、糖果(candies)、婴儿食物(诸如婴儿蛋糕)、营养食品产品，动物饲料或膳食补充剂。在一个实施方案中，食物产品为发酵食品，诸如发酵乳制品。在一个实施方案中，发酵乳制品为酸乳酪。在另一个实施方案中，发酵乳制品为奶酪、乳、奶油、冰淇淋、乳昔(milk shake)或克非尔(kefir)。在另一个实施方案中，将本发明的重组细菌组合在包含旨在用作益生菌的其他活细菌细胞的制剂中。在另一个实施方案中，食物产品为饮料。在一个实施方案中，饮料为基于果汁的饮料或包含植物或草药(herbal)提取物的饮料。在另一个实施方案中，食物产品为果冻或布丁。适于施用本发明的重组细菌的其他食物产品是本领域熟知的。例如，参见，U.S.2015/0359894和US 2015/0238545，其各自的全部内容通过引用明确地并入本文。在又另一个实施方案中，将本发明的药物组合物注射到、喷洒到或撒于食物产品，诸如面包、酸乳酪或奶酪上。
在一些实施方案中，组合物被配制为经由纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊或微片剂(其被肠溶包衣或未包衣)用于肠内施用、空肠内施用、十二指肠内施用、回肠内施用、胃分流施用或结肠内施用。药物组合物也可以使用例如常规栓剂基质诸如可可脂或其他甘油酯被配制为直肠组合物诸如栓剂或保留灌肠剂。组合物可以是在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳状液，并且可以包含悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
本文描述的遗传工程化的细菌可以被鼻内施用，被配制为气雾剂形式、喷雾剂、雾或液滴形式，并且以从加压包装或喷雾器呈现的气雾剂喷雾的形式借助于合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)方便地递送。加压气雾剂剂量单位可以通过提供阀确定以递送计量的量。可以配制用于在吸入器或吹入器(insufflator)中使用的(例如，明胶的)胶囊和药筒，该胶囊和药筒包含化合物和合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
遗传工程化的细菌可以作为贮库制剂被施用和配制。此类长效制剂可以通过植入或通过注射来施用，包括静脉内注射、皮下注射、局部注射、直接注射或输注。例如，可以用合适的聚合的或疏水的材料(例如，作为可接受的油中的乳状液)或离子交换树脂配制组合物，或将其配制为微溶的衍生物(例如，作为微溶的盐)。
在一些实施方案中，本文公开了呈单一剂型的药学上可接受的组合物。单一剂型可以呈液体或固体形式。单一剂型可以被直接施用至患者而不经修改，或者可以在施用之前被稀释或重构。在某些实施方案中，单一剂型可以以推注(bolus)形式被施用，例如单次注射、单次口服剂量，包括包含多个片剂、胶囊、丸剂等的口服剂量。在替代实施方案中，单一剂型可以例如通过输注在一定时间段内被施用。
药物组合物的单一剂型可以通过以下来制备：将药物组合物分配为较小的等分试样、分配到单剂量容器、分配为单剂量液体形式或单剂量固体形式，诸如片剂、粒剂、纳米颗粒、纳米胶囊、微胶囊、微片剂、小药丸或粉末，其可以是肠溶包衣或未包衣的。呈固体形式的单一剂量可以在施用至患者之前通过添加液体(通常是无菌水或盐水溶液)来重构。
在其他实施方案中，组合物可以在受控制释放或持续释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵来实现受控制或持续释放。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料来实现本公开内容的疗法的受控制或持续释放(参见，例如，美国专利第5,989,463号)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括，但不限于，聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。用于持续释放制剂中的聚合物可以是惰性的，不含可浸出(leachable)的杂质，在储存时是稳定的、无菌的和可生物降解的。在一些实施方案中，控制释放或持续释放系统可以被置于预防或治疗靶附近，因此仅需要全身剂量的一部分。可使用本领域技术人员已知的任何合适的技术。
可以调整剂量方案以提供治疗响应。剂量可以取决于几个因素，包括疾病的严重程度和响应性、施用途径、治疗时程(几天至几个月至几年)、以及到改善疾病的时间。例如，可以在一次施用单次推注，可以在预定时间段内施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况所指示的降低或增加剂量。剂量的规格由活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果决定。剂量值可以随着待缓解的状况的类型和严重程度而变化。对于任何特定的受试者，可以根据个体需要和治疗临床医师的专业判断随时间调整具体的剂量方案。本文提供的化合物的毒性和治疗功效可以通过标准药物程序在细胞培养或动物模型中来确定。例如，可以确定LD50、ED50、EC50和IC50，并且可以计算毒性和治疗效果之间的剂量比值(LD50/ED50)作为治疗指数。可以使用表现出毒性副作用的组合物，其中仔细修改以使潜在的损伤最小化以降低副作用。剂量最初可以从细胞培养测定和动物模型估计。从体外和体内测定和动物研究获得的数据可用于配制在人类中使用的剂量范围。
各成分单独供应或以单位剂型混合在一起供应，例如作为在指示活性剂的量的气密密封容器诸如安瓿或小药囊中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。如果施用的方式为通过注射，可以提供具有无菌注射用水或盐水的安瓿，以便可以在施用之前混合各成分。
药物组合物可以被包装于指示剂的量的气密密封容器，诸如安瓿或小药囊中。在一个实施方案中，一种或更多种药物组合物作为在气密密封的容器中的干燥灭菌的冻干粉末或无水浓缩物供应，并且可以被重构(例如，用水或盐水)为适当的浓度以用于施用至受试者。在一个实施方案中，一种或更多种预防或治疗剂或药物组合物作为在储存于2℃和8℃之间的气密密封容器中的干燥的无菌冻干粉末供应，并在被重构之后1小时内、3小时内、5小时内、6小时内、12小时内、24小时内、48小时内、72小时内、或1周内施用。冻干剂型可以包括冷冻保护剂，主要是0％-10％的蔗糖(最佳为0.5％-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。其他合适的膨松剂(bulking agent)包括甘氨酸和精氨酸(其任一种可以以0％-0.05％的浓度被包含)及聚山梨醇酯-80(最佳地以0.005％-0.01％的浓度被包含)。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。药物组合物可以被制备为可注射溶液，并且还可以包含可用作佐剂的剂，诸如用于增加吸收或分散的那些，例如，透明质酸酶。
治疗方法
本发明的另一个方面提供了治疗自身免疫性紊乱、腹泻疾病、IBD、相关疾病以及受益于降低的消化道炎症和/或增强的消化道屏障功能的其他疾病的方法。在一些实施方案中，本发明提供了本文描述细菌的至少一种遗传工程化的物种、菌株或亚型用于制备药物的用途。在一些实施方案中，本发明提供了本文描述的细菌的至少一种遗传工程化的物种、菌株或亚型用于制备用于治疗自身免疫性紊乱、腹泻疾病、IBD、相关疾病以及受益于降低的消化道炎症和/或增强的消化道屏障功能的其他疾病的药物的用途。在一些实施方案中，本发明提供了本文描述的细菌的至少一种遗传工程化的物种、菌株或亚型用于在治疗自身免疫性紊乱、腹泻疾病、IBD、相关疾病以及受益于降低的消化道炎症和/或增强的消化道屏障功能的其他疾病中使用。
在一些实施方案中，腹泻疾病选自由以下组成的组：急性水样腹泻例如霍乱，急性血性腹泻例如痢疾，和持续性腹泻。在一些实施方案中，IBD或相关疾病选自由以下组成的组：克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、转移性结肠炎、白塞氏疾病、未定型结肠炎、短肠综合征、溃疡性直肠炎、直肠乙状结肠炎、左侧结肠炎、全肠炎和暴发性结肠炎。在一些实施方案中，疾病或状况为选自由以下组成的组的自身免疫性紊乱：急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性脑炎、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经异常、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突&神经元神经病变、巴洛疾病、白塞氏综合征、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯特尔曼病、乳糜泻、南美洲锥虫病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多发性骨髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜性类天疱疮、克罗恩病、耳蜗前庭综合征、冷凝集素疾病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST疾病、特发性混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病变、疱疹样皮炎、皮肌炎、Devic氏病(Devic’s disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、Dressler综合征、子宫内膜异位、嗜酸粒细胞性食管炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎、结节性红斑、实验性变态反应性脑脊髓炎、伊文思综合征、纤维性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、肺出血-肾炎综合征、肉芽肿性多血管炎(GPA)、格雷夫斯病、吉兰巴雷综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关性硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白、包含体肌炎、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型特发性关节炎、幼年型肌炎、川崎综合征、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破裂性脉管炎、扁平苔藓、硬化苔藓、木样结膜炎、线性IgA疾病(LAD)、狼疮(系统性红斑狼疮)、慢性莱姆病、梅尼埃病、微血管性多血管炎、混合性结缔组织病(MCTD)、蚕蚀性角膜炎(Mooren’s