JP2022530503A - 遺伝子操作された微生物 - Google Patents

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Abstract

遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）、その組成物および製剤、ならびに前記細菌、組成物、および製剤の活性を（例えば、生細胞計数法を使用して）特性評価、投与、および決定するための方法が開示される。

Description

関連出願へのリファレンス
本申請は、2019年4月29日に申請した米国暫定出願番号62/840,281及び2019年12月11日に申請した米国暫定出願番号62/946,785の利点を主張するものであり、その内容は参照することによりその全体を組み込まれている。
細菌数を測定するために、「広く用いられているゴールドスタンダード法はColonies Forming Units (CFU)」であり、これは分裂中の細菌細胞数に基づく。Hazan他(2012)、96ウェルプレートにおける生菌数のハイスループット判定法であり、Jung and Jung (2016)、オンチップ顕微鏡を用いたリアルタイム細菌マイクロコロニー計数法も参照もされたい。CFU法は、「この方法では生菌のみを計数する」ことから有利であると記載されている。プロバイオティック菌の投与については、「製品1g当たりのコロニー形成単位は重要なパラメータである。最小限の有効濃度に関する情報はまだ不十分であるが、プロバイオティクス製品は106 CFU/mLまたはグラムを最低濃度とすべきであるというのが一般的に受け入れられている。」Kechagia他(2013)、プロバイオティクスの健康上の利益:レビュー。米国食品医薬品局(FDA)による生きたバイオ治療製品に対する最近の指針は同様に、「生きた微生物製品の効力は、一般的に、単位または容量あたり、すなわちコロニー形成単位(CFU)あたりの生存可能な細胞の指標」であり、「臨床開発の初期段階では、力価測定は、CFUの評価であるかもしれない。」FDA Early Clinical Trials with Live Biotical Products: Chemistry, Manufacturing and Control Information: Guidance for Industry (2016年6月)。しかし、臨床効果を得るのに必要な細菌の濃度は、「コロニー形成単位(cfu)の点で100倍以上」の変化する可能性がある。Minelli、Benini (2008)、細菌数とそのプロバイオティック効果との関係。-
いくつかの実施形態において、本開示は、例えば遺伝子操作された細菌のように、目的の治療分子を生産するための1つ以上の遺伝子、およびそれらの組成物および製剤を含む人工微生物、ならびに、例えば、生細胞計数法を用いて、細菌、組成物、および製剤の活性を特徴づけ、投与、および測定をするための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、人工微生物、例えば、遺伝子操作された細菌、組成物、および製剤製造する方法、例えば、本明細書に開示されている生細胞計数法を使用する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示された活性を特徴づける方法、投与する方法、および決定する方法、例えば生細胞計数法を用いてアッセイ、投与、および／または製造された、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌、組成物、および製剤を投与することによって、疾患または障害を患う被験体を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌(例えば、抗癌分子を生産するための遺伝子、例えば、脱アデニル酸シクラーゼ遺伝子またはインターフェロン遺伝子アゴニストの刺激物質を生産することができる酵素や、または改変アルギニン生合成経路をコード化する遺伝子、例えば、欠失アルギニンリプレッサー、改変アルギニンリプレッサー結合部位、および/またはアルギニンフィードバック耐性N-アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異、またはフェニルアラニン代謝酵素を産生するための遺伝子を含む)、本明細書に開示されている活性を特徴づけ、投与し、および測定する方法を用いてアッセイ、投与、および／または製造されたそれらの組成物および製剤、例えば生細胞計数法は、疾患または障害、例えば、代謝性疾患、癌などに罹患している被験体を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態において、微生物、組成物、または製剤は、患者の高フェニルアラニン血症を減少させることができ、および/または高フェニルアラニン血症、例えばフェニルケトン尿症(PKU)に関連する疾患または障害を治療することができる。いくつかの実施形態において、微生物、組成物、または製剤は、患者の中にある過剰なアンモニアを減少させることができ、および/または高アンモニア血症、例えば尿素サイクル異常症(UCD)または癌に関連する疾患または障害を治療することができる。いくつかの実施形態において、微生物、組成物、または製剤は、抗癌分子、例えば、脱アデニル酸シクラーゼ、またはインターフェロン遺伝子(STING)アゴニストの刺激因子を産生し、および/または癌を治療することができる酵素を生産することができる。
本開示は、例えば生細胞計数によって、微生物、例えば遺伝子操作された細菌の活性を特徴づけ、投与し、決定するための方法を記載している。ここで開示される生細胞計数法は、生分裂細胞ならびに生非分裂細胞の数を決定することを含む。対照的に、コロニー形成単位(CFU)方法は一般的に、生分裂細胞を補完するが、生非分裂(すなわち、非コロニー形成)細胞は補完しない。本開示は、生非分裂人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌が、所望の活性、例えば1つ以上の治療用分子を生み出すことが可能であり、したがって分裂する能力を持たないにもかかわらず、生存可能かつ効能であることを実証する。したがって、いくつかの実施形態において、微生物の活性を特徴づけ、投与し、および測定するための方法、例えば、本明細書に開示されている生細胞計数法は、改良された、例えば、CFU係数法よりもより正確な、所望の活性の測定、例えば、治療用分子の製造または機能を提供する。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌の凍結乾燥組成物および製剤は、微生物の活性を特徴づけ、投与、および測定するための方法、例えば、本明細書に開示されている生細胞計数法によってアッセイされ、非凍結乾燥細菌の効力と同等またはそれ以上の効力を有する。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌、および生細胞計数法によってアッセイされた組成物およびその製剤は、安定した貯蔵寿命を有する。いくつかの実施形態において、生細胞計数法は、改良された、例えば、CFU法よりもより正確な、細菌活性の測定、治療用量、および/または治療効果を提供する。いくつかの実施形態において、生細胞計数は、CFU法よりもバクテリアを製造および/または投薬するための改良された方法をもたらす。
図1は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患、例えばPKUの治療のための遺伝子操作された細菌の概略図を示す。また、図1には、遺伝子操作された細菌の量を増加させて投与された被験体におけるトランス桂皮酸(TCA)の形成を示すグラフ、および遺伝子操作された細菌の量を増加させて投与された被験体における馬尿酸(HA)の排泄を示すグラフが示されている。Isabella他、(2018)「ヒト代謝疾患フェニルケトン尿症のための合成生細菌治療剤の開発」を参照されたい。これらの内容は、参考文献により全体が組み込まれている。 図2は、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物を製造する処理のための模式図を示す。 図3は、凍結、凍結乾燥、または噴霧乾燥された遺伝子操作された細菌の透過型電子顕微鏡(TEM)画像を示す。表は、凍結、凍結乾燥、または凍結噴霧乾燥した細菌組成物の総細胞数、生細胞数、CFU数を示す。TEMを用いてバクテリアの細胞膜一体性を特徴付ける方法は、当技術分野で公知である。例えば、Tian他、(2005)「透過型電子顕微鏡によるWautersia eutropha H16におけるポリヒドロキシ酪酸顆粒形成の速度論的研究」を参照されたい。これらの内容は、以下にその全体を参考にして組み込まれている。 図4Aは、フェニルアラニンが消費され、TCAおよびフェニルピルビン酸(PP)がインビトロで生産される割合を示すグラフを表す。割合は細胞数に正規化される。図4Bは、胃腸管をシミュレーションするために使用されるIn Vitro模擬(IVS)腸管モデルを表す概略図、ならびにフェニルアラニンを代謝するために遺伝子操作された(凍結または凍結乾燥された)細菌と比較して、野生型大腸菌ニッスル株(EcN)によるTCA生産を示すグラフを含む。割合は、細胞の総数および生細胞の数に対して標準化されたものを示す。図4Cは、未変性の大腸菌(SYN094)および(凍結、凍結乾燥、または凍結噴霧乾燥された)フェニルアラニン(SYNB1618)を代謝するように遺伝子操作された細菌による模擬腸液(SGF)中でPheが消費される割合を示す棒グラフを表している。 図5Aは、フェニルアラニン代謝菌SYNB1618(凍結、凍結乾燥、または凍結噴霧乾燥された)を持つマウスにおけるin vivo活性を示すグラフを表している。全てのグループのマウスに、ほぼ同じ生細胞数を有する細菌組成物を投与した。図5Bは、フェニルアラニン代謝菌(凍結または凍結乾燥された)を持つヒト以外の霊長類(NHP)におけるin vivo活性を示す。NHPsの全てのグループに、ほぼ同じ生細胞数を有する細菌組成物を投与した。棒グラフは、単一の時点で測定された尿のHA濃度を示している。散布図は、複数の時点で測定したフェニルアラニン濃度を示している。 図6Aは、フェニルアラニン(SYNB1618)を代謝するように遺伝子操作された、凍結、噴霧乾燥、または凍結乾燥された細菌についてのCFU/mL、生細胞/mLおよび生細胞/CFUを示す表を示している。図6Bは、フェニルアラニン代謝SYNB1618(凍結または噴霧乾燥)を投与したマウスで排泄された尿中HAの量を示す棒グラフを示す。全てのグループのマウスに、ほぼ同じ生細胞数を有する遺伝子操作された細菌の組成物を投与した。図6Cは、フェニルアラニンを分解するように遺伝子操作された細菌を含む製剤を投与されたマウスにおいて排泄されたHAの量を示す棒グラフを示しており、ここでの製剤は、凍結、凍結乾燥、または凍結噴霧乾燥された細菌を含む。全3グループのマウスに同じ生細胞数を投与した。 図7Aは、同じ方法(固形バッチ)を用いて調製した3つのバッチのフェニルアラニン代謝細菌の安定性を示すグラフを示す。ここで、生存率%は、生細胞数を総細胞数で除したものとして計算される。バクテリアを2-8oCの間に保存した。図7Bは、室温で保存された凍結乾燥された細菌の安定性を示す。 図8は、同じ方法(固形バッチ)を用いて調製した3つのバッチのフェニルアラニン代謝細菌の生存率を示す。ここで、生存率は、配合1g当たりの生細胞数によって測定される。フェニルアラニンが消費され、TCAが生産されるIn vitro速度、マウスの尿中HA量も示されている。 図9は、In Vitro模擬(IVS)腸モデルの概略図を示す。 図10は、液体製剤を用いた尿中馬尿酸(HA)および標識D5-HAを示す。CFBは基線からの変化である。CFPはプラセボからの変化である。HVは健常なボランティアである。PKUはフェニルケトン尿症患者である。 図11は、固形経口(凍結乾燥)製剤を用いた尿中馬尿酸(HA)および標識D5-HAを示す。CFBは基線からの変化である。CFPはプラセボからの変化である。 図12A～Iは、Sytox Green濃度および培養時間の範囲にわたる、高フェニルアラニン血症、例えばPKUに関連する疾病治療のための例示的な遺伝子操作された細菌の生細胞計数を示す。総細胞/mL、生細胞/mLおよび生存率%を算出した。 図13A～Fは、UCDを処理するための例示的な遺伝子操作された細菌(SYNB1020)およびSytox Green濃度および培養時間の範囲にわたる癌を治療するためのdacAを含む例示的な遺伝子操作された細菌(SYNB1891)の生細胞計数を示す。総細胞/mL、生細胞/mLおよび生存率%を算出した。 図14A～Cは、生細胞計数を用いて、凍結液体形態でPKUを処理するための例示的な遺伝子操作された細菌の測定を示す。33個の複製物の平均総細胞数、死細胞数および生細胞数/mLを算出した。 図15A～Gは、PKUを処理するための例示的遺伝子操作された細菌(SYNB1618)、ならびに癌を治療するためのdacAを含む例示的遺伝子操作された細菌(SYNB1891)を用いて、希釈の範囲にわたって生細胞/mLの線形性を示す。また、生きた試料に比例した量の死細胞を加えることで、生存率測定の直線性を分析した。
本開示は、特に、人工微生物、例えば、目的の治療分子や組成物、および製剤を生産するための1つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌や、例えば生細胞計数法を用いて、細菌、組成物、および製剤の活性を特徴付け、投与し、および/またはアッセイするための方法、例えば生細胞計数法を用いて、活性を特徴づけ、投与し、アッセイする方法を用いて測定された細菌、組成物、および製剤を投与することによって疾患または障害を治療するための方法に関するものである。ある側面では、生細胞計数法は、例えば遺伝的に操作された細菌細胞のように、分裂細胞ならびに非分裂細胞の両方を補完する。細菌は生分裂しているもの、生分裂していないもの、あるいは生きていないものと分裂していないもの(たとえば死んでいるもの)がある。いくつかの実施形態において、例えば、生細胞カウント法といった方法は、CFU法と比較して、細菌活性、投薬、および/または治療効果のより正確な尺度を提供する。いくつかの実施形態において、例えば生細胞カウント法といった方法は、CFU法と比較して、細菌を製造し、投薬するためのより効率的な方法を提供する。
開示をより容易に理解できるようにするために、まず特定の用語を定義する。これらの定義は、開示の残りの部分に照らして読み、当業者が理解するものでなければならない。特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。詳細な説明の全体にわたって、追加の定義を述べる。
本明細書中で使用される「生細胞数測定法」または「生細胞数測定法」とは、試料中に存在する生細胞、例えば細菌細胞の数を測定するための方法、例えば顕微鏡的方法を指す。いくつかの実施形態において、生細胞数測定法は、生細胞と非生細胞を区別するために蛍光色素を使用する。「生細胞数」とは、生細胞数測定法によって測定されるように試料中に存在する生細胞の数を意味する。いくつかの実施形態において、生細胞数は、生きている分裂細胞ならびに生きているおよび生きている非分裂細胞を含む。いくつかの実施形態において、生細胞数、例えば医薬組成物の数は、CFU数よりも所望の細胞活性のより正確な測定を提供する。
本明細書中で使用される、「生きている」または「生きている」細胞とは、(1)無傷の膜を有し、例えば、分裂細胞とほぼ同様の膜透過性を示し、(2)細胞外環境に比べて減少する細胞内環境を有し(一方、非生物の細胞は、細胞外環境のそれと区別できない細胞内減少環境を有し得る)、(3)膜電位を維持する能力、および/または(4)プロトン勾配を維持する能力を有する細胞を意味する。いくつかの実施形態において、生細胞は、例えば、適切な制御のもの、例えば分裂細胞とほぼ同様の膜透過性を示す無傷の膜を有し、膜電位を維持する能力を有する。「非生物の」細胞とは、上記の特性の1つ以上を欠く、例えば、細胞膜の完全性が損なわれている細胞を意味する。いくつかの実施形態において、生細胞は、非分裂細胞と同様に分裂細胞を含むが、非生物、非分裂細胞(例えば、細胞膜の完全性が低下した、非生物の非分裂細胞)を除外する。いくつかの実施形態において、細胞膜の完全性は、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて特徴づけることができ、その方法は当該技術分野で公知である。例えば、Tian他、(2005)「透過型電子顕微鏡によるWautersia eutropha H16におけるポリヒドロキシ酪酸顆粒形成の速度論的研究」を参照されたく、これらの内容は、以下にその全体を参考にして組み込まれている。いくつかの実施形態において、細胞膜の完全性は、蛍光色素に対する透過性に基づいて特徴づけられることができ、ここで、細胞膜の完全性が損なわれた細胞のみが色素透過性を示す。
本明細書中で用いられる「生存率」または「生存可能率」は、細胞の総数で割った生細胞の数を意味する。
本明細書中で用いる「分裂細胞」は、分裂可能な細胞、例えば、固形培地上に播種された場合にバクテリアコロニーを形成する細胞を指す。「非分裂細胞」は、分裂可能でない細胞、例えば、固形培地上に播種された場合にバクテリアコロニーを形成しない細胞を指す。いくつかの実施形態において、非分裂細胞は生細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、非分裂細胞、例えば医薬組成物中の細菌細胞は、治療用分子を産生することができる。したがって、例えば治療用細菌組成物中の生きている分裂細胞ならびに生きている非分裂細胞の数を計数することは、他の方法、例えばCFUよりもより正確な活性の測定値を提供し得る。いくつかの実施形態において、生きている、非分裂細胞は、分裂することができないにもかかわらず、所望の分子、例えばフェニルアラニンアンモニアリアーゼを産生する能力に関して活性である。いくつかの実施形態において、生きている非分裂細胞は、還元性環境を有し、細胞膜電位を維持し、および/または機能的代謝などを有することができる。
本明細書中で使用される「総細胞」は、試料中の生細胞および非生細胞の合計を意味する。
いくつかの実施形態において、本開示の人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、疾患または障害の治療のための1以上の遺伝子、例えば外来遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、1つ以上の遺伝子は、所望の分子、例えば治療用分子、例えばフェニルアラニン代謝酵素をコード化する。いくつかの実施形態において、遺伝子は、所望の分子、例えば治療用分子、例えば酪酸を生産するための生合成経路をコード化し、遺伝子カセットと呼ぶことができる。
本明細書中で使用される場合、「治療」分子、例えばタンパク質は、被験体において治療効果を生じることができる分子を意味する。例えば、IL-10のような治療用分子は、被験体において炎症を減少させることができる可能性がある。いくつかの実施形態において、治療用分子は、被験体中の1つ以上の有害分子を減少させることが可能であり、例えば、フェニルアラニン代謝酵素は、PKUを有する被験体中の過剰で有害なフェニルアラニンを代謝することが可能である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、1つ以上の治療用分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、被験体に投与する前に1つ以上の治療用分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、被験体への投与後、に1つ以上の治療用分子を発現し、例えば、治療用分子を産生するための遺伝子は被験体への投与後に誘導される。
本明細書で使用される「活性」とは、分子、細胞または組成物、例えば細菌または細菌組成物の出力などの所望のパラメータを意味する。いくつかの実施形態では、「治療活性」とは、例えば細胞モデル、動物モデル、または人間の患者においてin vitroまたはin vivoで測定されるように、細胞からの所望の治療分子の生産を意味する。いくつかの実施形態において、活性は、細胞からの所望の治療分子の量または機能を指す。いくつかの実施形態において、活性は、1つ以上の所望の治療分子が生産される速度を指す。いくつかの実施形態において、活性は、例えば有害化合物または中間体のレベルによって測定されるように、1つ以上の有害化合物、例えば細胞外の有害化合物が代謝または減少する割合を指す。
いくつかの実施形態において、「効力」は、例えばCFU数、総細胞数、または生細胞数によって測定されるような、集団または所定の細胞数に対する活性を意味する。いくつかの実施形態において、効力は、例えば組成物中の細胞の数によって乗算された活性を意味する。いくつかの実施形態において、効力は、細胞の所定の質量、例えば重量について観察される活性を指す。いくつかの実施形態において、効力は、所定の容積の細胞について観察される活性を指す。
本明細書中で使用される「正確度」とは、測定、例えば細胞数が、本明細書に記載されるように活性と相関する程度を意味する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌の生細胞数は、CFU数と比較して、より正確な活性の測定値、例えば治療用分子機能を提供する。いくつかの実施形態において、生細胞計数は、CFU計数よりも、より良く、例えば、より正確に、対象における活性、治療活性、および/または治療効果を反映する。したがって、いくつかの実施形態において、生細胞計数による投与は、CFU計数よりも、例えばより正確に改善される。
本明細書中で用いられる「CFU」は、CFUカウント法によって決定されるコロニー形成単位を意味する。「CFU計数」は、試料中に存在するCFUの数を意味する。理論に拘束されることなく、CFUは大まかに1つの分裂細胞によって形成されるので、CFU計数は一般的に組成物中に存在する分裂細胞数を示す指標と考えられている。一般的に、CFU計数は生きた分裂細胞を含むが、生きた非分裂細胞を除外する。
本明細書中で使用されている細菌組成物の「安定性」とは、所定の期間にわたって組成物が変化する相対的な程度を意味する。いくつかの実施形態において、組成物の安定性は、一定期間にわたる生細胞数の変化によって定義される。いくつかの実施形態において、組成物の安定性は、所定の期間にわたる活性の変化を指す。
「フェニルアラニン」と「Phe」は、式C6 H5 CH2CH(NH2)COOHを持つアミノ酸を指すために使用される。フェニルアラニンはチロシン、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリンの前駆体である。L-フェニルアラニンは必須アミノ酸であり、フェニルアラニンの形態は主に食事性タンパク質にみられ、立体異性体であるD-フェニルアラニンは食事性タンパク質に含まれる量が少なく、DL-フェニルアラニンは両方の組み合わせである。フェニルアラニンは、1つ以上のL-フェニルアラニン、D-フェニルアラニン、およびDL-フェニルアラニンを指すことがある。
「フェニルアラニン代謝酵素」または「PME」は、フェニルアラニンを分解することができる酵素を意味するために使用される。当該技術分野で公知の任意のフェニルアラニン代謝酵素は、人工微生物、遺伝子操作された細菌によってコード化され得る。PMEには、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)、アミノトランスフェラーゼ、L-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
「フェニルアラニンアンモニアリアーゼ」および「PAL」は、フェニルアラニンをトランス-桂皮酸およびアンモニアに変換または処理するフェニルアラニン代謝酵素(PME)を指すために使用される。トランス桂皮酸は毒性が低く、哺乳動物の肝酵素によって馬尿酸に変換され、馬尿酸が尿中に分泌される。PALは、過剰なフェニルアラニンを代謝する酵素PAHの代わりに使われることがある。PAL酵素活性はTHB補因子活性を必要としない。いくつかの実施形態において、PALは、原核生物種に由来するPAL遺伝子によってコード化される。別の実施形態では、PALは、真核生物種に由来するPAL遺伝子によってコード化される。いくつかの実施形態において、PALは、アクロモバクター・キシロソクシダンス、緑膿菌、フォトダブラス発光、アナベナ バリアビリス、およびアグロバクテリウム ツメファシエンスを含む細菌種に由来するPAL遺伝子によってコード化されるが、限定されるわけではない。いくつかの実施形態において、PALは、アナベナ バリアビリスに由来するPAL遺伝子によってコード化され、本明細書では「PAL1」(Moffitt他、2007)と称される。いくつかの実施形態において、PALは、フォトダブラス発光に由来するPAL遺伝子によって符号化され、本明細書では「PAL3」(Williams他、2005)と称される。いくつかの実施形態において、PALは、酵母種、例えば油脂生産酵母 (Gilbert他、1985)に由来するPAL遺伝子によって符号化される。いくつかの実施形態において、PALは、植物種、例えばシロイヌナズナに由来するPAL遺伝子によってコード化される(Wanner他、1995)。PALの任意の適当なヌクレオチドおよびアミノ酸配列、またはその機能性断片を使用することができる。
「L-アミノ酸デアミナーゼ」及び「LAAD」は、L-アミノ酸の立体特異的な酸化的脱アミノ化を触媒し、それぞれのケト酸、アンモニア及び過酸化水素を生成する酵素をいう。例えば、LAADはフェニルアラニンからフェニルピルビン酸への変換を触媒する。複数のLAAD酵素が当該技術分野で知られており、その多くはプロテウス、プロビデンシア、モルガネラ、またはヴェノム等のバクテリアに由来する。LAADは、フェニルアラニン劣化の速い反応速度を特徴とする(Hou他.、 Appl Microbiol Technol 2015 Oct; 99(20): 8391-402; 「Proteus mirabilis由来のL-アミノ酸デアミナーゼを用いたL-フェニルアラニンからのフェニルピルビン酸の製造: 酵素的及び全細胞生体内変換アプローチの比較」)。ほとんどの真核生物と原核生物のL-アミノ酸デアミナーゼは細胞外にあるが、プロテウス属のLAADは細胞膜(内膜)に局在し、酵素活性が存在するペリプラズム空間の外側に面している。この局在化の結果として、内膜を通って細胞質へのフェニルアラニン輸送はProteus LAADが媒介するフェニルアラニン劣化に必要ではない。フェニルアラニンはトランスポーターなしで外膜を通ってペリプラズムに容易に取り込まれ、基質の利用性を向上させるためのトランスポーターの必要性がなくなる。
いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、プロテウス菌、プロビデンシア菌、およびモルガネラ菌を含むがこれらに限定されない細菌種に由来するLAAD遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、細菌種はプロテウス ミラビリスである。いくつかの実施形態において、細菌種はプロテウス ブルガリスである。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌によってコード化されるLAADは、細胞膜に局在化され、ペリプラズム空間に面し、ペリプラズム空間で生じる触媒活性を有する。
本明細書中で使用される、用語「トランスポーター」は、分子、例えばアミノ酸、毒素、代謝産物、基質などを細胞外環境から微生物内に取り込むためのメカニズム、例えばタンパク質またはタンパク質を意味する。たとえば、PhePのようなフェニルアラニントランスポーターはフェニルアラニンを微生物に取り込む。
「フェニルアラニントランスポーター」は、フェニルアラニンを細菌細胞内に輸送することができる膜輸送タンパク質を指すために使用される(例えば、Pi他、1991を参照されたい)。大腸菌においては、pheP遺伝子はフェニルアラニン輸送を担う高い親和性フェニルアラニン比透過酵素を符号化している(Pi他、1998)。いくつかの実施形態において、フェニルアラニントランスポーターは、限定されるわけではないが、アシネトバクター・ カルコアセティカス、サルモネラ菌、および大腸菌を含む細菌種に由来するpheP遺伝子によってコード化される。他のフェニルアラニントランスポーターには、aroP遺伝子によってコード化されるAageneralアミノ酸パーミアーゼがあり、フェニルアラニンを含む3つの芳香族アミノ酸を高い親和性で輸送し、フェニルアラニン輸入の大部分を担うPhePとともに考えられている。加えて、低レベルのフェニルアラニン輸送活性は、LIV‐I/LS系、LIV‐結合蛋白質(LIV‐I系)とLS‐結合蛋白質(LS系)の2つのペリプラズム結合蛋白質、及び膜成分、LivHMGFから成る分岐鎖アミノ酸輸送体の活性に追跡されている。いくつかの実施形態において、フェニルアラニントランスポーターは、細菌種に由来するaroP遺伝子によってコード化される。いくつかの実施形態において、フェニルアラニントランスポーターは、LIV結合タンパク質およびLS結合タンパク質、ならびに細菌種に由来するLivHMGF遺伝子によって符号化される。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、pheP、aroP、およびLIV-I/LSシステムから選択されるひとつの型以上のフェニルアラニントランスポーターを含む。
「フェニルアラニン代謝物」とは、フェニルアラニンの分解の結果として生成される代謝物をいう。代謝物は、フェニルアラニンからフェニルアラニンを基質とする酵素によって直接生成されることもあれば、フェニルアラニン代謝産物基質に作用する代謝経路の下流にある別の酵素によって間接的に生成されることもある。いくつかの実施形態において、フェニルアラニン代謝物は、人工微生物、例えば、PMEを符号化する遺伝子操作された細菌によって産生される。
「高アンモニア血症」、「高アンモニア血症の」、または「過剰アンモニア」とは、体内のアンモニア濃度の上昇を指す。高アンモニア血症は、解毒作用の低下および/またはアンモニア産生の増加によって引き起こされる。解毒作用の低下は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素欠損症、シトルリン血症、N-アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症などの尿素サイクル異常症(UCD)や、肝臓のバイパス、例えば、開肝管、および/またはグルタミン合成酵素の欠損によって生じることがある。例えば、Hoffman他., 2013; Haberle et al., 2013を参照されたい。アンモニアの産生増加は、感染症、薬物、神経因性膀胱、腸内細菌異常増殖によって起こることがある。例えば、Haberle 他., 2013を参照されたい。アンモニアの産生増加は、腫瘍の微小環境とも関連している可能性がある。例えば、Spinelli 他., 2017を参照されたい。高アンモニア血症に関連する他の障害および状態は、肝性脳症、急性肝不全、慢性肝不全などの肝障害を含むが、これらに限定されず、有機酸障害、イソ吉草酸血症、3-メチルクロトニルグリシン尿症、メチルマロン酸血症、プロピオン酸尿症、脂肪酸酸化不良、カルニチンサイクル不良、カルニチン欠乏症、脂肪酸β酸化欠乏症、リジン尿蛋白不耐症、ピロリン-5-カルボキシル化合成酵素欠乏症、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠乏症、炭酸脱水酵素欠乏症、高インスリン-高アンモニア血症症候、ミトコンドリア障害、バルプロ酸療法、アスパラギナーゼ療法、完全非経口栄養、グリシン含有溶液による膀胱鏡検査、肺/骨髄移植後、門脈体循環シャント、尿路感染症、尿管拡張、多発性骨髄腫、および化学療法を含む。例えば、Hoffman他、2013、Haberle他、2013、Pham他、2013、Lazier他、2014を参照されたい。健常被験者では、血漿アンモニア濃度は典型的には約50μmol/L未満である。例えば、Leonard, 2006を参照されたい。いくつかの実施形態において、高アンモニア血症の診断シグナルは、少なくとも約50μmol/L、少なくとも約80μmol/L、少なくとも約150μmol/L、少なくとも約180μmol/L、または少なくとも約200μmol/Lの血漿アンモニア濃度である。例えば、Leonard, 2006; Hoffman他.、2013;Haberle他.,2013を参照されたい。アルギニン生合成を改変する方法、例えば、人工微生物、例えば、遺伝子操作されたバクテリアにおいて、高アンモニア血症を減少させるために、例えば、アルギニンリプレッサーの欠失、アルギニンリプレッサー結合部位の改変、および/またはアルギニンフィードバック耐性N-アセチルグルタミン酸合成酵素を用いる方法は、当該技術分野で公知である。例えば、WO2016200614を参照されたく、これらの含有量は、ここに引用して組み込まれている。
「抗癌分子」とは、細胞成長または複製を減少および/または阻害することができる、例えば遺伝子操作された微生物のような人工微生物によって産生されるべき1つ以上の治療物質または関心のある薬物を意味する。いくつかの実施形態において、抗癌分子は、癌を調節または治療するのに有用な治療分子である。いくつかの実施形態において、抗癌分子は、遺伝子によって符号化される治療用分子である。別の実施形態では、抗癌分子は、生化学的または生合成経路によって産生される治療用分子であり、生合成または生化学的経路は、任意に微生物に対して内因性であり得る。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された微生物は、2つ以上の抗癌分子を産生することができる。抗癌分子の非限定的な例としては、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、CTLA-4抗体、PDL-1抗体、PDL-1抗体)、細胞傷害性薬剤(例えば、Cly A、FASL、TRAIL、TNF-α)、免疫刺激性サイトカインおよび補助刺激分子(例えば、OX40、CD28、ICOS、CCL21、IL-2、IL-18、IL-15、IL-12、IFN-γ、IL-21、TNFs、GM-CSF)、抗原および抗体(例えば、腫瘍抗原、ネオ抗原、CtxB-PSA融合タンパク質、CPV-OmpA融合タンパク質、NY-ESO-1腫瘍抗原、RAF1、免疫抑制分子に対する抗体、抗VEGF、抗CXR4/CXCL12、抗GLP1、抗GLP2、抗ガレクチン1、抗ガレクチン3、抗Tie2、抗CD47、免疫チェックポイントに対する抗体、免疫抑制性サイトカインやケモカインに対する抗体)、DNA導入ベクター（例えば、エンドスタチン、トロンボスポンジン-1、TRAIL、SMAC、Stat3、Bcl2、FLT3L、GM-CSF、IL-12、AFP、VEGFR2)、および酵素(例えば、大腸菌CD、HSV-TK)を含む。いくつかの実施形態において、抗癌分子は、例えばCRISPR干渉のように、RNA干渉、マイクロRNAの反応または抑制、TLR反応、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合(アプタマーまたはデコイオリゴ)、遺伝子編集を媒介する核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、細菌またはウイルスを、例えばバクタ感染により、哺乳動物細胞にDNAを移入するためのベクトルとして使用することができる。例えば、Bernardes 他., 2013を参照されたい。抗癌分子、例えば脱アデニル酸シクラーゼ遺伝子(例えば、リステリア・モノサイトゲネスからのdacA)またはインターフェロン遺伝子の刺激因子(STING)アゴニストを産生することができる酵素を産生することができる、人工微生物、例えば遺伝子操作されたバクテリアは、当該技術分野で公知である。例えば、WO2018129404を参照されたく、これらの含有量は、ここに引用して組み込まれている。
「操作可能に連結された」とは、核酸配列、例えばPALをコード化する遺伝子を指し、核酸配列の発現を可能にする方法で調節領域配列に連結され、例えばシスで作用する。調節領域は、関心の遺伝子の転写を指令し得る核酸であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、反応要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、プロモーター制御要素、タンパク質結合配列、5'および3'非翻訳領域、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、およびイントロンを含み得る。
「誘導性プロモーター」とは、1つ以上の遺伝子に機能的に連結された調節領域を指し、遺伝子の発現は、前記調節領域の誘導物質の存在下で増加する。
いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、その発現が温度感受性メカニズムによって制御される1つ以上の遺伝子を含む。外部化学物質や特殊な媒体を使用せずに強力な転写制御を行うため、体温調節器が有利である(例えば、Nemani他、酵素-プロドラッグ療法のためのマイクロカプセル化E. coliにおけるシトシンデアミナーゼ式を誘導した磁性ナノ粒子による熱中症、J Biotechnol 2015 Jun 10; 203: 32-40、およびその参考文献を参照されたい)。突然変異cI857リプレッサーおよびpLおよび/またはpRファージλ促進剤を用いた体温調節タンパク質式を用いて、組換え細菌株を操作することができる。目的の遺伝子はλプロモーターの下流側でクローニングされ、バクテリオファージλの変異熱不安定性cI857リプレッサーによって効率的に調節することができる。37℃以下の温度では、cI857はpRプロモーターのoLまたはoR領域に結合し、RNAポリメラーゼによる転写を阻止する。より高温では、機能的なcI857二量体が不安定化され、oLまたはoR DNA配列への結合が阻止され、mRNAの転写が開始される。
「酸素量依存性促進剤」または「酸素量依存性調節領域」は、1つ以上の酸素量感知転写因子が結合可能な核酸配列を意味し、転写因子の結合および/または活性化が下流の遺伝子発現を活性化する。
酸素レベル依存性転写因子の実施例としては、FNR、ANR、およびDNRが挙げられるが、これらに限定されない。対応するFNR反応性プロモーター、ANR反応性プロモーター、およびDNR反応性プロモーターは、当該技術分野において公知である(例えば、WO2017087580; Castiglione他、2009、Eiglmeier他、1989、Galimand他、1991、長谷川他、1998、Hoeren他、1993、Salmon他、2003を参照されたい)。いくつかの実施形態において、FNR反応性プロモーターは、環境酸素が低いかまたは全くない条件下で高度に発現されることが知られている大腸菌ニッスルフマル酸および硝酸レダクターゼ遺伝子S(fnrS)に由来するPfnrSである(Durand and Storz, 2010、Boysen他、 2010)。
PMEs及びフェニーラリントランスポーター、並びに上記酵素及びトランスポーターの代表的な例のヌクレオチド及びアミノ酸配列並びに代表的な促進因子は、WO2016183531A1及びWO2017087580A1に提供されており、それらの含有量は、本書ではそれらの全文を参照して盛り込まれている。任意の適当な酵素および/またはフェニルアラニントランスポーターを、人工微生物、例えば、遺伝子操作されたバクテリアにおいて、本開示では使用することができる。1つの実施形態において、1つ以上のPME、例えばPALおよび/またはLAAD、および/またはPheトランスポーター、例えばPheP、および/または転写調節因子、例えばFNRS24Yの式は、1つ以上の熱調節プロモーターによって駆動される。
本明細書中で使用される「非天然」核酸配列とは、細菌中に通常存在しない核酸配列、例えば内在性配列の余分な複写、または細菌の異なる種、株、または亜株由来の配列などの異種配列、または同じサブタイプの細菌由来の未改変配列と比較して改変および/または突然変異される配列を指す。いくつかの実施形態において、非天然核酸配列は合成の非天然配列である。例えば、Purcell他、2013、合成生物学のための全細胞モデリングアプローチに向けてを参照されたい。非天然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセット中の1つ以上の遺伝子であってよい。いくつかの実施形態において、「非天然」は、自然界において互いに同じ関係に見出されない2つ以上の核酸配列を意味する。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、複写数を増強するため、または複数の異なる機能を行う遺伝子カセットの複数の異なる成分を含むために、同じ調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットの複数のコピーを含むように操作される。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば本発明の遺伝子操作されたバクテリアは、自然界では前記遺伝子と関連していない誘導性プロモーターに機能的に連結されているフェニルアラニン代謝酵素を符号化する遺伝子、例えば、PALをコードする遺伝子に機能的に連結されているFNRプロモーター、またはLAADに機能的に連結されているParaBADプロモーターを含む。
「腸」とは、食品の移動や消化、栄養分の吸収、老廃物の排出を担う器官、腺、管、システムを指す。ヒトでは、腸は口から始まり肛門で終わる消化管(GI)からなり、さらに食道、胃、小腸、大腸からなる。腸はまた、脾臓、肝臓、胆嚢、および膵臓などの付属器官および腺からなる。上部消化管は小腸の食道、胃、十二指腸からなる。下部消化管は、小腸の残り、すなわち空腸および回腸、および大腸のすべて、すなわち盲腸、結腸、直腸、および肛門管からなる。細菌は腸全体、例えば消化管、特に腸内に見られる。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、腸において活性である(例えば、1つ以上の異種遺伝子を発現する)。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、大腸において活性である(例えば、1つ以上の異種遺伝子を発現する)。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、小腸において活性である(例えば、1つ以上の異種遺伝子を発現する)。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、小腸および大腸において活性である。
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、遺伝配列、例えば核酸配列を意味する。遺伝子、遺伝子配列又は遺伝子配列は、完全な遺伝子配列又は部分的な遺伝子配列を含むことを意味する。遺伝子、遺伝子配列または遺伝子配列は、タンパク質またはポリペプチドを符号化する配列を含むことを意味し、また、タンパク質またはポリペプチドをコード化しない遺伝子配列、例えば制御配列、リーダー配列、シグナル配列、または他の非タンパク質コード配列を含むことを意味する。
「微生物」とは、通常は単一の細胞からなる顕微鏡的、超顕微鏡的、または超顕微鏡的サイズの生物または微生物を意味する。微生物の例としては、細菌、酵母、ウイルス、寄生虫、真菌、ある種の藻類、および原生動物が挙げられる。いくつかの局面において、微生物は、1つ以上の関心の治療用分子またはタンパク質を産生するように操作される(「人口微生物」)。ある局面において、微生物は、ある種の代謝物または他の化合物をその環境、例えば腸から取り込んで異化するように操作される。ある局面において、微生物は、ある種の有益な代謝物または他の化合物(合成または天然に存在する)を合成し、それらをその環境中に放出するように操作される。ある実施形態では、人工微生物は操作された細菌である。ある実施形態では、人工微生物は、操作された細菌である。
「非病原性」とは、例えば、宿主において疾患または有害な応答を引き起こすことができない細菌などの微生物を意味する。いくつかの実施形態において、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態において、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。いくつかの実施形態において、非病原性細菌は常在細菌であり、常在細菌は腸内の常在微生物群に存在する。非病原性細菌の例としては、バシラス属、バクテロイデス属、ビフィズス菌、ブレビバクテリア、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、エスケリキア属、ラクトバチルス、ラクトコッカス属、サッカロミケス属、およびブドウ球菌、例えば、バチルス コアグランス、枯草菌、バクテロイデス フラジリス、バクテロイデス サブティルス、バクテロイデス テタイオタオミクロン、ビフィドバクテリウムビフィダム、
ビフィドバクテリウムインファンティス、ビフィドバクテリウムロングム、クロストリジウム・ブチリカム、エンテロコッカス フェシウム、大腸菌、ラクトバチルス アシドフィルス、ラクトバチルス ブルガリクス、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチルス ジョンソニー、ラクトバチルス パラカセイ、ラクトバチルス プランタルム、ラクトバチルス ロイテリ、ラクトバチルス ラムノサス、ラクトコッカス ラクチス、およびサッカロマイセス ブラウディが挙げられるが、これらに限定されない。(Sonnenborn他、2009、Dinleyici他、2014、米国特許第6,835,376号、米国特許第6,203,797号、米国特許第5,589,168号、米国特許第7,731,976号)。自然病原性細菌は、病原性を減少または除去するように遺伝子操作され得る。
「プロバイオティック」とは、微生物を適量含む宿主生物に健康上の利益を与えることができる、生きた、非病原性の微生物、例えば細菌を指すために使用される。いくつかの実施形態において、宿主生物は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、宿主生物はヒトである。非病原性細菌のいくつかの種、菌株、および/またはサブタイプは、現在、プロバイオティックとして認識されている。プロバイオティック細菌の例には、ビフィズス菌、大腸菌、ラクトバチルス、およびサッカロミセス、例えば、ビフィズス菌、エンテロコッカスフェシウム、大腸菌、大腸菌ニッスル菌株、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタール、およびサッカロミセス・ボラルディ(Dinleyic他、2014、米国特許第5,589,168号、米国特許第6,203,797号、米国特許第6,835,376号)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。プロバイオティックは、バクテリアの変異株または突然変異株でもあり得る(Arthur他、2012、Cuevas-Ramos他、2010、Olier他、2012、Nougayrede他、2006)。非病原性細菌は、所望の生物学的特性、例えば生存性を増強または改善するように遺伝子操作されてもよい。非病原性細菌は、プロバイオティック特性を提供するように遺伝子操作されてもよい。プロバイオティック細菌は、プロバイオティック特性を増強または改善するために遺伝子操作されてもよい。
本明細書で使用される用語である「治療する」および「調節する」および/またはその同種は、疾患、障害、および/または病態、または少なくともその１つの識別可能な症状の改善を意味する。別の実施形態では、「治療する」および「調節する」とは、少なくとも1つの測定可能な身体パラメータの改善を意味し、必ずしも患者によって識別可能ではない。別の実施形態では、「治療する」および「調節する」とは、疾患、障害、および/または病態の進行を物理的(例えば、識別可能な症状の安定化)、生理学的(例えば、身体パラメータの安定化)、またはその両方の進行を阻害することを意味する。別の実施形態では、「治療する」および「調節する」とは、疾患、障害、および/または病態の進行を遅らせるか、または逆転させることを意味する。本明細書で使用されている「防止する」またはその同種は疾患、障害、および/または病態になる始まりを遅らせ、または上記疾患、障害、または病態になる危険やそのような疾患、障害、および/または病態に関連する兆候を減らすことを意味する。
処置を必要とする人は、既に特定の医学的疾患を有する人、ならびに疾患を有するリスクを有する人、または最終的に疾患を獲得する可能性がある人を含み得る。治療の必要性は、例えば、疾患の発症に関連する1つ以上の危険因子の存在、疾患の存在もしくは進行、または疾患を有する被験体の治療に対する受容性の可能性によって評価される。例えば、一次性高フェニルアラニン血症、例えばPKUは、既知の治療法がない先天性遺伝子突然変異によって引き起こされ、高フェニルアラニン血症は、他の条件、例えば肝疾患に続発する可能性もある。治療には、例えば一次高フェニルアラニン血症における過剰なフェニルアラニンなど、1つ以上の疾患の特徴を軽減または排除することが含まれることがあり、必ずしも基礎疾患の排除を包含するわけではない。
本明細書中で使用される「医薬組成物」とは、生理学的に適切な担体および/または賦形剤のような他の成分を有する本発明の人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌の調製物を意味する。
互換的に使用することができる「生理学的に受容可能な担体」および「薬学的に受容可能な担体」という表現は、生物に重大な刺激を引き起こさず、投与された細菌化合物の生物学的活性および特性を妨げない担体または希釈剤を意味する。補助剤はこれらの表現の下に含まれている。
用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。例としては、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および界面活性剤、例えば、ポリソルベート20が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「治療有効服用量」および「治療有効用量」は、例えば高フェニルアラニン血症のような状態の予防、症状の発症の遅れ、または症状の改善をもたらす化合物の用量を意味するために使用される。治療有効量は、例えば、過剰なフェニルアラニンレベルに関連する疾患または状態の1つ以上の症状の治療、予防、重症度の低減、発症の遅れ、および/または発生リスクの低減に十分な量であり得る。治療上有効な量、ならびに治療上有効な投与頻度は、当該技術分野で公知の方法によって決定することができ、以下で考察する。
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」は、「ポリペプチド」ならびに「ポリペプチド」を含み、アミド結合(すなわち、ペプチド結合)によって直線的に結合されたアミノ酸単量体からなる分子を意味する。用語「ポリペプチド」とは、2つ以上のアミノ酸の任意の鎖または鎖を意味し、製品の特定の長さを意味しない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2つ以上のアミノ酸の鎖を意味するために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または互換的に使用され得る。「ジペプチド」とは、2つの結合したアミノ酸のペプチドを意味する。用語「トリペプチド」とは、3つの結合したアミノ酸のペプチドを意味する。用語「ポリペプチド」はまた、ポリペプチドの発現後の修飾の産物を指すことも意図し、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然型アミノ酸による修飾を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来してもよいし、組換え技術によって製造されてもよい。他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の人工微生物、例えば、遺伝子操作された細菌またはウイルスによって産生される。本発明のポリペプチドは、約3以上、5以上、10以上、20以上、25以上、50以上、75以上、100以上、200以上、500以上、1000以上、または2000以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、必ずしもそのような構造をしているわけではないが、決まった三次元構造をとっている可能性がある。決められた三次元構造をしているポリペプチドは折りたたまれたものとよばれ、決まった三次元構造をもたず、むしろ多数の異なる立体構造をとることができるポリペプチドは折りたたまれていないものとよばれる。用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、タンパク質またはタンパク質の一部に相当するアミノ酸配列を意味することもあれば、非タンパク質配列に相当するアミノ酸配列、例えば、調節ペプチド配列、リーダーペプチド配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列、および他のペプチド配列から選択される配列を意味することもある。
本明細書中で使用される、用語「十分に類似している」とは、第1および第2のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび/または共通の機能活性を有するように、第2のアミノ酸配列に対して十分な数または最小限の同一または同等のアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または少なくとも約100%共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、本明細書中で十分に類似していると定義される。好ましくは、変異体は本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似しているであろう。そのような変異体は、一般的に、本発明のペプチドの機能的活性を保持する。変異体は、天然およびwtペプチドとそれぞれアミノ酸配列が異なるペプチドを含み、1つ以上のアミノ酸欠失、添加、および/または置換を介している。これらは、人工的に設計されたものと同様に、天然に存在する変異体であってよい。
本明細書中で使用される「a」及び「an」は、反対を明確に示しない限り、「少なくとも1つ」を意味するものとして理解されるものである。
"および/または"という表現は、リスト中の元素間で使用される場合、(1)列挙された元素１つしか存在しないこと、または(2)リストの1つ以上の元素が存在すること、のいずれかを意味することを意図している。例えば、"A, B, および/またはC"は、選択がAのみ、Bのみ、Cのみ、AおよびB、AおよびC、BおよびC、またはA、BおよびCである。"および/または"という表現は、リスト中の元素の"少なくとも1つ"または“１つ以上の”と相互に使用されてもよい。
生菌数測定
本開示は、所望の治療用分子およびその組成物および製剤を製造するための1つ以上の遺伝子を含む、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌に関するものである。一つの側面では、細菌、組成物、および製剤の活性を特徴づけ、投与、および決定するための方法、例えば生細胞計数法を用いる方法が提供される。生細胞計数法を用いて、細菌試料中に存在する生細胞の数を測定することができる。具体的には、生細胞計数法を用いて、生きている人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌細胞の数を測定し、そして、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌を投与および/または測定することができる。
いくつかの実施形態において、生細胞計数は、(1)無傷の膜を有し、(2)細胞外環境に対して細胞内環境を減少させ、(3)膜電位を維持する能力を有し、および/または(4)プロトン勾配を維持する能力を有する、生細胞、例えば細菌細胞の数を提供する。いくつかの実施形態において、生細胞計数法は、生分裂細胞および生非分裂細胞を補完する。対照的に、CFU方法は、生きている分裂細胞を含むが、生きている非分裂細胞を除外する。いくつかの実施形態において、生細胞計数は、無傷の膜を有する生細胞、例えば細菌細胞の数を提供し、例えば、適切な制御のものとほぼ同様の膜透過性を示す。
本明細書に開示される、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、1つ以上の所望の治療分子、例えば、被験体において炎症を減少させることができるIL-22分子、またはPKUを有する被験体において有害なフェニルアラニンを代謝することができるフェニルアラニン代謝酵素を産生することが可能である。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌の活性は、所望のパラメータ、例えば、所望の治療分子の製造または機能によって測定され得る。いくつかの実施形態において、活性は、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌における所望の治療分子の産生を指す。いくつかの実施形態において、活性は、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌における所望の治療分子の量または機能を指す。いくつかの実施形態において、活性は、１つ以上の所望の治療分子が産生される割合を指す。いくつかの実施形態において、活性は、例えば有害化合物または中間体のレベルによって測定されるように、1つ以上の有害化合物が代謝または減少する割合を指す。本開示は、CFU法によってではなく、生細胞計数法によって補完される生きている非分裂細胞が、上記所望のパラメータを得ることができることを示している。例えば、生きている非分裂細胞は、分裂してコロニーを形成することができないにもかかわらず、所望のフェニルアラニン代謝酵素を産生し、および/または過剰なフェニルアラニンを減少させることができる(in vitroモデル、in vivoモデル、またはヒト対象)。したがって、いくつかの実施形態において、生細胞計数法は、CFU法よりもバクテリアの活性のより正確な測定を提供する。いくつかの実施形態において、生細胞計数法は、CFU法と比較して、減少したCFU数を提供する。いくつかの実施形態において、生細胞計数法は、CFU法と比較して、CFU数を減少させること、例えば、バクテリアを凍結乾燥すること、またはバクテリアを液体中で凍結することを可能にする。
いくつかの実施形態において、生細胞数は、顕微鏡(例えば、無傷膜によって、例えば、透過型電子顕微鏡によって)、セルメーター、および/または当該技術分野で公知の他の方法を用いて決定される。いくつかの実施形態において、生細胞数は、生細胞または非生細胞を選択的に特定することができる蛍光色素を用いて決定される。いくつかの実施形態において、蛍光色素は、生細胞または非生細胞に選択的に蓄積し、したがって、生細胞または非生細胞の特定を可能にする。いくつかの実施形態において、蛍光色素は、生細胞または非生細胞においてのみ実質的により蛍光性となり、したがって、生細胞または非生細胞の特定を可能にする。いくつかの実施形態において、非生細胞は、細胞膜に透過性でない蛍光色素を用いて生細胞と区別される。いくつかの実施形態において、生細胞は、プロトン勾配を有する細胞を選択的に特定することができる蛍光色素を使用して、非生細胞と区別される。いくつかの実施形態において、組成物の生細胞数は、総細胞数から非生細胞数を差し引くことによって決定することができる。いくつかの実施形態において、蛍光色素はSytoxグリーン染色である。
