JP2000513203A

JP2000513203A - ヘリコバクター・ピロリからの新規アドヘシン

Info

Publication number: JP2000513203A
Application number: JP09512395A
Authority: JP
Inventors: ハースライナー; オーデンブライトシュテファン; エフマイアートーマス; ブルームアンドレ; コートシー−トゥライレーヌ
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 2000-10-10
Also published as: NZ319160A; AU712447B2; IL123775A0; MX9802213A; US6096521A; DE19535321A1; WO1997011182A1; ZA967974B; CA2232730A1; KR19990063649A; EP0853670A1; AU7131496A; CN1200763A; BR9610558A

Abstract

(57)【要約】本発明はヘリコバクター・ピロリからの付着遺伝子ａｌｐＢおよびこれによりコードされたポリペプチドに関する。この遺伝子はＨ．ピロリの染色体からトランスポゾンＴｎＭａｘ９−挿入（突然変異誘発）により得られ、これをＡｌｐＡの下流に隣接する領域をクローニングおよび配列決定することにより特徴付けした。この２つの付着遺伝子は多分同じオペロンに属し、かつただ１つのプロモーターにより転写されると思われる。

Description

【発明の詳細な説明】ヘリコバクター・ピロリからの新規アドヘシン本発明はヘリコバクター・ピロリからの新規付着遺伝子ａｌｐＢおよびこれによりコードされたポリペプチドに関する。該遺伝子、ポリペプチドおよびこのポリペプチドに向けられた抗体はヘリコバクター感染の診断、予防および治療に使用することができる。ヒトの胃粘膜中に螺旋状のバクテリアが出現することはすでに長年にわたって公知である（Bizzozero、1893）。しかしながら、これが病原菌であるという事実は、胃に潰瘍（胃潰瘍）を有する患者の胃粘膜からマーシャルおよびヴァーレン（WarrenおよびMarshall、1983;Marshall等著、1984）により、これらのバクテリアを成功裏に単離および培養することにより初めて実現した。最初の分析が明らかにしているように、このバクテリアはグラム陰性で螺旋状のバクテリアであり、著しく高い運動性と強酸性環境（約ｐＨ１．５まで）中で生き延びるという普通でない能力を有する。最初に、カムピロバクター・ピロリ（Campylobacte r pylori）と命名されたが、この病原菌は最終的には生化学および形態学的特性により、新たに設けられた属“ヘリコバクター；Helicobacter”にまとめられた（Goodwin等著、1989）。近年、ヘリコバクター・ピロリ感染の意味およびこの発見の影響が明らかになった。テイラーおよびブラザー（TaylorおよびBlaser：1991）の疫学的実験は、このＨ．ピロリ感染が世界的に広がっており、かつ人口の約５０％がこのバクテリアに感染しており、この際開発途上国中での感染率が、産業化された国においてより高いことを示した。更に、慢性的なＨ．ピロリ感染の確率は年を取ると共に急激に上昇するということが観察された。こうして、Ｈ．ピロリ感染はヒトの最も頻繁にある慢性細菌性感染に数えられる。今日、この感染がヒトにおいて必然的に細菌性胃炎（Ｂ型胃炎）の誘発に導くことは認識されている。更に、Ｈ．ピロリは胃および十二指腸の潰瘍（胃潰瘍および十二指腸潰瘍）において、ならびにいくつかの形の胃ガン（腺ガン）において、発生の原因となっていることを前提としている（Lee等著、1993；SolnickおよびTompkins、1993）。免疫システムのＢ−細胞腫瘍の前段階と見なされている、まれに出現するヒトのＭＡＬＴ（Mucosa Associated Lymphoid Tissue:粘膜関連リンパ組織）リンパ腫はＨ．ピロリ感染の結果と想像される。抗菌治療を受けてＨ．ピロリの根絶（完全除去）に成功した患者は、胃潰瘍の完治および“低度の”ＭＡＬＴリンパ腫にも導かれる（SipponenおよびHyvaerinen，1993;Isaacso nおよびSpencer，1993;StolteおよびEdit，1993）。Ｈ．ピロリの長期間にわたる感染の結果は、前ガン症状として見なさなければならない、萎縮性胃炎、胃上皮の粘液生産細胞、酸生産細胞またはペプシン生産細胞の変性である。１９８０年の統計によれば、世界中で最もしばしば生じるガン種の二番目に胃ガンはあり、しかしその後は減少傾向にある（Parkin等、1988 ）。２つの研究はＨ．ピロリ感染と発生する胃ガン（腸型）の間の統計学的に明らかな関連を最近示している；この２つの研究は発生する全ての胃ガンの約６０％がＨ．ピロリ感染に起因するという、結論に達している（Personnet等著，199 1;Nomura等著，1991）。更に、シッポネン（Sipponen;1992）の研究は、多くの産業化した国において感染者の２０％を越えるヒトが生存している間に胃または十二指腸の潰瘍にかかり、一方正常な胃粘膜を有するヒトにおいてはこの危険は無視することができるほど小さい。このことは、これらしばしば発生する胃十二指腸の疾患は感染疾患として考察することができ、かつ相応して治療されなければならない（Alper，1993）ということを意味する。すでに存在する慢性Ｈ．