ulcer)、Mucha-Habermann疾病、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(Devic’s)、中性粒细胞减少、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的儿童自身免疫性神经精神紊乱((Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated withStreptococcus))、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、扁平部睫状体炎(外周葡萄膜炎)、天疱疮、外周神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型&III型自身免疫性多内分泌腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、莱特尔综合征、复发性多软骨炎、下肢不宁综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、精子&睾丸自身免疫、僵硬人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、交感性眼炎、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、哮喘、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱皮肤病、白癜风和韦氏肉芽肿病。在一些实施方案中，本发明提供了用于降低、改善或消除与这些疾病相关的一种或更多种症状的方法，这些症状包括但不限于腹泻、血便、口疮、肛周疾病、腹痛、腹部痉挛、发热、疲劳、体重减轻、缺铁、贫血、食欲不振、体重减轻、厌食、延迟生长、青春期延迟发育以及皮肤的炎症、眼睛的炎症、关节的炎症、肝脏的炎症和胆管的炎症。在一些实施方案中，本发明提供了用于降低消化道炎症和/或增强消化道屏障功能，从而改善或预防全身性自身免疫性紊乱，例如，哮喘的方法(Arrieta等，2015)。
该方法可以包括用本文描述的细菌的至少一种遗传工程化的物种、菌株或亚型制备药物组合物，并将该药物组合物以治疗有效量施用至受试者。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌以液体悬浮液口服施用。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌在凝胶帽中冻干并口服施用。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌经由饲管(feeding tube)施用。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌通过直肠施用，例如通过灌肠施用。在一些实施方案中，本发明的遗传工程化的细菌局部、肠内、空肠内、十二指肠内、回肠内和/或结肠内施用。
在某些实施方案中，施用本文描述的药物组合物以在受试者中降低消化道炎症、增强消化道屏障功能、和/或治疗或预防自身免疫性紊乱。在一些实施方案中，本公开内容的方法可以将受试者中的消化道炎症与未治疗或对照受试者中的水平相比降低了至少约10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，本公开内容的方法可以将受试者中的消化道屏障功能与未治疗或对照受试者中的水平相比增强了至少约10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，通过比较在施用药物组合物之前和之后的受试者来测量炎症和/或消化道屏障功能的变化。在一些实施方案中，治疗或改善自身免疫性紊乱和/或与消化道炎症和/或受损的消化道屏障功能相关的疾病或状况的方法允许疾病或状况的一种或更多种症状改善了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。
在药物组合物施用之前、期间和之后，可以在以下中测量受试者中的消化道炎症和/或消化道屏障功能：生物学样品，诸如血液、血清、血浆、尿液、粪便物、腹膜液、肠粘膜刮屑，从组织收集的样品和/或从以下一个或更多个的内含物收集的样品：胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠和肛管。在一些实施方案中，该方法可以包括施用本发明的组合物，以在受试者中增强消化道屏障功能和/或降低消化道炎症至基线水平，例如与健康对照的那些相当的水平。在一些实施方案中，该方法可以包括施用本发明的组合物以将受试者中的消化道炎症降低至不可检测的水平，或少于治疗之前受试者中的水平的约1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％或80％。在一些实施方案中，该方法可以包括施用本发明的组合物以将受试者中的消化道屏障功能增加了治疗之前受试者中的水平的约1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％或更多。
在某些实施方案中，遗传工程化的细菌为大肠杆菌Nissle。遗传工程化的细菌可以在施用之后几小时或几天内被破坏，例如被消化道或血清中的防御因子(Sonnenborn等，2009)，或者通过活化杀死开关。因此，包含遗传工程化的细菌的药物组合物可以以治疗有效剂量和频率被再施用。在替代实施方案中，遗传工程化的细菌在施用之后数小时或数天内不被破坏，并且可以在消化道繁殖并定殖。
药物组合物可以单独施用或与一种或更多种另外的治疗剂，例如，皮质类固醇、氨基水杨酸盐、抗炎剂组合施用。在一些实施方案中，药物组合物与以下联合施用：抗炎药物(例如，美沙拉秦(mesalazine)、泼尼松龙(prednisolone)、甲基强的松龙(methylprednisolone)、布地奈德)、免疫抑制药物(例如，咪唑硫嘌呤(azathioprine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、环孢菌素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus))、抗生素(例如，甲硝唑(metronidazole)、奥硝唑(ornidazole)、克拉霉素(clarithromycin)、利福昔明(rifaximin)、环丙沙星、抗TB)、其他益生菌和/或生物剂(例如，英夫利昔(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumabpegol))(Triantafillidis等、2011)。在选择一种或更多种另外的治疗剂中的重要考虑因素为，该剂应该与本发明的遗传工程化的细菌相容，例如，该剂必须不杀死细菌。可以基于紊乱的症状严重程度和进展来选择药物组合物的剂量和施用频率。治疗临床医生可以选择适当的治疗有效剂量和/或施用频率。
体内治疗
本发明的遗传工程化的细菌可以在体内例如在动物模型中进行评价。可以使用与消化道炎症、受损的消化道屏障功能相关的疾病或状况和/或自身免疫性紊乱的任何合适的动物模型(参见，例如，Mizoguchi,2012)。动物模型可以是IBD小鼠模型，例如，CD45RBHi T细胞转移模型或葡聚糖硫酸钠(DSS)模型。动物模型可以是1型糖尿病(T1D)小鼠模型，并且T1D可以通过用链脲菌素(streptozotocin)处理来诱导。
结肠炎的特征在于结肠内衬炎症，并且为IBD的一种形式。在小鼠中，建模结肠炎通常牵涉T细胞和/或细胞因子的异常表达。一个示例性IBD小鼠模型可以通过以下来产生，根据CD4+ T细胞的CD45RB表达水平分选CD4+ T细胞，并且将来自正常供体小鼠的具有高CD45RB表达的CD4+ T细胞过继转移到免疫缺陷小鼠中。可以用于转移的免疫缺陷小鼠的非限制性实例包括严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠(Morrissey等，1993；Powrie等，1993)和重组活化基因2(RAG2)缺陷小鼠(Corazza等，1999)。将CD45RBHi细胞例如，经由静脉内或腹膜内注射转移到免疫缺陷小鼠中，导致上皮细胞增生、组织损伤和结肠内严重的单核细胞浸润(Byrne等，2005；Dohi等，2004；Wei等，2005)。在一些实施方案中，可以在CD45RBHi T细胞转移IBD小鼠模型中评价本发明的遗传工程化的细菌。
另一个示例性IBD动物模型可以通过用葡聚糖硫酸钠(DSS)补充小鼠的饮用水来产生(Martinez等，2006；Okayasu等，1990；Whittem等，2010)。用DSS的处理导致上皮损伤，且结肠中的稳健炎症持续数日。单次处理可以用于建模急性损伤，或者急性损伤随后修复。急性处理的小鼠显示急性结肠炎的征象，包括血便、直肠出血、腹泻和体重减轻(Okayasu等，1990)。相比之下，DSS的重复施用周期可以用于建模慢性炎性疾病。发展为慢性结肠炎的小鼠表现出结肠粘膜再生的征象，诸如发育异常、淋巴滤泡形成和大肠缩短(Okayasu等，1990)。在一些实施方案中，可以在IBD的DSS小鼠模型中评价本发明的遗传工程化的细菌。
在一些实施方案中，将本发明的遗传工程化的细菌例如，通过口服管饲施用至动物，并且治疗功效例如，通过内窥镜检查、结肠半透明度、纤维蛋白附着、粘膜和血管病理学和/或粪便特征来确定。在一些实施方案中，将动物处死，并且将组织样品收集和分析(例如，结肠切片被固定并进行炎症和溃疡评分)，和/或均质化并分析髓过氧化物酶活性和细胞因子水平(例如，IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-10)。
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实施例
以下实施例提供了本公开内容的说明性实施方案。本领域普通技术人员将认识到可以在不改变本公开内容的精神或范围的情况下进行许多修改和变化。此类修改和变化被涵盖在本公开内容的范围内。这些实施例不以任何方式限制本公开内容。
实施例
以下实施例提供了本公开内容的说明性实施方案。本领域普通技术人员将认识到可以在不改变本公开内容的精神或范围的情况下进行许多修改和变化。此类修改和变化被涵盖在本公开内容的范围内。这些实施例不以任何方式限制本公开内容。
实施例1.构建用于产生治疗性分子的载体
丁酸
