DE60122326T2

DE60122326T2 - Rads, ein reguliertes bakterielles antigenverabreichungssystem

Info

Publication number: DE60122326T2
Application number: DE60122326T
Authority: DE
Inventors: III Roy St. Louis CURTISS; A. Steven St. Louis TINGE
Original assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL; Avant Immunotherapeutics Inc
Current assignee: Celldex Therapeutics Inc; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-30
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2021-05-01
Also published as: JP2004515210A; DE60122326D1; AU2001266560A1; WO2001083785A3; CN1433474A; ES2271031T3; EP1292687A2; PL365456A1; US7341860B2; BR0110408A; US6780405B1; US20050106176A1; ZA200209267B; ATE336584T1; HUP0300793A2; WO2001083785A2; CA2407709A1; NZ522433A; MXPA02010690A; EP1292687B1

Description

Hintergrund der Erfindung
(1) Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Materialien und Verfahren zum Herstellen von Impfstoffen und rekombinanten DNA-Expressionsprodukten und insbesondere gentechnisch hergestellte abgeschwächte pathogene Mikroorganismen, die für die Expression von Antigenen und anderen rekombinanten Produkten, die von Genen auf Plasmiden abstammen, geeignet sind.
(2) Beschreibung des Standes der Technik
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US-Patent Nr. 4,190,495.

Stand der Technik
Gentechnisch hergestellte Mikroorganismen haben vielfältigen Nutzen und vielfältige Bedeutung. Eine wichtige Verwendung dieser Mikroorganismen ist als Lebendimpfstoffe zum Hervorrufen einer Immunantwort. Lebendimpfstoffe sind am wirksamsten, wenn sie hohe Mengen an Antigen produzieren. Die Synthese einer Expression eines rekombinanten Antigens in hohen Mengen kann aber für den Mikroorganismus schädlich sein. Aus diesem Grund sind regulierte (im Gegensatz zu konstitutiven) Expressionssysteme identifiziert und eingesetzt worden, bei denen das relevante rekombinante Gen operativ mit Kontrollelementen verknüpft ist, welche die Expression signifikanter Mengen an rekombinantem Gen nur dann erlauben, wenn es induziert, dereprimiert oder aktiviert wird. Beispiele umfassen den cspA-Genpromotor, den phoA-Genpromotor, P_BAD (in einem araC-P_BAD-System), den trp-Promotor, den tac-Promotor, den trc-Promotor, λP_L P22 P_R mal-Promotoren und den lac-Promotor. Diese Promotoren vermitteln die Transkription bei niedriger Temperatur, niedrigen Phosphatmengen, in Gegenwart von Arabinose, in Gegenwart niedriger Tryptophanmengen und in Gegenwart von Lactose (oder anderen lac-Induktoren).
Eine wichtige Verwendung gentechnisch hergestellter Mikroorganismen ist als Lebendimpfstoff zum Auslösen von Immunität. Siehe z. B. US-Patent 6,024,961; 4,888,170; 5,389,368; 5,855,879; 5,855,880; 5,294,441; 5,468,485; 5,387,744; 5,840,483; 5,672,345; 5,424,065; 5,378.744; 5,888,790; 5,656,488; 5,006,335; 5,643,771; 5,980,907; 5,851,519 und 5,527,529. Wenn der gentechnisch hergestellte Mikroorganismus als ein Lebendimpfstoff für Wirbeltiere verwendet werden soll, müssen bestimmte Gesichtspunkte berücksichtigt werden. Um einen Nutzen über den eines Nicht-Lebendimpfstoffes hinaus zu erbringen, muss sich der Lebendimpfstoff-Mikroorganismus an lymphoide Gewebe des Wirbeltieres anheften, in diese eintreten und dort überleben und muss diese Immuneffektorstellen in dem Wirbeltier für längere Zeiträume Antigen aussetzen. Durch diese ständige Stimulation wird das Immunsystem des Wirbeltiers reaktiver gegenüber dem Antigen als bei einem Nicht-Lebendimpfstoff. Bevorzugte Lebendimpfstoffe sind daher abgeschwächte Pathogene des Vertebraten, insbesondere Pathogene, die das darmassoziierte lymphoide Gewebe (GALT) oder das Bronchienassoziierte lymphoide Gewebe (BALT) besiedeln. Ein weiterer Vorteil dieser abgeschwächten Pathogene gegenüber Nicht-Lebendimpfstoffen ist, dass diese Pathogene ausgeklügelte Mechanismen haben, um Zugang zu lymphoiden Geweben zu finden, und daher ist ein wirksames Aussetzen des Immunsystems des Wirbeltiers zu erwarten. Nicht-Lebendimpfstoffe dagegen liefern nur dann einen Immunreiz, wenn der Impfstoff passiv dem Immunsystem ausgesetzt wird oder wenn Wirtsmechanismen den Impfstoff zum Immunsystem bringen.
Wie beispielsweise in US-Patent Nr. 5,888,799 beschrieben, können pathogene Bakterien derart durch Einführen von Mutationen abgeschwächt werden, dass nach Infektion eines tierischen Wirtes keine Krankheitssymptome hervorgerufen werden, die Bakterien aber dennoch die Fähigkeit beibehalten, an lymphoide Gewebe in dem tierischen Wirt zu binden, in diese einzutreten und diese ausreichend lange zu besiedeln, um eine Immunantwort gegen die abgeschwächten Bakterien hervorzurufen. Diese abgeschwächten bakteriellen Impfstoffstämme lassen sich gentechnisch verändern, um Fremdantigene zu exprimieren, die von Genen auf Plasmidvektoren kodiert werden oder die in das Chromosom eingefügt werden und die von heterologen pathogenen Bakterien, Viren, Pilzen oder Parasiten stammen. Diese rekombinanten abgeschwächten bakteriellen Impfstoffe können als Lebendimpfstoffe an Schleimhautflächen in einem immunisierten Individuum derart abgegeben werden, dass die rekombinanten Bakterien als Fabrik in diesen lymphoiden Geweben des immunisierten Wirbeltiers dienen, welche das Fremdantigen produzieren und eine primäre und/oder schützende Immunantwort hervorrufen, welche es dem immunisierten tierischen Wirt ermöglicht, eine Infektion mit dem Pathogen, dessen Antigen von dem rekombinanten abgeschwächten Bakterienimpfstoff exprimiert wird, zu überleben.
Bakterien können abgeschwächt werden, indem Mutationen eingeführt werden, welche eine Regulierung der Synthese von Oberflächenmolekülen, wie beispielsweise von Lipopolysacchariden in gramnegativen Mikroorganismen, durch die Umwelt erlauben, wie sie die galE-Mutation hervorbringt (US-Patent Nr. 5,006,335). Bakterien lassen sich auch durch Einführen von Mutationen abschwächen, welche spezielle Ernährungsansprüche verleihen, beispielsweise für Bestandteile von Nukleinsäuren wie Purine, Bestandteile der Zellwand wie beispielsweise Diaminopimelinsäure (DAP) (US-Patent Nr. 4,888,170), oder die Bedarf für aromatische Aminosäuren und davon abgeleitete Vitamine vermitteln, wie ihn beispielsweise aro-Mutationen bewirken (US-Patent Nr. 5,643,771). Wieder andere Mittel einer Abschwächung werden erreicht, indem Gene mutiert werden, welche die globale Regulierung anderer Gene beeinflussen. Solche Mutanten mit Mutationen in Genen für Adenylatcyclase, cya und das cAMP-Rezeptorprotein, crp, sind abgeschwächt und immunogen (US-Patent Nr. 5,294,441; 5,389,368; 5,468,485; 5,855,879 und 5,855,880). Gleichermaßen wurden auch Mutationen in dem Zweikomponenten-Regulatorsystem phoPQ (US-Patent Nr. 5,424,065) und Mutationen wie beispielsweise ompR (US-Patent Nr. 5,527,529), hemA (Benjamin et al. 1991, Microb. Pathog. 11: 289–295) und htrA (US-Patent Nr. 5,980,907) verwendet, um Bakterien abgeschwächt, aber dennoch immunogen zu machen. Alle Mutanten pathogener Bakterien, die abgeschwächt sind, sind nicht zwingend im selbem Maß immunogen. Es ist daher möglich, Mutationen wie beispielsweise rpoS einzuführen, welche Bakterien abschwächen, aber die Fähigkeit der abgeschwächten Bakterien zur Kolonisierung lymphoider Gewebe beeinträchtigen, was die Immunogenität der Bakterien vermindert. Siehe US-Patent Nr. 6,024,961. Einige Abschwächungsmechanismen hyperattenuieren also den Impfstoff, was den Kandidatenimpfstoff davon abhält, lymphoide Gewebe in ausreichendem Umfang oder für ausreichend lange Zeit zu erreichen oder dort zu persistieren, um eine Induktion einer schützenden Immunantwort gegenüber dem Wildtyp-Pathogen zu erlauben, dessen Antigen von dem rekombinanten abgeschwächten bakteriellen Impfstoff exprimiert wird.
Da zur Expression von Fremdantigenen induzierte Immunantworten zu der Menge an Antigen proportional sind, die von dem rekombinanten abgeschwächten Bakterienimpfstoff exprimiert werden (Doggett et al., 1993, Infect. Immun. 61: 1859–1866; Schodel et al., 1994, Infect. Immun. 62: 1669–1676; Srinivasan et al., 1995, Biol. Reprod. 53: 462–471), ist die Platzierung des Gens für das Fremdantigen auf einem Plasmidvektor mit vielen Kopien dem Einfügen des Gens für das Fremdantigen in das Chromosom des rekombinanten abgeschwächten Bakterienimpfstoffvektors viel mehr zu bevorzugen. Dies begründet sich damit, dass das Maß der Fremdantigenexpression im Allgemeinen zu der Anzahl an Kopien des Gens für das Fremdantigen proportional ist, die in dem abgeschwächten bakteriellen Wirt exprimiert werden.
Da plasmidhaltige rekombinante abgeschwächte bakterielle Impfstoffe große Mengen an Antigen produzieren, die keinen Vorteil für den Impfstoff bieten, gehen die Plasmid vektoren im Lauf der Zeit nach der Immunisierung häufig verloren (Curtiss et al., 1988, Vaccine 6: 155–160). In vielen Fällen behalten zehn Prozent oder weniger des aus dem immunisierten Wirbeltier isolierten rekombinanten abgeschwächten bakteriellen Impfstoffes das Plasmid nach drei oder vier Tagen. Findet ein solcher Plasmidverlust statt, richtet sich die Immunantwort gegen den abgeschwächten bakteriellen Wirtsimpfstoff selbst und nicht gegen das exprimierte Fremdantigen. Dieses Problem wurde durch Etablierung balancierter letaler Wirt-Vektor-Systeme gelöst, wie beschrieben in US-Patent 5,672,345 und 5,840,483. Bei diesem System wird eine Mutation in das Chromosom des abgeschwächten bakteriellen Impfstoffes eingeführt, um die Synthese eines essenziellen Zellwandbestandteils, Diaminopimelinsäure bzw. DAP, zu verhindern, welcher in der Umwelt nicht prävalent ist und in tierischen Geweben ganz fehlt. In Abwesenheit von DAP kommt es bei den Bakterien, die DAP benötigen, infolge des Nichtvorhandenseins von DAP zu Tod und Lyse. Das Bakterium enthält ferner einen Plasmidvektor, welcher ein Gen aufweist, das die Mutation in dem Chromosom komplementiert. Der plasmidhaltige Stamm ist damit in der Lage, DAP zu synthetisieren und in Abwesenheit exogener Zufuhr von DAP zu überleben, wie es bei einem immunisierten Wirbeltier der Fall ist. Dann kann eine Besiedelung innerer lymphoider Organe in dem immunisierten Wirbeltier stattfinden. Ein solches System verwendet Deletionsmutationen für das Gen für β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase, das asd-Gen, und Plasmidvektoren, die das asd-Wildtypgen und Elemente enthalten, welche Expression eines Fremdantigens erlauben (Nakayama et al., 1988. Bio/Tech. 6: 693–691; Galan et al., 1990, Gene 94: 29–35). Abgesehen von dem Asd⁺-Plasmidvektor, welcher das Fremdantigen kodiert, enthaften diese ⎕asd-Bakterienstämme auch abschwächende Mutationen, wie oben beschrieben, Bei oraler Verabreichung kommt es zu einer effektiven Bindung, Invasion und Kolonisierung lymphoider Gewebe durch diese balancierten letalen Wirt-Vektor-Impfstoffe, ähnlich wie bei einem Bakterium, das auf dieselbe Weise abgeschwächt wurde, aber das Fremdantigen nicht exprimiert. Ein wichtiger zusätzlicher Vorteil dieses balancierten letalen Wirt-Vektor-Systems ist die Abwesenheit eines Antibiotikaresistenzgens auf dem Plasmidvektor, da Lebendimpfstoffe solche Gene nicht enthalten dürfen.
Wie oben angegeben, ist das Maß einer Immunantwort auf ein Fremdantigen im Allgemeinen zu dem Maß seiner Expression von dem rekombinanten abgeschwächten bakteriellen Impfstoff proportional. Leider ist die Überexpression eines Fremdantigens häufig so toxisch, dass es die Wachstumsrate und damit die Fähigkeit des abgeschwächten bakteriellen Impfstoffes zur Besiedelung lymphoider Gewebe vermindert. Demzufolge ist die Immunogenität stark herabgesetzt. Aus diesem Grund musste daher ein Gleichgewicht zwischen der Fähigkeit des Impfstoffes zur Besiedelung und zum Wachstum in lymphoiden Geweben und seiner Fähigkeit zur Produktion des Fremdantigens vorhanden sein.
Ein weiterer wichtiger Gesichtspunkt bei der Verwendung von rekombinanten abgeschwächten bakteriellen Impfstoffen ist deren Potenzial, nach Verabreichung an ein Tier oder einen Menschen im Kot ausgeschieden zu werden und in der Umwelt zu überleben, so dass sie potenziell zur Immunisierung von Individuen führen könnten, bei denen keine Immunisierung erwünscht ist. Dieser Gesichtspunkt ist besonders wichtig bei landwirtschaftlichen Impfstoffen, die im Futter und/oder Trinkwasser oder durch Sprühen verabreicht werden, so dass der Impfstoff in der Umwelt überdauern und andere Tiere gegenüber diesem Impfstoff aussetzen könnte, bei denen es sich nicht um die Tierarten handelt, die immunisiert werden sollen. Wir haben daher ein in der Umwelt begrenzt lebensfähiges System (ELVS) für rekombinante abgeschwächte Bakterienimpfstoffkonstruktionen entworfen, wie beschrieben in WO 96/44947, das hierin durch Bezugnahme enthalten ist. In einigen Ausführungsformen dieser Erfindung wurden Impfstoffstämme konstruiert, die in einer günstigen Umgebung essenzielle Gene exprimieren und letale Gene nicht exprimieren, aber mit der Expression essenzieller Gene aufhören und mit der Expression letaler Gene beginnen, wenn sie in eine ungünstige Umgebung gelangen, beispielsweise bei der Umgebungstemperatur nach Kotausscheidung, was zum Tod des Impfstoffkonstruktes führt. In anderen Ausführungsformen wurden die Eindämmungseigenschaften des Impfstoffes in Bezug auf die Expression essenzieller Gene und die Nichtexpression letaler Gene in einer günstigen Umgebung, beispielsweise während des Wachstums des Impfstoffstammes in einem Fermenter, um eine Zeit lang verlängert, nachdem der Impfstoffstamm in eine ungünstige Umgebung gelangt, beispielswiese in den immunisierten tierischen Wirt. Solche in der Umwelt begrenzt lebensfähige Systeme mit verzögertem Einsetzen ermöglichen eine Bindung, Invasion und Besiedelung lymphoider Gewebe durch den Impfstoff vor dem Einsetzen des Todes, der durch die Nicht-Expression essenzieller Gene und die Expression letaler Gene herbeigeführt wird. Obgleich viele Beispiele essenzieller Gene und letaler Gene in WO 96/40947 beschrieben sind, ist das asd-Gen, das β-Aspartat-Semialdehyddehydrogenase kodiert, ein Enzym, das für die Biosynthese von DAP, einem essenziellen Bestandteil der steifen Schicht der bakteriellen Zellwand, erforderlich ist und nicht in der Umgebung und insbesondere in tierischen Wirten verfügbar ist, darin ein bevorzugtes reguliertes essenzielles Gen. Die bevorzugten letalen Gene darin sind solche, die von einem Bakterienvirus abstammen, der zur Lyse des Bakteriums führt, wenn er aus dem Zytoplasma des Mikroorganismus exprimiert wird. Eine Möglichkeit, in solchen Erfindungen eine biologische Eindämmung zu erreichen, ist mittels Verwendung eines Runaway-Plasmidvektors, der sowohl als balanciertes letales Wirt-Vektor-System dient (zur Erhaltung des Plasmids) als auch als ein ELVS, um eine biologische Eindämmung zu erreichen. Wie hierin beschrieben, behält das Bakterium in einer günstigen Umgebung (z. B. in einem Fermenter) eine sehr niedrige Plasmidkopienanzahl bei und schaltet die Expression des von Plasmid kodierten Fremdantigens sogar ab. Zu einem gewissen Zeitpunkt nach Eintritt in eine ungünstige Umgebung (z. B. in den immunisierten tierischen Wirt) veranlasst das System, die Plasmidkopienanzahl sehr signifikant zu erhöhen, was die Anzahl an Kopien der letalen Gene für die phageninduzierte Lyse erhöht. Da sich die Kopienanzahl des Gens, welches das Fremdantigen spezifiziert, erhöht, findet zu einem Zeitpunkt nahe bei dem Zeitpunkt, wenn das Bakterium lysebedingt stirbt, um das Fremdantigen freizusetzen, eine Überproduktion des Fremdantigens statt, was die Induktion einer Immunantwort unterstützt.
Wright et al., Gene 49: 311–321 (1986) beschreiben die Verwendung von Plasmiden zweifachen Ursprungs für die regulierte Expression heterologer Proteine, wobei die Plasmide umfassen: einen ori mit niedriger Kopienzahl (pSC101), einen reprimierbaren ori mit hoher Kopienzahl (ein „ColE1-basierter" Hybrid-ori), der vom λP_R-Promotor kontrolliert wird, ein temperaturempfindliches Repressorgen (clts857), dessen Genprodukt den λP_R-Promotor reprimiert und ein heterologes Gen, das operativ mit den starken Promotor P_trp verknüpft ist. Das Gen ist nicht mit einer aktivierbaren Kontrollsequenz verknüpft, stattdessen ist das Genprodukt bei bestimmten Temperaturen aktiv/inaktiv.
Basierend auf obiger Diskussion besteht ein Bedarf für einen Lebendimpfstoff, der das inokulierte Tier effektiv besiedeln und in den lymphoiden Geweben wachsen kann, ohne Krankheit zu verursachen, und trotzdem die Fähigkeit aufweist, in vivo große Mengen an Antigen zu produzieren, um eine effektive Immunantwort zu induzieren. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf durch Verwendung eines regulierten Antigen-Zufuhrsystems (RADS), basierend auf dem Gebrauch und der Funktion von Runaway-Vektoren (RAVs).
Zusammenfassung der Erfindung
In Kürze waren die Erfinder daher erfolgreich, indem sie herausgefunden haben, dass ein neuartiges reguliertes Antigen-Zufuhrsystems (RADS) und mindestens ein aktivierbarer von Chromosomen abstammender Repressor, in dem sich die Kopienanzahl eines extrachromosoma1en Vektors als Reaktion auf die durch Entzug des Aktivierungsreizes hervorgerufene Dereprimierung des Vektors stark erhöht, in bakteriellen Expressionssystemen, vorzugsweise bakteriellen Lebendimpfstoffen, die abgeschwächte Derivate von pathogenen Mikroorganismen sind, vorteilhaft einsetzen lassen. Die dereprimierbaren Runaway-Eigenschaft des RADS stammt aus den chromosomalen aktivierbaren Repressoren in Kombination mit Elementen des RAV. Die essenziellen Elemente des RAV sind (a) ein erster Replikationsursprung (ori), der eine niedrige Kopienanzahl ver leiht, wobei der erste ori vorzugsweise Vektorreplikation unter Verwendung von DNA-Polymerase III verleiht, (b) ein zweiter ori, operativ verknüpft mit einem ersten Promotor, der von einem Chromosom-kodierten Repressor reprimiert wird, wobei der zweite ori vorzugsweise Vektorreplikation unter Verwendung von DNA-Polymerase I verleiht, und (c) ein Fremdgen, das operativ mit einem zweiten Promotor verknüpft ist, der vorzugsweise ebenfalls von einem Chromosom-kodierten Repressor reprimiert wird. Als Impfstoff ist das RADS in der Lage, ein effektives Aussetzen des lymphoiden Gewebes des immunisierten Wirbeltieres gegenüber einer großen Dosis von hergestelltem vektorkodiertem Fremdgenprodukt als Reaktion auf den Entzug des Reizes zu bewirken. Ein weiterer Vorteil, der als Impfstoff vermittelt wird, ist die Fähigkeit des RADs-Mikroorganismus, in vitro unter Kontrolle einer niedrigen Kopienanzahl gezüchtet werden zu können, dann nach Inokulierung des Wirbeltieres auf Runaway-Bedingungen umzustellen, um eine Erhöhung der Antigenproduktion in vivo zu bewirken. Unter dereprimierten Runaway-Bedingungen ist der RADS-Mikroorganismus aufgrund extrem hoher Plasmidreplikationsaktivität, gekoppelt mit extrem hoher Fremgenproduktproduktion, stark beeinträchtigt. Aufgrund seines beeinträchtigten Zustandes kann der dereprimierte RADS-Mikroorganismus im Allgemeinen nicht für längere Zeit überleben. Das RADS bildet daher ein inhärentes Eindämmungssystem, in dem der RADS-Mikroorganismus nicht überleben kann, wenn er dem Repressorgen-aktivierenden Reiz nicht ausgesetzt ist, selbst in Abwesenheit von dereprimierbaren Phagenlysegenen aus Plasmiden in dem System mit begrenzter Lebensfähigkeit in der Umwelt (ELVS), das in WO 96/40917 beschrieben ist.
Das Umschalten auf den dereprimierbaren Runaway-Zustand kann nach Aussetzen des Mikroorganismus gegenüber dem dereprimierenden Umweltreiz verzögert werden. Bei diesem „verzögerten RADS" setzen die reprimierbaren Promotoren auf dem RAV ihre Reprimierung des Runaway-Zustandes und der Antigenproduktion eine Zeit lang fort, selbst wenn der reprimierende Reiz entfernt wird. Ein Beispiel eines aktivierbaren Promotors, der operativ mit einem Repressor auf dem RADS-Chromosom verknüpft werden kann und für ein verzögertes RADS geeignet ist, ist der araC-P_BAD-Promotor, der auf Arabinose anspricht. Bei Verknüpfung in einem RADS mit einem Repressor, so dass das Vorhandensein von Arabinose den Runaway-Zustand reprimiert, bewirkt der Transfer der RADS-Bakterien in eine Umgebung ohne Arabinose (beispielsweise nach Inokulierung in ein Wirbeltier) keine Dereprimierung des ori mit hoher Kopienzahl bewirkt, bis Arabinose, die noch in dem Bakterium vorhanden ist, heraus diffundiert oder von dem Mikroorganismus verstoffwechselt wird. Die Verzögerung kann vorteilhafterweise erhöht werden, indem der Mikroorganismus mit Mutationen versehen wird, die seine Fähigkeit zur Verstoffwechselung des aktivierenden Reizes beseitigen. Dies kann in dem Beispielfall durch eine Mutation im araCBAD-Operon erreicht werden, um die Fähigkeit des Mikroorganismus auszuschalten, Arabinose zu verstoffwechseln. Die längere Verzögerung in diesem System mit längerer Verzögerung liegt daran, dass die Dereprimierung zum Runaway-Zustand nicht länger durch den Stoffwechsel des Aktivators beeinflusst wird, da die Fähigkeit zur Verstoffwechselung des Aktivators ausgeschaltet ist. Daher ist die Dereprimierung nur von der Diffusion des Aktivators (Arabinose) aus dem Mikroorganismus heraus abhängig. Es sind noch andere Mittel zum Verändern und/oder Verzögern des Runaway-Zustands und/oder der Expression von Fremdgenen beschrieben.
Das Verzögerungs-RADS ist besonders bei bakteriellen Lebendimpfstoffen geeignet, da es den Bakterien Zeit gibt, die lymphoiden Gewebe des Wirbeltiers zu besiedeln, bevor auf eine hohe Kopienanzahl umgeschaltet wird und hohe Antigenmengen produziert werden. Als solches ist das verzögerte RADS bei intranasal verabreichten Impfstoffen sehr effektiv. Wenn die Verzögerung durch Mutationen verstärkt wird, die die Verstoffwechselung des Repressors wie oben beschrieben verhindern, ist die Verzögerung ausreichend, damit ein oraler Impfstoff eingenommen und das mit dem Darm assoziierte lymphoide Gewebe (GALT) besiedeln kann, bevor der dereprimierte Runaway-Zustand die Produktion großer Mengen an Antigen erlaubt. Daher werden große Antigenmengen direkt an das GALT abgegeben, was eine hoch wirksame Immunantwort bewirkt.
