JP2005523716A - 部位特異的リステリア組込みベクターおよびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、米国立衛生研究所の助成金番号第1 R37 AI29619号および同第1 R01 AI27655号による政府支援によってなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本願は、2002年4月30日提出の出願番号第10/136,860号の一部継続出願であり、その開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明の分野は、リステリア種、例えばリステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、特にリステリア種の組換え株、ならびにそれらを製造および使用する方法である。
リステリアモノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)は、免疫無防備個体および妊婦の重篤な感染症の原因となる、グラム陽性で食品媒介性のヒトおよび動物の病原菌である。ヒトにおける重症のL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)感染症は、髄膜炎、髄膜脳炎、敗血症および胎児の死亡によって特徴付けられる。L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)は自然界に広く存在しており、また多種多様な温血動物から単離することができる。
関心対象の特許文献および公開されている特許出願には、米国特許第5,830,702号および公開されているPCT出願国際公開公報第99/25376号および国際公開公報第00/09733号が挙げられる。
部位特異的リステリア組込みベクターおよびその使用方法を提供する。本発明のベクターは、バクテリオファージインテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージ結合部位を含み、多くの態様において、これらの要素源であるバクテリオファージはリステリオファージである。ある態様において、本発明のベクターは、マルチクローニングサイトをさらに含み、マルチクローニングサイトは、例えば異種ポリペプチドのコード配列等をさらに含んでもよい。本発明のベクターおよび方法は、リステリア種の研究およびリステリア種ワクチンの製造を含む種々の異なる応用に有用である。
部位特異的リステリア組込みベクターおよびその使用方法を提供する。本発明のベクターは、バクテリオファージインテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージ結合部位を含み、多数の態様において、これらの要素源であるバクテリオファージはリステリオファージである。ある態様において、本発明のベクターは、マルチクローニングサイトをさらに含み、マルチクローニングサイトは、例えば異種ポリペプチド等のコード配列をさらに含んでもよい。本発明のベクターおよび方法は、リステリア種の研究、およびリステリアワクチンの製造を含む種々の異なる応用に有用である。
上記に要約したように、本発明は、リステリア部位特異的組込みベクター、すなわち、部位特異的にリステリアゲノムに組込まれるベクターを提供する。本発明のベクターは、ランダムでなく、部位特異的にリステリア種のゲノムに安定に組込まれることを特徴とする。本発明のベクターは標的ゲノムに部位特異的に組込まれるので、本発明のベクターは典型的には、リコンビナーゼ、具体的にはインテグラーゼによって媒介される機序によって標的ゲノムの特異的な位置または配列(すなわち、ドメイン、位置)に挿入される。インテグラーゼは基質として2つの別個の認識部位を使用するものであり、その1つは標的ゲノムの組込み部位に位置し(核酸が組込まれる予定の部位)、他方は組込み部位に導入される予定の関心対象の核酸に隣接している(すなわち、「バクテリオファージ結合部位」と本明細書において呼ばれる本発明のベクター上の部位)。例えば、ファージインテグラーゼの認識部位は、細菌ゲノム(核酸が挿入される予定の)に存在するattB、およびattP(「バクテリオファージ結合部位」と本明細書において呼ばれる、細菌ゲノムに挿入するための核酸に隣接するファージ核酸に存在する)と総称的に呼ばれる。認識部位は天然であっても(標的ゲノムに内因性)、天然の配列に対して改変されてもよい。インテグラーゼが認識配列を「認識する」という文脈における「認識する」という用語の使用は、インテグラーゼが認識部位と相互作用して部位特異的組換えを容易にする能力をさす。
本発明のベクターは、標準的な制限酵素切断、ライゲーション、および分子クローニング方法を含む任意の便利なプロトコールを使用して作製することができる。本発明のベクターを構築する1つのプロトコールは、以下の段階を含む。最初に、所望の成分のヌクレオチド配列およびその他の配列を含有する精製された核酸断片を制限エンドヌクレアーゼで最初の材料から切断する。次いで、従来の分離方法、例えばアガロースゲル電気泳動を使用して、所望のヌクレオチド配列を含有する断片を、異なるサイズの望ましくない断片から分離する。所望の断片をゲルから切り出し、所望の配列、例えば上記のような本ベクターの種々の要素に対応する配列を含有する環状の核酸またはプラスミドが作製されるように、適当な構成でライゲーションする。望ましい場合には、このように構築した環状分子を宿主、例えば大腸菌(E. coli)内で増幅する。これらの段階に関与する切断、プラスミド構築、細胞形質転換、およびプラスミド作製の手法は当業者に既知であり、制限およびライゲーションに必要な酵素は市販品を購入できる(例えば、R. Wu編、Methods in Enzymology、68巻、Academic Press, N. Y. (1979)、T. Maniatis, E. F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)、Catalog 1982-83、New England Biolabs, Inc.、Catalog 1982-83、Bethesda Research Laboratories, Inc.を参照されたい)。本発明のベクターを構築する方法の一例は以下の実験の部に提供されている。
