CN101801408A - 分枝杆菌的电穿孔和抗原在分枝杆菌中的过量表达 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有改进疫苗特性的重组分枝杆菌菌株，可以用作接种试剂。重组分枝杆菌菌株的亲本株是根据它们有效的免疫原性选择而来。分枝杆菌菌株不显示抗生素拮抗性，并且没有表现出向革兰氏阴性菌水平转移。

Description

分枝杆菌的电穿孔和抗原在分枝杆菌中的过量表达

技术领域

本发明提供了具有改进疫苗特性的分枝杆菌菌株，可以用作对抗肺结核的预防接种试剂。这些分枝杆菌菌株优选选自被鉴定为具有有效免疫原性的亲本株，不表现抗生素拮抗性，并且不显示向革兰氏阴性菌的水平转移。本发明也提供了具有改进特性的分枝杆菌，可以传递具有疫苗特性的转基因，用于对抗其他疾病的预防接种和癌症的治疗。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)已经感染了世界上三分之一的人群，每年引起8百万人得病并杀死1.6-2.2百万人，这些人大多数生活在发展中世界。结核病(TB)是一个全球比例的流行病，因为结核病与艾滋病病毒的交叉传播，它正在增加并且变得甚至更加致命。结核病是患有艾滋病的人群的头号杀手。

卡介苗(BCG)是当前被广泛使用的结核病疫苗，在80多年前被研制出来，并且在其被测试时，它对抗肺结核的疗效有很大的变化率，包括最近在印度所作的一次大范围的试验中没有有效性。(Fine et al.，Vaccine，16(20)：1923-1928；1998；Anonymous，IndianJ Med Res.，Aug；110：56-69；1999)。尽管如此，世界卫生组织目前仍然对结核病高发国家的所有孩子(除了有艾滋病症状的那些孩子)在出生时或与检疫部门第一次接触时就推荐卡介苗。这个政策是基于卡介苗能防止严重的儿童时期的结核病。(Lanckriet等人.，IntJ Epidemiol，24(5)：1042-1049；1995；Rodrigues等人，J Epidemiol Community Health，45(1)：78-80；1991)。卡介苗对与超过幼儿时期的结核病的预防是一个引起争议的话题，其有限的数据造成了混乱的结果。发展中国家的儿童与成年的结核病的高发生率，虽然在这些国家婴儿的卡介苗的免疫接种是广泛实行的，然而，这显示了当前给药的卡介苗经过这么多年，当人们处于结核病的危险之中时，并不是高度有效的，因此，卡介苗被不认为是一个干预并控制结核病的合适的公共卫生工具。

大约有70％接触结核病生物体的人，这些人有正常的免疫系统，不会被传染，在被传染的人中，大约只有5％在最初的两年发展成疾病。大多数被感染的个体都会抑制住感染，这是与对结核分枝杆菌抗原的有力的细胞免疫应答的发展相关的。当免疫力下降时，另外的5％稍后重新激活。初次的和重新激活的这两种疾病在带有艾滋病毒的人群中非常常见，再一次强调了免疫性在防止和控制感染上的的重要性。

发明内容

因为大多数人都能控制结核病，所以这里有很好的理由希望，通过诱导出合适种类的长效的免疫性，从而有可能开发出有效的疫苗来防止接触后初期的感染，防止早期的疾病的发展，防止从潜伏状态重新激活，防止治疗后的旧病复发。终极目标是，它是系统疫苗的使用和化学治疗的干预的组合来最终消除结核分枝杆菌成为人的病原体。

考虑到儿童时期的卡介苗接种被认为在预防急性结核病时起着关键的作用，在没有压倒优势的证据证明新的结核病的疫苗是更好的产品时，那就很难在试验中替换卡介苗来评价候选的结核病疫苗。问题是结核分枝杆菌主要是人特异性的病原体，动物模型只能模仿寄主-病原体相互作用的一部分。因此，证明新的结核病疫苗拥有改进的效力的明确证据只能从人类的对照现场试验中获得。这些考虑导致了许多研究者得出结论，得到改进的结核病疫苗的的一个关键步骤将是开发改进的卡介苗菌株，尽管动物模型有它们的局限性，但它们仍然暗示了能过量表达保护性抗原的重组卡介苗(rBCG)与卡介苗相比，其效力有所提高。

某些结核分枝杆菌抗原具有疫苗的特性，并且当作为疫苗制剂给药于动物时，这些抗原给予的保护与卡介苗单独给药时获得的保护是类似的(Anderson，Infect Immun，62(6)2536-2544；1994)。为了推动这些候选疫苗向前发展，已开发出一个策略来提高卡介苗中这些抗原的免疫原性。因此，卡介苗菌株被研制成能过量表达选定的结核分枝杆菌抗原，而且这些衍生于亲本卡介苗菌株的重组卡介苗(rBCG)菌株与亲本卡介苗菌株相比，显示出能诱导更加强大的保护作用(Horwitz et al.，Infect Immun，72(4)：1672-1679；2003)。在一项研究中，表达抗原85B(在此被称为“Ag 85B”)的重组卡介苗菌株与混合相同抗原的卡介苗相比，被证明是更具有效性(Horwitz et al.，supra，2003)。根据这些发现，该方法有着巨大的潜力。

在某些情况下，过量表达抗原的卡介苗菌株可以用来安全地和有效地引起免疫应答，起到避免结核病感染的保护作用。

本发明提供了具有改进疫苗特性的、遗传工程化的(重组)分枝杆菌菌株，可以用作对抗结核病的预防接种试剂。它们具有很多特征，每一个都能起到提高菌株免疫原性的作用。本发明中的重组分枝杆菌菌株是从亲本株发展而来，这些亲本株是有目的地根据它们有效的免疫原性而选择出来的。换句话说，被选为亲本株用于进行基因操作(比如去过量表达结核病抗原)的分枝杆菌菌株，它之所以被选中，是因为，甚至在基因操作前，它在被接种的寄主身上已经能引起有效的免疫应答。卡介苗菌株Danish 1331就是一个例子。然后优选这些菌株被修饰，比如用来过量表达所研究的结核病抗原。更优选地，在基因重组的分枝杆菌中使用一个可体内被激活的启动子。另外，本发明中的重组分枝杆菌菌株被遗传工程化后不需要根据抗生素拮抗来选择，或者以根本不需要任何选择性标记的方式来构造，这样使得它们在人群中作为接种试剂使用时通常是安全的。例如，将分枝杆菌复制所需要的基因切除，并放置于一个表达质粒中。另外，本发明中的重组分枝杆菌菌株并不会水平转移成革兰氏阴性菌，因此就不能从寄主生物体中“逃脱”。这样也保证了它们在人群中作为接种试剂时的安全性。

在另一个例子中，本发明描述了通过质粒表达的抗原85b被用作质粒稳定因子的应用，这样避免了需要抗生素选择来维持培养。用高浓度的表达抗原Ag85B和其他抗原的最小质粒直接转化分枝杆菌菌株，并使用PCR阳性选择作为它们的确认，产生的分枝杆菌菌株即使没有抗生素或营养缺陷型的选择，也具有质粒的稳定性并过量表达抗原。另外，本发明中的重组分枝杆菌菌株作为用于结核病疫苗很好的试剂的同时，它们也可以被遗传工程化后表达或过量表达与结核病不相关的抗原，因此作为对抗其他疾病的疫苗试剂时也很有效。此外，过量表达结核病抗原或其他疾病重要的抗原的重组卡介苗可以与重组蛋白、连同作为加强剂的佐剂、重组病毒载体或DNA或RNA疫苗一起用在致敏加强剂体系中。

本发明提供了一个转化的细菌或其子代，它们引入了一个外源的核苷酸序列，该序列的复制和表达都在转化的细菌(或子代)中进行，其中该外源的核苷酸序列没有与选择性标记连接。在一个具体化的实施方案中，该外源的核苷酸序列位于一个质粒中，在一些具体的实施方案中，质粒编码存活所必需的基因，该存活所必需的基因已经从转化细菌的基因组中删除。在另外一个具体的实施方案中，质粒包含一个编码用于逃出内体(endosomeescape)的基因，比如pfo。在其他一些具体的实施方案中，外源的核苷酸序列编码逃出内体的基因，比如pfo。在另外一些具体的实施方案中，外源的核苷酸序列编码抗原85a、抗原85b或者抗原85a/85b。仍然在另外的一些具体的实施方案中，质粒包含一个编码能维持和/或稳定质粒的蛋白质的基因。在一些具体的实施方案中，编码蛋白质的基因编码抗原85a、抗原85b或者抗原85a/85b。在本发明的一个具体的实施方案中，细菌是分枝杆菌。在又一个具体的实施方案中，外源的核苷酸序列编码细胞凋亡。在其他的具体的实施方案中，质粒包含一个编码细胞凋亡的基因。在本发明的又一个具体的实施方案中，外源的核苷酸序列不能在革兰氏阴性菌中复制。在一些具体的实施方案中，转化的细菌是营养缺陷型的。在另一个具体的实施方案中，外源的核苷酸序列至少是单向穿梭载体的一部分。

本发明更进一步地提供了一种转化细菌的方法。本方法包含了引入外源核苷酸序列的步骤，该序列的复制和表达都在细菌中进行，并且该外源的核苷酸序列没有与选择性标记连接。在本发明的一个具体的实施方案中，引入的步骤是通过电穿孔法完成的。在另一个具体的实施方案中，外源的核苷酸序列位于一个质粒上，电穿孔法是在以下的条件下完成的：质粒DNA与细菌细胞的比例范围是1μg至5μg的质粒DNA对应1.25×10⁸个细菌细胞。在本发明的一个具体实施方案中，这个比例是1.6μg的质粒对应大约1.25×10⁸个细菌细胞。在本发明的一些具体的实施方案中，外源的核苷酸序列不能在革兰氏阴性菌中复制。在另一些具体的实施方案中，外源的核苷酸序列至少是单向穿梭载体的一部分。在进一步的具体实施方案中，外源的核苷酸序列定位于质粒中，并且编码存活所必需的基因，此基因已从细菌的基因组中删除。

本发明进一步提供了一个转化的分枝杆菌或其子代，其包含一个外源的编码所研究的基因的核苷酸序列，并且其中存在着以下一个或多个条件：a)转化的分枝杆菌包括一个不能在革兰氏阴性菌中复制的质粒；b)转化的分枝杆菌不显示抗生素拮抗性；c)转化的分枝杆菌是营养缺陷型；以及d)转化的分枝杆菌包含了一个单向穿梭载体。在一个具体的实施方案中，外源的核苷酸序列是质粒的一部分。在另一个具体的实施方案中，质粒缺少选择性标记。在本发明的另一个具体实施方案中，外源的核苷酸序列编码存活所必需的基因，其中存活所必需的基因已经从转化的分枝杆菌的细菌基因组中删除。在一些具体的实施方案中，存活所必需的基因是leuD。转化的分枝杆菌或其子代可以进一步包含可以在体内被激活的启动子序列。转化的分枝杆菌或其子代可能是减毒的。转化的分枝杆菌或其子代有可能是卡介苗，举例来说，可能是BCG 1331，BCG Pasteur，BCG Tokyo或者BCGCopenhagen。

本发明进一步提供了一种疫苗，包括转化的分枝杆菌或其子代，包含可以编码研究中的基因的外源核苷酸序列，其中存在着以下一个或几个条件：a)转化的分枝杆菌包含一个不能在革兰氏阴性菌中复制的质粒；b)转化的分枝杆菌不显示抗生素拮抗性；c)转化的分枝杆菌是营养缺陷型；以及d)转化的分枝杆菌包含一个单向穿梭载体。

附图说明

图1.自杀载体pAF103的图谱。每个DNA片段的含义如下：L-侧翼和R-侧翼；分别是leuD基因的左侧翼和右侧翼；aph是氨基糖苷磷酸转移酶的基因(基因库登录号：X06402)，其赋予质粒卡那霉素抗性，OriE是pUC的复制起始点(基因库登录号：AY234331)；Ble是基因(基因库登录号：L36850)，赋予质粒Zeocin抗性；SacB是基因(基因库登录号：Y489048)，编码果聚糖蔗糖酶，其赋予细菌蔗糖敏感性；P_hsp60是热休克蛋白基因的启动子序列(即Rv 0440)；MCS是显示的限制性内切酶的多克隆位点。注意，在两个PacI位点之间的盒，在适当的时候可以被其他溶解内体的酶基因取代。

