KR20040094118A

KR20040094118A - 효모에서 악티노바실러스 플루로뉴모니애의 재조합ＡｐｘⅡＡ 독소 단백질을 제조하는 방법 및사료첨가제로서의 이의 용도

Info

Publication number: KR20040094118A
Application number: KR1020030028073A
Authority: KR
Inventors: 유한상; 신성제; 양문식; 장용석; 김대혁
Original assignee: 유한상; 장용석; 양문식; 김대혁
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2003-05-01
Publication date: 2004-11-09
Also published as: KR100465347B1

Abstract

본 발명은 돼지 흉막 폐렴(Haemophilus pleuropneumonia) 원인균인 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 ApxIIA 독소 단백질을 발현하는 벡터 YEpGPD-TER-apxIIA 및 상기 벡터를 형질전환시킨 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 제공한다. 또한, 본 발명은 형질전환된 효모를 배양 배지에서 배양하여 ApxIIA 독소 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 돼지 흉막 폐렴의 ApxIIA 독소 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 돼지 흉막 폐렴균에 대한 면역원성 및 방어 면역 능력을 갖는 상기 방법으로 제조된 ApxIIA 독소 단백질을 제공한다. 이러한 ApxIIA 독소 단백질을 발현하는 효모는 돼지 사육을 위한 사료첨가제로 사용되어 흉막 폐렴에 대한 면역원성을 돼지에게 제공할 수 있을 것이다.

Description

효모에서 악티노바실러스 플루로뉴모니애의 재조합 ＡｐｘⅡＡ 독소 단백질을 제조하는 방법 및 사료첨가제로서의 이의 용도 {Preparation method of recombinant ApxIIA toxin protein of Actinobacillus pleuropneumoniae in Yeast and use thereof as feedstuff additive}

파스퇴렐라세애(Pasteurellaceae) 과의 하나인 돼지 흉막 폐렴균 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae; APP)에 의해 발생하는 돼지 흉막 폐렴은 전염성, 섬유소성, 출혈성 그리고 괴사성의 폐 손상이 발생하는 질병이다. 또한, 급성으로 발생할 경우 돼지에서 이환율과 사망률이 매우 높으며, 출혈성, 괴사성 폐렴과 섬유소성 흉막염이 주특징인 질병이다.

APP 전염은 주로 공기를 통해서 돼지 대 돼지의 직접적인 접촉이나 근거리에서의 비말(droplet)에 의해 일어난다. APP는 일반적으로 기관 및 기관지를 통해서 직접적으로 폐포로 들어가는 것으로 알려져 있다. 돼지 흉막 폐렴의 임상적 증상은 동물의 면역성, 환경적 스트레스 또는 감염체에 대한 노출 정도에 따라서 다양할 수 있다. 임상적 경과는 심급성(peracute), 급성 또는 만성적일 수 있다. 심급성 상태에서는, 강한 염증성 반응과 출혈, 부종 및 섬유성 석출(fibrinous exudation)이 일어난다. 급성 상태에서는, 폐 실질조직 및 흉막강에서의 광범위한 출혈 및 섬유성 석출이 일어나며 이는 섬유성 흉막염 및 24 내지 48시간 내에 동물의 치사를 유발하는 출혈성 괴사 폐렴으로 정의된다. 이러한 질병으로부터 살아남은 돼지는 병원균의 보균체가 되어 폐 괴사, 혹 및 흉막강에서의 섬유성 점착 같은만성적인 손상을 야기한다. 또한, 만성형으로 진행되는 경우에는 폐에 작은 병변만을 나타내지만, 만성 감염된 돈군에서는 증체율의 감소, 낮은 사료 효율성과 출하 지연 등으로 막대한 경제적인 피해를 주는 질병이다. 즉, 돼지 흉막 폐렴은 임상학적 및 경제적으로 양돈 산업에서 매우 중요한 질병이다.

악티노바실러스 속에 속하는 세균은 모두 소위 RTX 독소를 생산한다. 이러한 RTX 독소의 존재는 악티노바이러스 세균의 주요한 병원성 특징이다. RTX 독소는 문헌[Braun et al., Critical Rev. in Microbiol. 18(2): 115-158 (1991)]에 의해 검토된 바 있다. 또한, 그람 음성 균주들의 RTX 독소는 문헌[Welch, R.A., Molecular Microbiology 5/3: 521-528 (1991)] 및 문헌[Welch et al., Inf. Agents and Disease 4: 254-272 (1995)]에서 검토된 바 있다.

모든 공지된 RTX 독소는 몇가지 세포독성 또는 세포용해 활성을 갖는다. 하지만, 독소와 아실화의 차이에 따라 표적 세포 특이성 및 숙주 특이성이 달라지는 것으로 공지되어져 있다[McWhinney et al., J. Bact. 174: 291-297 (1992); and Hackett et al., J. Biol. Chem. 270: 20250-20253 (1995)]. 표적 세포의 차이에 따라, RTX 독소에 속하는 다양한 독소들이 알려져 있고, 헤모리신, 세포용해소 또는 세포 독소가 포함된다. 악티노바실러스 속에는 다수의 여러 종이 포함되며 예를 들면, 악티노바실러스 플루로뉴모니애, 에이. 악티노마이세템코미탄스(A. actinomycetemcomitans), 에이. 수스(A. suis), 에이. 로시(A. rossi), 에이. 에쿨리(A. equuli) 및 에이. 리그니에레시(A. lignieresii) 등이 있다. 이중에서 특히, 악티노바실러스 플루로뉴모니애는 돼지, 말, 소 및 인간의 적혈구에 대해서,토끼와 돼지의 호중구에 대해서, 및 돼지의 폐포 대식세포에 대해 세포독성/세포용해성인 혈청형 의존적 RTX 독소를 생산하는 것으로 공지되어져 있다.

