JP2014509513A - ヘリコバクター・ピロリにおける遺伝子発現および除菌システム - Google Patents

Abstract

本発明は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ピロリ）のための遺伝子発現および除菌システムに関する。特に、本発明は、５’から３’方向に（ａ）プロモーター配列と、（ｂ）対象ＤＮＡ配列とを含み、プロモーター配列が、ヘリコバクター・ピロリにおいて対象ＤＮＡ配列の発現を調節することができるポリヌクレオチド配列を含み、かつ、プロモーター配列がテトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を含むように改変されている、遺伝子構築物に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）（Ｈ．ピロリ）のための遺伝子発現および除菌システムに関する。特に、本発明は、Ｈ．ピロリにおけるＴｅｔ誘導性遺伝子発現系に関し、この場合、形質転換されたＨ．ピロリをｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子の制御可能な発現に使用することができる。本発明はさらに、Ｈ．ピロリのある特定の糖類を利用する能力を改変するか、または欠失させることにより、Ｈ．ピロリ、特に遺伝子改変Ｈ．ピロリのコロニー形成能を制御する方法に関する。

世界の人口の過半数が胃の病原体Ｈ．ピロリに慢性的に感染している。感染は通常幼児期に獲得され、生涯続き、感染者の大多数は無症候性のまま留まる。Ｈ．ピロリ感染は消化性潰瘍疾患の主因であり（非特許文献１）、胃腺癌の発症の有意なリスク因子である（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。さらに、Ｈ．ピロリの処置は抗生物質耐性の出現をもってますます困難になってきており（非特許文献５；非特許文献６）、従って、抗生物質処置に代わるものを特定する必要がある。Ｈ．ピロリ持続の機構を解明することで、新規な薬物標的の発見および代替の除菌療法の開発につながるであろう。

挿入突然変異誘発、遺伝子置換および遺伝子の過剰発現を含む遺伝学は、組換え株および突然変異株の表現型の研究を通じて細菌の生物学的現象を解明するために大きな貢献をしてきた。このアプローチは、ウレアーゼ、ＣａｇＡ、ＶａｃＡおよび鞭毛などのいくつかのＨ．ピロリ病原性因子を特徴付けるために広く用いられてきた（非特許文献７）。当初は有用であったが、細菌遺伝学の分野では、ノックアウト突然変異体を使用すると機能欠失を完成させるための研究が限定されたものとなるという見解が増えつつあり、これはこのアプローチが、感染状態がひと度確立されれば、それを維持するために病原性決定因子をコードする特定の遺伝子もしくは遺伝子セットが必要であるかどうか、または全感染サイクルにこれらの病原性決定因子が必要であるかどうかを検討することができないためである（非特許文献８；非特許文献９）。さらに、細菌増殖に影響を及ぼす重大な表現型は、生理学的レベルで、もしくは遺伝学的レベルで、またはその両方で補償的適応を受ける。従って、標的遺伝子の誘導性発現に基づく遺伝学的ツールは、生理学的研究および表現型研究向けの条件付きノックアウトを構築するために、より適している。注目すべきことに、この条件付きノックアウトの使用に基づく遺伝学的研究により、研究者は標的遺伝子発現およびそれらの対応する産物の時間経過的な必要を調べ、コロニー形成および感染の維持などの感染の種々の段階におけるそれらの役割を区別することができる。このアプローチは、持続的な終生の感染であるＨ．ピロリ感染に対して特に重要である。

最近、Ｈ．ピロリにおける必須遺伝子を研究するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬａｃＩ^ｑ系に基づくプラスミドベースの誘導系が開発された（非特許文献１０）。残念ながら、このＬａｃＩ^ｑ系は遺伝子発現を効率的に抑制せず、遺伝子発現の誘導に多量のインデューサー分子を必要とし、このことにより、動物モデルにおいて感染プロセスを試験するためのツールとしての使用が実現不可能となる。さらに、Ｈ．ピロリ株のＤＮＡ制限障壁およびＤＮＡ改変は様々であり、この細菌におけるプラスミドの体系的使用の妨げとなる。

米国特許第５，４５９，０４１号明細書 米国特許第４，７４８，１１３号明細書 米国特許出願第２００３００８２６６４号明細書 Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ ｅｔ ａｌ．， （２０１０）， 国際公開第２０１０／１４８４５９号

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よって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで機能する、Ｈ．ピロリにおける標的遺伝子の誘導性発現に基づく遺伝学的ツールの必要が依然としてある。さらに、Ｈ．ピロリの除菌方法、特にペプチドなどのための生物学的送達ビヒクルとして使用可能な遺伝子改変Η．ピロリ菌の除菌を開発する必要が引き続き存在する。

本発明者らは、Ｈ．ピロリのためのテトラサイクリンに基づく誘導性遺伝子発現系を開発した。使用した条件付きノックアウト戦略は、感染過程の様々な時点での単一の標的遺伝子のスイッチのオンまたはオフを可能とする。

よって、第１の態様において、本発明は、５’から３’方向に（ａ）プロモーター配列と、（ｂ）対象ＤＮＡ配列とを含み、プロモーター配列が、ヘリコバクター・ピロリにおいて対象ＤＮＡ配列の発現を調節することができるポリヌクレオチド配列を含み、かつ、プロモーター配列がテトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を含むように改変されている遺伝子構築物を提供する。

いくつかの実施形態において、対象ＤＮＡ配列は、少なくとも１つの異種抗原、またはその機能的断片をコードする。いくつかの実施形態において、異種抗原、またはその機能的断片は、病原性微生物、好ましくは、ウイルス、細菌、原虫および真菌からなる群から選択される病原微生物に由来する。

いくつかの実施形態において、異種抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＨＴＬＶ抗原、ＳＩＶ抗原、ＲＳＶ抗原、ＰＩＶ抗原、ＨＳＶ抗原、ＣＭＶ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）抗原、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）抗原、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｔｅ）抗原、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）抗原、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）抗原、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）抗原、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）抗原、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）抗原、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）抗原、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）抗原、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗原、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）抗原、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）抗原からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、本発明の構築物は、（ｃ）遺伝子終結配列をさらに含む。

第２の態様において、本発明は、５’から３’方向に（ａ）プロモーター配列と、（ｂ）ウレアーゼオペロンとを含み、プロモーター配列が、ヘリコバクター・ピロリにおいてウレアーゼオペロンの発現を調節することができるポリヌクレオチド配列を含み、かつ、プロモーター配列がテトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を含むように改変されている遺伝子構築物を提供する。

いくつかの実施形態において、ウレアーゼオペロンはＨ．ピロリ株から単離される。好ましくは、ウレアーゼオペロンは、サブユニットＡおよびＢを含む。

好ましくは、遺伝子構築物はプラスミドベクターである。いくつかの実施形態において、プラスミドベクターは、本発明の遺伝子構築物をＨ．ピロリの染色体に挿入することができる。好ましくは、遺伝子構築物の染色体への挿入は相同組換えによる。

いくつかの実施形態において、ｔｅｔオペレーター配列を含むように改変される前のプロモーターは外因性であるか、または通常もしくは天然には、Ｈ．ピロリに見られず、かつ／もしくはＨ．ピロリによって産生されない外因性核酸を含む。好ましくは、プロモーターは内因性であるか、または通常Ｈ．ピロリに見られ、かつ／もしくは天然においてＨ．ピロリによって産生される内因性核酸を含む。より好ましくは、プロモーターは、ウレアーゼ、特にＨ．ピロリのウレアーゼサブユニットＡのプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ａｍｉＥプロモーター、コアウレアーゼプロモーター、ｒｅｖｔｅｔＲプロモーターおよびｆｌａＡプロモーターからなる群から選択される。

ひと度得られれば、プロモーターは、テトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を導入するために改変される。

第３の態様において、本発明は、５’から３’方向に（ａ）プロモーター配列と、（ｂ）対象ＤＮＡ配列とを含み、プロモーター配列が、Ｈ．ピロリにおいて対象ＤＮＡ配列の発現を調節することができるポリヌクレオチド配列を含み、プロモーター配列がテトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を含むように改変されている遺伝子構築物を含む、単離された遺伝子改変Ｈ．ピロリを提供する。

第４の態様において、本発明は、５’から３’方向に（ａ）プロモーター配列、（ｂ）ウレアーゼオペロン、および（ｃ）遺伝子終結配列を含み、プロモーター配列がヘリコバクター・ピロリにおいてウレアーゼオペロンの発現を調節することができるポリヌクレオチド配列を含み、かつ、プロモーター配列がテトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を含むように改変されている遺伝子構築物を含む、単離された遺伝子改変Ｈ．ピロリを提供する。

第５の態様において、本発明は、ヘリコバクター・ピロリの遺伝子改変法を提供し、その方法は、
（ｉ）５’から３’方向に（ａ）プロモーター配列と、（ｂ）対象ＤＮＡ配列とを含み、プロモーター配列が、ヘリコバクター・ピロリにおいて対象ＤＮＡ配列の発現を調節することができるポリヌクレオチド配列を含み、プロモーター配列がテトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を含むように改変されている遺伝子構築物を準備すること、および
（ｉｉ）ヘリコバクター・ピロリを形質転換して遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを作出すること
を含む。

第６の態様において、本発明は、第３および第４の態様の遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリと薬学上許容される担体とを含む免疫原性組成物を提供する。

いくつかの実施形態において、免疫原性組成物はアジュバントをさらに含む。

第７の態様において、本発明は、哺乳類を病原微生物による感染から保護する方法を提供し、その方法は、免疫学的に有効な量の、第６の態様の免疫原性組成物を投与する工程を含む。

第８の態様において、本発明は、Ｈ．ピロリの哺乳類の粘膜にコロニーを形成する能力を制御する方法を提供し、その方法は、Ｈ．ピロリのホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒｉｓｅ）を改変するか、または欠失させることによってリポ多糖（ＬＰＳ）のルイス抗原を代謝的に制御する工程を含み、Ｈ．ピロリによる粘膜のコロニー形成を維持するために、哺乳類の食餌へのマンノースの添加が必要とされる。

好ましくは、ルイス抗原の欠如は、哺乳類において樹状細胞の機能向上をもたらす。

本発明のいくつかの実施形態において、Ｈ．ピロリは、哺乳類の粘膜に薬剤を送達するために有用な生物学的ビヒクルとして特に選択される。好ましくは、Ｈ．ピロリ株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ受託番号４３５０４；４３５０４Ｄ−５；４３５２６；４３５７９；４３６２９；４９３９６；４９５０３；５１１１０；４９５０３；５１１１１；５１４０７；５１６５２；５１６５３；５１９３２；および５３７２７に寄託されているものを含む。また、例えば、参照により本明細書に組み込まれる特許文献１も参照。他の好ましいヘリコバクター・ピロリ株としては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに受託番号Ｖ０９／００９１０１；Ｖ０９／００９１０２；Ｖ０９／００９１０３；Ｖ１０／０１４０５９；Ｖ１０／０１４０６０およびＶ０９／００９１０４として寄託されている株が含まれる。

本発明に含まれる哺乳類の限定されない例としては、霊長類、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよび齧歯類がある。

組成物の種々の送達形態は、特定の種類および比率の具体的なＨ．ピロリ、プラスミドベクターおよび本明細書に記載のその他の送達機構、ならびにその本文が参照により本明細書に具体的に組み込まれる非特許文献１１に記載されているものなどの製薬分野で公知の調剤技術が与えられれば、本発明の実施に使用するために容易に調製される。