いくつかの実施形態において、生細胞数は、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌における所望の治療分子の量または機能のより正確な測定値を提供する。いくつかの実施形態において、生細胞数は、所望の治療分子の酵素活性のより正確な測定値を提供する。いくつかの実施形態において、生細胞数は、in vitroで、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌の治療効果のより正確な測定値を提供する。いくつかの実施形態において、生細胞数は、例えば、遺伝子操作された細菌in vivo、例えば、動物モデルまたはヒト対象において、人工微生物の治療有効性のより正確な測定値を提供する。治療効果は、例えば有害化合物の代謝からの有害化合物または中間体のレベルによって測定されるように、1つ以上の有害化合物、例えば、上記化合物が減少または代謝される割合の減少を指すことができる。
本開示によると、アッセイおよび/または投与され得る例示的微生物、例えば、細菌、および組成物は、WO2016090343、WO2016200614、WO2017139697、WO2016183531、WO2017087580、WO2016141108、WO2017074566、WO2017136792、WO2017136795、WO2018129404、WO2019014391、WO2016210384、WO2017123418、WO2017123676、WO2016183531、WO2018237198、WO2016201380、US20170216370、およびWO2017040719において提供され、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、例えば生細胞計数法を用いてアッセイされる人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、非病原性細菌、共生細菌、またはプロバイオティック細菌である。いくつかの実施形態において、例えば生細胞計数法を用いてアッセイされる人工微生物、例えば遺伝子操作されたバクテリアは、抗癌分子、例えば脱アデニル酸シクラーゼ遺伝子またはSTINGアゴニストを産生することができる酵素を産生するための少なくとも1つの遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、例えば生細胞計数法を用いてアッセイされる人工微生物、例えば遺伝子操作されたバクテリアは、改変アルギニン生合成経路、例えば欠失アルギニンリプレッサー、改変アルギニンリプレッサー結合部位、および/またはアルギニンフィードバック耐性N-アセチルグルタミン酸合成酵素突然変異を符号化する遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、例えば生細胞計数法を用いてアッセイされる人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、少なくとも1つのPME、例えばPALおよび/またはLAADを符号化する遺伝子を含み、場合によってはPME遺伝子が誘導性プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、例えば生細胞計数法を用いてアッセイされた人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、非天然PME遺伝子、例えば天然PME遺伝子の追加コピーを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、性質PME遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態において、例えば生細胞計数法を用いてアッセイされる人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニントランスポーター、例えばPhePをさらに含む。いくつかの実施形態において、例えば生細胞計数法を用いてアッセイされる人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、非天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子、例えば天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子の追加コピーを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、自然界においてフェニルアラニントランスポーター遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、低酸素または嫌気性条件下で誘導される熱調節プロモーターまたはプロモーターである。いくつかの実施形態において、例えば生細胞計数法を用いてアッセイされる人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、1つまたは複数の必須遺伝子、例えばthyAまたはdapAの要求株である。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、被験体への投与前に誘導される。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、被験体への投与後に誘導される。
いくつかの実施形態において、本開示は、人工微生物、例えば、本明細書に開示されている遺伝子操作された細菌、および少なくとも1つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物または製剤の活性を決定するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、pH 6～8の領域カバーする生物学的緩衝液中で1～20%トレハロース、1～10%トレハロース、5～15%トレハロース、7～13%トレハロース、9～11%トレハロース、または約10%トレハロースを含み、生物学的緩衝液はPIPES、MOPS、HEPES、および/またはトリス緩衝液であってよい。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～400mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～300mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～200mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～100mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～50mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～10mMのトリス緩衝液を含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、凍結乾燥細菌を含む組成物の活性を測定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、凍結乾燥されたバクテリアの水分率は、約1～10%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～8%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～6%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～5%である。いくつかの実施形態において、水分量は、約3%、約4%、または約5%である。
製法
いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、1つ以上の治療用遺伝子を含み、その組成物および製剤は、本明細書に開示されている活性、例えば生細胞計数を特徴づけ、投与し、そして決定するための方法を用いて製造される。本開示によると製造され得る例示的な微生物、例えば、細菌、ならびに組成物および製剤は、WO2016090343、WO2016200614、WO2017139697、WO2016183531、WO2017087580、WO2016141108、WO2017074566、WO2017136792、WO2017136795、WO2018129404、WO2019014391、WO2016210384、WO2017123418、WO2017123676、WO2016183531、WO2018237198、WO2016201380、US20170216370、およびWO2017040719において提供され、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本開示は、例えば生細胞計数法を用いて測定される非病原性、共生生物、またはプロバイオティクスである人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、抗癌分子、例えば脱アデニル酸シクラーゼ遺伝子(例えば、dacA)またはSTINGアゴニストを産生することができる酵素を産生するための少なくとも1つの遺伝子を含む、人工微生物、例えば、遺伝子操作された細菌を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、改変アルギニン生合成経路、例えば、欠失アルギニンリプレッサー、改変アルギニンリプレッサー結合部位、および/またはアルギニンフィードバック耐性N-アセチルグルタミン酸合成酵素突然変異を符号化する遺伝子を含む、人工微生物、例えば遺伝子操作されたバクテリアを製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、人工微生物、例えば、少なくとも1つのPME、例えばPALおよび/またはLAADをコード化する遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を製造するための方法を提供し、場合によってはPME遺伝子が誘導性プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法によって製造される細菌は、非天然PME遺伝子、例えば天然PME遺伝子の追加コピーを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、本質的にPME遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法によって製造されるバクテリアは、フェニルアラニントランスポーター、例えばPhePをさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法によって製造される細菌は、非天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子、例えば天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子の追加コピーを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、本質的にフェニルアラニントランスポーター遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、低酸素または嫌気性条件下で誘導される熱調節プロモーターまたはプロモーターである。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、被験体への投与前に誘導される。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、被験体への投与後に誘導される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法によって製造される細菌は、1つ以上の必須遺伝子、例えばthyAまたはdapAについての栄養要求株である。
いくつかの実施形態において、本開示は、pH6～8の領域をカバーする生物学的緩衝液中で1～20%トレハロース、1～10%トレハロース、5～15%トレハロース、7～13%トレハロース、9～11%トレハロース、または約10%トレハロースを含む医薬組成物を製造するための方法を提供し、生物学的緩衝液はPIPES、MOPS、HEPES、および/またはトリス緩衝液であってよい。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～400mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～300mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～200mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～100mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～50mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～10mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、凍結乾燥細菌を含む医薬組成物を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、凍結乾燥されたバクテリアの水分率は、約1～10%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～8%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～6%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～5%である。いくつかの実施形態において、水分量は、約3%、約4%、または約5%である。
凍結乾燥
いくつかの実施形態において、本開示は、凍結乾燥された人工微生物、例えば凍結乾燥された遺伝子的に操作された細菌を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、凍結乾燥された人工微生物、例えば凍結乾燥された細菌を製造するための方法は、細菌の凍結組成物と少なくともほぼ等しい生存率および効力をもたらす。
いくつかの実施形態において、凍結乾燥プロセスは、細胞を凍結乾燥緩衝液中に懸濁することを含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥プロセスは、-80℃～-30℃の温度で材料を凍結し、-25℃～-5℃で一次乾燥し、5℃～25℃で二次乾燥することを含む。いくつかの実施形態において、凍結乾燥プロセスは、-15℃での一次乾燥を含む。いくつかの実施形態において、凍結乾燥プロセスは、5℃での二次乾燥を含む。いくつかの実施形態において、凍結乾燥サイクルの終了後、凍結乾燥ケーキを80メッシュのスクリーンでふるいにかけ、自由に流動する粉末にする。
噴霧乾燥
いくつかの実施形態において、噴霧乾燥プロセスは、噴霧乾燥緩衝液中に細胞を懸濁させることを含む。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥プロセスは、110～150℃の入口温度、40～80℃の出口温度を目標とした2流体ノズルを介して細胞を噴霧乾燥することからなり、その結果、自由に流動する粉末が得られる。いくつかの実施形態において、入口温度は120-135o Cである。いくつかの実施形態において、目標出口温度は60o Cである。
凍結液
いくつかの実施形態において、凍結液体プロセスは、細胞を凍結保護緩衝液に浮遊させ、-20oC～200Cで凍結させることを含む。いくつかの実施形態において、細胞懸濁液を-80oCで凍結させる。
遺伝的に操作したバクテリア
本開示は、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌の生細胞数を決定する方法、および組成物、製剤、投薬、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌を製造する方法を、例えば生細胞計数法を用いて決定する方法を提供する。人口微生物、例えば、生細胞計数法を用いてアッセイされ得る、遺伝子操作された微生物、組成物、およびその製剤は、WO2016090343、WO2016200614、WO2017139697、WO20160183531、WO2017087580、WO2016141108、WO2017074566、WO2017136792、WO2017136795、WO20180129404、WO2019014391、WO2016210384、WO2017123418、WO2017123676、WO2016183531、WO2018237198、WO2016201380、US20170216370、およびWO2017040719に記載され、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、所望の治療分子を産生するための1つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、1つ以上の遺伝子は、誘導性プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、治療用分子は、被験体において治療効果を産生することができる。例えば、IL-10のような治療用分子は、被験体において炎症を減少させることが可能であり得る。いくつかの実施形態において、治療用分子は抗癌分子である。いくつかの実施形態において、治療用分子はSTINGアゴニストを産生することができる酵素である。いくつかの実施形態において、治療用分子は、脱アデニル酸シクラーゼ、例えばdacAである。いくつかの実施形態において、治療用分子は、被験体中の1つ以上の有害分子を減少させることが可能であり、例えば、フェニルアラニン代謝酵素は、PKUを有する被験体中の過剰で有害なフェニルアラニンを代謝することが可能である。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作されたバクテリアは、改変アルギニン生合成経路(例えば、欠失アルギニンリプレッサー、改変アルギニンリプレッサー結合部位、および/またはアルギニンフィードバック耐性N-アセチルグルタミン酸合成酵素突然変異)を符号化する遺伝子を含み、例えばUCDを有する被験体または癌を有する被験体において有害なアンモニアを減少させることができる。いくつかの実施形態において、治療用分子は、別の分子と連携して治療効果を生み出すように働き、例えば、フェニルアラニントランスポーターは、PKUの被験体において有害なフェニルアラニンを減少させるためにフェニルアラニン代謝酵素と連携して働く。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている人工微生物、例えば遺伝子操作されたバクテリアは、1つ以上の治療用分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている、人工微生物、例えば遺伝子操作されたバクテリアは、被験体への投与前に1つ以上の治療用分子を発現する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される、人工微生物、例えば遺伝子操作されたバクテリアは、被験体への投与後に1つ以上の治療用分子を発現し、例えば、治療用分子を産生するための遺伝子は被験体への投与後に誘導される。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、所定の数の人工微生物、例えば遺伝子操作されたバクテリアを含む組成物が挙げられる。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも約104の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも約105の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも約106の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも約107の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも約108の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば、遺伝子操作された細菌に対する適当な投与量は、約104から約1012の細菌、例えば、約104の細菌、約105の細菌、約106の細菌、約107の細菌、約108の細菌、約109の細菌、約1010の細菌、約101１の細菌、または約10の12細菌の範囲とすることができる。いくつかの実施形態において、組成物は、約108から1013の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約109から1013の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約1010から1012の生細胞を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、およそ1 x 1011の生細胞、およそ.1.1 x 1011の生細胞、およそ1.2 x 1011の生細胞、およそ1.3 x 1011の生細胞、およそ1.4 x 1011の生細胞、およそ1.5 x 1011の生細胞、およそ1.6 x 1011の生細胞、およそ1.7 x1011の生細胞、およそ1.8 x1011の生細胞、およそ1.9 x 10 11の生細胞、およそ2 x 1011の生細胞、およそ2.1 x 1011の生細胞、およそ2.2 x 1011の生細胞、およそ2.3 x 1011の生細胞、およそ2.4 x 1011の生細胞、およそ2.5 x1011の生細胞、およそ2.6 x 1011の生細胞、およそ2.7 x 1011の生細胞、およそ2.8 x 1011の生細胞、およそ2.9 x 1011の生細胞、およそ 3 x1011の生細胞、およそ3.1 x 1011の生細胞、約3.2 x 1011の生細胞、約3.3 x 1011の生細胞、およそ3.4 x 10 11の生細胞、およそ3.5 x 10 11の生細胞、約3.6 x 10 11の生細胞、約3.7 x 1011の生細胞、約3.8 x 1011の生細胞、約3.9 x 10 11の生細胞、または約4 x 1011の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約5×1011の生細胞、約6×1011の生細胞、約7×1011の生細胞、約8×1011の生細胞、または約9×10の生細胞を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、約1×1012の生細胞、約1.1×1012の生細胞、約1.2×1012の生細胞、約1.3×1012の生細胞、約1.4×1012の生細胞、約1.5×1012の生細胞、約1.6×1012の生細胞、約1.7×1012の生細胞、約1.8×1012の生細胞、約1.9×1012の生細胞、約2×1012の生細胞、約2.1×1012の生細胞、約2.2×1012の生細胞、約2.3×1012の生細胞、約2.4×1012の生細胞、約2.5×1012生細胞、約2.6×1012の生細胞、約2.7×1012の生細胞、約2.8×1012の生細胞、約2.9×1012の生細胞、約3×1012の生細胞、約3.1×1012の生細胞、約3.2×1012の生細胞、約3.3×1012の生細胞、約3.4×1012の生細胞、約3.5×1012の生細胞、約3.6×1012の生細胞 約3.7×1012の生細胞、約3.8×1012の生細胞、約3.9×1012の生細胞、約4×1012の生細胞、約4.1×1012の生細胞、約4.2×1012の生細胞、約4.3×1012の生細胞、約4.4×1012の生細胞、約4.5×1012の生細胞、約4.6×1012の生細胞、約4.7×1012の生細胞、約4.8×1012の生細胞、約4.9×1012の生細胞、または約5×1012の生細胞を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、1×1012の生細胞、2×1012の生細胞、3×1012の生細胞、4×1012の生細胞、または5×1012の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、組成物は2×1012の生細胞を含む。さらなる実施形態において、組成物は、2×1012の生細胞(5.3×1010CFU)を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、約1×1011の生細胞、約1.1×1011の生細胞、約1.2×1011の生細胞、約1.3×1011の生細胞、約1.4×1011の生細胞、約1.5×1011の生細胞、約1.6×1011の生細胞、約1.6×1011の生細胞、約1.7×1011の生細胞、約1.8×1011の生細胞、約1.9×1011の生細胞、約2×1011の生細胞、約2.1×1011の生細胞、約2.2×1011の生細胞、約2.3×1011の生細胞、約2.4×1011の生細胞、約2.5×1011の生細胞、約2.6×1011の生細胞、約2.7×1011の生細胞、約2.8×1011の生細胞、約2.9×1011の生細胞、約3×1011の生細胞、約3.1×1011の生細胞、約3.2×1011の生細胞、約3.3×1011の生細胞、約3.4×1011の生細胞、約3.5×1011の生細胞、約3.6×1011の生細胞、約3.7×1011の生細胞、約3.8×1011の生細胞、約3.9×1011の生細胞、または人工微生物の約4×1011の生細胞、例えば、dacA、または改変アルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素、例えば、PALおよび/またはLAADを発現する遺伝子操作された細菌であって、任意に組成物の活性は、トランスシンナム酸(TCA)、馬尿酸(HAまたは標識D5-HA)、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適している測定、例えば、制御によって決定される。
いくつかの実施形態では、組成物は、約5×1011の生細胞、約6×1011の生細胞、約7×1011の生細胞、約8×1011の生細胞、または約9×1011の生細胞をもつ人工微生物、例えば、dacAまたは修飾アルギニンバイオ合成経路、またはフェニルアラニンバイオ合成酵素、例えば、PALおよび/またはLAADを発現する遺伝的操作された細菌を含み、任意的な成物の活性は、TCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適している測定、例えば、制御との比較によって決定される。
いくつかの実施形態において、組成物は、約1×1012の生細胞、約1.1×10×12の生細胞、約1.2×1012の生細胞、約1.3 ×1012の生細胞、約1.4×1012の生細胞、約1.5×1012の生細胞、約1.6×1012の生細胞、約1.7×1012の生細胞、約1.8×1012の生細胞、約1.9×1012の生細胞、約2×1012の生細胞、約2.1×1012の生細胞、約2.2×1012の生細胞、約2.3×1012の生細胞、約2.4×1012の生細胞、約2.5×1012の生細胞、約2.6×1012の生細胞、約2.7×1012の生細胞、約2.8×1012の生細胞、約2.9×1012の生細胞、約3×1012の生細胞、約3.1×1012の生細胞、約3.2×1012の生細胞 、約3.3×1012の生細胞、約3.4×10×12の生細胞、約3.5×1012の生細胞、約3.6×1012の生細胞、約3.7×1012の生細胞、約3.8×1012の生細胞、約3.9×1012の生細胞、約4×1012の生細胞、約4.1×1012の生細胞、約4.2×1012の生細胞、約4.3×1012の生細胞、約4.4×1012の生細胞、約4.5×1012の生細胞、約4.6×1012の生細胞、約4.7×1012の生細胞、約4.8×1012の生細胞、約4.9×1012の生細胞、または約5×1012の生細胞を持つ人工微生物、例えばdacAまたは例えばPALおよび/またはLAADのような改変アルギニン生合成経路、フェニルアラニン代謝酵素を発現する遺伝子操作された細菌を含み、任意的に組成物の活性が、TCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適している測定、例えば制御との比較によって決定される。
いくつかの実施形態では、組成物は、1×1012の生細胞、2×1012の生細胞、3×1012の生細胞、4×1012の生細胞、または5×1012の生細胞をもつ人工微生物、例えば、PALおよび/またはLAADのようにフェニルアラニン代謝酵素を発現する遺伝的に操作された細菌を含み、任意的に、組成物の活性は、TCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血液フェニルアラニン、または、他の適している測定、例えば、制御との比較によって決定される。いくつかの実施形態において、組成物は、2 x 1012の生細胞をもつ人工微生物、例えばPALおよび/またはLAADのようにフェニルアラニン代謝酵素を発現する遺伝子操作された細菌を含み、任意的に組成物の活性が、TCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、または他の適している測定、例えば制御との比較によって決定される。さらなる実施形態において、組成物は、2 x 1012の生細胞(5.3 x 1010CFU)をもつ人工微生物、例えばdacAまたは例えばPALおよび/またはLAADのような改変アルギニン生合成経路、フェニルアラニン代謝酵素を発現する遺伝子操作された細菌を含み、任意的にTCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適している測定、例えば制御との比較によって組成物の活性が決定される。
いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、非病原性細菌である。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、共生細菌である。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌はプロバイオティックバクテリアである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、病原性を減少または排除するために改変または突然変異された自然な病原性の細菌である。いくつかの実施形態において、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態において、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。例示的な細菌は、限定されるわけではないが、バクテロイデス、ビフィズス菌、クロストリジウム、大腸菌、乳酸桿菌、およびラクトコッカスを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたバクテリアは、大腸菌株Nissle 1917(E. coli Nissle)であり、これは腸内バクテリア科のグラム陰性バクテリアであり、最もよく特徴的なプロバイオティクスの1つに進化した(Ukena他、2007)。その菌種は完全な無害性(Schultz, 2008)を特徴とし、GRAS (一般的に安全であると認識されている)の地位を有している(Reister他.、2014、強調)。
未修飾のE. coli Nissleまたは遺伝子操作された細菌は、例えば、腸または血液血清中の防御因子(Sonnenborn他、2009)によって、または死滅スイッチの活性化によって、投与の数時間または数日後に破壊され得る。したがって、組成物は、継続投与を必要とする可能性がある。いくつかの実施形態において、滞留時間は、ヒト対象について計算される。
いくつかの実施形態において、治療用分子、例えばPALは、低コピープラスミド、高コピープラスミド、または染色体上で、例えば、E. coli Nissleにおける以下の挿入部位の1つまたは複数で発現され得る。malE/K、insB/I、araC/BAD、lacZ、agaI/rsmI、thyA、およびmalP/Tである。挿入部位は、ゲノムのどこにあってもよく、例えば、thyA (栄養要求株を作り出すため)のような生存および/または成長に必要な遺伝子、ゲノム複製部位近傍のようなゲノムの活性領域、および/またはアラビノースオペロンのAraBとAraCとの間のような意図しない転写の危険を減少させるための分岐促進剤間である。いくつかの実施形態において、例えばPALのような治療用分子の2、3、4、5、6、7、8、9、10以上のコピーの1つ以上のコピーが、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌の1つ以上の組込み部位においてバクテリア染色体に組込まれる。
いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン代謝酵素(PME)をコード化する1つ以上の遺伝子を含み、抗癌分子、例えば脱アデニル酸シクラーゼ遺伝子(例えばdacA)またはSTINGアゴニストを産生することができる酵素を産生するための1つ以上の遺伝子を含み、およびアルギニンを産生するための修飾アルギニン生合成経路、例えば欠失アルギニンリプレッサー、修飾アルギニンリプレッサー結合部位、および/またはアルギニンフィードバック耐性N-アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異を符号化する1つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、PMEをコード化する遺伝子を含み、PME遺伝子は誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、微生物、例えば細菌は、非天然PME遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、微生物、例えば細菌は、天然PME遺伝子の追加的コピーを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、本質的にPME遺伝子と関連していない。
いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、PALをコード化する遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、PALを符号化する遺伝子を含み、PAL遺伝子は誘導性プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、微生物、例えばバクテリアは非天然PAL遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、微生物、例えばバクテリアは、天然PAL遺伝子の追加的コピーを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、本質的にPAL遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、本明細書に開示される１つ以上のプロモーターのいずれかである。
いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、LAADをコード化する遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、LAAD遺伝子は、誘導性プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、微生物、例えば細菌は、非天然LAAD遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、微生物、例えば細菌は、天然LAAD遺伝子の追加的コピーを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、本質的にLAAD遺伝子と関連していない。
いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニントランスポーター、例えばPhePをコード化する遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、非天然フェニルアラニントランスポーター、例えば天然フェニルアラニントランスポーターの追加コピーをコード化する遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は、誘導性プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、本質的にPheP遺伝子と関連していない。
いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、1つ以上の必須遺伝子の要求株である。例えば、必須遺伝子の突然変異、変形、または切り出しによって、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌が栄養要求株になることがある。栄養要求性変形とは、その必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子を欠いているために、生存や成長に必須な外因的に添加された栄養素がなくても細菌を死滅させることを意図したものである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌のいずれも、細胞の生存および/または成長に必要な遺伝子の欠失または突然変異を含む。
代表的な栄養要求株は、WO2016090343、WO2016200614、WO2017139697、WO2016183531、WO2017087580、WO2016141108、WO2017074566、WO2017136792、WO2017136795、WO2018129404、WO2019014391、WO2016210384、WO2017123418、WO2017123676、WO2016183531、WO2018237198、WO2016201380、US20170216370、およびWO2017040719において提供され、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。1つの実施形態において、必須遺伝子はDNA合成遺伝子、例えばthyAである。チミンは細菌の細胞増殖に必要な核酸であり、チミンがないと細菌は細胞死を起こす。thyA遺伝子は、dUMPをdTMPに変換することによってチミン合成の第一段階を触媒する酵素であるチミジル酸シンテターゼを符号化する(Sat他、2003年)。いくつかの実施形態において、微生物、例えば細菌細胞は、thyA遺伝子を欠失および/または無関係な遺伝子と置換したthyA栄養要求株である。thyA栄養要求株は、たとえばin vitroで増殖培地にチミンを加えることによって、あるいはin vivoでヒトの消化管に自然に見られる高いチミンレベルの存在下で、十分な量のチミンが存在するときにのみ増殖できる。いくつかの実施形態において、微生物、例えば細菌細胞は、細菌が哺乳動物の腸管に存在するときに相補される遺伝子において栄養要求性である。十分な量のチミンがなければ、thyA栄養要求株は死んでしまう。いくつかの実施形態において、栄養要求変形は、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の不在下(例えば腸の外側)では生存しないことを保証するために使用される。
別の実施形態では、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、細胞壁合成遺伝子、例えばdapAにおいて栄養要求株である。ジアミノピメリン酸(DAP)はリジン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、細菌の細胞壁増殖に必要である(Meadow他、1959、Clarkson他、1971)。いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば、本明細書に記載の遺伝子操作されたバクテリアのいずれかは、dapDが欠失され、および/または無関係な遺伝子と置換されるdapD栄養要求株である。dapD栄養要求株は、十分な量のDAPが存在する場合、例えば、in vitroで増殖培地にDAPを加えることによって、あるいはin vivoでヒトの消化管に自然に見られる高濃度のDAPが存在する場合にのみ増殖できる。十分な量のDAPがなければ、dapD栄養要求株は死んでしまう。いくつかの実施形態において、栄養要求性変形は、微生物、例えば細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の非存在下においては生存しないことを保証するために使用される(例えば、腸の外側)。
いくつかの実施形態において、単一のプロモーターは、PMEおよびフェニルアラニントランスポーターを符号化する1つ以上の遺伝子の発現を制御する。いくつかの実施形態において、同じプロモーターの別々のコピーは、PMEおよびフェニルアラニントランスポーターの発現の発現を制御する。いくつかの実施形態において、異なるプロモーターは、PMEおよびフェニルアラニントランスポーターの発現を制御する。いくつかの実施形態において、PMEの発現を制御するプロモーターは、フェニルアラニントランスポーターの発現を制御するプロモーターとは異なる。いくつかの実施形態において、PMEをコード化する遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコード化する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、哺乳動物の消化管に見出される外因性環境条件によって誘導される。いくつかの実施形態において、PMEをコード化する遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコード化する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、低酸素または嫌気性条件下、例えば、FNR反応プロモーター、ANR反応プロモーター、およびDNR反応プロモーターの下で誘導される。いくつかの実施形態において、PMEをコード化する遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコード化する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、熱調節プロモーターである。いくつかの実施形態において、PMEをコード化する遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターを符号化する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、アラビノース、IPTG、テトラサイクリン、またはラムノースによって誘導される。いくつかの実施形態において、PME、例えばPALおよび/またはLAADをコード化する遺伝子は、低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーター、熱調節プロモーター、およびアラビノース、IPTG、テトラサイクリン、またはラムノースによって誘導されるプロモーターから選択されるプロモーターに機能的に連結される。いくつかの実施形態において、体温調節プロモーターは、37oC～42Cの間の体温で誘導することができる。いくつかの実施形態において、体温調節プロモーターは、ラムダCI誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、温度感受性CI変異株を符号化する1つ以上の遺伝子をさらに含み、それはいくつかの実施形態において、CI857である。
医薬組成物
いくつかの実施形態において、本開示は、疾患もしくは障害、例えば癌、または高フェニルアラニン血症に関連する疾患、例えばPKU、または高アンモニア血症に関連する疾患、例えばUCDもしくは癌を治療、管理、改善、および/または予防するために使用可能な薬学的組成物を提供する。1つ以上の人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌を含む本発明の薬学的組成物は、単独で、または予防薬、治療薬剤、および/または薬学的に許容可能な担体と組み合わせて提供される。ある実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子改変を含むように操作される微生物、例えばバクテリアの1つの種、株、またはサブタイプを含む。別の実施形態では、医薬組成物は、それぞれが本明細書に記載される遺伝子改変を含むように操作される、微生物、例えば細菌の2つ以上の種、株、および/またはサブタイプを含む。
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に開示されている活性、例えば生細胞計数法を特徴づけ、投与、および決定するための方法を用いて測定されるように、所定の数の微生物、例えば細菌を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は少なくとも約104の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は少なくとも約105の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は少なくとも約106の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は少なくとも約107の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は少なくとも約108の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたバクテリアの適当な投与量は、約104から約1012の生菌、例えば、約104の生菌、約105の生菌、約106の生菌、約107の生菌、約108の生菌、約109の生菌、約1010の生菌、約1011の生菌、または約106の生菌の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約108から1013の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約109～1013の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約1010～1012の生細胞を含む。
いくつかの実施形態において、医薬品組成物は、約1×1011の生細胞、約1.1×1011の生細胞、約1.2×1011の生細胞、約1.3×1011の生細胞、約1.4×1011の生細胞、約1.5×1011の生細胞、約1.6×1011の生細胞、約1.7×1011の生細胞、約1.8×1011の生細胞、約1.9×1011の生細胞、約2×1011の生細胞、約2.1×1011の生細胞、約2.2×1011の生細胞、約2.3×1011の生細胞、約2.4×1011の生細胞、約2.5×1011の生細胞、約2.6×1011の生細胞、約2.7×1011の生細胞、約2.8×1011の生細胞、約2.9×1011の生細胞、約3×1011の生細胞、 約3.1×1011の生細胞、約3.2×1011の生細胞、約3.3×1011の生細胞、約3.4×1011の生細胞、約3.5×1011の生細胞、約3.6×1011の生細胞、約3.7×1011の生細胞、約3.8×1011の生細胞、約3.9×1011の生細胞、または約4×1011の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約5×1011の生細胞、約6×1011の生細胞、約7×1011の生細胞、約8×1011の生細胞、または約9×1011の生細胞を含む。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約1×1012の生細胞、約1.1×10×12の生細胞、約1.2×1012の生細胞、約1.3×1012の生細胞、約1.4×1012の生細胞、約1.5×1012の生細胞、約1.6×1012の生細胞、約1.7×1012の生細胞、約1.8×1012の生細胞、約1.9×1012の生細胞、約2×1012の生細胞、約2.1×1012の生細胞、約2.2×1012の生細胞、約2.3×1012の生細胞、約2.4×1012の生細胞、約2.5×1012の生細胞、約2.6×1012の生細胞、約2.7×1012の生細胞、約2.8×1012の生細胞、約2.9×1012の生細胞、約3×1012の生細胞、約3.1×1012の生細胞、約3.2×1012の生細胞、約3.3×1012の生細胞、約3.4×1012の生細胞、約3.5×1012の生細胞、約3.6×1012の生細胞、約3.7×1012の生細胞、約3.8×1012の生細胞、約3.9×1012の生細胞、約4×1012の生細胞、約4.1×1012の生細胞、約4.2×1012の生細胞、約4.3×1012の生細胞、約4.4×1012の生細胞、約4.5×1012の生細胞、約4.6×1012の生細胞、約4.7×1012の生細胞、約4.8×1012の生細胞、約4.9×1012の生細胞、または約5×1012の生細胞を含む。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、1×1012の生細胞、、2×1012の生細胞、3×1012の生細胞、、4×1012の生細胞、、または5×1012の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、2×1012の生細胞を含む。さらなる実施形態において、医薬組成物は、2×1012の生細胞(5.3×1010のCFU)を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は液体製剤である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、固形製剤、例えば、固形経口製剤である。
いくつかの実施形態において、本開示は、1x106-1x1015生細胞/mLの生細胞数濃度を有する医薬組成物、または乾燥細胞、または凍結乾燥細胞の場合には、1x106-1x1015生細胞/mLの再構成後の細胞数濃度を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、1x108-1x1013生細胞/mLの生細胞数濃度、または再構成生細胞数濃度を有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、1x108-1x1012生細胞/mLの生細胞数濃度、または再構成生細胞数濃度を有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、1x109-1x1011生細胞/mLの生細胞数濃度、または再構成生細胞数濃度を有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、1x1010-1x1012生細胞/mLの生細胞数濃度、または再構成生細胞数濃度を有する医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、固形製剤、例えば、固形経口製剤であり、約1×1011の生細胞、約1.1×1011の生細胞、約1.2×1011の生細胞、約1.3×1011の生細胞、約1.4×1011の生細胞、約1.5×1011の生細胞、約1.6×1011の生細胞、約1.7×1011の生細胞、約1.8×1011の生細胞、約1.9×1011の生細胞、約2×1011の生細胞、約2.1×1011の生細胞、約2.2×1011の生細胞、約2.3×1011の生細胞、約2.4×1011の生細胞、約2.5×1011の生細胞、約2.6×1011の生細胞、約2.7×1011の生細胞、約2.8×1011の生細胞、約2.9×1011の生細胞、約3×1011の生細胞、約3.1×1011の生細胞、約3.2×1011の生細胞、約3.3×1011の生細胞、約3.4×1011の生細胞、約3.5×1011の生細胞、約3.6×1011の生細胞、約3.7×1011の生細胞、約3.8×1011の生細胞、約3.9×1011の生細胞、または約4×1011の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、固形製剤、例えば、固形経口製剤であり、約5×1011の生細胞、約6×1011の生細胞、約7×1011の生細胞、約8×1011の生細胞、または約9×1011の生細胞を含む。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、例えば固形経口製剤であり、約1×1012の生細胞、約1.1×1012の生細胞、約1.2×1012の生細胞、約1.3×1012の生細胞、約1.4×1012の生細胞、約1.5×1012の生細胞、約1.6×1012の生細胞、約1.7×1012の生細胞、約1.8×1012の生細胞、約1.9×1012の生細胞、約2×1012の生細胞、約2.1×1012の生細胞、約2.2×1012の生細胞、約2.3×1012の生細胞、約2.4×1012の生細胞、約2.5×1012の生細胞、約2.6×1012の生細胞、約2.7×1012の生細胞、約2.8×1012の生細胞、約2.9×1012の生細胞、約3×1012の生細胞、約3.1×1012の生細胞、約3.2×1012の生細胞、約3.3×1012の生細胞、約3.4×1012の生細胞、約3.5×1012の生細胞、約3.6×1012の生細胞、約3.7×1012の生細胞、約3.8×1012の生細胞、約3.9×1012の生細胞、約4×1012の生細胞、約4.1×1012の生細胞、約4.2×1012の生細胞、約4.3×1012の生細胞、約4.4×1012の生細胞、約4.5×1012の生細胞、約4.6×1012の生細胞、約4.7×1012の生細胞、約4.8×1012の生細胞、約4.9×1012の生細胞、または約5×1012の生細胞を含む。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、固形製剤、例えば固形経口製剤であり、1×1012の生細胞、2×1012の生細胞、3×1012の生細胞、4×1012の生細胞、または5×1012の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、固形製剤、例えば固形経口製剤であり、2×1012の生細胞を含む。さらなる実施形態において、医薬組成物は、固形製剤、例えば固形経口製剤であり、2×1012の生細胞(5.3×1010のCFU)を含む。
いくつかの実施態様において、固形製剤、例えば固形経口製剤は、人工微生物、例えばdacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作された細菌の約1×1011の生細胞、約1.1×1011の生細胞、約1.2×1011の生細胞、約1.3×1011の生細胞、約1.4×1011の生細胞、約1.5×1011の生細胞、約1.6×1011の生細胞、約1.7×1011の生細胞、約1.8×1011の生細胞、約1.9×1011の生細胞、約2×1011の生細胞、約2.1×1011の生細胞、約2.2×1011の生細胞、約2.3×1011の生細胞、約2.4×1011の生細胞、約2.5×1011の生細胞、約2.6×1011の生細胞、約2.7×1011の生細胞、約2.8×1011の生細胞、約2.9×1011の生細胞、約3×1011の生細胞、約3.1 x 10 11の生細胞、約3.2 x 10 11の生細胞、約3.3 x 10 11の生細胞、約3.4 x 10 11の生細胞、約3.5 x 10 11の生細胞、約3.6 x 10 11の生細胞、約3.7 x 10 11の生細胞、約3.8 x 10 11の生細胞、約3.9 x 10 11の生細胞、または約4 x 10 11の生細胞を含み、固形製剤、例えば固形経口製剤の活性は任意的にトランス桂皮酸(TCA)、馬尿酸(HAまたは標識D5-HA)、血中フェニルアラニン、または他の適切な測定、例えば制御との比較によって決定される。
いくつかの実施形態では、固形製剤、例えば、固形経口製剤は、人工微生物、例えばdacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作された細菌の約5×1011の生細胞、約6×1011の生細胞、約7×1011の生細胞、約8×1011の生細胞、または約9×1011の生細胞を含み、、固形製剤、例えば、固形経口製剤の活性は、任意的にTCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シチルリニン、サイクリックジzヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適切な測定、例えば、制御との比較によって決定される。
約1.5×1012の生細胞、約1.5×1012の生細胞、
いくつかの実施態様において、固形製剤、例えば固形経口製剤は、人工微生物、例えば、dacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作された細菌の約1×1012の生細胞、約1.1×1012の生細胞、約1.2×1012の生細胞、約1.3×1012の生細胞、約1.4×1012の生細胞、約1.9×1012の生細胞、約2×1012の生細胞、約2.1×1012の生細胞、約2.2×1012の生細胞、約2.3×1012の生細胞、約2.4×1012の生細胞、約2.5×1012の生細胞、約2.6×1012の生細胞、約2.7×1012の生細胞、約2.8×1012の生細胞、約2.9×1012の生細胞、約3×1012の生細胞、約3.1×1012の生細胞、約3.2×1012の生細胞、約3.3×1012の生細胞、約3.4×1012の生細胞、約3.5×1012の生細胞、約3.6×1012の生細胞、約3.7×1012の生細胞、約3.8×1012の生細胞、約3.9×1012の生細胞、約4×1012の生細胞、約4.1×1012の生細胞、約4.2×1012の生細胞、約4.3×1012の生細胞、約4.4×1012の生細胞、約4.5×1012の生細胞、約4.6×1012の生細胞、約4.7×1012の生細胞、約4.8×1012の生細胞、約4.9×1012生細胞、または約5×1012の生細胞を含み、固形製剤、例えば固形経口製剤の活性は、任意的にTCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジーAMP、または他の適切な測定、例えば制御との比較によって決定される。