흉막 폐렴균의 병원성은 숙주 환경적 요인, 전염원과 관련된 여러요소의 다양한 특성을 포함하는 다인자(multifactorial diseases)에 의하여 발생하는 질병이다. 본 질병의 원인체인 APP는 RTX(Repeats in Toxins) 독소군에 속하는 Apx 독소를 포함한 많은 병원성 인자들을 생성한다. 흉막 폐렴의 병원성에 있어서 Apx 독소의 중요성은 자발적으로(spontaneous) 또는 화학적으로(chemically) 유도되거나, 트랜스포존(transposon)을 이용한 돌연변이체 (mutants)등을 이용한 여러 가지 방법을 통하여 규명되어졌다[Anderson C et al., Infect. Immun. 59: 4110-4116 (1991); and Frey J, Trends Microbiol. 3: 257-261 (1995); and Fuller TE et al., Micro. Patho. 29:39-52 (2000); and Prideaux CT et al., Infect. Immun. 67:1962-1966 (1999); and Reimer D et al., Micro. Patho. 18:197-209 (1995); and Tascon RV et al., Mol. Microbiol. 14:207-16 (1994)]. 현재까지, 이들 독소는 ApxI, ApXII, ApxIII 그리고 ApxIV의 네 가지가 밝혀져 있으며, 원인균은 협막 다당체(capsular polysacchride)에 따라서 15가지 혈청형이 밝혀졌으며, 이들 세포 독소의 생성은 혈청형에 따라서 다양하게 분비되며, 이들 혈청형의 분포는 지역에 따라 차이를 보이고 있다. 한국에서 가장 유행하는 혈청형은 2형, 5형 그리고 6형의 순서이다. 비록 흉막 폐렴균의 병원성이 다양하지만, 많은 연구들이 가장 강한 병원성을 나타내는 ApxI과 ApxII의 독소를 생산하는 혈청형과 밀접하게 연관되어 있음을 지적하고 있다. ApxI은 강한 용혈 작용을 나타내는 반면, ApxII는 상대적으로 낮은 용혈 작용을 보이나 두 독소 모두 다른 유형과 다른 종의 세포에 대하여 활발한 세포 독성을 가지고 있다. 이에 반하여, ApxIII는 용혈작용은 없으나 돼지 폐포 대식세포와 호중구를 포함한 세포에 세포독성을 가지고 있다. 그러나, 모든 혈청형에서 분비되는 ApxIV의 병원성과 관련된 역할은 아직까지도 명확하게 밝혀지지 않았다. 또한, 현재까지 Apx 독소들을 모두 분비하는 혈청형은 확인되지 않았으며 ApxII는 혈청형 10형을 제외한 모든 혈청형에서 생산된다.

활성을 가진 RTX 독소의 생성과 분비는 적어도 네 가지 유전자 (apxC, -A, -B 그리고 -D)가 필요하다.apxA 유전자는 구조 독소를 암호화하며,apxC 유전자는 지방 아실 그룹을 아실 캐리어(acyl carrier) 단백질에서 구조 독소로 옮기는 역할을 하는 해독후 활성화인자(postranslational activator)를 암호화한다. ApxA가 활성화되기 위해서는 목표가 되는 세포와의 결합이 필수적인데, 이는apxC에서 생성된 물질들에 의한다.apxB와apxD 유전자는 활성화된 독소의 분비를 위하여 필요한 단백질을 암호화한다.

돼지 흉막 폐렴의 예방 및 치료는 항생제를 이용한 치료, 백신 그리고 사양관리를 통하여 주로 이루어진다. 현재까지, 돼지 흉막 폐렴에 대한 백신은 약독화된 균체 배양액 또는 배양 상층액을 백신으로 사용하거나, 흉막 폐렴균의 여러 가지 구성 물질에 기초를 둔 박테린(bacterin)이나 서브유니트(subunit) 백신을 이용하고 있다. 박테린을 이용한 백신의 실험적인 결과는 단지 백신의 물질과 동일 혈청형에 대해서만 방어력을 나타내었다. 즉, 불활성화된 세균을 포함하는 백신, 또는 외막 단백질, 리포폴리사카라이드 또는 캡슐을 포함하는 서브유니트 백신을 사용하는 경우에는 질병 또는 보균 상태로부터 완전한 방어를 달성할 수 없는 것으로 알려져 있다.

이와 대조적으로, 자연 감염 후 회복한 돼지에서는 여러 가지 혈청형에 대한 자연적 재감염에 대하여 예방할 수 있었다. 이는 방어 면역(protective immunity)에서 Apx 독소의 특별한 중요성을 나타내며 이러한 것들은 위에서 언급한 돌연변이 균주를 이용한 실험에서도 증명되었다.

비록 지속적, 혹은 간헐적인 항생물질의 치료를 통한 예방이 수행되고 있지만, 이러한 치료는 질병의 급성 발생에서 효과적일 수 있다. 그러나 이러한 방법은 항생제 내성 균주의 발생을 유도하고 만연하게 할 수 있다. 현재 사용중인 백신접종법은 백신의 부작용과 백신 접종 과정의 노동 집중적 영향, 보균자를 증가시키는 문제 등 아직까지 많은 문제점들을 가지고 있다. 따라서, 자연 감염 후 회복에 의한 면역화 방식과 유사하게 다양한 혈청형에 대해 면역화를 달성할 수 있는 Apx 독소 단백질을 사용한 또 다른 면역화 방법이 여전히 필요하다.

본 발명은 ApxIIC의 부재하에서는 재조합 ApxIIA 독소 구조 단백질이 그 자체로 세포 독성을 갖지 않기 때문에 재조합 ApxIIA 독소 단백질을 면역원으로서 사용할 수 있다는데 근거를 두고 있다. 따라서, 본 발명은 재조합 ApxIIA 독소 구조 단백질만을 효모(S. cerevisiae)에서 발현시키는 방법을 제공하고, 특히, 원핵 세균성 단백질인 재조합 ApxIIA 독소 구조 단백질을 효모에서 발현을 시키는 경우에도 이의 면역원성 및 방어 면역 능력이 활성적임을 확인하였다. 이러한 방식으로 제조된 재조합 ApxIIA 독소 구조 단백질을 돼지에 대한 사료첨가제로서 사용함으로써 돼지에게 돼지 흉막 폐렴에 대한 면역성을 제공할 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 재조합 ApxIIA 독소 구조 단백질은 이를 생산하는 효모, 이러한 효모의 파쇄물(예를 들면, 초음파 파쇄에 의한) 및 이로부터 부분 정제된 재조합 ApxIIA 독소 구조 단백질 형태로 돼지에 대한 사료첨가제로서 제공할 수 있다. 효모는 이. 콜라이와는 다르게, 그 자체로서 공급해도 독성 등의 문제를 발생하지 않기 때문에, 재조합 ApxIIA 독소 구조 단백질을 함유하는 비정제된 효모 그 자체를 사용할 수도 있는 장점을 갖는다. ApxIIA 독소 구조 단백질을 발현하는 이. 콜라이를 사료첨가제로 사용하는 경우에는 여러 가지 문제점이 있을 수 있다.