図１は、Ｈ．ピロリにおけるＴｅｔＲｓの発現を駆動するｐｔｅｔＲ構築物の概略図を示す。 図２は、Ｈ．ピロリＸ４７株ｍｄａｂ：：ｐｔｅｔＲ １〜７によるＴｅｔＲｓの発現のウエスタンブロット分析を示す。ｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲ６で形質転換された大腸菌株を陽性対照（ｐｏｓ）として用いた。Ｘ４７受容株ｍｄａｂ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴを陰性対照（ｎｅｇ）として用いた。ＴｅｔＲｓは、１：２０００希釈のポリクローナルウサギ抗ＴｅｔＲ抗体を用いて検出した。ＴｅｔＲタンパク質バンドを黒い矢印で示す。 図３は、テトラサイクリン応答性プロモーターを示す。（Ａ）野生型ｕｒｅＡプロモーター、Ｐ_ｕｒｅＡ、およびテトラサイクリン応答性プロモーターｕｒｅＰｔｅｔＯＩＩＩおよびｕＰｔｅｔＯＩＩＩのヌクレオチド配列。−１０および−３５プロモーター配列を下線で示す。Ｔｅｔオペレーター配列を四角で囲んでいる。矢印は転写開始点を示し、星はｕＰｔｅｔＯ構築物に見られる−１０ボックス内におけるＣからＴへの突然変異を示す。（Ｂ）ｕＰｔｅｔＯ構築物の代表的な図を示す。白いｔｅｔＯボックスは、野生型Ｐ_ｕｒｅＡプロモーター配列がｔｅｔＯ配列に置換されている場合を示す。（Ｃ）ｕｒｅＰｔｅｔＯ構築物の代表的な図。 図４は、Ｈ．ピロリにおけるｕＰｔｅｔＯにより駆動されるＧＦＰ発現を示す。細菌を示されたように形質転換し、ＢＨＩ中で対数増殖期まで増殖させ（ＯＤ_６００＝０．５）、２４時間後にＧＦＰ活性を測定した。蛍光強度を細胞密度に対して正規化し、相対蛍光単位で表した。データは平均値であり、エラーバーは標準偏差を表す。ＴｅｔＲを発現しないｕｐｔｅｔＯ１株（単色の棒）およびｕｐｔｅｔＯ２株（斜線の棒）のＧＦＰ活性は、野生型の自発蛍光に匹敵した。 図５は、Ｈ．ピロリにおけるｕｒｅＰｔｅｔＯによるウレアーゼ発現を示す。（Ａ）Ｘ４７ ｕｒｅＰｔｅｔＯ株のウレアーゼ活性。ウレアーゼ活性は、野生型親（ＷＴ）のウレアーゼ活性に対するパーセンテージとして表す。バーの下にｕｒｅＰｔｅｔＯ構築物が示されている。（Ｂ）改変型ｕｒｅＡプロモーターを有するＸ４７株によるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの２週間のコロニー形成。ｕｒｅＡプロモーターに対する改変はコロニー形成を抑制しなかった。コロニー形成試験は、マウスにＸ４７ ｕｒｅＰｔｅｔＯ株を事前に順応させずに行った。 図６は、Ｈ．ピロリにおけるＧＦＰ発現のＴｅｔ調節を示す。種々のｐｔｅｔＲ構築物を有する株におけるＧＦＰ誘導の比較。細菌を示されたように形質転換し、ＢＨＩ中で対数増殖期まで増殖させ（ＯＤ_６００＝０．５）、その後、１００ｎｇ／ｍＬのＡＴｃを加えた（斜線の棒）。２４時間後にＧＦＰ活性を測定した。ベクターｕｐｔｅｔＯ ＧＦＰ１およびｕｐｔｅｔＯ−ＧＦＰ２を、（Ａ）ＴｒｐＡ、（Ｂ）ＧｌｔＤＨ、または（Ｃ）ＤａｐＢ遺伝子座のいずれかに形質転換した。独立に形成された３つのクローンを用いて、各構築物のＧＦＰ活性を測定した。蛍光の測定は全て、３回行った。蛍光強度を細胞密度に対して正規化し、相対蛍光単位で表した。データは平均値であり、エラーバーは標準偏差を表す。 図７は、最適なインデューサー濃度の決定、ＡＴｃによる増殖阻害、および誘導の速度論を示す。（Ａ）インデューサー濃度。Ｈ．ピロリを示されたように形質転換し、ＢＨＩ中で対数増殖期まで増殖させ（ΟＤ_６００＝０．５）、漸増量のＡＴｃを加えた。２４時間後にＧＦＰ蛍光活性を測定した。（Ｂ）ＴｅｔＲにより制御されるＧＦＰ発現の経時的推移。ｕｐｔｅｔＯ１プロモーターを用いてＧＦＰを発現するＨ．ピロリ（タンパク質１８ｍｇ）からの溶解液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。レーン１は、ＴｅｔＲを欠くＸ４７（ｐｏｓ）により構成的に発現されたＧＦＰ；レーン２は、親野生型Ｘ４７（ｎｅｇ）；レーン３は、抑制されたＧＦＰ（＋ｔｅｔＲ）；レーン４〜９は、ＴｅｔＲにより制御されるＧＦＰの、１００ｎｇ／ｍｌのＡＴｃによる誘導の経時的推移。 図８は、Ｈ．ピロリにおけるｕｒｅＰｔｅｔＯのｔｅｔ調節を示す。細菌を５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃの不在下または存在下で培養した。免疫ブロット法（Ａ）Ｔｅｔ−ＯＮ株によるＵｒｅＢ発現の誘導。（Ｂ）Ｔｅｔ−ＯＦＦ株におけるウレアーゼ発現の抑制。ウレアーゼ活性アッセイ。ウレアーゼ活性は、野生型親（ＷＴ）のウレアーゼ活性に対するパーセンテージとして表す。バーの下にｕｒｅＰｔｅｔＯ構築物を示す。（Ｃ〜Ｅ）ＴｅｔＲを発現するｕｒｅＰｔｅｔＯ株のウレアーゼ活性。（Ｆ〜Ｇ）ｒｅｖＴｅｔＲを発現するｕｒｅＰｔｅｔＯ株のウレアーゼ活性。 図９は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｕｒｅＰｔｅｔＯのＴｅｔ調節を示す。（Ａ）テトラサイクリン耐性Ｘ４７。１週間、野生型親Ｘ４７株に感染させ、一定濃度範囲のｄｏｘを添加したマウスの細菌量。これは、３回の独立した試験からのデータを合わせたものであり、動物群はｎ＝３である。（Ｂ）野生型Ｘ４７に感染させ、５ｎｇ／ｍＬを加え、感染２週間後および４週間後に評価したマウスの細菌量。動物群ｎ＝６。（Ｃ〜Ｄ）野生型Ｘ４７（ＷＴ）株またはｕｒｅＰｔｅｔＯ株の感染１週間後（ｎ＝３）、および（Ｅ）２週間後（ｎ＝６）のマウスの細菌量。マウスの飲用水に種々の濃度のｄｏｘを添加し、感染開始前にｕｒｅＰｔｅｔＯ株を誘導した。（Ｆ）ｕｒｅＰｔｅｔＯ株の感染は、ｄｏｘの添加に依存する。ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ４；ｕｒｅＰｔｅｔＯＩの強制経口投与後２週間、マウスにｄｏｘを添加した。その後、ｄｏｘ添加を止め、０、１、３、７および１４日目に細菌量を評価した。１群のマウスにはｄｏｘ添加を行わず（ｎｅｇ）、第２の群には試験期間の間ｄｏｘを施した（ｐｏｓ）。動物群ｎ＝６。 図１０は、Ｈ．ピロリＸ４７株ｍｄａｂ：：ｐｔｅｔＲ１〜７によるＴｅｔＲｓの発現のウエスタンブロット分析を示す。ｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲ６で形質転換された大腸菌株を陽性対照（ｐｏｓ）として用いた。Ｘ４７受容株ｍｄａｂ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴを陰性対照（ｎｅｇ）として用いた。ＴｅｔＲタンパク質バンドをを黒い矢印で示す。 図１１は、Ｈ．ピロリゲノムのｍｄａＢ遺伝子座への標的組み込みに使用されるｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲのベクターマップを示す。 図１２は、相同組換えによるＨ．ピロリゲノムのＧｌｔＤＨ遺伝子座へのＤＮＡの標的挿入に使用されるベクターの構築物マップを示す。（Ａ）ｐＧｌｔＤＨクローニングベクター、（Ｂ）ＧｌｔＤＨ遺伝子座におけるＨ．ピロリ受容株を作出するために使用される、ｒｐｓＬ−ＣＡＴを含有するｐＧｌｔＤＨ−ＲＣＡＴ。 図１３は、相同組換えによるＨ．ピロリゲノムのＴｒｐＡ遺伝子座へのＤＮＡの標的挿入に使用されるベクターの構築物マップを示す。（Ａ）ｐＴｒｐＡクローニングベクター、（Ｂ）ＴｒｐＡ遺伝子座におけるＨ．ピロリ受容株を作出するために使用される、ｒｐｓＬ−ＣＡＴを含有するｐＴｒｐＡ−ＲＣＡＴ。 図１４は、相同組換えによるＨ．ピロリゲノムのＤａｐＢ遺伝子座へのＤＮＡの標的挿入に使用されるベクターの構築物マップを示す。（Ａ）ｐＨｄａｐＢクローニングベクター、（Ｂ）ＤａｐＢ遺伝子座におけるＨ．ピロリ受容株を作出するために使用される、ｒｐｓＬ−ＣＡＴを含有するｐＨｄａｐＢ−ＲＣＡＴ。 図１５は、ＧＦＰと融合されたｔｅｔ応答性ｕＰｔｅｔＯの構築物マップを示す。（Ａ）ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰの詳細マップ。（Ｂ）ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ変異体にクローニングされたｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰ。 図１６は、Ｈ．ピロリゲノムの（Ａ）ＧｌｔＤＨ遺伝子座、（Ｂ）ｔｒｐＡ遺伝子座および（Ｃ）ｄａｐＢ遺伝子座への標的組み込みのための受容ベクターにクローニングされたｔｅｔ応答性ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰの構築物マップを示す。 図１７は、食餌へのマンノースおよびガラクトースの添加がＨ．ピロリノックイン変異体を維持する、Ｈ．ピロリ除菌のための糖シャントを作り出す方法を示す。 図１８は、ＬＰＳ上でのルイス抗原の発現を示す。Ｈ．ピロリ菌を、マンノース（０．５％）を含むまたは含まない血液寒天プレート上で増殖させ、ＬＰＳ抽出および抗ルイスＹ抗原を用いたウエスタンブロットのための処理を施した。ＬＰＳ上のルイス抗原の存在は、約２６ｋＤａのバンドとして検出される。レーン１は、マンノースを含む場合のＷＴ；レーン２および３は、それぞれマンノースを含まない場合と含む場合のＨＰ００４３欠失変異体；レーン４および５は、それぞれマンノースを含まない場合と含む場合の、ＧＭＰピロホスホリラーゼを補ったＨＰ００４３欠失変異体；レーン６および７は、それぞれマンノースを含まない場合と含む場合の、ＧＭＰピロホスホリラーゼおよびヘキソキナーゼ１を補ったＨＰ００４３欠失変異体のクローン＃１；レーン８および９は、それぞれマンノースを含まない場合と含む場合の、ＧＭＰピロホスホリラーゼおよびヘキソキナーゼ１を補ったＨＰ００４３欠失変異体のクローン＃２。 図１９は、ＬＰＳ上でのルイス抗原の発現および増殖阻害を示す。Ｈ．ピロリ菌を、マンノース（０．５％）を含むまたは含まない液体培地で増殖させ、ＬＰＳ抽出および抗ルイスＹ抗原を用いたウエスタンブロットのための処理を施した。ＬＰＳ上のルイス抗原の存在は、約２６ｋＤａのバンドとして検出される。Ｗｔは野生型、ＲＣは受容株（ΗΡ００４３ノックアウト）、＃１１６はマンノースシャントを有するクローン１、および＃１１７はマンノースシャントを有するクローン２。 図２０は、マンノースシャントを有する８つのクローンに関する、マンノースの存在下または不在下での細胞増殖を示す。 図２１は、組換え型Ｈ．ピロリのｉｎ ｖｉｖｏマンノース媒介除菌を示す。マウスにマンノースシャントを有する組換え型Ｈ．ピロリを感染させ、２週間のコロニー形成の後に、マウスに飲用水中５％のマンノースを与えた。５日間のマンノース食餌添加の後に、マウスを犠牲にし、各胃当たりのコロニー形成単位を測定した。 図２２は、Ｈ．ピロリにおけるｃｒｅ発現のＴｅｔＲｓ調節を示す。細菌を、５０ｎｇ／ｍｌのＡＴｃを含むまたは含まない液体培養で増殖させ、免疫ブロット法によって分析した。ｐＭｄａＢ−ＰｔａＴａａｔ−ＴｅｔＲｓで形質転換された大腸菌株を陽性対照（ｐｏｓ）として用いた。Ｘ４７株を陰性対照（ｎｅｇ）として用いた。Ｃｒｅは、１μｇ／ｍｌ濃度のポリクローナルウサギ抗Ｃｒｅ抗体を用いて検出した。 図２３は、Ｌｏｘ６６７１カセットの概略図を示す。このカセットは２つのｌｏｘ部位（Ｌｏｘ６６とＬｏｘ７１）に挟み込まれており、それらの非パリンドローム型コア配列は、これらのｌｏｘ部位の間の配列のｃｒｅ介在切断を可能とするように同じ方向を向いている。これらのｌｏｘ部位の間にはコアウレアーゼプロモーターおよびｄａｐＡ遺伝子がある。ＰｕｒｅＡはＳａｌＩにより、ｄａｐＡの上流にＲＢＳを残して切断され得る。 図２４は、Ｈ．ピロリにおけるＣｒｅ／ｌｏｘ切断を示す。ｕｒｅＢＩ遺伝子座でのｌｏｘ６６７１カセットの構築の様々な段階におけるｕｒｅＢＩ遺伝子座の概略図。数字は、矢印で示されるプライマーｕｒｅＢ＿ｓｅｑＦおよびｕｒｅＩ＿ｓｅｑＲを用いた場合に予測されるＰＣＲ断片サイズを示す。 図２５は、Ｈ．ピロリにおけるＣｒｅ／ｌｏｘ切断を示す。Ｈ．ピロリ株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２：：ｔｒｐＡ：：ｕＰｔｅｔＯ（１／２）−Ｃｒｅ（クローン１〜８）のゲノムＤＮＡが、プライマーｕｒｅＢ＿ｓｅｑＦおよびｕｒｅＩ＿ｓｅｑＲを用いたＰＣＲにおいて鋳型として使用されたことを示すＤＮＡ電気泳動。Ｘ４７（Ｃ１）のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡ ｐＢＩ−Ｌｏｘ６６７１（Ｃ２）を対照として用いた。 図２６は、ｔｅｔＲｓおよびＨ．ピロリにおけるｔｅｔＲの発現を示す。Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｔａＴａａｔ−ｔｅｔＲｓクローン１〜４株によるｔｅｔＲｓの発現およびＸ４７ ｍｄａＢ：：ＰａｍｉＥ−ｔｅｔＲ株によるｔｅｔＲの発現のウエスタンブロット分析。ｐＭｄａＢ−ＰｔａＴａａｔ−ＴｅｔＲｓで形質転換された大腸菌株を陽性対照（ｐｏｓ）として用いた。Ｘ４７株を陰性対照（ｎｅｇ）として用いた。ＴｅｔＲｓは、ポリクローナルウサギ抗ＴｅｔＲ抗体を用いて検出した。 図２７は、（Ａ）テトラサイクリン応答性プロモーターｕＰｔｅｔＯ５構築物の概略図を示す。２つのｔｅｔＯ部位が白いボックスで示されている。星は、全てのｕＰｔｅｔＯ構築物において見られる、−１０ボックス内におけるＣからＴへの突然変異を示す。（Ｂ）（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５構築物のヌクレオチド配列。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）および開始コドンを下線で示し、これらの配列の突然変異を太字で示す。 図２８は、構築物１〜６ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅのｃｒｅ発現を示す。（Ａ）プラスミドｐＴｒｐＡ−（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅを有する大腸菌株のウエスタンブロット分析。ｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ２−Ｃｒｅ（ｐｏｓ）またはｐＴｒｐＡ−ＲＣＡＴ（ｎｅｇ）で形質転換された大腸菌株をそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた。（Ｂ）ｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ２−Ｃｒｅ（ｐｏｓ）およびＸ４７ ｔｒｐＡ：：ＲＣ（ｎｅｇ）を有する大腸菌をそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた場合の、Ｈ．ピロリＸ４７ ｔｒｐＡ：：（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−ｃｒｅのウエスタンブロット。Ｃｒｅは、１μｇ／ｍｌ濃度のポリクローナルウサギ抗Ｃｒｅ抗体を用いて検出した。 図２９は、ｃｒｅセンス−アンチセンスカセットの構築の概略図を示す。ｐＭＡ−アンチセンスは、転写ターミネーター（黒いボックス）に隣接するｔｒｐＡの５００ｂｐ上流および下流配列、多重クローニング部位ならびにＰａｍｉＥプロモーターを含む。（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−ｃｒｅ融合物をｐＭＡ−アンチセンスのＭＣＳにクローニングし、最終的なｃｒｅ誘導性センス−アンチセンスカセットを作出した。黒い矢印は転写開始点を示す。 図３０は、Ｈ．ピロリにおけるＬｏｘ６６７１組み込みの確認を示す。Ｈ．ピロリ株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓ；ｔｒｐＡ：：ａｓ（２／３／４／６）ｕＰｔｅｔＯ−ｃｒｅ；ｕｒｅＢＩ：：Ｌｏｘ６６７１（各クローン１＋２）のゲノムＤＮＡを、プライマーｕｒｅＢ＿ｓｅｑＦおよびｕｒｅＩ＿ｓｅｑＲを用いたＰＣＲにおいて鋳型として用いた。Ｘ４７ ｕｒｅＢＩ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴ（Ｃ１）、Ｘ４７（Ｃ３）およびＸ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２；ｔｒｐＡ：：ｕＰｔｅｔＯ２−Ｃｒｅ（Ｃ４）のゲノムＤＮＡならびにプラスミドＤＮＡ ｐＢＩ−Ｌｏｘ６６７１（Ｃ２）を対照として用いた。 図３１は、合成テトラサイクリン誘導性遺伝子発現カセット（ＩＥＣ）の概略図を示す。このカセットは、２つの要素、すなわち、ｆｌａＡプロモーター（ＰｆｌａＡ）の制御下のテトラサイクリンレプレッサー遺伝子ｔｅｔＲｓと、ｔｅｔ応答性プロモーターｕＰｔｅｔＯ４により制御される標的遺伝子ｆｌｉＣからなる。ＴｅｔＲｓは構成的に発現され、−３５ボックスと−１０ボックスの間のｕＰｔｅｔＯ４に存在する単一のｔｅｔＯ部位に結合する。ＴｅｔＲｓはＡＴｃによって誘導され、ｆｌｉＣの発現が可能となる。非コードＤＮＡのスペーサー領域はＰｆｌａＡとｕＰｔｅｔＯ４の間に存在して、ＩＥＣの２本のアームを分離している。このカセットは、黒いボックスで示される２つの転写ターミネーターで挟み込まれている。ＩＥＣの各要素は２つの独特な制限部位によって挟み込まれ、それが他のプロモーターまたは遺伝子と交換できるようになっている。 図３２は、Ｈ．ピロリＢ１２８におけるｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎの同定を示す。Ｈ．ピロリトランスコンジュガントクローン１〜５から抽出したプラスミドをＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化した。ｐＢ１２８およびｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎの予測制限パターンは６ｋｂ、５ｋｂ、および２．７ｋｂのＤＮＡ断片を含む。適正な制限パターンは見られなかった。参考に、大腸菌から抽出したｐＢ１２８（６ｋｂ）およびｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎの制限パターン（５ｋｂおよび２．７ｋｂ）を示す。（Ｕ）は未消化、（ＥＢ）はＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化したもの。 図３３は、Ｂ１２８ ｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎトランスコンジュガントのウエスタンブロット分析を示す。（Ａ）ＦｌｉＣｓｙｎ（５５ｋＤａ）は、１／１０００希釈のポリクローナルウサギ抗ＦｌｉＣ抗血清を用いて検出し、（Ｂ）ＴｅｔＲｓ（２３ｋＤａ）は、１：１０００希釈のポリクローナルウサギ抗ＴｅｔＲ抗体を用いて検出した。細菌は、５０ｎｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）を加えることによって誘導した。Ｈ．ピロリＢ１２８を陰性対照（ｎｅｇ）として用いた。 図３４は、Ｈ．ピロリにおけるＴｅｔＲにより調節されるＣｒｅ／ｌｏｘ切断系の概略図を示す。Ｔｅｔレプレッサーの構成的発現は、ｍｄａＢ遺伝子座におけるＰａｍｉＥによって駆動される。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現は、ｔｒｐＡ遺伝子座におけるｔｅｔ応答性プロモーターｕＰｔｅｔＯによって制御される。テトラサイクリンにより誘導されるＣｒｅ発現は、ｕｒｅＢＩ遺伝子座に組み込まれたｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１部位によって挟み込まれた（Ｌｏｘ６６７１カセット）ＰｕｒｅＡ−ｄａｐＡ融合物の切断をもたらすことになる。

配列の簡単な説明
本発明の記載全体を通して以下の核酸およびアミノ酸配列が参照される。
配列番号１ ｐＭｄａＢ− ｐＢｌｕ−ＳＫ−ａｌｔの誘導体、ＨＰ０６３０およびＨＰ０６３１と相同な領域を含有、多重クローニング部位を含有

配列番号２ ｐＭｄａＢ−ＲＣＡＴ−ｐＭｄａＢの誘導体、ｒｐｓＬ−ＣＡＴ

配列番号３ ｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲ１−ｐＭｄａＢの誘導体、ＰａｍｉＥ−ｒｅｖｔｅｔＲ

配列番号４ ｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲ２−ｐＭｄａＢの誘導体、ＰａｍｉＥ−ｔｅｔＲ

配列番号５ ｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲ３−ｐＭｄａＢの誘導体、ＰｆｌａＡ−ｒｅｖｔｅｔＲ

配列番号６ ｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲ４−ｐＭｄａＢの誘導体、ＰｆｌａＡ−ｔｅｔＲ

配列番号７ ｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲ５−ｐＭｄａＢの誘導体、ＰｔａＴａａｔ−ｒｅｖｔｅｔＲ

配列番号８ ｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲ６−ｐＭｄａＢの誘導体、ＰｔａＴａａｔ−ｔｅｔＲ

配列番号９ ｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲ７−ｐＭｄａＢの誘導体、ＰｔａＣａａｔ−ｒｅｖｔｅｔＲ

配列番号１０ ｐＢｌｕ＿ｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰ−ｐＢｌｕ−ＢＩの誘導体、ｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰ

配列番号１１ ｐＢｌｕ＿ｕＰｔｅｔＯ２−ＧＦＰ−ｐＢｌｕ−ＢＩの誘導体、ｕＰｔｅｔＯ２−ＧＦＰ

配列番号１２ ｐＢｌｕ＿ｕＰｔｅｔＯ３−ＧＦＰ−ｐＢｌｕ−ＢＩの誘導体、ｕＰｔｅｔＯ３−ＧＦＰ

配列番号１３ ｐＴｒＡ−ｐＢｌｕ−ＳＫ−ａｌｔの誘導体、ＨＰ１２７７と相同な領域を含有、多重クローニング部位を含有

配列番号１４ ｐＴｒｐＡ−ＲＣＡＴ−ｐＴｒｐＡの誘導体、ｒｐｓＬ−ＣＡＴ

配列番号１５ ｐＧｌｔＤＨ−ｐＢｌｕ−ＳＫ−ａｌｔの誘導体、ＨＰ０３７９およびＨＰ０３８０と相同な領域を含有、多重クローニング部位を含有

配列番号１６ ｐＧｌｔＤＨ−ＲＣＡＴ−ｐＧｌｔＤＨの誘導体、ｒｐｓＬ−ＣＡＴ

配列番号１７ ｐＨｄａｐＢ−ｐＨＳＧ５７６の誘導体、ＨＰ０５０９およびＨＰ０５１１と相同な領域を含有、多重クローニング部位を含有

配列番号１８ ｐＨｄａｐＢ−ＲＣＡＴ−ｐＨｄａｐＢの誘導体、ｒｐｓＬ−ＣＡＴ

配列番号１９ ｕｒｅＰｔｅｔＯＩ−それぞれ−３５の前および−３５と−１０の間の位置にテトラサイクリンオペレーターの２箇所の挿入を有するウレアーゼプロモーター

配列番号２０ ｕｒｅＰｔｅｔＯＩＩ− −３５と−１０の間の位置にテトラサイクリンオペレーターの１箇所の挿入を有するウレアーゼプロモーター

配列番号２１ ｕｒｅＰｔｅｔＯＩＩＩ−それぞれ−３５の前、−３５と−１０の間、および−１０の後の位置にテトラサイクリンオペレーターの３箇所の挿入を有するウレアーゼプロモーター