为了促进大肠杆菌Nissle中丁酸的诱导性产生，将来自Peptoclostridiumdifficile630的丁酸产生途径的8个基因(bcd2、etfB3、etfA3、thiA1、hbd、crt2、pbt、和buk；NCBI；表4)以及转录和翻译元件合成(Gen9,Cambridge,MA)并克隆到载体pBR322中。在一些实施方案中，将丁酸基因盒置于FNR调节区域的控制下，该FNR调节区域选自SEQ IDNO：55-66(表9)。在某些构建体中，FNR响应性启动子被进一步融合至强核糖体结合位点序列。为了有效翻译丁酸基因，操纵子中的每一个合成基因被来源于T7启动子/翻译起始位点的15个碱基对核糖体结合位点分开。在某些构建体中，将丁酸基因盒置于RNS响应性调节区域(例如，norB)的控制下，并且细菌还包含编码相应的RNS响应性转录因子(例如，nsrR)的基因(参见，例如，表10和11)。在某些构建体中，将丁酸基因盒置于ROS响应性调节区域(例如，oxyS)的控制下，并且细菌还包含编码相应的ROS响应性转录因子(例如，oxyR)的基因(参见，例如，表14-17)。在某些构建体中，将丁酸基因盒置于四环素诱导型或组成型启动子的控制下。
bcd2-etfA3-etfB3基因的基因产物形成将巴豆酰-CoA转化为丁酰-CoA并且可以对氧表现出依赖性而作为辅助氧化剂的复合物。由于本发明的重组细菌被设计为在氧限制性环境(例如，哺乳动物消化道)中产生丁酸，该对氧的依赖性可能对消化道中的丁酸产生具有负面影响。已经表明，来自齿垢密螺旋体的编码反式-2-烯酰-CoA还原酶的单个基因(ter，表4)可以以不依赖于氧的方式功能上替代该三基因复合物。因此，合成其中ter基因替代第一丁酸盒的bcd2-etfA3-etfB3基因的第二丁酸基因盒(Genewiz,Cambridge,MA)。对于大肠杆菌密码子使用(coden usage)，使用整合DNA技术在线密码子优化工具(https://www.idtdna.com/CodonOpt)对ter基因进行密码子优化。将第二丁酸基因盒以及转录和翻译元件合成(Gen9,Cambridge,MA)并克隆到载体pBR322中。在某些构建体中，将第二丁酸基因盒置于如以上描述的FNR调节区域的控制下(表4)。在某些构建体中，将丁酸基因盒置于RNS响应性调节区域(例如，norB)的控制下，并且细菌还包含编码相应的RNS响应性转录因子(例如，nsrR)的基因(参见，例如，表10和11)。在某些构建体中，将丁酸基因盒置于ROS响应性调节区域(例如，oxyS)的控制下，并且细菌还包含编码相应的ROS响应性转录因子(例如，oxyR)的基因(参见，例如，表14-17)。在某些构建体中，将丁酸基因盒置于四环素诱导型或组成型启动子的控制下。
在第三丁酸基因盒中，pbt和buk基因被替代为tesB(SEQ ID NO:10)。TesB为在大肠杆菌中发现的硫酯酶，其从丁酰-coA裂解丁酸，因此避免了对pbt-buk的需要(参见图2)。
在一个实施方案中，将tesB置于FNR调节区域的控制下，该FNR调节区域选自SEQID NO:55-66(表9)。在一个替代实施方案中，将tesB置于RNS响应性调节区域(例如，norB)的控制下，并且细菌还包含编码相应的RNS响应性转录因子(例如，nsrR)的基因(参见，例如，表10和11)。在又另一个实施方案中，将tesB置于ROS响应性调节区域(例如，oxyS)的控制下，并且细菌还包含编码相应的ROS响应性转录因子(例如，oxyR)的基因(参见，例如，表14-17)。在某些构建体中，将不同描述的丁酸基因盒各自置于四环素诱导型或组成型启动子的控制下。例如，遗传工程化的Nissle被产生，所述遗传工程化的Nissle包含其中pbt和buk基因被替代为tesB(SEQ ID NO:10)、在一氧化氮响应性调节区域控制下表达的丁酸基因盒(SEQ ID NO:80)。SEQ ID NO:80包含来自淋病奈瑟氏菌的nsrR阻遏物基因的反向互补序列(加下划线的)、包含控制nsrR和产丁酸基因盒的趋异启动子及其各自的RBS的基因间区域(粗体)以及被RBS分开的丁酸基因(ter-thiA1-hbd-crt2-tesB)。
丁酸、IL-10、IL-22、GLP-2
在某些构建体中，除了以上描述的丁酸产生途径以外，使用以上描述的方法将大肠杆菌Nissle进一步工程化为产生选自以下的一个或更多个分子：IL-10、IL-2、IL-22、IL-27、SOD、犬尿氨酸、犬尿烯酸和GLP-2。在一些实施方案中，细菌包含如以上描述的用于产生丁酸的基因盒和编码IL-10的基因(参见，例如，SEQ ID NO:49)。在一些实施方案中，细菌包含如以上描述的用于产生丁酸的基因盒和编码IL-2的基因(参见，例如，SEQ ID NO:50)。在一些实施方案中，细菌包含如以上描述的用于产生丁酸的基因盒和编码IL-22的基因(参见，例如，SEQ ID NO:51)。在一些实施方案中，细菌包含如以上描述的用于产生丁酸的基因盒和编码IL-27的基因(参见，例如，SEQ ID NO:52)。在一些实施方案中，细菌包含如以上描述的用于产生丁酸的基因盒和编码SOD的基因(参见，例如，SEQ ID NO:53)。在一些实施方案中，细菌包含如以上描述的用于产生丁酸的基因盒和编码GLP-2的基因(参见，例如，SEQID NO:54)。在一些实施方案中，细菌包含如以上描述的用于产生丁酸的基因盒和用于产生犬尿氨酸或犬尿烯酸的基因或基因盒。在一些实施方案中，细菌包含如以上描述的用于产生丁酸的基因盒和编码IL-10、IL-22、和GLP-2的基因。在一个实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于FNR调节区域的控制下，该FNR调节区域选自SEQ ID NO：55-66(表9)。在一个替代实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于RNS响应性调节区域(例如，norB)的控制下，并且细菌还包含编码相应的RNS响应性转录因子(例如，nsrR)的基因(参见，例如，表10和11)。在又另一个实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于ROS响应性调节区域(例如，oxyS)的控制下，并且细菌还包含编码相应的ROS响应性转录因子(例如，oxyR)的基因(参见，例如，表14-17)。在某些构建体中，将一个或更多个基因置于四环素诱导型或组成型启动子的控制下。
丁酸、丙酸、IL-10、IL-22、IL-2、IL-27
在某些构建体中，除了以上描述的丁酸产生途径以外，使用以上描述的方法将大肠杆菌Nissle进一步工程化为产生丙酸及选自以下的一个或更多个分子：IL-10、IL-2、IL-22、IL-27、SOD、犬尿氨酸、犬尿烯酸和GLP-2。在某些构建体中，除了以上描述的丁酸产生途径以外，将大肠杆菌Nissle进一步工程化为产生丙酸及选自以下的一个或更多个分子：IL-10、IL-2、和IL-22。在某些构建体中，除了以上描述的丁酸产生途径以外，将大肠杆菌Nissle进一步工程化为产生丙酸及选自以下的一个或更多个分子：IL-10、IL-2、和IL-27。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含用于丙酸生物合成的丙烯酸途径基因，pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、和acrC。在一个替代实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于丙酸生物合成的丙酮酸途径基因，thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、和lpd。在另一个替代实施方案中，遗传工程化的细菌包含thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、lpd、和tesB。
细菌包含如以上描述的用于制备丁酸的基因盒、如以上描述的用于制备丙酸的基因盒、编码IL-10的基因(参见，例如，SEQ ID NO:49)、编码IL-27的基因(参见，例如，SEQ IDNO:52)、编码IL-22的基因(参见，例如，SEQ ID NO:51)、和编码IL-2的基因(参见，例如，SEQID NO:50)。在一个实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于FNR调节区域的控制下，该FNR调节区域选自SEQ ID NO：55-66(表9)。在一个替代实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于RNS响应性调节区域(例如，norB)的控制下，并且细菌还包含编码相应的RNS响应性转录因子(例如，nsrR)的基因(参见，例如，表10和11)。在又另一个实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于ROS响应性调节区域(例如，oxyS)的控制下，并且细菌还包含编码相应的ROS响应性转录因子(例如，oxyR)的基因(参见，例如，表14-17)。在某些构建体中，将一个或更多个基因置于四环素诱导型或组成型启动子的控制下。
丁酸、丙酸、IL-10、IL-22、SOD、GLP-2、犬尿氨酸
在某些构建体中，除了以上描述的丁酸产生途径以外，使用以上描述的方法将大肠杆菌Nissle进一步工程化为产生选自以下的一个或更多个分子：IL-10、IL-22、SOD、GLP-2和犬尿氨酸。在某些构建体中，除了以上描述的丁酸产生途径以外，使用以上描述的方法将大肠杆菌Nissle进一步工程化为产生丙酸及选自以下的一个或更多个分子：IL-10、IL-22、SOD、GLP-2和犬尿氨酸。在某些构建体中，除了以上描述的丁酸产生途径以外，使用以上描述的方法将大肠杆菌Nissle进一步工程化为产生IL-10、IL-27、IL-22、SOD、GLP-2和犬尿氨酸。在某些构建体中，除了以上描述的丁酸产生途径以外，使用以上描述的方法将大肠杆菌Nissle进一步工程化为产生丙酸、IL-10、IL-27、IL-22、SOD、GLP-2和犬尿氨酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含用于丙酸生物合成的丙烯酸途径基因，pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、和acrC。在一个替代实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于丙酸生物合成的丙酮酸途径基因，thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、和lpd。在另一个替代实施方案中，遗传工程化的细菌包含thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、lpd、和tesB。