图2.被当前不同的疫苗株攻击后通过肺CFU数量所测定的保护水平。

图3.用于将表达载体引入重组分枝杆菌，即重组卡介苗，的非抗生素表达载体的示意图。该将在重组卡介苗中被表达的基因通过pacI位点克隆到质粒上。在电穿孔进入重组卡介苗之前，质粒被显示的限制性内切酶消化以便去除oriE和Kan区域，形成单向穿梭表达载体。每个DNA片段的含义如下：P_Rv3130是抗原Rv3130c的启动子序列；P_Ag85B是抗原85B的启动子序列(即Rv 1886c)；抗原Y是分枝杆菌抗原TB10.4(即Rv 0288)；Ag85B是编码抗原85B的DNA序列(即Rv 1886c)；Ag85A是编码抗原85A的基因(即Rv 3804c)；aph是氨基糖苷磷酸转移酶基因(基因库登录号：X06402)，其赋予质粒卡那霉素抗性；OriE是pUC复制起始点(基因库登录号：AY 234331)；LeuD是编码3-异丙基苹果酸脱水酶的基因(即Rv 2987c)；oriM是分枝杆菌的复制起始点(基因库登录号：M23557)。

图4.等位基因交换的主要步骤流程图。

图5.选中的菌落的PCR分析，用于证明表达质粒的存在。PCR根据材料和方法中所描述的进行操作。PCR产物用含有1.0％琼脂糖胶的凝胶电泳进行分析。泳道1：DNA序列梯(Invitrogen)被用作1Kb加上DNA标准。泳道2：PCR模板阴性对照；泳道3：卡介苗菌株Danish 1331的PCR；泳道4到7：编号分别是59，61，69和84的菌落的PCR；泳道8：空白加样孔；泳道9：原始质粒的PCR。

图6.电泳凝胶图显示抗原Ag85A和Ag85b在结核分枝杆菌菌株中的过量表达，此菌株包含了一个在抗原85B启动子的转录控制下的oriM质粒，该质粒有编码抗原85A、抗原85B和TB10.4的序列，被称为pAF-105。

图7.示意图A-F显示了在小鼠中AFRO-1rBCG比BCG更具免疫原性。

图8.示意图A-D显示用AFRO-1rBCG接种与用BCG接种一样可以保护小鼠。

图9.示意图A-B显示用AFRO-1rBCG接种的小鼠甚至在17周后被攻击仍然处于被保护状态。

图10.图表A-C呈现的数据表明AFRO-1在豚鼠中是具有免疫原性的。

图11.图表A-B呈现的数据表明AFRO-1rBCG在豚鼠中起到的保护作用。

图12.示意图和图表A-E显示了当AFRO-1rBCG被Ad35-TBS加强后，在小鼠中免疫原性增强。

图13.图表A-B显示用Ad35-TBS加强后，AFRO-1致敏比BCG致敏产生了更多的IFN-γ阳性CD8+T细胞。

图14.用BCG致敏的豚鼠与被Ad35-TBS加强的AFRO-1rBCG致敏的豚鼠的比较。

图15.表格和示意图显示了在非人类的灵长类动物身上疫苗体系的免疫原性。

图16.柱状图显示了在用Ad35-TBS加强之前和之后抗原特异性IFN-γ增殖反应的差异。

具体实施方式

本发明提供了具有改进疫苗特性的遗传工程化的(重组)分枝杆菌菌株，可以用作对抗结核病的预防接种试剂。它们具有很多特征，每一个都能起到提高菌株免疫原性的作用。本发明中的重组分枝杆菌菌株是从亲本株开发而来，这些亲本株是有目的地根据它们有效的免疫原性而选择出来。换句话说，被选为亲本株用于进行基因操作(比如用来过量表达结核病抗原)的分枝杆菌菌株，它之所以被选中，是因为，甚至在基因操作前，它在被接种的寄主身上已经能引起有效的免疫应答。卡介苗菌株Danish 1331就是一个例子。然后这些菌株被更好地修饰，比如用来过量表达研究中的结核病抗原。更优选的是，在基因重组的分枝杆菌中使用在体内被激活的启动子。另外，本发明中的重组分枝杆菌菌株经遗传工程化后不需要根据抗生素拮抗来选择，这样使得它们在人群中作为接种试剂使用时通常是安全的。例如，将复制所需要的基因切除掉，并放置于表达质粒中。另外，本发明中的重组分枝杆菌菌株并不会水平转移成革兰氏阴性菌，因此就不能从寄主生物体中“逃脱”(即它们是“一个单向穿梭载体”)。这样也保证了它们在人群中作为接种试剂时的安全性。另外，本发明中的重组分枝杆菌菌株在作为用于结核病疫苗很好的试剂的同时，它们也可以被遗传工程化后表达或过量表达与结核病不相关的抗原，因此作为对抗其他疾病的疫苗试剂时也是有用的。

在本发明的优选的具体的实施方案中，分枝杆菌菌株是减毒的菌株，比如卡介菌。然而，正如本领域的技术人员将会立即意识到的一样，其他减毒的和非减毒的分枝杆菌菌株同样可以被使用。其他种类的分枝杆菌的例子包括但是不限于田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)，分枝杆菌H37Ra，牝牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)等等。

卡介苗菌株选择

现有技术表明，卡介苗不是同种的菌株，而是已经发展成一系列不同的遗传谱系(Oettinger et al.，Tuber Lung Dis.79(4)：243-250；1999)。直到最近还不是很清楚，这些差异是否改变了卡介苗家族成员的免疫原性和效力。然而，正如这里所描述的，现在已经发现重组卡介苗(这里称为rBCG)所来源于其的某个特定的菌株，造成了重组卡介苗的免疫原性的效力有很大的差异。下面的实例1中显示，卡介苗菌株Danish 1331(在此称作“BCG₁₃₃₁”)与BCG_Tice相比，是一个更好的疫苗。因此，虽然在菌株rBCG30中过量表达抗原85B提高了rBCG30衍生来源的亲本株BCG_Tice的免疫原性，但是在BCG tice菌株中过量表达抗原85B的rBCG 30并不能获得与BCG₁₃₃₁一样的效力。因此，在疫苗构建过程的起始阶段，通过选择一个有效力的亲本株卡介苗菌株，可以在卡介苗过量表达抗原上获得某些优势。文献Horwitz et al.，Proc Natl Acad Sci Acad Sci USA，97(25)：13853-13858；2000显示，至今为止，在构建重组卡介苗疫苗的起始阶段之前，首先确定亲本卡介苗菌株是否显示出足够的效力，这一点并不是常用的或者认为是必须的。这些菌株非常适合过量表达卡介苗和结核病的抗原或外源的抗原。

有效的亲本卡介苗菌株可以从下面的组中选择：包括但是不限于BCG₁₃₃₁，BCGPasteur，BCG Tokyo和BCG Copenhagen。亲本卡介苗菌株应当降低有活力的结核分枝杆菌攻击生物体的水平，至少是比下面实例1中低剂量气雾剂的豚鼠攻击模型中使用的BCGTice低0.4×10¹⁰倍。

提高卡介苗的免疫原性

正如上文讨论的，卡介苗的免疫原性不是不变的。而且，实例1也给我们显示了虽然卡介苗抗原的免疫原性可以通过卡介苗的基因修饰而得到提高，但是在豚鼠攻击模型中如果重组体改变的亲本卡介苗菌株失去效力，那么这样的修饰是毫无意义的。由该规则得出的推论就是，进一步提高卡介苗的免疫原性能更进一步提高来源于该亲本株的重组菌株的免疫原性。

运用上面详述的方法去选择一个合适的卡介苗菌株作为重组卡介苗疫苗和疫苗载体的亲本株，再将基因修饰引入到此菌株中，产生想要得到的重组卡介苗疫苗和疫苗载体。用于构建个体重组卡介苗菌株的方法对该发明来说并不是关键的，可以选自本领域的技术人员已知的方法中的任何一个或任何组合(Horwitz et al.，PNAS 97(25)：13853-13858；2000；Hess et al.，Proc Natl Acad Sci USA，95：5299-5304；1998)。

更进一步，重组卡介苗疫苗受益于在感染后在体内被激活的启动子。比如，使用组成性活性启动子，例如抗原85B、抗原85A、Hsp60或者Rv1908c(KatG)的启动子，能使得抗原在免疫接种后在体内组成性地表达。因此，在感染的过程中对于每个阶段的感染都能引起强有力的免疫应答。当选择潜伏期的活性启动子比如来自基因Rv2032、Rv3127、Rv2031c或者Rv3030c等的启动子时，能使重组卡介苗表达这些选中的抗原，特别是在接种免疫后当重组卡介苗疫苗在体内进入潜伏期时的那些潜伏期特异性抗原。

表达载体

非抗生素选择性系统的研究

如上所述，当前在重组卡介苗菌株中用来过量表达保护性抗原的质粒是不能接受的，因为它们需要依赖于抗生素拮抗性基因来维持生存，而且这些质粒有一个固有的能力，可将质粒水平转移给一系列微生物寄主，从而造成了向周围的生物体散布抗生素拮抗性基因和抗原表达盒的威胁。为了克服这些重要的限制，本发明描述了一个新的非抗生素选择性系统和单向穿梭系统，用于在分枝杆菌寄主菌株中如重组卡介苗中引入或维持表达载体。

质粒的非抗生素选择性是通过在表达质粒上先选择性地删除对于复制很重要的寄主基因、然后再引入功能性拷贝基因来补偿该删除部分来达到的。因此，细菌寄主依靠表达质粒存活，形成了不经抗生素选择而在分枝杆菌寄主内维持质粒的机理。一个较佳的方法需要使基因失活来创建营养缺陷型的表现型。例如，在结核分枝杆菌和卡介苗中，leuD基因(Genome Seq ID# Mb3011C)的失活产生亮氨酸依赖型的表现型，带有失活leuD基因的菌株是依赖于亮氨酸的添加来存活的(Hondalus et al.，Infect Immun.68(5)：2888-98.2000)。另外，分枝杆菌ΔleuD菌株是不能在体内复制的(Hondalus et al.，supra，2000)，因此结核分枝杆菌和重组卡介苗ΔleuD突变体将在体外和体内都维持leuD⁺质粒。带有其他缺陷的卡介苗菌株突变体，比如ΔlysA，可以用类似的方法得到。

用于将营养缺陷型突变引入到目标分枝杆菌菌株中的具体方法对于本发明来说不是很重要，可以选自本领域技术人员很熟悉的任何等位基因交换方法(Parish et al.，Microbiology，145：3497-3503；1999)。同样地，营养缺陷型突变的补偿通过在表达载体上引入失活基因的功能性拷贝来达到。表达载体同样需要分枝杆菌的复制起始点(例如OriM；Labidi et al.，Plasmid，27(2)：130-140；1992)以使得在目标结核分枝杆菌和重组卡介苗菌株中能够复制。带有这种质粒的分枝杆菌菌株在培养基中缺失亮氨酸时，其生存将会依赖于质粒编码的leuD基因的表达。

新的单向穿梭载体的研究

上述的步骤描述了创建一个选择系统用于维持结核分枝杆菌和重组卡介苗中的表达载体的方法。然而，该载体系统必须能够在大肠杆菌中复制以便在引入分枝杆菌之前能够对质粒结构进行高效率的操作。此外，为了在质粒构建中扩宽能被使用的潜在的重组大肠杆菌寄主菌株，从而允许研究人员使用便于质粒构建的大肠杆菌，优选在表达载体中包括抗生素选择性标记(比如卡那霉素抗性)和一个广泛寄主范围的复制起点(比如OriE；Halpern et al.，Proc Natl Acad Sci Acad Sci，USA 76(12)：6137-6141；1979；Mosig et al.，New Biol 1(2)：171-179；1989)。这些元件位于特定的限制性核酸内切酶(消化位点比如NdeI)的侧翼，以便在将这些质粒引入目标分枝杆菌菌株之前能够除去抗生素抗性标记和大肠杆菌复制起点。另外，包括可以引入抗原表达盒的特定的限制性核酸内切酶位点(比如PacI)。

一旦在大肠杆菌中完成了该步骤，希望得到的质粒也已经被识别和表征，那么重组质粒的DNA将会被分离并且用限制性核酸内切酶消化，释放出抗生素选择标记和OriE。然后被消化的质粒DNA用T4 DNA连接酶连接。生成的质粒包含寄主分枝杆菌的营养缺陷型的互补基因，但是不呈现抗生素拮抗性，而且不能在革兰氏阴性菌中复制。该质粒同样也包含抗原表达盒，使用标准电穿孔法的步骤将质粒引入目标分枝杆菌营养缺陷型突变体。包含质粒的重组菌株通过在缺少生长所必需的代谢产物(比如亮氨酸)的培养基中培养而被分离出来。该系统独有的优点在于，最终的表达质粒不再带有抗生素抗性基因。因此它就不会像当前通常使用的表达质粒那样将抗生素抗性基因传播到环境中。另外，本发明的表达质粒不能在广泛的寄主范围内再复制，因为能够复制的基因元件被删除了。这种载体被命名为“单向”穿梭载体。

