KR20100065243A - 마이코박테리움의 일렉트로포레이션 및 마이코박테리아에서의 항원의 과발현 - Google Patents

Abstract

백신화제로서 사용하기에 개선된 백신 성질들을 갖는 재조합 마이코박테리움 균주를 제공한다. 상기 재조합 마이코박테리움 균주의 모 균주는 그의 효능 있는 면역원성에 대해서 선택된다. 상기 마이코박테리움 균주는 항생물질 내성을 나타내지 않으며, 그람 음성 세균으로의 수평 이동을 나타내지 않는다.

백신화제, 재조합 마이코박테리움 균주

Description

마이코박테리움의 일렉트로포레이션 및 마이코박테리아에서의 항원의 과발현{ELECTROPORATION OF MYCOBACTERIUM AND OVEREXPRESSION OF ANTIGENS IN MYCOBACTERIA}

본 발명은 결핵에 대한 백신화제로서 사용하기 위한 개선된 백신 성질을 갖는 마이코박테리움 균주를 제공한다. 상기 마이코박테리움 균주는 바람직하게는 효능있는 면역원성을 갖는 것으로서 동정되고, 항생제 내성을 나타내지 않으며, 그람 음성 세균으로의 수평 이동을 나타내지 않는 모 균주들 중에서 선택된다. 본 발명은 또한 다른 질병에 대한 백신화 및 암의 치료에 사용하기 위한 백신 성질을 갖게 될 전이유전자(transgene)의 전달을 위해 개선된 성질을 갖는 마이코박테리움을 제공한다.

마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)(M. tb)는 전 세계 인구의 1/3을 감염시켜 왔으며, 매년 800 만명에게서 활동성 질병을 일으키고 160 만명 내지 220 만명을 사망케하며, 이들 중 대부분은 개발도상국에서 살고 있다. 결핵(TB)은 HIV의 확산과 맞물려 점점 더 증가하고 훨씬 더 치명적으로 되고 있는 세계적인 규모의 유행병이다. TB는 AIDS 환자의 제 1의 살해자이다.

현재 널리 사용되는 TB 백신인 BCG는 80년 전에 개발되었으며 시험 시, 인도 에서 수행된 마지막 대규모 야외 실험에서 효력이 없었음을 포함하여, 폐 결핵에 대해 광범위하게 가변적인 유효 비율을 지녔다(Fine et al., Vaccine, 16(20):1923-1928; 1998; Anonymous, Indian J Med Res., Aug;110:56-69; 1999). 그럼에도 불구하고, 세계 보건 기구는 현재 고 TB 만연 국가에서 출생 시 또는 모든 어린이들(HIV 질병/AIDS의 증상이 있는 어린이 제외)이 공공 의료 서비스와 최초 접촉시 BCG를 권장하고 있다. 이러한 정책은 BCG가 TB의 심각한 아동기 형태를 막는다는 증거를 근거로 한다(Lanckriet et al., Int J Epidemiol, 24(5):1042-1049; 1995; Rodrigues et al., J Epidemiol Community Health 45(1):78-80; 1991). 유아기를 넘어선 TB에 대한 BCG에 의한 보호는 혼합된 결과를 제공하는 제한된 데이터를 갖는, 논쟁의 주제이다. 그러나, 유아 BCG 면역화가 널리 시행되는 개발도상국에서 소아 및 성인 TB의 높은 발병률은 현재 투여되는 BCG가, 사람들이 TB 질병의 위험에 있는 수년 동안 그다지 유효하지 않음을 가리킨다. 따라서, BCG는 TB의 중재 및 억제에 부적합한 공중 보건 도구인 것으로 간주된다.

TB 유기체에 노출된, 정상적인 면역계를 갖는 인간의 대략 70%는 감염되지 않고, 감염되는 사람들 중 단지 약 5%만이 처음 2년 내에 발병한다. 감염된 개인의 대다수는 상기 감염을 나타내지 않으며, 이는 M. tb 항원에 대한 확고한 세포 면역 반응의 발생과 관련이 있다. 추가로 5%는 면역성이 감퇴될 때 나중에 재활성화된다. 원발성 및 재활성화 질병은 HIV/AIDS 환자에서 훨씬 더 흔하며, 이는 감염의 예방 및 억제에 있어서 면역성의 역할을 다시 강조한다.

대부분의 인간들은 TB를 억제할 수 있기 때문에, 적합한 종류의 오래 지속되는 면역성을 유도함으로써 노출 후 초기 감염을 예방하고, 질병으로의 조기 진행을 방지하며, 잠복기로부터의 재활성화를 방지하고, 치료 후 재발을 방지하는 유효 백신의 개발이 가능하기를 희망하는 좋은 이유가 존재한다. 궁극적으로, 이는 인간 병원체로서 결국 M. tb를 제거하는 전신 백신 사용 플러스 화학요법적 중재의 병행이다.

아동기 BCG 백신화가 급성 TB 예방에 중요한 역할을 한다는 생각에 비추어, 새로운 TB 백신이 우수한 제품이라는 압도적인 증거 없이 후보 TB 백신을 평가하기 위한 시도에서 BCG를 대체하는 것은 곤란하다. 문제는 M. tb가 주로 인간-특이적 병원체이며 동물 모델은 단지 숙주-병원체 상호작용의 일부만을 모방한다는 것이다. 따라서, 새로운 TB 백신이 개선된 효능을 갖는다는 결정적인 증거는 오직 인간의 통제된 야외 실험으로부터만 획득할 수 있다. 이러한 고려사항은 다수의 조사자들로 하여금 개선된 TB 백신으로의 핵심 단계가 개선된 BCG 균주 및 동물 모델을, 그의 한계에도 불구하고 개발하는 것일 것이라는 결론을 내리게 하며, 이는 보호 항원을 과발현하는 재조합 BCG가 BCG에 비해 증가된 효능을 가짐을 암시한다.

몇몇 M. tb 항원은 백신 성질을 가지며, 동물들에게 백신 제형으로서 제공될 때, BCG 단독으로 성취되는 것과 유사한 보호를 부여한다(Anderson, Infect Immun 62(6) 2536-2544; 1994). 이들 후보를 진보시키기 위해서, BCG에서 상기와 같은 항원의 면역원성을 향상시키기 위한 전략이 개발되었다. 따라서, 선택된 M. tb 항원을 과발현하는 BCG 균주가 개발되었으며 이러한 재조합 BCG(rBCG) 균주는 상기 rBCG 균주가 유래된 모 BCG 균주에 비해 더 강한 보호를 유도하는 것으로 나타났다(Horwitz et al., Infect Immun 72(4):1672-1679; 2003). 한 연구에서, 항원 85B(본 발명에서 "Ag85B"라 지칭함)를 발현한 rBCG 균주는 동일한 항원과 혼합된 BCG보다 더 효능이 있는 것으로 나타났다(상기 Horwitz et al., 2003). 이러한 발견들을 근거로, 상기 접근법은 대단한 가능성을 갖는다.

몇몇 상황에서 항원을 과발현하는 BCG 균주를 사용하여 TB에 의한 감염으로

부터 보호를 부여하는 면역 반응을 안전하고 유효하게 이끌어낼 수 있다.

본 발명은 결핵에 대한 백신화제로서 사용하기 위해 개선된 백신 성질을 갖는 유전공학(재조합) 마이코박테리움 균주를 제공한다. 상기 균주는 다양한 특징들을 가지며, 이들은 각각 상기 균주의 면역원성을 증가시키는 작용을 한다. 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주는 그의 효능 있는 면역원성을 위해 의도적으로 선택된 모 균주로부터 개발되었다. 즉, 유전자 조작(예를 들어 결핵 항원을 과발현하기 위해서)을 겪는 모 균주로서 선택되는 마이코박테리움의 균주는, 심지어 유전자 조작에 앞서, 백신화된 숙주에서 효능 있는 면역 반응을 이끌어내는 능력을 나타내기 때문에 선택된다. BCG 균주 대니쉬(Danish) 1331이 일례이다. 이어서 상기와 같은 균주를 바람직하게는 예를 들어 관심 결핵 항원을 과발현하도록 조작한다. 바람직하게는 생체 내 활성화되는 프로모터를 상기 유전자 재조합 마이코박테리움에 사용한다. 또한, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주를 항생물질 내성에 의한 것 이외의 기준으로 선택가능하게 유전자 가공하거나 또는 상기 균주가 선택성 마커를 전혀 필요로 하지 않도록 하는 방식으로 제작하여, 상기 균주를 인간 집단에 백신화제로서 사용하기에 일반적으로 안전하게 만든다. 예로서, 마이코박테리움 복제에 필요한 유전자를 제거하여 발현 플라스미드에 넣는다. 또한, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주는 그람 음성 세균으로의 수평 이동을 견디지 못하며 따라서 숙주 유기체로부터 "달아날" 수 없다. 이는 또한 인간 집단에서의 백신화제로서의 그의 안전성을 보장한다.

또 다른 예로서, 본 발명은 플라스미드의 유지를 위한 항생물질 선택 필요성을 없애는 플라스미드 안정화 인자로서 플라스미드에 의한 항원 85b 발현의 용도를 개시한다. Ag85B + 식별을 위해 PCR 양성 선택을 사용하는 다른 항원들을 발현하는 고 농도의 최소 플라스미드에 의한 마이코박테리움 균주의 직접적인 형질전환은 항생물질 또는 영양요구성 선택의 부재 하에서 플라스미드 안정성을 갖는 항원을 과발현하는 마이코박테리움 균주를 제공한다. 또한, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주는 결핵 백신에 사용하기에 탁월한 작용제인 반면, 상기 균주를 또한 결핵과 관련된 항원 이외의 항원을 발현 또는 과발현하도록 유전자 가공할 수도 있으며, 따라서 상기 균주는 또한 다른 질병에 대한 백신화제로서 유용하다. 더욱 또한, TB 항원 또는 다른 질병에 중요한 항원을 과발현하는 rBCG를 항원보강제, 재조합 바이러스 벡터, 또는 추가접종으로서 DNA 또는 RNA 백신과 함께, 재조합 단백질을 사용하는 1차 추가접종 섭생에 사용할 수 있다.

본 발명은 복제되고, 형질전환된 세균(또는 자손) 중에서 발현되는 외부 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 상기 형질전환된 세균 또는 그의 자손을 제공하며, 여기에서 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 선택성 마커에 결합되지 않는다. 하나의 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드 상에 있으며, 일부 실시태양에서, 상기 플라스미드는 생존에 필요한 유전자, 상기 형질전환된 세균의 세균 게놈이 결실된, 생존에 필요한 유전자를 암호화한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 플라스미드는 엔도솜 이탈을 암호화하는 유전자, 예를 들어 pfo를 갖고 있다. 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 엔도솜 이탈, 예를 들어 pfo를 암호화한다. 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 항원 85a, 항원 85b, 또는 항원 85a/85b를 암호화한다. 더욱 다른 실시태양에서, 상기 플라스미드는 상기 플라스미드를 유지하고/하거나 안정화하는 단백질을 암호화하는 유전자를 갖고 있다. 일부 실시태양에서, 단백질을 암호화하는 유전자는 항원 85a, 항원 85b 또는 항원 85a/85b를 암호화한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 세균은 마이코박테리움이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 세포사멸을 암호화한다. 다른 실시태양에서, 상기 플라스미드는 세포사멸을 암호화하는 유전자를 갖고 있다. 본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 그람 음성 세균에서 복제될 수 없다. 일부 실시태양에서, 상기 형질전환된 세균은 영양요구성이다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 적어도 일방(one-way) 셔틀 벡터의 일부이다.

본 발명은 세균의 형질전환 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 복제되고 상기 세균 중에서 발현되는 외부 뉴클레오타이드 서열을 통합시키는 단계를 포함하며, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 선택성 마커에 결합되지 않는다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 통합 단계를 일렉트로포레이션에 의해 수행한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드 상에 있으며, 상기 일렉트로포레이션을 하기의 조건 하에서 수행한다: 1 ㎍ 내지 5 ㎍ 범위의 플라스미드 DNA 대 1.25 x 10⁸ 세균 세포 범위의 플라스미드 DNA 대 세균 세포의 비. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 비는 대략 1.6 ㎍의 플라스미드 대 대략 1.25 x 10⁸ 세균 세포이다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 그람 음성 세균에서 복제될 수 없다. 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 적어도 일방 셔틀 벡터의 일부이다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드 상에 위치하며 상기 세균의 세균 게놈이 결실된, 생존에 필요한 유전자를 암호화한다.

본 발명은 관심 유전자를 암호화하는 외부 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손을 추가로 제공하며, 여기에서 하기의 조건들 중 하나 이상이 존재한다: a) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 그람 음성 세균에서 복제할 수 없는 플라스미드를 포함한다; b) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 항생물질 내성을 나타내지 않는다; c) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 영양요구성이다; 및 d) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 일방 셔틀 벡터를 갖고 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 플라스미드의 일부이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 플라스미드는 선택성 마커가 없다. 본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열은 생존에 필요한 유전자를 암호화하며, 상기 생존에 필요한 유전자는 상기 형질전환된 마이코박테리움의 세균 게놈이 결실된다. 일부 실시태양에서, 상기 생존에 필요한 유전자는 leuD이다. 상기 형질전환된 마이코박테리움 또는 자손은 생체 내에서 활성화되는 프로모터 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손을 약독화(attenuated)할 수 있다. 상기 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손은 BCG, 예를 들어 BCG 1331, BCG 파스퇴르, BCG 토쿄, 또는 BCG 코펜하겐일 수 있다.

본 발명은 관심 유전자를 암호화하는 외부 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손을 포함하고 하기의 조건들 중 하나 이상이 존재하는 백신을 추가로 제공한다: a) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 그람 음성 세균에서 복제할 수 없는 플라스미드를 포함한다; b) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 항생물질 내성을 나타내지 않는다; c) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 영양요구성이다; 및 d) 상기 형질전환된 마이코박테리움은 일방 셔틀 벡터를 갖고 있다.