细菌包含如以上描述的用于制备丁酸的基因盒、如以上描述的用于制备丙酸的基因盒、编码IL-10的基因(参见，例如，SEQ ID NO:49)、编码IL-22的基因(参见，例如，SEQ IDNO:51)、编码SOD的基因(参见，例如，SEQ ID NO:53)、编码GLP-2的基因(参见，例如，SEQ IDNO:54)、和用于产生犬尿氨酸的基因或基因盒。在一个实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于FNR调节区域的控制下，该FNR调节区域选自SEQ ID NO：55-66(表9)。在一个替代实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于RNS响应性调节区域(例如，norB)的控制下，并且细菌还包含编码相应的RNS响应性转录因子(例如，nsrR)的基因(参见，例如，表10和11)。在又另一个实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于ROS响应性调节区域(例如，oxyS)的控制下，并且细菌还包含编码相应的ROS响应性转录因子(例如，oxyR)的基因(参见，例如，表14-17)。在某些构建体中，将一个或更多个基因置于四环素诱导型或组成型启动子的控制下。
丁酸、丙酸、IL-10、IL-27、IL-22、IL-2、SOD、GLP-2、犬尿氨酸
在某些构建体中，除了以上描述的丁酸产生途径以外，使用以上描述的方法将大肠杆菌Nissle进一步工程化为产生选自以下的一个或更多个分子：IL-10、IL-27、IL-22、IL-2、SOD、GLP-2和犬尿氨酸。在某些构建体中，除了以上描述的丁酸产生途径以外，使用以上描述的方法将大肠杆菌Nissle进一步工程化为产生丙酸及选自以下的一个或更多个分子：IL-10、IL-27、IL-22、IL-2、SOD、GLP-2和犬尿氨酸。在某些构建体中，除了以上描述的丁酸产生途径以外，使用以上描述的方法将大肠杆菌Nissle进一步工程化为产生IL-10、IL-27、IL-22、SOD、GLP-2和犬尿氨酸。在一些实施方案中，遗传工程化的细菌还包含用于丙酸生物合成的丙烯酸途径基因，pct、lcdA、lcdB、lcdC、etfA、acrB、和acrC。在一个替代实施方案中，遗传工程化的细菌包含用于丙酸生物合成的丙酮酸途径基因，thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、和lpd。在另一个替代实施方案中，遗传工程化的细菌包含thrAfbr、thrB、thrC、ilvAfbr、aceE、aceF、lpd、和tesB。
细菌包含如以上描述的用于制备丁酸的基因盒、如以上描述的用于制备丙酸的基因盒、编码IL-10的基因(参见，例如，SEQ ID NO:49)、编码IL-27的基因(参见，例如，SEQ IDNO:52)、编码IL-22的基因(参见，例如，SEQ ID NO:51)、编码IL-2的基因(参见，例如，SEQID NO:50)、编码SOD的基因(参见，例如，SEQ ID NO:53)、编码GLP-2的基因(参见，例如，SEQID NO:54)、和用于产生犬尿氨酸的基因或基因盒。在一个实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于FNR调节区域的控制下，该FNR调节区域选自SEQ ID NO：55-66(表9)。在一个替代实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于RNS响应性调节区域(例如，norB)的控制下，并且细菌还包含编码相应的RNS响应性转录因子(例如，nsrR)的基因(参见，例如，表9和10)。在又另一个实施方案中，将基因或基因盒的每一个置于ROS响应性调节区域(例如，oxyS)的控制下，并且细菌还包含编码相应的ROS响应性转录因子(例如，oxyR)的基因(参见，例如，表14-17)。在某些构建体中，将一个或更多个基因置于四环素诱导型或组成型启动子的控制下。
在一些实施方案中，细菌基因可以被破坏或缺失以产生营养缺陷型菌株。这些包括，但不限于，寡核苷酸合成、氨基酸合成和细胞壁合成所需的基因，如下所示。
氨基酸 寡核苷酸 细胞壁
cysE thyA dapA
glnA uraA dapB
ilvD dapD
leuB dapE
lysA dapF
serA
metA
glyA
hisB
ilvA
pheA
proA
thrC
trpC
tyrA
实施例2.转化大肠杆菌
将每一个质粒转化到大肠杆菌Nissle或大肠杆菌DH5a中。将所有管、溶液和比色皿预冷至4℃。大肠杆菌Nissle或大肠杆菌DH5a的过夜培养物在5mL溶菌肉汤(lysogenybroth)(LB)中以1:100稀释，并生长直至使其达到OD600为0.4-0.6。细胞培养基包含适于质粒的选择标志，例如，氨苄青霉素。然后将大肠杆菌细胞在4℃以2,000rpm离心5min，去除上清液，并将细胞重悬于1mL的4℃水中。将大肠杆菌在4℃以2,000rpm再次离心5min，去除上清液，并将细胞重悬于0.5mL的4℃水中。将大肠杆菌在4℃以2,000rpm再次离心5min，去除上清液，并将细胞最终重悬于0.1mL的4℃水中。将电穿孔仪设置为2.5kV。将0.5μg以上质粒之一添加至细胞中，通过移液混合，并移液到无菌、冷的比色皿中。将干燥的比色皿置于样品室中，并施加电脉冲。立即添加1mL室温SOC培养基，并且将混合物转移至培养管中，并在37℃孵育1小时。将细胞分散在包含氨苄青霉素的LB板上并孵育过夜。
在替代实施方案中，丁酸盒可以通过同源重组被插入到Nissle基因组中(Genewiz,Cambridge,MA)。本文提供了构建体和核苷酸序列的组构。为了产生能够将合成的丁酸盒构建体整合到染色体中的载体，首先使用Gibson组装将与Nissle lacZ基因座同源的1000bp DNA序列添加到R6K起始质粒pKD3中。这将DNA靶向到克隆在这些同源臂之间以整合到Nissle基因组中的lacZ位点。Gibson组装用于克隆这些臂之间的片段。PCR用于扩增来自该质粒的包含同源臂以及它们之间的丁酸盒的完整序列的区域。该PCR片段用于转化电感受态Nissle-pKD46，一种包含编码λ红色重组酶(lambda red recombinase)基因的温度敏感性质粒的菌株。在转化之后，使细胞生长2小时，然后在37℃在20ug/mL的氯霉素上铺板。在37℃生长也可以固化pKD46质粒。包含转化体的盒为氯霉素抗性和lac-minus(lac-)。
实施例3.使用tet诱导型启动子在重组大肠杆菌中产生丁酸
图15-17、20和21示出了以上描述的在tet-诱导型启动子控制下的丁酸盒。使用下文实施例4中描述的方法评价丁酸的产生。测试的tet诱导型盒包括(1)包含所有8个基因的tet丁酸盒(pLOGIC031)；(2)其中ter被取代的tet丁酸盒(pLOGIC046)和(3)其中在pbt和buk基因的位置被tesB取代的tet-丁酸盒。图18示出了在氧的存在和不存在下菌株pLOGIC031和pLOGIC046中的丁酸产生，其中丁酸产生不存在显著差异。在表达pLOGIC046的低拷贝质粒在Nissle中显示出增强的丁酸产生，所述pLOGIC046包含最后两个基因(ptb-buk)的缺失并且它们被替代为内源大肠杆菌tesB基因(从丁酰CoA裂解丁酸部分的硫酯酶)。
将过夜的细胞培养物在Lb中以1:100稀释，并生长1.5小时直至达到早期对数期，在该早期对数期点以100ng/ml的最终浓度添加无水tet以诱导质粒表达。在诱导2小时之后，在OD600＝0.5时，将细胞洗涤并重悬于包含0.5％葡萄糖的M9基本培养基(minimalmedia)中。在指定时间将样品取出，并将细胞离心。使用LC-MS测试上清液的丁酸产生。图22示出了包含具有ter取代(pLOGIC046)或tesB取代(ptb-buk缺失)的tet丁酸盒的菌株中的丁酸产生，证明tesB取代的菌株具有更大的丁酸产生。
图19示出了大肠杆菌的BW25113菌株，其为常见的克隆菌株并为大肠杆菌突变体的KEIO收集物(collection)的背景。获得具有NuoB缺失的NuoB突变体。NuoB为参与呼吸生长(需要电子传递的生长形式)期间NADH氧化的蛋白复合物。防止NADH氧化与电子传递偶联允许用于支持丁酸产生的NADH的量的增加。图19示出了，与野生型Nissle相比，NuoB的缺失导致更大的丁酸产生。
pLOGIC046-tesB-丁酸：
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实施例4.重组大肠杆菌中丁酸的产生
评价包含以上描述的丁酸盒的大肠杆菌Nissle菌株中丁酸的产生以确定氧对丁酸产生的影响。所有孵育在37℃进行。用丁酸盒转化的大肠杆菌菌株DH5a和Nissle的培养物在LB中生长过夜，并且然后以1∶200稀释到包含0.5％葡萄糖的4mL M9基本培养基中。将细胞伴随振摇(250rpm)生长4-6h，并且需氧或在Coy厌氧室(供应90％N2、5％CO2、5％H2)中厌氧孵育。将1mL培养物等分试样制备于1.5mL带盖的管中并在静置培养箱中孵育以限制培养通气。在每一个时间点(0小时、1小时、2小时、4小时和20小时)取出一个管，并通过LC-MS分析丁酸浓度，以确认这些重组菌株中的丁酸产生可以在低氧环境中实现。
在替代实施方案中，将过夜细菌培养物以1∶100稀释到新鲜LB中并生长1.5小时以允许进入早期对数期。此时，将长半衰期的一氧化氮供体(DETA-NO；二亚乙基三胺-一氧化氮加合物)以0.3mM的最终浓度添加至培养物中以诱导由质粒的表达。在诱导2小时之后，将细胞离心，将上清液弃去，并且将细胞重悬于包含0.5％葡萄糖的M9基本培养基中。然后在指定的时间点分析培养物上清液以评价丁酸产生的水平。包含pLogic031-nsrR-norB-丁酸操纵子构建体；SYN133)或(pLogic046-nsrR-norB-丁酸操纵子构建体；SYN145)的遗传工程化的Nissle与野生型(SYN001)相比产生显著更多的丁酸。
遗传工程化的Nissle被产生，所述遗传工程化的Nissle包含其中pbt和buk基因被替代为tesB(SEQ ID NO:24)、在四环素启动子控制下表达的丁酸基因盒(pLOGIC046-tesB-丁酸；SEQ ID NO:81)。SEQ ID NO:81包含tetR阻遏物的反向互补序列(加下划线的)、包含控制tetR和丁酸操纵子的趋异启动子及其各自的RBS的基因间区域(粗体)以及被RBS分开的丁酸基因(ter-thiA1-hbd-crt2-tesB)。
将过夜细菌培养物以1:100稀释到新鲜LB中并生长1.5小时以允许进入早期对数期。此时，将无水四环素(ATC)以100ng/mL的最终浓度添加至培养物中以诱导由质粒表达丁酸基因。在诱导2小时之后，将细胞离心，将上清液弃去，并且将细胞重悬于包含0.5％葡萄糖的M9基本培养基中。然后在指定的时间点分析培养物上清液以评价丁酸产生的水平。将pbt和buk替代为tesB导致更大水平的丁酸产生。