이. 콜라이는 장내 세균으로 수백만 마리가 우리의 장에 존재하고 있으며, 장내에서 음식물의 소화를 돕거나, 몇몇 필요한 비타민을 만들기도 한다. 그러나, 병원성을 나타낼 경우, 요도감염증이나 패혈증 및 뇌막염을 일으키며, 상처난 곳에 감염증을 유발한다. 장관계에서 감염증을 일으키는 대장균은 외부에서 침입된 세균이고, 장관내에서 상주하고 있는 대장균과는 다르다. 장관독성 대장균은 특히 독소(enterotoxin)를 만들어 설사를 일으킨다.

이와는 다르게, 효모는 다양한 방식으로 경구 투여할 수 있다. 예를 들면, ApxIIA 독소 구조 단백질을 발현하는 효모는 돼지 사료에 첨가되는 사료 첨가제로서 사료와 함께 돼지에게 경구 투여함으로써 면역원성 및 방어 면역 효과를 제공하는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 본 발명에 따른 ApxIIA 독소 구조 단백질을 함유하는 효모를 돼지 사육용 사료첨가제, 즉 효모제로서 사용하는 것은 통상적인 효모제의 사용 방법과 동일하게 적용할 수 있다. 현재 돼지 사육용 사료첨가제로서 사용되는 효모제(yeast additive)로서 주로 사용되어지는 것은 사카로마이세스 종(Saccharomyses spp.)으로, 특히 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyses cereviseae)가 사용되고 있다. 효모제의 작용 메카니즘은 불분명하지만 생균제에 비해 일반적인 효모제가 가지는 우수성은 pH에 강해 장까지 살아서 이동하는 비율이 높고 호기성, 혐기성에 모두 강해 환경적 요인에 강하다는 것이다. 또한, 효모는 가축에게 급여시 사료의 풍미 개선 효과와 단백질 공급원으로서 이용성이 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 효모의 세표벽에는 β-글루칸(glucan), α-만난(mannans) 등을 분해하기 위해 아미사제(amysase), 프로테아제(protease) 등의 효소가 방출되어, 사육 가축의 증체량 및 사료 효율을 개선시키는 것으로 공지되어져 있다. 따라서, 돼지 사육용 사료첨가제로서의 일반적인 효모제의 용도에 부가하여, 본원 발명의 재조합 ApxIIA 독소 생산 효모를 사용함으로써, 돼지 흉막 폐렴에 대한 면역원성 부여 및 방어 면역 효과를 기대할 수 있을 것이다.

본 발명은 효모에서 돼지 흉막 폐렴 원인균인 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 ApxIIA 독소 단백질을 발현하는 벡터 YEpGPD-TER-apxIIA를 제공한다.

또한, 본 발명은 YEpGPD-TER-apxIIA 벡터를 형질전환시킨 효모(Saccharomyces cerevisiae) 숙주 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기된 바와 같이 형질전환된 효모 세포를 배양 배지에서배양하여 ApxIIA 독소 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 돼지 흉막 폐렴의 ApxIIA 독소 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 추가로, 상기 방법으로 제조된 재조합 ApxIIA 독소 단백질은 이에 대한 단클론 항체를 사용하여 면역원성을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 흉막 폐렴균 악티노바실러스 플루로뉴모니애에 대한 면역원성 및 방어 면역 능력을 갖는 돼지 흉막 폐렴의 재조합 ApxIIA 독소 단백질을 함유하는 효모를 사료첨가제로서 제공한다.

도 1은 이. 콜라이(E. coliM15)에서 발현된 ApxIIA 독소 단백질에 대한 분석 사진이다. 왼쪽 패널은 SDS-PAGE 결과를 나타내며, 오른쪽 패널은 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다.

도 2는 효모(S. cerevisiae)에서 발현시키기 위하여apxIIA를 클로닝시킨 YEpGPD-TER-apxIIA 발현 벡터의 모식도이다.

도 3은 효모(S. cerevisiae2805)에서 발현된 ApxIIA 독소 단백질에 대한 분석 사진이다. 왼쪽 패널은 SDS-PAGE 결과를 나타내며, 오른쪽 패널은 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다.

도 4는 이. 콜라이(E. coli) 및 효모(S. cerevisiae)에서 발현된 ApxIIA 독소로 면역된 마우스에 대한 돼지 흉막 폐렴균(A. pleuropneumoniae) 야외분리주를 사용한 공격 접종 후 생존율을 비교한 그래프이다.