본 발명은 결핵에 대한 백신화제로서 사용하기 위해 개선된 백신 성질을 갖는 유전자 가공된(재조합) 마이코박테리움 균주를 제공한다. 상기 균주는 다양한 특징들을 가지며, 이들은 각각 상기 균주의 면역원성을 증가시키는 작용을 한다. 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주는 그의 효능 있는 면역원성을 위해 의도적으로 선택된 모 균주로부터 개발되었다. 즉, 유전자 조작(예를 들어 결핵 항원을 과발현하기 위해서)을 겪는 모 균주로서 선택되는 마이코박테리움의 균주는, 심지어 유전자 조작에 앞서, 백신화된 숙주에서 효능 있는 면역 반응을 이끌어내는 능력을 나타내기 때문에 선택된다. BCG 균주 대니쉬 1331이 일례이다. 이어서 상기와 같은 균주를 바람직하게는 예를 들어 관심 결핵 항원을 과발현하도록 조작한다. 바람직하게는 생체 내 활성화되는 프로모터를 상기 유전자 재조합 마이코박테리움에 사용한다. 또한, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주를 항생물질 내성에 의한 것 이외의 기준으로 선택가능하게 유전자 가공하여, 상기 균주를 인간 집단에 백신화제로서 사용하기에 일반적으로 안전하게 만든다. 예로서, 복제에 필요한 유전자를 제거하여 발현 플라스미드에 넣는다. 또한, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주는 그람 음성 세균으로의 수평 이동을 견디지 못하며 따라서 숙주 유기체로부터 "달아날" 수 없다(즉 상기 균주는 "일방 셔틀 벡터"이다). 이는 또한 인간 집단에서의 백신화제로서의 그의 안전성을 보장한다. 또한, 본 발명의 재조합 마이코박테리움 균주는 결핵 백신에 사용하기에 탁월한 작용제인 반면, 상기 균주를 또한 결핵과 관련된 항원 이외의 항원을 발현 또는 과발현하도록 유전자 가공할 수도 있으며, 따라서 상기 균주는 또한 다른 질병에 대해서 백신화제로서 유용하다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 마이코박테리움 균주는 약독화된 균주, 예를 들어 BCG이다. 그러나, 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 인식되는 바와 같이, 다른 약독화 및 약독화되지 않은 마이코박테리움 균주를 또한 사용할 수 있다. 추가적인 유형의 마이코박테리움의 예로는 비 제한적으로 마이코박테리움 미크로티 , 마이코박테리움 H37Ra , 마이코박테리움 바카에 등이 있다.

BCG 균주 선택

종래 기술은 BCG가 동종 균주가 아니라 대신에 독특한 유전 계통의 배열을 발생시켰음을 제시하고 있다(Oettinger et al., Tuber Lung Dis. 79(4):243-250; 1999). 최근까지 이러한 차이가 BCG 계열 구성원들의 면역원성 및 효능을 변화시켰는지의 여부는 명확하지 않았다. 그러나, 본 발명에 개시된 바와 같이, 본 발명에 이르러 재조합 BCG(본 발명에서 rBCG라 칭함)가 유래되는 특정 균주가 rBCG의 면역원성 효능에 실질적인 차이를 만드는 것으로 밝혀졌다. 하기 실시예 1은 BCG 균주 대니쉬 1331(본 발명에서 "BCG₁₃₃₁"이라 칭함)이 BCG_Tice에 비해 우수한 백신임을 보인다. 따라서, 균주 rBCG30에서 항원 85B의 과발현이, rBCG30이 유래된 모 균주 BCG_Tice의 면역원성을 증가시켰다 하더라도, 상기 BCG tice 균주에서 항원 85B를 과발현하는 rBCG30은 BCG₁₃₃₁의 효능을 획득하지 못했다. 따라서, BCG에서 항원 과발현으로부터 얻은 몇몇 이점들은 상기 백신 제작 과정의 출발 시 효능있는 모 BCG 균주를 선택함으로써 획득될 수 있다. 이러한 해법이 가늠 시 명백한 것으로 보일수도 있지만, 당해 분야의 지식인들은 이러한 보충을 만들어 내지 못하며(Horwitz et al., Proc Natl Acad Sci USA 97(25):13853-13858; 2000), 이는 지금까지 모 BCG 균주가 상기 rBCG 백신의 제작을 시작하기 전에 적합한 효능을 나타내는 지의 여부를 먼저 결정하는 것이 통상적이지도 않았고 필수적으로 보이지도 않았음을 설명한다. 상기와 같은 균주는 BCG 및 TB 항원 또는 외부 항원의 과발현에 매우 적합하다.

효능있는 모 BCG 균주를 예를 들어 비 제한적으로 BCG 1331, BCG 파스퇴르, BCG 토쿄, 또는 BCG 코펜하겐 그룹으로부터 선택할 수 있다. 상기 모 BCG 균주는 하기 실시예 1에 나타낸 바와 같이 저-용량 에어로졸 기니 피그 시험감염 모델에서 생육 가능한 마이코박테리움 튜베르큘로시스 시험감염 유기체의 수준을 BCG Tice보다 0.4 x 10¹⁰ 이상까지 감소시킬 수 있어야 한다.

BCG 의 면역원성의 향상

상기 논의된 바와 같이, BCG의 면역원성은 불변성이 아니다. 더욱이, 실시예 1은 우리에게 BCG 항원의 면역원성을 BCG의 유전자 조작을 통해 향상시킬 수 있음을 보여주며, 상기와 같은 조작은 재조합 변화가 수행된 상기 모 BCG 균주가 상기 기니 피그 시험감염 모델에서 효능이 결여되는지를 쟁점화한다. 이러한 교시에 대한 당연한 결과는 BCG의 면역원성을 추가로 향상시키는 조작이 상기와 같은 모 균주로부터 유래한 재조합 균주의 면역원성을 추가로 개선시킬 것이라는 것이다.

rBCG 백신 및 백신 벡터가 유래되는 모체로서 작용하기에 적합한 BCG 균주를 선택하기 위해 상기 상세히 나타낸 접근법을 적용하여, 유전자 조작을 상기 균주에 도입시켜 목적하는 rBCG 백신 및 백신 벡터를 생성시킨다. 개별적인 rBCG 균주의 제작에 사용되는 방법들은 본 발명에 중요하지 않으며 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법들 중 어느 하나 또는 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다(Horwitz et al., PNAS 97(25):13853-13858; 2000; Hess et al., Proc Natl Acad Sci USA, 95:5299-5304; 1998).

더욱이, 상기 rBCG 백신은 감염 후 생체 내에서 활성화되는 프로모토를 사용하는 것이 유리하다. 예를 들어, 항원 85B, 항원 85A, Hsp60 또는 Rv1908c(KatG)로부터의 프로모터와 같은 구성적으로 활성인 프로모터를 사용하면 상기 항원을 면역 후 생체 내에서 구성적으로 발현되게 할 수 있다. 따라서, 감염 과정 동안 각 단계의 감염에 대해 확고한 면역 반응을 이끌어낸다. 잠복기 활성 프로모터, 예를 들어 유전자 Rv2032, Rv3127, Rv2031c 또는 Rv3030c 등으로부터의 프로모터를 선택하는 것은 rBCG 백신이 면역 후 생체 내에서 잠복기에 들어갈 때 rBCG가 선택된 항원, 특히 잠복기 특이 항원을 발현할 수 있게 한다.

발현 벡터

비-항생물질 선택 시스템의 개발

상기 나타낸 바와 같이, 현재 rBCG 균주에서 보호 항원의 과발현에 이용되는 플라스미드는, 유지를 위한 항생물질 내성 유전자에 대한 의존성 및 광범위한 배열의 미생물 숙주로 수평 이동하여 항생물질 내성 유전자 및 항원 발현 카세트를 주변 유기체로 전이시킬 위협을 갖는 상기와 같은 플라스미드의 고유 능력으로 인해 허용될 수 없다. 이러한 중요한 한계들을 극복하기 위해서, 본 발명은 rBCG와 같은 마이코박테리움 숙주 균주에서 발현 벡터의 도입 및 유지를 위한 신규의 비 항생물질 선택 시스템 및 일방 셔틀 시스템을 개시한다.

플라스미드의 비 항생물질 선택은 복제에 필수적인 숙주 유전자를 선택적으로 결실시키고 후속적으로 발현 플라스미드에 상기 유전자의 작용성 사본을 통합시켜 상기 결실을 보충함으로써 성취된다. 따라서, 상기 세균성 숙주는 생존을 위해 상기 발현 플라스미드에 의존하여, 항생물질 선택의 부재 하에서 상기 플라스미드를 상기 마이코박테리움 숙주 내부에서 유지시키는 기전을 생성시킨다. 바람직한 방법은 영양요구성 표현형을 생성시키는 유전자의 불활성화를 수반한다. 예를 들어, M. tb 및 BCG에서 leuD 유전자(게놈 Seq ID# Mb3011C)의 불활성화는 류신 의존성 표현형을 생성시키며 불활성화된 leuD 유전자를 갖는 균주들은 생존을 위해 류신 보충에 의존한다(Hondalus et al., Infect Immun. 68(5):2888-98, 2000). 또한, 마이코박테리움 ΔleuD 균주는 생체 내에서 복제할 수 없으며(상기 Hondalus et al. 2000), 따라서 M.tb 및 rBCG ΔleuD 돌연변이체는 시험관 내 및 생체 내에서 leuD⁺ 플라스미드를 유지할 것이다.

영양요구성 돌연변이를 표적 마이코박테리움 균주에 도입시키기 위한 특정 방법은 본 발명에 중요하지 않으며 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 임의의 대립형질 교환 방법 중에서 선택될 수 있다(Parish et al., Microbiology, 145:3497-3503; 1999). 유사하게, 상기 영양요구성 돌연변이의 상보성은 상기 불활성화된 유전자(예를 들어 leuD⁺)의 작용성 사본을 발현 벡터 상에 도입시킴으로써 성취된다. 상기 발현 벡터는 또한 표적 M. tb 및 rBCG 균주에서 복제를 가능하게 하기 위해 마이코박테리움 복제 기원(예를 들어 OriM; Labidi et al., Plasmid, 27(2):130-140; 1992)을 필요로 한다. 상기와 같은 플라스미드를 갖고 있는 마이코박테리움 균주는 배지로부터 류신의 제거 시 생존을 위해 플라스미드-암호화된 leuD 유전자의 발현에 의존할 것이다.

신규의 일방 셔틀 벡터의 개발

상기 과정은 M. tb 및 rBCG에서 발현 벡터의 유지를 위해 선택 시스템을 생성시키기 위한 접근법을 개시한다. 그러나, 상기 벡터 시스템은 마이코박테리움으로의 도입 전에 상기 플라스미드 구조의 효율적인 조작을 가능하게 하기 위해서 에스케리키아 콜라이에서 복제가 가능해야 한다. 더욱 또한, 플라스미드 제작 중에 사용될 수 있는 잠재적인 재조합 이 콜라이 숙주 균주를 확대시켜 연구자들이 플라스미드 제작을 용이하게 하는 이 콜라이 숙주를 사용할 수 있게 하기 위해서, 상기 발현 벡터 중에 항생물질 선택 마커(예를 들어 가나마이신-내성) 및 광범위한 숙주 범위의 복제 기원(예를 들어 OriE; Halpern et al., Proc Natl Acad Sci, USA 76(12):6137-6141; 1979; Mosig et al., New Biol 1(2):171-179; 1989)을 포함시키는 것이 바람직하다. 이러한 요소들을, 상기 플라스미드를 표적 마이코박테리움 균주에 도입시키기 전에 항생물질 내성 마커 및 이 콜라이 복제 기원의 제거를 가능하게 하기 위해 독특한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(예를 들어 NdeI)에 의해 측면에 배치시킨다. 또한, 항원 발현 카세트가 도입될 수도 있는 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위(예를 들어 PacI)를 포함시킨다.

일단 이 콜라이에서 상기가 수행되고 목적하는 플라스미드가 동정 및 특성화되었으면, 재조합 플라스미드 DNA를 단리하고 상기 항생물질 선택 마커 및 OriE를 유리시키는 제한 엔도뉴클레아제로 절단한다. 이어서 상기 절단된 플라스미드 DNA를 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킨다. 따라서 생성되는 플라스미드는, 숙주 마이코박테리움의 영양요구성을 보충하지만 항생물질 내성을 나타내지 않고 그람 음성 세균에서 복제가 가능하지 않은 유전자를 함유한다. 이어서 또한 항원 발현 카세트를 포함할 수도 있는 플라스미드를 표준 일렉트로포레이션 과정을 사용하여 표적 마이코박테리움 영양요구성 돌연변이체에 도입시킨다. 상기 플라스미드를 갖고 있는 재조합 균주를, 생육에 필요한 대사산물(예를 들어 류신)이 결여된 배지에서 배양하여 단리한다. 상기 시스템의 독특한 이점은 최종 발현 플라스미드가 더 이상 상기 항생물질 내성 유전자를 갖지 않는다는 것이다. 따라서, 상기 시스템은 상기 항생물질 내성 유전자를 현재 통상적으로 사용되는 발현 플라스미드와 같은 환경에 퍼뜨릴 수 없다. 또한, 본 발명의 발현 플라스미드는 상기와 같은 복제를 가능하게 가는 유전자 요소가 결실되기 때문에 광범위한 숙주 범위에서 더 이상 복제가 가능하지 않다. 따라서 상기와 같은 벡터를 "일방" 셔틀 벡터라 명명한다.

TB 항원의 과발현

본 발명에서, 상기 일방 셔틀 벡터 중의 발현 카세트에 통합되고 이어서 rBCG에 통합된 유전자는 M.tb 면역원을 암호화할 수 있다. 상기 M.tb 면역원은 예를 들어 완전한 길이의 고유 단백질, 2 개 이상의 M.tb 면역원 또는 유사물간의 키메릭 융합부, 또는 마이코박테리움 튜베르큘로시스로부터 기원하는 M.tb 면역원의 단편 또는 단편들일 수 있다.