配列番号２２ ｕｒｅＰｔｅｔＯＩＶ−それぞれ−３５と−１０の間、および−１０の後の位置にテトラサイクリンオペレーターの２箇所の挿入を有するウレアーゼプロモーター

配列番号２３ ｕｒｅＰｔｅｔＯＶ− −１０の後の位置にテトラサイクリンオペレーターの１箇所の挿入を有するウレアーゼプロモーター

配列番号２４ ｔｅｔ１ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号２５ ｔｅｔ２ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号２６ ｔｅｔ３ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号２７ ｔｅｔ４ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号２８ ｔｅｔ５ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号２９ ｔｅｔ６ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号３０ ｔｅｔ７ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号３１ ｔｅｔ８ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号３２ ｔｅｔ９ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号３３ ｔｅｔ１０ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号３４ ｔｅｔ１１ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号３５ ｔｅｔ１２ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号３６ ｔｅｔ１３ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号３７ ｔｅｔ１４ ｐｔｅｔＲの構築

配列番号３８ ｐｔｅｔＲをｐＢｌｕ＿ｍｄａＢにクローニングするためのｍｂｔｅｔフォワードプライマー

配列番号３９ ｐｔｅｔＲをｐＢｌｕ＿ｍｄａＢにクローニングするためのｍｂｔｅｔリバースプライマー

配列番号４０ ｒｅｐｓＬ−ＣＡＴによるｕｒｅＡの不活性化のためのｕｒｅＡｒｃａｔ１

配列番号４１ ｒｅｐｓＬ−ＣＡＴによるｕｒｅＡの不活性化のためのｕｒｅＡｒｃａｔ２

配列番号４２ ｒｅｐｓＬ−ＣＡＴによるｕｒｅＡの不活性化のためのｕｒｅＡｒｃａｔ３

配列番号４３ ｒｅｐｓＬ−ＣＡＴによるｕｒｅＡの不活性化のためのｕｒｅＡｒｃａｔ４

配列番号４４ ｒｅｐｓＬ−ＣＡＴによるｕｒｅＡの不活性化のためのｕｒｅＡｒｃａｔ５

配列番号４５ ｒｅｐｓＬ−ＣＡＴによるｕｒｅＡの不活性化のためのｕｒｅＡｒｃａｔ６

配列番号４６ ｒｅｐｓＬ−ＣＡＴによるｕｒｅＡの不活性化のためのｕｒｅＡｒｃａｔ７

配列番号４７ ｒｅｐｓＬ−ＣＡＴによるｕｒｅＡの不活性化のためのｕｒｅＡｒｃａｔ８

配列番号４８ ｕｒｅＡプロモーターの再構築のためのｕｒｅＡｔｅｔＯ１

配列番号４９ ｕｒｅＡプロモーターの再構築のためのｕｒｅＡｔｅｔＯ２

配列番号５０ ｕｒｅＡプロモーターの再構築のためのｕｒｅＡｔｅｔＯ３

配列番号５１ ｕｒｅＡプロモーターの再構築のためのｕｒｅＡｔｅｔＯ４

配列番号５２ ｕｒｅＡプロモーターの再構築のためのｕｒｅＡｔｅｔＯ５

配列番号５３ ｕｒｅＡプロモーターの再構築のためのｕｒｅＡｔｅｔＯ６

配列番号５４ ｕｒｅＡプロモーターの再構築のためのｕｒｅＡｔｅｔＯ７

配列番号５５ ｕｒｅＡプロモーターの再構築のためのｕｒｅＡｔｅｔＯ８

配列番号５６ ｕｒｅＡＢプロモーターのシークエンスのためのｕｒｅＰｓｅｑプライマー

配列番号５７ ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰの構築のためのｔｅｔＯＧＦＰ１

配列番号５８ ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰの構築のためのｔｅｔＯＧＦＰ２

配列番号５９ ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰの構築のためのｔｅｔＯＧＦＰ３

配列番号６０ ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰの構築のためのｔｅｔＯＧＦＰ４

配列番号６１ ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰの構築のためのｔｅｔＯＧＦＰ５

配列番号６２ ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰの構築のためのｔｅｔＯＧＦＰ６

配列番号６３ ＭｄａＢ１はｐＭｄａＢクローニングベクターである

配列番号６４ ＭｄａＢ２はｐＭｄａＢクローニングベクターである

配列番号６５ ＭｄａＢ３はｐＭｄａＢクローニングベクターである

配列番号６６ ＭｄａＢ４はｐＭｄａＢクローニングベクターである

配列番号６７ ＧｌｔＤＨ１はｐＧｌｔＤＨクローニングベクターである

配列番号６８ ＧｌｔＤＨ２はｐＧｌｔＤＨクローニングベクターである

配列番号６９ ＧｌｔＤＨ３はｐＧｌｔＤＨクローニングベクターである

配列番号７０ ＧｌｔＤＨ４はｐＧｌｔＤＨクローニングベクターである

配列番号７１ ＴｒｐＡ１ − ｐＴｒｐＡクローニングベクター

配列番号７２ ＴｒｐＡ２ − ｐＴｒｐＡクローニングベクター

配列番号７３ ＴｒｐＡ３ − ｐＴｒｐＡクローニングベクター

配列番号７４ ＴｒｐＡ４ − ｐＴｒｐＡクローニングベクター

配列番号７５ ＤａｐＢ１ − ｐＨｄａｐＢクローニングベクター

配列番号７６ ＤａｐＢ２ − ｐＨｄａｐＢクローニングベクター

配列番号７７ ＤａｐＢ３ − ｐＨｄａｐＢクローニングベクター

配列番号７８ ＤａｐＢ４ − ｐＨｄａｐＢクローニングベクター

配列番号７９ ＤａｐＢ５ − ｐＨｄａｐＢクローニングベクター

配列番号８０ ＤａｐＢ６ − ｐＨｄａｐＢクローニングベクター

配列番号８１ ＭＳ＿ＮｄｅＩ−Ｃｒｅ − ｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ２−Ｃｒｅの構築のためのフォワードプライマー

配列番号８２ ＭＳ＿Ｃｒｅ−ＳａｌＩ − ｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ２−Ｃｒｅの構築のためのリバースプライマー

配列番号８３ ＭＳ＿ｕｒｅＢｓｅｑ − Ｌｏｘカセットのためのフォワードプライマー

配列番号８４ ＭＳ＿ｕｒｅＩｓｅｑ − Ｌｏｘカセットのためのリバースプライマー

配列番号８５ ＭＳ＿ＮｄｅＩ−ＦｌｉＣ − ｐＭＡ−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎの構築のためのフォワードプライマー

配列番号８６ ＭＳ＿ＦｌｉＣ−ＳａｌＩ − ｐＭＡ−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎの構築のためのリバースプライマー

配列番号８７ コドンが最適化されたＣｒｅ Ｈ．ピロリ

配列番号８８ Ｌｏｘ６６７１カセット

配列番号８９ コドンが最適化されたｔｅｔＲｓ Ｈ．ピロリ

配列番号９０ １ｕＰｔｅｔＯ５

配列番号９１ ２ｕＰｔｅｔＯ５

配列番号９２ ３ｕＰｔｅｔＯ５

配列番号９３ ４ｕＰｔｅｔＯ５

配列番号９４ ５ｕＰｔｅｔＯ５

配列番号９５ ６ｕＰｔｅｔＯ５

配列番号９６ ｐＴｒｐＡ−ａｓ４ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅ

配列番号９７ ＩＥＣ−ＬＬＯ

配列番号９８ コドンが最適化されたｆｌｉＣｓｙｎ Ｈ．ピロリ

配列番号９９ ＩＥＣ−Ｔｓ−ｆｌｉＣｓｙｎ

配列番号１００ ｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎ

用語の定義
本明細書において、特定の用語は以下に定義される意味を持ち得る。本明細書および特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、複数の言及を包含する。例えば「細胞」という用語は、その混合物を含めた複数の細胞を包含する。同様に、本明細書に記載される処置または薬剤調製のための「化合物」の使用も、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、そのような処置または調製のために１または複数の本発明の化合物を使用することを意図する。

本明細書において「含む」という用語は、その組成物および方法が列挙された要素を包含するが、他を排除するものではないことを意味することを意図する。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用する場合、その組合せにとって本質的に重要な他の要素を排除することを意味するものとする。従って、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量混入物、ならびにリン酸緩衝生理食塩水および保存剤などの薬学上許容される担体を排除しない。「からなる」は、他の成分の微量とは言えない量の要素および本発明の組成物を投与するための実質的方法工程を排除することを意味するものとする。これらの変化する用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。

Ｈ．ピロリ株は、それらが機能的ウレアーゼ遺伝子を有する限り、全て本願の範囲に含まれる。特に好ましいＨ．ピロリ株としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ受託番号４３５０４；４３５０４Ｄ−５；４３５２６；４３５７９；４３６２９；４９３９６；４９５０３；５１１１０；４９５０３；５１１１１；５１４０７；５１６５２；５１６５３；５１９３２；および５３７２７として寄託されている株が挙げられる。さらに、例えば、参照により本明細書に組み込まれる特許文献１も参照。他の好ましいヘリコバクター・ピロリ株としては、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに受託番号Ｖ０９／００９１０１；Ｖ０９／００９１０２；Ｖ０９／００９１０３；Ｖ１０／０１４０５９；Ｖ１０／０１４０６０およびＶ０９／００９１０４として寄託されている株が挙げられる。

本明細書において「単離された」という用語は、あるＨ．ピロリ細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、該Ｈ．ピロリ細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然に存在する環境とは異なる環境にあることを表すことを意味する。単離された遺伝子改変Ｈ．ピロリ細胞は、Ｈ．ピロリ細胞の混合集団中に存在してもよい。

「遺伝子改変」Ｈ．ピロリとは、その表現型および／または遺伝子型が、対応する野生型Ｈ．ピロリとは異なるＨ．ピロリ菌を指す。より具体的には、本発明の遺伝子改変Ｈ．ピロリは、本発明の遺伝子構築物で形質転換されたものである。一般にＨ．ピロリを含む細菌の遺伝子改変法は当技術分野で周知であり、例えば、非特許文献１２を参照のこと。

「ウレアーゼ」または「ウレアーゼオペロン」とはＨ．ピロリのウレアーゼをコードする遺伝子を指し、これはすでに記載され、配列決定されている（例えば、非特許文献１３参照）。ウレアーゼ発現および分泌に関与する７つの遺伝子のうち、２つの遺伝子のみが、ウレアーゼ酵素の２つの構造的サブユニットであるウレアーゼＡおよびＢをコードする。これらの２つのポリペプチドは、ウレアーゼ活性を有するポリペプチド複合体（オペロン）を形成する。

ウレアーゼ活性は、いくつかの方法で測定することができる。例えば、ウレアーゼは尿素を炭酸アンモニウムに変換し、続いてアンモニアと二酸化炭素に分解することが知られている。その結果、従来、Ｈ．ピロリの存在を検出するための１つの試験は、胃物質のサンプルを尿素および指示薬、すなわち、ｐＨが上昇すると色が変化するｐＨ指示薬、を含有する組成物と接触させる工程を包含するものであった。ウレアーゼが胃物質中に存在すれば、それは尿素に分解し、その結果さらなる分解の後にアンモニアが生成し、ｐＨ指示薬の色の変化が起こる。Ｈ．ピロリのウレアーゼ活性は、被験者に尿素を経口投与しつつ、その後吐き出される二酸化物およびアンモニアをモニタリングすることによって検出することもできる。ウレアーゼ活性の種々の試験が、参照により本明細書に組み込まれる特許文献２および特許文献３に記載されている。

「機能的断片」という用語は、本明細書で使用される場合、天然分子と同様の機能を果たす能力をなお有する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの断片（すなわち、天然型に比べてサイズ縮小または末端切断された分子）を指す。

本明細書で使用される「核酸」という用語は、任意の長さの高分子形態のヌクレオチドを指し、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである。従って、この用語は、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、または多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマーまたはその他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に改変されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を包含する。

「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さの高分子形態のアミノ酸を指し、コードアミノ酸および非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的に改変されたアミノ酸または誘導体化されたアミノ酸、および改変されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを指す。

２つのアミノ酸配列または２つの核酸の「同一性（相同性）パーセント」は、非特許文献１４のように改変した非特許文献１５のアルゴリズムを用いて決定される。このようなアルゴリズムは、非特許文献１６のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るには、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行う。参照ポリペプチド（例えば、配列番号２）に相同なアミノ酸配列を得るには、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を行う。比較の目的で、ギャップを含むアライメントを得るには、非特許文献１７に記載されているように、ギャップを含むＢＬＡＳＴを用いる。ＢＬＡＳＴおよびギャップを含むＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いる。これらはワールドワイドウェブのＵＲＬ「ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．」でおそらく見出すことができる。

本明細書において「外因性核酸」という用語は、通常または天然にはＨ．ピロリ中に見られない、かつ／または天然においてはＨ．ピロリによって産生されない核酸を指す。本明細書において、「内因性核酸」という用語は、通常Ｈ．ピロリ中に存在する、かつ／または天然においてＨ．ピロリによって産生される核酸を指す。「内因性核酸」は「天然核酸」またはＨ．ピロリに対して「天然」である核酸とも呼ばれる。

「異種核酸」という用語は、本明細書において、下記のうち少なくとも１つに当てはまる核酸を指す：（ａ）その核酸がＨ．ピロリに対して外来（「外因性」）である（すなわち、天然にはＨ．ピロリ中に見られない）こと；（ｂ）その核酸が天然にＨ．ピロリ中に見出される（例えば、内因性の）ヌクレオチド配列を含む（例えば、その核酸がＨ．ピロリに対して内因性のヌクレオチド配列を含む）が、非自然的な（例えば、予想より多いもしくは天然に見られるものより多い）量で細胞内に産生される、または内因性ヌクレオチド配列と配列が異なり、その結果、内因的に見られるものと同じコードタンパク質（同じもしくは実質的に同じアミノ酸配列を有する）が非自然的な（例えば、予想より多いもしくは天然に見られるものより多い）量で細胞内に産生されること；（ｃ）その核酸が天然において互いに同じ関係では見られない２以上のヌクレオチド配列またはセグメントを含む、例えば、その核酸が組換え型であること。

「組換え」とは、本明細書において、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、天然系で見られる内因性核酸と区別できる構造的コード配列または非コード配列を有する構築物を生じるクローニング、制限、および／または連結工程の種々の組合せの産物であることを意味する。一般的に、構造的コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられて、細胞中または無細胞転写翻訳系に含有される組換え転写単位から発現できる合成核酸を提供することができる。このような配列は、一般的に真核生物遺伝子に存在する内部非翻訳配列すなわちイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供することができる。適切な配列を含むゲノムＤＮＡは、組換え遺伝子または転写単位の形成にも使用することができる。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’または３’側に存在してもよく、そこでこのような配列はコード領域の操作または発現に干渉せず、実際に様々な機構によって所望の産物の産生を調節する働きをする可能性がある。

従って、例えば、「組換え」ポリヌクレオチドまたは「組換え」核酸という用語は、天然に存在しない、例えば、本来は分離されている２つの配列セグメントのヒトの介入による人工的な組合せによって作製されるものを指す。この人工的な組合せは、多くの場合、化学合成手段によって、または単離された核酸セグメントの人工的操作によって、例えば、遺伝子操作技術によって達成される。これは通常、典型的には配列認識部位を導入または除去するとともに、あるコドンを同じまたは保存的アミノ酸をコードする冗長なコドンで置換するために行われる。あるいは、それは、所望の機能の組合せを生成するように所望の機能の核酸セグメントを互いに連結させるために行われる。この人工的な組合せは、多くの場合、化学合成手段によって、または単離された核酸セグメントの人工的操作によって、例えば、遺伝子操作技術によって達成される。

同様に、「組換え」ポリペプチドという用語は、天然に存在しない、例えば、本来は分離されている２つのアミノ配列セグメントのヒトの介入による人工的な組合せによって作製されるポリペプチドを指す。従って、例えば、異種アミノ酸配列を含むポリペプチドは組換え型である。

「ベクター」とは、特異的ヌクレオチド配列の発現および／または増幅を目的として生成された、または他の組換えヌクレオチド配列の構築に用いられる、組換え核酸、一般には組換えＤＮＡを意味する。

「ＤＮＡ調節配列」、「制御要素」、および「調節要素」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、Ｈ．ピロリ細胞内でコード配列の発現および／またはコードされるポリペプチドの産生を提供および／または調節する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写および翻訳制御配列を指す。

「ｔｅｔ」、「ｔｅｔレプレッサー」または「ＴｅｔＲ」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、ｔｅｔレプレッサー誘導系を指す。

「形質転換」という用語は、本明細書において「遺伝子改変」と互換的に用いられ、新しい核酸の導入後にＨ．ピロリ細胞において誘導される永続的または一時的な遺伝的変化を指す。遺伝的変化（「改変」）は、Ｈ．ピロリ細胞のゲノムへの新しいＤＮＡの組み込みによって、または組換えＨ．ピロリ細胞におけるそれらの維持を補助するために１または複数の選択マーカーを含有してもよい、プラスミドまたは発現ベクターなどのエピソーム要素としての新しいＤＮＡの一時的もしくは安定的な維持によって達成することができる。遺伝子改変の好適な方法には、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどが含まれる。これらの方法に関する一般的な考察は、非特許文献１８に見出すことができる。