图24示出了在葡萄糖和氧的存在/不存在下，包含FNR丁酸盒syn363(具有ter取代)的菌株中的丁酸产生。图24示出了细菌需要葡萄糖和厌氧条件两者用于由FNR启动子的丁酸产生。使细胞在不包含葡萄糖的培养基(LB)或包含在0.5％的葡萄糖的培养基(RMC)中需氧或厌氧生长。在指定的时间点采集培养物样品，并且使用LC-MS评价上清液级分的丁酸浓度。这些数据表明SYN 363需要葡萄糖用于丁酸产生，而且当在厌氧FNR调节的ydfZ启动子的控制下时，在葡萄糖的存在下在厌氧条件下可以增强丁酸产生。
实施例5.表达丁酸的细菌在IBD小鼠模型中的功效
携带以上描述的丁酸盒的细菌在LB中生长过夜。然后将细菌以1:100稀释到包含合适的选择标志例如氨苄青霉素的LB中，并且生长至光密度为0.4-0.5，并且然后通过离心沉淀。将细菌重悬于磷酸盐缓冲盐水中，并且将100微升通过口服管饲施用至小鼠。在细菌管饲之前，通过用3％葡聚糖硫酸钠持续7天补充饮用水，在小鼠中诱导IBD。将小鼠每天进行治疗持续1周，并且粪便样品中的细菌通过将粪便均质物铺板在补充有合适的选择标志例如氨苄青霉素的琼脂板上来检测。在细菌治疗5天之后，使用内窥镜检查在活小鼠中评分结肠炎。内窥镜检查损伤评分通过评价结肠半透明度、纤维蛋白附着、粘膜和血管病理学和/或粪便特征来确定。将小鼠处死，并且分离结肠组织。将远端结肠切片固定并对炎症和溃疡进行评分。将结肠组织均质化，并且使用酶促测定试剂盒对髓过氧化物酶活性和细胞因子水平(IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-10)进行测量。
实施例6.产生DSS诱导的IBD小鼠模型
可以在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠模型中测试实施例1中描述的遗传工程化的细菌。DSS至动物的施用导致对肠上皮的化学损伤，允许促炎性肠内含物(例如，腔抗原、肠细菌、细菌产物)传播并触发炎症(Low等，2013)。为了制备用于DSS处理的小鼠，将小鼠使用耳号钳(ear punch)或任何其他合适的标记方法进行标记。标记单独小鼠允许研究者跟踪每一只小鼠中的疾病进展，因为小鼠显示出对DSS诱导的差异的敏感性和响应性。然后将小鼠称重，并且如果需要，平均组重量被平衡以消除组之间的任何显著的重量差异。在DSS施用之前也收集粪便，作为随后测定的对照。下文描述了对粪便的炎症标志(例如，细胞因子水平或髓过氧化物酶活性)的示例性测定。
对于DSS施用，制备DSS(MP Biomedicals,Santa Ana,CA；目录号160110)在高压灭菌水中的3％溶液。然后将笼式水瓶填充100mL DSS水，并且对照小鼠被给予相同量的没有DSS补充的水。该量通常足够用于5只小鼠持续2-3天。尽管DSS在室温为稳定的，但两种类型的水均每2天或者当观察到瓶子中的浊度时更换。
急性、慢性和分辨性(resolving)肠炎症模型通过修改DSS剂量(通常1％-5％)和DSS施用的持续时间来实现(Chassaing等，2014)。例如，急性和分辨性结肠炎可以在单次连续暴露于DSS一周以内或更少时间之后实现，而慢性结肠炎通常DSS周期性施用并间以恢复期来诱导(例如，4个周期的持续7天的DSS处理，随后是7-10天的水)。
图27示出了在FNR启动子控制下的DSS小鼠模型体内产生的丁酸可以是消化道保护性的。LCN2和钙防卫蛋白均为消化道屏障破坏的测量(在该测定中通过ELISA测量)。图27示出了，与Syn 94(野生型Nissle)相比，Syn 363(ter取代)降低炎症和/或保护消化道屏障。
实施例7.监测体内疾病进展
在初始施用DSS之后，每天通过将单个小鼠置于空的笼(没有铺垫材料)中持续15-30min从每一只动物收集粪便。然而，随着DSS施用进展和炎症变得更加稳健，收集所需的时间段增加。将粪便样品使用无菌镊子(forceps)收集，并置于微量离心管中。根据以下评分系统使用单个沉淀监测隐血(occult blood)：0，与阴性隐血(hemoccult)一致的正常粪便；1，具有阳性隐血的软粪便；2，具有痕量血液的非常软的粪便；和3，具有可见直肠出血的水样粪便。该量表(scale)用于肠出血的比较分析。将所有剩余的粪便保留用于测量炎症标志，并在-20℃冷冻。
每一只动物的体重也被每天测量。在初始DSS施用之后的前三天，体重可能略微增加，并且然后在开始出血后开始逐渐减轻。对于急性结肠炎的小鼠模型，DSS通常被施用7天。然而，这个时间长度可以由研究员自行决定来修改。
实施例8.遗传工程化的细菌在DSS诱导之后的体内功效
可以在DSS诱导的IBD动物模型中测试实施例1中描述的遗传工程化的细菌。细菌在补充有适当抗生素的LB中生长过夜。然后将细菌在包含选择性抗生素的新鲜LB中以1:100进行稀释，生长至光密度为0.4-0.5，并且通过离心沉淀。然后将细菌重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在细菌管饲之前，通过补充具有3％DSS的饮用水，在小鼠中诱导IBD。在DSS处理的第7天，将100μL的细菌(或媒介物)通过口服管饲施用至小鼠。细菌治疗被每天重复一次持续1周，并且粪便样品中的细菌通过将粪便均质物铺板在选择性琼脂板上来检测。
在细菌治疗5天之后，使用Coloview系统(Karl Storz Veterinary Endoscopy,Goleta,CA)在活小鼠中评分结肠炎。在1.5％-2.0％异氟烷麻醉下的小鼠中，将结肠用空气充气，并且约3cm的近端结肠可以被视化(Chassaing等，2014)。内窥镜检查损伤通过评价以下进行评分：结肠半透明度(评分0-3)、纤维蛋白附着至肠壁(评分0-3)、粘膜粒度(评分0-3)、血管病理学(评分0-3)、粪便特征(正常至腹泻；评分0-3分)、以及腔中血液的存在(评分0-3)，产生最大评分18。将小鼠处死，并且结肠组织使用实施例8和9中描述的方案进行分离。将远端结肠切片固定并对炎症和溃疡进行评分。将剩余的结肠组织均质化，并且使用下文描述的方法测量细胞因子水平(例如，IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ和IL-10)以及髓过氧化物酶活性。
实施例9.用于IBD啮齿动物模型的安乐死程序
在处死之前4和24小时，可以按照供应商推荐，将5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)(Invitrogen,Waltham,MA；目录号B23151)腹膜内施用至小鼠。BrdU用于经由用标准抗-BrdU抗体(Abcam,Cambridge,MA)的免疫组织化学监测肠上皮细胞增殖和/或迁移。
在处死当天，将小鼠剥夺食物4小时，并且然后用FITC-葡聚糖示踪物(4kDa,0.6mg/g体重)管饲。收集粪粒(Fecal pellet)，并在FITC-葡聚糖施用之后3小时将小鼠安乐死。然后将动物心脏放血以收集无溶血的血清。肠通透性与适当稀释的血清的荧光强度(激发，488nm；发射，520nm)相关，并使用分光光度法测量。小鼠血清中已知量的FITC葡聚糖的系列稀释用于制备标准曲线。
可选地，肠炎症根据血清角质形成细胞来源的趋化因子(KC)、脂质运载蛋白2、钙防卫蛋白和/或CRP-1的水平来定量。这些蛋白为炎性疾病活性的可靠生物标志，并且根据制造商的说明使用DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)来测量。对于这些测定，对照血清样品对于KC以1:2或1:4稀释，且对于脂质运载蛋白2以1:200稀释。来自DSS处理的小鼠的样品需要显著更高的稀释。
实施例10.分离和保存结肠组织
为了从小鼠中分离肠组织，将每一只小鼠通过腹侧中线切口打开。然后将脾脏取出并称重。增加的脾脏重量通常与动物中的炎症和/或贫血程度相关。铺板在非选择性琼脂板上的脾脏裂解物(在PBS中的100mg/mL)也指示播散的肠细菌。细菌播散的程度应该与任何FITC葡聚糖通透性数据一致。
然后分离肠系膜淋巴结。这些可以用于表征免疫细胞群体和/或测定消化道细菌易位。淋巴结肿大也是DSS诱导病理学的可靠指征。最后，通过用镊子举起器官取出结肠，并且将其小心地拉直至盲肠可见。来自严重发炎的DSS处理的小鼠的结肠剥离(dissection)特别困难，因为炎性过程引起结肠组织变薄、缩短并附着于肠外组织。
结肠和盲肠将在回肠连接处与小肠分开，并在直肠远端处与肛门分开。此时，可以将小鼠肠(从盲肠至直肠)成像以用于总体分析，并且结肠长度可以通过伸直(但不拉伸)结肠来测量。然后将结肠在回肠连接处与盲肠分开，并使用5mL或10mL注射器(带有进针(feeding needle))用冷PBS短暂冲洗。冲洗去除任何粪便和/或血液。然而，如果最终预期粘蛋白层或细菌粘附/易位的组织学染色，应该避免用PBS冲洗结肠。相反，将结肠浸入Carnoy溶液(60％乙醇、30％氯仿、10％冰乙酸；Johansson等，2008)中以保存粘膜结构。盲肠可以被弃去，因为通常在该区域未观察到DSS诱导的炎症。
在冲洗之后，测量结肠重量。由于组织消耗，发炎结肠相对于正常结肠表现出降低的重量，并且结肠重量的降低与急性炎症的严重程度相关。相比之下，在慢性炎性肠炎模型中，炎症通常与增加的结肠重量相关。增加的重量可以归因于巨噬细胞、上皮样细胞和多核巨细胞的集中收集，和/或其他细胞诸如淋巴细胞、成纤维细胞和浆细胞的积累(Williams和Williams,1983)。
为了获得结肠样品用于以后测定，将结肠切割为适当数目的段。当进行任何测定时，比较来自不同组小鼠的结肠的相同区域是重要的。例如，将近端结肠在-80℃冷冻，并且保存用于MPO分析，将中间结肠储存于RNAlater中，并且保存用于RNA分离，并且将直肠区域固定在10％福尔马林中用于组织学。可选地，可以离体培养洗涤的结肠。这些测定中的每一个的示例性方案如下文描述。
实施例11.髓过氧化物酶活性测定
啮齿动物肠中的粒细胞浸润与炎症相关，并且通过髓过氧化物酶的活性水平测量，髓过氧化物酶为一种在嗜中性粒细胞粒细胞中大量表达的酶。髓过氧化物酶(MPO)活性可以使用邻联茴香胺二盐酸(o-dianisidine dihydrochloride)(Sigma,St.Louis,MO；目录号D3252)或3,3',5,5'-四甲基联苯二胺(Sigma；目录号T2885)作为底物来定量。
简言之，将清洁的冲洗的结肠组织样品(50-100mg)从在-80℃的储存中取出，并立即置于冰上。然后将样品在50mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0中的0.5％十六烷基三甲基溴化铵(Sigma；目录号H6269)中均质化。然后，将均质物通过超声处理破坏30秒，在干冰中快速冷冻并解冻持续总计三个冷冻-解冻循环，然后最后超声处理30秒。