M.tb 항원은 생체 내에서 마이코박테리움 감염의 하나 이상의 단계 중에 활성인 프로모터의 조절 하에서 상기 일방 셔틀 벡터에 의해 발현된다. 특정 프로모터가 본 발명에 중요하지는 않지만, 구성적으로 활성인 프로모터들, 예를 들어 항원 85B, Hsp60, 항원 85A, Rv1908c(KatC), 및/또는 유전자 Rv3130C(Florczyk et al., Infect Immun 71(9):5332-5343; 2003; Voskuil et al., J Exr Med 198(5):705-713; 2003), Rv2032, Rv3127 및/또는 Rv2031c의 프로모터와 같은 잠복기 감염 도중 활성인 프로모터로부터 선택될 수 있다. 항원 발현의 수준을 증가시키기 위해서, 마이코박테리움 벡터 균주의 미니세포 생산 유도체를 사용할 수 있다. 마이코박테리움 종의 미니세포 생산 균주는 FtsZ(게놈 데이터베이스 #Mb2174c)의 과발현 또는 whiB3의 부위 지향된 불활성화에 의해 생산한다. 상기 FtsZ 발현 수준의 변경 또는 whiB3의 불활성화를 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 표준 유전자 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, FtsZ 과발현은, 상기 ftsZ 유전자를 강한 프로모터, 예를 들어 항원 85B, 항원 85A, Hsp60 또는 Rv1908c(KatG)(구성적으로 활성이다)에 대한 프로모터, 및/또는 잠복 감염 중에 활성인 프로모터, 예를 들어 유전자 Rv2032, Rv3127, Rv2031c 및 Rv3130C에 대한 프로모터의 존절 하에서 일방 셔틀 벡터에 통합시킴으로써 성취된다(상기 Florczyk et al.; 2003; 상기 Voskuil et al., 2003). whiB3의 부위 지향된 불활성화를 하기 개략되는 과정을 사용하여 대립유전자 교환에 의해 수행한다.

재조합 마이코박테리움에 삽입될 수 있는 외부 항원들의 예

본 발명에서, 마이코박테리움 벡터에 의해 운반되는 일방 셔틀 벡터 중의 발현 카세트는 면역원(이는 바이러스, 세균 또는 기생적인 병원체로부터의 외부 면역원이거나, 내생 면역원, 예를 들어 비 제한적으로 자가면역 항원 또는 종양 항원일 수 있다)을 암호화할 수 있다. 상기 면역원은 예를 들어 완전한 길이의 고유 단백질; 외부 면역원과 내생 단백질 또는 유사물간의 키메릭 융합부; 또는 바이러스, 세균 및 기생적인 병원체로부터 기원하는 면역원의 단편 또는 단편들일 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "외부 면역원"은 수용 동물 세포 또는 조직에서 통상적으로 발현되지 않는 단백질 또는 그의 단편, 예를 들어 비 제한적으로 바이러스 단백질, 세균 단백질, 기생충 단백질, 사이토카인, 케모카인, 면역조절제, 또는 치료제를 의미한다.

"내생적인 면역원"은 수용 동물 세포 또는 조직 중에 천연적으로 존재하는 단백질 또는 그의 일부, 예를 들어 비 제한적으로 내생 세포 단백질, 면역조절제, 또는 치료제를 의미한다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 면역원은 합성 유전자에 의해 암호화될 수 있으며 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 재조합 DNA 방법을 사용하여 제작될 수 있다.

상기 외부 면역원은 그의 동물 숙주 내로 들어가기 전 또는 도중, 또는 그의 콜로니화 또는 복제 전 또는 도중에 임의의 바이러스, 세균 또는 기생적인 병원체에 의해 발현되는 임의의 분자일 수 있다. 상기 rBCG는 바이러스, 세균 및 기생적인 병원체로부터 기원하는 면역원 또는 그의 일부를 발현할 수 있다. 이들 병원체는 인간, 가축 또는 야생 동물 숙주에서 감염성일 수 있다.

바이러스 항원이 유래되는 바이러스 병원체는 예를 들어 비 제한적으로 오쏘믹소바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스(Taxonomy ID: 59771); 레트로바이러스, 예를 들어 RSV, HTLV-1(Taxonomy ID: 39015), 및 HTLV-II(Taxonomy ID: 11909); 헤르페스 바이러스, 예를 들어 EBV Taxonomy ID: 10295); CMV(Taxonomy ID: 10358) 또는 헤르페스 단순 바이러스(ATCC #: VR-1487); 렌티바이러스, 예를 들어 HIV-1(Taxonomy ID: 12721) 및 HIV-2 Taxonomy ID: 11709); 라브도바이러스, 예를 들어 광견병; 피코르노바이러스, 예를 들어 폴리오바이러스(Taxonomy ID: 12080); 폭스바이러스, 예를 들어 우두(Taxonomy ID: 10245); 로타바이러스(Taxonomy ID: 10912); 및 파르보바이러스, 예를 들어 아데노-관련된 바이러스 1(Taxonomy ID: 85106)를 포함한다.

바이러스 항원의 예들을 예를 들어 비 제한적으로 인간 면역결핍 바이러스 항원 Nef(국립 알러지 및 감염성 질병 연구소 HIV Repository Cat. # 183; Genbank 수탁 # AF238278), Gag, Env(국립 알러지 및 감염성 질병 연구소 HIV Repository Cat. # 2433; Genbank 수탁 # U39362), Tat(국립 알러지 및 감염성 질병 연구소 HIV Repository Cat. # 827; Genbank 수탁 # M13137), Tat의 돌연변이 유도체, 예를 들어 Tat-Δ31-45(Agwale et al. Proc. Natl. Acad. Sci. in press. Jul 8th; 2002), Rev(국립 알러지 및 감염성 질병 연구소 HIV Repository Cat. # 2088; Genbank 수탁 # L14572), 및 Pol(국립 알러지 및 감염성 질병 연구소 HIV Repository Cat. # 238; Genbank 수탁 # AJ237568) 및 gp120의 T 및 B 세포 에피토프(Hanke and McMichael, AIDS Immunol Lett., 66:177; 1999; Hanke, et al., Vaccine, 17:589; 1999; Palker et al., J. Immunol., 142:3612-3619; 1989), HIV-1 Env 및 gp120의 키메릭 유도체, 예를 들어 비 제한적으로 gp120과 CD4 사이의 융합부(Fouts et al., J. Virol. 2000, 74:11427-11436; 2000); HIV-1 env의 말단 불활성화 또는 변경된 유도체, 예를 들어 비 제한적으로 gp140(Stamatos et al. J Virol, 72:9656-9667; 1998), 또는 HIV-1 Env 및/또는 gp140의 유도체(Binley, et al. J virol, 76:2606-2616; 2002; Sanders, et al. J Virol, 74:5091-5100; 2000; Binley, et al. J Virol, 74:627-643; 2000), B 형 간염 표면 항원(Genbank 수탁 # AF043578; Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:4726-4730; 1989); 로타바이러스 항원, 예를 들어 VP4(Genbank 수탁 # AJ293721; Mackow et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:518-522; 1990) 및 VP7(GenBank 수탁 # AY003871; Green et al., J. Virol., 62:1819-1823; 1988), 인플루엔자 바이러스 항원, 예를 들어 헤마글루티닌(GenBank 수탁 # AJ404627; Pertmer and Robinson, Virology, 257:406; 1999); 핵단백질(GenBank 수탁 # AJ289872; Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:9654-9658; 2000) 헤르페스 단순 바이러스 항원, 예를 들어 티미딘 키나제(Genbank 수탁 # AB047378; Whitley et al., In: New Generation Vaccines, pages 825-854; 2004)를 포함하는 그룹에서 찾을 수 있다.

상기 세균 항원이 유래되는 세균성 병원체는 예를 들어 비 제한적으로 마이코박테리움 스페시즈, 헬리코박터 파이로리, 살모넬라 스페시즈, 시겔라 스페시즈, 이 콜라이, 리켓차 스페시즈, 리스테리아 스페시즈, 레지오넬라 뉴모니아에, 슈도모나스 스페시즈, 비브리오 스페시즈 및 보렐리아 부르그도르페리를 포함한다.

세균성 병원체의 보호 항원의 예로는 장독소형 이 콜라이의 체세포 항원, 예를 들어 CFA/I 섬모 항원(Yamamoto et al., Infect. Immun. 50:925-928; 1985) 및 열-불안정 독소의 무독성 B-서브유닛(Klipstein et al., Infect. Immun., 40:888-893; 1983); 보르데텔라 페르투시스의 페르탁틴(Roberts et al., Vacc., 10:43-48; 1992), 비 페르투시스의 아데닐레이트 사이클라제-헤모리신(Guiso et al., Micro. Path., 11:423-431; 1991), 클로스티리듐 테타니의 파상풍 독소의 단편 C(Fairweather et al., Infect. Immun., 58:1323-1326; 1990), 보렐리아 부르그도르페리의 OspA(Sikand, et al., Pediatrics, 108:123-128; 2001); Wallich, et al., Infect Immun, 69:2130-2136; 2001), 리켓차 프로와제키 및 리켓챠 타이피의 보호성 파라결정성-표면-층 단백질(Carl, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 87:8237-8241; 1990), 리스테리아 모노사이토제네스의 리스테리오리신(또한 "Llo" 및 "Hly"로서도 알려짐) 및/또는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(또한 "SOD" 및 "p60"으로도 알려짐)(Hess, J., et al., Infect. Immun. 65:1286-92; 1997; Hess, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1458-1463; 1996; Bouwer, et al., J. Exp. Med. 175:1467-71; 1992), 헬리코박터 파이로리의 유레아제(Gomez-Duarte, et al., Vaccine 16, 460-71; 1998; Corthesy-Theulaz, et al., Infection & Immunity 66, 581-6; 1998), 및 바실러스 안트락스의 치명적인 독소 및/또는 보호 항원의 수용체-결합 도메인(Price, et al., Infect. Immun. 69, 4509-4515; 2001)이 있다.

기생적인 항원이 유래되는 기생적인 병원체로는 비 제한적으로 플라스모듐 스페시즈, 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸(ATCC#30145); 트리파노소메 스페시즈, 예를 들어 트리파노소마 크루지(ATCC#50797); 기아르디아 스페시즈, 예를 들어 기아르디아 인테스티날리스 (ATCC#30888D); 부필루스 스페시즈 , 바베시아 스페시즈, 예를 들어 바베시아 미크로티(ATCC#30221); 엔타모에바 스페시즈, 예를 들어 엔타모에바 히스톨리티카(ATCC#30015); 에이메리아 스페시즈, 예를 들어 에이메리아 막시마(ATCC#40357); 레이슈마니아 스페시즈(Taxonomy ID: 38568); 치스토소메 스페시즈 , 브루기아 스페시즈 , 파치다 스페시즈 , 디로필라리아 스페시즈 , 우케레리아 스페시즈, 및 온코세레아 스페시즈가 있다.

기생적인 병원체의 보호 항원의 예로는 플라스모듐 스페시즈의 포자소체 항원(Sadoff et al., Science, 240:336-337; 1988), 예를 들어 피 베르게리의 포자소체 항원 또는 피 팔시파룸의 포자소체 항원; 플라스모듐 스페시즈의 분열소체 표면 항원(Spetzler et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 43:351-358; 1994); 엔타모에바 히스토리티카의 갈락토스 특이적 렉틴(Mann et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3248-3252; 1991), 레이슈마니아 스페시즈의 gp63(Russell et al., J. Immunol., 140:1274-1278; 1988; Xu and Liew, Immunol., 84:173-176; 1995), 레이슈마니아 메이저의 gp46(Handman et al., Vaccine, 18:3011-3017; 2000), 브루기아 말라이의 파라미오신(Li et al., Mol. Biochem. Parasitol., 49:315-323; 1991), 치스토소마 만소니의 트리오스-포스페이트 아이소머라제(Shoemaker et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:1842-1846; 1992); 트리코스트롱길루스 콜루브리포르미스의 분비된 글로빈형 단백질(Frenkel et al., Mol. Biochem. Parasitol., 50:27-36; 1992); 프라시올라 헤파티카의 글루타치온-S-트랜스퍼라제(Hillyer et al., Exp. Parasitol., 75:176-186; 1992), 치스토소마 보비스 및 에스 자포니쿰(Bashir et al., Trop. Geog. Med., 46:255-258; 1994); 및 치스토소마 보비스 및 에스 자포니쿰의 KLH(상기 Bashir et al, 1994)가 있다.

앞서 언급한 바와 같이, rBCG 백신은 내생적인 면역원을 암호화할 수 있으며, 상기 면역원은 임의의 세포 단백질, 면역조절제, 또는 치료제, 또는 그의 일부일 수 있고, 수용 세포, 예를 들어 비 제한적으로 종양, 이식, 및 자가면역 면역원, 또는 종양, 이식 및 그의 자가면역 면역원의 단편 및 유도체에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명에서, rBCG는 종양, 이식물, 또는 자가면역 면역원, 또는 그의 일부 또는 유도체를 암호화할 수 있다. 한편으로, 상기 rBCG는 종양-특이적, 이식물, 또는 자가면역 항원 또는 그의 일부를 암호화하는 합성 유전자(상술한 바와 같음)를 암호화할 수 있다.

종양 특이 항원의 예로는 전립선 특이 항원(Gattuso et al., Human Pathol., 26:123-126; 1995), TAG-72 및 CEA(Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers, 9:53-60; 1994), MAGE-1 및 티로시나제(Coulie et al., J. Immunothera., 14:104-109; 1993)가 있다. 최근에 마우스에서 종양 항원을 발현하는 비 악성 세포에 의한 면역이 백신 효과를 제공하며, 또한 상기 동물이 동일한 항원을 나타내는 악성 종양 세포를 제거하는 면역 반응을 개시하는 것을 돕는 것이 입증되었다(Koeppen et al., Anal. N.Y. Acad. Sci., 690:244-255; 1993).