上記リステリア部位特異的組込みベクターを使用して、異種核酸をリステリアゲノムに組込む方法もまた、本発明によって提供される。本発明の方法を実施する際には、本発明のベクターは、ベクターの標的細胞ゲノムへの組込みを生じさせるのに十分な条件下において、標的リステリア細胞に導入される。ベクターを標的細胞に導入するための任意の便利なプロトコールを使用することができる。
上記のベクターおよびその使用方法は、種々の異なる用途に有用であり、代表的な応用には、(a)研究用途、(b)ワクチン製造用途、(c)リステリア送達担体作製用途等が挙げられるが、これらに限定されない。
上記のような本発明のベクターの作製ならびに/または本発明のベクターおよび方法を使用する組換えリステリア細胞の製造に有用であるキットおよびシステムも提供される。例えば、本発明のベクターを作製するためのキットおよびシステムは、以下の1つ以上を含みうる:マルチクローニングサイトを有する最初のベクター、マルチクローニングサイトの部位を切断するための制限エンドヌクレアーゼ、マルチクローニングサイトに挿入する予定の関心対象の発現カセットを含むベクター等。キットおよびシステムが組換えリステリア細胞の作製に設計されている場合には、これらキットおよびシステムは、ベクター、または上記のようなこれを作製するための要素、リステリア標的細胞、非リステリア宿主細胞等を含んでもよい。本発明のキットは、本発明の方法に有用な他の要素、例えば、反応緩衝液、増殖培地等をさらに含んでもよい。
I. 材料と方法
A. pPL1組込みベクターの構築
標準的な分子的技法を、6101 bp組込みベクターpPL1(図1A)の構築に使用した。pPL1ベクターの完全な配列を配列番号:25として提供する。pPL1は大腸菌(E. coli)内で自己複製し、部位特異的にL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)に組込まれる低コピープラスミドであり、以下のように6つの別個のDNA源から集成した。構築に使用するPCRプライマーの制限部位に下線をつけてある。クローニング段階に使用した全てのPCR反応はVent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用した。
を用いたPCRの後にクローニングした。低コピーグラム陰性複製開始部およびpACYC184のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子(Chang, A.C.およびS.N. Cohen. 1978. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol. 134: 1141-1156.)(bp 172-2253)を、プライマー
を用いたPCRの後にクローニングした。大腸菌(E. coli)からL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)への直接接合は、RP4導入開始部(oriT)(Pansegrau, W.、E. Lanka、P. T. Barth、D. H. Figurski、D. G. Guiney、D. Haas、D. R. Helinski、H. Schwab、V. A. StanisichおよびC. M. Thomas. 1994. Complete nucleotide sequence of Birmingham IncP alpha plasmids. Compilation and comparative analysis. J. Mol. Biol. 239: 623-663)(bp 2254-2624)を、プライマー
を用いたPCRの後に、プラスミドpCTC3(Williams, D. R.、D. I. YoungおよびM. Young. 1990. Conjugative plasmid transfer from Escherichia coli to Clostridium acetobutylicum. J. Gen. Microbiol. 136: 819-826)からクローニングした。プラスミドの部位特異的組込みを誘導するリステリオファージU153インテグラーゼ遺伝子および結合部位(attPP')(A. Nolte、P. LauerおよびR. Calendar、未公開、bp 2629〜4127)(配列番号:25はこれらの部位の配列を含む)は、プライマー
を用いたPCRの後にクローニングした。U153インテグラーゼ遺伝子の発現は、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)p60プロモーター(Lauer, P.、J. A. Theriot、J. Skoble、M.D. WelchおよびD. A. Portnoy. 2001. Systematic mutational analysis of the amino-terminal domain of the Listeria monocytogenes ActA protein reveals novel functions in actin-based motility. Mol. Microbiol. 42: 1163-1177)を、プライマー