ピロリ感染を除く治療は胃炎、胃潰瘍もしくは十二指腸潰瘍またはＭＡＬＴ−リンパ腫の快方に導く。こうして、Ｈ．ピロリ感染を阻止する予防的治療（例えば接種）、ならびにすでに生じたＨ．ピロリ感染を除去する治療は、これらのしばしば起こる胃十二指腸疾患の治療のために使用することができる。いくつかの高度な霊長類と共に、ヒトは従来Ｈ．ピロリのための唯一の天然宿主として知られている。家猫もＨ．ピロリで感染されていることがあるという比較的新しい発見は、ヒト器官以外にこれらのバクテリアの感染および可能な貯蔵の問題に新たに光を投げかけた。時折成功する、感染患者の大便からのＨ．ピロリの培養およびこのバクテリアの数ヶ月にわたって水中で生き続ける能力は排泄物−経口感染の仮説を支持する。直接口−口伝染は家族調査によって公算が大きい。この感染は家族の中で多くの場合は幼少の頃行われ、この際狭い空間の生活様式および低い衛生状態は感染の頻度と相関する。経口摂取の後、このバクテリアは最初著しく酸性の胃腔（ｐＨ１〜２）に達する。そこで酵素、ウレアーゼの生産によりこのバクテリアの生存は可能となる、この際このウレアーゼは存在する尿素を切断し、胃中の酸性ｐＨ値を局所的中和に導く。化学走性配向および鞭毛依存性運動能力により、この病原菌は、その本来自然における生育地である、胃の洞の重炭酸塩−緩衝粘液層中に移動する。そこで、この病原菌は酸バリヤーにより僅かな競争相手のバクテリア種のみが到達する比類のない生態学的ニッチに存在する。多分、この病原菌は上皮に達するために、腔（ｐＨ１〜２）および上皮細胞表面（ｐＨ６〜７）の間のｐＨ−傾斜で方向付けしていると思われる。その螺旋形、その粘性粘液中での運動性、粘液変性酵素により、および更に微好気性生活様式により、この菌はこの生育地の生活条件に最高に適している。この菌は多くの場合洞領域の深い凹窩中に存在する、この菌はそこで外からの影響、例えば酸、ペプシン、ならびにこの菌を根絶するための薬剤、例えば抗生物質から守られている。個体群の一部（約２０％）は上皮細胞、特に粘液生産細胞と密接に結合している。胃異形成、即ち十二指腸中での酸誘発性胃上皮の形成の前提のもとに、十二指腸中の異形成面へのコロニー化が行われ、これにより十二指腸−潰瘍（十二指腸潰瘍）の形成の前提が達せられる。付着へのその能力により、剥がれる粘液と共にヘリコバクターの完全な排出は多分阻止されており、こうしてこのバクテリアは何年も、何十年も、または生存する限り継続することができる（慢性感染）。Ｈ．ピロリの存在および潰瘍疾患に関する意味が判明する前は、この疾患はいわゆる制酸剤、またはＨ２−レセプター拮抗薬により治療された。この際、これは胃壁細胞の酸分泌を阻止する物質である。この薬剤の影響により多くの場合潰瘍の快方に向かうが、この潰瘍の原因の一つ、即ちＨ．ピロリ感染は除去されていないので、多くの場合短期間の後に潰瘍が新たに形成される（再発）。その他の、潰瘍形成の際にしばしば適用される治療はビスマス治療である。種々のビスマス塩（ＣＢＳ，ＢＳＳ）はＨ．ピロリに対して殺菌効果を有する。しかしながら、この病原菌の完全な根絶は症例の８〜３２％に達するにすぎない。この治療はこの病原菌の一時的な抑制に導くと思われる、しかしながら治療を止めた後、多くの場合感染は再発する。高投与量での長期間にわたる治療は肝臓、腎臓中および神経系統へのこの物質の蓄積に導き、著しい神経医学的副作用を有する（Malfertheiner、1994）。胃十二指腸潰瘍疾患が感染疾患であるという認識以来、治療の目的は抗生物質による病原菌の根絶である。しかしながら、種々の抗生物質での単独治療（Amox icillin、Nitrofuran、Furazolidin、Erythromycin等）は十分ではないということが判明した、それというのも症例の０〜１５％においてのみ、病原菌を根絶できたためである。最も効果のあった治療は現在酸ブロッカー（Ompeprazol）と抗生物質（Amoxicillin）との組合せで達せられ、これは根絶率８０％まで導くことができる（Malfertheiner，1994）。しかしながら、Ｈ．ピロリを除去するための抗生物質治療は、抗生物質に対するバクテリアの迅速な耐性形成を考慮しなければならないために、長期間にわたって有望ではない。従って、Ｈ．ピロリ感染の根絶のための新規な治療法への要求、特にＨ．ピロリの発病力ファクターに対して特異的に向けられた接種物質に対する要求がある。発病力ファクターとは、病原菌の特性を表し、この特性は宿主の体内に一定の生態学的ニッチをコロニー化し、かつ宿主体の免疫応答および非特異的な防御機構にもかかわらず、増殖する能力を病原菌に付与する。こうして、発病力ファクターに関する知識は、感染疾患の進行および機構をよりよく理解するための助けとなる。従来研究したＨ．ピロリの最も重要な発病力ファクターはウレアーゼ、鞭毛、アドヘシン（付着因子；Adhesin）および細胞毒素の生産である。この菌の表面上の酵素であるウレアーゼは、２つのサブユニット（ＵｒｅＡ、２６ｋＤａ、ＵｒｅＢ、６６ｋＤａ）からなり、これは全細菌性蛋白質の５％をしめる。このウレアーゼは胃液中に低濃度で存在する尿素をアンモニアおよび二酸化炭素に分解する。慣用のモデルの実施によれば、このバクテリアは胃液の酸の局所的中和に導くアンモニアの雲で自体を取り囲んでいる。このバクテリアの著しく高い運動性は有極鞭毛の存在に起因し、この鞭毛はこのバクテリアが胃粘膜の粘性粘液中を移動し、かつこのことにより上皮細胞層に達することを可能にしている。ウレアーゼ−遺伝子クラスター（ｕｒｅＡ−ｕｒｅＨ）も鞭毛形成のための遺伝子（ｆｌａＡ、ｆｌａＢ）もＥ．