이식 항원의 예로는 T 세포 상의 CD3 분자가 있다(Alegre et al., Digest. Dis. Sci., 40:58-64; 1995). CD3 수용체에 대한 항체에 의한 치료가 순환하는 T 세포를 빠르게 제거하고 세포-매개된 이식물 거부를 역전시키는 것으로 나타났다(상기 Alegre et al., 1995).

*자가면역 항원의 예로는 IAS β 쇄가 있다(Topham et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8005-8009; 1994). IAS β 쇄로부터의 18 개 아미노산 펩타이드에 의한 마우스의 백신화는 실험적인 자가면역 뇌척수염이 있는 마우스에게 보호와 치료를 제공하는 것으로 나타났다(상기 Topham et al., 1994).

항원보강제를 발현하는 rBCG 의 개발

면역원 및 항원보강제를 암호화하는 rBCG를 제작할 수 있으며, 이를 사용하여 상기 rBCG에 대한 숙주 반응을 증가시킬 수 있다. 한편으로, 항원보강제를 암호화하고, 다른 rBCG와 혼합하여 상대 rBCG에 의해 암호화된 면역원에 대한 숙주 반응을 증가시키는 rBCG를 제작할 수 있다.

상기 rBCG에 의해 암호화된 특정 항원보강제는 본 발명에 중요하지 않으며, 임의의 전통적인 비브리오 콜레라에(예를 들어 브이 콜레라에 균주 395, ATCC #39541) 또는 E1 Tor 브이 콜레라에(예를 들어 브이 콜레라에 균주 2125, ATCC #39050) 균주로부터의 콜레라 독소의 A 서브유닛(즉 CtxA; GenBank 수탁 번호 X00171, AF175708, D30053, D30052), 또는 그의 일부 및/또는 돌연변이 유도체(예를 들어 Ctx의 A 서브유닛의 A1 도메인(즉 CtxA1; GenBank 수탁 번호 K02679)일 수 있다. 한편으로, 세균 아데노신 다이포스페이트-리보실화 외독소(Krueger and Barbier, Clin. Microbiol. Rev., 8:34; 1995) 계열의 구성원인 임의의 세균 독소를 CtxA, 예를 들어 장관독소원성 이 콜라이(GenBank 수탁 # M35581)의 열 불안정성 독소의 A 서브유닛(본 발명에서 EltA로서 지칭됨), 백일해 독소 S1 서브유닛(예를 들어 ptxS1, GenBank 수탁 # AJ007364, AJ007363, AJ006159, AJ006157 등) 대신에 사용할 수 있으며; 추가의 대안으로서 상기 항원보강제는 보르데텔라 페르투시스(ATCC # 8467), 보르데텔라 브론치셉티카(ATCC # 7773) 또는 보르데텔라 파라페르투시스(ATCC # 15237)의 아데닐레이트 사이클라제-헤모리신 중 하나, 예를 들어 비 페르투시스(GenBank 수탁 번호 X14199), 비 파라페르투시스(GenBank 수탁 번호 AJ249835) 또는 비 브론치셉티카(GenBank 수탁 번호 Z37112)의 cyaA 유전자일 수 있다.

면역조절제를 발현하는 rBCG 의 개발

면역원 및 사이토카인을 암호화하고 rBCG에 대한 숙주 반응을 증가시키는데 사용될 수 있는 rBCG를 제작할 수 있다. 한편으로, 상기 사이토카인을 단독으로 암호화하고, 다른 rBCG와 혼합하여 상대 rBCG에 의해 암호화된 면역원에 대한 숙주 반응을 증가시키는 rBCG를 제작할 수 있다.

상기 rBCG에 의해 암호화된 특정 사이토카인은 본 발명에 중요하지 않으며, 비 제한적으로 인터류킨-4(본 발명에서 "IL-4"로서 지칭된다; GenBank 수탁 번호 AF352783(쥐 IL-4) 또는 NM_000589(인간 IL-4)), IL-5(GenBank 수탁 번호 NM_010558(쥐 IL-5) 또는 NM_000879(인간 IL-5)), IL-6(GenBank 수탁 번호 M20572(쥐 IL-6) 또는 M29150(인간 IL-6)), IL-10(GenBank 수탁 번호 NM_010548(쥐 IL-10) 또는 AF418271(인간 IL-10)), Il-12_p40(GenBank 수탁 번호 NM_008352(쥐 IL-12 p40) 또는 AY008847(인간 IL-12 p40)), IL-12_p70(GenBank 수탁 번호 NM_008351/NM_008352(쥐 IL-12 p35/40) 또는 AF093065/AY008847(인간 IL-12 p35/40)), TGFβ(GenBank 수탁 번호 NM_011577(쥐 TGFβ1) 또는 M60316(인간 TGFβ1)) 및 TNFα GenBank 수탁 번호 X02611(쥐 TNFα) 또는 M26331(인간 TNFα)을 포함할 수 있다.

세포사멸은 프로그램화된 세포사이며, 그의 유도 및 결과 면에서 괴사성 세포사와 극적으로 상이하다. 외부 항원을 함유하는 세포의 세포사멸은 상기와 같은 항원에 대한 세포 면역성의 공지된 강력한 자극이다. 항원 함유 세포의 세포사멸이 세포 면역에 이르게 하는 과정은 때때로 교차 프라이밍(cross-priming)이라 지칭되었다(Heath, W.R., G.T. Belz, G.M. Behrens, C.M. Smith, S.P. Forehan, I.A., Parish, G.M. Davey, N.S. Wilson, F.R. Carbone, and J.A. Villandangos. 2004. 교차 발현, 수지상 세포 서브세트, 및 세포 항원에 대한 면역성의 발생. Immunol Rev 199:9; Gallucci, S., M. Lolkema, and P. Matzinger. 1999. 천연 항원보강제: 수지상 세포의 내생적인 활성화제. Nature Biotechnology. 5:1249; Albert, M.L., B. Sauter, and N. Bhadrdwaj. 1998. 수지상 세포는 세포사멸성 세포로부터 항원을 획득하고 I 부류-제한된 CTL을 유도한다. Nature 392:86). 증가된 항원 특이 세포 매개된 면역성에 이르게 되는 세포사멸의 유도에 대해 여러 가지 기전들이 존재한다. 카스파제 8 매개된 세포사멸은 항원 특이적인 세포 면역 보호를 유도한다. BCG 및 rBCG에 의해 과 발현된 다른 결핵 항원뿐만 아니라 BCG 자체의 항원들에 대한, rBCG에 의한 카스파제 8의 생산 및 상기 rBCG에 의해 발현된 외부 항원과 관련하여 rBCG에 의한 진핵 세포 세포질 중에의 분비는 높은 수준의 항원 특이성 세포 면역성을 유도할 것이다. 죽은 수용체-5(DR-5)(또한 TRAIL-R2(TRAIL 수용체 2) 또는 TNFR-SF-10B(종양 괴사 인자-상과 구성원 10B)로서 공지됨)는 또한 카스파제 8 매개된 세포사멸을 매개한다(Sheridan, J.P., S.A. Marsters, R.M. Pitti, A. Gruney, M. Skutbatch, D. Baldwin, L. Ramakrishnan, C.L. Gray, K. Baker, W.I. Wood, A.D. Goddard, P. Godowski, and A. Ashkenazi. 1997. 신호전달 계열 및 미끼 수용체에 의한 흔적 유도된 세포사멸의 조절. Science 277:818). 레오바이러스 유도된 세포사멸은 TRAIL-DR5에 의해 매개되어 상기 바이러스의 후속적인 제거의 원인이 된다(Clarke, P., S.M. Meintzer, S. Gibson, C. Widmann, T.P. Garrington, G.L. Johnson, and K.L. Tyler. 2000. 레오바이러스 유도된 세포사멸은 TRAIL에 의해 매개된다. J. Virol 74:8135). 재조합 BCG에 의한 DR-5의 발현은 rBCG 발현된 항원에 대한 항원 특이적 세포 면역성의 유도에 효능있는 항원보강 효과를 제공할 것이다. 항원 발현 세포를 또한 항원 특이적 세포 면역 반응의 유도에 강한 자극인 Fas 연결을 통해 세포사멸을 겪도록 유도할 수 있다(Chattergoon, M.A., J.J. Kim, J.S. Yang, T.M. Robbinson, D.J. Lee, T. Dentchev, D.M. Wilson, V. Ayyavoo, and D.B. Weiner. 2000. 가공된 Fas-매개된 세포사멸에 의한 수지상 세포를 포함하는 항원 제공 세포로의 표적 항원 전달. Nat Biotechnology 18:974).

Fas 또는 Fas 세포질 도메인/CD4 외부도메인 융합 단백질을 발현하는 재조합 BCG는 세포사멸 및 항원 특이적 세포 면역 반응을 유도할 것이다.

상술한 바와 같이 세포사멸의 증강인자를 생산하는 rBCG에 의한 세포 면역성의 향상은 BCG 항원, 또는 rBCG에 의한 과발현을 특이적으로 암호화하는 항원으로 제한되는 것이 아니라, 상기 언급한 rBCG가 침입할 수 있는 진핵 세포 중의 임의의 항원을 포함한다. 일례로서, 상기와 같은 rBCG를 세포사멸이 유도되는 종양 세포로 전달하는 경우, 중요한 종양 항원에 대한 세포 면역성은 상기 종양 및/또는 전이의 제거, 감소 또는 예방과 함께 유도될 것이다. 이러한 항종양 효과는 방광암의 경우와 같이 국소적으로 주어지는 경우 BCG가 발생시키는 일반적인 항종양 효과에 더하여 존재할 것이다.

본 발명의 추가의 실시태양에서, 세포사멸의 특이적인 매개체의 생산에 의해 향상되고, 종양 또는 다른 세포 내부로 전달되는 rBCG(여기에서 상기와 같은 rBCG는 또한 강한 세포 면역 반응이 적재되는 외부 항원을 생산한다)는 상기 외부 항원을 함유하는 세포들에 대한 강한 세포 반응의 생성을 유도할 것이다. 이러한 세포 반응은 면역 매개된 종양 세포 파괴, 추가의 교차 프라이밍 및 종양 또는 다른 중요한 항원들에 대한 세포 면역성의 유도의 원인이 될 것이며, 후속적으로 상기 종양 및/또는 전이를 제거, 감소 또는 예방하게 될 것이다. 상기와 같은 외부 항원의 예는 강한 이종 세포 반응이 적재되는 숙주 세포 HLA와 상이한 HLA 항원이다.

세포사멸 유도 성질이, 특이적인 종양 항원을 또한 발현하는 세포사멸의 특이적인 매개체의 발현에 의해 향상되는 rBCG는 상기 rBCG를 종양 자체 내로 직접 전달할 필요 없이 상기 종양 및/또는 전이의 제거, 감소 또는 예방을 유도하는 상기 항원에 대한 일부 허용성의 파괴를 포함한, 상기 종양 항원에 대한 강한 항원 특이적 세포 반응을 유도할 것이다.

DNA 손상에 이은 세포사멸 또는 카스파제 9는 몇몇 항원들에 대한 허용성을 유도한다(Hugues, S., E. Mougneau, W. Ferlin, D. Jeske, P. Hofman, D. Homann, L. Beaudoin, D. Schrike, M. Von Herrath, A. Lehuen, and N. Glaichenenhaus. 2002). 췌장 베타 세포의 제한된 세포사멸에 의해 유도된 섬 항원에 대한 허용성 및 당뇨병으로부터의 예방. Immunity 16:169). 허용성의 유도는 자가면역 질병, 예를 들어 비 제한적으로 당뇨병, 류마티스성 관절염, 크론병, 염증성 장 질환 및 다발성 경화증의 억제 또는 예방에 중요하다. 카스파제 9, 또는 세포, 예를 들어 비 제한적으로 B 췌장 세포, 결장직장 및 신경 세포에서 rBCG에 의한 다른 세포사멸 매개된 허용성 유도 단백질의 생산은 상기 세포들에서 자가면역성의 항원 표적에 대한 허용성을 유도하여 상기 자가면역 질병 상태를 치료 또는 예방하는 제한된 세포사멸을 생성시킬 것이다. 자가면역 반응에 관련된 특이 항원의 동정은 상기 항원과 카스파제 9 또는 세포사멸 매개된 허용성을 유도할 수 있는 다른 분자 모두의 rBCG 생산을 통해 이들 자가면역 표적 항원에 대한 허용성의 유도를 허용할 것이다. 상기와 같은 rBCG는 이들 자가면역 질병을 치료 및/또는 예방할 것이다.

진핵 세포 또는 조직에서 면역조절제를 발현할 수 있는 rBCG를 생성시키기 위한 작용성 발현 카세트의 도입을 위한 재조합 DNA 및 RNA 과정을 하기에 개시한다.

하기의 실시예들은 본 발명의 다양한 태양들의 예시로서 간주되며 본 발명의 실시를 제한하고자 하는 것이 아니다. 당해 분야의 통상적인 숙련가들은 또 다른 물질, 조건 및 과정들을 변화시킬 수 있고 이들이 명세서에서 교시하는 바와 같은 본 발명의 일반적인 범위로부터 이탈됨 없이 통상적인 숙련가의 기술 내에 있음을 알 것이다.

도 1은 자살 벡터 pAF103에 대한 지도이다. 상기 DNA 단편들 각각에 대한 표시는 하기와 같다: L-측면 및 R-측면: 각각 leuD 유전자의 좌측 및 우측 측면부; aph는 플라스미드에 가나마이신 내성을 부여하는 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 유전자(유전자 은행 수탁 번호: X06402)이다; OriE는 pUC 복제 기원이다(유전자 은행 수탁 번호 AY234331); Ble는 플라스미드에 제오신 내성을 부여하는 유전자이다(Genbank 수탁 번호 L36850); SacB는 세균에 슈크로스에 대한 민감성을 부여하는, 레반슈크라제를 암호화하는 유전자(Genbank 수탁 번호: Y489048)이다; P_bsp60는 열 충격 단백질 유전자(즉 Rv0440)의 프로모터 서열이다; MCS는 지시된 제한 효소에 대한 다중 클로닝 부위이다. 2 개의 PacI 부위 사이의 카세트를, 적용 가능한 경우, 다른 엔도솜분해성 효소 유전자로 대체할 수 있음에 주목한다.