を用いてPCR増幅し、インテグラーゼ遺伝子の上流にクローニングした。塩基対4570〜6101は、pUC18-Cat(Nancy Freitag氏からの供与)からサブクローニングしたHindIII-AatII制限断片であり、pC194由来の誘導性グラム陽性CAT遺伝子(Horinouchi, S.およびB. Weisblum. 1982. Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol. 150: 815-825)(bp 4788-5850))を含有する。
hly遺伝子は、BamHIおよびXbaIを用いて制限消化し、2.9kb断片をゲル精製し、BamHIおよびSpeIで切断したpPL1にライゲーションすることによって、プラスミドpDP-906(Jones, S.およびD. A. Portnoy. 1994. Characterization of Listeria monocytogenes pathogenesis in a strain expressing perfringolysin O in place of listeriolysin O. Infect. Immun. 62(12): 5608-5613)からサブクローニングした。得られたプラスミドはpPL24と名づけた(図1A)。actA遺伝子は、プライマー
を用いて10403SゲノムDNAからPCR増幅した。2220 bpのPCR産物をゲル精製し、BamHIおよびXbaIで切断し、BamHIおよびSpeIで切断したpPL1にクローニングした。得られたプラスミドはpPL25と名づけた(図1A)。
ファージキュアリングは、従来の方法(Cohen, D. 1959. A variant of Phage P2 Originating in Escherichia coli, strain B. Virology 7: 112-126; Six, E. 1960. Prophage substitution and curing in lysogenic cells superinfected with hetero-immune phage. J. Bacteriol. 80: 728-729)を適合させることによって実施した。comK-attBB'にプロファージを保有するL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)10403S誘導株(記載されているように(Loessner, M. J、R. B. Inman、P. LauerおよびR. Calendar. 2000. Complete nucleotide sequence, molecular analysis and genome structure of bacteriophage A118 of Listeria monocytogenes: implications for phage evolution. Mol. Microbiol. 35:(2): 324-340)、comK ORFに組込まれている)をBHI中で37℃において108CFU/mlまで増殖させ、5 mM CaCl2の存在下において感染多重度20:1でリステリオファージU153(Hodgson, D. A. 2000. Generalized transduction of serotype 1/2 and serotype 4b strains of Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 35(2): 312-323.)を感染させた。培養物は、37℃において75分間振盪することによってインキュベーションし、感染培養物のOD600を未感染対照培養物と比較することによって増殖阻害をモニターした。感染培養物はBHIで10-2および10-4希釈し、10-2希釈液の光学密度が100倍増加するまで、両希釈液を37℃において増殖させた。次いで10-4倍希釈液を10-2希釈し、3μlをBHIにプレーティングした。まずコロニーを0.25 mlのLBブロスに取り、プラークを特に形成しやすいL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の非溶原性ラフ株、Mack-4R(DP-L862)壌地上で30℃においてレプリカ培養することによって、50コロニーをファージ放出について試験した。次いで、10μlの培養物をMack-4Rの壌地にスポットしてプラーク形成を検出することによって、プラークを形成しなかった候補を試験した。この2番目の試験が陰性であった場合には、親10403S株のファージによるプラーク形成を支持することができるかどうかについて候補を試験した(Φ10403、Hodgson, D. A. 2000. Generalized transduction of serotype 1/2 and serotype 4b strains of Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 35(2): 312-323.))。キュアリングは、comK-attBB'特異的プライマー対PL60/PL61(配列は以下に示す)を用いたPCRによって、comK-attBB'にファージが存在しないことについて分子的に確認した。この手法を使用して約10%のコロニーがキュアリングされた。
を使用して、ファージ結合部位への組込みについてPCRによってスクリーニングした。PCR反応は、滅菌したP200ピペットチップでBHIプレートから20μlのPCR反応液に直接採取した個々の細菌コロニーの少量について実施した。プライマー対PL14/PL61はPCR反応においてattBP'を特異的に増幅し、組換え株(プロファージおよびpPL1誘導株)で743 bp産物を産生した。プライマー対PL60/PL61はPCR反応においてcomK-attBB'を特異的に増幅し、非溶原性株(すなわち、DP-L4056)においてのみ417 bp産物が産生された。PCRアッセイは、Hybaid Omn-Eサーモサイクラーにおいて、アニーリング温度55℃で30サイクル実施した。組換え体は、ドナー細胞あたり約2×10-4の頻度で生じた。