도 5는 ApxIIA 특이적 IgA 항체가에 대한 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 ApxIIA 특이적 IgG 항체가에 대한 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명에서는 하기 용어들이 사용되며 다음과 같은 의미를 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 폴리펩타이드 쇄를 제조하는데 관련되는 DNA의 단편을 의미하고, 이는 암호화 영역 전후의 리더 및 트레일러 영역 뿐만 아니라 각각의 엑손 사이에 개재된 인트론을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도되며, 플라스미드, 파아지 또는 코스미드와 같은 레플리콘으로서, 이에 또 다른 DNA 절편이 부착되어 부착된 절편의 복제를 초래한다. 용어 "레플리콘"은 생체내에서 DNA 복제의 자가 단위로서 작용하는 모든 유전적 인자(예를 들면, 플라스미드, 염색체, 바이러스 등)를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자를 가리킨다. 전형적으로, 유전자 발현은 프로모터, 조직특이적 조절 요소 및 인핸서를 포함한 특정 조절 요소의 조절하에 위치하게 된다. 이러한 유전자는 조절 요소에 작동적으로 연결되는 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역원"은 숙주 면역계를 자극하여 체액성 및/또는 세포성 항원-특이적 반응을 유도하는 하나 이상의 에피토프를 함유하는 분자를 의미한다. 상기 용어는 또한, "항원"과 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 외래 DNA 서열에 의해서 형질전환된 세포 또는 형질전환될 수 있는 세포를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환된"이란, 외래 DNA가 세포막 내부로 도입되는 것을 의미한다. 외래 DNA는 염색체 DNA에 통합되어 세포의 게놈을 구성하거나 통합되지 않을 수 있다. 원핵생물 또는 효모에서, 예를 들면, 외래 DNA는 플라스미드 같은 에피좀 인자에서 유지될 수 있다. 진핵 세포에 있어서는, "안정하게 형질전환된" 세포는 외래 DNA가 염색체내에 통합되어 염색체 복제를 통해서 자손 세포로 유전되는 세포이다. 이러한 안정성은 진핵 세포가 외래 DNA를 함유하는 자손 세포의 집단으로 이루어진 세포주 또는 클론을 확립하는 능력에 의해서 입증된다.

상기된 바와 같이, 용어 "클론"은 단일 세포 또는 일반적인 선조세포로부터 유사분열에 의해서 유도된 세포의 집단을 의미한다. 예를 들면, "세포주"는 수많은 세대 동안 시험관내에서 안정하게 성장할 수 있는 1차 세포의 클론이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 재조합 ApxIIA 독소 단백질을 발현하는 효모를 "사료첨가제"로서 사용한다는 것은 효모제의 일반적인 사료첨가제로서의 용도와상응하며, 다만 상기 효모는 재조합 ApxIIA 독소 단백질을 생산하여 함유하고 있다는 것을 의미한다. 본원에서는, 사료첨가제로서 재조합 ApxIIA 독소 단백질을 함유하는 효모를 돼지에게 급식시키는 것은 재조합 ApxIIA 독소 단백질이 비독성 면역원으로서 작용한다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 재조합 ApxIIA 독소 단백질은 효모 그 자체, 효모 파쇄물 또는 부분적으로 정제된 형태로 사료첨가제로서 공급될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합 ApxIIA 독소 단백질"은 효모에서 발현된 전체 ApxIIA 독소 단백질 형태뿐만 아니라, 악티노바실러스 플루로뉴모니애에 대한 면역원성 및 방어 면역 활성을 갖는 한 이의 변이체 및 변형체를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 변이체에는 치환, 결실, 부가 변이체 등이 포함될 수 있지만, 이로써 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명은 돼지 흉막 폐렴의 원인균인 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 구조 독소인 ApxIIA 단백질을 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 발현시키기 위한 벡터, 이러한 벡터를 형질전환시킨, 독성을 나타내지 않고 돼지 흉막 폐렴에 대한 면역원성 및 방어 면역 능력만을 제공할 수 있는 재조합 ApxIIA 독소 단백질을 발현하는 효모 균주의 제조 방법, 이러한 방법으로 제조된 효모 균주, 이러한 균주로부터 제조된 면역원성 및 방어 면역 활성을 갖는 재조합 ApxIIA 독소 단백질, 및재조합 ApxIIA 독소 단백질을 함유하는 효모, 효모 파쇄물 또는 이로부터 부분 정제된 재조합 ApxIIA 독소 단백질을 사료첨가제로서 사용하는 용도에 관한 것이다.

한 가지 양태에서, 본 발명은 돼지 흉막 폐렴 원인균인 악티노바실러스 플루로뉴모니애의 ApxIIA 독소 단백질을 발현하는 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 원핵생물 및 진핵생물에서 발현시킬 수 있으며, 본 발명은 특히 진핵생물인 효모(S. cerevisiae)에서의 발현을 위한 ApxIIA 독소 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 벡터를 제공한다.

원핵생물, 예를 들면, 이. 콜라이에서의 발현을 위해서는, apxIIA 유전자를 함유하는 DNA 단편은 플라스미드 또는 박테리오파아지 벡터 같은 적합한 재조합 벡터에 클로닝시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 박테리오파아지 람다, pACYC177, pHV14, TOPO 클로닝 벡터, pBluescript IIKS(+), pQE31, pBR322, pAR 시리즈, pIG317, pIG3B, pIG3B-TIK. pKK223-3 및 pUC 시리즈, pET 시리즈, pGEX 시리즈 등과 같은 사용할 수 있는 수많은 가능한 벡터들이 존재하며, 또한 보다 많은 상기 재조합 벡터들을 제작하는 방법들이 존재한다는 것을 인식할 것이다. 본 발명에서는 이. 콜라이에서의 클로닝 및 발현을 위하여 TOPO 클로닝 벡터, pBluescript IIKS(+) 및 pQE31 벡터를 사용하였다.

그러나, 원핵생물, 특히 이. 콜라이에서의 ApxIIA 독소 단백질의 발현은 이. 콜라이 자체의 독성으로 인해 돼지 사육용 사료첨가제로 사용하는데 있어서는 제한될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 이. 콜라이의 유해성은 상기 언급되었다.

진핵생물, 바람직하게는 효모(S. cerevisiae)에서의 발현을 위해서, apxIIA 유전자를 함유하는 DNA 단편은 효모에서 발현가능한 재조합 벡터에 클로닝시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 효모에서의 발현을 위한 YIp5, YCp19, pYES2 시리즈, pYC2, pYC6, YEP, pTEF1을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 사용할 수 있는 수많은 가능한 벡터들이 존재하며, 또한 보다 많은 상기 재조합 벡터들을 제작하는 방법들이 존재한다는 것을 인식할 것이다. 통상적으로는, YEp 벡터가 주로 사용되고 있다. 본 발명에서도, 효모에서 ApxIIA 독소 단백질를 발현시키기 위하여 YEpGPD 벡터에 apxIIA 유전자를 삽입하였다. 즉, 본 발명은 apxIIA 독소 유전자를 갖는 YEpGPD-TER-apxIIA 벡터를 제공한다.

