JPH1075774A - パスツレラ科の弱毒化ｒｔｘ産生細菌 - Google Patents

パスツレラ科の弱毒化ｒｔｘ産生細菌

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JPH1075774A
JPH1075774A JP9178792A JP17879297A JPH1075774A JP H1075774 A JPH1075774 A JP H1075774A JP 9178792 A JP9178792 A JP 9178792A JP 17879297 A JP17879297 A JP 17879297A JP H1075774 A JPH1075774 A JP H1075774A
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Ruud Philip Antoon Mari Segers
ルード・フイリツプ・アントーン・マリア・セヘルス
Den Johannes Franciscus Bosch Van
ヨハンネス・フランシスカス・ボツシユ・フアン・デン
Joachim Frey
ヨアヒム・フレイ
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Akzo Nobel NV
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 パスツレラシアエ（Pasteurellaceae ）科の
毒性ＲＴＸ−産生細菌による感染からの保護を提供す
る。 【解決手段】 この発明は、Pasteurellaceae 科の生き
た弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌に関し、弱毒は、ＲＴＸ
毒素を非活性形で産生するという事実による。この発明
はまた、Pasteurellaceae 科のＲＴＸ−毒素産生細菌に
よる感染に対して哺乳類を保護するためのワクチン、な
らびに生きた弱毒化細菌およびワクチンの製造法に関す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、パスツレラシアエ
（Pasteurellaceae ）科の生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産
生細菌、該細菌の製造法、該細菌を含むワクチン、該ワ
クチンの製造法およびPasteurellaceae 科の毒性ＲＴＸ
−産生細菌による感染に対してヒトおよび動物を保護す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Past
eurellaceae 科は、Haemophilus 、Actinobacillusおよ
び Pasteurella属を含む。この科の細菌は、しばしば、
ＨＡＰ−群の細菌とも言われる。これらの密接に関連し
た属のいくつかの種は、相同のカルシウム依存性、孔形
成細胞毒素、いわゆるＲＴＸ−毒素（ＲＴＸは、毒素の
反復を表す）を示すことが知られている。この科のＲＴ
Ｘ−毒素産生細菌は、ヒトおよび動物に影響を及ぼす感
染症の全範囲の原因である。
【０００３】ＲＴＸ−毒素はまた、ＨＡＰ−群に関係の
ない他の属、例えば EscherichiaおよびBordetellaから
のものも知られている。これらのＲＴＸ−毒素はいくつ
かの点でＨＡＰ−群のＲＴＸ−毒素と似ている。
【０００４】ＲＴＸ−毒素は、Braun ら（Critical Re
v. in Microbiol. 18(2): 115-158 (1991) ）によって
具体的に総説されており、グラム陰性菌も Welch, R.A.
（Molecular Microbiology 5/3: 521-528 (1991)）およ
び Welchら（Inf. Agents andDisease 4: 254-272 (199
5) ）によって総説されている。
【０００５】Pasteurellaceae 科のＲＴＸ−産生菌にお
けるＲＴＸ−毒素の存在は、ヒトおよび動物の両方に対
するこれらの細菌の病原性の大きな原因である。
【０００６】ＲＴＸ−毒素は全て、いくつかの種類の細
胞毒性または細胞溶解活性を示す。しかし、標的細胞−
および宿主−特異性は、毒素によって、またアシル化の
相違によって異なる（McWhinney ら; J. Bact. 174: 29
1-297 (1992)および Hackettら; J. Biol. Chem. 270:
20250-20253 (1995)）。標的細胞の相違の結果、ＲＴＸ
−毒素ファミリーの種々の毒素は、例えば、溶血素、細
胞溶解素または細胞毒素として知られる。
【０００７】ＨＡＰ−群の多くのＲＴＸ−産生菌が知ら
れているが、それらのいくつかは、経済的損害を招くこ
とで有名である。Actinobacillus pleuropneumoniae
は、ブタ、ウマ、ウシおよびヒトの赤血球、ウサギおよ
びブタの好中球ならびにブタの肺胞マクロファージに対
して細胞毒性／細胞溶解性であるＲＴＸ−毒素を産生す
る（Rosendalら; Am. J. Vet. Res. 49: 1053-1058 (19
88) 、Maudsley J.R. および Kadis S.; Can. J. Micro
biol. 32: 801-805 (1986), Frey. J および Nicolet.
J; Inf. & Imm. 56:2570-2575 (1988)、Bendixonら ; I
nf. & Imm. 33: 673-676 (1981) 、Kamp, E.M.および v
an Leengoed, L.A.M.G.; J. Clin. Microbiol. 27: 118
7-1191 (1989) ）。ブタにおけるActinobacillus感染
は、若いブタの急性死亡率および高齢動物の体重増加量
の減少により、ブタ産業に重大な経済的損失を招く。Pa
steurella haemolytica ＲＴＸ−毒素活性は主に、反芻
動物の好中球および単核球／マクロファージに対して特
異的である（Shewenおよび Wilie; Inf. & Immun. 35,
91-94 (1982)、Baluyut ら; Am. J. Vet. Res. 42: 192
0-1926 (1981) 、Himmelら; Am. J. Vet. Res. 43: 764
-767 (1982) ）。パスツレラ感染は、反芻動物、特にウ
シおよびヒツジにおいて重大な問題を引き起こす。乳腺
炎および肺炎は、ヒツジおよびウシの両方で見られる
が、輸送熱は、ウシにおいてさらに別の問題を引き起こ
す。パスツレラ感染による経済的損失は高い。他の非Ｈ
ＡＰ−群の細菌も、ＲＴＸ−毒素を産生することが知ら
れている。大腸菌溶血素は、多くの異なる動物種の種々
の細胞に対して毒性である。それは、接触後２、３分以
内に多くの動物種の赤血球を溶解する（Cavalieri, S.