コリ中でクローン化されかつ配列決定され、イソジーン突然変異体が製造された。全ての単離したＨ．ピロリ菌株の約５０〜６０％は、いわゆる空胞形成性細胞毒素である８７ｋＤａの蛋白質を生産し、これは試験管内細胞培養において細胞質空胞の形成に作用する。Ｈ．ピロリの細胞毒をコードするｖａｃＡ−遺伝子もこの間クローン化され、遺伝子学的に特徴付けられている。更に、細胞毒生産性菌株がこの毒素を生産しない菌株より高い発病力を有するということが想像される。更に、細胞毒素の生産および胃潰瘍の形成の間に関連があることが見いだされた。試験管中でのＨ．ピロリの上皮セルラインへの付着に関する研究は、このバクテリアが異なる組織の多くのセルラインに結合することができることを示す。宿主体中では、これとは反対にＨ．ピロリは非常に明確に種および組織選択的付着性（向性）を示す。こうして、このバクテリアは胃型の上皮細胞に属する上皮細胞にのみ結合していることを見いだした。この選択性は細菌性アドヘシンおよび特異的な細胞レセプター間の相互作用により説明することができる。従来、Ｈ．ピロリからの多くの可能なアドヘシンが記載されており、かついわゆるＮ−アセチル−ノイラミニルラクトース（Neuraminyllactose）−結合ヘマグルチニンをコードする遺伝子（ｈｐａＡ）が、クローン化され、かつ配列決定されている（Evans等，1993 ）。この際、これは上皮細胞上のシャル酸含有レセプターを認識すべき蛋白質である。しかしながら、Ｈ．ピロリ感染に関するこのアドヘシンの意味はなお異論のあるところである。他の可能なアドヘシンはその分子量によりまたはそのレセプター結合特異性によってのみ特徴付けられている。これには６３ｋＤａの蛋白質が属しており、これはプソイドモナス・アエルギノザ（Pseudomonas aerugino sa）の外酵素Ｓ、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ−活性を有するアドヘシンに類似であるように思われる。更に、胃上皮細胞のルイス^b−血液型抗原への特異的な結合を仲介する、なお同定されていないアドヘシンが推測されている（ Falk等，1993；Boren等，1993）。Ｈ．ピロリでの感染は胃粘膜の慢性的な炎症反応（胃炎）に導く。更に、Ｈ．ピロリ抗原に対する特異的な系統的免疫応答が誘発されるが、胃中での分泌性抗体（ｓＩｇＡ）の形成はなお明らかに解明されていない。炎症により胃粘膜および粘膜下組織中に種々の免疫細胞が生じる、例えば多形核白血球、単核細胞、マクロファージ、リンパ球および形質球（Blaser，1992）。更に、Ｈ．ピロリは試験管中で好中球も、単核細胞およびマクロファージも活性化する。試験管中では特異的な抗体および補体での実験は好中球によりＨ．ピロリの迅速な不活性化を示す。しかしながら、生体内の状況においてはこの機構は病原菌の不活性化には導かない。宿主が前記防御機構を活性化しても、Ｈ．ピロリは宿主中に長期間にわたって、いかに生き残るかということは明らかではない。宿主は自然の条件下にＨ．ピロリ感染を終結することはできない。Ｈ．ピロリの主要な発病力ファクターであるウレアーゼ（前記）がワクチンとしての高い能力を有している（ＵＳ−特許出願ＵＳＳＮ０７／９７０９９６“Urease-based Vaccine against Helicobacter Infection”）ので、このことはますます意外である。ヘリコバクター・フェリス／マウスモデル（Ｈ．フェリス（felis）は猫の胃中に天然にコロニーを形成しておりマウスにも感染することのできるヘリコバクター種である）においては、Ｈ．ピロリのウレアーゼもしくは組み換えウレアーゼＢサブユニット（ｒＵｒｅＢ）が、経口ワクチンにおいて、マウスをＨ．フェリス感染から保護することもできるし（予防ワクチン）、すでに罹患している感染を除去することもできる（Michetti等，1994;Corthesy-Theulaz等，Gastroent erol.印刷物）ということを示すことができた。経口ワクチンにおいて重要であるのはアジュバント、例えばコレラ毒素の添加であり、このアジュバントは合成抗体の生産の免疫反応を分泌性抗体に変換するために重要であると思われる。本発明の課題は、ヘリコバクター・ピロリからの新規分泌性遺伝子およびこれによりコードされたポリペプチドを製造することであり、このポリペプチドは接種物質のための候補物質である。ドイツ特許出願１９５２１３１２．２中にはヘリコバクター・ピロリからの分泌性遺伝子を同定するための方法が記載されており、ここではトランスポゾンを用いてＨ．ピロリの突然変異体遺伝子バンクを設け、付着挙動、例えばヒトの胃上皮細胞に対する付着挙動に欠陥を有する突然変異体に関する突然変異体コレクションを分析している。この方法でａｌｐＡと命名されたアドヘシン遺伝子およびこの遺伝子によりコードされたポリペプチドを同定することができた。ａｌｐＡの側面に隣接する下流の領域をクローニングする際に、ＳＥＱＩＤＮＯ．１中に示されたヌクレオチド配列を有する、Ｈ．ピロリからのａｌｐＢと命名された新規アドヘシン遺伝子およびＳＥＱＩＤＮＯ．１および２中に示されたアミノ酸配列を有する、この遺伝子によりコードされるポリペプチドを同定した。従って、本発明の課題は、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１中に示されたヌクレオチド配列、（ｂ）遺伝子コードの同義語の範囲において（ａ）の配列に相当するヌクレオチド配列または（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）の配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含するＤＮＡ−分子である。