KR20000049090A - 헬리코박터 필로리 생백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 헬리코박터 필로리에 의한 감염에 대하여 보호 면역성을 제공하는 신규한 재조합 생백신, 및 최적화된 백신을 수득하기 위해 헬리코박터 필로리를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 헬리코박터 필로리에 의한 감염에 대하여 보호 면역성을 제공하는 신규한 재조합 생백신, 및 최적화된 백신을 수득하기 위해 헬리코박터 필로리 항원을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
헬리코박터는 위염, 소화성 궤양 및 위암과 관련된 그램 음성 박테리아성 병원체이다. 수가지 헬리코박터 종은 위, 가장 현저하게는 헬리코박터 필로리, 헬리코박터 헤일마니(H. heilmanii) 및 헬리코박터 펠리스(H. felis)를 클로닝한다. 헬리코박터 필로리는 사람의 감염증과 가장 공통적으로 관련된 종이다. 헬리코박터 필로리 감염은 개발도상국 뿐만 아니라 제 3 세계에서 높은 비율로 관찰된다. 헬리코박터 필로리에 기재된 모든 병독성 인자 중에서도, 우레아제가 그노바이오틱(gnobiotic) 피그 및 누드마우스의 콜로니화에 필수적인 것으로 공지되어 있다. 우레아제는 두 개의 구성 서브유니트(UreA 및 UreB)로 구성된 효소이다. 이전의 연구는 재조합 UreB 및 콜레라 독소를 사용하여 경구적 면역법이 헬리코박터 펠리스 및 헬리코박터 필로리로 위 콜로니화로부터 마우스를 보호할 수 있다고 지적하였다[참고문헌: Michetti et al., Gastroenterology 107 (1994), 1002-1011]. 그러나, 수가지의 경우에 재조합 UreB 항원의 경구적 투여에 의해, 단지 하나의 불완전한 보호만이 얻어질 뿐이다. 부분적인 보호를 제공하는 것으로 입증된 그 밖의 헬리코박터 필로리 항원은 87kD 바쿠올라(vacuolar) 세포 독소 VacA[참고문헌: Cover and Blaser, J. Biol. Chem. 267 (1992), 10570; Marchetti et al., Science 267 (1995), 1655] 및 13 및 58kD 열 쇼크 단백질 HspA 및 HspB[참고문헌: Ferrero et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 6499]이다.
약독화 병원체, 예를 들어 살모넬라(Salmonella)와 같은 박테리아는 효과적인 생백신인 것으로 공지되어 있다. 사람에게 양호한 백신으로서 약독화 살모넬라의 효능은 화학적으로 돌연변이화된 살모넬라 타이피(typhi) Ty21a 균주를 사용한 연구[참고문헌: Germanier and Furer, J. Infect. Dis. 141 (1975), 553-558]에서 드러났고, 성인 지원자에게서 성공적으로 시험되었으며[참고문헌: Gilman et al., J. Infect. Dis. 136 (1977), 717-723], 나중에는 이집트의 어린이에게서 시험되었다[참고문헌: Whadan et al., J. Infect. Dis. 145 (1982), 292-295]. 경구로 투여된 Ty21a 백신은 3년의 감시 동안 백신으로 처리된 이집트 어린이의 96%를 보호할 수 있었다. 그 때 이래로, 새로운 약독화 살모넬라 생 벡터 백신이 개발되었으며[참고문헌: Hone et al., Vaccine 9 (1991), 810-816], 염색체 내로 혼입된 잘 규정된 변이체는 경구 투여 후에 강한 면역 반응을 야기시킬 수 있는 비악성적인 균주를 발생시켰다[참고문헌: Tacket et al., Vaccine 10 (1992), 443-446 and Tacket et al., Infect. Immun. 60 (1992), 536-541]. 약독화 살모넬라 생백신의 그 밖의 장점은 이전의 비운동성의 시판용 장티푸스 백신과 비교하여 이의 안전성, 용이한 투여, 장기간 보호를 포함하며, 어떠한 역반응도 없다는 것이다[참고문헌: Levine et al., Typhoid Fever Vaccines. In: Plotkin S.A., Mortimer E.A. Jr. (eds.) Vaccines. Philadelphia: WB Saunders (1988), 333-361].
사람에게 티푸스균을 감염시키는 것으로 믿어지는 쥐티푸스균의 변이체는 동물 모델로서 마우스를 사용할 수 있기 때문에 항원을 운반하는데 광범위하게 사용되었다. 가장 공통적으로 사용된 쥐티푸스균의 약독화는 방향족 아미노산의 합성에 영향을 미치는 유전자의 부위 관련 뮤타게네시스(mutagenesis)에 있다. 이러한 균주, 지정된 아로(aro) 변이체는 이들 구성물을 사용하는 사람 연구 및 동물 모델에서 입증된 바와 같이 무시할 만한 정도의 병원성을 갖는다[참고문헌: Hoiseth and Stocker, Nature 291 (1981), 238-239; Tacket et al. (1992), 서두]. 장점은 이종 항원을 전달하는데 살모넬라 생백신의 효능성 면역유전으로부터 취해졌다. 약독화 살모넬라에서 특이적 항원의 발현은 수가지의 박테리아성 병원체에 대한 뮤린 보호를 제공하였다. 헬리코박터 항원을 발현시킬 수 있고 백신 접종된 동물을 보호할 수 있는 재조합 생백신의 사용은 아직까지는 기술되지 않았다. 헬리코박터 감염증을 치료하기 위한 약독화 생백신의 사용도 명백하게 제공되지 않았다. 이에 대한 이유는 헬리코박터 감염 동안에 병원체 자체에 대한 강한 면역 반응이 야기되지만, 보호 면역을 유발시키지 않기 때문이다. 이와 같이, 매우 놀랍게도, 보호 면역 반응은 헬리코박터 항원을 코딩시키는 DNA 분자를 발현시킬 수 있는 항원 담체로서 재조합 약독화 박테리아 세포를 사용할 때 달성된다. 명백하게는, 헬리코박터 항원을 발현시키는 재조합 약독화 박테리아 세포는 헬리코박터 자체가 그 자신의 동종 항원에 대하여 반응하는 것이라기 보다 이종 헬리코박터 항원에 대하여 정성적으로 상이한 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 놀랍게도, 비보호성 면역 반응은 헬리코박터 감염으로부터 보호하는 면역 반응으로 이와 같이 전환된다. 이러한 예기치 않은 관찰은 보호성 항원의 스크리닝을 위한 담체로서 재조합 약독화 병원체, 예를 들어 박테리아 세포, 특히 살모넬라를 사용하는 것, 헬리코박터 감염에 대하여 어떠한 백신에서 이러한 방식으로 동정된 보호성 항원을 적용하는 것, 및 사람 및 그 밖의 포유동물의 헬리코박터 감염에 대하여 면역화를 위한 보호성 항원의 담체로서 재조합 약독화 박테리아를 사용하는 것을 가능하게 한다.
이와 같이, 본 발명의 대상 물질은 헬리코박터 항원을 코딩시키는 1종 이상의 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 약독화 병원체이며, 상기 병원체는 상기 핵산 분자를 발현시킬 수 있거나 표적 세포에서 상기 핵산의 발현을 야기시킬 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 DNA 분자이다.
약독화 병원체는 실제 항원에 대하여 감염 및, 바람직하게는, 효과적인 면역학적 보호를 야기시킬 수 있지만 그 자체로서는 더 이상의 병원성이 없는 미생물 균주이다. 약독화 병원체는 박테리아, 바이러스, 진균류 또는 기생충일 수 있다. 바람직하게는, 약독화 병원체는 박테리아, 예를 들어 쥐티푸스균 또는 티푸스균과 같은 살모넬라, 콜레라균[참고문헌: Mekalanos et al., Nature 306 (1983), 551-557], 플렉스너균과 같은 시겔라 종[참고문헌: Sizemore et al., Science 270 (1995), 299-302; Mounier et al., EMBO J. 11 (1992), 1991-1999], 단구증리스테리아와 같은 리스테리아[참고문헌: Milon and Cossart, Trends in Microbiology 3 (1995), 451-453], 대장균, 스트렙토커스 고도니(S. gordonii)와 같은 연쇄상구균속[참고문헌: Medaglini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 6868-6872] 또는 바실리 칼메트 구에린(Bacille Calmette Guerin)과 같은 미코박테리움속[참고문헌: Flynn, Cell. Mol. Biol. 40 Suppl. 1 (1994), 31-36]이다. 보다 바람직하게는, 병원체는 콜레라균, 플렉너스균, 대장균 또는 살모넬라와 같은 약독화 엔테로박테리아이다. 가장 바람직하게는, 약독화 병원체는 살모넬라 세포, 예를 들어 살모넬라 아로 변이성 세포이다. 그러나, 약독화 병원체는 바이러스, 예를 들어 약독화 우두 바이러스, 아데노바이러스 또는 수두 바이러스이다.
병원체 내로 삽입되는 핵산 분자는 헬리코박터 항원, 바람직하게는 헬리코박터 펠리스, 헬리코박터 헤일마니 또는 헬리코박터 필로리 항원, 보다 바람직하게는 헬리코박터 필로리 항원을 코드화한다. 헬리코박터 항원은 음성 헬리코박터 폴리펩티드, 이들의 면역학적 반응성 단편, 또는 음성 폴리펩티드 또는 이들의 단편의 면역학적 반응성 변이체일 수 있다. 또한, 헬리코박터 항원은 음성 헬리코박터 항원의 3차원 구조와 유사한 보호적 탄수화물 또는 펩티드 미모토프(mimotope)일 수 있다. 펩티드 미모토프는 박테리아 세포의 표면에 제시된 펩티드 라이브러리로부터 수득될 수 있다(PCT/EP96/01130 참조). 물론, 형질전환된 세포도 상이한 헬리코박터 항원을 코딩시키는 수개의 DNA 분자를 함유할 수 있다.
