DE60311252T3 - Stellenspezifische listeria-integrationsvektoren und verfahren zu deren verwendung - Google Patents

Description

• Fachgebiet der Erfindung
• Das Fachgebiet der Erfindung betrifft Listeria-Spezies, z. B. Listeria monocytogenes, insbesondere rekombinante Stämme von Listeria-Spezies, und Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.
• Hintergrund der Erfindung
• Listeria monocytogenes ist ein grampositives, durch Nahrungsmittel übertragenes menschliches und tierisches Pathogen, das für schwere Infektionen bei Personen mit beeinträchtigtem Immunsystem und bei schwangeren Frauen verantwortlich ist. Charakteristische schwere L.-monocytogenes-Infektionen bei Menschen sind Meningitis, Meningoencephalitis, Sepsis und Fetaltod. L. monocytogenes ist in der Natur allgegenwärtig und kann außerdem aus einer Vielzahl warmblütiger Tiere isoliert werden.
• Arbeitsvorschriften zur rekombinanten gentechnologischen Herstellung von Listeria-Spezies sind sowohl in der Forschung als auch in therapeutischen Anwendungen von Interesse. Zum Beispiel finden Listeria-Spezies-Transformationsprotokolle Anwendung in der Aufklärung der Mechanismen, die für das Wachstum und die Virulenz dieser Formen von Bakterien verantwortlich sind. Zusätzlich werden diese Arbeitsvorschriften zur Herstellung von Listeria-Lebendimpfstoffen verwendet, wobei diese Impfstoffe in einer Vielzahl verschiedener medizinischer Anwendungen Verwendung finden.
• Bis heute ist eine Vielzahl verschiedener Arbeitsvorschriften verwendet worden, um Listeria-Spezies zu transformieren, wobei diese Arbeitsvorschriften Folgendes umfassen: homologe Rekombination, transposonbasierte Rekombination etc. Während derzeit für die gentechnologische Herstellung von Listeria-Spezies verschiedene Arbeitsvorschriften verfügbar sind, sind diese Verfahren nicht gänzlich zufrieden stellend. Nachteile, die derzeit bei einem oder mehreren verfügbaren Arbeitsvorschriften festzustellen sind, umfassen Folgendes: (1) Instabilität der Expressionskassette in der transformierten Spezies; (2) variable Auswirkungen auf die Virulenz der transformierten Spezies; (3) Größenbeschränkungen der Expressionskassette, die in die transformierte Spezies positioniert werden kann, etc.
• Daher besteht trotz der Vielzahl verschiedener verfügbarer Transformationsarbeitsvorschriften kontinuierliches Interesse an der Identifikation weiterer Transformationsarbeitsvorschriften, die das Repertoire der verfügbaren genetischen Instrumente ausdehnen können. Von besonderem Interesse ist die Entwicklung eines wirksamen, ortsspezifischen Integrationsvektors, der zur Verwendung mit einer großen Vielzahl verschiedener Listeria-Spezies geeignet ist, worin der Vektor von einem oder mehreren der zuvor angeführten Nachteile der derzeit verfügbaren Arbeitsvorschriften nicht betroffen ist.
• Relevante Literatur
• Patente und veröffentlichte Patentanmeldungen von Interesse umfassen: US-Patent Nr. 5.830.702 und die veröffentlichten PCT-Anmeldungen mit den Seriennummern: WO 99/25376 und WO 00/09733 .
• Schaferkordt et al., in Biotechniques 19(5), 720–725 (1995), beschreiben einen Vektor, der eine komplementäre Sequenz vom Listeria-monocytogenes-Genom umfasst, wodurch dem Vektor ermöglicht wird, sich mittels homologer Rekombination in das Genom zu integrieren.
• Fortineau et al., in Res. Microbiol. 151, 353–360 (2000), offenbaren einen Vektor, der zur Integration in das Listeria-monocytogenes-Genom über das Transposon Tn1545 in der Lage ist.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Es werden ortsspezifische Listeria-Spezies-Integrationsvektoren und Verfahren für deren Verwendung bereitgestellt. Die gegenständlichen Vektoren umfassen ein Bakteriophagenintegrase-Gen. und eine Bakteriophagenanheftungsstelle, wo in vielen Ausführungsformen der Bakteriophage, der die Quelle dieser Elemente ist, ein Listeriaphage ist. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die gegenständlichen Vektoren weiters eine multiple Klonierungsstelle, wo die multiple Klonierungsstelle weiters eine Kodiersequenz umfasst, z. B. eine Kodiersequenz für ein heterologes Polypeptid etc. Die gegenständlichen Vektoren und Verfahren werden in einer Vielzahl verschiedener Anwendungen verwendet, einschließlich der Studie von Listeria-Spezies und der Herstellung von Listeria-Spezies-Impfstoffen.
• KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• 1. (A) Plasmidkarte des pPL1-Integrationsvektors. Seq.-ID Nr. 24 stellt die Sequenzen von pPL1 bereit. Chloramphenicolresistenzgene und E.-coli-Replikationsstartpunkt sind grau dargestellt, RP4-Transferstartpunkt weiß, Integrase-Gen und L.-monocytogenes-p60-Promotor schwarz. Eine multiple Klonierungsstelle ist auf der Unterseite des Plasmids mit einzigartigen Restriktionsstellen dargestellt, die als MCS in einem Kästchen angeführt ist. Unter der MCS sind pPL24- und pPL25-Inserts schematisch dargestellt und wurden wie im Kapitel „Materialien und Verfahren” beschrieben kloniert. Die Endgrößen der Plasmidkonstrukte und der Restriktionsstellen, die in der Klonierung verwendet wurden, sind mit jedem dieser Inserts angeführt. (B) Plasmidkarte des Integrationsvektors pPL2. Seq.-ID Nr. 28 stellt die Sequenz von pPL2 bereit. Das Farbschema und die Gene sind dieselben wie in 1A mit Ausnahme der PSA-Integrase- und PSAattPP'-Stellen, wie angeführt. Die multiple Klonierungsstelle mit 13 einzigartigen Restriktionsstellen ist an der Unterseite des Plasmids angeführt.
• 2. Genomische Organisation der Anheftungsstellen innerhalb des comK-Gens (A und B) und des tRNA^Arg-Gens (C und D). (A) Nicht-lysogener L.-monocytogenes-Stamm mit einem intakten comK-Gen. Primer PL60 und PL61 amplifizieren über die bakterielle Anheftungsstelle comK-attBB'. (B) Lysogener L.-monocytogenes-Stamm (mit etwa 40 kb von Phagen-DNA, die in das comK-Gen insertiert wurde) oder integrierter Stamm (mit pPL1-Konstrukt, das in das comK-Gen insertiert wurde). Primer PL14 und PL61 amplifizieren über die Hybridanheftungsstelle comKattPB'. (C) L.-monocytogenes-Serotyp-4b-Stamm, der an tRNA^Arg-attBB' nicht lysogen ist. Primer NC16 und NC17 amplifizieren über die bakterielle Anheftungsstelle tRNA^Arg-attBB' in Serotyp-4b-Stämmen. Der Stern gibt an, dass die Primer NC16 und NC17 durch PL102 und PL103 substituiert wurden, um über die bakterielle Anheftungsstelle tRNA^Arg-attBB' in Serotyp-1/2-Stämmen zu amplifizieren. (D) Lysogener L.-monocytogenes-Stamm (mit etwa 40 kb von Phagen-DNA oder 6 kb pPL2-Vektor-DNA, die am 3'-Ende des tRNA^Arg-Gens insertiert wurden). Primer NC16 und PL95 amplifizieren über die Hybridanheftungsstelle tRNA^Arg-attBP' sowohl in Serotyp-4b- als auch in -1/2-Stämmen.
• 3. Expression und funktionelle Komplementierung von ActA in SLCC-5764. (A) Coomassieblaugefärbte SDS-PAGE von Stämmen, die von SLCC-5764 stammen, die bis zur späten log-Phase gewachsen sind. ActA ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Spur 1: Molekulargrößenmarker; Spur 2: DP-L-3780; Spur 3: DP-L4083; Spur 4: DP-L4086; Spur 5: SLCC-5764; Spur 6: DP-L4082; Spur 7: DP-L4084; Spur 8: DP-L4085; Spur 9: DP-L4087. In Tabelle 1 sind Stämme dargestellt. (B) Actinschwanzbildung und Bewegung von DP-L4087 in Xenopus-Zellextrakt. Das obere Bild ist ein Phasenbild, das untere Bild ein Fluoreszenzbild desselben Felds.
• 4. (A) Kleeblattdiagramm von tRNA^Arg, das als PSA-Anheftungsstelle verwendet wurde. Das Argininanticodon ist von einem Kreis umgeben. Die Region mit Sequenzidentität zwischen dem tRNA-Gen und dem PSAattPP' ist umrissen. Die Grenzen des tRNA^Arg-Gens und der Cove-Score (82,37) wurden mit tRNAscan-SE (31) prognostiziert. (B) Anordnung der tRNA^Arg-attBB'-Region von L.-monocytogenes-WSLC-1042 (obere Reihe) und der attPP'-Region von PSA stromab des Integrase-Gens. Das 74-nt-tRNA^Arg-Gen von L. monocytogenes ist eingerahmt, und die überlappende 17-bp-Region der Sequenzidentität (Kernintegrationsstelle) ist grau schattiert. Das tRNA^Arg-Gen-Anticodon ist fett und unterstrichen dargestellt. Identische Nucleotidreste sind durch (:) angegeben. Die Zahlen, die sich an der linken Seite befinden, zeigen die Nucleotidposition in den DNA-Sequenzen der WSLC-1041-Anheftungsstelle (AJ314913) und dem PSA-Genom (AJ312240).
• BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
• Es werden ortsspezifische Listeria-Spezies-Integrationsvektoren und Verfahren für deren Anwendung bereitgestellt. Die gegenständlichen Vektoren umfassen ein Listeriaphagen-Integrase-Gen und eine Listeriaphagen-Anheftungsstelle, sowie eine heterologe Kodiersequenz.
• In bestimmten Ausführungsformen umfassen die gegenständlichen Vektoren weiters eine multiple Klonierungsstelle, wo die multiple Klonierungsstelle weiters eine Kodiersequenz umfassen kann, z. B. für ein heterologes Polypeptid etc. Die gegenständlichen Vektoren und Verfahren werden in einer Vielzahl verschiedener Anwendungen verwendet, einschließlich der Studie von Listeria-Spezies und der Herstellung von Listeria-Spezies-Impfstoffe.
• Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung wird durch die beigefügten Ansprüche dargestellt.
• In dieser Beschreibung und in den beigefügten Ansprüchen umfassen die Einzahlformen „ein/e” und „der/das/die” Mehrzahlreferenzen, wenn der Kontext nicht eindeutig etwas anderes angibt. Wenn nicht anders angegeben, haben alle hierin verwendeten fachlichen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, die ein Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung für gewöhnlich darunter versteht.
• Wo ein Bereich von Werten bereitgestellt wird, wird verstanden, dass jeder dazwischenliegende Wert, wenn der Kontext nichts anderes ergibt, bis zum Zehntel der Einheit der unteren Grenze, zwischen der oberen und unteren Grenze dieses Bereichs und jeder andere festgelegte oder dazwischenliegende Wert in diesem festgelegten Bereich im Schutzumfang der Erfindung enthalten ist. Die oberen und unteren Grenzen dieser kleineren Bereiche können voneinander unabhängig in den kleineren Bereichen enthalten sein und sind ebenfalls von der Erfindung umfasst, abhängig von jeder speziell ausgeschlossenen Grenze im festgelegten Bereich. Wo der festgelegte Bereich eine oder zwei der Grenzen umfasst, sind in der Erfindung auch Bereiche enthalten, die entweder eine oder beide dieser enthaltenen Grenzen ausschließen.