ＳＥＱＩＤＮＯ．１中に示されたヌクレオチド配列および遺伝子コードの同義語の範囲においてこの配列に相当するヌクレオチド配列の他に、本発明はこれらの配列の１つとストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ−配列をも包含する。本発明において、概念“ハイブリダイズ”とは、サンブルーク等（Sambrook;Mokecukar Cloning．A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，1101-1104）によると同様に使用される。本発明において、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで、１時間５５℃で、有利に６２℃でおよび特に有利に６８℃で、更に有利には０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で１時間５５℃で、有利には６２℃でおよび特に有利には６８℃で洗浄の後、更にプラスのハイブリダイズシグナルが観察される場合を、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションという。ＳＥＱＩＤＮＯ．１中に示されたヌクレオチド配列と、または遺伝子コードの同義語の範囲においてこの配列に相当するヌクレオチド配列と、前記の洗浄条件下にハイブリダイズしたヌクレオチドも本発明に包含される。有利に、本発明によるＤＮＡ−分子はヒト細胞、特にヒト胃上皮細胞に付着する能力を有するポリペプチドをコードする。更に、本発明によるＤＮＡ−分子はヌクレオチドレベルでＳＥＱＩＤＮＯ．１に記載されたヌクレオチド配列に少なくとも７０％、特に有利に少なくとも８０％相同であるのが有利である。更に有利にはこのＤＮＡ−分子がヌクレオチド少なくとも１５個、特に有利には少なくとも２０個の長さを示す。ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示されたアドヘシン遺伝子ａｌｐＢのＤＮＡ−配列はアミノ酸５１８個のポリペプチドをコードする。ＡｌｐＢとして示したこれらポリペプチドのアミノ酸配列をＳＥＱＩＤＮＯ．１および２に示した。ＡｌｐＢのアミノ酸配列のＮ−末端領域の分析は、このポリペプチドが典型的な原核生物シグナル配列を有することを、示唆する。ＡｌｐＢと、ＳＥＱＩＤＮＯ．３および４にそのアミノ酸配列を示したドイツ特許出願１９５２１３１２．２中に記載されたポリペプチドＡｌｐＡとの間のアミノ酸レベルでの比較は、この両方のポリペプチドが全アミノ酸配列にわたって４６％の同一性を有することを示す。Ｃ−末端部（アミノ酸３４１〜５１８）は６６％の同一性を示す。ａｌｐＢ−遺伝子の異なる２つの位置にトランスポゾンＴｎＭａｘ９を挿入することにより製造した、ａｌｐＢ−遺伝子中の欠陥突然変異体は胃上皮細胞の組織切断片に全く結合を示さない。このａｌｐＢ−突然変異体中のＡｌｐＡの安定な発現を証明することができたので、ａｌｐＢ−遺伝子の欠陥がａｌｐＢ−突然変異体の付着損失に直接の原因でなければならない。ＡｌｐＡおよびＡｌｐＢの間の機能的関連は、ＡｌｐＡおよびＡｌｐＢが複合体を形成することができるであろうということにある。この複合体はヘテロダイマーまたは／およびマルチマー集合体として存在し、これは機能的アドヘシンとして有効である。サブユニットの欠損、これはＡｌｐＡまたはＡｌｐＢと思われる、はアドヘシン複合体の機能損失および、したがってバクテリアの付着欠陥に導く。更に、本発明の課題はａｌｐＢ−遺伝子およびａｌｐＡ−遺伝子の配列領域を相互に融合して包含するＤＮＡ−分子である。特にこれは前記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に定義された配列が（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ．３中に示されたヌクレオチド配列、（ｅ）遺伝子コードの同義語の範囲において（ｄ）の配列に相当するヌクレオチド配列または（ｆ）（ｄ）および／または（ｅ）の配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列、と融合しているＤＮＡ−分子である。このような融合ＤＮＡ−分子の有利な例は、アドヘシン遺伝子ａｌｐＢ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）およびａｌｐＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）からのそれぞれ１つまたは複数の切断片を含有する。これらの切断片の長さは有利にヌクレオチド少なくとも１８個、特に有利にヌクレオチド少なくとも３０個、および最も有利にはヌクレオチド少なくとも６０個である。更に本発明の課題は、本発明によるＤＮＡ−分子のコピーを少なくとも１つ有するベクターである。このベクターは任意の原核または真核ベクターであってよく、本発明によるＤＮＡ配列はこのベクター上で有利に発現シグナル（プロモーター、オペレーター、エンハンサー等）のコントロール下にある。原核ベクターの例は染色体ベクター、例えばバクテリオファージ（例えばバクテリオファージ λ）および染色体外ベクター、例えばプラスミドであり、この際環状プラスミドベクターは特に有利である。