J. および Snyder, I.S.; Inf. & Imm. 37: 966-974 (1
982) 、Gadebergら; Inf. & Imm. 41: 358-364 (1983)
、Keane ら; Am. J. Pathol. 126: 305-357 (1987)、B
hadkiら; J. Exp. Med. 169: 737-754 (1989)）。Borde
tella pertussis溶血素も、宿主細胞の範囲が広い（Sha
ttuck, R.L.および Storm, D.R.; Biochemistry 24: 63
23-6328 (1985); Hewlettら、In Protein Bacterial To
xins, Rappuoli, R. ら（編）、Stuttgart, Fisher-Ver
lag 249-257 (1990) ）。
【０００８】グラム陰性菌におけるＲＴＸ毒素の合成、
活性化および輸送に関与するオペロンの遺伝子構成が最
近、Coote, J.G. によって総説された（FEMS Microbiol
ogyreviews 88: 137-162 (1992)）。一般に、ＲＴＸ−
オペロンは４種類の遺伝子を含む。すなわち、実際の毒
素遺伝子（Ａ）、アクチベーター遺伝子（Ｃ）および周
囲の媒体への毒素の分泌に関与するタンパク質をコード
する２種類の遺伝子（ＢおよびＤ（および Bordetella
pertussis におけるＥ））である。毒素遺伝子（Ａ）の
一次翻訳産物は、非毒性タンパク質である。アクチベー
ター遺伝子（Ｃ）の役割は、この遺伝子によってコード
される遺伝子産物が、翻訳後修飾によってＲＴＸ−毒素
の毒素活性を活性化するという点で非常に重要である。
この活性化により、毒素の構造的修飾が行われる。例え
ば、Bordetella pertussisでは、ＲＴＸ−毒素の翻訳後
修飾が、リシン残基のアミド結合パルミトイル化によっ
て引き起こされる(Hackettら、Science 266: 433-435
(1994))。大腸菌のＲＴＸ−毒素は、アシル担持タンパ
ク質からプロ溶血素への脂肪アシル基の移動によってin
vitro で活性化されることができる（Issartelら; Nat
ure 351: 759-761 (1991)）。
【０００９】ＲＴＸ−毒素は、Pasteurellaceae に属す
る細菌において重要な毒性因子であることが知られてい
る（例えば、Coote, J.G.; FEMS Microbiology reviews
88:137-162 (1992) 参照）。これは、例えば Actinoba
cillus pleuropneumoniaeに関するものが、Tasconら（M
ol. Microbiol. 14: 207-216 (1994)）およびJansenら
（Inf. & Imm. 63: 27-37 (1995)）によって示されてい
る。
【００１０】毒性因子は、ワクチンに配合するための主
たる目的物質であることが知られている。従って、ＲＴ
Ｘ−毒素をサブユニットワクチンとして使用するための
試みがいくつかなされている。in vivo で合成されるＨ
ＡＰ−群のＲＴＸ−毒素はそれ自体、ＲＴＸ−アクチベ
ータータンパク質の存在下で産生される。従って、ＲＴ
Ｘ−毒素はいつも、翻訳後修飾されて毒性がかなり高い
タンパク質になる。ＲＴＸ毒素の毒性が高いとすれば、
それらをワクチンの成分として使用し得る前に毒性を除
く必要があることは明らかである。
【００１１】毒性を失った A. pleuropneumoniae由来の
iv vivo合成ＲＴＸ−毒素をベースとするサブユニット
ワクチンは以前に記載されており、例えば欧州特許第03
54628 号には、溶血素および A. pleuropneumoniaeの細
胞毒素をベースとしたサブユニットワクチンが開示され
ており、欧州特許第0453024 号には、溶血素、細胞毒素
および外膜タンパク質をベースとした A. pleuropneumo
niaeサブユニットワクチンが開示されている。
【００１２】Pasteurella haemolytica 由来のＲＴＸ毒
素をベースとするサブユニットワクチンも、例えば米国
特許第5,055,400 号、カナダ特許出願第2,014,033 号お
よびカナダ特許出願第2,081,950 号に開示されている。
【００１３】ワクチンで使用するためのサブユニットと
してのＲＴＸ−毒素は、野生型菌株の細菌培養の上清か
ら容易に得られる。ＲＴＸ−毒素をサブユニットとして
得る別の方法は、カナダ特許出願第2,045,950 号で提案
されており、異種細菌菌株である大腸菌での A. pleuro
pneumoniae ＲＴＸ−タンパク質をコードする遺伝子の
異種発現が記載されている。しかし、そのようにして得
られたＲＴＸ−毒素によるワクチンの実験は示されてい
ない。サブユニットワクチンの製造に匹敵する方法は、
欧州特許第0500736 号で提案されている。この特許で
は、ＲＴＸ毒素遺伝子（Ａ）およびアクチベーター遺伝
子（Ｃ）の配列が開示されている。アクチベーター遺伝
子Ｃの存在下または不在下での毒素遺伝子Ａ発現のため
の異種発現系も開示されている。しかし、毒素サブユニ
ットによるワクチン接種の実験は記載されていなかっ
た。
【００１４】しかし、全てのＲＴＸ−毒素サブユニット
ワクチンに対しては、重大な３つの欠点がある。
【００１５】・免疫系を十分誘発するために、大量の抗
原性物質が必要である。
【００１６】・通常は、Ｂ−細胞免疫のみが誘発され
る。
【００１７】・生きた病原性細菌は、外膜タンパク質お
よび莢膜多糖類などの重要な多くの免疫原性分子を有
し、それらは全て、保護に対して重要である。
【００１８】従って、有効なサブユニットワクチンを製
造するためには、できるだけ多くの免疫学的に重要な他
の抗原をさらに含めなければならない。
【００１９】ポイント１および２で述べた明らかな問題
に次いで、特に第三のポイントは、有効なサブユニット
ワクチンの製造を困難にしている。これは、例えば、上
記した欧州特許第0453024 号に開示されたA. pleuropne
umoniae サブユニットワクチンが例として挙げられ、一
つのワクチンに４種類のサブユニット（３種類のＲＴＸ
−毒素および外膜タンパク質）を有している。
【００２０】Pasteurellaceae 感染に対するサブユニッ
トワクチンの欠点を克服するためには、生きた弱毒ワク
チンがかなり望ましいことは明らかである。生きた弱毒
ワクチンは、次の利点を有する。
【００２１】・低用量で投与することができる（自己複
製する）。
【００２２】・天然／野生型感染を厳密に模倣する。
【００２３】・免疫学的に重要な可能な全ての抗原を同
時に提供する。
【００２４】上記利点にもかかわらず、あまり活性でな
いＲＴＸ−毒素を産生するＨＡＰ−群の細菌をベースと
する生きたワクチンは、本発明以前には利用できなかっ
た。生きた弱毒ワクチンの不足の理由は、下記のパラド
ックスによって明らかに説明される。
【００２５】・生きた弱毒ワクチン菌株の第一の特徴
は、活性なＲＴＸ毒素を産生する必要がないということ
である。上記したように、このＲＴＸ−毒素は、ＨＡＰ
−群の菌株をとても毒性にするからである。
【００２６】・しかし、ＲＴＸ−毒素の発現不能により
弱毒化された生きた弱毒細菌はそれ自体、最も重要な毒
性因子、すなわちＲＴＸ−毒素を欠き、従って、この毒
素に対する免疫応答が誘発されない。
【００２７】その結果、ＲＴＸ−毒素がＨＡＰ−群の菌
株から欠損し、該弱毒菌株がＨＡＰ−群の毒性野生型菌
株によって引き起こされる疾患に対するワクチンのベー
スとして使用される場合、部分的な保護のみが達成さ
れ、これらの野生型菌株の最も重要な毒性因子、すなわ
ちＲＴＸ−毒素に対する保護的免疫は決して得られない
だろう。
【００２８】従って、ＲＴＸ−毒素の欠損した細菌をベ
ースとするワクチンによって、野生型菌株による感染後
のＲＴＸ−毒素の有害な影響に対する保護を得ることを
期待することはできない。apxIオペロンを欠く菌株は、