도 2는 현재 상이한 백신 균주들의 시험감염 후 폐 CFU 양에 의해 측정된 보호 수준이다.

도 3은 발현 벡터를 재조합 마이코박테리움, 즉 rBCG에 도입시키기 위한 비 항생물질 발현 벡터의 도식적 표현이다. rBCG에서 발현되는 유전자를 pacI 부위를 통해 상기 플라스미드에 클로닝한다. rBCG로의 일렉트로포레이션 전에, 상기 플라스미드를 지시된 제한 효소로 절단하여 oriE 및 Kan 부위를 제거하여, 일방 셔틀 발현 벡터를 생성시킨다. 상기 DNA 단편들 각각에 대한 표시는 하기와 같다: P_Rv3130는 항원 Rv3130c의 프로모터 서열이고; P_Ag85B는 항원 85B의 프로모터 서열(즉 Rv1886c)이고; 항원 Y는 마이코박테리움 항원 TB10.4(즉 Rv0288)이고; Ag85B는 항원 85B를 암호화하는 DNA 서열(즉 Rv1886c)이고; Ag85A는 항원 85A를 암호화하는 유전자(즉 Rv3804c)이고; aph는 플라스미드에 가나마이신 내성을 부여하는 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제 유전자(유전자 은행 수탁 번호: X06402)이고; OriE는 pUC 복제 기원이고(유전자 은행 수탁 번호 AY234331); LeuD는 3-아이소프로필말레이트 데하이드라타제를 암호화하는 유전자(즉 Rv2987c)이고; oriM은 마이코박테리움 중의 복제기원이다(Genbank 수탁 번호: M23557).

도 4는 대립유전자 교환의 주요 단계들에 대한 흐름도이다.

도 5는 발현 플라스미드의 존재에 대한 선택된 콜로니들의 PCR 분석이다. PCR을 물질 및 방법에 개시된 바와 같이 수행하였다. PCR 산물들을 1.0% 아가로스 젤 중에서 젤 전기영동에 의해 분석하였다. 레인 1: DNA 사다리(Invitrogen)를 1Kb + DNA 표준으로서 사용하였다. 레인 2: PCR 주형 음성 대조군; 레인 3: BCG 균주 대니쉬 1331에 대한 PCR; 레인 4 내지 7: 각각 59, 61, 69 및 84 번 콜로니들에 대한 PCR; 레인 8: 블랭크 적재 웰; 레인 9: 원래의 플라스미드에 대한 PCR.

방법

마이코박테리움 균주의 배양

선택된 BCG 균주를 액체 배지, 예를 들어 미들브룩(Middlebrook) 7H9 또는 술튼(Saulton) 합성 배지에서, 바람직하게는 37 ℃에서 배양한다. 상기 균주를 정적 또는 교반된 배양물로서 유지시킬 수 있다. 또한 BCG의 생육 속도를 올레산(0.06% v/v; Research Diagnostics Cat. No. 01257) 및 타일록사폴(Tyloxapol)(0.05% v/v; Research Diagnostics Cat. No. 70400)과 같은 세제의 첨가에 의해 향상시킬 수 있다. 상기 BCG 배양물의 순도를, 포스페이트 완충 염수(본 발명에서 PBS라 칭함) 중에서 일련으로 희석된(예를 들어 순수에서 10^-8까지 10 배 단계로) 100 mcl 분액의 BCG 배양물을 25 내지 30 ㎖의 고체 배지, 예를 들어 미들브룩 7H10을 함유하는 3.5 in 플레이트 상에 고르게 펴발라 평가할 수 있다. 또한, 상기 배양물의 순도를 상업적으로 입수할 수 있는 키트, 예를 들어 싸이글리콜레이트 배지(Science Lab, Cat. #1891) 및 대두-카제인 배지(BD, Cat. #211768)를 사용하여 추가로 평가할 수 있다.

BCG 시드 롯트를 -80 ℃에서 0.1 내지 2 x 10⁷ cfu/㎖의 밀도로 보관한다. 상기 액체 배양물을 멸균 대조군에 비해 0.2 내지 4.0의 광학 밀도(600 ㎚에서)에서 전형적으로 수확한다, 즉 상기 배양물을 적합한 크기의 원심분리 튜브에 넣고 상기 유기체에 5 내지 10 분간 8,000 x g에서 원심분리를 가한다. 상등액은 버리고 유기체를 0.1 내지 2 x 10⁷ cfu/㎖의 밀도로, 10 내지 30%(v/v)의 글리세롤을 함유하는 미들브룩 7H9를 포함하는 저장 용액에 재현탁시킨다. 상기 현탁액을 1 ㎖ 분액으로, 멸균 1.5 ㎖ 붕소 실리케이트 냉동기 바이알에 분배하고 이어서 -80 ℃에 둔다.

일반적인 분자 생물학 기법

제한 엔도뉴클레아제(본 발명에서 "RE"); New England Biolabs Beverly, MA), T4 DNA 리가제(New England Biolabs, Beverly, MA) 및 Taq 폴리머라제(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하며; 플라스미 드 DNA를 제조사의 프로토콜(Qiagen, Santa Clarita, CA)에 따라 소규모(Qiagen Miniprep^R kit, Santa Clarita, CA) 또는 대규모(Qiagen Maxiprep^R kit, Santa Clarita, CA) 플라스미드 DNA 정제 키트를 사용하여 제조하고; 뉴클레아제가 없는, 분자 생물학 등급의 밀리-Q 수, 트리스-HCl(pH 7.5), EDTA pH 8.0, 1M MgCl₂, 100%(v/v) 에탄올, 초순수 아가로스, 및 아가로스 젤 전기영동 완충제를 라이프 테크놀로지스(Life Technologies, Gaithersburg, MD)로부터 구입한다. RE 절단, PCR, DNA 연결 반응 및 아가로스 젤 전기영동을 널리 공지된 과정에 따라 수행한다(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1,2,3; 1989); Straus, et al., Proc Natl Acad Sci USA. Mar; 87(5) 1889-93; 1990). 하기 섹션들에 개시된 각각의 재조합 플라스미드의 DNA 서열을 확인하기 위한 뉴클레오타이드 서열화를 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 자동화된 서열화기, 모델 373A를 사용하여 통상적인 자동화된 DNA 서열화 기법에 의해 수행하였다.

PCR 프라이머를 상업적인 판매처, 예를 들어 시그마(Sigma)(St. Louis, MO)로부터 구입하고 어플라이드 바이오시스템스 DNA 합성기(모델 373A)를 사용하여 합성한다. PCR 프라이머를 150 내지 250 μM의 농도로 사용하고 상기 PCR 반응에 대한 어닐링 온도를 클론 매니저 소프트웨어 버전 4.1(Scientific and Educational Software Inc., Durham NC)을 사용하여 측정한다. PCR을 스트레이트진 로보사이클러(Strategene Robocycler), 모델 400880(Strategene, La Jolla, CA)에서 수행한다. 증폭을 위한 PCR 프라이머를 클론 매니저(등록상표) 소프트웨어 버전 4.1(Scientific and Educational Software Inc., Durham NC)을 사용하여 디자인한다. 상기 소프트웨어는 조작되는 특정 DNA 단편에 적합한 PCR 프라이머를 디자인하고 RE 부위를 식별할 수 있게 한다. PCR을 써모사이클러(thermocycler) 장치, 예를 들어 스트레이트진 로보사이클러, 모델 400880(Strategene)에서 수행하며, 상기 PCR에서 프라이머 어닐링, 연장 및 변성 회수를 표준 과정(상기 Straus et al., 1990)에 따라 정한다. 상기 RE 절단 및 PCR을 후속적으로 표준 과정(상기 Straus et al., 1990; 및 상기 Sambrook et al., 1989)을 사용하여 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석한다. 양성 클론을 적합한 RE 패턴 및/또는 PCR 패턴을 나타내는 것으로서 정의한다. 상기 과정을 통해 동정된 플라스미드를 상술한 바와 같이, 표준 DNA 서열화 과정을 사용하여 추가로 평가할 수 있다.

에스케리키아 콜라이 균주, 예를 들어 DH5α 및 Sable2^R를 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(Gaithersburg, MD)로부터 구입하며 이는 하기 실시예들에 개시되는 재조합 플라스미드의 초기 숙주로서 작용한다. 재조합 플라스미드를 개시된 바와 같이(상기 Straus et al., 1990), 100 내지 200 Ω, 15 내지 25 μF 및 1.0 내지 2.5 kV로 고정된 고 전압 전기펄스 장치, 예를 들어 진 펄서(Gene Pulser)(BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 이 콜라이 균주 내로 도입한다. 최적의 일렉트로포레이션 조건을 최대 형질전환 속도/DNA mcg/세균을 생성시키는 설정들을 측정함으로써 확인한다.

세균 균주를 트립신 대두 아가(Difco, Detroit, MI) 상에서 또는 트립신 대 두 브로쓰(Difco, Detroit, MI)에서, 제조사의 지시에 따라 증식시킨다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 세균들을 서서히 교반하면서 5% CO₂(v/v) 중에서 37 ℃에서 증식시킨다. 적합한 경우, 상기 배지에 항생제(Sigma, St. Louis, MO)를 보충한다. 세균성 균주를 -80 ℃에서 약 10⁹ 콜로니-형성 단위(본 발명에서 "cfu"라 칭한다)/㎖로, 30%(v/v) 글리세롤(Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 (Difco)에 현탁하여 보관한다.

BCG 에서 대립유전자 교환

종래 기술은 변경된 대립유전자를 마이코박테리움 균주 내로 도입하는 방법을 교시하며 당해 분야의 숙련가들은 상기와 같은 방법을 해석하고 실행할 수 있을 것이다(Parish et al., Microbiology 146:1969-1975; 2000). 대립유전자 교환 플라스미드를 생성시키는 신규의 방법은 합성 DNA의 사용을 수반한다. 상기 접근법의 이점은 상기 플라스미드 산물이 매우 한정된 이력을 가질 것이며 환경 규제에 순응할 것인 반면, 앞서 사용된 방법들은, 유효하다 하더라도, 불충분하게 기록된 실험 배양물 기록을 가지며 따라서 순응되지 않을 듯하다는 것이다. 상기 규제에 대한 순응성은 제품이 미국 및 유럽 규제 당국에 의해 인간에 대한 사용이 허가되어야 하는 경우 필수적이다.

마이코박테리움에서 대립유전자 교환을 위한 자살 벡터는 이 콜라이 균주에서 복제하는 능력을 갖지만 마이코박테리움 스페시즈, 예를 들어 M. tb 및 BCG에서는 복제할 수 없는 플라스미드이다. 본 발명에서 대립유전자 교환 과정에 사용하 는데 특정한 자살 벡터는 중요하지 않으며 학회(상기 Parish et al., 2000) 및 상업적인 출처로부터 입수할 수 있는 것들 중에서 선택될 수 있다. 대립유전자 교환용 자살 플라스미드의 바람직한 디자인을 도 1에 나타낸다. 상기 플라스미드는 하기의 DNA 단편들을 포함한다; 상기 플라스미드가 이 콜라이에서 복제하기 위한 oriE 서열(GenBank 수탁 # L09137), 이 콜라이 및 마이코박테리움 모두에서 선택을 위한 가나마이신-내성 서열(GenBank 수탁 # AAM97345), 및 추가적인 항생물질 선택 마커(예를 들어 제오신-내성 유전자(GenBank 수탁 # AAU06610), 상기는 마이코박테리움 프로모터(예를 들어, hsp60 프로모터)의 조절 하에 있을 것이다). 상기 제 2 항생물질 선택 마커는 필수적이지는 않지만, 상기 대립유전자 교환 과정 동안 자발적인 가나마이신-내성 단리물의 성장을 방지하기 위해 이중선택이 가능하도록 포함되어야 한다(Garbe et al., Microbiology 140:133-138; 1994).

상기와 같은 자살 벡터의 제작을 본 발명에 개시된 바와 같이 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 수행할 수 있다. 그러나, 현행 규제 기준은 BSE-감염된 물질을 함유하는 생성물 노출된 소 생성물로부터 획득되는 프리온 입자의 도입 문제를 제기하였다. 따라서 물질들(예를 들어 DNA 서열)이 미지 기원의 표적 균주 내로 도입되는 것을 피하기 위해서, 상기 자살 벡터 중의 모든 DNA를 상업적인 출처(예를 들어 Picoscript, Inc.)에 의해 합성적으로 제조하는 것이 바람직하다. 따라서, 자살 벡터를 제작하기에 바람직한 방법은 DNA 소프트웨어(예를 들어 Clone Manager)를 사용하여 상기 DNA 서열들의 플랜을 모으고, 이어서 상기 DNA를 상기와 같은 서비스를 제공하는 임의의 상업적인 공급처(예를 들어 Picoscript Inc.)에 의 해 행위별 수가제(fee-for-service basis)로 합성하는 것이다. 상기 방법을 사용하여 자살 벡터, pAF100(도시 안됨)을 제조하고, 이어서 이를 본 발명의 특정한 용도를 위해 추가로 조작하였다(pAF103, 도 1에 도식적으로 묘사되고 표 1에 추가로 개시되었다).

자살 벡터
명칭	주쇄	대립유전자 교환을 위한 특정 대립유전자
pAF103	pAF100	leuD 유전자의 1kb 측면 부위

상기와 같은 자살 벡터는 이점들, 예를 들어 2 개의 항생물질 선택 마커를 함유하고, 따라서 하나의 항생물질에 대해 내성(세대 당 약 1/10⁸으로 발생한다)을 나타내는 자발적인 돌연변이체의 선택을 최소화하는 이점을 갖는다. 2 개의 항생물질에 대한 자발적인 내성은 대단히 드물며 세대 당 단지 약 1/10¹⁶으로 발생한다. 따라서, 상기 대립유전자 교환 과정을 실행하는데 사용되는 배양물에서 나타나는 이중 내성 균주의 확률은 1/10⁶ 미만이다.

