DE69935927T2

DE69935927T2 - Plasmidstabilisierungssystem für die verabreichung von antigenen

Info

Publication number: DE69935927T2
Application number: DE69935927T
Authority: DE
Inventors: James E. Galen
Original assignee: University of Maryland at Baltimore
Current assignee: University of Maryland at Baltimore
Priority date: 1998-12-02
Filing date: 1999-12-02
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2019-12-03
Also published as: NO20012721L; NZ511449A; ATE360366T1; US20060029616A1; US6703233B1; NO20012721D0; ES2286905T3; US20040161420A1; AU776562B2; HUP0104609A2; AU2036400A; US20050003539A1; US7138112B2; WO2000032047A1; US6977176B2; US6969513B2; EP1135025A1; US7141408B2; EP1135025A4; US20060030048A1

Description

1. Stand der Technik
1.1 Technisches Gebiet
Allgemein betrifft die vorliegende Erfindung Expressionsplasmide, die durch ein Plasmiderhaltungssystem (wie es hierin definiert wird) stabilisiert werden und ein Protein oder Peptid exprimieren, wie beispielsweise ein Antigen zur Verwendung als Vektor-Lebendimpfstoff, sowie Verfahren zum Herstellen und Verwenden der stabilisierten Plasmide. Die Erfindung optimiert die Stabilisierung (maintenance) von Expressionsplasmiden auf zwei voneinander unabhängigen Ebenen, da: (1) die alleinige Abhängigkeit von katalytischen, balancierten letalen Erhaltungssystemen aufgehoben wird; und (2) ein Plasmid-Partitionierungssystem eingeschleust wird, das eine zufällige Trennung von Expressionsplasmiden verhindert und dadurch die Vererbbarkeit und Stabilität erhöht.
Das U.S. Patent Nr. 4,760,022 (Molin et al.) beschreibt einen Expressionsvektor, der die Elemente parA und parB umfasst, die beide als Partitionierungsfunktionen gelten, da sie eine geordnete Aufteilung der Plasmidmoleküle bei der Zellteilung ermöglichen.
Kim et al. (1996) J. Fermentation and Bioengineering, 82, 495-497 beschreiben eine Reihe von Plasmiden, die einen par-Locus aus dem Plasmid pSC101 umfassen. Diese Plasmide werden stabil gehalten, wenn die Transkription von dem P_L-Promotor unterdrückt wird, sie gehen jedoch schnell verloren, wenn die Transkription aktiviert wird.
1.2.1 Bakterielle Vektor-Lebendimpfstoffe.
Bakterielle Vektor-Lebendimpfstoffe übertragen Antigene auf das Immunsystem eines Wirts, wobei die Antigene aus dem genetischen Material exprimiert werden, das in einem bakteriellen Lebendvektor enthalten ist. Das genetische Material ist üblicherweise ein Replikon, wie beispielsweise ein Plasmid. Die Antigene können eine breite Vielfalt an Proteinen und/oder Peptiden bakteriellen, viralen, parasitären oder anderen Ursprungs einschließen.
Unter den derzeit untersuchten bakteriellen Lebendvektoren befinden sich attenuierte Darmpathogene (z.B. Salmonella typhi, Shigella, Vibrio cholerae), Komensale (z.B. Lactobacillus, Streptococcus gordonii) und zugelassene Impfstoffstämme (z.B. BCG). S. typhi ist ein zum Impfen von Menschen besonders interessanter Stamm.
1.2.2 Attenuierte Salmonella typhi als Lebendvektorstamm
S. typhi ist ein gut-tolerierter Lebendvektor, der verschiedene, nicht miteinander verwandte immunogene Antigene auf das humane Immunsystem übertragen kann. Es wurde gezeigt, dass S. typhi-Lebendvektoren Antikörper und eine zelluläre Immunantwort auf ein exprimiertes Antigen hervorrufen. Beispiele für Antigene, die erfolgreich von S. typhi übertragen wurden, schließen das nicht-toxigene, jedoch stark immunogene C-Fragment des Tetanus-Toxins und Malaria-Circumsporozoiten-Protein aus Plasmodium falciparum ein.
S. typhi ist gekennzeichnet durch einen enteralen Infektionsweg, eine Eigenschaft, die eine orale Verabreichung des Impfstoffs erlaubt. S. typhi infiziert auch Monozyten und Makrophagen und kann somit Antigene gegen professionelle APCs richten.
Die Expression eines Antigens durch S. typhi erfordert allgemein den Einbau eines rekombinanten Plasmids, das für das Antigen codiert. Die Stabilität eines Plasmids ist folglich ein Schlüsselfaktor in der Entwicklung hochqualitativer Impfstoffe aus S. typhi, die die Fähigkeit besitzen, beständig fremde Antigene zu exprimieren.
Mögliche Kandidaten für attenuierte S. typhi-Impfstoffe zur Verwendung in Menschen sollten wenigstens zwei völlig voneinander getrennte und genau definierte Mutationen aufweisen, da die Wahrscheinlichkeit einer Reversion solcher Doppelmutanten in vivo vernachlässigbar gering ist. Der attenuierte Impfstoff-Kandidat S. typhi CVD908 besitzt entsprechende Eigenschaften. CVD908 enthält zwei nicht-revertierende Deletionsmutationen in den aroC- und aroD-Genen. Diese beiden Gene codieren für Enzyme, die für den Biosyntheseweg entscheidend sind, der die Synthese von Chorismat, dem Haupt-Precursor, der für die Synthese der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan erforderlich ist, bewirkt. Ebenso ist Chorismat für die Synthese von p-Aminobenzoesäure erforderlich; nach Umwandlung desselben in Tetrahydrofolat wird die p-Aminobenzoesäure in die Purinnukleotide ATP und GTP umgewandelt.
1.2.3 Plasmid-Instabilität
Plasmidlose Bakterienzellen neigen dazu, sich schneller anzuhäufen als Plasmidtragende Zellen. Ein Grund für die erhöhte Anhäufungsgeschwindigkeit ist, dass die Transkription und die Translation von Plasmidgenen den Stoffwechsel belasten, was das Zellwachstum verlangsamt und plasmidlosen Zellen einen Wettbewerbsvorteil verschafft. Zudem sind fremde Plasmidgene mitunter für die Wirtszelle toxisch.
Bei attenuierten bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoffen ist eine dauerhafte Vererbbarkeit von Plasmiden erwünscht, um dadurch eine erfolgreiche, fortdauernde Antigenproduktion sicherzustellen sowie bei kommerziellem Betrieb von Bioreaktoren, zu verhindern, dass der Bioreaktor von plasmidlosen Zellen übernommen wird.
Eine dauerhafte Vererbbarkeit eines Plasmids erfordert generell, dass: (1) sich das Plasmid einmal in jeder Generation replizieren muss, (2) die Abweichungen der Kopienzahlen vor einer Zellteilung schnell korrigiert werden müssen und (3) die Produkte der Plasmid-Replikation bei der Zellteilung auf beide Tochterzellen aufgeteilt werden müssen.
Obwohl der Einbau der fremden Gene in die Chromosomen die Stabilität solcher Sequenzen erhöht, können die beteiligten genetischen Manipulationen schwierig sein und eine Abnahme der Kopienzahl der heterologen Gene führt somit oftmals zu einer Produktion von Mengen an heterologem Antigen, die nicht dazu ausreichen, eine optimale Immunantwort zu gewährleisten. Der Einbau von heterologen Genen in Vielkopie-Plasmide, die in einem Lebendvektor-Stamm gehalten werden, stellt eine in der Natur vorkommende Lösung des Problems der Kopienzahl dar; eine genetische Manipulation dieser Plasmide für eine kontrollierte Expression der heterologen Gene ist einfach. Trotzdem können die resultierenden Plasmide in vivo instabil werden und somit ein Verlust dieser fremden Gene eintreten.
1.2.4 Plasmiderhaltungssysteme
In der Natur werden bakterielle Plasmide oft stabilisiert, auch wenn sie in der Regel mit sehr geringen Kopienzahlen vorhanden sind. Eine stabile Vererbbarkeit von natürlich vorkommenden Plasmiden mit geringer Kopienzahl kann von dem Vorhandensein bestimmter genetischer Systeme, die aktiv das Auftreten von plasmidfreien Nachkommen verhindern, abhängen. Ein aktueller Review über Plasmiderhaltungssysteme ist bei Jensen et al., Molecular Microbiol., 17:205-210, 1995 zu finden.
1.2.5 Antibiotikaresistenz
Ein Mittel zur Erhaltung von Plasmiden ist, ein Antibiotikaresistenzgen auf dem Plasmid bereitzustellen und die Zellen in einem mit dem Antibiotikum angereicherten Medium anzuzüchten. Dieses Verfahren bringt jedoch einige Schwierigkeiten mit sich. Der Antibiotikaresistenz-Ansatz ist teuer, da die Verwendung teurer Antibiotika erforderlich ist und, was vielleicht noch wichtiger ist, die Amerikanische Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimitteln (U.S. Food and Drug Administration) rät derzeit von der Verwendung von Antibiotika in Verbindung mit der in vivo Verabreichung von Vektor-Impfstoffen ab.
Bei großtechnischen Produktionsansätzen kann der Einsatz von Antibiotika anderen Einschränkungen unterliegen. Bei kommerziell verwendeten Bioreaktoren kann das Antibiotikum durch die Mechanismen der Antibiotikaresistenz abgebaut werden und so das Fortbestehen einer erheblichen Population an plasmidlosen Zellen in der Kultur ermöglichen. Diese plasmidlosen Zellen sind unproduktiv und verringern den Ertrag des Bioreaktors.
In der Technik besteht daher ein Bedarf nach einem Plasmiderhaltungssystem, das speziell für eine Verwendung als Impfstoff aus bakteriellen Lebendvektoren ausgelegt ist, nicht auf eine Antibiotikaresistenz angewiesen ist und das vorzugsweise auch bei der Anwendung kommerziell verwendeter Bioreaktoren von Nutzen ist.
1.2.6 Segregationale Plasmiderhaltungsfunktionen
Stabile Plasmide mit geringer Kopienzahl benutzen üblicherweise eine Partitionierungsfunktion, die aktiv Plasmidkopien zwischen den Tochterzellen aufteilt. Beispielhafte Partitionierungsfunktionen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Systeme von pSC101, den F-Faktor, den P1-Prophagen und IncFII-Arzneimittelresistenzplasmide. Diese Funktionen werden hierin als „SEG"-Funktionen bezeichnet.
1.2.7 Post-segregationale Killing-(PSK-)Funktionen
In der Natur vorkommende PSK-Plasmiderhaltungsfunktionen benutzen üblicherweise ein aus zwei Komponenten bestehendes Toxin-/Antitoxin-System und funktionieren generell wie folgt: Das Plasmid codiert sowohl für ein Toxin als auch für ein Antitoxin. Die Antitoxine sind weniger stabil als die Toxine, die dazu neigen, ziemlich stabil zu sein. In einer plasmidlosen Tochterzelle werden keine Toxine und Antitoxine mehr produziert; die weniger stabilen Antitoxine werden allerdings schnell abgebaut und setzen dabei das Toxin frei, wodurch die Zelle getötet wird.
Allgemein sind die Toxine kleine Proteine und die Antitoxine sind entweder kleine Proteine (Proteinsysteme, wie beispielsweise phd-doc) oder antisense-RNAs, die an die für das Toxin codierenden mRNAs binden und so deren Synthese verhindern (antisense-Systeme, wie beispielsweise hok-sok).
Die später in Abschnitt 1.2.7.3 diskutierten, balancierten Letalsysteme sind ein Beispiel für eine künstliche PSK-Funktion.
1.2.7.1 Protein-Erhaltungssystem: Das phd-doc-System
In Protein-PSK-Funktionen werden sowohl das Toxin als auch das Antitoxin aus Operons synthetisiert, in denen das für das Antitoxin codierende Gen stromaufwärts von dem für das Toxin codierenden Gen liegt. Diese Operons autoregulieren die Transskriptionsniveaus und die Synthese von codierten Proteinen ist an die Translation gekoppelt. Das Antitoxin wird generell im Überschuss synthetisiert, um sicherzustellen, dass die Wirkung des Toxins blockiert ist. Die instabilen Antitoxine werden beständig durch von dem Wirt codierte Proteasen abgebaut, was, um die Zelle zu schützen, eine kontinuierliche Synthese des Antitoxins erfordert. Bei einem Verlust des Plasmids werden keine Antitoxine mehr produziert und die vorhandenen Antitoxine werden schnell abgebaut, wodurch das Toxin die Wirtszelle töten kann.
Das phd-doc-System ist ein Beispiel für eine Protein-PSK-Funktion. In der Natur tritt das phd-doc-System in dem temperenten Bakteriophagen P1, der Escherichia coli lysiert, in Form eines ~ 100 kb großes Plasmid auf. Der Erhaltungslocus codiert für zwei kleine Proteine: das toxische, 126 Aminosäuren lange Doc-Protein bewirkt über einen unbekannten Mechanismus den Verlust „death an curing" des Plasmids und das 73 Aminosäuren lange Phd-Antitoxin verhindert den Tod des Wirts (prevents host death), indem es vermutlich an Doc bindet und die Wirkung von Doc blockiert.
Phd und Doc werden von einem einzelnen Transkript codiert, bei dem das ATG-Startcodon des stromabwärts gelegenen doc-Gens mit einer Base des TGA-Stoppcodons des stromaufwärts gelegenen phd-Gens überlappt. Die Expression dieser beiden Proteine ist daher an die Translation gekoppelt, wobei mehr Phd als toxisches Doc-Protein synthetisiert wird.
Daneben wird die Transkription dieses Operons auf der Transkriptionsebene von der Bindung eines Phd-Doc-Proteinkomplexes an die Stelle, die, wenn die Konzentrationen der beiden Proteine einen kritischen Wert erreichen, den Zugang der RNA-Polymerase an den Promotor des Operons blockiert, autoreguliert. Obwohl Doc relativ resistent gegen einen proteolytischen Angriff zu sein scheint, ist Phd für eine Spaltung äußerst anfällig. Der PSK-Mechanismus eines von einem Plasmid codierten phd-doc-Locus wird demzufolge aktiviert, wenn Bakterien spontan das in ihnen befindliche Plasmid verlieren, wodurch das Phd-Antitoxin abgebaut und anschließend das Zelltod verursachende Doc-Toxin aktiviert wird.
1.2.7.2 Antisense-Erhaltungssystem: Das hok-sok-System
In antisense-Stabilisierungssystemen sind die Antitoxine antisense-RNAs, die die Translation von mRNAs, die für Toxine codieren, hemmen. Wie die Antitoxinpeptide sind die antisense-RNAs weniger stabil als die für Toxine codierende mRNA. Ein Verlust des Plasmids lässt einen Abbau der vorhandenen Antitoxine und damit die Synthese des Toxins, das die Wirtszelle tötet, zu.
Ein Beispiel für ein antisense-Stabilisierungssystem ist das hok-sok-System, das von dem parB-Locus des Plasmids R1 codiert wird. Das System umfasst drei Gene: hok, sok und mok.
Hok ist ein membranassoziiertes Protein, das die Zellmembran irreversibel schädigt und dadurch Wirtszellen tötet. Die Expression von Hok aus hok-mRNA verursacht einen Verlust des Zellmembranpotentials, ein Aussetzen der Zellatmung, Veränderungen der Zellmorphologie und den Tod der Zelle.
Das sok-Gen codiert für eine trans-agierende RNA, die die Translation der hok-mRNA blockiert und dadurch verhindert, dass Hok Wirtszellen getötet werden. Die sok-RNA ist weniger stabil als die hok-mRNA und wird von einem relativ schwachen Promotor exprimiert (Gerdes et al., Annu. Rev. Genet., 31:1-31, 1997). Der Mechanismus, über den die sok-RNA die Translation von Hok in Plasmid-tragenden Zellen blockiert, konnte erst durch die Identifikation von mok (modulation of killing), einem dritten Gen auf dem parB-Locus erkannt werden. Der offene Leserahmen von mok überlappt mit hok und ist für die Expression und Regulation der hok-Translation erforderlich.
Die sok-antisense-RNA bildet mit dem 5'-Ende der mok-hok-Message ein Duplex, wodurch die Ribosomenbindungsstelle von mok für Ribosomen unzugänglich wird und eine Spaltung mit RNase III und der Abbau der mRNA begünstigt werden. Ohne Translation von mok wird hok von einer intakten Message nicht exprimiert, auch wenn dessen eigene Ribosomenbindungsstelle nicht direkt von der sok-RNA verdeckt wird.
Wenn eine plasmidfreie Zelle gebildet wird, zerfällt die sok-RNA viel schneller als die stabile mok-hok-Message. Wenn der durch sok gebotene Schutz verloren wird, werden Mok und Hok translatiert und die Zelle stirbt.
Eine Einschränkung des hok-sok-Systems ist, dass eine signifikante Menge an plasmidlosen Zellen entstehen kann, wenn das hok-sok-System durch Mutationen im offenen Leserahmen von Hok inaktiviert wird.
1.2.7.3 Balancierte Letalsysteme
In einem balancierten Letalsystem (eine PSK-Funktion) wird ein chromosomales Gen, das für ein essentielles Strukturprotein oder Enzym codiert, von dem Bakterienchromosom deletiert oder so mutiert, dass das Gen nicht länger funktionieren kann. Das entfernte oder beschädigte Gen wird dann gegen ein Plasmid ausgetauscht, das ein vollständig funktionsfähiges Gen umfasst. Ein Verlust des Plasmids führt zu einem Mangel an dem essentiellen Protein und dem Tod der plasmidlosen Zelle.
Ein balanciertes Letalsystem wurde erfolgreich in S. typhimurium verwendet, das auf der Expression des für Aspartat-β-semialdehyddehydrogenase (Asd) codierenden asd-Gens basiert. Asd ist ein entscheidendes Enzym, das an der Synthese von L-Asparagin-β- Semialdehyd, einem Vorläufer, der für die Synthese der Aminosäuren L-Threonin (und L-Isoleucin), sowie Diaminopimelinsäure, einem entscheidenden strukturellen Bestandteil bei der Ausbildung der Zellwand Gram-negativer Bakterien, essentiell ist, beteiligt ist. Der Verlust von Plasmiden, die für Asd codieren, wäre für jedes Bakterium, das nicht in der Lage ist, Asd aus dem Chromosom zu synthetisieren, tödlich und würde, aufgrund des Unvermögens des Bakteriums, die Peptidoglykanschicht in der Zellwand korrekt aufbauen zu können, zur Lyse des Bakteriums führen.
Das asd-System (eine PSK-Funktion) wurde erfolgreich in attenuierten, auf S. typhimurium basierenden Lebendvektorstämmen zur Immunisierung von Mäusen mit einer Vielzahl an prokaryotischen und eukaryotischen Antigenen, einschließlich solcher verschiedener Antigene, wie detoxifiziertem Fragment C von Tetanus-Toxin und dem LT-Enterotoxin, synthetischen viralen Peptiden von Hepatitis B und Gameten-spezifischen Antigenen, wie beispielsweise dem Antigen SP 10 von humanem Sperma, durchgeführt.
Eine Immunisierung von Mäusen mit diesen Lebendvektorstämmen in die Mucosa hat signifikante Immunreaktionen, an denen Reaktionen von IgG und sekretorischem IgA beteiligt sind, an den Mucosaoberflächen ausgelöst.
Das asd-System wurde kürzlich in einem Versuch zur Erhöhung der Stabilität von synthetischen viralen Peptiden von Hepatitis B exprimierenden Plasmiden in attenuierte Salmonella typhii-Impfstoffstämme eingeschleust. Als die freiwilligen Patienten mit diesen Lebendvektorstämmen immunisiert wurden, konnte jedoch keine Immunantwort auf das fremde Antigen nachgewiesen werden.
Tatsächlich wurden nach der Impfung von Menschen mit einem Lebendvektor von attentuiertem S. typhi bis heute nur sehr wenige Berichte über eine Immunreaktion auf die auf Plasmiden basierende Expression eines fremden Antigens aus stabilisierten Plasmiden dokumentiert. In einem Bericht wurde der Impfstoffstamm Ty21a für Thymin autotroph gemacht, indem in Gegenwart von Trimethoprim eine nicht-definierte Mutation in dem thyA-Gen, das für Thymidylatsynthetase codiert, selektiert wurde.
Obwohl in manchen Fällen eine übermäßige Attenuierung des Stammes selbst zu einer Fehlfunktion der Lebendvektorstämme führen kann, scheint es möglich, dass die derzeit für Plasmide verwendeten Killing-Systeme weiteren Einschränkungen unterliegen. In Fällen, wo die chromosomale Kopie des Gens eher inaktiviert als entfernt wurde, kann, wenn der verwendete Bakterienstamm für eine Rekombination kompetent ist, eine Wiederherstellung der chromosomalen Kopie durch homologe Rekombination mit der aus dem Plasmid stammenden Genkopie erfolgen.
Balancierte Letalsysteme, die auf der Produktion katalytischer Enzyme beruhen, zeigen eine Reihe erheblicher Mängel. Da für eine Komplementierung der chromosomalen Gendeletion nur eine einzelne Genkopie erforderlich ist, ist es an sich besonders schwierig, mehr als ein paar Kopien eines Expressionsplasmids zu stabilisieren. Der plasmidlose Wirtsstamm muss auf Spezialmedien angezüchtet werden, um den vorhandenen Stoffwechselmangel auszugleichen.
Wenn ein diffusionsfähiger Wachstumsfaktor wachstumsbedingt ist, können die plasmidlosen Zellen zudem auch von den Effekten einer „Kreuzfütterung" profitieren.
In der Technik besteht daher der Bedarf nach einem Plasmiderhaltungssystem, das nicht allein von einem balancierten Letalsystem abhängt und insbesondere bei bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoffen verwendet werden kann.
2. Zusammenfassung
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir einen Expressionsvektor bereit, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die codiert für:
einen Replikationsursprung, der eine durchschnittliche Kopienzahl zwischen 2 und 75 verleiht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: oriE1 (SEQ ID No. 1), ori101 (SEQ ID No. 3), ori15A (SEQ ID No. 2) und Derivaten davon und an beiden Enden von Transkriptionsterminatoren flankiert wird;
wenigstens eine post-segregationale Killing-Funktion, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus asd, ssb, phd-doc, kis-kid und hok-sok, und in der die Transkription flankierender Regionen von Loci, die die wenigstens eine post-segregationale Funktion umgeben, divergent ist und das Transkriptionsniveau des Wildtyps nicht in erheblichem Maße stören wird;
wenigstens eine Partitionierungsfunktion, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dempar-Locus von pSC101 und dem parA von pR1, in der die Transkription flankierender Regionen von der wenigstens einen Partitionierungsfunktion aus fortschreitet; und
einen ompC-Promotor mit folgender Sequenz:
AGATCX¹X²TAAX³CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEQ ID No: 36), in der X¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus G, C und A; X² ein aus 1 bis 5 Nukleotiden bestehendes Insert ist; und X³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus A, T, G und C.
Entsprechend einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt, der eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen Expressionsvektor codiert, welcher eine Nukleotidsequenz umfasst, die codiert für:
eine Replikationsursprungskassette, die umfasst: eine Nukleotidsequenz, die für einen Replikationsursprung codiert, der eine durchschnittliche Kopienzahl zwischen 2 und 75 verleiht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: oriE1 (SEQ ID No. 1), ori101 (SEQ ID No. 3), ori15A (SEQ ID No. 2) und Derivaten davon; einer ersten einzigartigen Stelle zur Spaltung mit einem Restriktionsenzym, das 5' von der für den Replikationsursprung codierenden Nukleotidsequenz angeordnet ist; und einer zweiten einzigartigen Stelle zur Spaltung mit einem Restriktionsenzym, das 3' von der für den Replikationsursprung codierenden Nukleotidsequenz angeordnet ist;
wenigstens eine post-segregationale Killing-Kassette, die umfasst: eine Nukleotidsequenz, die für wenigstens eine post-segregationale Killing-Funktion codiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus asd, phd-doc, kis-kid und hok-sok; einer ersten einzigartigen Stelle zur. Spaltung mit einem Restriktionsenzym, die 5' von der für die wenigstens eine post-segregationale Killing-Funktion codierenden Nukleotidsequenz angeordnet ist; und einer zweiten einzigartigen Stelle zur Spaltung mit einem Restriktionsenzym, die 3' von der für die wenigstens eine post-segregationale Killing-Funktion codierenden Nukleotidsequenz angeordnet ist;
wenigstens eine Partitionierungskassette, die umfasst: (i) eine Nukleotidsequenz, die für wenigstens eine Partitionierungsfunktion codiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem par-Locus von pSC101 und dem parA von pR1; einer ersten einzigartigen Stelle zur Spaltung mit einem Restriktionsenzym, das 5' von der für die wenigstens eine Partitionierungsfunktion codierenden Nukleotidsequenz angeordnet ist; und einer zweiten einzigartigen Stelle zur Spaltung mit einem Restriktionsenzym, die 3' von der für die wenigstens eine Partitionierungsfunktion codierenden Nukleotidsequenz angeordnet ist; und
eine Expressionskassette, die (i) eine Nukleotidsequenz, die für einen ompC-Promotor, der die folgende Sequenz: AGATCX¹X²TAAX³CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEQ ID No. 36) umfasst, codiert, in der X¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus G, C und A; X² ein aus 1 bis 5 Nukleotiden bestehendes Insert ist; und X³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus A, T, G und C, (ii) eine erste einzigartige Stelle zur Spaltung mit einem Restriktionsenzym, die 5' von der für den Promotor codierenden Nukleotidsequenz angeordnet ist, und (iii) eine zweite einzigartige Stelle zur Spaltung mit einem Restriktionsenzym, die 3' von der für den Promotor codierenden Nukleotidsequenz angeordnet ist, umfasst.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir eine Zelle bereit, die einen Expressionsvektor gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung umfasst.
Als vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein attenuierter bakterieller Vektor-Lebendimpfstoff zur Verwendung in einem Verfahren zum Auslösen einer Immunantwort in einem Probanden bereitgestellt, wobei der attenuierte bakterielle Vektor-Lebendimpfstoff eine Zelle gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung umfasst.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen wir ein Herstellungsverfahren für einen attenuierten bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoff bereit, das das Transformieren eines Bakterienstammes mit einem Expressionsvektor gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung umfasst.
In einem speziellen Aspekt wird ein stabilisiertes Expressionsplasmid in einem Vektor-Lebendimpfstoff aus Salmonella typhi, wie beispielsweise CVD908-htrA, verwendet.
Die Stabilisierung von Expressionsplasmiden wird auf zwei voneinander unabhängigen Ebenen erreicht, da (1) die alleinige Abhängigkeit von katalytischen, balancierten Letalstabilisierungssystemen aufgehoben wird; und (2) ein Plasmid-Partitionierungssystem eingeschleust wird, das eine zufällige Segregation von Expressionsplasmiden verhindert und dadurch die Vererbbarkeit und Stabilität derselben erhöht. Das stabilisierte Expressionsplasmid kann rekombinant so hergestellt werden, dass es ein oder mehrere Antigene, vorzugsweise ein oder mehrere Shiga-Toxin 2-(Stx 2-) Antigene oder wesentliche Homologe davon, wie zum Beispiel Pentamere der Untereinheit von Shiga-Toxin oder ein genetisch detoxifiziertes Stx 2, exprimiert.
Das stabilisierte Expressionsplasmid umfasst vorzugsweise eine oder mehrere nichtkatalytische Plasmiderhaltungsfunktionen.
Wir beschreiben Expressionsplasmide, die ein Plasmiderhaltungssystem umfassen, das wenigstens eine PFK-Funktion und wenigstens eine SFG-Funktion umfasst. Das Plasmiderhaltungssystem kann beispielsweise ein aus zwei Komponenten bestehendes Plasmiderhaltungssystem umfassen, das eine PSK-Funktion und eine SEG-Funktion umfasst. Alternativ dazu kann das Plasmiderhaltungssystem ein aus drei Komponenten bestehendes Plasmiderhaltungssystem umfassen, das eine PSK-Funktion, eine SFG-Funktion und eine weitere PSK umfasst. In einer bevorzugten Alternative umfasst das Plasmiderhaltungssystem hok-sok + par + parA + phd-doc, wobei jede der angegebenen Funktionen gegen ein wesentliches Homologon davon ausgetauscht werden kann.
Die Plasmiderhaltungssysteme können in Vielkopie-Expressionsplasmide, die für eines oder mehrere Proteine oder Peptide von Interesse codieren, eingeschlossen sein. Solche Vielkopie-Expressionsplasmide erzeugen einen Gendosiseffekt, der die Expressionsmenge des Proteins oder Peptids von Interesse verstärkt. Wenn das Plasmiderhaltungssystem in einem bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoff verwendet werden soll, ist das Protein oder Peptid von Interesse ein Antigen oder mehrere Antigene.
In einem Aspekt ist das Expressionsplasmid ein Expressionsplasmid für einen Impfstoff, das ein Plasmiderhaltungssystem und wenigstens ein Antigen, zum Beispiel wenigstens ein Shiga-Toxin 2-(Stx 2-) Antigen und/oder ein wesentliches Homologon davon, umfasst. Wenn das Antigen ein Shiga-Toxin 2-Antigen ist, kann das Shiga-Toxin 2-Antigen zum Beispiel entweder ein Pentamer der Untereinheit B oder ein genetisch detoxifiziertes Stx 2 sein.
Wir beschreiben ferner Expressionsplasmide, die ein Plasmiderhaltungssystem umfassen, das das balancierte Letalsystem ssb einschließt und in denen der ssb-Locus des bakteriellen Lebendvektors, der unter Verwenden eines Suizidvektors, der einen temperatursensitiven Replikationsursprung umfasst, inaktiviert wurde. In einem Aspekt wird der bakterielle Lebendvektor S. typhi und der Suizidvektor zur Inaktivierung des ssb-Locus von S- typhi verwendet. In einem Aspekt ist der Suizidvektor ein Derivat von pSC101, das das hierin beschriebene sacB trägt.
Wir beschreiben ferner ein Plasmiderhaltungssystem, in dem eine PSK-Funktion enthalten ist, die ein stilles Plasmid-Addiktionssystem einschließt, das auf antisense-RNA-Kontroilmechanismen beruht, die Letalproteine erst dann synthetisieren, wenn ein Plasmidverlust eingetreten ist.
Das Expressionsplasmid kann eine Reihe von Expressionsplasmiden umfassen, von denen jedes eine vollständige genetische Kassette, die für die regulierte Expression eines heterologen Antigens, eines Replikationsursprungs und eines selektierbaren Markers zur Rückgewinnung des Plasmids codiert, umfasst.
Das Expressionsplasmid umfasst ein Plasmiderhaltungssystem, das eine PSK-Funktion einschließt, die auf dem ssb-Gen basiert. Mutierte Allele, wie zum Beispiel das hierin beschriebene ssb-1, können in die Expressionsplasmide eingebaut werden, um Plasmide mit höherer Kopienzahl durch Überexpression von SSB1-gleichen Proteinen zu verstärken, um so die erforderlichen biologisch aktiven Tetramere von SSB zu bilden.
Das Expressionsplasmid umfasst einen Promotor. Der Promotor ist ein modifizierter ompC-Promotor mit der Sequenz SEQ ID No. 36. Der induzierbare Promotor kann der hierin beschriebene, mutierte P_ompC1- oder der P_opmC3-Promotor sein.
Das Expressionsplasmid kann einen Locus für Plasmidvererbbarkeit (oder – partitionierung); einen Replikationsursprung, der so ausgewählt ist, dass eine Kopienzahl, die ein gegebenes Antigen effektiv stabilisiert, bereitgestellt wird; eine PSK-Funktion; und eine Nukleotidsequenz, die für ein Antigen und einen Promotor, der letztlich die Translation des Antigens kontrolliert und eine Stärke besitzt, die zur Verbesserung der Antigenproduktion ohne Abtöten der Zelle ausgewählt ist, umfassen.
Wir beschreiben auch ein Verfahren zur Verwendung des Expressionsplasmids, welches das Transformieren einer Bakterienzelle unter Verwenden des Expressionsplasmids und das Kultivieren der Bakteriellenzelle zur Produktion des Proteins oder Peptids (z.B. des Antigens) und/oder das Verabreichen der transformierten Zelle oder Zellkultur an einen Probanden umfasst. Wenn die transformierten Bakterienzellen einem Probanden verabreicht werden, werden sie in einer Menge verabreicht, die für das Auslösen einer Immunreaktion, die dem Probanden eine Immunität gegen das Protein oder Peptid verleiht, notwendig ist. Der Proband ist vorzugsweise ein Mensch, kann jedoch auch ein anderes Lebewesen, wie beispielsweise ein Hund, Pferd-oder Huhn, sein.
Das Expressionsplasmid kann wenigstens 3 unabhängig voneinander funktionierende Expressionskassetten umfassen, von denen eine Kassette für ein Protein oder Peptid von Interesse codiert und die restlichen Kassetten jeweils für ein anderes Plasmiderhaltungssystem codieren.
Das Expressionsplasmid kann für (1) ein Testantigen, das funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft ist, und (2) ein Plasmiderhaltungssystem codieren.