Reimerら(Microbial Pathog.18: 197-209 (1995))によ
って作られた。彼らは、A. pleuropneumoniae ApxI毒素
の合成および輸送において役割を果たす全ての遺伝子を
欠失させた。該菌株は、最も重要な毒性因子であるＲＴ
Ｘ−毒素をもはや分泌しないので、予想通り、無毒性で
ある。しかし、その結果、ＲＴＸ−毒素に対する抗体、
ましてや保護抗体は誘発されない。
【００２９】本発明は、初めて、ＲＴＸ−Ａ毒素を非活
性形で産生するPasteurellaceae 科の生きた弱毒化ＲＴ
Ｘ−毒素産生細菌を提供する。
【００３０】
【課題を解決するための手段】これらの細菌は、一方で
は弱毒化されているが、他方では依然としてＲＴＸ−毒
素を産生することができるという特徴を有する。これ
は、機能的ＲＴＸ−アクチベータータンパク質を産生し
ないように細菌を改変することによって達成される。し
かし、ＲＴＸ−Ａ毒素の発現は損なわれない。
【００３１】本発明に係る生きた弱毒化菌株のサブユニ
ットワクチン、およびＲＴＸ−毒素遺伝子が欠失した生
きた菌株、の利点は、以下の通りである。
【００３２】・ＲＴＸ−毒素を産生するので、この毒素
に対する保護抗体が誘発される。
【００３３】・それにもかかわらず、ＲＴＸ−毒素を非
毒性形で産生するので、毒性は弱められている。
【００３４】・さらに、ＲＴＸ−毒素の他に、有効な免
疫応答を得るために必要な他の全ての抗原を有する。
【００３５】非活性形のＲＴＸ−Ａ毒素は、非毒性であ
る、すなわち活性化毒素と同様の毒素作用を有さないと
考えられる。上述したように、これは、機能的ＲＴＸ−
アクチベータータンパク質を産生しないように細菌を改
変することによって達成される。しかし、ＲＴＸ−Ａ毒
素の発現は損なわれない。
【００３６】機能的ＲＴＸ−アクチベータータンパク質
は、野生型の細菌で発現されるＲＴＸ−アクチベーター
タンパク質の特徴を全て有し、野生型レベルで発現され
るタンパク質であると考えられる。従って、非機能的Ｒ
ＴＸ−アクチベータータンパク質は、野生型の細菌で発
現されるＲＴＸ−アクチベータータンパク質の特徴のい
くつかまたは全てが欠けており、および／または野生型
レベルの活性化ＲＴＸ−毒素を得るには不十分なレベル
で発現されるタンパク質であると考えられる。ここで
は、次のことが強調されなければならない。すなわち、
非機能的ＲＴＸ−アクチベータータンパク質が、野生型
の細菌で発現されるＲＴＸ−アクチベータータンパク質
の全ての特徴を欠いている場合、その細菌は、活性化Ｒ
ＴＸ−毒素を全く産生しない。しかし、非機能的ＲＴＸ
−アクチベータータンパク質が、野生型の細菌で発現さ
れるようなＲＴＸ−アクチベータータンパク質のいくつ
かの特徴のみを欠いている場合、その細菌は、活性形の
ＲＴＸ−毒素の一部および非活性形のＲＴＸ−毒素の一
部を産生することができる。これは、例えば、アクチベ
ータータンパク質が突然変異により発現されるが、その
アクチベータータンパク質の活性化効力は減少している
場合である。活性化速度は、アクチベータータンパク質
がＲＴＸ−毒素を活性化する、すなわちＲＴＸ−毒素を
非活性形から活性形に変換する速度である。すなわち、
非活性形のＲＴＸ−毒素の一部および活性形の一部を産
生する細菌も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００３７】野生型レベルの活性化ＲＴＸ−毒素を得る
ことができないのは、ＲＴＸ−アクチベータータンパク
質の活性の減少の結果であると考えられる。また、ＲＴ
Ｘ−アクチベータータンパク質の発現レベルの減少の結
果、または二つの可能性の組み合わせの結果であるかも
しれない。従って、活性が減少した、および／または発
現レベルが減少したＲＴＸ−アクチベータータンパク質
は、本発明の範囲内である。
【００３８】あるいは、ＲＴＸ毒素におけるＲＴＸ−ア
クチベータータンパク質の標的部位、すなわちアシル化
部位を修飾することもできる。この部位を、アシル化が
減少する、または存在しない程度に修飾しても、非活性
形のＲＴＸ−毒素が産生される。アシル化部位は、組換
えＤＮＡ技術を使用して容易に突然変異を誘発すること
ができる。突然変異は、例えば、アシル化部位を含む制
限断片の欠失によって、またはアシル化部位の部位特異
的突然変異誘発によって得ることができる。
【００３９】非機能的ＲＴＸ−アクチベータータンパク
質を有する生きた弱毒化細菌は、いくつかの方法で得る
ことができる。一つの可能性は、突然変異を、ＲＴＸ−
アクチベータータンパク質をコードする遺伝子に、好ま
しくは組換えＤＮＡ技術を使用して導入することであ
る。突然変異は、上記した領域における、野生型細菌の
ゲノムのこの領域に存在する遺伝情報に関する、遺伝情
報の変化であると理解される。突然変異は、例えば、核
酸の置換、欠失、挿入もしくは逆位またはそれらの組み
合わせであり、その結果、機能的ＲＴＸ−アクチベータ
ータンパク質を産生しない細菌が生じる。
【００４０】現在、ＨＡＰ−群のＲＴＸ−毒素産生菌株
のＲＴＸ−アクチベーター遺伝子に関しては、その位
置、制限パターンおよびヌクレオチド配列すらも多くの
ことが知られている。この情報は、例えば、Coote, J.
G. による総説（FEMS Microbiology reviews 88: 137-1
62 (1992)）に見られ、種々のＲＴＸ−毒素間の構造と
機能との関係の概説が示されている。特異的ＲＴＸ−毒
素に関する非常に詳しい情報は、例えば、Pasteurella
haemolytica のＲＴＸ−遺伝子に関する米国特許第5,05
5,400 号、ならびに A. pleuropneumoniae ＲＴＸ−毒
素の合成および輸送において役割を果たす全遺伝子に関
するFreyら、J. Gen. Microbiol. 139: 1723-1728 (199
3)およびFreyら、Proceedings of the HAP-conference
U.K., Edinburgh 1994に見られる。
【００４１】ＲＴＸ−アクチベータータンパク質をコー
ドする遺伝子またはその遺伝子の転写／翻訳に関与する
配列の突然変異は、いくつかの方法で得ることができ
る。一つの可能性は、ベクターでのＲＴＸ−アクチベー
ター遺伝子の関係する配列のクローニング、制限酵素を
使用するＲＴＸ−配列の一部または全部の切除および野
生型ＲＴＸ−毒素遺伝子の突然変異誘発された配列によ
る置換である。そのような置換は、例えば、周知の相同
組換え法によって行われる。別の可能性は、部位特異的
突然変異誘発を使用して所望の突然変異を得ることであ
る。これらの標準的な組換えＤＮＡ法は、例えば、Samb
rookら、Molecular Cloning: a laboratory manual Col
d Spring Harbor Laboratory Press (1989) に記載され
ている。
【００４２】すなわち、好ましい態様では、細菌が、Ｒ
ＴＸ−アクチベータータンパク質をコードする遺伝子に
突然変異を有する。この突然変異は、突然変異の大きさ
および特徴に依存して、ＲＴＸ−アクチベータータンパ
ク質の活性を小さくしたり、完全に不活性にしたりする
と考えられる。
【００４３】より好ましい形態では、ＲＴＸ−アクチベ
ータータンパク質をコードする遺伝子の突然変異は欠失
である。その欠失は、大きさがかなり変わる可能性があ
り、例えば、１ヌクレオチド分と小さく、フレームシフ
トを生じるものでもよい。他方、ＲＴＸ−アクチベータ
ータンパク質をコードする遺伝子全体が欠失する可能性
もある。
【００４４】別の可能性は、ＲＴＸ−アクチベータータ
ンパク質をコードする遺伝子はそのまま残すが、ＲＴＸ
−アクチベータータンパク質の発現レベルを減少させる
ことである。毒素−遺伝子およびアクチベーター−遺伝
子はポリシストロン性ｍＲＮＡの同じプロモーターから
転写されるので、ＲＴＸ−毒素の発現レベルを付随的に
低下させることなく転写レベルを低下させることはでき