结核病抗原的过量表达

在本发明中，基因先引入至位于单向穿梭载体中的表达盒中，然后再引入到重组卡介苗中，此基因可能编码结核分枝杆菌免疫原。结核分枝杆菌免疫原可能是，比如是完整长度的内在蛋白质，是两个或更多结核分枝杆菌免疫原或类似的嵌合融合体，或者来自于结核分枝杆菌的结核分枝杆菌免疫原的一个片段或多个片段。

结核分枝杆菌抗原在启动子的控制下被单向穿梭载体表达，此启动子在体内至少在分枝杆菌感染的一个感染阶段中是激活的。该特定的启动子对于本发明不是很重要的，可以是选自组成性激活的启动子，比如抗原85B、Hsp60、抗原85A、Rv1908c(KatG)和/或在潜伏期激活的启动子，比如基因Rv3130C(Florczyk et al.，Infect Immun 71(9)：5332-5343；2003；Voskuil et al.，J Exr Med 198(5)：705-713；2003)、Rv2032、Rv3127和/或Rv2031c的启动子。为了提高抗原表达的水平，产生小型细胞的分枝杆菌载体菌株的衍生菌株的有可能被使用。产生小型细胞的分枝杆菌种类的菌株是通过过量表达FtsZ(基因组文库#Mb 2174c)或通过whiB 3位点定向失活得到的。FtsZ表达水平的改变或whiB 3的失活是可以通过本领域的技术人员所熟悉的标准基因方法来实现。比如，FtsZ过量表达是可以通过在一个强大的启动子的控制下将ftsZ基因引入单向穿梭载体中来实现的。这些启动子诸如抗原85B、抗原85A、Hsp60或Rv1908c(KatG)的启动子，是组成性激活的，和/或是在潜伏感染期激活的启动子，诸如基因Rv2032、Rv3127、Rv2031c和Rv3130C的启动子(Florczyk et al.，supra；2003；Voskuil et al.，supra，2003)。whiB3位点定向的失活是通过使用下面概括的步骤进行等位基因交换来实现的。

可以插入重组分枝杆菌的外源抗原的实例

在本发明中，分枝杆菌携带的单向穿梭载体中的表达盒可以编码免疫原，该免疫原可以是来自病毒、细菌或寄生病原体的外源免疫原，或者是内源免疫原，比如但不限制是自体免疫的抗原或肿瘤抗原。这些免疫原可能是，例如，一个完整长度的天然蛋白质；外源免疫原和内原性蛋白质或类似的之间的嵌合融合体；或来源于病毒、细菌和寄生病原体的免疫原的一个片段或一些片段。

在这里使用的术语“外源免疫原”是指蛋白或它的片段，不是在受体动物细胞或者组织中正常表达的，例如但不限于，病毒蛋白质、细菌蛋白质、寄生物蛋白质、细胞因子、趋化因子、免疫调节因子或治疗试剂。

“内源免疫原”是指蛋白或它的一部分，是在受体动物细胞或者组织中天然存在的，例如但不限于，内源细胞蛋白质、免疫调节因子或治疗试剂。另外地或补充的，免疫原可以由人工合成基因编码、也可以用本领域的技术人员所知道的传统的重组DNA方法来构建。

在外源免疫原进入动物寄主、在动物寄主中集群或复制之前或过程中，外源的免疫原可以是被任何病毒、细菌或寄生病原体表达的任何分子。重组卡介苗可以表达来自于病毒、细菌和寄生病原体的免疫原或者其部分。这些病原体可以在人、家畜或野生动物的寄主中传染。

病毒病原体，病毒抗原由其衍生而来，包括但不限于：正黏病毒，例如流感病毒(分类学编号ID：59771)；逆转录病毒，例如呼吸道合胞体病毒、HTLV-1(分类学编号ID：39015)和HTLV-II(分类学编号ID：11909)；疱疹病毒，例如EBV(分类学编号ID：10295)；巨细胞病毒(分类学编号ID：10358)或者单纯疱疹病毒(ATCC#：VR-1487)；慢病毒，例如人体免疫缺损病毒-1(分类学编号ID：12721)和人体免疫缺损病毒-2(分类学编号ID：11709)；棒状病毒，例如麻痹型狂犬病；微小RNA病毒，例如脊髓灰质炎病毒(分类ID学编号：12080)；痘病毒，例如牛痘(分类学编号ID：10245)；轮状病毒(分类学编号ID：10912)；和细小病毒，例如腺-相关病毒1(分类学编号ID：85106)。

病毒抗原的例子如下组所示，包括但不限于：人类免疫缺陷型病毒抗原Nef(国家研究院过敏反应和感染疾病HIV贮藏库目录号183；基因库登录号AF238278)、Gag、Env(国家研究院过敏反应和感染疾病HIV贮藏库目录号2433；基因库登录号U39362)、Tat(国家研究院过敏反应和感染疾病HIV贮藏库目录号827；基因库登录号M13137)、Tat的突变体衍生物例如Tat-Δ31-45(Agwale et al.Proc.Natl.Acad.Sci.in press.Jul 8^th；2002)、Rev(国家研究院过敏反应和感染疾病HIV贮藏库目录号2088；基因库登录号L14572)、以及Pol(国家研究院过敏反应和感染疾病HIV贮藏库目录号238；基因库登录号AJ237568)；以及T细胞和B细胞的gp120表位(Hanke and McMichael，AIDS Immunol Lett.，66：177；1999；Hanke，et al.，Vaccine，17：589；1999；Palker et al，J.Immunol.，142：3612-3619；1989)；HIV-1 Env和gp120的嵌合衍生物，例如但不限于gp120和CD4的融合体(Fouts et al.，J.Virol.2000，74：11427-11436；2000)；HIV-1 env截断的或修饰的衍生物，例如但不限于gp140(Stamatos et al.J Virol，72：9656-9667；1998)，或者HIV-1 Env和/或gp140的衍生物(Binley，et al.J Virol，76：2606-2616；2002；Sanders，et al.J Virol，74：5091-5100；2000；Binley，et al.J Virol，74：627-643；2000)、乙型肝炎表面抗原(基因库登录号AF043578；Wu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86：4726-4730；1989)；轮状病毒，例如VP4(基因库登录号AJ293721；Mackow et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，87：518-522；1990)和VP7(基因库登录号AY003871；Green et al.，J.Virol.，62：1819-1823；1988)，流感病毒抗原例如血凝素(基因库登录号AJ404627；Pertmer and Robinson，Virology，257：406；1999)；核蛋白(基因库登录号AJ289872；Lin et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，97：9654-9658；2000)；单纯性疱疹病毒例如胸腺嘧啶核苷激酶(基因库登录号AB047378；Whitley et al，In：New Generation Vaccines，pages825-854；2004)。

细菌性病原体，细菌抗原由其衍生而来，包括但不限于：分枝杆菌属(Mycobacteriumspp.)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，沙门氏菌(Salmonella spp.)，志贺氏杆菌(Shigellaspp.)，大肠杆菌(E.coli)，立克次氏体(Rickettsia spp.)，李斯特菌属(Listeria spp.)，肺炎军团杆菌(Legionella pneumoniae)，假单胞菌属(Pseudomonas spp.)，弧菌(Vibriospp.)，和伯氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi)。

细菌病原体的保护性抗原的例子包括：产肠毒的大肠杆菌的菌体抗原，例如CFA/I菌毛抗原(Yamamoto et al.，Infect.Immun.，50：925-928；1985)和热不稳定毒素的无毒的B亚基(Klipstein et al.，Infect.Immun.，40：888-893；1983)；百日咳杆菌的粘附素(Roberts et al.，Vacc.，10：43-48；1992)，百日咳杆菌的腺苷酸环化酶-溶血素(Guiso et al.，Micro.Path.，11：423-431；1991)，破伤风杆菌的破伤风毒素的片段C(Fairweather et al.，Infect.Immun.，58：1323-1326；1990)，伯氏疏螺旋体的OspA(Sikand，et al.，Pediatrics，108：123-128；2001)；Wallich，et al.，Infect Immun，69：2130-2136；2001)，普氏立克次氏体和莫氏立克次氏体的保护性的不完全结晶-表面-层蛋白(Carl，et al.，Proc Natl Acad Sci USA，87：8237-8241；1990)，单核细胞增多性李斯特氏菌的李斯特菌素(也称为“Llo”和“Hly”)和/或过氧化物歧化酶(同样被称为“SOD”和“p60”)(Hess，J.，et al.，Infect.Immun.65：1286-92；1997；Hess，J.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.93：1458-1463；1996；Bouwer，et al.，J.Exp.Med.175：1467-71；1992)，幽门螺杆菌脲酶(Gomez-Duarte，et al.，Vaccine 16，460-71；1998；Corthesy-Theulaz，et al.，Infection & Immunity 66，581-6；1998)，和炭疽芽胞杆菌的致死毒素及或保护性抗原的受体-结合区域(Price，et al.，Infect.Immun.69，4509-4515；2001)。

寄生的病原体，寄生抗原由此衍生而来，包括但不限于：疟原虫(Plasmodium spp.)，比如镰状疟原虫(ATCC号30145)；锥体虫(Trypanosome spp.)例如克氏锥虫(ATCC号50797)；贾弟虫(Giardia spp.)，例如肠贾第虫(Giardia intestinalis)(ATCC号30888D)；牛蜱(Boophilus spp.)；巴贝西虫(Babesia spp.)，例如果氏巴贝西虫(Babesia microti)(ATCC号30221)；内阿米巴(Entamoeba spp.)，例如痢疾内阿米巴(Entamoeba histolytica)(ATCC号30015)；艾美球虫(Eimeria spp.)，例如巨型艾美球虫(Eimeria maxima)(ATCC号40357)；利什曼原虫(Leishmania spp.)(分类学编号ID：38568)，血吸虫(Schistosomespp.)；布鲁格丝虫(Brugia spp.)；Fascida spp.，恶丝虫(Dirofilaria spp.)；吴策线虫(Wuchereria spp.)和Onchocerea spp.。

寄生病原体保护性抗原的例子包括疟原虫环子孢子抗原(Sadoff et al.，Science，240：336-337；1988)，例如P.bergerii的环子孢子抗原或者恶性疟原虫的环子孢子抗原；疟原虫的裂殖性孢子的表面抗原(Spetzler et al.，Int.J.Pept.Prot.Res.，43：351-358；1994)；痢疾阿米巴半乳糖特异性的凝集素(Mann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88：3248-3252；1991)；利什曼虫的gp 63(Russell et al.，J.Immunol.，140：1274-1278；1988；Xu and Liew，Immunol.，84：173-176；1995)；硕大利什曼虫的gp 46(Handman et al.，Vaccine，18：3011-3017；2000)；马来丝虫的副肌球蛋白(Li et al.，Mol.Biochem.Parasitol.，49：315-323；1991)；曼氏血吸虫的丙糖-磷酸盐异构酶(Shoemaker et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：1842-1846；1992)；类似蛇形毛圆线虫蛋白质的分泌球蛋白(Frenkel et al.，Mol.Biochem.Parasitol.，50：27-36；1992)；Frasciola hepatica的谷胱甘肽-S-转移酶(Hillyer et al.，Exp.Parasitol.，75：176-186；1992)；牛血吸虫和日本裂体吸虫(Bashir et al.，Trop.Geog.Med.，46：255-258；1994)；以及牛血吸虫和日本裂体吸虫的KLH(Bashir et al.，supra 1994)。

如上所述，重组卡介苗可以编码内源的免疫原，该免疫原可以是任何细胞蛋白、免疫调节因子或治疗试剂、或其部分，其也可以在受体细胞中表达。该免疫原包括但不限制于：肿瘤免疫原、移植免疫原和自身免疫免疫原，或肿瘤免疫原、移植免疫原和自身免疫免疫原的片段和衍生物。因此，在本发明中，重组卡介苗可以编码肿瘤免疫原、移植免疫原或自身免疫的免疫原、或者其部分和衍生物。另外，重组卡介苗可以编码人工合成基因(如上所述)，其编码肿瘤特异性抗原、移植抗原或自身免疫抗原或其部分。