대립유전자 교환 과정 중 음성 선택의 경우, 슈크로스-민감성 표현형을 부여하는 sacB 유전자(Genome Seq ID # NT01BS4354)를, 배양물에 최종 DNA 재조합 단계 및 완성된 대립유전자 교환을 겪은 균주를 농축시키기 위해 포함시킨다.

제형화 및 백신화 전략

백신 제형화를 위한 전략을 제작 과정 전체를 통한 최대의 생육성 및 안정성을 측정하기 위한 연구 상에 구축한다. 이는 마이코박테리움의 배양이 글리세롤, 당, 아미노산, 및 세제 또는 염의 첨가를 포함하도록 하기 위해 통상적으로 사용되는 다양한 배지를 사용하는 배양 과정 동안 최대 유기체의 생육성(생 대 사)을 측정함을 포함한다. 배양 후에 세포를 원심분리 또는 접선 유동 여과에 의해 수확하고 이를 동결 또는 동결 건조 과정 동안 세포의 보호를 허용하는 안정화 배지에 재현탁한다. 통상적으로 사용되는 안정화제는 나트륨 글루타메이트, 또는 아미노산 또는 아미노산 유도체, 글리세롤, 당 또는 통상적으로 사용되는 염을 포함한다. 최종 제형화는 유지하기에 충분한 안정성 및 분배 및 사용에 적합한 저장 수명으로 피 내, 피부 주사, 관류 또는 경구 전달에 의해 전달되기에 충분히 생육성인 유기체를 제공할 것이다.

TB 백신의 임상전 평가

일반적인 안정성 시험

6 개 그룹의 BALB/c 마우스를 2 x 10⁶ CFU의 관심 rBCG 균주 및 유사한 모 균주로 복강 내 감염시킨다. 상기 동물들을 감염 후 14일 동안 일반적인 건강 및 체중에 대해 모니터한다. 상기 BCG 및 rBCG 균주를 수용한 동물들은 관찰 기간 동안 건강한 채로 유지되며, 체중 손실이나 명백한 질병 증상을 나타내지 않는다.

면역능력 마우스에서 신규의 rBCG 균주의 독성

15 마리의 면역능력 BALB/c 마우스 그룹을 각각 2 x 10⁶ rBCG 및 BCG 모 균주로 정맥 내 감염시킨다. 감염 후 제 1 일에, 각 그룹 중 3 마리의 마우스를 죽이고 비장, 폐 및 간 중의 CFU를 분석하여 각각의 동물이 동등한 감염 용량을 확실히 갖게 한다. 감염 후 4, 8, 12 및 16 주째에, 각 그룹 중 3 마리의 마우스를 죽이고 비장, 간 및 폐 중의 CFU를 획득하여 모 BCG 균주에 비해 상기 rBCG 균주의 생체 내 생육을 평가한다. rBCG 균주는 상기 모 BCG의 경우와 유사한 독성을 나타낼 것으로 예상된다.

면역타협된 마우스에서 엄격한 안전성 시험

10 개 그룹 중의 SCID(중증 복합 면역결핍)를 갖는 면역타협된 마우스를 각각 2 x 10⁶ cfu rBCG 및 모 BCG 균주로 정맥 내 감염시킨다. 감염 후 제 1 일에, 각 그룹 중의 3 마리 마우스를 죽이고 비장, 간 및 폐 중의 cfu를 평가하여 상기 접종 용량을 확인한다. 각 그룹 중의 나머지 7 마리 마우스를 일반적인 건강 및 체중에 대해 모니터한다. 이들 마우스의 생존을 추적하고 rBCG-감염된 마우스의 생존이 전체 관찰 기간 중의 모 균주 감염된 동물보다 더 악화되지 않으면 결과는 성공적이다.

기니 피그 안전성 시험

rBCG 균주의 안전성을 또한 모 BCG 백신(이는 인간에서 잘 확립된 안전성 프로파일을 갖는다)과 비교하여 기니 피그 모델에서 평가한다. 먼저, 상기 동물들의 체중 증가를 포함하여, 일반적인 건강 상태에 대한 상기 백신의 효과를 조사한다. 기니 피그를 10⁷(100x의 백신화 용량) cfu의 재조합 및 모 균주로 근육 내 면역시키고 상기 동물들을 6주간 일반적인 건강 및 체중에 대해 모니터한다. 상기 6 주의 기간 전에 죽은 동물들에 대해 사후 검사를 수행한다. 모든 동물들을 상기 감염 후 6 주의 끝에서 죽이고 전체 병리학(gross pathology)을 수행한다. 체중 손실은 없으며, 이상 행동도 없고 모든 기관은 6 주째 부검 시 정상으로 보인다. 성공적인 시험은 건강상 부작용이 rBCG-Pfo 백신에 대해 관찰되지 않고 동물들이 상기 모 균주 접종된 동물에 비해 정상적인 속도로 체중이 증가되는 때를 가리킨다.

동시에, 동물 기관의 세균 수준을 모니터한다. 상기 모 백신 또는 재조합 백신으로 면역시킨 기니 피그를, 접종 후 다양한 간격으로 안락사시키고, 그 후에 폐, 비장 및 국부(서혜부) 림프절을 BCG 또는 rBCG의 cfu에 대해 분석한다.

독성 시험:

상기 rBCG 균주의 독성을 평가하기 위해서, 각 그룹 중의 12 마리의 기니 피그를 각각 1 회 용량, 상기 단일 용량보다 4 배 더 높은 용량, 또는 상기 단일 용량보다 4 배 더 낮은 용량의 인간용 rBCG 균주, BCG 모 균주 또는 염수로 피 내 백신화한다. 백신화 후 3일째에, 6 마리의 동물을 죽여 상기 동물들에 대한 상기 백신의 급성 효과를 평가한다. 백신화 후 28일째에, 나머지 6 마리 동물을 죽여 상기 동물들에 대한 만성적인 효과를 평가한다. 상기 두 시점 모두에서, 각 동물의 체중을 획득하고, 전체 병리학 및 주사 부위의 외관을 검사한다. 혈액 화학을 위해 채혈하고, 내부 기관 및 주사 부위의 조직병리학을 수행한다.

보호를 측정하기 위한 연구:

쥐 보호 연구

13 개 그룹 중의 C57Bl/6 마우스(암컷, 5 내지 6 주 된 것)를 10⁶ CFU의 rBCG, 모 BCG 또는 염수로 피하 면역시킬 것이다. 또 다른 그룹의 마우스를 건강한 대조군으로서 사용한다. 면역화 후 8주째에, 마우스를 앞서 개시한 바와 같이, 각 동물의 폐에 100 개의 생 세균을 전달하는 용량인, 총 10⁷ CFU의 시험감염 균주를 함유하는 10 ㎖ 단일 세포 현탁액으로부터 생성되는 에어로졸에 의해 M. tb 엘드만(Erdman) 균주(또는 H37Rv Kan-내성 균주)로 시험감염시킨다. 상기 실험 동물들을 시험감염시키지 않은 동물들과 함께 생존에 대해 모니터한다. 상기 시험감염에 이어서, 상기 동물들을 또한 체중 손실 및 일반적인 건강에 대해 모니터한다. 시험감염 후 제 1 일째에, 각 그룹 중의 3 마리의 마우스를, 폐 cuf가 시험감염 용량인지를 확인하기 위해 죽이고, 한 마리는 비장 및 폐 조직병리학을 위해 죽인다. 이어서 시험감염 후 5주째에, 각 그룹 중 9 마리의 동물을 죽이고, 상기 동물의 조직병리학 및 미생물학 분석을 수행한다. 6 마리 마우스로부터의 폐 및 비장 조직을 cfu 수에 대해 평가한다(선택 보충물이 있는 플레이트를 사용하여 상기 백신 균주를 상기 시험감염 균주와 구분한다). H37Rv-kan 내성 균주로 시험감염시키는 경우, Kan 또는 TCH를 사용하여 상기 시험감염 균주를 상기 백신 균주와 구분한다. 상기 M. tb 엘드만 균주를 시험감염에 사용하는 경우, TCH를 사용하여 상기 백신 균주를 상기 시험감염 균주와 구분한다(BCG는 민감하지만, M.tb는 천연적으로 내성이다).

피부 지연된 유형의 과민성( DTH )의 유도

특이 병원체가 없는(SPF) 기니 피그를 10³ rBCG 또는 BCG 모 균주로 피 내 면역시킬 것이다. 면역화 후 9주째에, 상기 동물들의 등털을 밀고 포스페이트 완충 염수 100 ㎕ 중의 10 ㎍의 PPD를 피 내 주사하였다. 24 시간 후에, 단단한 경화부위의 직경을 측정한다. rBCG 균주는 DHT를 모 BCG 균주에 의해 유도된 것 이상으로 유도할 것이다.

기니 피그 시험감염 연구

M. tb 시험감염에 대한 상기 rBCG 백신의 효능을 측정하기 위해서, 12 개 그룹 중의 기니 피그(젊은 성체 SPF Hartley, 250 - 300 g, 수컷)를, 각각 rBCG, 모 BCG 균주 또는 염수로 면역화시킨다. 상기 백신 및 대조군을 10⁶ cfu로 피 내 투여한다. 면역화 후 10 주째에, 상기 rBCG-, BCG- 및 거짓-면역화시킨 동물들을 총 10⁷ CFU의 M. tb를 함유하는 10 ㎖ 단일 세포 현탁액으로부터 생성되는 에어로졸에 의해 상기 M. tb로 시험감염시킬 것이며; 이러한 과정은 ∼100 개의 생 세균을 앞서 개시된 바와 같이(Brodin et al., J Infect Dis. 190(1), 2004) 각 동물의 폐로 전달한다. 상기 시험감염에 이어서, 상기 동물들을 백신화되지 않은, 시험감염시키지 않은 건강한 동물 그룹과 함께 생존에 대해 모니터한다. 상기 시험감염에 이어서, 상기 동물들을 또한 체중 손실 및 일반적인 건강에 대해 모니터한다. 각 그룹 중의 6 마리 동물을 시험감염 후 10 주째에 죽이고, 각 그룹 중 나머지 6 마리를 시험감염 후 70 주째에 장기적인 평가를 위해 죽인다. 상기 두 시점 모두에서, 상기 동물의 조직병리학 및 미생물학 분석을 수행한다. 폐 및 비장 조직을 조직병리학 및 cfu 수에 대해 평가한다(선택 보충물이 있는 플레이트를 사용하여 상기 백신 균주를 상기 시험감염 균주와 구분한다). H37Rv-kan 내성 균주로 시험감염시키는 경우, Kan 또는 TCH를 사용하여 상기 시험감염 균주를 상기 백신 균주와 구분한다. 상기 M. tb 엘드만 균주를 시험감염에 사용하는 경우, TCH(BCG는 민감하지만, M.tb는 천연적으로 내성이다)를 사용하여 백신 균주를 상기 시험감염 균주와 구분한다. 성공은 거짓 면역화시킨 동물들이 시험감염 후 가장 빠르게 죽은 반면, 상기 rBCG-면역화시킨 동물들은 상기 BCG 모 균주 면역화시킨 동물보다 더 오래 생존하는 경우를 가리킨다.

영장류 안전성 및 시험감염 연구:

추적 BCG 1차 접종 프로토콜은, 동물들을 BCG, rBCG 및 염수로 1차 백신화한 다음, 과발현된 항원이 있는 2 회의 추가접종으로 백신화함을 제외하고, 필수적으로 상기와 동일하다.

상기 비 인간 영장류 모델에서 면역원성 및 보호 연구는 rBCG 구조물에 대한 효능 연구를 위한 짧은꼬리원숭이에서의 결핵의 면역생물학적 및 면역병리학적 태양의 조사를 목표로 할 것이다. 상기 동물들은 상기 실험의 출발 전에 철저히 상태조절된, 평균 체중 2 내지 3 ㎏의, 감금 사육된 어린 내지 젊은 성체이다. 접종 전 연구는 통상적인 혈액 연구 및 적혈구 침강속도뿐만 아니라 림프구 증식 분석을 포함하는 기준선 혈액 시험으로 이루어진다. 피부 시험을 PPD를 사용하여 수행하여 튜베르쿨린에 대한 민감성의 결여를 확실히 하고, 흉부 x-선을 감염 전 프로파일의 일부로서 획득한다. 상기 면역화 기간은 총 21주 지속될 것이며, 0주째 BCG 또는 rBCG에 의한 1차 백신화 및 12 및 16주째 항원 추가접종을 포함한다. 항원-특이적 면역성을 림프구 자극 시험에서 증식 및 인터페론 γ(IFNγ) 분비를 측정함으로써 평가한다. IFNγ 생산 림프구의 빈도를 효소 결합된 면역흡수 분석(ELISPOT) 또는 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)에 의해 측정한다. 이를 위해서, 혈액 샘플을 1차 백신화에 비해 0, 4, 8, 12, 16 및 20 주째에 취한다.

최종 면역화 후 4 내지 6주째에, 동물들을 같은 날, 같은 제제로 3 ㎖(1,000 cfu)의 상기 엠 튜베르큘로시스 엘드만의 기관 내 설치에 의해 시험감염시킬 것이다. 상기 감염 과정을 체중 손실, 발열, 상승된 ESR, DTH 대 PPD, PPD 및 rBCG에서 과발현된 항원으로 자극된 PBMC의 시험관 내 증식 반응에 대해 평가하고 이어서 IFN-g 생산 수준을 측정할 것이다. 흉부 x-선을 수행하여 폐 TB와 일치하는 이상을 검출하고, 최종적으로 시험감염 후 12 내지 16주째에 부검을 수행할 것이다.