「形質転換性の核酸配列」とは、本明細書において、本発明の遺伝子構築物をコードする核酸配列を含有する、プラスミドベクターまたは他の発現カセットを意味する。本発明のいくつかの実施形態では、核酸配列は１または複数の抗原をコードすることができる。「形質転換性の核酸配列」とはまた、本発明の特定の実施形態によれば、「導入遺伝子」を意味するためにも用いることができる。本発明の別の実施形態では、形質転換性の核酸配列は、プロモーターおよび／または他の調節要素をコードする核酸配列を含む。

「遺伝子構築物」とは、少なくとも２つの要素（ａ）プロモーター配列と（ｂ）対象ＤＮＡ配列、好ましくは、ウレアーゼサブユニットＡおよびＢをコードするオペロンを含む核酸配列である。いくつかの実施形態では、遺伝子構築物は（ｃ）遺伝子終結配列も含む。

「機能的に連結される」とは、そのように記載された成分がそれらの意図される様式でそれらを機能させる関係にある並置を指す。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターはコード配列に機能的に連結されている。本明細書において「異種プロモーター」および「異種制御領域」という用語は、天然においては特定の核酸に通常結合していないプロモーターおよび他の制御領域を指す。例えば、「コード領域に対して異種である転写制御領域」は、天然においてはコード領域に通常結合していない転写制御領域である。

「プロモーター」という用語は、本発明の遺伝子構築物に関して用いられる場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＨ．ピロリにおいて対象ＤＮＡ配列またはウレアーゼオペロンの発現を調節することができるポリヌクレオチド配列を指す。より具体的には、プロモーター配列は、本明細書で定義されるテトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を含むように改変されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、Ｈ．ピロリに内在するものである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ａｍｉＥプロモーター、コアウレアーゼプロモーター、ｒｅｖｔｅｔＲプロモーターおよびｆｌａＡプロモーターからなる群から選択される。

「保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質における、類似の側鎖を有するアミノ酸残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびトレオニンからなり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンからなり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなり；また、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。

「ワクチン組成物」、「ワクチン」、「免疫原性組成物」、および類似の用語は、本発明の遺伝子構築物を発現し、従って、哺乳類に投与した際にＨ．ピロリが慢性感染を確立し、Ｈ．ピロリ自体または本明細書で定義される対象ＤＮＡの発現産物に対する哺乳類の免疫応答を惹起する、生きた遺伝子改変Ｈ．ピロリ株を含む組成物を指す。例えば、対象ＤＮＡが抗原をコードする場合、哺乳類における免疫応答はＨ．ピロリで発現される抗原に対するものとなり、それにより、抗原に対して少なくとも部分的な防御免疫を提供する。このような防御免疫は、限定されるものではないが、１または複数の疾病症状の軽減、疾病持続期間の短縮、組織損傷の軽減、健康な組織の再生、哺乳類からの病原微生物の除去、および哺乳類による健康であるという感じの増大を含む、種々の観察可能なまたは検出可能な状態のいずれを証拠としてもよい。強く望まれることであるが、当業者には、ワクチンを投与した全個体に疾患からの完全な防御を誘導すると期待されるワクチンはないこと、または防御免疫はワクチン組成物の定期的な「追加免疫」投与なく個体の生涯にわたって持続すると期待されることが理解されよう。また、本明細書に記載の遺伝子改変Ｈ．ピロリを含む生ワクチンは、疾患の症状は現れていないが感染リスクがあると考えられる個体、または例えば感染哺乳類、または汚染された空気、液体もしくは表面への接近もしくは接触によってすでに疾患に曝されたことが知られている個体に、医療専門家の判断で投与されてもよいと理解される。

本明細書に記載される本発明の遺伝子改変Ｈ．ピロリの「治療上有効な量」は、所望の応答を惹起するために有効であるが毒性反応を引き起こすには不十分な量を含むと理解される。所望の応答は、例えば、血液サンプルにおいて、十分かつ／または許容される検出可能な抗体価レベルの形成であってもよい。哺乳類に投与される製剤の用量および処置期間は、処置を必要とする哺乳類被験体を担当する医療専門家によって決定され、被験体の齢、性別および体重、ならびに発現されている特定のＨ．ピロリおよび核酸分子を考慮する。

「経口」、「経腸」、「経腸的」、「経口的」、「非腸管外」および「非腸管外的」などの用語は、消化管に沿った経路または様式による、哺乳類への本発明の遺伝子改変Ｈ．ピロリの投与を指す。ワクチン組成物の投与の「経口」経路の例としては、限定されるものではないが、口からの液体または固体形態のワクチン組成物の嚥下、経鼻空腸管または胃瘻管を介するワクチン組成物の投与、ワクチン組成物の十二指腸内投与、および例えば本明細書に記載の生菌ワクチン株を消化管の下部消化管に放出する坐剤を用いる直腸投与が挙げられる。

「抗原に対して免疫寛容を誘導する」という用語は、対象ＤＮＡの産物、例えば抗原の、粘膜送達用の薬剤、医療食または栄養補助食品の調製のための産物を分泌する単離された遺伝子改変Ｈ．ピロリによる、粘膜送達を含む。

「異種」抗原は、Ｈ．ピロリに対して天然ではない抗原、すなわち、天然においてまたはＨ．ピロリに導入する前にはＨ．ピロリによって発現されない抗原である。

本明細書において「検出可能な免疫応答」は、抗原に応答して哺乳類内で形成される抗体（体液性）または細胞傷害（細胞性）応答のいずれかであり、限定されるものではないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、補体結合アッセイ（ＣＦ）、ウェスタンブロット（ＷＢ）またはそれらの同等法を含む慣例の実験法を用いて測定することができる。

本明細書において「粘膜のコロニー形成」は、限定されるものではないが、口腔粘膜、食道粘膜、胃粘膜、鼻腔粘膜、気管支粘膜および子宮粘膜を含む哺乳類組織の内面内または内面上に感染、好ましくは、慢性感染を確立する本発明のヘリコバクター株の能力を指す。好ましくは、粘膜は胃粘膜である。

本明細書において「慢性感染」は、数日程度の短期間持続する「急性感染」または「一過性感染」に対して、数週間または数ヶ月程度の長期間の感染を意味する。

本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特に具体的に示された方法に限定されるものでなく、当然、変更してもよいと理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、単に本発明の特定の実施形態を記載することを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される以外は限定を意図しないものと理解されるべきである。

本明細書において上記または下記に引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み込まれる。ただし、本明細書で述べられている刊行物は、当該刊行物に報告されている、また、本発明に関連して使用される可能性のあるプロトコール、試薬およびベクターを記載および開示する目的で引用される。ここで、先行発明を理由として、本発明がこのような開示に先行する権利がないことを認めるものとみなされるべきではない。

さらに、本発明の実施では、特に断りのない限り、当業者の範囲内にある製薬学、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を利用する。このような技術は当業者に周知であり、文献に十分に説明されている。例えば、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献１２、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８および非特許文献２９参照。

最も広い態様において、本発明は、５’から３’方向に（ａ）プロモーター配列と、（ｂ）対象ＤＮＡ配列とを含み、プロモーター配列が、ヘリコバクター・ピロリにおいて対象ＤＮＡ配列の発現を調節することができるポリヌクレオチド配列を含み、プロモーター配列がテトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を含むように改変されている、遺伝子構築物を提供する。

他所に記載されているように、好ましいプロモーターは、そのプロモーターから「下流」の遺伝子の発現を調節することができる、Ｈ．ピロリ由来のプロモーターである。特に好ましいプロモーターは、ウレアーゼオペロン、特にＵｒｅＡに関連するものである。プロモーターを単離する方法は当技術分野で周知であるが、要するに、Ｈ．ピロリの分離株から得られたゲノムＤＮＡを、標準的な技術により、好適なシャトルベクター、例えば、選択マーカー、例えば抗生物質マーカーを有するシャトルプラスミドに挿入する。広義には、好適なシャトルベクターは、以下の特徴、すなわち、クローニング部位、Ｈ．ピロリ複製起点、大腸菌複製起点、ならびに抗生物質耐性遺伝子および／または選択マーカーのうちの１つ、２つ、３つまたはそれを超えるものを含む。この目的に好適な、またはこの目的に容易に採用できる、技術分野で公知のベクターとしては、例えば、非特許文献３０に記載されている組換えシャトルプラスミドｐＨＲ１０６；非特許文献３１に記載されているＰＪＩＲ７５０およびＰＪＩＲ７５１プラスミド；非特許文献３２のプロモーターレスＰＰＳＶプロモーター選択ベクター；非特許文献３３に記載されているシャトルプラスミドｐＪＩＲ１４５６およびｐＪＩＲ１４５７；ならびに非特許文献３４に記載されているｐＡＫ２０１シャトルベクターが挙げられ、これらの内容は参照によりそれらの全内容が本明細書に組み込まれる。Ｈ．ピロリ複製起点を除去すると、シャトルベクターは自殺ベクターとなる。

次に、プロモーターを、テトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列のコード配列を導入するために変更または改変する。プロモーターに対する変更は、オリゴヌクレオチド媒介（部位指定）突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発などの当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。クローニングされたＤＮＡに対して部位指定突然変異誘発（非特許文献３５、非特許文献３６）、カセット突然変異誘発（非特許文献３７）、制限選択突然変異誘発（非特許文献３８）または他の公知の技術を行い、ウレアーゼ変異体ＤＮＡを作出することができる。

テトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列のコード配列が導入されれば、本発明の基本遺伝子構築物が産生される。次に、形質転換／トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介核酸導入、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ（Ｄｉｏｌｏｙｌｏｘｙ））プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート媒介形質転換、およびその他を含む核酸導入プロトコールを用いて、選択されたＨ．ピロリに遺伝子構築物を導入する。当業者ならば、当技術分野における知識およびデザイン選択肢に従って形質転換に成功したＨ．ピロリを選択するための適当なツールおよび方法を容易に選択することができる。

本発明の一実施形態では、遺伝子改変Ｈ．ピロリは、そのＨ．ピロリがＨ．ピロリによる感染を維持するために哺乳類宿主の食餌にマンノースおよび／またはガラクトースの添加を必要とするように改変される。他所に述べられているように、本発明の１つの目的は、外来ペプチド、例えば抗原の発現のために生物学的送達ビヒクルとして安全に使用することができる遺伝子改変Ｈ．ピロリを産生することである。これを達成するためには、Ｈ．ピロリ株は、ペプチドが発現されるように十分長く哺乳類粘膜の感染を確立できる必要がある。遺伝子改変Ｈ．ピロリがひと度、外来因子を発現したならば、それを除去することが好ましい。遺伝子改変Ｈ．ピロリを除去する１つの方法は、本明細書に記載のｔｅｔ系の使用である。別法としては、糖シャントの使用がある。ヘリコバクターゲノム分析によれば、マンノースがグルコースのみから生成されることが示される。Ｈ．ピロリＬＰＳは、コロニー形成および樹状細胞のＤＣ ｓｉｇｎ受容体を介した免疫調節に不可欠なルイス抗原（フコースおよびガラクトース）で修飾されていることが知られている。従って、ＬＰＳのルイス抗原の代謝制御は、Ｈ．ピロリのコロニー形成／除菌および免疫調節それぞれの制御を提供することができる。一実施形態において、Ｈ．ピロリのホスホマンノースイソメラーゼ（ＨＰ００４３）を欠失させて、コロニー形成の維持にマンノース添加を必要とする遺伝子改変Ｈ．ピロリを作出する。

以下、本発明を非限定的実施例のみに関してさらに説明する。しかしながら、以下の実施例は例示であり、いかなる形でも本明細書に記載の発明の一般性に対する制限とみなされるべきではないと理解されるべきである。

実施例１ ＴｅｔＲおよびｒｅｖＴｅｔＲを発現するＨ．ピロリ株の構築
テトラサイクリンレプレッサーを発現させるため、４つの異なるＨ．ピロリプロモーター、すなわち、ａｍｉＥ、ｆｌａＡ、およびウレアーゼオペロンの野生型と変異型双方のコアプロモーターを選択した（非特許文献３９）。ｔｅｔＲおよびｒｅｖｔｅｔＲをコードする配列を多重融合ＰＣＲにより各Ｈ．ピロリプロモーターと融合させ、プロモーター−ｔｅｔＲ（ｐｔｅｔＲ１〜８）構築物パネルを作製した（図１）。これらの構築物をｐＭｄａＢプラスミドにクローニングし、プラスミドｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲ１〜８を作製した（図１１）。受容株Ｈ．ピロリＸ４７（Ｘ４７ｍｄａＢ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴ）をこれらのプラスミドで自然形質転換することで、相同組換えにより、染色体のｍｄａＢ遺伝子座にｐｔｅｔＲ（１〜７）プロモーターを挿入することが可能であった。これらのＸ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ株におけるＴｅｔＲおよびｒｅｖＴｅｔＲの発現を免疫ブロット法によって分析した。Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ株におけるＴｅｔＲの発現は、大腸菌陽性対照（ｐｏｓ）に比べて有意に低い（図２および図１０）。ＴｅｔＲ発現株のシグナル強度は、等価なｒｅｖＴｅｔＲ発現株より高い。

実施例２ Ｈ．ピロリテトラサイクリン応答性プロモーターの構築
テトラサイクリン応答性プロモーターを作製するため、重要なプロモーター要素の破壊を最小限とするようにしながら、１または複数のｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列をｕｒｅＡプロモーター配列に導入した。−３５ボックスの上流、−３５ボックスと−１０ボックスの間、および転写開始点のすぐ下流に、ｔｅｔＯ導入のための３つの主要な部位を特定した（図３Ａ）。２セットのｔｅｔ応答性プロモーターを設計した。第１のセットのｔｅｔ応答性プロモーター、ｕＰｔｅｔＯ（１〜３）は、Ｈ．ピロリ染色体の任意の領域で標的遺伝子の発現を駆動および調節するように設計した。それらは−１０ボックス内のＣからＴへの突然変異と１または複数のｔｅｔＯ部位を含有するコアｕｒｅＡプロモーターからなる（図３Ｂ）。第２のセットのｔｅｔ応答性プロモーター、ｕｒｅＰｔｅｔＯ（Ｉ〜Ｖ）は、それらの天然遺伝子座においてｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ（ウレアーゼオペロン）の発現を調節するように設計した。異なる位置に３つのｔｅｔＯ部位を含有するいくつかのプロモーター構築物を、ＰＣＲ法を用いて設計および構築し（図３Ｃ）、それらを用いてｕｒｅＡプロモーター内に１または複数のｔｅｔＯ部位を有するＸ４７ Ｈ．ピロリ株を作製し、ｕｒｅＰｔｅｔＯと呼称した。

ｔｅｔレプレッサーの不在下でのｕＰｔｅｔＯプロモーターの強度を、３つの異なる受容遺伝子座においてリポーター遺伝子ｇｆｐ（ｍｕｔ２）（非特許文献４０）を用いて評価した。ＧＦＰ活性は、ｕＰｔｅｔＯ１を有するＸ４７株の方がｕＰｔｅｔＯ２を有する株よりも高く、ＧＦＰ活性を定量したところ、ＧＦＰ活性はｇｌｔＤＨおよびｄａｐＢ遺伝子座に比べてｔｒｐＡ遺伝子座からＧＦＰを発現する株で高かった（図４）ことから、ｕＰｔｅｔＯ１およびｕＰｔｅｔＯ２の強度は受容遺伝子座にも依存した。ｕｒｅＰｔｅｔＯ（Ｉ−Ｖ）株のウレアーゼ活性はウレアーゼ活性アッセイを用いて評価し、野生型親株と比較した（図５）。ｕｒｅＰｔｅｔＯＩ、ＩＩおよびＶを有する株のウレアーゼ活性は野生型親株と同等であったが、ウレアーゼ活性はｕｒｅＰｔｅｔＯＩＩＩを有する株では７５％低く、ｕｒｅＰｔｅｔＯＩＶを有する株では４０％低かった。Ｘ４７ ｕｒｅＰｔｅｔＯ株の遺伝子操作中に生じる、コロニー形成に影響を及ぼす二次突然変異の出現を除外するため、また、コロニー形成に必要とされるウレアーゼ発現レベルを評価するため、これらの組換え株の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでのそれらのコロニー形成能を評価した（図５）。胃のコロニー形成量を経口投与の１週間後に評価した。マウスの胃から全ての株の再単離に成功した。ｕｒｅＰｔｅｔＯＩＶおよびｕｒｅＰｔｅｔＯＩＩＩ株では感染率および感染量は低かった。最後に、感染したマウスの胃から再単離されたクローンのｕｒｅＡプロモーター領域の配列決定を行い、ｕｒｅＰｔｅｔＯ配列はマウスで継代した後も安定であることが分かった（データは示されていない）。

実施例３ Ｈ．ピロリにおけるＡＴｃによるｕＰｔｅｔＯの調節
ＧＦＰをリポーターとして用いて、ｕＰｔｅｔＯ１およびｕＰｔｅｔＯ２プロモーターの誘導および抑制能を測定した。Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ受容株をｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰ構築物で形質転換して、ＧＦＰおよびＴｅｔＲｓの両方を発現する株のパネルを作製した（表１）。