헬리코박터 항원을 코딩시키는 핵산 분자는 염색체외 벡터, 예를 들어 플라스미드상에 위치되고/거나 병원체의 세포 염색체에 합체될 수 있다. 병원체가 백신으로 사용될 때는, 염색체 합체가 보편적으로 바람직하다.
약독화 박테리아는 상기 핵산 분자를 박테리아 세포내로 직접 복사하고 번역하거나 상기 핵산 분자를 감염된 표적 세포로 전달하는데 사용되며, 그 결과 DNA 분자가 진핵 표적 세포 장치에 의해 복사되고/거나 번역된다. 본원에서 유전자 백신 접종으로 언급되는 이러한 간접적인 박테리아 백신 접종 방법은 담체로서 시겔라로 성공적으로 사용되었다[참고문헌: Sizemore, D. R., Branstrom, A. A. & Sadoff, J. C. (1995) Attenuated Shigella as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization. Science 270:299-302].
본 발명의 바람직한 구체예에서, 헬리코박터 항원은 우레아제, 우레아제 서브유니트 또는 면역학적 반응성 변이체 또는 이들의 단편 또는 이들의 펩티드 미모토프이다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 구체예에서, 헬리코박터 항원은 헬리코박터로부터의 분비성 폴리펩티드, 면역학적 반응성 변이체 또는 이들의 단편 또는 이들의 펩티드 미모토프이다. 이러한 분비성 폴리펩티드, 및 특히 어드히신(adhesin)을 코딩시키는 헬리코박터 유전자를 동정하기 위한 방법은 본원에 참조로 인용된 국제특허출원 PCT/EP96/02544호에 기술되어 있다. 이러한 방법은,
a) 분비성 활성을 갖는 마아커에 커플링된 유도 가능한 트랜스포슨을 함유하는 숙주 유기체에서 헬리코박터 필로리 DNA의 유전자 뱅크를 제조하는 단계;
b) 헬리코박터 필로리 DNA내로 트랜스포슨을 삽입시키는 단계; 및
c) 마아커에 의해 분비성 유전자를 함유하는 클론에 대한 선택을 수행하는 단계, 및, 임의로,
d) 분비성 활성을 갖는 유전자를 함유하는 클론의 DNA에 의해 헬리코박터 필로리의 재형질전환을 수행하는 단계로서, 이소게닉(isogenic) 헬리코박터 필로리 변이체 균주가 DNA를 염색체내로 합체시킴으로써 생성되는 단계;
e) 유착성 부족 헬리코박터 변이체 균주를 검출해내기 위한 선택을 수행하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 의해 수득할 수 있는 항원의 적합한 예는 항원 AlpA, AlpB, 면역학적 반응성 변이체 또는 이들의 단편 또는 이들의 펩티드 미모토프로 구성된 군으로부터 선택된다. 항원 AlpA 및 AlpB의 핵산 및 아미노산 서열은 본원에 참조로 인용된 국제특허출원 PCT/EP96/02545호 및 PCT/EP96/04124호에 기술되어 있다. 또한, AlpB의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호: 1 및 2에 나타내어져 있으며, AlpA의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호: 3 및 4에 나타내어져 있다.
그러나, 예를 들어 자기분해성 해방에 의해 표면에 제공될 수 있는 세포내 항원이 사용될 수 있으며, 면역학적 보호를 제공한다고 생각할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 병원체내에 헬리코박터 항원의 제시는 상이한 방식으로 성취될 수 있다. 항원(들)은 구성적인, 유도 가능한 또는 페이즈 가변 방식으로 재조합 병원체내에서 합성될 수 있다. 헬리코박터 항원의 구성적 또는 유도 가능한 합성에 관해서는, 발현 시스템이 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기술되어 공지되어 있는 바, 이를 참조할 수 있다.
특히 바람직한 항원은 페이즈 가변 발현 시스템에서 제시된다. 하이브리드 생백신에서 이종 항원의 생성 및 제시를 위한 이러한 페이즈 가변 발현 시스템은 본원에 참조로 인용된 EP-B-0 565 548호에 기술되어 있다. 이러한 페이즈 가변 발현 시스템에서, 헬리코박터 항원을 코딩하는 핵산 분자는 발현 시그날의 조절하에 있으며, 병원체내에서 실질적으로 비활성적이며, 핵산에 의해 야기된 자발적인 재구성, 예를 들어 병원체내에서 DNA 재구성화 메카니즘, 예를 들어 특정 DNA 전환 방법, 특정 DNA 삭제 방법, 특정 DNA 복제 방법 또는 특정 슬리프드-스트랜드-미스페어링(slipped-strand-mispairing) 메카니즘 의해 활성화될 수 있다.
페이즈 가변 발현 시스템을 갖는 재조합 세포는 두 개의 서브유니트 A 및 B를 형성시킬 수 있으며, 여기에서 상기 서브유니트로의 분할은 재조합 핵산내에서의 자발적인 재구성에 의해 일어나며, 상기 서브유니트 A는 감염을 유발시킬 수 있으며, 그 자체로서 면역학적으로 활성적이지만, 서브유니트 A로부터 재생되는 서브유니트 B는 1종 이상의 헬리코박터 항원을 생성시키며, 상기의 추가 항원과 관련하여 면역학적으로 작용한다.
헬리코박터 항원을 코딩시키는 발현 시그날의 활성화는 핵산 재구성에 의해 직접 또는, 대안적으로는, 헬리코박터 항원을 코딩시키는 유전자의 발현을 조절하는 단백질을 코딩시키는 유전자의 활성화에 의해 간접적으로 달성될 수 있다. 간접적 활성화는 케스케이드 시스템을 통해 헬리코박터 항원이 생성되게 하는 시스템을 나타내며, 예를 들어 DNA 재구성에 의해 직접적으로 조절된 유전자가 헬리코박터 유전자 앞에 있는 프로모터에 특이적인 RNA 폴리머라아제를 코딩시키거나, 또 다른 특정 방식으로 헬리코박터 유전자의 발현을 유도하는 조절 유전자를 코딩시킨다는 점에 있어서 인지될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 헬리코박터 항원을 코딩시키는 유전자에 대한 발현 시그날은 박테리오파지 프로모터, 예를 들어 T3, T7 또는 SP6 프로모터이며, 발현 시그날의 활성화는 병원체내 상응하는 박테리오파이지 RNA 폴리머라아제를 생성시키는 핵산 재궁성에 의해 야기된다.
페이즈 가변 발현 시스템은 헬리코박터 항원의 소정의 발현 수준을 제공하도록 조정될 수 있다. 이러한 조정은 예를 들어 핵산 재구성 메카니즘에 의해 활성화되는 발현 시그날의 누클레오티드 서열을 변경시키고/거나 추가의 유전자 조절 요소를 삽입시킴으로써 성취될 수 있다.
헬리코박터 항원은 본 발명에 따른 병원체에서 세포외 방식 뿐만 아니라 세포내 방식으로 생성될 수 있다. 예를 들어, IgA-프로테아제 시스템과 같은 오토트랜스포터(autotransproter) 시스템[참조예: EP-A-0 254 090호] 또는 대장균 AIDA-1 어드히신 시스템[참고문헌: Benz et al., Mol. Microbiol. 6 (1992), 1539]은 세포외 분비 시스템으로서 적합하다. 그 밖의 적합한 외부 막 트랜스포터 시스템으로는 RTX-톡신 트랜스포터, 예를 들어 대장균 헤몰리신 트랜스포트 시스템이 있다[참고문헌: Hess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 11458-11463].
본 발명에 따른 병원체는 헬리코박터 항원을 코딩시키는 핵산 분자와는 별도로 면역 반응에 정량적으로 또는 정성적으로 영향을 미치는 면역조절성 펩티드를 코딩시키는 제 2의 이종 핵산, 예를 들어 DNA 분자를 함유할 수 있다. 이러한 면역조절성 폴리펩티드의 예로는 면역-자극 펩티드, IL-2, IL-6 또는 IL-12와 같은 시토킨, 케모킨, 톡신, 예를 들어 콜레라 톡신 B, 또는 어드히신이 있다.
본 발명은 임의로 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 및 보조제와 함께, 상기된 바와 같이 활성제로서 재조합 약독화 병원체를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 조성물은 생백신이다. 백신 접종 경로는 백신 접종 백터의 선택에 의존한다. 투여는 단일 용량으로 수행되거나 일정한 시간 간격으로 반복될 수 있다. 적합한 용량은 백신 백터 그 자체, 또는 투여 경로와 같은 다양한 파라미터에 의존한다. 보편적으로, 용량은 백신 접종 당 약 106내지 1012세포(CFU), 바람직하게는 약 108내지 1010세포(CFU)를 포함한다. 점막 표면(예, 눈, 비내, 경구, 위, 장, 직장, 질 또는 요로)에 또는 장관외 경로(예, 피하, 피내, 근내, 정맥내 또는 복막내)를 통한 투여가 선택될 수 있다. 생백신의 제조 방법은 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 및/또는 보조제와 함께 약제학적 유효량으로 약독화 병원체를 제형화시키는 것을 포함한다.
약제 조성물은 어떠한 적합한 형태, 예를 들어 물 또는 우유와 같은 적합한 액체 담체 중의 현탁액, 캡슐, 정제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 조성물은 사용하기 전에 액체 담체중에 현탁되는 동결건조된 생성물이다.
또한, 본 발명은, a) 헬리코박터 항원을 코딩시키는 핵산 분자를 약독화 병원체내로 삽입시키는 단계로서, 상기 핵산 분자를 발현시킬 수 있거나 상기 핵산 분자를 표적 세포내에서 발현시킬 수 있는 재조합 병원체, 예를 들어 형질전환된 박테리아 세포가 수득되는 단계; 및 상기 재조합 약독화 병원체를 적합한 조건하에서 배양시키는 단계를 포함하여, 상기 규정된 바와 같은 재조합 약독화 병원체를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 병원체가 박테리아 세포인 경우, 헬리코박터 항원을 코딩시키는 핵산 분자는 염색체외 플라스미드상에 위치되어질 수 있다. 그러나, 핵산 분자를 병원체의 염색체내로 삽입시키는 것도 또한 가능하다.