Wir beschreiben ferner eine Kassette zur regulierten Expression eines Testantigens, die so funktioniert, dass, wenn die Induktion einer Antigenexpression erhöht wird, der Stoffwechsel des Bakteriums belastet wird, und dies phänotypisch gesehen zu einer Instabilität des Plasmids führt, d.h. es wird ein selektiver Vorteil für alle diejenigen Bakterien geschaffen, die das störende Plasmid spontan verlieren können. Das Testantigen kann das grüne fluoreszierende Protein (GFPuv) sein. Die für das Testantigen codierende Expressionskassette kann auch einen induzierbaren Promotor, beispielsweise den ompC-Promotor, umfassen, der so positioniert ist, dass der induzierbare Promotor letztlich die Translation des Testantigens steuert.
Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung eines Expressionsplasmids, das das Synthetisieren eines Expressionsplasmids umfasst, das wenigstens 3 unabhängig voneinander funktionierende Expressionskassetten, von denen eine Kassette für ein Protein oder Peptid von Interesse codiert und die restlichen Kassetten jeweils für ein anderes Plasmiderhaltungssystem codieren, umfasst.
Ein Verfahren zum Screenen von Plasmiderhaltungssystemen kann umfassen:
Bereitstellen einer Expressionskassette, die für ein Protein oder Peptid von Interesse codiert, und wenigstens zwei weiterer Expressionskassetten, von denen jede für eine andere Plasmidstabilisierungsfunktion codiert und diese in einem Lebendvektor eines bakteriellen Wirts exprimieren kann; Einschleusen der drei Expressionskassetten in ein einziges Expressionsplasmid; Transformieren eines bakteriellen Lebendvektors mit dem einzigen Expressionsplasmid; Kultivieren des transformierten, bakteriellen Lebendvektors und Bestimmen des Anteils an in die Kultur eingeschleusten, plasmidlosen Zellen.
Wir beschreiben einen attenuierten bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoff, der einen attenuierten bakteriellen Lebendvektor umfasst, der mit einem stabilisierten Expressionsplasmid, das ein Plasmiderhaltungssystem, vorzugsweise ein nicht-katalytisches Plasmiderhaltungssystem, umfasst, transformiert wurde.
Wir beschreiben auch einen attenuierten bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoff, der einen attenuierten bakteriellen Lebendvektor umfasst, der mit einem Expressionsplasmid, das ein Plasmiderhaltungssystem umfasst, das wenigstens ein PSK-System und wenigstens ein SEG-System einschließt, transformiert wurde. Der attenuierte bakterielle Lebendvektor kann zum Beispiel S. typhi CVD908-htrA sein.
Wir beschreiben ferner ein Verfahren zum Impfen eines Probanden, welches das Verabreichen einer Menge an bakteriellem Vektor-Lebendimpfstoff, die zum Auslösen einer verstärkten Immunreaktion ausreicht, an den Probanden umfasst. Wir beschreiben auch ein Verfahren zur Prophylaxe einer Erkrankung durch Impfen eines Probanden unter Verwenden einer Menge eines solchen bakteriellen Lebendvektors, die zum Auslösen einer schützenden Immunreaktion gegen eines oder mehrere Pathogene einer solchen Erkrankung ausreicht. Der Proband ist vorzugsweise ein Mensch, kann jedoch auch ein anderes Lebewesen, wie beispielsweise ein Pferd, eine Kuh oder ein Schwein sein. Wir beschreiben zum Beispiel ein Verfahren zur Prophylaxe von hämorrhagisch-urämischem Syndrom (HUS), das von Shiga-Toxin 2-produzierenden enterohämorrhagischen Escherichia coli verursacht wird, durch Verabreichen einer Menge an bakteriellem Lebendvektor, der mit einem stabilisierten Plasmid, das für wenigstens ein Shiga-Toxin 2-Antigen codiert, transformiert wurde, an einen Probanden.
Plasmiderhaltungssysteme können auf ihre Effizienz gescreent werden, wobei ein Verfahren verwendet wird, das umfasst: das Bereitstellen von Expressionsplasmiden, die die hierin beschriebenen Plasmiderhaltungssysteme umfassen und für ein Protein oder Peptid von Interesse codieren, wobei die Expressionsplasmide eine Kopienzahl besitzen, die von einer geringen Kopienzahl (z.B. ~ 5 Kopien pro Zelle) zu einer mittleren Kopienzahl (z.B. ~ 15 Kopien pro Zelle) zu einer hohen Kopienzahl (z.B. ~ 60 Kopien pro Zelle) variieren kann; Transformieren von bakteriellen Lebendvektoren mit diesen Expressionsplasmiden; und Überprüfen des Anteils an eingeschleusten plasmidlosen Zellen und/oder des Anteils an wachsenden, Plasmid-enthaltenden Zellen. Die modifizierten Replikationsursprünge können Replikationsursprünge aus den Plasmiden pSC101 (niedrige Kopienzahl), pACYC184 (mittlere Kopienzahl) und pAT153 (hohe Kopienzahl) sein. Es können unabhängig voneinander funktionierende Plasmidreplikationskassetten verwendet werden, die das Überprüfen der Effizienz von einem oder mehreren Plasmiderhaltungssystemen, wenn die Kopienzahl zunimmt, zulassen.
Wir beschreiben stabilisierte Expressionsplasmide zur Verwendung in Lebendvektoren aus attenuierten S. typhi, die einen selektierbaren Marker enthalten, der leicht gegen einen nicht-arzneimittelresistenten Locus oder ein Gen, das für einen verträglichen Arzneimittelresistenz-Marker, wie beispielsweise asp, der für eine Resistenz gegen die Aminoglykoside Kanamycin und Neomycin codiert, ausgetauscht werden kann.
Die hierin beschriebenen Plasmiderhaltungssysteme stellen eine verbesserte Stabilität von rekombinanten Plasmiden bereit und räumen damit die Probleme der Instabilität von Plasmiden aus dem Stand der Technik, zum Beispiel in Bioreaktoren und bei der Verwendung von Vektor-Lebendimpfstoffen, aus. Die Plasmide sind speziell auf Impfstoffanwendungen zugeschnitten, sie sind jedoch auch zur großtechnischen Herstellung von Proteinen nützlich.
Die größte Verbesserung bei den Plasmiden gegenüber dem Stand der Technik ist, dass sie die Probleme überwinden, die mit einer Übernahme durch plasmidlose Zellen und der Instabilität von Plasmiden verbunden sind, und eine weit reichende Verwendung in Gebieten, wie beispielsweise der kommerziellen Produktion von Proteinen und der Produktion von attenuierten bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoffen finden.
Es bestand lange Zeit der Bedarf, die Probleme mit einer Übernahme durch plasmidlose Zellen oder einer Stabilität von Plasmiden, die mit der Verabreichung von Impfstoffen und der Produktion von Proteinen verbunden sind, zu lösen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen seit langem bestehenden Bedarf.
3. Definitionen
Der Begriff „Plasmiderhaltungssystem" („ plasmid maintenance System", „PMS"), wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine Nukleotidsequenz, die wenigstens eine postsegregationale Killing-Funktion („PSK") und wenigstens ein Partitionierungs- oder Segregationssystem („SEG") und gegebenenfalls irgendeine weitere Plasmidstabilisierungsfunktion umfasst.
Der Begriff „Plasmiderhaltungssystem", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jede die Stabilität von Plasmiden verstärkende Funktion, die mit einem PMS verbunden ist. Der Begriff schließt sowohl natürlich vorkommende Nukleotidsequenzen, die für Plasmiderhaltungsfunktionen codieren, als auch Nukleotidsequenzen, die im Wesentlichen homolog zu den natürlich vorkommenden Plasmiderhaltungsfunktionen sind und die die von der entsprechenden, natürlich vorkommenden Plasmidstabilisierungsfunktion gezeigte Funktion beibehalten, ein.
Der Begriff „post-segregationales Killing-System" („PSK"), wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jede Funktion, die zum Tod irgendeiner neu geteilten Bakterienzelle führt, die das Plasmid von Interesse nicht geerbt hat, und er schließt insbesondere balancierte Letalsysteme, wie zum Beispiel asd oder ssb, aus Proteinen bestehende Systeme, wie beispielsweise phd-doc, und antisense-Systeme, wie beispielsweise hok-sok, ein. Der Begriff schließt sowohl natürlich vorkommende Nukleotidsequenzen, die für PSKs codieren, als auch Nukleotidsequenzen, die im Wesentlichen homolog zu den natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen sind und die die von den entsprechenden, natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen gezeigte Funktion beibehalten, ein.
Der Begriff „im Wesentlichen homolog" oder „wesentliches Homologon", bezogen auf eine Nukleotidsequenz oder eine Aminosäuresequenz, gibt an, dass die Nukleinsäuresequenz im Vergleich zu einer Referenzsequenz (z.B. einer nativen Sequenz) ausreichende Homologie besitzt, um zuzulassen, dass die Sequenz die gleichen grundlegenden Funktionen wie entsprechende Referenzsequenz ausführen kann; eine im Wesentlichen homologe Sequenz ist üblicherweise zu wenigstens ungeführ 70 Prozent sequenzidentisch mit der Referenzsequenz, üblicherweise zu wenigstens ungefähr 85 Prozent sequenzidentisch, vorzugsweise zu wenigstens ungefähr 95 Prozent sequenzidentisch und ganz besonders bevorzugt zu ungefähr 96, 97, 98 oder 99 Prozent sequenzidentisch mit der Referenzsequenz. In der Beschreibung, wo auf spezifische Nukleotidsequenzen und/oder Aminosäuresequenzen Bezug genommen wird, können solche Nukleotidsequenzen und/oder Aminosäuren vorzugsweise gegen im Wesentlichen homologe Sequenzen ausgetauscht werden.
Die Begriffe „Segregationssystem" und/oder „Partitionierungssystem" (hierin beide als „SEG" bezeichnet) sind hierbei gegeneinander austauschbar und werden dazu verwendet, jede beliebige, die Stabilität von Plasmiden verstärkende Funktion zu beschreiben, die eine Funktion dafür hat, die Häufigkeit einer erfolgreichen Übertragung eines Plasmids auf jede neu geteilte Bakterienzelle, im Vergleich zu der Häufigkeit der Übertragung eines entsprechenden Plasmids ohne ein solches SEG-System, zu erhöhen. SEG-Systeme schließen zum Beispiel equipartitionierende Systeme, „pair-site"-Partitionierungssysteme und den par-Locus von pSC101 ein. Der Begriff schließt sowohl natürlich vorkommende Nukleotidsequenzen, die für SEG-Systeme codieren, als auch Nukleotidsequenzen, die im Wesentlichen homolog zu den natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen sind und die die von den entsprechenden natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen gezeigte Funktion beibehalten, ein.
Der Begriff „detoxifiziert" ziert" wird hierin zur Beschreibung eines Toxins mit einer oder mehreren Punktmutation(en), die die Toxizität, im Vergleich zu einem entsprechenden Toxin ohne solche Punktmutationen, erheblich senken, verwendet
Der Begriff „im Hinblick auf eine Immunisierung effektiv", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Immunreaktion, die einem Probanden ein immunologisches Zellgedächtnis verleiht, mit dem Effekt, dass eine sekundäre Reaktion (gegen das gleiche oder ein ähnliches Toxin) durch eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften gekennzeichnet ist: eine kürzere Lag-Phase im Vergleich zu der Lag-Phase, die sich aus dem entsprechenden Aussetzen ohne die vorliegende Immunisierung ergibt; eine Produktion von Antikörpern, die länger andauert als die Produktion von Antikörpern bei einem entsprechenden Aussetzen ohne eine solche Immunisierung; eine Veränderung im Typ und in der Menge von Antikörpern, im Vergleich zu dem Typ und der Menge an Antikörpern, die bei einem solchen Aussetzen ohne die vorliegende Immunisierung produziert werden; eine Verschiebung in der an der Reaktion beteiligten Klasse, wobei IgG-Antikörper in höheren Konzentrationen auftreten und länger bestehen bleiben als IgM; eine erhöhte mittlere Affinität (Bindungskonstante) der Antikörper zu dem Antigen, im Vergleich zu der mittleren Affinität von Antikörpern gegen das Antigen bei einem Aussetzen ohne die vorliegende Immunisierung; und/oder andere in der Wissenschaft zur Charakterisierung einer sekundären Immunantwort bekannte Eigenschaften.
4. Kurze Beschreibung der Figuren
1A-1C: Genkarten von beispielhaften pGEN-Expressionsplasmiden (pGEN2, pGEN3 und pGEN4) der vorliegenden Erfindung.
2A-2D: Genkarten von beispielhaften, auf oriE1 basierenden Expressionsplasmiden (pJN72, pJN51, pJN10 und pJN12) der vorliegenden Erfindung.
3A-3H: Durchflusszytometriehistogramme der Fluoreszenz von GFP für CVD 908-htrA-tragende Expressionsvektoren mit dem post-segregationalen Killing-System hoksok.
4A-4D: Vollständige Nukleotidsequenz von pGEN2 (SEQ ID No. 1), die die Nukleotide 1-4196 umfasst.
5A-B: Partielle Nukleotidsequenz von pGEN3 (SEQ ID No. 2), die die Nukleotide 1201-2397 umfasst und die Sequenz von ori15A zeigt.
6A-C: Partielle Sequenz der Nukleotidsequenz von pGEN4 (SEQ ID No. 3), die die Nukleotide 1201-3848 umfasst und die Sequenz von ori101 zeigt.
7A-7E: Genkarten von beispielhaften, auf ori15A-basierenden pGEN-Expressionsplasmiden (pGEN91, pGEN111, pGEN121, pGEN193 und pGEN222) der vorliegenden Erfindung.
8A-C: Durchflusszytometriehistogramme der Fluoreszenz von GFP für die Expressionsplasmide pGEN91, pGEN111, pGEN121, pGEN193 und pGEN222.
5. Ausführliche Beschreibung
Bakterielle Vektor-Lebendimpfstoffe verwenden einen bakteriellen Lebendvektor zur Expression von Genen, die für schützende Antigene von bakteriellen, viralen oder parasitären Pathogenen codieren. Die bakteriellen schützenden Antigene sind in dem bakteriellen Lebendvektor vorzugsweise nicht nativ vorhanden, d.h. sie sind heterolog. Der bakterielle Vektor-Lebendimpfstoff wird einem Wirt verabreicht, wodurch die exprimierten Antigene dem Immunsystem des Wirts ausgesetzt werden und dadurch eine Immunreaktion von geeigneter Beschaffenheit auslösen, um so dem Wirt Immunität zu verleihen.
Um eine erhöhte Immunogenität zu erreichen, müssen die Plasmide, die solche schützenden Antigene exprimieren, stabilisiert werden. Den Erkenntnissen des Erfinders zufolge wird in keinem derzeit verwendeten auf S. typhi basierenden Plasmiderhaltungssystem der Vorteil von natürlich vorkommenden Partitionierungsmechanismen genutzt, die in anderen Stämmen bekanntermaßen die Stabilität von Vielkopie-Plasmiden verbessern.
Wir beschreiben ein nichtkatalytisches Plasmiderhaltungssystem zur Stabilisierung von Expressionsplasmiden, die für fremde Antigene in einem Vektor-Lebendimpfstoff aus einem S. typhi-Stamm codieren. Der S. typhi-Stamm kann CVD 908-htrA sein. Wir beschreiben Verbesserungen und/oder Optimierungen der Stabilisierung von Expressionsplasmiden durch die Verwendung von Plasmiderhaltungssystemen, die auf zwei voneinander unabhängigen Ebenen fungieren: (1) Autheben der alleinigen Abhängigkeit von katalytischen, balancierten Letalstabilisierungssystemen; und (2) Einschleusen eines Plasmid-Partitionierungssystems, das eine zufällige Segregation der Expressionsplasmide verhindert und dadurch die Vererbbarkeit und Stabilität derselben erhöht. Ein entscheidender Grund für die Verfolgung dieses speziellen Ansatzes ist, dass dieses Verfahren zur Verbesserung der Stabilisierung von Plasmiden keine weiteren Manipulationen des Lebendvektorstammes beinhaltet und daher die Immunogenität heterologer Antigene, die mit irgendeinem Lebendvektorstamm exprimiert werden, verbessern kann.
Das hierin beschriebene Plasmiderhaltungssystem verbessert die Stabilität von Vielkopie-Expressionsplasmiden in einem bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoff, wie beispielsweise CVD908-htrA.
Die natürlich vorkommende PSK-Funktion hok-sok aus dem Antibiotikaresistenzfaktor pR1, oder ein wesentliches Homologon davon, kann in Vielkopie-Expressionsplasmide eingeschleust werden. Das hok-sok-System ist ein Addiktionssystem von stillen Plasmiden, das auf antisense-RNA-Kontrollmechanismen beruht, die nur dann zur Synthese von Letalproteinen führen, wenn der Verlust des Plasmids eingetreten ist.
Wir beschreiben ferner ein Plasmiderhaltungssystem, das eine auf Komplementierung basierende PSK-Funktion umfasst, in der das chromosomale Gen ssb, das für das essentielle, nicht-katalytische, einzelsträngige Bindungsprotein (SSB), das für die DNA-Replikation erforderlich ist, codiert, spezifisch deletiert und in ein Vielkopie-Expressionsplasmid inseriert ist.
Wir beschreiben auch ein verbessertes Plasmiderhaltungssystem, das ein Expressionsplasmid umfasst, das für wenigstens einen SEG-Locus und wenigstens eine PSK-Funktion codiert.
5.1 Suizidvektoren
Heterologe Antigene können in Lebendvektorstämmen, wie beispielsweise CVD908-htrA, aus Genen, die entweder auf Plasmiden liegen oder in das Chromosom integriert sind, exprimiert werden. Eine Technik zum Integrieren dieser Gene in das Wirtsgenom beinhaltet die Verwendung von temperatursensitiven „Suizidvektoren", wie beispielsweise pIB307, der einen temperatursensitiven Replikationsursprung von pSC101 (ori101^ts) enthält. Wir beschreiben einen verbesserten Suizidvektor zur Verwendung in CVD908 und CVD908-htrA, die von pIB307 stammen, wodurch eine leichtere Konstruktion von Mutagenesekassetten zur Veränderung des Lebendvektorchromosoms möglich ist.
Ein Einbau dieser Suizidvektoren in das Chromosom mittels homologer Rekombination resultiert aus. der Temperaturinaktivierung des Replikationsproteins des Plasmids, RepA, einem Protein, das für die Funktion von ori101 essentiell ist. Eine spontane Auflösung der resultierenden instabilen, merodiploiden Intermediate wird mittels Gegenselektion des Verlusts des sacB-Gens, das in dem sich auflösenden Suizidvektor enthalten ist, nachgewiesen. Das in allen ausgeschnittenen Plasmiden enthaltene sacB-Gen codiert für das Enzym Levansucrase, das letal ist, wenn es im Zytoplasma von Darmbakterien, einschließlich S. typhi, die in der Gegenwart von Sucrose wachsen, exprimiert wird. Da sich auflösende Merodiploide durch Inkubation in Gegenwart von 10% Sucrose selektiert werden, werden die ausgeschnittenen Plasmide die Wirtsbakterien solange abtöten, bis sie spontan verlören gehen (cure).
Dieses System wurde erfolgreich zum Einbau einer Kanamycinresistenz-Kassette in den ☐aroC1019-Locus von CVD908 verwendet. Diese Versuche waren jedoch deshalb erfolgreich, weil das Gen, das in das Chromosom von S. typhi aktiviert wurde, für einen selektierbaren Arzneimittelresistenz-Marker codierte. Unter Verwenden dieser früheren Vektoren, war ein Austausch der Kanamycinresistenz-Kassette gegen einen nichtselektierbaren Marker erfolglos, weil, obwohl der eingeführte Marker als Merodiploid in das Chromosom eingebaut werden könnte, eine Auflösung des Merodiploids für einen Austausch des Arzneimittelresistenzgens niemals nachgewiesen werden konnte.
Wir beschreiben deshalb ein Verfahren zur Verwendung solcher Suizidvektoren zum Inaktivieren des ssb-Locus attenuierter Salmonella typhi-Stämme, wie beispielsweise CVD908-htrA.
Suizidvektoren können somit eine effiziente Aktivierung von Genen, die Proteine oder Peptide von Interesse, wie zum Beispiel heterologe Antigene, exprimieren, in dem Chromosom von S. typhi CVD908-htrA in zwei Stufen ermöglichen. Der vorliegende Erfinder schleuste zum Beispiel eine sacB-aph-Kassette in den ☐aroC1019-Locus ein, die dann mit Hilfe von Kanamycin selektiert wurde. Bei der Bildung von Generationen dieses S. typhi CVD908-htrA☐aroC1019::sacB-aph-Stamms wird ein nützlicher Intermediatstamm erzeugt, in dem theoretisch jedes Strukturgen durch Austausch des Markers effizient in den aroC-Locus inseriert werden kann. Da die Auflösung von Merodiploiden in Gegenwart von Sucrose zu einem Verlust des sacB-Gens führt, wird das sacB-Gen als Marker für eine Gegenselektion dafür verwendet, während des Passagierens der Merodiploide in Gegenwart von 10% Sucrose einen Austausch der sacB-aph-Kassette gegen die eingeführte Antigen-Kassette zu selektieren, um so eine lebensfähige Nachkommenschaft zu erzeugen. Dieser Intermediatstamm wurde zum effizienten Einbau der nichttoxischen Mutante LT-K63 des nichthitzebeständigen Enterotoxins von E. coli verwendet, wobei CVD908☐aroC1019::LT-K63 erzeugt wurde.
5.2 Plasmid-basierte Expression von heterologen Antigenen
Obwohl ein Einbau fremder Gene in das Chromosom den entsprechenden Sequenzen Stabilität verleiht, können die beteiligten genetischen Manipulationen schwierig sein und eine Abnahme der Kopienzahl des heterologen Gens führt oftmals zu einer Produktion von Mengen des heterologen Antigens, die nicht ausreichen, um eine optimale Immunreaktion zu gewährleisten.
Die Stabilität von Plasmiden ist hingegen ein kompliziertes Phänomen, das von mehreren Faktoren abhängt, die (1) die Kopienzahl des Plasmids; (2) die genau regulierte Expression von Genen, die in dem Plasmid enthalten sind; und (3) den selektiven Druck einschließen, um eine korrekte Segregation und Vererbbarkeit des Plasmids zu gewährleisten.
Um Stabilität zu gewährleisten, müssen Plasmide in einer regulierten Weise repliziert werden, damit so verhindert wird, dass ihre Kopienzahl auf letale Mengen ansteigt.
Des Weiteren müssen Plasmide während der Teilung eines wachsenden Bakteriums segregiert werden, damit gewährleistet ist, dass jede Tochterzelle wenigstens eine Kopie des Plasmids erhält. Die Segregation kann ein passiver, ein sich zufällig ereignender oder ein aktiver Prozess sein, der die Synthese von neuartigen Proteinen, die die Segregation und Vererbung des Plasmids unterstützen, beinhaltet. Eine erfolgreiche Vererbbarkeit zufällig segregierender Plasmide ist auf eine ausreichend hohe Kopienzahl zufällig verteilter Plasmide in einem sich teilenden Bakterium angewiesen, so dass die Vererbung von wenigstens einem Plasmid auf jede Tochterzelle gewährleistet ist.
Die üblicherweise verwendeten Plasmidklonierungsvektoren, einschließlich pBR322-Derivate mit mittlerer Kopienzahl und pUC-Plasmide mit hoher Kopienzahl, werden durch zufällige Segregation vererbt.
Eine aktive Segregation beinhaltet die Synthese von Proteinen, die an solche Plasmide binden sollen und ferner mit den Membranen von sich teilenden Bakterien koordinieren, so dass gewährleistet ist, dass jede Tochterzelle wenigstens eine Plasmidkopie erhält. Plasmide, die diese Systeme der aktiven Partitionierung verwenden, sind in der Regel Plasmide mit sehr kleiner Kopienzahl, wie beispielsweise der Sex-Faktor F von E. coli oder die Antibiotikaresistenz-Faktoren R, beispielsweise pR1 und pRK2.
Wir beschreiben die Verwendung natürlich vorkommender SFG-Funktionen zur Erhöhung der Vererbbarkeit von Vielkopie-Expressionsplasmiden, die ansonsten durch zufällige Segregation vererbt würden, um die Stabilität dieser Plasmide zu erhöhen.
Ebenso verwenden wir natürlich vorkommende Gensysteme, in denen Tochterzellen, bei denen die Vererbung eines Expressionsplasmides erfolglos war, getötet und aus der wachsenden Population entfernt werden, d.h. eine PFK-Funktion. Hierin wird der Einbau von mehr als einer Klasse an Plasmiderhaltungsfunktionen als ein Plasmiderhaltungssystem bezeichnet. Beispielsweise wird mit dem Einbau von sowohl einer SFG-Funktion, wie beispielsweise einem Partitionslocus, als auch einer PSK-Funktion in ein einziges Expressionsplasmid ein Plasmiderhaltungssystem erhalten.
Es sollte beachtet werden, dass ein Gen, das Resistenz gegen ein bakterielles Antibiotikum verleiht, wie beispielsweise das aph-Gen, das für die Resistenz gegen Kanamycin und Neomycin codiert, genauso als PFK-Funktion zu betrachten ist, wie das auf asd basierende, balancierte Letalsystem.
5.3 Balancierte Letalsysteme
Ein Verfahren, um die Vererbung von Expressionsplasmiden sicherzustellen, beinhaltet die Konstruktion eines PSK-Systems, oder eines wesentlichen Homologons davon, als balanciertes Letalsystem bezeichnet, für Plasmide, die heterologe Antigene exprimieren. In einem auf Plasmiden basierenden, balancierten Letalsystem exprimieren Plasmide, die im Zytoplasma des Bakteriums replizieren, ein entscheidendes Protein, das für das Wachstum und die Replikation des Bakteriums benötigt wird. Ein Verlust solcher Plasmide nimmt dem Bakterium die Fähigkeit, das entscheidende Protein zu exprimieren und bewirkt den Tod der Zelle.
Das asd-System wurde vor kurzem in einem Versuch zur Erhöhung der Stabilität von Plasmiden, die synthetische Peptide von Hepatitis B-Virus exprimieren, in attenuierte S. typhi-Impfstoffstämme eingeschleust.
Wenn jedoch die freiwilligen Probanden mit diesen Lebendvektorstämmen immunisiert wurden, wurde keine Immunreaktion auf das fremde Antigen nachgewiesen. Tatsächlich haben bis heute nur sehr wenige Berichte eine Immunreaktion auf die Plasmidbasierte Expression eines fremdes Antigens aus Plasmiden (stabilisierten oder anderen) nach der Impfung von Menschen mit einem attenuierten S. typhi-Lebendvektor belegt.
Obwohl in manchen Fällen eine übermäßige Attenuierung des Stammes selbst zu einer Fehlfunktion der Lebendvektorstämme führen kann, nimmt der Erfinder an, dass die derzeit verwendeten PSK-Funktionen für Plasmide weiteren Einschränkungen, insbesondere Einschränkungen infolge der Segregation und Einschränkungen infolge der katalytischen Aktivität unterliegen. Deshalb stellen wir verbesserte Expressionsplasmide mit verbesserten Segregationsfähigkeiten bereit, in denen wenigstens ein Partitionierungssystem zusammen mit wenigstens einem PSK-System eingebaut ist.
5.4 Einschränkungen infolge der Segregation
Eine Einschränkung der Plasmiderhaltungsfunktionen, wie beispielsweise der asd-Funktion (sowie der thyA-Funktion) ist, dass sie die Vererbbarkeit der in ihnen befindlichen Plasmide, die mit oder ohne asd-Funktion weiter zufällig segregieren, nicht verstärken. Wenn die in diesen befindlichen Expressionsplasmide, die asd-Gene tragen, nicht stabil vererbt werden können, werden sie deshalb, unabhängig von dem Bedarf des Bakteriums nach Asd, verloren gehen.
Die stabile Vererbung eines asd-Expressionsplasmids kann durch das Anzüchten von Plasmid-tragenden Stämmen in Gegenwart von DAP, das den selektiven Druck als Garantie dafür, dass alle lebensfähigen Bakterien das Expressionsplasmid enthalten, wegnimmt, bestimmt werden. Wenn ein gegebenes Plasmid instabil vererbt wird, wird es in hohen Anteilen aus den Bakterien verloren gehen und die plasmidlosen Bakterien werden in Abwesenheit von Wachstumssupplementen lysieren; das Gesamtergebnis dieses Effekts wird eine Population von Bakterien sein, die viel langsamer wachst als nicht veränderte Wildtyp-Stämme.
Die hierin beschriebenen Plasmide besitzen eine verbesserte Plasmidstabilität, da eine SFG-Funktion, wie beispielsweise ein Partitionslocus, oder ein wesentliches Homologon einer SFG-Funktion, in das Expressionsplasmid eingeschleust wurde, um so die Vererbbarkeit der Plasmide bei sich aktiv teilenden Bakterien zu verbessern. Die Partitionsloci, die in der Natur vorkommen, befinden sich auf den Virulenzplasmiden von S. typhimurium. Tinge und Curtiss, Journal of Bacteriology, 172:5266, 1990, berichteten, dass von den Virulenzplasmiden von S. typhimurium solche Partitionsloci gut konserviert waren und dass, wenn ein 3,9 kb großes Restriktionsfragment, das für diesen Locus codiert, in das Plasmid pACYC 184 mit geringer Kopienzahl (~ 15 Kopien pro Zelle) eingeschleust wurde, die beobachtete Plasmidstabilität nach 50 Generationen von 34% Plasmid-enthaltende Zellen auf 99% Plasmid-tragende Zellen zunahm. Die Nukleotidsequenz dieses Locus wurde später von Cerin und Hackett, Plasmid, 30:30, 1993 (GenBank-Zugangsnummer M97752) bestimmt.
5.5 Einschränkungen infolge der katalytischen Aktivität
Eine weitere potentielle Einschränkung einer Plasmidstabilisierungsfunktion, wie beispielsweise der asd-Funktion (sowie des thyA-Systems) ist dessen Abhängigkeit von einem Enzym mit katalytischer Aktivität. Angesichts dessen, dass eine Komplementierung mit nur einer einzigen Kopie des asd-Gens dazu ausreicht, die Autotrophie aufzuheben, ist nicht klar, warum alle Kopien eines Vielkopie-Plasmids stabil bleiben sollten, insbesondere, wenn diese für ein besonders problematisches, heterologes Antigen codieren, das das Wachstum des Bakteriums hemmt.
Obwohl Expressionsplasmide mit höheren Kopienzahlen gewünschte Mengen eines gegebenen heterologen Antigens in vitro exprimieren können, können diese Plasmide aufgrund der Toxizität ferner nicht in vivo mit der erwarteten Kopienanzahl stabilisiert werden und dürften tatsächlich mit viel geringeren Kopienzahlen vorliegen, die erwartungsgemäß jede beobachtete Immunreaktion, die für das heterologe Antigen spezifisch ist, reduzieren sollten. Die vorliegende Erfindung stellt daher entsprechend dauerhaft stabilisierte Plasmide mit geringer und mittlerer Kopienzahl für die Expression heterologer Antigene bereit.
5.6 Die nichtkatalytische ssb-PSK-Funktion
Die potentielle Einschränkung infolge katalytischer Aktivität, die mit balancierten Letalsystemen assoziiert ist, wird hierbei durch die Verwendung von Plasmiden, die das einzelsträngige Bindungsprotein (SSB) von S. typhi exprimieren, zur Transkomplementierung einer ansonsten letalen Mutation, die in dem chromosomalen ssb-Gen eingebaut ist, angegangen. Die Biochemie und die Rolle des SSB-Proteins von E. coli im Stoffwechsel sind rückblickend ausführlich bei Lohman et al., Annual Reviews in Biochemistry, 63:527, 1994 und Chase et al., Annual Reviews in Biochemistry, 55:103, 1986 zusammengefasst.
SSB ist ein nicht-katalytisches, 177 Aminosäuren langes Protein mit einem relativen Molekulargewicht von 19 kDa, das mit hoher Affinität an einzelsträngige DNA (ssDNA) bindet und eine wesentliche Rolle als akzessorisches Protein bei der Replikation, Rekombination und Reparatur von DNA spielt. Die biologisch relevante Form von SSB, die an der Bindung an ssDNA beteiligt ist, ist ein Tetramer, das auf zwei Arten an ssDNA bindet, die eng mit einem Durchschnitt von entweder 35 (SSB₃₅-Bindungsmodus) oder 65 Basen (SSB₆₅-Bindunsmodus) assoziiert sind. Die spezifischen Bedingungen, die den bevorzugten Bindungsmodus steuern, sind kompliziert und hängen von der Konzentration in der Umgebung vorhandener monovalenter oder divalenter Salze, dem pH und der Temperatur sowie der Menge an vorliegendem SSB-Protein ab. Bei gegebenen Bedingungen begünstigen hohe Konzentrationen an SSB den SSB₃₅-Bindungsmodus und niedrigere SSB-Konzentrationen den SSB₆₅-Modus. Es muss jedoch betont werden, dass die erforderliche Konformation von SSB in beiden Bindungsmodi ein Tetramer ist.
Das spontane Auftreten von temperatursensitiven Punktmutationen innerhalb des ssb-Gens wurde nun auf der biochemischen, der physiologischen und der Nukleotidebene charakterisiert; eine solche Mutante, ssb-1, enthält die Punktmutation His 55 bis Tyr und es wurde gefunden, dass sie für eine Assemblierung in Tetramere bei nicht-toleranten Temperaturen und bei den natürlich vorkommenden Expressionsmengen instabil ist. Diese mutanten Stämme zeigen temperatursensitive, letale Defekte bei der Replikation und Rekombination von DNA.
Die Häufigkeiten der Segregation von Plasmiden, die ssb tragen, das chromosomale ssb-Mutationen in E. coli-Bakterien komplementiert, wurden von Porter et al., Bio/Technology 8:47, 1990, untersucht. Sie beobachteten, dass in Versuchen, an denen Bioreaktoren beteiligt sind, die Segregationshäufigkeit in Plasmid-tragenden Stämmen, die in kontinuierlicher Kultur unter nicht-selektiven Bedingungen 150 Stunden lang angezüchtet wurden, 1 × 10^–7 betrug; diese Segregationshäufigkeit hing nicht von der Kopienzahl ab, da sowohl die pACYC184-Plasmide mit geringerer Kopienzahl als auch die pUC19-Plasmide mit sehr hoher Kopienzahl bei der gleichen Häufigkeit stabilisiert wurden. Es muss jedoch beachtet werden, dass die beteiligten Plasmide zusätzlich zu dem SSB-Protein nur einen Arzneimittelresistenz-Marker exprimierten.