TB 벡터 및 백신의 임상 평가

안전성 및 독성 연구:

규제 지침에 의해 요구된 바와 같은 임상 전 안전성 및 독성 연구를 상술한 바와 같은 임상 전 독물학 및 안전성 연구로서 수행한다. 이들 연구에 이어서 인간 안전성 연구를 수행한다. 상기 연구를 처음에는 건강한 콴티페론 음성 성인에서 수행한 다음, 어린이 및 신생아로 연령을 점차 감소시켜 수행한다.

면역원성 연구:

마우스 및 영장류에서 면역원성 연구는 비 제한적으로 단기 및 장기 항원 또는 펩타이드 자극과 함께 IFNγ, ELISPOT 및/또는 유식 세포측정과 같은 세포 면역성을 평가하는 표준 방법을 사용할 수 있다. 유사한 방법론들을 인간 반응의 평가에 사용한다. 테트라머 연구를 인간의 백신화에 이은 CD4 및 CD8 반응의 평가에 사용한다.

1차 접종-추가접종 전략의 최적화:

rBCG는 TB 또는 관련된 전이유전자를 발현하도록 가공된 다른 질병들에 대한 표준 단독 백신으로서 잘 작용한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "전이유전자"는 마이코박테리움 프로모터에 작용적으로 연결되고 관심 단백질을 발현하는 DNA 단편이다. TB용 백신 또는 다른 질병들에 대해 보호하도록 전이유전자를 발현하는 백신으로서 본 발명에 개시된 바와 같은 rBCG는 또한 항원보강제 또는 바이러스 또는 세균 벡터화된 항원과 혼합된 재조합 단백질에 의한 추가접종 면역화를 위해 상기 면역계를 1차 접종하는데 대단히 잘 작용한다. 동물 임상전 연구 및 인간 연구 모두에서 상기 BCG는 1차 접종에 이은 재조합 단백질/항원보강제 또는 벡터 추가접종을 섭생 및 용량 면에서 최적화한다. 이러한 1차 접종 추가접종 전략은 특히 본 발명에서 구체화한 바와 같이 상기 BCG 1차 접종의 효능으로 인해 인간에서 면역성을 유도한 다음 재조합 단백질 또는 벡터에 의한 상기 면역계의 추가접종 반응에 집중하고 상기 반응을 향상시키는 가장 효능 있는 수단이다.

동물에서 치료 백신 노출 후 연구

C57BL/6 마우스를 잠복성 감염의 확립에 사용할 것이다; 치료 백신을, 단지 무시할만한 M. tb 특이적 면역성이 저 용량 감염에 의해 유도된 시점 및 M. tb 특이적 면역성이 감퇴되고 기억 T 세포가 우세한 또 다른 시점에서 상기 마우스에게 제공할 것이다. 이어서 상기 백신의 치료 이점을, 개별적인 마우스의 폐 및 비장에서 cfu 수를 일일이 세어 최종 치료 백신 전달 후 2 및 5 개월째에 마우스에서 평가할 것이다. 상기 cfu 수를 상기 마우스의 그룹들에서 표준 통계학적 방법에 의해 분석할 것이며 그 결과를 사용하여 치료 백신화가 마우스에서 잠복성 M. tb, 감염을 현저하게 감소시키는지의 여부를 다룰 것이며; 필요에 따라 유사한 방법론들을 사용하여 다른 동물들의 반응을 평가한다.

BCG 벡터의 임상적 평가: rBCG 백신의 경구 투여

본 발명의 rBCG에 의한 표적 동물의 경구 백신화를 또한 앞서 개시된 방법들을 사용하여 성취할 수 있다(Miller et al., Can Med Assoc J 121(1):45-54; 1979). 경구 투여된 rBCG의 양은 환자의 종뿐만 아니라 치료하려는 질병 또는 상태에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 사용되는 투여량은 약 10³ 내지 10¹¹ 생육성 유기체, 바람직하게는 약 10⁵ 내지 10⁹ 생육성 유기체일 것이다.

*상기 rBCG를 일반적으로는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 투여한다. 사용되는 특정의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 본 발명에 중요하지 않다. 희석제의 예로는 인산염 완충 염수, 위 중의 위산을 완충하기 위한 완충제, 예를 들어 슈크로스 함유 시트레이트 완충제(pH 7.0), 바이카보네이트 완충제(pH 7.0) 단독(Levine et al., J. Clin. Invest., 79:888-902; 1987; and Black et al., J. Infect. Dis., 155:1260-1265; 1987) 또는 아스코르브산, 락토오스 및 임의로 아스파탐을 함유하는 바이카보네이트 완충제(pH 7.0)(Levine et al, Lancet, II:467-470; 1988)가 있다. 담체의 예로는 단백질, 예를 들어 탈지유에서 발견되는 것, 당, 예를 들어 슈크로스, 또는 폴리비닐피롤리돈이 있다. 전형적으로는 상기 담체를 약 0.1 내지 90%(w/v)의 농도, 바람직하게는 1 내지 10%(w/v)의 범위로 사용한다.

실시예

실시예 1. 기니 피그에서 모 BCG 균주의 효능: rBCG 30을 사용한 기니 피그 보호 연구

기존의 rBCG30 백신을 사용하여 수행된 연구의 예로서, 대규모 기니 피그 연구를 2 개의 rBCG30 로트와 모 BCG Tice 균주 자체 및 인간에서 전 세계적으로 사용되는 또 다른 상업적으로 입수할 수 있는 BCG 백신(SSI-1331 균주)의 보호 효능 비교를 목적으로 수행하였다. 상기 2 개의 rBCG30 로트를 실험실 조건 하에서 생산하거나(rBCG30-UCLA) 또는 인간 용도로 GMP 조건 하에서 제작하였다(rBCG30-KIT).

기니 피그(그룹 당 10 마리의 동물)를 상기 BCG 백신 각각의 10³ cfu의 단일 용량으로 피하 경로를 통해 면역시켰다. 음성 대조군(염수 면역화된)을 상기 연구에 포함시켰다. 상기 백신화 후 8주째에, 상기 동물들을 폐에 대략 10 내지 15 개의 세균이 전달되도록 미들브룩 풍매 감염 장치의 분무기 구획을 눈금화함으로써 에어로졸 경로를 통해 독성 엘드만 균주로 시험감염시켰다. 동물들을 시험감염 후 10주째에 죽였다. 부검 시, 폐 및 비장을 상기 동물로부터 제거하고 생육성 세균의 수를 일련의 폐엽 및 비장 균질물의 10 배 희석물을 영양 미들브룩 7H11 상에 도말함으로써 측정하였다. 세균 콜로니 형성을 37 ℃에서 5%(v/v) CO₂ 하에서 21일 배양 후에 계산하였다. 데이터를 회수된 세균의 평균 수의 로그 10으로서 나타낸다.

결과(도 2)는 상기 백신 전부가 음성, 염수 대조군과 비교 시 상기 Mtb 시험감염에 대해 보호성인 반면, 상기 백신들 간의 차이는 하기 2 개의 그룹으로 향하는 것을 가리킨다:

1) rBCG30(UCLA) 및 BCG 대니쉬 1331이 보다 보호성이고;

2) BCG(모 Tice 균주) 및 rBCG30(KIT)이 덜 보호성이다.

따라서 rBCG30(UCLA)이 실험실 조건 하에서 생산되는 반면 GMP 등급은 모 Tice 균주보다 양호한 보호를 유도하는 것으로 보이며, 기껏해야 상기 보호 효능은 상업적으로 입수할 수 있는 BCG SSI와 단지 필적할만하다는 결론을 내리는 것이 타당하다. 따라서, BCG 대니쉬 1331은 신규의 rBCG 백신을 생성시키는 것을 목적으로 개선되어야 한다.

실시예 2. 항생물질 내성 마커가 없는 발현 벡터의 담체로서 작용하는 숙주의 제작

BCG 대니쉬 1331 균주에서 녹아웃 LeuD 유전자에 대한 플라스미드 제작:

상기 leuD 유전자의 좌측 및 우측 1kb 측면 부위를 DNA 합성(DNA 2.0, CA)에 의해 함께 조립하여 양쪽 단부에 pacI 부위를 갖는 2 kb DNA 단편을 제조하였다. 상기 DNA 단편을 PacI 제한 효소 절단을 사용하여 상기 언급한 대립유전자 교환 플라스미드에 클로닝한 다음 연결하여 leuD 녹아웃 플라스미드를 생성시켰다.

*leuD 유전자의 대립유전자 교환 불활성화:

상기 leuD 유전자의 불활성화를, 50 ㎍/㎖의 류신을 leuD 유전자 녹아웃을 갖는 균주에 대해 배양 배지에 보충함을 제외하고 개시된 바와 같이 수행한다. 상기 과정의 주요 단계들의 흐름도를 도 4에 제공한다.

LeuD 녹아웃의 확인:

표현형 시험: 상기 수득된 균주를 생육을 위한 류신 보충에 대한 그의 의존성에 대해 시험한다. 구체적으로, 상기 세균을 50 ㎍/㎖의 류신의 존재 또는 부재 하에서 10% OADC 및 0.05%(v/v) 타이록사폴 보충물이 있는 7H9 배지에서 배양하고, 상기 세균의 생육을 OD₆₀₀ 값을 측정하여 모니터한다.

게놈 부위 서열 분석: 상기 제작된 균주의 게놈 DNA를 앞서 개시된 바와 같이 제조한다. 상기 표적화된 유전자의 좌측 및 우측 1 kb 측면 모두에 상보성인 프라이머 쌍을 PCR 증폭에 사용하여 염색체로부터 대략 2 kb 단편을 획득한다. 상기 PCR 산물을 서열화하여 상기 부위 중의 leuD 유전자의 부재를 확인한다.

실시예 3. rBCG 균주에서 M. tb 항원의 과발현

DNA 조작:

상기 M.tb 항원 TB10.4(Rv0288), Ag85B(Rv1886c) 및 Ag85A(Rv3804c)를, Ag85B + Rv3130으로부터의 프로모터를 사용하여 개시된 순서로 다중시스트론에 의해 발현시킨다(상기 Florczyk et al., 2003). 서열 KDEL을 갖는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 소포체 체류 신호로서 각 항원의 끝에 두어 각 항원에 대한 항원 발현을 개선시킨다. 또한, 5'-고리 구조 및 3'-전사 종결자 서열을 두어 상기 전사된 다중시스트론 mRNA의 안정성을 보장한다. 최종적으로, 제한 효소 PacI 서열을 사용하여 상기 발현 카세트의 발현 벡터 내로의 클로닝 용이성을 위해 상기 2 개의 단부를 모두 인접시킨다. 상기 발현 카세트 중의 모든 DNA를 유전자 합성에 의해 제조한다(Picoscript Inc, TX). 상기 발현 카세트를 PacI 부위를 사용함으로써 상기 발현 벡터 내로 클로닝시킨다. 이 콜라이에서 증폭 후, 상기 플라스미드를 NdeI로 절단하여 oriE 및 가나마이신 내성 유전자를 제거한 다음 연결하여 일방 셔틀 시스템을 생성시키고, 이어서 이를 표준 일렉트로포레이션 과정을 사용하여 마이코박테리움 leuD 영양요구성 돌연변이체 내로 도입시킨다(Parish et al., Microbiology, 145:3497-3503; 1999). 도 3은 예시적인 비 항생물질 발현 벡터를 도식적으로 묘사한다.

비 항생물질 선택 시스템을 사용하는 M. tb 항원의 발현:

상기 비 항생물질 선택 시스템에 대한 숙주로서 사용되는, 류신 영양요구성의 BCG 대니쉬 1331을 10% OAD(올레산-알부민-덱스트로스-카탈라제), 0.05%(v/v) 타이록사폴 및 50 ㎍/㎖의 류신이 보충된 7H9 배지에서 배양한다. 일렉트로포레이션 후, 상기 항원 발현 플라스미드를 갖고 있는 재조합 균주를 류신 없이 7H10 플레이트(BD Difco) 상에 도말함으로써 단리한다. 상기 세균의 생존은 상기 플라스미드에 의한 leuD 유전자의 항원 발현에 따라 변하며, 이는 차례로 상기 세포 중에서 상기 플라스미드를 유지시키는 기전으로서 작용한다. 생성되는 개별적인 콜로니들을 단리하고, 류신 보충이 없음을 제외하고 상기와 같은 7H9 배지에서 배양한다.

발현의 확인:

각 항원의 발현을 웨스턴 블럿 분석에 의해 검출한다. 구체적으로, 상기 배양 상등액을 수거하고 앞서 개시된 바와 같이 처리한다(Harth et al., Infect Immun 65(6):2321-2328; 1997). 이어서 상기 발현된 항원을 SDS-PAGE 젤 상에서 분리시키고 항원 85A, 85B 및 10.4에 대한 항체들로 블럿팅한다. 각 항원의 발현 수준을, 발현 플라스미드 음성 숙주 세균에 의해 생성된 것과 비교하여 각 특정 밴드의 강도를 정량적으로 측정함으로써 평가한다.