肿瘤特异性抗原例子包括前列腺特异抗原(Gattuso et al.，Human Pathol.，26：123-126；1995)，TAG-72和CEA(Guadagni et al.，Int.J.Biol.Markers，9：53-60；1994)、MAGE-1和酪氨酸酶(Coulie et al.，J.Immunothera.，14：104-109；1993)。最近显示，用表达肿瘤抗原的非恶性肿瘤细胞免疫接种小鼠，可以提供疫苗的作用，以及针对显示相同抗原性的恶性肿瘤细胞，能帮助动物增加清除恶性肿瘤细胞的免疫应答(Koeppen et al.，Anal.N.Y.Acad.Sci.，690：244-255；1993)。

移植抗原的例子包括在T细胞上的CD3分子(Alegre et al.，Digest.Dis.Sci.，40：58-64；1995)。用CD3受体的抗体进行治疗显示出快速的清除循环T细胞和逆转细胞-介导的移植排斥(Alegre et al.，supra，1995)。

自身免疫抗原的例子包括IAS β链(Topham et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：8005-8009；1994)。用来自于IAS β链的18个氨基酸的肽免疫接种小鼠，表明可以给带有实验性自身免疫脑脊髓炎的小鼠提供保护和治疗(Topham et al.，supra，1994)。

表达佐剂的重组卡介苗的研究

重组卡介苗可以被构建成能编码免疫原和佐剂，而且可以用来提高寄主对重组卡介苗的应答。另外，重组卡介苗可以被构建成能编码佐剂，和其他重组卡介苗混合在一起，可以用来提高寄主对配对的卡介苗编码的免疫原的应答。

重组卡介苗编码的特定的佐剂对于本发明来说不是至关重要的，它可能是霍乱毒素的一个亚基(即CtxA；基因库登录号X00171、AF175708、D30053、D30052)、或者其部分和/或突变体衍生物(比如Ctx的A亚基的A1功能域(即CtxA1；基因库登录号K02679)，来自任何典型的霍乱弧菌(比如霍乱弧菌菌株395，ATCC号39541)或者El Tor霍乱弧菌(比如霍乱弧菌菌株2125，ATCC号39050)菌株。可选地，细菌二磷酸腺苷-核糖基化外毒素家庭成员的任何细菌毒素(Krueger and Barbier，Clin.Microbiol.Rev.，8：34；1995)，可以用于替代CtxA例如：肠毒性大肠杆菌(基因库登录号M35581)的热不稳定毒素的亚基(在此称为EltA)、百日咳毒素1的亚基(比如ptxS1，基因库登录号AJ 007364、AJ 007363、AJ 006159、AJ 006157等)；进一步可选择的佐剂可以是百日咳杆菌的腺苷酸环化酶溶血素(ATCC号8467)、支气管败血性博代杆菌(ATCC号7773)或者副百日咳博德特氏菌(ATCC号15237)，比如百日咳杆菌的cyaA基因(基因库登录号X14199)、副百日咳博德特氏菌(基因库登录号AJ 249835)或者支气管败血性百日咳杆菌(Bordetellabronchiseptica)(基因库登录号Z37112)。

表达免疫调节因子的重组卡介苗的研究

重组卡介苗可以被构建成能编码免疫原和细胞因子，而且可以用来提高寄主对重组卡介苗的应答。另外，重组卡介苗可以被构建成能只编码上述细胞因子，和其他重组卡介苗混合在一起，可以用来提高寄主对配对卡介苗编码的免疫原的反应。

重组卡介苗编码的特定的细胞因子对于本发明来说不是至关重要的，可以包括但不限于：白介素-4(在此称为“IL-4”；基因库登录号AF352783(鼠IL-4)或NM_000589(人IL-4))，IL-5(基因库登录号NM_010558(鼠IL-5)或NM_000879(人IL-5))，IL-6(基因库登录号M20572(鼠IL-6)或M29150(人IL-6))，IL-10(基因库登录号NM_010548(鼠IL-10)或AF418271(人IL-10))，I1-12^p40(基因库登录号NM_008352(鼠IL-12p40)或AY008847(人IL-12p40))，IL-12_p70(基因库登录号NM_008351/NM_008352(鼠IL-12p35/40)或AF093065/AY008847(人IL-12p35/40))，TGFβ(基因库登录号NM_011577(鼠TGFβ1)或M60316(人TGFβ1))，和TNFα基因库登录号X02611(鼠TNFα)或M26331(人TNFα)).

细胞凋亡是细胞程序死亡，它与细胞坏死死亡在诱导与结果上有显著的不同。包含外源抗原的细胞凋亡是已知的应对这种抗原的细胞免疫的强大刺激。包含抗原的细胞凋亡导致细胞免疫性的过程有时被称为交叉-致敏。(Heath，W.R.，G.T.Belz，G.M.Behrens，C.M.Smith，S.P.Forehan，I.A.，Parish，G.M.Davey，N.S.Wilson，F.R.Carbone，and J.A.Villandangos.2004.Cross-presentaion，dentritic cell subsets，and the generation of immunityto cellular antigens.Immunol Rev 199：9；Gallucci，S.，M.Lolkema，and P.Matzinger.1999.Natural adjuvants：Endogenous activators of dendritic cells.Nature Biotechnology.5：1249；Albert，M.L.，B.Sauter，and N.Bhadrdwaj.1998.Dendtritic cells acquire antigen from apoptoticcells and induce class I-restricted CTLs.Nature 392：86).导致抗原特异性细胞介导的免疫性增加的细胞凋亡的诱导有几种机理。胱天蛋白酶8介导的细胞凋亡导致了抗原特异性的细胞免疫保护。由重组卡介苗生成的胱天蛋白酶8和在重组卡介苗表达外源抗原的情况下重组卡介苗在真核细胞中分泌胱天蛋白酶8，针对卡介苗过量表达卡介苗和其他结核病抗原以及针对卡介苗本身的抗原，将会导致高水平的抗原特异性细胞免疫。死亡受体-5(DR-5)也称为TRAIL-R2(TRAIL受体2)或者TNFR-SF-10B(肿瘤坏死因子-超家族成员10B)同样调节胱天蛋白酶8介导的细胞凋亡。(Sheridan，J.P.，S.A.Marsters，R.M.Pitti，A.Gruney，M.Skutbatch，D.Baldwin，L.Ramakrishnan，C.L.Gray，K.Baker，W.I.Wood，A.D.Goddard，P.Godowski，and A.Ashkenazi.1997.Control of Trail induced apoptosis by a family of signalingand decoy receptors.Science 277：818)。呼吸道肠道病毒诱导的细胞凋亡是通过TRAIL-DR介导的，导致了随后的病毒的清除(Clarke，P.，S.M.Meintzer，S.Gibson，C.Widmann，T.P.Garrington，G.L.Johnson，and K.L.Tyler.2000 Reovirus-induced apoptosis is mediated b yTRAIL.J.Virol 74：8135)。通过重组卡介苗表达DR-5会提供一个强大的辅助效果，用于诱导针对重组卡介苗表达的抗原的抗原特异性细胞免疫。也可以诱导表达抗原的细胞通过Fas连接进行细胞凋亡，Fas连接是用于诱导抗原特异性细胞免疫应答的强有力的刺激(Chattergoon，M.A.，J.J.Kim，J.S.Yang，T.M.Robbinson，D.J.Lee，T.Dentchev，D.M.Wilson，V.Ayyavoo，and D.B.Weiner.2000.Targeted antigen delivery to antigen-presenting cellsincluding dendritic cells by engineered Fas-mediated apoptosis.Nat Biotechnology 18：974)。

表达Fas或Fas胞浆结构域/CD4胞外结构域的融合蛋白质的重组体卡介苗会诱导细胞凋亡和抗原特异性细胞免疫应答。

通过重组卡介苗使得细胞免疫增强，产生了如上所述的细胞凋亡的增强子，并不限于卡介苗抗原或重组卡介苗特异性编码的过量表达的抗原，还包括上述的重组卡介菌可以侵入的真核细胞中的任何抗原。举例来说，如果将重组卡介苗传递给肿瘤细胞，在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡，接着将会诱导针对重要的肿瘤抗原的细胞免疫，消除、减少或防止了肿瘤和/或转移。当卡介苗局部给药时，比如膀胱癌的例子，此抗肿瘤作用是卡介苗产生的普通抗肿瘤作用之外的作用。

在本发明进一步的实施方案中，通过产生细胞凋亡特异性的介导因子而增强的重组卡介苗，被传送至肿瘤或其他细胞里面，在其中重组卡介苗也产生了外源抗原，针对这些外源抗原强烈的细胞免疫应答被增强，重组卡介苗针对这些含有外源抗原的细胞将诱导产生强烈的细胞应答。这些细胞应答会导致免疫介导的肿瘤细胞的毁灭，更进一步地交叉致敏并且诱导针对肿瘤或其他重要抗原的细胞免疫，和随后的肿瘤和/或转移的减少或防止。这种外源抗原的一个例子是不同于寄主HLA抗原的HLA抗原，针对该抗原，将会建立强烈的异源性细胞应答。

重组卡介苗的细胞凋亡诱导特性通过细胞凋亡的特异性介导因子的表达而增强，它同时也表达特异性的肿瘤抗原，重组卡介苗会针对这些肿瘤抗原诱导出强烈的抗原特异性细胞应答，包括破坏这些抗原的某些耐受性，不需要将重组卡介苗直接传递到肿瘤本身就可以导致肿瘤和/或转移的消除、减少或防止。

紧接着DNA损伤后的细胞凋亡或者胱天蛋白酶9可诱导某些抗原的耐受性(Hugues，S.，E.Mougneau，W.Ferlin，D.Jeske，P.Hofman，D.Homann，L.Beaudoin，D.Schrike，M.VonHerrath，A.Lehuen，and N.Glaichenenhaus.2002).Tolerance to islet antigens and preventionfrom diabetes induced by limited apoptosis of pancreatic beta cells.Immunity 16：169)。耐受性的诱导在控制或防止自身免疫性疾病上是很重要的，例如但不限于糖尿病，类风湿性关节炎，局限性回肠炎(Crohns disease)，炎性肠病和多发性硬化。在细胞中，例如但不限于B胰细胞、结肠直肠细胞和神经细胞，通过重组卡介苗产生胱天蛋白酶9或其他的细胞凋亡介导的耐受性诱导蛋白，会产生有限的细胞凋亡，可以在细胞中诱导出针对自身免疫的抗原靶的耐受性，从而治疗或者防止自身免疫性疾病的病情。涉及自身免疫应答的特异性的抗原的识别，通过重组卡介苗产生这些抗原和胱天蛋白酶9或者其他的能诱导出细胞凋亡介导的耐受性的分子，将允许诱导出针对这些自身免疫标靶抗原的耐受性。这种重组卡介苗可以治疗和/或防止这些自身免疫性疾病。

引入功能性的表达盒产生能够在真核细胞或组织中表达免疫调节因子的重组卡介苗的重组DNA和RNA步骤如下所述。

下面的实施例被认为是本发明不同方面的示例，并不对本发明的实施进行限制。本领域中的技术人员可以理解可选的材料、条件和步骤有可能会不同，并且仍然在技术人员的技术知识范围之内，并没有超出说明书所述的本发明的一般范围之外。

实施例

方法

分枝杆菌菌株的培养

被选的卡介苗菌株在液体培养基例如Middlebrook 7H9或Saulton合成培养基中培养，优选在37℃下培养。菌株可以在静置或振荡培养中维持。另外，卡介苗的生长速率可以通过添加油酸(0.06％ v/v；Research Diagnostics产品目录号01257)和去污剂例如四丁酚醛(0.05％v/v；Research Diagnostics产品目录号70400)来增强。通过将卡介苗培养物在磷酸缓冲盐溶液中(在此称作PBS)连续稀释(比如从整10^-8以10倍梯度稀释)后，以100微升的等份均匀涂布在含有25-30毫升的固体培养基例如Middlebrook 7H10的3.5英寸的平板上，可以对卡介苗培养物的纯度进行评估。另外，培养物的纯度也可进一步的通过使用市场上可买到的试剂盒例如thiglycolate培养基(Science Lab，产品目录号1891)和大豆-酪蛋白培养基(BD，产品目录号211768)来进行评估。

卡介苗种子罐以0.1-2×10⁷cfu/ml的密度在-80℃保存。液体培养物是在相对于无菌对照样的光学密度(在600nm处)为0.2-4.0时进行收获；培养物被放置在大小合适的离心管中，并且生物体在8,000xg下离心5-10分钟。丢弃上清液，生物体在含有10-30％(V/V)甘油的Middlebrook 7H9组成的贮存溶液中，以密度0.1-2×10⁷cfu/ml再悬浮。这些悬浮液以1ml等份被分配到1.5ml的无菌硼硅酸盐冷冻管中，然后放置在-80℃。