血液プレートにおける溶血は、5%脱線維素(defimbrinated)ヒツジ血液(HemoStat、Davis CA)を添加したトリプシンダイズ寒天プレート(tryptic soy agar plate)で判定した。溶血アッセイは本質的に、記載されているように実施した(Portnoy, D. A.、P. S. JacksおよびD. J. Hinrichs. 1988. Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 167(4): 1459-1471.)。溶血活性は、ヒツジ赤血球の50%を溶血するのに必要な培養上清の希釈の逆数として表す。
プラークサイズは、以前に記載されているように求めた(Lauer, P.、J. A. Theriot、J. Skoble、M.D. WelchおよびD. A. Portnoy. 2001. Systematic mutational analysis of the amino-terminal domain of the Listeria monocytogenes ActA protein reveals novel functions in actin-based motility. Mol. Microbiol. 42(5): 1163-1177)。各株は6〜8個の独立した実験においてプラーク形成させ、各実験において10403Sと比較した。
表面発現型ActAタンパク質は、等量をSDS-PAGE緩衝液に再懸濁し、5分間煮沸することによって、LBブロスにおいて増殖した後期対数増殖期の細菌培養物(OD600約0.7)から調製した。この手法は表面発現型タンパク質を抽出するが、細胞壁を損傷しない。等量を7% SDS-PAGEにロードし、クーマシーブルーで可視化した。
アフリカツメガエル(X. laevis)の卵の細胞質抽出物を記載されているように調製し(Theriot, J. A.、J. Rosenblatt、D. A. Portnoy、P. J. Goldschmidt-ClermontおよびT. J. Mitchison. 1994. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell 76(3): 505-517)、テトラメチルローダミンヨードアセトアミドで標識したアクチンを添加した(Theriot, J. A.およびD. C. Fung. 1998. Listeria monocytogenes-based assays for actin assembly factors. Methods Enzymol. 298: 114-122)。SLCC-5764由来株は静止期まで終夜増殖させ、1回洗浄し、細胞抽出物に添加し、45分間インキュベーションしてから顕微鏡で観察した。
限界LD50は、記載されているように(Portnoy, D. A.、P. S. JacksおよびD. J. Hinrichs. 1988. Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 167(4): 1459-1471.)、BALB/cマウスにおいて実施した。動物実験は、実験室(the laboratory of Archie Bouwer at Oregon Health Sciences Center、Portland、OR)で実施した。
PSA結合部位(tRNAArg-attBB')DNA配列は、インバースPCRとゲノムウォーキングの組み合わせにより得た。インバースPCRは、PSA int遺伝子内でアニーリングする多岐プライマー(divergent primers)
を使用して、Sau3AI消化したDP-L4061 DNA(PSAに対してはWSLC 1042溶原性)(配列番号:26はWSLC 1042 tRNAArg-attBB'周囲の2,072 bpの配列である)で実施した。得られたDNA配列はさらに別のオリゴヌクレオチドを設計するために使用し、製造業者の推奨によりこれらをGenome Walkerキット(Clontech)と共に使用した。DNA配列およびtRNA分析は、MacVector(Accelrys)、DNAsis(Hitachi)、BLASTアルゴリズム(2)およびtRNAscan-SE(Lowe, T. M.およびS. R. Eddy. 1997. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25(5): 955-964)を使用して実施した。
ならびにVent DNAポリメラーゼを用いてPSAゲノムDNAからPCR増幅し、BglIIおよびSphIで消化し、同じ酵素で消化されているpPL1にライゲーションした。得られたプラスミドはpPL2と名づけた(図1B)。pPL2の配列は配列番号:28として提供されている。
およびPL95(配列は上記)を用いて配列決定した。さらに、血清型間のtRNAArg遺伝子の下流の配列間の相違のために、tRNAArg-attBB'の血清型1/2特異的PCRアッセイを10403S DNA配列から開発し、種々のL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株のプロファージ状態を判定するために使用した。プライマー
は、非溶原性血清型1/2株の533 bpのPCR産物を特異的に増幅する。プライマー対NC16