好適な原核ベクターは例えばサンブルーク等（前記、第１〜４章）により、記載されている。他方、本発明によるベクターは真核ベクターであってもよく、例えば酵母ベクターまたは高度な細胞に好適なベクター（例えば、プラスミドベクター、ヴィールスベクター、植物ベクター）であってもよい。この種のベクターは前記サンブルーク等の第１６章に記載されている。本発明の更なる課題は本発明のベクターで形質転換した細胞である。有利な実施態様においては、この細胞は原核細胞であり、有利にグラム陰性原核細胞、特に有利にＥ．コリ細胞である。他方、本発明による細胞は真核細胞であってよく、例えば真菌細胞（例えば、酵母）、動物性または植物性細胞であってよい。本発明は本発明によるＤＮＡ−分子によりコードされているポリペプチドにも関する。有利にこのポリペプチドはヒト細胞に付着する能力を有し、かつ（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２中に示されたアミノ酸配列、または（ｂ）（ａ）による配列と免疫学的に交差反応するアミノ酸配列を包含する。特に有利であるのは、ＳＥＱＩＤＮＯ．２中に示したアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同および最も有利には少なくとも９０％の相同を有する。本発明によるポリペプチドの製造は、有利に細胞を本発明によるＤＮＡ−分子またはベクターで形質転換し、この形質転換した細胞を、このポリペプチドの発現が行われる条件下に培養し、かつこのポリペプチドを細胞からまたは／および培養上澄みから単離することにより行われる。この際、本発明によるポリペプチドは融合ポリペプチドとしておよび非融合ポリペプチドとして得られる。本発明の更なる課題は融合ポリペプチドであり、これはそれぞれポリペプチドＡｌｐＢ（ＳＥＱＩＤＮ０．２）およびＡｌｐＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ．４）からの１つまたは複数の切断片を含有する。この切断片の長さはアミノ酸少なくとも６個、有利に少なくとも１０個および特に有利に少なくとも２０個である。このＡｌｐＢ−蛋白質はＤＥ１９５２１３１２．２中に開示されたＡｌｐＡ− 蛋白質と機能的に活性の複合体を形成することができるので、本発明は更にポリペプチド複合体にも関し、この複合体は少なくとも２つのポリペプチド成分を含有し、この際第１の成分はａｌｐＢ−配列により、またはそれから誘導された配列によりコードされており、かつこの際第２の成分はａｌｐＡ−配列またはそれから誘導された配列、特に（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ．３中に示されたヌクレオチド配列、（ｅ）遺伝子コードの同義語の範囲において（ｄ）の配列に相当するヌクレオチド配列または（ｆ）（ｄ）および／または（ｅ）の配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を包含するＤＮＡ−分子から誘導された配列によりコードされている。複合体の第２のポリペプチド、即ちＡｌｐＡ−成分が、ＳＥＱＩＤＮＯ．４中に示されたアミノ酸配列、この配列と少なくとも８０％および有利に少なくとも９０％相同のアミノ酸配列またはこの配列と免疫学的に交差反応をするアミノ酸配列を包含するのが有利である。本発明によるポリペプチドＡｌｐＢまたはその一部を抗体の製造のために免疫原として使用することができる。こうして、本発明は本発明によるポリペプチド、または本発明による複合体に向けられた抗体にも関する。有利であるのはＮ−末端、例えばＳＥＱＩＤＮＯ．２中に示されたアミノ酸配列の最初の３４０および特に２５０アミノ酸、に対する抗体である。本発明の更なる課題は医薬組成物に関し、これは作用物質として本発明によるＤＮＡ−分子、本発明によるポリペプチド、本発明によるポリペプチド複合体または本発明による抗体を、場合により常用の医薬助剤、希釈剤、添加物および担体と一緒に含有する。本発明による医薬組成物は一方では、ヘリコバクター・ピロリ感染の診断のために使用することができる。核酸レベルでの診断は有利に、本発明によるａｌｐＢ−遺伝子に特異的なＤＮＡ−配列を含有するハイブリダイゼーション−プローブの使用により、またはプライマーとして本発明によるＤＮＡ−分子の使用下に増幅することにより行われる。蛋白質レベルにおいては、この診断は有利に本発明による抗体を用いて行われる。他方では、この医薬組成物はヘリコバクター・ピロリ感染の予防および治療にも使用される。有利に治療適用のためにはＡｌｐＢ−ポリペプチドまたはその一部を場合によりＡｌｐＡ−ポリペプチドまたはその一部と一緒に活性接種物質の製造に、または抗体を受動接種物質の製造のために使用する。更に、本発明を次の実施例および図面により詳細に説明する。図１はプラスミドｐＭｕ１４０の制限酵素図を示し、これは制御領域およびａｌｐＡ−遺伝子（ＳＥＱＩＤＮＯ．３）の５’−末端を含有する。このａｌｐＡ−遺伝子はトランスポゾンＴｎＭａｘ９の挿入により不活性化される（説明文字ＴｎＭａｘを有する三角を参照）。このプラスミドの発現により、ａｌｐＡ−β−ラクタマーゼ−融合蛋白質が得られる。ｐＭｕ１４０は突然変異体遺伝子バンクからの最初のクローンであり、これから再形質転換および相同組み換えにより、付着欠陥Ｈ．ピロリ−菌株ｐ１−１４０が得られた。