• Wenn nicht anders angegeben haben alle hierin verwendeten fachlichen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, die ein Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung für gewöhnlich darunter versteht. Obwohl jegliche Verfahren, Vorrichtungen und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich sind oder ihnen entsprechen, in der praktischen Umsetzung oder beim Testen der Erfindung verwendet werden können, sind nun repräsentative Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben.
• In der weiteren Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die gegenständlichen Vektoren zuerst detailliert beschrieben, gefolgt von einem Überblick über die Verfahren zur Verwendung der gegenständlichen Vektoren, wie auch repräsentative Anwendungen, in welchen die gegenständlichen Vektoren und Verfahren Anwendung finden.
• VEKTOREN
• Wie zuvor zusammengefasst stellt die vorliegende Erfindung ortsspezifische Listeriaintegrationsvektoren bereit, d. h. Vektoren, die auf eine ortsspezifische Art und Weise in Listeria-Genome integrieren. Die gegenständlichen Vektoren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie sich in ortsspezifischer anstatt zufälliger Art und Weise stabil in ein Genom einer Listeria-Spezies integrieren. Weil die gegenständlichen Vektoren ortsspezifisch in ein Targetgenom integrieren, werden die Vektoren der vorliegenden Erfindung typischerweise in einen spezifischen Ort oder Sequenz (d. h. Domäne, Ort) des Targetgenoms mithilfe von Mechanismen, die durch eine Rekombinase, speziell eine Integrase, vermittelt werden, integriert, wobei die Integrase zwei verschiedene Erkennungsstellen als Substrate verwendet, wovon eine an der Integrationsstelle des Targetgenoms positioniert ist (die Stelle, in welche eine Nucleinsäure integriert werden soll) und eine andere angrenzend an eine Nucleinsäure von Interesse, die in die Integrationsstelle eingeführt werden soll (d. h. eine Stelle auf dem betreffenden Vektor, die hierin als „Bakteriophagenanheftungsstelle” bezeichnet wird). Zum Beispiel werden die Erkennungsstellen für Phagenintegrasen allgemein als attB bezeichnet, die im bakteriellen Genom gegenwärtig ist (in welches Nucleinsäure insertiert werden soll), und attP (die in der Phagennucleinsäure gegenwärtig ist, die an die Nucleinsäure zur Insertion in das bakterielle Genom angrenzt, die hierin als „Bakteriophagenanheftungsstelle” bezeichnet wird). Erkennungsstellen können nativ (endogen zu einem Targetgenom) oder im Vergleich zu einer nativen Sequenz verändert werden. Die Verwendung des Begriffs „erkennen” im Kontext mit einer Integrase „erkennt” eine Erkennungssequenz, bezieht sich auf die Fähigkeit der Integrase, mit der Erkennungsstelle wechselzuwirken und ortsspezifische Rekombination zu erleichtern.
• Die gegenständlichen Vektoren sind in der Lage, in die Genome einer großen Vielzahl verschiedener Listeria-Spezies zu integrieren. Integration wird einfach mithilfe eines herkömmlichen Tests bestimmt, einschließlich jener fachbekannten Tests, die feststellen können, ob Vektor-DNA in die genomische DNA eines Targetorganismus integriert ist oder nicht. Zum Beispiel kann Vektor-DNA in einen Targetorganismus eingeführt werden, z. B. durch Konjugation, und dann kann die Integration mittels PCR-Amplifikation der integrierten Sequenz unter Einsatz von Primern bestimmt werden, welche die Targetstelle flankieren, wo die Größe des Amplifikationsprodukts bestimmend ist, ob Integration stattgefunden hat. Ein Beispiel für einen solchen Test ist im nachstehenden experimentellen Teil bereitgestellt. Zusätzliche Eigenschaften vieler Ausführungsformen der gegenständlichen Vektoren sind, dass sie sich autonom in einer Nicht-Listeria-Wirtszelle, z. B. E. coli, replizieren und in solchen Nicht-Listeria-Wirtszellen stabil und harmlos sind.
• Die gegenständlichen Integrationsvektoren sind typischerweise doppelsträngige Plasmidvektoren, wo die Vektoren im Allgemeinen zumindest etwa 3 kb sind, oft zumindest etwa 5 kb sind, und können so groß wie 15 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb oder größer sein, wobei die Vektoren manchmal in der Größe von etwa 3–6 bis etwa 20 kb variieren. Die Vektoren umfassen eine Reihe struktureller Eigenschaften, die den Vektoren die oben beschriebenen funktionellen Eigenschaften verleihen.
• Ein strukturelle Eigenschaft der betreffenden Vektoren ist ein Bakteriophagenintegrase-Gen, d. h. eine Nucleinsäurekodiersequenz für eine Bakteriophagenintegrase, die operabel an einen listeriaspezifischen Promotor gebunden ist, sodass das Gen (die Kodiersequenz) in der Listeria-Zelle exprimiert wird, für welche der Vektor verwendet werden soll. Bei der Erfindung wird das Bakteriophagenintegrase-Gen von einem Listeriaphagen erhalten, d. h. es ist ein Listeriaphasenintegrase-Gen. Es ist eine Reihe verschiedener Listeriaphagen fachbekannt, wobei am beliebiger herkömmlicher Listeriaphage als Quelle für das Integrase-Gen dienen kann, d. h. die integrasekodierende Nucleinsäure. Spezifische Integrasen von Interesse umfassen einschließlich aber nicht ausschließlich U153-Integrase, die PSA-Integrase und dergleichen.
• Wie oben angegeben ist das Integrase-Gen operabel an einen Promotor gebunden (wie auch Regulations- und/oder Signalsequenzen, wenn nötig), der die Expression des Integrase-Gens steuert, Wenn der Vektor in der Listeriazelle gegenwärtig ist, für welche der Vektor hergestellt wird und in welcher die Integration des Vektors erwünscht ist. Es kann jeder beliebige herkömmliche Promotor verwendet werden, wo der Promotor in bestimmten Ausführungsformen ein Listeria-spezifischer Promotor ist. Repräsentative Promotoren von Interesse umfassen unter anderem, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt: den Listeria-p60-Promotor, Listeria-actA-Promotor, den Listeria-plcA-Promotor, den Listeria-mpl-Promotor, den Listeria-plcB-Promotor, den Listeria-inlA-Promotor, einen Hitzeschockpromotor und dergleichen. Die Promotoren können auch bestimmte Bakteriophagenpromotoren, wie z. B. die Promotoren für T7, Qß, SP6 und dergleichen, umfassen, wenn der Listeriastamm auch die zugehörige Bakteriophagen-RNA-Polymerase exprimiert. Zusätzlich zum zuvor beschriebenen Integrase-Gen/Promotorelement umfassen die betreffenden Vektoren auch eine Listeriaphagenanheftungsstelle, d. h. eine Sequenz oder eine Domäne von Nucleotiden, die eine ortsspezifische Integration mit einem Listeria-Genom bereitstellen. Es kann jede beliebige Phagenanheftungsstelle verwendet werden, wo die Auswahl der Phagenanheftungsstelle zumindest teilweise vom gewünschten Integrationsort für den Vektor abhängt. Repräsentative Phagenanheftungsstellen von Interesse umfassen unter anderem die U153attPP'-Anheftungsstele (wie im Versuchsteil detaillierter beschrieben ist), die PSAattPP'-Anheftungsstelle (wie im Versuchsteil nachstehend detaillierter beschrieben ist) und dergleichen.
• Zusätzlich dazu können die betreffenden Vektoren einen Replikationsstartpunkt umfassen, der die Replikation des Vektors in einer Nicht-Listeria-Wirstzelle, z. B. E. coli, bereitstellt. Dieser Replikationsstartpunkt kann jeder beliebige Replikationsstartpunkt oder jede beliebige Ori-Stelle sein, wobei eine Reihe von Ori-Stellen fachbekannt ist, wobei bestimmte Stellen von Interesse unter anderem p15A, pSC101, ColEI, pUC, pMB9 und dergleichen umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind.
• Außerdem umfassen die betreffenden Vektoren einen Transferstellenstartpunkt oder ein Element, wenn es zweckdienlich ist, z. B. wenn der Vektor unter Einsatz eines Konjugationsprotokolls in die Target-Listeria-Zelle eingeführt wird, wie unten stehend genauer erläutert wird. Es kann jeder beliebige Transferstartpunkt (oriT) verwendet werden, wobei repräsentative Transferstartpunkte von Interesse unter anderem RP4-oriT, RSF1010-oriT und dergleichen umfassen.
• Außerdem umfassen die gegenständlichen Vektoren typischerweise zumindest eine Restriktionsendonucleaseerkennungsstelle, d. h. Restriktionsstelle, die sich an einem Ort auf dem Vektor befindet, welcher der Insertion eines heterologen Gens/einer Expressionskassette unterworfen ist. Es ist eine Vielzahl von Restriktionsstellen fachbekannt und kann auf dem Vektor vorhanden sein, wo solche Stellen die von den folgenden Restriktionsenzymen erkannten Restriktionsstellen umfassen: HindIII, PstI, SalI, AccI, HincII, XbaI, BamHI, SmaI, XmaI, KpnI, SacI, EcoRI, BstXI, EagI, NotI, SpeI und dergleichen. In vielen Ausführungsformen umfasst der Vektor einen Polylinker oder eine multiple Klonierungsstelle, d. h. eine eng angeordnete Reihe oder Anordnung von Stellen, die von einer Vielzahl verschiedener Restriktionsenzyme, wie z. B. den oben angeführten, erkannt wird.
• Die Vektoren umfassen zumindest eine Kodiersequenz, d. h. eine Kodiersequenz für eine heterologe Polypeptid-/Proteinkodiersequenz, die in der multiplen Klonierungsstelle gegenwärtig ist, z. B. als Ergebnis der Verwendung einer Restriktionsendonucleasestelle, die in der multiplen Klonierungsstelle gegenwärtig ist, um die Kodiersequenz nach bekannten Rekombinationstechnologieprotokollen in den Vektor zu insertieren. „Heterolog” beschreibt, dass die Kodiersequenz für ein Produkt kodiert, z. B. ein Protein, Peptid, Polypeptid, Glykoprotein, Lipoprotein oder ein anderes Makromolekül, das normalerweise in Listeria nicht exprimiert wird. In vielen Ausführungsformen ist diese Kodiersequenz ein Teil einer Expressionskassette, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Listeria-Zelle bereitstellt, für welche der Vektor hergestellt wurde. Der Begriff „Expressionskassette” bezeichnet wie hierin verwendet ein Expressionsmodul oder Expressionskonstrukt, bestehend aus einem rekombinanten DNA-Molekül, das zumindest eine gewünschte Kodiersequenz und eine geeignete Nucleinsäuresequenz umfasst, die für die Expression der operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus, d. h. der Listeria-Zelle, notwendig ist, für welche der Vektor geschaffen ist, wie z. B. die Promotor-/Regulations-/Signalsequenzen, die zuvor identifiziert wurden, wobei die Expressionskassette wenn gewünscht Kodiersequenzen für zwei oder mehrere verschiedene Polypeptide oder multiple Kopien derselben kodierenden Sequenzen umfassen kann. Die Größe der kodierenden Sequenz und/oder Expressionskassette, die dasselbe umfasst, kann variieren, fällt aber in den Bereich von etwa 25–30 bis etwa 6000 bp, für gewöhnlich etwa 50 bis etwa 2000 bp. Daher kann die Größe des kodierten Produkts stark variieren, und es kann für ein breites Spektrum verschiedener Produkte von den Expressionskassetten kodiert werden, die in den Vektoren dieser Ausführungsform vorhanden sind.