또한, 본 발명은, a) 약독화 병원체에 헬리코박터의 발현 유전자 뱅크를 제공하는 단계 및 b) 포유동물 숙주에서 헬리코박터 감염에 대하여 보호 면역성을 부여하는 능력을 위해 유전자 뱅크의 클론을 스크리닝하는 단계를 포함하여, 포유동물 숙주에서 보호 면역 반응을 상승시키는 헬리코박터 항원을 동정하기 위한 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 동정 방법은 페이즈 가변 발현 시스템에서 일어나서, 모든 헬리코박터 항원의 안정한 발현을 가능하게 한다. 그런 다음, 재조합 클론은 마우스와 같은 시험 동물의 구강 면역화를 위한 "푸울(pool)"로서 제공될 수 있다. 그런 다음, 보호 항원으로서 이들 클론의 잠재성은 헬리코박터, 예를 들어 마우스 적합된 헬리코박터 필로리 균주에 공격 감염을 통해 결정된다. 이와 같이, 최적화된 헬리코박터 필로리 백신 항원을 직접 선택하는 것이 가능하다.
본 발명은 하기의 도면 및 서열 목록에 의해 추가로 설명될 것이다.
도 1은 우레아제 서브유니트 UreA 및 UreB를 코딩하는 유전자가 T7 프로모터 ø10의 전사 조절하에 위치한 우레아제 발현 벡터 pYZ97를 개략적으로 도시하는 도면이다. T7 프로모터와 우레아제 유전자 사이에 리보솜 결합 부위(RBS)가 있다. 추가하여, 플라스미드는 복제의 기점(ori), β-락타마아제 내성 유전자(bla) 및 4 T7 터미네이터를 연속해서 나타낸다.
T7 프로모터에 의한 발현과는 별개로, 우레아제 A 및 B 서브유니트의 구성분의 저수준 발현은 플라스미드 pYZ97 상에서, T7 프로모터로부터 업스트림에 위치한 암호를 사용한 프로모터를 통해 또한 야기될 수 있다.
도 2는 플라스미드 pYZ97 상에서 우레아제 서브유니트 A의 아미노산 서열의 개시 및 우레아제 발현을 위한 전사 조절 영역의 누클레오티드 서열을 도시하는 도면이다.
도 3은 박테리아의 염색체내로 합체될 수 있는 T7 RNA 폴리머라아제 (T7RNAP) 발현 카세트 pYZ88, pYZ84 및 pYZ114를 개략적으로 도시하는 도면이다.
고 발현 카세트 pYZ88에서, 람다 PL 프로모터는 T7RNAP 유전자로부터 업스트림으로, 역배향으로 위치된다. 온도에 민감한 억제체 cI 857 (cI)에 대한 유전자는 이러한 프로모터의 조절하에 있다. 박테리오파지 fd의 터미네이터 (fdT)는 cI 유전자로부터 업스트림에 위치한다. 진(gin) 유전자[참고문헌: Mertens, EMBO J. 3 (1984), 2415-2421]는 DNA 재구성 메카니즘의 조절 효소를 코딩시킨다. tRNA Arg를 코딩시키는 DNA 서열은 진 유전자로부터 다운스트림에 위치한다.
페이즈 A에서, T7RNAP 유전자의 발현의 원인이 되는 PL 프로모터는 cI857 유전자 및 진 유전자 방향으로 향한다. 이러한 결과로서 활성 억제체가 28℃의 허용 온도에서 형성되고 PL 프로모터로부터 복사율을 감소시킨다. 고온에서, 억제체가 적어도 부분적으로 이러한 외부 영향하에서 비활성화되기 때문에, PL 프로모터의 복사가 감소된다. 복사시 온도에 따른 증가는 조절 효소로서 PL 프로모터의 전환을 촉매화하는 그 다음의 진 유전자의 발현, 및 T7RNAP 유전자가 발현되는, 페이즈 B에서 전환을 상응하는 양 만큼 증가시킨다.
고 발현 시스템 pYZ88에서, 추가의 fdT 복사 터미네이터는 카나마이신 내성 유전자(km)와 이 유전자의 프로모터 사이에 위치한다. 이러한 방식으로, T7RNAP 발현의 감소에 정상적으로 기여하는, T7RNAP 유전자에 역으로 배향된 안티센스 RNA의 합성은 감소된다. 이러한 결과에 의해 T7RNAP의 발현율이 높아진다.
중간 발현 시스템 pYZ84에서, 복사 터미네이터(fdT)는 PL 프로모터와 T7RNAP 유전자의 개시 사이에 위치한다. 이러한 방식으로, T7RNAP mRNA의 발현이 감소된다. 추가하여, 안티센스 RNA는 T7RNAP 번역에 영향을 미친다. 따라서, 단지 중간 발현만이 일어난다.
저 발현 시스템 pYZ114에서, PL의 100bp의 삭제 부분이 추가로 도입된다(ΔPL). 이러한 방식으로, PL 프로모터의 활성은 T7RNAP 발현을 보다 낮아지게 하여 UreA/B 유전자 발현을 감소시킬 정도의 높은 정도로 감소된다. 이러한 구성에서, pYZ97에 대한 암호를 사용한 프로모터의 영향은 이미 관찰되어 있다.
도 4는 백신 접종된 마우스의 장액내 안티-헬리코박터 필로리 항체에 대한 ELISA의 결과를 나타낸다.
도 5는 백신 접종된 마우스의 혈청내 안티-헬리코박터 필로리 항체에 대한 ELISA의 결과를 나타낸다.
도 6은 헬리코박터 필로리 공격 후에 백신 접종된 마우스의 위 조직에서의 우레아제 활성을 나타낸다.
서열번호: 1 및 2는 헬리코박터 필로리로부터 어드히신 유전자 AlpB의 누클레오티드 서열 및 이로부터 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호: 3 및 4는 헬리코박터 필로리로부터 어드히신 유전자 AlpA의 누클레오티드 서열 및 이로부터 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 5 및 도 6은 플라스미드 pYZ97상에서 우레아제 발현을 위한 전사 조절 영역의 누클레오티드 서열, 및 우레아제 서브유니트 A의 아미노산 서열의 개시를 나타낸다.
실시예 1
UreA 및 UreB 유전자의 클로닝
유니버시티 오브 암스테르담(University of Amsterdam)에서 단리되고 조스 반 푸텐(Jos van Putten)이 제공한 임상 표본 P1(이전에는 69A)의 염색체 DNA로부터 우레아제, UreA 및 UreB를 코딩시키는 구조 유전자를 유전학적으로 클로닝시켰다. 유전자를 증폭용 프라이머쌍 YZ019 (5'-GGAATTCCATATGAAACTGACTCCCAAAGAG-3') 및 RH132 (5'-CTGCAGTCGACTAGAAAATGCTAAAGAG-3')를 사용하는 PCR 방법에 의해 단리시켰다. 프라이머 서열을 진뱅크(GenBank)(수탁번호 M60398, X57132)로부터 추론하였다. 프라이머 YZ019의 DNA 서열은 공개된 서열중의 누클레오티드 2659-2679를 포함하고 전사 조절 서열(다운스트림 박스)[참고문헌: Sprengart, M. L. et al., 1990, Nuc. Acid. Res. 18:1719-1723] 및 NdeI에 대한 분열 부위를 추가로 함유하였다. 프라이머 RH 132의 DNA 서열은 공개된 서열중의 누클레오티드 5071-5088, 및 SalI에 대한 분열 부위를 포함하였다. 증폭 생성물의 크기는 헬리코박터 염색체로부터 본래의 전사 개시 및 종료 없이 UreA 및 UreB 유전자의 완전한 코딩 영역을 포함하는 2.4kbp 였다. 정제된 PCR 단편을 NdeI 및 SalI로 분해하고 T7 발현 플라스미드 pYZ57의 상응하는 클로닝 부위내로 삽입시켜 플라스미드 pYZ97을 수득하였다.
문헌[Tabor, 1990, In Current Protocols in Molecular Biology, 16.2.1-16.2.11. Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York]에 기술된 플라스미드 pT7-7로부터 pYZ57을 처음으로 유도하였다. 두 개의 터미네이터 단편을 하기의 방법에 의해 상이한 부위에서 pT7-7 골격내로 삽입시켰다: (1) 탠덤 T7 터미네이터. 2.2kbp EcoRI/HindIII 단편을 pEP12로부터 삭제하고[참고문헌: Brunschwig & Darzins, 1992, Gene, 111:35-41], 정제된 단편을 사전 분해된 pBA로 결찰시켰다[참고문헌: Mauer, J. et al., 1997, J. Bacteriol. 179:794-804]. 결찰 생성물을 HindIII 및 ClaI로 분해하였다. 계속해서, 생성된 2.2kbp HindIII/ClaI 단편을 사전 분해된 pT7-7 내로 삽입시켰다. (2) T1 터미네이터. 230bp HpaI/NdeI 단편을 플라스미드 pDS3EcoRV(에이치. 부자드(H. Bujard) 박사에 의해 제공됨; ZMBH, 하이델베르그)로부터 삭제하였다. 그런 다음, 단편을 Klenow로 추가 처리하여 끝을 무디게 하였다. 정제된 rrnBT1 단편을 이전의 pT7-7 유도체내로 삽입시키고, BglII로 사전 분해하고, 계속해서 Klenow 처리로 무디게 하였다. 도 1은 쥐티푸스균에서 우레아제 서브유니트 UreA 및 UreB를 코딩시키는 우레아제 유전자의 발현을 위해 사용된 완전 벡터 pYZ97을 도시하고 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 우레아제 유전자는 T7 프로모터 ø10에 의해 조절될 수 있다. 리보솜 결합 부위(RBS)는 T7 프로모터와 우레아제 유전자 사이에 위치한다. 또한, 플라스미드는 복제의 기점(ori) 및 β-락타마아제 내성 유전자(bla)를 나타낸다.