（表１）
テトラサイクリン応答性ＧＦＰ発現を伴うＸ４７株

ＴｅｔＲとｒｅｖＴｅｔＲの両方に極めて高い結合親和性を有し、かつ、毒性および抗生物質活性の低いテトラサイクリン誘導体であるアンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）（非特許文献４１、非特許文献４２）をインデューサーとして用いて、ｕＰｔｅｔＯ１およびｕＰｔｅｔＯ２の誘導および抑制を測定した。観測された蛍光強度に基づけば、血液寒天培地プレートに５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃを加えると、ＴｅｔＲまたはｒｅｖＴｅｔＲを発現する株におけるＧＦＰ発現の、それぞれ誘導または抑制がもたらされた。ＢＨＩ培地で増殖させたＴｅｔＲ発現株に１００ｎｇ／ｍＬのＡＴｃを加えると、３種類の受容遺伝子座の全てにおいてｐｔｅｔＲ２ ｕＰｔｅｔＯ１では４〜９倍、ｐｔｅｔＲ４ ｕＰｔｅｔＯ１では１３〜８０倍、そしてｐｔｅｔＲ６ ｕＰｔｅｔＯ１では２〜５倍のＧＦＰ発現の誘導がもたらされた。ＧＦＰ誘導はｕＰｔｅｔＯ２株の方がはるかに低く、ｐｔｅｔＲ２では１．５〜３倍、ｐｔｅｔ４では３〜８倍、そしてｐｔｅｔＲ６では３〜８倍であった（図６）。しかしながら、ＴｅｔＲ発現株におけるＧＦＰ活性は、ＴｅｔＲの不在下で見られたレベルに達しなかったが、これはｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰがＴｒｐＡ遺伝子座の位置する場合に最も著しかった（図６Ａ）。

実施例４ Ｈ．ピロリにおけるＡｔｃによるｕｐｔｅｔｏの誘導は用量および時間に依存する
Ｈ．ピロリにおけるｔｅｔ誘導性発現系のさらなる特性決定を、インデューサー濃度を増加させ、いくつかの異なる時点でリポーター遺伝子発現を評価することによって行った。細菌を種々の濃度のＡＴｃの存在下で増殖させた。ＧＦＰ活性を定量したところ、１００ｎｇ／ｍＬ ＡＴｃの濃度で最大ＧＦＰ活性をもたらしたことを示した（図７Ａ）。

２５ｎｇ／ｍｌのＡＴｃで誘導を行ったところ、ＧＦＰ活性は２．４分の１となった。これらの実験から、誘導は用量に依存すること、および最大誘導は１００ｎｇ／ｍＬ ＡＴｃの濃度で達成できることが示された。さらに、液体培養で測定した場合、最小阻害濃度（ＭＩＣ）の１０分の１のＡＴｃ濃度で最大誘導が達成される。

ディスク拡散アッセイを用いて、ＡＴｃによるＧＦＰ発現の誘導を実証した。ＡＴｃを添加したディスクを、ｐｔｅｔＲ２およびｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰを含有する細菌叢の上に置いた。２４時間のインキュベーションの後、各ディスクの周囲にＧＦＰ発現のハローが明らかとなる。ｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰ誘導の速度論をＴｅｔＲ発現株において免疫ブロット法により分析した（図７Ｂ）。ｐｔｅｔＲ２およびｐｔｅｔＲ４含有細菌における最大ＧＦＰ活性をＡＴｃ添加の１６時間後に観察した。ｐｔｅｔＲ６含有細菌は、強いが遅延型の誘導を示した。

これらの実験は、ｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰの誘導が時間に依存し、誘導の速度論はｐｔｅｔＲ構築物に依存したことを示す。

実施例５ ｉｎ ｖｉｖｏにおける条件付き遺伝子相補性に関する受容株のコロニー形成能の試験
コロニー形成に影響を及ぼす二次突然変異の出現を除外するため、また、ｔｅｔ誘導性転写下でのＧＦＰリポーター遺伝子の発現安定性を評価するために、これらの組換え株の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでのそれらのコロニー形成能を評価した。動物にｐＴｒｐΑ−ｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰ、ｐＧｌｔＤＨ−ｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰまたはｐＨｄａｐＢ−ｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰで形質転換されたＸ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ５受容株を強制経口投与した。全ての試験株で、感染１週間後にＧＦＰ発現細菌の再単離に成功した（データは示されていない）。

実施例６ Ｈ．ピロリにおけるテトラサイクリン誘導性発現に基づくウレアーゼ発現の調節
ｕｒｅＰｔｅｔＯ構築物で形質転換されたＸ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ受容株においてウレアーゼ発現の調節を検討し、改変型ｕｒｅＡプロモーターを含有し、かつ、ＴｅｔＲｓを発現する株のパネルを作製した（表２）。

（表２）
テトラサイクリン応答性ｕｒｅＡおよびｕｒｅＢ発現プロモーターを有するＸ４７株

ＡＴｃによるｕｒｅＰｔｅｔＯプロモーターの調節を、免疫ブロット法およびウレアーゼ活性アッセイにより分析した。免疫ブロット法によれば、ＵｒｅＢサブユニットの存在量はＴｅｔＲレプレッサー（Ｔｅｔ−ＯＮ系）を有する株におけるＡＴｃの制限時（図８Ａ）、およびｒｅｖＴｅｔＲレプレッサー（Ｔｅｔ−ＯＦＦ系）を有する株におけるＡＴｃの添加時（図８Ｂ）に検出限界を下回ることが明らかになった。Ｔｅｔ−ＯＦＦ系の構築物Ｉ、ＩＩおよびＶでは不完全な抑制が見られた（図８Ｂ）。ｐｔｅｔＲ３を有する株はＡＴｃに対して応答を示さなかった（データは示されていない）。

ＡＴｃの不在下で、Ｔｅｔ−ＯＮ株のウレアーゼ活性（図８Ｃ〜Ｅ）は検出限界の２Ｕ／ｍＬを下回った。ＡＴｃを加えると、ｐｔｅｔＲ２；ｕｒｅＰｔｅｔＯＩＩ株（図８Ｃ）、ｐｔｅｔＲ３；ｕｒｅＰｔｅｔＯＩ、ＩＩおよびＩＩＩ株（図８Ｄ）のウレアーゼ活性が完全に回復された。ｐｔｅｔＲ２；ｕｒｅＰｔｅｔＯＩおよびＶ株（図８Ｃ）、ｐｔｅｔＲ３；ｕｒｅＰｔｅｔＯＩＶ株（図８Ｄ）およびｐｔｅｔＲ６；ｕｒｅＰｔｅｔＯＶ株（図８Ｅ）株ではウレアーゼ活性は部分的に回復されたに過ぎなかった。他のＴｅｔ−ＯＮ株のウレアーゼ活性は、野生型ウレアーゼ活性の１０％未満であった。Ｔｅｔ−ＯＦＦ株のウレアーゼ活性は、野生型親Ｘ４７株の活性の３５％〜１０％と低かった（図８Ｆ〜Ｇ）。

実施例７ Ｈ．ピロリにおけるＡＴｃによるｕｒｅＰｔｅｔＯの誘導は用量およびｐｔｅｔＲに依存する
より感度の高いウレアーゼプレートアッセイを用いて、種々の濃度のＡＴｃの存在下でのＴｅｔ−ＯＮ株の、残存ウレアーゼ活性および低レベルｕｒｅＰｔｅｔＯ誘導を検出した。ｐｔｅｔＲ４株では、５種類全てのｕｒｅＰｔｅｔＯプロモーターを誘導するために１ｎｇ／ｍＬの濃度のＡＴｃで十分であるが、２５ｎｇ／ｍＬを超える濃度では、ウレアーゼ活性は低下する。ＡＴｃの不在下では、２４時間後に極めて低レベルのウレアーゼ活性が見られ、これは４８時間後により顕著となる。ｐｔｅｔＲ６株では、ｕｒｅＰｔｅｔＯＶおよびｕｒｅＰｔｅｔＯＩＶでそれぞれ５ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬ濃度のＡＴｃにおいて、２４時間後に、有意なウレアーゼ活性が検出される。ｕｒｅＰｔｅｔＯＩＩＩの誘導によるウレアーゼ活性は、２５ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬにおいて４８時間後に初めて明らかになる。ウレアーゼ活性は５０ｎｇ／ｍＬを超える濃度、およびＡＴｃの不在下で低下し、３種類全てのｕｒｅＰｔｅｔＯプロモーターで４８時間後に極めて低レベルのウレアーゼ活性が見られる。

誘導済みのｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２；ｕｒｅＰｔｅｔＯＶ株を播種したプレートは播種３０分以内に色が変わるので、このウレアーゼプレートに見られる色の変化はウレアーゼの活性によるものである。ウレアーゼ活性は、非処置細菌を播種したプレートに置いたディスクからのＡＴｃの拡散により起こり、ウレアーゼ陰性Ｘ４７ ｕｒｅＡ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴ株を播種した場合にはプレートは黄色のままである。

実施例８ Ｈ．ピロリはｉｎ ｖｉｖｏにおいて低レベルドキシサイクリンに耐用性がある
文献調査から、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子発現を調節するためにテトラサイクリン系を用いるほとんどの研究では、インデューサーとしてＡＴｃよりもむしろドキシサイクリン（ｄｏｘ）を用いていたことが明らかになった。コストの理由から、Ｈ．ピロリｔｅｔ系のｉｎ ｖｉｖｏ評価にはｄｏｘが選択され、野生型Ｈ．ピロリがＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのコロニー形成中に耐用性を示すｄｏｘの最大用量を特定するためのパイロット実験を行った。動物に野生型親Ｘ４７株を強制経口投与し、飲用水に一定範囲のｄｏｘ濃度を添加した。感染１週間後、細菌量はｄｏｘ濃度１００μｇ／ｍＬで有意に低下し、１０００μｇ／ｍＬを添加したマウスからは細菌は単離できなかった（図９Ａ）。１μｇ／ｍＬを超えるｄｏｘ濃度で、細菌量は２ｌｏｇ低下したが、より以降の感染時点（２週間および４週間）では、５μｇ／ｍＬのｄｏｘを添加したマウスの細菌量は、非処置マウスと同等である（図９Ｂ）。

実施例９ Ｈ．ピロリにおけるドキシサイクリンによるｔｅｔ誘導性ウレアーゼのｉｎ ｖｉｖｏ誘導
ｄｏｘによるウレアーゼの発現を駆動するためのｕｒｅＰｔｅｔＯの調節を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ感染モデルを用いて評価した。マウスに数種のＴｅｔ−ＯＮ、ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ；ｕｒｅＰｔｅｔＯ株を経口投与し、Ｘ４７の耐用性の範囲内であった一定範囲のｄｏｘ濃度を添加した。ウレアーゼは、コロニー形成に必要な必須遺伝子であることが知られており、従って、Ｔｅｔ−ＯＮ ｕｒｅＰｔｅｔＯ株はインデューサーの不在下ではコロニー形成ができないはずである。いくつかの予備実験から、ｄｏｘはｉｎ ｖｉｖｏでｕｒｅＰｔｅｔＯを誘導可能であることが示された（図９Ｃ〜Ｄ）。ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ４；ｕｒｅＰｔｅｔＯＩ株およびｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ６；ｕｒｅＰｔｅｔＯＶ株は、それぞれ動物に０．１〜５μｇ／ｍＬおよび５〜２０μｇ／ｍＬのｄｏｘを添加した場合の感染１週間後に再単離することができた。感染２週間後、ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ４；ｕｒｅＰｔｅｔＯＶ株は、５μｇ／ｍＬのｄｏｘを添加した動物から再単離することができた（図９Ｅ）。ｕｒｅＰｔｅｔＯ株の感染は、ｄｏｘの添加に依存する（図９Ｆ）。感染２週間後にマウスにｄｏｘを添加し、ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ４；ｕｒｅＰｔｅｔＯＩのコロニー形成が上手く確立できるようにした。この株はｄｏｘ添加を中止した１日後および３日後には再単離できたが、７日後には単離できなかった（図９Ｆ）。ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ４；ｕｒｅＰｔｅｔＯＩ株による感染は、ｄｏｘ添加を伴えば少なくとも４週間維持することができた。

実施例１０ 除菌の方法論
本発明者らは、マンノースの代謝がＨ．ピロリ除菌を達成するための有望な候補経路であることを見出した。実際に、ヘリコバクターゲノム分析によれば、マンノースがグルコースのみから作られることが示唆される。Ｈ．ピロリＬＰＳは、コロニー形成および樹状細胞のＤＣ ｓｉｇｎ受容体を介した免疫調節に不可欠なルイス抗原（フコースおよびガラクトース）で修飾されていることが知られている。従って、ＬＰＳのルイス抗原の代謝制御は、Ｈ．ピロリのコロニー形成／除菌および免疫調節それぞれの制御を提供することができる。

図１７は、食餌へのマンノースおよびガラクトースの添加がＨ．ピロリノックイン変異体を維持する、Ｈ．ピロリ除菌のための糖シャントを作り出す方法を示す。シャントを確立するために、Ｈ．ピロリにおいて欠損している２つの酵素、すなわち、細胞に輸送された際にマンノースをリン酸化するためのヘキソキナーゼおよびピロホスホリラーゼ（ＧＭＰ）をゲノムにノックインする。注目すべきことに、Ｈ．ピロリはマンノースを輸送することができ、食餌への添加が可能であることが知られている。グルコースとは対照的に、マンノースの血中濃度は極めて低く、グルコースは５ｍＭであるのに対してマイクロモルの範囲である。

マンノース糖シャントを構築するために、Ｈ．ピロリのホスホマンノースイソメラーゼ（ＨＰ００４３）を欠失させる。しかしながら、ＨＰ００４３は、マンノース−１−リン酸からＧＤＰ−マンノースを作り出すピロホスホリラーゼ機能も有する二機能性酵素である。従って、代謝経路を回復させるために大腸菌のピロホスホリラーゼをノックインした。また、輸送されたマンノースをマンノース−６−リン酸にリン酸化するために、広域特異性を有するヘキソキナーゼ（酵母ヘキソキナーゼ１）もノックインした。

ＨＰ００４３完全欠失変異体の作出は、従前に記載されている対抗選択カセットｒｐｓｌ−ｃａｔを用いて行った。ＧＭＰの発現は、ｕｒｅＡＢ遺伝子座とＨｘｋ１遺伝子座の間、ＵｒｅＢ遺伝子座の後に設計した。遺伝子操作の配列は次のものからなった。
１．Χ４７Δ００４３
２．Ｘ４７Δ００４３：：ｒｐｓＬ−ｃａｔ（ｕｒｅＡＢ）
３．Ｘ４７Δ００４３：：ｇｍｐ（ｕｒｅＡＢ）
４．Χ４７Δ００４３：：ｇｍｐ（ｕｒｅＡＢ）：：ｒｐｓＬ−ｃａｔ（ｕｒｅＢＩ）
５．Ｘ４７Δ００４３：：ｇｍｐ（ｕｒｅＡＢ）：：ｈｘｋ１（ｕｒｅＢＩ）

遺伝子操作および遺伝子挿入の確認は、ゲノムＤＮＡに対する診断ＰＣＲによって行った。

マンノース糖シャント組換え株および野生型のルイス抗原発現を、マンノース添加の有りおよび無しで評価した。図１８は、マンノースシャントがマンノース添加時のルイス抗原回復に基づいて働くことを明らかに示している。

Ｈ．ピロリの組換え株のコロニー形成能を、マウスモデルにおいて、食餌にマンノース添加を行う場合と行わない場合で試験した。注目すべきことに、ＨＰ００４３ノックアウト株は、マウスに確実にコロニー形成することはできなかった（データは示されていない）。

ＨＰ００４３のノックアウト株：ｇｍｐ（ｕｒｅＡＢ）：ｈｘｋ１（ｕｒｅＢＩ）を、０．５％マンノースを含有する血液寒天培地で増殖させ、採取し、５個体のマウス群の経口投与に用いた。マウスを経口投与およびコロニー形成の１週間後に犠牲にし、胃のホモジネートから寒天ペトリ皿で細菌を増殖させることにより評価した。結果を表３に示す。

（表３）

マンノースの添加は、マンノース濃度が飲用水中５％の高さであった場合に、ＨＰ００４３：ｇｍｐ（ｕｒｅＡＢ）：ｈｘｋ１（ｕｒｅＢＩ）のノックアウトのコロニー形成をレスキューした。組換え株のこの不完全なレスキューは、おそらくこの株のウレアーゼ活性が低いことによるものである。実際に、ウレアーゼオペロンにおける２つの遺伝子ｈｘｋ１およびＧＭＰの挿入はウレアーゼ活性を妨げた。従って、ｈｘｋ１およびＧＭＰ遺伝子から構成される新規なオペロンの合成によりシャントの再操作を行い、Ｈ．ピロリゲノムの別の位置に挿入した。

新規なマンノースシャントを有する組換え株は、マンノース添加を行わない場合ではＬＰＳ上のルイス抗原の生合成に関して、およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてマンノース添加時には増殖感受性に関してレスキューされることが判明した（それぞれ図１９および２０）。この結果は予想されなかったが、ルイス抗原の生合成と同様にマンノース添加時に細胞増殖が阻害されるので、これによりより良い代謝制御が得られる。本発明者らは、マンノースシャントは培養培地中の微量マンノースを利用する際に極めて効率的であるが、過剰なマンノースは細胞に有害であると判断を下した。

本発明者らはさらに、この調節された経路を、ヘキソキナーゼ単独の過剰発現が、マンノース単独の存在下でのＨ．ピロリの増殖を阻害するとして特定した。これまでに試験した他の糖では細胞増殖を阻害することができず、この阻害機構のマンノース特異性が強調される。よって、Ｈ．ピロリの細胞増殖にはマンノース−６−リン酸の厳格な調節が必要であると思われる。

新規なマンノースシャントの除菌能を評価するため、マウスにマンノースシャントを有する組換えＨ．ピロリを投与し、２週間のコロニー形成後に、マウスの飲用水に５％マンノースを与え、細菌量を評価した。細菌量はマンノース処置後に１〜２Ｌｏｇ減少した（図２１）。