ない。しかし、ＲＴＸ−アクチベータータンパク質の発
現レベルの改変は、ＲＴＸ−アクチベータータンパク質
をコードする遺伝子の上流にあるリボソーム結合部位に
突然変異を、好ましくは組換えＤＮＡ技術を使用して導
入することにより達成できる。
【００４５】従って、別の好ましい態様では、細菌が、
ＲＴＸ−アクチベーターｍＲＮＡの翻訳を制御する領
域、例えばリボソーム結合部位に突然変異を有する。そ
のような突然変異は、ＲＴＸ−アクチベータータンパク
質をコードするＲＮＡの翻訳の効率に影響を及ぼす。リ
ボソーム結合部位は一般に、共通モチーフ、およびリボ
ソーム結合部位と開始コドンとの間の約５〜６ヌクレオ
チドの相対的距離、に基づいて容易に検出される。多く
の場合、例えば、A. pleuropneumoniae のいくつかのＲ
ＴＸ−アクチベーターに関しては、発表されている（Fr
eyら、 Gene 142:97-102 (1994)）。
【００４６】この態様のより好ましい形態では、ＲＴＸ
−アクチベーターｍＲＮＡの翻訳を制御する領域の突然
変異は欠失である。その欠失は、例えば、リボソーム結
合部位の１個以上のヌクレオチドの欠失を含んでもよ
い。
【００４７】非機能性ＲＴＸ−アクチベータータンパク
質を有する生きた弱毒化細菌を得るためのさらに別の可
能性は、アクチベータータンパク質をコードするｍＲＮ
Ａに結合し得る、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸
配列を付加することである。そのとき、該配列の発現
は、アクチベータータンパク質のレベルを減少させる。
【００４８】アンチセンスＲＮＡは、それに対してアン
チセンスであるｍＲＮＡの配列に対して部分的または完
全に相補的である配列を有するＲＮＡである。
【００４９】最も好ましい態様では、本発明に係る生き
た弱毒化細菌が Actinobacillus pleuropneumoniaeであ
る。
【００５０】本発明はまた、Pasteurellaceae 科のＲＴ
Ｘ−毒素産生細菌による感染に対して動物を保護するた
めのワクチンにも関する。該ワクチンは、本発明に係る
生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌および薬剤的に許容
されうる担体をベースとする。
【００５１】これらのワクチンは、本発明に係る生きた
弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌を少なくとも免疫学的に有
効な量で含む。免疫学的に有効とは、ワクチン投与され
る生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌の量が、毒性のあ
る形のＲＴＸ−毒素産生細菌に対して有効な免疫応答を
宿主に誘発するのに十分であることを意味する。
【００５２】有用な投与量は、ワクチンを受ける年齢、
体重および哺乳類、投与法ならびにワクチン接種が求め
る病原体の種類に依存して変わる。
【００５３】ワクチンは、免疫反応を引き出すのに十分
であればどんな用量の細菌を含んでもよい。例えば、10
3 〜1010個の細菌の用量が非常に適している。
【００５４】上記した免疫学的に有効な量の生きた弱毒
化ＲＴＸ−毒素産生細菌の他に、本発明に係るワクチン
は、薬剤的に許容されうる担体も含む。該担体は、水の
ように簡単なものであってもよいが、例えば、その細菌
を培養する培養流体を含んでもよい。別の適する担体
は、例えば、生理学的塩濃度の溶液である。本発明に有
用な薬剤的に許容されうる担体または希釈剤の他の例と
しては、ＳＰＧＡなどの安定剤、炭水化物（例えば、ソ
ルビトール、マンニトール、澱粉、ショ糖、グルコー
ス、デキストラン）、アルブミンまたはカゼインなどの
タンパク質、ウシ血清または脱脂粉乳などのタンパク質
含有物質、および緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）が挙
げられる。
【００５５】所望により、アジュバント活性を有する１
種以上の化合物をワクチンに添加することができる。ア
ジュバントは、免疫系の非特異的刺激剤である。それら
は、侵入する病原体に対する宿主の免疫反応を高める。
周知のアジュバントの例は、フロイントの完全および不
完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオンブロックポリ
マー、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合
体、例えば欧州特許第109942号を参照）、サポニン、鉱
物油、植物油ならびにCarbopol（ホモポリマー）であ
る。特に粘膜への使用に適するアジュバントは、例え
ば、大腸菌熱不安定毒素（ＬＴ）またはコレラ毒素（Ｃ
Ｔ）である。他の適するアジュバントとしては、例え
ば、水酸化，リン酸または酸化アルミニウム、油−エマ
ルジョン（例えば、 Bayol F(R) または Marcol 5
2(R) ）、サポニンまたはビタミンＥ可溶化剤が挙げら
れる。
【００５６】従って、好ましい形態では、本発明に係る
ワクチンはアジュバントを含む。
【００５７】動物に投与する場合、本発明に係るワクチ
ンは、特に、鼻腔内、皮内、皮下、エーロゾルまたは筋
肉内投与することができる。
【００５８】より好ましい態様では、本発明に係るワク
チンは、さらに、他の病原体微生物またはウイルスから
選択される１種以上の抗原を含む。そのようなワクチン
は、他の病原体細菌またはウイルスから選択される１種
以上の抗原を本発明に係る生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産
生細菌および上記した薬剤的に許容されうる担体に添加
することにより得ることができる。もちろん、１種以上
の抗原だけでなく、１種以上の病原体全体をそのまま、
不活性形または生きた形で添加することも可能である。
あるいは、他の病原体微生物またはウイルスから選択さ
れる１種以上の抗原をコードする遺伝情報を、公知の組
換えＤＮＡ技術を使用して生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産
生細菌でクローン化することにより得ることもできる。
本発明に係る細菌は、弱毒性であるために、そのような
遺伝情報のための担体、すなわちベクターとして非常に
適する。他の病原体微生物またはウイルスから選択され
る１種以上の抗原をコードする遺伝情報をさらに有す
る、本発明に係る細菌をベースとするワクチンは、同時
に２種以上の病気に対して免疫感作することができる。
このことは、もちろん、各病原体に関して別々にワクチ
ン接種するよりも、医療的および肉体的の両方の観点か
ら、ワクチン接種される動物に対するストレスが少な
い。
【００５９】さらにより好ましい態様では、本発明に係
るワクチンが、Actinobacillus pleuropneumoniae に属
する生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌を含む。
【００６０】さらにより好ましい形態では、これらの抗
原が、それらに限定されないが、ブタ生殖呼吸症候群
（ＰＲＲＳ）ウイルス、偽狂犬病ウイルス、ブタインフ
ルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎
ウイルス、ロタウイルス、大腸菌、 Erysipelothrix rh
usiopathiae 、 Pasteurella multocida、 Bordetellab
ronchiseptica、Haemophilus parasuisおよび Streptoc
occus suis から成る群から選択される。
【００６１】より好ましい態様の別の形態では、本発明
に係るワクチンが、 Pasteurellahaemolytica に属する
生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌を含む。