図２はａｌｐＡ−遺伝子の一部および全ａｌｐＢ−遺伝子（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）を含有するプラスミドｐＭＴ５の制限酵素地図を示す。この複製開始点ｏｒｉ_fdおよびトランスポゾンＴｎＭａｘ９からのクロラムフェニコール−トランスフェラーゼ遺伝子ｃａｔ_GCを突然変異したａｌｐＡ−遺伝子座位および側面に隣接するａｌｐＢ−遺伝子領域を選択的バッククローニングに使用した。ＲｅｓはＴｎＭａｘ９の分解部位を意味し、かつＩＲはトランスポゾンの逆位反復を表す。Ｍ１３−ＦＰおよびＭ１３−ＲＰ１はＭ１３−前方（FORWARD）もしくはＭ１３−逆（REVERSE）シークエンシング−プライマーの配列を含有する領域を意味する。クローニング位置ＳａｃＩおよびＳｔｕＩの間のポリリンカー−領域はプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳから由来する。図３はアドヘシンＡｌｐＡおよびＡｌｐＢのアミノ酸配列比較を示す。（Ａ）配列比較はＧＣＧ−プログラムＢＥＳＴＦＩＴで実施し（Devereux等、1984）、かつポリペプチドＡｌｐＡおよびＡｌｐＢ全体を包含した。縦線は同一アミノ酸を意味し；点は保存的アミノ酸交換を示す。２つの配列の類似性および同一性の程度は配列の最後に記載した。（Ｂ）両方のポリペプチドのＣ−末端領域において明らかに高い同一性が確認された（３４１〜５１８位）、このことは多分細菌外膜中の蛋白質の内在に責任を有している。典型的であるのは、フェニルアラニン（Ｆ）で終了する、Ｃ−末端領域の５つのアミノ酸であり、このことはグラム陰性バクテリアの分泌性蛋白質において外膜中への挿入を示唆する（Struyve等、1991）。ＳＥＱＩＤＮＯ．１はＨ．ピロリ付着遺伝子ａｌｐＢのヌクレオチド配列および相応するアミノ酸配列を示す。ＳＥＱＩＤＮＯ．２はＨ．ピロリからのａｌｐＢ−付着ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。ＳＥＱＩＤＮＯ．３はＨ．ピロリ付着遺伝子ａｌｐＡのヌクレオチド配列および相応するアミノ酸配列を示す。ＳＥＱＩＤＮＯ．４はＨ．ピロリからのＡｌｐＡ−付着ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。例１Ｈ.ピロリプラスミド遺伝子バンクの製造Ｈ．ピロリ野生型株６９Ａの染色体ＤＮＡのプラスミド遺伝子バンクを設けた。このために染色体ＤＮＡをLeying等（１９９２）の方法によりＨ．ピロリから単離し、かつ制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３ＡＩおよびＨｐａＩＩでその都度部分的に切断した。引き続きＤＮＡ−フラグメントを分取アガロースゲルで分離し、かつ３〜６ｋｂのフラグメントをゲルから溶離した。該ＤＮＡ−フラグメントを、特別にこのために構成した、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩで切断した、プラスミドベクターｐＭｉｎ２に連結し（Ｔ４−リガーゼ）、かつこの連結反応バッチを、Ｅ．コリ株Ｅ１８１に、つまり既にトランスポゾンＴｎＭａｘ９で形質転換されている株ＨＢ１０１（Bayer und Roulland-Dussoix，１９６９）のリソゲンのλ−ファージλＣＨ６１６を含有する誘導体に形質転換した。その際に約２４００個の独立した形質転換体が得られた。最小ベクターｐＭｉｎ２を含有するＥ．コリ株ＤＨ５αは、ドイツ微生物保存機関（Deutschen Sammlunq von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSM ）,Mascheroder Weg lb，D-38124 Braun schweig）に整理番号１０００７で寄託されている。トランスポゾン誘導体ｐＴｎＭａｘ９を含有するＥ．コリ株Ｅ１８１はＤＳＭに整理番号１０００８で寄託されている。例２Ｈ．ピロリ突然変異体の単離トランスポゾンの突然変異誘発を実施するために、その都度１０個の形質転換体を合し、かつ一緒に誘発し、このことにより合計でそれぞれ１０〜２０個のクローンのプール１９０個をさらに処理した。この突然変異誘発体から、独立した突然変異したＨ．ピロリ遺伝子を有するアンピシリン耐性Ｅ．コリ−プラスミドクローン１９１個を単離した。この１９２個のプラスミドをＥ．コリから単離し、かつＨ．ピロリ株６９Ａの再形質転換のために使用した。これらの１９２個の形質転換体から、分泌性タンパク質をコードする遺伝子において変異しているはずのＨ．ピロリ突然変異体１３５個を単離した。次いでＨ．ピロリ突然変異体コレクションをスクリーニングアッセイで、ＫａｔｏＩＩＩ上皮細胞に付着する能力を失ったＨ．ピロリ突然変異体に関してテストした。このために突然変異体をＦＩＴＣでマークし、かつ３７℃で１時間、上皮細胞と一緒に培養した。付着に関するテストは直接、蛍光顕微鏡での観察により行った。その際に著しく減少した付着を示した２つの突然変異体が発見された（Ｎｏ．Ｐ１−１４０およびＰ１−１７９ａ）。どちらの突然変異体もまた第２の付着モデル、つまりヒトの胃の組織切片への付着を示さなかった。Ｈ．ピロリ野性型株ならびに全てのその他の突然変異体はこのモデルにおいてもまた強い付着を示した。突然変異株Ｐ１−１４０の生産のために使用したプラスミドｐＭｕ１４０は図１に記載されている。突然変異株Ｐ１−１７９ａの生産のためにプラスミドｐＭｕ１７９ａ（図示せず）を使用した。両プラスミドのＨ．