Die RADS der vorliegenden Erfindung können in Verbindung mit bekannten Mutationen genutzt werden, die verwendet werden, um die Virulent der bevorzugten pathogenen Lebendimpfstoffe zu abzuschwächen. Das RADS ist außerdem mit Plasmiderhaltungssystemen voll kompatibel, wie beispielsweise mit den balancierten letalen Systemen wie offenbart in US-Patent Nr. 5,672,345.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform einen Mikroorganismus, umfassend ein reguliertes Antigen-Zufuhrsystem (RADS), wobei das RADS Folgendes umfasst:
Ein Gen, das auf dem Chromosom des Mikroorganismus angeordnet ist, worin das Gen für einen ersten Repressor, der operabel an eine erste aktivierbare Kontrollsequenz gebunden ist, und gegebenenfalls einen zweiten Chromosom-kodierten Repressor, der operabel an eine zweite aktivierbare Kontrollsequenz gebunden ist, kodiert, und
einen Runaway-Vektor, der

(1) einen ersten Replikationsursprung (ori), der unter Verwendung von DNA-Polymerase III Vektorreplikation verleiht,
(2) einen zweiten ori, der unter Verwendung von DNA-Polymerase (Vektorreplikation verleiht, worin dieser zweite ori operabel an eine erste reprimierbare Kontrollsequenz gebunden ist, die durch den ersten Repressor reprimierbar ist, und
(3) ein Gen, das für ein gewünschtes Genprodukt kodiert, das operabel an eine zweite reprimierbare Kontrollsequenz gebunden ist;

Vorzugsweise umfasst das RADS auch ein Gen, das einen ersten Repressor kodiert. Vorzugsweise umfasst der Vektor auch ein Gen, das ein gewünschtes Genprodukt kodiert, das an die Stelle von Schritt (a) eingesetzt wird, wobei das Gen, weiches das ge wünschte Genprodukt kodiert, operativ mit einer zweiten Kontrollsequenz verknüpft ist. Bei der ersten Kontrollsequenz und der zweiten Kontrollsequenz kann es sich um dieselbe Sequenz oder verschiedene Sequenzen handeln. Bevorzugte Repressoren sind der LacI-Repressor und C2-Repressor; die zweite Kontrollsequenz kann durch einen zweiten Repressor reprimierbar sein.
Vorzugsweise sind die oben beschriebenen Mikroorganismen ein abgeschwächtes Derivat eines pathogenen Bakteriums. Außerdem ist der Vektor vorzugsweise ein Plasmid und das gewünschte Genprodukt ist ein Antigen. Am meisten bevorzugt ist der Mikroorganismus eine Salmonella sp. Eine bevorzugte aktivierbare Kontrollsequenz ist araCP_BAD.
Die oben beschriebenen Mikroorganismen können ein balanciertes letales Wirt-Vektor-System enthalten, welches aus dem Fehlen eines funktionierenden essenziellen Gens auf dem Chromosom und einer rekombinanten funktionierenden Kopie des essenziellen Gens auf dem Vektor besteht. Das essenzielle Gen ist vorzugsweise ein asd-Gen. In einer Ausführungsform wird das asd-Gen durch Insertion eines operabel mit araCP_BAD verknüpften Repressorgens inaktiviert. Die Mikroorganismen können auch eine inaktivierende Mutation in einem nativen Gen aufweisen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus cya, crp, phoPQ, ompR, galE, cdt, hemA, aroA, aroC, aroD und htrA besteht.
In den oben beschriebenen Mikroorganismen ist der erste ori vorzugsweise ein pSC-ori und der zweite ori ist vorzugsweise ein pUC-ori; die erste Kontrollsequenz ist vorzugsweise P22P_R, und der erste Repressor ist vorzugsweise ein C2-Repressor. Ferner ist die zweite Kontrollsequenz vorzugsweise P_trc, und die zweite Kontrollsequenz ist vorzugsweise durch einen zweiten Repressor reprimierbar, bei dem es sich vorzugsweise um einen LacI-Repressor handelt. Ein Beispiel eines bevorzugten Runaway-Vektor der vorliegenden Erfindung ist pMEG-771 mit einem Gen, das ein Antigen kodiert. Modifikationen dieses Runaway-Vektors und andere Beispielvektoren sind ebenfalls im Umfang der Erfindung enthalten. Beispiele für in der vorliegenden Erfindung verwendete Antigene sind Ery65 und SeM.
In einer weiteren Ausführungsform ist das gewünschte Gen in dem Mikroorganismus operable mit einer eukaryotischen Kontrollsequenz verknüpft. In diesen Ausführungsformen umfasst der Mikroorganismus vorzugsweise eine ΔendA-Mutation.
Der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung kann auch verzögerte RADS-Eigenschaften aufweisen. Die verzögerten RADS-Eigenschaften werden vorzugsweise durch eine Veränderung verliehen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus (a) einer Mutation besteht, welche den Verlust von Aktivatormolekülen durch Mutation oder Austritt verzögert, (b) aus einer Mutation oder Insertion, um die Konzentration des Repressors zu erhöhen, und (c) aus dem Einbau einer Vektorkontrollsequenz mit Bindungsstellen für mehr als einen Repressor und/oder Vektorsequenzen, die Repressormoleküle kodieren, die auf eine Vektorkontrollsequenz wirken.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Produzieren eines gewünschten Genproduktes. Das Verfahren umfasst der Reihe nach (a) den Einbau eines Gens, welches das gewünschte Genprodukt kodiert, in den Vektor in einem der oben beschriebenen Mikroorganismen, wobei der Mikroorganismus Kontrollsequenzen aufweist, welche die Expression des zweiten ori unter einer ersten Umweltbedingung reprimieren, aber bei dem die Expression des zweiten ori unter einer zweiten Umweltbedingung dereprimiert ist; (b) Kultivieren des oben beschriebenen Mikroorganismus unter der ersten Umweltbedingung; und (c) Kultivieren des Mikroorganismus unter der zweiten Umweltbedingung über einen ausreichenden Zeitraum, um das gewünschte Genprodukt hervorzubringen. Eine bevorzugte erste Umweltbedingung umfasst das Vorhandensein von Arabinose und eine bevorzugte zweite Umweltbedingung umfasst das Nichtvorhandensein von Arabinose. Die erste Umweltbedingung kann unter In-vitro-Kulturbedingungen erreicht werden, und die zweite Umweltbedingung kann in einem Wirbeltier erreicht werden. Der in diesem Verfahren verwendete Mikroorganismus kann auch eine inaktivierende Deletion in dem araCBAD-Operon und/oder in dem araE-Gen umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Impfstoff für die Immunisierung eines Wirbeltiers, wobei der Impfstoff einen beliebigen der oben beschriebenen Mikroorganismen umfasst, in einem pharmazeutisch zulässigen Träger.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Induzieren von Immunschutz in einem Wirbeltier. Das Verfahren umfasst das Verabreichen des obigen Impfstoffes an das Wirbeltier.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren des Verabreichens eines gewünschten Genproduktes an ein Wirbeltier. Das Verfahren umfasst das Verabreichen eines beliebigen der obigen Mikroorganismen an das Wirbeltier.
Zu den mehreren Vorteilen, die durch die vorliegende Erfindung erreicht werden, gehört die Bereitstellung von Vektoren und Mikroorganismen zur Herstellung eines gewünschten Genproduktes, wie bei einem bakteriellen Lebendimpfstoff, bei dem eine Runaway-Bedingung durch Umweltbedingungen herbeigeführt wird, welche die konstitutive Vektorreplikation und die Genproduktproduktion dereprimieren; die Bereitstellung von Impfstoffen, welche die obigen Mikroorganismen umfassen, für eine überlegene Stimulierung von Immunschutz vor dem Antigengenprodukt; das Bereitstellen von Verfahren zum Induzieren von Immunschutz vor dem Antigengenprodukt durch Verwendung der obigen Impfstoffe; und das Bereitstellen von Verfahren zum Verabreichen eines gewünschten Genproduktes an ein Wirbeltier.
Kurzbeschreibung von Figuren und Figurenlegenden
1 zeigt die RAVs pMEG-546 und pMEG-771 und die essenziellen Chromosomendeletions-/-insertionsmutationen, die für deren Erhaltung erforderlich sind.
2 zeigt verschiedene Deletions- und Deletions-/Insertionsmutationen, die für die Erhaltung von RAVs als Bestandteile regulierten Antigen-Zufuhrsystems (RADS) erforderlich sind, und Deletionsmutationen, die für die Abschwächung von Impfstoffstämmen geeignet sind, um diese avirulent zu machen, während die Immunogenität erhalten bleibt.
3 zeigt den mobilisierbaren Suicide (Selbstmord)-Vektor pMEG-375.
4 zeigt den Suicide-Vektor pMEG-611 für die Verabreichung von ΔasdAJ9::TTaraCP_BADc2TT.
5 zeigt den Suicide-Vektor pMEG-249 für die Verabreichung von ΔilvG3::TTaraCP_BADlacITT.
6 zeigt den Suicide-Vektor pYA3484 für die Verabreichung von ΔaraBAD1923.
7 zeigt den Suicide-Vektor pYA3485 für die Verabreichung von ΔaraE25.
8 zeigt den Suicide-Vektor pMEG-550 für die Verabreichung von ΔphoP1918.
9 zeigt den Suicide-Vektor pMEG-368 für die Verabreichung von ΔphoP24.
10 zeigt die Erzeugung der RAVs pMEG-546 aus pMEG-283 und pMEG771 aus pMEG-546 und pMEG-104.
11 zeigt die Modifikation von pMEG-771, um eine lacRB (LacI-Repressorbindungs-)-Stelle nach P22 P_R, aber vor pUC RNAII zu enthalten, um pYA353 zu ergeben.
12 zeigt das RAV pMEG-771-Derivat mit TTaraCP_BADc2GTGasd anstelle von asd.
13 zeigt den RAV pMEG-525, wobei das Antigen Ery65 spezifiziert ist.
14 zeigt die Ergebnisse von Experimenten, welche die Erhöhung der Kopienzahl für RAVs zeigen, die Ery65 kodieren. Plasmid-DNA ist gezeigt für den S. typhimurium MGN-966(pMEG-283)-Vektor und MGN-966(pMEG-525)+Ery65 bzw. S. choleraesuis MGN-2267(pMEG-546)-Vektor und MGN-2267(pMEG-S2S)+Ery65, gezüchtet in Luria-Nährbrühe in Anwesenheit oder Abwesenheit von Arabinose nach einer Verdünnung von 1 zu 1.000.
15 zeigt die Ergebnisse desselben Experimentes wie in 14, wobei hier aber die Erhöhung des Ery65-Proteins in Abhängigkeit von dem Wachstum von S. typhimurium MGN-966(pMEG-525) und S. choleraesuis MGN-2267(pMEG-525) gezeigt wird, welche in Luria-Nährbrühe in Anwesenheit oder Abwesenheit von Arabinose nach einer Verdünnung von 1 zu 1.000 gezüchtet wurden.
16 zeigt das Wachstum der S. typhimurium-Stämme MGN-966(pMEG-525), die Ery65 exprimieren, und MGN-966(PMEG-283)-Vektorkontrolle, die in Luria-Nährbrühe in Anwesenheit oder Abwesenheit von Arabinose nach einer Verdünnung von 1 zu 1.000 gezüchtet wurden.
17 zeigt Western-Blot-Analysen von Seren von Mäusen, die mit der Vektorkontrolle MGN-966(pMEG-283) und mit MGN-966(pMEG-525), welcher das Ery65-Antigen exprimiert, immunisiert wurden.
18 zeigt den RAV pMEG-S73, wobei das M-Protein von Streptococcus equi (SeM) spezifiziert ist.
19 ist ein Vergleich der SeM-Expression von den S. typhimurium-Stämmen MGN-4598(pMEG-825)P22P_RSeM, MGN-4598(pMEG-826) P22P_trcSeM, MGN-2238(pMEG-57S)ΔP_LSeM, welche verschiedene Asd⁺-Vektoren mit Antigenexpression unter der Kontrolle verschiedener Promotoren enthaften, mit der Expression von einem RADS, MGN-4S98(pMEG-S73)+SeM, gezeigt anhand von Coomassie-Färbung bzw. Western Blut einer PAGE von Gesamtproteinen der Stämme bei sechsstündigem Wachstum in Lennox-Nährbrühe in Anwesenheit oder Abwesenheit von Arabinose nach einer Verdünnung von 1 zu 1.000.
20 zeigt den Asd⁺-Vektor pYA3530 mit araCP_BADGTGasd.
21 zeigt den Ast⁺-Vektor PYA3531 mit araCP_BADc2GTGasd.
22 zeigt den auf RAVSs basierenden DNA-Transfervektor.
23 zeigt den Suicide-Vektor pMEG-776 zur Verabreichung von ΔendA3.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
A. Definitionen
„Rekombinante Wirtszellen", „Wirtszellen", „Zellen" und andere solche Begriffe, die Mikroorganismen bezeichnen, werden im Wechsel verwendet und beziehen sich auf Zeilen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder sonstige übertragene DNA verwendet werden können bzw. verwendet wurden, und umfassen die Nachkommen der ursprünglichen transfizierten Zelle. Es versteht sich, dass die Nachkommen einer einzel nen Elternzelle bedingt durch zufällige oder absichtliche Mutationen nicht zwingend mit der ursprünglichen Elternzelle identisch sind, was die ergänzende genomische DNA bzw. die Gesamt-DNA anbelangt.
Eine „Nachkommenpopulation" bedeutet die Population lebender Bakterienzellen in einer Kultur, die von einer einzelnen rekombinanten Bakterienzelle abstammt. Sofern nicht anders angegeben, wird ein rekombinantes Gen auf einem extrachromosomalen Vektor in einer Nachkommenpopulation „stabil erhalten", wenn die Mehrzahl der Zellen in einer Population, welchen ein natives essenzielles Gen fehlt, das von dem rekombinanten Gen ergänzt wird, sowohl in einer bestimmten Umgebung (z. B. ahne Diaminopimelinsäure (DAP)) überleben als auch ein gewünschtes Gen auf dem extrachromosomalen Vektor weiter beibehalten und/oder exprimieren können. Vorzugsweise überleben mindestens 90% der Zeilen in der Population in einer stabil aufrechterhaltenen Umgebung; mehr bevorzugt überleben mindestens 99% der Zellen.
„Kontrollsequenz" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die benötigt werden, um die Expression von Kodierungssequenzen zu bewirken, mit denen sie operativ verknüpft sind. Als solche bieten Kontrollsequenzen Orte für die Wirkung von Repressoren, Aktivatoren, Enhancern, RNA-Polymerase und sonstiger Transkriptionsfaktoren. Nicht beschränkende Beispiele solcher Kontrollsequenzen sind Promotoren und Ribosomenbindungsstellen.
Kontrollsequenzen, welche die Expression von Genprodukten in Bakterien erlauben, unterscheiden sich insofern deutlich von Kontrollsequenzen, die für die Genexpression in eukaryotischen Organismen benötigt werden, als prokaryotische Kontrollsequenzen im Allgemeinen in eukaryotischen Zellen nicht funktionieren und umgekehrt. Der Begriff „Kontrollsequenz" kann solche Sequenzen von Prokaryoten oder Eukaryoten umfassen.
Ein „Regulatorgen" ist ein Gen, das ein Protein kodiert, welches die Syntheserate eines anderen Gens steuert. Ein Beispiel eines Regulatorgens ist ein Gen, das einen Repressor kodiert.
Wie hierin verwendet, ist ein „Repressor" ein Protein, das von einem Regulatorgen synthetisiert wird und an einen Operatorlokus bindet, wodurch die Transkription dieses Operons blockiert wird.
Wie hierin verwendet, ist ein „Inducer" ein kleines organisches Molekül, das bewirkt, dass eine aktivierbare Kontrollsequenz aktiv wird.
Operativ verknüpft" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, bei der die so beschriebenen Bestandteile sich in einer Beziehung befinden, die es ihnen erlaubt, auf ihre jeweils beabsichtigte Art zu funktionieren. Eine mit einer Kodierungssequenz „operativ verknüpfte" Kontrollsequenz ist derart in der Zelle vorhanden, dass die Expression der Kodierungssequenz durch das Vorhandensein der Kontrollsequenz beeinflusst werden kann.
„Gramnegative Bakterien" umfassen Kokken, nicht-enterische Stäbchen, enterische Stäbchen und Spirilla. Nicht beschränkende Beispiele von Gattungen gramnegativer Bakterien umfassen Neisseria, Spirillum, Pasteurella, Brucella, Yersinia, Francisella, Enferobacter, Naemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Profeus, Vibrio, Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Spirilla, Serratia, Vibrio, Myxococcus, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Fusobacterium. Borrelia und Trepanema.
„Grampositive Bakterien" umfassen Kokken, nicht Sporen bildende Stäbchen und Sporen bildende Stäbchen. Nicht beschränkende Beispiele von Gattungen gramnpositiver Bakterien umfassen Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipe lothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Nocardia, Staphylococcus, Streptococcus und Streptomyces.
„Mykobakterien" sind definiert auf der Basis ihrer typischen Färbeeigenschaft, d. h. sie widerstehen einer Entfärbung mit angesäuerten organischen Lösungsmitteln, und auf dem Vorhandensein langkettiger (etwa 60 Kohlenstoffe) Mycolsäuren.
Eine „Mutation" ist eine Veränderung einer Polynukleotidsequenz, die entweder von einer Veränderung in einer oder mehreren Nukleotidbasen oder von einer Insertion eines oder mehrere Nukleotide in die Sequenz oder von einer Deletion eines oder mehrere Nukleotide aus der Sequenz oder von einer Kombination davon gekennzeichnet ist.
Ein „Gen" ist eine biologische Einheit der Vererbung. Im Allgemeinen ist ein Gen eine Polynukleotidsequenz, die ein RNA-Molekül oder ein Polypeptid kodiert, oder eine Mutation dieser Polynukleotidsequenz. Das Gen kann eine natürlich vorhandene Sequenz sein, die zu einem aktiven oder inaktiven Polypeptid exprimiert werden kann. Das Gen kann auch eine Mutation aufweisen, beispielsweise eine Punktmutation, Insertion oder Deletion, so dass es nicht exprimiert werden kann oder so dass es ein verändertes oder trunkiertes Polypeptid- oder RNA-Molekül exprimiert. Ein Gen kann durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Alternativ kann das Gen durch gut bekannte Syntheseverfahren synthetisiert werden.
Die meisten (91%) Strukturgene verwenden das ATG-Codon für Methionin als erstes Codon. Seltener (8%) verwenden sie jedoch GTG als Startcodon, und noch seltener (1%) verwenden sie das TTG-Startcodon, aber niemals CTG. Zur Transkription von Boten-RNA (Messenger-RNA) beginnt die Transkription an der Nukleotidstelle +1 und endet nach dem Transkriptionsterminator.
Ein „natives Gen" ist ein Gen, wie es im Chromosom eines Wildtyp-Organismus vorkommt, beispielsweise das Gen, das in Wildtyp-E.-coli oder Salmonella für β-Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase (Asd) kodiert.
Ein „rekombinantes Gen", wie hierin verwendet, ist definiert als eine identifizierbare Polynukleotidsequenz innerhalb einer größeren Polynukleotidsequenz, die in dieser Form und Position in er größeren Sequenz in der Natur nicht vorkommt. Das rekombinante Gen kann beispielsweise ein Wildtypgen sein, das in einer nicht-nativen Position in das Chromosom eingefügt wurde, oder eine mutante Form des Wildtypgens in der nativen Position oder ein Wildtypgen, das zusammen mit anderen nicht-nativen Sequenzen an seiner nativen Position eingefügt wurde, wie es mit geringer Häufigkeit bei einer homologen Rekombination zwischen einem Plasmid und einem Chromosom stattfinden kann. Ein rekombinantes Gen kann auch Kombinationen von Kodierungsregionen mit Kontrollregionen umfassen, mit denen die Kodierungsregionen natürlicherweise nicht vorkommen. Wie hierin verwendet, sind rekombinante Gene die Produkte bestimmter gentechnischer Manipulationen.
Die hierin verwendeten Gensymbole für mutante Stämme entsprechen den von Berlyn, Kapitel 109 in Neidhardt et al., 1996, und Sanderson et al., Kapitel 110 in Neidhardt et al., 1996, Beschriebenen. Die für Transposons verwendeten Symbole, insbesondere Tn10 folgen der in Altman et al., Kapitel 141 in Neidhardt et al., 1996, verwendeten Konvention.
Ein „Replikon" ist eine autonom replizierende DNA. Die Eigenschaft der autonomen Replikation wird von einem Replikationsursprung verliehen. Beispiele umfassen Plasmidvektoren und bakterielle Chromosomen.
Ein „Runaway-Vektor" („RAV") ist eine extrachromosomal replizierende Nukleinsäure, wie beispielsweise ein Plasmid, das zwei Replikationsursprünge umfasst. Einer der Replikationsursprünge verleiht eine niedrige Kopienanzahl und verleiht vorzugsweise Vektorreplikation unter Verwendung der DNA-Polymerase III; der zweite Replikationsursprung verleiht vorzugsweise Vektorreplikation unter Verwendung der DNA-Polymerase I, der sich in einem Mikroorganismus entweder mit einer niedrigen Kopienzahl oder einer hohen Kopienzahl replizieren kann, je nach dem Status der Kontrollsequenzen, welche die Kopienanzahl kontrollieren.
Ein „Individuum", das mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff behandelt wird, ist hierin so definiert, dass es alle Wirbeltiere umfasst, beispielsweise Säugetiere, einschließlich Nutztiere und Menschen, verschiede Vogelarten, einschließlich Nutzgeflügel, besonders solche von landwirtschaftlicher Bedeutung. Darüber hinaus haben Mollusken und bestimmte andere Wirbellose ein primitives Immunsystem und sind ebenfalls als „Individuum" gemeint.
Transformation" oder „Transfektion", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Insertion eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, unabhängig von dem für die Insertion verwendeten Verfahren, beispielsweise direkte Aufnahme (natürlich oder durch Elektroporation), Transduktion oder Konjugation. Das exogene Polynukleotid kann als Plasmid erhalten werden oder kann alternativ in das Wirtsgenom integriert werden.
Mit „Impfstoff" ist ein Agens gemeint, das so konzipiert ist, um das Immunsystem eines lebenden Organismus zu stimulieren, so dass Schutz vor späterem Schaden vermitteln wird. Ein bestimmter Impfstoff kann in einem bestimmten Tier wirksam sein oder nicht. Immunisierung bezieht sich auf den Vorgang des Immunmachens eines Organismus gegenüber einer Krankheit.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Immunsystem" auf anatomische Funktionen und Mechanismen, durch die ein mehrzelliges Tier auf ein Antigen reagiert. Wie gut bekannt ist, führt das humorale Immunsystem eines Wirbeltieres zur Herstellung von Antikörpern, die spezifisch an das Antigen binden. Der so produzierte Antikörper kann zu einer der immunologischen Klassen gehören, wie beispielsweise Immunglobulin A, D, E, G oder M. Von besonderem Interesse sind Impfstoffe, die die Produktion von Immunglobulin A (IgA) stimulieren, da dies das wichtigste Immunglobulin ist, das vom Sekretionssystem von Warmblütlern hergestellt wird. Impfstoffe der vorliegenden Erfindung sind jedoch nicht auf solche beschränkt, die IgA-Praduktion stimulieren. Beispielsweise können Impfstoffe der unten beschriebenen Art außer der Bildung von IgA wahrscheinlich eine Reihe weiterer Immunreaktionen hervorbringen, beispielsweise zelluläre Immunität. Immunreaktionen auf Antigene sind gut untersucht und umfangreich berichtet worden. Ein Überblick über die Immunologie befindet sich in Roitt, Brostoff and Male, Immunology: Vierte Auflage, C.V. Mosby international Ltd., London (1998). Sofern nicht anders angegeben, sind Impfstoffe Lebendbakterien, die Antigene oder genetisches Material, das Antigene kodiert, gegen welche Immunreaktionen gewünscht sind, exprimieren oder verabreichen.
Wie hierin verwendet, bedeutet "immunogen" in der Lage zu sein, eine Immunreaktion hervorzurufen.
Ein Wirbeltier ist jedes Mitglied des Substammes der Vertebrata, einer Hauptabteilung des Stammes der Chordata, zu dem die Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säuger gezählt werden, und die alle von einer segmentierten knöchrigen oder knorpeligen Wirbelsäule gekennzeichnet sind. Alle Wirbeltierarten haben ein funktionelles Immunsystem und reagieren mit zellulären und/oder humoralen Immunreaktionen auf Antigene. Alle Wirbeltiere sind daher fähig, auf Impfstoff zu reagieren. Obgleich Impfstoffe üblicherweise an Säuger verabreicht werden, wie beispielsweise an Menschen oder Hunde (Tollwutimpfstoff), sollen Impfstoffe für kommerziell gezüchtete Wirbeltiere andere Klassen, wie beispielsweise Fische und Vögel, im Umfang der folgenden Erfindung liegen.
Ein „Pathogen", wie hierin verwendet, ist ein Mikroorganismus, der Krankheit verursachen oder normale physiologische Funktion beeinträchtigen kann bzw. bei dem es sich um ein abgeschwächtes Derivat eines krankheitsverursachenden Mikroorganismus handelt.