普通分子生物学技术

限制性内切酶(在此为“RE”)；New England Biolabs Beverly，T4DNA连接酶(NewEngland Biolabs，Beverly，马萨诸塞州)和Taq聚合酶(Life Technologies，Gaithersburg，马里兰州)根据厂家的操作手册使用，质粒DNA使用小批量(Qiagen Miniprep^R kit，Santa Clarita，加州)或大批量(Qiagen Maxiprep^R kit，Santa Clarita，加州)的质粒DNA纯化试剂盒，根据厂家的操作手册(Qiagen，Santa Clarita，加州)进行制备；无核酸酶，分子生物学级别的milli-Q水，Tris-HCl(pH 7.5)，EDTA pH 8.0，1M MgCl₂，100％(v/v)乙醇，超纯的琼脂糖和琼脂糖凝胶电泳缓冲液是从Life Technologies(Gaithersburg，马里兰州)公司购买。限制性内切酶消化、PCR、DNA连接反应和琼脂糖凝胶电泳是按照已知的步骤实施的(Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.1，2，3；1989)；Straus，et al.，Proc Natl Acad SciUSA.Mar；87(5)1889-93；1990)。下文中描述的用来验证每个重组质粒DNA序列的核苷酸序列是通过传统的DNA自动测序技术，使用Applied Biosystems公司的自动测序仪(型号为373A)来完成。

PCR引物是从供应厂商例如Sigma(St.Louis，密苏里州)公司购买，并且通过使用Applied Biosystems公司的DNA合成仪(型号为373A)进行合成。PCR引物的使用浓度是150-250mM，并且用软件Clone manager software version 4.1(Scientific and EducationalSoftware Inc.，Durham，北罗卡莱纳州)确定PCR反应的退火温度。PCR在型号为400880的Strategene Robocycler(Strategene，La Jolla，加州)中进行。用于扩增的PCR引物通过使用Clone

software version 4.1(Scientific and Educational Software Inc.，Durham，北罗卡莱纳州)来设计。该软件能够设计PCR引物并且能识别与被操作的特定的DNA片段相适配的RE位点。PCRs在热循环仪器中进行，例如型号为400880的Strategene Robocycler(Strategene)，并且PCRs中引物退火、延长和变性的时间根据标准程序来设定(Straus et al.，supra，1990)。RE消化和PCRs随后通过琼脂糖凝胶电泳按照标准程序来分析(Straus et al.，supra，1990；and Sambrook et al.，supra，1989)。阳性克隆被定义为是显示合适的RE模式和/或PCR模式的克隆。通过该步骤识别的质粒也可以如上所述使用标准DNA测序步骤被进一步评估。

大肠埃希氏杆菌菌株，例如DH 5和Sable 2R，是购买自Technologies(Gaithersburg，马里兰州)，并且如下面的实施例所述，是作为重组质粒的起始寄主。重组质粒通过使用高压电脉冲仪器例如Gene Pulser(BioRad Laboratories，Hercules，加州)经电穿孔被引入进大肠杆菌，操作设置在100-200W、15-25mF和1.0-2.5kV，如文献(Straus et al.，supra，1990)所述。最佳的电穿孔条件是通过导致每个细菌DNA微克数的最大转化效率的设定来确定的。

按照该厂家的说明，菌株在胰蛋白酶水解的(tryptic)豆胨琼脂(Difco，Detroit，密歇根州)或胰蛋白酶水解的豆胨培养液(Difco，Detroit，密歇根州)中培养。除非另有说明，所有细菌都是在37℃、5％CO₂(v/v)、轻度振荡下生长。在适当的时候，在培养基中添加抗生素(Sigma，St.Louis，密苏里州)。菌株于-80℃下在含有30％(v/v)甘油(Sigma，St.Louis，密苏里州)的(Difco)中以每毫升约10⁹个菌落形成单位(在此称为“cfu”)悬浮保存。

卡介苗中的等位基因交换

现有技术教导了将改变的等位基因引入到分枝杆菌菌株的方法，并且本领域的技术人员也能解释并实行此方法(Parish et al.，Microbiology 146：1969-1975；2000)。一种产生等位基因质粒交换的新方法需要合成的DNA。该方法的优点在于质粒产物有高度明确的来历，并且与政府的规章相适应。反之，以前的使用方法虽然有效，但是缺乏实验室培养记录，因此不大可能被应允。如果产品要被美国和欧洲权威机构许可在人的身上使用，就必需与该法规相适应。

在分枝杆菌中用于等位基因交换的自杀载体是一个质粒，它可以在大肠杆菌中复制，但是不能在分枝杆菌例如结核分枝杆菌和卡介苗中复制。本发明中的用于等位基因交换步骤的具体的自杀载体不是很重要，可以选自学术(Parish et al.，supra，2000)和商业来源。一个用于等位基因交换的较好的自杀基因的设计如图1所示。该质粒包括以下几个DNA片段：oriE序列是用于质粒在大肠杆菌(基因库登录号L09137)中复制的，卡那霉素抗性序列用于在大肠杆菌和分枝杆菌(基因库登录号AAM97345)中进行筛选的，另一个抗生素选择标记(例如zeocin抗性基因(基因库登录号AAU06610)，是受分枝杆菌启动子(例如hsp60启动子)控制的。第二个抗生素选择标记不是必需的，但是被包括时，会使得双重筛选能抑制在等位基因交换过程中自发的卡那霉素抗性分离株的生长晕(Garbe et al.，Microbiology140：133-138；1994)。

这种自杀载体的构建可以通过使用如这里所述的标准重组DNA技术来实现。然而，当前的规章的标准已经增加了引入朊病毒颗粒的恐惧，此病毒颗粒是从和含有BSE-传染物质的牛产品接触的产物中获得的。为了避免将不知来源的物质(比如DNA序列)引入目标菌株，因此将所有的在自杀载体中的DNA通过商业来源(比如Picoscript，Inc.)进行合成是比较合适的。因此，构建自杀载体的较合适的方法就是用DNA软件(例如CloneManager)来汇编DNA序列设计，然后通过任何一个提供此项服务的供应商(比如Picoscript Inc.)在付费的基础上合成DNA。该方法是用来产生一个自杀载体--pAF100(未图示)，然后将它进一步修饰用于本申请中(pAF103，在图1中用示意图描绘，并在表1中进一步描述)。

表1.自杀载体

名称	主链	用于等位基因交换的具体的等位基因
			pAF103	pAF100	leuD基因的1kb侧翼区

这种自杀载体具有优点，例如含有两个抗生素选择标记，因此减少对一种抗生素呈现出抗性的自发突变的选择，这种突变发生率是每代大约1/10⁸。对两种抗生素都自发产生抗性是极度罕见的，每一代发生率在大约1/10¹⁶。因此，培养基中出现双重抗性菌株、被用在等位基因交换步骤上的概率小于1/10⁶。

对于等位基因交换过程中的阴性选择，能赋予蔗糖敏感型的表型的sacB基因(GenomeSeq ID # NT01BS4354)被包含，用于富集培养已经进行最终的DNA重组步骤和完成等位基因交换的菌株。

制剂和接种策略

疫苗制剂的策略是建立在研究的基础上来确定整个制造过程中最大存活率和稳定性。其包括，使用各种经常用到的培养基用于分枝杆菌的培养，包括添加甘油、糖、氨基酸和去污剂或盐，来测定在培养过程中最高生物存活率(从活到死)。培养后细胞通过离心或者正切流向过滤收获，并且再悬浮在能给予冷冻或冷冻-干燥过程中细胞保护的稳定的培养基中。经常使用的稳定剂包括谷氨酸钠，或氨基酸或氨基酸派生物，甘油，糖或经常使用的盐。最后的制剂将提供足够多的活的生物体通过皮内、经皮注射、输液或口服而被释放，具有足够的稳定性来维持以及可用于分布和使用的足够的储存期。

结核病疫苗的临床前评估

一般的安全性试验

六只一组BALB/c老鼠用研究中的2×10⁶CFU重组卡介苗和类似的亲本株进行腹膜内感染。动物在感染后14天内被监控一般的健康和体重。接受卡介苗和重组卡介苗的动物保持健康，在观察期内即没有体重减轻，也没有显示出明显的疾病症状。

新的重组卡介苗菌株在具有免疫能力的小鼠中的毒性

15只具有免疫能力的BALB/c小鼠分别用2×10⁶个重组卡介苗和卡介苗亲本株进行静脉内感染。感染后的第一天，每组三个小鼠被处死，并分析脾、肺和肝中的菌落形成单位CFU，以确保每个动物有相同的感染剂量。在感染后的第4、8、12、16周，每组处死三个小鼠，检测脾、肝和肺中的CFU，与亲本卡介苗菌株相比，用来评估重组卡介苗在体内的生长。预计重组卡介苗显示出与亲本株卡介苗相似的毒性。

免疫功能不全的小鼠的严格安全性试验

拥有SCID(重症联合免疫缺陷病)的免疫功能不全的小鼠10只一组分别用2×10⁶cfu的重组卡介苗和亲本株卡介苗菌株进行静脉内感染。感染后的第一天，每组三个小鼠被处死，评估脾、肝和肺中的菌落形成单位CFU，用来验证接种剂量。每组中剩下的七只小鼠被监控一般的健康和体重。追踪这些小鼠的存活，当整个观察期内重组卡介苗感染的小鼠的存活不比亲本株感染的动物差时，这就是成功的结果。

豚鼠的安全性试验

与在人身上已经很好地建立了安全性轮廓的亲本株卡介苗疫苗相比，重组卡介苗菌株的安全性也要在豚鼠中被评估。首先，检查疫苗对动物的一般健康状态的影响，包括体重增加。豚鼠用10⁷(接种剂量的100倍)cfu的重组和亲本卡介苗菌株进行肌肉注射接种，并且监控动物的一般健康和体重六周。对死在六周前的动物进行尸体解剖检查。在感染后的六周末，所有的动物都被处死，进行宏观病理学研究。在六周后的尸体解剖中，体重没有减轻，没有异常行为并且所有的器官都显示正常。当重组卡介苗-Pfo疫苗对健康没有不利的影响、并且动物的体重增加与用亲本株接种的动物相比以正常的速度增加时，这就表明了这是个成功的试验。

同时，动物器官中的细菌水平也被监控。对用亲本株或重组卡介苗疫苗接种的豚鼠在接种后在不同的时间间隔内使之安乐死，之后在肺、脾和局部(腹股沟)淋巴结处检测卡介苗或重组卡介苗的cfu.

毒性试验

为了评估重组卡介苗的毒性，分别用人类使用的重组卡介苗菌株、卡介苗菌株或盐水以一倍剂量、高于单剂量的四倍、低于单剂量的四倍，对每组的12只豚鼠进行皮内接种疫苗。在接种后的第三天，六只动物被处死，来评估疫苗在这些动物身上的急性作用。在接种后的第28天，剩余的六只动物被处死，来评估在这些动物身上的慢性作用。在两个时间点，每只动物的体重被称重，并且检查了宏观病理学和注射部位的外部特性。取血用于血液化学检查，并且检查了内脏器官的组织病理学和注射部位。

测定保护作用的研究

鼠的保护研究

C57Bl/6小鼠(雌性，5-6周龄)13只一组经皮下免疫接种10⁶CFU重组卡介苗、亲本卡介苗和盐水。另一组小鼠作为健康对照。接种后八周，通过包含总共10⁷CFU的攻击菌株的10ml单细胞悬浮液的气雾剂，小鼠被结核分枝杆菌Erdman菌株(或H37Rv卡那霉素抗性菌株)攻击，如前所述，这个剂量释放100个活性细菌到每个动物的肺部。监控实验动物以及没有被攻击的动物的存活率。攻击后，紧接着监控动物的体重损失和常规的一般的健康状况。攻击后的第一天，每组三个小鼠被处死，检测CFU来确定攻击的剂量，还有一只被处死用于脾和肺的组织病理学。攻击后的五周，每组九只动物被处死，进行动物的组织病理学检查和微生物学分析。来源于六只小鼠的肺和脾组织的cfu计数被评估(用带有选择性添加物的平板区分疫苗菌株和攻击菌株)。如果用H37Rv-卡那霉素抗性菌株攻击，将用卡那霉素或TCH区分攻击菌株和疫苗菌株。如果结核分枝杆菌Erdman菌株用于攻击，将用TCH区分疫苗菌株和攻击菌株(卡介苗是敏感的，但结核分枝杆菌是自然抗性的。)