Wir beschreiben ein verbessertes Plasmiderhaltungssystem, das einen Partitionslocus, wie beispielsweise den auf pSC101 vorhandenen, oder ein wesentliches Homologon eines solchen Partitionslocus, einschließt und auch ein aktives Partitionierungssystem, oder ein wesentliches Homologon davon, wie beispielsweise das oben für das Virulenzplasmid von S. typhimurium beschriebene, einschließen kann.
Die vorliegende Erfindung hebt die Abhängigkeit von katalytischen Enzymen zur Verleihung von Plasmidstabilität auf. Mutierte Allele, die ssb-1 ähneln, können in das Expressionsplasmid eingeschleust werden, um so Plasmide mit hoher Kopienzahl durch Überexpression von SSB1-gleichen Proteinen zu verstärken, um die erforderlichen biologisch aktiven Tetramere von SSB auszubilden. Eine PSK-Funktion, die ein Addiktionssystem von stillen Plasmiden umfasst, das auf antisense-RNA-Kontrollmechanismen, die nur dann letale Proteine synthetisieren, wenn ein Verlust der Plasmide eingetreten ist, basiert, kann ebenso verwendet werden.
5.7 Expressionsplasmide und vollständige Genkassetten
Wir beschreiben außerdem eine Reihe von Expressionsplasmiden, die hierin als pGEN-Plasmide bezeichnet werden. pGEN-Plasmide umfassen vollständige Genkassetten, die für die regulierte Expression eines heterologen Antigens, eines Replikationsursprungs und eines selektierbaren Markers zur Rückgewinnung des Plasmids codieren. Diese Reihe von Vektoren wurde speziell dafür konstruiert, zu testen, ob irgendein Plasmiderhaltungssystem die Stabilität von Plasmiden, zum Beispiel in einem Ansatz mit einem attenuierten S. typhi-Impfstoff, erhöhen kann.
Die Grundstruktur dieser Vektoren ist in 1 angegeben und die zusammengesetzte Gensequenz für den Vektor pGEN2 (SEQ ID No. 1) ist in 4 dargestellt; 5 und 6 zeigen entsprechend die spezifischen, zusammengesetzten Sequenzen für die Replikationsursprünge in pGEN 3 (SEQ ID No. 2) und pGEN4 (SEQ ID No. 3).
Es ist entscheidend zu beachten, dass die pGEN-Plasmide dazu ausgelegt sind, 3 unabhängig voneinander funktionierende Genkassetten zu umfassen. Diese Kassetten wurden so konstruiert, dass einzelne Komponenten, falls nötig, durch Austausch optimiert werden können. Neben den verschiedenen, hierin beschriebenen Plasmiderhaltungssystemen, können die Kassetten entsprechend andere viel versprechende Systeme, die derzeit existieren, oder die in Zukunft zur Verfügung stehen könnten, testen. Das (die) optimierte(n) Plasmid(e) kann (können) daran angepasst werden, relevante, schützende, heterologe Antigene in attenuierten Impfstoffstämmen für eine Imminisierung von Menschen zu exprimieren.
Die pGEN-Plasmide stellen eine Kassette zur regulierten Expression eines Testantigens bereit, das so funktionieren kann, dass, wenn die Induktion der Expression von Antigenen erhöht ist, der Stoffwechsel des Bakteriums belastet wird, und dies phänotypisch gesehen zu einer Instabilität des Plasmids führt, d.h. es wird ein selektiver Vorteil für alle diejenigen Bakterien geschaffen, die das störende Plasmid spontan verlieren können. Wir beschreiben daher ein hinsichtlich der Bedingungen instabiles Plasmid, das auf Stabilität untersucht werden kann, solange Plasmiderhaltungssysteme eingeschlossen sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Kassette zur regulierten Expression eines Testantigens, die in den pGEN-Plasmiden enthalten ist, den induzierbaren ompC-Promotor, oder ein wesentliches Homologon davon, der die Expression eines nachweisbaren Proteins, wie beispielsweise des codon-optimierten grünen fluoreszierenden Proteins (GFPuv, erhältlich bei Clontech), dessen Überexpression für E. coli und S. typhi toxisch ist, steuert.
Wir beschreiben auch eine Reihe von Plasmidreplikons mit Kopienzahlen, die von geringer Kopienzahl (d.h. 1 bis ~ 10, vorzugsweise ~ 5 Kopien pro Zelle) zu mittleren Kopienzahlen (d.h. ~ 11 bis ~ 25, vorzugsweise ~ 15 Kopienzahlen pro Zelle) zu hohen Kopienzahlen (d.h. ~ 26 bis ~ 100, vorzugsweise ~ 60 Kopienzahlen pro Zelle) variieren. Um dies zu erreichen, wurden Replikationsursprünge der genau charakterisierten Plasmide pSC101, pACYC184 und pAT153 unter Verwenden von Polymerasekettenreaktions-(PCR-) Techniken modifiziert, um so unabhängig voneinander funktionierende Plasmidreplikationskassetten zu erzeugen.
Wir beschreiben auch selektierbare Expressionsplasmide zur Verwendung in attenuierten S. typhi-Lebendvektoren. Diese Expressionsplasmide enthalten einen selektierbaren Marker, der letztlich gegen entweder einen nicht-arzneimittelresistenten Locus, wie beispielsweise ssb, oder ein Gen, das für einen verträglichen Arzneimittelresistenz-Marker, wie beispielsweise aph, das für eine Resistenz gegen die Aminoglykoside Kanamycin und Neomycin codiert, ausgetauscht werden kann.
Um dies zu erreichen, wurden die für eine Resistenz gegen Carbenicillin und Tetracyclin codierenden Resistenzkassetten, deren Transkription effizient von einem rrnB-T1T2-Terminator terminiert wird, konstruiert. Eine ausführliche Beschreibung der einzelnen Bestandteile, die die Expressions- und Replikationskassetten umfassen, ist im Folgenden angegeben.
Bestimmte Komponenten des Plasmiderhaltungssystems können systematisch in die Basisexpressionsreplikons inseriert werden, um so jeden individuellen oder synergistischen Einfluss von diesen Funktionen auf die Plasmidstabilität mit und ohne Selektion beurteilen zu können. Beispielsweise kann eine post-segregationale Killing-Funktion (z.B. der hok-sok-Locus) so als EcoRI-XbaI-Kassette inseriert werden, dass die Transkription flankierender Regionen von umgebenden Loci, wie beispielsweise des Antigens und der Selektionskassetten, divergent ist und die Transkriptionsebenen des Wildtyps, die die Letalität dieses Locus kontrollieren, nicht signifikant stören wird (7B, pGEN111).
In ähnlicher Weise kann der passive Pertitionslocus der Partition par als BamHI-BglII-Fragment zwischen den Replikationsursprung und Selektionskassetten inseriert werden (7C, pGEN121). Interessanterweise wurde in der Arbeit, die zu der vorliegenden Erfindung führte, beobachtet, dass die Orientierung des par-Locus die Synthese von GFPuv auf festem Medium verstärkt, wenn er in der natürlichen, in ori101 von pSC101 gefundenen Orientierung inseriert wurde; diese Orientierung wurde bei allen anderen Expressionsplasmiden angepasst.
Der aktive Partitionierungslocus ist vorzugsweise der parA-Locus, der als XhoI-EcoRI-Kassette aus dem gleichen pR1-Resistenzplasmid konstruiert wurde, aus dem hok-sok angepasst worden war. Um die natürlichen Transkriptionsmengen und die Regulation innerhalb von diesem Locus zu bewahren, wird die Kassette vorzugsweise so in einem Bereich der Expressionsplasmide angeordnet, dass die Transkription der flankierenden Regionen von parA aus fortschreitet (7D und 7E, pGEN193 und pGEN222).
5.8 Bestandteile der Antigenexpressions- und Replikationskassetten
5.8.1 Promotor
Fachleute werden verstehen, dass eine breite Vielfalt an in der Wissenschaft bekannten Komponenten in die Expressionskassetten eingebaut werden kann, einschließlich einer breiten Vielfalt an Transkriptionssignalen, wie beispielsweise Promotoren und anderen Sequenzen, die die Bindung von RNA-Polymerase an den Promotor regulieren. Die Funktionsweise von Promotoren ist im Stand der Technik allgemein bekannt und ist bei Doi, Regulation of Gene Expression, Modern Microbial. Genetics, Seite 15-39 (1991) beschrieben. Die folgende Beschreibung verwendet den ompC-Promotor lediglich als Beispiel und die Erfindung ist nicht darauf beschränkt.
Der Promotor ist vorzugsweise ein durch die Umgebung regulierbarer Promotor, der von einem biologisch relevanten Signal, wie beispielsweise der Osmolarität, kontrolliert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor der ompC-Promotor. Das ompC-Gen codiert für ein Porinprotein, das als Trimer in die äußere Membran einer Bakterienzelle eingeschleust wird. Die Expression und Kontrolle von ompC ist kompliziert und wurde kürzlich in beachtlicher Ausführlichkeit von Pratt et al., Molecular Microbiology, 20:911, 1996 und Egger et al., Genes to Cells, 2:167, 1997 rückblickend zusammengefasst.
Die Synthese des OmpC-Proteins wird auf der Transkriptionsebene zuletzt durch die Osmolarität der umliegenden Umgebung kontrolliert, so dass eine Zunahme der Osmolarität mit einer erhöhten Transkription von ompC einhergeht. Die Zunahme der Osmolarität bewirkt jedoch nicht direkt die erhöhte Transkription von ompC. Vielmehr erkennt das Bakterium die umliegende Osmolarität mit Hilfe eines aus zwei Komponenten bestehenden Signalübertragungssystems, das von dem ompB-Operon codiert wird. Dieses Operon besteht aus zwei Genen, die in der Reihenfolge envZ-ompR transkribiert werden. Das envZ-Gen codiert für ein 450 Aminosäuren (AS) langes Protein, das zwei Transmembranregionen enthält, wobei eine 118 AS lange, osmotisch sensitive Domäne in den periplasmatischen Raum reicht, und eine 270 AS lange, katalytische Domäne am C-Terminus in das Zytoplasma reicht; und in die innere Membran des Bakteriums (vielleicht als Dimer) eingeschleust wird.
Die C-terminale, katalytische Domäne besitzt sowohl Kinase- als auch Phosphatase-Aktivität, die beide von der Osmolarität bestimmt werden, so dass, wenn die Osmolarität zunimmt, die Kinase-Aktivität vorherrscht und wenn die Osmolarität abnimmt, die Phosphatase-Aktvität vorherrscht.
Die Kinase-Aktivität von EnvZ phosphoryliert den Asparaginsäurerest 55 des 239 AS langen, zytoplasmatischen Proteins OmpR, wodurch OmpR-P erzeugt wird. Dieses modifizierte Protein OmpR-P bindet an den ompC-Promotor und aktiviert die Transkription durch RNA-Polymerase; wenn die Osmolarität zunimmt, produziert die zunehmende Kinase-Aktivität von EnvZ somit höhere Mengen an OmpR-P und das wiederum führt zu einer höheren Transkription von ompC. OmpR-P bindet an eine Region auf dem ompC-Promotor, die die Basen –41 (bezogen auf die Stelle des Transkriptionsbeginns mit +1) bis –102 umspannt, wobei OmpR-P zunächst an die Basen –78 bis –102 bindet und anschließend weiter an die bis –41 reichenden Basen bindet, wenn die Konzentration von OmpR-P mit der Osmolarität zunimmt. Daneben wurde gezeigt, dass OmpR-P an eine AT-reiche, stromaufwärts gelegene Region, die bis zu der Base –405 zurückreicht, bindet, was die Transkription von ompC zusätzlich verstärkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umspannt das Fragment des ompC-Promotors von E. coli die Nukleotide +70 bis –389. Der Promotor kann die Transkription eines Antibiotikaresistenzgens, wie zum Beispiel des Kanamycinresistenzgens, in attenuierten S. ryphi-Stämmen auf eine für Osmose sensitive Weise steuern. Unsere Versuchen haben zum Beispiel gezeigt, dass sich die Resistenz gegen Kanamycin von 0 μg/ml auf > 800 μg/ml erhöhte, wenn die Konzentration von NaCl in dem flüssigen Wachstumsmedium von 0 mM auf 300 mM erhöht wurde.
5.8.2 Replikationsursprung
Aufgrund der verschienen Toxizitätsgrade, die mit verschiedenen heterologen Antigenen assoziiert sind (d.h. höhere Toxizität bei Antigenen, die von parasitären Organismen wie Plasmodium falciparum stammen gegenüber einer nahezu nicht vorhandenen Toxizität des Fragments C von Tetanus-Toxin), beschreiben wir Vektor-Lebendimpfstoffe, die solche Antigene vorzugsweise aus entweder Plasmiden mit geringer Kopienzahl oder aus. Plasmiden mit mittlerer Kopienzahl exprimieren. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Auswahl eines Replikationsursprungs von dem Toxizitätsgrad abhängen wird, d.h. die Kopienzahl sollte kleiner werden, wenn sich die Toxizität des Bakterienstammes erhöht. In einer bevorzugten Ausführungsform sind das (die) verwendeten Plasmiderhaltungssysteme in der Lage, Replikons mit geringer oder mittlerer Kopienzahl zu stabilisieren.
Der Replikationsursprung verleiht vorzugsweise eine durchschnittliche Kopienzahl, die zwischen ungefähr 2 und ungefähr 75 liegt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Replikationsursprung so ausgewählt, dass er eine durchschnittliche Kopienzahl verleiht, die zwischen ungefähr 5 und ungefähr 50 liegt. Besonders bevorzugt liegt sie in einem Bereich zwischen ungefähr 5 und ungefähr 30. Optimalerweise liegt sie in einem Bereich zwischen ungefähr 15 und ungefähr 20.
Der Replikationsursprung kann von pSC101, der eine Kopienzahl von ungefähr 5 Kopien pro Genäquivalent verleiht, stammen.
Der onE1-Locus bestimmt die Synthese eines 555 Basen großen Iranskripts, das RNA I genannt wird, und die Synthese eines 110 Basen großen antisense-RNA-Transkripts, das RNA II genannt wird. Wenn RNA I synthetisiert wird, nimmt die 5'-proximale Region des Iranskripts eine Stamm-Schleifen-Struktur an, die aus 3 Domänen besteht und mit einer komplementären Stamm-Schleifen-Struktur, die von RNA II gebildet wurde, hybridisieren kann, was zur Bildung einer doppelsträngigen RNA-RNA-Struktur führt, die einen Abbruch der Plasmidreplikation auslöst.
Wenn die Synthese von RNA I weiter fortschreitet und dabei das 555 Basen große Iranskript in voller Länge erzeugt, zerstört eine Neuordnung der Sekundärstruktur des Iranskripts die anfängliche, aus 3 Domänen gebildete Stamm-Schleifen-Struktur und es wird eine alternative Stamm-Schleifen-Konfiguration ausgebildet, die nicht mehr mit RNA II hybridisiert. Die Ausbildung dieser alternativen Struktur ermöglicht die Selbst-Hybridisierung des Iranskripts mit einem DNA-Strang des Plasmids, wodurch ein RNA-DNA-Komplex gebildet wird, der, um die Synthese des ersten DNA-Strangs des Plasmids und eine Plasmidreplikation auszulösen, mit endogener RNAse aufgebrochen wird.
Die Replikation des Plasmids wird somit durch die Synthese von RNA I kontrolliert, die eine Kaskade von strukturellen Konfigurationen durchlauft, die eine Initiierung der Replikation bewirken. Das notwendige Fortschreiten der RNA I-Faltungskaskade (und die daraus resultierende Initiierung der Replikation) wird durch die Konkurrenz der Domänen mit RNA II gestört. Dieser Mechanismus ist in Plasmiden, die entweder oriE1 oder ori15A enthalten, im Wesentlichen gleich.
Der Grund dafür, dass diese beiden Typen von Plasmiden nebeneinander in dem gleichen Bakterium vorliegen, beruht auf Sequenzdivergenz innerhalb der Region der Hybridisierung zwischen RNA I und RNA II, so dass die RNA II von ori15A nicht mit RNA I von oriE1 hybridisieren wird; diese Sequenzdivergenz beeinträchtigt auch die Stabilität des RNA I:RNA II-Hybrids, was die Unterschiede in den Kopiezahlen zwischen den Plasmiden, die die Replikationsursprünge oriE1 oder ori15A tragen, erklärt.
Der strukturelle Organisation der konstruierten Replikationsursprungskassetten für pSC101 (ori101; ~ 5 Kopien pro Genomäquivalent), pACYC184 (Derivat von ori15A; ~ 15 Kopien pro Genomäquivalent) und pAT153 (Derivat von oriE1; ~ 60 Kopien pro Genomäquivalent) sind hinsichtlich der Struktur und der Funktion analog.
5.8.3 Exprimiertes Protein oder Peptid
Wenn die Expressionskassette zum Screenen von Plasmiderhaltungssystemen verwendet wird, exprimiert sie vorzugsweise ein Protein oder Peptid ohne Stoffwechselaktivität. Ein bevorzugtes Protein ist das grün fluoreszierende Protein (GFP) der biolumineszierenden Qualle Aequoria victoria, ein 238 Aminosäuren langes Protein, das eine post-translationale Modifikation durchlauft, bei der 3 interne Aminosäuren (⁶⁵Ser-Tyr-Gly⁶⁷) an einer Zyklisierungs- und Oxidationsreaktion beteiligt sind. Das resultierende Fluorophor emittiert bei einer Bestrahlung mit langwelligem ultravioletten Licht bei einer Wellenlänge von 395 nm blau-grünes Licht bei einer maximalen Wellenlänge von 509 nm. Daneben ist die Fluoreszenzaktivität über einen weiten pH-Bereich von 5,5 bis 12 und bis zu einer Temperatur von 70°C bemerkenswert konstant.
Da GFP keine bekannte katalytische Aktivität besitzt, kann die Höhe der beobachteten Fluoreszenz direkt auf die Menge der Transkription des in jedem Bakterium enthaltenen gfp-Gens zurückgeführt werden. Die Expression des GFP-Proteins wurde nun in einer Vielzahl von sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen quantifiziert und erfordert keine weiteren Cofaktoren oder Enzyme von A. victoria. Die Bildung des Fluorophors hängt offensichtlich entweder von ubiquitären Enzymen ab oder ist ein autokatalytisches Ereignis.
Einzelne Bakterien, die GFP exprimieren, können mittels Durchflusszytometrie entweder allein oder in Makrophagen, Epithelzelllinien und infizierten Geweben von Lebewesen quantifiziert werden. Die Fluoreszenz von GFP ist absolut unabhängig von den Resten 2-232 des nichtdenaturierten Proteins. Die Fusion nicht miteinander verwandter, biologisch aktiver Proteindomänen mit dem N-Terminus von GFP hat jedoch zu Fusionsproteinen mit der erwarteten, heterologen, biologischen Aktivität geführt, die auch weiterhin fluoreszieren.
Mittels Sequenzanalyse (Clontech) wurde bestätigt, dass das hierin bevorzugte gfp-Allel (d.h. gfpuv) eine GFP-Mutante (GFPuv) exprimiert, das 3 Aminosäuresubstitutionen (die nicht das Fluorophor betreffen) enthält und die Fluoreszenz gegenüber dem Wildtyp-GFP um das 18-Fache erhöht.
Daneben wurden 5 selten verwendete Arginincodons für eine effiziente Expression von GFP in E. coli optimiert. Da ein Vergleich von Expressionsmengen verschiedener heterologer Proteine in E. coli und CVD908 eine äquivalente oder höhere Expression bei CVD908 ergeben hat, wurde erwartet, dass gfpuv effizient in CVD908-htrA funktionieren würde.
Eine Codierungssequenz wird in einer korrekten Beziehung zu einem Promotor inseriert, wobei der Promotor und die Codierungssequenz so miteinander verbunden sind, dass der Promotor die Expression der Codierungssequenz steuert, so dass das von diesemcodiertes Peptid oder Protein letztlich produziert wird. Es versteht sich von selbst, dass die Codierungssequenz auch in einer korrekten Beziehung mit jeder anderen regulatorischen Sequenz, die vorhanden sein kann, stehen muss.
5.8.4 Heterologe Antigene
Die Expressiortsplasmide exprimieren vorzugsweise ein Antigen, das einem Wirt präsentiert werden soll, um so eine Immunreaktion auszulösen, was dann zur Immunisierung und zum Schutz vor einer Erkrankung führt. Während Shiga-Toxine hierin als Beispiele für Antigene, die von den hierin offenbarten, als Impfstoff verwendeten Expressionsplasmiden in nützlicher Weise exprimiert werden, genannt werden, umfasst die Erfindung in ihrem breiten Umfang die Expression jedes beliebigen Antigens, das den bakteriellen Lebendvektor nicht zerstört und eine Immunantwort auslöst, wenn der bakterielle Lebendvektor, der das (die) Expressionsplasmid(e) enthält, einem Wirt, d.h. einem Menschen oder einem Tier, verabreicht wird.
Die hierin als Impfstoffe bereitgestellten Expressionsplasmide werden dazu verwendet, attenuierte Bakterienstämme, vorzugsweise Stämme zur Impfung von Menschen, genetisch zu transformieren und ganz besonders bevorzugt werden sie dazu verwendet, attenuierte S. typhi-Impfstoffstämme, wie beispielsweise CVD908htrA, zu transformieren, wobei sie vorzugsweise für entweder die Untereinheit B von Stx 2 oder ein genetisch detoxifiziertes Stx 2-Holotoxin codieren.
Eine Untergruppe von STEC, die oft als enterohämorrhagische E. coli (EHEC) bezeichnet wird, kann ernsthafte klinische Syndrome, die Hämorrhagische Colitis, Hämolytisch-Urämisches-Syndrom (HUS) und Thrombotisch-Thrombozytopenische Purpura (TTP) einschließen, in einem kleinen Teil infizierter Individuen verursachen und daneben bei den meisten anderen einen nicht-blutigen Durchfall verursachen.
Hämorrhagische Colitis ist durch übermäßigen, blutigen Durchfall, in der Regel ohne Fieber oder mit leichtem Fieber und einem relativen Mangel an fäkalen Leukozyten, wie sich anhand des Durchfallstuhls zeigen lässt, gekennzeichnet. Diese Eigenschaften unterscheiden eine hämorrhagische Colitis von einer durch Shigella verursachten Dysenterie, die sich üblicherweise durch einen geringen, blutigen und schleimigen Stuhlgang, dem hohes Fieber vorausgegangen ist, und eine große Anzahl an fäkalen Leukozyten, die unter dem Mikroskop sichtbar sind, kennzeichnet.
HUS, eine potentiell tödliche Erkrankung, die oft Kleinkinder, aber auch Individuen jeden Alters befallen kann, ist durch die Dreiergruppe aus mikroangiopathischer hämolytischer Anämie, Thrombozytopenie und Urämie gekennzeichnet. In Nordamerika ist HUS derzeit die häufigste Ursache für akutes Nierenversagen bei Säuglingen und Kleinkindern. Bei einer Studie von Siegler et al. in Utah von 1970-1994 mit 288 Patienten, die auf HUS nach Diarrhö behandelt wurden, trat eine ernsthafte Erkrankung (definiert als eine länger als 7 Tage andauernde Anurie, eine länger als 14 Tage andauernde Oligurie oder extrarenale, strukturelle Schäden, wie zum Beispiel Herzinfarkt) in 25% aller Fälle auf und war mit Kindern unter 2 Jahren assoziiert; ungefähr ein Drittel dieser ernsthaften Fälle von HUS führten zum Tod (5%) oder zu ernsthaften Folgeschäden, einschließlich Nierenerkrankung im Endstadium (5%) oder chronischem Hirnschaden (3-5%) und weniger ernsthaften chronischen Problemen, die Hypertonie, Proteinurie oder Azotämie umfassen.
TTP, die meistens Erwachsene befällt, ist durch neurologische Komplikationen, wie beispielsweise Herzinfarkt, neben Thrombozytopenie, hämolytische Anämie und Nierenerkrankungen gekennzeichnet.
Der bei weitem häufigste EHEC-Serotyp ist O157:H7. Dennoch verursachen auch andere EHEC-Serotypen, einschließlich O26:H11, O111:H8 und eine Reihe anderer, HUS und hämorrhagische Colitis. Mit HUS assoziierte EHEC-Stämme vervollkommnen ein oder mehrere Shiga-Toxine und tragen ein 60 MDa großes Virulenzplasmid. Daneben beherbergen die meisten auch eine chromosomale Pathogenitätsinsel (so genannte LEE) mit einer Gruppe von Genen, die für die Fähigkeit zur Anheftung und Beseitigung codieren. Es wird allgemein angenommen, dass durch EHEC vervollkommnete Shiga-Toxine eine Schlüsselrolle in der Pathogenese von hämorrhagischer Colitis und HUS spielen.
Wie im Folgenden ausführlich beschrieben wird, besteht die Shiga-Toxin-Familie aus zwei Gruppen von Toxinen, Stx1 (das im Wesentlichen mit dem von Shigella dysenteriae-Typ 1, dem Shiga-Bacillus, produzierten Cytotoxin/Neurotoxin/Enterotoxin identisch ist) und Stx2 (das sich immunologisch von Stx 1 unterscheidet und verschiedene miteinander verwandte Varianten aufweist). In den USA exprimiert die überwältigende Mehrheit von EHEC, die mit Fällen von HUS assoziiert sind, Stx2, entweder allein oder in Verbindung mit Stx1.
Das wichtigste Reservoir für EHEC-Infektionen sind Rinder. Die einzige und maßgeblichste Art der Übertragung von EHEC auf Menschen erfolgt durch den Verzehr von nicht garem, kontaminiertem Rindfleisch, am häufigsten Hackfleisch. Eine Reihe anderer Lebensmittelträger und andere Übertragungsarten sind dafür weniger häufig ursächlich. EHEC ist vor allem eines der schwierigen bakteriellen Darmpathogene, die, wie Shigella, durch direkten Kontakt oder durch Kontakt mit Infektionsträgern übertragen werden können.
Seitens der meisten Epidemiologen werden große Erwartungen und ein großer Optimismus darauf gesetzt, dass eine Bestrahlung von Fleisch, das in den USA verkauft wird, die Übertragung von EHEC auf Menschen drastisch einschränken wird, da somit die maßgeblichste Art der Übertragung eingeschränkt wird.
Dennoch werden bestimmte Risikogruppen, die anderen Übertragungsarten von EHEC ausgesetzt sind, nicht von dieser Maßnahme profitieren. Zum Beispiel erfolgt das Aussetzen der Mitarbeiter eines Schlachthofs gegen EHEC, was eine berufsbedingte Gefährdung darstellt, an einem Punkt in der Fleischverarbeitung, der vor dem Einsatz einer Bestrahlung liegt. Für solche speziellen Gruppen wie diese, für die das Risiko auch dann weiterhin besteht, wenn eine Bestrahlung von Fleisch alltäglich wird, können anti-EHEC-Impfstoffe nützlich sein. Die hierin beschriebenen Plasmide können zur Konstruktion von Impfstoffen gegen EHEC, die für die Prophylaxe von Infektionen (in Tierreservaten oder bei Menschen) und zur Prophylaxe der ernsthaften Komplikationen von EHEC-Infektionen nützlich sind, durch Stimulation der Neutralisierung von Shiga-Antitoxin verwendet werden.
Studien mit attenuierten Vibrio cholerae O1, die die Untereinheit B von Stx1 exprimieren, haben die Durchführbarkeit des Auslösens von neutralisierendem Shiga-Antitoxin durch mucosale Immunisierung mit Lebendvektoren gezeigt. Da jedoch nahezu alle mit HUS-Fällen in den USA assoziierte EHEC Stx2, allein oder in Verbindung mit Stx1, exprimieren, wird bevorzugt, dass ein Impfstoff zur Prophylaxe von ernsthaften Komplikationen einer EHEC-Infektion durch Auslösen von das Toxin neutralisierenden Antikörpern anti-Stx2 sowie Stx1 stimulieren sollte. In dem breiten Umfang der vorliegenden Erfindung ist auch das Bereitstellen eines stabilisierten Plasmidsystems zur Expression von Stx2-Antigenen, allein oder in Verbindung mit Stx1, in einem attenuierten S. typhi-Lebendvektor enthalten.
Andere Antigene, die in gemäß den hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren, in geeigneter Weise verabreicht werden können, schließen zum Beispiel diejenigen für Hepatitis B, Haemophilus influenzae Typ B, Hepatitis A, azelluläre Pertussis (_acP), Varicella, Rotavirus, Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) und Neisseria meningitidis (Meningokokken) ein. Siehe Ellis et al., Advances in Pharm., 39:393-423, 197.
Die von den Expressionsplasmiden codierten Antigene sind vorzugsweise Krebsimpfstoffe.
Die von diesen Plasmiden codierten Antigene können so konstruiert werden, dass sie Immunreaktionen gegen Autoantigene, B-Zellrezeptoren und/oder T-Zellrezeptoren provozieren, die an Autoimmunerkrankungen oder immunologischen Erkrankungen beteiligt sind. Wenn beispielsweise ungünstige Immunreaktionen gegen Körpergewebe oder Antigene aus der Umgebung gerichtet werden, können die erfindungsgemäßen Impfstoffe gegen die Autoantigene, B-Zellrezeptoren und/oder T-Zellrezeptoren immunisieren, um so die Reaktionen anzupassen und die Erkrankungen zu verbessern. Zum Beispiel können solche Techniken bei der Behandlung von Mysthenia gravis, Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose, Allergien und Asthma wirksam sein.
5.8.4.1 Die Shiga-Toxin-Familie
1903 berichtete Conradi als erster, dass S. dysenteriae 1 ein starkes Exotoxin produzierte. Da eine Injektion dieses Toxins zu einer Lähmung der hinteren Gliedmaßen eines Kaninchens führte, wurde es ursprünglich als Neurotoxin bezeichnet. Später wurde gezeigt, dass dieses Toxin, das Shiga-Toxin, für bestimmte Zellen in Gewebekulturen tödlich war (d.h. es war ein Zytotoxin). Vicari et al. und später Keusch et al. zeigten, dass es auch als Enterotoxin fungiert.
Heute erkennen Wissenschaftler die Existenz einer Familie von Shiga-Zytotoxinen an, die die Proteinsynthese hemmen, was den Tod der dafür anfälligen Zellen bewirkt. Viele Jahre nach der Offenbarung, dass solche Toxine neben dem ursprünglichen Shiga-Toxin, das von Shigella dysenteriae Typ 1 produziert wurde, von bestimmten E. coli-Stämmen produziert wurden, war die Nomenklatur dieser Familie von Toxinen verwirrend. Da erste Berichte die Aktivität dieser Toxine auf Vero-Zellen (eine aus Nierenepithelzellen von afrikanischen grünen Meerkatzen [African green monkey kidney epithelial cells] stammende Zelllinie) beschreiben, wurden sie von vielen Forschern Verotoxine genannt. Andere bezeichneten diese in E. coli exprimierten Toxine als Shiga-gleiche Toxine.
Die Proteintoxine werden hierin insgesamt als Shiga-Toxine (Stx) bezeichnet und die Gene, die für diese Toxine codieren, werden als stx bezeichnet, wobei die tief gestellten Indices die Gruppe und Variante angeben [d.h. stx₁ für das von E. coli produzierte Shiga-Toxin, das im Wesentlichen mit dem von Shigella dysenteriae Typ 1 (stx) identisch ist, und stx₂, stx_2c, stx_2d stx_2e für die sich hinsichtlich der Antigene unterscheidenden Gruppen miteinander verwandten Toxinen].
Die Struktur, Biochemie und Antigenität von Shiga-Toxinen sind allgemein bei Melton-Celsa et al., Escherichia coli 0157:H7 and Other Shiga Toxin producing E. coli Strains, 1998; Takeda, Bacterial and Virulence Factors in Disease, 1995; Gyles, Canadian J. of Microbiology, 38:734, 1992; und O'Brien et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 180:165, 1992, beschrieben.
Diese Shiga-Zytotoxine bestehen aus einer einzelnen, katalytischen Untereinheit A von ungeführ 32 kDa, die nicht-kovalent an eine pentamere Rezeptorbindungsdomäne von ungefähr 7,7 kDa großen B-Untereinheiten gebunden ist. Diese Untereinheiten werden von einem einzelnen Operon mit der Reihenfolge stxA-stxB codiert; die Transkription der stx- und stx₁-Operons wird sowohl in S. dysenteriae Typ 1 als auch bei E. coli durch Eisen reguliert, es wurden jedoch bislang keine aus der Umgebung stammenden Kontrollsignale für irgendein stx₂-Operon bestimmt. Keines dieser Toxine wird auf einem Plasmid codiert; vielmehr werden sie von Phagen (Stx1, Stx2, Stx2c und Stx2d) oder von Chromosomen (Stx, Stx2e) codiert.
Wie oben angegeben ist, sind alle Mitglieder der Shiga-Toxin-Familie cytolytische Toxine, die die Proteinsynthese in dafür empfänglichen Zellen hemmen, indem sie die Bindung der von Elongationsfaktor 1 abhängigen Aminoacyl-tRNA an Ribosome blockieren. Bei allen Toxinen, die bei humanen Infektionen identifiziert wurden, folgt eine Penetration dafür empfänglicher Zellen durch Endozytose der Bindung des Holotoxins an den notwendigen Glycolipid-Rezeptor Globotriaosylceramid (Gb₃) auf der Zeltoberfläche, wodurch das Toxin in den Golgi-Apparat und in das endoplasmatische Reticulum geleitet und anschließend in das Zytoplasma freigesetzt wird. Shiga-Toxine sind RNA-N-Glycosidasen, die ein einzelnes Adenin aus der 28S-RNA der eukaryotischen 60S-ribosomalen Untereinheit depurinieren, wodurch die 60S-Untereinheit inaktiviert wird und dies möglicherweise zum Tod der Zelle führt.
Es gibt sechs prototypische Mitglieder der Shiga-Toxin-Familie: Stx, Stx1, Stx2, Stx2c, Stx2d und Stx2e, die sich in immunologischer Hinsicht und in ihrer toxischen Aktivität voneinander unterscheiden. Es sind hierin signifikante Einzelheiten aufgeführt, die den Hintergrund für das Verständnis der Bedeutung von Punktmutationen, die nachfolgend erörtert werden und für genetisch detoxifizierte Holotoxine erforderlich sind, bereitstellen.
Die Mitglieder der Shiga-Toxin-Familie unterscheiden sich auf 3 grundlegende Arten voneinander, wie vor kurzem von Melton-Celsa et al., Escherichia coli O157:H7 and Other Shiga toxin-producing E. coli strains, 1998 zusammengefasst wurde.