およびPL95は、溶原性であるかまたはtRNAArg-attBB'に組込みベクターを含有する株の499 bp PCR産物を特異的に増幅する。(配列番号:27は10403S tRNAArg-attBB'の周囲の643 bpを提供する。)
A. pPL1は種々のL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株において安定なシングルコピー組込み体を形成する。
pPL1は、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)における株構築を促進するために本発明者らが構築した最初の組込み型シャトルベクターである。pPL1ベクターを試験するために、本発明者らは、comK細菌結合部位にファージを持たないL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株を必要とした。本発明者らは、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株のプロファージをキュアリングするための従来の方法を適合させ、内因性10403Sプロファージと同じ結合部位を有するファージU153による重感染後に、プロファージフリー株を単離することができることを見出した(「材料と方法」を参照されたい)。プロファージをキュアリングした10403S株はDP-L4056と名づけ、以降の実験に使用した。
a(-):カラムの上部に記載されているプライマー対で陰性のPCR結果を生じた。b(+):カラムの上部に記載されているプライマー対で陽性のPCR結果を生じた。PL60/PL61プライマー対は、非溶原性株において417 bp PCR産物を特異的に増幅し、溶原性株ではPCR産物を生じない。PL14/PL61プライマー対は、溶原性株において743 bp PCR産物を特異的に増幅し、非溶原性株においてPCR産物を生じない。
本発明者らは次に、comKにプロファージが存在すること、プロファージが存在しないこと、または組込みベクターが病原性の表現型を変更するかどうかを判定するために、標準的な病原性アッセイにおいてDP-L4056およびDP-L4074を野生型10403Sと比較した。これらの3つの株を、LLO活性、単層のL2細胞においてプラークを形成する能力、およびマウスLD50アッセイにおける病原性についてアッセイした(表3)。全て互いに識別不可能であり、comK ORFの完全性およびpPL1の存在は病原性に測定可能な影響を与えないことを強く示唆した。
a示してある溶血単位データは1つの代表的な実験のものである。nd:測定されず。bプラークサイズは8〜10の独立した実験の平均であり、野生型(100%と規定する)に対する割合として示されている。標準偏差を括弧内に示す。na:適用不能。c10403SおよびΔhly(DP-L2161)のLD50は(37)で測定し、ΔactA株(DP-L1942、細菌表面においてアクチンの核形成を支持しない、actA ORF内のわずかな欠損)のLD50は(4)で測定した。
hlyの遺伝子産物であるリステリオリシン-O(LLO)は、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)が最初に宿主細胞に侵入した際に、膜結合液胞からの回避を担当する分泌型の孔形成細胞溶解素である。LLOは、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の細胞内ライフサイクルおよび病原性に欠くことができない。LLO活性は、赤血球細胞に対する溶血活性によって測定することができる。Hly突然変異体は単層のL2細胞においてプラークを形成せず、マウスLD50アッセイにおいて病原性が5log低い。
第2の主要なL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)病原性因子であるActAは、細菌細胞内の運動に使用される宿主細胞アクチン-細胞骨格因子を奪い取る原因である。actAの突然変異体は細胞間の伝播だけでなく、細胞単層においてプラーク形成もできず、野生型と比較して病原性が3log低いので、ActAも細菌の病原性に欠くことができない。さらに、ActA発現はLLOより複雑と考えられ、actA発現を誘導するプロモーターは2つある。1つはactA ORFのすぐ上流にあり、2つめはactAの上流のmpl遺伝子の前にある。
comK結合部位にプロファージを有するL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株へのpPL1組込みは、最初に宿主株からプロファージをキュアリングしなければならない過程によって妨害される。ファージキュアリング段階の必要性を軽減するために、pPL1組込みの特異性をPSAプロファージのそれに変更した。PSA((Phage from ScottA)は、ヒトリステリア症の流行中に単離された血清型4b株であるL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株ScottAのプロファージである。本発明者らは、PSAゲノムDNA配列を使用して、attPP'配列を含有すると本発明者らが予測した近接する非コード配列を有するインテグラーゼ様ORFを同定した。次いで、PSAインテグラーゼ配列を使用して、PSA溶原性株DP-L4061からPSA-attBB'のDNA配列を得た(「材料と方法」を参照されたい)。PSAは、枯草菌(B. subtilis)のtRNAArg遺伝子(trnSL-ARG2)と88%同一であるtRNAArg遺伝子に組込むことが見出された。tRNAArg遺伝子のアンチコドンは5'UCUであり、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)において最も普通に使用されるアルギニンアンチコドンである。PSAおよび細菌結合部位は17 bpのDNA同一性を有し、tRNAArg-attBB'は、PSAの組込みによって中断されるtRNAArg配列を完成させる短いヌクレオチド配列を有する(図4)。結合部位tRNAArg遺伝子はL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)株EGDeのゲノムに1箇所だけ存在し、おそらく血清型4bに1箇所だけ存在する。これは、PSA組込み部位が1つしかないことだけではなく、組込み(または切断)の結果遺伝子の正確な再構成が細胞の生存に必要である可能性が高いことを示している。