• Das Wesen der kodierenden Sequenz und anderer Elemente der Expressionskassette kann variieren, abhängig von der besonderen Anwendung des Vektors, z. B. um Listeria-Spezies zu studieren, um Listeria-Spezies-Impfstoffe zu produzieren, zur zytosolischen Verabreichung von Markomolekülen etc. Zum Beispiel kann die Kodiersequenz, wo die Vektoren in der Produktion von Listeria-Impfstoffen verwendet werden, für ein heterologes Antigen kodieren, wobei repräsentative heterologe Antigene von Interesse unter anderem Folgendes umfassen: (a) virale Antigene, z. B. Influenza-np-Protein, HIV-gag-Protein, HiV-env-Protein oder Teile davon, z. B. gp120 und gp41, HIV-nef-Protein, HIV-pol-Proteine, reverse HIV-Transkriptase, HIV-Protease, Herpes-Virus-Proteine etc., (b) Malaria-Antigene, (c) Pilzantigene, (d) bakterielle Antigene, (e) Tumor- und tumorverwandte Antigene und dergleichen. Aufgrund der Flexibilität des Vektorsystems kann beinahe jede beliebige Kodiersequenz von Interesse insertiert werden. Wo die Sekretion jenes Produkts erwünscht ist, für welches die Expressionskassette kodiert, kann die Expressionskassette eine Kodiersequenz für ein Fusionsprotein eines gewählten fremden Antigens und eines Proteins umfassen, das die Sekretion lenkt, z. B. Listeriolysin O oder PI-PLC, eine Signalsequenz, wie z. B. eine Hämolysinsignalsequenz, etc. Wo die betreffenden Vektoren zur Herstellung von Listeria-Abgabevehikel verwendet werden, wie z. B. in PCT-Veröffentlichung Nr. WO 00/09733 und Dietrich et al., Nature Biotechnology 16, 181–185 (1998), beschrieben, kann die heterologe, für ein Polypeptid kodierende Sequenz ein Cytolysin sein, z. B. Phospholipase, ein porenbildendes Toxin, Listeriolysin O, Streptolysin O, Perfringolysin O, säureaktivierte Cytolysine, Phagenlysine etc. Andere Kodiersequenzen von Interesse umfassen unter anderem: Cytokine, co-stimulierende Moleküle und dergleichen. Wie oben angegeben kann der Vektor zumindest eine Kodiersequenz umfassen, wo in bestimmten Ausführungsformen die Vektoren zwei oder mehrere Kodiersequenzen umfassen, wo die kodierenden Sequenzen für Produkte kodieren können, die gleichzeitig wirken, um gewünschte Ergebnisse bereitzustellen.
• Im Allgemeinen kann die Kodiersequenz für eine beliebige Zahl verschiedener Produkte kodieren und kann aus einer Vielzahl verschiedener Größen sein, wobei die obige Diskussion rein repräsentative Kodiersequenzen von Interesse bereitstellt.
• VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DER GEGENSTÄNDLICHEN VEKTOREN
• Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können unter Einsatz eines herkömmlichen Protokolls hergestellt werden, einschließlich mittels Standardverfahren zur Restriktionsenzymspaltung, Ligation und Molekularklonierung. Ein Protokoll zur Herstellung der betreffenden Vektoren umfasst die folgenden Schritte. Erstens werden gereinigte Nucleinsäurefragmente, die Nucleotidsequenzen der gewünschten Komponente sowie fremde Sequenzen umfassen, mit Restriktionsendonucleasen aus anfänglichen Quellen gespalten. Fragmente, welche die gewünschten Nucleotidsequenzen enthalten, werden dann von unerwünschten Fragmenten unterschiedlicher Größe mithilfe herkömmlicher Trennverfahren getrennt, z. B. durch Agarose-Gelelektrophorese. Die gewünschten Fragmente werden aus dem Gel geschnitten und in der geeigneten Konfiguration zusammen ligiert; sodass eine zirkuläre Nucleinsäure oder ein zirkuläres Plasmid, das die gewünschten Sequenzen enthält, z. B. Sequenzen, die den verschiedenen Elementen der betreffenden Vektoren entsprechen, produziert wird, wie oben beschrieben. Wo es erwünscht ist, werden die so hergestellten zirkulären Moleküle in einem Wirt, z. B. E. coli, amplifiziert. Die Verfahren zur Spaltung, Plasmidherstellung, Zelltransformation und Plasmidproduktion, die in diese Schritte involviert sind, sind Fachleuten bekannt, und die Enzyme, die zur Restriktion und Ligation erforderlich sind, sind käuflich zu erwerben (siehe z. B. R. Wu, Hrsg., Methods in Enzymology, Band 68, Academic Press, N. Y. (1979), T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982), Katalog 1982–83, New England Biolabs, Inc., Katalog 1982–83, Bethesda Research Laborstories, Inc.). Ein Beispiel für die Herstellung eines Vektors der vorliegenden Erfindung ist im nachstehenden Versuchsteil bereitgestellt.
• VERFAHREN
• Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Verwendung der oben beschriebenen ortsspezifischen Listeria-Integrationsvektoren zur Integration einer heterologen Nucleinsäure in ein Listeria-Genom bereit. In der Ausführung dieser Verfahren wird ein Vektor der vorliegenden Erfindung in eine Target-Listeriazelle unter Bedingungen eingeführt, die zum Eintreten der Integration des Vektors in das Targetzellgenom ausreichend sind. Es kann jedes herkömmliche Protokoll zum Einführen des Vektors in die Targetzelle verwendet werden.
• Geeignete Protokolle umfassen kalziumphosphatvermittelte Transfektion; Protoplastenfusion, in welcher Protoplasten, die amplifizierte Mengen des Vektors tragen, mit der Targetzelle fusioniert werden; Elektroporation, in welcher ein kurzer elektrischer Hochspannungspuls auf die Taregtzelle angewendet wird, um die Zellmembran der Targetzelle für den Vektor durchlässig zu machen; Mikroinjektion, in welcher der Vektor direkt in die Zelle injiziert wird, wie in Capechhi et al., Cell 22, 479 (1980), beschrieben, und dergleichen. Die obigen In-vitro-Protokolle sind fachbekannt und werden in Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 16.30–16.55 (1989), detaillierter beschrieben.
• In bestimmten Ausführungsformen, z. B. wo die direkte Einführung in die Target-Listeriazelle keine optimalen Ergebnisse bereitstellt, ist ein repräsentatives Verfahren, das verwendet werden kann, ein Konjugationsverfahren, das Folgendes umfasst: (a) Einführung des Vektors in eine Nicht-Listeria-Wirtszelle, z. B. E. coli, gefolgt von (b) Transfer des Vektors von der Nicht-Listeria-Wirtszelle in die Listeria-Wirtszelle, z. B. durch Konjugation. Die Einführung in die Nicht-Listeria-Wirtszelle kann unter Einsatz beliebiger zuvor beschriebener Protokolle erreicht werden. Für den Konjugationsschritt kann jedes beliebige geeignete Protokoll verwendet werden, wobei geeignete Protokolle typischerweise die Kombination der Spender- und Akzeptorzellen in einem geeigneten Medium und das Halten unter geeigneten Bedingungen zum Eintritt von Konjugation und Vektortransfer umfassen. Spezifische repräsentative Bendingungen sind im nachstehenden experimentellen Teil bereitgestellt.
• Die obigen Verfahren resultieren in der stabilen Integration des Vektors und einer beliebigen davon getragenen Expressionskassette, die z. B. für ein heterologes Protein/fremdes Antigen kodiert, in ein Target-Listeriazellgenom auf ortsspezifische Art und Weise. Die betreffenden Verfahren finden mit einer großen Vielzahl verschiedener Listeria-Spezies Anwendung.
• NUTZEN
• Die oben beschriebenen Vektoren und Verfahren zur Verwendung derselbigen werden in einer Vielzahl verschiedener Anwendungen verwendet, wobei repräsentative Anwendungen unter anderem Folgendes umfassen: (a) Forschungsanwendungen, (b) Impfstoffherstellungsanwendungen; (c) Anwendungen zur Herstellung von Listeria-Abgabevehikel und dergleichen.
• Eine Form der Anwendung, in welcher die betreffenden Vektoren und Verfahren zu deren Verwendung verwendet werden können, ist die Erforschung von Listeria-Spezies. Zum Beispiel ermöglichen die betreffenden Vektoren und Verfahren eine einfache und wirksame Stammherstellung und sind in verschiedenen Stämmen, die verwendet werden, um den intrazellulären Lebenszyklus von L. monocytogenes zu studieren, weitgehend nützlich. Außerdem können die betreffenden Vektoren und Verfahren verwendet werden, um stabile merodiploide Stämme zu produzieren, um verfeinerte Studien der Kopienzahl und Studien über die Wechselwirkungen innerhalb eines Proteins durch Multimerisierung und Testen der Dominanz oder rezessiven Art verschiedener Allele eines Gens im selbem Bakterienstamm zu ermöglichen.
• Die betreffenden Vektoren und Verfahren werden auch in Impfstoffherstellungsanwendungen verwendet. Zum Beispiel finden die betreffenden Vektoren in der Produktion von Listeria-Kulturen Anwendung, die zur Expression eines heterologen Antigens in der Lage sind, d. h. in Listeriaimpfstoffen, wobei die verwendeten Listeriazellen abgeschwächt sein können. Die verwendeten abgeschwächten Stämme können zur normalen Invasion einer Wirtszelle in der Lage, jedoch nicht zum normalen Überleben oder Wachstum in der Zelle oder Zell-Zell-Verbreitung in der Lage sein, oder sie können andere Veränderungen haben, die eine normale Pathogenität ausschließen.
• Die unter Verwendung der Vektoren der vorliegenden Erfindung produzierten Impfstoffe werden einem Wirbeltier durch Kontaktieren des Wirbeltiers mit einer subletalen Dosis des gentechnologisch hergestellten Listeria-Impfstoffes verabreicht, wobei der Kontakt typischerweise die Verabreichung des Impfstoffes an den Wirt umfasst. Daher stellt die vorliegende Erfindung Impfstoffe bereit, die mit dem Integrationsvektor gentechnologisch hergestellt werden und in einer pharmazeutisch annehmbaren Formulierung bereitgestellt sind. Die Verabreichung kann oral, parenteral, intranasal, intramuskulär, intravaskulär, über direkte Vakzinierung der Lymphknoten, über die Verabreichung mittels Katheter oder über einen oder mehrere einer Vielzahl bekannter Verabreichungswege erfolgen. Bei Nutztieren kann der Impfstoff zum Beispiel oral mittels Zugeben des Impfstoffes zu Futter oder Flüssigkeit (wie z. B. Wasser) erfolgen. Er kann als gefriergetrocknetes Pulver, als gefrorene Formulierung oder als Komponente einer Kapsel oder in jeder beliebigen anderen herkömmlichen, pharmazeutisch annehmbaren Formulierung verabreicht werden, welche die Antigenität des Impfstoffes erhält. Jeder einer Reihe bekannter pharmazeutisch annehmbarer Verdünnungsmittel oder Träger kann in den Impfstoffen der Erfindung verwendet werden. Geeignete Verdünnungsmittel umfassen zum Beispiel steriles destilliertes Wasser, Salzlösung, phosphatgepufferte Lösung und dergleichen. Die Menge des Verdünnungsmittels kann, wie einem Fachmann klar ist, stark variieren. Geeignete Träger sind Fachleuten bekannt und können zum Beispiel aus A. Wade und P. J. Weller, Hrsg., Handbook of Pharmaceutical Excipients, The Pharmaceutical Press: London (1994), ausgewählt werden. Die verabreichte Dosierung kann vom Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Patienten und gegebenenfalls dem Bestehen einer gleichzeitigen Behandlung abhängen. Die Impfstoffe können in Dosierungsformen wie Kapseln, flüssigen Lösungen, Suspensionen oder Elixieren zur oralen Verabreichung oder in sterilen Flüssigkeiten für Formulierungen wie z. B. Lösungen oder Suspensionen zur parenteralen, intranasalen, intramuskulären oder intravaskulären Anwendung verwendet werden. Gemäß der Erfindung kann der Impfstoff in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel als Impfstoffzusammensetzung verwendet werden, die zur Immunisierung eines Patienten gegen Infektion durch einen ausgewählten Organismus oder ein ausgewähltes Virus oder im Hinblick auf einen Tumor etc. zweckdienlich ist. Die Immunisierung eines Patienten bedeutet, dem Patienten zumindest einen gewissen Grad an therapeutischer oder prophylaktischer Immunität gegen ausgewählte Pathogene, kanzeröse Zellen etc. bereitzustellen.