(1) Immunologisch: Die Shiga-Toxin-Familie besteht aus 2 Serogruppen, Stx/Stx1 und Stx2; Antiseren, die gegen Stx/Stx1 gerichtet sind, neutralisieren nicht die Mitglieder der Stx2-Serogruppe, wie mit dem Verozellzytotoxizitätstest bestimmt wurde.
(2) Strukturell: Stx und Stx1 sind im Wesentlichen identisch, unterscheiden sich in einer einzigen Aminosäure an der Position 45 der reifen Untereinheit A und die Kristallstruktur des Stx-Holotoxins wurde gelöst. Der Prototyp Stx2 ist nur 55% homolog zu den Resten der reifen Untereinheit A von Stx/Stx1 und 57% homolog zu der reifen Untereinheit B, was erklärt, warum die gegen Stx/Stx1 gerichteten Antiseren nicht die Mitglieder der Stx2-Gruppe neutralisieren. In der Stx2-Gruppe ist Stx2e am weitesten entfernt verwandt und teilt 93% Aminosäurehomologie mit der reifen Untereinheit A von Stx2 und 84% Homologie mit der reifen Untereinheit B; Stx2c und Stx2d sind Stx2 sehr ähnlich und teilen 99-100% Homologie mit den Resten der reifen Untereinheit A und 97% Homologie mit den Resten der reifen Untereinheit B.
(3) Zytotoxizität: Stx2 ist eines der am meisten letalen Shiga-Toxine mit einer in Mäuse intraperitoneal injizierten LD₅₀ von 0,5-2 ng. Die LD₅₀ bei Stx1 und Stx2e beträgt 200-400 ng und 1-5 ng bei Stx2d; Stx2d ist jedoch dahingehend ungewöhnlich, dass dieses Toxin durch die Darmschleimhaut von Mäusen aktiviert werden kann, wobei die Toxizität des Toxins zunimmt und dadurch die LD₅₀ auf 0,5 ng sinkt.