ピロリ６９Ａ中での独立した形質転換は同定された付着性欠陥に導き、このことは２次的な突然変異は細菌染色体中で発現しているのではなく、クローニングしたアドヘシン遺伝子中のＴｎＭａｘ９挿入が、観察されたＨ．ピロリ突然変異体の表現型に導いたことを裏付けた。トランスポゾンＴｎＭａｘ９により不活性化されたプラスミドクローンｐＭｕ１４０およびｐＭｕ１７９の遺伝子の地図作製および配列決定は、どちらのクローンも同一の遺伝子であり、単にトランスポゾンが異なった位置に挿入されていたことを示していた。コードされたタンパク質はリポタンパク、つまりリピドアンカーで膜に付着しているタンパク質であるので、相応する遺伝子をＡｌｐＡ(adherence-associated lipoprotein A)と命名する。膜タンパク質およびタンパク質のＣ末端における特定の保存されたタンパク質配列（Ｃ末端フェニルアラニン）( 造予測による我々のデータから、グラム陰性菌の外膜に付着した膜内在性タンパク質であることがわかる。例３ａｌｐＢ付着遺伝子の同定ａｌｐＡ遺伝子座の遺伝子の特徴付けに従って側方に隣接するゲノムの配列をＥ．コリ中でクローニングし、かつ配列決定した。下流にあるａｌｐＡ隣接領域のクローニングをＨ．ピロリからの染色体のＴｎＭａｘ９挿入のバッククローニングにより行った。突然変異体Ｐ１−１７９ａの染色体ＤＮＡ（例２を参照）を制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩおよびＳｔｕＩで切断し、生じたＤＮＡ−フラグメントをプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳのポリリンカーからのＳａｃＩ−ＨｉｎｃＩＩ−フラグメントと一緒にＴ４−リガーゼの使用下で環状化し、かつコンピテントＥ．コリＥ１３１細胞に形質転換し、その際にクロラムフェニコールに対して選択を行った。得られた形質転換体は全て、突然変異したａｌｐＡ遺伝子を有し、かつ隣接する配列を有しているはずである。というのは複製および増殖はＴｎＭａｘ９により挿入された染色体の複製の開始点ｏｒｉ_fdを経由し、かつＴｎＭａｘ９に局在するクロラムフェニコール耐性遺伝子によってのみ行うことができるからであった。得られた組み換えプラスミドｐＭＴ５（図２）の１つをさらに分析した。ｐＭＴ５の配列決定およびここから製造されたサブクローンはａｌｐＡ遺伝子（停止コドンの後の６７個のヌクレオチド）に引き続き別の開放読み取り枠の開始を示し、これは５１８個のアミノ酸のポリペプチドをコードし、かつａｌｐＢと命名した（ＳＥＱＩＤＮｏ．１および２）。遺伝子の構築に基づき、オペロンから出発し、かつ恐らくａｌｐＡおよびａｌｐＢを唯一のプロモーターから転写することができるであろう(polycystronic mRNA)。ＡｌｐＢ遺伝子生産物はＡｌｐＡとちょうど同じ数のアミノ酸を有する。ＡｌｐＢポリペプチド配列のＮ末端領域の分析は、典型的な原核生物シグナル配列の存在を示しており、これは分泌性ポリペプチドを示す。ＡｌｐＡおよびＡｌｐＢ間のアミノ酸レベルでの比較は全ポリペプチドにわたって４６％の同一性を示す。Ｃ末端部（アミノ酸３４１〜５１８）は６６％の同一性を示す（図３）。例４付着遺伝子ＡｌｐＡおよびＡｌｐＢの機能的関係ＡｌｐＡおよびＡｌｐＢの機能的関係を調査するために２つのＴｎＭａｘ９トランスポゾン挿入を異なった位置でａｌｐＢ遺伝子に導入し（Ｐｏｓ．９７およびＰｏｓ．１１０８）、かつ自然な形質転換によりＨ．ピロリ６９ａのゲノムに転移させた。トランスポゾンのＨ．ピロリ染色体への正確な挿入およびこれによるａｌｐＢ遺伝子の不活性化をサザン−ブロット−ハイブリダイゼーションにより検証した。生じたａｌｐＢ欠陥突然変異体を胃上皮細胞への付着能力に関して分析した。どちらのａｌｐＢ突然変異体も組織切片からなる胃上皮細胞への付着を示さないことが判明した。ａｌｐＢ突然変異体におけるＡｌｐＡの安定した発現は免疫ブロットにより検出することができた。これによりＡｌｐＢが直接ａｌｐＢ突然変異体の付着性欠陥の原因であることが明らかになった。両方のポリペプチドのＣ末端領域における構造予測および高い相同性に基づいて推測しうることは、ＡｌｐＢもまた外側の細菌膜に挿入されて存在し、かつ場合によりＡｌｐＡと共に複合体を形成しうることである。このような複合体はヘテロダイマーの、またはマルティマーの集合体として機能的アドヘシンとして有効であり得る一方で、サブユニットの損失は、それがＡｌｐＡであろうとＡｌｐＢであろうと、既にアドヘシン複合体の機能損失ひいては場合により細菌の付着性欠陥につながる。文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/106 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｒ 39/395 Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ０７Ｋ 16/12 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＦＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 21/08 ＢＧ０１Ｎ 33/569 15/00 ＣＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者トーマスエフマイアードイツ連邦共和国チュービンゲンシュペーマンシュトラーセ 30 (72)発明者アンドレブルームスイス国ロマンモティエヴェルスレコレジュ（番地なし) (72)発明者イレーヌコートシー−トゥラスイス国ローザンヌルトデュジョラ 144