• Die betreffenden Impfstoffe, die mit den betreffenden Vektoren hergestellt wurden, werden in Verfahren zum Auslösen oder Fördern einer Helfer-T-Zell- oder einer zytotoxischen T-Zellreaktion auf ein gewähltes Mittel, z. B. einen pathogenen Organismus, Tumor etc., bei einem Wirbeltier verwendet, wobei solche Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Listeria-Impfstoffes umfassen. Die betreffenden Impfstoffe, die mit den betreffenden Vektoren hergestellt wurden, finden in Verfahren zum Auslösen einer endogenen Immunreaktion Anwendung, welche die antigenspezifische Immunreaktion verstärkt. Weiters können die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung zur Behandlung nach der Exposition oder nach der Diagnose verwendet werden. im Allgemeinen ist die Verwendung von Impfstoffen zur Postexpositionsbehandlung von Fachleuten anerkannt, zum Beispiel in der Behandlung von Tollwut und Tetanus. Es kann derselbe Impfstoff der vorliegenden Erfindung z. B. sowohl zur Immunisierung als auch zur Förderung der Immunität nach Exposition verwendet werden. Alternativ dazu kann ein anderer Impfstoff der vorliegenden Erfindung zur Postexpositionsbehandlung eingesetzt werden, z. B. für eine solche Behandlung, die für Antigene spezifisch ist, die in späteren Expositionsstadien exprimiert werden. Daher finden die betreffenden Impfstoffe, die mit den betreffenden Vektoren hergestellt wurden, sowohl als prophylaktische als auch therapeutische Impfstoffe Anwendung, um Immunreaktionen zu induzieren, die für Antigene spezifisch sind, welche für verschiedene Krankheitszustände relevant sind.
• Der Patient kann jedes beliebige menschliche und nicht-menschliche Tier sein, das für eine Infektion mit dem gewählten Organismus anfällig ist. Die betreffenden Impfstoffe werden insbesondere bei Wirbeltieren wie Menschen und Nutztieren verwendet. Nutztiere umfassen Hausgeflügel, Rinder, Schweine, Schafe, Pferde, Ziegen, Leporidae (wie z. B. Kaninchen) oder andere Tiere, die in Gefangenschaft gehalten werden können.
• Im Allgemeinen werden die betreffenden Vektoren und Verfahren in der Produktion von Impfstoffen wie in US-Patent Nr. 5.830.702 und PCT-Veröffentlichung Nummer WO 99/25376 beschrieben verwendet.
• Die betreffenden Vektoren werden auch in der Produktion von Listeria-Abgabevektoren zur Abgabe von Makromolekülen an Targetzellen verwendet, wie z. B. in PCT-Veröffentlichung Nummer WO 00/09733 und Dietrich et al., Nature Biotechnology 16, 181–185 (1998), beschrieben. Es kann eine Vielzahl verschiedener Formen von Makromolekülen abgegeben werden, einschließlich aber nicht ausschließlich Nucleinsäuren, Polypeptide/Proteine etc., wie in diesen Publikationen beschrieben.
• SETS & SYSTEME
• Es werden auch Sets und Systeme bereitgestellt, die in der Herstellung der betreffenden Vektoren und/oder der Herstellung rekombinanter Listeriazellen unter Einsatz der betreffenden Vektoren und Verfahren wie zuvor beschrieben verwendet werden. Zum Beispiel können Sets und Systeme zur Produktion der betreffenden Vektoren eines oder mehrere der Folgenden umfassen: einen Anfangsvektor mit einer multiplen Klonierungsstelle, eine Restriktionsendonuclease zur Spaltung einer Stelle in der multiplen Klonierungsstelle, einen Vektor, der eine Expressionskassette von Interesse umfasst, die in die multiple Klonierungsstelle eingeführt werden soll, etc. Wenn die Sets und Systeme zur Produktion von rekombinanten Listeriazellen hergestellt worden sind, können die Sets und Systeme wie oben beschrieben Vektoren oder Komponenten zur Herstellung derselbigen, Listeria-Targetzellen, Nicht-Listeria-Wirtszellen und dergleichen umfassen. Die betreffenden Sets können weiters andere Komponenten umfassen, die in den betreffenden Verfahren verwendet werden, z. B. Reaktionspuffer, Wachstumsmedien etc.
• Die verschiedenen Reagenskomponenten der Sets können in getrennten Behältern vorhanden sein oder alle zu einem Reagensgemisch zur Kombination mit Matrizen-DNA vorvereinigt werden.
• Zusätzlich zu den obigen Komponenten umfassen die betreffenden Sets weiters Gebrauchsanweisungen zur Ausführung der betreffenden Verfahren. Diese Gebrauchsanweisungen können in den betreffenden Sets in einer Reihe von verschiedenen Formen vorliegen, wovon eine oder mehrere im Set vorhanden sind. Eine Form, in welcher diese Gebrauchsanweisungen vorhanden sein können, ist eine gedruckte Information auf einem geeigneten Medium oder Substrat, z. B. ein oder mehrere Blatt Papier, auf welchem die Information gedruckt ist, in der Verpackung des Sets, in einer Packungsbeilage etc. Ein wieder anderes Mittel wäre ein von einem Computer lesbares Medium, z. B. eine Diskette, eine CD etc., auf welche die Information gespeichert worden ist. Ein wieder anderes Mittel, das vorhanden sein kann, ist die Adresse einer Website, die via Internet verwendet werden kann, um Zugang zu der Information an einem anderen Ort zu erhalten. In den Sets können beliebige herkömmliche Mittel gegenwärtig sein.
• Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind in keinster Weise einschränkend.
• BEISPIELE
• 1. MATERIALIEN UND VERFAHREN
• A. Herstellung des pPL1-Integrationsvektors
• Standardmolekularverfahren wurden zur Herstellung des 6101-bp-Integrationsvektors pPL1 verwendet (1A). Die vollständige Sequenz des pPL1-Vektors ist als Seq.-ID Nr. 25 bereitgestellt. pPL1 ist ein Plasmid mit niedriger Kopienzahl, das sich in E. coli autonom repliziert und auf ortsspezifische Art und Weise in L. monocytogenes integriert und wurde wie folgt aus 6 unabhängigen DNA-Quellen assembliert. Restriktionsstellen in den PCR-Primern, die zur Herstellung verwendet werden, sind unterstrichen. Alle PCR-Reaktionen, die in den Klonierungsschritten verwendet worden waren, verwendeten Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs).
• Die multiple Klonierungsstelle (MCS) von pBluescript-KS-(M. A. Alting-Mees und J. M. Short; pBluescript II: gene mapping vectors, Nucleic Acids Res. 17, 9494 (1989)) (bp 1–171) wurde nach PCR mit den Primern 5'-GGACGTCATTAACCCTCACTAAAGG-3' und 5'-GGACGTCAATACGACTCACTATAGG-3' (Seq.-ID Nr. 01 & 02) kloniert.
• Der gramnegative Replikationsstartpunkt mit niedriger Kopienzahl und das Chloramphenicolacetyltransferase-(CAT-)Gen von pACYC184 (A. C. Chang und S. N. Cohen; Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid, J. Bacteriol. 134, 1141–1156 (1978)) (bp 172–2253) wurde nach PCR mit den Primern 5'-GGACGTCGCTATTTAACGACCCTGC-3' und 5'-GAGCTGCAGGAGAATTACAACTTATATCGTATGGGG-3' (Seq.-ID Nr. 03 & 04) kloniert. Zur direkten Konjugation von E. coli an L. monocytogenes wurde der RP4-Transferstartpunkt (oriT) (W. Pansegrau, E. Lanka, P. T. Barth, D. H. Figurski, D. G. Guiney, D. Haas, D. R. Helinski, H. Schwab, V. A. Stanisich und C. M. Thomas, Complete nucleotide sequence of Birmingham IncP alpha plasmids. Compilation and comparative analysis, J. Mol. Biol. 239, 623–663 (1994)) (bp 2254–2624) aus Plasmid pCTC3 (D. R. Williams, D. I. Young und M. Young, Conjugative plasmid transfer from Escherichia coli to Clostridium acetobutylicum, J. Gen. Microbiol. 136, 819–826 (1990)) nach PCR mit den Primern 5'-GCACTGCAGCCGCTTGCCCTCATCTGTTACGCC-3' und 5'-CATGCATGCCTCTCGCCTGTCCCCTCAGTTCAG-3' (Seq.-ID Nr. 05 & 06) kloniert. Das Listeriaphagen-U153-Integrase-Gen und Anheftungsstelle (attPP') (A. Nolte, P. Lauer und R. Calendar, unveröffentlicht, bp 2629–4127) (Seq.-ID Nr. 25 umfasst die Sequenzen für diese Stellen), welche die ortsspezifische Integration des Plasmids steuern, wurden nach PCR mit den Primern 5'-GTAGATCTTAACTTTCCATGCGAGAGGAG-3' und 5'-GGGCATGCGATAAAAAGCAATCTATAGAAAAACAGG-3' (Seq.-ID Nr. 07 & 08) kloniert. Zur Expression des U153-Integrase-Gens wurde der L.-monocytogenes-p60-Promotor (P. Lauer, J. A. Theriot, J. Skoble, M. D. Welch, D. A. Portnoy; Systematic mutational analysis of the amino-terminal domain of the Listeria monocytogenes ActA protein reveals novel functions in actin-based motility, Mol. Microbiol. 42; 1163–1177 (2001)) mittels PCR mit den Primern 5'-CCTAAGCTTTCGATCATCATAATTCTGTC-3' und 5'-GGGCATGCAGATCTTTTTTTCAGAAAATCCCAGTACG-3' (Seq.-ID Nr. 09 & 10) amplifiziert und stromauf des Integrase-Gens kloniert. Die Basenpaare 4570–6101 bilden ein Hind-III-Aat-II-Restriktionsfragment, das aus pUC18-Cat (ein Geschenk von Nancy Freitag) subkloniert wurde, und enthalten das induzierbare grampositive CAT-Gen von pC194 (S. Horinouchi und B. Weisblum; Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance, J. Bacteriol. 150, 815–825 (1982)) (bp 4788–5850).
• B. Klonierung von hly- und actA-Genen in pPL1.
• Das hly-Gen wurde aus Plasmid pDP-906 (S. Jones und D. A. Portnoy, Characterization of Listeria monocytogenes pathogenesis in a strain expressing perfringolysin O in place of listeriolysin O, Infect Immun. 62(12), 5608–5613 (1994)) durch Restriktionsverdau mit BamHI und XbaI, Gelreinigung eines 2,9-kb-Fragments und Ligation in einen mit BamHI und SpeI geschnittenen pPL1 subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde pPL24 (1A) genannt. Das actA-Gen wurde mittels PCR von genomischer 10403S-DNA mit den Primern 5'-GGTCTAGATCAAGCACATACCTAG-3' und 5'-CGGGATCCTGAAGCTTGGGAAGCAG-3' (Seq.-ID Nr. 11 & 12) amplifiziert. Das 2220-bp-PCR-Produkt wurde gelgereinigt, mit BamHI und XbaI geschnitten und in einen mit BamHI und SpeI geschnittenen pPL1 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pPL25 genannt (1A).