皮肤迟发型超敏反应(DTH)的诱导

无特异病原的(SPF)豚鼠用10³个重组卡介苗或卡介苗亲本株经皮内接种。接种后九周，动物的背部被刮毛，经皮内注射含有10μg PPD的100μl磷酸盐缓冲溶液。24小时后，硬块的直径被测量。重组卡介苗菌株诱导的DTH相等或大于被亲本卡介苗菌株诱导的DTH。

豚鼠的攻击研究

为了确定重组卡介苗疫苗针对肺结核分枝杆菌攻击的效力，豚鼠12只一组，分别用重组卡介苗、亲本卡介苗菌株或盐水来免疫(年轻成年SPF Hartley，250-300克，雄性)。疫苗和对照用10⁶cfu经皮内给药。接种后10周，重组卡介苗、卡介苗和假的免疫的动物将被含有结核病分枝杆菌的气雾剂攻击，气雾剂来自于总共含有10⁷cfu的结核病分枝杆菌的10ml单细胞悬浮液。如前所述(Brodin et al.，J Infect Dis.190(1)，2004)，该步骤释放了大约100个活性细菌到每个动物的肺部。攻击后，监控动物以及没有被接种的健康组、没有被攻击的动物的存活率。攻击后，监控动物的体重损失和一般的健康状况。攻击后10周，每组六只动物被处死，每组剩余的六只在攻击后70周进行长期评估。在两个时间点，都要进行动物的组织病理学检查和微生物学分析。肺和脾组织的组织病理学和cfu计数被评估(用带有选择性补充物的平板区分疫苗菌株和攻击菌株)。如果用H37Rv-卡那霉素抗性菌株攻击，将用卡那霉素或TCH区分攻击菌株和疫苗菌株。如果用肺结核分枝杆菌Erdman菌株攻击，将用TCH(卡介苗是敏感的，但是肺结核分枝杆菌是自然抗性的)区分疫苗菌株和攻击菌株)。当假的免疫的动物在攻击后迅速的死去、而用重组卡介苗免疫的动物比用卡介苗亲本株免疫接种的动物存活的长时，则表示成功。

灵长类动物的安全性和攻击性研究：

近年来，猕猴被用作针对结核病分枝杆菌的疫苗的评估。在人类和非人类灵长类动物之间的演化关系和肺结核在这些物种上相似的临床和病理学的表现使得非人类灵长类动物模型用于肺结核疾病和疫苗效力的实验研究很有吸引力。

该模型，肺部空泡的发展作为特征，显示出可以运用到人类的结核病上。感染和疾病的过程被X光追踪并测定体重减轻和各种血液实验，包括红细胞沉降率(ESR)、外周血单核细胞(PBMC)增殖和细胞因子产生、细胞毒性T细胞(CTL)活性、和抗体应答。感染后，猕猴特发展成有特征性病变的肺部病症，并且取决于攻击的剂量，在感染后的四-六周内由于急性的呼吸道感染而死亡。低的感染剂量可以导致没有疾病的慢性感染，更像在人类体内。

研究设计

这项研究将直接比较不同剂量的卡介苗亲本菌株与重组卡介苗菌株，单独给药或继之以用含有重组卡介苗构建中过量表达的序列的疫苗来两次加强免疫。后者可以作为基于合适的佐剂的重组蛋白、DNA或Ad35构建体而被释药。

第一项研究评估了在没有免疫加强的情况下亲本株卡介苗对比重组卡介苗构建体的保护效果。这项研究包括了三个组(每个组10只动物)，设计如下：包括卡介菌、重组卡介苗和盐水各个一组。每个组有两只动物用重组卡介苗构建体过量表达的抗原做皮肤测试，以及用标准PPD和盐水作对照。与卡介苗相比，重组卡介苗组阳性的和大的硬块表明了体内疫苗的摄取和引发了免疫应答。每组的剩余的八只动物被低剂量的结核病分枝杆菌Erdman菌株气雾剂攻击，并且通过攻击后16周的细菌负荷的减少或结束时的存活率测定保护作用。

随后的卡介苗致敏步骤与上面所述的基本一样，不同的是动物首先用卡介苗、重组卡介苗和盐水接种后，接着用过量表达的抗原两次加强免疫。

非人类灵长类动物模型中的免疫原性和保护作用的研究目的在于研究猕猴肺结核的免疫生物学和免疫病理学方面，用于重组卡介苗构建体的效力研究。这些动物是被笼养的青少年到青壮年动物，在开始试验前经全面调控平均体重从2到3Kg。接种前的研究包括基准的血液测试，包括常规的血液学研究和红细胞沉降率以及淋巴细胞增殖分析。用PPD测定的皮肤试验是用来确保对结核菌缺乏敏感性，以及获得胸部X光作为感染前概况的一部分。免疫接种期间总体持续21周，包括在0周时用卡介苗或重组卡介苗的最初的免疫接种和在12和16周时的抗原免疫加强。抗原特异性免疫是通过淋巴细胞刺激试验中测定增殖和干扰素γ(IFNγ)的分泌来进行评估。淋巴细胞产生IFNg的频率通过酶联免疫吸附试验(ELISPOT)或荧光活化细胞分类器(FACS)确定。最后，血样在相对于最初接种免疫0、4、8、12、16、20周时采集。

在上次免疫后的四到六周时，在同一天用相同的制备的3ml(1,000cfu)的结核病分枝杆菌Erdman经气管装置攻击动物。评估感染过程的体重减少、发热、升高ESR、DTH至PPD、体外PPD刺激的PBMC的增殖反应和重组卡介苗过量表达抗原后的生成的IFN-g水平的测定。进行胸部的X光检测来检查与肺部肺结核病相一致的异常情况，最后，在攻击后的12-16周时进行尸体剖检。

结核病载体和疫苗的临床评估

安全性和毒性研究：按照规章指南的要求进行的临床前的安全性和毒性研究作为上述的临床前毒性和安全性研究，这些研究之后接着要进行人的安全性研究。这些研究最初在健康的Quantiferon阴性成年人身上进行，接着年龄降低在孩子和婴儿身上进行。

免疫原性研究：小鼠和灵长类动物的免疫原性研究可以使用但不限于评估细胞免疫的标准方法，例如短期和长期抗原或肽刺激下的INFγ、ELISPOT和/或流式细胞术。相似的方法学被使用在人体反应的评估上。四聚物研究被运用在人接种后的CD4和CD8反应的评估上。

致敏-加强策略的优化；重组卡介苗可很好地作为针对肺结核或其他的疾病的单一疫苗，为此它被工程化为能表达相关的转基因。在此处使用的，“转基因”是与分枝杆菌的启动子功能性地连接并能表达所研究的蛋白的DNA片段。此处描述的重组卡介苗作为肺结核病的疫苗或表达转基因保护避免其他疾病，也可以用重组蛋白与辅助剂或病毒或细菌携带的抗原混合，在致敏免疫系统用于加强免疫上很好地工作。在动物的临床前研究和人的研究上，卡介苗致敏接着被重组蛋白/辅助剂或载体加强免疫，其体系和剂量被优化。因为卡介苗致敏的效力，这些致敏加强策略是将免疫力引入人体中的最有效的方法，特别体现在本发明中，接着通过重组蛋白或载体集中和提高免疫系统的加强反应。

在动物中接触后的治疗疫苗研究

C57BL/6小鼠被用于建立潜伏期感染；在低剂量的感染诱导可忽略不计的肺结核分枝杆菌特异性免疫时的时间点，以及，在肺结核分枝杆菌特异性免疫减少和被记忆T细胞占优势的那个时间点，治疗的疫苗将给小鼠接种。疫苗治疗的优点将在小鼠上次治疗疫苗释药后的二和五个月中通过在个体小鼠的肺和脾中cfu计数来评估。用标准统计方法分析小鼠组的cfu计数，并且结果将用来表明治疗疫苗是否显著地减少潜伏的肺结核分枝杆菌对小鼠的感染；在必要时相似的方法学可以用在其他动物反应的评估上。

卡介苗载体的临床评估：重组卡介苗的口服给药

本发明中用重组卡介苗对目标动物的口服接种也可以用以前描述的方法完成(Miller etal.，Can Med Assoc J 121(1)：45-54；1979)。口服给药重组卡介苗的量将取决于受试者的种类以及疾病或被治疗的状况而不同。一般地，采用的剂量大约是10³至10¹¹个活生物体，更优选10⁵至10⁹个生物体。

重组卡介苗通常与药学上容许的的载体或稀释剂一起给药。具体的药学上允许被使用的载体或稀释剂对本发明来说不是关键性的。稀释剂的例子包括：磷酸盐缓冲溶液，缓冲胃中胃酸的缓冲溶液例如含蔗糖的柠檬酸盐缓冲溶液(pH7.0)，单一的碳酸氢盐缓冲溶液(Levine et al，J.Clin.Invest.，79：888-902；1987；and Black et al.，J.Infect.Dis.，155：1260-1265；1987)，或者含有抗坏血酸、乳糖和任选的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的碳酸氢盐缓冲溶液(pH7.0)。载体的例子包括：蛋白质例如在脱脂奶中发现的蛋白质，糖类例如蔗糖，或者聚乙烯吡咯烷酮。一般地这些载体在浓度大约是0.1-90％(w/v)是被使用，在1-10％(w/v)的范围时更合适。

实施例

实施例1.亲本卡介苗菌株在豚鼠中的效力：重组卡介苗30对豚鼠的保护作用研究。

举一个用现有的重组卡介苗30疫苗进行的研究的实施例，进行大规模的豚鼠研究目的在于比较两个批次的重组卡介苗30和亲本卡介苗Tice菌株自身、以及其他在全世界人身上使用的市场上可买到的的卡介苗菌株(SSI——1331菌株)相比的保护效力。这两个批次的重组卡介苗30，或者在实验室条件下生产(重组卡介苗30-UCLA)，或者在GMP条件下制备(重组卡介苗30-KIT)用于人类使用。

豚鼠(每组10只动物)通过皮下注射途径用每种卡介苗疫苗的10³cfu的单剂量免疫。在本研究中包括了一个阴性对照组(用盐水免疫)。在接种后的第八周，动物被有毒的Erdman菌株通过气雾剂途径攻击，通过校准Middlebrook空气传染装置的喷雾器小室释放大约10-15个细菌到肺部。动物在攻击后的第10周被处死。在尸体解剖中，肺和脾从动物身上取出，活菌的数量通过在培养基Middlebrook 7H11上用依次10倍稀释的肺叶和脾的组织均浆涂平板来确定。在37℃、5％(v/v)CO2下培养21天后计数形成的细菌菌落。数据以回收的细菌的平均值的log10来表示。

结果(图2)显示与阴性盐水对照相比，所有的疫苗针对肺结核分枝杆菌的攻击都有保护作用，疫苗之间的不同趋向于下述两组：

重组卡介苗30(UCLA)和卡介苗Danish 1331具有更多的保护性；以及

卡介苗(亲本Tice菌株)和重组卡介苗30(KIT)有较少的保护性。

因此，可合理地得出结论：在实验室条件下产生、而非GMP条件等级的重组卡介苗30(UCLA)，显示能诱导出比亲本Tice菌株更好的保护作用，但此保护效果最多也只能比得上市场上可买到的卡介苗SSI。因此，卡介苗Danish 1331的改善应当成为产生新的重组卡介苗疫苗的目标。

实施例2.构建寄主作为没有抗生素抗性标记的表达载体的携带者

敲除卡介菌Danish 1331菌株的leuD基因的质粒构建：LeuD基因的左、右1kb侧翼区通过DNA合成(DNA2.0，CA)组装在一起，形成了两端带有pacI位点的2kb的DNA片段。使用PacI限制酶消化之后连接，该DNA片段被克隆进上述等位基因交换质粒，形成了LeuD敲除质粒。

LeuD基因的等位基因灭活：LeuD基因的灭活按所述的方法进行，除了将50μg/ml亮氨酸添加到LeuD基因敲除的菌株的培养基中。该操作的主要步骤的流程图在图4中给出。

LeuD敲除的验证：

表型试验：测试获得的菌株的生长对亮氨酸的依赖性。具体地，该细菌在存在或缺乏50μg/ml亮氨酸的情况下，在含有10％OADC和0.05％(v/v)四丁酚醛添加物的7H9培养基中被培养，通过测量OD₆₀₀值监控细菌的生长。

基因组区域序列分析：构建的菌株的基因组DNA如上面描述的方法被制备。与目标基因左、右1kb侧翼区互补的引物对被用于PCR扩增，由染色体得到一个大约2kb的片段。该PCR产物被测序来确证该区域的leuD基因的缺失。