【００６２】この態様のさらにより好ましい形態では、
別の病原体微生物またはウイルスから選択される抗原
が、ウシロタウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、
パラインフルエンザ３型ウイルス、ウシパラミクソウイ
ルス、口蹄疫ウイルス、Pasteurella multocida 、Haem
ophilus somnus、Brucella abortus、 Staphilococcusa
ureus、Streptococcus spp.、Mycoplasma spp. 、およ
びウシ呼吸系シンシチウム（Respiratory Syncytial ）
ウイルスから成るウシ病原体群から選択される。
【００６３】生きた生物を保存するための方法はいくつ
かある。例えば、冷蔵庫での保存がよく知られた方法で
ある。また、しばしば使用されるのは、グリセロールを
含む緩衝液中、−70℃での保存である。また、細菌を液
体窒素に入れて保存することもできる。凍結乾燥も別の
保存方法である。凍結乾燥した細菌は、長い年月にわた
って保存し、生きたままにしておくことができる。凍結
乾燥した細菌の保存温度は、生存に有害でなければ、０
度以上であっても十分である。凍結乾燥は、周知の全て
の標準的凍結乾燥法に従って行うことができる。所望に
より、例えば脱脂粉乳、トレハロース、ゼラチンまたは
ウシ血清アルブミンなどの有益な付加物を凍結乾燥処理
中に添加することができる。従って、好ましい態様で
は、ワクチンが凍結乾燥形態である。
【００６４】本発明はまた、Pasteurellaceae 科の細菌
による感染に対して感染を受けやすい動物を保護するた
めの本発明に係るワクチンの使用に関する。
【００６５】好ましい態様では、本発明に係るワクチン
を、Actinobacillus pleuropneumoniae 感染に対して感
染を受けやすい動物を保護するために使用する。
【００６６】また、本発明は、Pasteurellaceae 科の生
きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌の製造法に関する。該
方法は、ＲＴＸ−アクチベータータンパク質をコードす
る遺伝子に突然変異を導入することを含む。
【００６７】この方法の好ましい態様では、導入される
突然変異が、ＲＴＸ−アクチベータータンパク質遺伝子
における欠失である。
【００６８】最後に、本発明は、Pasteurellaceae 科の
ＲＴＸ−毒素産生細菌による感染に対して動物を保護す
るためのワクチンの製造法に関する。一つの方法は、本
発明に係る細菌を上記した薬剤的に許容されうる担体と
混合することを含む。
【００６９】
【実施例】実施例１：生きた弱毒化 A ctinobacillus pleuropneumo
niae菌株の製造 pApxI-D11 の構築 本発明に係る生きた弱毒化細菌の可能性を、Actinobaci
llus pleuropneumoniae ΔapxIC 突然変異体の構築によ
って例示する。この突然変異体を得るために、まず、Ｒ
ＴＸ−アクチベーター遺伝子に欠失を含むプラスミドを
作製した。その構築の概要を図１に示す。A. pleuropne
umoniae の apxI オペロンの配列は、GenBank に受理番
号X52899で寄託されている。pJFF750 (Gygi ら、Infec
t. Immun.60:3059-3064, 1992)から、apxIC および apx
IA遺伝子ならびにプロモーター領域を 4481 bpのBglII/
PstI断片として切り出し、プラスミドpGEM3Z(Promega C
o., Leiden NL)にクローン化し、酵素 BamHIおよびPstI
で消化した。得られたプラスミドを pApxI-D1 と命名し
た。pApxICをコードする領域のほとんどを含む 407bp
のＤＮＡ断片を、制限酵素XhoIで消化し、次いで制限酵
素SspIで部分消化することにより切り出した。付着末端
の突き出し部分を、Ｓ１−ヌクレアーゼによって平滑末
端に変換し、約 6800 bpの断片をアガロースゲルから単
離し、再連結した。得られたプラスミドを pApxI-D2 と
命名した。XhoI/SspI 欠失ジャンクションを横切る配列
は、ヌクレオチド配列分析により確認した。次いで、Ap
xIA をコードする領域のほとんどをAflII/SmaI消化、Ｓ
１−ヌクレアーゼによる平滑化および再連結により欠失
した。対立遺伝子置換のための 1454 bpの交換カセット
をpApxI-D3から制限酵素PstIおよびSacIによって切り出
し、ベクター pJQ200KS（Quandtら、Gene 127:15-21, 1
993) でクローン化し、同じ酵素で消化した。得られた
プラスミドをpApxI-D4と命名した。pApxI-D4の sacB 遺
伝子の３’端をHpaI消化によって除去し、pAP13 (Prent
kiら、Gene 103:17-23, 1991) から切り出したrpsL遺伝
子によって540 bpの EcoRV断片として置き換えた。得ら
れたプラスミドをpApxI-D11 と命名した。
【００７０】結果 得られたプラスミドを pApxI-D11の構造を、種々の制限
酵素を使用した消化によりチェックした。消化パターン
は、実際に所望のプラスミドが得られたことを示した。
このプラスミドは、ΔapxIC 突然変異体の構築のために
さらに使用した。
【００７１】Actinobacil lus pleuropneumoniae 菌株 H
V 211からのΔapxIC 突然変異体の構築 プラスミド pApxI-D11を使用して対立遺伝子置換を行っ
た。この目的のために、それを標準的フィルター接合法
(De Lorenzoおよび Timmis, Methods Enzymol. 235:38
6-405, 1994)による大腸菌からの接合により A. pleuro
pneumoniaeに導入した。MBHPP101と命名した大腸菌ドナ
ーを、プラスミド pApxI-D11による菌株SM10 λpir (Mi
ller および Mekalanos, J. Bacteriol. 170:2575-258
3, 1988)の形質転換により構築した。A. pleuropneumon
iae 受容体菌株 MBHPP105 は、ストレプトマイシンの存
在下、次いでストレプトマイシンおよびナラジキシン酸
（naladixic acid）（菌株Ｒ）の両存在下で血清型10野
外単離物 HV211（Beckら、J. Clin. Micrbiol. 32:2749
-2754, 1994によって試験された菌株の一つ）を培養し
た後に単離された。接合後、ナラジキシン酸およびゲン
タマイシン耐性 A.pleuropneumoniae接合完了体が、固
体培地上での選択の後に得られた。得られた菌株（Ｉ）
は、サザンブロット法による分析から判断して、pApxI-
D11 ＤＮＡを、環状プラスミドおよび ApxI オペロンへ
の組み込み体として含んでいた。このことは、図２の左
側のパネルに見ることができる。ここで示した菌株のＤ
ＮＡは、pApxI-D11 の 1.478 kB のSalI/SacI 断片にハ
イブリダイズさせた。ナラジキシン酸の存在下でさらに
培養した後、その菌株をナラジキシン酸を含む血液寒天
上にプレーティングし、溶血ゾーンのない A. pleuropn
eumoniaeコロニーを同定した。
【００７２】結果：この結果得られた菌株（MBHPP113と
命名）は、サザンブロット分析により、A.pleuropneumo
niae 血清型10のApxIC 陰性突然変異体であることが確
認された（図２参照）。予想されたように、菌株MBHPP1
13の SspI で消化した染色体ＤＮＡでは、ただ１つのバ
ンドが欠失領域に隣接するプローブとハイブリダイズす
る（図２、左のパネル）。バンドの大きさ（約4.4 kB）
は、親菌株の染色体ＤＮＡのハイブリダイズする二つの
バンドの大きさを合わせたものから407 bpの欠失を差し