• C. Phagen-Curing, Konjugation und molekulare Bestätigung von Plasmidintegration
• Phagen-Curing wurde mittels Anpassung historischer Methodiken erreicht (D. Cohen, A variant of Phage P2 Originating in Escherichia coli, strain B, Virology 7, 112–126 (1959); E. Six, Prophage substitution and curing in lysogenic cells superinfected with hetero-immune phage, J. Bacteriol. 80, 728–729 (1960)). L.-monocytogenes-10403S-Derivate, die einen Prophagen an comK-attBB' tragen (integriert in das comK-ORF wie beschrieben (M. J. Loessner, R. B. Inman, P. Lauer und R. Calendar, Complete nucleotide sequence, molecular analysis and genome structure of bacteriophage A118 of Listeria monocytogenes: implications for phage evolution, Mol. Microbiol. 35(2), 324–340 (2000))) wurden in BHI bei 37°C auf 10⁸ CFU/ml gezüchtet und mit Listeriaphagen-U153 (D. A. Hodgson, Generalized transduction of serotype 1/2 und serotype 4b strains of Listeria monocytogenes, Mol. Miocrobiol. 35(2), 312–323 (2000)) bei einer Infektionsmultiplizität von 20:1 in Gegenwart von 5 mM CaCl₂ infiziert. Die Kulturen wurden durch Schütteln bei 37°C 75 Minuten lang inkubiert, und die Hemmung des Wachstums wurde durch einen Vergleich von OD₆₀₀ der infizierten Kultur mit einer nicht infizierten Kontrollkultur überwacht. Die infizierte Kultur wurde 10^–2 und 10^–4 in BHI verdünnt, und beide Verdünnungen wurden bei 37°C wachsen gelassen, bis die 10^–2-Verdünnung in optischer Dichte 100fach gesteigert worden war. Die 10^–4 fache Verdünnung wurde dann 10^–2 verdünnt, und 3 μl wurden auf BHI ausplattiert. Fünfzig Kolonien wurden auf Phagenfreisetzung getestet, anfänglich durch Auswählen von Kolonien mit Zahnstocher in 0,25 ml LB-Broth und Replikaplattierung bei 30°C auf einem Rasen von Mack-4R (DP-L862), einem nicht-lysogenen groben Stamm von L. monocytogenes, der insbesondere für die Bildung von Plaques empfindlich ist. Dann wurden Kandidaten, die keine Plaques bildeten, getestet, indem 10 μl der Kultur auf einen Mack-4R-Rasen gespottet wurden, um die Plaque-Bildung zu detektieren. Wenn dieser zweite Test negativ war, wurde getestet, ob der Kandidat die Plaque-Bildung durch den Phagen vom 10403S-Elternstamm unterstützen konnte (Φ 10403, D. A. Hodgson, Generalized transduction of serotype 1/2 und serotype 4b strains of Listeria monocytogenes; Mol. Microbiol. 35(2); 312–323 (2000)). Es wurde Curing mittels PCR mit dem comK-attBB'-spezifischen Primerpaar PL60/PL61 (die Sequenzen folgen) für das Fehlen eines Phagen an comK-attBB' molekular nachgewiesen. Etwa 10% der Kolonien wurden unter Einsatz dieses Verfahrens Curing unterworfen.
• Rezipientenstämme von L. monocytogenes (SLCC-5764, DP-L1169 und DP-L1172) wurden zur Gegenselektion in Konjugationsversuchen durch Plattenselektion auf BHI, das mit 200 μg/ml Antibiotikum ergänzt war, streptomycinresistent gemacht.
• pPL1-Plasmidkonstrute wurden in den E.-coli-Stamm SM10 elektroporiert (R. Simon; U. Priefer und A. Pühler; A broad host range mobilization system for in vitro genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria; Bio/Technology 1, 784–791 (1983)) unter Einsatz von Standardverfahren (J. Sambrook, T. Maniatis und E. F Fritsch, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N. Y. (1989)), Bakterielle Stämme wurden bis mid-log (OD₆₀₀ ~0,55) unter Schütteln bei 30°C gezüchtet. E.-coli-Spenderstämme wurden in LB, das 25 μg/ml Chloramphenicol enthielt, gezüchtet. L.-monocytogenes-Rezipientenstämme wurden in BHI gezüchtet. 2,5 ml einer Spenderkultur wurden mit 1,5 ml Rezipientenkultur auf vorgewaschenen 47-mm-0,45-μm-Filtern vom HA-Typ (Millipore) filtriert. Der Filter würde einmal mit 10 ml BHI gewaschen, auf eine BHI-Platte ohne Antibiotika transferiert und 2 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die Bakterienzellen wurden sanft in 2,5 ml BHI resuspendiert, und 25-μl- und 50-μl-Aliquoten wurden in 3 ml LB-Topagar auf BHI-Platten ausplattiert, die mit 7,5 μg/ml Chloramphenicol und 200/ml Streptomycin ergänzt waren. Die Platten wurden bei 30°C über Nacht inkubiert und für 2–3 Tage auf 37°C geändert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und mittels PCR auf Integration an der Phagenanheftungsstelle unter Einsatz der Primer PL14 (5'-CTCATGAACTAGAAAAATGTGG-3') (Seq.-ID Nr. 13), PL60 (5'-TGAAGTAAACCCGCACACGATG-3') (Seq.-ID Nr. 14) und PL61 (5'-TGTAACATGGAGGTTCTGGCAATC-3') (Seq.-ID Nr. 15) gescreent. PCR-Reaktionen wurden auf kleinen Abschnitten individueller Bakterienkolonien durchgeführt, die mit sterilen P200-Pipettenspitzen von BHI-Platten direkt in 20 μl PCR-Reaktionen überimpft wurden. Das Primerpaar PL14/PL61 amplifiziert speziell attBP' in einer PCR-Reaktion, was zu einem 743-bp-Produkt auf integrierten Stämmen führt (sowohl Prophagen- als auch pPL1-Derivate). Das Primerpaar PL60/PL61 amplifiziert speziell comK-attBB' in einer PCR-Reaktion, was zu einem 417-bp-Produkt nur auf nicht-lysogenen Stämmen (d. h. DP-L-4056 führt). PCR-Tests wurden in einem Hybaid-Omn-E-Thermocycler mit einer Annealing-Temperatur von 55°C für 30 Zyklen durchgeführt. Es entstanden Integranten bei einer Häufigkeit von etwa 2 × 10^–4 pro Spenderzelle.
• D. Hämolyse auf Blutplättchen und hämolytischer Aktivitätstest
• Die Hämolyse auf Blutplatten wurde auf tryptischen Sojaagarplatten beurteilt, die mit 5% Schafblut ohne Fimbrin (HemoStat, Davis, Kalifornien) ergänzt waren. Hämolytische Tests wurden im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (D. A. Portnoy; P. S. Jacks und D. J. Hinrichs, Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes; J. Exp. Med. 167(4), 1459–1471 (1988)). Hämolytische Aktivität wird als reziproker Wert der Verdünnung des Kulturüberstands ausgedrückt, der erforderlich ist, um 50% von Schaferythrozyten zu lysieren.
• E. Plaque-Bildung in L2-Zellen
• Plaque-Größen wurden wie zuvor beschrieben bestimmt (P. Lauer, J. A. Theriot, J. Skoble, M. D. Welch und D. A. Portnoy; Systematic mutational analysis of the aminoterminal domain of the Listeria monocytogenes ActA-Protein reveals novel functions in actin-based motility; Mol. Microbiol. 42(5); 1163–1177 (2001)). Jeder Stamm wurde Plaque-Bildung in 6 bis 8 unabhängigen Versuchen unterworfen und in jedem Versuch mit 10403S verglichen.
• F. SDS-PAGE von oberflächenexprimiertem ActA
• Oberflächenexprimiertes ActA-Protein wurde aus Spät-Logphasen-Bakterienkulturen hergestellt, die in LB-Broth gezüchtet wurden (OD₆₀₀ ~0,7), indem entsprechende Mengen in SDS-PAGE-Puffer resuspendiert und 5 min. gesiedet wurden, was oberflächenexprimiertes Protein extrahiert, die Zellwand jedoch nicht stört. Entsprechende Mengen wurden auf 7% SDS-PAGE geladen und mit Coomassie-Blau sichtbar gemacht.
• G. Xenopus-laevis-Zellextraktmotilitätstests
• Ein zytoplasmatisches Extrakt eines X.-laevis-Eis wurde wie beschrieben hergestellt (J. A. Theriot, J. Rosenblatt, D. A. Portnoy, P. J. Goldschmidt-Clermont und T. J. Mitchison, Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts, Cell 76(3), 505–517 (1994)) und mit tetramethylrhodaminiodacetamidmarkiertem Actin (J. A. Theriot und D. C. Fung, Listeria monocytogenesbased assays for actin assembly factors; Methods Enzymol, 298; 114–122 (1998)) ergänzt. Von SLCC-5764 abstammende Stämme wurden über Nacht bis zur stationären Phase wachsen gelassen, einmal gewaschen, zu Zellextrakten zugegeben und 45 Minuten lang inkubiert, bevor sie mikroskopisch beobachtet wurden.
• H. LD₅₀-Bestimmungen
• Bei BALB/c-Mäusen wurde wie beschrieben begrenztes LD₅₀ durchgeführt (D. A. Portnoy; P. S. Jacks und D. J. Jacks, Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes, J. Exp. Med. 167(4), 1459–1471 (1988)). Tierversuche wurden im Labor von Archie Bouwer im Oregon Health Sciences Center, Portland, Oregon, durchgeführt.
• I. Identifikation der PSA-Anheftungsstelle und Herstellung von pPL2
• Die PSA-Anheftungsstellen-(tRNA^Arg-attBB'-)DNA-Sequenz wurde durch eine Kombination von inverser PCR und Genom-Walking erhalten. Inverse PCR wurde auf Sau3-AI-verdauter DP-L4061-DNA (WSLC-1042-lysogen für PSA) (Seq.-ID Nr. 26 ist die Sequenz von 2.072 bp, die WSLC-1042-tRNA^Arg-attBB' umgibt) unter Einsatz der divergierenden Primer PL95 (5'-ACATAATCAGTCCAAAGTAGATGC) (Seq.-ID Nr. 16) und PL97 (5'-ACGAATGTAAATATTGAGCGG) (Seq.-ID Nr. 17) durchgeführt, die innerhalb des PSA-int-Gens anellieren. Die resultierende DNA-Sequenz wurde zur Herstellung weiterer Oligonucleotide verwendet, und diese wurden mit dem Genome-Walker-Set (Clontech) nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet. DNA-Sequenz- und tRNA-Analyse wurde unter Einsatz von MacVector (Accelrys), DNAsis (Hitachi), BLAST-Algorithmus (2) und tRNA-scan-SE (T. M. Lowe und S. R. Eddy; tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence; Nucleic Acids Res. 25(5); 955–964 (1997)) durchgeführt.
• pPL1 wurde modifiziert, um eine andere Anheftungsstelle auf dem L.-monocytogenes-Chromosom zu verwenden, indem das U153-Integrase-Gen und Anheftungsstelle im Plasmid ersetzt wird. Das PSA-int und attPP' wurde mittels PCR aus genomischer PSA-DNA mit den Primern PL100 (5'-GAAGATCTCCAAAAATAAACAGGTGGTGG) (Seq.-ID Nr. 18) und PL101 (5'-CATGCATGCGTGGAGGGAAAGAAGAACGC) (Seq.-ID Nr. 19) mit Vent-DNA-Polymerase amplifiziert, mit BglII und SphI verdaut und an pPL1 ligiert, das mit denselben Enzymen verdaut worden war. Das resultierende Plasmid wurde pPL2 genannt (1B). Die Sequenz von pPL2 ist als Seq.-ID Nr. 28 bereitgestellt.