„Abgeschwächt" bezieht sich auf ein Pathogen mit Mutationen, welche die Fähigkeit des Pathogens, in einem Individuum Krankheitssymptome und Krankheit hervorzurufen, reduziert, aber welche das Potenzial des abgeschwächten Bakteriums zur Bindung, Invasion und Fortdauer in geeigneten lymphoiden Geweben in dem Individuum nicht ausschalten. Abgeschwächte Mikroben sind beispielsweise geeignet, um einen Organismus über längere Zeit einem bestimmten Genprodukt wie beispielsweise einem Antigen oder einem therapeutischen Protein auszusetzen. „Abgeschwächt" bedeutet nicht, dass eine Mikrobe dieser Gattung oder Art nie als Pathogen wirken kann, aber dass die jeweils verwendete Mikrobe im Hinblick auf das bestimmte getestete Tier abgeschwächt ist, Abgeschwächte Wirtszellen der vorliegenden Erfindung können zu einer Gattung oder Art gehören, die normalerweise pathogen ist. Abgeschwächte Stämme sind nicht der Lage, Symptome der Krankheit, die normalerweise mit ihrem pathogenen Gegenteil assoziiert sind, in vollem Umfang auszulösen. Bisweilen wird „avirulent" als Ersatzbegriff für abgeschwächt verwendet.
Relevante lymphoide Gewebe in der vorliegenden Erfindung umfassen das Darmassoziierte lymphoide Gewebe (GALT), das Bronchien-assoziierte lymphoide Gewebe (BALT), basalassoziiertes lymphoides Gewebe (NALT), das Schleimhaut-assoziierte lymphoide Gewebe (MALT) und das Bindehaut-assoziierte lymphoide Gewebe.
Wie hierin verwendet, umfassen „Mikrobe" oder "Mikroorganismus" Bakterien, Viren, Protozoen und einzellige Pilze.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „DNA-Impfstoffvektor" auf ein DNA-Plasmidmolekül, das in einer Bakterienzelle propagiert wird und eine Gensequenz aufweist, die ein gewünschtes Genprodukt kodiert, das operativ mit einer eukaryotischen Kontrollsequenz verknüpft ist, so dass das gewünschte Genprodukt nur nach Einführen des DNA-Impfstoffvektors in eukaryotische Zellen durch Impfung exprimiert wird. Der DNA-Impfstoffvektor kann an zu immunisierende Individuen durch Injektion, mechanisch (mit einer „Air Gun") oder vorzugsweise durch Verwendung abgeschwächter Bakterien verabreicht werden, welche den DNA-Impfstoffvektor nach Eintritt in die Wirtszellen des immunisierten Individuums freisetzen. Siehe z. B. Herrmann et al., 1999, „DNA Vaccines for Mucosal Immunity", S. 809–816 in MUCOSAL IMMUNITY, Zweite Auflage, Ogra, Mestecky, Lamm, Strober, Bienenstock and McGhee, Hrsg., Academic Press, San Diego, 1628 S.; Ulmer et al. (1996).
B. Allgemeine Beschreibung
Sofern nicht anders angegeben, verwendet die Praxis der vorliegenden Erfindung herkömmliche Techniken der Zellkultur, der Molekularbiologie, der Mikrobiologie, der rekombinanten DNA-Manipulation, Immunologie und Tierforschung, welche aus dem Stand der Technik bekannt sind. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur beschrieben. Siehe z. B. DNA CLONING, Band I und II (D.N. Glover, Hrsg., 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait Hrsg., 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames and S.J. Biggins, Hrsg., 1984); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); die Reihe METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); VECTORS: A SURVEY OF MOLECULAR CLONING VECTORS AND THEIR USES (R.L. Rodriguez and D.T. Denhardt, Hrsg., 1987, Butterworths); Sambrook et al. (1989), MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press; und Ausubel et al. (1995), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass die Produktion eines rekombinanten erwünschten Genproduktes in einem Mikroorganismus aus einem Vektor durch Nutzung von Vektorkontrollelementen bequem erhöht werden kann, die sich einführen lassen, um die Kopienanzahl des Vektors zu erhöhen.
Die Erfindung betrifft ein reguliertes Antigen-Zufuhrsystem (RADS), das Mikroorganismen verwendet, welche extrachromosomale Vektoren aufweisen, die als Runaway-Vektoren (RAV) bezeichnet werden, sowie Gene, die mindestens einen Repressor kodieren, dessen Synthese unter der Kontrolle einer aktivierbaren Kontrollsequenz steht. Essenzielle Elemente eines RAV sind (a) das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt kodiert und operativ mit einer Kontrollsequenz verknüpft ist, (b) ein erster Replikationsursprung („ori"), der Vektorreplikation unter Verwendung von DNA-Polymerase I verleiht; (c) ein zweiter ori, der Vektorreplikation unter Verwendung von DNA-Polymerase III verleiht. Der zweite ori ist mit einer ersten Kontrollsequenz, die von dem Repressor reprimiert werden kann, operativ verknüpft.
In einem RADS wird der Mikroorganismus unter Bedingungen erhalten, bei denen die erste Kontrollsequenz reprimiert ist. Da die erste Kontrollsequenz die Nutzung des zweiten ori kontrolliert, wird die Replikation unter diesen Erhaltungsbedingungen von dem ersten ori kontrolliert. Unter Bedingungen, bei denen der Repressor, der den zweiten ori beeinflusst, nicht hergestellt wird, findet eine Dereprimierung des zweiten ori statt, und die Kontrolle der Vektorreplikation schaltet um auf den zweiten ori. Der zweite ori verleiht daraufhin unkontrollierte Vektorreplikation, wodurch sehr große Mengen des Vektors und des auf dem Vektor kodierten erwünschten Genprodukt hergestellt werden.
Wie unten weiter beschrieben ist, werden RADS-Mikroorganismen vorzugsweise als bakterielle Lebendimpfstoffe eingesetzt. In solchen Ausführungsformen ist das erwünschte Genprodukt ein Antigen.
In RADS wird das Maß der Expression des gewünschten Genproduktes zumindest teilweise durch Kontrollieren der Vektorkopienzahl kontrolliert. Die Kopienzahl wird durch Verwendung von mehr als einem Replikationsursprung (ori) auf dem RAV kontrolliert.
Wie gut bekannt ist, ist ein ori der Bereich auf einem Chromosom eines extrachromosomalen Vektors, bei dem die DNA-Replikation startet. Eine Übersicht über die Plasmidreplikation bei Bakterien findet sich in Helinski et al., S. 2295–2324 in Escherichia coli und Salmonella, Cellular and Molecular Biology, Zweite Auflage, Neidhardt et al, Hrsg., 1996. In den ColE1-Plasmiden wird die Replikation durch die Synthese einer Vorprimer-RNA mit 799 Basen initiiert, die als RNA II bezeichnet wird. Die Transkription der RNA II wird 555 Basen stromaufwärts (upstream) von dem ori initiiert. Bei der Transkription bildet das 3'-Ende der RNA II an dem ori ein Hybrid mit dem Plasmid. Die Spaltung dieses RNA-DNA-Hybrids findet am Replikationsursprung statt, wodurch eine 3'-Hydroxylgruppe frei gelegt wird, die als Primer für die von der Wirts-Polymerase I katalysierten DNA-Synthese dient. Replikons vom ColE1-Typ spezifizieren kein essenzielles Replikationsprotein, benötigen aber die DNA-Polymerase I. Die Replikationskontrolle in den Plasmiden vom ColE1-Typ wird normalerweise durch die Bindung eines instabilen RNAI-Transkriptes reguliert, das zu dem RNA-II-Vorprimer-Transkript komplementär ist. Die RNAI wird divergent zur, aber innerhalb der RNAII-Kodierungsregion transkribiert. Ein zusätzliches Maß an Regulation bietet ein von rop kodiertes Protein an anderer Stelle auf dem Plasmid, das mit den RNAI- und RNAII-Transkripten interagiert, um die DNA-Replikation zu verhindern. Der RAV, wie beschrieben, wurde erhalten, indem der native Promotor für RNAII durch einen starken regulierten Promotor ersetzt wurde, der RNAII-Transkripte im Überschuss und daher eine unkontrollierte Replikation des Replikons vom ColE1-Typ produzieren kann, wenn der Repressor für den neuen Promotor nicht vorhanden ist.
Die Wahl der oris zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist nicht eng begrenzt, vorausgesetzt, der erste ori verleiht Replikation durch DNA-Polymerse III (z. B. das Produkt des dnaE-Gens in E. coli) und der zweite ori verleiht Replikation durch DNA-Polymerase I (z. B. das Produkt des polA-Gens in E. coli). Vorzugsweise verleiht der erste ori dem Vektor eine niedrige Kopienzahl, um etwaige Nachteile durch die Replikation des Vektors zu minimieren. Ein bevorzugter erster ori ist ein pSC ori, von dem bekannt ist, dass er etwa sechs bis acht Vektorkopien je chromosomalem DNA-Äquivelent in E. coli oder Salmonella spp. verleiht. Ein bevorzugter zweiter ori ist ein pUC ori.
Der zweite ori ist operabel mit einem Promotor verknüpft, der von einem Repressor reprimiert werden kann. Bevorzugte Promotoren für diesen Zweck sind P_lac oder P_trc, die von dem LacI-Repressor reprimiert werden, und P22P_R, der vom C22-Repressor reprimiert wird.
Der LacI-Repressor und der C22-Repressor sind bevorzugte Repressoren. Vorzugsweise sind diese Repressoren auf dem Chromosom des Mikroorganismus kodiert. Das Repressorgen ist operabel mit einer aktivierbaren Kontrollsequenz verknüpft, die nur dann eine Synthese des Repressors erlaubt, wenn der Inducer der Kontrollsequenz vorhanden ist. Wie unten ausführlicher erläutert ist, ist araCP_BAD eine bevorzugte aktivierbare Kontrollsequenz, die durch Arabinose aktiviert wird. In einem RADS-Mikroorganismus, der araCP_BAD verwendet, um Repressorsynthese zu kontrollieren, aktiviert daher das Vorhandensein von Arabinose den Repressor, was die Nutzung des zweiten ori verhindert. Die Vektorreplikation steht dann unter der Kontrolle des ersten ori. Wird die Arabinose jedoch entzogen, wird der Repressor nicht länger hergestellt und die erste Kontrollsequenz wird dereprimiert, was eine Runaway-Replikation des Vektors ermöglicht. Regulierung durch Arabinose ist sinnvoll, da freie Arabinose in der Natur im Allgemeinen nicht verfügbar ist. Beispielsweise kommt Arabinose im Vogel- und Wirbeltiergewebe nicht vor.
Regulierung durch Arabinose ist besonders für verzögerte RADS geeignet. Wie unten ausführlicher erläutert ist, ist die Induktion des ori für hohe Kopienzahl bei verzögerten RADS verzögert, nachdem sie ausgelöst ist. Ein solches System ist für bakterielle Lebendimpfstoffe geeignet, der im Allgemeinen in Kultur unter Bedingungen gezüchtet werden, bei denen die Runaway-Plasmidreplikation nicht initiiert wird (z. B. durch Arabinose). Die Bakterien werden dann in das Wirbeltier inokuliert. In einem solchen System besiedeln die inokulierten Bakterien das lymhoide Gewebe, bevor die Runawayplasmidreplikation initiiert wird, was die Produktion großer Mengen an Antigen erlaubt. Die Verzögerung der Initiation der Runawayplasmidreplikation durch den ori für hohe Kopienzahl vermeidet die Störung der Kolonisierungsfähigkeit der Bakterien, welche durch die Produktion hoher Antigenmengen und hoher Vektormengen verursacht wird. Ein Verzögerungssystem, bei dem araCP_BAD die Synthese des Repressors kontrolliert, um es dem zweiten ori zu erlauben, eine Runaway-Replikation zu initiieren, wenn keine Arabinose vorhanden ist, ist wirksam, da es eine Zeit lang dauert, nachdem keine Arabinose mehr zugeführt wird, bis die Arabinosekonzentration ausreichend gesunken ist, damit das AraC-Protein anfangen kann, als Repressor zu wirken. Diese Verzögerung ist jedoch nicht sehr lange, da das araCBAD-Operon Arabinose effizient verstoffwechselt, weshalb die Arabinosekonzentrationen schnell (innerhalb von etwa 15 Minuten) auf einen Punkt zurückgeht, an dem keine Repressorsynthese stattfindet. Dieses System mit kurzer Verzögerung kann dennoch eine ausreichende Verzögerung der Initiation der Runaway-Replikation erlauben, um einen Vorteil zu liefern, z. B. bei bakteriellen Lebendimpfstoffen, bei denen der Impfstoff schnell in lymphoide Gewebe abgegeben werden kann, wie es bei der intranasalen Inokulierung der Fall ist. Bei der oralen Inokulierung allerdings würde die Runaway-Replikation erheblich früher beginnen, als der Impfstoff das GALT erreicht. IN dieser Situation wird eine große Menge an Antigen, das von dem Runaway-Vektor produziert wird, dem lymphoiden Gewebe nicht ausgesetzt ist daher verschwendet. Für Situationen, bei denen eine Längere Verzögerung gewünscht wird, wie bei der oralen Verabreichung eines bakteriellen Lebendimpfstoffes, kann ein RADS mit verlängerter Verzögerung verwendet werden. In diesem System wird die Dauer der temporären Lebensfähigkeit durch Verwendung eines Mikroorganismus mit einer Inaktivierungsmutation in dem Operon verlängert, das die Produktion von Enzymen kontrolliert, welche den Inducer abbauen. Ist Arabinose der men kontrolliert, welche den Inducer abbauen. Ist Arabinose der Inducer, lässt sich sein Metabolismus durch eine inaktivierende Deletionsmutation in dem araCBAD-Operon ausschalten. Solch eine Deletion verhindert die Verstoffwechselung von Arabinose, was zu einer höheren intrazellulären Menge an Arabinose führt, nachdem das Aussetzen gegenüber Arabinose weggefallen ist. Dies führt zu einer längeren Verzögerung, bevor der Arabinosespiegel ausreichend abfällt, damit das AraC-Protein beginnen kann, als Repressor zu wirken. Diese verlängerte Verzögerung ist ausreichend, damit oral verabreichte Impfstoffe, welche das RADS-System mit verlängerter Verzögerung aufweisen, das GALT besiedeln können, bevor die Runawayvektorreplikation beginnt.
Ein Beispiel eines RAV ist der Plasmidvektor pMEG-771 (1). pMEG-771 muss in einem Bakterienstamm gehalten werden, der Gene für zwei Repressorproteine aufweist, den P22 C2-Repressor und den LacI-Repressor des lac-Operons, deren Synthesen von der araCP_BAD-Kontrollsequenz derart reguliert werden, dass die Transkription der Gene c2 und lacI vom Vorhandensein von Arabinose in dem Wachstumsmedium abhängt. Das araC-Genprodukt in Gegenwart von Arabinose ist ein Transkriptionsaktivator, welcher die Transkription von P_BAD von allen mit ihm verknüpften Strukturgenen verursacht. In Abwesenheit von Arabinose dient das araC-Genprodukt als Repressor an P_BAD um der Transkription von Strukturgenen, die mit dem P_BAD-Promotor verschmolzen sind, vorzubeugen. Im Chromosom des Stammes, der pMEG-771 birgt, befinden sich die Deletions-/Insertionsmutationen ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT und ΔilvG3::TTaraCP_BADlacITT. Wird dieser Stamm in Gegenwart von Arabinose gezüchtet, wird das c2-Repressorgen exprimiert und der C2-Repressor bindet an P22P_R, um der Transkription des mit PR verschmolzenen pUC RNAII-Gens vorzubeugen. Das RNAII-Gen spezifiziert eine Initiator-RNA, die in Gegenwart der DNA-Polymerase I (kodiert von dem chromosomalen polA-Gen) die Replikation an dem pUC ori initiiert. Das Plasmid repliziert weiter, wobei es die pSC101-Replikonkontrolle derart nutzt, dass es je Chromosomen-DNA-Äquivalent etwa sechs Plasmidkopien gibt. Dieser Stamm produziert außerdem großzügige Mengen des LacI-Repressorproteins, wenn der Stamm in Ge genwart von Arabinose gezüchtet wird. In dieser Situation bindet das lacI-Genprodukt an P_TRC und reprimiert die Transkription von diesem Promotor aus, so dass eine etwaige in die Multi-Klonierungsstelle von NcoI bis HindIII eingesetzte Fremdgensequenz nicht synthetisiert wird. In diesem Fall wächst der Stamm unter Kulturbedingungen, wie beispielsweise in einem Fermenter, sehr gut, da die Energieansprüche zur Erhaltung des pMEG-771-Plasmids infolge der niedrigen Plasmidkopienzahl und der Unfähigkeit zur Expression großer Mengen des Fremdproteins minimal sind. Wenn der Impfstoffstamm aber einem immunisierten tierischen Wirt verabreicht wird, gibt es keine exogene Arabinose, und die Arabinose in den bakteriellen Impfstoffzellen verschwindet infolge ihrer Katabolisierung oder auch durch möglichen Austritt aus der Zelle. Unter solchen Bedingungen werden die C2 und LacI-Repressorproteine nicht länger synthetisiert, und die Dichte dieser Repressoren in der Zelle nimmt ab, was nicht nur die Transkription der pUC RNAII-Sequenz erlaubt, die zur Initiierung der Plasmidreplikation von dem pUC-ori in einer komplett unregulierten Art und Weise erforderlich ist, sondern auch die Initiierung der Transkription eines Gens für ein Fremdantigen. Das Gesamtmaß der Produktiori des gewünschten Genproduktes ist daher aufgrund einer steigenden Plasmidkopienzahl und aufgrund der verstärkten Transkription des Fremdgens von P_TRC stark erhöht.
Einige Elemente von RADS sind zuvor in WO 96/40947 beschrieben worden. Siehe insbesondere 8 dieser Anmeldung, in diesem System wurde der RAV allerdings hauptsächlich eingesetzt, um zu verhindern, dass der Bakterienimpfstoff seine Lebensfähigkeit in ungünstigen Umgebungen wie beispielsweise bei unter 30°C beibehält, da das Genprodukt cI857 aus dem Vektor bei der Überführung von Körpertemperatur zu Umgebungstemperatur funktional wird, so dass die Expression des c2-Repressorgens aufhört, was zur Dereprimierung der Lysegene führt.
Der in pMEG-771 als Beispiel angeführte RAV nutzt verschiedene regulatorische Elemente, die alleine oder in Verbindung mit anderen regulatorischen Elementen arbeiten, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen. Die in einem RADS verwendeten regulatori schen Elemente sind nicht eng auf die in pMEG-771 und seinem assoziierten Wirt Verwendeten begrenzt (araCP_BAD, P_R, P_TRC, lacI-Repressor, C2-Repressor); diese Elemente können durch andere mit ähnlichen Funktionen, die im Folgenden beschrieben und aus dem Stand der Technik bekannt sind, ersetzt werden.
Allgemein können die Gene in einem RADS der vorliegenden Erfindungen reguliert werden durch 1) Verknüpfen der Kodierungssequenzen mit Kontrollsequenzen, die die Transkription unter günstigen und ungünstigen Bedingungen fördern oder verhindern, 2) Regulieren der Expression transregulatorischer Elemente, die ihrerseits die Transkriptiori der Gene des RAV und/oder des Wirtschromosoms fördern oder verhindern, 3) Anpassen oder Verändern transregulatorischer Elemente, die auf die Gene des RAV und/oder Wirtschromosoms einwirken, um entweder bei Bedingungen einer hohen Kopienzahl oder einer niedrigen Kopienzahl aktiv oder inaktiv zu sein, oder durch Verwenden von Kombinationen dieser Schemata. Die RAVs der vorliegenden Erfindung erfordert verschiedene Promotoren, um Expression verschiedener Elemente des Systems zu koordinieren. Manche Elemente, wie beispielsweise temperaturempfindliche Repressoren oder umweltspezifische regulatorische Elemente, verwendet induzierbare, dereprimierbare oder aktivierbare Promotoren. Bevorzugte Promotoren zur Verwendung als regulatorische Elemente in einem RAV sind der cspA-Genpromotor, der phoA-Genpromotor, P_BAD (in einem araC-P_BAD-System), der trp-Promotor, der tac-Promotor, der trc-Promotor, λP_L P22P_R-mal-Promotoren und der lac-Promotor. Diese Promotoren vermitteln Transkription respektive bei niedriger Temperatur, bei geringen Phosphatkonzentrationen, in Gegenwart von Arabinose, in Gegenwart niedriger Tryptophankonzentrationen und in Gegenwart von Laktose (oder anderen lac-Inducern). Jeder dieser Promotoren und ihre regulatorischen Systeme sind gut bekannt.
Transregulatorische Elemente. Wie hierin verwendet, bezieht sich „transregulatorische Elemente" auf ein Molekül oder einen Komplex, der die Expression eines Gens moduliert. Beispiele umfassen Repressoren, die an Operatoren in einer Kontrollsequenz bin den, Aktivatoren, die die Initiation einer Transkription bewirken, und Antisense-RNA, die an eine mRNA bindet und deren Translation verhindert. Zur Verwendung in RADS der vorliegenden Erfindung wird die Expression von regulierten Promotoren aus durch regulatorische Promotorproteine moduliert. Diese regulatorischen Promotorproteine können wirken, um die Transkription von dem Promotor aus zu aktivieren oder zu reprimieren. Bevorzugte transregulatorische Elemente sind Proteine, welche die Regulierung des cspA-Genpromotors, des phoA-Genpromotors, P_BAD (in einem araC-P_BAD-System), des trp-Promotors, des tac-Promotors, des trc-Promotors, der mal-Promotoren und des lac-Promotors vermitteln.
Eine andere Art von transregulatorischem Element ist die RNA-Polymerase. Gene des RADS können reguliert werden, indem sie mit Promotoren verknüpft werden, die nur von bestimmten RNA-Polymerasen erkannt werden. Durch Regulieren der Expression der spezifischen RNA-Polymerase wird auch die Expression des Gens reguliert. Beispielsweise erfordert die T7-RNA-Polymerase eine spezifische Promotorsequenz, die nicht von bakteriellen RNA-Polymerasen erkannt wird. Ein T7-RNA-Polymerase-Gen kann in der Wirtszelle platziert und so reguliert werden, dass es nur in einer günstigen bzw. ungünstigen Umgebung exprimiert wird. Die Expression der T7-RNA-Polymerase exprimiert andererseits jedes Gen, das mit dem T7-RNA-Polymerase-Promotor verknüpft ist. Eine Beschreibung zur Verwendung der T7-RNA-Polymerase zur Regulierung der Expression eines relevanten Gens, einschließlich Beschreibungen von Nukleinsäuresequenzen, die für diese Regulierung geeignet sind, erscheint in Studier et al., Methods Enzymol. 185: 60–89 (1990).
Eine weitere Art von transregulatorischem Element ist Antisense-RNA. Antisense-RNA ist zu einer Nukleinsäuresequenz, die als Zielsequenz bezeichnet wird, eines zu regulierenden Gens komplementär. Hybridisierung zwischen der Antisense-RNA und der Zielsequenz verhindert die Expression des Gens. Typischerweise wird eine Antisense-RNA verwendet, die zu der mRNA eines Gens komplementär ist, und der primäre Effekt be steht daraus, die Translation der mRNA zu verhindern. Expression der Gene eines RADS kann reguliert werden, indem die Expression der Antisense-RNA kontrolliert wird. Expression der Antisense-RNA verhindert wiederum die Expression des relevanten Gens. Eine vollständige Beschreibung zur Verwendung von Antisense-RNA zur Regulierung der Expression eines relevanten Gens erscheint in US-Patent Nr. 5,190,931.
Sonstige Arten transregulatorischer Elemente sich Elemente des Apparates zum Quorum Sensing. Quorum Sensing wird von manchen Zellen verwendet, um die Expression von Genen zu induzieren, wenn die Zellpopulation eine hohe Dichte erreicht. Das Quorum-Sensing-System wird von einer diffundierbaren Verbindung aktiviert, welche mit einem regulatorischen Protein interagiert, um die Expression bestimmter Gene zu induzieren (Fuqua et al., J. Bacteriol. 176: 269–275 (1994)). Es liegen Hinweise vor, dass die diffundierbare Verbindung, die als Autoinducer bezeichnet wird, direkt mit einem Transkriptionsaktivator interagiert. Diese Interaktion erlaubt dem Aktivator, an DNA zu binden und die Transkription zu aktivieren. Jeder Quorum-Sensing-Transkriptionsaktivator wird typischerweise nur von einem spezifischen Autoinducer aktiviert, obwohl der Aktivator mehr als ein Gen induzieren kann. Es wurde auch gezeigt, dass eien Quorum-Sensing-Regulierung nur den Transkriptionsaktivator und ein Gen erfordert, welches eine funktionelle Bindungsstelle für den Aktivator aufweist (Gray et al., J. Bacteriol. 176: 3076–3080 (1994)). Dies deutet darauf hin, dass für die Regulierung von Genen in einem RADS der vorliegenden Erfindung eine Quorum-Sensing-Regulierung übernommen werden kann. Beispielsweise kann ein Gen, das einen Quorum-Sensing-Transkriptionsaktivator kodiert, in einem RADS-Wirt exprimiert werden, und ein anderes Gen des RADS kann unter der Kontrolle eines Promotors stehen, der von dem Quorum-Sensing-Transkriptionsaktivator kontrolliert wird. Dies führt dazu, dass das RADS-Gen exprimiert wird, wenn der verwandte Autoinducer vorhanden ist, und nicht exprimiert wird, wenn der Autoinducer nicht vorhanden ist. Ein Gen, das so kontrolliert wird, wird hierin als unter Quorum-Kontrolle stehend bezeichnet. Wenn der RADS-Wirt den Autoinducer produziert, wird das Gen unter Quorum-Kontrolle exprimiert, wenn die Zelldichte hoch ist, und wird nicht exprimiert, wenn die Zelldichte niedrig ist. Jedes der Gene in einem RADS kann unter Quorum-Kontrolle gestellt werden, einschließlich essenzieller Gene, letaler Gene, Replikationsgene und regulatorischer Gene, die in WO 96/40947 beschrieben sind. Für die Funktion des RADS kann der Autoinducer beispielsweise von dem RADS-Wirt durch die Wirkung endogener Gene (d. h. durch Gene, die für die Synthese des Autoinducer zuständig sind), durch Kulturmedium oder beides zugeführt werden. Im letzteren Fall ahmt der im Medium zugeführte Autoinducer die günstigen Bedingungen hoher Zelldichte. Alternativ kann das Gen für die Produktion bzw. Synthese des Autoinducers als Element des RADS eingebaut werden. Ein solches Autoinducergen würde als regulatorisches Gen, wie hierin verwendet, gelten.