実施例１１ ヘリコバクター・ピロリにおける遺伝子発現系
ＴｅｔＲ調節型のＣｒｅリコンビナーゼ発現を有するＨ．ピロリ株の構築
Ｈ．ピロリにおいて条件に応じてＣｒｅリコンビナーゼを発現させるため、ｃｒｅ発現の制御のために２つのＴｅｔ応答性プロモーターｕＰｔｅｔＯ１およびｕＰｔｅｔＯ２を選択した。それらは−１０ボックス内のＣからＴへの突然変異と転写開始点のすぐ下流に１つのｔｅｔＯ部位を含有するコアウレアーゼプロモーターからなる。ｕＰｔｅｔＯ２は、−３５ボックスと−１０ボックスの間に第２のｔｅｔＯ部位を含有する。合成Ｈ．ピロリのコドン使用頻度に関して最適化したｃｒｅ遺伝子を増幅し、プラスミドｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰおよびｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ２−ＧＦＰにクローニングし、ＧＦＰを置換した。受容株Ｈ．ピロリＸ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２；ｔｒｐＡ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴをこれらのプラスミド（ｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ（１／２）−Ｃｒｅ）で自然形質転換することで、相同組換えにより、染色体のｔｒｐＡ遺伝子座におけるｕＰｔｅｔＯ−ｃｒｅ融合物の組み込みが可能であった。構築されたＸ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２；ｔｒｐＡ：：ｕＰｔｅｔＯ−ｃｒｅ株における条件付きｃｒｅ発現を免疫ブロット法により分析した。細菌をそれぞれ５０ｎｇ／ｍｌのＡＴｃの不在下または存在下の液体培養で増殖させた。両株においてｃｒｅ発現はＡＴｃの存在下で誘導され、ｕＰｔｅｔＯ１の制御下での発現はｕＰｔｅｔＯ２に比べて有意に高い（図２２）。

Ｈ．ピロリ株におけるＣｒｅ／ｌｏｘ切断の試験
２つのｌｏｘ部位で挟み込まれたプロモーター−ｄａｐＡ融合物であるＬｏｘ６６７１カセット（図２３）を用いて、Ｈ．ピロリにおけるＣｒｅリコンビナーゼの機能性を調べた。ｕｒｅＡプロモーターおよびｄａｐＡ遺伝子を含有するこのカセットを設計および合成した。ＰｕｒｅＡ−ｄａｐＡ融合物は、２つのｌｏｘ部位（Ｌｏｘ６６とＬｏｘ７１）に挟み込まれており、それらの非パリンドローム型コア配列は、これらのｌｏｘ部位の間の配列のＣｒｅ介在切断を可能とするように同じ方向を向いている。ｌｏｘ部位のヌクレオチド配列は変異型ｌｏｘＰモチーフである。ｌｏｘ６６部位とｌｏｘ７１部位の間のＣｒｅ介在組換えは１つの野生型ｌｏｘＰ部位と１つの二重突然変異型ｌｏｘＰ部位を作り出す。二重突然変異型ｌｏｘＰ部位はＣｒｅリコンビナーゼに対してはるかに低い結合親和性を示すので、変異型Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系を用いるＣｒｅ介在切断は正方向の反応を好む。

このＬｏｘ６６７１カセットをベクターｐＢｌｕ−ＢＩにクローニングし、プラスミドｐＢＩ−Ｌｏｘ６６７１を作製した。Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２；ｔｒｐＡ：：ｕＰｔｅｔＯ（１／２）−ｃｒｅ；ｕｒｅＢＩ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴをｐＢＩ−Ｌｏｘ６６７１で自然形質転換して、Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２；ｔｒｐＡ：：ｕＰｔｅｔＯ（１／２）−ｃｒｅ；ｕｒｅＢＩ：：Ｌｏｘ６６７１を得た。

構築された株のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｕｒｅＢＩ遺伝子座におけるカセットの組み込みを確認した。細菌を、誘導を行わずに血液寒天培地上で増殖させ、ゲノムＤＮＡを単離した。全ての試験クローンは、Ｘ４７野生型対照のバンドよりも若干大きなＰＣＲバンドを示した（図２４）。このバンドは、１つのｌｏｘ部位を有するｕｒｅＢＩ遺伝子座の予想サイズに相当する。この実験は、ＣｒｅがＨ．ピロリ内で機能的であり、ｌｏｘ介在遺伝子切断を促進することを示す。しかしながら、Ｃｒｅ／ｌｏｘ切断はＴｅｔＲの誘導無しで起こり、このことは、Ｃｒｅのレベルは免疫ブロット法の検出限界に満たないものではあるが、Ｃｒｅの抑制が切断を防ぐには十分でないことを意味する。

ＴｅｔＲ誘導性Ｃｒｅ／ｌｏｘ切断系の最適化
Ｈ．ピロリにおける誘導性Ｃｒｅ／ｌｏｘ系を最適化するため、ｔｅｔＲをＨ．ピロリコドンに関して最適化したｔｅｔＲ（ｔｅｔＲｓ）に置換し、ｔｅｔレプレッサーの発現レベルを改善した。ｔｅｔＲｓをプラスミドｐＭｄａＢ−ＰｕｒｅＡ−ｈｙｄＡにクローニングし、プラスミドｐＭｄａＢ−ＰｕｒｅＡ−ＴｅｔＲｓを得た。構築されたプラスミドを用いて、受容株Ｘ４７ ｍｄａＢ：ｒｐｓＬ−ｃａｔを自然形質転換により形質転換し、Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓを作製した。この株におけるｔｅｔＲｓの発現を免疫ブロット法により分析した。Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓにおけるｔｅｔＲｓの発現は、Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２株に比べて高いが、大腸菌陽性対照（ｐｏｓ）における発現より低い（図２５）。

この系のさらなる最適化を、ｃｒｅの上流のプロモーターｕＰｔｅｔＯを改変して基本ｃｒｅ発現を低下させることによって行った。翻訳発現効率の異なる６つのｔｅｔ応答性プロモーター（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５を設計した（図２６）。これらのプロモーターは、ｕＰｔｅｔＯに基づき、ｕｒｅＰｔｅｔＯ１と同様に−３５ボックスの上流、および−３５ボックスと−１０ボックスの間に位置する２つのｔｅｔＯ部位を有する。翻訳効率を低下させるために、開始コドンをＡＴＧからＣＴＧおよびＴＴＧに置換し（（４〜６）ｕＰｔｅｔＯ５）、さらにリボソーム結合配列をＴＡＧＧＡＧからＴＡＧＣＡＧに変更した（（１〜３）ｕＰｔｅｔＯ５）。プロモーター変異体をｃｒｅの５’末端との融合物として合成し、プラスミドｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ２−Ｃｒｅにクローニングし、６種類のプラスミドｐＴｒｐＡ−（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅを作製した。

受容株の自然形質転換
Ｘ４７ ｔｒｐＡ：：ｒｐｓＬ−ｃａｔをプラスミドで形質転換し、Ｘ４７ ｍｄａＢ：：（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−ｃｒｅ株を作製した。これらの株およびプラスミドｐＴｒｐＡ−（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅを有する大腸菌を用いて、ｔｅｔレプレッサーの不在下でｕＰｔｅｔＯプロモーター変異体の強度を評価した。

図２７の免疫ブロット法により示されているように、ｕＰｔｅｔＯ５に基づく構築物の強度は、ｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ２−Ｃｒｅを有する対照株に比べてはるかに弱かった。ｕＰｔｅｔＯ５において開始コドンがＡＴＧからＣＴＧまたはＴＴＧに変更された場合、ｃｒｅの発現レベルは徐々に低下し、この変更を変異型ＲＢＳ（（１〜３）ｕＰｔｅｔＯ５）と組み合わせた場合に低下し続けた。Ｈ．ピロリ株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−ｃｒｅでは、ｃｒｅ発現は、弱いバンドを示した構築物６ｕＰｔｅｔＯ５を除き、検出限界を下回った。

Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓ株の自然形質転換の次工程は、まず（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−ｃｒｅ構築物、次にＬｏｘ６６７１カセットに対して行った。最終株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓ；ｔｒｐＡ：：（２／４／５／６）ｕＰｔｅｔＯ−ｃｒｅ：ｕｒｅＢＩ：：Ｌｏｘ６６７１のゲノムＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用い、従前に行った通りにＬｏｘ６６７１カセットの組み込みを確認した。４種類全ての株が、１つのｌｏｘＰ部位を有するｕｒｅＢＩ遺伝子座に相当するバンドを示し、ウエスタンブロット検出限界を下回るレベルのＣｒｅがＬｏｘ６６７１カセットの切断を促進できることを示す（データは示されていない）。

アンチセンスＲＮＡ発現を用いた基本ｃｒｅ発現の低減
ｔｅｔレプレッサー系では、一般に、サイレンシングを受けた遺伝子の最小の弱い、残存基本発現が見られる。Ｃｒｅリコンビナーゼの場合、この発現はｌｏｘが隣接するＤＮＡ配列の切断に十分なものである。第２のアプローチは、Ｈ．ピロリにおけるＣｒｅ／ｌｏｘ系を最適化するために、アンチセンスＲＡＮ干渉を用いてｃｒｅ発現レベルをより厳格に制御することによって行った。センス−アンチセンスＲＮＡカセットを、同じ遺伝子から、ｃｒｅ ｍＲＮＡを誘導転写し、かつ、アンチセンスＲＮＡを構成的に転写するように設計した（図２８）。このカセットを、６種類の（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅ融合物またはｃｒｅ遺伝子だけをｐＭＡ−アンチセンスにクローニングすることによって構築し、ｐＴｒｐＡ−ａｓ（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−ＣｒｅおよびｐＴｒｐＡ−ａｓ−Ｃｒｅを作製した。Ｈ．ピロリ受容株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓ；ｔｒｐＡ：：ｒｐｓＬ−ｃａｔを、ｐＴｒｐＡ−ａｓ（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅで自然形質転換した後、上記のように、ｕｒｅＢＩ遺伝子座にＬｏｘ６６７１カセットを組み込んだ。得られたＸ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓ；ｔｒｐＡ：：ａｓ（２／４／６）ｕＰｔｅｔＯ−ｃｒｅ；ｕｒｅＢＩ：：Ｌｏｘ６６７１株の、Ｌｏｘ６６７１カセットの組み込みをＰＣＲにより調べたが、構築物は全て、１つのｌｏｘＰ部位を有するｕｒｅＢＩ遺伝子座に相当するバンドを示した（図２９）。

ｔｅｔ誘導性抗原発現カセットに基づくプラスミドの開発
誘導性発現カセット（ＩＥＣ）を、２つの成分、すなわち、テトラサイクリンレプレッサー（ｔｅｔＲｓ）の発現を制御する構成プロモーター（ｆｌａＡプロモーター）およびｔｅｔＲにより負の調節を受け、標的遺伝子の発現を制御する誘導プロモーター（ｕＰｔｅｔＯ４）を含むように設計した（図３０）。ｕＰｔｅｔＯ４の設計物は、−３５ボックスと−１０ボックスの間に１つのｔｅｔＯ部位を有するコアｕｒｅＡプロモーターからなる（ｕｒｅＰｔｅｔＯＩＩと同様）。反対方向を向いているこれら２つの要素は非コードスペーサー配列によって分離されている。このカセットは、シャトルベクターｐＨｅｌ２に組み込んだ際にこの単位を隔離するために、２つの転写ターミネーターにより挟み込まれている。

誘導性発現カセットを、テトラサイクリンレプレッサーの遺伝子を含まず、かつ、標的としてのリステリオリシン遺伝子を含むように合成した（ｐＭＡ−ＩＥＣ−ＬＬＯ）。この誘導カセットを完成させるために、Ｈ．ピロリのコドン使用頻度に関して最適化した遺伝子（ｔｅｔＲｓ）をｐＭＡ−ＩＥＣ−ＬＬＯにクローニングし、ｐＭＡ−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＬＬＯを作製した。このリステリオリシン遺伝子をＨ．ピロリのコドン使用頻度に関して最適化したサルモネラ菌属フラジェリンサブユニットＣ遺伝子（ｆｌｉＣｓｙｎ）に置換し、ｐＭＡ−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎを作出した。最後に、ｆｌｉＣｓｙｎを有するＩＥＣ全体をシャトルベクターｐＨｅｌ２にクローニングした。得られたプラスミドｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−ＦｌｉＣｓｙｎを大腸菌β２１５０に形質転換した後、細胞から細胞へのプラスミド伝達によりＨ．ピロリ株Ｂ１２８に導入した。トランスコンジュガントを制限マッピングにより調べたが、適正な制限パターンは示されなかった（図３１）。プラスミドＤＮＡはＨ．ピロリにより改変され、このような改変により制限酵素が阻害される場合が多い。しかしながらやはり、全てのクローンに２つの未消化プラスミドの存在を見て取ることができ、分子量の点から、これらの一方はＢ１２８内因性プラスミド（ｐＢ１２８）に相当し、他方はｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎに相当する。

トランスコンジュガントＢ１２８ ｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎにおけるｆｌｉＣｓｙｎの条件付き発現およびＴｅｔＲｓの発現を免疫ブロット法により分析した。細菌を、５０ｎｇ／ｍｌのＡＴｃをそれぞれ添加しない、または添加した選択血液寒天培地プレートで増殖させた。ｔｅｔＲｓの発現は高く、試験した全てのクローンが、アンヒドロテトラサイクリン（ＡＴｃ）で誘導した際にＦｌｉＣｓｙｎの発現を示した（図３２）。

材料および方法
本試験に用いた細菌株およびプラスミドを表４に挙げる。

（表４）
本試験に用いた細菌株およびプラスミド

Ｈ．ピロリＸ４７（非特許文献４３）株は、通常、３７℃、微好気性条件下、５％ウマ血液およびデントの抗生物質サプリメント（Ｏｘｏｉｄ）を含有するコロンビア血液寒天培地（ＣＢＡ）プレート上で増殖させた。適当であれば、Ｈ．ピロリにおける抗生物質選択は、培地にクロラムフェニコールまたはストレプトマイシンを終濃度１０μｇ／ｍＬで添加することによって行った。Ｈ．ピロリ液体培養：細菌を、１０％ウシ新生仔血清（ＮＣＳ）およびデントの抗生物質サプリメントを添加したブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地またはブルセラブロス中で増殖させた。培養物に、開始ＯＤ_６００が０．０５となるようにＰＢＳに再懸濁させた細菌を播種し、微好気性条件下、３７℃、１２０ｒｐｍで増殖させた。増殖試験は、Ｈ．ピロリ株を液体培地に事前に順応させずに行った。大腸菌ＤＨ５αはＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス中で増殖させた。必要であれば、抗生物質を次の終濃度で加えた：アンピシリン１００μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌ。

ＴｅｔＲおよびｒｅｖＴｅｔＲを発現するＨ．ピロリ株の構築
ＨＰプロモーター−ｔｅｔＲ融合構築物（ｐｔｅｔＲ）の作製
４つの異なるＨ．ピロリプロモーターを用いて、Ｈ．ピロリにおいてＴｅｔＲｓの構成的発現を駆動するために数種の異なるプロモーター−ｔｅｔＲ構築物を作製した（ｐｔｅｔＲ１〜８）（図１）。ｐｔｅｔＲ１〜４は、ショートフュージョンＰＣＲ（ｓｈｏｒｔ ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ）（非特許文献４４）により作製した。簡単に述べれば、ｐｔｅｔＲ１では、ａｍｉＥプロモーターは、２６６９５ゲノムＤＮＡ（ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿０００９１５）から、プライマーｔｅｔ１およびｔｅｔ２を用いて増幅し、ｔｅｔＲは、ｐＷＨ１９２５ ＢＤ（非特許文献４５）から、プライマーｔｅｔ３およびｔｅｔ９を用いて増幅した。融合ＰＣＲ産物を増幅し、フランキングＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位を導入するために、プライマーｔｅｔ４およびｔｅｔ１０を用いた。ｐｔｅｔＲ２では、ｒｅｖｔｅｔＲをｐＷＨ１９２５ ｒ２（非特許文献４６）から増幅した。ｐｔｅｔＲ３およびｐｔｅｔＲ４では、ｔｅｔＲ／ｒｅｖｔｅｔＲの発現を駆動するためにｆｌａＡプロモーターを用い、プライマーｔｅｔ５〜ｔｅｔ１０を用いて作製した。異なる方法論を用いてコアウレアーゼプロモーター−ｔｅｔＲ融合物であるｐｔｅｔＲ５〜８を作製した。コアプロモーターは極めて小さく、従って、３つの長いフォワードプライマーと１つの短いリバースプライマーを用いる３連続のＰＣＲを用いて、プロモーターとｔｅｔＲ／ｒｅｖｔｅｔＲ遺伝子を段階的に融合させた。

工程１ 長いフォワードプライマーｔｅｔ１１とリバースプライマーｔｅｔ９、工程２ フォワードプライマーｔｅｔ１２（ｐｔｅｔＲ５〜６変異体）またはｔｅｔ１３（ｐｔｅｔＲ７〜８）とプライマーｔｅｔ９、その後、工程３ フォワードプライマーｔｅｔ１４とリバースプライマーｔｅｔ１０を用いてフランキングＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位を導入。全てのｐｔｅｔＲ構築物をベクターｐＨＲｄｘ（非特許文献４７；非特許文献４８）にクローニングし、ｐＨ＿Ｒｄｘ−ｐｔｅｔＲ（１〜８）を作製した。相同組換えによりｐｔｅｔＲ構築物をＸ４７受容株のＨＰ０９５４遺伝子座に導入するいくつかの試みは失敗した。従って、プライマーｍｂｔｅｔＦおよびｍｂｔｅｔＲを用いてｐｔｅｔＲ構築物を増幅し、ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＭｄａＢクローニングベクターへのクローニングのためのフランキングＳｂｆＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位を導入し、ｐＭｄａＢ−ｐｔｅｔＲ（１〜７）構築物を作製した（図１１）。Ｈ．ピロリ受容株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴを、これらのプラスミド構築物で自然形質転換し、Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ（１〜７）を作出した。得られたストレプトマイシン耐性形質転換体の染色体ＤＮＡを、対立遺伝子の挿入が適正かどうか確認した。