• Die DNA-Sequenz von PSA-tRNA^Arg-attBB' von Serotyp-1/2-L.-monocytogenes-Sätmmen wurde durch eine Plasmid-Einfang-Strategie erhalten. Genomische DP-L4211-DNA (in 10403S integriertes pPL2) wurde mit NsiI und NheI verdaut, die im Vektor nicht spalten, und unter verdünnten Bedingungen ligiert, um Selbstligation zu fördern. Die Ligationen wurden in XL-1-Blau transformiert, und es wurden chloramphenicolresistente Kolonien ausgewählt. Die erhaltenen Plasmide wurden mit den konvergenten Primern PL94 (5'-GGAGGGAAAGAAGAACGC) (Seq.-ID Nr. 20) und PL95 (Sequenz s. o.) für attPB' bzw. attBP' sequenziert, die attPP' in der genomischen PSA-DNA-Sequenz flankieren. Weiters wurde aufgrund der Divergenz zwischen den Sequenzen stromab des tRNA^Arg-Gens unter Serotypen ein Serotyp-1/2-spezifischer PCR-Test über tRNA^Arg-attBB' aus der 10403S-DNA-Sequenz entwickelt und dazu verwendet, den Prophagenstatus verschiedener L-monocytogenes-Stämme zu bestimmen. Die Primer PL102 (5'-TATCAGACCTAACCCAAACCTTCC) (Seq.-ID Nr. 21) und PL103 (5'-AATCGCAAAATAAAAATCTTCTCG) (Seq.-ID Nr. 22) amplifizieren speziell ein 533-bp-PCR-Produkt in nicht-lysogenen Serotyp-1/2-Stämmen. Das Primerpaar NC16 (5'-GTCAAAACATACGCTCTTATC (Seq.-ID Nr. 23) und PL95 amplifiziert insbesondere ein 499-bp-PCR-Produkt in Stämmen, die entweder lysogen sind oder einen Integrationsvektor an tRNA^Arg-attBB' enthalten. (Seq.-ID Nr. 27 stellt die 643 bp bereit, die 10403S-tRNA^Arg-attBB' umgeben.)
• II. ERGEBNISSE UND DIKUSSION
• A. pPL1 bildet stabile Einzelkopieintegranten in verschiedenen L-monocytogenes-Stämmen
• pPL1 ist der erste Shuttle-Integrationsvektor, den die Erfinder herstellten, um die Stammbildung in L. monocytogenes zu erleichtern. Zum Testen des pPL1-Vektors brauchten die Erfinder einen L.-monocytogenes-Stamm, der an der bakteriellen comK-Anheftungsstelle keinen Phagen aufwies. Die Erfinder adaptierten historische Verfahren zum Entfernen von Prophagen von L.-monocytogenes-Stämmen und stellten nach einer Superinfektion mit dem Phagen U153, der dieselbe Anheftungsstelle besitzt wie der endogene 10403S-Prophage, fest, dass sie in der Lage waren, prophagenfreie Stämme zu isolieren (siehe Materialien und Verfahren). Der 10403S-Stamm, dessen Prophagen entfernt waren, wurde DP-L4056 genannt und in darauf folgenden Versuchen verwendet.
• Konjugation wurde als Verfahren zur Einführung des Vektors in die Targetzellen verwendet, weil viele Listeria-Spezies ineffizient transformiert sind. Die Konjugation von pPL1 von E. coli in L. monocytogenes war erfolgreich. Arzneimittelresistente Transkonjugante entstanden in einer reproduzierbaren Häufigkeit von ~2 × 10^–4 pro Spender-E.-coli-Zelle, etwa dreimal geringer als eine Konjugation mit autonom replizierenden Plasmiden, was ~30% Integrationseffizienz für Stämme anzeigt, die das Plasmid durch Konjugation erhalten. Alle chloramphenicolresistenten Kolonien waren mit dem PCR-Test unter Einsatz der Primer PL14 und PL61 positiv und unter Einsatz eines PCR-Tests über attPP' in pPL1 (PL14 gepaart mit einem Primer in RP4-oriT) negativ, was anzeigt, dass sie wahre Integranten waren und dass sich das volle genetische Komplement von Plasmid pPL1 in das Listeria-Chromosom integriert hatte. Zusätzlich zeigte dieser Versuch, dass pPL1 nicht als Episomenplasmid beibehalten wurde und dass der Vektor nicht als Concatamer integriert.
• Die Erfinder testeten die Stabilität der Integranten unter nicht-selektiven Wachstumsbedingungen. Drei wesentliche Stämme, DP-L4074 und die merodiploiden Stämme DP-L4076 und DP-L4078 (in den folgenden Abschnitten beschrieben), wurden für 100 Generationen in flüssiges BHI-Medium geleitet und für einzelne Kolonien ausplattiert. Sechsundneunzig Kolonien wurden dann gegenüber 0,1 μg/ml Chloramphenicol exponiert (um CAT-Genexpression zu induzieren) und auf Platten, die 7,5 μg/ml Anitibiotikum enthielten, positioniert. Alle Kolonien blieben arzneimittelresistent. Dreißig Kolonien jedes nicht-selektiven Wachstumsversuchs wurden mit dem PL14/PL61-PCR-Test getestet, und alle PCR-Reaktionen resultierten in dem 743-bp-Produkt, was angab, dass alle Transkonjuganten das integrierte Plasmid beibehielten.
• Die Erfinder beschäftigten sich weiter damit, ob der Integrationsvektor im Allgemeinen für einen beliebigen L.-monocytogenes-Stamm mit einer verfügbaren Anheftungsstelle nützlich ist. Es wurden mehr als 320 Listeriaphagen isoliert, und viele haben eingeschränkte Wirtbereiche. Es war unklar, ob es eine biologische Barriere für die U153-Integrase-Genfunktion in Wirtsstämmen gab, die eine U153-Infektion nicht unterstützen. Die Erfinder wählten daher drei Stämme aus, die an der comK-Anheftungsstelle keinen Prophagen enthielten, zwei klinische Serotyp-4b-Isolate und SLCC-5764, einen Serotyp-1/2a-Stamm, der die bekannten Virulenzfaktoren in einer ungeregelten Weise konstitutiv exprimierte und zum In-vitro-Studium dieser Virulenzfaktoren geeignet gewesen ist. Jeder dieser Stämme wurde zuerst für eine Gegenselektion in Konjugationsversuchen streptomycinresistent gemacht (wie in Materialien und Verfahren beschrieben). Streptomycinresistente Derivate wurden auf Basis derselben Wachstumsrate wie jener des Elternstamms ausgewählt, um Versuchskomplikationen zu vermeiden, die mit der Lebensfähigkeit in Verbindung standen. Die resultierenden Stämme DP-L4088, DP-L4089 und DP-L4082 erwiesen sich alle als geeignete Rezipienten für pPL1-Integration bei einer ähnlichen Häufigkeit wie DP-L4056.
• Letztendlich führten die Erfinder unter Einsatz eines PCR-Tests über comK-attBB' (Primer PL60/PL61) und dem Hybrid attPB' (Primer PL14/PL61) eine Studie über L.-monocytogenes-Isolate durch, um geeignete Stämme zu identifizieren, die an der comK-Anheftungsstelle keinen Prophagen beherbergten. Die Ergebnisse dieser Versuche (Tabelle 2) zeigten, dass viele der Stämme, die für gewöhnlich zum Studium der Biologie und Pathogenese von L. monocytogenes verwendet wurden, einschließlich 10403S, L028 und EGDe, einen Prophagen an comK hatten. Tabelle 2: Prophagenstatus verschiedener Stämme

  Stamm	Beschreibung	Quelle	Serotyp	PL60/PL61 comK	PL14/PL61 attPB'
  10403S	Wildtyp	Kaninchenpellets	1/2a	–a	+
  DP-L4056	10403S-Phage, cured	diese Arbeit	1/2a	+b	–
  DP-L861	SLCC-5764 (Mack)	WT (Überexprimierer)	1/2a	+	–
  DP-L3818	WSLC 1118::A118	Camembert-Käse	4b	–	+
  DP-L3633	EGDe	WT (1960iger, menschlich)	1/2a	–	+
  DP-L3293	LO28	WT (klinischer Ursprung)	1/2c	–	+
  DP-L185	F2397	L. A., Jalisco-Käse	4b	+	–
  DP-L186	ScottA	Massachusetts-Massenauftreten, Milch	4b	+	–
  DP-L188	ATTC 19113	Dänemark, menschlich	3	+	–
  DP-L1168	klinisch	Kohlsalat	4b	+	–
  DP-L1169	klinisch	Patient	4b	+	–
  DP-L1170	klinisch	Patient	4b	+	–
  DP-L1171	klinisch	Brie	1/2b	+	–
  DP-L1172	klinisch	Alfalfa-Tabletten	4b	+	–
  DP-L1173	klinisch	verstorbener Patient	4b	–	+
  DP-L1174	klinisch	verstorbener Patient	4b	–	+
  DP-L3809	1981 Halifax	Plazenta	4b	+	–
  DP-L3810	1981 Halifax	CSF & Gehirn	4b	+	–
  DP-L3812	1981 Halifax	Kohlsalat	4b	+	–
  DP-L3813	1996 Halifax	Blut	?	–	+
  DP-L3814	1981 Halifax	CSF	4b	+	–
  DP-L3815	1993 Halifax	CSF	1/2a	+	–
  DP-L3816	1995 Halifax	Blut	?	+	–
  DP-L3817	1993 Halifax	CSF	1/2a	+	–
  DP-L3862	1998 Michigan	Patient	4b	–	+

• ^a(–): negatives PCR-Ergebnis für ein Primerpaar, das am oberen Ende der Spalte angeführt ist. ^b(+) positives PCR-Ergebnis für ein Primerpaar, das am oberen Ende der Spalte angeführt ist. Des PL60/PL61-Primerpaar amplifiziert spezifisch ein 417-bp-PCR-Produkt in nicht-lysogenen Stämmen und führt zu keinem PCR-Produkt in lysogenen Stämmen. Das PL14/PL61 Primerpaar amplifiziert spezifisch ein 743-bp-PCR-Produkt in lysogenen Stämmen und führt zu keinem PCR-Produkt in nicht-lysogenen Stämmen.
• B. Der Status von comK beeinflusste nicht die Virulenz von L. monocytogenes
• Die Erfinder verglichen in Standardvirulenztests DP-L4056 und DP-L4074 mit Wildtyp-10403S, um zu bestimmen, ob die Gegenwart eines Prophagen an comK, das Fehlen eines Prophagen oder ein Integrationsvektor die Virulenzphänotypen änderte. Diese drei Stämme wurden auf LLO-Aktivität, die Fähigkeit, in Monoschichten von L2-Zellen Plaques zu bilden, und auf Virulent im Maus-LD₅₀-Test (Tabelle 3) getestet. Alle konnten voneinander nicht unterschieden werden, was vermuten ließ, dass die Integrität von comK-ORF und die Gegenwart von pPL1 keinen messbaren Einfluss auf Virulenz hatte. Tabelle 3. Komplementation von actA und hly

  Stamm	Genotyp	Hämolyse auf Blutplättchen	Hämolytische Aktivitäta	Plaque-Größeb	LD50 c
  10403S	Wildtyp	+	nd	100 (na)	~2 × 104
  DP-L4056	10403S-Phage, cured	+	97	101 (1,4)	< 1 × 105
  DP-L4074	DP-L4056 comK::pPL1	+	98	99 (1,4)	< 1 × 105
  DP-L4027	DP-L2161-Phage, cured, Δhly	–	0	0 (0)	1 × 108
  DP-L4075	DP-L4027 Δhly, comK::pPL24	+	99	97 (3,9)	< 1 × 105
  DP-L4076	DP-L4056 comK::pPL24	+	198	96 (2)	nd
  DP-L4029	DP-L3078 Phage, cured, ΔactA	nd	nd	0 (0)	2 × 107
  DP-L4077	DP-L4029 ΔactA, comK::pPL25	nd	nd	86 (4)	< 1 × 105
  DP-L4078	DP-L4056 comK::pPL25	nd	nd	72 (6,8)	nd

• ^aDie dargestellten Daten der hämolytischen Einheiten stammen aus einem repräsentativen Versuch. nd: nicht bestimmt. ^bDie Plaquegröße ist der Durchschnitt aus 8 bis 10 unabhängigen Versuchen und ist als Prozentsatz vom Wildtyp (als 100% definiert) angegeben. Standardabweichungen sind in Klammern dargestellt. na: nicht anwendbar. ^cLD₅₀s von 10403S und Δhly (DP-L2161) wurden in (37) bestimmt, LD₅₀ des ΔactA-Stamms (DP-L1942, eine kleinere Deletion innerhalb des ActA-ORF, das keine Actinnucleation an der bakteriellen Oberfläche unterstützt) wurde in (4) bestimmt.