对于用邻联茴香胺二盐酸的测定，将样品在4℃以高速(13,400g)离心6min。然后在96孔板中通过添加1mg/mL邻联茴香胺二盐酸和0.5x10-4％H2O2并测量在450nm处的光密度测定上清液中的MPO。棕黄色在10-20min的时间内缓慢显色；然而，如果颜色显色过快，则在进一步稀释样品后重复测定。人类嗜中性粒细胞MPO(Sigma；目录号M6908)用作标准品，其中范围为0.5-0.015单位/mL。一个酶单位被定义为在25℃每分钟降解1.0μmol过氧化物所需的酶的量。该测定用于分析啮齿动物结肠样品中，特别是在DSS诱导的组织中的MPO活性。
对于用3,3’,5,5’-四甲基联苯二胺(TMB)的测定，将样品在60℃孵育2小时，并且然后以4,000g离心12min。上清液中的酶活性在630nm处光度法进行定量。测定混合物由溶解于二甲亚砜中的20mL上清液、10mLTMB(最终浓度，1.6mM)和稀释于80mM磷酸盐缓冲液(pH5.4)中的70mL H2O2(最终浓度，3.0mM)组成。一个酶单位被定义为每分钟产生一个吸光度单位增加的酶的量。该测定用于分析啮齿动物结肠样品中，特别是通过如本文描述的三硝基苯(TNBS)诱导的组织中的MPO活性。
实施例12.RNA分离和基因表达分析
为了获得对遗传工程化的细菌可以如何降低体内消化道炎症的进一步的机制了解，基因表达通过半定量和/或实时逆转录PCR进行评价。
对于半定量分析，总RNA使用RNeasy分离试剂盒(Qiagen,Germantown,MD；目录号74106)从肠粘膜样品中提取。RNA浓度和纯度基于在260nm和280nm处的吸光度测定来确定。随后，将1μg总RNA进行逆转录，并对以下基因扩增cDNA：肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)或任何其他与炎症相关的基因。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内标(internal standard)。如下进行聚合酶链式反应(PCR)的反应：在95℃的2-min解链步骤，然后25个以下的循环：在94℃30秒、在63℃30秒和在75℃1min，最后是在65℃5min的延伸步骤。逆转录(RT)-PCR产物在4％琼脂糖凝胶上通过尺寸来分开并用溴化乙锭染色。相对条带强度使用标准图像分析软件分析。
对于实时定量分析，将肠样品(50mg)储存于RNAlater溶液(Sigma；目录号R0901)中，直至RNA提取。样品应该被保持在-20℃用于长期储存。在RNA提取当天，将样品解冻或从RNAlater中取出，并且总RNA使用Trizol(Fisher Scientific,Waltham,MA；15596026)进行提取。可以使用任何适合的RNA提取方法。当用DSS诱导的样品工作时，有必要使用氯化锂方法去除所有的多糖(包括DSS)(Chassaing等，2012)。已知结肠组织中痕量的DSS干扰随后的步骤中的PCR扩增。
使用Primer软件(Applied Biosystems,Foster City,CA)设计用于与免疫应答相关的多种基因和细胞因子的引物。在分离总RNA之后，逆转录使用随机引物、dNTP和 II酶(Invitrogen；18064014)来进行。然后用SYBR Green PCRMaster Mix(Applied Biosystems；4309155)和ABI PRISM 7000序列检测系统(AppliedBiosystems)将cDNA用于实时PCR，但也可以使用任何合适的检测方法。PCR产物通过熔解分析(meltanalysis)验证。
实施例13.组织学
标准组织染色用于在显微水平评价肠炎症。苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin)(H&E)染色允许可视化细胞浸润、上皮变化和粘膜结构的质量和尺寸(Erben等，2014)。高碘酸希夫氏(Periodic Acid-Schiff)(PAS)染色剂用于对碳水化合物大分子(例如，糖原、糖蛋白、粘蛋白)进行染色。例如，杯状细胞(goblet cell)由于粘蛋白的存在为PAS阳性的。
Swiss roll被推荐用于大多数组织学染色，以便可以检查啮齿动物肠的整个长度。这为一种简单的技术，其中肠被分为部分，纵向打开，并且然后粘膜向外卷起(Moolenbeek和Ruitenberg,1981)。简言之，将各段结肠纵向切开，缠绕在用PBS润湿的牙签上，并置于盒中。在10％福尔马林中固定24小时后，将盒储存于70％乙醇中直至染色当天。福尔马林固定的结肠组织可以使用抗BrdU抗体(Abcam)对BrdU染色。可选地，Ki67可以用于可视化上皮细胞增殖。对于使用针对更特定靶的抗体的染色(例如，免疫组织化学、免疫荧光)，将冷冻切片固定于冷冻保护性包埋介质，诸如Tissue- OCT(VWR,Radnor,PA；目录号：25608-930)中。
对于H&E染色，染色的结肠组织通过基于上皮损伤的程度以及粘膜、粘膜下层和粘膜肌层/浆膜中的炎性浸润，分配每一个切片0-3的4个评分来分析。将这些评分的每一个乘以：1，如果变化为集中的(focal)；2，如果变化为零散的(patchy)；和3，如果变化为扩散的。然后对每一个结肠将4个单独评分相加，得出每只动物的总评分范围为0-36。将对照组和受影响组的平均评分列表。替代评分系统在本文被详述。
实施例14.啮齿动物结肠的离体培养
离体培养结肠可以提供关于肠炎症严重程度的信息。纵向切开的结肠(约1.0cm)在具有1.0％青霉素/链霉素(Fisher；目录号BP295950)的Hank平衡盐溶液中连续洗涤3次。然后将洗涤的结肠置于24孔板的孔中，每一个孔包含1.0mL具有1.0％青霉素/链霉素的无血清RPMI1640培养基(Fisher；目录号11875093)中，并在37℃用5.0％CO2孵育24小时。在孵育之后，将上清液收集并在4℃离心10min。在分析促炎细胞因子之前，将上清液在-80℃储存。
实施例15.遗传工程化的细菌在TNBS诱导之后的体内功效
除了DSS以外，还可以在其他化学诱导的IBD动物模型中测试实施例1中描述的遗传工程化的细菌。非限制性实例包括由以下诱导的那些：噁唑酮(Boirivant等，1998)、乙酸(MacPherson和Pfeiffer,1978)、吲哚美辛(indomethacin)(Sabiu等，2016)、巯基抑制剂(Satoh等，1997)和三硝基苯磺酸(TNBS)(Gurtner等，2003；Seguí等，2004)。为了确定遗传工程化的细菌在TNBS诱导的结肠炎小鼠模型中的功效，使细菌在补充有适当抗生素的LB中生长过夜。然后将细菌在包含选择性抗生素的新鲜LB中以1:100进行稀释，生长至光密度为0.4-0.5，并且通过离心沉淀。将细菌重悬于PBS中。通过结肠内施用在0.25mL 50％(体积/体积)乙醇中的30mg TNBS在小鼠中诱导IBD(Seguí等，2004)。对照小鼠被施用0.25mL盐水。诱导后4小时，将100μL的细菌(或媒介物)通过口服管饲施用至小鼠。细菌治疗被每天重复一次，持续1周。将动物每天称重。
在细菌治疗7天之后，小鼠经由腹膜内施用硫仲丁比妥(thiobutabarbital)(100mg/kg)被处死。结肠组织通过钝性剥离来分离，用盐水润洗并称重。血液样品通过在无菌条件下的开放式心脏穿刺使用1-mL注射器来收集，置于Eppendorf小瓶中，并在4℃以1,500g离心10min。然后将上清液血清移液到高压灭菌的Eppendorf小瓶中，并在-80℃冷冻，以用于使用定量的比色商业试剂盒(R&D Systems)以后测定IL-6水平。
宏观结肠损伤由盲观察者在解剖显微镜下检查。建立的评分系统用于说明肠粘附(评分0-2)、狭窄(评分0-3)、溃疡(评分0-3)和壁厚(评分0-2)的存在/严重程度(Mourelle等，1996)。然后将两个结肠样品(50mg)切除，在液氮中快速冷冻，并在-80℃储存用于随后的髓过氧化物酶活性测定。如果需要，将另外的样品保存在10％福尔马林中用于组织学分级。然后将福尔马林固定的结肠样品包埋在石蜡中，并且将5μm切片用H&E染色。结肠的显微炎症根据先前定义的标准以0至11的量表进行评价(Appleyard和Wallace,1995)。
实施例16.产生IBD的细胞转移小鼠模型
可以在IBD的细胞转移动物模型中测试实施例1中描述的遗传工程化的细菌。一个示例性的细胞转移模型为结肠炎的CD45RBHi T细胞转移模型(Bramhall等，2015；Ostanin等，2009；Sugimoto等，2008)。该模型通过以下产生：根据CD4+ T细胞的CD45RB表达水平分选CD4+ T细胞，并且将来自正常供体小鼠的具有高CD45RB表达的CD4+ T细胞(被称为CD45RBHi T细胞)过继转移到免疫缺陷小鼠(例如，SCID或RAG-/-小鼠)中。具体方案被如下描述。
CD4 T细胞的富集
在任一性别的C57BL/6野生型小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)的安乐死之后，将小鼠脾脏取出，并在包含10-15mL FACS缓冲液(无Ca2+/Mg2+、补充有4％胎牛血清的1X PBS)的100mm培养皿中置于冰上。将脾脏使用以FACS缓冲液包被的两个玻璃载玻片进行梳理(tease apart)，直至没有大块组织剩余。然后将细胞悬浮液使用10-mL注射器(无针头)从培养皿中取出，并从注射器(使用26号针头(26-gauge needle))中排出到置于冰上的50-mL锥形管中。将培养皿使用相同的针头技术用另外的10mLFACS缓冲液洗涤，直至50-mL锥形管充满。将细胞通过在4℃以400g离心10min来沉淀。在用FACS缓冲液流轻轻破坏细胞沉淀之后，将细胞计数。将用于计数的细胞保持在冰上，并保存用于在下一部分中描述的单色染色。将所有其他细胞(即，保留在50-mL锥形管中的那些细胞)转移至新的50-mL锥形管中。每一个管应该包含最多25x107个细胞。
为了富集CD4+ T细胞，按照制造商的说明使用小鼠CD4阴性分离试剂盒(Invitrogen；目录号114-15D)。可以使用任何可比的CD4+ T细胞富集方法。在阴性选择之后，CD4+细胞保留在上清液中。将上清液小心地移液到冰上的新的50-mL锥形管中，并且将细胞通过在4℃以400g离心10min来沉淀。然后将来自所有50-mL管的细胞沉淀重悬，汇集到单个15-mL管中，并通过离心沉淀再一次沉淀。最后，将细胞重悬于1mL新鲜的FACS缓冲液中，并用抗-CD4-APC和抗-CD45RB-FITC抗体染色。
荧光标记CD4+ T细胞
为了标记CD4+ T细胞，将包含在FACS缓冲液中预先滴定的抗-CD4-APC和抗-CD45RB-FITC抗体的适当稀释的抗体混合物(cocktail)(约1mL混合物/5x107个细胞)添加至1.5mL Eppendorf管中，并且将体积用FACS缓冲液调节至1mL。然后将抗体混合物与15-mL管中的细胞合并。将管加盖，轻轻倒置以确保适当混合，并在4℃在摇摆平台上孵育15min。