Beispiele für Quorum-Sensing-Transkriptionsaktivatorgene und Gene für die Produktion des mit ihnen verwandten Autoinducers sind luxR und luxI (Gray et al., J. Bacteriol. 176: 3076–3080 (1994)), lasR und lasI (Gambello and Iglewski, J. Bacteriol. 173: 3000–3009 (1991)), traR und traI (Piper et al., Nature 362: 448–450 (1993)), rhlI und rhlR (Latifi et al., Mol. Microbiol 17(2): 333–343 (1995)) und expR und expI (Pirhonen et al., EMBO J 12: 2467–2476 (1993)). Autoinducer diese Paare umfassen N-(3-Oxohexanoyl)homoserinlacton (VAI; für LuxR); N-(3-Oxododecanoyl)homoserinlacton (PAI; für LasR) und N-(3-Oxooctanoyl)homoserinlacton (AAI; für TraR). Manche Promotoren, die von den Quorum-Sensing-Transkriptionsaktivatoren induziert werden, sind luxI-Promotoren, der lasB-Promotor, der traA-Promotor und der traI-Promoter.
Quorum-Kontrolle kann verwendet werden, um auf eine Reihe von Arten eine regulierte Antigenzufuhr zu bewirken, beispielsweise durch Erhalt der Produktion erwünschter Genprodukte beispielsweise Antigene und Nichtexpression einer hohen Kopienzahl von ori-RNA-II-Primersequenzen unter günstigen Bedingungen hoher Zelldichte, beispielsweise in einem Fermenter, wobei sich bei Rückgang der Zelldichte das entgegen gesetzte Expressionsmuster zeigt, wenn die Zellen beispielsweise in ein Tier eingeführt oder in die Umgebung freigesetzt werden. Als ein weiteres Beispiel kann ein regulatori sches Gen, wie c2, unter Quorum-Kontrolle gestellt werden. Dann können andere Elemente des RADS unter die Kontrolle des Produktes des regulatorischen Gens gestellt werden, wobei beispielsweise P22P_R verwendet wird. Das regulatorische Gen wird in Gegenwart des Autoinducers exprimiert und bei Nichtvorhandensein des Autoinducers nicht exprimiert. Wenn es sich bei dem regulatorischen Gen um c2 handelt und ein RADS-Gen mit P22P_R verknüpft ist, wird das RADS-Gen exprimiert (d. h. dereprimiert), wenn der Autoinducer nicht vorhanden ist (da kein C2-Protein hergestellt wird), und reprimiert, wenn der Autoinducer vorhanden ist. Wenn ein essenzielles Gen oder ein Replikationsgen unter Quorum-Kontrolle steht (der Autoinducer induziert Expression), ist es bevorzugt, dass der Autoinducer unter günstigen Bedingungen vorhanden und unter ungünstigen Bedingungen nicht vorhanden ist. Wenn ein regulatorisches Gen unter Quorum-Kontrolle steht, richtet sich das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein des Autoinducers unter günstigen bzw. ungünstigen Bedingungen danach, ob das Produkt des regulatorischen Gens ein positiver oder negativer Regulator ist.
Transregulatorische Elemente, wie beispielsweise Repressoren oder Antisense-RNA, können entweder von dem Chromosom oder dem Plasmid exprimiert werden. Zur Eingrenzung der Größe und Komplexität des Plasmidanteils des Systems ist es jedoch bevorzugt, dass diese regulatorischen Elemente von dem Bakterienchromosom exprimiert werden.
Temperaturempfindliche Regulierung. Eine bevorzugte Art der Regulation für Mikroorganismen, die in Menschen oder anderen Warmblütlern wachsen sollen, ist die Temperaturregulierung. Dies beruht auf dem Kontrast zwischen der hohen und konstanten Körpertemperatur bei Säugern und Vögeln und der niedrigen und variablen Temperatur in der Umgebung, in welche die Mikroorganismen ausgeschieden werden. Um dies zu erreichen, exprimiert ein bevorzugtes RADS Gene, die ein Überleben bei etwa 37°C sicherstellen. Es ist bevorzugt, dass jede temperaturbasierte Regulation die normale Körpertemperatur des Zieltieres berücksichtigen sollte, wenn ein RADS an ein Tier verab reicht werden soll. Beispielsweise haben Hühner eine Körpertemperatur von 41,5°C, und Schweine haben eine Körpertemperatur von etwa 40°C.
Temperaturregulierte Genexpression, die für die Verwendung in dem RADS geeignet ist, ist von Neidhardt et al., Annu. Rev. Genet. 18: 295–329 (1984) beschrieben. Es gibt gut definierte Hitzeschockgene, die bei hoher Temperatur stark exprimiert werden. Wenngleich die Expression dieser Gene temperaturreguliert ist, gibt es häufig ein gewisses Maß an niedriger Basisexpression bei den restriktiven Temperaturen (Jones et al., J. Bacteriol. 169: 2092–2095 (1987)). Temperaturregulierte Promotoren, die eine strengere Kontrolle aufweisen, sind beschrieben von Tobe et al., Mol. Micro. 5: 887–893 (1991) Hromockyi et al., Mol. Micro. 6: 2113–2124 (1991) und Qoronfleh et al., J. Bacteriol. 174: 7902–7909 (1992).
Für gewünschte Gene wie beispielsweise Antigene kann der virB-Promotor von S. flexneri verwendet werden, wobei sich das virF-Gen und der virF-Promotor von S. flexneri an anderer Stelle auf demselben Plasmid, auf einem anderen Plasmid oder auf dem Chromosom befinden (Hromockyi et al. (1992); Tobe et al. (1991). Es kann auch ein Yersinia-Zweikomponentensystem zur Temperaturregulierung verwendet werden, welches das Strukturgen für den temperatur-regulierten positiven Aktivator virF (Lambert de Rouvroit et al., Molec. Microbiol. 6: 395–409 (1992) in Kombination mit Promotoren der Gene yopH oder yadR umfasst, mit oder ohne Modifikation des histonähnlichen Proteins YmoA, das von ymoA kodiert wird (Cornelis, in Molecular Biology of Bacterial Infections (Cambridge University Press, Cambridge; 1992)). Das virF-Gen von Shigella ist äquivalent zu IcrF in Y. pestis (Hoe et al., J. Bacteriol. 174: 4275–4286 (1992)). Viele weitere Repressor-Promotor-Kombinationen können angepasst werden, um Gene auf temperaturspezifische Weise zu exprimieren, indem temperaturempfindliche Formen des Repressors verwendet werden. Verfahren zum Erhalten temperaturempfindlicher mutierter Repressoren sind gut etabliert.
Kältespezifische Expression lässt sich auch erreichen, indem ein Gen mit einem Kälteschockpromotor oder einem kälteempfindlichen Promotor gekoppelt wird. Kälteschockpromotoren können aus bekannten Kälteschockgenen erhalten werden. Kälteschockgene mit Promotoren sind beschrieben worden (Jones et al. (1987)). Ein Beispiel eines geeigneten Kälteschockpromotors ist der Promotor von cspA (Vasina and Baneyx, Appl. Environ. Micro. 62: 1444–1447 (1996)). Promotoren mit temperaturempfindlicher Expression lassen sich durch einen Promotorsondenvektor identifizieren. Solche Vektoren weisen flankierende DNA eines Gens auf, das verzichtbar ist und das einfach ausgewählt oder identifiziert werden kann, indem beispielsweise ein chromogenes Substrat verwendet wird. Andere kältespezifische Promotoren, die für die Expression des essenziellen Gens geeignet sind, lassen sich durch Testen auf kälteempfindlichen Mangel an Expression von β-Galaktosidase in einer lacZ-Fusionsbibliothek von S. typhimurium identifizieren (Tanabe et al., J. Bacteriol. 174: 3867–3873 (1992)).
Ein bevorzugtes System, das weniger komplex ist, umfasst die Interaktion der Promotoren λP_L und λP_R des Bakteriophagen lambda mit dem temperaturempfindlichen Repressor CI857. Dieses System wurde beispielsweise beschrieben von Lieb, J. Mol. Biol. 16: 149–163 (1966). Die Promotoren λP_L und λP_R des Phagen lambda mit ihrem temperaturempfindlichen Repressor CI857 liefern ein stark reguliertes System, das in Expressionsvektoren verwendet wird, um eine kontrollierte Expression toxischer Gene zu erhalten (O'Connor and Timmis. J. Bacteriol. 169: 4457–4462 (1987)), und sollten auch verwendet werden, um die Synthese der Initiator-RNAII zur Initiation der RNA-Replikation an dem DNA-Polymerase-I-abhängigen ori von Plasmidvektoren mit hoher Kopienzahl zu regulieren. Das Produkt des cI857-Gens wird bei 37°C, und vor allem bei noch höheren Temperaturen, wie sie bei Vögeln und manchen Säugern vorkommen, synthetisiert, ist aber inaktiv, und wird bei 30°C und darunter synthetisiert, reprimiert aber aktiv die Expression von Genen, deren Transkription von λP_L oder λP_R kontrolliert wird.
Undichte Expression der Kontrollsequenzen eines RADS, falls eine solche stattfindet, kann auf verschiedene Weise beseitigt werden. Beispielsweise kann die Menge an produziertem CI-Repressor erhöht werden, indem das cI857-Gen unter die Kontrolle eines starken Promotors wie P_trc gestellt wird, wodurch ein Überschuss des thermoempfindlichen Repressors bereitgestellt wird. Darüber hinaus können in die Operatorregion von λP_R mehr Bindungsstellen für den CI-Repressor eingefügt werden, um Transkriptionsstarts bei ungünstigen Temperaturen zu verringern, oder technisch in Regionen stromabwärts (downstream) von dem Promotorelement eingebracht werden, um die Transkription bei niedrigeren Temperaturen zu behindern. Außerdem kann eine Antisense-RNA für das regulierte Gen von einem anders regulierten Promotor transkribiert werden, der in entgegen gesetzter Richtung zu λP_R ausgerichtet ist.
Arabinose-Regulierung. Wie zuvor erläutert, ist das araC-P_BAD-System ein bevorzugtes regulatorisches System zum Auslösen des Expressionsschalters, wenn ein Mikroorganismus von einer günstigen in eine ungünstige Umgebung verbracht wird. Das araC-P_BAD-System ist ein eng reguliertes Expressionssystem, das als starker Promotor arbeitet und durch die Zugabe von geringen Mengen an Arabinose induziert wird (siehe Guzman et al., J. Bacteriol. 177(14): 4121–4130 (1995)). Der araC-araBAD-Promotor ist ein bidirektionaler Promotor, welcher die Expression der araBAD-Gene in einer Richtung und des araC-Gens in der anderen Richtung kontrolliert. Aus praktischen Gründen wird der Anteil des araC-araBAD-Promotors, der die Expression der araBAD-Gene vermittelt und der von dem araC-Genprodukt kontrolliert wird, hierin als P_BAD bezeichnet. Für die Verwendung in den hierin beschriebenen Vektoren und Systemen sollte eine Kassette mit dem araC-Gen und dem araC-araBAD-Promotor verwendet werden. Diese Kassette wird hierin als araC-P_BAD bezeichnet. Das AraC-Protein ist sowohl ein positiver als auch ein negativer Regulator von P_BAD. In Gegenwart von Arabinose ist das AraC-Protein ein positives regulatorisches Element, das die Expression von P_BAD zulässt. In Abwesenheit von Arabinose reprimiert das AraC-Protein die Expression von P_BAD. Dies kann zu einem 1.200-fachen Unterschied des Expressionsniveaus von P_BAD führen.
Enterische Bakterien enthalten Arabinose-regulatorische Systeme, die homolog sind zu dem araC-araBAD-System von E. coli. Beispielsweise liegt auf Ebene der Aminosäuresequenz zwischen den AraC-Proteinen von E. coli und S. typhimurium Homologie vor, aber weniger Homologie auf DNA-Ebene. Die Aktivität der AraC-Proteine zeichnet sich jedoch durch hohe Spezifität aus. Beispielsweise aktiviert das AraC-Protein von E. coli nur P_BAD von E. coli (in Gegenwart von Arabinose) und nicht P_BAD von S. typhimurium. Ein RADS kann daher mehrere Arabinose-regulatorische Sequenzen von mehreren enterischen Bakterien verwenden, um verschiedene Bestandteile im selben System verschieden zu regulieren.
Maltose-Regulierung. Ein weiteres bevorzugtes regulatorisches System zum Auslösen des Expressionsschalters, wenn eine hohe Kopienzahl gewünscht wird, ist das malT-System, malT kodiert malT, einen positiven Regulator von vier maltosereaktiven Promotoren (P_PQ, P_EFG, P_KBM und P_S). Die Kombination von malT und einem mal-Promotor schafft ein eng reguliertes Expressionssystem, das als starker Promotor arbeitet, der durch Zugabe von Maltose induziert wird (siehe Schleif, „Two Positively Regulated Systems, ara and mal" S. 1300–1309 in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology. Zweite Auflage. Neidhardt et al., Hrsg., ASM Press, Washington, D.C., 1996). Im Gegensatz zum araC-P_BAD-System wird malT von einem Promotor (P_T) aus exprimiert, der nicht operativ mit den anderen mal-Promotoren verbunden ist. P_T wird nicht von MalT reguliert. Der malEFG-malKBM-Promotor ist ein bidirektionaler Promotor, der die Expression der malKBM-Gene in einer Richtung und der malEFG-Gene in die andere Richtung kontrolliert. Aus praktischen Gründen wird der Anteil des malEFG-malKBM-Promotors, welcher die Expression der malKBM-Gene vermittelt und der von dem malT-Genprodukt kontrolliert wird, hierin als P_KBM bezeichnet, und der Anteil des malEFG-malKBM-Promotors, welcher die Expression der malEGF-Gene vermittelt und der von dem malT-Genprodukt kontrolliert wird, hierin als P_EFG bezeichnet. Eine volle Induktion von P_KBM erfordert das Vorhandensein der MalT-Bindungsstellen von P_EFG. Zur Verwendung in den hierin beschriebenen Vektoren und Systemen sollte eine Kassette mit dem malT-Gen und einem der mal-Promotoren verwendet werden. Diese Kassette wird hierin als malT-P_mal bezeichnet. In Gegenwart von Maltose ist das malT-Protein ein positives regulatorisches Element, welches die Expression von P_mal erlaubt.
Wie bei Arabinose und araC-P_BAD ist die Regulierung mit Maltose geeignet für verzögerte RADS. Dies liegt daran, dass es Zeit braucht, bis die Maltosekonzentration ausreichend gefallen ist, um die Induktion durch das MalT-Protein aufzuheben, wenn keine Maltose mehr zugeführt wird. Zur Verlängerung der Dauer der temporären Lebensfähigkeit ist bevorzugt, dass Stämme zur Verwendung mit einem maltoseregulierten RADS eine Deletion eines oder mehrerer Elemente des mal-Operons enthalten. Eine solche Deletion verhindert die Verstoffwechselung von Maltose, was zu einer höheren intrazellulären Konzentration von Maltose führt. Dies führt zu einer längeren Verzögerung, bevor die Maltosekonzentration ausreichend gefallen ist, um die Induktion durch das malT-Protein aufzuheben. Regulierung mit Maltose ist auch geeignet, da freie Maltose in der Natur im Allgemeinen nicht verfügbar ist.
Verzögertes Sterben
Als Alternativ zu einer schnellen Induktion des ori für hohe Kopienzahl, kann das RADS so ausgeführt sein, dass es dem Wirtsmikroorganismus erlaubt, eine begrenzte Zeit lang lebensfähig zu bleiben, nachdem der Faktor, welcher den ori für hohe Kopienzahl reprimiert, entzogen wird. Dies wird hierin als verzögertes RADS bezeichnet und ergibt RAVs, die nach Aussetzen des Wirts gegenüber dem Umgebungssignal zum Umschalten auf den ori für hohe Kopienzahl vorübergehend weiter unter der Kontrolle des ori für niedrige Kopienzahl bleibt. Ein bevorzugter Mechanismus zum Verzögern der hohen Kopienzahl eines RAV ist es, die Regulierung auf einem transregulatorischen Element basieren zu lassen, das abgebaut oder verdünnt werden muss, bevor der RAV auf die Runaway-Bedingung umschalten kann. In einem solchen System hört die Produktion eines transregulatorischen Elementes, welches das Regime für niedrige Kopienzahl aufrecht erhält, auf, wenn der Wirtsmikroorganismus von einer Umgebung, die eine hohe Kopienzahl reprimiert, in eine Umgebung, die eine hohe Kopienzahl induziert, verbracht wird. So lange jedoch die bereits vorhandenen transregulatorischen Elemente in ausreichender Menge vorhanden bleiben, kann das Regime für niedrige Kopienzahl wirksam bleiben. Je nach Umsetzung (Turnover) des transregulatorischen Elements und der Beziehung zwischen der verfügbaren Menge an transregulatorischem Element und der erforderlichen Menge an transregulatorischem Element, um das Regime für niedrige Kopienzahl beizubehalten, kann das Regime für niedrige Kopienzahl mehrere Generationen lang nach dem Transfer in die Umgebung für hohe Kopienzahl beibehalten werden. Eine solche temporäre Bedingung für niedrige Kopienzahl kann beispielsweise geeignet sein, um es dem Wirtsmikroorganismus zu erlauben, den Wirt in einer Umgebung für hohe Kopienzahl (z. B. ohne Arabinose) zu besiedeln, wie beispielsweise in einem Tier, aber nicht unendlich zu bleiben. Als solches ist das RADS selbst ohne die Phagenlysegene, die in WO 96/40947 beschrieben sind, ein Eindämmungssystem. Ein verzögertes RADS ist auch geeignet, wenn das gewünschte Genprodukt für die Wirtszelle schädlich ist, wie in Beispiel 3. Darüber hinaus kann das verzögerte RADS verwendet werden, um ein essenzielles Gen eines balancierten letalen Wirtssystems wie beispielsweise asd von einer aktivierbaren Kontrollsequenz wie araCP_BAD abhängig zu machen, um eine Schwächung der Zellwand nach der Immunisierung (und bei Entzug, in diesem Fall, von Arabinose) zu erzielen. Siehe Beispiel 5.
Ein bevorzugtes transregulatorisches Element zur Verwendung in einem verzögerten RADS besteht aus dem AraC-Protein und Arabinose, seinem Inducer. Das AraC-Protein setzt die Reprimierung des mit P_BAD operativ verknüpften ori für hohe Kopienzahl fort, bis die Arabinosekonzentration unter einen kritischen Wert fällt.
Vektoren
Wie hierin verwendet, bezieht sich „Vektor" auf eine autonom replizierende Nukleinsäureeinheit. Die vorliegende Erfindung lässt sich mit jedem bekannten Vektortyp durchfüh ren, einschließlich viraler, Vektoren, Kosmidvektoren, Phasmid- und Plasmidvektoren. Der am meisten bevorzugte Vektortyp ist eine Plasmidvektor.
Wie aus dem Stand der Technik gut bekannt ist, besitzen Plasmid und andere Vektoren eine breite Vielzahl von Promotoren, multiplen Klonierungssequenzen, etc. und diese Replikons lassen sich so verwenden, dass die Menge eines synthetisierten Fremdantigens durch die relative Anzahl an Genkopien kontrollierbar ist. Beispielsweise lassen sich Vektoren mit pl5A-, pBR- und pUC-Replikons konstruieren, deren Replikation sämtlich von dem polA-Gen abhängig ist, das DNA-Polymerase I kodiert. Ob die Replikation eines Vektors von DNA-Polymerase I abhängt, kann festgestellt werden, indem der Vektor in einem Wirt mit einer temperaturempfindlichen polA-Mutation, wie beispielsweise χ1891, gezüchtet (siehe Tabelle 1) und hinsichtlich einer Erhaltung des Vektors als Funktion der Temperatur geprüft wird. Vorzugsweise verwenden Vektoren, die in RAD-Systemen zum Einsatz kommen, keine Antibiotikaresistenz, um hinsichtlich einer Erhaltung des Vektors zu selektieren.
Bevorzugte Vektoren haben alle essenziellen Elemente eines RAV, d. h. (a) ein Gen, das ein gewünschtes Genprodukt kodiert und operativ mit einer Kontrollsequenz verknüpft ist, (b) ein Replikationsursprung („ori"), der eine niedrige oder mittlere Kopienzahl des Vektors in dem Mikroorganismus verleiht, und (c) einen ori, der eine hohe Kopienzahl verleiht. Auf dem Vektor oder auf einem anderen kompatiblen Vektor oder auf dem Chromosom des Wirtsmikroorganismus können weitere Elemente vorhanden sein, die Teil eines jeweils bestimmten RADAS sind.
Transfervektoren. Statt ein Expressionsprodukt direkt zu exprimieren, kann ein Mikroorganismus einen RAV zum Transfer in eine andere Zelle und zur dortigen Expression in der Umgebung aufweisen, in die der Mikroorganismus platziert wird. Wie hierin verwendet, ist ein Transfervektor ein Expressionsvektor, der von einem RADS-Mikroorganismus in eine Zelle übertragen werden kann und die Expression eines von dem Transfer vektor kodierten Expressionsgens steuert. Es ist beabsichtigt, dass der Transfervektor ein beliebiges Expressionsgen enthaften kann, einschließlich Gene, die Antigene, Immunmodulatoren, Enzyme und Expressionsprodukte kodieren, welche die Genexpressiori oder zelluläre Aktivität in der Empfängerzelle regulieren.
Bevorzugte Empfänger für Transfervektoren sind Zellen von mit dem Vektor behandelten Tieren. Zu diesem Zweck können einem Tier RADS-Mikroorganismen, die einen RAV-Transfervektor enthalten, verabreicht werden. Es ist bevorzugt, dass die Mikroorganismen in Zellen des Tieres eindringen, um den Transfervektor abzugeben. Zu diesem Zweck ist bevorzugt, dass der Mikroorganismus lysiert, sobald er eine Zelle des Tieres betritt. Ein bevorzugtes Verfahren, um diese Lyse zu bewirken, ist ein ELVS-System, wie beschrieben in WO 96/40947, In diesem System sind letale Gene von Vektoren, beispielsweise die Phagenlysegene lys13 und lys19 operabel mit P22P_R verknüpft, und der chromosomenverknüpfte C2-Repressor ist operabel mit araCP_BAD verknüpft. Wird der Stamm in eine Umgebung ohne Arabinose eingeführt, beispielsweise in ein inokuliertes Tier, führt dies zu einer Verdünnung des vorhandenen C2-Repressors, bis die letalen Genprodukte die Zelle töten. Darüber hinaus kann das RADS mit einem RAV, das einen Transfervektor aufweist, als ein ELVS konzipiert werden, das infolge von regulierten Lysegenen, die in das Chromosom eingesetzt sind, lysiert. Eine solche Expression von Lysegenen würde eine verzögerte Expression aufweisen, so dass eine Lyse nur stattfindet, nachdem die Wirbeltierzellen mit dem Transfervektor in eine eukaryotische Zelle hinein gelangt und Runaway-Vektorreplikation verliehen haben. Siehe auch Beispiel 6, das neuartige Transfervektoranpassungen an das RADS beschreibt. Wird das ELV-System richtig konzipiert, ist es mit dem RAD-System voll kompatibel und kann Kontrollelemente teilen. In diesem Fall setzt die Lyse der Zelle, beispielsweise verursacht durch ein ELVS, den Transfervektor im Inneren der Empfängerzelle frei. Hinsichtlich der Expression von Genen auf dem Transfervektor in Empfängerzellen ist bevorzugt, dass die Expressionsgene operativ mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft sind, welche in der Empfängerzelle operabel sind. Ist die Empfängerzelle bei spielsweise eine Tierzelle, ist bevorzugt, dass die Expressionsgene operativ mit einem Promotor verknüpft sind, der in dem Tier funktional ist und Sequenzen aufweist, die eine Polyadenylierung der mRNA sicherstellen. Verfahren zum technischen Herstellen solcher Sequenzen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Transfervektoren können auch Replikationssequenzen enthalten, die in der Empfängerzelle operabel sind. Dies würde eine Replikation des Transfervektors erlauben, was zu erhöhter oder längerer Expression von Expressionsgenen führt, die auf dem Transfervektor vorhanden sind. Transfervektoren sind besonders für die Expression von Antigenen und anderen Proteinen geeignet, die in einer eukaryotischen Zelle glykosyliert oder posttranslational modifiziert werden müssen. Auf diese Weise kann eine Bakterienzelle mit einem RAV/ELVS-Vektor verwendet werden, um ein Protein zuzuführen, das eukaryotische Prozessierung erfordert, indem das Protein von einem Transfervektor exprimiert wird.