하기 실시예에서 보다 구체적으로 기술되는 바와 같이, 이러한 벡터는 apxIIA 유전자의 5' 및 3'말단 부위를 클레나우 단편으로 평활말단화시킨 후 평활말단 처리된 pBluescript IIKS 플라스미드에 클로닝시킨 후, 이러한 플라스미드로부터 제한효소로 처리하여 apxIIA 유전자를 절단하여 동일한 제한효소 처리한 효모 발현 벡터 YEpGPD 벡터에 결합시켜 제조하였다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 언급된 본 발명에 따라 작제된 YEpGPD-TER-apxIIA 벡터를 형질전환시킨 숙주 세포를 제공한다. 상기 벡터와 같은 작제물의 숙주 세포로의 도입은 일반적으로 인산칼슘 형질감염, LiAc/PEG 방법, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 전기천공법, 형질도입법, 형질감염법, 또는 기타 방법에 의해 수행할 수 있다[참조: Davis, L., et al., Basic Method in Molecular Biology, (1986)].

바람직하게는, 본 발명은 상기 벡터를 형질전환시킨 효모(Saccharomyces cerevisiae) 세포를 제공한다. 본 발명에서는 효모의 형질전환에 LiAc 방법을 사용하였다. 상기 방법은 문헌[Ito H et al., J. Bacteriol. 153:163-168 (1983)]에 공지되어져 있다. 상기 방법으로 형질전환된 효모에 대한 형질전환 유무는 apxIIA 유전자를 운반하는 YEpGPD 벡터를 다시 이. 콜라이에 형질전환시키는 역형질전환(back transformation) 방법으로 확인하였다.

본 발명을 통해서, 상기와 같이 형질전환된 효모 숙주를 생성시키는 경우 효모 숙주에서 발현된 ApxIIA 독소 단백질은 원핵 세균성 단백질임에도 불구하고 동물에게 면역원성 및 방어 면역 능력을 제공할 수 있음을 확인할 수 있었다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기된 바와 같은 본 발명에 따라 제조된 발현 벡터 YEpGPD-TER-apxIIA 벡터를 효모(Saccharomyces cerevisiae) 세포에 형질전환시키는 단계 및 효모를 배양 배지에서 배양하여 ApxIIA 독소 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 돼지 흉막 폐렴의 ApxIIA 독소 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 발현된 ApxIIA 독소 단백질을 ApxIIA 독소 단백질을 인식하는 단클론 항체와 결합시켜 이의 면역원성을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 ApxIIA 독소 단백질의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법으로 제조된 돼지 흉막 폐렴균 악티노바실러스 플루로뉴모니애에 대한 면역원성 및 방어 면역 능력을 제공할 수 있는 돼지 흉막 폐렴의 재조합 ApxIIA 독소 단백질을 제공한다. 본 발명에 따라 apxIIA 유전자를 발현하는 벡터로 형질전환시킨 효모로부터 제조된 재조합 ApxIIA 독소 단백질은 효모 그 자체 또는 효모 파쇄물 형태 또는 부분 정제된 재조합 ApxIIA 독소 단백질로서 돼지 사육용 사료첨가제로 사료와 함께 급식을 통해 사용할 수 있을 것이다. 이러한 방법으로 사육중인 돼지에게 흉막 폐렴에 대한 면역원성 및 방어 면역 능력을 제공할 수 있을 것이다.

본 발명의 실시는 특별한 언급이 없는 한, 당해 분야의 기술 범위내에 포함되는 분자생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술 및 면역학의 통상적인 기술들을 사용할 것이다. 상기 기술들은 문헌들에서 충분히 설명되어져 있다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Animal Cell Culture (R.K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods In Enzymology(S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); and Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)].

실시예 1

균주 및 벡터

국내에서 흉막폐렴 진단을 위하여 병성감정의뢰된 돼지의 폐로부터 병변부위를 무균적으로 채취하여 초콜레이트 아가(Chocolate agar)에 접종한 후 37^oC, 5% CO₂분압하에서 24 시간 배양한 후 특징적인 집락을 선발하여 분리하고, 생화학적 시험 및 미생물 자동동정 장치(Vitek System)를 이용하여 흉막폐렴의 원인균인 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)를 동정하였고, 혈청형은 흉막폐렴의 각혈청형에 대한 표준혈청을 이용하여 동정하였으며, 추가적으로 PCR 방법으로 독소형을 동정하였다. 이렇게 분리 동정된 혈청형 2형과 5형을apxIIA 유전자의 클로닝에 이용하였다. 이. 콜라이(Escherichia coliTop 10 M 15) 및 효모(Saccharomyces cervisiae2805)를 재조합 ApxIIA 단백질의 형질전환과 발현을 위한 숙주로 사용하였다. TOPO 클로닝 벡터, pBluescript IIKS(+)와 pQE31 발현 벡터는 대장균에서, YEpGPD는 효모(S. cerevisiae)에서의 클로닝과 발현에 각각 사용하였다.

실시예 2

apxIIA의 클로닝, 염기서열 분석 및 발현

유전자은행(GeneBank)에 등록된 염기서열(Accession No. M30602)에 기초하여 프라이머를 제작하였고, PCR을 위한 주형은 상기 분리 동정한 균을 배양한 후 게놈 DNA을 정제하여 사용하였다. 실시예 1에서 분리 동정한 흉막폐렴균으로부터 보일링 방법으로 게놈 DNA를 주형으로 하여apxIIA 유전자를 PCR을 통하여 증폭하였으며 겔 추출 키트(Gel extraction-AIA quick Gel extraction kit; QUIAGEN HildenUSA)를 이용하여 증폭된 PCR 산물을 정제한 후, TOPO 클로닝 벡터 키트(제조원: Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 클로닝하였다.

apxIIA 유전자의 증폭에 이용된 프라이머는 각각 정방향 프라이머 5'-GGATCCATGTCAAAAATCACTTTGTCA-3'와 역방향 프라이머 5'-GGATCCTTAAGCGGCTCTAGCTAATTG-3'를 사용하고, PCR 사이클은 94℃ 5분간 고온 개시(hot starting)시킨 후, 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 3분을 30회 반복하였고 최종 온도는 72℃ 7분으로 작동시켜 최종 중합화(final polymerization)를 수행하였다.