受容遺伝子座への遺伝子の組み込みのためのクローニングベクターｐＭｄａＢ、ｐＧｌｔＤＨ、ｐＴｒｐＡおよびｐＨｄａｐＢの構築
ｐＧｌｔＤＨ： ＨＰ０３８０の１ｋｂのＣ末端を、プライマーＧｌｔＤＨ１およびＧｌｔＤＨ２を用いて増幅し、ＨＰ００３７９の１ｋｂを、プライマーＧｌｔＤＨ３およびＧｌｔＤＨ４を用いて増幅した。これら２つの断片を、プライマーＧｌｔＤＨ１およびＧｌｔＤＨ４を用いたショートフュージョンＰＣＲにより互いに連結し、ＨＰ０３８０とＨＰ０３７８の間に挿入された、ＣｌａＩ制限部位とＳａｃＩＩ制限部位に挟み込まれた小ＭＣＳ部位を含む２ｋｂのＰＣＲ産物を作製した。この断片をｐＢｌｕ−ＳＫ−ａｌｔ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のｘｈｏＩおよびＳａｌＩ部位を、制限酵素消化と再連結により欠失させた）のベクター骨格にクローニングして、ｐＧｌｔＤＨを作製した。このクローニングベクターでは、対象ＤＮＡをミニＭＣＳの独特な制限部位にクローニングし、相同組換えによりＨ．ピロリゲノムのＨＰ０３８０とＨＰ０３７９の間に組み込むことができる（図１２Ａ）。

ｐＴｒｐＡ： 同様の方法論を用い、プライマーＴｒｐＡ１〜ＴｒｐＡ４をＨＰ１２７７の中央に挿入された小ＭＣＳを含有する最終構築物とともに用いてｐＴｒｐＡを作製した。このベクターを用いて、ＨＰ１２７７の中央に対象ＤＮＡ配列を導入する（図１３Ａ）。

ｐＭｄａＢ： ｍｄａＢ遺伝子を挟み込む２つの１ｋｂ領域（ＨＰ０６３０）を、プライマーＭｄａＢ１とＭｄａＢ２、およびＭｄａＢ３とＭｄａＢ４を用いて増幅した。これら２つの断片を、プライマーＭｄａＢ１およびＭｄａＢ４を用いたショートフュージョンＰＣＲにより互いに連結し、ＨＰ０６３０とＨＰ０６３１の間に挿入された、ＣｌａＩ制限部位とＮｏｔＩ制限部位に挟み込まれた小ＭＣＳ部位を含む２．１ｋｂのＰＣＲ産物を作製した。この断片をｐＢｌｕ−ＳＫ−ａｌｔのベクター骨格にクローニングして、ｐＭｄａＢを作製した。このクローニングベクターでは、対象ＤＮＡをミニＭＣＳの独特な制限部位にクローニングし、相同組換えによりＨ．ピロリゲノムのＨＰ０６３０とＨＰ０６３１の間に組み込むことができる。

ｐＨｄａｐＢ： ＨＰ０５１０を挟み込む２つの６００ｂｐ領域を、プライマーＤａｐＢ１とＤａｐＢ２、およびＤａｐＢ３とＤａｐＢ４を用いて増幅し、融合ＰＣＲにより互いに連結し、ＨＰ０５１０が小ＭＣＳで置換された１．２ｋｂの産物を得た。プライマーＤａｐＢ５およびＤａｐＢ６を用いて融合産物を増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を導入した。最終産物をｐＨＳＧ５７６にクローニングして、ｐＨｄａｐＢを作製した。このクローニングベクターでは、対象ＤＮＡをＭＣＳの独特な制限部位にクローニングした後、Ｈ．ピロリに形質転換し、ＨＰ０５１０が対象ＤＮＡ配列に置換された株を作製することができる（図１４Ａ）。

受容遺伝子座に外来ＤＮＡを導入するための受容Ｘ４７株を作製するためのプラスミド構築物
ＢａｍＨＩ制限部位に挟み込まれた対抗選択カセットｒｐｓＬ−ＣＡＴを、ｐＧｌｔＤＨ、ｐＴｒｐＡ、ｐＭｄａＢおよびｐＨｄａｐＢのＢａｍＨＩ部位にクローニングし、それぞれｐＧｌｔＤＨ−ＲＣＡＴ、ｐＴｒｐＡ−ＲＣＡＴ、ｐＭｄａＢ−ＲＣＡＴおよびｐＨｄａｐＢ−ＲＣＡＴを作製した（図１２Ｂ、１３Ｂおよび１４Ｂ）。これらの構築物を用いて、適当な受容遺伝子座に対象ＤＮＡ配列を導入するために必要な受容Ｘ４７株、ｇｌｔＤＨ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴ、ｔｒｐＡ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴ、ｍｄａＢ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴおよびｄａｐＢ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴを作製する。

リポーター遺伝子としてＧＦＰを用いたテトラサイクリン応答性プロモーターｕＰｔｅｔＯの構築：ｐＢｌｕ＿ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰ
ｐｔｅｔＲ（５〜８）を作製するために使用したものと同様の３工程ＰＣＲ方法論を用いて、ｕＰｔｅｔＯ（１〜３）−ＧＦＰ構築物を作製した。簡単に述べれば、ｇｆｐ−ｍｕｔ２を、プライマーｔｅｔＯＧＦＰ１およびｔｅｔＯＧＦＰ５を用いて増幅した（工程１）。工程２では、ｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰ、ｕＰｔｅｔＯ２−ＧＦＰおよびｕＰｔｅｔＯ３−ＧＦＰのためにそれぞれフォワードプライマーｔｅｔＯＧＦＰ２、ｔｅｔＯＧＦＰ３およびｔｅｔＯＧＦＰ４をリバースプライマーｔｅｔＯＧＦＰ５とともに用い、最終的にプライマーｔｅｔＯＧＦＰ５およびｔｅｔＯＧＦＰ６を用いて３つの構築物を完成させた（工程３）。この場合、これらの最終構築物は、ｇｆｐ−ｍｕｔ２と融合し、ＮｄｅＩ切断部位により分離され、両末端にいくつかの独特な制限部位が隣接する改変型コア変異体ウレアーゼプロモーター（１または複数のｔｅｔＯ結合部位を含有する、図３Ｂ）を含んでいた（図１５Ａ）。各構築物をＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩで消化したｐＢｌｕ＿ＢＩプラスミド（特許文献４）のベクター骨格に連結し、ベクターｐＢｌｕ＿ｕＰｔｅｔＯ（１〜３）−ＧＦＰを作製した（図１５Ｂ）。

Ｈ．ピロリテトラサイクリン応答性プロモーターｕｒｅＰｔｅｔＯの構築
様々な位置に最大３つのｔｅｔＯ部位を含有する数種のｔｅｔＯ改変ｕｒｅＡプロモーター構築物（ｕｒｅＰｔｅｔＯＩ−Ｖ）を設計し、ショートフュージョンＰＣＲを用いて構築した（図３Ｃ）。各ｕｒｅＰｔｅｔＯ構築物の作製に用いたプライマー対を表６に挙げる。

（表５）
本試験に用いたオリゴヌクレオチドプライマー

簡単に述べれば、ｕｒｅＡプロモーターの１ｋｂ上流および２ｋｂ下流を別々に増幅した。長いプライマーテールを用い、２つの増幅断片のＰＣＲによる融合時にｕｒｅＡプロモーター領域を再構築した。プライマーｕｒｅＡｒｃａｔ７およびｕｒｅＡｒｃａｔ８を用いて、最終的に３ｋｂの産物ｕｒｅＰｔｅｔＯ（Ｉ〜Ｖ）を増幅した。

ｕｒｅＡノックアウト株の構築：
ｕｒｅＡ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴ構築物をショートマルチプルフュージョンＰＣＲ（ｓｈｏｒｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ）により作製した。簡単に述べれば、断片１および３を２６６９５ゲノムＤＮＡから、それぞれプライマーｕｒｅＡｒｃａｔ１とｕｒｅＡｒｃａｔ２、およびｕｒｅＡｒｃａｔ３とｕｒｅＡｒｃａｔ４を用いて増幅し、ｒｐｓＬ−ＣＡＴ選択カセット（ミドル断片）を、プライマーｕｒｅＡｒｃａｔ５およびｕｒｅＡｒｃａｔ６を用いて増幅した。ネステッドプライマーｕｒｅＡｒｃａｔ７およびｕｒｅＡｒｃａｔ８を用いて融合ＰＣＲ産物を増幅した。Ｈ．ピロリ株Ｘ４７を、最終ＰＣＲ融合産物で自然形質転換し、受容株Ｘ４７ ｕｒｅＡ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴを作出した。これは、ｕｒｅＡとｕｒｅＡプロモーターをｒｐｓＬ−ＣＡＴに置き換えたものである（ｗｅｒｅ ｕｒｅＡ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｒｅＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｒｅ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｂｙ ｒｐｓＬ−ＣＡＴ）。

ｕｒｅＰｔｅｔＯ株の構築：
受容株Ｘ４７ ｕｒｅＡ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴをｕｒｅＰｔｅｔＯ（Ｉ〜Ｖ）構築物で自然形質転換して、Ｘ４７ ｕｒｅＰｔｅｔＯ（Ｉ〜Ｖ）株を得た。得られたストレプトマイシン耐性形質転換体の適正な対立遺伝子置換を、プライマーｕｒｅＰｓｅｑを用いたシーケンシングにより確認した。

Ｈ．ピロリにおけるｕＰｔｅｔＯのテトラサイクリン調節を特性決定するためのＧＦＰリポーター株の構築
ｕｐｔｅｔＯ−ＧＦＰ（１〜３）構築物をｐＢｌｕ＿ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰ（１〜３）から、ＳａｌＩおよびＸｂａＩを用いた二重制限消化によって切り出し、同様に消化したｐＧｌｔＤＨ、ｐＴｒｐＡおよびｐＨｄａｐＢベクターにクローニングしてｐＧｌｔＤＨ−ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰ（１〜３）、ｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰ（１〜３）およびｐＨｄａｐＢ−ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰ（１〜３）プラスミドを得た（図１６Ａ〜Ｃ）。Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ（１〜６）株をｐＴｒｐＡ−ＲＣＡＴ、ｐＧｌｔＤＨ−ＲＣＡＴおよびｐＨｄａｐＢ−ＲＣＡＴで形質転換して各受容株を作製した。これらの受容株を次に、適当なｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰ含有プラスミドで形質転換し、３つの受容遺伝子座のうち１つからテトラサイクリン誘導プロモーターの制御下でＧＦＰを発現し、また、ＴｅｔＲまたはｒｅｖＴｅｔＲのいずれかも発現するＸ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ；ｕＰｔｅｔＯ−ＧＦＰ株のパネル（表４）を作出した。ｒｅｖＴｅｔＲを発現する株は、インデューサー分子の不在下でＧＦＰを発現し、ＴｅｔＲを発現する株はインデューサーの存在下で増殖させた場合にのみＧＦＰを発現する。

Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ；ｕｒｅＰｔｅｔＯ株の構築
Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲＩ（１〜７）株をｕｒｅＡ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴ構築物で自然形質転換して受容株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ；ｕｒｅＡ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴ（１〜７）を得た。これらの株を全てｕｒｅＰｔｅｔＯ（Ｉ〜Ｖ）構築物で形質転換し、Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ；ｕｒｅＰｔｅｔＯ株の全シリーズを作製した（表４）。

（表６）
ｕｒｅＰｔｅｔＯ構築物を作製するためのプライマー対

イムノアッセイ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析
クロラムフェニコールまたはストレプトマイシンプレートのいずれかで増殖している細菌の全細胞溶解液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）バッファーに再懸濁させた。細胞をペレットとし、溶解バッファー（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００）に再懸濁させ、氷上で１５分間インキュベートした。次に、サンプルを１０秒間超音波処理した。不溶性細胞残渣を、４℃にて１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により除去した。細胞溶解液をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルバッファーと混合し、９５℃で１０分間インキュベートした。これらのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、ｐｖｄｆ（０．２２μＭ Ｉｍｍｏｂｕｌｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜に、４℃、転写バッファー（１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭトリス、２０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］メタノール）中、９０Ｖの一定電圧で２時間、電気転写した。この膜をＰＢＳＴ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス−Ｃｌ、ｐＨ７．０、０．１％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］ツィーン２０）中、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を使用することによりブロッキングし、次に、適当な一次抗体とともにインキュベートし、洗浄し、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄｉｓｅ）（ＨＲＰ）コンジュゲートを含有する二次抗体とともにインキュベートした。この膜を再び洗浄し、二次ＨＲＰコンジュゲートの検出は化学発光（Ｓｉｇｍａ）によって達成した。ＴｅｔＲおよびｒｅｖＴｅｔＲの検出には、一次抗体としてウサギポリクローナルＩｇＧ抗ＴｅｔＲ（ＭｏＢｉＴｅｃ）を１：２０００希釈で用いた。ＵｒｅＢサブユニットの検出には、マウスモノクローナルＩｇＧ抗ＵｒｅＢ（Ａｕｓｔｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を１：８０００希釈で用いた。ＧＦＰの検出には、ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ（Ｏｎｄｅｋ）を１：２０００希釈で用いた。二次抗体、マウス抗ウサギ−ＨＲＰおよびウサギ抗マウス−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１：１０，０００希釈で用いた。化学発光はＬＡＳ ３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）（ソフトウエアイメージリーダーＬＡＳ ３０００ Ｖ２．２）を用いて検出した。

ウレアーゼ活性アッセイ
ウレアーゼプレートアッセイ
細菌をＰＢＳに０．１ＯＤ_６００となるように再懸濁させ、２０μｌの懸濁液を、０〜２５０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度のＡＴｃを含有する新しいウレアーゼプレート（ブルセラブロス、７％ＮＣＳ、１ｍＭ尿素、フェノールレッド１００ｍｇ／Ｌ、バンコマイシン６ｍｇ／Ｌ、ｐＨ約６．２、すなわち、ｐＨ指示薬によるプレートの色の変化を見るには十分であるが、ウレアーゼ陰性株の増殖を阻害するほどの酸性度ではない）にスポットした。プレートを微好気性条件下でインキュベートし、２４時間ごとに色の変化を調べた。

ディスク拡散アッセイ：
細菌をウレアーゼプレートに播種し、ブランクディスクを播種済みプレート上に置いた。１０μｌのＡＴｃを各ディスク上に置き、プレートを微好気性条件下でインキュベートし、３０時間ごとに色の変化を調べた。

液体ウレアーゼアッセイ：
細菌を、５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃを含む、または含まないＣＢＡプレート上で２連続の継代培養の間増殖させた。細菌を冷バッファーＡ（２５ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．８）に再懸濁させ、ＯＤ_６００ ４．０に対して標準化した。５０μＬの標準化細菌懸濁液を５０μＬのバッファーＢ（２５ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．８、０．２％ツィーン−２０）で希釈した。９６ウェルプレートにて、２５μＬの希釈細菌懸濁液を１５０μＬのバッファーＣ（２５ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．８、２５０μΜフェノールレッド）で希釈し、３７℃で５分間インキュベートした。次に、７５μＬの尿素溶液（０．５Ｍ）を加え、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ（ＢＧＭ Ｌａｂｔｅｃｈ）プレートリーダーを用いて、５６０ｎｍにおける吸光度を７２秒ごとに７５サイクル測定した。活性は、経時的な吸光度の変化率として測定し、野生型親株のウレアーゼ活性に対するパーセントとして表した。ウレアーゼ活性の測定は全て３回行い、実験を３回繰り返した。

ＧＦＰリポーターアッセイ
ディスク拡散アッセイ：
細菌をＣＢＡプレートに播種し、３７℃で１４時間インキュベートした。ブランクディスクを細菌叢上に置き、３０μＬのＡＴｃ溶液を添加し、４８時間インキュベートした後に、ＬＡＳ ３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）（光源−Ｂｌｕｅ−４６０ｎｍ ＥＰＩ、Ｆｉｌｔｅｒ ＧＦＰ５１０ＤＦ１０）を用いてＧＦＰ発現を可視化した。

ＧＦＰ蛍光：
細菌を、５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃを含む、または含まない新しいＣＢＡプレートに播種し、２４時間インキュベートした後に可視化した。Ｔｅｔ−ＯＦＦ株では、ｐｔｅｔＲ（２，４，６）細菌を、実験前にＡＴｃを含有するＣＢＡプレート上で２回継代培養し、株にＧＦＰ発現を抑制するために十分な時間経過させた。

液体培養：
５ｍＬの培養物を１４時間増殖させた後、特に断りのない限り、２００ｎｇ／ｍＬのＡＴｃで誘導した。細菌を遠心分離により採取し、ＰＢＳで２回洗浄し、２ ＯＤ_６００の密度で再懸濁させた。その後、０．１ｍｌの細菌懸濁液を黒色の９６ウェルプレートに移し、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダーを用い、４８５ｎｍで励起した後に５２０ｎｍで蛍光を測定した。

動物実験
６〜７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスに、５０ｎｇ／ｍＬのＡＴｃを含有するＣＢＡプレートで継代培養された２００μＬの１×１０^９ＣＦＵ／ｍＬの細菌を１回、強制経口投与して、テトラサイクリン応答性遺伝子の発現を誘導した。マウスの５％スクロースを含有する飲用水にドキシサイクリンを添加した。示された時点でマウスを犠牲にし、胃を摘出し、組織溶解剤（Ｒｅｔｃｈ）を用いて１ｍＬのＢＨＩ中でホモジナイズした。ホモジネートを連続希釈し、Ｈ．ピロリ選択プレート（５％ウマ血液、デント、ポリミキシンＢ ２５００Ｕ／Ｌまたは０．２９７５ｍｇ／Ｌ、ナリジクス酸１０ｍｇ／Ｌおよびバシトラシン１００ｍｇ／Ｌを含有するＣＢＡ）に播種した。コロニーを計数して細菌量を算出した。再単離されたクローンのｔｅｔ応答性遺伝子発現を確認し、適当であれば配列決定を行った。