5.8.5 Ortsspezifische Mutagenese von Shiga-Toxinen
Wir beschreiben ein genetisch detoxifiziertes Shiga-Toxin. Die Detoxifizierung wird von einer ortsspezifischen Mutagenese begleitet, die zwei definierte und genau voneinander abgegrenzte Punktmutationen, die entscheidende Reste in der katalytischen Stelle der Untereinheit A verändern, einführt. Zwei weitere definierte und genau voneinander abgegrenzte Punktmutationen werden in die Untereinheit B eingeführt, um die entscheidenden Reste in der primären Bindungsstelle (d.h. SITE I), die innerhalb der von den benachbarten Untereinheiten B des pentameren Holotoxinrings gebildeten Spalte liegt, zu verändern.
Es wurden bereits Versuche durchgeführt, um die Bindungsstelle SITE II mit geringerer Affinität zu verändern. Diese Bindungsstelle wurde jedoch nur aus Untersuchungen mit Hilfe von Molekularmodellierung identifiziert und wird weitgehend nicht Untersuchungen der Mutation gestützt, die eine Bindung des Gb₃-Rezeptors an SITE I befürworten. Selbst wenn SITE II eine alternative Bindungsstelle mit geringer Affinität ist, die einen Zugang unseres mutanten Holotoxins zu dafür empfänglichen Zellen zulässt, kann die Inaktivierung der katalytischen Domäne dennoch den Zelltod verhindern.