제한 효소EcoRI,BamHI,HaeIII 및KpnI을 이용하여 클로닝된 유전자를 분석하였으며 정확한 클론으로 추정되는 것을 자동 염기서열 분석기(ABI PRISM 377XL; 제조원: Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 염기서열 분석을 실시하였다. 전체 염기서열 분석에 이용된apxIIA 유전자의 프라이머는 하기 표 1과 같으며 처음 염기서열 분석에는 M 13 유니버셜 프라이머를 사용하였다.

apxIIA 유전자의 전체 서열 분석을 위한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열

*apx* IIA 유전자 서열 분석 프라이머
5`- 정방향 -3`	5`- 역방향 -3`
787'-ATGTCAAAAATCACTTTGTCA-807'	3637'-TTAAGCGGCTCTAGCTAATTG-3657'
1171'-TTAGGAAGTGCTTCTAGCATC-1191'	3220'-GACAAGATAAACCTGCATTTT-3200'
1684'-GGTCCTGTCGCTGCATTAATCGC-1706'	3321'-GTGCTAGCCAAATCATCTTCT-3341'
2047'-GTTCATGACAGAATAGTTGA-2066'	2794'-GTTTCATGTAATGCTTTACTGTC-2816'

실시예 3

이. 콜라이 및 효모에서 ApxIIA 독소의 생산

3.1 이. 콜라이에서 ApxIIA 독소의 발현 및 정제

상기 실시예 2에서 클로닝된apxIIA 유전자를 pQE31 발현 백터에 재클로닝한 후, IPTG의 유도에 의해 이. 콜라이 M15에서 ApxIIA 단백질을 발현시켰다. 발현된 단백질은 하기 실시예 4에서 기술되는 바와 같은 SDS-PAGE와 ApxIIA에 대한 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다(도 1). 상기 언급된 바와 같은 본 실험에 사용된 ApxIIA에 대한 단클론 항체는 이. 콜라이에서 발현된 재조합 ApxIIA를 항원으로 하여 BALB/C 마우스를 면역한 후 골수종 세포와 면역된 마우스의 비장 세포와 융합하여 제조된 하이브리도마 세포로부터 생산하였다. 도 1에서 확인되는 바와 같이, 왼쪽 패널에서는 SDS-PAGE 결과를 나타내며, ApxIIA가 97.4kDa 크기로 검출되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1의 오른쪽 패널에서는 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내며, ApxIIA가 112kDa의 크기로 검출되었다.

상기 확인된 재조합 ApxIIA(rApxIIA)는 Ni-NTA 수지 키트(Ni-NTA resin kit; 제조원; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 순수 정제하였다. 간략한 정제 방법은 다음과 같다. ApxIIA 유전자를 함유하는 pQE31 벡터를 M15 수용능 세포에 형질전환시킨 후 10mL LB 육즙(25㎍/mL 카나마이신 & 100㎍/mL 암피실린이 포함된 육즙)에 균을 접종하고 밤새 배양하였다. 이렇게 수득된 씨드 배양물(seed culture)을 500mL LB 육즙(25㎍/mL 카나마이신 및 100㎍/mL 암피실린 함유)에 접종하고 O.D. 값 0.5-0.6이 될 때까지 배양하여 수확하고 IPTG를 최종 농도가 2mM이 되도록 첨가하였다. 5시간 동안 37℃, 270 RPM으로 진탕하에서 배양하였다. 이를 원심분리(약 8,000 RPM)하여 균을 모으고 천연 조건하에서 용해 완충액(1 리터 당 50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸, NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정함)을 이용하여 500mL 배양시 50mL 정도로 부유시켰다. 여기에 트리톤 X100을 0.5 내지 1.0%가 되게 첨가하였다. 집균한 세포를 용해 완충액에 잘 부유시키고 1시간 동안 투명해질 때까지 초음파 처리를 실시하였다. 이후, 10,000 RPM에서 30분간 침전시키고 세포 펠렛을 모아 다시 용해 완충액에 재부유하고 다시 한번 초음파 처리하였다. 다시 10,000 RPM에서 침전시키고, 변성 완충액 B(100mM NaH₂PO₄, 10mM 트리스ㆍCl, 8M 우레아, NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정함, 이후 사용시 이러한 pH를 유지시킴)를 이용하여 500mL 배양시 20 내지 30mL로 모아진 펠렛을 재부유시켰다. 이를 완전히 맑아질 때까지 부유시켜, 펠렛이 없도록 봉입체를 완전히 파쇄시켰다. 이를 10,000 RPM에서 30분간 원심분리하여 상층액을 프로본드 수지(Probond resin, 제조원: Invitrogen)가 들어있는 컬럼에 걸었다. 처음 100mL의 변성 완충액 B로 세척하고 다음 50mL의 변성 세척 완충액 C(1리터 당 100mM NaH₂PO₄, 10mM 트리스ㆍCl, 8M 우레아, HCl로 pH를 6.3으로 조정함)로 세척한 후 50mM의 이미다졸이 들어있는 변성 세척 완충액 C로 세척하였다. 이후, 250mM의 이미다졸이 첨가된 용출 완충액 E(1리터 당 100mM NaH₂PO₄, 10mM 트리스ㆍCl, 8M 우레아, HCl로 pH를 4.5로 조정함)를 이용하여 단백질을 정제하였다.

3-2 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 ApxIIA 독소의 발현 및 정제

YEpGPD 벡터를 이용하여apxIIA 유전자를 효모(S. cerevisiae)에 클로닝하기 위하여, 우선 pBluescript IIKS 클로닝 백터를 이용하여 적당한 제한 효소 부위를 생성하고apxIIA 유전자를 이. 콜라이 Top 10에서 클로닝하였다.