Eine bevorzugte Verwendung für Transfervektoren ist in einem RADS für die Stimulierung einer Immunreaktion in einem Tier. Zu diesem Zweck ist bevorzugt, dass es sich bei dem Bakterium um avirulente Salmonella, Shigella, Yersinia oder invasive Escherichia handelt, die eine Invasion durchführen und anschließend lysieren, um einen Transfervektor frei zu setzen, der für die Expression in Zellen des Tieres konzipiert ist. Dies kann geeignet sein, um eine Immunreaktion gegen Viren, Parasiten oder gegen Gametenantigene zu stimulieren, bei denen die Antigene normalerweise glykosyliert oder so posttranslational modifiziert sind, dass dies nur dann erreicht werden kann, wenn das Antigenprodukt innerhalb der eukaryotischen Zelle synthetisiert wird.
Die Effizienz des Transfers eines Transfervektors kann verbessert werden, indem eine endA-Mutation, Mutationen in recBC (mit oder ohne sbc-Suppressormutation) und/oder Mutationen in anderen Nukleasegenen eingebaut werden. Solche Mutationen können den Abbau des Transfervektors bei Lyse der Bakterienzelle reduzieren. Es ist auch möglich, den Zelltyp und die Schleimhautoberfläche, an welche der Mikroorganismus, welcher den Transfervektor enthält, bindet und darin eindringt, zu beeinflussen. Dies lässt sich erreichen, indem die Expression spezifischer Adhäsine und/oder Invasine blockiert oder eingeschaltet wird.
Für DNA-Immunisierung oder Einführen in Zellen in einem Tier sind viele Vektoren bekannt. Solche Vektoren können als Transfervektoren in Mikroorganismen verwendet werden, die einen RAV in einem ELVS enthalten. In diesem Fall liefert das RADS ein geeignetes Mittel zum Einführen solcher Vektoren in Zellen. Bevorzugte Promotoren zur Expression von Expressionsgenen auf Transfervektoren sind Adenovirus-, Herpesvirus- und Zytomegalieviruspromotoren. Expression des Expressionsgens kann auch erhöht werden, indem ein bakterieller Promotor stromaufwärts des eukaryotischen Promotors platziert wird, so dass bereits der Bakterienstamm das Expressionsprodukt in gewissem Maß exprimiert. Dieses Expressionsprodukt würde bei Lyse des Bakteriums freigesetzt werden.
Bevorzugte bakterielle Wirte/Stämme und Vektoren, die zum Konstruieren von Systemen mit begrenzter Lebensfähigkeit in der Umwelt geeignet sind, sind in Tabelle 1 und 2 aufgeführt.
Tabelle 1 BAKTERIENSTÄMME
TABELLE 2 PLASMIDVEKTOREN
Wie zuvor erörtert, weisen die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung auch ein gewünschtes rekombinantes Gen auf, welches das Polynukleotid des gewünschten Genproduktes kodiert, wie beispielsweise ein Polypeptid oder eine mRNA. Die Wahl des gewünschten Gens ist nicht eng begrenzt und kann Gene umfassen, die beispielsweise virale und bakterielle Antigene oder Pilz- oder Parasitenantigene, etc. kodieren.
Damit das gewünschte Gen für die vorliegende Erfindung geeignet ist, muss das Gen exprimiert werden. Genexpression bedeutet, dass die in der Abfolge der DNA-Basen kodierte Information durch die biochemischen Mechanismen der Zelle, in der sich das Gen befindet, zu einem physikalischen Produkt in Form eines RNA-Moleküls, Polypeptids oder einem anderen biologischen Molekül verwandelt wird. Das so produzierte biologische Molekül wird als das Genprodukt bezeichnet. Der Begriff Genprodukt, wie hier verwendet, bezieht sich auf jedes biologische Produkt bzw. Produkte, die als Ergebnis der Expression des Gens produziert werden. Bei dem Genprodukt kann es sich beispielsweise um ein RNA-Molekül, ein Peptid oder ein Produkt handeln, das unter der Kontrolle eines Enzyms oder eines anderen Moleküls produziert wird, bei dem es sich um das initiale Produkt des Gens handelt, d. h. ein metabolisches Produkt. Beispielsweise kann ein Gen zunächst die Synthese eines RNA-Moleküls kontrollieren, das durch die Wirkung von Ribosomen zu einem Enzym translatiert wird, das die Bildung von Glykanen in der Außenumgebung der ursprünglichen Zelle, in welcher das Gen vorkommt, kontrolliert. Das RNA-Molekül, das Enzym und das Glykan sind, entsprechend der Verwendung des Begriffes hierin, alles Genprodukte. Jedes davon sowie viele andere Arten von Genprodukten, wie beispielsweise Glykoproteine und Polysaccharide, wirken als Antigene, wenn sie in das Immunsystem eines Tieres eingeführt werden. Proteingenprodukte, einschließlich Glykoproteine und Lipoproteine, sind bevorzugte Genprodukte zur Verwendung als Antigene in Impfstoffen.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beziehen sich die Verwendung der oben beschriebenen RADS-Mikroorganismen als Bestandteile von Lebendimpfstoffen. In diesen Fällen würde das gewünschte rekombinante Gen ein Antigen eines fungalen, bakteriellen, parasitären oder viralen Krankheitsagens kodieren. Lebendimpfstoffe sind besonders geeignet, wenn eine lokalisierte Immunität gegen das Krankheitsagens wichtig und ein erster Verteidigungsmechanismus sein könnte. In diesem Fall ist es allerdings entscheidend, dass die Wirtszellen dem geimpften Individuum in abgeschwächter Form verabreicht werden.
Vorzugsweise sind die in Lebendimpfstoffen verwendeten Wirtszellen abgeschwächte Derivate von Pathogenen. Am meisten bevorzugt sind die abgeschwächten Derivate zur Bindung, Invasion und Fortdauer in Darm-assoziiertem lymphoidem Gewebe (GALT) oder Bronchien-assoziiertem lymphoidem Gewebe (BALT) fähig. Solche abgeschwächten Wirtszellen sind bevorzugt, da sie bekanntlich in dem inokulierten Tier fortdauern können, was ein Aussetzen gegenüber dem Antigen über längere Zeit hinweg bewirkt.
Ein solcher langer Aussetzungszeitraum ist bekanntlich bei der Induktion einer immunogenen Antwort gegenüber dem Antigen hoch wirksam.
Abschwächung kann den Mikroben durch beliebige bekannte Mittel verliehen werden, einschließlich chemische Mutagenese und die Verwendung verschiedener rekombinanter Gene. Bevorzugte Verfahren des Verleihens einer Abschwächung machen die Wirtszellen unfähig, auf den pathogenen Zustand umzustellen. Die am meisten bevorzugten Verfahren des Verleihens einer Abschwächung an Wirtszellen bestehen aus der Einführung stabiler Mutationen oder Geninsertionen mittels Rekombinationsverfahren. Nicht einschränkende Beispiele solcher Verfahren umfassen (1) Einführen von Mutationen, welche einen Bedarf für aromatische Aminosäuren und Vitamine verleihen, die von Vorläufern in diesem Weg abstammen (Stocker et al., 1983, Dev. Biol. Stand. 53: 47–54; Hoiseth and Stocker, 1981, Nature 291: 238–9); (2) Mutation von Genen für allgemeinen Regulatoren wie beispielsweise cya und cyp (US-Patent 5,389,368; 5,855,879; 5,855.880; 5,294,441 und 5,468.485), phoP (US-Patent 5,424,065), ompR (Donnan et al., 1989, Infect. Immun. 57: 2136–40) und poxA (US-Patentanmeldung 08/829,402); (3) Mutation von Genen für die Synthese von Lipopolysacchariden (LPS), wie beispielsweise galE (Germanier et al., 1975. J. Infect. Dis. 131: 553–8), obgleich dies allein unter Umständen nicht ausreichend ist (Hone et al., 1988. Infect. Immun. 56: 1325–33); (4) Mutieren von Genen, die zur Besiedelung tiefer Gewebe erforderlich sind, wie beispielsweise cdt (US-Patent 5,387,744) oder (5) durch Verhindern der Expression von Genen für Proteasen, die bei hohen Temperaturen erforderlich sind, wie beispielsweise htrA (Johnson et al., 1991. Mol. Microbiol. 5; 401–7).
Wenn sie abgeschwächt sind, können die Mikroben als immunogener Bestandteil eines Impfstoffes dienen, um Immunität gegen die Mikrobe zu verleihen. Daher wird die Verwendung einer Mikrobe, welche die oben beschriebenen Eigenschaften der Wirtszellen besitzt, einschließlich Avirulenz, von dieser Erfindung in Betracht gezogen, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, E. coli. Salmonella spp., E. coli – S. typhimurium- Hybride, Shigella spp., Yersinia spp., Pasteurella spp., Legionella spp. oder Brucella spp. Bevorzugte Mikroben sind Mitglieder der Gattung Salmonella wie beispielsweise S. typhimurium, S. typhi, S. paratyphi, S. gallinorum, S. enteritidis, S. choleraesuis, S. arizona oder S. dublin.
Lebende bakterielle Antigen-Zufuhrsysteme. Bevorzugte Wirte zur Verwendung als Antigen-Zufuhrsysteme sind enterische Bakterien. Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Antigen-Zufuhrsystem" und „Antigen-Zufuhr-Mikroorganismus" auf einen Mikroorganismus, der ein Antigen produziert oder einen Transfervektor birgt, welcher ein Antigen kodiert. Wie hierin verwendet, bezieht sich „enterische Bakterien" auf alle Enterobacteriaceae. Viele der hierin beschriebenen bevorzugten Gene und regulatorischen Elemente sind in den meisten enterischen Bakterien operabel, was die Verwendung der vielen gut entwickelten E. coli- und Salmonella-Regulationssysteme erlaubt. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei dem bakteriellen Wirt und ein abgeschwächtes Derivat einer pathogenen Salmonella.
In einer Ausführungsform des hierin beschriebenen Systems wird ein abgeschwächtes Derivat einer pathogenen Mikrobe, die zur Bindung an, Invasion und Fortdauer in dem darmassoziierten lymphoiden Gewebe (GALT) oder dem Bronchien-assoziierten lymphoiden Gewebe (BALT) fähig ist, als ein Träger des Genproduktes verwendet, das zum Stimulieren von Immunreaktionen gegen ein Pathogen oder ein Allergen verwendet wird.
Abgeschwächt bedeutet nicht, dass eine Mikrobe dieser Gattung oder Art nie Krankheit verursachen könnte, aber dass die jeweils verwendete Mikrobe hinsichtlich des jeweils behandelten Tieres abgeschwächt ist. Die Mikrobe kann einer Gattung oder sogar einer Art angehören, die normalerweise pathogen ist, muss aber zu einem Stamm gehören, der abgeschwächt ist. Mit pathogen ist die Fähigkeit zur Verursachung einer Krankheit oder der Beeinträchtigung einer normalen physiologischen Funktion gemeint. Abge schwächte Stämme sind nicht in der Lage, die gesamte Symptomatik der Krankheit zu induzieren, die normalerweise mit ihrem virulenten pathogenen Gegenstück assoziiert sind. Mikroben, wie hierin verwendet, umfassen Bakterien, Protozoen, Parasiten, einzellige Pilze und mehrzellige Pilze.
Shigella oder ein enteroinvasives E. coli kann für Antigen-Zufuhrsysteme geeignet sein, da die Invasion in die Darmschleimhaut an den Darm angrenzende lymphoide Gewebe stimulieren könnte, um eine starke Immunreaktion in der Schleimhaut des Fortpflanzungstraktes zu stimulieren. Rektale Immunisierung kann aufgrund von anatomischen Merkmalen, wie der Nähe von Lymphknoten und Lymphgeweben zum Darm, effektiv sein.
Damit ein Impfstoff Antikörper wirksam induzieren kann, muss das antigene Material so frei gesetzt werden, dass der Antikörper produzierende Mechanismus des geimpften Tieres aktiviert wird. Der Mikrobenträger des Genproduktes muss daher in das Tier eingeführt werden. Um eine bevorzugte Reaktion der GALT- oder BALT-Zellen, wie oben beschrieben, zu stimulieren, ist das Einführen der Mikrobe oder des Genproduktes direkt in den Darm oder Bronchus bevorzugt, beispielsweise durch orale Verabreichung, Magenintubation oder intranasal, obgleich andere Verfahren der Verabreichung des Impfstoffes, wie beispielsweise intravenöse, intramuskuläre, subkutane Injektion oder Injektion in die Brust, in den Penis oder in die Vagina, möglich sind.
Wenn die abgeschwächte Mikrobe als Impfstoff verwendet wird, muss das Antigen für das Immunsystem des Tieres verfügbar werden. Dies kann erreicht werden, wenn die Trägermikrobe stirbt, so dass die Antigenmoleküle frei gesetzt werden. Natürlich ist auch die Verwendung von „undichten" abgeschwächten Mutanten möglich, welche den Inhalt des Periplasmas ohne Lyse freisetzen. Alternativ kann ein Gen ausgewählt werden, das die Produktion eines Antigens kontrolliert, welches von der Trägerzelle vor dem Tod der Zelle der Außenumgebung verfügbar gemacht wird.
Antigene. Es können lebende rekombinante RADS-Mikroorganismen verwendet werden, um jedes beliebige Produkt zuzuführen, das in dem Wirtsmikroorganismus exprimiert werden kann. Bevorzugte Expressionsprodukte für diesen Zweck sind Antigene. Beispielsweise können Antigene von bakteriellen, viralen, mykotischen und parasitären Pathogenen stammen, um gegen bakterielle, virale, mykotische bzw. parasitäre Infektionen zu schützen; Gameten, vorausgesetzt, sie sind gametenspezifisch, zur Blockierung einer Befruchtung; und Tumorantigene, um Krebs aufzuhalten. Es wird besonders in Betracht gezogen, dass Antigene von Organismen, die neu identifiziert oder neu mit einer Krankheit oder einem pathogenen Zustand sind, oder neue oder aufkommende Pathogene von Tieren oder Menschen, einschließlich solchen, die jetzt bekannt oder in der Zukunft identifiziert werden, in einem RADS verwendet werden können. Des Weiteren sind Antigene zur Verwendung in einem RADS nicht auf solche von pathogenen Organismen beschränkt. Die Auswahl und rekombinante Expression von Antigenen wurde zuvor beschrieben von Schödel (1992) und Curtiss (1990). Immunogenität der Mikroorganismen kann verstärkt und/oder moduliert werden, indem Stämme konstruiert werden, die auch Gene für Zytokine, Adjuvanzien und andere Immunmodulatoren exprimieren.
Einige Beispiele von Mikroorganismen, die als Antigenquelle geeignet sind, sind unten aufgeführt. Diese umfassen Mikroorganismen für die Kontrolle von Pest, die durch Yersinia pestis und andere Yersinia-Arten verursacht wird, beispielsweise Y. pseudotuberculosis und Y. emerocolitica, zur Kontrolle von Gonorrhö, die von Neisseria gonorrhoea verursacht wird, zur Kontrolle von Syphilis, die durch Treponema pallidum verursacht wird, und von Geschlechtskrankheiten sowie von Augeninfekten, die durch Chlamydia trachomatis verursacht werden. Streptococcus-Arten der Gruppe A und der Gruppe B, wie beispielsweise die Arten, die Halsschmerzen oder Herzerkrankungen verursachen, Erisipelothrix rhusiopathiae, Neisseria meningitidis, Mycoplasma pneumoniae und andere Mycoplasma-Arten, Hemophilus influenza, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Bordetella-Arten, Escherichia coli, Streptococcus equi, Streptococcus pneumoniae, Brucella abortus, Pasteurella hemolytica und P. multo cida, Vibrio cholera, Shigella-Arten, Borrellia-Arten, Bartonella-Arten, Helicobacter pylori, Campylobacter-Arten, Pseudomonas-Arten, Moraxella-Arten, Brucella-Arten, Francisella-Arten, Aeromonas-Arten, Actinobacillus-Arten, Clostridium-Arten, Rickettsia-Arten, Bacillus-Arten, Coxiella-Arten, Ehrlichia-Arten, Listeria-Arten und Legionella pneumophila sind weitere Beispiele von Bakterien innerhalb des Umfangs dieser Erfindung, aus denen Antigene erhalten werden könnten. In einem RADS können auch virale Antigene verwendet werden. Virale Antigene können in gegen Viren, entweder DNA- oder RNA-Viren gerichteten Antigen-Zufuhr-Mikroorganismen verwendet werden, beispielsweise aus den Klassen Papovavirus, Adenovirus, Herpesvirus, Poxvirus, Parvovirus, Reovirus, Picornavirus, Myxovirus, Paramyxovirus, Flavivirus oder Retrovirus. Es können auch Antigen-Zufuhr-Mikroorganismen verwendet werden, die Antigene pathogener Pilze, Protozoen und Parasiten verwenden.
Bestimmte Impfstoffausführungsformen umfassen die Nutzung von Mikroorganismen, welche ein RADS-System aufweisen, bei dem das gewünschte Gen ein Allergen kodiert. Ein solcher Impfstoff kann in einem Aussetzungsregime verwendet werden, das so konzipiert ist, um einen allergischen Wirt spezifisch zu desensibilisieren. Allergene sind Substanzen, die in Tier, das ihnen ausgesetzt ist, allergische Reaktionen verursachen. Allergische Reaktionen, auch bekannt als Typ-I-Hypersensitivität oder unmittelbare Hypersensitivität, sind Immunreaktionen bei Wirbeltieren, die von einer IgE-Produktion in Verbindung mit bestimmten zellulären Immunreaktionen gekennzeichnet sind. Viele verschiedene Materialien können Allergene sein, beispielsweise tierische Hautschuppen und Pollen, und die allergische Reaktion einzelner Tiere variiert bei jedem bestimmten Allergen. Es ist möglich, Toleranz gegenüber einem Allergen in einem Tier zu induzieren, das normalerweise eine allergische Reaktion zeigt. Die Verfahren der Induktion einer Toleranz sind gut bekannt und umfassen im Allgemeinen das Verabreichen des Allergens an das Tier in steigenden Dosen.
Rekombinante abgeschwächte Salmonellen sind in der Lage, starke mukosale, systemische und zelluläre Immunreaktionen gegen Fremdantigene und damit gegen das Pathogen zu stimulieren, das die Quelle des Fremdantigens darstellt. Es ist nicht erforderlich, dass das Antigengen ein vollständiges Gen ist, wie es im Elternorganismus vorhanden ist und in der Lage war, ein Makromolekül, beispielsweise ein funktionierendes Polypeptid, zu produzieren oder dessen Produktion zu regulieren. Es ist lediglich erforderlich, dass das Gen als Vorlage dient, die als Richtlinie bei der Produktion eines antigenen Produktes verwendet wird. Das Produkt kann eines sein, das nicht in dieser genauen Form in dem Elternorganismus gefunden wird. Beispielsweise kann ein funktionales Gen, das ein Polypeptidantigen kodiert, welches 100 Aminosäurereste umfasst, teilweise in eine Trägermikrobe überführt werden, so dass von dem zellulären Mechanismus der Wirtszelle ein Peptid produziert wird, das nur 75 oder sogar nur 10 Aminosäurereste aufweist. Alternativ ist es möglich, wenn die Aminosäuresequenz eines bestimmten Antigens oder dessen Fragments bekannt ist, das DNA-Fragment oder ein Analog davon mittels eines Gensynthesegeräts, durch PCR oder dergleichen chemisch zu synthetisieren und die DNA-Sequenz in den entsprechenden Expressionsvektor einzubauen. Am anderen Ende des Spektrums ist ein langer Abschnitt von DNA, der mehrere Genprodukte kodiert, von denen eines oder alle antigen sein können.
Von einem rekombinanten avirulenten Salmonella-Stamm können auch mehrere Antigene exprimiert werden. Darüber hinaus können Antigene oder sogar Teile von Antigenen, die ein B-Zell-Epitop bilden oder eine Region eines Antigens definieren, gegen die eine Immunreaktion erwünscht ist, als eine Fusion an ein Trägerprotein exprimiert werden, das ein starkes vermischtes T-Zellepitop enthält und/oder als Adjuvans dient und/oder die Präsentation des Antigens ermöglicht, um in allen Fällen die Immunreaktiori auf da Antigen oder dessen Teilkomponente zu verstärken. Dies lässt sich leicht erreichen, indem DNA-Sequenzen gentechnisch verändert werden, um solche Fusionen zur Expression abgeschwächter Stämme zu spezifizieren. Für diesen Zweck sind Fusionen an Tenus-Toxinfragment C, CT-B, LT-B und Hepatitis-B-Virus-Kernprotein beson ders geeignet, obgleich andere Epitoppräsentationssysteme aus dem Stand der Technik gut bekannt sind.
Damit das Expressionsgen wirksam eine Immunreaktion auslösen kann, muss es exprimiert werden, was wie oben beschrieben erreicht werden kann. Damit ein Antigen-Zufuhr-Mikroorganismus ein Individuum wirksam immunisieren kann, muss das antigene Material so frei gesetzt werden, dass das Immunsystem des geimpften Tieres aktiviert wird. Daher muss der lebende avirulente Mikroorganismus in das Tier eingeführt werden. Um eine bevorzugte Reaktion der GALT- oder BALT-Zellen, wie oben beschrieben, zu stimulieren, ist das Einführen der Mikrobe oder des Genproduktes direkt in den Darm oder Bronchus bevorzugt, beispielsweise durch orale Verabreichung, intranasale Verabreichung, Magenintubation oder in Form von Aerosolen, obgleich andere Verfahren der Verabreichung des Antigen-Zufuhr-Mikroorganismus, wie beispielsweise intravenöse, intramuskuläre, subkutane Injektion oder Injektion in die Brust, in den Penis, in das Rektum oder in die Vagina, möglich sind.
Zusammensetzungen zur Antigen-Zufuhr. Eine besonders bevorzugte Verwendung von Antigen-Zufuhr-Mikroorganismen ist als Impfstoffe zur Stimulation einer Immunreaktion auf die zugeführten Antigene. Orale Immunisierung in einem geeigneten tierischen Wirt mit lebenden rekombinanten Salmonella-Impfstoffstämmen führt zur Besiedelung des Darm-assoziierten lymphoiden Gewebes (GALT) oder der Peyer-Plaques, was zur Induktion einer allgemeinen mukosalen Immunreaktion sowohl gegen Salmonella-Antigene als auch gegen die Fremdantigene führt, die von den rekombinanten Salmonella synthetisiert werden (Curtiss et al., Adv. Exp. Med. Biol. 251: 33–47 (1989)). Weiteres Eindringen des Impfstoffstammes in die mesenterischen Lymphknoten, die Leber und die Milz verstärkt die Induktion systemischer und zellulärer Immunreaktionen gegen Salmonella-Antigene und die von den rekombinanten Salmonella hergestellten Fremdantigene (Doggett and Curtiss (1992)). Die Verwendung rekombinanter avirulenter Salmonella-Impfstoffe für orale Immunisierung stimuliert also alle drei Teile des Immunsys tems, was besonders wichtig ist, wenn gegen infektiöse Krankheitserreger geimpft wird, welche Schleimhautoberflächen besiedeln und/oder durch Schleimhautoberflächen eindringen.
Mit Impfstoff ist ein Agens gemeint, das verwendet wird, um das Immunsystem eines lebenden Organismus so zu stimulieren, dass eine Immunreaktion stattfindet. Vorzugsweise ist der Impfstoff ausreichend, um das Immunsystem eines lebenden Organismus zu stimulieren, so dass Schutz gegen zukünftige Schäden vermittelt wird. Immunisierung bezieht sich auf den Prozess des Induzierens eines fortlaufenden hohen Spiegels an Antikörpern und/oder einer zellulären Immunreaktion, bei der T-Lymphozyten das Pathogen entweder töten und/oder andere Zellen aktivieren (beispielsweise Phagozyten), dies zu tun, in einem Organismus, der gegen ein Pathogen oder ein Antigen gerichtet ist, dem der Organismus zuvor ausgesetzt worden ist. Obgleich der Begriff „Immunsystem" Reaktionen einzelliger Organismen gegen das Vorhandensein von Fremdkörpern umfassen kann, also Interferonproduktion, ist der Begriff, wie hierin verwendet, auf die anatomischen Merkmale und Mechanismen beschränkt, mit denen ein mehrzelliger Organismus auf Antigenmaterial reagiert, das in die Zellen des Organismus oder in die extrazelluläre Flüssigkeit des Organismus eindringt. Der so produzierte Antikörper kann jeder beliebigen immunologischen Klasse angehören, beispielsweise den Immunglobulinen A, D, E, G oder M. Von besonderem Interesse sind Impfstoffe, welche die Produktion von Immunglobulin A (IgA) anregen, da es sich dabei um das wichtigste Immunglobulin handelt, das von dem sekretorischen System warmblütiger Tiere produziert wird, obgleich die hierin beschriebenen Impfstoffe nicht auf solche beschränkt sind, die eine IgA-Produktion stimulieren. Beispielsweise könnten Impfstoffe der hierin beschriebenen Art wahrscheinlich eine Vielfalt weiterer Immunreaktionen außer der Bildung von IgA produzieren, beispielsweise zelluläre und humorale Immunität. Immunreaktionen gegen Antigene sind gut untersucht und auf breiter Basis dokumentiert. Ein Überblick über die Immunologie findet sich in Paul, Hrsg. (1999), Fundamental Immunology, Vierte Auflage, Philadelphia: Lippincott-Raven, Sites et al., Basic and Clinical Immunology (Lange Medical Books, Los Altos, CA, USA, 1994), und in Orga et al., Handbook of Mucosal Immunology (Academic Press, San Diego, CA, USA 1994). Mukosale Immunität wird auch beschrieben von Ogra et al., Hrsg. (1999), Mucosal Immunology, Zweite Auflage, Academic Press, San Diego, USA.