米国特許第5,777,079号(開示内容が参照として本明細書に組み入れられる)に記載されているGFPコード配列をプラスミドpPL1にクローニングし、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)のゲノムに組み込む。GFPコード配列をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅し、PCR断片をpPL1のマルチクローニングサイトにクローニングする。L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)においてGFPを発現するために適当な転写要素および翻訳リーダー配列を含有する好適なプロモーターを、GFPタンパク質の発現を誘導するように、GFPコード配列の5'末端にクローニングする。改変したpPL1プラスミド構築物を標準的な技法を使用して大腸菌(E. coli)株SM10に電気穿孔し、上記のように、改変したpPL1プラスミド構築物をL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)に接合する。7.5μg/mlクロラムフェニコールおよび200μg/mlストレプトマイシンを添加したBHIプレートで組換えL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)を選択する。個々のコロニーを取り、プライマー
を使用して、ファージ結合部位への組込みについてPCRでスクリーニングする。組換えL.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の培養物を増殖、調製し、GFPについてスクリーニングする。
L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)に使用するための最初の一段階部位特異的組込みベクターの構築および特徴づけは、この病原菌の研究に利用可能な遺伝子ツールを推進する。これらのベクターは、従来の方法と比較して手軽な株構築を可能にし、L.モノサイトゲネス(L. monocytogenes)の細胞内ライフサイクルを研究するために使用される種々の株において広範囲に有用である。さらに、安定な部分二倍体株を構築して、精密なコピー数検討、および多量体化によるタンパク質内相互作用の検討、および同じ細菌株における遺伝子の異なる対立遺伝子の優性または劣性の試験を可能にすることができる。
Claims (23)
- 部位特異的リステリアゲノム組込みを可能にする組込みベクター。
- プラスミドである、請求項1記載の組込みベクター。
- バクテリオファージインテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージ結合部位を含む、請求項2記載の組込みベクター。
- バクテリオファージがリステリオファージである、請求項3記載の組込みベクター。
- 結合部位が、comK組込み部位およびtRNAArg組込み部位からなる群より選択される組込み部位における組込みを提供する、請求項3記載の組込みベクター。
- マルチクローニングサイトをさらに含む、請求項1記載の組込みベクター。
- コード配列をさらに含む、請求項6記載の組込みベクター。
- コード配列がポリペプチドをコードする、請求項7記載の組込みベクター。
- ポリペプチドが抗原である、請求項8記載の組込みベクター。
- pPL1である、請求項1記載の組込みベクター。
- pPL2である、請求項1記載の組込みベクター。
- リステリアを形質転換する方法であって、
組込みベクターがリステリアのゲノムに組込まれるのに十分な条件下においてリステリアに請求項1記載の組込みベクターを接触させる段階
を含む方法。 - 請求項1記載のベクターで形質転換したリステリア。
- 被験者において抗原に対する細胞性免疫応答を誘発または追加免疫投与する方法であって、
請求項13記載のリステリア細胞の有効量を被験者に投与する段階
を含む方法。 - リステリア細胞が弱毒化されている、請求項14記載の方法。
- リステリア細胞が異種抗原を発現する、請求項13記載のリステリア細胞株を含むワクチン。
- リステリア細胞が弱毒化されている、請求項16記載のワクチン。
- 請求項13記載のリステリア細胞の組換え培養物。
- リステリア細胞が弱毒化されている、請求項18記載の組換え培養物。
- 請求項1記載のベクターと、
マルチクローニングサイトでベクターを切断する少なくとも1つのヌクレアーゼと
を含む、請求項7記載のベクターを作製する際に使用するためのキット。 - 宿主細胞をさらに含む、請求項20記載のキット。
- 請求項1記載のベクターと、
マルチクローニングサイトでベクターを切断する少なくとも1つのヌクレアーゼと、
リステリア細胞と
を含む、請求項13記載の細胞を作製する際に使用するためのキット。 - 請求項1記載のベクターと、
マルチクローニングサイトでベクターを切断する少なくとも1つのヌクレアーゼと、
異種抗原のコード配列と、
リステリア細胞と
を含む、請求項16記載のワクチンを作製するためのシステム。
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