보다 상세히 설명하면,apxIIA 유전자의 5'과 3'말단 부위를 클레나우 단편(Klenow fragment)를 이용하여 평활 말단(blunt end)으로 만들고EcoRV로 처리된 pBluescript IIKS와 함께 클로닝하였다. 삽입된 유전자의 방향은 제한 효소를 처리하여 확인하였고, 계속해서 pBluescript IIKS에 클로닝된apxIIA 유전자는 제한효소BamHI과SalI으로 처리하여 잘라내어 동일한 제한 효소로 처리한 효모 발현 백터인 YEpGPD 백터에 결합시켰다(도 2). 결합 후, LiAc 방법[Ito H et al., J. Bacteriol. 153:163-168 (1983)]을 통하여 효모 숙주(S. cerevisiae2805)에 형질전환시켰다. 형질전환의 유무는 이. 콜라이에 YEpGPD-TER-apxIIA 벡터를 재형질전환시키는 역형질전환(back transformation)의 방법[Ito et. al. J. Bacteriol, 153 : 163-168, 1983]으로 확인하였다.

형질전환된 콜로니들은 선택 배지[URA-: 탈이온수 1000ml 중 효모 질소 기재(yeast nitorogen base) 6.7 g, 카스아미노산(casamino acid) 5 g, 글루코오스 20 g, 아데닌 0.03 g, 트립토판 0.03 g 및 박토 20 g]에서 12시간 배양 후, 기초 배지[YEPD; 탈이온수 1000ml 중 효모 추출물 10 g, 박토펩톤 20 g, 및 글루코오스 20 g]로 옮겨 30℃에서 2 내지 3일간 흡광도 600에서 0.6 내지 0.7이 될 때까지 배양하였다. 배양한 효모는 원심분리(3,000 rpm 으로 20분동안)하여 모은 다음 추출 완충액(트리스-HCl 50mM, 글리세롤 10%, EDTA 10mM)과 글래스 비이드(glass beads)를 이용하여 1분 동안 5번 볼텍싱(vortexing)하여 세포 단백질을 추출하였다. 추출 후 4℃, 7,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 추출된 단백질을 모으고, 실시예 4에서 기술되는 바와 같은 SDS-PAGE와 rApxIIA에 대한 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통하여 분석하였다(도 3). 도 3에서 확인되는 바와 같이, 왼쪽 패널에서는 SDS-PAGE 결과를 나타내며, ApxIIA가 97.4kDa 크기로 검출되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3의 오른쪽 패널에서는 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내며, ApxIIA가 약 110kDa의 크기로 검출되었다. 효모에서 발현시킨 rApxIIA 단백질의 순수 정제는 이. 콜라이에서의 정제 방법과 유사하게 수행할 수 있다.

실시예 4

SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석

대장균 및 효모에서 발현되고 추출한 단백질을 SDS-PAGE와 rApxIIA에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 방법을 이용하여 분석하였다.

SDS-PAGE를 위해서, 대장균과 효모(S. cerevisiae2805)로부터 전체 단백질 10㎍을 샘플 완충액(60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 2-메캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)에 혼합하여 100℃에서 5 분간 처리한 후, 12% 폴리아크릴아미드 겔에서 20mA로 2시간 동안 전기영동하여 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brillinant blue) R-250으로 염색하였다.

웨스턴 블롯에서는 전기영동한 후, Towbin 등의 방법[Towbin H et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 76:4350-4354 (1979)]에 따라 단백질을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 400 mA에서 한 시간 동안 이전시킨 후, 실온에서 한 시간 동안 1% 탈지유(skimmed milk)를 포함한 차단 완충액(blocking buffer)을 이용하여 차단하였다. 그 후, 실온에서 rApxIIA 항체와 함께 한 시간 항온처리하고 세척 완충액으로 씻어내었다. 그 후, HRP 접합체 항-마우스 또는 항-토끼 IgG를 이용하여 실온에서 한 시간 반응시키고 반응한 밴드는 ABTS(2,2'-아지노-디-<3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산>)와 3% H₂O₂를 이용하여 발색시켰다.

실시예 5

방어 면역 효과 시험

YEpGPD-TER-apxIIA을 보유하고 있어 apxIIA 독소를 생산하는 효모(S. cerevisiae)를 사용한 면역화 및 이후 흉막 폐렴 야외 분리주를 사용한 공격 접종에 대한 생존율을 4주령의 ICR(CD-1) 마우스를 이용하여 실험하였다. 이들 마우스는 무작위로 각각 10마리씩 7 개의 그룹으로 나누었다: 네가티브 대조군(negative control group, 비면역 후 흉막 폐렴 분리주 처리한 대조군), 포지티브 대조군(positive control group, 본 발명에 따른 면역화 및 흉막 폐렴 야외 분리주에 의한 공격 접종 모두 수행하지 않은 순수 마우스 그룹), 효모 벡터 대조군(vector control group), 상기 효모 1mg 또는 5mg을 3주 동안 1주 간격으로 식도 캐눌라(cannula)를 통해 각각 경구로 투여한 두개 그룹, ApxIIA 발현 이. 콜라이를 초음파 파쇄 후 근육내로 면역 투여한 그룹 및 ApxIIA 발현 효모(S. cerevisiae)를 초음파 파쇄 후 근육내로 면역 투여한 그룹.

매주 각 그룹의 마우스 중 4 마리를 안구를 통하여 채혈하였으며, 또한 IgA 측정을 위하여 신선한 분변을 매주 모았다. ApXIIA에 대한 항체가(IgA 와 IgG)는 하기 실시예 6에 기재된 바와 같은 ELISA를 통하여 검사하였다. 마지막 면역화한 후 1주 후에, 흉막 폐렴균 야외 분리주를 각 그룹의 개체에 접종하였으며 매 6시간 마다 생존율을 모니터링하여, 72시간까지 실시하였다.