Ein Individuum, das mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff behandelt wird, ist hierin so definiert, dass alle Wirbeltiere enthalten sind, beispielsweise Säuger, einschließlich Nutztiere und Menschen, verschiedene Vogelarten, einschließlich Nutzgeflügel, besonders solche mit landwirtschaftlicher Bedeutung. Vorzugsweise ist das Individuum ein Warmblütler.
Die Dosierung rekombinanter Lebendimpfstoffe, die erforderlich ist, um eine Immunreaktion auszulösen, variiert je nach der Antigenität des klonierten rekombinanten Expressionsproduktes und muss lediglich ausreichend sein, um eine für bestehende Impfstoffe typische Immunreaktion auszulösen. Die erforderliche Dosis kann problemlos durch Routineversuche bestimmt werden. Typische Anfangsdosen eines Impfstoffes für orale Gabe können bei 1 × 10⁷ bis 1 ×10¹¹ CFU liegen, je nach Größe und Alter des zu immunisierenden Individuums. Es können auch gegebenenfalls Mehrfachdosen verabreicht werden, um das gewünschte Maß an schützender Immunität zu bieten. Der pharmazeutische Träger, in dem der Impfstoff suspendiert ist, kann jedes beliebige Lösungsmittel oder Festmaterial zur Verkapselung sein, das für das inokulierte Tier nicht toxisch und mit dem Trägerorganismus oder dem Antigen-Genprodukt kompatibel ist. Geeignete pharmazeutische Träger umfassen flüssige Träger, wie beispielsweise physiologische Salzlösung und andere nicht-toxische Salze mit physiologischer Konzentration oder nahezu physiologischer Konzentration, und feste Träger, die nicht beim Menschen verwendet werden, wie beispielsweise Talkum, Saccharose, oder Tierfutter. Falls gewünscht, können Adjuvanzien zugegeben werden, um die Antigenität zu erhöhen. Wenn der Impfstoff zur Verabreichung über die Bronchialröhren verwendet wird, wird er vorzugsweise in Form eines Aerosols präsentiert.
Immunisierung mit einem von einem Pathogen abstammenden Genprodukt kann auch in Verbindung mit vorheriger Immunisierung mit dem abgeschwächten Derivat eines pathogenen Mikroorganismus verwendet werden, der als Träger wirkt, um das von einem rekombinanten Gen eines Pathogens spezifizierte Genprodukt zu exprimieren. Eine solche parenterale Immunisierung kann als Verstärkung (Booster) dienen, um die Expression der sekretorischen Immunreaktion zu verstärken, nachdem das sekretorische Immunsystem gegen dieses von einem Pathogen abstammende Genprodukt durch Immunisierung mit der Trägermikrobe, welche das von dem Pathogen abstammende Genprodukt exprimiert, geprimt worden ist, um die lymphoiden Zellen des GALT oder BALT zu stimulieren. Die verstärkte Reaktion wird als sekundäre Reaktion, Booster-Reaktion oder anamnestische Reaktion bezeichnet und führt zu einem länger dauernden Immunschutz des Wirtes. Booster-Immunisierungen können zahlreiche Male mit günstigem Ergebnis wiederholt werden.
Obgleich bevorzugt wird, dass Antigen-Zufuhr-Mikroorganismen auf solche Weise verabreicht werden, dass eine mukosale Immunreaktion stimuliert wird, nämlich oral, intranasal, intravaginal und intrarektal, können diese Mikroorganismen auch intramuskulär, intravenös und auf andere parenterale Weise zugeführt werden. Verabreichung eines Antigen-Zufuhr-Mikroorganismus kann auch mit der parenteralen Verabreichung gereinigter Antigenkomponenten kombiniert werden. Wenn ein ELVS verwendet wird, um Krebs zu kontrollieren oder zu behandeln, ist bevorzugt, dass das ELVS parenteral verabreicht wird.
Adaption des RADS an geeignete Wirtsstämme. Avirulente Stämme von S. typhimurium sind bekanntlich vollständig abgeschwächt und hoch immunogen bei Mäusen, Hühnern und Schweinen, wobei schützende Immunität gegenüber einer Infektion mit dem 10.000-Fachen einer letalen Dosis des virulenten Wildtypstamm erreicht wird. Avirulente Stämme von S. choleraesuis sind gleichermaßen abgeschwächt und bei Mäusen und Schweinen immunogen, und bieten ebenfalls signifikante schützende Immunität. Aviru lente Stämme von S. dublin sind isoliert und getestet worden und haben sich beim Kalb als avirulent, immunogen und protektiv erwiesen. Es wurden auch abgeschwächte Stämme von S. typhi konstruiert und es wurde festgestellt, dass sie signifikante Immunreaktionen bei menschlichen Freiwilligen induzierten. Es wurden auch abgeschwächte Derivate von Vibrio cholerae und Shigella flexneri konstruiert und als Impfstoffe verwendet, um signifikante Immunreaktionen bei menschlichen Freiwilligen zu induzieren. Auch der Mycobacterium bovis-Stamm BCG wurde verwendet, um Menschen oral zu immunisieren. Auch abgeschwächte Listeria monocytogenes wurden als Lebendimpfstoff zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Außer dass sie als Impfstoffe zur Immunisierung von tierischen und menschlichen Wirten gegen Infektion mit verwandten virulenten Wildtypstämmen dienen, können avirulente Derivate der oben genannten Mikroorganismen auch als Antigen-Zufuhr-Vektoren verwendet werden, indem sie genetisch verändert werden, um Fremdantigene zu exprimieren. Diese Antigene können aus bakteriellen, viralen, fungalen und parasitären Pathogenen stammen, oder es kann sich dabei um Pathogene handeln, oder es kann sich sich dabei um gametenspezifische Antigene in einem Verhütungsimpfstoff oder um Tumorantigene in Antikrebsimpfstoffen handeln. Immunisierung von tierischen und/oder menschlichen Wirten mit diesen rekombinanten avirulenten Lebendimpfstoffen induziert bekanntlich mukosale, systemische und zelluläre Immunreaktionen, die gegen das Fremdantigen und gegen das Pathogen, aus dem das Gen, welches das Fremdantigen spezifiziert, isoliert wurde, oder gegen Allergene oder gegen Spermien oder Eizellen oder gegen Tumorzellen gerichtet sind.
Bakterielle Pathogene können abgeschwächt werden, indem Deletionsmutationen in verschiedene Gene, wie oben beschrieben oder wie einem Fachmann bekannt ist, eingebaut werden. Jeder dieser Stämme ist zur Einführung eines RADS der hierin beschriebenen Art geeignet, obgleich Modifikationen erforderlich wären, um das System in grampositiven Bakterien operabel zu machen. Spezifisch würden diese Modifikationen eine Modifikation der Shine-Dalgarno-Sequenzen erfordern, um eine Translation der mRNA zu erlauben, sowie leichte Veränderungen in Promotorsequenzen, damit die Transkription effizienter wird, wie aus dem Stand der Technik bekannt ist.
Die Verabreichung eines Lebendimpfstoffes der oben beschriebenen Art an ein Tier kann durch jede bekannte Technik oder Standardtechnik erfolgen. Diese umfassen orale Einnahme, Magenintubation oder broncho-nasales Sprühen. All diese Verfahren erlauben es dem Lebendimpfsfoff, die GALT- oder BALT-Zellen einfach zu erreichen und Antikörperbildung zu induzieren, und sind die bevorzugten Verfahren der Verabreichung. Es können weitere Verfahren der Verabreichung, wie beispielsweise intravenöse Injektion, damit die Trägermikrobe den Blutstrom des Tieres erreichen kann, zulässig sein. Bei anderen Ausführungsformen der Erfindung, wie später beschrieben wird, sind intravenöse, intramuskuläre oder intramammale Injektionen zulässig.
Da orale Einnahme, Aerosolspray und Magenintubation bevorzugte Verabreichungsverfahren sind, sind bevorzugte Trägermikroben solche, die zu Arten gehören, welche vorzugsweise zu einer der lymphoepithelialen Strukturen des Darms oder der Bronchien des geimpften Tieres steuern (Homing). Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Stämmen um abgeschwächte Derivate enteropathogener Stämme, die durch genetische Manipulation enteropathogener Stämme produziert werden. Stämme, die zu den Peyer-Plaques steuern und so direkt die Produktion von IgA stimulieren, sind am meisten bevorzugt. Bei Tieren gehören dazu spezifische Stämme von Salmonella und Salmonella-E.coli-Hybride, die zu den Peyer-Plaques steuern.
Die erforderlichen Dosen variieren je nach Antigenität des Genproduktes und müssen nur so hoch sein, wie es zur Induktion einer Immunreaktion, die für bestehende Impfstoffe typisch ist, ausreichend ist. Die erforderliche Menge kann durch Routineversuche leicht bestimmt werden. Typische Anfangsdosen des Impfstoffes können 0,001–0,1 mg Antigen/kg Körpergewicht sein, wobei je nach Bedarf steigende Mengen oder Mehrfachdosen verwendet werden, um das gewünschte Maß an Schutz zu verleihen.
Der pharmazeutische Träger, in dem der Impfstoff suspendiert oder gelöst ist, kann jedes beliebige Lösungsmittel oder Festmaterial oder verkapselt in einem Material sein, das für das inokulierte Tier nicht toxisch und mit dem Trägerorganismus oder dem Antigen-Genprodukt kompatibel ist. Geeignete pharmazeutische Träger umfassen flüssige Träger, wie beispielsweise physiologische Salzlösung und andere nicht-toxische Salze mit physiologischer Konzentration oder nahezu physiologischer Konzentration, und feste Träger, die nicht beim Menschen verwendet werden, wie beispielsweise Talkum, Saccharose, oder Futter für Nutztiere. Falls gewünscht, können Adjuvanzien zugegeben werden, um die Antigenität zu erhöhen. Wenn der Impfstoff zur Verabreichung über die Luftröhre verwendet wird, wird er vorzugsweise in Form eines Aerosols präsentiert.
Immunisierung mit einem von einem Pathogen abstammenden Genprodukt kann auch in Verbindung mit vorheriger Immunisierung mit dem abgeschwächten Derivat eines pathogenen Mikroorganismus verwendet werden, der als Träger wirkt, um das von einem rekombinanten Gen eines Pathogens spezifizierte Genprodukt zu exprimieren. Eine solche parenterale Immunisierung kann als Verstärkung (Booster) dienen, um die Expression der sekretorischen Immunreaktion zu verstärken, nachdem das sekretorische Immunsystem gegen dieses von einem Pathogen abstammende Genprodukt durch Immunisierung mit der Trägermikrobe, welche das von dem Pathogen abstammende Genprodukt exprimiert, geprimt worden ist, um die lymphoiden Zellen des GALT oder BALT zu stimulieren. Die verstärkte Reaktion wird als sekundäre Reaktion, Booster-Reaktion oder anamnestische Reaktion bezeichnet und führt zu einem länger dauernden Immunschutz des Wirtes. Booster-Immunisierungen können zahlreiche Male mit günstigem Ergebnis wiederholt werden.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung kann ein rekombinantes abgeschwächtes Derivat einer pathogenen Mikrobe verwendet werden, um in dem tierischen Wirt Genprodukte zu exprimieren, in in dem inokulierten Tier therapeutisch sind. Nicht einschränkende Beispiele solcher Produkte umfassen Lymphokine oder Zytokine zur Modulierung der Immunreaktion (Saltzman et al., 1996, Cancer Bio. Ther. Radiol. Pharm. 11: 145–153; Saltzman et al., 1997, J. Pediatric. Surg. 32: 301–306; Whittle et al., 1997, J. Med. Microbiol. 46: 1029–1038, 1997; Dunstan et al., 1996, Infect. Immun. 64: 2730–2736), spermien-spezifische und eizellenspezifische Autoantigene, um die Fruchtbarkeit einzustellen (US-Patent Nr. 5,656,488), Blutprodukte wie beispielsweise Gerinnungsfaktoren, spezifische Antikörper, die beispielsweise an Tumoren oder Pathogene wie Viren, Pilze, Parasiten oder Bakterien binden, Wachstumsfaktoren, essenzielle Enzyme oder Strukturproteine, die in dem Wirt unzureichend produziert werden, Ribozyme oder Antisense-RNA, die eine Nukleinsäure, die ein unerwünschtes Genprodukt kodiert (z. B. ein Genprodukt, das für die Tumormetastasierung oder die Angiogenese von Tumoren entscheidend ist; ein Genprodukt, das entscheidend ist, damit ein Pathogen Krankheit verursachen kann) spaltet oder inaktiviert, oder Enzyme, die Propharmaka innerhalb einer Tumorzellmasse in einem Individuum mit einem massiven Tumor in toxische Wirkstoffe umwandeln können (Pawelek et al., 1997, Cancer Res. 57: 4537–44).
Weil die avirulenten Mikroben dieser Erfindung in der Lage sind, eine Reihe immunkompetenter Strukturen zu durchqueren, einschließlich des GALT, der mesenterischen Lymphknoten und der Milz, können solche Mikroben auch verwendet werden, um das Immunsystem zu modulieren, indem verschiedene immunregulatorische Produkte produziert werden. Entsprechend können eines oder mehrere Gene, die immunregulatorische Proteine oder Peptide kodieren, derart in die abgeschwächten Mikroben als ein gewünschtes Gen rekombinant eingebaut werden, dass die Mikroben in dem entsprechenden immunkompetenten Gewebe bleiben und das rekombinante gewünschte Genprodukt exprimieren können, um die Immunreaktion in dem Wirt zu unterdrücken, zu unterstützen oder zu modifizieren. Nicht einschränkende Beispiele immunregulatorischer Moleküle umfassen Kolonie-stimulierende Faktoren (Makrophagen, Granulozyten oder gemischt), Makrophagen-Chemotoxin, Makrophagen-Inhibitionsfaktor, Leukozyten-Inhibitionsfaktoren, Lymphotoxine, blastogener Faktor, Interferone und Interleukine.
Auch Derivate abgeschwächter Mikroben sollen im Umfang dieser Erfindung enthalten sein. Mit Derivat sind geschlechtliche oder ungeschlechtlich entstandene Nachkommen und Mutanten der avirulenten Stämme gemeint, einschließlich Substitutionen einzelner oder mehrerer Basen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen, welche die grundlegende Funktion der oben beschriebenen Wirtszellen bewahren.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den folgenden Beispielen beschrieben. Weitere Ausführungsformen im Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche sind einem Fachmann nach Berücksichtigung der Patentschrift oder Ausführung der Erfindung wie hierin beschrieben offensichtlich.
Beispiele
Beispiel 1
Konstruktion bakterieller Wirtsstämme als abgeschwächte Antigen-Zufuhr-Wirte für RAVs.
Die RADS sind abhängig von dem Vorhandensein von RAV-Konstrukten, wie in Beispiel 2 beschrieben ist, und dem Vorhandensein chromosomaler Deletionsmutationen, häufig mit Insertionen, um die Regulierung von Genen der RAVs unter günstigen im Gegensatz zu ungünstigen Bedingungen zu erlauben. Im Allgemeinen werden die Deletions/Insertionsmutation 1 und 2 in 2 für die Erhaltung der meisten beschriebenen RAV benötigt, obgleich die Deletions-/Insertionsmutation 2 zur Erhaltung und Funktion eines der RAV ausreichend ist, der in einem anschließenden Beispiel beschrieben ist. Das Einführen von Mutationen wie beispielsweise ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT und ΔilvG3::TTaraCP_BADlacITT wird am besten durch die Verwendung von Suicide-Vektoren erreicht. Wie oben erwähnt, erlaubt das araCP_BAD-Regulationssystem, dass Arabinose als freier Zucker zugeführt wird, um an das AraC-Protein zu binden, welches als Aktivator der Transkription, beginnend am PBAD-Promotor, wirkt, was nach Translation der c2- und/oder lacI-mRNA die Synthese der Repressorproteinprodukte C2 und/oder LacI bewirkt. Die molekulare Konstruktion des TTaraCP_BADc2TT-Produkts und seine Insertion in die 1244-bp-Deletion des asd-Gens sowie die molekulargenetische Konstruktion des TTaraCP_BaDlacITT-Konstruktes und seine Insertion in die ΔilvG3-Mutation sind in WO 96/40947 beschrieben. (Erwähnenswert ist, dass die ilvG3-Mutation in WO 96/40947 irrtümlicherweise als ΔrelA3 bezeichnet ist). Diese Molekülkonstrukte können in einen Suicide-Vektor wie beispielsweise pMEG-375 (3) platziert werden, welcher Gene für Ampicillin- und Chloramphenicolresistenz besitzt, um primäre Rekombinanten zu selektieren, bei denen der Suicide-Vektor in das Chromosom eingebaut ist, und welche das sacB-Gen aufweisen, das Levansucrase für die Hydrolyse von Saccharose kodiert. Letzteres erlaubt die Selektion von Rekombinanten, die den Suicide-Vektor durch ein zweites Rekombinationsereignis verlieren, hoffentlich verbunden mit einer Allelsubstitution. Der Suicide-Vektor enthält auch die mob-Sequenz aus einem IncP-Plasmid, um seine Mobilisierung und Konjugation aus Stämmen zu erlauben, die ein integriertes konjugatives IncP-Plasmid besitzen. pMEG-375 besitzt außerdem den Replikationsursprung des Plasmids R6K, welcher von einem Gen pir abhängig ist und der in das Chromosom eines Suicide-Vektor-Donorstammes wie beispielsweise MGN-617 (Tabelle 1) in einem Prophagen des Bakteriophagen λ eingebaut ist. Wenn ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT in pMEG-375 eingebaut ist, entsteht der Suicide-Vektor pMEG-611 (4). pMEG-611 kann entweder durch Transformation oder Elektroporation in einen konjugatianalen Suicide-Vektor-Donorstamm MGN-617 (Tabelle 1) eingeführt werden. MGN-617 besitzt auch eine Δasd-Mutation, die eine zwingende Abhängigkeit von DAP bewirkt. MGN-617, der einen Suicide-Vektor wie pMEG-611 enthält (4), kann daher mit einem geeigneten Empfängerstamm von S. typhimurium, wie beispielsweise χ3761, in Gegenwart von DAP zusammengebracht werden, und Exkonjuganten, die den Suicide-Vektor pMEG-611 durch einen einzelnen reziproken Crossover zwischen homologen Sequenzen, welche das asd-Gen auf dem Plasmidvektor flankieren, und solchen auf dem Chromosom erben, führen zu Ampicillin- und Chloramphenicol-resistenten Überlebenden. (DAP ist in diesem Selektionsmedium nicht enthalten, so dass die MGN-117- Zellen, die für den Suicide-Vektor permissiv sind, lysebedingt sterben.) Diese durch Einzelcrossover entstandenen Integranten lassen sich durch Neuausstreichen auf Medium, das Ampicillin oder Chloramphenicol, aber kein DAP enthält, reinigen. Aus diesen wirkstoffresistenten Isolaten lassen sich dann kleine Kulturen herstellen und auf Medium mit 5% Saccharose und DAP ausplattieren (so dass die Zellen, welche die Mutation ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT geerbt haben, überleben). Ist das Suicide-Plasmid noch in dem Bakterienchromosom vorhanden, werden die Zellen getötet, aber wenn das zweite Crossover-Ereignis stattgefunden hat, wodurch der Suicide-Vektor aus dem Chromosom ausgeschnitten wurde, überleben die Bakterien und bilden eine Kolonie. Findet das zweite Crossover-Ereignis auf der entgegen gesetzten Seite der asd-Deletionsmutation statt als beim ersten Crossover-Ereignis, findet eine Allelsubstitution statt, so dass das asd*-Wildtypallel in dem Chromosom nun durch eine ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT-Deletions-/Insertionsmutation ersetzt ist. Durch Verwendung von DNA-Sonden und PCR mit geeigneten Oligonukleotiden lässt sich die stabile Existenz der Konstruktion in dem Chromosom, einschließlich der Abwesenheit des asd*-Wildtypallels, nachweisen. Die Bakterien haben nun einen zwingenden Bedarf für DAP.
Ein Suicide-Vektor zur Verwendung für die Allelsubstitution zum Einführen der ΔilvG3::TTaraCP_BADlacITT-Deletions-/Insertionsmutation ist als pMEG-249 (5) dargestellt. Der Suicide-Vektor-Anteil von pMEG-249 unterscheidet sich insofern leicht von dem in pMEG-611, als kein Gen für Chloramphenicol-Resistenz vorhanden ist, obwohl andere Eigenschaften des des Suicide-Vektors gleich sind und er von dem Suicide-Vektor-Donorstamm MGN-617 konjugiert werden kann.
Wie zuvor erwähnt, kann ein RAV in einem bakteriellen Wirt mit Mutationen 1 und 2 (2), wenn er aus einem Medium mit Arabinose in ein Medium ohne Arabinose verbracht wird, die Runaway-Replikation relativ schnell initiieren, und das Wachstum kann innerhalb von zwei Generationen aufhören. Eine Möglichkeit, die Rate der Arabinosenutzung zu verringern, ist der Einbau von Mutation 3, d. h. ΔaraBAD1923. Diese Mutati ori schaltet die Strukturgene für die Enzyme aus, welche Arabinose abbauen, deshalb bleibt die in die Zelle aufgenommene Arabinose dort, bis sie austritt oder ihre Konzentration bei jeder nachfolgenden Zellteilung abnimmt. Ein Bakterienstamm mit Mutation 1, 2 und 3 (2) initiiert die Runaway-Replikation nach längerer Zeit in Abwesenheit von exogener Arabinose als dies bei einem Stamm der Fall ist, der nur Mutation 1 und 2 aufweist, wie in 1 gezeigt ist. 6 zeigt den Suicide-Vektor pYA3484 für die Zufuhr der Deletionsmutation ΔaraBAD1923 in das Chromosom des zu konstruierenden Stammes. Die Vorgehensweisen, um Allelaustausch zu erreichen, entsprechen den oben für die Deletions-/Insertionsmutation ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT ausführlich beschriebenen. Das Ausplattieren in Gegenwart von 5% Saccharose erfolgt hingegen auf MacConkey-Agar-Platten, die 1% Arabinose enthalten (plus DAP, wenn der Stamm auch die Mutation ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT aufweist). Ob der Allelaustausch erfolgreich war, lässt sich erkennen, indem die Platten nach 16-stündiger Inkubation bei 37°C untersucht werden, um nicht-fermentierende Ara-Isolate zu identifizieren.
Wie oben angegeben ist es in einem Stamm mit Mutation 3, welche den metabolischen Abbau von Arabinose verhindert, möglich, dass eine gewisse Menge der von der Zelle, die in Gegenwart von Arabinose gezüchtet wird, aufgenommenen Arabinose austreten könnte. Aus diesem Grund kann Mutation 7, bei der es sich um eine ΔaraE25-Mutation handelt (7) in den Stamm eingeführt werden, wobei der Suicide-Vektor pYA3485 verwendet wird (7). Das araE-Gen kodiert das Transportprotein für Arabinose mit niedriger Affinität, und in seiner Abwesenheit werden höhere Konzentrationen von Arabinose zur Expression des araCP_BAD-Regulationssignals benötigt, aber einmal in der Bakterienzelle tritt Arabinose sehr uneffizient aus der Bakterienzelle aus (Schlief et al., S. 1300–1309 in Neidhardt et al.). In einem Bakterienstamm mit Mutation ΔaraBAD1923 und ΔaraE25 außer Mutation 1 und 2 (2) wäre die Runaway-Replikation eines RAV verzögert, insbesondere beim Überführen aus einem Medium mit in ein Medium ohne Arabinose. Bei der Konstruktion eines solchen Stammes muss die ΔaraE25-Mutation vor der ΔaraBAD1923-Mutation eingeführt werden. Dies liegt daran, dass Bak terien mit der ΔaraE25-Mutation noch in der Lage sind, Arabinose zu fermentieren, was eine Farbveränderung auf MacConkey-Agar-Platten bewirkt, dies aber langsam tun. Es ist aus diesem Grund wichtig, die MacConkey-Agar-Platten (mit 5% Saccharose, 1% Arabinose und DAP, falls erforderlich) erst nach 16-stündiger Inkubation bei 37°C zu untersuchen. Längere Inkubation verdeckt die Unterschiede zwischen Zellen, da das ΔaraE25-Allel irgendwann genug Arabinose metabolisiert, so dass ausreichend Säure produziert wird, um eine Farbreaktion zu ergeben, die von der Farbreaktion von Zellkolonien mit dem ΔaraE-Wildtypallel nicht unterscheidbar ist. Die Erkennung einer erfolgreichen Einführung des ΔaraBAD1923-Allels in den Stamm mit der ΔaraE25-Mutation ist direkt, da Kolonien, die nach 40-stündiger Inkubation bei 37°C untersucht werden, im Fall der ΔaraE25-Elternzellen einen Ara⁺-Phänotyp aufweisen, während die Doppelmutanten mit den Mutationen ΔaraE25 und ΔaraBAD1923 Arabinose nicht fermentieren können und den Phänotyp Ara aufweisen.