Auf der Basis von Aminosäuresequenz-Alignments, Untersuchungen der Röntgenstrahlkristallographie und Untersuchungen mit Hilfe von Molekularmodellierung wurden essentielle Aminosäuren, die die aktive Stelle in der katalytischen Untereinheit A von Stx umfassen, sowie diejenigen Reste, die die Bindung von SITE I mit dem Pentamer der Untereinheit B von Stx/Stx1 umfassen, identifiziert. Die Schlussfolgerung des Erfinders geht dahin, dass die für die aktive Stelle essentiellen Aminosäuren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Tyr 77, Tyr 114, Glu 167, Arg 170 und Trp 203. Die Reste, die vermutlich für die Bindung des Rezeptors an die von den benachbarten Untereinheiten B gebildeten Spalte erforderlich sind, schließen Lys 13, Asp 16, Asp 17, Asp 18, Thr 21, Glu 28, Phe 30, Gly 60 und Glu 65 ein. Diese vorhergesagten Orte stimmen mit Untersuchungen der Funktionen und in-vivo-Versuchen unter Verwenden definierter Einzel- und Doppelmutationen innerhalb einzelner Domänen des Holotoxins, die mittels ortsspezifischer Mutagenese eingeschleust wurden, überein. Eine Zusammensetzung solcher Mutationen ist in Tabelle 1 angegeben. Auf der Basis von diesen Daten und kristallographischen Vorhersagen wird die Bereitstellung von Expressionsplasmiden, die für Shiga-Toxine codieren, welche zwei spezifische Gruppen von Punktmutationen innerhalb von sowohl der Untereinheit A als auch der Untereinheit B aufweisen, zur Erzeugung nicht-toxischer, mutanter Stx2-Holotoxine für eine Verwendung als Impfstoff, zum Beispiel mittels einer Expression in attenuierten S. typhi-Lebendvektoren wie beispielsweise CVD908htrA, von der weit reichenden praktischen Ausführbarkeit der Erfindung erfasst. Tabelle 1. Untersuchungen der ortsspezifischen Mutagenese

Untereinheit	Toxin	Mutation	Abnahme der Zytotoxi-zität	Abnahme der Letalität	neutralisierende Antikörper
A	Stx1	Leu201 → Val + von Resten 202-213	keine Zytotoxizität	-	-
	Stx1	Glu167 → Asp	10³	-	-
	Stx1	Arg170 → Leu	10³	-	-
	Stx2	Glul67 → Asp	10³	-	-
	Stx2e	Glu167 → Asp	10⁴	-	-
	Stx2e	Arg170 → Lys	10	-	-
	Stx2e	Glu167 → Asp Arg170 → Lys	10⁴
	Stx2e	Glu167 → Gin	10⁶	10⁴	Y
B	Stx	Asp 16 → His + Asp17 → His	keine Zytotoxizität	-	-
	Stx	Arg33 → Cys	10⁸		-
	Stx	Gly60 → Asp	10⁶		-
	Stx1	Phe30 → Ala	10⁵	10	Y
	Stx2	Ala42 → Thr	10³-10⁴	Y	Y
	Stx2	Gly59 → Asp	10³-10⁴	Y	Y

5.9 Pharmazeutische Formulierungen
Es wird in Erwägung gezogen, die hierin beschriebenen bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoffe zur Verwendung bei der Impfung von Individuen, vorzugsweise Menschen, in pharmazeutischen Formulierungen zu verabreichen. Solche pharmazeutischen Formulierungen können pharmazeutisch wirksame Träger und gegebenenfalls andere therapeutische Bestandteile, wie zum Beispiel verschiedene, im Stand der Technik bekannte Hilfsstoffe, umfassen.
Der Träger oder die Träger müssen dahingehend pharmazeutisch verträglich sein, dass sie mit den therapeutischen Bestandteilen kompatibel sind und den Empfänger derselben nicht übermäßig schädigen. Der therapeutische Bestandteil oder die therapeutischen Bestandteile wird (werden) in einer Menge und Häufigkeit bereitgestellt, die dazu erforderlich ist, den gewünschten immunologischen Effekt zu erreichen.
Die Verabreichungsart und die Dosierungsformen werden die therapeutischen Mengen der Verbindungen, die für die Anwendung der Impfungen gewünscht und wirksam sind, beeinflussen. Die bakteriellen Vektor-Lebendmaterialien werden in einer Menge verabreicht, die eine Immunreaktion dadurch auslösen kann, dass sie effektiv darin ist, die Immunreaktion des Patienten auf das exprimierte, mutante Holotoxin oder auf ein anderes gewünschtes heterologes Antigen oder andere gewünschte heterologe Antigene zu erhöhen. Eine im Hinblick auf die Immunisierung wirksame Menge ist eine Menge, die ein erhöhtes Vermögen. zur Prophylaxe, Verzögerung oder Senkung der Ernsthaftigkeit bei der Entstehung einer Erkrankung verleiht, wenn sie mit dem entsprechenden Vermögen ohne eine solche Immunisierung verglichen wird. Ein Fachmann wird durchaus verstehen, dass die Menge, die auf den Faktoren, wie beispielsweise dem Gewicht und dem Gesundheitszustand des Empfängers, der Art des zu exprimierenden Proteins oder Peptids, der Art des zu bekämpfenden, infizierenden Organismus und der Art der Verabreichung und der Art der Zusammensetzungen basiert, variieren wird.
Die Verabreichungsarten können die Verwendung irgendeines geeigneten Mittels und/oder Verfahrens zur Verabreichung der bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoffe an eine Körperstelle des Wirtslebewesens, an dem die bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoffe in immunstimulierender Hinsicht effektiv sind, umfassen.
Verabreichungsarten können, ohne darauf beschränkt zu sein, parenterale Verabreichungsverfahren, wie beispielsweise subcutane (SC) Injektion, intravenöse (IV) Injektion, transdermale, intramuskuläre (IM), intradermale (ID), sowie nicht-parenterale, z.B. orale, nasale, intravaginale, pulmonale, ophtalmische und/oder rektale Verabreichung einschließen.
Der Dosisanteil und geeignete Dosierungsformen für die bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoffzusammensetzungen können leicht von Fachleuten ohne übermäßige Versuchsdurchführungen, mit Hilfe herkömmlicher Methoden zur Bestimmung der Antikörpertiter und herkömmlicher Protokolle zur biologischen Wirksamkeit/Biokompatibilität bestimmt werden. Neben anderen Dingen hängen der Dosisanteil und geeignete Dosierungsformen von dem speziell verwendeten Antigen, der gewünschten therapeutischen Wirkung und der gewünschten Zeitspanne für die Bioaktivität ab.
Die bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoffe können einem Wirtslebewesen in der Regel mit beliebigen anderen geeigneten, pharmazeutischen oder physiologischen Wirkstoffen, z.B. antigenen und/oder biologisch aktiven Substanzen verabreicht werden.
Die Formulierungen können beispielsweise als diskrete Einheiten, wie zum Beispiel Kapseln, Oblatenkapseln, Tabletten, Pastillen, wobei jedes eine vorher bestimmte Menge der Vektorübertragungsstruktur enthält; oder als Suspension zubereitet werden.
6. Beispiele
Eine isogene Reihe von Expressionsplasmiden, die aus einzelnen Kassetten bestehen, wurde zur Verwendung in bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoffen, wie beispielsweise E. coli und Salmonella, konstruiert. Mit Ausnahme der ribosomalen Bindungsstellen (RBS), sind die entscheidenden genetischen Loci, die die Initiierung und Terminierung der Transkription und Plasmidreplikation kontrollieren oder die für die exprimierten Proteine codieren, in definierten Restriktionsfragmenten, wie beispielsweise mit dem repräsentativen Plasmid-Diagramm von pGEN2 dargestellt wird, das in 1A zu sehen ist, enthalten. Zunächst wird die Basisstruktur dieser Expressionsplasmide herausgestellt und dann werden die Daten, die die Funktion eines jeden Locus innerhalb des attenuierten Impfstoffstamms CVD908-htrA angeben, zusammengefasst.
6.1 pGEN-Struktur
Die Transkription eines beliebigen heterologen Antigens, das in CVD908-htrA exprimiert werden soll, wird in erster Linie von einem induzierbaren Promotor, der auf einer EcoRI – BglII-Kassette enthalten ist, kontrolliert. Da die Expressionsplasmide zu Beginn mit pTETnir15 modelliert wurden, trugen frühe Versionen den anaerob aktivierten Promotor nir15 (P_nir15). Dieser Promotor wurde jedoch gegen einen strenger regulierten, osmotisch kontrollierten Promotor P_ompC ausgetauscht, der leicht in vivo durch Variieren der Konzentration von NaCl manipuliert werden kann.
Heterologe Antigene sind auf einer BglII – AvrII-Kassette enthalten, die von optimierten RBS an dem 5'-proximalen Ende und einem Transkriptionsterminator trpA am 3'-distalen Ende dieser Kassette flankiert wird. Der Replikationsursprung für diese Expressionsplasmide wurde als AvrII – BglII-Kassette konstruiert und wird vor einer durchlesenden Transkription, die aus flankierenden Regionen stammt, geschützt. Diese Kassetten tragen ein extrem effizientes Derivat des Transkriptionsterminators T1T2 an einem Terminus und den Transkriptionsterminator trpA von der heterologen Antigenkassette an dem entgegen gesetzten Ende der Replikationskassette.
Die flankierenden BglII- und SpeI-Orte (siehe 2) zwischen der Replikationskassette und der Selektionskassette sollen eine Plasmidstabilisierungsfunktion, wie beispielsweise denpar-Locus von pSC101, inserieren. Die in den Plasmiden enthaltenen Selektionskassetten sind innerhalb der SpeI – XbaI-Kassetten enthalten und können zum Beispiel zum Codieren der Resistenz gegen Carbenicillin (des bla-Gens) oder der Resistenz gegen Tetracyclin (des tetA-Gens, siehe 1) verwendet werden.
Die Arzneimittelresistenzkassette kann gegen das ssb-Gen, das für das essentielle, einzelsträngige Bindungsprotein von Salmonella typhi CVD908-htrA codiert, ausgetauscht werden.
Die flankierenden XbaI- und EcoRI-Stellen zwischen der Selektionskassette und P_ompC sollen weitere Stabilisierungsfunktionen, einschließlich eines PSK-Locus, wie beispielsweise hok-sok (siehe 1 und 2), oder eine weitere Partitionsfunktion, wie beispielsweise den parA-Locus von pR1 (siehe 7) inserieren.
6.2 Modifizierter ompC-Promotor
Es war vorgesehen, dass jeder Promotor, der die Transkription eines heterologen Gens kontrolliert, für ein aus der Umgebung stammendes Signal mit biologischer Relevanz verantwortlich war. Für die hierin beschriebenen Expressionsplasmide wurde eine ompC-Promotorkassette (PompC) von E. coli verwendet, die durch zunehmende Osmolarität induziert wird. Eine Konstruktion dieser Kassette basierte auf der offen gelegten Sequenz von P_ompC, die von Norioka et al. (Norioka et al., 1986) offenbart wurde, und wurde unter Verwenden synthetischer Primer zur Erzeugung einer 459 bp langen EcoRI-Bg/II-Kassette, in der die natürliche RBS entfernt worden war, durchgeführt.
Um zu bestätigen, dass dieser Promotor in CVD908-htrA osmotisch kontrolliert war, wurde ein Derivat von pTETnir 15 konstruiert, in dem P_nir15 – toxC gegen eine Kassette, die aus der von P_ompC gesteuerten Expression einer promotorlosen aphA2-Kassette, die Resistenz gegen Kanamycin verleiht, bestand, ausgetauscht. Dieses Plasmid, als pKompC bezeichnet, wurde mittels Elektroporation in CVD908-htrA eingeschleust, und die Empfänger auf eine Resistenz gegen Kanamycin in LG-Medium gescreent. Die osmotisch regulierte Expression von aph-2 wurde bestimmt, indem CVD908-htrA(pKompC) in 50 ml supplementiertem Nährmedium (NB), das von 0 auf 300 μg/ml ansteigende Konzentrationen an Kanamycin enthielt, angeimpft wurden; eine parallele Gruppe von Kulturen wurde mit den gleichen Bereichen von zugegebenem Kanamycin angesetzt, das jedoch auch 10% Sucrose zur Induktion von P_ompC enthielt. Die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und die OD₆₀₀ gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2, Versuch 1 angegeben.