いくつかの実施形態では、固形製剤、例えば、固形経口製剤は、人工微生物、例えば、dacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作された細菌の1×1012の生細胞、2×1012の生細胞、3×1012の生細胞、4×1012の生細胞、または5×1012の生細胞を含み、任意的に固形製剤、例えば、固形経口製剤の活性は、TCA、HA、または標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適切な測定、例えば、制御との比較によって決定される。いくつかの実施形態において、固形製剤、例えば固形経口製剤は、人工微生物、例えばdacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作された遺伝子バクテリアの2×1012の生細胞を含み、固形製剤、例えば固形経口製剤の活性は、任意的にTCA、HA、または標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適切な測定、例えば、制御との比較によって決定される。さらなる実施形態において、固形製剤、例えば固形経口製剤は、人工微生物、例えばdacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作された遺伝子バクテリアの2×1012の生細胞(5.3×1010CFU)を含み、固形製剤、例えば固形経口製剤の活性は、任意的にTCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適切な測定、例えば、制御との比較によって決定される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約1×1011の生細胞、約1.1×10×11の生細胞、約1.2×1011の生細胞、約1.3×1011の生細胞、約1.4×1011の生細胞、約1.5×1011の生細胞、約1.6×1011の生細胞、約1.7×1011の生細胞、約1.8×1011の生細胞、約1.9×1011の生細胞、約2×1011の生細胞、約2.1×1011の生細胞、約2.2×1011の生細胞、約2.3×1011の生細胞、約2.4×1011の生細胞、約2.5×1011の生細胞、約2.6×1011の生細胞、約2.7×1011の生細胞、約2.8×1011の生細胞、約2.9×1011の生細胞、約3×1011の生細胞、約3.1×1011の生細胞、約3.2×1011の生細胞、約3.3×1011の生細胞、約3.4×1011の生細胞、約3.5×1011の生細胞、約3.6×1011の生細胞、約3.7×1011の生細胞、約3.8×1011の生細胞、約3.9×1011の生細胞、または約4×1011の生細胞を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約5×1011の生細胞、約6×1011の生細胞、約7×1011の生細胞、約8×1011の生細胞、または約9×1011の生細胞を含む液状製剤である。
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、約1×1012の生細胞、約1.1×10×12の生細胞、約1.2×10×12の生細胞、約1.3×1012の生細胞、約1.4×1012の生細胞、約1.5×1012の生細胞、約1.6×1012の生細胞、約1.7×1012の生細胞、約1.8×1012の生細胞、約1.9×1012の生細胞、約2×1012の生細胞、約2.1×1012の生細胞、約2.2×1012の生細胞、約2.3×1012の生細胞、約2.4×1012の生細胞、約2.5×1012の生細胞、約2.6×1012の生細胞、約2.7×1012の生細胞、約2.8×1012の生細胞、約2.9×1012の生細胞、約3×1012の生細胞、約3.1×1012の生細胞、約3.2×1012の生細胞、約3.3×1012の生細胞、約3.4×1012の生細胞、約3.5×1012の生細胞、約3.6×1012の生細胞、約3.7×1012の生細胞、約3.8×1012の生細胞、約3.9×1012の生細胞、約4×1012の生細胞、約4.1×1012の生細胞、約4.2×1012の生細胞、約4.3×1012の生細胞、約4.4×1012の生細胞、約4.5×1012の生細胞、約4.6×1012の生細胞、約4.7×1012の生細胞、約4.8×1012の生細胞、約4.9×1012の生細胞、または約5×1012の生細胞を含む液状製剤である。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、1×1012の生細胞、2×1012の生細胞、3×1012の生細胞、4×1012の生細胞、または5×1012の生細胞を含む液状製剤である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、2×1012の生細胞を含む液状製剤である。さらなる実施態様において、医薬組成物は、2×1012の生細胞(5.3×1010 のCFU)を含む液状製剤である。
いくつかの実施態様において、液状製剤は、人工微生物、例えば、dacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作された細菌の約1×1011の生細胞、約1.1×1011の生細胞、約1.2×1011の生細胞、約1.3×1011の生細胞、約1.4×1011の生細胞、約1.5×1011の生細胞、約1.6×1011の生細胞、約1.7×1011の生細胞、約1.8×1011の生細胞、約1.9×1011の生細胞、約2×1011の生細胞、約2.1×1011の生細胞、約2.2×1011の生細胞、約2.3×1011の生細胞、約2.4×1011の生細胞、約2.5×1011の生細胞、約2.6×1011の生細胞、約2.7×1011の生細胞、約2.8×1011の生細胞、約2.9×1011の生細胞、約3×1011の生細胞、約3.1×1011の生細胞、約3.2×1011の生細胞、約3.3×1011の生細胞、約3.4×1011の生細胞、約3.5×1011の生細胞、約3.6×1011の生細胞、約3.7×1011の生細胞、約3.8×1011の生細胞、約3.9×1011の生細胞、または約4×1011の生細胞を含み、任意的に液状製剤の活性はTCA、HAまたは標識D5-HA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適切な測定、例えば、制御との比較によって決定される。
いくつかの実施形態では、液状製剤は、人工微生物、例えば、dacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作された遺伝子バクテリアの約5×1011の生細胞、約6×1011の生細胞、約7×1011の生細胞、約8×1011の生細胞、または約9×1011の生細胞を含み、任意的に液状製剤の活性は、TCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適切な測定、例えば、制御との比較によって決定される。
いくつかの実施形態において、液状製剤は、人工微生物、例えば、dacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作された細菌の約1×1012の生細胞、約1.1×1012の生細胞、約1.2×1012の生細胞、約1.3×1012の生細胞、約1.4×1012の生細胞、約1.5×1012の生細胞、約1.6×1012の生細胞、約1.7×1012の生細胞、約1.8×1012の生細胞、約1.9×1012の生細胞、約2×1012の生細胞、約2.1×1012の生細胞、約2.2×1012の生細胞、約2.3×1012の生細胞、約2.4×1012の生細胞、約2.5×1012の生細胞、約2.6×1012の生細胞、約2.7×1012の生細胞、約2.8×1012の生細胞、約2.9×1012の生細胞、約3×1012の生細胞、約3.1×1012の生細胞、約3.2×1012の生細胞、約3.3×1012の生細胞、約3.4×1012の生細胞、約3.5×1012の生細胞、約3.6×1012の生細胞、約3.7×1012の生細胞、約3.8×1012の生細胞、約3.9×1012の生細胞、約4×1012＼の生細胞、約4.1×1012＼の生細胞、約4.2×1012＼の生細胞、約4.3×1012＼の生細胞、約4.4×1012＼の生細胞、約4.5×1012＼の生細胞、約4.6×1012＼の生細胞、約4.7×1012＼の生細胞、約4.8×1012＼の生細胞、約4.9×1012＼の生細胞、または約5×1012の生細胞を含み、任意的に液状製剤の活性はTCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適切な測定、例えば、制御との比較によって決定される。
いくつかの実施形態において、液状製剤は、人工微生物、例えば、dacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作された細菌の1×1012の生細胞、2×1012の生細胞、3×1012の生細胞、4×1012の生細胞、または5×1012の生細胞を含み、任意的に液体製剤の活性は、TCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適切な測定、例えば、制御との比較によって決定される。いくつかの実施形態において、液状製剤は、人工微生物、例えば、dacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作されたバクテリアの2 x 1012の生細胞を含み、任意的に液状製剤の活性はTCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適切な測定、例えば、制御との比較によって決定される。さらなる実施形態において、液状製剤は、人工微生物、例えば、dacA、または改変アルギニン生合成経路またはフェニルアラニン代謝酵素、例えばPALおよび/またはLAADを発現する、遺伝子操作された細菌の2 x 1012の生細胞(5.3 x 1010のCFU)を含み、任意的に液状製剤の活性はTCA、HAまたは標識D5-HA、PPA、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ-AMP、または他の適切な測定、例えば、制御との比較によって決定される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物中に存在する細胞の数は、生細胞計数法を使用して決定される。いくつかの実施形態において、組成物の生細胞数を決定することは、CFU数よりも医薬組成物の活性のより正確な測定を提供する。いくつかの実施形態において、生細胞計数は、CFU方法と比較して、医薬組成物中の減少したCFU数を提供する。いくつかの実施形態において、生細胞計数は、CFU方法と比較して、医薬組成物、例えば凍結乾燥または凍結液体医薬組成物中のCFU数を減少させることを可能にする。いくつかの実施形態において、生細胞計数によって医薬組成物中に存在する細胞数を決定することは、医薬組成物の耐性を改善する。例えば、医薬組成物は、CFU法と比較して、生細胞計数法を用いて低下したCFU数を含み、細胞可溶化物、エンドトキシンなどのレベルの低下に対応する。いくつかの実施形態において、生細胞計数を用いて決定される医薬品組成物は、少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の生細胞、例えば、細胞の総数で割った生細胞の数を含む。いくつかの実施形態において、生細胞計数を用いて決定される医薬組成物は、少なくとも約50～60%の生細胞、例えば、細胞の総数で割った生細胞の数を含む。いくつかの実施形態において、生細胞計数を用いて決定される医薬組成物は、少なくとも約60～70%の生細胞、例えば、細胞の総数で割った生細胞の数を含む。いくつかの実施形態において、生細胞計数を用いて決定される医薬組成物は、少なくとも約70～80%の生細胞、例えば、細胞の総数で割った生細胞の数を含む。いくつかの実施形態において、生細胞計数を用いて決定される医薬組成物は、少なくとも約80～90%の生細胞、例えば、細胞の総数で割った生細胞の数を含む。いくつかの実施形態において、生細胞計数を用いて決定される医薬組成物は、少なくとも約90～10%の生細胞、例えば、細胞の総数で割った生細胞の数を含む。いくつかの実施形態において、生細胞計数を用いて決定される医薬組成物は、少なくとも約60%の生細胞、例えば、細胞の総数で割った生細胞の数を含む。いくつかの実施形態において、生細胞計数を用いて決定される医薬組成物は、少なくとも約70%の生細胞、例えば、細胞の総数で割った生細胞の数を含む。いくつかの実施形態において、生細胞計数を用いて決定される医薬組成物は、少なくとも約80%の生細胞、例えば、細胞の総数で割った生細胞の数を含む。いくつかの実施形態において、CFU法は、従来の製剤および/または製造には高すぎる微生物細胞数、例えば細菌細胞数をもたらし、より正確な生細胞計数法は、治療的に有効であり、従来の製剤および/または製造にも適している細菌細胞数を提供する。
いくつかの実施形態において、生菌数を用いて決定される医薬組成物は、約1.9×108±1.8×108EU/グラム以下のエンドトキシン、約4.0×108 EU/グラム以下のエンドトキシン、約3.0×108 EU/グラム以下のエンドトキシン、約2.0×108EU/グラム以下のエンドトキシン、約1.0×108 EU/グラム以下のエンドトキシン、または約5×107 EU/グラム以下のエンドトキシンを含む。
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書に開示される活性を特徴付け、投与し、および決定するための方法、例えば、生細胞カウント法、を使用して決定される。いくつかの実施形態において(例えば、微生物、例えば、細菌がPMEを含むように遺伝子操作されている)活性は、フェニルアラニンのTCAへの変換、例えば、in vitroまたはin vivo、例えば、尿中のHAによって測定され得る。いくつかの実施形態において(例えば、微生物、例えば、細菌が、PMEを含むように遺伝子操作されている)、活性は、フェニルアラニンのPPAへの変換、例えば、インビトロまたはインビボで測定され得る。いくつかの実施形態において(例えば、微生物が、例えば、細菌が、改変アルギニン生合成経路、例えば、欠失アルギニンリプレッサー、改変アルギニンリプレッサー結合部位、および/またはアルギニンフィードバック耐性N-アセチルグルタミン酸合成酵素突然変異を含むように遺伝子操作されている)、活性は、例えば、インビトロまたはインビボで、アンモニア、アルギニンまたはシトルリンのレベルをアッセイすることによって測定され得る。いくつかの実施形態において(例えば、微生物が、例えば、細菌が、抗癌分子、例えばdacAを含むように遺伝子操作されている)、活性は、サイクリックジヌクレオチド、例えば、サイクリックジ-AMPのレベルを例えば、in vitroまたはin vivoでアッセイすることによって測定されることができる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも約0.5μmol/時/109細胞の速度でTCAを産生することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも約1.0μmol/時/109細胞の速度でTCAを産生することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも約1.9±1.2μmol/時/109細胞の速度でTCAを産生することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、およそ1.5～10.0μmol/時/109細胞の速度でTCAを産生することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約1.5～5.0μmol/時/109細胞の速度でTCAを産生することができる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも約1.0μmol/時/109細胞の速度でPPAを産生することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも約1.5μmol/時/109細胞、少なくとも約2.9±0.7μmol/時/109細胞の速度でPPAを産生することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約2.0～10.0μmol/時/109細胞の速度でPPAを産生することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約2.0～5.0μmol/時/109細胞の速度でPPAを産生することができる。
いくつかの実施形態において、生細胞数は、生細胞または非生細胞を選択的に特定することができる蛍光色素を用いて決定される。いくつかの実施形態において、蛍光色素は、生細胞または非生細胞に選択的に蓄積し、したがって、生細胞または非生細胞の特定を可能にする。いくつかの実施形態において、蛍光色素は、生細胞または非生細胞においてのみ実質的により蛍光性となり、したがって、生細胞または非生細胞の特定を可能にする。いくつかの実施形態において、非生細胞は、細胞膜に透過性でない蛍光色素を用いて生細胞から区別される。いくつかの実施形態において、生細胞は、プロトン勾配を有する細胞を選択的に特定することができる蛍光色素を使用して、非生細胞から区別される。いくつかの実施形態において、組成物の生細胞数は、総細胞数から非生細胞数を差し引くことによって決定することができる。いくつかの実施形態において、蛍光色素はSytoxグリーン染色である。
いくつかの実施形態において、生細胞計数法は、CFU法と比較して、医薬組成物中の減少したCFU数を提供する。いくつかの実施形態において、生細胞計数法は、CFU法と比較して、医薬組成物、例えば凍結乾燥または凍結液体中のCFU数を減少させることを可能にする。
いくつかの実施形態において、医薬組成物中に含まれる生細胞の数は、所定の数の分裂細胞を含む組成物、例えば、所定の数のCFUを含む組成物の活性を使用して決定され得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物中に含まれる生細胞の数は、1)所定の数の分裂細胞を含む組成物の活性を得ること、2)組成物の生細胞数を決定すること、3)組成物の効力、例えば、活性/生細胞に関して計算すること、および4)組成物についての生細胞の数を決定するために効力を使用することによって決定され得る。いくつかの実施形態において、活性は、治療効果、毒性データ、治療タンパク質のレベル、および/または医薬組成物の有効性および/または毒性を示す任意の他のメトリックを反映しうる。所定の数の分裂細胞を含む組成物を用いて、医薬組成物中に含める生細胞の数がどのように決定され得るかの例を、以下の表1に示す。
被験体に投与された生細胞の数を決定すること
[表１]
本明細書に記載されている医薬組成物は、賦形剤および補助剤を含む1つ以上の生理学的に許容可能な担体を用いて、従来の方法で処方されてよく、医薬用途のための組成物への活性成分の処理を容易にする。医薬組成物を処方する方法は、当該技術分野において公知である(例えば、「レミントンの薬学」、マック出版社、イーストン、Pa.を参照されたい。)。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、従来の混合、溶解、顆粒化、粉末化、乳化、カプセル化、封入化、または噴霧乾燥に供し、錠剤、顆粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロ錠剤、ペレット、または粉末を形成し、これらは腸溶コーティングまたは非コーティングであり得る。適切な製剤は投与経路による。
人工微生物、例えば、ここに記載されている遺伝子操作されたバクテリアは、任意の適切な剤形(例えば、経口投与のための液体、カプセル、サケット、硬カプセル、軟カプセル、錠剤、腸溶錠、懸濁粉末、粒剤、またはマトリックス徐放性製剤)および任意の適切な種類の投与(例えば、経口、局所、注射、即放性、脈動性放出、遅延放出、または持続性)のための医薬組成物に製剤化され得る。
人口微生物、例えば遺伝子操作されたバクテリアは、1つ以上の薬学的に許容可能な担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、緩衝剤、表面活性剤、中性またはカチオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透増強剤、担体化合物、および他の薬学的に許容可能な担体または薬剤を含む医薬組成物に処方され得る。例えば、医薬組成物は、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、種々の糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコース、および界面活性剤、例えば、ポリソルベート20の添加を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、炭酸水素ナトリウムの溶液、例えば炭酸水素ナトリウムの1モル溶液(例えば、胃のような酸性細胞環境を緩衝するため)の中に処方することができる。いくつかの実施形態において、人工微生物は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼのようなフェニルアラニン代謝酵素を含み、酸性環境(例えば、pH1未満、pH2未満、pH3未満、pH4未満、pH5未満、pH6未満、またはpH7未満)を緩衝するため、および/または環境の酸性度を低下させるため(例えば、pH5以上、pH6以上、pH7以上、pH8以上、pH9以上、またはpH10以上)、例えば、サブジェックにおける腸の酸性度または酸性環境を調節するために任意的にPPIを有する重炭酸ナトリウムや重炭酸カルシウム溶液中に処方される。いくつかの実施形態において、人工微生物は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼのようなフェニルアラニン代謝酵素を含み、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カルシウムの溶液中に処方され、さらに制吐剤とともに(例えば、前に、同時に、後に)投与される。制吐剤の例としては、プロメタジン、メクリジン、ヒドロキシジン、ドロペリドール、メトクロプラミド、オンダンセトロン、ドラセトロン、マロピタント、フェノチアジン、ファモチジン、ラニチジン、オメプラゾール、パントプラゾール、ミソプロストールプロトンポンプ阻害剤、ヒスタミン-2受容体拮抗剤、セロトニン(5-HT3)拮抗剤、抗ヒスタミン剤、ブチロフェノン、または胃機能剤が挙げられるが、これらに限定されない。人工微生物、例えば、遺伝子操作されたバクテリアは中性形態または塩形態として投与され処方され得る。医薬上許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオン、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンと生成するものが含まれる。
本明細書に開示されている医薬組成物は、局所的に投与され、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョン、または当業者に既知の他の形態で処方され得る。例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co., Easton, Pa」を参照されたい。一実施形態では、噴霧不可能な局所剤形態として、局所適用に適合し、水よりも大きな粘着性を有する担体または1つ以上の賦形剤を含む粘性のある半固体形態、または固体形態が採用される。適当な製剤は、例えば浸透圧のような種々の特性に影響するために、消毒され、または補助剤(例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、または塩)と混合することができる溶液、懸濁剤、乳剤、クリーム、軟膏、粉末、リニメント剤、膏薬などを含むが、これらに限定されない。他の適切な局所剤形は、噴霧可能なエアロゾル調製物を含み、固体または液体の不活性担体と組み合わせた活性成分が、加圧揮発性物質(例えば、フレオンなどの気体推進剤)との混合物中に、または圧搾ボトル中に詰められる。保湿剤または湿潤剤もまた、医薬組成物および剤形に添加することができる。このような追加成分の実施例は、当技術分野において周知である。1つの実施形態において、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、衛生製品として処方され得る。例えば、衛生製品は、抗菌製剤であってもよいし、発酵ブロスのような発酵製品であってもよい。衛生製品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト剤、ローション、およびリップクリームであってもよい。
本明細書に開示された薬学的組成物は、経口投与され、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方され得る。経口使用のための薬理学的組成物は、固体賦形剤を用いて作られ、任意に得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適当な補助剤を加えた後、顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖剤の芯を得ることができる。適切な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類などの充填剤、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、片栗粉、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなどのセルロース組成物、および/またはポリビニルピロリドン(PVP)またはポリエチレングリコール(PEG)などの生理学的に許容可能な重合体が含まれるが、これらに限定されない。崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩類を加えてもよい。
錠剤またはカプセルは、結合剤(例えば、プレゲラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ショ糖、ブドウ糖、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリン、およびトラガント)、充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム)、潤滑剤(例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、L-ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ)、崩壊剤(例えば、デンプン、片栗粉、グリコール酸ナトリウム、糖質、セルロース誘導体、シリカ粉末)、または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム錠剤)のような賦形剤と一緒に従来の手段によって調製することができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングしてもよい。コーティングシェルが存在してもよく、一般的な膜としては、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物、他の生分解性ポリマー、アルギン酸塩-ポリリジン-アルギン酸塩（APA）、アルギン酸塩?ポリメチレン-コ-グアニジン-アルギン酸塩(A-PMCG-A)、ヒドロメチルアクリレート-メチルメタクリレート(HEMA-MMA)、多層HEMA-MAA、ポリアクリロニトリル塩化ビニル（PAN-PVC）、アクリロニトリル/メタリルスルホン酸ナトリウム(AN-69)、ポリエチレングリコール/ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン/ポリジメチルシロキサン(PEG/PD5/PDMS)、ポリN,N-ジメチルアクリルアミド(PDMAAm)、珪質カプセル、硫酸セル/アルギン酸ナトリウム/ポリメチレン-コ-グアニジン(CS/A/PMCG)、酢酸セルロース、アルギン酸カルシウム、k-カラギーナン-ローカストビーンガムゲルビーズ、ゲラン-キサンタンビーズ、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、カラギーナン、デンプンポリ無水物、デンプンポリメタクリル酸、ポリアミノ酸、および腸溶性コーティングポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、腸管または腸管の特定の領域、例えば大腸に放出するために腸溶性でコーティングされている。胃から結腸までの典型的なpH特性は、約1～4(胃)、5.5～6(十二指腸)、7.3～8.0(回腸)、および5.5～6.5(結腸)である。一部の疾患では、pH特性が改変されることがある。いくつかの実施形態において、コーティングは、放出部位を特定するために特定のpH環境において分解される。いくつかの実施形態において、少なくとも2つのコーティングが使用される。いくつかの実施形態において、外側のコーティングおよび内側のコーティングは、異なるpH量で分解される。
経口投与用の液体製剤は、使用前に水または他の適当な溶剤と構成するために溶液、シロップ、懸濁液、または乾燥製品の形成をとることができる。このような液体製剤は、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化された食用脂肪)、乳化剤(例えばレシチンまたはアカシア)、非水溶剤(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分画された植物油)、および防腐剤(例えば、メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸)のような薬学的に許容可能な薬剤を用いる従来の手段によって調製することができる。また、その調製は、緩衝塩、芳香剤、着色剤、甘味剤を適宜含有してもよい。経口投与用の調製物は、本明細書に記載される人工微生物、例えば、遺伝子操作された細菌の低速な放出、制御された放出、または持続放出のために適切に配合され得る。
一実施形態において、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌は、小児被験者への投与に適した組成物で処方され得る。当技術分野でよく知られているように、小児は、胃内容排出速度、pH、胃腸管透過性などが異なるなど、多くの側面で大人とは異なる(Ivanovska 他.、2014)。さらに、投与経路や味覚特性のような小児用製剤の受容性や嗜好性は、許容できる小児コンプライアンスを達成するために極めて重要である。したがって、一実施形態において、小児被験者への投与に適した組成物は、嚥下しやすい剤形または溶解可能な剤形、または、加味剤、甘味剤、または味覚遮断剤を有する組成物などのより味のよい組成物を含み得る。ある実施形態において、小児被験者への投与に適した組成物は、成人への投与にも適している可能性がある。
一実施形態において、小児被験者への投与に適した組成物は、溶液、シロップ、懸濁液、エリキシル、懸濁液または溶液としての溶解のための粉末、分散性/発泡性錠剤、チュアブル錠剤、グミキャンディー、ロリポップ、フリーザーポップ、トローチ、チューインガム、経口薄片、経口内崩壊錠剤、サケット、軟ゼラチンカプセル、スプリンクル口内粉末、または顆粒を含み得る。一実施形態において、組成物は、ゼラチン塩基から作られ、キャンディーの弾力性、所望の噛む持続性、およびより長い賞味期限を与えられるグミキャンディーである。いくつかの実施形態において、グミキャンディーは、甘味料または風味料も含み得る。
一実施形態において、小児被験者への投与に適した組成物は、風味を含むことができる。本明細書中で用いられる「風味」は、製剤に独特の味および芳香を提供する物質(液体または固体)である。香料はまた、製剤の嗜好性を改善するのに役立つ。香料には、イチゴ、バニラ、レモン、ブドウ、風船ガム、およびサクランボが含まれるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌を、例えば不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と共に経口投与することができる。その化合物はまた、ハードまたは軟らかい殻のゼラチンカプセルに封入され、錠剤に圧縮され、または被験体の食事に直接組み込まれてもよい。経口の治療的投与のためには、当該化合物を、添加剤とともに組み込み、摂取できる錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート剤などの形態で用いてよい。非経口投与以外の方法で化合物を投与するためには、化合物の不活性化を防ぐ物質で化合物をコーティングするかまたは化合物と同時に投与する必要があるかもしれない。
別の実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、可食製品、例えば食品であってもよい。一実施形態では、食品は、ミルク、濃縮ミルク、発酵乳(ヨーグルト、サワーミルク、冷凍ヨーグルト、乳酸菌発酵飲料)、ミルクパウダー、アイスクリーム、クリームチーズ、乾燥チーズ、豆乳、発酵豆乳、植物-果実ジュース、フルーツジュース、スポーツドリンク、菓子、キャンディー、乳児用食品(乳児用ケーキなど)、栄養食品、動物飼料、または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は、発酵乳製品などの発酵食品である。1つの実施形態において、発酵乳製品はヨーグルトである。別の実施形態では、発酵乳製品はチーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクシェイク、またはケフィアである。別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、プロバイオティクスとして役立つことを意図した他の生細菌細胞を含む調製物の中で組み合わせられる。別の実施形態では、食品は飲料である。1つの実施形態において、飲料は、フルーツジュースベースの飲料、または植物もしくはハーブエキスを含有する飲料である。別の実施形態では、食品はゼリーまたはプリンである。本発明の組換え細菌の投与に適した他の食品は、当技術分野では周知である。例えば、US2015/0359894およびUS2015/0238545を参照することとし、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、パン、ヨーグルト、またはチーズなどの食品中に注入されるか、食品上にスプレーされるかまたは振りかける。
いくつかの実施形態において、組成物は、小腸内投与、空腸内投与、十二指腸内投与、回腸内投与、胃分流投与、または結腸内投与のために、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、またはマイクロ錠を介して処方され、これらは、腸溶コーティングされるかまたはコーティングされていない。医薬組成物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を用いて、坐剤または保持浣腸剤のような直腸組成物中に調製することもできる。組成物は、油性または水溶剤中の懸濁剤、溶液、またはエマルジョンでよく、懸濁剤、安定剤、および/または分散剤を含むことができる。
医薬組成物は、鼻腔内に投与され、エアロゾル形態、スプレー、ミスト、または滴状に処方され、適切な高圧ガス(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガス)を使用して、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形態で便宜的に送達され得る。加圧エアロゾル投与単位は、定量量を送達する弁を提供することによって決定され得る。吸入器または注入器に使用するカプセルおよびカートリッジ(例えば、ゼラチン)は、化合物とラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含有して処方することができる。
人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌を投与し、デポ製剤として処方することができる。このような長時間作用型製剤は、移植によって、または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射、または点滴を含む注射によって投与され得る。例えば、組成物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料(例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして)もしくはイオン交換樹脂、または難溶性系薬物(例えば、難溶性塩として)として処方することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるのは、単一投与形態における薬学的に許容可能な組成物である。単一の投与形態は、液体または固体の形態であり得る。単一の剤形は、変形することなく患者に直接投与されてもよく、または投与前に希釈または再溶解されてもよい。ある実施形態では、単一の剤形を、例えば一回投与、複数の錠剤、カプセル、ピル等を含む経口投与を含む一回経口投与などのボーラス形態で投与することができる。別の実施形態では、単一の剤形を、例えば点滴によって一定期間にわたって投与することができる。
医薬組成物の単一投与形態は、錠剤、顆粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロ錠剤、ペレット、または粉末のようにより小さな分割量、単回用量容器、単回用量液体形態、または単回用量固体形態に医薬組成物を分配して調製することができ、これらは、腸溶コーティングまたはコーティングされていないことがある。固形状での単回投与は、患者に投与する前に、液体、典型的には滅菌水または生理食塩水溶液を加えることによって再構成され得る。
他の実施形態では、組成物は、制御解放または徐放システムで送達することができる。一実施形態において、制御された放出または徐放性を達成するためにポンプを使用することができる。別の実施形態では、高分子化合物を用いて、本開示の治療の制御解放または徐放性を達成することができる(例えば、米国特許第5,989,463号を参照されたい)。徐放性製剤に使用されるポリマーの例としては、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリ無水物、ポリ（N-ビニル-ピロリドン）、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLGA)、およびポリオルトエステルが含まれるが、これらに限定されない。徐放性製剤に使用されるポリマーは、不活性であり、浸出性不純物を含まず、保管時に安定感があり、無菌であり、生分解性であり得る。いくつかの実施形態において、制御または徐放システムは、予防または治療のための標的の近傍に配置することができ、したがって、全身投与量のほんの一部を必要とする。当業者に公知の任意の適切な技術を使用することができる。
治療反応を得るために、投与法を調節してもよい。投薬は、疾患の重症度および応答性、投与経路、治療の時間経過(日、月、年)、および疾患の改善までの時間など、いくつかの因子に依存しうる。例えば、一度に単回ボーラス投与したり、所定の期間にわたって数回に分割して投与したり、又は治療状況によって示されるように投与量を減量又は増量したりすることができる。投与量の指定は、活性化合物の特有の特性及び達成すべき特定の治療効果によって決まる。用量値は、軽減すべき状態の型および重症度によって異なる可能性がある。いずれの特定の被験者についても、個々の必要性および治療する臨床医の専門的判断に応じて、特定の投与法を時間をかけて調整することができる。本明細書に提供される化合物の毒性および治療効果は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な医薬手順によって決定することができる。例えば、LD50、ED50、EC50、およびIC50が決定され、毒性効果と治療効果との間の用量比(LD50/ED50)が治療指数として計算され得る。有害な副作用を示す組成物を使用してもよいが、副作用を軽減するために潜在的な損傷を最小限に抑えるよう注意深く修正する。投与量は、最初は細胞培養アッセイおよび動物モデルから推定してもよい。in vitro及びin vivoアッセイ並びに動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するための一連の投与量を調製する際に使用することができる。
成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたは小袋のような密閉容器中の乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々にまたは単位投与形態で一緒に混合されるかのいずれかで供給される。投与方法が注射によるものであれば、投与前に食材を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
医薬組成物は、薬剤の量を示すアンプルまたは袋のような密閉容器に包装されていてもよい。1つの実施形態において、ひとつ以上の医薬組成物は、密閉容器内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給され、被験体への投与に適切な濃度まで溶解(例えば、水または生理食塩水で)することができる。実施形態では、ひとつ以上の予防薬または治療薬または医薬組成物はは、2°Cから8°Cの間に保存される溶解密閉容器中の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給され、溶解後1時間以内、3時間以内、5時間以内、6時間以内、12時間以内、24時間以内、48時間以内、72時間以内、または1週間以内に投与される。凍結保護剤は、凍結乾燥製剤、主としてトレハロースに含めることができる。他の適切な凍結保護剤には、他の二糖類(例えば、ショ糖またはラクトース)、アミノ酸、および重合体が含まれる。
いくつかの実施形態において、凍結乾燥は、pH範囲6～8をカバーする生物学的緩衝液中の1～20%トレハロース、1～10%トレハロース、5～15%トレハロース、7～13%トレハロース、9～11%トレハロース、または約10%トレハロースで実施することができ、生物学的緩衝液はPIPES、MOPS、HEPES、および/またはトリス緩衝液であり得る。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～400mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～300mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～200mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～100mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～50mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～10mMのトリス緩衝液を含む。他の適切な充填剤としては、グリシンおよびアルギニンが挙げられ、これらのいずれかは、0～0.05%の濃度で、またポリソルベート-80(0.005～0.01%の濃度で任意に含まれる)が含まれる。さらなる界面活性剤には、ポリソルベート20およびBRIJ界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。医薬組成物は、注射用溶液として調製することができ、吸収または分散を増加させるために使用されるもの(例えば、ヒアルロニダーゼ)のようなアジュバントとして有用な薬剤をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態において、凍結乾燥細胞の水分率は、約1～10%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～8%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～6%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～5%である。いくつかの実施形態において、水分量は、約3%、約4%、または約5%である。
いくつかの実施形態において、本開示は、2～8Coにおいて保存されたときに安定する薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は2～8Coにおいて保存されたときに少なくとも約3か月間安定である薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は2～8Coにおいて保存されたときに少なくとも約6か月間安定である薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は2～8Coにおいて保存されたときに少なくとも約9か月間安定である薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は2～8Coにおいて保存されたときに少なくとも約12か月間安定である薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、室温および相対湿度60%において保存された時に安定する薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、室温および相対湿度60%で保存された場合、少なくとも1ヵ月間安定である医薬組成物を提供する。
治療方法
いくつかの実施形態において、本開示は、疾患または障害を患う被験体を治療するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示された活性を特徴付け、投与し、決定するための方法、例えば、生細胞計数法を用いて測定、投与、および/または製造された人工微生物、例えば、遺伝子操作された細菌を投与することを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている遺伝子操作された細菌(例えば、抗癌分子、例えば、脱アデニル酸シクラーゼ遺伝子またはインターフェロン遺伝子アゴニストの刺激物質を産生することができる酵素を産生するための遺伝子を含み、または改変アルギニン生合成経路、例えば、欠失アルギニンリプレッサー、改変アルギニンリプレッサー結合部位、および/またはアルギニンフィードバック耐性N-アセチルグルタミン酸シンターゼ突然変異を符号化する遺伝子を含み、またはフェニルアラニン代謝酵素を産生するための遺伝子を含む)、本明細書に開示された活性を特徴付けし、投与し、決定するための方法、例えば、生細胞計数法を用いてアッセイ、投与、および/また製造された組成物およびその製剤は、疾患または障害、例えば、代謝性疾患、癌などを治療するために使用される。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示された活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法、例えば生細胞計数法を用いて測定、投与、および／または製造された人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌を投与することによって、高フェニルアラニン血症を軽減する、または高フェニルアラニン血症に関連する疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、高フェニルアラニン血症を減少させる方法、または高フェニルアラニン血症に関連する疾患を治療する方法は、本明細書に開示される医薬組成物のいずれか1つを投与することを含む。いくつかの実施形態において、高フェニルアラニン血症に関連する疾患は、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、非定型フェニルケトン尿症、恒久的な軽度の高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿性高フェニルアラニン血症、フェニルアラニン水酸化酵素欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、瀬川病、および肝疾患から選択される。
いくつかの実施形態において、本開示は、人工微生物、例えば、本明細書に開示された活性、例えば生細胞計数法を特徴付ける方法、および決定する方法を用いて測定、投薬、および/または製造された遺伝子操作された細菌を投与することによって、消化管の炎症の減少および/または腸のバリア機能の増強から恩恵を受ける、炎症性腸疾患(IBD)、自己免疫疾患、下痢疾患、関連疾患、および他の疾患を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、下痢性疾患は、急性水様性下痢、例えばコレラ、急性血性下痢、例えば赤痢、および持続性下痢からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、IBDまたは関連疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、膠原線維性大腸炎、リンパ球性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット病、中間体大腸炎、短腸症候群、潰瘍性直腸炎、直腸S状結腸炎、左側大腸炎、汎大腸炎、および劇症型大腸炎からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、疾患または状態は、急性散在性脳脊髄炎(ADEM)、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗GBM/抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群（APS）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患(AIED)、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵臓炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索性および神経性の神経障害、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー(CIDP)、慢性再発性多巣性骨髄炎(CRMO)、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト症候群、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病(視神経脊髄炎)、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症(GPA)、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ-ショーンライン紫斑病、妊娠性ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgA腎症、IgG4関連硬化性疾患、免疫調節性リポ蛋白、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、川崎症候群、ランベルト・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、靱帯状結膜炎、線状IgA病(LAD)、ループス(全身性エリテマトーデス)、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病(MCTD)、ムーレン潰瘍、ムシャーハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼球瘢痕性天疱瘡、視神経炎、回帰性リューマチ、PANDAS (レンサ球菌を伴う小児自己免疫性神経精神疾患)、腫瘍随伴性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症(PNH)、パリーロンベルグ症候群、パーソナージュ・ターナー症候群、パーズプラニティス（末梢性ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、I型、III型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発筋炎、心筋梗塞後症候群、心筋切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、純赤血球無形成、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、レストレスレッグス症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣の自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、スザック症候群、交感神経性眼症、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（TTP）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、1型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病(UCTD)、ぶどう膜炎、血管炎、小水疱性皮膚症、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群より選択される自己免疫障害である。いくつかの実施形態において、本発明は、下痢、血便、口内炎、肛門周囲疾患、腹痛、腹部痙攣、発熱、疲労、体重減少、鉄欠乏、貧血、食欲減退、体重減少、食欲不振、成長遅延、思春期発達の遅延、および皮膚、眼、関節、肝臓、胆管の炎症を含む疾患に関連する1つ以上の症状を減少、改善、または排除するための方法を提供するが、これらの疾患に限定されるわけではない。いくつかの実施形態において、本発明は、腸の炎症を減少させるおよび/または腸のバリア機能を増強するための方法を提供し、それにより、全身性自己免疫障害、例えば喘息を改善または予防する(Arrieta他、2015年)。
いくつかの実施形態において、本開示は、人工微生物、例えば、遺伝子操作されたバクテリア(例えば、改変アルギニン生合成経路、例えば、欠失アルギニンリプレッサー、改変アルギニンリプレッサー結合部位、および/またはアルギニンフィードバック抵抗性N-アセチルグルタミン酸合成酵素突然変異を含む)を投与することによって、高アンモニア血症に関連する疾患または障害を治療するための方法を提供し、これは、本明細書に開示されている生細胞カウント法のような方法を用いて測定、投与、および/または製造される。いくつかの実施形態において、障害は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素欠損症、シトルリン血症、N-アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、およびオルニチン、トランスカルバミラーゼ欠損症などの尿素サイクル障害である。代替の実施形態では、障害は、肝性脳症、急性肝不全、慢性肝不全、有機酸障害、イソ吉草酸尿症、3-メチルクロトニルグリシン尿症、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、脂肪酸酸化欠損症、カルニチンサイクル欠損症、カルニチン欠損症、β酸化欠損症、リシン尿性タンパク質不耐症、ピロリン-5-カルボン酸合成酵素欠損症、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症、炭酸脱水酵素欠損症、高インスリン血症・低アンモニア血症症候群、ミトコンドリア障害、バルプロエート療法、アスパラギナーゼ療法、完全非経口栄養法、グリシン含有溶液を用いた膀胱鏡検査、肺／骨髄移植後、ポートシステムシャント、尿路感染症、尿管拡張、多発性骨髄腫、化学療法、感染症、神経因性膀胱、腸内細菌の過剰増殖などがある。いくつかの実施形態において、高アンモニア血症はハンチントン病と関連している。いくつかの実施形態において、それらに関連する症状は、限定されるわけではないが、痙攣、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力喪失、急性脳症、脳浮腫、ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシス、および低体温症を含む。いくつかの実施形態において、障害は癌であり、例えば、癌の腫瘍微小環境はアンモニアの増加と関連している。
いくつかの実施形態において、本開示は、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌(例えば、抗癌分子、例えばdacAまたはSTINGアゴニストを産生することができる酵素を産生するための少なくとも1つの遺伝子を含む)を、本明細書に開示されている活性、例えば生細胞計数法を特徴づけ、投薬、および決定する方法を用いて測定、投薬、および/または製造して癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、癌は、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、胆管癌、膀胱がん、骨癌(例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫)、脳腫瘍(例えば、アストロサイトーマ、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫など)、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃腸癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛疾患、心臓癌、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭癌、下咽頭癌、白血病(例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病)、肝臓癌、肺がん、リンパ腫(AIDS関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホグキンリンパ腫、非ホグキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫など)、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔癌、副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体癌、網膜芽細胞腫、前立腺癌、横紋筋肉腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌(例えば基底細胞癌、黒色腫)、小腸癌、胃癌、奇形腫、精巣腫瘍、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、珍しい小児癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍から選択される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、人工微生物、例えば遺伝子操作された細菌、または非病原性、共生、またはプロバイオティクスであるそれらの組成物または製剤を、本明細書に開示されている活性、例えば生細胞計数法を特徴づけ、投薬、および決定するための方法を用いて測定することを含む。いくつかの実施形態において、治療の方法は、少なくとも1つのPME、例えばPALおよび/またはLAADを符号化する遺伝子の投与を含み、バクテリアPME遺伝子は誘導性プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態において、治療の方法は、非天然PME遺伝子、例えば天然PME遺伝子の追加コピーを含む遺伝子操作されたバクテリアを投与することを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、本質的にPME遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態において、治療の方法は、フェニルアラニントランスポーター、例えばPhePをさらに含む遺伝子操作されたバクテリアを投与することを含む。いくつかの実施形態において、治療の方法は、非天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子、例えば天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子の追加コピーを含む遺伝子操作されたバクテリアを投与することを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、本質的にはフェニルアラニントランスポーター遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、低酸素または嫌気性条件下で誘導される熱調節プロモーターまたはプロモーターである。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、被験体への投与前に誘導される。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、被験体への投与後に誘導される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法によって製造されるバクテリアは、1つ以上の必須遺伝子、例えばthyAまたはdapAについての栄養要求株である。