실시예 4. 항생물질 선택 없이 마이코박테리움에서 선택된 항원들의 발현

물질 및 방법:

일렉트로포레이션을 위한 플라스미드 및 마이코박테리움 제조:

재조합 플라스미드 DNA를 단리하고 제한 엔도뉴클레아제 NdeI(New England Biolabs)로 절단하여 항생물질 선택 마커(예를 들어 가나마이신-내성) 및 이 콜라이 복제 기원(OriE) 부위를 유리시켰다. 이어서 상기 절단된 플라스미드 DNA 단편을 제조사의 설명에 따라 T4 DNA 리가제(New England Biolabs)를 사용하여 환상화하였다. 상기 생성되는 플라스미드(상기는 마이코박테리움 복제 기원 및 선택된 항원들을 함유하지만, 항생물질 내성 유전자를 함유하지 않고 그람 음성 세균에서 복제할 수 없다)를 상기 선택된 마이코박테리움에 도입시켰다. 일렉트로포레이션을 위한 마이코박테리움을 제조하기 위해서, BCG 대니쉬 1331 세균을 37 ℃에서 10% OADC 보충물이 있는 미들브룩 7H9 배지(BD Biosciences)에서 지수 증식기로 배양하였다. 타이록사폴(0.05% v/v, Research Diagnostics Cat. No. 70400)을 사용하여 상기 세균을 분산시켰다. 이어서 상기 세포를 10% 글리세롤 + 0.05%의 타이록사폴에서 3 회 세척하여 일렉트로포레이션 전에 상기 배양 배지를 제거하였다. 각각의 일렉트로포레이션을 위해서, 1.6 ㎍의 플라스미드를 각각의 1.25 x 10⁸ 세균 세포에 대해 사용하였다. 상기 일렉트로포레이션을 2.2 kV, 25 μF의 용량 및 1.0 kΩ의 저항에서 수행하였다. 상기 일렉트로포레이션 후, 상기 세포들을 미들브룩 7H10 아가(BD Biosciences) 플레이트 상에 일련의 10 배 희석으로 즉시 도말하고 37 ℃에서 배양하였다.

발현 플라스미드를 갖고 있는 세균 콜로니의 PCR 선별:

재조합 균주들을 먼저 순방향 프라이머 GTTAAGCGACTCGGCTATCG(서열식별번호: 1) 및 역방향 프라이머 ATGCCACCACAAGCACTACA(서열식별번호: 2)를 사용하는 PCR에 의해 선별하여 발현 플라스미드 중의 oriM 부위의 DNA 서열을 증폭시켰다. 상기 PCR 매개변수들은 하기와 같았다: 단계 1: 95 ℃ 4 분, 1 주기; 단계 2: 총 30 주기 동안 95 ℃ 1 분, 60 ℃ 1 분, 및 이어서 72 ℃ 1 분; 단계 3: 1 주기 동안 72 ℃ 10 분; 단계 4: 4 ℃ 저장. 생성되는 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하여 상기 세포 중의 상기 플라스미드의 존재를 확인하였다.

결과

상기 플라스미드의 복제 부위(OriM)를 증폭하도록 고안된 PCR을 수행하여 생성 콜로니들을 상기 과발현 플라스미드를 갖고 있는지에 대해 선별하였다. 상기 부위는 상기 세균 염색체 상에 존재하지 않기 때문에, 상기 세포 중의 상기 부위의 존재는 상기 플라스미드가 상기 세포 내에 도입되었음을 강하게 가리킨다. 상기 선별된 rBCG 콜로니들 중에서, 일부 콜로니들은 상기 PCR 산물을 생산하였으며, 상기 산물은 젤 전기영동에 의해 분석된 바와 같이, 플라스미드 양성 대조군 반응의 경우와 크기가 유사하다. 대조적으로, 모 BCG 세균은 도 5에 도시된 바와 같이, 어떠한 PCR 산물도 생산하지 않았다. 상기 실험은 상기 플라스미드가 마이코박테리움에 성공적으로 도입되었고 상기 플라스미드를 갖고 있는 세균 클론이 항생물질 선택의 사용 없이 단리되었다는 일단의 증거를 제공한다.

논의

재조합 마이코박테리움 균주에 사용하기 위한 통상적인 플라스미드는 재조합 DNA 실험에 유용성을 갖는 필수 플라스미드 요소로서 복제 부위 및 선택 마커(통상적으로 항생물질 내성 유전자, 예를 들어 가나마이신 내성 또는 대사 결함을 보충하는 유전자, 예를 들어 leuD 또는 asd(Galan et al., Gene, 94:29; 1990))를 함유한다. 전형적으로, 항생물질을 사용하여 재조합 플라스미드를 갖고 있는 클론들을 선택한다. 그러나, 상기 항생물질-내성 유전자 조작된 유기체를 실험실 봉쇄 밖에서 사용하고자 하는 경우에 항생물질-내성 유전자의 우연한 확산 위험의 문제가 있다.

상기 연구에서, 우리는 상기 세균 내로 항원 발현을 할 수 있는 재조합 플라스미드(oriE 부위도 항생물질-선택 마커도 함유하지 않는다)를 도입하였으며 선택의 사용 없이 상기 플라스미드를 갖고 있는 클론들을 성공적으로 단리하였다. 비록 본 발명의 실험이 플라스미드 복제 부위로서 oriM을 사용하였지만, 다른 플라스미드 복제 부위도 대용물, 예를 들어 pMF1의 복제 부위로서 작용할 것이 예상된다(Bachrach et al., Microbiol., 146:297; 2000). 상기 시스템의 독특한 이점은 상기 재조합 플라스미드가 더 이상 항생물질 내성 유전자를 갖지 않는다는 것이다. 따라서, 통상적으로 사용되는 발현 플라스미드의 경우와 같이, 항생물질 내성이 주변에 무심코 확산될 수는 없다. 또한, 상기와 같은 복제를 가능하게 하는 유전 요소들이 결실되기 때문에, 본 발명의 일방 셔틀 벡터 발현 플라스미드는 더 이상 광범위한 숙주 범위 복제를 할 수 없다. 이러한 구속은 상기 재조합 플라스미드에 두 번째 수준의 봉쇄를 가하여, 유전자 조작된(GMO) 유기체가 환경으로 방출되는 것과 관련된 위험을 실질적으로 감소시킨다.

본 발명의 결과는 재조합 플라스미드를 선택 없이 약독화된 마이코박테리움 균주에 도입시키는 것이 가능함을 보이지만, 다른 인자들도 상기 마이코박테리움에서 상기 선택 마커-비 함유 플라스미드의 안정성에 한 역할을 할 수 있다. 따라서, 상기 복제 부위는 플라스미드 복제를 촉진하고 자매 세포 내로의 플라스미드 분리를 매개하는 유전자를 함유하여, 선택 없이 상기 플라스미드를 갖고 있는 클론들을 식별하는 능력에 기여한다.

선택 없이 상기 플라스미드를 갖고 있는 클론들의 단리를 가능하게 한 가능 인자는 본 발명의 접근법에 사용된 보다 높은 플라스미드 대 세포 비이다. 보다 높은 플라스미드 대 세포 비의 사용은 세포가 플라스미드를 수용할 확률을 증가시키고, 플라스미드가 없는 세포의 수를 감소시킨다. 상기 연구에서, 상기 플라스미드 대 세포 비는 선택 시스템을 사용하는 통상적인 접근법에 전형적으로 사용되는 경우보다 약 10 배 더 높았다. 이론상, 훨씬 더 높은 플라스미드 대 세포 비는 플라스미드 포화점에 도달할 때까지, 상기 플라스미드를 갖고 있는 클론들을 훨씬 더 많이 생성시킬 것이며, 이는 일렉트로포레이션된 세포에 의한 상기 플라스미드 DNA의 흡수를 억제할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 플라스미드 대 세균의 비는 약 0.5 ㎍ 내지 약 10 ㎍의 플라스미드 DNA 대 약 1.25 x 10⁸ 세균 세포의 범위, 및 바람직하게는 약 1 ㎍ 내지 약 5 ㎍의 플라스미드 DNA 대 약 1.25 x 10⁸ 세균 세포의 범위이다.

또한, 플라스미드 pAF105에 의해 과발현되는 상기 TB 항원은 플라스미드 안정화에서 중요한 역할을 할 수도 있다. 상기 플라스미드는 항원 85 복합체(Ag85A(Rv3804c) 및 Ag85B(Rv1886v))의 2 개의 단백질을 과발현하며, 상기 단백질은 모두 마이코릴트랜스퍼라제 활성을 갖고, 이는 세포 벽 완전성을 유지하는데 필요한 주된 구조인 트레할로스 다이마이콜레이트의 생합성에 필요하다. 따라서, 이들 항원 중 하나 이상의 과발현은 상기 플라스미드를 갖고 있는 세포에 생육 이점을 부여함으로써 선택 부재 플라스미드의 안정성에 기여하고, 따라서 선택 없이 상기 플라스미드를 갖고 있는 클론들을 식별하게 할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Aeras Global TB Vaccine Foundation <120> Electroporation of Mycobacterium and Overexpression of Antigens in Mycobacteria <130> 08560015tb <140> PCT/US08/65241 <141> 2008-05-30 <150> US 11/755,768 <151> 2007-05-31 <160> 2 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide forward primer <400> 1 gttaagcgac tcggctatcg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide reverse primer <400> 2 atgccaccac aagcactaca 20

Claims (33)

1. 복제되고, 형질전환된 세균 또는 그의 자손 중에서 발현되는 외부 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 형질전환된 세균 또는 그의 자손으로서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 선택성 마커에 결합되지 않은 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 플라스미드 상에 존재하는 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
3. 제 2 항에 있어서,

   상기 플라스미드가 생존에 필요한 유전자를 암호화하며, 상기 생존에 필요한 유전자가 상기 형질전환된 세균의 세균 게놈으로부터 결실된 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
4. 제 2 항에 있어서,

   상기 플라스미드가 엔도솜 이탈을 암호화하는 유전자를 갖고 있는 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
5. 제 4 항에 있어서,

   상기 엔도솜 이탈을 암호화하는 유전자가 pfo인 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
6. 제 2 항에 있어서,

   상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 엔도솜 이탈을 암호화하는 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
7. 제 6 항에 있어서,

   상기 뉴클레오타이드 서열이 pfo를 암호화하는 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
8. 제 2 항에 있어서,

   상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 항원 85a, 항원 85b, 또는 항원 85a/85b를 암호화하는 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
9. 제 2 항에 있어서,

   상기 플라스미드가 상기 플라스미드를 유지하고/하거나 안정화시키는 단백질을 암호화하는 유전자를 갖고 있는 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
10. 제 9 항에 있어서,

    상기 단백질을 암호화하는 유전자가 항원 85a, 항원 85b, 또는 항원 85a/85b를 암호화하는 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
11. 제 1 항에 있어서,

    상기 세균이 마이코박테리움( Mycobacterium )인 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
12. 제 1 항에 있어서,

    상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 세포사멸을 암호화하는 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
13. 제 2 항에 있어서,

    상기 플라스미드가 세포사멸을 암호화하는 유전자를 갖고 있는 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
14. 제 1 항에 있어서,

    상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 그람 음성 세균에서 복제될 수 없는 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
15. 제 1 항에 있어서,

    영양요구성인 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
16. 제 1 항에 있어서,

    상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 적어도 일방 셔틀 벡터의 일부인 형질전환된 세균 또는 그의 자손.
17. 복제되고 세균 중에서 발현되는 외부 뉴클레오타이드 서열을 통합시키는 단계를 포함하는 상기 세균의 형질전환 방법으로서, 상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 선택성 마커에 결합되지 않은 방법.
18. 제 17 항에 있어서,

    상기 통합 단계를 일렉트로포레이션에 의해 수행하는 방법.
19. 제 17 항에 있어서,

    상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 플라스미드 상에 있고 상기 일렉트로포레이션을 하기의 조건 하에서 수행하는 방법:

    1 ㎍ 내지 5 ㎍의 플라스미드 DNA 대 1.25 x 10⁸ 세균 세포 범위의 플라스미드 DNA 대 세균 세포의 비.
20. 제 4 항에 있어서,

    상기 비가 약 1.6 ㎍의 플라스미드 대 약 1.25 x 10⁸ 세균 세포인 방법.
21. 제 20 항에 있어서,

    상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 그람 음성 세균에서 복제될 수 없는 방법.
22. 제 17 항에 있어서,

    상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 일방 셔틀 벡터의 적어도 일부인 방법.
23. 제 17 항에 있어서,

    상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 플라스미드 상에 위치하고, 상기 서열이, 상기 세균의 세균 게놈이 결실된, 생존에 필요한 유전자를 암호화하는 방법.
24. 관심 유전자를 암호화하는 외부 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 하기의 조건들 중 하나 이상이 존재하는 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손:

    a) 상기 형질전환된 마이코박테리움이 그람 음성 세균에서 복제할 수 없는 플라스미드를 포함하고;

    b) 상기 형질전환된 마이코박테리움이 항생물질 내성을 나타내지 않고;

    c) 상기 형질전환된 마이코박테리움이 영양요구성이고;

    d) 상기 형질전환된 마이코박테리움이 일방(one-way) 셔틀 벡터를 갖고 있다.
25. 제 24 항에 있어서,

    상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 플라스미드의 일부인 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손.
26. 제 25 항에 있어서,

    상기 플라스미드에 선택성 마커가 결여된 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손.
27. 제 25 항에 있어서,

    상기 외부 뉴클레오타이드 서열이 생존에 필요한 유전자를 암호화하고 상기 생존에 필요한 유전자에 상기 형질전환된 마이코박테리움의 세균 게놈이 결실된 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손.
28. 제 27 항에 있어서,

    상기 생존에 필요한 유전자가 leuD인 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손.
29. 제 27 항에 있어서,

    생체 내에서 활성화되는 프로모터 서열을 또한 포함하는 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손.
30. 제 24 항에 있어서,

    약독화된(attenuated) 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손.
31. 제 30 항에 있어서,

    BCG인 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손.
32. 제 31 항에 있어서,

    상기 BCG가 하기의 균주 BCG1331, BCG 파스퇴르, BCG 토쿄, 및 BCG 코펜하겐 중에서 선택되는 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손.
33. 관심 유전자를 암호화하는 외부 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 하기의 조건들 중 하나 이상이 존재하는 형질전환된 마이코박테리움 또는 그의 자손을 포함하는 백신:

    a) 상기 형질전환된 마이코박테리움이 그람 음성 세균에서 복제할 수 없는 플라스미드를 포함하고;

    b) 상기 형질전환된 마이코박테리움이 항생물질 내성을 나타내지 않고;

    c) 상기 형질전환된 마이코박테리움이 영양요구성이고;

    d) 상기 형질전환된 마이코박테리움이 일방 셔틀 벡터를 갖고 있다.

Images