本試験に用いたＨ．ピロリ株およびプラスミドを表４に挙げる。Ｈ．ピロリＸ４７株は、通常、３７℃、微好気性条件下、５％ウマ血液および５％ウシ新生仔血清（ＮＣＳ）を含有するブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）血液寒天培地（ＢＨＩＢ）プレートまたはハートインフュージョン（ＨＩ）血液寒天培地（ＨＩＢ）プレート上で増殖させた。適当であれば、Ｈ．ピロリ抗生物質選択は、培地にクロラムフェニコールまたはストレプトマイシンを終濃度１０μｇ／ｍＬで添加することによって行った。Ｈ．ピロリ液体培養：細菌を、１０％ウシ新生仔血清（ＮＣＳ）およびデントの抗生物質サプリメントを添加したブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地で増殖させた。培養物に、開始ＯＤ_６００が０．０５となるようにＰＢＳに再懸濁させた細菌を播種し、微好気性条件下、３７℃、１２０ｒｐｍで増殖させた。大腸菌ＤＨ１０βはＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス中、３７℃、１８０ｒｐｍで増殖させた。必要であれば、抗生物質を次の終濃度で加えた：アンピシリン１００μｇ／ｍｌおよびクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌ。

Ｈ．ピロリ２６６９５コドンの使用頻度に関して最適化したｃｒｅリコンビナーゼ（配列番号８７）遺伝子を、ｐＵＣ１９−Ｃｒｅから、プライマーＭＳ＿ＮｄｅＩ−Ｃｒｅ ＦおよびＭＳ＿Ｃｒｅ−ＳａｌＩ Ｒを使用することにより増幅した。１ｋｂのＰＣＲ断片をＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化し、同様に消化したベクターｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ１−ＧＦＰまたはｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ２−ＧＦＰ（表４）にクローニングし、ｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ１−ＣｒｅおよびｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ２−Ｃｒｅを作製した。

Ｈ．ピロリ受容株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２；ｔｒｐＡ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴをプラスミドｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ１−ＣｒｅまたはｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ２−Ｃｒｅで自然形質転換してＸ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２；ｔｒｐＡ：：ｕＰｔｅｔＯ（１／２）−ｃｒｅを作製した（表４）。

ｌｏｘ６６およびｌｏｘ７１ ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位で挟み込まれたＰｕｒｅＡ−ｄａｐＡを含有する合成カセットＬｏｘ６６７１（配列番号８８）を設計および合成した（ｐＭＫ−ＲＱ−Ｌｏｘ６６７１）（図２２）。このカセットをＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩによる二重制限消化によって切り出し、同様に消化したベクターｐＢｌｕ＿ＢＩにクローニングしてプラスミドｐＢＩ−Ｌｏｘ６６７１を得た。

Ｘ４７ ｕｒｅＢＩ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴ株のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、ｕｒｅＢ遺伝子とｕｒｅＩ遺伝子の間に組み込まれた対抗選択カセットｒｐｓＬ−ＣＡＴを増幅した。Ｈ．ピロリ株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２；ｔｒｐＡ：：ｕＰｔｅｔＯ（１／２）−ｃｒｅをｕｒｅＢＩ−ＲＣＡＴ ＰＣＲ産物で自然形質転換し、Ｌｏｘ６６７１カセットをｕｒｅＢＩ遺伝子座に導入するための受容株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２；ｔｒｐＡ：：ｕＰｔｅｔＯ（１／２）−ｃｒｅ；ｕｒｅＢＩ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴを作製した。これらの株をｐＢＩ−Ｌｏｘ６６７１で形質転換し、Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｐｔｅｔＲ２；ｔｒｐＡ：：ｕＰｔｅｔＯ（１／２）−ｃｒｅ；ｕｒｅＢＩ：：Ｌｏｘ６６７１株を作製した（表４）。さらに、受容株Ｘ４７ ｕｒｅＢＩ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴをｐＢＩ−Ｌｏｘ６６７１で形質転換し、対照株Ｘ４７ ｕｒｅＢＩ：：ｌｏｘ６６７１を作製した。

ｔｅｔＲの遺伝子配列をＨ．ピロリ２６６９５のコドン使用頻度に関してコドンの最適化を行い、合成した。この合成ｔｅｔＲｓ（配列番号８９）を、ｐＭＡ−Ｔ−ＴｅｔＲｓから、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩによる二重制限消化により切り出し、同様に消化したベクターｐＭｄａＢ−ＰｕｒｅＡ−ｈｙｄＡにクローニングし、プラスミドｐＭｄａＢ−ＰｕｒｅＡ−ＴｅｔＲｓを得た。受容株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴをこのプラスミドで自然形質転換し、Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓを作製した。

ＴｅｔＲｓ調節型Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系および異なるＣｒｅ発現効率を有するＨ．ピロリ株の構築
ｐＴｒｐＡ−（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅの構築
６種類の異なる誘導プロモーター−ｃｒｅ５’変異体のセットを設計および合成した（ｐＭＫ−（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅ５’）。これらのプロモーター変異体は２つのｔｅｔＯ部位、１つの野生型または変異型ＲＢＳおよび開始コドンとしてのＡＴＧ、ＣＴＧまたはＴＴＧを含む（図２３）。ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅ５’融合物をｐＭＫ−（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅ５’から、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩによる二重制限消化により切り出し、同様に消化したベクターｐＴｒｐＡ−ｕＰｔｅｔＯ２−ＣｒｅにクローニングしてｐＴｒｐＡ−（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅプラスミド（配列番号９０〜９５）を得た。この構築はＮｄｅＩによる制限消化によって確認した。融合物（１／４）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅ５’を同様にｐＴｒｐＡ−６ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅにクローニングし、プラスミドｐＴｒｐＡ−（１，４）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅを作製した。

ＴｅｔＲｓ調節型Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系を有するＨ．ピロリ株の構築
Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓをｐＴｒｐＡ−ＲＣＡＴで自然形質転換し、受容株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓ；ｔｒｐＡ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴを作製した。この株を構築されたプラスミドｐＴｒｐＡ−（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅで形質転換した。得られた株をｐＢＩ−ＲＣＡＴおよびｐＢＩ−Ｌｏｘ６６７１で順次形質転換し、Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓ；ｔｒｐＡ：：（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−ｃｒｅ；ｕｒｅＢＩ：：Ｌｏｘ６６７１株を作出した。

ＴｅｔＲｓ調節型Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系を有するＣｒｅアンチセンスＲＮＡ発現Ｈ．ピロリ株の構築
ｐＴｒｐＡ−ａｓ（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅ（配列番号９６）の構築
対象遺伝子のｍＲＮＡを誘導転写し、かつ、ｔｒｐＡ遺伝子座にある同じ遺伝子コピーからアンチセンスＲＮＡを構成的に発現するためのカセットを設計および合成した（ｐＭＡ−アンチセンス）（図２８）。ｐＴｒｐＡ−（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅの（１−６）ｕＰｔｅｔＯ５−ｃｒｅ変異体を切り出し、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩによる消化によってｐＭＡ−アンチセンスにクローニングし、ｐＴｒｐＡ−ａｓ（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−Ｃｒｅを作製した。これらのプラスミドを用いて受容株Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓ；ｔｒｐＡ：：ｒｐｓＬ−ＣＡＴを形質転換し、Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓ；ｔｒｐＡ：：ａｓ−（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−ｃｒｅを作製した。その後、これらの株をｐＢＩ−ＲＣＡＴおよびｐＢＩ−Ｌｏｘ６６７１で順次形質転換し、Ｘ４７ ｍｄａＢ：：ＰｕｒｅＡ−ｔｅｔＲｓ；ｔｒｐＡ：：ａｓ−（１〜６）ｕＰｔｅｔＯ５−ｃｒｅ；ｕｒｅＢＩ：：Ｌｏｘ６６７１株を作出した。

イムノアッセイ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析
細菌を選択プレート上または選択液体培地中で２４時間増殖させた。細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）バッファーに再懸濁させた。次に、サンプルを１０秒間超音波処理し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルバッファーと混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。不溶性細胞残渣を、１３，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離により除去した。これらのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｕｌｏｎ−Ｐ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、０．４５μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に、転写バッファー（１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭトリス、２０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］メタノール）中、１００Ｖの一定電圧で１時間、電気転写した。これらの膜をＰＢＳＴ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．０、０．１％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］ツィーン２０）中、３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でブロッキングし、次に、適当な一次抗体とともにインキュベートし、洗浄し、その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄｉｓｅ）（ＨＲＰ）コンジュゲートを含有する二次抗体とともにインキュベートした。この膜を再び洗浄し、二次ＨＲＰコンジュゲートの検出は化学発光（Ｓｉｇｍａ）によって達成した。Ｃｒｅリコンビナーゼの検出には、ウサギポリクローナルＩｇＧ抗Ｃｒｅ（ａｂｃａｍ）を１：１０００希釈で用いた。ＴｅｔＲの検出には、一次抗体として１：１０００希釈のウサギポリクローナルＩｇＧ抗ＴｅｔＲ（ａｂｃａｍ）を用いた。二次抗体ウサギ抗マウスＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は１：５０００希釈で用いた。化学発光はＬＡＳ ３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）（ソフトウエアイメージリーダーＬＡＳ ３０００ Ｖ２．２）を用いて検出した。

ｔｅｔ誘導性抗原発現カセットを含有するシャトルベクターに基づくｐＨｅｌ２の構築
ＰｆｌａＡの制御下のｔｅｔＲｓｙｎ遺伝子とｕＰｔｅｔＯ４ａの制御下の標的遺伝子を含有するｔｅｔ誘導性発現カセットを設計した。Ｈ．ピロリのコドン使用頻度に関して最適化したリステリオリシン（ｌｉｓｔｅｒｉｏｓｙｌｉｎ）遺伝子を標的遺伝子として有し、ｔｅｔＲｓｙｎ遺伝子を含まないカセットを合成した（ｐＭＡ−ＩＥＣ−ＬＬＯ）（配列番号９７）。第１のクローニング工程で、ｔｅｔＲｓｙｎをｐＭＡ−Ｔ−ＴｅｔＲｓｙｎから、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩによる二重制限消化により切り出し、同様に消化したベクターｐＭＡ−ＩＥＣ−ＬＬＯにクローニングし、プラスミドｐＭＡ−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＬＬＯを作製した。第２のｆｌｉＣｓｙｎ（配列番号９８）は、プライマーＭＳ＿ＮｄｅＩ−ＦｌｉＣ ＦおよびＭＳ＿ＦｌｉＣ−ＳａｌＩ Ｒと鋳型としてのプラスミドｐＭＫ−ＲＱ−ＦｌｉＣｓｙｎを用いて増幅した。得られたＰＣＲ断片およびｐＭＡ−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＬＬＯをＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化し、ＬＬＯ遺伝子に取って代わるこのベクター中にｆｌｉＣｓｙｎをクローニングした（ｐＭＡ−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎ）（配列番号９９）。最後に、構築されたプラスミドをＸｈｏＩで消化して、誘導性発現カセット全体を切り出した。このカセットを、同様に消化したベクターｐＨｅｌ２にクローニングし、シャトルベクターｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎ（配列番号１００）を得た。

大腸菌からＨ．ピロリへのｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦＬｉＣｓｙｎの細胞間移入
ドナー株として大腸菌β２１５０株およびヘルパー株としてβ２１５０［ｐＲＫ２０１３］株を用い、組換えシャトルベクターｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎを大腸菌からＨ．ピロリへコンジュゲートした。Ｈ．ピロリ受容株Ｂ１２８を選択血液寒天培地プレート上で２４時間増殖させた。組換えシャトルベクターを含有する大腸菌β２１５０とβ２１５０［ｐＲＫ２０１３］の両方を一晩、１ｍＭのＤＡＰを含有する液体培養中で増殖させた。全ての細菌を採取し、リン酸緩衝生理食塩水またはＬＢ培地のそれぞれに再懸濁させた。これらの細菌株を次の相対ＯＤ_６００で混合した：１０ＯＤ_６００単位のドナー２５μｌ；１０ＯＤ_６００単位のヘルパー２５μｌ；および１０ＯＤ_６００単位の２５０μ１のレシピエント２５０μｌ。この細胞混合物を、１ｍＭのＤＡＰを添加した血液寒天培地プレートにスポットし、微好気性条件下、３７℃で４時間インキュベートした。次に、この細菌混合物を、選択性抗生物質とデントを添加した新しい血液寒天培地プレートに拡げ、微好気性条件下、３７℃でインキュベートした。結果としてのトランスコンジュガントＢ１２８ ｐＨｅｌ２−ＩＥＣ−Ｔｓ−ＦｌｉＣｓｙｎは３〜５日後に見られた。

Claims (27)

1. ５’から３’方向に（ａ）プロモーター配列と、（ｂ）対象ＤＮＡ配列とを含み、前記プロモーター配列が、ヘリコバクター・ピロリにおいて前記対象ＤＮＡ配列の発現を調節することができるポリヌクレオチド配列を含み、前記プロモーター配列がテトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を含むように改変されている、遺伝子構築物。
2. ５’から３’方向に（ａ）プロモーター配列と、（ｂ）ウレアーゼオペロンとを含み、前記プロモーター配列が、ヘリコバクター・ピロリにおいてウレアーゼオペロンの発現を調節することができるポリヌクレオチド配列を含み、前記プロモーター配列がテトラサイクリン（ｔｅｔ）オペレーター配列を含むように改変されている、遺伝子構築物。
3. 前記対象ＤＮＡ配列が少なくとも１つの異種抗原またはその機能的断片をコードする、請求項１または２に記載の遺伝子構築物。
4. 前記異種抗原またはその機能的断片が病原微生物に由来する、請求項３に記載の遺伝子構築物。
5. 前記病原微生物がウイルス、細菌、原虫および真菌からなる群から選択される、請求項４に記載の遺伝子構築物。
6. 前記異種抗原がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ＨＴＬＶ抗原、ＳＩＶ抗原、ＲＳＶ抗原、ＰＩＶ抗原、ＨＳＶ抗原、ＣＭＶ抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、水痘帯状疱疹ウイルス抗原、流行性耳下腺炎ウイルス抗原、麻疹ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ライノウイルス抗原、Ａ型肝炎ウイルス抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ノーウォークウイルス抗原、トガウイルス抗原、アルファウイルス抗原、風疹ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、エボラウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、メタニューモウイルス抗原、コロナウイルス抗原、コレラ菌抗原、熱帯熱マラリア原虫抗原、三日熱マラリア原虫抗原、卵形マラリア原虫抗原、四日熱マラリア原虫抗原、二日熱マラリア原虫抗原、肺炎球菌抗原、化膿連鎖球菌抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原、ストレプトコッカス・アガラクティアエ抗原、髄膜炎菌抗原、淋菌抗原、ジフテリア菌抗原、破傷風菌抗原、百日咳菌抗原、ヘモフィルス抗原、クラミジア抗原および大腸菌抗原からなる群から選択される、請求項４に記載の遺伝子構築物。
7. 前記構築物が（ｃ）遺伝子終結配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
8. 前記遺伝子構築物がプラスミドベクターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
9. 前記プラスミドベクターが前記遺伝子構築物をＨ．ピロリの染色体に挿入することができる、請求項８に記載の遺伝子構築物。
10. 前記遺伝子構築物の前記染色体への挿入が相同組換えによるものである、請求項９に記載の遺伝子構築物。
11. 前記ウレアーゼオペロンがＨ．ピロリ株から単離される、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
12. 前記ウレアーゼオペロンがサブユニットＡおよびＢを含む、請求項１１に記載の遺伝子構築物。
13. 前記ｔｅｔオペレーター配列を含むように改変される前の前記プロモーターがＨ．ピロリに対して外因性である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
14. 前記プロモーターがウレアーゼのプロモーターである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
15. 前記ウレアーゼプロモーターがＨ．ピロリのウレアーゼサブユニットＡである、請求項１４に記載の遺伝子構築物。
16. 前記プロモーターがａｍｉＥプロモーター、コアウレアーゼプロモーター、ｒｅｖｔｅｔＲプロモーターおよびｆｌａＡプロモーターからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子構築物。
17. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を含む、単離された遺伝子改変Ｈ．ピロリ。
18. ヘリコバクター・ピロリの遺伝子改変法であって、
    （ｉ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を準備すること；および
    （ｉｉ）前記ヘリコバクター・ピロリを形質転換して前記遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリを作出すること
    を含む、方法。
19. Ｈ．ピロリの哺乳類の粘膜にコロニーを形成する能力を制御する方法であって、前記Ｈ．ピロリのホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒｉｓｅ）を改変するか、または欠失させることによってリポ多糖（ＬＰＳ）のルイス抗原を代謝的に制御する工程を含み、前記Ｈ．ピロリによる粘膜のコロニー形成を維持するために、前記哺乳類の食餌へのマンノースの添加が必要とされる、方法。
20. 前記ルイス抗原の欠如が前記哺乳類において樹状細胞の機能向上をもたらす、請求項１９に記載の方法。
21. 前記Ｈ．ピロリがＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ受託番号４３５０４；４３５０４Ｄ−５；４３５２６；４３５７９；４３６２９；４９３９６；４９５０３；５１１１０；４９５０３；５１１１１；５１４０７；５１６５２；５１６５３；５１９３２；および５３７２７として寄託されているＨ．ピロリ株から選択される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記Ｈ．ピロリがＮａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに受託番号Ｖ０９／００９１０１；Ｖ０９／００９１０２；Ｖ０９／００９１０３；Ｖ１０／０１４０５９；Ｖ１０／０１４０６０およびＶ０９／００９１０４として寄託されているＨ．ピロリ株から選択される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
23. 請求項１７に記載の単離された遺伝子改変ヘリコバクター・ピロリと薬学上許容される担体とを含む、免疫原性組成物。
24. アジュバントをさらに含む、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
25. 哺乳類を病原微生物による感染から保護する方法であって、免疫学的に有効な量の、請求項２３または２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与する工程を含む、方法。
26. 前記哺乳類が霊長類、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジおよび齧歯類である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記哺乳類がヒトである、請求項２６に記載の方法。

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