いくつかの実施形態において、処置の方法は、人工微生物、例えば、生細胞計数を用いて決定される遺伝子操作された細菌、組成物または製剤を投与することを含み、組成物または製剤は、少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の生細胞、例えば、生細胞の数を細胞の総数で割った生細胞を含む。
いくつかの実施形態において、治療法は、生細胞計数を用いて決定されるように遺伝子操作された細菌組成物または製剤を投与することを含み、組成物または製剤は、約1.9×108±1.8×10EU/グラム以下のエンドトキシン、約4.0×108EU/グラム以下のエンドトキシン、約3.0×108/グラム以下のエンドトキシン、約2.0×108/グラム以下のエンドトキシン、約1.0×108/グラム以下のエンドトキシン、または約5×107/グラム以下のエンドトキシンを含む。
いくつかの実施形態において、治療法は、人工微生物、例えば、遺伝子操作された細菌、組成物または製剤を、本明細書に開示されている活性を特徴づけ、投与、および決定をする方法、例えば生細胞計数法を用いて決定されるように投与することを含み、その組成物または製剤は、少なくとも約0.5μmol/時/109細胞、少なくとも約1.0μmol/時/109細胞、少なくとも約1.9±1.2μmol/時/109細胞、約1.5～10.0μmol/時/109細胞、または約1.5～5.0μmol/時/109細胞の速度でTCAを産生することが可能である。
いくつかの実施形態において、治療法は、人工微生物、例えば、遺伝子操作された細菌、組成物または製剤を、本明細書に開示されている活性を特徴づけ、投与、および決定をする方法、例えば生細胞計数法を用いて決定されるように投与することを含み、その組成物または製剤は、少なくとも約1.0μmol/時/109細胞、少なくとも約1.5μmol/時/109細胞、少なくとも約2.9±0.7μmol/時/109細胞、約2.0～10.0μmol/時/109細胞、または約2.0～5.0μmol/時/109細胞の速度でPPAを産生することができる。
いくつかの実施形態において、治療法は、人工微生物、例えば、遺伝子操作された細菌、組成物または製剤を、本明細書に開示されている活性を特徴づけ、投与、および決定をする方法、例えば生細胞計数法を用いて決定されるように投与することを含み、その組成物または製剤は、1～20%トレハロース、1～10%トレハロース、5～15%トレハロース、7～13%トレハロース、9～11%トレハロース、または約10%トレハロースをpH範囲6～8をカバーする生物学的緩衝液に含むが、その生物学的緩衝液は、PIPES、MOPS、HEPES、および/またはトリス緩衝液であってよい。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～400mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～300mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～200mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～100mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～50mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、組成物または製剤は、1～10mMのトリス緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、凍結乾燥されたバクテリアを含む医薬組成物を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、凍結乾燥されたバクテリアの水分率は、約1～10%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～8%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～6%である。いくつかの実施形態において、水分率は約3～5%である。いくつかの実施形態において、水分量は、約3%、約4%、または約5%である。
例示的な疾患、障害、および治療方法は、WO2016090343、WO2016200614、WO2017139697、WO2016183531、WO2017087580、WO2016141108、WO2017074566、WO2017136792、WO2017136795、WO2018129404、WO2019014391、WO2016210384、WO2017123418、WO2017123676、WO2016183531、WO2018237198、WO2016201380、US20170216370、およびWO2017040719に提供され、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１
バクテリアの構築
大腸菌ニッスルにおけるPALの誘導性製造を促進させるために、アナベアナバリアビリス("PAL1")またはフォトラブダス発光("PAL3")のPAL遺伝子、ならびに転写および翻訳の元素を合成し(Gen9、Cambridge、MA)、ベクトルpBR322にクローンを作った。PAL遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に置いた。誘導性FNRプロモーターまたはTetプロモーターの制御下で、PAL1およびPAL3のそれぞれについて、低コピーおよび高コピープラスミドを作製した。本明細書に記載されているプラスミドの各々を、以下の工程に従って本明細書に記載されている研究のために、大腸菌、例えば大腸菌ニッスルに形質転換した。試験管、溶液、キュベットはすべて4℃まであらかじめ冷却した。大腸菌ニッスルの一晩にわたる培養を、アンピシリンを含む溶原性ブロス(LB)5mL中で1:100に希釈し、0.4～0.6のOD600に達するまで増殖させた。 その後、大腸菌細胞を4℃で5分間2000rpmで遠心分離し、上澄みを除去し、細胞を4℃の水1mL中で再懸濁した。大腸菌を4℃で2000rpmで5分間再び遠心分離し、上澄みを除去し、細胞を4℃の水0.5mL中に再懸濁した。大腸菌を4℃で2000rpmで5分間再び遠心分離し、上澄みを除去し、最終的に細胞を4℃の水0.1mLに再懸濁した。エレクトロポレーターは2.5 kVに設定した。プラスミド(0.5μg)を細胞に加え、ピペッティングにより混合し、滅菌し、冷却したキュベットにピペットした。乾燥キュベットを試料室に入れ、電気パルスを加えた。直ちに室温SOC培地1mLを加え、混合物を培養管に移し、37℃で1時間培養した。細胞をアンピシリンを含むLB板上に広げ、一晩培養した。
いくつかの実施形態において、PALはニッスルゲノムに挿入された。ギブソンアセンブリーを用いて、ニッスルのmalPおよびmalT遺伝子座に相同なDNAの1000bpの配列を追加し、この配列を相同アームの間にクローニングした。KIKOプラスミドへのフラグメントの挿入の成功は、配列決定により確証した。PCRを用いて全領域を増幅した。このノックインPCR断片を用いて、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子を発現するエレクトロコンピテントニッスル株を形質転換した。形質転換後、細胞を37℃で2時間増殖させた。malPT遺伝子間領域での組込みに成功した形質転換体を、50μg/mLのカナマイシンで選択した。
いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターによって駆動されるフェニルアラニントランスポーターの高い親和性をもつ非天然コピー(例えば、天然の第2コピー)であるPhePを、相同組換えを介してニッスルゲノムに挿入した。最初にギブソンアセンブリーを用いて、ニッスルlacZ座位に相同なDNAの1000bp配列をR6K起点プラスミドpKD3に付加した。これは、これらの相同アーム間にクローン化されたDNAをニッスルゲノムのlacZ座位に組み込むことを標的としている。PCRを用いて、相同アームの全配列を含むこのプラスミド由来の領域、ならびにそれらの間のpheP配列を増幅した。このPCR断片を用いて、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子をコード化する温度感受性プラスミドを含む株である、エレクトロコンピテントニッスル-pKD46を形質転換した。形質転換後、細胞を37℃で20μg/mLのクロラムフェニコール上で平板培養する前に2時間増殖させた。37℃での増殖はpKD46プラスミドを硬化させる。無水テトラサイクリン(ATC)誘導性phePを含む形質転換体はlac‐マイナス(lac‐)およびクロラムフェニコール耐性であった。いくつかの実施形態において、フェニルアラニントランスポーターは、ニッスルに形質転換されたプラスミド上にあってもよい。
いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターによって駆動されるLAADを、本明細書に記載のニッスルゲノムに挿入した。一晩培養を1:100に希釈し、ATC (100ng/ml)で2時間誘導する前に初期の対数期まで増殖させた。細胞を遠心沈殿し、次のように培養した。細胞(1ml)を14mlの培養管中で好気的に培養し、250rpmで振盪した。微好気の条件では、細胞(1ml)を1.7mlの円錐管中で振盪せずに培養した。90%のN2,5%のCO2,5%のH2を供給するCoy嫌気性チャンパーで細胞を嫌気的に培養した。いくつかの実施形態において、LAADはニッスルに形質転換されたプラスミド上にあってよい。
例示的なフェニルアラニン代謝酵素、PAL、LAAD、プロモーター(例えば、FNRプロモーター)、フェニルアラニントランスポーター(例えば、PheP)、これらの構築物の機構および核酸配列、ならびにこれらの構築物を作製する方法をWO2017087580に示す。他のプロモーターを用いて遺伝子の発現を促し、他の遺伝子、例えばフェニルアラニン代謝遺伝子を用いてもよい。
例示的な細菌はフェニルアラニン代謝細菌SYNB1618である。Isabella他、2018 ヒト代謝疾患フェニルケトン尿症の合成生細菌治療薬の開発を参照されたい。SYNB1618を、嫌気性誘導性プロモーターPfnrSの調節制御下で、phePの2つの染色体統合コピーとstlAの3つのコピーで操作した。PfnrS促進剤は酸素の存在下では不活性であり、嫌気性感知転写活性化因子FNRにより嫌気的または微好気的条件下で活性化された。大腸菌ニッスルにおけるPfnrS-GFP転写融合を用いて、C57BL/6マウスにおける経口投与後のこのプロモーターの活性化および胃腸管からの回復を確認した。さらにstlAの2つのコピーをPtacプロモーターの制御下に置いたところ、in vitroでイソプロピルβ‐d‐1‐チオガラクトピラノシド(IPTG)による誘導が可能であった。SYNB1618は、アラビノース誘導性PBADプロモーターの制御下にpmaのコピーを含む。
実施例２
処理
凍結乾燥
発酵および下流工程を行って細胞を凍結乾燥緩衝液に入れた後、細胞懸濁物質を投入し深さ15mmで凍結乾燥トレイに装填する。凍結乾燥器を用いて次のサイクルを行う。-40℃で凍結し、-15℃で一次乾燥し、5℃で二次乾燥する。凍結乾燥サイクルの終了後、凍結乾燥ケーキを80メッシュのスクリーンを通してふるい分けて、流動性のある粉末にする。
噴霧乾燥
発酵および下流工程を行って細胞を噴霧乾燥緩衝液に入れた後、細胞懸濁液を、60℃の出口温度を目標とする120～135℃の入口温度を有する2-流体ノズルを通して噴霧乾燥し、流動性のある粉末にする。
凍結液
細胞を凍結保護緩衝液中に得るための発酵および下流工程を行った後、細胞懸濁液を-80℃で凍結する。
実施例３
生細胞数測定
Nexcelom社のCellometerを用いて生細胞数および生存率を求めた。凍結液体中に細菌を含む製剤については、試料を37℃の水浴中で解凍した。凍結乾燥菌体および噴霧乾燥菌体を含む製剤については、1gをバイアルに量り、PBS6mLで再水和した。その後、すべての細胞サンプルをPBS中で1:1000に希釈し、PBSまたはHBSS中でのSytox green染色でさらに1:1に希釈した(合計1:2000希釈)。この希釈液4μLをCellometerスライドに移した。スライドをCellometerに配置し、明視野および蛍光画像を得た。明視野で検出されたセル数(総細胞)と蛍光で検出された細胞数(非生細胞)の差から生細胞数を算出した。生存率は生細胞数/総細胞数として算出した。
実施例４
凍結液体、凍結乾燥又は噴霧乾燥バクテリアを含む製剤のin vitro活性
実施例2に開示された方法に従って調製された凍結乾燥、凍結液体、および噴霧乾燥バクテリアを含むバクテリアの組成物を、インビトロでの活性について特徴付けた。表2は、プロセス1(凍結液体)またはプロセス2(固形バッチ、凍結乾燥)によって調製されたフェニルアラニン代謝バクテリアの例示的な特性を示す。
[表２]
実施例５
In Vitro シミュレーション(IVS) 腸モデル
遺伝子操作した細菌株の生存性と代謝活性を特性化し、in vivoでの機能を予測するために、in vitroシミュレーション(IVS)腸モデルを設計して、酸素濃度、胃および膵臓酵素、胆汁を含むヒト消化管通過の重要な側面をシミュレートした。IVSモデルは、胃、小腸、大腸の状態をシミュレートするように設計された96ウェルマイクロプレート形式での一連の培養を含む(図9)。フェニルケトン尿症の治療のために設計された遺伝子操作株を研究するために、模擬胃および小腸を考察した。IVSモデルの胃および小腸部分は、Minekus他(2014)の、食品に適した標準化された静的in vitro消化法-国際的なコンセンサス-から適合させた。
腸通過をシミュレートするために、細菌細胞の凍結アリコートを、まず室温で解凍した。凍結乾燥した細菌細胞材料を4℃で保存したが、解凍を必要としなかった。細菌細胞濃度は、CFUプレート法、またはセロメーターによる生細胞および/または総細胞の計数によって測定した。細菌細胞のアリコートを、5.0 x 109細胞/mLで0.077M炭酸ナトリウム緩衝液に再懸濁した。次にこの溶液を等量の模擬胃液(SGF、表1および表2を参照のこと)と混合し、2%の酸素に調整されたCoy微好気性室中で振盪しながら37°Cで2時間培養した。細胞密度は2.5×109/mLであった。フェニルアラニン(Phe)を消費するように設計された遺伝子操作株の研究のために、SGFを20mM Pheで修正した。2時間のSGF培養後、等しい量の模擬腸液(SIF、表3および表4を参照のこと。)をSGF-炭酸水素ナトリウム混合物に加え、2%の酸素に調整されたCoy微好気性室中で振盪しながら37℃でさらに2時間培養した。SIFと混合した場合の細胞密度は1.25×109細胞/mLであった。
IVS研究において経時的にバクテリア生存率を測定するため、SGFおよびSIFアリコートを採取し、段階希釈を行い、LB寒天プレート上で平板培養した後、37°Cで一晩培養し、その後CFU計数を行った。ジアミノピメリン酸(DAP)の栄養要求性を有する株の場合、LB寒天プレートに100μg/mLのDAPを添加した。あるいは、生細胞および/または総細胞をセロメーターで計数することによって、経時的な細菌の生存率を測定した。Pheの消費を測定するために、SGFおよびSIFアリコートを定期的に採取し、テーブルトップ遠心機を用いて4000rpmで5分間遠心分離した。次いで、Phe、トランス桂皮酸(TCA)、フェニルピルビン酸(PP)を含む代謝産物のLC‐MS/MS計量のために無細胞上澄み液を採取した。無細胞上澄み液を、LC-MS/MS分析まで、任意に-20℃で保存した。
1.25×模擬の胃液(1.25×SGF)の組成物
[表３]
模擬の胃液(SGF)の組成物
［表４］
1.25×模擬の心臓流体(1.25×SIF)の組成物
［表５］
模擬の腸液(SIF)の組成物
［表６］
実施例６
生細胞数及びCFU方法
試験の少なくとも4日前から、非ナイーブの接合性体雌BTBR-Pahenu2/enu2マウス(約15～25週齢)をフェニルアラニンを含まない固形飼料と水に入れ、0.5g/Lのフェニルアラニンを補給した。1日目に、マウスの体重を測定し、体重に基づいてグループに無作為に振り分けた。その後、マウスにバクテリアを経口投与し、直ちに代謝ケージに移した。初回バクテリア投与の1時間後と2時間後にそれぞれ2回追加投与した。最初のバクテリア用量から3時間後、総尿サンプルを採取し、体積を記録した。試験終了後、動物を自宅のケージに戻した。
細胞を調製するため、SYN094及び凍結液体SYNB1618(SYNB1618バッチA)を37℃で融解した。凍結乾燥(バッチC)及び噴霧乾燥(バッチD)SYNB1618を配合グループ別に調製した。細胞をPBSで5.03e10生細胞/mlに希釈し、1M重曹で9:1に混合した。各マウスは合計900uLを摂取させ、4.08e10の生細胞/マウスとした。
初回バクテリアを投与して3時間後に尿サンプルを採取した。尿中の馬尿酸(HA)レベルは質量分析計を用いて測定した。例えば、WO2017087580を参照されたい。馬尿酸の測定総量を図5Aに描かれており、SYN094では0.031μmol±0.006、冷凍液体SYNB1618では2.569μmol±0.468、凍結乾燥SYNB1618では3.926μmol±0.222、噴霧乾燥SYNB1618では2.217μmol±0.495であった。凍結乾燥および噴霧乾燥SYNB1618で測定したHA量は凍結液体SYNB1618と変わらなかったが、凍結乾燥SYNB1618は噴霧乾燥SYNB1618より非常に高いHA回復をもたらした。
実施例７
生細胞数及びCFU方法
試験の少なくとも4日前から、非ナイーブの接合性雌性BTBR-Pah enu2/enu2マウス(約12～22週齢)に、フェニルアラニンを含まない固形飼料と水を与え、0.5g/Lのフェニルアラニンを補給した。1日目に、マウスの体重を測定し、体重に基づいてグループに無作為に振り分けた。その後、マウスにバクテリアを経口投与し、直ちに代謝ケージに移した。初回バクテリア投与の1時間後と2時間後にそれぞれ2回追加投与した。初回のバクテリア投与から3時間後、総尿サンプルを採取し、体積を記録した。試験終了後、動物を自宅のケージに戻した。
細胞を調製するため、凍結液体SYNB1618(SYNB1618バッチA)を37℃で解凍した。凍結乾燥および噴霧乾燥(バッチB)SYNB1618を配合グループ別に調製した。細胞をPBSで5.03e10生細胞/mlに希釈し、1M重曹で9:1に混合した。各マウスは、合計で900uLを摂取させ、5e10の生細胞/マウスとした。
初回バクテリアの投与から3時間後に尿サンプルを採取した。尿中の馬尿酸(HA)レベルは質量分析計を用いて測定した。例えば、WO2017087580を参照されたい。馬尿酸の測定総量は図6Bに描かれており、冷凍液体と噴霧乾燥SYNB1618では3.107μmol±0.743と1.563μmol±0.146で、有意な差はなかった。
実施例８
非ヒト霊長類(NHP)研究
約2～5歳の未処置の雄型カニクイザル10匹を2つのグループ(n=5)に無作為に振り分け、一晩絶食させた。投与前に、基準線となるフェニルアラニン濃度について血漿を採取した。動物は、採尿用のクリーニング回収パンで分かれた。その後、各動物に500g/Lペプトン11mL、0.36M重曹5mL、および凍結液SYNB1618(SYNB1618バッチA)または凍結乾燥SYNB1618(1回投与あたり1.3 x 10 11生細胞)のいずれかを投与した。投与して0.5、1、2、4、6時間後に血漿サンプルを採取した。投与後6時間の終了時に、尿の総量を測定し、記録し、採取した。
凍結液体SYNB1618(SYNB1618バッチA)を37℃で解凍した。凍結乾燥SYNB1618をPBSに再懸濁した。凍結液及び凍結乾燥菌は、いずれも製剤緩衝液で2.6×1010生細胞/mLに希釈した。
血漿フェニルアラニン量と尿馬尿酸(HA)回収率を質量分析計で測定した。血漿フェニルアラニン量は、凍結液(0.0771mM±0.005)では投与2時間後、凍結乾燥菌(0.0690mM±0.003)では投与1時間後に最高量を示した。いずれの採取時点においても2つのグループ間に有意な差は認められなかった(p>0.05)。凍結液SYNB1618の尿HA回収率は凍結液SYNB1618では49.599μmol±10.498であり、凍結乾燥SYNB1618と有意な差はなく、74.770μmol±12.044であった(p=0.1625)。
実施例９
In Vivo SYNB1618
試験の少なくとも4日前から、非ナイーブな野生型雌C57Bl/6マウス(約14週齢)を、フェニルアラニンを含まない固形飼料および0.5g/Lフェニルアラニンを補給した水を置いた。1日目に、マウスの体重を測定し、体重に基づいてグループに無作為に振り分けた。その後、マウスにバクテリアを経口投与し、直ちに代謝ケージに移した。初回バクテリア投与の1時間後と2時間後にそれぞれ2回追加投与した。初回のバクテリア投与から3時間後、尿のサンプルを採取し、総体積を記録した。試験終了後、動物を自宅のケージに戻した。
細胞を調製するために、バッチA(凍結液体SYNB1618)を37℃で解凍した。凍結乾燥固体バッチ1、2、および3を、本明細書に記載の通りに調製した。細胞をPBSで9.43e10生細胞/mlに希釈し、1M重曹で9:1に混合した。各マウスは、合計で600uLを摂取させ、5.09e10個の生細胞/マウスとした。
初回バクテリアの投与から3時間後に尿のサンプルを採取した。尿中馬尿酸(HA)量は質量分析計を用いて測定した。例えば、WO2017087580を参照されたい。測定した馬尿酸の総量は図8の右手棒グラフに図示されており、バッチ1、バッチ2及びバッチ3でそれぞれ5.377μmol±0.440、5.353μmol±0.995及び5.260μmol±0.499であった。治療グループの間で有意な差はなかった(p>0.05)。
実施例10
凍結乾燥菌体を含む製剤の安定性
安定性試験は、SYNB1618原薬及び製剤について、5±3℃、25±5℃/60±5%RHで6ヵ月間実施する。試験開始は、検体が適切な保存条件に置かれた日時と定めた。
バルク製剤は、密封パウチ内のポリエチレン袋または密封HDPEボトルに保管した。いずれも5±3℃、25±5℃/60±5%RHの安定性室に保存し、試験スケジュールごとに2週間、1ヵ月、2ヵ月、3ヵ月、6ヵ月で保存から外した。アリコートを生細胞、生存率(生細胞/全細胞)、効力、および固形外観について評価した。各時点の結果を、最初の時点および所定の定義した規格で観察された結果と比較した。各時点において、バルク製剤5g及び製剤2瓶を用いて試験を行った。
実施例11
PKU菌株の生菌数測定
細菌株およびSytox Green染色は、既述のとおり調製した。SYNB1618の3つのバッチ(#12、#17及びCTM)を異なる染色濃度及び培養時間で分析した。データは、全細胞/mL、生細胞/mL、および生存率の3つの主要属性について分析した。
#12をSytox Green濃度2.5、5、7.5、10、12、および15uMで培養した。各濃度について、2、4、6、8分間染色を行った。総細胞/mLはSYTOX Green染色濃度および染色時間の影響を受けなかった。すべての染色濃度および時点にわたる総細胞数の平均は、SD = 7.76E9細胞/mlで1.32E11細胞/mlであり、%CV = 5.88、N = 24であった。2.5uMでの染色濃度の結果は、7.5uMでの生細胞/mLと同様であった。5uM染色濃度は、1.25E11生細胞/mlをもたらした。(図12A-12C)
凍結液体形態の#12の33個の複製についても、生細胞計数法を用いてアッセイし、平均総細胞数、死細胞数、生細胞数/mLを分析した。生細胞/mLの%CVは12.3であった。(図14A-14C)
バッチ17をSytox Green濃度2.5、5、7.5、10、および15uMで培養した。各濃度について、2、4、6、8分間染色を行った。いずれの染色濃度においても、CVは<2%であった。(図12D-12F)
CTMをSytox Green濃度5、7.5、10、および15uMで培養した。各濃度について、2、4、6、8分間染色を行った。総細胞数/mLは染色濃度及び時間によって変化しなかった。(図12G-12I)
実施例１２
UCD及び癌治療細菌株の生細胞数測定
SYNB1020(耐フィードバック性版のN-アセチルグルタミン酸シンターゼ酵素ArgA、argfbr、および欠失アルギニンリプレッサーArgRを含む。Kurtz他、An Engineered E.coli Nissleはマウスにおける高アンモニア血症および生存を改善し、健康なヒトにおける用量依存性露光を示す、2019年を参照されたい。)を、5、7.5、10、および15uMのSytox Green濃度で培養した。各濃度について、2、4、6、8分間染色を行った。総細胞数/mLは、染色濃度の違いや経時的な変化は認められなかった。(図13A-13C)
dacA遺伝子(SYNB1891)を含む例示的細菌を、5および7.5uMのSytox Green濃度で培養した。各濃度について、1、2および3分間染色を行った。5μMでの2つの複製と7.5μMでの2つの複製は、生細胞/mLおよび%生存率について非常に類似していた。(図13D-13F)
実施例１３
生細胞の直線範囲の判定/mL
PKU凍結乾燥株SYNB1618のいくつかの希釈液を試験し、細胞数を求め、線形性について分析した。計数した861～2547個の細胞では、R2= 0.84、CVはこの範囲の逆計算された力価で9.85%であった。賦形剤(pH 7.5の50mMトリス緩衝液中10%のトレハロース)を添加したSYNB1618についても、生細胞/mLの線形性を試験し、同じ線形範囲が適用可能であった(図15A-15D)。
GMPレベルのSYNB1891バッチについて、セロメーターの線形性を試験した。R2=900-2400レンジの場合は0.84であった。(図15EおよびF)
生存率測定の線形性は、加熱で一部の細胞を死滅させることによって試験紙、SYTOX色素がDNAに結合できるように膜を十分に透過性にした。次に、死滅させた試料を種々の割合で元の生きた試料に加え、25%、50%、75%、および100%の生細胞の混合物を作った。生存率は約±7%の誤差であり、セロメーター生存率測定は25%以上の生存率で直線であり、最適な範囲は50～100%の生存率であった。(図15G)
 関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月２９日に出願された米国仮出願第６２／８４０，２８１号、および２０１９年１２月１１日に出願された米国仮出願第６２／９４６，７８５号の利益を主張し、それらの内容は参照によりその全体が援用される。
細菌細胞カウントを決定するために、「広く使用されているゴールドスタンダードの方法はコロニー形成単位（ＣＦＵ）」であり、これは分裂している細菌細胞の数に基づく。Ｈａｚａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２年）Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｓ ｉｎ ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ；Ｊｕｎｇ ａｎｄ Ｊｕｎｇ（２０１６年）Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎｙ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｏｎ－ｃｈｉｐ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙも参照もされたい。ＣＦＵ法は、「この方法では生細菌（ｖｉａｂｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）のみがカウントされる」ため、有利であると記載されている。プロバイオティクス細菌の投与では、「製品１ｇ当たりのコロニー形成単位が重要なパラメータである。最小有効濃度に関する情報はまだ不十分であるが、プロバイオティクス製品の最低濃度は１０６ＣＦＵ／ｍＬまたはグラムであることが一般的に受け入れられている」。Ｋｅｃｈａｇｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１３年）プロバイオティクスの健康上の利点：レビュー（Ｈｅａｌｔｈ ｂｅｎｅｆｉｔｓ ｏｆ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ： ａ ｒｅｖｉｅｗ）。生きたバイオ治療製品に関する米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による最近の指針も同様に、「生きた微生物製品の効力は、一般に、単位または用量あたりの生細胞（すなわち、コロニー形成単位（ＣＦＵ））の尺度である」、および「初期の臨床開発中、効力アッセイはＣＦＵの評価であり得る」とアドバイスしている。生きたバイオ治療製品を使用したＦＤＡ初期臨床試験：化学、製造、およびコントロール情報：業界向け指針（ＦＤＡ Ｅａｒｌｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｗｉｔｈ Ｌｉｖｅ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ， ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ： Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）（２０１６年６月）。しかし、臨床効果を得るのに必要な細菌の濃度は、「コロニー形成単位（ｃｆｕ）で１００倍以上」変動する可能性がある。ＭｉｎｅｌｌｉおよびＢｅｎｉｎｉ（２００８年）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ。
いくつかの実施形態では、本開示は、所望の治療用分子を産生するための１つ以上の遺伝子を含む操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）、ならびにその組成物および製剤、ならびに、例えば生細胞カウンティング法を使用して、当該細菌、組成物および製剤の活性を特徴付ける、投与する、および測定するための方法、を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、例えば本明細書に開示される生細胞カウンティング法を使用して、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）、組成物、および製剤を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して、アッセイ、投与、および／または製造された、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）、組成物、および製剤を投与することによって、疾患または障害を患っている対象を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して、アッセイ、投与、および／または製造された、遺伝子操作された細菌（例えば：抗癌分子、例えばデアデニレートシクラーゼ遺伝子またはインターフェロン遺伝子刺激因子アゴニストを産生することができる酵素を産生するための遺伝子を含む；または改変されたアルギニン生合成経路（例えば、欠失されたアルギニンリプレッサー、改変されたアルギニンリプレッサー結合部位、および／またはアルギニンフィードバック耐性Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ変異）をコードする遺伝子を含む；またはフェニルアラニン代謝酵素を産生するための遺伝子を含む）、その組成物および製剤は、疾患または障害（例えば、代謝性疾患、癌など）を患っている対象を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、微生物、組成物または製剤は、対象における高フェニルアラニン血症を軽減することができ、かつ／または、高フェニルアラニン血症に関連する疾患または障害（例えば、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ））を処置することができる。いくつかの実施形態では、微生物、組成物または製剤は、対象における過剰なアンモニアを減少させることができ、かつ／または、高アンモニア血症に関連する疾患または障害（例えば、尿素回路障害（ＵＣＤ）または癌）を処置することができる。いくつかの実施形態では、微生物、組成物または製剤は、抗癌分子、例えばデアデニレートシクラーゼまたはインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストを産生することができる酵素を産生することができ、かつ／または、癌を処置することができる。
本開示は、例えば生細胞カウンティングによって、微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法を記載している。本明細書に開示される生細胞カウンティング法は、生きている分裂細胞および生きている非分裂細胞の数を決定することを含む。対照的に、コロニー形成単位（ＣＦＵ）法は、一般に、生きている分裂細胞を捕捉するが、生きている非分裂（すなわち、非コロニー形成）細胞は捕捉しない。本開示は、生きている非分裂の操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）が、所望の活性（例えば、１つ以上の治療用分子）を産生することができ、したがって分裂する能力を持たないにもかかわらず、生存可能かつ効力があることを実証する。したがって、いくつかの実施形態では、微生物の活性を特徴付ける、投与する、および測定するための本明細書に開示される方法（例えば、生細胞カウンティング法）は、ＣＦＵカウンティング法よりも改善された（例えば、より正確な）所望の活性（例えば、治療用分子の産生または機能）の測定を提供する。いくつかの実施形態では、微生物の活性を特徴付ける、投与する、および測定するための本明細書に開示される方法（例えば、生細胞カウンティング法）によってアッセイされた、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の凍結乾燥組成物および製剤は、非凍結乾燥細菌の効力以上の効力を有する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティング法によってアッセイされた操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）、ならびにその組成物および製剤は、安定した貯蔵寿命を有する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティング法は、ＣＦＵ法よりも改善された（例えば、より正確な）細菌活性、治療用量、および／または治療有効性の測定を提供する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングは、ＣＦＵ法よりも改善された細菌を製造および／または投与するための方法をもたらす。
図１は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患（例えばＰＫＵ）の処置のための遺伝子操作された細菌の概略図を示す。また、図１には、遺伝子操作された細菌の量を増やして投与された対象におけるトランス－ケイ皮酸（ＴＣＡ）の形成を示すグラフ、および遺伝子操作された細菌の量を増やして投与された対象における馬尿酸（ＨＡ）の排泄を示すグラフも示されている。Ｉｓａｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，（２０１８年）“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ”を参照されたい。その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。 図２は、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）を含む医薬組成物を製造するプロセスの概略図を示す。 図３は、凍結、凍結乾燥、または噴霧乾燥された遺伝子操作された細菌の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。表は、凍結、凍結乾燥または噴霧乾燥された細菌組成物の総細胞カウント、生細胞カウント、およびＣＦＵカウントを示す。ＴＥＭを使用して細菌の細胞膜の完全性を特徴付けるための方法は、当技術分野で既知である。例えば、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５年）“Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｇｒａｎｕｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｗａｕｔｅｒｓｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６ ｂｙ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”を参照されたい。その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。 図４Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、フェニルアラニンが消費され、ＴＣＡおよびフェニルピルビン酸（ＰＰ）が産生される速度を示すグラフを示している。速度は細胞の数に対して正規化される。図４Ｂは、胃腸管をシミュレーションするために使用されるＩｎ Ｖｉｔｒｏシミュレーション（ＩＶＳ）消化管モデルを示す概略図と、フェニルアラニンを代謝するように遺伝子操作された（凍結または凍結乾燥された）細菌と比較して、野生型大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株（ＥｃＮ）によるＴＣＡ産生を示すグラフを含む。速度は、細胞の総数および生細胞の数に対して正規化されて示される。図４Ｃは、未改変の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ０９４）および（凍結、凍結乾燥、または噴霧乾燥された）フェニルアラニンを代謝するように遺伝子操作された細菌（ＳＹＮＢ１６１８）によって、シミュレートされた腸液（ＳＧＦ）においてＰｈｅが消費される速度を示す棒グラフを示している。 図５Ａは、（凍結された、凍結乾燥された、または噴霧乾燥された）フェニルアラニン代謝菌ＳＹＮＢ１６１８の、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフを示している。マウスのすべての群に、ほぼ同じ生細胞カウントを有する細菌組成物を投与した。図５Ｂは、（凍結または凍結乾燥された）フェニルアラニン代謝細菌の、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す。ＮＨＰのすべての群に、ほぼ同じ生細胞カウントを有する細菌組成物を投与した。棒グラフは、単一の時点で測定された尿中ＨＡレベルを示している。散布図は、複数の時点で測定されたフェニルアラニンレベルを示している。 図６Ａは、フェニルアラニンを代謝するように遺伝子操作された、凍結、噴霧乾燥、または凍結乾燥された細菌（ＳＹＮＢ１６１８）のＣＦＵ／ｍＬ、生細胞／ｍＬおよび生細胞／ＣＦＵを示す表を示している。図６Ｂは、（凍結または噴霧乾燥された）フェニルアラニン代謝ＳＹＮＢ１６１８を投与されたマウスにおいて排泄された尿中ＨＡの量を示す棒グラフを示している。マウスのすべての群に、ほぼ同じ生細胞カウントを有する遺伝子操作された細菌の組成物を投与した。図６Ｃは、フェニルアラニンを分解するように遺伝子操作された細菌を含む製剤を投与されたマウスにおいて排泄されたＨＡの量を示す棒グラフを示しており、ここで当該製剤は、凍結、凍結乾燥、または噴霧乾燥された細菌を含む。３つのすべての群のマウスに同じ生細胞カウントを投与した。 図７Ａは、同じ方法を使用して調製されたフェニルアラニン代謝細菌の３つのバッチ（固体バッチ）の安定性を示すグラフを示している。ここで、生存率％は、細胞の総数で除した生細胞の数として算出される。細菌は２～８℃の間で保管された。図７Ｂは、室温で保管された凍結乾燥細菌の安定性を示す。 図８は、同じ方法を使用して調製されたフェニルアラニン代謝細菌の３つのバッチ（固体バッチ）の生存率を示す。ここで、生存率は、製剤１ｇ当たりの生細胞の数によって測定される。フェニルアラニンが消費されてＴＣＡが産生されるｉｎ ｖｉｔｒｏ速度、およびマウスの尿中ＨＡレベルも示される。 図９は、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏシミュレーション（ＩＶＳ）消化管モデルの概略図を示す。 図１０は、液体製剤を使用した、尿中の馬尿酸（ＨＡ）および標識Ｄ５－ＨＡを示す。ＣＦＢ＝ベースラインからの変化。ＣＦＰ＝プラセボからの変化。ＨＶ＝健康なボランティア。ＰＫＵ＝フェニルケトン尿症患者。 図１１は、固形経口（凍結乾燥）製剤を使用した、尿中の馬尿酸（ＨＡ）および標識Ｄ５－ＨＡを示す。ＣＦＢ＝ベースラインからの変化。ＣＦＰ＝プラセボからの変化。 図１２Ａ～Ｉは、Ｓｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ濃度および培養時間の範囲にわたる、高フェニルアラニン血症に関連する疾患（例えばＰＫＵ）の処置のための例示的な遺伝子操作された細菌の生細胞カウンティングを示す。総細胞／ｍＬ、生細胞／ｍＬおよび生存率％を算出した。 図１３Ａ～Ｆは、Ｓｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ濃度および培養時間の範囲にわたる、ＵＣＤを処置するための例示的な遺伝子操作された細菌（ＳＹＮＢ１０２０）および癌を処置するためのｄａｃＡを含む例示的な遺伝子操作された細菌（ＳＹＮＢ１８９１）の生細胞カウンティングを示す。総細胞／ｍＬ、生細胞／ｍＬおよび生存率％を算出した。 図１４Ａ～Ｃは、生細胞カウンティングを使用して、ＰＫＵを処置するための凍結液体形態の例示的な遺伝子操作された細菌の測定値を示す。３３個のレプリケートについて、平均の総細胞／ｍＬ、死細胞／ｍＬおよび生細胞／ｍＬを算出した。 図１５Ａ～Ｇは、ＰＫＵを処置するための例示的な遺伝子操作された細菌（ＳＹＮＢ１６１８）、および癌を処置するためのｄａｃＡを含む例示的な遺伝子操作された細菌（ＳＹＮＢ１８９１）を使用して、希釈の範囲にわたる生細胞／ｍＬの線形性を示す。また、生存率パーセント測定の線形性は、生サンプル（ｌｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ）に比例量の死滅細胞を加えることによっても分析された。
本開示は、とりわけ、所望の治療用分子を産生するための１つ以上の遺伝子を含む操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）ならびにその組成物および製剤；前記細菌、組成物、および製剤の活性を、生細胞カウンティング法などを使用して特徴付ける、投与する、および／またはアッセイするための方法；活性を特徴付ける、投与する、および／またはアッセイするための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して測定される細菌、組成物、および製剤を製造するための方法；ならびに、活性を特徴付ける、投与する、および／またはアッセイするための方法を使用して（例えば、生細胞カウンティング法を使用して）測定される前記細菌、組成物、および製剤を投与することによって、疾患または障害を処置するための方法に関するものである。一態様では、生細胞カウンティング法は、分裂細胞および非分裂細胞の両方、例えば、遺伝子操作された細菌細胞を捕捉する。細菌は、生きていて分裂していてもよいし、生きていて分裂していなくてもよいし、または生きておらず分裂していなくて（例えば、死んでいる）もよい。いくつかの実施形態では、前記方法（例えば、生細胞カウンティング法）は、ＣＦＵ法と比較して、細菌活性、投与、および／または治療有効性のより正確な測定値を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法（例えば、生細胞カウンティング法）は、ＣＦＵ法と比較して、細菌を製造および投与するためのより効率的な方法を提供する。
開示をより容易に理解できるようにするために、最初に特定の用語を定義する。これらの定義は、開示の残りの部分に照らして読み、当業者が理解するものでなければならない。別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。詳細な説明全体を通して、追加の定義が示される。
本明細書で使用される場合、「生細胞カウント法」または「生細胞カウンティング法」は、サンプル中に存在する生細胞（例えば、細菌細胞）の数を測定するための方法（例えば、顕微鏡的方法）を指す。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティング法は、生細胞と非生細胞を区別するために蛍光色素を使用する。「生細胞カウント」とは、生細胞カウンティング法によって決定された、サンプル中に存在する生細胞の数を指す。いくつかの実施形態では、生細胞カウントには、生きている分裂細胞および生きている非分裂細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、生細胞カウント（例えば、医薬組成物の生細胞カウント）は、ＣＦＵカウントよりも、所望の細胞活性のより正確な測定値を提供する。
本明細書で使用される場合、「生きている」または「生」細胞は、（１）無傷の膜（例えば、分裂細胞とほぼ同様の膜透過性を示す）、（２）細胞外環境に比べて還元的な細胞内環境（一方、非生細胞は、細胞外空間のそれと区別できない細胞内還元環境を有し得る）、（３）膜電位を維持する能力、および／または（４）プロトン勾配を維持する能力、を有する細胞を指す。いくつかの実施形態では、生細胞は、無傷の膜を有する（例えば、適切なコントロール（例えば、分裂細胞）とほぼ同様の膜透過性を示す）。いくつかの実施形態では、生細胞は、無傷の膜を有し（例えば、適切なコントロールとほぼ同様の膜透過性を示す）、かつ膜電位を維持する能力を有する。「非生」細胞とは、上記の特性の１つ以上を欠く（例えば、細胞膜の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が損なわれている）細胞を指す。いくつかの実施形態では、生細胞には、分裂細胞および非分裂細胞が含まれるが、非生、非分裂細胞（例えば、細胞膜の完全性が損なわれた非生、非分裂細胞）は除外される。いくつかの実施形態では、細胞膜の完全性は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して特徴付けることができ、その方法は当技術分野で既知である。例えば、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５年）“Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｇｒａｎｕｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｗａｕｔｅｒｓｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６ ｂｙ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”を参照。その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、細胞膜の完全性は、蛍光色素に対する透過性に基づいて特徴付けることができ、細胞膜の完全性が損なわれた細胞のみが色素透過性を示す。
本明細書で使用される場合、「生存パーセント」または「生存可能パーセント」は、細胞の総数で割った生細胞の数を指す。
本明細書で使用される場合、「分裂細胞」は、分裂することができる細胞、例えば、固形培地上にプレーティングされたときに細菌コロニーを形成する細胞を指す。「非分裂細胞」は、分裂することができない細胞、例えば、固形培地上にプレーティングされたときに細菌コロニーを形成しない細胞を指す。いくつかの実施形態では、非分裂細胞は生細胞であり得る。いくつかの実施形態では、非分裂細胞（例えば、医薬組成物中の細菌細胞）は、治療用分子を産生することができる。したがって、例えば治療用細菌組成物中の、生きている分裂細胞と生きている非分裂細胞の数をカウントすることは、他の方法（例えば、ＣＦＵ）よりも正確な活性の測定値を提供し得る。いくつかの実施形態では、生きている非分裂細胞は、分裂することができないにもかかわらず、所望の分子（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）を産生する能力に関して活性である。いくつかの実施形態では、生きている非分裂細胞は、還元環境を有し、細胞膜電位を維持し、かつ／または機能的代謝などを有し得る。
本明細書で使用される場合、「総細胞」は、サンプル中の生細胞および非生細胞の合計を指す。
いくつかの実施形態では、本開示の操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、疾患または障害の処置のための１つ以上の遺伝子（例えば、非天然遺伝子）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、所望の分子、例えば治療用分子（例えば、フェニルアラニン代謝酵素）をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子は、所望の分子、例えば治療用分子（例えば、酪酸）を産生するための生合成経路をコードし、遺伝子カセットと呼ばれ得る。
本明細書で使用される場合、「治療用」分子（例えば、タンパク質）は、対象において治療効果を生み出すことができる分子を指す。例えば、ＩＬ－１０などの治療用分子は、対象において炎症を軽減することができる可能性がある。いくつかの実施形態では、治療用分子は、対象において１つ以上の有毒分子を減少させることができる。例えば、フェニルアラニン代謝酵素は、ＰＫＵを有する対象において過剰で有毒なフェニルアラニンを代謝することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、１つ以上の治療用分子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、対象への投与前に１つ以上の治療用分子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、対象への投与後に１つ以上の治療用分子を発現する。例えば、治療用分子を産生するための遺伝子が、対象への投与後に誘導される。
本明細書で使用される場合、「活性」とは、細胞または組成物（例えば、細菌または細菌組成物）の所望のパラメータ（例えば、分子の産生量（ｏｕｔｐｕｔ））を指す。いくつかの実施形態では、「治療活性」とは、例えば細胞モデル、動物モデルまたはヒト患者においてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで測定される、細胞からの所望の治療用分子の産生を指す。いくつかの実施形態では、活性は、細胞からの所望の治療用分子の量または機能を指す。いくつかの実施形態では、活性は、１つ以上の所望の治療用分子が産生される速度を指す。いくつかの実施形態では、活性は、例えば有毒化合物または中間体のレベルによって測定される、１つ以上の有毒化合物（例えば、細胞外の有毒化合物）が代謝または減少される速度を指す。
いくつかの実施形態では、「効力」は、例えばＣＦＵカウント、総細胞カウント、または生細胞カウントによって測定される、集団または所定数の細胞についての活性を指す。いくつかの実施形態では、効力は、（例えば組成物中の）細胞の数で乗算された活性を指す。いくつかの実施形態では、効力は、細胞の所定の質量、例えば重量について観察される活性を指す。いくつかの実施形態では、効力は、所定量の細胞について観察される活性を指す。
本明細書で使用される場合、「正確さ」とは、測定値（例えば、細胞カウント）が本明細書に記載される活性と相関している程度を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の生細胞カウントは、ＣＦＵカウントと比較して、より正確な活性（例えば、治療用分子の機能）の測定値を提供する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングは、ＣＦＵカウンティングよりも、対象における活性、治療活性、および／または治療有効性をより良く（例えば、より正確に）反映する。したがって、いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングによる投与は、ＣＦＵカウンティングよりも改善される（例えば、より正確である）。
本明細書で使用される場合、「ＣＦＵ」とは、ＣＦＵカウンティング法によって決定されるコロニー形成単位を指す。「ＣＦＵカウント」は、サンプル中に存在するＣＦＵの数を指す。理論に拘束されることなく、ＣＦＵはおよそ１つの分裂細胞によって形成されるので、ＣＦＵカウントは一般的に組成物中に存在する分裂細胞の数の測定値と見なされる。一般的に、ＣＦＵカウントは、生きている分裂細胞を含むが、生きている非分裂細胞を除外する。
本明細書で使用される場合、細菌組成物の「安定性」とは、該組成物が所与の期間にわたって変化する相対的な程度を指す。いくつかの実施形態では、組成物の安定性は、所与の期間にわたる生細胞の数の変化によって定義される。いくつかの実施形態では、組成物の安定性は、所与の期間にわたる活性の変化を指す。
「フェニルアラニン」および「Ｐｈｅ」は、式Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨのアミノ酸を指すために使用される。フェニルアラニンは、チロシン、ドーパミン、ノルエピネフリンおよびエピネフリンの前駆体である。Ｌ－フェニルアラニンは必須アミノ酸であり、主に食物タンパク質に含まれるフェニルアラニンの形態である；立体異性体のＤ－フェニルアラニンは食物タンパク質に含まれる量が少ない；ＤＬ－フェニルアラニンは両方の形態の組み合わせである。フェニルアラニンは、Ｌ－フェニルアラニン、Ｄ－フェニルアラニンおよびＤＬ－フェニルアラニンの１つ以上を指す場合がある。
「フェニルアラニン代謝酵素」または「ＰＭＥ」は、フェニルアラニンを分解することができる酵素を指すために使用される。当技術分野で既知の任意のフェニルアラニン代謝酵素が、操作された微生物、遺伝子操作された細菌によってコードされ得る。ＰＭＥには、限定されるものではないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノトランスフェラーゼ、Ｌ－アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが含まれる。
「フェニルアラニンアンモニアリアーゼ」および「ＰＡＬ」は、フェニルアラニンをトランス－ケイ皮酸およびアンモニアに変換または処理するフェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）を指すために使用される。トランス－ケイ皮酸は毒性が低く、哺乳動物の肝酵素によって馬尿酸に変換され、馬尿酸が尿中に分泌される。ＰＡＬは、過剰なフェニルアラニンを代謝するために、酵素ＰＡＨの代わりに使用され得る。ＰＡＬ酵素活性はＴＨＢ補因子活性を必要としない。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、原核生物種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。別の実施形態では、ＰＡＬは、真核生物種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を含むがこれらに限定されない細菌種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、アナベナ・バリアビリスに由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされ、本明細書では「ＰＡＬ１」と称される（Ｍｏｆｆｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， ２００７年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、フォトラブダス・ルミネッセンスに由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされ、本明細書では「ＰＡＬ３」と称される（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， ２００５年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、酵母種、例えば油脂生産酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９８５年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、植物種、例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる（Ｗａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５年）。ＰＡＬの任意の適切なヌクレオチドおよびアミノ酸配列、またはその機能的断片を使用することができる。