ΔlysA卡介苗菌株：与上面所述的步骤相似，我们已经由Danishi 1331的衍生物构建了ΔlysA卡介苗菌株，其也表达被引入到ureC位点的突变的pfoA等位基因，允许生物体逃离增加的MHC I类的提呈抗原的吞噬体。LysA基因编码内消旋二氨基庚二酸盐脱羧酶(DAPDC)。此酶催化赖氨酸的生物合成途径的最后步骤，通过吡哆醛-5′-磷酸酯(PLP)依赖机制将内消旋二氨基庚二酸(DAP)转化成L-赖氨酸。在免疫功能不全的的小鼠中结核病分枝杆菌H37Rv的lysA基因被确定对于细菌的存活是必须的，说明了新的生物合成的赖氨酸对于在体内存活是至关重要的，并表明了与赖氨酸营养缺陷型互补的质粒应当在体内和体外都是被稳定携带的。菌株通过使用本领域技术人员熟悉的方法经噬菌体转导而被创建。

实施例3.在重组卡介苗菌株中过量表达肺结核分枝杆菌抗原

DNA操作：肺结核分枝杆菌的抗原TB10.4(Rv0288)、Ag85B(Rv1886c)和Ag85A(Rv3804c)，使用来自Ag85B plus Rv3130的启动子按照描述的顺序(Florczyk et al.，supra，2003)被多顺反子地(polycistronically)表达。具有KDEL序列编码肽段的DNA序列被放置在抗原的末端，作为内质网保留信号来提高每个抗原的抗原提呈。另外，设置5’-环状结构和3’-转录终止子序列用来确保转录的多顺反子mRNA的稳定性。最终，限制性内切酶PacI序列被用在两个末端的侧翼，以便将表达盒克隆进表达载体。所有表达盒里的DNA通过基因合成被制备(Picoscript Inc，TX)。表达盒通过使用PacI位点被克隆进表达载体。在大肠杆菌中扩增后，质粒被NdeI消化以除去oriE和卡那霉素抗性基因，接着通过连接产生单向穿梭载体，然后使用标准电穿孔步骤(Parish et al.，Microbiology，145；3497-3503；1999)被引入到分枝杆菌leuD营养缺陷型突变体中。图3用示意图描述了示范性的非抗生素表达载体。

使用非抗生素选择系统的肺结核分枝杆菌抗原的表达：卡介苗Danish 1331的亮氨酸自养型，被用作非抗生素选择系统的寄主，在添加10％OAD(油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶)、0.05％(v/v)四丁酚醛和50μg/ml亮氨酸的7H9培养集中培养。在电穿孔后，含有抗原表达质粒的重组菌株在没有亮氨酸的情况下通过涂布在7H10平板(BD Difco)上而被分离。该细菌的存活是取决于通过质粒的leuD基因的抗原表达，其反过来又作为维持细胞中的质粒的机理。生成的单个菌落被分离，并培养在上述的7h9培养基中，除了没有亮氨酸添加物。

表达的验证：每个抗原的表达经过蛋白印迹(Western blot)分析来检测。具体来说，培养物的上清液被收集，并按照以前描述的方法进行处理(Harth et al.，Infect Immun65(6)：2321-2328；1997)。然后表达的抗原在SDS-PAGE凝胶电泳上分离，并与抗原85A、85B和10.4的抗体杂交。通过定量测定每个特定条带的强度，与表达质粒阴性寄主产生的条带相比较，来评估每个抗原的表达水平。

实施例4.在没有抗生素选择性的分枝杆菌中表达选定的抗原

材料和方法：

用于电穿孔的质粒和分枝杆菌的制备：重组质粒DNA被分离并被限制性内切酶NdeI(New England Biolabs)消化，释放出抗生素选择标记(例如抗卡那霉素)和大肠杆菌复制区域的起始点(OriE)。然后，根据产品说明，被消化的质粒DNA片段用T4DNA连接酶(NewEngland Biolabs)环化。生成的质粒，含有分枝杆菌复制起始点和选定的抗原，没有抗生素抗性基因，不能在革兰氏阴性细菌中复制，将此质粒引入到选定的分枝杆菌中。为了制备用于电穿孔的分枝杆菌，卡介苗Danish 1331细菌于37℃下在含有10％OADC添加物的Middlebrook 7H9培养基(BD Biosciences)中培养到指数生长期。Tyloxapol(0.05％v/v，Research Diagnostics Cat.No.70400)被用来分散细菌。细胞在10％甘油加0.05％四丁酚醛中清洗三次，在电穿孔前除去培养基。每次电穿孔，每1.25×10⁸个细菌细胞使用1.6μg质粒。电穿孔在2.2kV、25μF电容和1.0kΩ电阻下进行。电穿孔后，细胞以10倍连续稀释涂布在Middlebrook 7H10琼脂(BD Biosciences)的平板上，并在37℃下孵育。

含有表达质粒的细菌菌落的PCR筛选；

重组菌株通过PCR进行第一次筛选，使用正向引物GTTAAGCGACTCGGCTATCG(SEQ ID NO：1)和反向引物ATGCCACCACAAGCACTACA(SEQ ID NO：2)扩增表达质粒中的oriM区域的DNA序列。PCR参数如下：第一步：95℃4分钟，一个循环；第二步：95℃1分钟，60℃1分钟，接着72℃1分钟，总共30个循环；第三步：72℃10分钟，1个循环。第四步：4℃储存。生成的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析来确证细胞中质粒的存在。

结果

被设计用于扩增质粒起始点(OriM)的PCR是用来筛选生成的含有过量表达质粒的菌落。因为这个区域不在细菌的染色体中，细胞中该区域的存在强烈的暗示了质粒已经被引入细胞中。在被筛选的重组卡介苗的菌落中，一些菌落产生PCR产物，正如通过凝胶电泳分析的一样，其在大小上与质粒阳性对照反应类似。相反，亲本卡介苗细菌不能产生任何PCR产物，如图5所示。该试验提供了初步证据，即质粒已经成功的被引入到分枝杆菌中，并且含有质粒的细菌的克隆在没有使用抗生素选择的情况下被分离出来。

讨论

常规的用在重组分枝杆菌菌株上的质粒包括复制区和选择标记(通常是抗生素抗性基因，例如抗卡那霉素或补偿代谢缺陷的基因，比如leuD或asd(Galan et al.，Gene，94：29；1990))，作为必不可少的质粒元件用于重组DNA的实验。一般的，抗生素是用来选择含有重组质粒克隆的。然而，这就面临着一个危险，在被抗生素抗性遗传修饰的生物体将要被用于实验室之外的情况下，抗生素抗性基因被无意地传播开来。

在上述的研究中，我们引入了一个能表达抗原的重组质粒到细菌中，它既不包含oriE区域也不包含抗生素选择标记，并且在没有使用选择的情况下成功地分离了含有质粒的克隆。虽然现在的实验使用oriM作为质粒的复制区，但是可以预见到其他的质粒复制区也可以作为替换物，例如pMF 1复制区(Bachrach et al.，Microbiol.，146：297；2000)。该系统独有的优点在于重组质粒不再带有抗生素抗性基因。因此，它就不会像当前通常使用的表达质粒一样，将抗生素抗性基因无意地传播到环境中。另外，本发明的单向穿梭载体表达质粒不能再在广泛的寄主范围内复制，因为能够复制的基因元件被删除了。该限制对重组质粒加了第二个层次的限制，因此显著减少了将遗传修饰生物体(GMO)释放到环境中的风险。

尽管现在的结果显示，在没有选择性的情况下将重组质粒引入减毒的分枝杆菌菌株中是有可能的，但是其他的因子可能在分枝杆菌中无选择标记的质粒的稳定性上起到作用。因此，复制区域包括的基因可以促进质粒的复制并介导质粒分离进入同胞细胞中，从而使得具有不经选择就能识别含有质粒克隆的能力。

不经选择就能分离含有质粒的克隆的一个可能的因素是在当前方法中使用了较高的质粒对细胞的比例。这种较高的质粒对细胞的比例增加了细胞接受质粒的概率，减少不含质粒的细胞数目。在本项研究中，质粒对细胞的比例比利用选择系统的常规方法中用到的比例高了大约10倍。在理论上，更高的质粒与细胞比例会导致更多含有质粒的克隆，直到到达质粒饱和的临界点，其可能抑制质粒DNA被电穿孔的细胞接受。在本发明的较好的具体实施方案中，质粒与细菌的比例是大约0.5μg到10μg质粒DNA对应大约1.25×10⁸个细菌细胞，更好的是1μg到5μg质粒DNA对应1.25×10⁸个细菌细胞。

另外，肺结核病的抗原被质粒pAF105过量表达，可能在质粒稳定性上起到重要的作用。该质粒过量表达抗原85复合物(Ag85A(Rv3804c)和Ag85B(Rv1886c))的两种蛋白质，两者都有分枝酰转移酶(mycolyltranferase)活性，其在海藻糖二霉菌酸酯的生物合成中是必需的，海藻糖二霉菌酸酯是维持细胞壁完整的必需的主要结构。因此，如果无选择性质粒给予了包含该质粒的细胞的生长优势，则过量表达至少一种抗原就有可能对稳定性起到作用，从而不经选择就能够识别含有质粒的克隆。

比较例：分枝杆菌中抗原的过量表达

根据在此处描述的步骤，我们已经构建了一种菌株，其能不经抗生素选择而由质粒稳定地过量表达肺结核分枝杆菌抗原85A、85B和TB10.4。编码Ag85A、Ag85B和TB10.4的基因被编码在处于Ag85B启动子转录控制下的被称为pAF-105的oriM质粒上。Ag85A和85B在培养物上清液中的过量表达如图6所示。该菌株，在下文中被称为AFRO-1，显示出在体外培养和在豚鼠中都能稳定地维持质粒。

为了比较AFRO-1和卡介苗的免疫原性和保护效果，C57Bl/6和BALB/c小鼠(15只小鼠/组)经皮下注射用5×10⁵CFU的一种或另一种疫苗免疫接种。8周后从每组3只小鼠中制备脾细胞，培养3天后通过测定上清液中的IFN-γ来评估对分枝杆菌抗原的回忆应答(图7)。在图7中，C57Bl/6小鼠(图A-C)和BALB/c小鼠(图D-F)没有被接种(图A、D)、或者经皮下注射接种了5×10⁵CFU的卡介苗1331(图B、E)或重组卡介苗AFRO-1(图C、F)。接种后第八周，每组3只小鼠被处死，脾细胞被分离、汇集，并且在体外用Ag85A、Ag85B、TB10.4、Ag85复合物或CFP刺激3天。通过ELISA测定培养物上清液中的IFN-γ。柱状图是3个重复孔的平均值±标准偏差。参照图7，在C57Bl/6小鼠中未检测出卡介苗的免疫应答(图B)。然而，在C57Bl/6和BALB/c小鼠的脾细胞中，AFRO-1诱导了针对分枝杆菌抗原的显著的IFN-γ反应应答(图C和F)。虽然卡介苗在BALB/c小鼠中诱导了显著的IFN-γ反应应答(图E)，但不像在C57Bl/6小鼠中(图B)那样，AFRO-1尤其增强了对CFP的应答，这也许是由于与单个抗原相比CFP有较复杂的成分。

该实验中剩余的每组12只小鼠(图7)在用卡介苗或AFRO-1重组卡介苗接种八周后的通过气雾剂用毒性的结核病分枝杆菌攻击。具体而言，参照图8，C57Bl/6(图A、B)或BALB/c小鼠(图C、D)在用5×10⁵CFU的卡介苗1331或者重组卡介苗AFRO-1接种八周后，动物被通过气雾剂感染大约100CFU毒性结核病分枝杆菌Erdman KO1菌株。小鼠被处死，并且肺(图A、C)和脾(图B、D)被匀浆化并涂布在7H10琼脂板上来测定细菌负荷。柱状图代表每组12只小鼠的平均值±SE(标准偏差)。在柱状图上面的数字是相对于未接种的对照动物的减少的百分比。尽管AFRO-1与卡介苗相比增强了免疫原性，但是卡介苗和AFRO-1接种都导致了C57Bl/6和BALB/c小鼠中肺(图8，图A、C)和脾(图8，图B、D)的分枝杆菌负荷的显著并且大致相等的减少。