引いたものに対応する。さらに、プラスミドの骨格はMB
HPP113にはもはや存在しないことが示された（図２、中
央のパネル）。非常に重要なこととして、apxIC 遺伝子
を含む SspI/XhoI断片は MBHPP113 にはもはや存在しな
いこてが示された（図２、右のパネル）。
【００７３】実施例２：ΔapxIC 突然変異体 MBHPP113
のＲＴＸ−毒素の溶血活性の発現、分泌および欠損 に関
する試験 A. pleuropneu moniae ΔapxIC 突然変異体 MBHPP113 の
溶血活性の欠損 MBHPP113におけるΔapxIC 欠失の影響を調べるために、
ΔapxIC 菌株 MBHPP113 および野生型親菌株の溶血活性
を血液プレート上での増殖後に比較した。血清型７に属
する A. pleuropneumoniae参照菌株（ApxII のみを産生
する）も比較のために含めた。この菌株は、ApxII が中
位の溶血活性を有するという事実から、中間の溶血活性
レベルを示す。個々のコロニーを、0.1 ％のＮＡＤおよ
び 2％のヒツジ赤血球を含むコロンビア寒天プレート
に、滅菌したつまようじで移した。
【００７４】結果 図３から分かるように、37℃で８時間増殖した後、HV21
1 （野生型）、MBHPP105（Ｒ、すなわち、耐性菌株）お
よびプラスミド組み込み突然変異体（Ｉ）が、予想され
たように、溶血ゾーンによって囲まれる。血清型７の
A. pleuropneumoniae参照菌株（ApxII のみを産生す
る）は、中間レベルの溶血を示す。また、予想されるよ
うに、ΔapxIC 菌株 MBHPP113 （図３中Δで示される）
の周りには溶血ゾーンは検出され得なかった。この実験
は、ΔapxIC 菌株 MBHPP113 が実際に活性化 Apx−毒素
を産生しないことを明らかに示すものである。
【００７５】ΔapxIC 菌株 MBHPP113 による apxIAの発
現および分泌 本発明に係るΔapxIC 菌株は、非溶血形であるが、ＲＴ
Ｘ−毒素を発現し、分泌すると推定される。発現および
分泌をこの実験で試験した。
【００７６】ApxIA タンパク質の分泌を、記載されてい
るように(Beck ら、J. Clin. Microbiol., 32:2749-275
4, 1994)、種々の A. pleuropneumoniae菌株からの濃縮
した培養上清と単特異的抗−ApxIA との反応によって調
べた。抗−ApxIIA血清、および他の血清型の野生型菌
株、は主に比較として使用した。A. pleuropneumoniae
は、チョコレート寒天プレートから、0.1 ％のＮＡＤを
含む 5 ml のコロンビアブイヨン培地に接種し、200 rp
m で振とうしながら37℃で６時間インキュベートした。
10,000 x gで30分遠心分離した後、細胞を含まない培養
上清を集めた。ApxIA タンパク質を、Centricon-100 (M
illipore Co., Etten-Leur, NL) 濃縮フィルター上で、
製造者の指示に従って20倍に濃縮した。ポリアクリルア
ミドゲルで電気泳動した後、タンパク質をブロットし、
単特異的抗−ApxIA 血清および抗−ApxIIA血清と反応さ
せた。チョコレート寒天プレートは、ＫＨ2 ＰＯ4 (1
g) 、Ｋ2 ＨＰＯ4 (4 g) 、ＮａＣｌ(5 g) 、Proteose
ペプトン No.3 (15 g)、澱粉(1g) 、Bacto 寒天(15
g)、滅菌水（全体積が1000 ml になるまで）、ヒツジの
血(100 ml)、ウマ血清(100 ml)および Isovitalex 溶液
(12 ml) を含む。
【００７７】結果 濃縮培養上清を平行ポリアクリルアミドゲルで電気泳動
して、図４に示すように Immobilon-P上に電気ブロット
した。得られたブロットを、パネルＡでは単特異的抗−
ApxIA 血清と、パネルＢでは単特異的抗−ApxIIA血清と
反応させた。試験した菌株は、HV211 （野生型）、MBHP
P105（Ｒ、すなわち、耐性菌株）、プラスミド組み込み
突然変異体（Ｉ）、MBHPP113（Δ）（Actinobacillus p
leuropneumoniae 菌株 HV211からのΔApxIC 突然変異体
の構築の項参照）ならびに血清型６、5aおよび5bの野生
型参照菌株である。血清型６の野生型参照菌株は、ApxI
IAは産生するが、ApxIA は産生しない。図４Ａのレーン
ＷＴ、Ｒ、ＩおよびΔの105 kDバンドから、ＷＴ−菌株
ならびにＲ−菌株、Ｉ−菌株および菌株 MBHPP113は、A
pxIA タンパク質を産生し、分泌することが明らかであ
る。
【００７８】実施例２の実験結果は、A. pleuropneumon
iae 菌株 MBHPP113 が実際に、ＲＴＸ−毒素を非活性形
で発現し、分泌することができることを示している。
【００７９】実施例３：Actino bacillus pleuropneumon
iae 菌株 4074 からのΔapxIC ΔapxIIC突然変異体の構
築 菌株 4074 でのΔapxIC 突然変異体の構築を、実施例１
に記載したように行った。ストレプトマイシンの存在
下、次いでストレプトマイシンおよびナラジキシン酸の
両存在下で血清型１参照菌株 4074(Freyおよび Nicole
t, J. Clin. Microbiol. 28:232-236, 1990) を培養し
た後、A. pleuropneumoniae 受容体菌株 MBHPP104 を単
離した。この菌株を、2 ％のヒツジ赤血球、0.1 ％のＮ
ＡＤおよびナラジキシン酸を含むＣＢＭプレート上にプ
レーティングした後、より小さい溶血ゾーンを有するい
くつかのコロニーを同定した。これらのうちの一つを M
BHPP111 と命名し、サザンブロット分析により、A. ple
uropneumoniae 菌株のapxIC 陰性突然変異体であること
を確認した。apxIIC欠失を、接合ドナー菌株 MBHPP142
において pApxII-D2構築体（pApxI-D11 の代わりに）を
使用して、 apxIC欠失と同様の方法により MBHPP111 菌
株で行った。pApxII-D2 の構築を図５に示す。簡単に述
べると、プラスミド pJFFapxIICU15を、apxIICおよびap
xIIA遺伝子を含む4.3 kb の断片をベクターλZAP Expre
ss (Stratagene Co.)に挿入し、ヘルパーファージを使
用してベクターpBK-CMV (Stratagene Co.)に切り出すこ
とにより構築した。apxIICのコード領域での枠内欠失
は、pJFFapxIIcu15 を鋳型として使用し、オリゴ APXII
C-OL(5'-CAATACCTTAAGATCATTTTTTAGCATCATCCC)およびAP
XIIC-OR(5'-ACATTTCTTAAGTATGAGCAAGAGTTAATAACAGC) に
よるＰＣＲ増幅によって行った。得られた8.5 kbのＰＣ
Ｒ断片をAflII で消化し、再連結した。得られたプラス
ミドをpApxII-D1 と命名し、欠失部位を横切る配列を配
列分析により確認した。pApxII-D1 の挿入物をSpeI/Bgl
II断片として切り出し、XbaIおよびBamHI で消化したpA
ppEX-KG1に連結した。得られたプラスミドをpApxII-D2
と命名し、大腸菌S17-1λpir(Simon ら、Biotechnology
1:784-791, 1983)に移した。この接合ドナー菌株をMBH
PP142と命名した。
【００８０】MBHPP111をMBHPP142と接合した後、ナラジ
キシン酸およびゲンタマイシン耐性A. pleuropneumonia
e 接合完了体が得られた、これを、0.1 ％のＮＡＤ、2
％のヒツジ赤血球および 20 μg/mlのナラジキシン酸を
含むＣＢＭ寒天プレートにプレーティングした。非溶血
性A. pleuropneumoniae コロニーを同定することができ
た。それらのうちの一つを MBHPP147 と命名し、サザン