상기 언급된 바와 같이 본 발명자들이 국내 야외 분리한 돼지 흉막 폐렴균(A. pleuropneumonia)를 이용한 마우스 생존율 조사 결과, 5mg을 경구 투여한 그룹에서의 생존율은 흉막 폐렴 야외 균주를 접종한 후 24시간까지는 각각의 시간대에서 효모 및 이. 콜라이 파쇄물의 근육 주사를 제외한 다른 그룹들에 비해 보다 높았다(도 4). 이는 경구 투여한 그룹이 비면역 대조군들에 비해서 유의한 면역원성을 갖는다는 것을 보여 주었다. 다른 그룹에서의 생존율은 균 접종 후 6시간까지 20% 보다 작았으며, 비면역화시킨 그룹과 apxIIA 유전자 비함유 벡터만을 처리한 효모를 경구 투여한 그룹에서는 균 접종 18시간 후에 모두 폐사하였다. 그러나, ApxIIA를 발현하는 이. 콜라이 및 효모를 초음파 파쇄하여 근육 접종으로 면역화 그룹들에서는 공격 접종 24시간 후까지도 각각 100% 및 90%의 생존율을 나타냈으며, 72시간까지도 90% 및 80%의 높은 생존율을 나타내었다.

이러한 결과는 이. 콜라이 및 효모에서 발현된 ApxIIA가 높은 면역원성을 나타내며, 돼지 흉막 폐렴균(A. pleuropneumoniae) 국내 야외 분리주로 공격 접종하는 경우 높은 방어력을 나타낸다는 것을 확인시켜 주었다.

실시예６

항체 형성능 시험

흉막 폐렴균의 ApxIIA에 대한 특이 항체가(IgA와 IgG)는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 측정하였다. 먼저, 대장균에서 발현 정제된 rApxIIA 단백질을 항원 코팅 완충액(14.2 mM Na₂CO₃, 34.9 mM NaHCO₃, 3.1 mM NaN₃, pH 9.6)을 이용하여 각 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 4℃에서 하루 동안 방치함으로써 항원 단백질을 코팅하였다. 다음 날, 0.05 % T-PBS(트윈 20-포스페이트 완충된 염수)를 각 웰 당 200 ㎕씩 분주하고 약 1분간 진탕한 후, 연속 세번 세척하였다. 그 다음 1 % BSA/T-PBS를 각 웰 당 250 ㎕씩 분주하고 37℃에서 한 시간 차단(blocking)한 후 다시 세번 세척하였다. 일차 항체로서 면역화된 마우스에서 모은 혈청과 분변에서 추출한 IgA를 이용하여 1:100으로 희석한 후 각 웰 당 100 ㎕를 분주하고 다시 37℃에서 한 시간 항온처리한 후 동일한 과정으로 세척하였다. 100 ㎕의 염소 항-마우스 IgG (H+L)-HRP 접합체 또는 항-마우스 IgA(α-쇄 특이적)-HRP 접합체를 각 플레이트에 분주하고 37℃에서 한 시간 항온처리하였다. 발색을 위한 기질(substrate)로서는 ABTS를 이용하여 각 웰 당 100 ㎕씩 분주하고 실온에서 20분 반응시킨 후, 반응 종결 용액(stop solution)을 50 ㎕를 첨가하여 파장 405 nm에서 ELISA 판독기로 결과를 판독하였다.

분변으로부터 IgA를 추출하기 위하여, 5 내지 6개의 신선한 분변 (100 mg)을에펜도르프 원심분리 튜브에 모으고 PBS 1 ml를 첨가하여 4℃에서 한 시간 동안 방치하였다. 항온처리 후, 고체 물질은 강력한 볼텍싱을 통하여 균질화시키고 4℃, 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 깨끗한 상층액을 IgA 추출물로서 분리하고 -20℃에서 사용 전까지 동결 보관하였다.

상기 분석 결과, ApxIIA 특이적인 IgA 항체가는 apxIIA 유전자를 발현시키는 효모(S. cerevisiae2805) 5mg을 경구 투여한 그룹에서 다른 그룹과 비교하여 3주까지 유의하게 증가하였으며 그 후에는 감소하였다(도 5). 또한, 비록 실험군들 사이에서 유의한 차이는 보이지는 않았지만, IgG의 항체가도 IgA 항체가와 비슷한 양상을 나타냈다(도 6).

상기 실시예에서 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 돼지 흉막 폐렴 원인균의apxIIA 유전자를 발현할 수 있는 형질전환된 대장균과 효모를 제조하였으며, 이중에서 효모에서 발현된 재조합 ApxIIA 독소 단백질의 면역원성 및 방어 면역 활성을 확인하였다. 이는 진핵세포인 효모에서 재조합 발현시켜 면역원성 및 방어 면역 활성을 갖는 세균성 독소 단백질 ApxIIA를 생산할 수 있다는 것을 입증하였다.

본 발명에 따라 제조된 재조합 독소 단백질 ApxIIA는 이를 포함하는 효모 그 자체로서, 효모 파쇄물로서 또는 이로부터 부분 정제된 형태로서 사료첨가제로서 돼지 같은 가축에게 공급될 수 있음을 입증하고 이러한 ApxIIA 독소 단백질은 돼지에게 돼지 흉막 폐렴에 대한 면역원성을 부여할 것으로 기대된다.

본 발명의 방법에 따라 ApxIIA 독소 구조 단백질을 효모(S. cerevisiae)에서 발현시키는 경우, 원핵 세균성 단백질인 재조합 ApxIIA 독소 구조 단백질은 돼지 흉막 폐렴에 대한 이의 면역원성 및 방어 면역 능력이 활성적임을 확인하였으며, 이로써 제조된 ApxIIA 독소 구조 단백질은 가축 사료첨가제로서 공급하여 돼지에게 상기 면역원성을 제공할 수 있을 것이다.

Claims

재조합 ApxIIA 독소 구조 단백질을 발현하는 벡터를 작제하는 단계, 상기 발현 벡터로 효모(S. cerevisiae)를 형질전환시켜 재조합 ApxIIA 독소 단백질을 발현시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 효모에서 돼지 흉막 폐렴에 대한 면역원성 및 방어 면역 활성이 있는 재조합 ApxIIA 독소 단백질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 발현 벡터가 YEpGPD-TER-apxIIA인 방법.
제1항 또는 제2항에 따라 제조된 재조합 ApxIIA 독소 구조 단백질을 활성 성분으로 포함함을 특징으로 하는 사료 첨가제.
제3항에 있어서, 재조합 ApxIIA 단백질이 이를 발현하는 효모 그 자체, 효모 파쇄물 또는 부분 정제된 형태로 사용됨을 특징으로 하는 사료 첨가제.