T7 프로모터에 의해 조절된 발현과는 별도로, 우레아제 A 및 B 서브유니트의 구성상 중간 수준 발현은 살모넬라 RNA 폴리머라아제에 의해 유도된 프로모터로부터 일어난다. 프로모터는 플라스미드 pYZ97 상에서, T7 프로모터로부터 업스트림에 위치한다. 상세한 분자 분석을 위해, pYZ97의 정제된 BglII/HindIII 단편을 pCR-Script(상표명) SK(+) 키트(스트라타겐(Stratagene))내로 서브클로닝시키고, DNA 시퀀싱하였다. 서열 데이터는 이들의 완전성에 있어서 다양한 요소를 확실케하였다(도 2 및 서열번호 5 및 6 참조): 일부 UreA 유전자, 다운스트림 박스, RBS, T7 프로모터 및 T1 터미네이터(rrnBT1). 서열 분석는 또한 T1 터미네이터 영역과 살모넬라 RNA 폴리머라아제 프로모터가 편재되어 있는 T7 프로모터 사이의 영역을 드러냈다. 서열 데이터는 구조 예상으로부터 추론된 누클레오티드 222와 245 사이에 이러한 구성 프로모터가 위치함을 시사한다[참고문헌: Lisser & Margalit, 1993, Nuc. Acid. Res. 21:1507-1516].
실시예 2
생백신의 투여에 의한 면역학적인 보호
물질 및 방법
박테리아 균주 : 쥐티푸스균 SL3261 생 벡터 백신 균주를 재조합 헬리코박터 필로리 우레아제 플라스미드 구성물에 대한 수용체로서 사용하였다. 쥐티푸스균 SL3261은 쥐티푸스균 SL1344 야생형 균주로부터 유도된 aroA 트랜스포슨 변이체이다. 쥐티푸스균 SL3261은 경구 투여 후 야생형 쥐티푸스균에 의한 감염에 대하여 마우스를 보호하는 비병독성 균주이다[참조예: Hoiseth and Stocker (1981) 서두]. 우레아제 발현 플라스미드 pYZ97(염색체외) 및 T7RNAP 발현 카세트 pYZZZ88, pYZ84 또는 pYZ114(염색체내로 합체됨)를 각각 함유하는 쥐티푸스균 SL3261 및 이들의 유도체는 표 1에 기재되어 있다. 루리아(Luria) 육즙 또는 세균 배양기를 사용하여 28℃에서 박테리아를 성장시켰다. 혈청 플레이트상에서 37℃에서 성장시킨 헬리코박터 필로리 야생형 균주를 사용하여 감염 실험을 하였다.
마우스의 면역법 : 인터파우나(Interfauna, 독일 투틀링겐)에서 구입한 4주된Balb/c 마우스를 실험에 사용하기 전에 동물용 시설에서 2주 동안 적응시켰다. 모든 마우스로부터 혈액 150㎕를 취하여 사전면역성 혈청을 수득하였다. 면역화 1주 및 3주 후, 역행 출혈을 모든 면역된 마우스로부터 반복하였다.
대조군을 포함하여 5마리 마우스로 구성된 8개 그룹을 이 연구에서 사용하였다(표 2 참조). 그룹 A (천연 대조군)는 살모넬라로 면역화시키지도, 야생형 헬리코박터 필로리로 감염시키지도 않았다. 나머지 그룹은 모두 경구로 면역화시켰다. 그룹 B (음성 대조군)는 살모넬라를 수용하지 않았지만, 헬리코박터 필로리로 감염시켰다. 그룹 C 내지 G로부터의 마우스를 살모넬라 백신 균주로 면역화하고 헬리코박터 필로리에 감염시켰다. 최종 그룹 H는 콜레라 독소와 조합된 재조합 우레아제 B를 수용하였으며, 또한 감염되었다.
면역시키기 전에, 마우스를 고형의 먹이 없이 밤새, 그리고 물 없이 4시간 방치시켰다. 3% 중탄산나트륨 100㎕를 스테인레스강 카테테르 튜브를 사용하여 구강으로 투여하여 위의 pH를 중성화시켰다. 그런 다음, 그룹 B로부터의 마우스는 100㎕ PBS를 수용하였고, 그룹 C 내지 G로부터의 마우스는 100㎕ 용적중에 살모넬라 1.0×1010CFU를 수용하였다. 그룹 H로부터의 마우스는 매주 1회 용량으로 재조합 헬리코박터 필로리 우레아제 B와 콜레라 독소의 혼합물 100㎕를 4회 수용하였다. 매 면역화 후, 물과 먹이를 마우스에게 다시 공급하였다.
헬리코박터 필로리 감염 : 첫 번째 구강 면역 4주 후, 그룹 B 내지 H로부터의 마우스를 헬리코박터 필로리로 감염시켰다. 마우스를 감염시키기 전에 고형의 먹이 없이 밤새 그리고 물 없이 4시간 동안 방치시켰다. 3% 중탄산나트륨 100㎕를 스테인레스 카테테르 튜브를 사용하여 마우스에 구강으로 투여한 후, 헬리코박터 필로리 5×109CFU/ml 용량으로 구강으로 투여하였다. 감염시킨 후, 물 및 먹이를 마우스에게 다시 공급하였다.
마우스로부터 혈액 및 조직의 수집 : 첫 번째 면역화 12 주 후, 마우스를 먹이 없이 밤새 방치시키고, 계속해서 보호 및 면역 반응을 분석하였다. 마우스를 경부 탈구에 의해 희생시키기 전에 말단 심장 출혈을 위해 메톡시-플루오란으로 마취시켰다. 방부 조건하에서, 비장 및 위를 각각의 마우스로부터 조심스럽게 제거하고 추가로 처리하기 전까지 별도의 살균 용기내의 얼음위에 위치시켰다. 장액을 추가로 단리시키기 위해 큰창자 및 작은 창자를 수득하였다.
위의 처리 및 우레아제 활성의 측정 : 조직내의 활성 우레아제의 존재에 의해 마우스 위에서의 헬리코박터 필로리 콜로니화의 정도를 측정하였다. 제조업자의 안내서에 따라서 자트록스-테스트(Jatrox-test)(독일 베이테르스타츠 룀-파르마 게엠베하(Rohm-Pharma GmbH))를 사용하였다. 위 점막을 드러내고 PBS로 세척하고, 곧바로 위의 동부(antral portion)의 절반을 우레아제 활성의 측정을 위한 기질을 함유하는 에펜도르프(Eppendorf) 튜브 내에 위치시켰다. 튜브를 실온에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 위 조직중의 나머지를 추가의 처리를 위해 -20℃에서 보관하였다. 면역화 또는 감염되지 않은 천연 마우스의 위로부터 얻은 우레아제 활성 값을 사용하여 기준선을 생성시켜 헬리코박터 필로리 감염의 부재 및 이로인한 보호를 나타냈다.
| 균주 | 우레아제 발현 | 공급처 |
| 쥐티푸스균 SL3261 | 음성 | 호이세쓰 및 스토커 |
| 쥐티푸스균 SL3262 pYZ97 | 구성적으로 낮음 | 본 연구 |
| 쥐티푸스균 SL3261::pYZ88pYZ97 | 높은 T7 유도 발현 | 본 연구 |
| 쥐티푸스균 SL3261::pYZ84pYZ97 | 중간 T7 유도 발현 | 본 연구 |
| 쥐티푸스균 SL3261::pYZ114pYZ97 | 낮은 T7 유도 발현 | 본 연구 |
| 그룹 | 면역원 | 구강 면역의 수 |
| A | 없음 | 0 |
| B | PBS 구강 면역 | 1 |
| C | 쥐티푸스균 SL3261 | 1 |
| D | 쥐티푸스균 SL3261 pYZ97 | 1 |
| E | 쥐티푸스균 SL3261::pYZ88pYZ97 | 1 |
| F | 쥐티푸스균 SL3261::pYZ84pYZ97 | 1 |
| G | 쥐티푸스균 SL3261::pYZ114pYZ97 | 1 |
| H | 우레아제 B 및 콜레라 독소 | 4 |
결과:
대조군 마우스(그룹 B 및 C)에 있어서, 헬리코박터 필로리에 100% 감염된 것이 관찰되었다. 재조합 약독화 병원체에 감염된 마우스(그룹 D, E, F, G)에 있어서는, 0% 내지 60% 감염(100% 내지 40% 보호)이 관찰되었다. 면역-보호는 체액의 안티-UreA 및 UreB 반응과는 상관하지 않았으며, 이는 체액 면역성 이외에 세포 면역이 헬리코박터 필로리 감염에 대한 보호에 중요하다는 것을 암시한다. 결과는 쥐티푸스균 약독화 균주에 의해 전달된 UreA 및 UreB에 의한 구강 면역화가 헬리코박터 필로리 콜로니화에 높은 수준의 보호를 유도하는데 효과적임을 나타낸다.
재조합 우레아제 B 및 콜레라 독소로 면역된 마우스에 있어, 본 발명에 따른 재조합 약독화 병원체를 처리할 때 보다도 상기 실험 조건하에서 보다 훨씬 높은 수준의 우레아제 활성이 관찰되었다.
우레아제 시험의 결과는 표 3에 기재되어 있다.
실시예 3
ureA/ureB 서브유니트를 발현시키는 다양한 재조합 쥐티푸스균 균주의 구성 및 분자 분석
면역 실험용 쥐티푸스균 균주에 대한 설명
쥐티푸스균 SL3261(pYZ97) (구성 A): 쥐티푸스균 SL3261 생백신 벡터 균주를 재조합 우레아제 플라스미드 구성물 pYZ97에 대한 수용체로서 사용하였다.