ブロット分析により、A. pleuropneumoniae菌株 4074
の apxIC apxIIC 欠失突然変異体であることを確認し
た。
【００８１】結果 構築工程により、apxIC およびapxIICの両遺伝子に欠失
を有する菌株MBHPP147が得られた。
【００８２】A. pleuropn eumoniae 血清型１ ΔapxC突然
変異体の溶血活性 ΔapxIC 菌株 MBHPP111 、ΔapxIC ΔapxIIC二重欠失突
然変異体 MBHPP147 および野生型親菌株 MBHPP104 の溶
血活性を、血液プレートでの増殖後に比較した（実施例
２の記載と同様に）。個々のコロニーを、0.1 % のＮＡ
Ｄおよび2 ％のヒツジ赤血球を含むＣＢＭプレートに、
滅菌したつまようじで移した。37℃で８時間増殖させた
後、野生型菌株 MBHPP104 は、2 mmのβ−溶血ゾーンに
よって囲まれた。なおも活性 ApxIIA を産生するMBHPP1
11菌株は、約1 mmのより広がった溶血ゾーンを産生した
（ApxII のみを産生することが知られている、血清型７
および12に対するA. pleuropneumoniae 参照菌株を取り
囲む溶血ゾーンに匹敵する）。MBHPP147二重欠失突然変
異体は非溶血性であった。
【００８３】結果 apxIC 欠失により、ApxI溶血素に対しては典型的であ
る、強い溶血活性の低下が生じる。続くapxIIC欠失によ
り、溶血活性の完全な消失が生じる。結果を表１にまと
める。
【００８４】
【表１】
【００８５】表１：溶血およびウェスタンブロットの結
果のまとめ。溶血ゾーンはmmで示し、「(d) 」は広がっ
た溶血を示す。「＋」は抗体と約105 kDa の抗原とのウ
ェスタンブロット反応を示す。「−」は該反応がないこ
とを示す。
【００８６】血清型１菌株4074から誘導されたΔapxC菌
株によるApxIA および ApxIIAの発現および分泌 ApxIA タンパク質の分泌は、記載されたウェスタンブロ
ット法（Beckら、 J.Clin. Microbiol., 32:2749-2754,
1994および実施例２）における、種々の A.pleuropneu
moniae菌株からの濃縮培養上清と単特異的抗−ApxIA お
よび抗−ApxIIA血清との反応によって調べた。
【００８７】結果 血清型１の全菌株（MBHPP104、MBHPP111およびMBHPP14
7）は、ApxIA およびApxIIAの両方をなおも発現し、分
泌することが示された。対照として、血清型10の菌株
（ApxIのみを発現する）および血清型12の菌株（ApxII
のみを発現する）からの濃縮上清を含めた。結果を表1
に示した。
【００８８】実施例４：マウスでのA . pleuropneumonia
e の毒性に対するΔapxC突然変異の効果 A. pleuropneumoniae の毒性に対する apxICおよび／ま
たはapxIIC欠失の効果を調べるために、７匹のマウス
（６〜７週齢）を一群として、５種類の菌株を３種類の
用量で腹腔内注射して試験した（表２参照）。菌株を0.
1 ％のＮＡＤを含むＣＢＭ培地で新しく増殖させ、0.9
％(w/v) のＮａＣｌ溶液で１回洗浄し、同じ緩衝液に再
懸濁して、OD600 を0.8 （約 3×109 cfu/mlを表す）と
した。次いで、同じ緩衝液で10および100 倍の希釈物を
作った。各マウス群に一つの菌株の一つの希釈物0.5 ml
を腹腔内注射した。チャレンジ培養物の残りの逐次希釈
物を0.1 ％のＮＡＤを含むＣＢＭプレートにプレーティ
ングし、チャレンジ培養物の真の cfu含量を求めた。
【００８９】結果 データから、菌株HV211 のLD50がapxIC 欠失によって少
なくとも20倍増加したことが結論づけられる。菌株4074
の場合、ΔapxIC のみの欠失により、10倍以上のLD50の
増加が得られる。さらにΔapxIIC突然変異を行うと、さ
らに９倍の増加が得られ、合わせると毒性が少なくとも
90倍まで低下する。結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
【００９１】表２：apxC遺伝子の欠失による A. pleuro
pneumoniaeの弱毒化。菌株 MBHPP105は、血清型10野外
単離物 HV211のナラジキシン酸およびストレプトマイシ
ン耐性誘導体である。MBHPP113は、MBHPP105からのapxI
C 欠失突然変異体である。MBHPP104は、血清型１参照菌
株のナラジキシン酸およびストレプトマイシン耐性誘導
体である。MBHPP111は、MBHPP104から誘導されるapxIC
欠失突然変異体である。MBHPP147は、MBHPP111から誘導
されるapxIC apxIIC二重欠失突然変異体である。
【００９２】生きたMBHPP147 をワクチンとして使用し
た、 A. pleuropneu moniae チャレンジに 対するマウスの
保護 マウス10匹を一群として、４群を使用した（表３参
照）。２群は、菌株 MBHPP147 の細胞を 1.5×108 個含
む腹腔内注射を７週齢でワクチン接種した。これらのマ
ウスは、同じ注射の追加免疫を４週間後に行った。追加
免疫の２週間後、ワクチン接種を行った１群と行ってい
ない１群に、108 cfu の菌株MBHPP104（MBHPP147由来
の、毒性の血清型１菌株）を腹腔内注射してチャレンジ
を行った。他の２群は、106 cfu の菌株MBHPP105（毒性
の血清型10菌株）によるチャレンジを行った。
【００９３】結果 対照群では、全てのマウスが死亡したが、血清型１菌株
MBHPP104による同種チャレンジ試験では、ワクチン接種
した10匹中９匹が抵抗し（p=0.0001フィッシャー正確度
試験）、血清型10菌株MBHPP105による異種誘発試験に対
しては、ワクチン接種した10匹中４匹が保護された（p=
0.0433フィッシャー正確度試験）。菌株MBHPP147 は、
同種および異種保護を付与する、生きたワクチンとして
使用することができる。結果を表３に示す。
【００９４】
【表３】
【００９５】表３：生きた血清型１（MBHPP104）および
血清型10菌株（MBHPP105）によるチャレンジに対する、
MBHPP147でワクチン接種した後のマウスの保護。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】pApxI-D11 の構築を示す（説明は本文を参
照）。使用したプラスミドの遺伝子の主な特徴を、使用
した全ての制限部位とともに示す。もとのXhoIおよびSs
pI制限部位が結合した箇所は「X/S 」で示し、Freyら、
Gene, 142:97-102 (1994) によって決定されたApxIオペ
ロンの転写開始点は「tsp 」として示す。
【図１Ｂ】pApxI-D11 の構築を示す（説明は本文を参
照）。使用したプラスミドの遺伝子の主な特徴を、使用
した全ての制限部位とともに示す。もとのXhoIおよびSs
pI制限部位が結合した箇所は「X/S 」で示し、Freyら、
Gene, 142:97-102 (1994) によって決定されたApxIオペ
ロンの転写開始点は「tsp 」として示す。
【図２】HV211 野生型菌株（Ｗｔ）、誘導されたストレ
プトマイシンおよびナラジキシン酸耐性菌株MBHPP105
（Ｒ）、中間組み込み体（Ｉ）および最終の欠失構築体
MBHPP113（Ｄ）からの染色体ＤＮＡのSspI消化のサザン
ブロット分析を示す。比較のために、プラスミドpApxI-
D1（Ｄ１）およびpApxI-D11 （Ｄ11）も含めた。左のパ
ネルでは、ブロットをpApxI-D11 からの1.487 kBのSalI
/SacI 断片（欠失に隣接する領域を含む）とハイブリダ
イズさせた。中央のパネルでは、ブロットをpApxI-D11
ベクターの骨格（5004 bp のSalI/SacI 断片として単
離）とハイブリダイズさせた。右のパネルでは、ブロッ
トをpApxICの欠失部分内に位置する369bpの断片（ＰＣ