• C. Vollständige Komplementation von hly an der Phagenanheftungsstelle
• Listeriolysin-O (LLO), das Genprodukt von hly, ist ein sekretiertes porenbildendes Cytolysin, das für den Austritt aus einer membrangebundenen Vakuole verantwortlich ist, wenn L. monocytogenes zum ersten Mal in eine Wirtszelle eintritt. LLO ist absolut für den intrazellulären Lebenszyklus von L. monocytogenes und Virulenz erforderlich. LLO-Aktivität kann mittels hämolytischer Aktivität auf roten Blutzellen gemessen werden. Hly-Mutanten bilden in Monoschichten von L2-Zellen keine Plaques und sind im Maus-LD₅₀Test um 5 log weniger virulent.
• Die Erfinder klonierten das strukturelle hly-Gen in pPL1 und konjugierten dieses Plasmid von E. coli an einen phagen-cured Wildtyp und Δhly-L.-monocytogenes-Derivate, was zu DO-L4076 (einem hly-Merodiploid) und DP-L4075 (hly nur an der Phagen-comK-att-Stelle) führte. Diese Stämme wurden auf hämolytische Aktivität auf Blutplättchen, auf die relative Menge sekretierter hämolytischer Einheiten, auf die Fähigkeit, in einer Monoschicht von L2-Zellen ein Plaque zu bilden, und auf Virulenz im Maus-LD₅₀-Test getestet (Tabelle 3). Die quantitative Komplementation von hly im Deletionsstammhintergrund und die Verdoppelung hämolytischer Einheiten, die in dem merodiploiden Stamm produziert wurden, zeigen zwei Dinge. Erstens wird die Genexpression de facto nicht von ektopischer Expression an der comK-Chromosomenposition beeinflusst. Zweitens ist der hly-Promotor in sich geschlossen. Außerdem ist eine Verdoppelung der Menge von LLO für die Virulenz und den intrazellulären Lebenszyklus von L. monocytogenes, zumindest bei Messung durch Plaquebildung, nicht schädlich.
• D. Komplementation von actA an der Phagenanheftungsstelle ähnelt der Wildtypexpression
• ActA, ein zweiter wesentlicher L.-monocytogenes-Virulenzfaktor, ist für die Steuerung von Wirtszell-Actinzytoskelettfaktoren verantwortlich, die für intrazelluläre bakterielle Motilität verwendet werden. ActA ist auch für die Bakterienpathogenese absolut erforderlich, weil Mutanten in ActA sowohl unfähig sind, von Zelle zu Zelle überzuspringen, als auch in einer Zellmonoschicht ein Plaque zu bilden, und sind 3 log weniger virulent als der Wildtyp. Außerdem scheint die ActA-Expression komplexer zu sein als jene von LLO: es gibt zwei Promotoren, welche die ActA-Expression antreiben. Einer befindet sich unmittelbar stromauf von actA-ORF, und der zweite befindet sich vor dem mpl-Gen stromauf von actA.
• Die Erfinder erzeugten mehrere Stämme, um die Komplementation von actA an der Phagenanheftungsstelle zu beurteilen. Die erste Gruppe umfasste die Herstellung von mit einer zweiten Stelle komplementierten (DP-L4077-) und merodiploiden (DP-L4078-)Stämmen im 10403S-Hintergrund. Diese wurden auf Plaquebildung in einer L2-Monoschicht getestet (Tabelle 3). Integriertes ActA komplementierte in diesem Test (Plaquegröße von 86%) nicht vollständig, und der merodiploide Stamm bildete ein noch kleineres Plaque (72% des Wildtyps). Die Erfinder interpretieren diese Ergebnisse, um zu zeigen, dass es einen kleinen Beitrag des zweiten Promotors stromauf des mpl-Gens zur optimalen ActA-Expression gibt. Außerdem scheint es eine kritische Konzentration von ActA auf der Oberfläche intrazellulärer Bakterien zu geben, weil zwei Kopien von actA (mit 3 Promotoren, welche die Expression antreiben) die Fähigkeit weiter verringern, von Zelle zu Zelle überzuspringen, vermutlich weil es für optimale Motilität zuviel ActA auf der Bakterienoberfläche gibt.
• Die Erfinder testeten außerdem die ActA-Komplementation im virulenzgen-überexprimierenden Stamm SLCC-5764. ActA wurde in diesem Stamm von der comK-attBB'-Stelle wirksam exprimiert (3A, Spur 9). Unter Berücksichtigung der Plaquebildungsdaten von 10403S-komplementierten actA-Stämmen kann davon ausgegangen werden, dass der merodiploide Stamm DP-L4085 mehr ActA als der Elternstamm produziert. Jedoch war dies nicht zu beobachten: der Elternstamm, der komplementierte Stamm und der merodiploide Star exprimierten alle ähnliche Ausmaße an ActA (3A, Spuren 5, 8 und 9). Diese Beobachtung ist vermutlich auf das vollständige Fehlen von Regulierung und einen hohen Grad an konstitutiver Expression von ActA in SLCC-5764 zurückzuführen. Außerdem unterstützt DP-L4087 die Actinnucleation an der Bakterienoberfläche, Actinschwanzbildung und Bakterienmotilität in Zellextrakten (3B). Die Ergebnisse dieser Zellextraktversuche zeigen, dass das Integrationsvektorsystem zur Komplementation in In-vitro-Studien der L.-monocytogenes-Motilität nützlich ist, die Stammbildung erleichtert und verschiedene molekulare Konstrukte zum Studium in einer gewünschten Versuchsreihe in verschiedene Wirtsstämme platziert. Insbesondere sind mehrere Allele von actA, die unübliche Motilitätsphänotypen aufweisen, unter Einsatz von pPL1 auf den SLCC-5764-ΔactA-Stamm transferiert worden und werden derzeit in Zellextrakten beurteilt. Die Studie dieser Mutanten im vereinfachten Zellextraktsystem soll Einblicke in die Aktivitäten schlecht verstandener Regionen des ActA-Proteins geben.
• Die zuvor angeführten Stämme sind in der folgenden Tabelle 1 bereitgestellt.

  Stamm	relevanter Genotyp oder Plasmid
  E. coli:
  SM10	Konjugationsspender, F-thi-1 thr-1 leuB6 recA tonA21 lacY1 supE44 Mu+C I-[RP4-2(Tc::Mu)] Kmr Tra+
  XL1-Blau	Plasmidmanipulationen. recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB laclqZ ΔM15 Tn10 (Tetr)]
  DP-E4067	Integrationsvektor pPL1/SM10
  DP-E4068	hly Integrationsvektor pPL24/SM10
  DP-E4069	actA Integrationsvektor pPL25/SM10
  DP-E4190	Integrationsvektor pPL2/SM10
  L. monocytogenes:
  10403S	Wildtyp
  DP-L4056	10403S-Phage, cured
  DP-L4027	DP-L2161-Phage, cured, Δhly
  DP-L4029	DP-L3078-Phage, cured, ΔactA
  DP-L4074	DP-L4056 comK::pPL1
  DP-L4075	DP-L4027 Δhly, comK::pPL24
  DP-L4076	DP-L4056 comK::pPL24
  DP-L4077	DP-L4029 ΔactA, comK::pPL25
  DP-L4078	DP-L4056 comK::pPL25
  SLCC-5764	Virulenzgenüberexprimierer (Mack, DP-L861)
  DP-L862	Mack-4R (grobes SLCC-5764-Isolat)
  DP-L4082	SLCC-5764-Strr-Derivat
  DP-L3780	SLCC-5764 ΔactA (Deletion von Aminosäuren 7-633)
  DP-L4083	DP-L3780S (Strr-Derivat)
  DP-L4084	DP-L4082, comK::pPL1
  DP-L4085	DP-L4082, comK::pPL25
  DP-L4086	DP-L4083, comK::pPL1
  DP-L4087	DP-L4083 ΔactA, comK::actA
  DP-L4088	DP-L1169S-4b-Stamm, Strr
  DP-L4089	DP-L1172S-4b-Stamm, Strr
  DP-L4090	DP-L4088, comK::pPL1
  DP-L4091	DP-L4089, comK::pPL1
  DP-L4199	EGDe, Strr-Derivat
  DP-L4026	WSLC 1042 (ATCC 23074)
  DP-L4061	WSLC 1042::PSA
  DP-L4221	10403S, tRNAArg::pPL2

• E. Phagen-PSA integriert in ein tRNA^Arg-Gen und pPL2-Bildung
• pPL1-Integration in L.-monocytogenes-Stämme, die einen Prophagen an der comK-Anheftungsstelle beherbergen, ist durch den Prozess behindert, dass man zuerst den Prophagen vom Wirtsstamm befreien muss. Um den Bedarf eines Phagen-Curingschritts zu verringern, wurde die Spezifität der pPL1-Integration auf jene des PSA-Prophagen geändert. PSA (Phage von ScottA) ist der Prophage des L.-monocytogenes-Stamms ScottA, ein Serotyp-4b-Stamm, der während einer Epidemie menschlicher Listeriose isoliert wurde. Unter Verwendung der genomischen PSA-DNA-Sequenz identifizierten die Erfinder ein integraseähnliches ORF mit einer zusammenhängenden nicht-kodierenden Sequenz, von der erwartet wurde, dass sie die attPP'-Sequenzen enthielt. Die PSA-Integrase-Sequenz wurde dann dazu verwendet, die DNA-Sequenz von PSA-attBB' aus dem lysogenen PSA-Stamm DP-L4061 zu erhalten (siehe Materialien und Verfahren). Es wurde herausgefunden, dass PSA in ein tRNA^Arg-Gen integrierte, das zu 88% mit einem tRNA^Arg-Gen (trnSL-ARG2) von B. subtilis identisch war. Des Anticodon des tRNA^Arg-Gens ist 5'UCU, das am häufigsten verwendete Argininanticodon in L. monocytogenes. Der PSA und die bakteriellen Anheftungsstellen teilen 17 bp DNA-Identität, und tRNA^Arg-attBB' enthält eine kurze Nucleotidsequenz, welche die tRNA^Arg-Sequenz vervollständigt, die durch die Integration von PSA unterbrochen ist (4). Das Anheftungsstellen-tRNA^Arg-Gen ist im Genom des L.-monocytogenes-Stamms EGDe nur einmal und offensichtlich nur einmal im Serotyp 4b gegenwärtig. Das zeigt, dass nicht nur die PSA-Integrationsstelle einzigartig ist, sondern auch, dass eine genaue Rekonstitution des Gens nach Integration (oder Exzision) wahrscheinlich für das Überleben der Zelle erforderlich ist.