当接种与攻击之间的间隔从8周延长至17周时，我们同样比较了AFRO-1和AFV-12与卡介苗在BALB/c小鼠中保护作用(图9)。BALB/c小鼠(20只/组)经皮下注射接种了5×10⁵CFU标准的、冻干的卡介苗1331、在液体培养基中的卡介苗1331、AFV-102重组卡介苗、或者AFRO-1重组卡介苗。在17周后，这些小鼠被通过气雾剂感染毒性的结核病分枝杆菌，并在感染后第13周处死。肺(图A)和脾(图B)被匀浆化并涂布在7H10琼脂板上以便测定细菌的负荷。柱状图代表每组20只小鼠的平均值±SE。在图9中，柱状图上面的数字是相对于未接种的对照动物的减少的百分比。图9显示了在17周后，被接种的小鼠被气雾剂的结核病分枝杆菌攻击，并且在13周后处死来测定的细菌的负荷。所有的疫苗菌株在肺(图A)和脾(图B)中引发了相等的保护作用，与未接种的动物相比，每种疫苗减少了大约1log的分枝杆菌数量。尽管在保护方面重组卡介苗没有优于卡介苗、或者AFRO-1没有优于AFV-102的明显优势，但这有可能只是反应了用于评估肺结核疫苗的小鼠模型的局限性。

我们因此在豚鼠中延伸这些研究来确定AFRO-1重组卡介苗的免疫原性和保护作用。图10显示了当豚鼠(20只动物/组)被单剂量的卡介苗或AFRO-1重组卡介苗接种时的结果。参见图10，Hartly豚鼠(每组20只)经皮内接种1×10⁴CFU标准的、冻干的卡介苗1331(黑色柱)，或者接种在液体培养基生长中的1×10⁴CFU或1×10⁵CFU的卡介苗1331或AFRO-1重组卡介苗。在10周后，每组3只动物被处死，并且它们的肺和脾被摘除。制备来自于这些组织的单细胞悬浮液，并且在体外用Ag85A、Ag85B、TB10.4和PPD刺激24小时。接着，来自细胞的RNA被纯化，被反转录成cDNA，并且使用对豚鼠IFN-γ(图A)、TNF(图B)和IL-10(图C)特异的引物进行了实时RT-PCR。相对于在未刺激的细胞中的每个基因的表达量，计算每个基因的诱导倍数。柱状图是3个动物的平均值±标准偏差。注意，对于不同的细胞因子和不同的刺激以及必要应用的不同规模，表达量也有很大的不同。

用卡介苗接种的豚鼠的肺细胞和脾细胞对单个分枝杆菌抗原的应答表达了很少的IFN-γ，虽然它们确实对较复杂的PPD的刺激有应答。正相反，用AFRO-1接种的动物的肺细胞对所有3种分枝杆菌刺激的应答大大增加了IFN-γ的表达量，同时在AFRO-1接种的动物的脾细胞中也观察到了对这三种抗原的显著的应答(图10，图A)。肺细胞和脾细胞中对单个分枝杆菌抗原的应答只是轻微地诱导了高于基线的TNF的表达，虽然注意到在PPD刺激之后脾细胞中TNF转录有很大上调(图10，图B)。最后，当Ag85A被用来刺激AFRO-1接种的豚鼠的脾细胞时，IL-10的表达极强烈地诱导(图10，图C)。每组中剩余的17只豚鼠被攻击，并在10周后被处死，以便对在动物肺和脾中的细菌负荷进行计数。

虽然动物之间每个器官上分枝杆菌的数目有很大不同，但是AFRO-1和卡介苗对于肺结核分枝杆菌的攻击给予了保护作用(图11)。参见图11，接种十周后，剩余的每组17只豚鼠被用肺结核分枝杆菌Erdman气雾剂攻击，并且在攻击10周后，肺和脾上的细菌负荷通过将器官的匀浆涂布在7H10琼脂板上来确定。柱状图代表17只豚鼠的平均值±标准偏差。虽然每组中动物之间的差异很大，但是在本研究中卡介苗和AFRO-1重组卡介苗给予了相似程度的保护作用这一点是很清楚的。然而，差异的程度是没有预料到的，本研究会被重复来确证这些结果。而且，将这些数据综合起来考虑，AFRO-1重组卡介苗显示出是安全的，在小鼠和豚鼠中比卡介苗更具免疫原性，并且有至少与卡介苗一样的保护作用。

与单个疫苗或者用相同、同种疫苗作为加强剂的疫苗相比，使用异种疫苗的“致敏-加强”疫苗策略能诱导出更强的细胞免疫应答。因此，对于可能的儿童疫苗体系，受试者将会用改进的重组卡介苗菌株致敏，然后用另一个候选疫苗来加强。以前已经表明，我们重组的Ad35载体化的肺结核疫苗(在此称为Ad 35-TBS、AERAS-402)能在卡介苗致敏的小鼠中加强免疫性，我们评估当小鼠首先用我们的重组卡介苗AFRO-1致敏时是否可以得到更大的作用。于是，小鼠被卡介苗或AFRO-1致敏，然后，10周后，相同的小鼠接受了单剂量的Ad35-TBS肌肉注射加强，在一周后评估对分枝杆菌抗原的免疫应答(图12)。参见图12，BALB/c小鼠经皮下注射用5×10⁵CFU卡介苗1331(图B、D)或AFRO-1重组卡介苗(图C、E)致敏，10周后有些组被Ad35-TBS 5×10⁹毒性颗粒肌肉注射加强(图D、E)。未接种的对照组没有接受任何注射(图A)。一周后从每组6只小鼠中摘除脾，每组的脾细胞被收集，并在体外用Ag85A、Ag85B、TB10.4和CFP以1和5μg/ml刺激3天。用ELISA测定上清液中的IFN-γ。柱状图是3个重复孔的平均值±标准偏差。参照图10，只接受卡介苗或AFRO-1致敏的小鼠的脾细胞当在体外受到分枝杆菌抗原刺激时只产生了很少的IFN-γ(图B、C)。相反，用单剂量Ad35-TBS加强的卡介苗致敏的小鼠的脾细胞当在体外受到刺激时产生了显著较多的IFN-γ(图D)。然而，Ad35-TBS加强的AFRO-1致敏的小鼠诱导脾细胞，与用卡介苗致敏的小鼠的脾细胞相比，在受到刺激时产生多得多的IFN-γ(比较图D和E)。

另外，我们在体外用重叠的分枝杆菌肽刺激后使用细胞内染色(ICS)来分析这些小鼠的脾细胞。在体外用蛋白抗原刺激3天后，用IFN-γELISA较好地评估CD4+T细胞应答，而肽刺激后的ICS能更好地评估CD8+T细胞的IFN-γ应答。此项分析表明，与BCG致敏相比，用AFRO-1致敏在Ad35-TBS增强一周后诱导出更大的CD8+T细胞应答(图13)。参见图13，BALB/c小鼠经皮下注射5×10⁵CFU卡介苗-133或AFRO-1致敏，在10周(图A)或17周(图b)后用5×10⁹个Ad35-TBS病毒颗粒来加强动物。小鼠在1周后被处死，并且脾细胞被重叠的分枝杆菌肽刺激6小时后进行细胞内染色。简而言之，细胞被透化，并且与荧光标记的抗IFN-γ反应，固定，然后用抗CD4和抗CD8标记。细胞用Partec流式细胞仪分析，相对于DMSO单独孵育后的百分比，计算刺激后的IFN-γ阳性的CD8+T细胞的百分比。柱状图代表6只小鼠的平均值±标准偏差。

因此，当我们的AFRO-1重组卡介苗被用于致敏、随后被Ad35-TBS加强的小鼠时，与卡介苗相比显示了更强的免疫原性。在该体系中，AFRO-1的优点反应在能较好评估CD4+T细胞应答的实验上(图12)、以及测定CD8+T细胞的实验上(图13)。

在小鼠模型中表明AFRO-1重组卡介苗比卡介苗有更强免疫原性的这些发现，将被进一步延伸，以便在豚鼠中进行当用两个(不是一个)剂量的Ad35-TBS加强时AFRO-1与卡介苗的比较(图14)。作为较大的研究项目中的一部分，32只一组的豚鼠被卡介苗或重组卡介苗AFRO-1致敏。一个对照组(#1)的17只动物只接受盐水注射，同时另一个对照组(#2)只接受卡介苗的单个疫苗接种。组#3和#4分别在卡介苗或AFRO-1致敏后的第14周、接着第16周，被用Ad35-TBS肌肉注射增强。组#5和#6是这些研究中不相关的分支。接着这些疫苗体系之后，所有的动物通过气雾剂用毒性的肺结核分枝杆菌Erdman菌株感染，并监控超过1年的时间，在此期间，存活率、细菌负荷和肺部的病理学将被评估(图14)。感染将在最后一次加强八周后(本研究开始38周后)进行。动物的存活率将被监控。肺部的组织病理学和细菌负荷将在尸体解剖后确定。因此，这项研究将提供有效性数据，即，当用Ad35-TBS增强时，比较用卡介苗或AFRO-1重组卡介苗致敏的接种体系，以及预计显示当AFRO-1重组卡介苗被用于致敏时比较优越或至少相当的结果。

我们同样也开始了相似的研究来显示一些候选疫苗在非人类灵长类动物上的免疫原性和保护效力(图15)。这项研究的一个分支是当用Ad35-TBS加强两次时直接比较卡介苗和AFRO-1的免疫原性(图15，图A，第1组和第2组)。参见图15的图A，恒河猴(总共33只)被分成6组(图A)。四组用1×10⁴CFU卡介苗(参照菌株SSI-1331，组1、3、4)或AFRO-1重组卡介苗(组2)经皮内致敏。未接种的对照组(#5)只接受盐水注射。组#1和#2在14周后用3×10¹⁰vp Ad35-TBS经肌肉注射加强，然后12周后再一次加强。第3、4、6组是另一个研究的组成部分。如红色箭头(图B)所示，每隔一定时间在所有的猴子身上采血并且用于分析针对分枝杆菌抗原的免疫应答。

图16表明，用AFRO-1致敏的猕猴(见图15A中的第2组)对Ag85A和Ag85b产生了更强的致敏反应，正如通过Ad35-TBS增强前后抗原特异性淋巴组织增殖反应之间的差异被测定的一样。这些动物现在已经被毒性肺结核分枝杆菌Erdman攻击，接着被确定保护作用。

上述的和在该比较例中的研究表明了在重组分枝杆菌中质粒表达抗原，并且表明它们可作为候选疫苗使用。通过使用上述技术，我们也设计出并且已构建出表达其他结核病分枝杆菌抗原(包括Rv3407、Rv3133c、Rv0867c、Rv1884c、Rv2389c、Rv1009和Rv2450c)的重组卡介苗的疫苗，。另外，我们已经构建出表达HIV抗原Gag、Nef、Env、RT的重组卡介苗疫苗，并且连接了来源于大量的HIV蛋白交叉分支的T细胞表位。类似地，我们已经构建了表达部分恶性疟原虫CS蛋白质的重组卡介苗，此蛋白质能诱导强烈的细胞和体液免疫性。这些构建体证明，我们的表达技术的能力并不限于结核病分枝杆菌蛋白，并且我们能从生物体中表达异源抗原，包括真核生物。

序列表

<120>分枝杆菌的电穿孔和抗原在分枝杆菌中的过量表达

<130>PUSWC0901897S

 

<140>PCT/US08/65241

<141>2008-05-30

 

<150>US 11/755,768

<151>2007-05-31

 

<160>2

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成寡聚核苷酸正向引物

<400>1

gttaagcgac tcggctatcg                                      20

 

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成寡聚核苷酸反向引物

 

<400>2

atgccaccac aagcactaca                                      20

Claims (6)

1.一种转化的细菌或它的子代，其引入了在其中复制并被表达的外源核苷酸序列，其中，所述外源核苷酸序列不与选择性标记相连，所述外源核苷酸序列位于质粒上，以及所述外源核苷酸序列编码下述中的至少之一：

a)存活所必需的蛋白质；

b)编码用于逃出内体的蛋白质；以及

c)免疫原或免疫调制蛋白

2.如权利要求1所述的转化的细菌或它的子代，其特征在于，所述外源核苷酸序列至少编码a)、b)和c)中的两个。

3.如权利要求1所述的转化的细菌或它的子代，其特征在于，所述质粒编码a)、b)和c)。

4.如权利要求1所述的转化的细菌或它的子代，其特征在于，所述细菌是转化的分枝杆菌

5.如权利要求4所述的转化的细菌或它的子代，其特征在于，所述转化的卡介苗是Danish菌株1331。

6.如权利要求1所述的转化的细菌或它的子代，其特征在于，所述免疫原或免疫调节蛋白选自由抗原85a、抗原85b和抗原TB 10.4中的一个或多个所组成的组。

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