쥐티푸스균 SL3261::YZ 열 (pYZ97) (구성 B): 이들 담체 균주는 도 3에 개략적으로 제시된 T7 RNA 폴리머라아제(T7RNAP) 발현 카세트가 갖추어진 쥐티푸스균 SL3261의 유도체이다. 이들 발현 카세트는 이전의 얀(Yan) 등에 의한 발명["Two phase system for the production and presentation of foreign antigens in hybrid live vaccines", PCT/EP91/02478]에 기술된 바와 같이 2 상 방식(ON/OFF)으로 발현되는 T7RNAP에 대한 유전자를 코딩시킨다. 카세트는 박테리아 염색체내로 합체될 수 있으며 pYZ97과 같은 T7RNAP 의존성 발현 플라스미드를 활성화시키기 위해 최적량의 T7RNAP로 ON-위치에서 세포를 제공한다.
YZ84 카세트의 원리는 파지 Mu 인버타아제 진에 의해 전환되는 단편상에 위치한 전환 가능한 람다 PL 프로모터이다[참고문헌: Yan & Meyer, 1996, J. Biotechnol. 44:197-201]. PL 프로모터의 배향에 따라서, 진 유전자(OFF-위치) 또는 T7RNAP 유전자(ON-위치)가 발현된다. YZ84에는 다음과 같은 조절 요소가 포함되었다: (1) 28℃에서 PL 프로모터를 억제하고 37℃에서 분리시키는 온도 민감성 cIts람다 억제체(cI). (2) 파지 fd 터미네이터(fdT)는 진 유전자의 발현을 감소시켜 전환 가능한 단편상에서 PL 프로모터의 중간 수준의 전환률을 달성한다.
2 상 발현 시스템은 우레아제 서브유니트 A 및 B와 같은 이종 항원의 높은 발현율을 가능하게 한다. 이종 항원의 높은 발현율이 살모넬라 담체의 생육력을 감소시켜 면역 반응을 감소시켜, 결과적으로 보호 능력을 감소시킨다는 것은 널리 공지되어 있다. 2 상 시스템이 다량의 이종 항원을 발현시키는 재조합 살모넬라의 생존을 향상시키는 자연적인 능력을 갖는다는 것은 확인되었다. 구성 B에서, UreA 및 UreB의 발현이 주로 강한 T7 프로모터의 조절하에서 일어나서 우레아제 서브유니트가 많이 생성된다. T7RNAP 발현 카세트가 OFF 위치에 있고 어떠한 T7RNAP도 존재하지 않으면, UreA 및 UreB 유전자는 살모넬라 프로모터에 의해 중간 범위에서 구성적으로 발현된다.
면역 실험에 사용된 다양한 쥐티푸스균 균주에 의해 생성된 UreA/B의 분석.
살모넬라 구성물 A 및 B를 UreA 및 UreB 발현용 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 의해 먼저 분석하였다. 밤샘 배양으로부터 출발하여 100㎍/ml 암피실린이 공급된 액체 루리아 브로쓰중에서 37℃에서 재조합 균주를 성장시켰다. 원심분리에 의해 박테리아를 대수 성장식으로 배양시키고 세포 펠릿을 10mM Tris-HCl 및 10mM EDTA (pH 8.0)중에서 재현탁시키고 세포 밀도를 모든 프로브에서 표준 A590=1.0으로 조정하였다. 박테리아 현탁액을 동일 용적의 SDS-샘플 완충액과 혼합시키고[참고문헌: Sambrook, J. et al. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.], 5분 동안 비등시켰다. 현탁액 20㎕를 두 개의 SDS-10% 폴리아크릴아미드 겔상으로 로딩시켰는데; 상기 겔 중의 하나는 쿠마씨에(Coomassie) 청염료로 착색시키고 나머지 겔은 니트로셀룰로오스 막상으로 전기블로팅시키고 면역블로팅하는 동안 추가로 처리하였다. 옮겨진 단백질을 운반하는 니트로셀룰로오스 막을 10(v/w)%의 비지방성 우유 Tris-완충액-염수(TBS)(TrisHCl 100ml, NaCl 150mM, pH 7.2)중의 실온에서 45분 동안 블로킹시켰다. TBS-0.05 (v/v)% Tween-20 중에서 세 번 세척한 후, 5(w/v)%의 비지방성 우유-TBS중에서 1:2000으로 희석된 토끼의 안티-UreB 항체(AK 201)를 스트립에 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 친화 크로마토그래피를 통해 정제된 재조합 우레아제 B 서브유니트로 면역된 토끼로부터 혈청을 취하였다. PBS중의 0.05(v/v)% Tween-20으로 막을 10분 동안 세 번 세척하고, 실온에서 45분 동안 염소 항토끼 IgG 항체 양고추냉이 페록시다아제 컨쥬케이트로 5 (w/v)%의 비지방성 우유-TBS 중에서 추가로 인큐베이션하였다. 상기에서와 같이 0.2 (v/v)% Tween-20으로 세 번 세척한 후, 제조업자의 추천에 따라서 ECL 킷(독일 아메르샴)을 사용하여 막을 전개하였다.
구성물 A : 구성물 A(쥐티푸스균 균주 SL326 pYZ97)의 전체 세포 용해질의 쿠마씨에 착색된 겔중에서 단백질 67kDa 및 30kDa을 관찰하였는데; 이들의 크기는 각각의 UreB 및 UreA의 크기와 매우 관련성이 있다. 이러한 단백질은 쥐티푸스균 SL3261 균주를 함유하는 대조군 레인에는 없었다. 토끼 안티-UreB 항체를 사용하는 동일 단백질의 면역블롯 분석은 UreB로서 쿠마씨에 착색 겔에서 관찰된 67kDa 단백질을 확실케 하였다. 2시간, 6시간 및 11시간 동안 37℃에서 각각 인큐베이션시킴으로써 상이한 단계에서 쥐티푸스균 균주 SL3261(pYZ97)로부터 UreB의 발현을 조사하였다. 정지상을 포함하는 모든 성장 단계에서 UreB의 발현을 관찰하였지만; 초기 성장 단계에서 보다 높은 발현이 관찰되었다. 균주 SL3261(pYZ97)로 얻어진 결과는 UreA 및 UreB 단백질이 살모넬라에 대하여 비독성적이며 37℃에서 어떠한 박테리아 성장 단계에서도 발현될 수 있음을 나타낸다.
구성물 B : 구성물 B로 유사한 분석을 수행하였다. SDS-PAGE 분석에서 양 구성물의 비교는 구성물 B가 보다 효율적인 생산자이고, 반면에 구성물 A가 UreA 및 UreB의 중간수준의 발현을 갖는다는 것을 나타낸다. 구성물 B의 박테리아 성장 과정 중에, UreA 및 UreB의 발현은 항생물질의 선택 없이도 장기간에 걸쳐 일정하게 높았다. 이것은 구성물 A와 비교하여 구성물 B의 예외적인 생산성을 확실케 한다.
요약하면, 본 발명의 데이터는 헬리코박터 필로리로부터의 UreA 및 UreB가 박테리아에 역효과를 미치지 않으면서 쥐티푸스균에서 발현될 수 있어서 살모넬라 담체에 의해 전달되는 경우에 동물 보호 실험에 적합함을 나타낸다.
플라스미드 안정성
플라스미드 안정성은 상기 플라스미드내로 클로닝된 유전자에 의해 코딩된 항원의 안정한 발현을 보장하는데 필수적이다.
시험관내 플라스미드 안정성. 플라스미드 pYZ97상에는 존재하지만 플라스미드 없는 쥐티푸스균 균주 SL3261에는 존재하지 않는 암피실린 내성 마아커를 플라스미드 안정성의 인디케이터로서 사용하였다. 쥐티푸스균 균주 SL3261을 상기된 바와 같이 개체수가 100이 될 때까지 28℃에서 LB 액체 배지중에서 성장시켰다[참고문헌: Summers, D. K and D. J. Sherrat. 1984. Cell. 36:1097-1103]. 개체수 10 마다, 동수의 박테리아 희석물을 평평한 LB 세균배양기 플레이트 및 100㎍/ml 암피실린이 공급된 LB 세균배양기 플레이트상에 플레이팅시킴으로써 살모넬라의 콜로니 형성 유니트(CFU)의 총수로부터 암피실린 내성 CFU의 수를 결정하였다.
생체내에서의 플라스미드 안정성. 5.0×109CFU의 쥐티푸스균 SL3261(pYZ97)으로 마우스를 경구 감염시킨 시킨지 2일 및 7일 후, 마우스의 비장으로부터 전체 CFU 및 암피실린 내성 CFU를 조사하여 생체내에서의 플라스미드 안정성을 분석하였다. 마우스를 상기된 바와 같이 살모넬라로 경구 감염시켰다. 감염 2일 및 7일 후, 마우스를 메톡시플루오란 마취제하에서 희생시키고 추가로 처리하기 위해 무균적으로 비장을 제거하였다. 비장을 페트리 접시에서 작은 조각으로 절개하고 1ml의 얼음같이 차가운 ddH2O와 혼합시키고, 18 게이지 니들을 통해 수차례 통과시켜 비장 세포를 부유시켰다. 그런 다음, 세포 부유물을 100㎍/ml의 암피실린 존재하 또는 부재하의 LB 세균배양기 플레이트상에 플레이팅시켰다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션시키고 그 다음날 콜로니의 수를 세었다.