Weitere Modifikation der Stämme für eine noch stärkere Verzögerung der zeitlichen Abstimmung der RAV-Expression lässt sich durch Modifikation von Mutation 3 (2) in zwei Schritten erzielen. Zunächst wird das ΔaraBAD1923-Allel modifiziert, um die Sequenz zu entfernen, die mehrere N-terminale Aminosäuren des araB-Gens kodiert, und wird durch eine NcoI-Klonierungsstelle ersetzt, um die Insertion anderer Gene an dieser Stelle zu ermöglichen und um Mutation ΔaraBAD1924 zu erhalten. Diesbezüglich wird darauf hingewiesen, dass die Mutation ΔaraBAD1924 eine Deletion aller Teile des Arabinose-Operons außer dem araCP_BAD-Promotor darstellt. Das modifizierte Allel ΔaraBAD1924 (Mutation 4, 2) ist daher das Äquivalent eines nativen araCP_BAD in dem Chromosom, in das unter Verwendung der NcoI-Schnittstelle, welche ein ATG-Startcodan kodiert, verschiedene Fremdgene eingeführt werden können. Ein solches Derivat, Mutation 5 in 2, kodiert das P22c2-Repressorgen. in einem anderen Fall hat Mutation 6 in 2 sowohl das c2-Repressorgen als auch den lacI-Repressor, um Allel ΔaraBAD1926 zu ergeben. In diesen beiden Fällen sollten die Spiegel der C2- bzw. C2- und LacI-Repressorproteine die in Zellen, die nur eine einzelne Kopie des Repressorgens enthalten, wie in Mutation 1 und 2 (2), vorhandene Konzentration verdoppeln. Diese dualen Repressorgene bewirken eine weitere Verzögerung der Dauer der Dereprimierung des C2-reprimierbaren RNAII-Gens und des LacI-reprimierbaren P_trc-kontrollierten Gens für das Fremdantigen auf dem RAV.
Kandidatenimpfstoffstämme müssen Mutationen aufweisen, welche sie für den tierischen oder menschlichen Wirt avirulent machen, und trotzdem Immunogenität wahren. Mutationen, die wirksam S. typhimurium sowie andere Salmonella-Subtypen abschwächen, und Mutationen, die sie mit hoher Immunität erzeugen, umfassen Mutation im phoPQ-Operon (US-Patent Nr. 5,424,065; Miller et al., 1989), wie beispielsweise die Mutationen ΔphoP1918 und ΔphoP24 (Mutation 8 und 9 in 2). Ein Suicide-Vektor für die Allelsubstitution zum Einführen des ΔphoP1918-Allels ist in 8 als pMEG-550 gezeigt, und der Suicide-Vektor pMEG-368 für die Allelsubstitution zum Einführen des ΔphoP24-Mutation ist in 9 gezeigt. Der Erfolg des Einführens dieser phoP-Mutationen kann überprüft werden, indem hinsichtlich des phoN-Gens, das eine unspezifische saure Phosphatase kodiert, die in phP-Mutanten nicht synthetisiert wird, getestet wird (Kier et al., 1979) Dies wird erreicht, indem ein Weichagar-Überschichtungstest mit dem chromogenen Phosphatasesubstrat α-Naphthyl verwendet wird (Kier et al., 19991 J. Bacteriol. 138: 155–161). Ein definierter Nachweis des Vorhandenseins der mutanten Allele wird mittels PCR erreicht, um die Größe der Deletionen anzuzeigen, mittels DNA-Sondenhybridisierung, um das Fehlen von phoP-Sequenzen aufzuzeigen, und mittels Testen auf Phänotypen in Verbindung mit ΔphoP-Mutationen. Zu diesen Phänotypen gehören: die Unfähigkeit zur Synthetisierung unspezifischer saurer Phosphatase (Kier et al., 1979), Empfindlichkeit gegenüber Polymyxin B und Anfälligkeit gegenüber dem Getötetwerden von Makrophagen (Fields et al., 1989).
Konstruktion von RAVs zur Verwendung in RADS
Der RAV pMEG-771 (10) wird erhalten, indem das EagI-XhoI-Fragment von pMEG-546 (10), welches den lac-Promotor enthält, entfernt und durch P22P_R von pMEG-104 ersetzt wird. pMEG-546 wird mit EagI verdaut und mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um das Ende stumpf zu machen, und anschließend mit XhoI verdaut. Dadurch wird P_lac entfernt. pMEG-104 wird dann mit HindIII verdaut, dann mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um das Ende stumpf zu machen, und mit Sa/I verdaut. Dieses Fragment von pMEG-104 enthält den 5S T1 T2-Transkriptionsterminator und P22PR, welcher mit dem stumpfen Ende in den geschnittenen pMEG-546 ligiert wird, um pMEG-771 zu erhalten (10). pMEG-771 kann mit Wirtsstämmen verwendet werden, die Mutation 1 und 2 enthalten (2) plus weitere Mutationen, wie beispielsweise 3 oder 5 oder 6, wahlweise mit Mutationen wie in Beispiel 1 beschrieben, um eine arabinoseregulierte Runaway-Expression zu ergeben. Ein anderer RAV, pMEG-546, wie in 1 gezeigt, weist alle regulatorischen Signale auf, die von dem lacI-Genprodukt reprimiert werden können, das in der Deletions-/Insertionsmutation 2 ilvG3::TTaraCP_BADlacITT kodiert ist (2). In diesem Fall steht das pUC-RNAII-Transkript unter der Kontrolle des lac-Promotors (P_lac), der in Abwesenheit von LAcI transkriptional aktiv ist, was zu der pUC-Art der unregulierten Replikation führt. Darüber hinaus befindet sich die Stelle zum Einfügen von Fremdgenen in pMEG-546 neben und stromabwärts von P_trc, bei dem es sich um einen trp-lac-Hybridpromotor handelt, der bei der Transkriptionsinitiation sehr effizient ist und auch vom LacI-Repressorprotein reprimiert werden kann (Brossius, J. et al. (1984) Gene 27:161–172). pMEG-546 enthält wie pMEG-771 den pSC101-Replikationsursprung, und wenn daher der RAV-Wirtsstamm in Medium gezüchtet wird, in dem Arabinose vorhanden ist, gibt es nur fünf bis sechs Kopien von pMEG-546 je Chromosom-DNA-Äquivalent, und der Stamm wächst aufgrund dieser niedrigen Kopienzahl und der geringen Expression jedes Gens für ein Fremdantigen, das in die multiple Klonierungsstelle stromabwärts von P_trc kloniert wurde, sehr gut.
Eine andere Möglichkeit, den Zeitpunkt des Einsetzens der Expression der Runaway-Vektorreplikation nach Einführen des Impfstoffstammes in ein immunisiertes Tier zu verzögern, ist die Verstärkung der repressiven Fähigkeit von Repressoren. Diese verstärkte Reprimierung verzögert dann die Zeit, bevor die Transkription von P22P_R in pMEG-771 (1) beginnt, um das pUC-RNAII-Transkript herzustellen. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen, ist durch Einsetzen einer LacI-Repressorbindungsstelle (lacRB) als Teil von P22P_R, so dass sowohl der P22C2-Repressor als auch der LacI-Repressor die Transkription blockieren, die zur Synthese des pUC-RNAII-Transkriptes führt. Solch ein Konstrukt als Modifizierung von pMEG-771 ist in 11 gezeigt.
In 8 von WO96/40947 ist ein Runaway-Lyseeindämmungsvektor gezeigt, der die Attribute von pMEG-546 (10), aber auch die P22-Phagenlysegene lys-13 und lys-19 unter der Kontrolle von P22P_R aufweist, so dass durch Umstellen von Medium mit Arabinose auf Medium ohne Arabinose die Einstellung der P22c2-Genexpression zu einer Verringerung des C2-Repressors und der Transkription der Phagenlysegene auf dem RAV führt, um schließlich Lyse und Tod des Bakteriums zu bewirken. Bisherige Beobachtungen hinsichtlich der Expression von Plasmiden mit hoher Kopienzahl mit Phagenlysegenen, sogar unter stringenter Reprimierung, haben gezeigt, dass durch Transkription ein gewisses Maß an Austreten stattfindet, was zum Tod einiger Zellen in der Population durch Lyse führt. Wir haben daher auf eine Lyse mit verzögertem Einsetzen durch Einstellen der Synthese des essenziellen Gens asd zurückgegriffen, das für die Synthese von DAP benötigt wird, einem essenziellen Bestandteil der steifen Schicht der Bakterienzellwand. Dies wurde erreicht, indem eine TTaraCP_BADc2GTG-asd-Sequenz geschaffen wurde, in der das Startcodon für das asd-Gen von ATG auf GTG verändert wurden, um die Effizienz der Translation der asd-mRNA und damit die Menge an synthetisiertem Asd-Enzym zu verringern. Diese modifizierte Version von pMEG-771 ist in 12 gezeigt. Insbesondere wurde das 2,5-kb-BglII-NdeI-TTaraCP_BADc2GTG-asd-DNA-Fragment von pYA3531 (21) in pMEG-771 (1) subkloniert, der mit BglII an Position 1 und NdeI an Position 827 partiell verdaut worden war. Anschließend wird an der BglII-Schnittstelle vor dem P_trc-Promotor ein synthetisierter Transkriptionsterminator eingefügt, um das in 12 gezeigte Plasmid zu erhalten. Wir haben dasselbe Konstrukt ohne das c2-Gen, aber das Vorhandensein des c2-Gens in der Nähe des P22P_R auf dem RAV verstärkt die Effizienz der Reprimierung der bei P_R initiierten Transkription. In diesem Zusammenhang wird daran erinnert, dass das Repressorgen und die Promotoren, an welche der Repressor bindet, bei Bakteriophagen wie λ und P22 nebeneinander liegen, was die Effizienz der Reprimierung erhöht. Dies ist unzweifelhaft auf die Tatsache zurückzuführen, dass Proteine auf Polyribosomen synthetisiert werden, in denen die mRNA noch immer in der Nähe des Wirkortes der Repressorgenpropdukte an der DNA-Vorlage haftet. Nun wird die Synthese der asd-mRNA eingestellt, wenn die Arabinose verbraucht ist und die Transkription vom araCP_BAD-Promotor auf dem RAV aus eingestellt wird, und infolge der Ineffizienz seiner Translation aufgrund des GUG-Startcodons (kodiert als GTG in der DNA-Sequenz) wird das Asd-Enzym limitierend, und die Zellen beginnen nach einigen Generationen, einen DAP-losen Tod zu sterben. Das Ausmaß, in dem dies erreicht wird, wenn die Plasmidkopienzahl vom pSC101-Niveau auf das unregulierte Niveau im Überschuss von mehreren hundert Kopien von Plasmid-DNA je Chromosom-DNA-Äquivalent nach Induktion der RAV-Expression umstellt, ist noch zu untersuchen. Eine weitere Modifikation, um die Effizienz der Translation der mRNA des asd-Gens noch mehr zu verringern, ist die Veränderung der Shine-Dalgarno-Sequenz von AGGA auf AAGA oder AGAA.
Beispiel 3
Konstruktion und Evaluierung von RADS zur Vorbeugung gegen eine Infektion und Erkrankung durch Erysipelothrix rhusiopathiae
Erysipelothrix rhusiopathiae ist ein grampositives Pathogen von Schweinen und Truthähnen, das die Krankheit Erysipelas verursacht und im Alter Arthritis verursachen kann (Wood, R. L. (1984) J. Am. Vet. Med. Assoc. 184: 944–949). Frühere Arbeiten haben ein 65-kDa-Oberflächenantigen mit der Bezeichnung Ery65 bzw. SpaA.1 identifiziert (Shi moji, Y. et al. 1999 Infect. Immun. 67: 1646–1651), das mit Adjuvans in Tiere injiziert werden kann, um schützende Immunität vor E. rhusiopathiae zu verleihen. Es gibt auch einen monoklonalen Antikörper (Mab) gegen das Ery65-Protein, welcher Tieren, denen der Mab infundiert wird, passiven Schutz vor lebensfähigen E. rhusiopathiae bietet (Henderson, L. et al. 1997. US-Patent Nr 5,625,038).
Die Expression des ery65-Gens in voller Länge in E. coli und S. typhimurium ist tendenziell relativ toxisch, möglicherweise wegen der Signalsequenz, die in gramnegativen Bakterien nicht so gut funktioniert wie bei grampositiven Bakterien als natürlichem Wirt, wahrscheinlich aber eher wegen der stark hydrophoben C-terminalen Domäne, die dazu neigt, eine Affinität für die Zytoplasmamembran in E. coli und Salmonella aufzuweisen, wodurch der Elektronentransport und die gute metabolische Gesundheit beeinträchtigt werden. Eine Lösung für dieses Problem besteht darin, das Ery65-Antigen auf einem RAV zu exprimieren, so dass die Expression verzögert wird, bis der Impfstoffstamm in einer Umgebung ohne Arabinose fortdauert, bis die Arabinose verbraucht ist, was zur Verringerung von Repressoren führt, um die Runaway-Replikation vom pUC-Replikationsursprung und eine starke Expression des klonierten Geninserts zu ermöglichen. pMEG-525 (13) ist ein RAV, der die Ery65-Kodierungsregion enthält, wie in 14 gezeigt ist, einschließlich derjenigen für die Signalsequenz, kloniert als ein 2,5-bp-BstEII-HindIII-Fragment aus pMEG-446 (einem pYA3332-Vektor, der das 1881-bp-NcoI-HindIII-PCR-Fragment enthält, welches erg54 von E. rhusiopathiae E1-E6 kodiert) in den mit BstEII-HindIII verdauten Runaway-Vektor pMEG-283. Wenn pMEG-525 in S. typhimurium oder S. choleraesuis platziert wird, findet nach Überführen von einem Medium mit Arabinose in ein Medium ohne Arabinose ein zeitabhängiger Anstieg der Plasmidkopienzahl als Funktion der Zeit statt. Es ist außerdem klar, dass bei jedem nur Vektor enthaltenden Kontroll-RAV pMEG-283 in S. typhimurium MGN-966 oder pMEG-546 in S. choleraesuis MGN.2267 im Vergleich zum RAV pMEG-525, welcher das Ery65-Antigen (14) in MGN-996 oder MGN-2267 kodiert, eine wesentlich erhöhte Menge an Plasmid-DNA vorhanden ist. Die Toxizität von Ery65 wird daher auch wäh rend der Induktion noch in gewissem Maß beobachtet. Dennoch gibt es sehr erhebliche Steigerungen in der Synthese des Ery65-Proteins in S. typhimurium und S. choleraesuis als Funktion der Zeit, wenn die Kulturen aus Medium mit Arabinose in Medium ohne Arabinose überführt werden (15). Wie 16 zeigt, wächst der S. typhimurium-Stamm MGN-966 (pMEG-525) mit dem RAV, welcher das Ery65-Antigen spezifiziert, gleich gut wie der isogene Stamm MGN-966 (pMEG-283), der den Kontroll-RAV enthält, welcher kein Fremdantigen kodiert, vorausgesetzt, dass Arabinose vorhanden ist. Nachdem jedoch unbelüftete Kulturen, die 12–16 Stunden in Luria-Bertani-Nährbrühe mit 0,2% Arabinose gewachsen waren, 1 zu 1.000 in Luria-Bertani-Nährbrühe ohne Arabinose verdünnt wurden, reduziert die Expression des Ery65-Antigens die Wachstumsrate deutlich, schließlich gefolgt von Tod und Unfähigkeit, lebensfähige Bakterien hervorzubringen (16).
Die oben beschriebenen Stämme wurden in Luria-Bertani-Nährbrühe mit 0,2% Arabinose bis zu einer OD₆₀₀ von 1,0 gezüchtet und intranasal an mit Rompun und Ketaset sedierte BALB/c-Mäuse mit einem Gewicht von ~20 g verabreicht. Mäuse, die an Tag 0 und 31 mit ~10⁵ CFU des S. typhimurium-Impfstoffstammes MGN-966 (pMEG-525) immunisiert wurden, zeigen, wie durch Western Blot mit Seren von immunisierten Mäusen festgestellt wurde, nach einer einzelnen Immunisierung an Tag 28 starke Immunreaktionen gegen ein Protein mit einer Größe von etwa 65 kD in einem Extrakt des SE-9-Stammes von E. rhusiopathiae (17). Diese Antikörperantwort ist nach der Booster-Immunisierung an Tag 31 noch erheblicher, wie sich an Tag 48 nach der Immunisierung zeigte (17). Subkutane Verabreichung einer letalen Dosis von 118 CFU des E. rhusiopathiae-Stammes E1-6P an diese immunisierten Mäuse ergab einen Schutz von 100% relativ zu den Kontrollmäusen, die nur Vektor erhielten, wie in Tabelle 3 gezeigt ist. Dies stand im Gegensatz zu vorherigen Studien, die unter Verwendung des gesamten Ery65-Antigens in anderen Expressionsvektoren in Salmonella durchgeführt wurden, in welchen weder eine nachweisbare Immunreaktion auf Ery65 noch ein Schutz gegen eine letale Gabe von E. rhusiopathiae erreicht wurden.
TABELLE 3 Überleben von BALB/c-Mäusen, die mit dem RAV S. typhimurium immunisiert wurden, welcher das gesamte Ery65 exprimiert, nach subkutaner Verabreichung (Challenge) von E. rhusiopathiae E1-6P

¹Genotyp: ΔphoP22ΔasdA19(P_BADc2)ΔilvG3(P_BADlacI)
²Nach Gabe von 118 CFU von E1-6P an Tag 52

Beispiel 4
Konstruktion von RADS zur Vorbeugung gegen eine Infektion und Erkrankung durch Streptococcus equi.
Streptococcus equi verursacht eine sehr ernste Erkrankung von Rennpferden und anderen Pferden, die als Druse bezeichnet wird (Nara, P. et al. (1983) Am. J. Vek. Res. 44: 529–534). Noch schlimmer ist die Immunkomplexerkrankung Purpura hemorrhagica, eine Folge einer Infektion mit S. equi zu einem früheren Zeitpunkt im Leben (Galan. J. and J. Timoney (1985) J. Immunology 135: 3134–3137). Wie Streptokokken der Gruppe A produziert S. equi. ein M-Protein auf der Oberfläche, das antiphagozytär und daher eine wichtige Virulenzdeterminante ist, welche den Erfolg der Infektion mit S. equi verstärkt. Antikörper gegen das M-Protein von S. equi (SeM) sind opsonisch und erleichtern die erfolgreiche Phagozytose und Abtötung von S. equi (Galan, J. and J. Timoney (1985) Infect. Immum. 47: 623–628). Eine Antikörperantwort gegen SeM ist daher wahrscheinlich hoch protektiv zur Vorbeugung einer Infektion von Pferden mit S. equi. Der RAV pMEG-573, welcher das SeM-Protein von S. equi kodiert, ist in 18 dargestellt. Dieser RAV wurde erhalten, indem das PCR-Fragment, das von den Primern SeM444-474 GCGAACTCTGAGGTTAGTCGTACGGCGACTC und SeM1265-1233 TTGATCAATTTCTGCTAATTTTTGAGCCATTTC flankiert wird, welche den zentralen Anteil der SeM-Kodierungsregion des SeM-Klons pSEM06 enthalten, in die NcoI-und BamHI-Schnittstellen von pMEG-546 kloniert wurde. pMEG-573 ist nur von dem Vorhandensein der Deletions-/Insertionsmutation ΔilvG3::TTaraCP_BADlacITT (2) im Chromosom abhängig, um den Runaway-Phänotyp und die SeM-Expression zu unterdrücken. Die Impfstoffstämme für SeM enthalten außerdem entweder die abschwächende Deletionsmutation ΔphoP1918 oder ΔphoP24 (Mutation 8 und 9, 2). Ein Vergleich des Maßes der SeM-Expression von verschiedenen abgeschwächten Salmonella-Impfstoffstämmen, in denen die SeM-Expression auf dem Plasmidvektor unter der Transkriptionskontrolle von P22P_R, P_trc oder λ P_L auf pBR-basierten Plasmiden oder unter der Kontrolle von P_trc auf dem RAV pMEG-573 stand, ist in 19 gezeigt. Stämme für diesen Vergleich wurden nach einer Verdünnung 1:1000 von unbelüfteten Kulturen in Luria-Bertani-Nährbrühe mit 0,2% Arabinose 6 Stunden lang in Luria-Bertani-Nährbrühe mit oder ohne 0,2% Arabinose gezüchtet. Anschließend wurde ein Milliliter Zellen pelletiert, und die Gesamtproteine wurden zur Analyse durch Färbung mit Coomassie-Blau oder Transfer auf Nitrozellulose für Western-Blot-Analyse mit SeM-spezifischen Antikörpern, wie gezeigt in 19, durch SDS-PAGE aufgetrennt. Aus diesen Experimenten ist einfach erkennbar, dass die Menge des SeM-Proteins in dem Bakterienstamm MGN-4598 (pMEG-573) mit dem RAV pMEG-573 erheblich größer ist als in einem der anderen Vektorwirtstämmen. In Anbetracht dessen, dass alle Plasmide in diesen Stämmen dieselbe in pMEG-573 vorkommende SeM-Kodierungsregion enthalten und dass das erhaltene Maß der Expression von SeM auf dem Coomassie-Gel mit keinem der anderen in MGN-4598 (pMEG-825) P22P_R, MGN-4598 (pMEG-826) P_trc oder -2238 (pMEG-575) λ P_L (alle auf pBR-basierten Plasmiden) getesteten starken Promotoren nachweisbar ist, wurden bei Tieren immer nur die RAV-Konstrukte untersucht.
Die immunogenen Eigenschaften des RAV SeM-Impfstoffstammes wurden zu Anfang in BALB/c-Mäusen untersucht, die ~10⁷ CFU jedes Stammes intranasal an Tag 0 und Tag 28 ohne Anästhesie erhielten. Aus den Lungen und Peyer-Plaques der immunisierten Mäuse wurden 72 Stunden nach der Immunisierung nur niedrige Konzentrationen (< 1.000 CFU) der Impfstoffstämme zurück gewonnen, und auch nach Tag 3 wurden die Impfstoffstämme nur selten im Kot der immunisierten Mäuse festgestellt. Die festgestellte serologische SeM-spezifische IgG-Antikörperantwort zeigt, dass alle Stämme starke Antikörperimmunreaktionen gegen das SeM-Antigen induzierten, wie in Tabelle 4 aufgeführt ist.
TABELLE 4 Durchschnittliche IgG-Immunreaktionen gegen SeM im Serum, induziert durch RAV-Impfstoffstämme bei Mäusen ELISA-Messungen bei einer Serumverdünnung von 1:1000
Auf Basis dieser Informationen wurden Pferdestudien durchgeführt, wobei dieselben Stämme an die Pferde verabreicht wurden, um die serologische Immunreaktion gegen das SeM-Antigen in dem Zieltier zu untersuchen. Die Pferde wurden an Tag 0 und 14 mit ~10⁸ CFU jedes angegebenen Stammes immunisiert. Anschließend wurden Seren und Nasenspülflüssigkeiten gewonnen und wie in Tabelle 5 und Tabelle 6 angegeben auf SeM-spezifische Antikörper untersucht. Die Daten ergaben bei vielen untersuchten Pferden höhere Hintergründe für das SeM-Antigen als bei den Mäusen, dennoch ist bei dreien der mit dem MGN-4598 (pMEG-573) Ara⁺-Tranduktanten im munisierten Pferde und bei 1 Pferd, das mit MGN-4598 (pMEG-573) immunisiert wurde, eine klare IgG-Serumreaktion vorhanden. IgA-Reaktionen gegen SeM in Nasenspülflüssigkeiten (Tabelle 6) sind insofern ähnlich, als es bei den Pferden vor der Immunisierung einen hohen SeM-Hintergrund, wohingegen zwei der mit dem MGN-4598 (pMEG-573) Ara⁺-Tranduktanten immunisierten Pferde und bei drei Pferden, die mit MGN-4598 (pMEG-573) immunisiert wurden, IgA-Reaktionen gegen SeM aufzuweisen scheinen. Sowohl die Mausstudien als auch die Pferdestudien unterstützen die Verwendung von RAV-basierten SeM-Impfstoffen für die intranasale Immunisierung mit oder ohne Modifikation der Stämme zum Ausschalten der Fähigkeit zur Verwertung von Arabinose.
TABELLE 5 Durchschnittliche IgG-Immunreaktionen gegen SeM im Serum, induziert durch RAV-SeM-Impfstoffstämme bei Pferden ELISA-Messungen bei einer Serumverdünnung von 1:10.000
TABELLE 6 Durchschnittliche IgA-Immunreaktionen gegen SeM in Nasenspülflüssigkeit, induziert durch RAV-SeM-Impfstoffstämme bei Pferden ELISA-Messungen bei einer Verdünnung der Nasenspülflüssigkeit von 1:10
Beispiel 5
Konstruktion von RAVs zur Verwendung in RADS.