「Ｌ－アミノ酸デアミナーゼ」および「ＬＡＡＤ」は、Ｌ－アミノ酸の立体特異的な酸化的脱アミノ化を触媒し、それぞれのケト酸、アンモニアおよび過酸化水素を生成する酵素を指すために使用される。例えば、ＬＡＡＤはフェニルアラニンからフェニルピルビン酸への変換を触媒する。複数のＬＡＡＤ酵素が当技術分野で知られており、その多くは、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）およびモルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）などの細菌、または毒に由来する。ＬＡＡＤは、フェニルアラニン分解の速い反応速度によって特徴付けられる（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１５年１０月；９９（２０）：８３９１－４０２頁；“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｌ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ”）。ほとんどの真核生物および原核生物のＬ－アミノ酸デアミナーゼは細胞外にある；しかしながら、プロテウス種のＬＡＡＤは細胞膜（内膜）に局在し、酵素活性が存在するペリプラズム空間に向かって外側を向いている。この局在化の結果として、内膜を通って細胞質へのフェニルアラニン輸送は、プロテウスＬＡＡＤが媒介するフェニルアラニン分解には必要でない。フェニルアラニンは、トランスポーターなしで外膜を通ってペリプラズムに容易に取り込まれるため、基質の利用可能性を向上させるためのトランスポーターの必要性がなくなる。
いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）菌、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）菌、およびモルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）菌を含むがこれらに限定されない細菌種に由来するＬＡＡＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）である。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）によってコードされるＬＡＡＤは、細胞膜に局在し、ペリプラズム空間に面しており、ペリプラズム空間で触媒活性が発生する。
本明細書で使用される場合、「トランスポーター」という用語は、分子（例えば、アミノ酸、毒素、代謝産物、基質など）を細胞外環境から微生物内にインポートするためのメカニズム（例えば、タンパク質または複数のタンパク質）を指すことを意味する。例えば、ＰｈｅＰなどのフェニルアラニントランスポーターは、フェニルアラニンを微生物内にインポートする。
「フェニルアラニントランスポーター」は、フェニルアラニンを細菌細胞に輸送することができる膜輸送タンパク質を指すために使用される（例えば、Ｐｉ ｅｔ ａｌ．， １９９１年を参照）。大腸菌では、ｐｈｅＰ遺伝子は、フェニルアラニン輸送を担う高親和性フェニルアラニン特異的パーミアーゼ（ｐｅｒｍｅａｓｅ）をコードする（Ｐｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８年）。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を含むがこれらに限定されない細菌種に由来するｐｈｅＰ遺伝子によってコードされる。他のフェニルアラニントランスポーターには、ａｒｏＰ遺伝子によってコードされるＡａｇｅｎｅｒａｌアミノ酸パーミアーゼ（Ａａｇｅｎｅｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｅｒｍｅａｓｅ）が含まれ、フェニルアラニンを含む３つの芳香族アミノ酸を高い親和性で輸送し、ＰｈｅＰとともに、フェニルアラニンのインポートの大部分を担う考えられている。さらに、低レベルのフェニルアラニン輸送活性は、ＬＩＶ－Ｉ／ＬＳ系の活性に起因するとされており、当該ＬＩＶ－Ｉ／ＬＳ系は、ＬＩＶ結合蛋白質（ＬＩＶ－Ｉ系）およびＬＳ結合蛋白質（ＬＳ系）の２つのペリプラズム結合蛋白質、ならびに膜成分であるＬｉｖＨＭＧＦからなる分岐鎖アミノ酸トランスポーターである。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、細菌種に由来するａｒｏＰ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、細菌種に由来するＬＩＶ結合タンパク質およびＬＳ結合タンパク質ならびにＬｉｖＨＭＧＦ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、ｐｈｅＰ、ａｒｏＰ、およびＬＩＶ－Ｉ／ＬＳ系から選択される複数のタイプのフェニルアラニントランスポーターを含む。
「フェニルアラニン代謝産物」とは、フェニルアラニンの分解の結果として生成される代謝産物を指す。代謝産物は、フェニルアラニンを基質として使用する酵素によってフェニルアラニンから直接生成されることもあれば、フェニルアラニン代謝産物基質に作用する代謝経路の下流の別の酵素によって間接的に生成されることもある。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、操作された微生物、例えば、ＰＭＥをコードする遺伝子操作された細菌によって産生される。
「高アンモニア血症」、「高アンモニア血症の」、または「過剰なアンモニア」は、体内のアンモニア濃度の上昇を指すために使用される。高アンモニア血症は、解毒の低下および／またはアンモニア産生の増加によって引き起こされる。解毒の低下は、尿素回路障害（ＵＣＤ）、例えば、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損症、およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症；または肝臓のバイパス（例えば、開総肝管（ｏｐｅｎ ｄｕｃｔｕｓ ｈｅｐａｔｉｃｕｓ））；および／またはグルタミンシンテターゼの欠乏に起因する可能性がある。例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３年；Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３年を参照。アンモニアの産生の増加は、感染症、薬物、神経因性膀胱、および腸内細菌異常増殖に起因する可能性がある。例えば、Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３年を参照。アンモニアの産生の増加は、腫瘍の微小環境にも関連している可能性がある。例えば、Ｓｐｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７年を参照。高アンモニア血症に関連する他の障害および状態には、限定されるものではないが、肝性脳症、急性肝不全、慢性肝不全などの肝障害；有機酸障害；イソ吉草酸血症；３－メチルクロトニルグリシン尿症；メチルマロン酸血症；プロピオン酸血症；脂肪酸酸化異常症（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｓ）；カルニチン回路異常症（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｃｙｃｌｅ ｄｅｆｅｃｔｓ）；カルニチン欠損症；β－酸化欠損症（β－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）；リジン尿性タンパク質不耐症；ピロリン－５－カルボキシレートシンテターゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）；炭酸脱水酵素欠損症；高インスリン－高アンモニア血症症群（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｉｓｍ－ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；ミトコンドリア病（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）；バルプロ酸療法；アスパラギナーゼ療法；総非経口栄養；グリシン含有溶液による膀胱鏡検査；肺／骨髄移植後（ｐｏｓｔ－ｌｕｎｇ／ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）；門脈体循環シャント；尿路感染症；尿管拡張；多発性骨髄腫；および化学療法が含まれる。例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３年；Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３年；Ｐｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３年；Ｌａｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４年を参照。健康な対象では、血漿アンモニア濃度は典型的には約５０μｍｏｌ／Ｌ未満である。例えば、Ｌｅｏｎａｒｄ，２００６年を参照。いくつかの実施形態では、高アンモニア血症の診断シグナルは、少なくとも約５０μｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約８０μｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約１５０μｍｏｌ／Ｌ、少なくとも約１８０μｍｏｌ／Ｌ、または少なくとも約２００μｍｏｌ／Ｌの血漿アンモニア濃度である。例えば、Ｌｅｏｎａｒｄ，２００６年；Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３年；Ｈａｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３年を参照。高アンモニア血症を軽減するために、例えば操作された微生物（例：遺伝子操作された細菌）において、アルギニン生合成を改変する方法（例えば、アルギニンリプレッサーを欠失させること、アルギニンリプレッサー結合部位を改変すること、および／またはアルギニンフィードバック耐性Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼを使用することによって）は、当技術分野で既知である。例えば、ＷＯ２０１６２００６１４を参照。その内容は、参照により本明細書に援用される。
「抗癌分子」とは、細胞の増殖または複製を低減および／または阻害することができる、操作された微生物（例えば、操作された細菌）によって産生される１つ以上の目的の治療用物質または薬物を指す。いくつかの実施形態では、抗癌分子は、癌を調節または処置するのに有用な治療用分子である。いくつかの実施形態では、抗癌分子は、遺伝子によってコードされる治療用分子である。別の実施形態では、抗癌分子は、生化学的または生合成経路によって産生される治療用分子であり、当該生合成または生化学的経路は、任意に微生物に対して内因性であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された微生物は、２つ以上の抗癌分子を産生することができる。抗癌分子の非限定的な例には、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ－４抗体、ＰＤ－１抗体、ＰＤＬ－１抗体）、細胞毒性剤（例えば、Ｃｌｙ Ａ、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ－α）、免疫刺激性サイトカインおよび共刺激性分子（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＣＬ２１、ＩＬ－２、ＩＬ－１８、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、ＴＮＦ、ＧＭ－ＣＳＦ）、抗原および抗体（例えば、腫瘍抗原、新生抗原、ＣｔｘＢ－ＰＳＡ融合タンパク質、ＣＰＶ－ＯｍｐＡ融合タンパク質、ＮＹ－ＥＳＯ－１腫瘍抗原、ＲＡＦ１、免疫抑制分子に対する抗体、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＸＲ４／ＣＸＣＬ１２、抗ＧＬＰ１、抗ＧＬＰ２、抗ガレクチン１、抗ガレクチン３、抗Ｔｉｅ２、抗ＣＤ４７、免疫チェックポイントに対する抗体、免疫抑制サイトカインおよびケモカインに対する抗体）、ＤＮＡトランスファーベクター（例えば、エンドスタチン、トロンボスポンジン－１、ＴＲＡＩＬ、ＳＭＡＣ、Ｓｔａｔ３、Ｂｃｌ２、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＡＦＰ、ＶＥＧＦＲ２）、および酵素（例えば、大腸菌ＣＤ、ＨＳＶ－ＴＫ）が含まれる。いくつかの実施形態では、抗癌分子には、ＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ応答または阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合（アプタマーまたはデコイオリゴ）、ＣＲＩＳＰＲ干渉などの遺伝子編集を媒介する核酸分子が含まれる。いくつかの実施形態では、細菌またはウイルスは、例えばバクトフェクション（ｂａｃｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）によって、ＤＮＡを哺乳動物細胞に移入するためのベクターとして使用され得る。例えば、Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１３年を参照されたい。抗癌分子、例えばデアデニレートシクラーゼ遺伝子（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）由来のｄａｃＡ）またはインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストを産生することができる酵素を産生可能な操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、当技術分野で既知である。例えば、ＷＯ２０１８１２９４０４を参照されたい。その内容は、参照により本明細書に援用される。
「作動可能に連結された」とは、核酸配列（例えば、ＰＡＬをコードする遺伝子）であって、当該核酸配列の発現を可能にする方法で調節領域配列に連結された（例えば、シスで作用する）、核酸配列を指す。調節領域は、目的の遺伝子の転写を指示することができる核酸であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導性要素、プロモーター制御要素、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、およびイントロンを含み得る。
「誘導性プロモーター」とは、１つ以上の遺伝子に作動可能に連結された調節領域であって、当該遺伝子の発現は前記調節領域の誘導物質の存在下で増加する、調節領域を指す。
いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、その発現が温度感受性メカニズムによって制御される１つ以上の遺伝子を含む。温度調節因子（Ｔｈｅｒｍｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）は、外部の化学物質または特殊な培地を使用せずに強力な転写制御を行うため有利である（例えば、Ｎｅｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ Ｅ． ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ－ｐｒｏｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ；Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１５年６月１０日；２０３：３２－４０頁、およびその参考文献を参照）。変異体ｃＩ８５７リプレッサーならびにｐＬおよび／またはｐＲファージλプロモーターを用いた温度調節されたタンパク質発現を使用して、組換え細菌株を操作することができる。目的の遺伝子はλプロモーターの下流にクローニングされ、バクテリオファージλの変異体熱不安定性ｃＩ８５７リプレッサーによって効率的に調節され得る。３７℃未満の温度では、ｃＩ８５７はｐＲプロモーターのｏＬまたはｏＲ領域に結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写をブロックする。より高い温度では、機能的なｃＩ８５７二量体が不安定化され、ｏＬまたはｏＲ ＤＮＡ配列への結合が阻止され、ｍＲＮＡの転写が開始される。
「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」は、１つ以上の酸素レベル感知転写因子が結合可能な核酸配列を指し、ここで、対応する転写因子の結合および／または活性化は、下流の遺伝子発現を活性化する。
酸素レベル依存性転写因子の例には、限定されるものではないが、ＦＮＲ、ＡＮＲおよびＤＮＲが含まれる。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーターおよびＤＮＲ応答性プロモーターは、当技術分野において既知である（例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０；Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９年；Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９年；Ｇａｌｉｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９１年；Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９８年；Ｈｏｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３年；Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３年を参照）。いくつかの実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、環境酸素が少ないかまたは全くない条件下で高度に発現することが知られている大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのフマル酸および硝酸レダクターゼ遺伝子Ｓ（ｆｕｍａｒａｔｅ ａｎｄ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｇｅｎｅ Ｓ（ｆｎｒＳ））に由来するＰｆｎｒＳである（Ｄｕｒａｎｄ ａｎｄ Ｓｔｏｒｚ， ２０１０年；Ｂｏｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ， ２０１０年）。
ＰＭＥおよびフェニルアラニントランスポーター、ならびにそのような酵素およびトランスポーターの代表的な例のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびに例示的なプロモーターは、ＷＯ２０１６１８３５３１Ａ１およびＷＯ２０１７０８７５８０Ａ１に提供されており、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。任意の適切な酵素および／またはフェニルアラニントランスポーターが、本開示の操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）において使用され得る。一実施形態では、１つ以上のＰＭＥ（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）、および／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または転写調節因子（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）の発現は、１つ以上の温度調節プロモーターによって駆動される。
本明細書で使用される場合、「非天然」核酸配列とは、細菌中に通常は存在しない核酸配列、例えば、内因性配列の余分なコピー、または細菌の異なる種、株、もしくは亜株由来の配列などの異種配列、または同じ亜型の細菌由来の未改変配列と比較して改変および／もしくは変異された配列、を指す。いくつかの実施形態では、非天然核酸配列は、合成の天然に存在しない配列である。例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１３年、Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい。非天然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセット中の１つ以上の遺伝子であり得る。いくつかの実施形態では、「非天然」とは、自然界では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、コピー数を増強するために、または複数の異なる機能を実行する遺伝子カセットの複数の異なる成分を含むために、同じ調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットの複数のコピーを含むように操作される。いくつかの実施形態では、本発明の操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されているフェニルアラニン代謝酵素をコードする遺伝子であって、当該誘導性プロモーターは自然界では前記遺伝子と関連していない（例えば、ＰＡＬをコードする遺伝子に作動可能に連結されているＦＮＲプロモーター、またはＬＡＡＤに作動可能に連結されているＰａｒａＢＡＤプロモーター）、遺伝子を含む。
「消化管」とは、食物の移動および消化、栄養素の吸収、ならびに老廃物の排泄を担う器官、腺、管、およびシステムを指す。ヒトでは、消化管は、口から始まり肛門で終わる胃腸管（ＧＩ）を含み、さらに食道、胃、小腸、および大腸を含む。消化管は、付属の器官および腺、例えば、脾臓、肝臓、胆嚢、および膵臓も含む。上部胃腸管は、食道、胃、および小腸の十二指腸を含む。下部胃腸管は、残りの小腸（すなわち、空腸および回腸）、および大腸のすべて（すなわち、盲腸、結腸、直腸、および肛門管）を含む。細菌は、消化管全体、例えば胃腸管、特に腸内に見られる。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、消化管において活性である（例えば、１つ以上の異種遺伝子を発現する）。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、大腸において活性である（例えば、１つ以上の異種遺伝子を発現する）。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、小腸において活性である（例えば、１つ以上の異種遺伝子を発現する）。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、小腸および大腸において活性である。
本明細書で使用される場合、「遺伝子（ｇｅｎｅ）」または「遺伝子配列（ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、遺伝子の配列（ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、例えば、核酸配列を指すことを意味する。遺伝子、遺伝子配列または遺伝子の配列は、完全な遺伝子配列または部分的な遺伝子配列を含むことを意味する。遺伝子、遺伝子配列または遺伝子の配列は、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むことを意味し、また、タンパク質またはポリペプチドをコードしない遺伝子配列（例えば、調節配列、リーダー配列、シグナル配列、または他の非タンパク質コード配列）を含むことも意味する。
「微生物」とは、通常は単一の細胞からなる顕微鏡的（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）、超顕微鏡的（ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）または限外顕微鏡的（ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）サイズの生物または微生物を指す。微生物の例には、細菌、酵母、ウイルス、寄生虫、真菌、特定の藻類、および原生動物が含まれる。いくつかの態様では、微生物は、目的の１つ以上の治療用分子またはタンパク質を産生するように操作されている（「操作された微生物」）。特定の態様では、微生物は、その環境（例えば、消化管）から特定の代謝産物または他の化合物を取り込んで異化するように操作されている。特定の態様では、微生物は、特定の有益な代謝産物または他の化合物（合成または天然に存在する）を合成し、それらをその環境に放出するように操作されている。特定の実施形態では、操作された微生物は、操作された細菌である。特定の実施形態では、操作された微生物は、操作されたウイルスである。
「非病原性」とは、宿主において疾患または有毒な反応を引き起こすことができない微生物（例えば、細菌）を指す。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、消化管の常在微生物叢に存在する共生細菌である。非病原性細菌の例には、限定されるものではないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・サブティリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノースス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、およびサッカロミセス・ブーラルディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）が含まれる（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９年；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１４年；米国特許第６，８３５，３７６号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第７，７３１，９７６号）。自然病原性細菌（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ）は、病原性を低減または排除するように遺伝子操作され得る。
「プロバイオティクス」は、生きている非病原性の微生物（例えば、細菌）であって、適切な量の当該微生物を含む宿主生物に健康上の利益を与えることができる、微生物を指すために使用される。いくつかの実施形態では、宿主生物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物はヒトである。非病原性細菌のいくつかの種、菌株、および／または亜型は、現在、プロバイオティクスとして認識されている。プロバイオティクス細菌の例には、限定されるものではないが、ビフィドバクテリウム属、エシェリキア属、ラクトバチルス属、およびサッカロミセス属、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎ Ｎｉｓｓｌｅ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびサッカロミセス・ブーラルディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）が含まれる（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１４年；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第６，８３５，３７６号）。プロバイオティクスは、細菌のバリアントまたは変異体株であり得る（Ａｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２年；Ｃｕｅｖａｓ－Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１０年；Ｏｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２年；Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６年）。非病原性細菌は、所望の生物学的特性（例えば、生存性）を増強または改善するように遺伝子操作されてもよい。非病原性細菌は、プロバイオティクス特性を提供するように遺伝子操作されてもよい。プロバイオティクス細菌は、プロバイオティクス特性を増強または改善するように遺伝子操作されてもよい。
本明細書で使用される場合、「処置する」および「調節する」という用語ならびにそれらの同族語は、疾患、障害、および／もしくは状態、またはそれらの少なくとも１つの識別可能な症状の改善を指す。別の実施形態では、「処置する」および「調節する」とは、必ずしも患者によって識別可能であるとは限らない、少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善を指す。別の実施形態では、「処置する」および「調節する」とは、物理的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメータの安定化）、またはその両方のいずれかで、疾患、障害、および／または状態の進行を阻害することを指す。別の実施形態では、「処置する」および「調節する」とは、疾患、障害、および／または状態の進行を遅らせるか、またはその進行を逆転させることを指す。本明細書で使用される場合、「予防する」およびその同族語は、所与の疾患、障害および／もしくは状態、またはそのような疾患、障害および／もしくは状態に関連する症状の発症を遅らせること、または獲得するリスクを低減することを指す。
処置を必要とする人は、既に特定の医学的疾患を有する個人、ならびに疾患を有するリスクのある人、または最終的に疾患を獲得する可能性のある人を含み得る。処置の必要性は、例えば、疾患の発症に関連する１つ以上のリスク因子の存在、疾患の存在もしくは進行、または疾患を有する対象の処置に対する受容性の可能性によって評価される。例えば、原発性高フェニルアラニン血症（例えば、ＰＫＵ）は、既知の治療法がない先天性の遺伝子変異によって引き起こされ、高フェニルアラニン血症は、他の状態（例えば、肝疾患）に続発する可能性もある。処置は、１つ以上の疾患の特徴（例えば、原発性高フェニルアラニン血症における過剰なフェニルアラニン）を軽減または排除することを含み得、必ずしも基礎疾患の排除を包含するわけではない。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」とは、生理学的に適切な担体および／または賦形剤などの他の成分を有する本発明の操作された微生物、例えば、遺伝子操作された細菌の調製物を指す。
互換的に使用され得る「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という句は、生物に重大な刺激を引き起こさず、投与された細菌化合物の生物学的活性および特性を妨げない担体または希釈剤を意味する。これらの句にはアジュバントが含まれている。
「賦形剤」という用語は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。例としては、限定されるものではないが、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、さまざまな種類の糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０を含む）が挙げられる。
「治療有効用量」および「治療有効量」という用語は、状態（例えば、高フェニルアラニン血症）の予防、発症の遅延、または症状の改善をもたらす化合物の量を指すために使用される。治療有効量は、例えば、過剰なフェニルアラニンレベルに関連する疾患または状態の１つ以上の症状の処置、予防、重症度の低減、発症の遅延、および／または発生リスクの低減に十分な量であり得る。治療有効量、ならびに治療有効投与頻度は、当技術分野で既知であり、以下で論じられる方法によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド」ならびに「ポリペプチド」を含み、アミド結合（すなわち、ペプチド結合）によって直線的に連結されたアミノ酸単量体から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または鎖（複数）を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖または鎖（複数）を指すために使用される任意の他の用語は「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用され得る。用語「ジペプチド」は、２つの連結されたアミノ酸のペプチドを指す。用語「トリペプチド」は、３つの連結されたアミノ酸のペプチドを指す。用語「ポリペプチド」はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然型アミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図している。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来してもよいし、組換え技術によって産生されてもよい。他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の操作された微生物、例えば、遺伝子操作された細菌またはウイルスによって産生される。本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、または２０００個以上のアミノ酸のサイズであり得る。ポリペプチドは、必ずしもそのような構造を有するわけではないが、決まった三次元構造を有する可能性がある。決まった三次元構造を有するポリペプチドは折りたたまれた（ｆｏｌｄｅｄ）と呼ばれ、決まった三次元構造を持たず、むしろ多数の異なるコンフォメーションをとることができるポリペプチドは折りたたまれていない（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）と呼ばれる。用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、タンパク質またはタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を指すこともあれば、非タンパク質配列に対応するアミノ酸配列（例えば、調節ペプチド配列、リーダーペプチド配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列、および他のペプチド配列から選択される配列）を指すこともある。
本明細書で使用される場合、「十分に類似している」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的活性を有するように、第２のアミノ酸配列に対して十分なまたは最小限の数の同一または同等のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列が、本明細書で十分に類似していると定義される。好ましくは、バリアントは、本発明のペプチドのアミノ酸配列に十分に類似しているであろう。そのようなバリアントは、一般的に、本発明のペプチドの機能的活性を保持している。バリアントには、１つ以上のアミノ酸欠失、付加、および／または置換によって、それぞれネイティブおよび野生型（ｗｔ）ペプチドとアミノ酸配列が異なるペプチドが含まれる。これらは、天然に存在するバリアントであってもよいし、人工的に設計されたバリアントであってもよい。
本明細書で使用される冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確に反対の指示がない限り、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」を意味するものとして理解されるべきである。
「および／または」という句は、リスト中の要素間で使用される場合、（１）列挙された１つの要素しか存在しないこと、または（２）リストの複数の要素が存在すること、のいずれかを意味することを意図している。例えば、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は、選択が、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、ＢおよびＣ、または、Ａ、ＢおよびＣであり得ることを示している。「および／または」という句は、リスト中の要素の「少なくとも１つ」または「１つ以上の」と交換可能に使用され得る。
生細胞カウンティング
本開示は、所望の治療用分子を産生するための１つ以上の遺伝子を含む操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）ならびにその組成物および製剤に関する。一態様では、例えば生細胞カウンティング法を使用して、細菌、組成物、および製剤の活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法が提供される。生細胞カウンティング法が、細菌サンプル中に存在する生細胞の数を測定するために使用され得る。具体的には、生きている操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌細胞）の数を決定するため、ならびに操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の活性を投与および／または測定するために、生細胞カウンティング法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングは、（１）無傷の膜、（２）細胞外環境に比べて還元的な細胞内環境、（３）膜電位を維持する能力、および／または（４）プロトン勾配を維持する能力、を有する生細胞（例えば細菌細胞）の数を提供する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティング法は、生きている分裂細胞および生きている非分裂細胞を捕捉する。対照的に、ＣＦＵ法は、生きている分裂細胞を含むが、生きている非分裂細胞を除外する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングは、無傷の（例えば、適切なコントールとほぼ同様の膜透過性を示す）膜を有する生細胞（例えば細菌細胞）の数を提供する。
本明細書に開示される操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、１つ以上の所望の治療用分子（例えば、対象において炎症を減少させることができるＩＬ－２２分子、またはＰＫＵを有する対象において有毒なフェニルアラニンを代謝することができるフェニルアラニン代謝酵素）を産生することができる。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の活性は、所望のパラメータ（例えば、所望の治療用分子の産生または機能）によって測定され得る。いくつかの実施形態では、活性は、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）における所望の治療用分子の産生を指す。いくつかの実施形態では、活性は、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）における所望の治療用分子の量または機能を指す。いくつかの実施形態では、活性は、１つ以上の所望の治療用分子が産生される速度を指す。いくつかの実施形態では、活性は、例えば有毒化合物または中間体のレベルによって測定される、１つ以上の有毒化合物が代謝または減少される速度を指す。本開示は、生細胞カウンティング法によって捕捉されるが、ＣＦＵ法によっては捕捉されない生きている非分裂細胞が、そのような所望のパラメータを依然として生み出すことができることを実証している。例えば、生きている非分裂細胞は、分裂してコロニー形成することができないにもかかわらず、（ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル、ｉｎ ｖｉｖｏモデル、またはヒト対象において）、所望のフェニルアラニン代謝酵素を産生し、かつ／または過剰なフェニルアラニンを減少させることができる可能性がある。したがって、いくつかの実施形態では、生細胞カウンティング法は、ＣＦＵ法よりも正確な細菌の活性の測定値を提供する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティング法は、ＣＦＵ法と比較して、減少したＣＦＵカウントを提供する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティング法は、ＣＦＵ法と比較して、ＣＦＵカウントを減少させること（例えば、細菌を凍結乾燥すること、または細菌を液体中で凍結すること）を可能にする。
いくつかの実施形態では、生細胞カウントは、顕微鏡（例えば無傷の膜によって、例えば透過型電子顕微鏡によって）、セロメーター（ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）、および／または当技術分野で既知の他の方法を使用して決定される。いくつかの実施形態では、生細胞カウントは、生細胞または非生細胞を選択的に同定することができる蛍光色素を使用して決定される。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、生細胞または非生細胞に選択的に蓄積するため、生細胞または非生細胞の同定を可能にする。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、生細胞または非生細胞においてのみ実質的により蛍光性になるため、生細胞または非生細胞の同定を可能にする。いくつかの実施形態では、非生細胞は、細胞膜を透過しない蛍光色素を使用して生細胞から区別される。いくつかの実施形態では、生細胞は、プロトン勾配を有する細胞を選択的に同定することができる蛍光色素を使用して、非生細胞から区別される。いくつかの実施形態では、組成物の生細胞カウントは、総細胞の数から非生細胞の数を差し引くことによって決定することができる。いくつかの実施形態では、蛍光色素はＳｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ染色剤である。
いくつかの実施形態では、生細胞カウントは、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）における所望の治療用分子の量または機能のより正確な測定値を提供する。いくつかの実施形態では、生細胞カウントは、所望の治療用分子の酵素活性のより正確な測定値を提供する。いくつかの実施形態では、生細胞カウントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の治療有効性のより正確な測定値を提供する。いくつかの実施形態では、生細胞カウントは、ｉｎ ｖｉｖｏでの（例えば、動物モデルまたはヒト対象における）、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の治療有効性のより正確な測定値を提供する。治療有効性は、例えば有毒化合物または有毒化合物の代謝からの中間体のレベルによって測定される、１つ以上の有毒化合物の減少（例えば、そのような化合物が減少または代謝される速度）を指し得る。
本開示に従ってアッセイおよび／または投与され得る例示的な微生物（例えば細菌）、ならびに組成物および製剤は、ＷＯ２０１６０９０３４３、ＷＯ２０１６２００６１４、ＷＯ２０１７１３９６９７、ＷＯ２０１６１８３５３１、ＷＯ２０１７０８７５８０、ＷＯ２０１６１４１１０８、ＷＯ２０１７０７４５６６、ＷＯ２０１７１３６７９２、ＷＯ２０１７１３６７９５、ＷＯ２０１８１２９４０４、ＷＯ２０１９０１４３９１、ＷＯ２０１６２１０３８４、ＷＯ２０１７１２３４１８、ＷＯ２０１７１２３６７６、ＷＯ２０１６１８３５３１、ＷＯ２０１８２３７１９８、ＷＯ２０１６２０１３８０、ＵＳ２０１７０２１６３７０、およびＷＯ２０１７０４０７１９において提供されており、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、例えば生細胞カウンティング法を使用してアッセイされる操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、非病原性細菌、共生細菌、またはプロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、例えば生細胞カウンティング法を使用してアッセイされる操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、抗癌分子、例えばデアデニレートシクラーゼ遺伝子またはＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる酵素を産生するための少なくとも１つの遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、例えば生細胞カウンティング法を使用してアッセイされる操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、改変されたアルギニン生合成経路（例えば、欠失されたアルギニンリプレッサー、改変されたアルギニンリプレッサー結合部位、および／またはアルギニンフィードバック耐性Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ変異）をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、例えば生細胞カウンティング法を使用してアッセイされる操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、少なくとも１つのＰＭＥ（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）をコードする遺伝子を含み、任意に、当該ＰＭＥ遺伝子が誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、例えば生細胞カウンティング法を使用してアッセイされる操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、非天然ＰＭＥ遺伝子（例えば、天然ＰＭＥ遺伝子の追加コピー）を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、自然界ではＰＭＥ遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態では、例えば生細胞カウンティング法を使用してアッセイされる操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、フェニルアラニントランスポーター（例えばＰｈｅＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、例えば生細胞カウンティング法を使用してアッセイされる操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、非天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子（例えば、天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子の追加コピー）を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、自然界ではフェニルアラニントランスポーター遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、温度調節プロモーターまたは低酸素もしくは嫌気性条件下で誘導されるプロモーターである。いくつかの実施形態では、例えば生細胞カウンティング法を使用してアッセイされる操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、１つ以上の必須遺伝子（例えば、ｔｈｙＡまたはｄａｐＡ）の栄養要求株である。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、対象への投与前に誘導される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、対象への投与後に誘導される。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物または製剤の活性を決定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、６～８のｐＨ範囲をカバーする生物学的緩衝液中に１～２０％のトレハロース、１～１０％のトレハロース、５～１５％のトレハロース、７～１３％のトレハロース、９～１１％のトレハロース、または約１０％のトレハロースを含み、当該生物学的緩衝液は、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、および／またはＴｒｉｓ緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～４００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～３００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～２００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、凍結乾燥された細菌を含む組成物の活性を測定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された細菌の水分含有率は、約１～１０％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～８％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～６％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～５％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は、約３％、約４％、または約５％である。
製造方法
いくつかの実施形態では、１つ以上の治療用遺伝子を含む操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）ならびにその組成物および製剤は、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング）を使用して製造される。本開示に従って製造され得る例示的な微生物（例えば細菌）ならびに組成物および製剤は、ＷＯ２０１６０９０３４３、ＷＯ２０１６２００６１４、ＷＯ２０１７１３９６９７、ＷＯ２０１６１８３５３１、ＷＯ２０１７０８７５８０、ＷＯ２０１６１４１１０８、ＷＯ２０１７０７４５６６、ＷＯ２０１７１３６７９２、ＷＯ２０１７１３６７９５、ＷＯ２０１８１２９４０４、ＷＯ２０１９０１４３９１、ＷＯ２０１６２１０３８４、ＷＯ２０１７１２３４１８、ＷＯ２０１７１２３６７６、ＷＯ２０１６１８３５３１、ＷＯ２０１８２３７１９８、ＷＯ２０１６２０１３８０、ＵＳ２０１７０２１６３７０、およびＷＯ２０１７０４０７１９において提供されており、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、本開示は、例えば生細胞カウンティング法を使用して測定される、非病原性、共生、またはプロバイオティクスである、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、抗癌分子、例えばデアデニレートシクラーゼ遺伝子（例えばｄａｃＡ）またはＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる酵素を産生するための少なくとも１つの遺伝子を含む操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、改変されたアルギニン生合成経路（例えば、欠失されたアルギニンリプレッサー、改変されたアルギニンリプレッサー結合部位、および／またはアルギニンフィードバック耐性Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ変異）をコードする遺伝子を含む、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＰＭＥ（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）をコードする遺伝子を含む、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）を製造するための方法を提供し、任意に、当該ＰＭＥ遺伝子は誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって製造される細菌は、非天然ＰＭＥ遺伝子（例えば、天然ＰＭＥ遺伝子の追加コピー）を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、自然界ではＰＭＥ遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって製造される細菌は、フェニルアラニントランスポーター（例えばＰｈｅＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって製造される細菌は、非天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子（例えば、天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子の追加コピー）を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、自然界ではフェニルアラニントランスポーター遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、温度調節プロモーターまたは低酸素もしくは嫌気性条件下で誘導されるプロモーターである。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、対象への投与前に誘導される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、対象への投与後に誘導される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって製造される細菌は、１つ以上の必須遺伝子（例えば、ｔｈｙＡまたはｄａｐＡ）の栄養要求株である。
いくつかの実施形態では、本開示は、６～８のｐＨ範囲をカバーする生物学的緩衝液中に１～２０％のトレハロース、１～１０％のトレハロース、５～１５％のトレハロース、７～１３％のトレハロース、９～１１％のトレハロース、または約１０％のトレハロースを含む医薬組成物を製造するための方法であって、当該生物学的緩衝液は、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、および／またはＴｒｉｓ緩衝液であり得る、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～４００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～３００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～２００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、凍結乾燥された細菌を含む医薬組成物を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された細菌の水分含有率は、約１～１０％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～８％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～６％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～５％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は、約３％、約４％、または約５％である。
凍結乾燥
いくつかの実施形態では、本開示は、凍結乾燥された操作された微生物（例えば、凍結乾燥された遺伝子操作された細菌）を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、操作された凍結乾燥された微生物（例えば、凍結乾燥された細菌）を製造するための方法は、細菌の凍結組成物と少なくともほぼ等しい生存率および効力をもたらす。
いくつかの実施形態では、凍結乾燥プロセスは、細胞を凍結乾燥緩衝液に懸濁することを含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥プロセスは、－８０℃～－３０℃の温度で材料を凍結すること、－２５℃～－５℃での一次乾燥、および５℃～２５℃での二次乾燥を含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥プロセスは、－１５℃での一次乾燥を含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥プロセスは、５℃での二次乾燥を含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥サイクルの終了後、凍結乾燥ケーキは、８０メッシュのスクリーンを通してふるい分けされて、自由流動性の粉末にされる。
噴霧乾燥
いくつかの実施形態では、噴霧乾燥プロセスは、細胞を噴霧乾燥緩衝液に懸濁することを含む。いくつかの実施形態では、噴霧乾燥プロセスは、１１０～１５０℃の入口温度を有し、４０～８０℃の出口温度を目標とする２流体ノズルを通して細胞を噴霧乾燥することを含み、その結果、自由流動性の粉末が得られる。いくつかの実施形態では、入口温度は１２０～１３５℃である。いくつかの実施形態では、目標とする出口温度は６０℃である。
凍結液体
いくつかの実施形態では、凍結液体プロセスは、細胞を凍結保護緩衝液に懸濁することと、－２０℃～２００℃で凍結させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は－８０℃で凍結される。
遺伝子操作された細菌