5.0×109CFU의 쥐티푸스균 SL3261(pYZ97)의 1회 경구 용량으로 마우스를 감염시킨 후, 생체내에서의 플라스미드 안정성을 분석하였다. 감염 2일 및 7일 후에 마우스 비장을 취하고, 전체 CFU 및 암피실린 내성 CFU를 조사하기 위해 LB 세균배양기 플레이트상에 플레이팅시켰다. 48시간 후 비장으로부터 2.0×104암피실린 내성 CFU를 단리시켰다(표 4 참조). 면역 후, CFU의 수는 56으로 감소하였지만, 모두 다시 암피실린에 내성적이었다. 데이터는 플라스미드 pYZ97이 시험관내 및 생체내 조건하에서 살모넬라내에서 안정하며 헬리코박터 필로리의 마우스 위의 콜로니화에 대하여 보호 항원으로서 우레아제 서브유니트를 평가하기에 적합함을 나타낸다. 감염 7일 후 살모넬라 균주 SL3261의 저회수율은 마우스내로 우레아제의 전달을 위해 이의 안전한 사용을 허용하는 이러한 균주의 약독화를 확실케 한다.
| 감염 후의 시간 | 전체 CFUa | AmprCFUb의 백분율(%) |
| 2일 | 2.0×104 | 100 |
| 7일 | 56 | 100 |
a 마우스를 쥐티푸스균 균주 SL3261 (pYZ97) 5.0×109CFU로 구강으로 접종된 지 2일 및 7일 후 마우스 비장으로부터 항생물질 없이 LB 플레이트상에서 분리된 쥐티푸스균의 CFU의 수.
b 마우스 비장으로부터 분리된 CFU의 전체 수로부터 암피실린 내성 CFU의 백분율(%)
| 마우스 그룹 | 수 | 우레아제 활성a | CFUb |
| 천연 대조군 | 5 | 0.058 ± 0.004 | 0 ± 0 |
| PBS 대조군 | 5 | 0.427 ± 0.059 | 2.7×103± 1.0×103 |
| SL3261pYZ97c | 5 | 0.057 ± 0.006 | 62.6 ± 97.3 |
a 우레아제 활성은 평균값 ± 표준 편차이다.
b 스트렙토마이신 내성 헬리코박터 필로리 P76 균주의 결정은 스트렙토마이신 200㎍/ml로 보충된 혈청 플레이트상에서 위의 동강 부분을 플레이팅시킴으로써 수행되었다. 헬리코박터 필로리는 콜리니 형태학, 우레아제 활성, 및 광 현미경 조사를 기초로 하여 인지되었다. 값은 CFU ± 표준 편차에 상응한다.
c 물질 및 방법에서 기술된 바와 같이 헬리코박터 필로리로부터 UreA 및 UreB를 발현시키는 쥐티푸스균 SL3261(pYZ97)로 면역된 마우스.
실시예 4
헬리코박터 필로리 마우스 모델에서 ureA/ureB 서브유니트를 발현시키는 다양한 재조합 쥐티푸스균 균주에 의한 보호 실험.
실험용 헬리코박터 필로리 균주의 설명
하스(Hass) 등의 발명["Verfahren zur Identifizierung sekretorischer Gene aus Helicobacter pylori"; PCT/EP96/02544]에 기술된 바와 같이 TnMax5 미니-트랜스포슨을 사용하는 트랜스포슨 셔틀 뮤타게네시스에 의해 발생된, 우레아제 결핍 헬리코박터 필로리 P11 균주는 P1의 유도체이다. TnMax5의 삽입부를 ureA 유전자의 3'-말단에서 맵핑시켜서 양 유전자의 전사 커플링으로 인한 ureA 및 ureB의 결함 발현을 생성시켰다.
마우스 적합된 헬리코박터 필로리 P49 균주는 고양이과 단리물로부터 제이. 지. 폭스(J. G. Fox) 박사(매사추세츠 보스턴의 MIT)에 의해 처음으로 생성되었다. 헬리코박터 필로리 P76 균주는 문헌[P. Nedenskov-Sorensen (1990, J. Infect. Dis. 161:365-366]에 기술된 바와 같이 스트렙토마이신 내성 헬리코박터 필로리 균주 NCTC11637로부터 염색체 DNA와의 동종 재조합에 의해 발생된 P49의 스트렙토마이신 내성 유도체이다.
적합한 경우에 200㎍/ml의 스트렙토마이신이 보충된 혈청 플레이트상에서, 미호기적 분위기(5% O2, 85% N2및 10% CO2), 37℃에서 모든 헬리코박터 필로리 균주를 배양하였다[참고문헌: Odenbreit, S. et al., 1996. J. Bacteriol. 178:6960-6967].
마우스에 의한 예방 면역 실험.
헬리코박터 필로리에 의한 위 콜로니화로부터 마우스를 보호하는 살모넬라에 의해 전달된 UreA 및 B의 능력을 시험하기 위해 면역 실험을 수행하였다. 전체적으로, 5개의 독립적인 면역 실험을 수행하였다. 각각의 실험은 5마리의 마우스를 각각 갖는 5개 그룹으로 구성하여 수행하였다: (1) 음성 대조군은 살모넬라에 의해 면역되거나 야생형 헬리코박터 필로리 P49 또는 스트렙토마이신 내성 유도체 균주 P76에 의해 감염되지 않은 마우스이고; (2) PBS 대조군은 PBS를 수용하면서 헬리코박터 필로리에 의해 구강으로 감염된 면역되지 않은 마우스이고; (3) 살모넬라 대조군은 약독화 쥐티푸스균 SL3261 균주에 의해서만 면역되고 헬리코박터 필로리에 의해 감염된 마우스이고; (5) 백신 그룹은 UreA 및 UreB를 발현시키는 적합한 재조합 쥐티푸스균 구성물(A+B)에 의해 면역되고 헬리코박터 필로리에 의해 감염된 마우스이다.
마우스를 면역시키기 전에 고형의 먹이 없이 밤새, 그리고 물 없이 4시간 동안 방치시켰다. 위의 pH를 중성화시키기 위해 스테인레스강 카테테르 튜브를 사용하여 3% 중탄산나트륨 100㎕를 구강으로 투입하였다. 위를 중성화시킨 후 곧바로, PBS 대조군으로부터의 마우스는 100㎕ PBS를 수용하였고, 살모넬라 대조군 및 살모넬라 백신 그룹으로부터의 마우스는 100㎕의 전체 용적중에 각각 5.0×109CFU의 쥐티푸스균 균주 SL3261 및 다양한 재조합 구성물을 수용하였다. 면역시킨 후 마우스에게 다시 물과 먹이를 공급하였다.
구강 면역 4주 후, PBS 대조군, 살모넬라 대조군 및 백신 그룹을 헬리코박터 필로리 1.0×109CFU에 의해 감염시켰다. 감염시키기 전에, 마우스를 고형의 먹이 없이 밤새, 그리고 물 없이 4시간 동안 방치하였다. 스테인레스강 카테테르 튜브를 사용하여 3% 중탄산나트륨 100㎕를 구강으로 투입한 후, 1.0×109CFU/ml 경구 용량의 헬리코박터 필로리 균주 P49 또는 P76을 투입하였다.
실시예 5
헬리코박터 필로리 마우스 모델에서 ureA/ureB 서브유니트를 발현시키는 다양한 재조합 쥐티푸스균 균주에 의한 보호 실험의 면역학적 분석
혈청학적인 분석을 위해 마우스로부터 혈액 및 장액 채취.
혈청 및 장액을 사용하여 모든 마우스로부터 항체 반응을 평가하였다. 면역전에 및 면역 3주 후에, 헬리코박터 감염전에 150㎕의 혈액을 역궤도로 채취하였다. 메톡시플루오란 마취제하에서 심장 말단의 뚫린 구멍에 의해 살모넬라 면역 11주 후(감염 6주 후) 최종 출혈을 수행하였다. 실험이 거의 끝나갈 무렵에 마우스로부터 작은 창자를 취하고 약간의 변형된 형태로 상기된 바와 같이 처리하였다[참고문헌: Elson, C. O. et al 1984. J. Immunol. Meth. 67:101-108]. 요약하면, 0.1mg/ml 대두 트립신 억제제(시그마(Sigma))를 함유하는 50mM EDTA pH 7.5(라이에델(Riedel)) 2ml를 통과시킴으로써 장의 내용물을 제거하였다. 0.15M NaCl을 사용하여 용적이 5ml가 되게 하였다. 샘플을 격렬하게 교반하고, 2,500rpm(독일 헤라에우스(Heraeus))으로 10분 동안 원심분리하고, 상청액에 95% 에탄올중의 100mM 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)(세르바(Serva)) 50㎕를 보충한 후 4℃에서 20분 동안 13,000rpm(헤르메스)으로 원심분리하였다. 상청액에 100mM PMSF 50㎕ 및 2% 아지드화나트륨(머크) 50㎕를 보충하고 얼음상에서 15분 동안 방치한 후 7% 우혈청 알부민(바이오몰(Biomol)) 250㎕를 첨가하였다. 샘플을 추가로 사용할 때까지 -20℃에서 동결시켰다.
ELISA에 의한 마우스 혈청 및 장 점막내 안티-우레아제 항체의 분석
살모넬라에 의한 구강 면역은 IgA 항체 반응을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 쥐티푸스균 구성물 A+B에 의해 면역된 마우스 및 대조군 마우스의 우레아제 서브유니트에 대한 IgA 반응을 ELISA에 의해 평가하였다. 45초 동안 5초 간격(35% 펄스)으로 소니퍼(코네티컷 데인베리 브란손(Branson))로 5회 초음파처리함으로써 가용성의 추출물인 헬리코박터 필로리 P1 및 이의 우레아제 결핍 변이성 유도체 균주 P11을 포스페이트-완충액-염수중에서 제조하였다. 이 현탁액을 4℃에서 10분 동안 13,000rpm(독일 헤라에우스)으로 원심분리하여 손상되지 않은 세포를 제거하였다. 바이오래드(BioRad) 킷을 사용하여 단백질 함량을 결정한 다음 상청액을 항원으로 사용하였다. 96웰 마이크로역가판(독일 눈크(Nunc))을 pH 9.6의 나트륨 탄산염-중탄산염 완충액중의 50㎍/ml의 항원 분취액 50㎕로 피막처리하고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 웰을 실온에서 45분 동안 Tris-완충액-염수(TBS) 중의 1.0(w/v)% 비지방성 우유에 의해 블로킹시키고, TBS-0.05% Tween-20으로 세 번 세척하였다. 3중으로 수행된 검정은 웰에 첨가된 0.5(w/v)% 비지방성 우유-TBS중에서 각각 1:100 또는 1:2로 희석되고 4℃에서 밤새 방치된 혈청 또는 소화관 세척액 50㎕를 사용하였다. 그런 다음, 웰을 TBS-0.05% Tween 20으로 세 번 세척하고, 염소 항마우스 IgA 양고추냉이 페록시다아제-컨쥬게이트(시그마)의 1:3000 희석액을 모든 웰에 첨가하고 4℃에서 밤새 방치하였다. 과산화수소 및 아세트산나트륨 완충액중의 오르토페닐렌디아민으로 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시킴으로써 색상 반응을 전개하였다. 반응을 10N H2SO4로 중지시키고 ELISA 판독기(오스트리아 이시스 하이테크 게엠베하(Asys Hitech GmbH) 디기스캔(Digiscan))에서 A492를 결정하였다.