在孵育时间期间，96孔圆底染色板通过以下来制备：将相等的计数细胞等分试样(从先前部分保存的)转移到板的相应于单色对照染色的每一个孔中。然后将这些孔用FACs缓冲液填充至200μL，并将细胞使用预冷板离心机在4℃将以300g沉淀3min。在离心之后，将上清液使用附着至真空管线上的21号针头弃去，并将100μL抗-CD16/32抗体(Fc受体-阻断)溶液添加至每一个孔中，以防止非特异性结合。将板在4℃在摇摆平台上孵育15min。然后将细胞用200μL FACS缓冲液洗涤并且通过离心沉淀。将上清液吸出，弃去，并将100μL适当的抗体(即，预滴定的抗-CD4-APC或抗-CD45RB-FITC)添加至相应于每一个单色对照的孔中。将未染色的对照孔中的细胞重悬于100μL FACS缓冲液中。将板在4℃在摇摆平台上孵育15min。在两次洗涤之后，将细胞重悬于200μL FACS缓冲液中，转移到包含150-200μL FACS缓冲液的12个75-mm流动管中，并将管置于冰上。
在孵育之后，将在包含抗体混合物的15-mL管中的细胞通过在4℃以400g离心10min来沉淀，并重悬于FACS缓冲液中以获得浓度为25-50x106个细胞/mL。
CD4+ CD45RBHi T细胞的纯化
CD45RBHi和CD45RBLow群体的细胞分选使用流式细胞术来进行。简言之，未染色细胞的样品用于建立基线自发荧光、以及淋巴样细胞的前向散射与侧向散射门控。单色对照用于设置适用于每一个荧光染料的适当水平的补偿。然而，对于FITC和APC荧光染料，通常不需要补偿。然后单参数直方图(对单线态淋巴样细胞门控)用于门控CD4+(APC+)单线态细胞，并收集第二单线态参数(对CD4+单线态细胞门控)以建立分选门控。CD45RBHi群体被定义为40％的细胞表现出最亮的CD45RB染色，而CD45RBLow群体被定义为15％的细胞具有最暗的CD45RB表达。这些群体的每一个被单独分选，并且CD45RBHi细胞被用于过继转移。
过继转移
将纯化的CD4+ CD45RBHi细胞群体过继转移到6至8周龄的RAG-/-雄性小鼠中。包含分选细胞的收集管用FACS缓冲液填充，并且将细胞通过离心沉淀。然后将上清液弃去，并且将细胞重悬于500mL PBS中。将重悬的细胞转移到注射管中，其中每管最多5×106个细胞，并用冷PBS稀释至1×106个细胞/mL的最终浓度。将注射管保存在冰上。
在注射之前，将接受者小鼠称重，并将注射管轻轻倒置数次以混合细胞。将混合细胞(0.5mL，～0.5x106个细胞)小心地吸入到具有附着的26G3/8针的1-mL注射器中。然后将细胞腹膜内注射到接受者小鼠中。
实施例17.遗传工程化的细菌在CD45RBHi T细胞转移模型中的功效
为了确定本公开的遗传工程化的细菌是否在CD45RBHi T细胞转移小鼠中有效，过继转移之后的疾病进展通过基于每周称重每一只小鼠来监测。通常，在转移后的前3周内观察到适度的体重增加，随后在接下来的4-5周内缓慢但逐渐体重减轻。体重减轻通常伴随稀便(loose stools)和腹泻的出现。
在转移后第4或5周时，随着接受者小鼠开始发展疾病征象，将实施例1中描述的遗传工程化的细菌在补充有适当抗生素的LB中生长过夜。然后将细菌在包含选择性抗生素的新鲜LB中以1:100进行稀释，生长至光密度为0.4-0.5，并且通过离心沉淀。将细菌重悬于PBS中，并且将100μL细菌(或媒介物)通过口服管饲施用至CD45RBHi T细胞转移小鼠。细菌治疗被每天重复一次，持续1-2周，然后将小鼠安乐死。鼠结肠组织使用以上描述的程序分离并分析。
实施例18.遗传工程化的细菌在IBD遗传小鼠模型中的功效
可以在IBD的遗传(包括同类系和遗传修饰)动物模型中测试实施例1中描述的遗传工程化的细菌。例如，IL-10为抗炎细胞因子，并且编码IL-10的基因为克罗恩病和溃疡性结肠炎两者的易感性基因(Khor等，2011)。IL-10或其受体的功能损伤已经用于产生用于炎症研究的几种小鼠模型(Bramhall等，2015)。在正常条件下圈养的IL-10敲除(IL-10-/-)小鼠发展消化道中的慢性炎症(Iyer和Cheng,2012)。
为了确定本公开内容的遗传工程化的细菌在IL-10-/-小鼠中是否有效，使细菌在补充有适当抗生素的LB中生长过夜。然后将细菌在包含选择性抗生素的新鲜LB中以1:100进行稀释，生长至光密度为0.4-0.5，并且通过离心沉淀。将细菌重悬于PBS中，并且将100μL细菌(或媒介物)通过口服管饲施用至IL-10-/-小鼠。细菌治疗被每天重复一次，持续1-2周，然后将小鼠安乐死。鼠结肠组织使用以上描述的程序分离并分析。
用于测试遗传工程化的细菌的方案类似于IBD的其他遗传动物模型。此类模型包括，但不限于，转基因小鼠模型，例如，SAMP1/YitFc(Pizarro等，2011)、显性阴性N-钙粘着蛋白突变体(NCADδ；Hermiston和Gordon,1995)、TNFΔARE(Wagner等，2013)、IL-7(Watanabe等，1998)、C3H/HeJBir(Elson等，2000)、和显性阴性TGF-β受体II突变体(Zhang等，2010)；以及敲除小鼠模型，例如，TCRα-/-(Mombaerts等，1993；Sugimoto等，2008)、WASP-/-(Nguyen等，2007)、Mdr1a-/-(Wilk等，2005)、IL-2Rα-/-(Hsu等，2009)、Gαi2-/-(Ohman等，2002),和TRUC(Tbet-/-Rag2-/-；Garrett等，2007)。
实施例19.遗传工程化的细菌在IBD转基因大鼠模型中的功效
可以在IBD的非鼠动物模型中测试实施例1中描述的遗传工程化的细菌。将人类白细胞抗原B27(HLA-B27)和人类β2-微球蛋白基因引入Fisher(F344)大鼠诱导GI道中的自发性慢性炎症(Alavi等，2000；Hammer等，1990)。为了研究本发明的遗传工程化的细菌是否能够改善该模型中的消化道炎症，使细菌在补充有适当抗生素的LB中生长过夜。然后将细菌在包含选择性抗生素的新鲜LB中以1:100进行稀释，生长至光密度为0.4-0.5，并且通过离心沉淀。将细菌重悬于PBS中，并且将100μL细菌(或媒介物)通过口服管饲施用至转基因F344-HLA-B27大鼠。细菌治疗被每天重复一次，持续2周。
为了确定细菌治疗是否降低了在25周龄时的F344-HLA-B27大鼠中通常存在的总体和组织学肠病变，所有动物在初始治疗之后在第14天时被处死。然后将GI道从Treitz的韧带至直肠切除，沿着肠系膜对缘(antimesenteric border)打开，并使用平板扫描仪成像。使用标准图像分析软件定量总粘膜损伤，其被报告为占损伤的总表面积的百分比。
对于显微分析，从小肠和大肠的正常和患病区域两者切除样品(0.5-1.0cm)。将样品固定于福尔马林中并包埋于石蜡中，然后处理切片(5μm)用于H&E染色。对染色的切片进行分析并如下评分：0，无炎症；1，延伸到粘膜下层的轻度炎症；2，延伸到固有肌层的中度炎症；和3，严重炎症。将评分组合并报告为平均值±标准误差。
实施例19.丁酸产生细菌菌株降低了低剂量DSS诱导的IBD小鼠模型中的消化道炎症
在第0天，将40只C57BL6小鼠(8周龄)称重，并随机分为以下5个处理组(每组n＝8)：H2O对照(第1组)；0.5％DSS对照(第2组)；0.5％DSS+100mM丁酸(第3组)；0.5％DSS+SYN94(第4组)；以及0.5％DSS+SYN363(第5组)。在随机分组之后，将用于第3组的笼水更换为补充有丁酸(100mM)的水，并且第4组和第5组通过口服管饲分别施用100μL的SYN94和SYN363。在第1天，第4组和第5组在早上用细菌管饲，称重，并在晚上再次管饲。第4组和第5组还在第2天和第3天被每天一次管饲。
在第4天，第4组和第5组用细菌管饲，并然后将所有小鼠称重。将笼水更换为H2O+0.5％DSS(第2组、第4组和第5组)、或补充有100mM丁酸的H2O+0.5％DSS(第3组)。来自第4组和第5组的小鼠在晚上再次被管饲。在第5-7天，第4组和第5组在早上用细菌管饲，称重，并在晚上再次管饲。
在第8天，将所有小鼠禁食4小时，并且第4组和第5组在去除食物之后立即用细菌管饲。然后将所有小鼠称重，并用单剂量的FITC-葡聚糖示踪物(4kDa，0.6mg/g体重)管饲。收集粪粒；然而，如果结肠炎足够严重而阻止粪便收集，则在安乐死之后收获粪便。在FITC-葡聚糖施用之后精确地3小时将所有小鼠安乐死。然后将动物心脏放血，并处理血液样品以获得血清。小鼠脂质运载蛋白2、钙防卫蛋白和CRP-1的水平通过ELISA定量，并且FITC-葡聚糖的血清水平通过分光光度法分析(另参见实施例8)。
图27示出了如在研究的第8天通过ELISA显示的所有处理组中的脂质运载蛋白2(LCN2)水平。由于LCN2为炎性疾病活性的生物标志，所以这些数据表明SYN363在低剂量DSS诱导的IBD小鼠模型中产生足够的丁酸显著降低LCN2浓度以及消化道炎症。
实施例20.一氧化氮诱导型报告物构建体
合成ATC和一氧化氮诱导型报告物构建体(Genewiz,Cambridge,MA)。当由这些构建体的同源诱导物诱导时，这些构建体表达GFP，这通过分别在395/509nm的激发/发射在读板器中监测荧光来检测。使携带具有对照、ATC诱导型Ptet-GFP报告物构建体或一氧化氮诱导型PnsrR-GFP报告物构建体的质粒的Nissle细胞首先生长至早期对数期(OD600为约0.4-0.6)，在该早期对数期点将Nissle细胞转移至包含LB和2倍减少的诱导物(ATC或长半衰期NO供体，DETA-NO(Sigma))的96孔微量滴定板中。ATC和NO两者均能够跨越一系列浓度范围在它们各自构建体中诱导GFP的表达(图28)；启动子活性被表示为相对荧光单位。示出了一氧化氮诱导型报告物构建体的示例性序列。bsrR序列被加粗。gfp序列被加下划线。PnsrR(NO调节的启动子和RBS)被加斜体。组成型启动子和RBS被
当由这些构建体的同源诱导物诱导时，这些构建体导致高水平的GFP表达，这通过分别在395/509nm的激发/发射在读板器中监测荧光来检测。使携带具有ATC诱导型Ptet-GFP报告物构建体或一氧化氮诱导型PnsrR-GFP报告物构建体的质粒的Nissle细胞首先生长至早期对数期(OD600＝～0.4-0.6)，在该早期对数期点将Nissle细胞转移至包含LB和2倍减少的诱导物(ATC或长半衰期NO供体，DETA-NO(Sigma))的96孔微量滴定板中。观察到ATC和NO两者均能够跨越宽泛范围浓度在它们各自构建体中诱导GFP的表达。启动子活性被表示为相对荧光单位。