本開示は、例えば生細胞カウンティング法を使用して、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の生細胞カウントを決定する方法、および組成物、製剤、投与、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）を製造する方法を提供する。例えば生細胞カウンティング法を使用してアッセイされ得る操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）、ならびにその組成物および製剤は、ＷＯ２０１６０９０３４３、ＷＯ２０１６２００６１４、ＷＯ２０１７１３９６９７、ＷＯ２０１６０１８３５３１、ＷＯ２０１７０８７５８０、ＷＯ２０１６１４１１０８、ＷＯ２０１７０７４５６６、ＷＯ２０１７１３６７９２、ＷＯ２０１７１３６７９５、ＷＯ２０１８０１２９４０４、ＷＯ２０１９０１４３９１、ＷＯ２０１６２１０３８４、ＷＯ２０１７１２３４１８、ＷＯ２０１７１２３６７６、ＷＯ２０１６１８３５３１、ＷＯ２０１８２３７１９８、ＷＯ２０１６２０１３８０、ＵＳ２０１７０２１６３７０、およびＷＯ２０１７０４０７１９に記載されており、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、所望の治療用分子を産生するための１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、該１つ以上の遺伝子は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、治療用分子は、対象において治療効果を生み出すことができる。例えば、ＩＬ－１０などの治療用分子は、対象において炎症を減少させることができる可能性がある。いくつかの実施形態では、治療用分子は抗癌分子である。いくつかの実施形態では、治療用分子は、ＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる酵素である。いくつかの実施形態では、治療用分子は、デアデニレートシクラーゼ（例えばｄａｃＡ）である。いくつかの実施形態では、治療用分子は、対象において１つ以上の有毒分子を減少させることができ、例えば、フェニルアラニン代謝酵素は、ＰＫＵを有する対象において過剰で有毒なフェニルアラニンを代謝することができる。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、改変されたアルギニン生合成経路（例えば、欠失されたアルギニンリプレッサー、改変されたアルギニンリプレッサー結合部位、および／またはアルギニンフィードバック耐性Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ変異）をコードする遺伝子を含み、例えばＵＣＤを有する対象または癌を有する対象において、有毒なアンモニアを減少させることができる。いくつかの実施形態では、治療用分子は、別の分子と連動して作用して治療効果を生み出す。例えば、フェニルアラニントランスポーターは、フェニルアラニン代謝酵素と連動して作用して、ＰＫＵを有する対象において有毒なフェニルアラニンを減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、１つ以上の治療用分子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、対象への投与前に１つ以上の治療用分子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、対象への投与後に１つ以上の治療用分子を発現する。例えば、治療用分子を産生するための遺伝子は、対象への投与後に誘導される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、所定数の操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）を含む組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１０４個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１０５個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１０６個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１０７個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１０８個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の適切な投与量は、約１０４～１０１２個の生細菌（ｌｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）、例えば、約１０４個の生細菌、約１０５個の生細菌、約１０６個の生細菌、約１０７個の生細菌、約１０８個の生細菌、約１０９個の生細菌、約１０１０個の生細菌、約１０１１個の生細菌、または約１０１２個の生細菌の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、組成物は、約１０８～１０１３個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約１０９～１０１３個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約１０１０～１０１２個の生細胞を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、約１×１０１１個の生細胞、約１．１×１０１１個の生細胞、約１．２×１０１１個の生細胞、約１．３×１０１１個の生細胞、約１．４×１０１１個の生細胞、約１．５×１０１１個の生細胞、約１．６×１０１１個の生細胞、約１．７×１０１１個の生細胞、約１．８×１０１１個の生細胞、約１．９×１０１１個の生細胞、約２×１０１１個の生細胞、約２．１×１０１１個の生細胞、約２．２×１０１１個の生細胞、約２．３×１０１１個の生細胞、約２．４×１０１１個の生細胞、約２．５×１０１１個の生細胞、約２．６×１０１１個の生細胞、約２．７×１０１１個の生細胞、約２．８×１０１１個の生細胞、約２．９×１０１１個の生細胞、約３×１０１１個の生細胞、約３．１×１０１１個の生細胞、約３．２×１０１１個の生細胞、約３．３×１０１１個の生細胞、約３．４×１０１１個の生細胞、約３．５×１０１１個の生細胞、約３．６×１０１１個の生細胞、約３．７×１０１１個の生細胞、約３．８×１０１１個の生細胞、約３．９×１０１１個の生細胞、または約４×１０１１個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約５×１０１１個の生細胞、約６×１０１１個の生細胞、約７×１０１１個の生細胞、約８×１０１１個の生細胞、または約９×１０１１個の生細胞を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、約１×１０１２個の生細胞、約１．１×１０×１２個の生細胞、約１．２×１０１２個の生細胞、約１．３×１０１２個の生細胞、約１．４×１０１２個の生細胞、約１．５×１０１２個の生細胞、約１．６×１０１２個の生細胞、約１．７×１０１２個の生細胞、約１．８×１０１２個の生細胞、約１．９×１０１２個の生細胞、約２×１０１２個の生細胞、約２．１×１０１２個の生細胞、約２．２×１０１２個の生細胞、約２．３×１０１２個の生細胞、約２．４×１０１２個の生細胞、約２．５×１０１２個の生細胞、約２．６×１０１２個の生細胞、約２．７×１０１２個の生細胞、約２．８×１０１２個の生細胞、約２．９×１０１２個の生細胞、約３×１０１２個の生細胞、約３．１×１０１２個の生細胞、約３．２×１０１２個の生細胞、約３．３×１０１２個の生細胞、約３．４×１０１２個の生細胞、約３．５×１０１２個の生細胞、約３．６×１０１２個の生細胞、約３．７×１０１２個の生細胞、約３．８×１０１２個の生細胞、約３．９×１０１２個の生細胞、約４×１０１２個の生細胞、約４．１×１０１２個の生細胞、約４．２×１０１２個の生細胞、約４．３×１０１２個の生細胞、約４．４×１０１２個の生細胞、約４．５×１０１２個の生細胞、約４．６×１０１２個の生細胞、約４．７×１０１２個の生細胞、約４．８×１０１２個の生細胞、約４．９×１０１２個の生細胞、または約５×１０１２個の生細胞を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、１×１０１２個の生細胞、２×１０１２個の生細胞、３×１０１２個の生細胞、４×１０１２個の生細胞、または５×１０１２個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、２×１０１２個の生細胞を含む。さらなる実施形態では、組成物は、２×１０１２個の生細胞（５．３×１０１０ＣＦＵ）を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えばＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の約１×１０１１個の生細胞、約１．１×１０１１個の生細胞、約１．２×１０１１個の生細胞、約１．３×１０１１個の生細胞、約１．４×１０１１個の生細胞、約１．５×１０１１個の生細胞、約１．６×１０１１個の生細胞、約１．７×１０１１個の生細胞、約１．８×１０１１個の生細胞、約１．９×１０１１個の生細胞、約２×１０１１個の生細胞、約２．１×１０１１個の生細胞、約２．２×１０１１個の生細胞、約２．３×１０１１個の生細胞、約２．４×１０１１個の生細胞、約２．５×１０１１個の生細胞、約２．６×１０１１個の生細胞、約２．７×１０１１個の生細胞、約２．８×１０１１個の生細胞、約２．９×１０１１個の生細胞、約３×１０１１個の生細胞、約３．１×１０１１個の生細胞、約３．２×１０１１個の生細胞、約３．３×１０１１個の生細胞、約３．４×１０１１個の生細胞、約３．５×１０１１個の生細胞、約３．６×１０１１個の生細胞、約３．７×１０１１個の生細胞、約３．８×１０１１個の生細胞、約３．９×１０１１個の生細胞、または約４×１０１１個の生細胞を含み、任意に、組成物の活性は、トランス－ケイ皮酸（ＴＣＡ）、馬尿酸（ＨＡまたは標識Ｄ５－ＨＡ）、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、組成物は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の約５×１０１１個の生細胞、約６×１０１１個の生細胞、約７×１０１１個の生細胞、約８×１０１１個の生細胞、または約９×１０１１個の生細胞を含み、任意に、組成物の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、組成物は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の約１×１０１２個の生細胞、約１．１×１０１２個の生細胞、約１．２×１０１２個の生細胞、約１．３×１０１２個の生細胞、約１．４×１０１２個の生細胞、約１．５×１０１２個の生細胞、約１．６×１０１２個の生細胞、約１．７×１０１２個の生細胞、約１．８×１０１２個の生細胞、約１．９×１０１２個の生細胞、約２×１０１２個の生細胞、約２．１×１０１２個の生細胞、約２．２×１０１２個の生細胞、約２．３×１０１２個の生細胞、約２．４×１０１２個の生細胞、約２．５×１０１２個の生細胞、約２．６×１０１２個の生細胞、約２．７×１０１２個の生細胞、約２．８×１０１２個の生細胞、約２．９×１０１２個の生細胞、約３×１０１２個の生細胞、約３．１×１０１２個の生細胞、約３．２×１０１２個の生細胞、約３．３×１０１２個の生細胞、約３．４×１０１２個の生細胞、約３．５×１０１２個の生細胞、約３．６×１０１２個の生細胞、約３．７×１０１２個の生細胞、約３．８×１０１２個の生細胞、約３．９×１０１２個の生細胞、約４×１０１２個の生細胞、約４．１×１０１２個の生細胞、約４．２×１０１２個の生細胞、約４．３×１０１２個の生細胞、約４．４×１０１２個の生細胞、約４．５×１０１２個の生細胞、約４．６×１０１２個の生細胞、約４．７×１０１２個の生細胞、約４．８×１０１２個の生細胞、約４．９×１０１２個の生細胞、または約５×１０１２個の生細胞を含み、任意に、組成物の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、組成物は、フェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の１×１０１２個の生細胞、２×１０１２個の生細胞、３×１０１２個の生細胞、４×１０１２個の生細胞、または５×１０１２個の生細胞を含み、任意に、組成物の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。いくつかの実施形態では、組成物は、フェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の２×１０１２個の生細胞を含み、任意に、組成物の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。さらなる実施形態では、組成物は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の２×１０１２個の生細胞（５．３×１０１０ＣＦＵ）を含み、任意に、組成物の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、非病原性細菌である。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、共生細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はプロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、病原性を低減または排除するために改変または変異された自然に病原性の細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。例示的な細菌としては、限定されるものではないが、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ １９１７（大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ）であり、これは最もよく特徴が分かっているプロバイオティクスの１つに進化した腸内細菌科のグラム陰性細菌である（Ｕｋｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００７年）。この菌株は完全な無害性を特徴とし（Ｓｃｈｕｌｔｚ，２００８年）、ＧＲＡＳ（一般的に安全と認められる）ステータスを有している（Ｒｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４年、強調を追加）。
未改変の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅまたは遺伝子操作された細菌は、例えば、消化管または血清中の防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００９年）または死滅スイッチの活性化によって、投与後数時間または数日で破壊され得る。したがって、組成物は、継続投与を必要とし得る。いくつかの実施形態では、滞留時間は、ヒト対象について算出される。
いくつかの実施形態では、治療用分子（例えばＰＡＬ）は、低コピープラスミド、高コピープラスミド、または染色体上（例えば、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける以下の挿入部位の１つ以上）で発現され得る：ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ、ｔｈｙＡ、およびｍａｌＰ／Ｔ。挿入部位は、ゲノムのどこにあってもよく、例えば、ｔｈｙＡ（栄養要求株を作り出すため）などの生存および／または増殖に必要な遺伝子中；ゲノム複製部位近傍などのゲノムの活性領域内；および／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒａＣの間などの意図しない転写のリスクを低減するための発散プロモーターの間、であり得る。いくつかの実施形態では、治療用分子（例えば、ＰＡＬ）の２個以上のコピー（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上のコピー）が、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の１つ以上の組み込み部位で細菌染色体に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、フェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）をコードする１つ以上の遺伝子；抗癌分子、例えばデアデニレートシクラーゼ遺伝子（例：ｄａｃＡ）またはＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる酵素を産生するための１つ以上の遺伝子；およびアルギニンを産生するための改変されたアルギニン生合成経路（例えば、欠失されたアルギニンリプレッサー、改変されたアルギニンリプレッサー結合部位、および／またはアルギニンフィードバック耐性Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ変異）をコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、ＰＭＥをコードする遺伝子を含み、ＰＭＥ遺伝子は誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、非天然ＰＭＥ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、天然ＰＭＥ遺伝子の追加コピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、自然界ではＰＭＥ遺伝子と関連していない。
いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、ＰＡＬをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）はＰＡＬをコードする遺伝子を含み、ＰＡＬ遺伝子は誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、非天然ＰＡＬ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、天然ＰＡＬ遺伝子の追加コピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、自然界ではＰＡＬ遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に開示されるプロモーターのうちの任意の１つ以上である。
いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、ＬＡＡＤをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、非天然ＬＡＡＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、微生物（例えば、細菌）は、天然ＬＡＡＤ遺伝子の追加コピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、自然界ではＬＡＡＤ遺伝子と関連していない。
いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、フェニルアラニントランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）をコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、非天然フェニルアラニントランスポーター（例えば、天然フェニルアラニントランスポーターの追加コピー）をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、自然界ではＰｈｅＰ遺伝子と関連していない。
いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、１つ以上の必須遺伝子の栄養要求株である。例えば、必須遺伝子の変異、改変、または切り出しによって、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）が栄養要求株になる可能性がある。栄養要求性改変とは、生存または増殖に必須の外因的に添加された栄養素の非存在下で細菌を死滅させることを目的としており、これは細菌がその必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子を欠いているためである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）のいずれも、細胞の生存および／または増殖に必要な遺伝子の欠失または変異を含む。
例示的な栄養要求株は、ＷＯ２０１６０９０３４３、ＷＯ２０１６２００６１４、ＷＯ２０１７１３９６９７、ＷＯ２０１６１８３５３１、ＷＯ２０１７０８７５８０、ＷＯ２０１６１４１１０８、ＷＯ２０１７０７４５６６、ＷＯ２０１７１３６７９２、ＷＯ２０１７１３６７９５、ＷＯ２０１８１２９４０４、ＷＯ２０１９０１４３９１、ＷＯ２０１６２１０３８４、ＷＯ２０１７１２３４１８、ＷＯ２０１７１２３６７６、ＷＯ２０１６１８３５３１、ＷＯ２０１８２３７１９８、ＷＯ２０１６２０１３８０、ＵＳ２０１７０２１６３７０、およびＷＯ２０１７０４０７１９において提供され、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。一実施形態では、必須遺伝子は、ＤＮＡ合成遺伝子（例えばｔｈｙＡ）である。チミンは細菌の細胞増殖に必要な核酸であり、チミンの非存在下では細菌は細胞死を起こす。ｔｈｙＡ遺伝子は、ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換することによってチミン合成の最初のステップを触媒する酵素であるチミジル酸シンテターゼ（ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）をコードする（Ｓａｔ ｅｔ ａｌ．，２００３年）。いくつかの実施形態では、微生物（例えば、細菌細胞）は、ｔｈｙＡ遺伝子が欠失されているおよび／または無関係の遺伝子で置換されているｔｈｙＡ栄養要求株である。ｔｈｙＡ栄養要求株は、十分な量のチミンが存在する（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖培地にチミンを添加することによって、またはｉｎ ｖｉｖｏでヒトの消化管に自然に見られる高レベルのチミンの存在下で）ときにのみ増殖できる。いくつかの実施形態では、微生物（例えば、細菌細胞）は、その細菌が哺乳動物の消化管に存在するときに補完される遺伝子において栄養要求性である。十分な量のチミンがないと、ｔｈｙＡ栄養要求株は死んでしまう。いくつかの実施形態では、細菌細胞が栄養要求性遺伝子産物の非在下（例えば、消化管の外部）で生存しないことを確実するために、栄養要求性改変が使用される。
別の実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、細胞壁合成遺伝子（例えば、ｄａｐＡ）の栄養要求株である。ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、リジン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、細菌の細胞壁の成長に必要である（Ｍｅａｄｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９５９年；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７１年）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）のいずれかは、ｄａｐＤが欠失されているおよび／または無関係の遺伝子で置換されているｄａｐＤ栄養要求株である。ｄａｐＤ栄養要求株は、十分な量のＤＡＰが存在する（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖培地にＤＡＰを添加することによって、またはｉｎ ｖｉｖｏでヒトの消化管に自然に見られる高レベルのＤＡＰの存在下で）ときにのみ増殖できる。十分な量のＤＡＰがないと、ｄａｐＤ栄養要求株は死んでしまう。いくつかの実施形態では、微生物（例えば細菌細胞）が栄養要求性遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管の外部）で生存しないことを確実にするために、栄養要求性改変が使用される。
いくつかの実施形態では、単一のプロモーターが、ＰＭＥおよびフェニルアラニントランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子の発現を制御する。いくつかの実施形態では、同じプロモーターの別々のコピーが、ＰＭＥおよびフェニルアラニントランスポーターの発現を制御する。いくつかの実施形態では、異なるプロモーターが、ＰＭＥおよびフェニルアラニントランスポーターの発現を制御する。いくつかの実施形態では、ＰＭＥの発現を制御するプロモーターは、フェニルアラニントランスポーターの発現を制御するプロモーターとは異なる。いくつかの実施形態では、ＰＭＥをコードする遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、哺乳動物の消化管に見出される外因性環境条件によって誘導される。いくつかの実施形態では、ＰＭＥをコードする遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、低酸素または嫌気性条件下で誘導される（例えば、ＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーター、およびＤＮＲ応答性プロモーター）。いくつかの実施形態では、ＰＭＥをコードする遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、温度調節プロモーターである。いくつかの実施形態では、ＰＭＥをコードする遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、アラビノース、ＩＰＴＧ、テトラサイクリンまたはラムノースによって誘導される。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）をコードする遺伝子は、低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーター、温度調節プロモーター、およびアラビノース、ＩＰＴＧ、テトラサイクリンまたはラムノースによって誘導されるプロモーターから選択されるプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、温度調節プロモーターは、３７℃から４２℃の間の温度で誘導することができる。いくつかの実施形態では、温度調節プロモーターは、ラムダＣＩ誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、温度感受性ＣＩリプレッサー変異体をコードする１つ以上の遺伝子をさらに含み、いくつかの実施形態では、温度感受性ＣＩリプレッサー変異体はＣＩ８５７である。
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、疾患または障害（例えば、癌；または高フェニルアラニン血症に関連する疾患（例：ＰＫＵ）；または高アンモニア血症に関連する疾患（例：ＵＣＤまたは癌））を処置、管理、改善、および／または予防するために使用され得る医薬組成物を提供する。１つ以上の操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）を単独で、または予防剤、治療剤および／もしくは薬学的に許容される担体と組み合わせて含む本発明の医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子改変を含むように操作された、微生物（例えば細菌）の１つの種、株、または亜型を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子改変を含むようにそれぞれ操作された、微生物（例えば細菌）の２つ以上の種、株、および／または亜型を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して測定された、所定数の微生物（例えば細菌）を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約１０４個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約１０５個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約１０６個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約１０７個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約１０８個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌の適切な投与量は、約１０４～約１０１２個の生細菌（ｌｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）、例えば、約１０４個の生細菌、約１０５個の生細菌、約１０６個の生細菌、約１０７個の生細菌、約１０８個の生細菌、約１０９個の生細菌、約１０１０個の生細菌、約１０１１個の生細菌、または約１０１２個の生細菌の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１０８～１０１３個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１０９～１０１３個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１０１０～１０１２個の生細胞を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１×１０１１個の生細胞、約１．１×１０１１個の生細胞、約１．２×１０１１個の生細胞、約１．３×１０１１個の生細胞、約１．４×１０１１個の生細胞、約１．５×１０１１個の生細胞、約１．６×１０１１個の生細胞、約１．７×１０１１個の生細胞、約１．８×１０１１個の生細胞、約１．９×１０１１個の生細胞、約２×１０１１個の生細胞、約２．１×１０１１個の生細胞、約２．２×１０１１個の生細胞、約２．３×１０１１個の生細胞、約２．４×１０１１個の生細胞、約２．５×１０１１個の生細胞、約２．６×１０１１個の生細胞、約２．７×１０１１個の生細胞、約２．８×１０１１個の生細胞、約２．９×１０１１個の生細胞、約３×１０１１個の生細胞、約３．１×１０１１個の生細胞、約３．２×１０１１個の生細胞、約３．３×１０１１個の生細胞、約３．４×１０１１個の生細胞、約３．５×１０１１個の生細胞、約３．６×１０１１個の生細胞、約３．７×１０１１個の生細胞、約３．８×１０１１個の生細胞、約３．９×１０１１個の生細胞、または約４×１０１１個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５×１０１１個の生細胞、約６×１０１１個の生細胞、約７×１０１１個の生細胞、約８×１０１１個の生細胞、または約９×１０１１個の生細胞を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１×１０１２個の生細胞、約１．１×１０×１２個の生細胞、約１．２×１０１２個の生細胞、約１．３×１０１２個の生細胞、約１．４×１０１２個の生細胞、約１．５×１０１２個の生細胞、約１．６×１０１２個の生細胞、約１．７×１０１２個の生細胞、約１．８×１０１２個の生細胞、約１．９×１０１２個の生細胞、約２×１０１２個の生細胞、約２．１×１０１２個の生細胞、約２．２×１０１２個の生細胞、約２．３×１０１２個の生細胞、約２．４×１０１２個の生細胞、約２．５×１０１２個の生細胞、約２．６×１０１２個の生細胞、約２．７×１０１２個の生細胞、約２．８×１０１２個の生細胞、約２．９×１０１２個の生細胞、約３×１０１２個の生細胞、約３．１×１０１２個の生細胞、約３．２×１０１２個の生細胞、約３．３×１０１２個の生細胞、約３．４×１０１２個の生細胞、約３．５×１０１２個の生細胞、約３．６×１０１２個の生細胞、約３．７×１０１２個の生細胞、約３．８×１０１２個の生細胞、約３．９×１０１２個の生細胞、約４×１０１２個の生細胞、約４．１×１０１２個の生細胞、約４．２×１０１２個の生細胞、約４．３×１０１２個の生細胞、約４．４×１０１２個の生細胞、約４．５×１０１２個の生細胞、約４．６×１０１２個の生細胞、約４．７×１０１２個の生細胞、約４．８×１０１２個の生細胞、約４．９×１０１２個の生細胞、または約５×１０１２個の生細胞を含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１×１０１２個の生細胞、、２×１０１２個の生細胞、３×１０１２個の生細胞、４×１０１２個の生細胞、または５×１０１２個の生細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２×１０１２個の生細胞を含む。さらなる実施形態では、医薬組成物は、２×１０１２個の生細胞（５．３×１０１０ＣＦＵ）を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は液体製剤である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、固形製剤（例えば、固形経口製剤）である。
いくつかの実施形態では、本開示は、１×１０６～１×１０１５生細胞／ｍＬの生細胞カウント濃度、または乾燥細胞もしくは凍結乾燥細胞の場合には１×１０６～１×１０１５生細胞／ｍＬの再構成後細胞カウント濃度（ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１×１０８～１×１０１３生細胞／ｍＬの生細胞カウント濃度または再構成生細胞カウント濃度（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１×１０８～１×１０１２生細胞／ｍＬの生細胞カウント濃度または再構成生細胞カウント濃度を有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１×１０９～１×１０１１生細胞／ｍＬの生細胞カウント濃度または再構成生細胞カウント濃度を有する医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１×１０１０～１×１０１２生細胞／ｍＬの生細胞カウント濃度または再構成生細胞カウント濃度を有する医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１×１０１１個の生細胞、約１．１×１０１１個の生細胞、約１．２×１０１１個の生細胞、約１．３×１０１１個の生細胞、約１．４×１０１１個の生細胞、約１．５×１０１１個の生細胞、約１．６×１０１１個の生細胞、約１．７×１０１１個の生細胞、約１．８×１０１１個の生細胞、約１．９×１０１１個の生細胞、約２×１０１１個の生細胞、約２．１×１０１１個の生細胞、約２．２×１０１１個の生細胞、約２．３×１０１１個の生細胞、約２．４×１０１１個の生細胞、約２．５×１０１１個の生細胞、約２．６×１０１１個の生細胞、約２．７×１０１１個の生細胞、約２．８×１０１１個の生細胞、約２．９×１０１１個の生細胞、約３×１０１１個の生細胞、約３．１×１０１１個の生細胞、約３．２×１０１１個の生細胞、約３．３×１０１１個の生細胞、約３．４×１０１１個の生細胞、約３．５×１０１１個の生細胞、約３．６×１０１１個の生細胞、約３．７×１０１１個の生細胞、約３．８×１０１１個の生細胞、約３．９×１０１１個の生細胞、または約４×１０１１個の生細胞を含む固形製剤（例えば固形経口製剤）である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５×１０１１個の生細胞、約６×１０１１個の生細胞、約７×１０１１個の生細胞、約８×１０１１個の生細胞、または約９×１０１１個の生細胞を含む固形製剤（例えば固形経口製剤）である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１×１０１２個の生細胞、約１．１×１０１２個の生細胞、約１．２×１０１２個の生細胞、約１．３×１０１２個の生細胞、約１．４×１０１２個の生細胞、約１．５×１０１２個の生細胞、約１．６×１０１２個の生細胞、約１．７×１０１２個の生細胞、約１．８×１０１２個の生細胞、約１．９×１０１２個の生細胞、約２×１０１２個の生細胞、約２．１×１０１２個の生細胞、約２．２×１０１２個の生細胞、約２．３×１０１２個の生細胞、約２．４×１０１２個の生細胞、約２．５×１０１２個の生細胞、約２．６×１０１２個の生細胞、約２．７×１０１２個の生細胞、約２．８×１０１２個の生細胞、約２．９×１０１２個の生細胞、約３×１０１２個の生細胞、約３．１×１０１２個の生細胞、約３．２×１０１２個の生細胞、約３．３×１０１２個の生細胞、約３．４×１０１２個の生細胞、約３．５×１０１２個の生細胞、約３．６×１０１２個の生細胞、約３．７×１０１２個の生細胞、約３．８×１０１２個の生細胞、約３．９×１０１２個の生細胞、約４×１０１２個の生細胞、約４．１×１０１２個の生細胞、約４．２×１０１２個の生細胞、約４．３×１０１２個の生細胞、約４．４×１０１２個の生細胞、約４．５×１０１２個の生細胞、約４．６×１０１２個の生細胞、約４．７×１０１２個の生細胞、約４．８×１０１２個の生細胞、約４．９×１０１２個の生細胞、または約５×１０１２個の生細胞を含む固形製剤（例えば固形経口製剤）である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１×１０１２個の生細胞、２×１０１２個の生細胞、３×１０１２個の生細胞、４×１０１２個の生細胞、または５×１０１２個の生細胞を含む固形製剤（例えば固形経口製剤）である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２×１０１２個の生細胞を含む固形製剤（例えば固形経口製剤）である。さらなる実施形態では、医薬組成物は、２×１０１２個の生細胞（５．３×１０１０ＣＦＵ）を含む固形製剤（例えば固形経口製剤）である。
いくつかの実施形態では、固形製剤（例えば、固形経口製剤）は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の約１×１０１１個の生細胞、約１．１×１０１１個の生細胞、約１．２×１０１１個の生細胞、約１．３×１０１１個の生細胞、約１．４×１０１１個の生細胞、約１．５×１０１１個の生細胞、約１．６×１０１１個の生細胞、約１．７×１０１１個の生細胞、約１．８×１０１１個の生細胞、約１．９×１０１１個の生細胞、約２×１０１１個の生細胞、約２．１×１０１１個の生細胞、約２．２×１０１１個の生細胞、約２．３×１０１１個の生細胞、約２．４×１０１１個の生細胞、約２．５×１０１１個の生細胞、約２．６×１０１１個の生細胞、約２．７×１０１１個の生細胞、約２．８×１０１１個の生細胞、約２．９×１０１１個の生細胞、約３×１０１１個の生細胞、約３．１×１０１１個の生細胞、約３．２×１０１１個の生細胞、約３．３×１０１１個の生細胞、約３．４×１０１１個の生細胞、約３．５×１０１１個の生細胞、約３．６×１０１１個の生細胞、約３．７×１０１１個の生細胞、約３．８×１０１１個の生細胞、約３．９×１０１１個の生細胞、または約４×１０１１個の生細胞を含み、任意に、固形製剤（例えば固形経口製剤）の活性は、トランス－ケイ皮酸（ＴＣＡ）、馬尿酸（ＨＡまたは標識Ｄ５－ＨＡ）、血中フェニルアラニンまたは他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、固形製剤（例えば固形経口製剤）は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の約５×１０１１個の生細胞、約６×１０１１個の生細胞、約７×１０１１個の生細胞、約８×１０１１個の生細胞、または約９×１０１１個の生細胞を含み、任意に、固形製剤（例えば固形経口製剤）の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、固形製剤（例えば固形経口製剤）は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の約１×１０１２個の生細胞、約１．１×１０１２個の生細胞、約１．２×１０１２個の生細胞、約１．３×１０１２個の生細胞、約１．４×１０１２個の生細胞、約１．５×１０１２個の生細胞、約１．６×１０１２個の生細胞、約１．７×１０１２個の生細胞、約１．８×１０１２個の生細胞、約１．９×１０１２個の生細胞、約２×１０１２個の生細胞、約２．１×１０１２個の生細胞、約２．２×１０１２個の生細胞、約２．３×１０１２個の生細胞、約２．４×１０１２個の生細胞、約２．５×１０１２個の生細胞、約２．６×１０１２個の生細胞、約２．７×１０１２個の生細胞、約２．８×１０１２個の生細胞、約２．９×１０１２個の生細胞、約３×１０１２個の生細胞、約３．１×１０１２個の生細胞、約３．２×１０１２個の生細胞、約３．３×１０１２個の生細胞、約３．４×１０１２個の生細胞、約３．５×１０１２個の生細胞、約３．６×１０１２個の生細胞、約３．７×１０１２個の生細胞、約３．８×１０１２個の生細胞、約３．９×１０１２個の生細胞、約４×１０１２個の生細胞、約４．１×１０１２個の生細胞、約４．２×１０１２個の生細胞、約４．３×１０１２個の生細胞、約４．４×１０１２個の生細胞、約４．５×１０１２個の生細胞、約４．６×１０１２個の生細胞、約４．７×１０１２個の生細胞、約４．８×１０１２個の生細胞、約４．９×１０１２個の生細胞、または約５×１０１２個の生細胞を含み、任意に、固形製剤（例えば固形経口製剤）の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、固形製剤（例えば固形経口製剤）は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の１×１０１２個の生細胞、２×１０１２個の生細胞、３×１０１２個の生細胞、４×１０１２個の生細胞、または５×１０１２個の生細胞を含み、任意に、固形製剤（例えば固形経口製剤）の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。いくつかの実施形態では、固形製剤（例えば固形経口製剤）は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の２×１０１２個の生細胞を含み、任意に、固形製剤（例えば固形経口製剤）の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。さらなる実施形態では、固形製剤（例えば固形経口製剤）は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の２×１０１２個の生細胞（５．３×１０１０ＣＦＵ）を含み、任意に、固形製剤（例えば固形経口製剤）の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１×１０１１個の生細胞、約１．１×１０×１１個の生細胞、約１．２×１０１１個の生細胞、約１．３×１０１１個の生細胞、約１．４×１０１１個の生細胞、約１．５×１０１１個の生細胞、約１．６×１０１１個の生細胞、約１．７×１０１１個の生細胞、約１．８×１０１１個の生細胞、約１．９×１０１１個の生細胞、約２×１０１１個の生細胞、約２．１×１０１１個の生細胞、約２．２×１０１１個の生細胞、約２．３×１０１１個の生細胞、約２．４×１０１１個の生細胞、約２．５×１０１１個の生細胞、約２．６×１０１１個の生細胞、約２．７×１０１１個の生細胞、約２．８×１０１１個の生細胞、約２．９×１０１１個の生細胞、約３×１０１１個の生細胞、約３．１×１０１１個の生細胞、約３．２×１０１１個の生細胞、約３．３×１０１１個の生細胞、約３．４×１０１１個の生細胞、約３．５×１０１１個の生細胞、約３．６×１０１１個の生細胞、約３．７×１０１１個の生細胞、約３．８×１０１１個の生細胞、約３．９×１０１１個の生細胞、または約４×１０１１個の生細胞を含む液体製剤である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５×１０１１個の生細胞、約６×１０１１個の生細胞、約７×１０１１個の生細胞、約８×１０１１個の生細胞、または約９×１０１１個の生細胞を含む液体製剤である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１×１０１２個の生細胞、約１．１×１０×１２個の生細胞、約１．２×１０×１２個の生細胞、約１．３×１０１２個の生細胞、約１．４×１０１２個の生細胞、約１．５×１０１２個の生細胞、約１．６×１０１２個の生細胞、約１．７×１０１２個の生細胞、約１．８×１０１２個の生細胞、約１．９×１０１２個の生細胞、約２×１０１２個の生細胞、約２．１×１０１２個の生細胞、約２．２×１０１２個の生細胞、約２．３×１０１２個の生細胞、約２．４×１０１２個の生細胞、約２．５×１０１２個の生細胞、約２．６×１０１２個の生細胞、約２．７×１０１２個の生細胞、約２．８×１０１２個の生細胞、約２．９×１０１２個の生細胞、約３×１０１２個の生細胞、約３．１×１０１２個の生細胞、約３．２×１０１２個の生細胞、約３．３×１０１２個の生細胞、約３．４×１０１２個の生細胞、約３．５×１０１２個の生細胞、約３．６×１０１２個の生細胞、約３．７×１０１２個の生細胞、約３．８×１０１２個の生細胞、約３．９×１０１２個の生細胞、約４×１０１２個の生細胞、約４．１×１０１２個の生細胞、約４．２×１０１２個の生細胞、約４．３×１０１２個の生細胞、約４．４×１０１２個の生細胞、約４．５×１０１２個の生細胞、約４．６×１０１２個の生細胞、約４．７×１０１２個の生細胞、約４．８×１０１２個の生細胞、約４．９×１０１２個の生細胞、または約５×１０１２個の生細胞を含む液体製剤である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１×１０１２個の生細胞、２×１０１２個の生細胞、３×１０１２個の生細胞、４×１０１２個の生細胞、または５×１０１２個の生細胞を含む液体製剤である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２×１０１２個の生細胞を含む液体製剤である。さらなる実施形態では、医薬組成物は、２×１０１２個の生細胞（５．３×１０１０ＣＦＵ）を含む液体製剤である。
いくつかの実施形態では、液体製剤は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えばＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の約１×１０１１個の生細胞、約１．１×１０１１個の生細胞、約１．２×１０１１個の生細胞、約１．３×１０１１個の生細胞、約１．４×１０１１個の生細胞、約１．５×１０１１個の生細胞、約１．６×１０１１個の生細胞、約１．７×１０１１個の生細胞、約１．８×１０１１個の生細胞、約１．９×１０１１個の生細胞、約２×１０１１個の生細胞、約２．１×１０１１個の生細胞、約２．２×１０１１個の生細胞、約２．３×１０１１個の生細胞、約２．４×１０１１個の生細胞、約２．５×１０１１個の生細胞、約２．６×１０１１個の生細胞、約２．７×１０１１個の生細胞、約２．８×１０１１個の生細胞、約２．９×１０１１個の生細胞、約３×１０１１個の生細胞、約３．１×１０１１個の生細胞、約３．２×１０１１個の生細胞、約３．３×１０１１個の生細胞、約３．４×１０１１個の生細胞、約３．５×１０１１個の生細胞、約３．６×１０１１個の生細胞、約３．７×１０１１個の生細胞、約３．８×１０１１個の生細胞、約３．９×１０１１個の生細胞、または約４×１０１１個の生細胞を含み、任意に、液体製剤の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、液体製剤は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えばＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の約５×１０１１個の生細胞、約６×１０１１個の生細胞、約７×１０１１個の生細胞、約８×１０１１個の生細胞、または約９×１０１１個の生細胞を含み、任意に、液体製剤の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、液体製剤は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えばＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の約１×１０１２個の生細胞、約１．１×１０１２個の生細胞、約１．２×１０１２個の生細胞、約１．３×１０１２個の生細胞、約１．４×１０１２個の生細胞、約１．５×１０１２個の生細胞、約１．６×１０１２個の生細胞、約１．７×１０１２個の生細胞、約１．８×１０１２個の生細胞、約１．９×１０１２個の生細胞、約２×１０１２個の生細胞、約２．１×１０１２個の生細胞、約２．２×１０１２個の生細胞、約２．３×１０１２個の生細胞、約２．４×１０１２個の生細胞、約２．５×１０１２個の生細胞、約２．６×１０１２個の生細胞、約２．７×１０１２個の生細胞、約２．８×１０１２個の生細胞、約２．９×１０１２個の生細胞、約３×１０１２個の生細胞、約３．１×１０１２個の生細胞、約３．２×１０１２個の生細胞、約３．３×１０１２個の生細胞、約３．４×１０１２個の生細胞、約３．５×１０１２個の生細胞、約３．６×１０１２個の生細胞、約３．７×１０１２個の生細胞、約３．８×１０１２個の生細胞、約３．９×１０１２個の生細胞、約４×１０１２個の生細胞、約４．１×１０１２個の生細胞、約４．２×１０１２個の生細胞、約４．３×１０１２個の生細胞、約４．４×１０１２個の生細胞、約４．５×１０１２個の生細胞、約４．６×１０１２個の生細胞、約４．７×１０１２個の生細胞、約４．８×１０１２個の生細胞、約４．９×１０１２個の生細胞、または約５×１０１２個の生細胞を含み、任意に、液体製剤の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、液体製剤は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の１×１０１２個の生細胞、２×１０１２個の生細胞、３×１０１２個の生細胞、４×１０１２個の生細胞、または５×１０１２個の生細胞を含み、任意に、液体製剤の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。いくつかの実施形態では、液体製剤は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の２×１０１２個の生細胞を含み、任意に、液体製剤の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。さらなる実施形態では、液体製剤は、ｄａｃＡ、または改変されたアルギニン生合成経路、またはフェニルアラニン代謝酵素（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）を発現する遺伝子操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の２×１０１２個（５．３×１０１０ＣＦＵ）の生細胞を含み、任意に、液体製剤の活性は、ＴＣＡ、ＨＡもしくは標識Ｄ５－ＨＡ、ＰＰＡ、血中フェニルアラニン、アンモニア、アルギニン、シトルリン、サイクリックジヌクレオチド、サイクリックジ－ＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ＡＭＰ）、または他の適切な測定値（例えば、コントロールと比較して）によって決定される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物中に存在する細胞の数は、生細胞カウンティング法を使用して決定される。いくつかの実施形態では、組成物の生細胞カウントを決定することは、ＣＦＵカウントよりも医薬組成物の活性のより正確な測定値を提供する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングは、ＣＦＵ法と比較して、医薬組成物中の減少したＣＦＵカウントを提供する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングは、ＣＦＵ法と比較して、医薬組成物（例えば、凍結乾燥または凍結液体医薬組成物）中のＣＦＵカウントを減少させることを可能にする。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングによって医薬組成物中に存在する細胞の数を決定することは、医薬組成物の耐容性（ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ）を改善する。例えば、医薬組成物は、ＣＦＵ法と比較して、生細胞カウンティング法を使用して低下したＣＦＵカウントを含み、細胞可溶化物、エンドトキシンなどのレベルの低下に対応する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングを使用して決定された医薬組成物は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の生細胞（例えば、細胞の総数で割った生細胞の数）を含む。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングを使用して決定された医薬組成物は、少なくとも約５０～６０％の生細胞（例えば、細胞の総数で割った生細胞の数）を含む。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングを使用して決定された医薬組成物は、少なくとも約６０～７０％の生細胞（例えば、細胞の総数で割った生細胞の数）を含む。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングを使用して決定された医薬組成物は、少なくとも約７０～８０％の生細胞（例えば、細胞の総数で割った生細胞の数）を含む。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングを使用して決定された医薬組成物は、少なくとも約８０～９０％の生細胞（例えば、細胞の総数で割った生細胞の数）を含む。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングを使用して決定された医薬組成物は、少なくとも約９０～１０％の生細胞（例えば、細胞の総数で割った生細胞の数）を含む。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングを使用して決定された医薬組成物は、少なくとも約６０％の生細胞（例えば、細胞の総数で割った生細胞の数）を含む。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングを使用して決定された医薬組成物は、少なくとも約７０％の生細胞（例えば、細胞の総数で割った生細胞の数）を含む。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングを使用して決定された医薬組成物は、少なくとも約８０％の生細胞（例えば、細胞の総数で割った生細胞の数）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＵ法は、従来の製剤および／または製造には高すぎる微生物細胞カウント（例えば、細菌細胞カウント）をもたらし、より正確な生細胞カウンティング法は、治療的に有効であり、従来の製剤および／または製造にも適した細菌細胞カウントを提供する。
いくつかの実施形態では、生細胞カウンティングを使用して決定された医薬組成物は、約１．９×１０８±１．８×１０８ＥＵ／グラム以下のエンドトキシン、約４．０×１０８ＥＵ／グラム以下のエンドトキシン、約３．０×１０８ＥＵ／グラム以下のエンドトキシン、約２．０×１０８ＥＵ／グラム以下のエンドトキシン、約１．０×１０８ＥＵ／グラム以下のエンドトキシン、または約５×１０７ＥＵ／グラム以下のエンドトキシンを含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して決定される。いくつかの実施形態（例えば、細菌などの微生物がＰＭＥを含むように遺伝子操作されている）では、活性は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、フェニルアラニンのＴＣＡへの変換（例えば、尿中ＨＡ）によって測定され得る。いくつかの実施形態（例えば、細菌などの微生物がＰＭＥを含むように遺伝子操作されている）では、活性は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、フェニルアラニンのＰＰＡへの変換によって測定され得る。いくつかの実施形態（例えば、細菌などの微生物が、改変されたアルギニン生合成経路（例：欠失されたアルギニンリプレッサー、改変されたアルギニンリプレッサー結合部位、および／またはアルギニンフィードバック耐性Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ変異を含むように遺伝子操作されている）では、活性は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、アンモニア、アルギニンまたはシトルリンのレベルをアッセイすることによって測定され得る。いくつかの実施形態（例えば、細菌などの微生物が、ｄａｃＡなどの抗癌分子を含むように遺伝子操作されている）では、活性は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、サイクリックジヌクレオチド（例えば、サイクリックジ－ＡＭＰ）のレベルをアッセイすることによって測定され得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約０．５μｍｏｌ／時間／１０９細胞の速度でＴＣＡを産生することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約１．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞の速度でＴＣＡを産生することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約１．９±１．２μｍｏｌ／時間／１０９細胞の速度でＴＣＡを産生することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１．５～１０．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞の速度でＴＣＡを産生することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１．５～５．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞の速度でＴＣＡを産生することができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約１．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞の速度でＰＰＡを産生することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約１．５μｍｏｌ／時間／１０９細胞、少なくとも約２．９±０．７μｍｏｌ／時間／１０９細胞の速度でＰＰＡを産生することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２．０～１０．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞の速度でＰＰＡを産生することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２．０～５．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞の速度でＰＰＡを産生することができる。