Claims

【特許請求の範囲】 1．ヒト細胞への付着能力を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ−分子において、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１中に示されたヌクレオチド配列、（ｂ）遺伝子コードの同義語の範囲において（ａ）の配列に相当するヌクレオチド配列、または（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）の配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含することを特徴とするＤＮＡ−分子。 2．ヌクレオチドレベルにおいて、ＳＥＱＩＤＮＯ．１中に示されたヌクレオチド配列に少なくとも８０％の相同を示す請求項１記載のＤＮＡ−分子。 3．ポリペプチドの切断片をコードし、かつ少なくともヌクレオチド１５個の長さを有するが、その際このＤＮＡ−分子がヌクレオチド配列ＥＭＢＬＡＣＵ２２０６２Ｐｏｓ８８１３〜８８２７（GTAGTGGTGGTGGTG）ではない、請求項１または２記載のＤＮＡ−分子。 4．（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ．３中に示されたヌクレオチド配列、（ｅ）遺伝子コードの同義語の範囲において（ｄ）の配列に相当するヌクレオチド配列、または（ｆ）（ｄ）および／または（ｅ）の配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列、と融合している請求項１から３までのいずれか１項記載のＤＮＡ−分子。 5．請求項１から４までのいずれか１項記載のＤＮＡ−分子のコピーを少なくとも１つ含有することを特徴とするベクター。 6．請求項５記載のベクターで形質転換していることを特徴とする細胞。 7．請求項１から４までのいずれか１項記載のＤＮＡ−分子によりコードされているポリペプチド。 8．（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．２中に示されたアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）からの配列と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列、（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）による配列と免疫学的に交差反応するアミノ酸配列を包含する請求項７記載のポリペプチド。 9．ヒト細胞に付着能力を有する請求項７または８記載のポリペプチド。 10．少なくとも２つのポリペプチド成分を含有し、この際第１の成分は請求項１から３までのいずれか１項記載のＤＮＡ−分子によりコードされており、かつこの際第２の成分は、（ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ．３中に示されたヌクレオチド配列、（ｅ）遺伝子コードの同義語の範囲において（ｄ）の配列に相当するヌクレオチド配列、または（ｆ）（ｄ）および／または（ｅ）の配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含するＤＮＡ−分子によりコードされている、ポリペプチド複合体。 11．第２の成分が、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ．４中に示されたアミノ酸配列、（ｂ）配列（ａ）と少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列、（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）による配列と免疫学的に交差反応するアミノ酸配列を包含する請求項１０記載の複合体。 12．細胞が請求項１から４までのいずれか１項記載のＤＮＡ−分子で、または請求項５記載のベクターで形質転換しており、この形質転換した細胞をこのポリペプチドの発現が行われる条件下で培養し、かつこのポリペプチドを細胞または／および培養上澄みから単離することを特徴とする請求項７から９までのいずれか１項記載のポリペプチドの製法。 13．請求項７から９までのいずれか１項記載のポリペプチドの、抗体形成のための免疫原としての使用。 14．請求項７から９までのいずれか１項記載のポリペプチドまたは請求項１０または１１項記載の複合体に対する抗体。 15．ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示されたアミノ酸配列のＮ−末端に対して反応する請求項１４記載の抗体。 16．作用物質として請求項１から４までのいずれか１項記載のＤＮＡ−分子、請求項７から９までのいずれか１項記載のポリペプチド、請求項１０または１１記載のポリペプチド複合体、または請求項１４または１５記載の抗体を、場合により常用の医薬助剤、希釈剤、添加剤および担体と一緒に含有することを特徴とする医薬組成物。 17．請求項１６記載の医薬組成物の、ヘリコバクター・ピロリ感染の診断のための使用。 18．請求項１６記載の医薬組成物の、ヘリコバクター・ピロリ感染の予防または治療のための薬剤を製造するための使用。