Tabelle 2 zeigt die Induktion des Promotors P_ompC, der die Expression der Resistenz gegen Kanamycin kontrolliert, durch die Osmolarität in dem attenuierten S. typhi-Lebendvektor CVD908-htrA. Tabelle 2

Versuch 1¹			Versuch 2²
Konzentration von Kanamycin (μg/ml)	Geringe Osmolarität (OD₆₀₀)	10% Sucrose (OD₆₀₀)	Konzentration von Kanamycin /ml (μg/ml)	Geringe Osmolarität (OD₆₀₀)	300 mM NaCl (OD₆₀₀)
0	0,92	0,35	0	0,95	1,04
50	0,13	0,35	200	0,04	0,99
100	0,07	0,31	400	0,02	0,96
200	0,03	0,21	600	0,01	0,92
300	0,02	0,19	800	0,01	0,92

Eine Kultur von CVD908-htrA(pKompC) wurde in LB-Nährmedium, das mit 0,0001% (w/v) 2,3-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und 50 μg/ml Kanamycin supplementiert war, angesetzt und 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Diese Ausgangskultur wurde dann 1:10 in frischem Medium verdünnt und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert, um eine Animpfkultur exponentiell wachsender Bakterien bereitzustellen. 50 μl dieser Kultur wurden dann in Kulturen von 50 ml Nährmedium (NB), das wie oben mit DHB supplementiert war, jedoch ansteigende Konzentrationen von Kanamycin aufwies, angeimpft; eine parallele Gruppe von Kulturen wurde mit den gleichen Bereichen an dazugegebenem Kanamycin angesetzt, enthielt jedoch zusätzlich 10% Sucrose, um hoffentlich P_ompC zu induzieren. Die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und die OD₆₀₀ gemessen.
² Kultur von CVD908-htrA(pKompC) in supplementiertem NB-Nährmedium und Kanamycin wurde 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert, 1:10 in frischem Medium verdünnt und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert, um eine Animpfkultur exponentiell wachsender Bakterien bereitzustellen. 100 μl-Aliquots aus dieser Kultur wurden dann in Kulturen von 50 ml NB-Nährmedium, das von 200 auf 800 μg/ml ansteigende Konzentrationen von Kanamycin enthielt, angeimpft; eine parallele Gruppe von Kulturen, die 300 mM NaCl enthielten, wurde angesetzt und alle Kulturen wurden 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert und die OD₆₀₀ gemessen.
Trotz des selektiven Drucks durch die Verwendung von Kanamycin, übte die Gegenwart von 10% Sucrose einen inhibitorischen Effekt auf das Wachstum von CVD908-htrA(pKompC) aus. Die Ergebnisse legen jedoch nahe, dass P_ompC von E. coli osmotisch kontrolliert war, wenn er die Expression des aph-2-Gens in CVD908-htrA(pKompC) steuerte. Um dies zu bestätigen, wurde CVD908-htrA(JKompC) in 50 ml supplementierter NB-Nährmedium, das von 200 auf 800 μg/ml ansteigende Konzentrationen an Kanamycin enthielt, angeimpft; eine parallele Gruppe, die erneut 300 mM NaCl enthielt, wurde angesetzt, um P_ompC zu induzieren. Die Kulturen wurden 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 2, Versuch 2 angegeben. Es hat sich bestätigt, dass die durch P_ompC gesteuerte Expression des aphA-2-Gens in CVD908-htrA eine Resistenz gegen Kanamycin in Mengen von bis zu 800 μg/ml in einer durch Osmolarität regulierten Weise verleiht.
Die aph-Genkassette wurde dann gegen eine 756 bp große BglII – NheI-Kassette ausgetauscht, die das für GFPuv codierende gfpuv-Allel enthielt. Während des visuellen Screenings der mit ultraviolettem Licht durchleuchteten E. coli-Kolonien wurde eine sehr hell fluoreszierende Kolonie und eine andere beispielhafte, fluoreszierende Kolonie zur weiteren Untersuchung ausgesucht und diese entsprechend Klon 1 und Klon 3 genannt wurden. Nach der Reinigung der beteiligten Plasmide wurde bestimmt, dass Klon 1 ein Plasmid enthielt, dass nicht länger die BglII-Stellen trug, die P_ompC und gfpuv voneinander abgrenzen, wohingegen Klon 3 die erwartete BglII-Stelle trug. Wir untersuchten die Induktion der Expression von GFP, wenn die Klone 1 und 3 auf Nähragar in An- oder Abwesenheit von NaCl angezüchtet wurden und bestimmten durch optische Untersuchung, dass Klon 3 eine nur sehr geringe Fluoreszenz zeigte, wenn er auf NaCl-haltigem Nähragar angezüchtet wurde, jedoch hell fluoreszierte, wenn er auf 300 mM NaCl enthaltendem Nähragar ausplattiert wurde (Daten sind nicht gezeigt). Klon 1 wies jedoch eine höhere Background- Fluoreszenz auf, wenn er nicht induziert wurde, fluoreszierte jedoch intensiv, wenn er mit 300 mM NaCl induziert wurde. Um die Mutationen in dem gfpuv-Gen, die die Fluoreszenz beeinträchtigen könnten, zu bestimmen, tauschten wir P_ompC von Klon 1 gegen P_ompC von Klon 3 aus und bestätigten so die erwartete Abnahme der Fluoreszenz, wie sie mittels Durchleuchtung bestimmt wurde (Daten sind nicht gezeigt). Wir schlossen daher, dass die Unterschiede in der beobachteten Fluoreszenz von zwei genetisch verschiedenen Versionen des P_ompC-Promotors, die wir P_omp1 (höhere Transkriptionsmengen bei geringerer osmotischer Kontrolle) und P_ompC3 (mäßige Transkriptionsmengen bei einer osmotischen Kontrolle, die derjenigen, die bei der oben beschriebenen P_ompC – aph-Kassette beobachtet wurde, ähnelte) nannten, kontrolliert wurden; wir nannten die Plasmide, die diese Expressionskassetten enthielten, entsprechend pGFPompC1 und pGFPompC3.
Um die Unterschiede in der induzierten und nicht-induzierten Expression von gfpuv, die von P_ompC1 und P_ompC3 kontrolliert wurden, zu quantifizieren, wurde die Synthese von GFPuv in E. coli DH5α und S. typhi CVD 908-htrA mittels Durchflusszytometrie überwacht. Diese wirkungsvolle Methode besitzt den einzigartigen Vorteil, der eine schnelle Messung der Expression von GFPuv in großen Anzahlen von einzelnen Bakterien sowie eine exakte Bestimmung der mittleren Fluoreszenzintensität durch die Synthese von GFPuv in jeder der analysiertem Bakterienpopulationen zulässt. Um dies zu erreichen, wurden pGFPompC1 und pGFPompC3 mittels Elektroporation eingeschleust und die Kolonien auf supplementiertem 1X LB-Agar, der 100 μg/ml Carbenicillin enthielt, nachdem sie 48 Stunden lang bei 30°C angezüchtet worden waren, isoliert. Die isolierten Kolonien wurden sodann angezüchtet und die Kulturen als Master Stocks (Ausgangsstock) schockgefroren. Anschließend wurden frische Kolonien in entweder supplementiertem Nährmedium oder in supplementiertem Nährmedium, das 150 mM NaCl enthielt, angeimpft und 24 Stunden lang bei 37°C mit 250 rpm angezüchtet; die Unterschiede in der OD₆₀₀ bei jeder Kultur betrugen nie mehr als 0,07. Die Induktion der Expression von gfpuv, die von P_ompC1 und P_ompC3 kontrolliert wurde, wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3 zeigt einen Vergleich der Induktion von P_ompC1 und P_ompC3, die die Expression von GFPuv kontrollieren, in den Wirtsstämmen E. coli DH5α und CVD 908-htrA.¹ Tabelle 3

Stamm	Geringe Osmolarität (OD₆₀₀)	Mittlere Fluoreszenz-intensität	150 mM NaCl (OD₆₀₀)	Mittlere Fluoreszenzintensität	Induktions-verhältnis²
DH5α	0,61	0,28	0,95	0,29	NA³
DH5α (pGFPompC1)	0,56	4,45	0,72	7,69	1,7
DH5α (pGFPompC3)	0,58	1,77	0,73	4,21	2,4
CVD 908-htrA	0,58	0,27	0,65	0,26	NA
CVD 908-htrA (pGFPompC1)	0,60	5,37	0,54	23,4	4,4
CVD 908-htrA (pGFPompC3)	0,54	2,56	0,53	17,1	6,7

¹Alle Stämme wurden aus den eingefrorenen Master Stocks aus 2X LB-Agar, der mit DHB und 50 μg/ml Carbenicillin supplementiert war, ausgestrichen und 36 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die isolierte Kolonien wurden in einem Pool in 300 μl NB-Nährmedium, das mit DHB und Carbenicillin supplementiert war, gesammelt und 25 μl davon in 25 ml supplementiertem NB-Nährmedium, mit und ohne 150 mM NaCl, angeimpft und 24 Stunden lang bei 37°C mit 250 rpm inkubiert. Die Bakterien wurden dann pelletiert, in 1 ml PBS, pH 7,4, resuspendiert und anschließend für eine Analyse mittels Durchflusszytometrie 1:1000 in PBS verdünnt.
²Definiert das Verhältnis der mittleren Fluoreszenzintensität, die nach der Induktion mit 150 mM NaCl gemessen wurde, geteilt durch die Grundhöhe der mittleren Fluoreszenzintensität, die bei geringer Osmolarität gemessen wurde.
³NA = nicht anwendbar.