いくつかの実施形態では、生細胞カウントは、生細胞または非生細胞を選択的に同定することができる蛍光色素を使用して決定される。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、生細胞または非生細胞に選択的に蓄積するため、生細胞または非生細胞の同定を可能にする。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、生細胞または非生細胞においてのみ実質的により蛍光性になるため、生細胞または非生細胞の同定を可能にする。いくつかの実施形態では、非生細胞は、細胞膜を透過しない蛍光色素を使用して生細胞から区別される。いくつかの実施形態では、生細胞は、プロトン勾配を有する細胞を選択的に同定することができる蛍光色素を使用して、非生細胞から区別される。いくつかの実施形態では、組成物の生細胞カウントは、総細胞の数から非生細胞の数を差し引くことによって決定することができる。いくつかの実施形態では、蛍光色素はＳｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ染色剤である。
いくつかの実施形態では、生細胞カウンティング法は、ＣＦＵ法と比較して、医薬組成物中の減少したＣＦＵカウントを提供する。いくつかの実施形態では、生細胞カウンティング法は、ＣＦＵ法と比較して、医薬組成物（例えば、凍結乾燥または凍結された液体）中のＣＦＵカウントを減少させることを可能にする。
いくつかの実施形態では、医薬組成物に含まれる生細胞の数は、所定数の分裂細胞を含む組成物（例えば、所定数のＣＦＵを含む組成物）の活性を使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物に含まれる生細胞の数は、１）所定数の分裂細胞を含む組成物の活性を得ること、２）組成物の生細胞カウントを決定すること、３）例えば活性／生細胞に関して、組成物の効力を算出すること、および４）効力を使用して組成物の生細胞の数を決定すること、によって決定され得る。いくつかの実施形態では、活性は、治療効果、毒性データ、治療タンパク質のレベル、ならびに／または医薬組成物の効果および／もしくは毒性を示す任意の他のメトリックを反映し得る。所定数の分裂細胞を含む組成物を使用して、医薬組成物に含まれる生細胞の数をどのように決定できるかの例を、以下の表１に示す。
表１：対象に投与された生細胞の数の決定
Figure 2022530503000021
本明細書に記載の医薬組成物は、医薬用途のための組成物への有効成分の加工を容易にする、賦形剤および助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して、従来の方法で処方され得る。医薬組成物を処方する方法は、当技術分野において既知である（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、Ｍａｃｋ出版社、イーストン、ペンシルベニア州を参照）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、従来の混合、溶解、顆粒化、粉末化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ）、封入化（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）、または噴霧乾燥に供されて、錠剤、顆粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロ錠剤、ペレット、または粉末を形成し、これらは腸溶性コーティングされていてもコーティングされていなくてもよい。適切な処方は投与経路に依存する。
本明細書に記載の操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、任意の適切な剤形（例えば、液体、カプセル、サシェ、ハードカプセル、ソフトカプセル、錠剤、腸溶性コーティング錠、懸濁粉末、顆粒、または経口投与用のマトリックス持続放出性製剤）で、任意の適切なタイプの投与（例えば、経口、局所、注射可能、即時放出、脈動放出、遅延放出、または持続放出）のための医薬組成物に処方され得る。
操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、１つ以上の薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、緩衝剤、界面活性剤、中性またはカチオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または薬剤を含む医薬組成物に処方され得る。例えば、医薬組成物は、限定されるものではないが、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、さまざまな種類の糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および例えばポリソルベート２０を含む界面活性剤の添加を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、（例えば、胃などの酸性細胞環境を緩衝するために）重炭酸水素ナトリウムの溶液、例えば、重炭酸水素ナトリウムの１モル溶液中で処方され得る。いくつかの実施形態では、操作された微生物は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼなどのフェニルアラニン代謝酵素を含み、酸性環境（例えば、ｐＨ１未満、ｐＨ２未満、ｐＨ３未満、ｐＨ４未満、ｐＨ５未満、ｐＨ６未満、またはｐＨ７未満）を緩衝するためおよび／または環境の酸性度を低下させる（例えば、ｐＨ５超、ｐＨ６超、ｐＨ７超、ｐＨ８超、ｐＨ９超、またはｐＨ１０超をもたらす）ために（例えば、対象の消化管の酸性度または酸性環境を調節するために）、ＰＰＩを任意に含む重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カルシウムの溶液中で処方される。いくつかの実施形態では、操作された微生物は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼなどのフェニルアラニン代謝酵素を含み、重炭酸ナトリウムまたは重炭酸カルシウムの溶液中で処方され、さらに鎮吐剤とともに（例えば、鎮吐剤の前に、鎮吐剤と同時に、鎮吐剤の後に）投与される。鎮吐剤の例としては、限定されるものではないが、プロメタジン、メクリジン、ヒドロキシジン、ドロペリドール、メトクロプラミド、オンダンセトロン、ドラセトロン、マロピタント、フェノチアジン、ファモチジン、ラニチジン、オメプラゾール、パントプラゾール、ミソプロストールプロトンポンプ阻害剤、ヒスタミン－２受容体アンタゴニスト、セロトニン（５－ＨＴ３）アンタゴニスト、抗ヒスタミン剤、ブチロフェノン、または胃運動剤（ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）が挙げられる。操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、中性または塩の形態として投与および処方され得る。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンなどのアニオンで形成される塩、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンなどのカチオンで形成される塩が挙げられる。
本明細書に開示される医薬組成物は局所投与され、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョン、または当業者に周知の他の形態で処方され得る。例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、Ｍａｃｋ出版社、イーストン、ペンシルベニア州を参照されたい。一実施形態では、噴霧不可能な局所剤形の場合、局所適用と適合性があり、水よりも大きな動粘度を有する担体または１つ以上の賦形剤を含む粘稠から半固体または固体の形態が使用される。適切な製剤には、限定されるものではないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、塗布薬、膏薬（ｓａｌｖｅ）などが含まれ、これらは、さまざまな特性（例えば浸透圧）に影響を与えるために、滅菌され得るか、または助剤（例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液、または塩）と混合され得る。他の適切な局所剤形には、固体または液体の不活性担体と組み合わせた有効成分が、加圧揮発性物質（例えば、フレオンなどのガス噴射剤）との混合物中または圧搾ボトル中に詰められた噴霧可能なエアロゾル製剤が含まれる。保湿剤または保水剤も、医薬組成物および剤形に添加することができる。このような追加の成分の例は、当技術分野でよく知られている。一実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、衛生製品として処方され得る。例えば、衛生製品は、抗菌製剤であってもよいし、発酵ブロスなどの発酵製品であってもよい。衛生製品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト剤、ローション、およびリップクリームであり得る。
本明細書に開示される医薬組成物は、経口投与され得、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方され得る。経口使用のための医薬組成物は、固体賦形剤を使用して作製され、必要に応じて得られた混合物を粉砕し、所望に応じて適切な助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適切な賦形剤としては、限定されるものではないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールを含む糖などの充填剤；トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなどのセルロース組成物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生理学的に許容されるポリマーが挙げられる。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例：アルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤を添加することもできる。
錠剤またはカプセルは、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリン、およびトラガカント）、充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ－ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）、崩壊剤（例えば、デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉末）または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製され得る。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングされ得る。コーティングシェルが存在してもよく、一般的な膜には、限定されるものではないが、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物、他の生分解性ポリマー、アルギン酸塩－ポリリジン－アルギン酸塩（ＡＰＡ）、アルギン酸塩－ポリメチレン－コ－グアニジン－アルギン酸塩（Ａ－ＰＭＣＧ－Ａ）、ヒドロキシメチルアクリレート－メチルメタクリレート（ＨＥＭＡ－ＭＭＡ）、多層ＨＥＭＡ－ＭＭＡ－ＭＡＡ、ポリアクリロニトリルビニルクロリド（ＰＡＮ－ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メタリルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ－６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、珪質カプセル（ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｓ）、硫酸セルロース／アルギン酸ナトリウム／ポリメチレン－コ－グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、酢酸フタル酸セルロース、アルギン酸カルシウム、ｋ－カラギーナン－ローカストビーンガムゲルビーズ（ｋ－ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ－ｌｏｃｕｓｔ ｂｅａｎ ｇｕｍ ｇｅｌ ｂｅａｄｓ）、ジェラン－キサンタンビーズ（ｇｅｌｌａｎ－ｘａｎｔｈａｎ ｂｅａｄｓ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、カラギーナン、デンプンポリ無水物、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸、および腸溶性コーティングポリマーが含まれる。
いくつかの実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、消化管または消化管の特定の領域（例えば大腸）への放出のために腸溶性コーティングされる。胃から結腸までの典型的なｐＨプロファイルは、約１～４（胃）、５．５～６（十二指腸）、７．３～８．０（回腸）、および５．５～６．５（結腸）である。一部の疾患では、ｐＨプロファイルが変更される場合がある。いくつかの実施形態では、コーティングは、放出部位を特定するために、特定のｐＨ環境において分解される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのコーティングが使用される。いくつかの実施形態では、外側のコーティングおよび内側のコーティングは、異なるｐＨレベルで分解される。
経口投与用の液体製剤は、溶液、シロップ、懸濁液、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品の形態をとることができる。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または分別された植物油）および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル－ｐ－ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的に許容される薬剤を用いた従来の手段によって調製され得る。また、製剤は、必要に応じて、緩衝塩、フレーバー剤、着色剤、および甘味剤を含み得る。経口投与用の製剤は、本明細書に記載の操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）の徐放、制御放出、または持続放出のために適切に処方され得る。
一実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、小児対象への投与に適した組成物に処方され得る。当技術分野でよく知られているように、小児は、胃内容排出速度、ｐＨ、胃腸透過性を含む多くの点で成人とは異なる（Ｉｖａｎｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１４年）。さらに、投与経路や味覚属性などの小児用製剤の受容性および嗜好性は、許容可能な小児コンプライアンスを達成するために極めて重要である。したがって、一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、嚥下しやすい剤形もしくは溶解可能な剤形、またはフレーバー、甘味料もしくは味覚遮断剤が添加された組成物などのより口当たりの良い組成物を含み得る。一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、成人への投与にも適している可能性がある。
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物には、溶液、シロップ、懸濁液、エリキシル、懸濁液または溶液としての再構成用の粉末、分散性／発泡性錠剤、チュアブル錠、グミキャンディー、ロリポップ、フリーザーポップ、トローチ、チューインガム、経口薄片、口腔内崩壊錠、サシェ、ソフトゼラチンカプセル、スプリンクル経口粉末（ｓｐｒｉｎｋｌｅ ｏｒａｌ ｐｏｗｄｅｒ）、または顆粒が含まれ得る。一実施形態では、組成物は、ゼラチンベースから作られ、キャンディーに弾力性、所望の歯ごたえのある持続性、およびより長い貯蔵寿命を与えるグミキャンディーである。いくつかの実施形態では、グミキャンディーはまた、甘味料またはフレーバーを含み得る。
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、フレーバーを含み得る。本明細書で使用される場合、「フレーバー」は、製剤に明確な味および芳香を与える物質（液体または固体）である。フレーバーはまた、製剤の嗜好性を改善するのに役立つ。フレーバーには、限定されるものではないが、イチゴ、バニラ、レモン、ブドウ、風船ガム、およびチェリーが含まれる。
特定の実施形態では、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、例えば不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と共に経口投与され得る。化合物はまた、ハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、または対象の食事に直接組み込まれ得る。経口治療投与のためには、化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で使用され得る。非経口投与以外の方法で化合物を投与するためには、化合物の不活性化を防ぐための材料で化合物をコーティングするか、または化合物の不活性化を防ぐための材料と化合物を同時投与する必要があるかもしれない。
別の実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、食用製品、例えば食品であり得る。一実施形態では、食品は、ミルク、濃縮ミルク、発酵ミルク（ヨーグルト、サワーミルク、冷凍ヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、ミルクパウダー、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜フルーツジュース、フルーツジュース、スポーツドリンク、菓子、キャンディー、離乳食（幼児用ケーキなど）、栄養食品、動物飼料、または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は、発酵乳製品などの発酵食品である。一実施形態では、発酵乳製品はヨーグルトである。別の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクシェイク、またはケフィアである。別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、プロバイオティクスとして機能することを目的とした他の生細菌細胞（ｌｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を含む調製物に組み合わせられる。別の実施形態では、食品は飲料である。一実施形態では、飲料は、フルーツジュースベースの飲料、または植物もしくはハーブエキスを含む飲料である。別の実施形態では、食品はゼリーまたはプリンである。本発明の組換え細菌の投与に適した他の食品は、当技術分野でよく知られている。例えば、ＵＳ２０１５／０３５９８９４およびＵＳ２０１５／０２３８５４５を参照されたい。これらの各々の全内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、パン、ヨーグルト、チーズなどの食品中に注入されるか、その上に噴霧されるか、またはその上に振りかけられる。
いくつかの実施形態では、組成物は、腸溶性コーティングされるかまたはコーティングされていないナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセルまたはマイクロ錠を介して、腸内投与、空腸内投与、十二指腸内投与、回腸内投与、胃シャント投与、または結腸内投与用に処方される。医薬組成物はまた、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースを使用して、坐剤または保持浣腸剤などの直腸組成物に処方され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液、またはエマルジョンであり得、懸濁剤、安定剤および／または分散剤を含み得る。
医薬組成物は、鼻腔内に投与され、エアロゾル形態、スプレー、ミスト、もしくは液滴の形態で処方され、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で便利に送達され得る。加圧エアロゾル投与単位は、計量された量を供給するためのバルブを提供することによって決定することができる。吸入器または吹送器で使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチン製）は、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含有するように処方され得る。
操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）は、デポ製剤として投与および処方され得る。そのような長時間作用型製剤は、移植によって、または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射もしくは点滴を含む注射によって投与され得る。例えば、組成物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性系誘導体として（例えば、難溶性塩として）処方され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、単一剤形の薬学的に許容される組成物である。単一剤形は、液体または固体の形態であり得る。単一剤形は、改変なしに患者に直接投与されてもよく、または投与前に希釈もしくは再構成されてもよい。特定の実施形態では、単一剤形は、ボーラス形態、例えば単一注射、単一経口用量（複数の錠剤、カプセル、ピル等を含む経口用量を含む）で投与され得る。代替の実施形態では、単一剤形は、例えば注入によって、ある期間にわたって投与され得る。
医薬組成物の単一剤形は、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロ錠剤、ペレット、粉末など、より小さなアリコート、単一用量容器、単一用量液体形態、または単一用量固体形態に医薬組成物を分割することによって調製され得、これらは腸溶性コーティングされていてもコーティングされていなくてもよい。固体形態の単一用量は、患者に投与する前に、液体、典型的には滅菌水または生理食塩水を加えることによって再構成され得る。
他の実施形態では、組成物は、制御放出または持続放出システムで送達され得る。一実施形態では、制御放出または持続放出を達成するためにポンプが使用され得る。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、本開示の治療法の制御放出または持続放出を達成することができる（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号を参照）。持続放出性製剤に使用されるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－コ－酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。持続放出性製剤に使用されるポリマーは、不活性で、浸出性不純物がなく、保管時に安定で、無菌で、生分解性であり得る。いくつかの実施形態では、制御放出または持続放出システムは、予防的または治療的標的の近くに配置することができ、したがって、全身用量のほんの一部しか必要としない。当業者に既知の任意の適切な技術を使用することができる。
投与計画は、治療反応をもたらすために調整され得る。投与は、疾患の重症度および反応性、投与経路、処置の時間経過（数日～数ヵ月～数年）、および疾患の改善までの時間など、いくつかの因子に依存し得る。例えば、単一ボーラスを一度に投与してもよいし、いくつかの分割された用量を所定の期間にわたって投与してもよいし、または治療状況に応じて用量を増減してもよい。投与量の仕様は、活性化合物の固有の特性および達成すべき特定の治療効果によって決定される。投与量の値は、軽減すべき状態の種類および重症度によって変動する場合がある。任意の特定の対象について、特定の投与計画は、個々の必要性および処置する臨床医の専門的判断に従って、時間をかけて調整され得る。本明細書に提供される化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な医薬手順によって決定することができる。例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＥＣ５０、およびＩＣ５０が決定され得、有毒効果と治療効果との間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）が治療指数として算出され得る。潜在的な損傷を最小限に抑えて副作用を減らすように注意深く修正して、有毒な副作用を示す組成物を使用してもよい。投与量は、最初は細胞培養アッセイおよび動物モデルから推定してもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイならびに動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するための一連の投与量を処方する際に使用することができる。
成分は、別々に供給されるか、または単位剤形で一緒に混合されて（例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器内の乾燥凍結乾燥粉末（ｄｒｙ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ）または水を含まない濃縮物として）供給される。投与方法が注射による場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
医薬組成物は、薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器に包装されていてもよい。一実施形態では、１つ以上の医薬組成物が、密閉容器内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末（ｄｒｙ ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ）または水を含まない濃縮物として供給され、対象に投与するための適切な濃度に（例えば、水または生理食塩水で）再構成され得る。一実施形態では、予防剤もしくは治療剤または医薬組成物の１つ以上が、２℃から８℃の間に保管される密閉容器内の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給され、再構成後１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、または１週間以内に投与される。凍結乾燥剤形には、凍結保護剤、主としてトレハロースを含めることができる。他の適切な凍結保護剤には、他の二糖類（例えば、スクロースまたはラクトース）、アミノ酸、およびポリマーが含まれる。
いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、６～８のｐＨ範囲をカバーする生物学的緩衝液中の１～２０％トレハロース、１～１０％トレハロース、５～１５％トレハロース、７～１３％トレハロース、９～１１％トレハロースまたは約１０％トレハロースで実施され得、当該生物学的緩衝液は、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、および／またはＴｒｉｓ緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～４００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～３００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～２００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。他の適切な増量剤としては、グリシンおよびアルギニン（これらのいずれも、０～０．０５％の濃度で含まれ得る）、およびポリソルベート－８０（最適には、０．００５～０．０１％の濃度で含まれる）が挙げられる。追加の界面活性剤としては、限定されるものではないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。医薬組成物は、注射可能な溶液として調製され得、吸収または分散を増加させるために使用されるもの（例えば、ヒアルロニダーゼ）などの、アジュバントとして有用な薬剤をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態では、凍結乾燥された細胞の水分含有率は、約１～１０％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～８％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～６％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～５％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は、約３％、約４％、または約５％である。
いくつかの実施形態では、本開示は、２～８℃で保管されたときに安定な医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、２～８℃で保管されたときに少なくとも約３ヵ月間安定な医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、２～８℃で保管されたときに少なくとも約６ヵ月間安定な医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、２～８℃で保管されたときに少なくとも約９ヵ月間安定な医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、２～８℃で保管されたときに少なくとも約１２ヵ月間安定な医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、室温および相対湿度６０％で保管されたときに安定な医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、室温および相対湿度６０％で保管されたときに少なくとも１ヵ月間安定な医薬組成物を提供する。
処置方法
いくつかの実施形態では、本開示は、疾患または障害を患っている対象を処置するための方法であって、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して測定、投与、および／または製造された、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用してアッセイ、投与、および／また製造された、本明細書に開示される遺伝子操作された細菌（例えば：抗癌分子、例えばデアデニレートシクラーゼ遺伝子またはインターフェロン遺伝子刺激因子アゴニストを産生することができる酵素を産生するための遺伝子を含む；または改変されたアルギニン生合成経路（例えば、欠失されたアルギニンリプレッサー、改変されたアルギニンリプレッサー結合部位、および／またはアルギニンフィードバック耐性Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ変異）をコードする遺伝子を含む；またはフェニルアラニン代謝酵素を産生するための遺伝子を含む）、その組成物および製剤は、疾患または障害（例えば、代謝性疾患、癌など）を処置するために使用される。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して測定、投与、および／または製造された、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）を投与することによって、高フェニルアラニン血症を軽減するまたは高フェニルアラニン血症に関連する疾患を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症を軽減するまたは高フェニルアラニン血症に関連する疾患を処置するための方法は、本明細書に開示される医薬組成物のいずれか１つを投与することを含む。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症に関連する疾患は、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、非定型フェニルケトン尿症、永続的な軽度の高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症性高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、瀬川病および肝疾患から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して、測定、投与、および／または製造された、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）を投与することによって、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、自己免疫障害、下痢性疾患、関連疾患、ならびに消化管の炎症の減少および／または消化管のバリア機能の増強から利益を得る他の疾患を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、下痢性疾患は、急性水様性下痢（例えばコレラ）、急性血性下痢（例えば、赤痢）、および持続性下痢からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＩＢＤまたは関連疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、膠原線維性大腸炎、リンパ球性大腸炎、便流変更性大腸炎、ベーチェット病、中等度大腸炎（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、短腸症候群、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側大腸炎、汎大腸炎、および劇症大腸炎からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索および神経の神経障害、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト症候群、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経炎（ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｅｓ）、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状エリテマトーデス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管性肉芽腫症（ＧＰＡ）、バセドウ病、ギラン・バレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節リポタンパク質（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（全身性エリテマトーデス）、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッカ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼の瘢痕性天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌感染に関連する小児の自己免疫性神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣の自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、水疱性皮膚病（ｖｅｓｉｃｕｌｏｂｕｌｌｏｕｓ ｄｅｒｍａｔｏｓｉｓ）、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群から選択される自己免疫障害である。いくつかの実施形態では、本発明は、限定されるものではないが下痢、血便、口内炎、肛門周囲疾患、腹痛、腹部痙攣、発熱、倦怠感、体重減少、鉄欠乏、貧血、食欲減退、体重減少、食欲不振、成長の遅れ、思春期発達の遅れ、ならびに皮膚、眼、関節、肝臓および胆管の炎症を含む、これらの疾患に関連する１つ以上の症状を軽減、改善、または排除するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、消化管の炎症を減少させるおよび／または消化管のバリア機能を増強し、それにより、全身性自己免疫障害（例えば喘息）を改善または予防するための方法を提供する（Ａｒｒｉｅｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１５年）。
いくつかの実施形態では、本開示は、例えば本明細書に開示される生細胞カウンティング法を使用して、測定、投与、および／または製造された、操作された微生物、例えば遺伝子操作された細菌（例えば、改変アルギニン生合成経路（例：欠失されたアルギニンリプレッサー、改変されたアルギニンリプレッサー結合部位、および／またはアルギニンフィードバック耐性Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ変異）を含む）を投与することによって、高アンモニア血症に関連する疾患または障害を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸シンテターゼ欠損症、シトルリン血症、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠損症、およびオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ， ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）などの尿素回路障害である。代替の実施形態では、障害は、肝性脳症、急性肝不全、慢性肝不全などの肝障害；有機酸障害；イソ吉草酸血症；３－メチルクロトニルグリシン尿症；メチルマロン酸血症；プロピオン酸血症；脂肪酸酸化異常症（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｓ）；カルニチン回路異常症（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ ｃｙｃｌｅ ｄｅｆｅｃｔｓ）；カルニチン欠損症；β－酸化欠損症（β－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）；リシン尿性タンパク質不耐症、ピロリン－５－カルボキシレートシンテターゼ欠損症；ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）；炭酸脱水酵素欠損症；高インスリン－高アンモニア血症症群（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｉｓｍ－ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；ミトコンドリア病（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）；バルプロ酸療法；アスパラギナーゼ療法；総非経口栄養；グリシン含有溶液による膀胱鏡検査；肺／骨髄移植後（ｐｏｓｔ－ｌｕｎｇ／ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）；門脈体循環シャント；尿路感染症；尿管拡張；多発性骨髄腫；化学療法；感染症；神経因性膀胱；または腸内細菌異常増殖（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ）である。いくつかの実施形態では、高アンモニア血症はハンチントン病に関連している。いくつかの実施形態では、それらに関連する症状には、限定されるものではないが、発作、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力喪失、急性脳症、脳浮腫、ならびに嘔吐、呼吸性アルカローシス、および低体温症が含まれる。いくつかの実施形態では、障害は癌であり、例えば、癌の腫瘍微小環境はアンモニアの増加に関連している。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して測定、投与、および／または製造された、操作された微生物、例えば遺伝子操作された細菌（例えば：抗癌分子、例えばｄａｃＡまたはＳＴＩＮＧアゴニストを産生することができる酵素を産生するための少なくとも１つの遺伝子を含む）を投与することによって、癌を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌は、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌（例えば、ユーイング肉腫腫瘍、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳癌（例えば、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫）、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃腸癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、下咽頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病）、肝臓癌、肺癌、リンパ腫（例えば、エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔癌、副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌（例えば、基底細胞癌、黒色腫）、小腸癌、胃癌、奇形腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、異常小児癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症およびウィルムス腫瘍から選択される。
いくつかの実施形態では、処置方法は、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して測定された、非病原性、共生、またはプロバイオティクスである操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）またはその組成物もしくは製剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、処置方法は、少なくとも１つのＰＭＥ（例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ）をコードする遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を投与することを含み、当該ＰＭＥ遺伝子は誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、処置方法は、非天然ＰＭＥ遺伝子（例えば、天然ＰＭＥ遺伝子の追加コピー）を含む遺伝子操作された細菌を投与することを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、自然界ではＰＭＥ遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態では、処置方法は、フェニルアラニントランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）をさらに含む遺伝子操作された細菌を投与することを含む。いくつかの実施形態では、処置方法は、非天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子（例えば、天然フェニルアラニントランスポーター遺伝子の追加コピー）を含む遺伝子操作された細菌を投与することを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、自然界ではフェニルアラニントランスポーター遺伝子と関連していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、温度調節プロモーターまたは低酸素もしくは嫌気性条件下で誘導されるプロモーターである。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、対象への投与前に誘導される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、対象への投与後に誘導される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって製造される細菌は、１つ以上の必須遺伝子（例えば、ｔｈｙＡまたはｄａｐＡ）の栄養要求株である。
いくつかの実施形態では、処置方法は、生細胞カウンティングを使用して決定された、操作された微生物（例えば遺伝子操作された細菌）組成物または製剤を投与することを含み、当該組成物または製剤は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の生細胞（例えば、細胞の総数で割った生細胞の数）を含む。
いくつかの実施形態では、処置方法は、生細胞カウンティングを使用して決定された、遺伝子操作された細菌組成物または製剤を投与することを含み、当該組成物または製剤は、約１．９×１０８±１．８×１０８ＥＵ／グラム以下のエンドトキシン、約４．０×１０８ＥＵ／グラム以下のエンドトキシン、約３．０×１０８ＥＵ／グラム以下のエンドトキシン、約２．０×１０８ＥＵ／グラム以下のエンドトキシン、約１．０×１０８ＥＵ／グラム以下のエンドトキシン、または約５×１０７ＥＵ／グラム以下のエンドトキシンを含む。
いくつかの実施形態では、処置方法は、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して決定された、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）、組成物または製剤を投与することを含み、当該組成物または製剤は、少なくとも約０．５μｍｏｌ／時間／１０９細胞、少なくとも約１．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞、少なくとも約１．９±１．２μｍｏｌ／時間／１０９細胞、約１．５～１０．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞、または約１．５～５．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞の速度でＴＣＡを産生することができる。
いくつかの実施形態では、処置方法は、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して決定された、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）、組成物または製剤を投与することを含み、当該組成物または製剤は、少なくとも約１．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞、少なくとも約１．５μｍｏｌ／時間／１０９細胞、少なくとも約２．９±０．７μｍｏｌ／時間／１０９細胞、約２．０～１０．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞、または約２．０～５．０μｍｏｌ／時間／１０９細胞の速度でＰＰＡを産生することができる。
いくつかの実施形態では、処置方法は、本明細書に開示される活性を特徴付ける、投与する、および決定するための方法（例えば、生細胞カウンティング法）を使用して決定された、操作された微生物（例えば、遺伝子操作された細菌）、組成物または製剤を投与することを含み、当該組成物または製剤は、６～８のｐＨ範囲をカバーする生物学的緩衝液中に１～２０％のトレハロース、１～１０％のトレハロース、５～１５％のトレハロース、７～１３％のトレハロース、９～１１％のトレハロース、または約１０％のトレハロースを含み、当該生物学的緩衝液は、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、および／またはＴｒｉｓ緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～４００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～３００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～２００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、１～１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、凍結乾燥された細菌を含む医薬組成物を製造するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された細菌の水分含有率は、約１～１０％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～８％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～６％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は約３～５％である。いくつかの実施形態では、水分含有率は、約３％、約４％、または約５％である。
例示的な疾患、障害、および処置方法は、ＷＯ２０１６０９０３４３、ＷＯ２０１６２００６１４、ＷＯ２０１７１３９６９７、ＷＯ２０１６１８３５３１、ＷＯ２０１７０８７５８０、ＷＯ２０１６１４１１０８、ＷＯ２０１７０７４５６６、ＷＯ２０１７１３６７９２、ＷＯ２０１７１３６７９５、ＷＯ２０１８１２９４０４、ＷＯ２０１９０１４３９１、ＷＯ２０１６２１０３８４、ＷＯ２０１７１２３４１８、ＷＯ２０１７１２３６７６、ＷＯ２０１６１８３５３１、ＷＯ２０１８２３７１９８、ＷＯ２０１６２０１３８０、ＵＳ２０１７０２１６３７０、およびＷＯ２０１７０４０７１９に提供されており、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
実施例１：細菌の構築
大腸菌ＮｉｓｓｌｅにおけるＰＡＬの誘導性産生を促進するために、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）のＰＡＬ遺伝子（「ＰＡＬ１」）またはフォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）のＰＡＬ遺伝子（「ＰＡＬ３」）、ならびに転写および翻訳要素を合成し（Ｇｅｎ９、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、ベクターｐＢＲ３２２にクローニングした。ＰＡＬ遺伝子は誘導性プロモーターの制御下に置かれた。低コピーおよび高コピープラスミドが、誘導性ＦＮＲプロモーターまたはＴｅｔプロモーターの制御下でＰＡＬ１およびＰＡＬ３のそれぞれに対して作製された。本明細書に記載のプラスミドのそれぞれを、以下のステップに従って本明細書に記載の試験のために、大腸菌（例えば、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ）に形質転換した。すべてのチューブ、溶液、およびキュベットは４℃に予め冷却された。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの一晩培養物を、アンピシリンを含む５ｍＬの溶原性ブロス（ＬＢ）で１：１００に希釈し、ＯＤ６００が０．４～０．６に達するまで増殖させた。次に、大腸菌細胞を２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を４℃の水１ｍＬに再懸濁した。大腸菌を２０００ｒｐｍ、４℃で５分間再び遠心分離し、上清を除去し、細胞を４℃の水０．５ｍＬに再懸濁した。大腸菌を２０００ｒｐｍ、４℃で５分間再び遠心分離し、上清を除去し、最終的に細胞を４℃の水０．１ｍＬに再懸濁した。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定した。プラスミド（０．５μｇ）を細胞に加え、ピペッティングにより混合し、ピペットで滅菌した冷却キュベットに入れた。乾燥キュベットをサンプルチャンバーに入れ、電気パルスを印可した。直ちに１ｍＬの室温ＳＯＣ培地を加え、混合物を培養チューブに移し、３７℃で１時間インキュベートした。アンピシリンを含むＬＢプレート上に細胞を広げ、一晩インキュベートした。
いくつかの実施形態では、ＰＡＬが、Ｎｉｓｓｌｅゲノムに挿入された。ギブソンアセンブリーを使用して、ＮｉｓｓｌｅのｍａｌＰおよびｍａｌＴ遺伝子座に相同なＤＮＡの１０００ｂｐ配列を付加し、この配列を相同アームの間にクローニングした。ＫＩＫＯプラスミドへの断片の挿入の成功を、配列決定により確証した。ＰＣＲを使用して全領域を増幅した。このノックインＰＣＲ断片を使用して、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子を発現するエレクトロコンピテントＮｉｓｓｌｅ株を形質転換した。形質転換後、細胞を３７℃で２時間増殖させた。ｍａｌＰＴ遺伝子間領域での組込みに成功した形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンで選択した。
いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターによって駆動される高親和性フェニルアラニントランスポーターＰｈｅＰの非天然コピー（例えば、天然の第２コピー）が、相同組換えによってＮｉｓｓｌｅゲノムに挿入された。最初にギブソンアセンブリーを使用して、ＮｉｓｓｌｅのｌａｃＺ遺伝子座に相同なＤＮＡの１０００ｂｐ配列をＲ６ＫオリジンプラスミドｐＫＤ３に付加した。これは、これらの相同アーム間にクローニングされたＤＮＡを標的にして、ＮｉｓｓｌｅゲノムのｌａｃＺ遺伝子座に組み込む。ＰＣＲを使用して、相同アームの全配列とそれらの間のｐｈｅＰ配列を含むこのプラスミド由来の領域を増幅した。このＰＣＲ断片を使用して、ラムダレッドリコンビナーゼ遺伝子をコードする温度感受性プラスミドを含む株であるエレクトロコンピテントＮｉｓｓｌｅ－ｐＫＤ４６を形質転換した。形質転換後、細胞を２時間増殖させた後、３７℃で２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールにプレーティングした。３７℃での増殖はｐＫＤ４６プラスミドを治癒する。無水テトラサイクリン（ＡＴＣ）誘導性ｐｈｅＰを含む形質転換体は、ｌａｃマイナス（ｌａｃ－）およびクロラムフェニコール耐性であった。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、Ｎｉｓｓｌｅに形質転換されたプラスミド上にあり得る。
いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターによって駆動されるＬＡＡＤを、本明細書に記載のＮｉｓｓｌｅゲノムに挿入した。一晩培養物を１：１００に希釈し、対数増殖期の初期まで増殖させた後、ＡＴＣ（１００ｎｇ／ｍｌ）で２時間誘導した。細胞をスピンダウンし、次のようにインキュベートした。細胞（１ｍｌ）を１４ｍｌの培養チューブ内で好気的にインキュベートし、２５０ｒｐｍで振盪した。微好気性条件では、細胞（１ｍｌ）を１．７ｍｌのコニカルチューブ内で振盪せずに培養した。９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２を供給するＣｏｙ嫌気性チャンパー内で細胞を嫌気的に培養した。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤは、Ｎｉｓｓｌｅに形質転換されたプラスミド上にあり得る。
例示的なフェニルアラニン代謝酵素、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、フェニルアラニントランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、これらの構築物の構成およびヌクレオチド配列、ならびにこれらの構築物を作製する方法は、ＷＯ２０１７０８７５８０に示されている。他のプロモーターを使用して遺伝子の発現を駆動してもよく、他の遺伝子（例えば、フェニルアラニン代謝遺伝子）を使用してもよい。
例示的な細菌は、フェニルアラニン代謝細菌ＳＹＮＢ１６１８である。Ｉｓａｂｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１８年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａを参照されたい。ＳＹＮＢ１６１８は、嫌気性誘導性プロモーターＰｆｎｒＳの調節制御下で、２つの染色体に組み込まれたｐｈｅＰのコピーおよび３つのｓｔｌＡのコピーで操作された。ＰｆｎｒＳプロモーターは、酸素の存在下では不活性であり、嫌気性または微好気性条件下で嫌気性感知転写活性化因子ＦＮＲによって活性化された。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ中のＰｆｎｒＳ－ＧＦＰ転写融合物（ＰｆｎｒＳ－ＧＦＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける経口投与および胃腸管からの回収後のこのプロモーターの活性化を確認した。ｓｔｌＡの２つの追加コピーをＰｔａｃプロモーターの制御下に置き、ｉｎ ｖｉｔｒｏでイソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘導を可能にした。ＳＹＮＢ１６１８は、アラビノース誘導性ＰＢＡＤプロモーターの制御下にｐｍａのコピーを含む。