점막 항체 : (구성물 A) 실험의 막바지(헬리코박터 필로리 감염 6주 후)에 희생된 각각의 마우스로부터 장액을 취하고, 헬리코박터 필로리 야생형(P1) 및 우레아제 결핍 변이성 균주(P11)의 전체 세포 추출물을 사용함으로써 안티-우레아제 항체의 존재에 대하여 시험하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 야생형 헬리코박터 필로리 추출물에 대한 IgA 항체 반응은 비면역되거나 천연 마우스에 대하여 면역된 마우스에서 약 10배 더 높았다. 우레아제 결핍된 헬리코박터 필로리 변이체에 대한 점막 IgA 항체 반응은 모든 마우스 그룹에서 매우 낮았으며, 이는 면역된 마우스에서 대부분의 장 IgA 항체 반응이 우레아제에 대하여 유도된다는 것을 나타낸다.
혈청 항체 : (구성물 A) 야생형 및 우레아제 결핍된 헬리코박터 필로리에 대한 혈청 IgA 항체의 수준을 면역 전에, 면역 3주 후(감염전) 및 면역 10주 후(헬리코박터 필로리에 의한 감염 6주 후)에 조사하였다. 도 5의 패널 A에 도시된 바와 같이, 우레아제 발현하는 쥐티푸스균 구성물 A로 면역시킨 마우스에서의 안티-야생형 헬리코박터 필로리 항체의 수준은 사전 면역 혈청에 관하여 면역시킨 3주 후에 ~20배 및 10주 후에 34배 더 높았다. 3주 및 10주에 우레아제 결핍된 헬리코박터 필로리 균주에 대한 혈청 IgA 항체 반응은 살모넬라 구성물 A로 면역시킨 마우스를 포함하여 모든 마우스 그룹에서 낮았으며(도 5의 패널 B 참조), 이는 면역된 마우스에서 대부분의 IgA 항체 반응이 우레아제 서브유니트에 대하여 유도됨을 나타낸다. 야생형 헬리코박터 필로리에 대한 낮은 항체 반응은 비면역된 마우스에서 10주에 또한 관찰되었으며, 이는 3주 전에 된 헬리코박터 필로리 감염이 이들 마우스에서 특정의 항체 반응을 유도하는데 충분하다는 것을 시사한다. 쥐티푸스균 SL3261로 3주 동안 면역된 마우스에서의 야생형 헬리코박터 필로리에 대한 IgA 반응은 알맞게 증가하였는데, 이는 헬리코박터 필로리에 대하여 가교반응하는 항체를 유도할 수 있는 살모넬라에 항원이 존재한다고 설명될 수 있다. 이와는 대조적으로, 면역된 마우스에서 우레아제 결핍 헬리코박터 필로리 균주에 대한 항체 반응은 비면역된 마우스의 항체 반응 만큼 낮았다(도 5의 페널 B 참조). 이러한 결과는 면역된 마우스에서 관찰된 대부분의 항체 반응이 우레아제에 대한 것이었음을 나타낸다. 우레아제 네거티브 변이체에 대하여 낮은 항체 반응은 PBS가 주어지거나 쥐티푸스균 SL3261로 면역된 10주 된 마우스의 혈청에서 관찰되었는데, 이는 관찰된 항체 반응이 감염 동안 3주 전에 이들 마우스에게 제공된 헬리코박터 필로리 항원에 대한 특정의 면역 반응으로 인한 것이라는 것을 시사한다. 우레아제 결핍 헬리코박터 필로리 균주에 대한 낮은 항체 반응이 우레아제를 발현시키거나 발현시키지 않은 살모넬라로 면역된 마우스에서 3주에 관찰되었지만, PBS 제공된 마우스에는 없었다. 이것은 살모넬라로부터의 단백질과 헬리코박터 필로리 사이에 가교반응하는 에피토프가 각각 존재한다는 것을 확신시킨다. (구성물 B): 일련의 구성물 B로 면역된 마우스의 혈청학적인 분석은 유사한 결과를 달성하였으며, 이는 재조합 살모넬라에 의해 항원의 보다 많은 생성이 항체 반응을 상당히 증가시키지 못한다는 것을 나타낸다.
면역블로팅에 의한 마우스내 안티-우레아제 항체의 분석
헬리코박터 필로리에 대한 마우스의 특이적 면역 반응의 유도에 필요한 쥐티푸스균으로부터 UreA 및 UreB의 발현을 분석하였다. 살모넬라 구성물 A로 면역된 마우스와 대조군 마우스의 혈청내에 안티-UreA 및 안티-UreB 항체를 조사함으로써 UreA 및 UreB의 생체내 발현을 확인하였다. 헬리코박터 필로리 전체 항원을 야생형 헬리코박터 필로리 균주 P1으로부터 제조하였다. 박테리아를 3개의 혈청 플레이트로부터 회수하고, PBS중에서 재현탁시키고, 5,000g에서 10분 동안 원심분리함으로써 배양하였다. 세포 펠릿을 10mM Tris-HCl 및 10mM EDTA (pH 8.0)중에서 재현탁시키고, 모든 프로프에서 세포 밀도를 표준 A590=1.0으로 조정하였다. 박테리아 현탁액을 동일 용적의 SDS-샘플 완충액(샘브룩(Sambrook), 1989)과 혼합시키고, 5분 동안 비등시켰다. 펠릿 20㎕를 SDS-10% 폴리아크릴아미드겔로 로딩시켰다. 단백질을 니트로셀룰로오스막으로 전기 블로팅시키고, 10 (v/w)% 비지방성 우유 Tris-완충액-염수(TBS)(TrisHCl 100mM, NaCl 150mM, pH 7.2)중의 실온에서 45분 동안 블로킹시킨 스트립내로 커팅시켰다. TBS-0.05 (v/v)% Tween-20중에서 세 번 세척한 후, 5 (w/v)%의 비지방성 우유-TBS중의 1:80으로 희석된 마우스 혈청을 스트립에 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 비면역된 및 살모넬라로 면역된 마우스로부터 혈청을 수득하였다. 세 번의 세척후에, 5 (w/v)%의 비지방성 우유-TBS중에서 1:3000으로 희석된 염소 항마우스 IgG 양고추냉이 페록시다아제 컨쥬게이트(시그마)로 스트립을 인큐베이션시켰다. ECL 화학발광 검출 킷(독일 아메르샴)을 사용하여 공급업자의 사용법에 따라 블롯을 전개하였다.
헬리코박터 필로리로의 감염전에 면역 3주 후에 면역된 및 비면역된 마우스로부터 혈청을 수득하고 UreA 및 UreB를 발현시키는 야생형 헬리코박터 필로리 P1 균주의 전체 세포 용해물에 대하여 시험하였다. UreA 및 UreB에 각각 상응하는 67kDa 및 30kDa 크기의 단백질은 구성물 A로 면역된 면역 마우스로부터 혈청에 의해 인지되었다. 이들 밴드는 비면역된 마우스 또는 단지 살모넬라만으로 면역된 마우스로부터의 혈청에 의해 시험된 스트립에서는 관찰되지 않았으며, 이는 살모넬라 백신 균주에 의해 발현된 우레아제가 야생형 헬리코박터 필로리 균주의 UreA 및 UreB 둘 모두에 대하여 특이적 항체 반응을 유도할 수 있다는 것을 시사한다. 구성물 B에서도 유사한 결과를 얻었다.
실시예 6
헬리코박터 필로리 마우스 모델에서 UreA/UreB 서브유니트를 발현시키는 다양한 재조합 쥐티푸스균 균주로 사전 처리된 마우스에서의 헬리코박터 필로리 콜리니화의 결정
위를 처리하고 우레아제 활성을 측정.
우레아제 시험 : 마우스 위의 강 부분에서 우레아제 활성을 시험함으로써 헬리코박터 필로리에 의한 위 콜로니화에 대한 보호 분석을 수행하였다. 우레아제 활성의 측정은 헬리코박터 필로리 감염의 존재에 대해서 시험하는데 매우 신뢰성 있는 민감한 특이적 방법이며[참고문헌: NIH consensus development on Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. 1994. Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. JAMA. 272:65], 임상적 세팅[참고문헌: Kawanishi, M., S. et al 1995. J. Gastroenterol. 30:16-20; Kamija, S. et al 1993. Eur. J. Epidemiol. 9:450-452; Conti-Nibali, S. et al 1990. Am. J. Gastroenterol. 85:1573-1575] 및 동물 연구[참고문헌: Gottfried, M. R. et al 1990. Am. J. Gastroenterol. 85:813-818]에서 통상적으로 사용된다. 공급업자의 설명서에 따라서 자트록스-시험(독일 베이테르스타츠 룀-파르마 게엠베하(Rohm-Pharma GmbH))을 사용하였다. 살모넬라에 의한 면역 11주 후, 마우스를 희생시키고 무균 조건하에서 위를 조심스럽게 제거하였다. 위를 살균 용기중의 얼음같이 차가운 PBS 내에 위치시키고, 살균 블레이드로 소수 만곡부를 따라 절개함으로써 점막을 노출시켰다. 위를 PBS로 세척하여 잔류 음식물을 제거하고, 절개하여 신체 영역으로부터 강 영역을 분리하였다. 위의 강 부분의 절반을 곧바로 자트록스-시험으로부터 우레아제 기질 500㎕를 함유하는 에펜도르프 튜브내에 위치시켰다. 위의 샘플을 실온에서 4시간 동안 인큐베이션시키고 550nm에서의 흡광도(A550)를 측정하였다. 면역되거나 감염되지 않은 천연 마우스의 위로부터 얻은 우레아제 활성값을 사용하여 기준선을 결정하였다. 기준선은 시험된 5마리의 천연 마우스 위 플러스 이러한 평균의 표준편차의 2배의 평균적인 우레아제 활성값에 상응하였다. 기준선보다 우레아제 활성값이 높으면 헬리코박터 필로리 콜로니화는 양의 값으로 간주되고, 기준선보다 값이 낮으면 헬리코박터 필로리 콜로니화는 음의 값이라고 간주되었다.