Ｒ増幅によって生成）とハイブリダイズさせた。
【図３】溶血素プレートアッセイを示す。種々の菌株
を、0.1 ％のＮＡＤおよび 2％のヒツジ赤血球を含むコ
ロンビア寒天プレート上で、滅菌したつまようじによっ
てつついた。次いで、プレートを37℃で８時間インキュ
ベートした。左から右へ、野生型HV211 菌株（Ｗｔ）、
ナラジキシン酸およびストレプトマイシン耐性菌株MBHP
P105（Ｒ）、挿入突然変異体（Ｉ）、欠失突然変異体MB
HPP113（Ｄ）およびA. pleuropneumoniae 血清型７参照
菌株を接種した。
【図４】ApxIA および ApxIIA の発現を示す。濃縮した
培養上清を平行ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、
Immobilon-P 上に電気ブロットした。得られたブロット
を、パネルＡでは単特異的抗−ApxIA 血清と、パネルＢ
では単特異的抗−ApxIIA血清と反応させた。試験した菌
株はHV211 （Ｗｔ）、MBHPP105（Ｒ）、プラスミド組み
込み突然変異体（Ｉ）、MBHPP113（Ｄ）ならびに血清型
６、5aおよび5bの野生型参照菌株である。血清型６の野
生型参照菌株は、ApxIIAを産生するが、ApxIA は産生し
ない。
【図５】pApxII-D2 の構築を示す。使用したプラスミド
の遺伝子の主な特徴を、使用した全ての制限部位ととも
に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/15 Ａ６１Ｋ 39/15 39/155 39/155 39/39 39/39 (72)発明者 ヨアヒム・フレイ スイス国、セー・ハー・3054・シユプフエ ン、ホーエウエヒ・53

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 非活性形のＲＴＸ毒素を産生することを
    特徴とするPasteurellaceae 科の生きた弱毒化ＲＴＸ−
    毒素産生細菌。
  2. 【請求項２】 ＲＴＸ−アクチベータータンパク質をコ
    ードする遺伝子に突然変異があることを特徴とする請求
    項１に記載の生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌。
  3. 【請求項３】 ＲＴＸ−アクチベーターｍＲＮＡの翻訳
    を制御する領域に突然変異があることを特徴とする請求
    項１または２に記載の生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細
    菌。
  4. 【請求項４】 該突然変異が欠失であることを特徴とす
    る請求項１〜３のいずれかに記載の生きた弱毒化ＲＴＸ
    −毒素産生細菌。
  5. 【請求項５】細菌が Actinobacillus pleuropneumoniae
    であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載
    の生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌。
  6. 【請求項６】 細菌が Pasteurella haemolyticaである
    ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の生き
    た弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌。
  7. 【請求項７】 Pasteurellaceae 科のＲＴＸ−毒素産生
    細菌による感染に対して動物を保護するためのワクチン
    であって、該ワクチンが、請求項１〜４のいずれかに記
    載の生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌および薬剤的に
    許容されうる担体を含むことを特徴とするワクチン。
  8. 【請求項８】 アジュバントを含むことを特徴とする請
    求項７に記載のワクチン。
  9. 【請求項９】 ワクチンが凍結乾燥形態であることを特
    徴とする請求項７または８に記載のワクチン。
  10. 【請求項１０】 生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌が
    Actinobacillus pleuropneumoniaeに属することを特徴
    とする請求項７〜９のいずれかに記載のワクチン。
  11. 【請求項１１】 さらに、ブタ生殖呼吸症候群（ＰＲＲ
    Ｓ）ウイルス、偽狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザ
    ウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイル
    ス、ロタウイルス、大腸菌、Erysipelothrix rhusiopat
    hiae、Pasteurella multocida 、Bordetella bronchise
    ptica 、Haemophilus parasuisおよび Streptococcus s
    uis から成る群から選択される１種以上の抗原を含むこ
    とを特徴とする請求項１０に記載のワクチン。
  12. 【請求項１２】 生きた弱毒化ＲＴＸ−毒素産生細菌が
    Pasteurella haemolytica に属することを特徴とする請
    求項７〜９のいずれかに記載のワクチン。
  13. 【請求項１３】 さらに、ウシロタウイルス、ウシウイ
    ルス性下痢ウイルス、パラインフルエンザ３型ウイル
    ス、ウシパラミクソウイルス、口蹄疫ウイルス、Pasteu
    rella multocida 、Haemophilus somnus、Brucella abo
    rtus、Staphilococcus aureus 、Streptococcus spp.、
    Mycoplasma spp. 、およびウシ呼吸系シンシチウムウイ
    ルスから成るウシ病原体から成る群から選択される１種
    以上の抗原を含むことを特徴とする請求項１２に記載の
    ワクチン。
  14. 【請求項１４】 Actinobacillus pleuropneumoniae 感
    染を受けやすい動物を該感染から保護する方法であっ
    て、請求項１０または１１に記載のワクチンを投与する
    ことを含む方法。
  15. 【請求項１５】 Pasteurella haemolytica 感染を受け
    やすい動物を該感染から保護する方法であって、請求項
    １２または１３に記載のワクチンを投与することを含む
    方法。
  16. 【請求項１６】 ＲＴＸ毒素を非活性形で産生する、Pa
    steurellaceae 科の生きた弱毒ＲＴＸ−毒素産生細菌の
    製造法であって、ＲＴＸ−アクチベータータンパク質を
    コードする遺伝子に突然変異を導入することを含むこと
    を特徴とする方法。
  17. 【請求項１７】 該突然変異が欠失の導入によって得ら
    れることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 Pasteurellaceae 科のＲＴＸ−毒素産
    生細菌による感染に対して動物を保護するためのワクチ
    ンの製造法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の
    細菌を薬剤的に許容されうる担体と混合することを含む
    方法。
JP9178792A 1996-05-31 1997-05-30 パスツレラ科の弱毒化ｒｔｘ産生細菌 Pending JPH1075774A (ja)

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