图29示出了携带一氧化氮诱导型NsrR-GFP报告物融合物的NO-GFP构建体(斑点印迹)大肠杆菌Nissle在补充有卡那霉素的LB中生长过夜。然后将细菌以1:100稀释到包含卡那霉素的LB中，并生长至光密度为0.4-0.5，并且然后通过离心沉淀。将细菌重悬于磷酸盐缓冲盐水中，并且将100微升通过口服管饲施用至小鼠。在细菌管饲之前，通过用2％-3％葡聚糖硫酸钠持续7天补充饮用水，在小鼠中诱导IBD。在管饲后4小时时，将小鼠处死，并且将细菌从结肠样品中回收。将结肠内含物在SDS中煮沸，并且可溶性级分用于进行斑点印迹以用于GFP检测(NsrR调节的启动子的诱导)。GFP的检测通过缀合至HRP(辣根过氧化物酶)的抗-GFP抗体的结合来进行。检测使用Pierce化学发光检测试剂盒来可视化。在图中示出了，NsrR调节的启动子在DSS处理的小鼠中被诱导，但显示在未处理的小鼠中未被诱导。这与响应于NO的NsrR以及因此对炎症的作用是一致的。
使携带表达在组成型启动子的控制下的NsrR和在NsrR诱导型启动子的控制下的报告物基因gfp(绿色荧光蛋白)的质粒的细菌在补充有卡那霉素的LB中生长过夜。然后将细菌以1:100稀释到包含卡那霉素的LB中，并生长至光密度为约0.4-0.5，并且然后通过离心沉淀。将细菌重悬于磷酸盐缓冲盐水中，并且将100微升通过口服管饲施用至小鼠。在细菌管饲之前，通过用2％-3％葡聚糖硫酸钠持续7天补充饮用水，在小鼠中诱导IBD。在管饲后4小时时，将小鼠处死，并且将细菌从结肠样品中回收。将结肠内含物在SDS中煮沸，并且可溶性级分用于进行斑点印迹以用于GFP检测(NsrR调节的启动子的诱导)。GFP的检测通过缀合至HRP(辣根过氧化物酶)的抗-GFP抗体的结合来进行。检测使用Pierce化学发光检测试剂盒来可视化。图15示出了，NsrR调节的启动子在DSS处理的小鼠中被诱导，但在未处理的小鼠中未被诱导。

Claims (25)

1.一种遗传工程化的细菌，所述遗传工程化的细菌包含：
a)第一启动子，所述第一启动子由外源环境条件诱导并被可操作地连接至以下的一种或更多种：
i.编码非天然抗炎分子的第一基因；
ii.编码非天然消化道屏障功能增强分子的第一基因；以及
iii.编码生物合成途径的基因盒，其中所述生物合成途径的最终产物选自由以下组成的组：抗炎分子和消化道屏障功能增强分子。
2.如权利要求1所述的细菌，其中所述第一启动子在低氧或厌氧条件下被诱导。
3.如权利要求2所述的细菌，其中在低氧或厌氧条件下被诱导的所述第一启动子为FNR响应性启动子、ANR响应性启动子或DNR响应性启动子。
4.如权利要求3所述的细菌，其中所述第一启动子为FNR响应性启动子。
5.如权利要求1所述的细菌，其中所述第一启动子由活性氮类的存在诱导。
6.如权利要求1所述的细菌，其中所述第一启动子由活性氧类的存在诱导。
7.如权利要求1-6中任一项所述的细菌，其中所述第一基因和/或所述基因盒位于所述细菌中的染色体上。
8.如权利要求1-7中任一项所述的细菌，其中所述第一基因和/或所述基因盒位于所述细菌中的质粒上。
9.如权利要求1-8中任一项所述的细菌，其中所述抗炎分子和/或所述消化道屏障增强分子选自短链脂肪酸、丙酸、丁酸、乙酸、IL-10、IL-27、TGF-β2、TGF-β1、GLP-2、NAPE、弹性蛋白酶抑制剂和三叶因子。
10.如权利要求1-8中任一项所述的细菌，其中所述抗炎分子和/或所述消化道屏障增强分子选自针对选自TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、CXCL-8和CCL2的促炎分子的scFv、反义RNA、siRNA和shRNA。
11.如权利要求1-10中任一项所述的细菌，其中所述细菌为益生细菌。
12.如权利要求11所述的细菌，其中所述细菌选自由以下组成的组：拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)、埃希氏菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)。
13.如权利要求12所述的细菌，其中所述细菌为大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株Nissle。
14.如权利要求1-13中任一项所述的细菌，其中所述细菌为当所述细菌存在于哺乳动物消化道中时被补充的基因的营养缺陷型。
15.如权利要求14所述的细菌，其中哺乳动物消化道为人类消化道。
16.如权利要求14或15所述的细菌，其中所述细菌为二氨基庚二酸的营养缺陷型或胸腺嘧啶生物合成途径中的酶的营养缺陷型。
17.如权利要求1-16中任一项所述的细菌，其中所述细菌被进一步工程化为携带编码对所述细菌有毒性的物质的第二基因，其中所述第二基因在由非天然存在于哺乳动物消化道中的环境因素直接或间接诱导的第二启动子的控制下。
18.如权利要求1-17中任一项所述的细菌，其中所述细菌被进一步工程化为携带编码对所述细菌有毒性的物质的第三基因，其中所述第三基因在所述第一启动子的控制下，并且其中所述毒性物质的表达与所述抗炎分子、所述消化道屏障增强分子或编码所述生物合成途径的基因盒的表达相比在时间上延迟。
19.一种药学上可接受的组合物，所述药学上可接受的组合物包含如权利要求1-18中任一项所述的细菌；和药学上可接受的载体。
20.如权利要求19所述的组合物，所述组合物被配制用于口服或直肠施用。
21.一种治疗或预防自身免疫性紊乱的方法，所述方法包括将如权利要求19或20中任一项所述的组合物施用至有相应需要的患者的步骤。
22.一种治疗与消化道炎症和/或受损的消化道屏障功能相关的疾病或状况的方法，所述方法包括将如权利要求19或20中任一项所述的组合物施用至有相应需要的患者的步骤。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述自身免疫性紊乱选自由以下组成的组：急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性白质脑炎、阿狄森氏病、无丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性自主神经异常、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突&神经元神经病变、巴洛疾病、白塞氏病、大疱性类天疱疮、心肌病、卡斯特尔曼病、乳糜泻、美洲锥虫病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多发性骨髓炎(CRMO)、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜性类天疱疮、克罗恩病、耳蜗前庭综合征、冷凝集素疾病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇心肌炎、CREST疾病、特发性混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘性神经病变、疱疹样皮炎、皮肌炎、Devic氏病(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、Dressler综合征、子宫内膜异位、嗜酸粒细胞性食管炎、嗜酸粒细胞性筋膜炎、结节性红斑、实验性变态反应性脑脊髓炎、伊文思综合征、纤维性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、肺出血-肾炎综合征、肉芽肿性多血管炎(GPA)、格雷夫斯病、吉兰巴雷综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠疱疹、低丙种球蛋白血症、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关性硬化性疾病、免疫调节性脂蛋白、包含体肌炎、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型特发性关节炎、幼年型肌炎、川崎综合征、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破裂性脉管炎、扁平苔藓、硬化苔藓、木样结膜炎、线性IgA疾病(LAD)、狼疮(系统性红斑狼疮)、慢性莱姆病、梅尼埃病、微血管性多血管炎、混合性结缔组织病(MCTD)、蚕蚀性角膜炎、Mucha-Habermann疾病、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(Devic’s)、中性粒细胞减少、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌(Streptococcus)相关的儿童自身免疫性神经精神紊乱)、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、扁平部睫状体炎(外周葡萄膜炎)、天疱疮、外周神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型&III型自身免疫性多内分泌腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、孕酮皮炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、雷诺现象、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、莱特尔综合征、复发性多软骨炎、下肢不宁综合征、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、精子&睾丸自身免疫、僵硬人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、交感性眼炎、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、哮喘、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱皮肤病、白癜风和韦氏肉芽肿病。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述自身免疫性紊乱选自由以下组成的组：1型糖尿病、狼疮、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、幼年型关节炎、银屑病、银屑病关节炎、乳糜泻和强直性脊柱炎。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述疾病或状况选自炎性肠病以及腹泻疾病，所述炎性肠病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。
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