実施例２：プロセス
凍結乾燥
発酵および細胞を凍結乾燥緩衝液に入れるための下流プロセスの後、細胞懸濁材料を１５ｍｍの充填深さで凍結乾燥トレイにロードする。凍結乾燥器を使用して次のサイクルを実行する：－４０℃で材料を凍結し、－１５℃で一次乾燥し、５℃で二次乾燥する。凍結乾燥サイクルの終了後、凍結乾燥ケーキを８０メッシュのスクリーンを通してふるい分け、その結果、自由流動性の粉末が得られる。
噴霧乾燥
発酵および細胞を噴霧乾燥緩衝液に入れるための下流プロセスの後、１２０～１３５℃の入口温度を有し、６０℃の出口温度を目標とする２流体ノズルを通して細胞懸濁液を噴霧乾燥し、自由流動性の粉末にする。
凍結液体
発酵および細胞を凍結保護緩衝液に入れるための下流プロセスの後、細胞懸濁液を－８０℃で凍結する。
実施例３：生細胞カウンティング
Ｎｅｘｃｅｌｏｍ社のセロメーター（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）を使用して、生細胞カウントおよび生存率を求めた。凍結液体中に細菌を含む製剤については、サンプルを３７℃の水浴で解凍した。凍結乾燥および噴霧乾燥した細菌を含む製剤については、１ｇをバイアルに量り取り、６ｍＬのＰＢＳで再水和した。次に、すべての細胞サンプルをＰＢＳで１：１０００に希釈し、さらにＰＢＳまたはＨＢＳＳ中のＳｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ染色液で１：１に希釈した（合計１：２０００希釈）。次に、この希釈液４μＬをセロメーター（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）スライドに移した。スライドをセロメーター（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）に置き、明視野および蛍光画像を取得した。明視野で検出された細胞の数（総細胞）と蛍光で検出された細胞の数（非生細胞）の差から、生細胞カウントを算出した。生存率は、生細胞の数／総細胞の数として算出された。
実施例４：凍結液体、凍結乾燥または噴霧乾燥細菌を含む製剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
実施例２に開示された方法に従って調製された凍結乾燥、凍結液体および噴霧乾燥細菌を含む細菌の組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性について特性評価された。表２は、プロセス１（凍結液体）またはプロセス２（固体バッチ、凍結乾燥）によって調製されたフェニルアラニン代謝細菌の例示的な特性を示す。
Figure 2022530503000022
実施例５：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏシミュレーション（ＩＶＳ）消化管モデル
操作された細菌株の生存率および代謝活性を特徴付け、ｉｎ ｖｉｖｏでの機能を予測するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏシミュレーション（ＩＶＳ）消化管モデルを設計して、酸素濃度、胃および膵臓の酵素、胆汁など、ヒトの胃腸通過の重要な側面をシミュレートした。ＩＶＳモデルは、胃、小腸、および結腸の状態をシミュレートするように設計された９６ウェルマイクロプレート形式の一連のインキュベーションを含む（図９）。フェニルケトン尿症の処置のために設計された操作された菌株を試験するために、シミュレートされた胃および小腸が検討された。ＩＶＳモデルの胃および小腸部分は、Ｍｉｎｅｋｕｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４年）Ａ ｓｔａｎｄａｒｄｉｓｅｄ ｓｔａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｆｏｏｄ－ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓから採用された。
消化管の通過をシミュレートするために、細菌細胞の凍結アリコートを最初に室温で解凍した。凍結乾燥した細菌細胞材料は４℃で保管され、解凍を必要としなかった。細菌細胞濃度は、ＣＦＵプレーティングによって、またはセロメーター（ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）による生細胞および／もしくは総細胞のカウントによって測定された。細菌細胞のアリコートを、０．０７７Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液に５．０×１０９細胞／ｍＬで再懸濁した。次に、この溶液を等量のシミュレートされた胃液（ＳＧＦ；表１および表２を参照）と混合し、２％酸素に調整されたＣｏｙ微好気性チャンバー内で振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした。ＳＧＦの細胞密度は２．５×１０９／ｍＬであった。フェニルアラニン（Ｐｈｅ）を消費するように設計された操作された菌株の試験のために、ＳＧＦは２０ｍＭのＰｈｅで修正された。２時間のＳＧＦインキュベーション後、等量のシミュレートされた腸液（ＳＩＦ；表３および表４を参照）をＳＧＦ－重炭酸水素ナトリウム混合物に加え、２％酸素に調整されたＣｏｙ微好気性チャンバー内で振盪しながら３７℃でさらに２時間インキュベートした。ＳＩＦと混合したときの細胞密度は１．２５×１０９細胞／ｍＬであった。
ＩＶＳ試験において経時的な細菌の生存率を決定するために、ＳＧＦおよびＳＩＦアリコートを収集し、段階希釈してＬＢ寒天プレートにプレーティングした後、３７℃で一晩インキュベートし、その後ＣＦＵカウンティングを行った。ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の栄養要求性を有する株の場合、ＬＢ寒天プレートに１００μｇ／ｍＬのＤＡＰを添加した。あるいは、生細胞および／または総細胞をセロメーターでカウントすることによって、経時的な細菌の生存率を決定した。Ｐｈｅの消費量を決定するために、ＳＧＦおよびＳＩＦアリコートを定期的に収集し、卓上遠心分離機を使用して４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、Ｐｈｅ、トランス－ケイ皮酸（ＴＣＡ）、フェニルピルビン酸（ＰＰ）などの代謝産物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定量のために、無細胞上清を採取した。無細胞上清は、任意に、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析まで－２０℃で保管された。
表３：１．２５×のシミュレートされた胃液（１．２５×ＳＧＦ）の組成
Figure 2022530503000023
表４：シミュレートされた胃液（ＳＧＦ）の組成
Figure 2022530503000024
表５：１．２５×のシミュレートされた腸液（１．２５×ＳＩＦ）の組成
Figure 2022530503000025
表６：シミュレートされた腸液（ＳＩＦ）の組成
Figure 2022530503000026
実施例６：生細胞カウントおよびＣＦＵ法
試験の少なくとも４日前から、非ナイーブ（ｎｏｎ－ｎａｉｖｅ）ホモ接合の雌のＢＴＢＲ－Ｐａｈｅｎｕ２／ｅｎｕ２マウス（約１５～２５週齢）に、フェニルアラニンを含まない固形飼料と０．５ｇ／Ｌのフェニルアラニンを添加した水とを与えた。１日目に、マウスの体重を測定し、体重に基づいてランダムに群に分けた。次に、マウスに細菌を経口投与し、直ちに代謝ケージに移した。最初の細菌投与の１時間後と２時間後に、それぞれ２回の追加投与を行った。最初の細菌投与の３時間後、総尿サンプルを収集し、その体積を記録した。試験終了後、動物をホームケージに戻した。
細胞を調製するために、ＳＹＮ０９４および凍結液体ＳＹＮＢ１６１８（ＳＹＮＢ１６１８バッチＡ）を３７℃で解凍した。凍結乾燥（バッチＣ）および噴霧乾燥（バッチＤ）ＳＹＮＢ１６１８は、製剤グループによって調製された。細胞をＰＢＳで５．０３ｅ１０生細胞／ｍｌに希釈し、１Ｍ重炭酸ナトリウムで９：１に混合した。各マウスに合計で９００ｕＬを強制経口投与した。これは４．０８ｅ１０生細胞／マウスに相当した。
最初の細菌投与の３時間後に尿サンプルを収集した。尿中の馬尿酸（ＨＡ）レベルは、質量分析を使用して測定された。例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０を参照されたい。測定された馬尿酸の総量が図５Ａに示されており、ＳＹＮ０９４では０．０３１μｍｏｌ±０．００６、凍結液体ＳＹＮＢ１６１８では２．５６９μｍｏｌ±０．４６８、凍結乾燥ＳＹＮＢ１６１８では３．９２６μｍｏｌ±０．２２２、噴霧乾燥ＳＹＮＢ１６１８では２．２１７μｍｏｌ±０．４９５であった。凍結乾燥および噴霧乾燥ＳＹＮＢ１６１８で測定されたＨＡレベルは、凍結液体ＳＹＮＢ１６１８と変わらなかったが、凍結乾燥ＳＹＮＢ１６１８は噴霧乾燥ＳＹＮＢ１６１８より有意に高いＨＡ回収量をもたらした。
実施例７：生細胞カウントおよびＣＦＵ法
試験の少なくとも４日前から、非ナイーブ（ｎｏｎ－ｎａｉｖｅ）ホモ接合の雌のＢＴＢＲ－Ｐａｈｅｎｕ２／ｅｎｕ２マウス（約１２～２２週齢）に、フェニルアラニンを含まない固形飼料と０．５ｇ／Ｌのフェニルアラニンを添加した水とを与えた。１日目に、マウスの体重を測定し、体重に基づいてランダムに群に分けた。次に、マウスに細菌を経口投与し、直ちに代謝ケージに移した。最初の細菌投与の１時間後と２時間後に、それぞれ２回の追加投与を行った。最初の細菌投与の３時間後、総尿サンプルを収集し、その体積を記録した。試験終了後、動物をホームケージに戻した。
細胞を調製するために、凍結液体ＳＹＮＢ１６１８（ＳＹＮＢ１６１８バッチＡ）を３７℃で解凍した。凍結乾燥および噴霧乾燥（バッチＢ）ＳＹＮＢ１６１８は、製剤グループによって調製された。細胞をＰＢＳで５．０３ｅ１０生細胞／ｍｌに希釈し、１Ｍ重炭酸ナトリウムで９：１に混合した。各マウスに合計で９００ｕＬを強制経口投与した。これは５ｅ１０生細胞／マウスに相当した。
最初の細菌投与の３時間後に尿サンプルを収集した。尿中の馬尿酸（ＨＡ）レベルは、質量分析を使用して測定された。例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０を参照されたい。測定された馬尿酸の総量が図６Ｂに示されており、凍結液体および噴霧乾燥ＳＹＮＢ１６１８では３．１０７μｍｏｌ±０．７４３および１．５６３μｍｏｌ±０．１４６であり、有意な差はなかった。
実施例８：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）試験
約２～５歳の雄の非ナイーブ（ｎｏｎ－ｎａｉｖｅ）カニクイザル１０匹をランダムに２つのグループ（ｎ＝５）に分け、一晩絶食させた。投与前に、ベースラインのフェニルアラニン濃度用に血漿を収集した。動物は、採尿用の清潔な収集パンで分離された。次に、５００ｇ／Ｌのペプトン１１ｍＬ、０．３６Ｍの重炭酸ナトリウム５ｍＬ、および凍結液体ＳＹＮＢ１６１８（ＳＹＮＢ１６１８バッチＡ）または凍結乾燥ＳＹＮＢ１６１８のいずれかを各動物に投与した（１回投与あたり１．３×１０１１生細胞）。投与後０．５、１、２、４および６時間後に血漿サンプルを収集した。投与後６時間の終了時に、尿の総量を測定し、記録し、そして収集した。
凍結液体ＳＹＮＢ１６１８（ＳＹＮＢ１６１８バッチＡ）を３７℃で解凍した。凍結乾燥ＳＹＮＢ１６１８をＰＢＳに再懸濁した。凍結液体および凍結乾燥細菌は、いずれも製剤緩衝液で２．６×１０１０生細胞／ｍＬに希釈した。
血漿フェニルアラニンレベルと尿中の馬尿酸（ＨＡ）回収量は、質量分析で測定された。血漿フェニルアラニンレベルは、凍結液体では投与後２時間でピークに達し（０．０７７１ｍＭ±０．００５）、凍結乾燥細菌では投与後１時間でピークに達した（０．０６９０ｍＭ±０．００３）。どの収集時点においても２つの群間に有意な差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。凍結液体ＳＹＮＢ１６１８の尿中ＨＡ回収量は４９．５９９μｍｏｌ±１０．４９８であり、凍結乾燥ＳＹＮＢ１６１８の７４．７７０μｍｏｌ±１２．０４４と有意差はなかった（ｐ＝０．１６２５）。
実施例９：Ｉｎ Ｖｉｖｏ ＳＹＮＢ１６１８
試験の少なくとも４日前から、野生型で雌の非ナイーブ（ｎｏｎ－ｎａｉｖｅ）Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（約１４週齢）に、フェニルアラニンを含まない固形飼料と０．５ｇ／Ｌのフェニルアラニンを添加した水とを与えた。１日目に、マウスの体重を測定し、体重に基づいてランダムに群に分けた。次に、マウスに細菌を経口投与し、直ちに代謝ケージに移した。最初の細菌投与の１時間後と２時間後に、それぞれ２回の追加投与を行った。最初の細菌投与の３時間後、尿サンプルを収集し、その総体積を記録した。試験終了後、動物をホームケージに戻した。
細胞を調製するために、バッチＡ（凍結液体ＳＹＮＢ１６１８）を３７℃で解凍した。凍結乾燥固体バッチ１、２および３を、本明細書に記載されるように調製した。細胞をＰＢＳで９．４３ｅ１０生細胞／ｍｌに希釈し、１Ｍ重炭酸ナトリウムで９：１に混合した。各マウスに合計で６００ｕＬを強制経口投与した。これは５．０９ｅ１０個生細胞／マウスに相当した。
最初の細菌投与の３時間後に尿のサンプルを収集した。尿中の馬尿酸（ＨＡ）レベルは、質量分析を使用して測定された。例えば、ＷＯ２０１７０８７５８０を参照されたい。測定された馬尿酸の総量が図８の右側の棒グラフに示されており、バッチ１、バッチ２およびバッチ３で、それぞれ５．３７７μｍｏｌ±０．４４０、５．３５３μｍｏｌ±０．９９５および５．２６０μｍｏｌ±０．４９９であった。処置群の間で有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。
実施例１０：凍結乾燥された細菌を含む製剤の安定性
安定性試験は、ＳＹＮＢ１６１８原薬製剤および製剤について、５±３℃および２５±５℃／６０±５％ＲＨで６ヵ月間実施される。試験の開始を、サンプルが適切な保管条件に置かれた日として定めた。
原薬製剤は、密封されたホイルパウチ内のポリエチレン袋中、または密封されたＨＤＰＥボトル中に保管した。どちらも、５±３℃および２５±５℃／６０±５％ＲＨの安定性チャンバーに保管され、試験スケジュールに従って２週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、および６ヵ月で保管から取り出された。アリコートは、生細胞、生存率（生細胞／総細胞）、効力、および固形外観について評価された。各時点の結果を、最初の時点および所定の仕様で観察された結果と比較した。各時点で、５ｇの原薬製剤と２瓶の製剤が試験に使用された。
実施例１１：ＰＫＵ細菌株の生細胞カウンティング
細菌株およびＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ染色液は、既述のとおり調製された。ＳＹＮＢ１６１８の３つのバッチ（＃１２、＃１７、およびＣＴＭ）を、異なる染色濃度およびインキュベーション時間で分析した。データは、総細胞／ｍＬ、生細胞／ｍＬ、および生存率の３つの主要属性について分析された。
＃１２は、２．５、５、７．５、１０、１２および１５ｕＭのＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ濃度でインキュベートされた。各濃度について、２、４、６および８分間染色を行った。総細胞／ｍＬは、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ染色濃度および染色時間の影響を受けなかった。すべての染色濃度および時点にわたるすべての総細胞カウントの平均は、１．３２Ｅ１１細胞／ｍｌで、ＳＤ＝７．７６Ｅ９細胞／ｍｌ、％ＣＶ＝５．８８、Ｎ＝２４であった。染色濃度２．５ｕＭでの結果は、７．５ｕＭでの生細胞／ｍＬと同様であった。５ｕＭの染色濃度で、１．２５Ｅ１１生細胞／ｍｌが得られた。（図１２Ａ－１２Ｃ）。
凍結液体形態の＃１２の３３個のレプリケートについても、生細胞カウンティング法を使用してアッセイし、平均の総細胞／ｍＬ、死細胞／ｍＬおよび生細胞／ｍＬを分析した。生細胞／ｍＬの％ＣＶは１２．３であった。（図１４Ａ－１４Ｃ）。
バッチ１７は、２．５、５、７．５、１０および１５ｕＭのＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ濃度でインキュベートされた。各濃度について、２、４、６および８分間染色を行った。いずれの染色濃度でも、ＣＶは２％未満であった。（図１２Ｄ－１２Ｆ）。
ＣＴＭは、５、７．５、１０および１５ｕＭのＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ濃度でインキュベートされた。各濃度について、２、４、６および８分間染色を行った。総細胞／ｍＬは染色濃度および染色時間によって変化しなかった。（図１２Ｇ－１２Ｉ）。
実施例１２：ＵＣＤおよび癌処置細菌株の生細胞カウンティング
ＳＹＮＢ１０２０（Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ酵素ＡｒｇＡのフィードバック耐性バージョンａｒｇＡｆｂｒ、および欠失されたアルギニンリプレッサーＡｒｇＲを含む；Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｓｈｏｗｓ Ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｈｕｍａｎｓ、２０１９年を参照）は、５、７．５、１０および１５ｕＭのＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ濃度でインキュベートされた。各濃度について、２、４、６および８分間染色を行った。総細胞／ｍＬは、染色濃度の違いまたは時間の経過とともに変化しなかった。（図１３Ａ－１３Ｃ）。
ｄａｃＡ遺伝子を含む例示的な細菌（ＳＹＮＢ１８９１）は、５および７．５ｕＭのＳｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ濃度でインキュベートされた。各濃度について、１、２および３分間染色を行った。５μＭでの２つのレプリケートと７．５μＭでの２つのレプリケートは、生細胞／ｍＬおよび％生存率について非常に類似していた。（図１３Ｄ－１３Ｆ）。
実施例１３：生細胞／ｍＬの線形範囲の決定
ＰＫＵ凍結乾燥株ＳＹＮＢ１６１８のいくつかの希釈液を試験し、細胞カウントを求め、線形性について分析した。カウントされた細胞が８６１～２５４７個の範囲では、Ｒ２＝０．８４であり、この範囲の逆算されたタイター（ｂａｃｋ－ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｔｉｔｅｒｓ）のＣＶは９．８５％であった。賦形剤（５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液中の１０％トレハロース、ｐＨ７．５）を含むＳＹＮＢ１６１８も、生細胞／ｍＬの線形性について試験され、同じ線形範囲が適用可能であった。（図１５Ａ－１５Ｄ）。
ＧＭＰレベルのＳＹＮＢ１８９１バッチについて、セロメーター（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）の線形性を試験した。９００～２４００の範囲でＲ２＝０．８４であった。（図１５ＥおよびＦ）。
生存率パーセント測定の線形性は、熱で一部の細胞を死滅させることによって試験され、ここで、熱はＳＹＴＯＸ色素がＤＮＡに結合できるように膜を十分に透過性にする。次に、死滅させたサンプルをさまざまな比率で元の生サンプル（ｌｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ）に加えて、生細胞２５％、５０％、７５％および１００％の細胞の混合物を作製した。生存率の誤差は約±７％であり、セロメーター（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）の生存率測定は生存率２５％超で線形であり、最適範囲は５０～１００％の生存率であった。（図１５Ｇ）。

Claims (112)

  1. 治療用分子を産生するための1つ以上の遺伝子を含む所定の数の遺伝子操作された細菌細胞を含む医薬組成物であって、細菌細胞の数は生細胞計数によって決定され、生細胞計数はコロニー形成単位(CFU)計数よりも治療活性のより正確な尺度を提供する。
  2. 所定数の遺伝子操作されたバクテリアが、生細胞計数によって測定されるように、1x108～1x1013の細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 所定数の遺伝子操作されたバクテリアが、生細胞計数によって測定されるように、1x109～1x1013の細胞である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 所定数の遺伝子操作されたバクテリアが、生細胞計数によって測定されるように、約1×1011の生細胞、約1.1×1011の生細胞、約1.2×1011の生細胞、約1.3×1011の生細胞、約1.4×1011の生細胞、約1.5×1011の生細胞、約1.6×1011の生細胞、約1.7×1011の生細胞、約1.8×1011の生細胞、約1.9×1011の生細胞、約2×1011の生細胞、約2.1×1011の生細胞、約2.2×1011の生細胞、約2.3×1011の生細胞、約2.4×1011の生細胞、約2.5×1011の生細胞、約2.6×1011の生細胞、約2.7×1011の生細胞、約2.8×1011の生細胞、約2.9×1011の生細胞、約3×1110の生細胞、約3.1×1011の生細胞、約3.2×1011の生細胞、約3.3×1011の生細胞、約3.4×1011の生細胞、約3.5×1011の生細胞、約3.6×1011の生細胞、約3.7×1011の生細胞、約3.8×1011の生細胞、約3.9×1011の生細胞、約4×1011の生細胞、約5×1011の生細胞、約6×1011の生細胞、約7×1011の生細胞、約8×1011の生細胞、または約9×1011の生細胞である、請求項１～３に記載の医薬組成物。
  5. 所定数の遺伝子操作されたバクテリアが、生細胞計数によって測定されるように、約1×1012の生細胞、約1.1×1012の生細胞、約1.2×1012の生細胞、約1.3×1012の生細胞、約1.4×1012の生細胞、約1.5×1012の生細胞、約1.6×1012の生細胞、約1.7×1012の生細胞、約1.8×1012の生細胞、約1.9×1012の生細胞、約2×1012の生細胞、約2.1×1012の生細胞、約2.2×1012の生細胞、約2.3×1012の生細胞、約2.4×1012の生細胞、約2.5×1012の生細胞、約2.6×1012の生細胞、約2.7×1012の生細胞、約2.8×1012の生細胞、約2.9×1012の生細胞、約3×1012の生細胞、約3.1×1012の生細胞、約3.2×1012の生細胞、約3.3×1012の生細胞、約3.4×1012の生細胞、約3.5×1012の生細胞、約3.6×1012の生細胞、約3.7×1012の生細胞、約3.8×1012の生細胞、約3.9×1012の生細胞、約4×1012の生細胞、約4.1×1012の生細胞、約4.2×1012の生細胞、約4.3×1012の生細胞、約4.4×1012の生細胞、約4.5×1012の生細胞、約4.6×1012の生細胞、約4.7×1012の生細胞、約4.8×1012の生細胞、約4.9×1012の生細胞、または約5×1012生細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 遺伝子操作されたバクテリアが、被験体における疾患または障害の治療のための1つ以上の非天然遺伝子を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 前記1つ以上の遺伝子が、誘導性プロモーターに動作可能に連結されている、請求項６に記載の医薬組物。
  8. 医薬組成物を被験体に投与するとき、前記１つ以上の遺伝子が誘導される、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 医薬組成物が被験体に投与される前に前記１つ以上の遺伝子が誘導される、請求項７に記載の医薬組成物。
  10. 遺伝子操作された細菌が、１つ以上のフェニルアラニン代謝酵素(PME)を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  11. 請求項１～１０のいずれかに記載の医薬組成物:であって、遺伝子操作された細菌は、
    a) フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする１つ以上の遺伝子であって、PALをコードする遺伝子が、本質的にPAL遺伝子と関連していない誘導性プロモーターと動作可能に連結されているものであり、
    b) フェニルアラニントランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子であって、フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子が、本質的にフェニルアラニントランスポーター遺伝子と結合していない誘導性プロモーターと動作可能に結合しているもの、を含む。
  12. 前記細菌が、さらにL-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする1つ以上の遺伝子を含み、LAADをコードする遺伝子は、本質的にLAAD遺伝子と関連していない誘導性プロモーターと動作可能に連結されている、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. PALをコード化する遺伝子と動作可能に連結されたプロモーターとフェニルアラニントランスポーターをコード化する遺伝子と動作可能に連結されたプロモーターが、同じプロモーターの別々のコピーである、請求項１１または１２に記載の薬学的組成物。
  14. PALをコード化する遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコード化する遺伝子が、単一のプロモーターに機能的に連結されている、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
  15. PALをコード化する遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコード化する遺伝子が、異なるプロモーターと作動可能に連結されている、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
  16. LAADをコード化する遺伝子、PALをコード化する遺伝子、およびフェニルアラニントランスポーターをコード化する遺伝子が、同じプロモーターの別々のコピーと作動可能に連結されている、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
  17. LAADをコード化する遺伝子が、PALをコード化する遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコード化する遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターとは異なるプロモーターと作動可能に連結されている、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  18. PALをコード化する遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコード化する遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターまたは複数のプロモーターが、哺乳動物の消化管に見出される外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  19. フェニルアラニントランスポーターをコード化する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーター、熱調節プロモーター、およびアラビノース、IPTG、テトラサイクリン、またはラムノースによって誘導されるプロモーターから選択される、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  20. PALをコード化する遺伝子が、低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーター、熱調節プロモーター、およびアラビノース、IPTG、テトラサイクリン、またはラムノースによって誘導されるプロモーターから選択されるプロモーターと作動可能に連結された、請求項１１～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  21. LAADをコード化する遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーター、熱調節プロモーター、およびアラビノース、IPTG、テトラサイクリン、またはラムノースによって誘導されるプロモーターから選択される、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  22. 熱調節プロモーターは、３７oC～４２oCの間の温度で誘導される、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 熱調節プロモーターは、ラムダCI誘導性プロモーターである、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  24. 遺伝子操作された細菌は、温度感受性CIリプレッサー突然変異体をコード化する１つ以上の遺伝子をさらに含む、請求項１１～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  25. 温度感受性CIリプレッサー突然変異体がCI857である、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 温度感受性CIリプレッサー突然変異体をコード化する遺伝子およびLAADをコード化する遺伝子が、同じプロモーターの制御下にある請求項２４または２５のいずれかに記載の遺伝子操作された細菌。
  27. PALをコード化する遺伝子およびフェニルアラニントランスポーターをコード化する遺伝子と作動可能に連結されたプロモーターまたは複数のプロモーターが、低酸素または嫌気性条件下で直接的または間接的に誘導される、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  28. プロモーターまたは複数のプロモーターが、FNR応答性プロモーター、ANR応答性プロモーター、およびDNR応答性プロモーターからなる群より選択される、請求項２７に記載の医薬組成物。
  29. フェニルアラニンプロモーターをコード化する遺伝子が、細菌中の染色体上に位置する、請求項１１～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  30. フェニルアラニンプロモーターをコード化する遺伝子が、細菌中のプラスミド上に位置する、請求項１１～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  31. PALをコード化する遺伝子が細菌中の染色体上に位置する、請求項１１～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  32. PALをコード化する遺伝子が細菌中のプラスミド上に位置する、請求項１１～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  33. LAADをコード化する遺伝子が、細菌中の染色体上に位置する、請求項１２～３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  34. LAADをコード化する遺伝子が、細菌中のプラスミド上に位置する、請求項１２～３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  35. PALがアナベナ・バリアビリス(PAL1)由来またはフォトラブダス・ルミネッセンス(PAL3)由来である、請求項１１～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  36. フェニルアラニントランスポーターがPhePである、請求項１１～３５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  37. 遺伝子操作された細菌が、抗癌分子、例えば脱アデニル酸シクラーゼ遺伝子またはインターフェロン遺伝子(STING)アゴニストの刺激因子を産生することができる酵素を産生するための少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  38. 遺伝子操作された細菌が、改変アルギニン生合成経路、例えば、欠失アルギニンリプレッサー、改変アルギニンリプレッサー結合部位、および/またはアルギニンフィードバック耐性N-アセチルグルタミン酸合成酵素突然変異をコード化する遺伝子を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  39. 遺伝子操作された細菌が、細菌が哺乳動物の腸内に存在するときに補完される遺伝子中の栄養要求株である、請求項１～３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  40. 前記細菌がジアミノピメリン酸中またはチミジン中の栄養要求株である、請求項３９に記載の遺伝子操作された細菌。
  41. 細菌に毒性のある物質をコード化する遺伝子を持つように細菌がさらに操作され、遺伝子は、環境因子または信号の有無によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下にある、請求項１～４０のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細菌。
  42. 前記細菌が、バクテロイデス、ビフィズス菌、クロストリジウム、大腸菌類、ラクトバチルス、および乳酸球菌からなる群より選択される、請求項１～４１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  43. 前記細菌が、大腸菌株ニッスルである、請求項４２に記載の医薬組成物。
  44. 経口または直腸投与のために処方された請求項１～４３のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 遺伝子操作されたバクテリアが、凍結乾燥製剤、再構成された凍結乾燥製剤、固形製剤、または固形経口製剤である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  46. 遺伝子操作されたバクテリアが、液体製剤または凍結液体製剤である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  47. 遺伝子操作されたバクテリアを噴霧乾燥する、請求項１～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  48. 1～100mMのトリス緩衝液をさらに含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  49. 1～50mMのトリス緩衝液をさらに含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  50. 1～10mMのトリス緩衝液をさらに含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  51. 1～20%のトレハロースをさらに含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  52. 10～20%のトレハロースをさらに含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  53. pHが6.0～8.0である請求項１～５２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  54. pHが6.0～7.0である請求項１～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  55. pHが7.0～8.0である請求項１～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  56. 組成物が2-8℃で保存される場合少なくとも1ヵ月間安定である、請求項１～５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  57. 組成物が少なくとも3ヵ月間安定である、請求項５６に記載の医薬組成物。
  58. 組成物が少なくとも6ヵ月間安定である、請求項５７に記載の医薬組成物。
  59. 組成物が少なくとも9ヵ月間安定である、請求項５８に記載の医薬組成物。
  60. 組成物が少なくとも12ヵ月間安定である、請求項５９に記載の医薬組成物。
  61. 室温および相対湿度60%で保存した場合、組成物が少なくとも1ヵ月間安定である、請求項１～６０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  62. 組成物が凍結液体中で遺伝子操作されたバクテリアを有する医薬組成物と同様の安定性を示す、請求項１～６１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  63. 組成物が凍結液体中の同数の生細胞を有する医薬組成物と同様の活性を有する、請求項１～６２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  64. 組成物が凍結した液体状の遺伝的に操作されたバクテリアを含む組成物と同じ割合の生細胞を有し、生細胞の割合は、総細胞数で割った生細胞の数である、請求項１～６３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  65. 生細胞の割合が少なくとも60%であって、生細胞の割合は、総細胞数で割った生細胞数の数である、請求項６４に記載の医薬組成物。
  66. 生細胞の割合が少なくとも65%である請求項６５に記載の医薬組成物。
  67. 生細胞の割合が少なくとも70%である請求項６６に記載の医薬組成物。
  68. 生細胞の割合が少なくとも75%である請求項６７に記載の医薬組成物。
  69. 生細胞の割合が少なくとも80%である請求項６８に記載の医薬組成物。
  70. 生細胞の割合が少なくとも82%である請求項６９に記載の医薬組成物。
  71. 生細胞の割合が少なくとも84%である請求項７０に記載の医薬組成物。
  72. 医薬組成物が少なくとも約0.5μmol/時/109細胞の速度でTCAを産生することができる、請求項１～３６または３９～７１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  73. TCA産出速度が少なくとも約1.0μmol/時/109細胞である、請求項７２に記載の医薬組成物。
  74. TCA産出速度が少なくとも約1.9±1.2μmol/時/109細胞である、請求項１～３６または３９～７１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  75. TCA産出速度がおよそ1.5～10.0μmol/時/109細胞である、請求項７３に記載の医薬組成物。
  76. TCA産出速度がおよそ1.5～5.0μmol/時/109細胞である、請求項７５に記載の医薬組成物。
  77. 医薬組成物が、約1.0μmol/時/109細胞の速度でPPAを産生することができる、請求項１～３６または３９～７６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  78. PPA産出速度が少なくとも約1.5μmol/時/109細胞である、請求項７７に記載の医薬組成物。
  79. PPA産出速度が少なくとも約2.9±0.7μmol/時/109細胞である、請求項１～３６または３９～７６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  80. PPA産出速度が約2.0～10.0μmol/時/109細胞である、請求項７９に記載の医薬組成物。
  81. PPA産出速度が約2.0～5.0μmol/時/109細胞である、請求項８０に記載の医薬組成物。
  82. バクテリアが、制御と比較して増加した馬尿酸(例えば、HAまたは標識D5-HA)を産生することができる、請求項１～３６または３９～７６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  83. 医薬組成物が、約1.9×108±1.8×108EU/g以下のエンドトキシンを含む、請求項１～８２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  84. 医薬組成物が、約4.0×108EU/g以下のエンドトキシンを含む請求項１～８２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  85. 医薬組成物が、約3.0×108EU/g以下のエンドトキシンを含む、請求項８４に記載の医薬組成物。
  86. 医薬組成物が、約2.0×108EU/g以下のエンドトキシンを含む、請求項８５に記載の医薬組成物。
  87. 医薬組成物が、約1.0×108 EU/g以下のエンドトキシンを含む、請求項８６に記載の医薬組成物。
  88. 医薬組成物が約5×107EU/g以下のエンドトキシンを含む、請求項８７に記載の医薬組成物。
  89. 細菌がカプセルまたは錠剤中に処方される、請求項１～８８のいずれかに記載の医薬組成物。
  90. 請求項１～８９のいずれかに記載の薬学的組成物を投与することを含む被験体を治療する方法。
  91. 治療用分子を産生するための１つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作されたバクテリアを含む医薬組成物の活性を決定するための方法であって、この方法は遺伝子操作されたバクテリアの生細胞数を決定することを含み、その生細胞数がCFUよりもより正確な治療活性の測定値を提供する、方法。
  92. 治療用分子を産生するための１つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作されたバクテリアを含む医薬組成物の効力を決定するための方法であって、この方法は遺伝子操作されたバクテリアの生細胞数を決定することを含み、その生細胞数がCFUよりもより正確な効力の測定値を提供する、方法。
  93. 請求項９２の記載の方法に従って製造された遺伝子操作された細菌。
  94. 請求項１～８９のいずれかに記載の医薬組成物の活性を決定する方法であって、その方法は生細胞数を決定することを含み、生細胞数がCFUよりもバクテリア活性のより正確な測定値を提供する、方法。
  95. 請求項１～８９のいずれかに記載の医薬組成物の効力を測定する方法であって、その方法は生細胞数を測定することを含み、生細胞数がCFUよりも正確な効力の測定値を提供する、方法。
  96. 治療用分子を産生するための1つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物を製造する方法であって、細菌を凍結乾燥し生細胞数によって細菌細胞数を測定することを含み、生細胞数がCFUよりも細菌活性のより正確な測定値を提供する、方法。
  97. 治療用分子を産生するための1つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌を含み、細菌を凍結乾燥し、生細胞数によって細菌細胞数を測定することを含む医薬組成物を製造する方法であって、細菌のCFU数を測定することを含む方法と比較して、CFU数が減少した医薬組成物を提供する、方法。
  98. 遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物のCFU数を減少させる方法であって、細菌を凍結乾燥し、生細胞数によって細菌細胞数を測定することからなり、液体中で細菌を凍結し、CFU数を測定することを含む方法と比較して、CFU数を減少していることを特徴とする方法。
  99. 請求項９８に記載の方法に従って製造された遺伝子操作された細菌。
  100. 請求項１～８９のいずれかに記載の医薬組成物を製造する方法であって、生細胞数によって細菌細胞数の決定をすることを含み、生細胞数がCFUよりも細菌活性のより正確な測定値を提供することを特徴とする方法。
  101. 生細胞計数によって決定されるように、遺伝子操作された細菌の活性を非未変性の細菌と比較して維持および/または増加させる方法であって、細菌を凍結乾燥することを含む、方法。
  102. 請求項１０１に記載の方法に従って製造される遺伝子操作された細菌。
  103. 高フェニルアラニン血症の低減又は高フェニルアラニン血症に関連する疾患の治療に使用する請求項１～３６又は３９～８９のいずれか一項に記載の組成物。
  104. 疾患が、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、非定型フェニルケトン尿症、永久的に軽度の高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿性高フェニルアラニン血症、フェニルアラニン水酸化酵素欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、瀬川病、および肝疾患からなる群より選択される、請求項１０３に記載の組成物の使用。
  105. 高アンモニア血症の減少または高アンモニア血症に関連する疾患の治療に使用する請求項１～９、３８～７１または８３～８９のいずれかに記載の組成物。
  106. 疾患が、尿素サイクル不良、癌、アルギニノコハク酸尿症、アルギナーゼ欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素欠損症、シトルリン血症、N-アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、オルニチン、トランスカルバミラーゼ欠損症、肝性脳症、肝不全、慢性肝不全、有機酸不良、イソ吉草酸尿症、3-メチルクロトニルグリシン尿症、メチルマロン酸血症、プロピオン酸尿症、脂肪酸酸化欠損症、カルニチンサイクル欠損症、カルニチン欠損症、β-酸化欠損症、リジン尿性タンパク質不耐症、ピロリン-5-カルボン酸合成酵素欠損症、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症、炭酸脱水酵素欠損症、高インスリン血症-高アンモニア血症症候群、ミトコンドリア障害、バルプロ酸療法、アスパラギナーゼ療法、完全非経口栄養法、グリシン含有溶液による膀胱鏡検査、肺/骨髄移植後、門脈体循環シャント、尿路感染症、尿管拡張、多発性骨髄腫、化学療法、感染症、神経因性膀胱、腸内細菌の過剰増殖、ハンチントン病、痙攣、運動失調、脳卒中様病変、昏睡、精神病、視力低下、急性脳症、嘔吐, 呼吸性アルカローシス、低体温からなる群より選択される、請求項１０５に記載の組成物。
  107. 請求項１～９、３７、３９～７１、または８３～８９のいずれか一項に記載の癌の治療に使用する組成物。
  108. 癌が副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌(例えばユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫)、脳癌(例えば星状細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫)、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃腸癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、下咽頭癌、白血病(例えば急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病)、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、(例えば、AIDS関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホグキンリンパ腫、非ホグキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫)、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔癌、副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、口腔がん、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌(例えば、基底細胞癌、黒色腫)、小腸癌、胃癌、奇形腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、異常小児癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される、請求項１０７に記載の組成物。
  109. 所定の数の遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物で患者を治療する方法であって、患者が疾患または障害に罹患している場合、その方法は以下のステップを含む。
    所定の数の遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物を投与すること。
  110. 請求項１～８９のいずれか一項に記載の医薬組成物を使用する、請求項１０９に記載の方法。
  111. 遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物で患者を治療する方法であって、患者が疾患または障害に罹患している場合、その方法は以下のステップを含む。
    遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物の入手すること、
    医薬品組成物の生細胞数の測定をすること、
    所定数の生細胞に相当する量の医薬組成物を投与すること。
  112. 遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物を製造するための方法であって、組成物の生細胞数を測定することを含み、得られた医薬組成物が、同じ医薬組成物のCFU数を測定することを含む方法を使用して製造された医薬組成物と比較して減少したCFU数を有する、方法。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116847860A (zh) 2020-12-31 2023-10-03 同生运营公司 经工程化以减轻高苯丙氨酸血症的微生物

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9107305D0 (en) 1991-04-08 1991-05-22 Unilever Plc Probiotic
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
US6203797B1 (en) 1998-01-06 2001-03-20 Stephen C. Perry Dietary supplement and method for use as a probiotic, for alleviating the symptons associated with irritable bowel syndrome
EP1034787A1 (en) 1999-03-11 2000-09-13 Société des Produits Nestlé S.A. Lactobacillus strains preventing diarrhea caused by pathogenic bacteria
AUPQ899700A0 (en) 2000-07-25 2000-08-17 Borody, Thomas Julius Probiotic recolonisation therapy
US7731976B2 (en) 2003-08-29 2010-06-08 Cobb And Company, Llp Treatment of irritable bowel syndrome using probiotic composition
US9084434B2 (en) 2006-09-27 2015-07-21 Little Calumet Holdings Llc Probiotic oral dosage forms
WO2016141108A1 (en) 2015-03-02 2016-09-09 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat diseases that benefit from reduced gut inflammation and/or tightened gut mucosal barrier
BR112017011923A2 (pt) 2014-12-05 2018-02-27 Synlogic Inc bactéria modificada para tratar doenças associadas com hiperamonemia
US9889164B2 (en) 2014-12-05 2018-02-13 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat a disease or disorder
AU2016276973B2 (en) 2015-06-10 2022-09-01 Synlogic Operating Company, Inc. Bacteria engineered to treat disorders involving the catabolism of a branched chain amino acid
EP3307879A2 (en) 2015-06-10 2018-04-18 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat diseases associated with hyperammonemia
US11291693B2 (en) 2015-06-25 2022-04-05 Synlogic Operating Company, Inc. Bacteria engineered to treat metabolic diseases
US20170216370A1 (en) 2015-07-31 2017-08-03 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat disorders involving propionate catabolism
US11273184B2 (en) 2015-08-31 2022-03-15 Synlogic Operating Company, Inc. Bacteria engineered to treat disorders in which oxalate is detrimental
JP2018532412A (ja) 2015-10-30 2018-11-08 シンロジック オペレーティング カンパニー インコーポレイテッド 消化管炎症低下および／または消化管粘膜バリア強化の利益を享受する疾患処置のために操作された細菌
WO2017087580A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to reduce hyperphenylalaninemia
EP3402497A1 (en) 2016-01-11 2018-11-21 Synlogic Operating Company, Inc. Bacteria engineered to treat metabolic diseases
WO2017123676A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Synlogic, Inc. Recombinant bacteria engineered to treat diseases and disorders associated with amino acid metabolism and methods of use thereof
WO2017136795A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat diseases associated with tryptophan metabolism
AU2017213646A1 (en) 2016-02-04 2018-08-23 Synlogic Operating Company, Inc. Bacteria engineered to treat diseases that benefit from reduced gut inflammation and/or tightened gut mucosal barrier
WO2017139697A1 (en) 2016-02-10 2017-08-17 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat diseases associated with hyperammonemia
EP3565566A1 (en) 2017-01-06 2019-11-13 Synlogic Operating Company, Inc. Microorganisms programmed to produce immune modulators and anti-cancer therapeutics in tumor cells
JP7358245B2 (ja) 2017-06-21 2023-10-10 シンロジック オペレーティング カンパニー インコーポレイテッド 障害の処置のための細菌
WO2019014391A1 (en) 2017-07-12 2019-01-17 Synlogic Operating Company, Inc. MICROORGANISMS PROGRAMMED TO PRODUCE IMMUNOMODULATORS AND ANTICANCER THERAPEUTIC AGENTS IN TUMOR CELLS

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