• pPL2 wurde durch das Ersetzen des U153-Listeriaphagen-Integrase-Gens und der -Anheftungsstelle in pPL1 durch das PSA-Listeriaphagen-Integrase-Gen und die -Anheftungsstelle hergestellt. pPL2 wurde in SM10 transformiert, und der resultierende Stamm wurde zu 10403S, EGDe (das eine Streptomycinresistenzmutation trägt) und dem Serotyp-4b-Stamm DP-L4088 gepaart. Chloramphenicolresistente Transkonjuganten entstanden auch aus jeder dieser Kreuzungen bei etwa 2 × 10^–4 pro Spenderzelle, bei derselben Geschwindigkeit wie bei der pPL1-Integration. Zwei Rekombinanten jeder Kreuzung wurden unter Arzneimittelselektion erneut ausgestrichen und mittels PCR unter Einsatz der Primer NC16 und PL95 auf die Gegenwart von PSA-attBP' getestet. Das erwartete 499-bp-PCR-Produkt wurde in jeder der getesteten Kolonien erhalten, was anzeigte, dass pPL2 sowohl im Serotyp-1/2- als auch in -4b-Stämmen in tRNA^Arg-attBB' integriert. Die Erfinder testeten die Stabilität des integrierten pPL2 sowohl in EGDe- als auch DP-L4088-Stämmen mit demselben nicht-selektiven 100-Generationen-Versuch, der für pPL1 beschrieben wurde. Neunundvierzig Kolonien aus jeder der amplifizierten Kulturen wurden auf Chloramphenicolresistenz getestet. Die von EGDe abstammenden Stämme behielten 100% arzneimittelresistente Kolonien bei, was auf eine komplette Stabilität der Integranten hindeutete. im Fall des DP-L4088-Integranen waren zwei der 49 Kolonien chloramphenicolempfindlich, was einen geringen Grad an Exzision vermuten lässt, der in diesem Seroytp-4b-Stamm auftreten kann. Zum Testen, ob eine präzise Exzision aufgetreten war, amplifizierten die Erfinder mittels PCR über tRNA^Arg-attBB' und sequenzierten die PCR-Produkte. Es wurde die Wildtyp-DNA-Sequenz erhalten, was eine präzises Exzisionsereignis anzeigte.
• Im Verlauf der PCR-Versuche erkannten die Erfinder eine Divergenz zwischen den tRNA^Arg-attPB'-Stellen des Serotyps 4b und jenen des Serotyp s1/2 von L. monocytogenes. Zur Bestimmung des Wesens der Divergenz isolierten und sequenzierten die Erfinder die tRNA^Arg-attBB'-Stelle aus 10403S (wie in Materialien und Verfahren beschrieben). Die Erfinder stellten fest, dass die Sequenz von attPB' in 10403S (3' des tRNA^Arg-Gens) mit jener des Serotyp-4b-Stamms WSLC-1042 nicht verwandt ist. Im Gegensatz dazu ist die Sequenz von attBP' (5' des tRNA^Arg-Gens) in 10403S zu 96–97% identisch mit den entsprechenden Regionen im L.-monocytogenes-Serotyp-4b-Stamm WSLC 1042, im durch TIGR sequenzierten Serotyp-4b-Stamm und im vom European Listeria Consortium sequenzierten Serotyp-1/2a-Stamm EGDe. Daher umfassen die bakteriellen attBB'-Sequenzen, die von der PSA-Integrase erkannt werden, wahrscheinlich mehr von der attB-DNA-Sequenz als der attB'-DNA-Sequenz. Außerdem testeten die Erfinder die Verfügbarkeit von tRNA^Arg-attBB' in den üblichen Laborstämmen von L. monocytogenes mit einem PCR-Test unter Einsatz der Primer PL102 und PL103. Die Erfinder stellten fest, dass die tRNA^Arg-Anheftungsstelle in den Stämmen 10403S, EGEe und L028 verfügbar war, was anzeigte, dass pPL2 in diesen Fällen einfach zur Stammherstellung, Komplementation und für genetische Studien verwendet werden können, ohne erst endogene Prophagen einem Curing zu unterziehen.
• F. Expression von Aquoria-victoria-GFP
• Eine GFP-Kodiersequenz wie in US-Patent Nr. 5.777.079 beschrieben wird in Plasmid pPL1 kloniert und in des Genom von L. monocytogenes transferiert. Die GFP-Kodiersequenz wird durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert und das PCR-Fragment in die multiple Klonierungsstelle von pPL1 kloniert. Ein geeigneter Promotor, der geeignete Transkriptionselemente enthält, und eine Translationsleadersequenz zur Expresion von GFP in L. monocytogenes werden am 5'-Ende der GFP-Kodiersequenz kloniert, sodass sie die Expression des GFP-Proteins induzieren. Die modifizierten pPL1-Plasmidkonstrukte werden in E.-coli-Stamm SM10 unter Einsatz von Standard-Verfahren kloniert, und das modifizierte pPL1-Plasmidkonstrukt wird wie oben beschrieben zu L. monocytogenes konjugiert. Rekombinantes L. monocytogenes wird auf BHI-Platten slektiert, die mit 7,5 μg/ml Chloramphenicol und 200 μg/ml Streptomycin ergänzt sind. Individuelle Kolonien werden ausgewählt und mittels PCR auf Integration an der Phagenanheftungsstelle unter Einsatz der Primer PL14 (5'-CTCATGAACTAGAAAAATGTGG-3') (Seq.-ID Nr. 13), PL60 (5'-TGAAGTAAACCCGCACACGATG-3' (Seq.-ID Nr. 14) und PL61 (5'-TGTAACATGGAGGTTCTGGCAATC-3') (Seq.-ID Nr. 15) gescreent. Kulturen von rekombinantem L. monocytogenes werden wachsen gelassen, vorbereitet und auf GFP gescreent.
• III. Nützlichkeit von pPL1 und pPL2.
• Die Herstellung und Charakterisierung der ersten ortsspezifischen Einschrittintegrationsvektoren zur Verwendung in L. monocytogenes fördert die für die Studie dieses Pathogens verfügbaren genetischen Instrumente. Diese Vektoren ermöglichen eine einfachere Stammbildung als herkömmliche Verfahren und sind in verschiedenen Stämmen, die zur Studie des intrazellulären Lebenszyklus von L. monocytogenes verwendet werden, sehr nützlich. Außerdem können stabile merodiploide Stämme hergestellt werden, um eine genaue Kopienzahlstudie und Studie der Wechselwirkungen innerhalb eines Proteins durch Multimerisierung und Testen der Dominanz oder rezessiven Natur verschiedener Allele eines Gens im selben Bakterienstamm zu ermöglichen.
• pPL1 und pPL2 sind zur Impfstoffentwicklung nützlich, z. B. zur Verstärkung, einschließlich zum Auslösen und Fördern, einer Immunreaktion gegen eine Targetzelle oder Targetzellen, z. B. ein fremdes Pathogen, etc. Mehrere rekombinante L.-monocytogenes-Systeme sind verwendet worden, um zellvermittelte Immunreaktionen bei Mäusen auszulösen (F. R. Frankel, S. Hedge, J. Lieberman und Y. Paterson, Induction of cell-mediated immune responses to human immunodeficiency virus type 1 Gag protein by using Listeria monocytogenes as a live Vaccine vector, J. Immunol. 155(10), 4775–4782 (1995); P. L. Goossens, G. Milan, P. Cossart und M. F. Saron, Attenuated Listeria monocytogenes as a live vector for induction of CD8+ T cells in vivo: a study with the nucleoprotein of the lymphocytic choriomeningitis virus, Int. Immunol. 7(5), 797–805 (1995); G. Ikonomidis, Y. Paterson, F. J. Kos und D. A. Portnoy, Delivery of a viral antigen to the class I processing and presentation pathways by Listeria monocytogenes, J. Exp. Med. 180(6), 2209–2218 (1994); H. Shen, M. K. Slifka, M. Matloubian, E. R. Jensen, R. Ahmed und J. F. Miller, Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(9); 3987–3991 (1995)). Eine Einschränkung der plasmidbasierten Expression von rekombinanten Proteinen in L. monocytogenes ist die Stabilität der Plasmide in vivo (d. h. im Wirtstier) ohne Selektion. Außerdem ist die chromosomale Herstellung von Stämmen, die fremde Antigene exprimieren, zeitraubend. pPL1 und pPL2 lindern beide Probleme.
• Aus den obigen Ergebnissen und der obigen Diskussion ist offensichtlich, dass die betreffende Erfindung eine Reihe von Vorteilen bereitstellt. Die Herstellung und Charakterisierung der ersten ortsspezifischen Einschrittintegrationsvektoren zur Verwendung bei L. monocytogenes wie hierin beschrieben fördert die genetischen Instrumente, die zur Studie dieses Pathogens verfügbar sind. Zum Beispiel ermöglichen die betreffenden Vektoren und Verfahren eine einfachere Stammbildung als herkömmliche Verfahren und sind in verschiedenen Stämmen nützlich, die zum Studium des intrazellulären Lebenszyklus von L. monocytogenes verwendet werden. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung wichtige neue Instrumente zur Herstellung von Impfstoffformulierungen bereit.
• Eine Einschränkung der plasmidbasierten Expression rekombinanter Proteine in L. monocytogenes ist die In-vivo-Stabilität von Plasmiden (d. h. im Wirtstier) ohne Selektion. Außerdem ist die Chromosomenherstellung von Stämmen, die fremde Antigene exprimieren, zeitraubend. Die vorliegenden Vektoren und Verfahren zur Verwendung lindern beide Probleme. Daher stellt die vorliegende Erfindung einen bedeutenden Beitrag zum Gebiet der Erfindung dar.
• Der Verweis auf jegliche Publikation dient ihrer Offenbarung vor dem Einreichungsdatum und sollte nicht als Zugeständnis verstanden werden, die vorliegende Erfindung sei nicht berechtigt, einer solchen Publikation durch eine frühere Erfindung vorzugreifen. SEQUENZPROTOKOLL

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

Claims (15)

1. Integrationsvektor, der eine durch Listeriaphagenintegrase vermittelte ortsspezifische Listeriagenom-Integration durchführen kann, wobei der Vektor eine Listeriaphagenanheftungsstelle, ein Listeriaphagenintegrasegen und eine heterologe Kodiersequenz umfasst.
2. Integrationsvektor nach Anspruch 1, worin der Integrationsvektor ein Plasmid ist.
3. Integrationsvektor nach Anspruch 1, worin der Listeriaphage eine U153-Integrase oder PSA-Integrase ist.
4. Integrationsvektor nach Anspruch 1, worin die Anheftungsstelle Integration an einer Integrationsstelle, die aus der aus der comK-Integrationsstelle und der tRNAArg-Integrationsstelle bestehenden Gruppe ausgewählt ist, bereitstellt.
5. Integrationsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Integrationsvektor der 6101-bp-Vektor pPL1 aus 1 ist.
6. Integrationsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Integrationsvektor pPL2 ist, der durch Ersetzen der pPL1-U153-Integrase und Anheftungsstelle durch die PSA-Integrase und attPP'-Stelle erhalten wurde.
7. Verfahren zur Transformierung von Listeria, worin das Verfahren das Kontaktieren von Listeria mit einem Integrationsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 unter für die Integration des Integrationsvektors in das Listeria-Genom hinreichenden Bedingungen umfasst.
8. Listeria, das mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7 transformiert ist.
9. Listeria-Zellen nach Anspruch 8 zur Verwendung in einem Verfahren zum Auslösen oder Verstärken einer Immunreaktion der Zellen auf ein Antigen in einem Individuum.
10. Impfstoff, umfassend einen Stamm von Listeria-Zellen nach Anspruch 8, worin die Listeria-Zellen ein heterologes Antigen exprimieren.
11. Rekombinante Kultur von Listeria-Zellen nach Anspruch 8.
12. Set, umfassend einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und zumindest eine Nuclease, welche den Vektor an einer Klonierungsstelle schneidet, zur Verwendung beim Auslösen oder Verstärken einer Immunreaktion von Zellen auf ein Antigen in einem Individuum.
13. Set nach Anspruch 12, worin das Set weiters eine Wirtszelle umfasst.
14. Integrationsvektor nach Anspruch 5, worin der Integrationsvektor Integration an einer comK-Integrationsstelle bereitstellt.
15. Integrationsvektor nach Anspruch 6, worin der Integrationsvektor Integration an einer tRNAArg-Integrationsstelle bereitstellt.

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