In WO 96/40947 enthalten die beschriebenen RAVs solche Eindämmungsmerkmale, dass die Vektoren Phagenlysegene stellvertretend für letale Gene exprimierten oder keine essenziellen Gene, wie beispielsweise das asd-Gen, exprimierten. Wir haben beobachtet, dass das asd-Gen, das in Vektoren mit hoher Kopienzahl (pBR und pUC) vorhanden ist, selbst in Abwesenheit einer -35 oder -10 gelegenen Promotorsequenz häufig ausreichend transkribiert wird, dass ausreichend Asd-Protein hergestellt werden kann, um das Leben eines Stammes mit einer Δasd-Chromosomenmutation zu erhalten. Ein Plasmidvektor wie beispielsweise pYA3530 mit einer araCP_BADasd-Konstruktion und einem pBR-ori kann daher auf Medium ohne DAP und Arabinose wachsen, da das asd-Gen häufig genug transkribiert wird, damit die Zelle genug Asd-Protein herstellen kann, um das Wachstum in Abwesenheit von DAP aufrechtzuerhalten. Die meisten (91%) Strukturgene verwenden das ATG-Codon für Methionin als erstes Codon. Seltener (8%) verwenden sie allerdings GTG als Startcodon und noch seltener (1%) das TTG-Startcodon des asd-Gens in pYA3450 von ATG bis GTG, um pYA3530 zu erhalten (20). Wenn pYA3450 mit der araCP_BADGTG-asd-Sequenz in einen Δasd-Stamm wie MGN-023 eingeführt wird (Tabelle 1), besteht ein zwingender Bedarf für das Vorhandensein von Arabinose, wenn DAP fehlt. In einer anderen Version von pYA3450 haben wir das P22c2-Gen zwischen P_BAD und dem asd-Gen eingesetzt, um die asd-Genexpression moderat zu reduzieren und damit die Expression des C2-Repressors von einer Plasmidsequenz in der Nähe der Stelle seiner Reprimierungswirkung auf P22P_R stattfindet (siehe Beispiel 2). Dieser Vektor wurde pYA3488 genannt, der anschließend einer positionsgerichteten Mutagenese unterzogen wurde, um das asd-Startcodon von ATG auf GTG zu ändern. Dies ergab pYA3531, der in 21 dargestellt ist. Entweder die araCP_BADGTG-asd-Sequenz von pYA3531 oder die araCP_BADc2GTG-asd-Sequenz aus pYA3531 können anstelle des asd-Gens in pMEG-771 subkloniert werden (1), um ein Plasmid wie gezeigt in 12 mit der araCP_BADc2GTG-asd-Sequenz zu ergeben. Insbesondere wird das 700-bp-BglII-Fragment mit der P_trc MCS 5ST1T2-Kassette des in 12 dargestellten Plasmids durch ein PCR-amplifiziertes 920-bp-BSG-pA-DNA-Fragment von pVAX1 (Invitrogen) ersetzt, um das in 22 dargestellte Plasmid zu ergeben. Stämme mit diesem Konstrukt sollten, nachdem sie in ein immunisiertes Tier oder einen immunisierten Menschen gelangen, bei dem keine Arabinose vorhanden ist, geschwächte Zellwände annehmen, da die Runaway-Vektor-Replikationsexpression und die Überproduktion eines Fremdantigens unter der Kontrolle von P_trc unterstützt werden. Daraus sollte sich aufgrund des Einbaus des C2-Repressorgens in den RAV-Vektor und aufgrund des Einbaus von Mutationen 1 und 2, 3,5 oder 6 und 7 und entweder 8 oder 9 (2) in das Wirtschromosom ein RADS-Impfstoffstamm mit ausreichender Verzögerung der RAV-Expression ergeben, so dass der Impfstoffstamm in Abwesenheit von Arabinose genügend Zeit und Gelegenheit zum Wachstum hat, um an lymphoide Organe zu binden, in diese einzudringen und sie zu besiedeln, unabhängig davon, ob er intranasal oder oral an Tiere oder Menschen verabreicht wird.
Beispiel 6
Zirkuläre Plasmid-DNA, so genannte Transfer-Plasmide, die Antigene verschiedener Pathogene kodieren, können in tierische Wirte eingeführt werden, um die Induktion von Immunität gegen das Pathogen zu stimulieren, aus dem das Antigen-Gen stammt (Ullmer et al., ASM News 62: 476–479, 1996; Ullmer et al., Curr. Opin. Immunol. 8: 531–536, 1996; Whalen, Emerg. Infect. Dis. 2: 168–175, 1996; Robinson, Vaccine 15: 785–787, 1997). DNA-Impfstoffe nutzten Expressionssysteme so, dass die genetische Information, die das Antigen eines Pathogens spezifiziert, von dem immunisierten Wirt unter Verwendung der Maschinerie des Wirts für Transkription und Translation exprimiert wird. Dies könnte für die Expression viraler, fungaler und parasitärer Antigene besonders wichtig sein, die häufig glykosyliert sind, aber nur, wenn sie in einem eukaryotischen Wirt synthetisiert werden, und nie, wenn sie in einem prokaryotischen Wirt exprimiert werden, wie beispielsweise in einem abgeschwächten Bakterienwirt zur Antigen-Zufuhr. Anfangs wurden DNA-Impfstoffe durch Injektion in Muskelgewebe verabreicht, aber es wurden auch andere Injektionsstellen verwendet. In letzter Zeit wurden DNA-Impfstoffe unter Verwendung von Teilchenpistolen verabreicht, um den Eintritt von DNA-beschichteten Goldkügelchen in die Haut oder Schleimhautgewebe zu beschleunigen. Die DNA-Impfstoffvektoren werden in rekombinanten E.coli-Stämmen, die in Fermentern gezüchtet werden, propagiert und daraus isoliert.
Sizemore et al. (Science, 270: 299–302, 1995; Vaccine 15: 804–807, 1997) beschrieben die Verwendung des Shigella flexneri 2a-Stammes 15D mit einer Δasd-Mutation, die einen DNA-Impfstoffvektor enthielt, der so verändert wurde, dass er die β-Galaktosidase von E. coli exprimiert. Der Shigella-Stamm war aufgrund der Δasd-Mutation abgeschwächt, die bei Invasion von eukaryotischen Zellen Tod infolge des Fehlens von Diaminapimelinsäure verursacht. Der Stamm war in der Lage, nach Bindung an und Invasion in eukaryotische Zellen und Lyse im Zytoplasma von eukaryotischen Zellen in Kultur oder in immunisierten Mäusen den DNA-Impfstoffvektor intrazellulär zu verabreichen. Darüber hinaus haben Andere S. typhimurium-Stämme verwendet, die einen DNA-Impfstoffvektor besitzen, und spontan oder durch vom tierischen Wirt abhängige Mittel eine Lyse verursacht (Powell et al., WO 96/34631, 1996; Pascal et al., Behring. Inst. Mitt. 98: 143–152, 1997; Darji et al., Cell 91: 765–775, 1997). In Fällen, bei denen eine spontane Lyse auftrat, war es erforderlich, dass der Bakterienstamm eine oder mehrere Deletionsmutationen besitzt, welche den Stamm abgeschwächt machen. Shigella, Salmonella und invasive E. coli können bekanntlich viel besser an M-Zellen, welche das GALT überlagern, binden und in sie eindringen, als an Darmepithelzellen (Enterozyten) zu binden und in sie einzudringen. Die Zufuhr von Fremdantigenen oder die Produktion von Fremdantigenen in den NALT, BALT, CALT und GALT, die alle eine Schicht von M-Zellen aufweisen, führt zur Induktion von mukosalen Immunreaktionen sowie zu systemischer Immunität. Da mukosale Immunreaktionen gegen sehr viele Erreger von Infektionskrankheiten schützen, die eine Schleimhautoberfläche besiedeln oder durch eine Schleimhautoberfläche eindringen, wäre zu erwarten, dass DNA-Impfstoffvektoren deshalb von Salmonella, Shigella und Escherichia oder Hybriden aus zwei beliebigen dieser Gattungen zugeführt werden könnten. Diese Mikroben hätten eine überlegene Fähigkeit, an M-Zellen, welche die lymphoiden Gewebe der NALT, CALT, BALT und GALT überlagern, zu binden und in sie einzudringen, wo sie Zugang zu Antigen präsentierenden Zellen wie beispielsweise Makrophagen und dendritischen Zellen hätten. Da Immunreaktionen mehr oder weniger zur Dosis des Antigens proportional sind, dem das immunisierte Individuum ausgesetzt wird, wäre zu erwarten, dass Mittel zum Zuführen von DNA-Impfstoffvektoren, welche die Anzahl an Kopien der Kodierungssequenz für das Fremdantigen, das in einer eukaryotischen Zelle exprimiert werden soll, erhöhen, für das Maximieren der induzierten Immunreaktion geeignet wären. Tatsächlich exprimieren nur etwa 2% der eukaryotischen Zellen, die einen DNA-Impfstoffvektor erhalten, das Genprodukt, das von dem in den DNA-Impfstoffvektor eingesetzten Fremdgen kodiert wird, funktional. Die Verwendung eines abgeschwächten RADS, das einen Runaway-Vektor zuführen würde, der so modifiziert ist, dass die Expression eines eingesetzten Fremdgens nur in eukaryotischen Zellen und nicht in prokaryotischen Zellen stattfindet, würde daher die Wirksamkeit einer Immunisierung mit einem DNA-Impfstoffvektor signifikant verbessern.
In der Vergangenheit haben wir DNA-Impfstoffvektoren eingesetzt, die von pCMV β und von pVAX-1 stammten und die kommerziell erhältlich sind, und haben das Wirkstoffresistenzgen durch das asd-Gen von S. typhimurium ersetzt, um die Einwände im Hinblick auf das Einführen von Antibiotikaresistenzgenen als Teil von Impfstoffen in immunisierte tierische und menschliche Wirte zu zerstreuen. Im vorliegenden Fall wird es jedoch wichtig, das RADS mit RAV zu konzipieren, so dass das System bei einer Runaway-Amplifizierung des Plasmidvektors in den eukaryotischen Zellen in dem immunisierten tierischen Wirt lysiert. Der in 12 dargestellte und in Beispiel 5 beschriebene Plasmidvektor, der eine araCP_BADP22c2SDGTG-asd-Kassette enthält, dient daher als Plasmidausgangskanstrukt. Die Erhaltung dieses RAV in Bakterienzellen, die eine Mutation 1 besitzen (2), bei der es sich um die Mutation/Insertion ΔasdA19::araCP_BADc2 handelt, hängt von Wachstum in Gegenwart von Arabinose ab. In Abwesenheit von Arabinose beginnt die Runaway-Replikation, aber auch die Einstellung der Synthese des Asd-Enzyms, was zu einer geschwächten Zellwand aufgrund der Unfähigkeit zur Synthese von DAP führt. Außerdem wird der DAP-Pool durch Umwandlung von DAP zu Lysin, das für die Proteinsynthese benötigt wird, rasch aufgebraucht. Es muss darauf hingewiesen werden, dass die Anzahl an Asd-Enzymmolekülen, die in der Bakterienzelle mit dem in 12 gezeigten Plasmid produziert wird, knapp ausreicht, um die Lebensfähigkeit in Abwesenheit von zugegebenem DAP aufrecht zu erhalten. Der Grund dafür ist die niedrige Translationseffizienz der asd-Kodierungssequenz aufgrund des GTG-Startcodons. Zur Konstruktion eines Transfervektors, der für die Verwendung als Transfer-RAV geeignet ist, wird die P_trc MCS 5S T1T2-Transkriptionsterminator-Kassette entfernt und durch die pCMV-MCS-Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungsspezifikation aus dem kommerziell erhältlichen DNA-Impfstoffvektor pVAX-1 ersetzt. Der resultierende Transfervektor, der von dem modifizierten pMEG-771 abstammt, ist in 22 gezeigt. Dieser Transfer-RAV kann in verschiedene abgeschwächte Bakterienstämme eingeführt werden, um ein RADS zu erzeugen. Der bakterielle Wirtsstamm würde Mutation 1 und 2 besitzen (2) sowie, je nach dem gewünschten Maß an Verzögerung der phänotypischen Expression der Runaway-Replikation, Mutation 3, 5 oder 6 und 7 (2). Um den bakteriellen Wirtsstamm abzuschwächen, könnten ab schwächende Mutationen wie beispielsweise Mutation 8 oder 9 eingebaut werden (2), obgleich man jede einer Vielzahl verschiedener abschwächender Mutationen verwenden könnte. Wenn Bakterien lysieren, um Transfervektoren freizusetzen, wie beispielsweise den Transfer-RAV, der in 22 dargestellt ist, kommt die Endonuklease I ins Spiel, die im periplasmatischen Raum vorhanden ist, und dieses Enzym kann zirkuläre Plasmid-DNA in lineare Fragmente spalten, die dann einem exonukleolytischen Verdau unterzogen werden. Wir haben daher das endA-Gen, welches Endonuklease I von S. typhimurium SL1344 Stamm χ3339 kodiert, kloniert, eine definierte interne Deletion erzeugt und einen Suicide-Vektor konstruiert, der als pMEG-776 bezeichnet wurde und in 23 gezeigt ist. Dieser Suicide-Vektor weist alle Merkmale von pMEG-375 (3) auf, von dem pMEG-771 abstammt, und ermöglicht einem Fachmann die Anwendung von oben beschriebenen Verfahren, um die ΔendA-Mutation durch Allelsubstitution in das Chromosom bakterieller Wirtsstämme einzuführen, die für die Zufuhr von Transfer-RADs verwendet werden sollen.
Der Transfer-RAV in 22 wäre modifiziert, um eine Sequenz, die ein Fremdantigen kodiert, unter Verwendung der multiplen Klonierungsstelle nach dem P_CMV-Promotor einzufügen. Die Gene für diese Fremdantigene würden vorzugsweise von viralen, fungalen und parasitären Pathogenen abstammen, deren Expression in einem eukaryotischen Wirt von der posttranslationalen Modifizierungsmaschinerie des eukaryotischen Wirts profitieren würde. Dies ist besonders wichtig im Hinblick auf protektive Antigene, die einen solcher posttranslationalen Modifizierung unterzogen werden würden, beispielsweise durch Glykosylierung.
Der Fremdantigen kodierende Transfervektor der in 22 gezeigten Art könnte auch von einem nicht abgeschwächten bakteriellen Wirt produziert werden, beispielsweise von einem E. coli-Stamm, der nur Mutation 1 und 2 besitzt (2), aber auch mit der endA3-Mutation, um das Vorhandensein von Endonuklease I im periplasmatischen Raum zu beseitigen. Dieses Konstrukt wurde in einem Fermenter in Gegenwart von Arabinose gezüchtet werden, und nach Entfernen und/oder vollständigem Verbrauchen der Arabinose würde eine Runaway-Replikation stattfinden, um sehr hohe Mengen an Plasmid-DNA herzustellen, welche gewonnen und als DNA-Impfstoff verwendet werden könnte, um sie durch Injektion, Teilchenpistole, etc. zu verabreichen. Ein wichtiges Merkmal ist die Abwesenheit von Antibiotikaresistenzgenen, was damit die Möglichkeit einer Kontaminierung des DNA-Impfstoffes durch Antibiotika, die während der Propagierung der Bakterien in einem Fermenter verwendet werden, ausschließt.
Ein weiterer wichtiger Vorteil des Typs des DNA-Impfstoffvektors, der in 22 dargestellt ist, ist das Vorhandensein einmaliger CpG-Sequenzen, die Immunreaktionen verstärken können (Krieg, J. Lab. Clin. Med. 128: 128–133, 1996). Viele Forschungslabors haben festgestellt, dass bestimmte CpG-Sequenzen besonders für die Stimulierung von B-Zell-Reaktionen wichtig sind, die zu hoher Antikörperproduktion führen. Diesbezüglich fehlen dem Antibiotikaresistenzgen für Kanamycin, das in vielen DNA-Impfstoffvektoren vorhanden ist, alle diese bevorzugten CpG-Sequenzen. Andererseits besitzt das asd-Gen von S. typhimurium, das in den hierin beschriebenen Vektoren enthalten ist, zwei natürliche CpG-Sequenzen, welche die Immunogenität des DNA-Impfstoffvektors erheblich verstärken. Darüber hinaus enthält das P22c2-Gen zwei zusätzliche natürliche CpG-Sequenzen, die ebenfalls die Immunogenität des DNA-Impfstoffvektors erheblich verstärken. Der in 22 gezeigte RAV weist daher zahlreiche Merkmale auf, um die Immunogenität von Fremdgenen, die in den Vektor kloniert worden sind und in eukaryotischen Zellen in dem immunisierten tierischen Wirt exprimiert werden, zu verstärken. Die Verwendung des asd-Gens von S. typhimurium in solchen DNA-Impfstoffvektoren ist in US-Patent Nr. 5,840,483 beschrieben.

Claims

Mikroorganismus, umfassend ein reguliertes Antigen-Zufuhrsystem (RADS), worin das RADS Folgendes umfasst: ein Gen, das auf dem Chromosom des Mikroorganismus angeordnet ist, worin das Gen für einen ersten Repressor, der operabel an eine erste aktivierbare Kontrollsequenz gebunden ist, und gegebenenfalls einen zweiten, Chromosom-kodierten Repressor, der operabel an eine zweite aktivierbare Kontrollsequenz gebunden ist, kodiert; und einen Runaway-Vektor, der (1) einen ersten Replikationsursprung (ori), der unter Verwendung von DNA-Polymerase III Vektorreplikation verleiht; (2) einen zweiten ori, der unter Verwendung von DNA-Polymerase I Vektorreplikation verleiht, worin dieser zweite ori operabel an eine erste reprimierbare Kontrollsequenz gebunden ist, die durch den ersten Repressor reprimierbar ist; und (3) ein Gen, das für ein gewünschtes Genprodukt kodiert, das operabel an eine zweite reprimierbare Kontrollsequenz gebunden ist; umfasst, worin die zweite reprimierbare Kontrollsequenz durch den ersten Repressor oder durch den zweiten Repressor reprimierbar ist und worin der Runaway-Vektor kein Phagenlyse-Gen umfasst.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, worin die erste reprimierbare Kontrollsequenz und die zweite reprimierbare Kontrollsequenz dieselbe Sequenz sind.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, worin die erste reprimierbare Kontrollsequenz und die zweite reprimierbare Kontrollsequenz unterschiedliche Sequenzen sind.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, worin der Repressor aus der aus LacI-Repressor und C2-Repressor bestehenden Gruppe ausgewählt ist und worin die zweite reprimierbare Kontrollsequenz durch einen zweiten Repressor reprimierbar ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 1, worin (a) der Vektor ein Plasmid ist; (b) das gewünschte Genprodukt ein Antigen ist und (c) der Mikroorganismus ein abgeschwächtes Derivat eines pathogenen Bakteriums ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, worin der Mikroorganismus eine Salmonella sp. ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, worin die erste aktivierbare Kontrollsequenz araC-P_BAD ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, weiters umfassend ein System ausbalancierter, letaler Wirtsvektoren, dem ein funktionierendes essentielles Gen auf dem Chromosom und eine rekombinante funktionierende Kopie des essentiellen Gens auf dem Vektor fehlt.
Mikroorganismus nach Anspruch 8, worin das essentielle Gen asd-Gen ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 9, worin das asd-Gen durch die Insertion eines Repressorgens, das operabel an araC-P_BAD gebunden ist, deaktiviert wird.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, weiters umfassend eine inaktivierende Mutation in einem nativen Gen, ausgewählt aus der aus cya, crp, phoPQ, ompR, galE, cdt, hemA, aroA, aroC, aroD und htrA bestehenden Gruppe.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, worin der erste ori pSC-ori und der zweite ori ein pUC-ori ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, worin die erste reprimierbare Kontrollsequenz P22P_R und der erste Repressor C2-Repressor ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, worin die zweite reprimierbare Kontrollsequenz P_trc ist, die zweite reprimierbare Kontrollsequenz durch einen zweiten Repressor reprimierbar ist und der zweite Repressor ein LacI-Repressor ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 14, worin die erste reprimierbare Kontrollsequenz P22P_R ist; der erste Repressor C2-Repressor ist; der erste ori ein pSC-ori ist und der zweite ori ein pUC-ori ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 15, worin der Vektor ein pMEG-771 – oder eine Modifikation davon – mit einem für ein Antigen kodierenden Gen ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, worin das Antigen aus der aus Ery65 und SeM bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, worin das für das gewünschte Genprodukt kodierende Gen operabel an eine eukaryotische Kontrollsequenz gebunden ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 18, weiters umfassend eine end-A-Mutation.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, der verzögerte RADS-Eigenschaften aufweist, worin die verzögerten RADS-Eigenschaften durch eine aus der folgenden Gruppe ausgewählte Veränderung hervorgerufen werden: Mutationen, die den Verlust von Aktivatormolekülen durch Metabolismus und/oder Austritt verzögern, eine Mutation oder Insertion zur Steigerung der Repressorkonzentration und Einbindung einer Vektorkontrollsequenz mit Bindungsstellen für mehr als einen Repressor und/oder Vektorsequenzen, die für Repressormoleküle, die auf eine Vektorkontrollsequenz einwirken, kodieren.
Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Genprodukts, in der folgenden Reihenfolge umfassend: (a) den Einbau eines Gens, das für das gewünschte Genprodukt kodiert, in den Vektor in einem Mikroorganismus nach Anspruch 6, worin der Mikroorganismus Kontrollsequenzen umfasst, die Expression des zweiten ori unter einer ersten Bedingung reprimieren, worin jedoch die Expression des zweiten ori unter einer zweiten Umgebungsbedingung dereprimiert wird; (b) das Kultivieren des Mikroorganismus aus Schritt (a) unter der ersten Umgebungsbedingung; und (c) das Kultivieren des Mikroorganismus mit Runaway-Vektor aus Schritt (a) unter der zweiten Umgebungsbedingung über einen ausreichenden Zeitraum, um das gewünschte Genprodukt zu produzieren.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das gewünschte Genprodukt ein Antigen ist.
Verfahren nach Anspruch 22, worin die erste Umgebungsbedingung die Gegenwart von Arabinose und die zweite Umgebungsbedingung die Abwesenheit von Arabinose umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die erste Umgebungsbedingung In-vitro-Kultur-Bedingungen und die zweite Umgebungsbedingung Bedingungen in einem Wirbeltier umfasst.
Verfahren nach Anspruch 24, worin (a) der erste ori ein pSC-ori ist; (b) der zweite ori ein pUC-ori ist, der operabel an eine reprimierende Kontrollsequenz, bestehend aus p22P_R, gebunden ist; (c) die zweite Kontrollsequenz P_trc ist; (d) der Mikroorganismus ein Gen umfasst, das für einen ersten Repressor kodiert, der operabel an eine erste aktivierbare Kontrollsequenz gebunden ist, worin der erste Repressor C2 ist; und (e) der Mikroorganismus ein Gen umfasst, das für einen zweiten Repressor kodiert, der operabel an eine zweite aktivierbare Kontrollsequenz gebunden ist, worin der zweite Repressor LacI ist; (f) der Mikroorganismus ein Chromosom ohne funktionelles asd-Gen umfasst und der Runaway-Vektor ein funktionelles asd-Gen umfasst; und (g) der Mikroorganismus eine inaktivierende Mutation im nativen Gen, ausgewählt aus der aus cya, crp phoPQ, ompR, galE, cdt, hemA, aroA, aroD und htr bestehenden Gruppe, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 25, worin der Mikroorganismus weiters eine inaktivierende Deletion im araCBAD-Operon und/oder im araE-Gen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26, worin das gewünschte Genprodukt aus der aus Ery65 und SeM bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 26, worin das für das gewünschte Genprodukt kodierende Gen operabel an eine eukaryotische Kontrollsequenz gebunden ist.
Vakzine zur Immunisierung eines Wirbeltiers, umfassend einen Mikroorganismus nach Anspruch 6 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Vakzine nach Anspruch 29, worin der Mikroorganismus eine Salmonella sp. ist.
Vakzine nach Anspruch 29, worin: (a) der erste ori ein pSC-ori ist; (b) der zweite ori ein pUC-ori ist, der operabel an eine reprimierende Kontrollsequenz, bestehend aus p22P_R, gebunden ist; (c) die zweite Kontrollsequenz P_trc ist; (d) ein Gen für einen ersten Repressor kodiert, der operabel an eine erste induzierbare Kontrollsequenz gebunden ist, worin der erste Repressor C2 ist; und (e) ein Gen für einen zweiten Repressor kodiert, der operabel an eine zweite induzierbare Kontrollsequenz gebunden ist, worin der zweite Repressor LacI ist.
Vakzine nach Anspruch 31, worin die erste induzierbare Kontrollsequenz und die zweite induzierbare Kontrollsequenz beide araC-P_BAD sind.
Vakzine nach Anspruch 32, worin der Mikroorganismus weiters eine inaktivierende Deletion im araCBAD-Operon und/oder im araE-Gen umfasst.
Verwendung eines Mikroorganismus nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Präparats zur Zufuhr eines gewünschten Genprodukts zu einem Wirbeltier.
Verwendung des Mikroorganismus nach Anspruch 5 bei der Herstellung einer Vakzine zur Induktion von Immunsuppression in einem Wirbeltier.
Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 19 und 20 zur Verwendung in Therapieverfahren.