배양 실험 : 스트렙토마이신 내성 헬리코박터 필로리 균주 P76에 의해 감염된 마우스로부터 수득된 위의 강 영역의 나머지 부분을 200㎍/ml의 스트렙토마이신이 보충된 혈청 플레이트상에 위치시키고 표준 조건하에서 인큐베이션시켰다. 3일 동안 인큐베이션시킨 후, 콜로니 형태학, 현미경 검사, 및 우레아제 활성에 기초하여 헬리코박터 필로리로서 박테리아를 동정하였다. 플레이트상에서 성장시킨 헬리코박터 필로리의 콜로니 형성 유니트(CFU)의 수는 각각의 마우스의 위 샘플로부터 결정하였다.
우레아제 시험 (구성물 A 대 B) : 살모넬라 ~5.0×109CFU로 면역시키고 헬리코박터 필로리 균주 P49 1.0×109CFU로 감염시킨 마우스, 및 대조군 마우스를 마취제 하에서 희생시키고 우레아제 활성을 측정하기 위해 위의 강 영역의 일부를 채취하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 살모넬라 구성물 A에 의해 전달된 UreA 및 B로 면역된 100%의 마우스는 기준선보다 낮은 우레아제 활성을 지녔으며, 이는 헬리코박터 필로리 콜로니화가 없음을 나타낸다. 이와는 대조적으로, 비면역된 100%의 마우스 및 쥐티푸스균 균주 SL3261로 면역된 마우스는 기준선보다 훨씬 높은 우레아제 활성을 지녔으며, 이는 헬리코박터에 의한 위 콜로니화가 있음을 나타낸다. 면역되거나 감염되지 않은 천연 마우스 그룹을 사용하여 우레아제 활성의 기준을 삼았다.
일련의 구성물 B의 살모넬라는 기준선보다 높은 우레아제 활성값을 지녔으며, 이는 헬리코박터 감염 균주에 의해 위가 콜로니화됨을 됨을 나타낸다. 그러나, 이러한 그룹내에서의 우레아제 활성은 대조군에서와 같이 낮았으며, 이는 일련의 살모넬라 구성물 B로 면역된 마우스의 부분적인 보호 상태를 나타낸다(도 6 참조). 살모넬라 구성물, A 및 B 둘 모두 유사한 항체 반응을 매개하지만, UreA 및 UreB의 발현에 있어서는 차이가 난다. 본 발명자들은 이로부터 발현된 우레아제 항원의 양이 최적의 보호를 얻는데 관련하고 있다고 결론을 내린다.
구성물 A : 우레아제 활성과 헬리코박터 필로리에 의한 위 콜로니화를 관련시키기 위해서, 마우스를 살모넬라 구성물 A로 구강으로 면역시키고 이들을 스트렙토마이신 내성 헬리코박터 P76 균주에 의해 감염시킴으로써 새로운 보호 실험을 수행하였다. 우레아제 활성값은 동정된 헬리코박터 필로리의 CFU의 수와 관련하였다. 우레아제 발현 살모넬라로 면역된 5마리의 마우스 중 2마리의 마우스에서, 어떠한 헬리코박터 필로리 CFU도 검출되지 않았으며 면역된 5마리 마우스 모두에 있어서의 CFU의 평균수는 단지 62였다. 이와는 대조적으로, 비면역된 마우스에서 CFU의 수는 2,737이었으며, 상기 수는 44배 더 높은 콜로니화에 상응한다. 이들 데이터는 우레아제 발현 살모넬라로 면역된 마우스가 마우스 위로부터 콜로니화되는 헬리코박터 필로리를 제거하거나 상당히 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
서열목록
(1) 일반적 사항
(i) 출원인:
(A) 성명: 막스-플랑크-게젤샤프트 쭈어 푀르데룽 데어 비쎈샤프텐 에. 파우.
(B) 거리: 호프가르텐슈트라쎄 2
(C) 도시: 뮌헨
(E) 국가: 독일
(F) 우편 번호: 80539
(ii) 발명의 명칭: 헬리코박터 필로리 생백신
(iii) 서열의 수: 6개
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS / MS-DOS
(D)소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 # 1.30
(EPO)
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 1557 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 양형태
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: genomic DNA
(vi) 기원:
(A) 생물명 : 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori)
(vii) 직접적인 기원:
(B) 클론: alpB
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재위치: 1..1554
(xi) 서열 설명 : 서열 번호:1:
(2) 서열번호 2에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 518 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: 단백질
(xi) 서열 설명 : 서열 번호:2:
(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 1557 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 양형태
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: Genomic DNA
(vi) 기원:
(A) 생물명 : 헬리코박터 필로리
(vii) 직접적인 기원:
(B) 클론: alpA
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재위치: 1..1554
(xi) 서열 설명 : 서열 번호:3:
(2) 서열번호 4에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 518 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: 단백질
(xi) 서열 설명 : 서열 번호:4:
(2) 서열 번호 5에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 656 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 2본쇄
(D) 형태: 양형태
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재위치: 567..656
(xi) 서열 설명 : 서열 번호:5:
(2) 서열번호 6에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: 단백질
(xi) 서열 설명 : 서열 번호:6:
Claims (16)
- 헬리코박터 항원을 코딩시키는 하나 이상의 이종 핵산 분자를 포함하는 재조합 약독화 세균성 병원체로서, 핵산 분자를 발현시킬 수 있거나 표적 세포내에서 핵산 분자의 발현을 야기시킬 수 있는 병원체.
- 제 1항에 있어서, 장내 박테리아 세포, 특히 살모넬라 세포임을 특징으로 하는 병원체.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 살모넬라 아로(aro) 변이성 세포임을 특징으로 하는 병원체.
- 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 헬리코박터 항원이 우레아제, 우레아제 서브유니트, 이들의 면역학적 반응성 단편, 또는 이들의 펩티드 미모토프임을 특징으로 하는 병원체.
- 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 헬리코박터 항원이 헬리코박터로부터의 분비성 폴리펩티드, 이들의 면역학적 반응성 단편, 또는 이들의 펩티드 미모토프임을 특징으로 하는 병원체.
- 제 1항 내지 3항 및 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 헬리코박터 항원이 항원 AlpA, AlpB, 이들의 면역학적 반응성 단편, 및 이들의 펩티드 미모토프로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 병원체.
- 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 헬리코박터 항원을 코딩시키는 핵산 분자가 페이즈 가변적으로 발현될 수 있음을 특징으로 하는 병원체.
- 제 7항에 있어서, 헬리코박터 항원을 코딩시키는 핵산 분자가 병원체에서 실질적으로 비활성적이며 병원체에서 핵산 재구성 메카니즘에 의해 야기된 핵산 재구성에 의해 활성화될 수 있는 발현 시그날의 조절하에 있음을 특징으로 하는 병원체.
- 제 8항에 있어서, 발현 시그날이 박테리오파지 프로모터이며, 활성화가 병원체에서 상응하는 박테리오파지 RNA 폴리머라아제를 생성시키는 DNA 재구성에 의해 야기됨을 특징으로 하는 병원체.
- 제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역조절성 폴리펩티드를 코딩시키는 하나 이상의 제 2 핵산 분자를 추가로 포함하며, 상기 제 2 핵산 분자를 발현시킬 수 있음을 특징으로 하는 병원체.
- 임의의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 및 보조제와 함께, 활성화제로서 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 따른 재조합 약독화 병원체를 포함하는 약제 조성물.
- 제 11항에 있어서, 생백신이며, 점막 표면에 또는 비경구 경로를 통해 투여하기에 적합한 약제 조성물.
- 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 및/또는 보조제와 함께 약제학적 유효량의 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 따른 약독화 병원체를 제형화시키는 것을 포함하여, 생백신을 제조하는 방법.
- a) 헬리코박터 항원을 코딩시키는 핵산 분자를 약독화 병원체내로 삽입시켜, 핵산 분자를 발현시키거나 표적 세포내 핵산 분자의 발현을 야기시킬 수 있는 재조합 약독화 병원체를 수득하는 단계;b) 적합한 조건하에서 재조합 약독화 병원체를 배양하는 단계를 포함하여, 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 따른 재조합 약독화 병원체를 제조하는 방법.
- 제 14항에 있어서, 헬리코박터 항원을 코딩시키는 핵산 분자가 염색체외 플라스미드에 위치하거나 염색체내에 삽입됨을 특징으로 하는 방법.
- a) 약독화 병원체에서 헬리코박터의 발현 유전자 뱅크(gene bank)를 제공하는 단계;b) 포유동물 숙주에서 헬리코박터 감염에 대한 보호 면역성을 제공하는 유전자 뱅크의 클론의 능력에 대해서 스크리닝하는 단계를 포함하여, 포유동물 숙주에서 보호 면역 반응을 향상시키는, 헬리코박터 항원을 동정하는 방법.
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