Die Grundmenge der Expression für die P_ompC1 – gfpuv-Kassette ist 2,5-mal größer als das der P_ompC3-Kassette, wenn sie in DH5α exprimiert wird, und 2,1-mal größer, wenn sie in CVD 908-htrA exprimiert wird; die Grundhöhe der Fluoreszenz, die bei der Synthese von GFPuv nachgewiesen wurde, überstieg trotz des Backgrounds vom Wirt niemals eine Fluoreszenzintensität von 5,37,. Wenn wir das Induktionsverhältnis als das Verhältnis der mittleren Fluoreszenzintensität, die nach der Induktion gemessen wurde, geteilt durch die Grundhöhe der mittleren Fluoreszenzintensität definieren, wurde beobachtet, dass P_ompC1 und P_ompC3, wenn sie mit 150 mM NaCl induziert wurden, in DH5α Induktionsverhältnisse von entsprechend 1,7 und 2,4 zeigten. Das Induktionsverhältnis bei P_ompC1, wenn es in CVD 908-htrA gemessen wurde, betrug überraschenderweise 4,4 und ergab bei diesen Versuchen eine maximale mittlere Fluoreszenzintensität von 23,4. Obwohl das Induktionsverhältnis von P_ompC3 in CVD 908-htrA bei 6,7 lag, war die mittlere Fluoreszenzintensität von 17,1 geringer als die bei P_ompC1 gemessene. Auf der Basis dieser Daten scheint P_ompC1 der stärkste und noch osmotisch kontrollierte der beiden ompC-Promotoren zu sein. Daher wurde P_ompC1 für die Synthese des breitest möglichsten Bereichs von heterologen Testantigenen zur Untersuchung der Effekte einer solchen Synthese auf die Plasmidstabilität ausgesucht.
Diese Daten zeigen deutlich, dass, wenn sie die Expression von gfpuv in dem Lebendvektorstamm CVD 908-htrA steuern, P_ompC1 und P_ompC3 durch die zunehmende Osmolarität induzierbar sind, obwohl die Grundmenge der Transkription in beiden Fällen noch erheblich ist. Die unter diesen Bedingungen geringer Osmolarität beobachteten Ergebnisse belegen zudem unsere Beobachtung unter Verwenden von festen Medien, bei denen festgestellt wurde, dass P_ompC1 eine höhere Expression von heterologen Antigenen steuert als P_ompC3. Da festgestellt wurde, dass P_ompC3 die gewünschte 3'-terminale BglII-Stelle besitzt, die bei P_ompC1 nicht nachgewiesen werde konnte, bestimmten wir die Nukleotidsequenz von P_ompC1 für einen eventuellen Nachweis von (einer) Punktmutation(en), welche die Stärke von P_omC1 erklären könnten. Die einzigen Unterschiede, die identifiziert werden konnten, waren am 3'-Terminus der Kassette lokalisiert. Die gewünschte Sequenz in dieser Region war 5'-...catataacAGATCTtaatcatccacAGGAGGatatctgATG-3' (SEQ ID No. 4) (von links nach rechts, der obere Fall gibt entsprechend die BglII-Stelle, die Ribosomenbindungsstelle und das GFPuv-Startcodon an); die aktuelle Sequenz ergab sich zu 5'-...catataacAGATCGATCTtaaAcatccacAGGAGGAtAtctgATG-3 (SEQ ID No. 5) (inserierte oder geänderte Basen sind im oberen Fall durch Fettdruck und Unterstreichen angegeben). Diese innerhalb der Sequenz des ompC1-Promotors nachgewiesenen Änderungen sind offensichtlich für die Zunahme der beobachteten Stärke von PompC1 aufgrund eines unbekannten Mechanismus verantwortlich, da sich weder die Grundsequenz des ompC-Promotors noch die optimierte Ribosomenbindungsstelle spontan verändert haben.
6.3 Replikationsursprünge und Selektionskassetten
Der Erfolg der Expression potentiell toxischer oder auf andere Weise problematischer, heterologer Antigene in CVD908-htrA hängt von der Kopienzahl des Expressionsplasmids ab. Daneben werden die beobachteten Immunreaktionen auf ein gegebenes heterologes Antigen von der Kopienzahl des (der) Gens (e), die für das Antigen codieren beeinflusst, wobei die von Chromosomen exprimierten Antigene im Vergleich zu der auf Plasmiden beruhenden Expression schwächere Immunreaktionen hervorrufen.
Eine optimierte Immunantwort wird von der auf Vielkopie-Plasmiden beruhenden Expression des (der) heterologen Antigens (e) von Plasmiden mit der geeigneten Kopienzahl abhängen.
Da die geeignete Kopienzahl für ein gegebenes heterologes Gen nicht a priori bekannt sei kann, stellt die vorliegende Erfindung eine Gruppe. von Expressionsplasmiden bereit, die die Replikationsursprünge oriE1 (amplifiziert aus pAT153; Kopienzahl ~ 60), ori15A (amplifiziert aus pACYC184; Kopienzahl ~ 15) und ori101 (amplifiziert aus pSC101; Kopienzahl ~ 5) enthalten. Diese vollständigen Replikationskassetten werden alle von BglII -BamHI-Fragmenten getragen und sind für eine Gruppe von 3 Tetracyclinresistenz-tragenden Expressionsplasmiden in den 1A-1C gezeigt.
Die Expression der durch P_ompC1 kontrollierten gfpuv-Expressionskassette, die auf diesen Expressionsplasmiden enthalten war, wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Diese Versuche wurden so konstruiert, dass nachgewiesen werden konnte, ob Unterschiede in der Höhe der beobachteten Fluoreszenz mit den erwarteten Kopienzahlen eines gegebenen Expressionsplasmids in Verbindung gebracht werden konnten. CVD908-htrA-Stämme, die pGEN2, pGEN3 und pGEN4 trugen, wurden auf reichhaltigem SuperAgar-Medium, das, wenn geeignet, mit DHB und 20 μg/ml Tetracyclin supplementiert war, ausgestrichen. Es wurde SuperAgar verwendet, weil dies ein sehr reichhaltiges Medium ist (3X LB-Agar). Die Platten wurden bei 30°C inkubiert, um die Toxizität der Synthese von GFP zu reduzieren und um die Bakterien üppig auf den Platten wachsen zu lassen. Die isolierten Kolonien wurden dann in 45 ml SuperBroth, die, wenn geeignet, mit DHB und 20 μg/ml Tetracyclin supplementiert war, angeimpft und 16 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Bakterien wurde mittels Zentrifugation konzentriert, in 1 ml sterilem PBS, pH = 7,4, resuspendiert und vor der FACS-Analyse 1:100 in PBS, pH = 7,4, verdünnt. Die Bakterien wurden mittels Durchflusszytometrie, wie es oben für die beiden unabhängigen Versuche zum Wachstum beschrieben ist, analysiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 am Ende dieses Abschnitts angegeben.
Diese Daten belegen die Schlussfolgerung, dass eine Überexpression von GFPuv in CVD908-htrA für die Bakterien toxisch ist. Wenn die theoretische Kopienzahl für die Plasmide pGEN4, pGEN3 und pGEN2, die GFPuv unter identischen Wachstumsbedingungen für den anfänglichen P_omp _C1-Promotor exprimieren, nimmt der Prozentsatz der wachsenden Population, die fluoresziert, ab. Erwartungsgemäß sind die „dim"-Bakterien nicht lebensfähig und können das Expressionsplasmid nicht länger enthalten, da diese Kulturen in der Gegenwart von 20 μg/ml Tetracyclin angezüchtet worden waren. Es wurde jedoch festgestellt, dass CVD908-htrA(pGEN2), wenn es auf festen Medien ausgestrichen wurde und 24-36 Stunden lang bei 37°C angezüchtet wurde, nur wenig wachst und keine isolierten Kolonien produzieren kann, wohingegen CVD908-htrA(pGEN3) und CVD908-htrA(pGEN4) ziemlich gut wachsen und intensiv fluoreszierende, isolierte Kolonien produzieren.
GFPuv wird hierin als ein Beispiel von weiteren problematischen heterologen Antigenen verwendet, die interessant sind, um in einen bakteriellen Lebendvektor, wie beispielsweise den auf S. typhi basierenden Lebendvektor, eingebaut werden zu können; vorzugsweise kann GFPuv gegen irgendein nicht im Stoffwechsel vorkommendes Protein- oder Peptidantigen ausgetauscht werden.
Die obigen Daten zeigen, dass, obwohl die Verwendung von oriE1-Replikons enthaltenden Expressionsplasmiden mit mittlerer Kopienzahl bei der Expression einiger Antigene nützlich sein kann, die Expression von Antigenen mit höherer Toxizität erfolgreicher aus Plasmiden mit geringerer Kopienzahl exprimiert wird, die Replikationsursprünge verwenden, die eine mittlere Kopienzahl zwischen 2 und 30 erreichen, wie beispielsweise die Replikationsursprünge ori101 oder ori15A.
6.4 Der antisense-post-segregationale Killing-Locus von hok-sok
Mittels Polymerasekettenreaktion wurden die PSK-Gene von hok-sok unter Verwenden des multiplen Antibiotikaresistenz-R-Plasmids pR1 als Templat in diesen Reaktionen amplifiziert. Alle anfänglichen Versuche, diesen Locus auf Plasmiden mit entweder hoher oder mittlerer Kopienzahl zu klonieren, war nicht erfolgreich. Um direkt auf den hok-sok-Locus während des Subklonierens selektieren zu können, wurde eine Gruppe von Primern zur Verwendung in sich überlappenden PCR-Reaktionen konstruiert, so dass das finale Produkt ein Fragment war, dass eine genetische Fusion des hok-sok-Locus von pR1 und eines promotorlosen tetA-Gens von pBR322, das für eine Resistenz gegen Tetracyclin codiert, enthielt. Diese Kassette wurde so konstruiert, dass die Transkription des hok-Gens in tetA hineinreichen würde; die beiden Loci in dieser Kassette wurden durch eine XbaI-Restriktionsstelle für zukünftige Manipulationen voneinander abgegrenzt.
Die Konstruktion dieser Kassette ermöglichte nicht nur eine direkte Selektion des hoksok-Locus, sondern auch die Bestätigung, dass die PSK-Funktion in S. typhi CVD908-htrA funktionsfähig wäre. Nach der Elektroporation von Plasmiden, die die Kassette in CVD908-htrA einbringen, könnten die Transformanten mit Hilfe von Tetracyclin selektiert werden. Eine erfolgreiche Rückgewinnung der isolierte Kolonien belegte die erfolgreiche Synthese der hok – tetA-mRNA und die erfolgreiche Synthese der antisense-sok-RNA zur Verhinderung der Synthese von Hok, das die Bakterien töten würde. Die Wiedergewinnung der hok-soktetA-Kassette war dann einfach und sie war leicht in unsere Expressionsplasmide einzubauen, um so die Kassette für den selektierbaren Marker für die Plasmide pGEN2, pGEN3 und pGEN4, die in den 1A-1C dargestellt sind, zu erzeugen.
Dann wurden Versuche gestartet, um den Effekt der PSK-Funktion von hok-sok auf die Stabilität der oriE1 enthaltenden Expressionsplasmide und den für β-Lactamase codierenden Resistenzmarker bla, der eine Resistenz gegen Carbenicillin verleiht, zu bestimmen. Die hok-sok-Kassette wurde in das auf pAT153 basierende Expressionsplasmid pTETnir15 inseriert, in dem die heterologe Antigenkassette Pnir15-toxC gegen unsere PompC1gfpuv-Kassette ausgetauscht worden war, was die Plasmide pJN72 (ohne hok-sok) und pJN51 (mit hok-sok) erzeugte. Eine weitere Gruppe von Plasmiden wurde durch Austausch von P_omp1 gegen den schwächeren Promotor P_ompC3 erzeugt, was pJN10 und pJN12 erzeugte; die Strukturen dieser vier isogenen Plasmide sind in 2 dargestellt. CVD908-htrA-Stämme, die entweder pJN72, pJN51, pJN10 oder pJN12 trugen, wurden auf reichhaltigem SuperAgar-Medium, das mit DHB und 100 μg/ml Carbenicillin supplementiert war, ausgestrichen und die Platten wie oben bei den pGEN-Plasmiden bei 30°C inkubiert, um die Toxizität der Synthese von GFPuv zu reduzieren und die Bakterien üppig auf den Platten wachsen zu lassen.
Die isolierten Kolonien wurden dann in 45 ml Super-Nährmedium, das mit DHB und 100 μg/ml Carbenicillin supplementiert war, angeimpft und zur Analyse mittel Durchflusszytometrie der Fluoreszenz 24 Stunden lang bei 37°C angezüchtet. Ein zweites, davon unabhängiges Experiment wurde genau so wie das erste durchgeführt, außer dass sie isolierten Klone in 500 μl Super-Nährmedium suspendiert wurden und jeweils 250 μl in 45 ml gepaarten Kulturen in Super-Nährmedium angeimpft wurden, wobei 300 mM NaCl zur Induktion der P_ompC-gfpuv-Kassetten dazugegeben wurden oder nicht; die Kulturen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert und erneut mittels Durchflusszytometrie analysiert; die Ergebnisse der beiden Versuche sind in Tabelle 5 gezeigt. Die Fluoreszenzhistogramme für nicht-induzierte und induzierte Expressionsplasmide aus Versuch 2 sind in den 2A-3H dargestellt.
Die Ergebnisse dieser Durchflusszytometrie lassen sich wie folgt erklären: die Expression von für das sekretierte Enzym β-Lactamase codiert, nimmt der selektive Druck, wenn die GFPuv (oder einem anderen potentiell schädlichen, heterologen Antigen) aus einem Vielkopie-Expressionsplasmid, wie beispielsweise pJN72, stellt eine erhöhte Belastung für den Stoffwechsel des Lebendvektors CVD 908-htrA(pJN72) dar und verstärkt die Plasmidstabilität in Abwesenheit einer Selektion. Da der selektierbare Marker des Expressionsplasmids Konzentration von Carbenicillin in dem umgebenden Medium mit der Zeit abnimmt, ab und die Häufigkeit von Plasmidverlusten nimmt zu; da jedoch Vielkopie-Plasmide beteiligt sind, gelingt es nur relativ wenigen Bakterien, alle in ihnen vorhandenen Plasmide zu verlieren, die mittlere Kopienzahl von pJN72 pro Bakterium nimmt jedoch ab.
Eine Quantifizierung der Produktion von GFPuv mittels Durchflusszytometrie bei einer nicht-induzierten Population aus gesund wachsendem CVD908-htrA(pJN72) belegt, dass die Mehrzahl der Bakterien GFPuv exprimieren und nur wenige, nichtfluoreszierende Zellen nachgewiesen werden (3A). Die ansteigende Produktion von GFPuv durch die Induktion der P_ompC1-gfpuv-Kassette stellt jedoch eine erhöhte Belastung für den Stoffwechsel von CVD 908-htrA(pJN72) dar und obwohl sich die Produktion von GFP verdoppelt, nimmt der Prozentsatz an nicht fluoreszierenden Bakterien zu, je mehr Plasmide aus der Population verloren gehen (3B).
In einer ähnlichen Population aus wachsendem CVD 908-htrA(pJN51) trägt jedes Bakterium Vielkopie-Plasmide, die für sowohl GFPuv als auch eine PSK-Funktion codieren. Die Häufigkeit des Plasmidverlusts bei pJN51 bleibt die gleiche wie bei pJN72, aber in diesem Fall ist die 1:1-Stöchiometrie, wenn die einzelnen Bakterien die Kopien des Expressionsplasmids verlieren, zwischen den mRNA-Mengen von hok und sok gestört und eine Produktion von Hok führt zum Tod der Zelle; daher sind die einzigen CVD 908-htrA(pJN51)-Bakterien die schnell wachsen, solche, die alle ihre Expressionsplasmide behalten. Entsprechend ist es nicht überraschend, dass bei einer Quantifizierung der Produktion von GFPuv mittels Durchflusszytometrie bei einer nicht-induzierten Population gesund wachsender CVD 908-htrA(pJN51) nun eine Population von fluoreszierenden Bakterien nachgewiesen wird, die Höhen der Fluoreszenz von GFPuv zeigen, die mit denjenigen, die bei CVD 908-htrA(pJN72), die unter induzierenden Bedingungen angezüchtet wurden, beobachtet wurden, äquivalent sind (3C gegenüber 3B); der Prozentsatz an nichtfluoreszierenden Bakterien steigt jedoch bei über der Hälfte der Gesamtpopulation der Organismen an.
Eine Erhöhung der Produktion von GFPuv in dieser Population durch Induktion der P_ompC1-gfpuv-Kassette in CVD 908-htrA(pJN51) stellt wiederum eine Belastung für den Stoffwechsel des Lebendvektors dar, aber nun übernimmt der Prozentsatz an nichtfluoreszierenden Bakterien fast vollständig die wenigen fluoreszierenden Bakterien, da vermutlich viele Plasmide aus der Population verloren werden und dadurch Bakterien getötet werden (2D).
Es würde erwartet werden, dass, wenn ein schwächerer Promotor zur Kontrolle der Expression von GFPuv verwendet wird, die Gesamtfluoreszenz der Population abnehmen würde (verglichen mit derjenigen, die bei einer ähnlichen Population von Organismen, die mit einem stärkeren, GFPuv exprimierenden Promotor unter identischen Bedingungen angezüchtet wurden, beobachtet wird), und der Prozentsatz an nicht-fluoreszierenden Bakterien sollte aufgrund der Gesamtabnahme der Synthese von GFPuv abnehmen. Wie in den 3E-3H zu sehen ist, verbesserte die Verwendung der schwächeren P_ompC3-gfpuv-Kassette nicht signifikant die Lebensfähigkeit von induzierten Bakterien, die ein Killing-System trugen, obwohl die gesamte Expression von GFPuv vermindert war.
Daraus wird geschlossen, dass es, um den Prozentsatz einer Population von Lebendvektoren, die das heterologe Antigen nach Wahl exprimieren, zu maximieren, nicht ausreicht, nur eine PSK-Funktion in ein gegebenes Expressionsplasmid einzuschleusen, unabhängig davon, ob dies ein Arzneimittelresistenzmarker, das asd-System, ein alternierendes ssb-System oder das hok-sok-Killing-System ist. Um die Kopienzahl und Expressionsmengen zu optimieren, müssen zusätzlich auch die Segregationshäufigkeiten dieser Plasmide verbessert werden, um so sicherzustellen, dass jede Tochterzelle in einer aktiv wachsenden Population wenigstens ein Expressionsplasmid erben wird und dass diejenigen, die keines erben, getötet und aus der Population entfernt werden. Die Bereitstellung eines Expressionsplasmids, das eine PSK-Funktion besitzt und ferner eine optimierte Kopienzahl und/oder optmierte Expressionsmengen aufweist, gekoppelt mit der Insertion von einer oder mehreren SEG-Funktionen, ist im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten.
6.5 Auf Komplementierung basierendes Killing-System
Im breiten Umfang der vorliegenden Erfindung sind auch die Bereitstellung eines Expressionsplasmids, das ein auf Komplementierung basierendes Killing-System, zum Beispiel ein System, das die Deletion des chromosomalen ssb-Locus von CVD908-htrA durch homologe Rekombination beinhaltet, und die Transkomplementierung dieser Lücke unter Verwenden von ssb-Funktionen tragenden Vielkopie-Plasmiden umfasst.
Die Ausführung solcher Konstruktionen erfordert die Klonierung des relevanten Abschnitts des S. typhi-Chromosoms, das das ssb-Gen und flankierende Sequenzen umfasst und in das spezifische Deletionen für chromosomale Mutagenese eingeschleust werden.
Seit unserer ersten Eingabe wurden wesentliche Fortschritte in der Sequenzierung des Chromosoms von Salmonella typhi im Sanger Centre in London gemacht. Das Sanger Centre ist ein Genomforschungszentrum, das 1992 von dem Wellcome Trust und dem Medical Research Council gegründet wurde, um unser Wissen über Genome zu steigern. Neben anderen Projekten sequenziert das Sanger Centre in Zusammenarbeit mit Gordon Dougan vom Department of Biochemistry, Imperial College, London das 4,5 Mb große Genom von S. typhi. Sie sequenzieren den Stamm CT18, einen hoch-pathogenen, gegen viele Arzneimittel resistenten Stamm, der aus einem Patienten mit Typhus im Cho Quan Hospital, Ho Chi Minh-Stadt, Vietnam isoliert wurde. Es ist bekannt, dass dieser Stamm pVN100 (ein 133 kb großes, gegen viele Arzneimittel resistentes Plasmid) und ein kryptisches 80 kb Plasmid beherbergt. Das Genom wird in einem Shotgun-Ansatz des vollständigen Genoms unter Verwenden einer 2 kb großen pUC-Genbank sequenziert, die firmenintern aus einer aus dem Labor von Prof. Dougan zur Verfügung gestellten chromosomalen DNA erzeugt wurde. Jedes Insert wird einmal von jedem Ende aus sequenziert. Die Shotgun-Phase ist nun beendet und die Nachbearbeitung hat begonnen. Derzeit liegen 60 Contigs über 1 kb in der Datenbank vor; insgesamt wurden 5,106 Mb der Sequenz in 87.331 Ablesedurchgängen assembliert.
Basierend auf den aktualisierten Daten, die am 4. Oktober 1999 bekannt gegeben wurden, haben wir Contig 343 identifiziert, das den ssb-Locus von S. typhi und entscheidende flankierende Sequenzen innerhalb einer 205,199 bp großen Region enthält. Wir haben die Primer 1 und 4 (unten angegeben) konstruiert, um ein 3535 bp großes Fragment aus dem Chromosom von S. typhi, in dem der ssb-Locus von 1,5 kb der chromosomalen Sequenz flankiert wird, mit Hilfe von PCR amplifiziert; die Symmetrie dieser flankierenden Regionen ist für optimale Häufigkeiten von Crossing-Over erforderlich, um so die gegen-selektierbare sacB – neo-Kassette einzuschleusen und gegen ssb auszutauschen. Unter Verwenden der bereits eingereichten Methodik werden wir die Primer 1 und 2 zu Konstruktion einer 5'-proximalen, 1,5 kb großen EcoRI – XmaI-Kassette, stromaufwärts von ssb gelegen, verwenden. Die Primer 3 und 4 werden zur Konstruktion der 3'-distalen, 1,5 kb großen XmaI – EcoRI-Kassette, stromabwärts von ssb gelegen, verwendet; beide 1,5 kb großen Kassetten werden miteinander ligiert werden, wobei das 3 kb große EcoRI-Fragment, das eine einzigartige XmaI-Stelle genau in der Mitte der Kassette enthält, ausgebildet wird. Die sabB-neo-Kassette kann nun leicht in die XmaI-Stelle inseriert werden, um so die Konstruktion der Mutagenesekassette, die in pCON (wurde bereits in unserer ersten Eingabe beschrieben) inseriert werden soll, zu vervollständigen. Die erforderliche, komplementierende ssb-1-Kassette wird unter Verwenden der Primer 5 und 6 als NheI-Kassette für einen Austausch der Arzneimittelresistenzmarker innerhalb der XbaI – SpeI-Kassetten von pGEN211, pGEN222, pGEN206 oder irgendeiner im Folgenden genannten Version der hierin ausführlich beschriebenen Expressionsplasmide, konstruiert werden.

PRIMER 1:
5' – gaattcGCGCGCTTCGCGATTCAGTCGCGTTCCTTCACA GCTGGCGCAGGGGCGATTACTGATGAA – 3' (SEQ ID No. 6)
PRIMER 2:
5' – cccggGAGTCTCCTGAATACGTTTCATAAATAGTGTAAA ACGCGTGAGTGTACCATTTCCACGTAGC – 3' (SEQ ID No. 7)
PRIMER 3:
5' – cccggGTAAAAAACTCAAAGCGTTATTTGCATTTTCGC TATAGTTCTCGTCTGCTGAAATGCCTGGTGT – 3' (SEQ ID No. 8)
PRIMER 4:
5' – gaattcCATTTCTATCAATAAATTACTATTAGTTTTGTCT TCTAACCAAGCCTCTATTTTATGAGTATCCTCTTCAG -3' (SEQ ID No. 9)
PRIMER 5:
5' – gctagcATGGCCAGCAGAGGCGTAAACAAGGTGATTCT CGTTGGTAATCTGGGCCAGGACCCGGAAGTACGC – 3' (SEQ ID No. 10)
PRIMER 6:
5' – gctagcTCAGAACGGAATGTCGTCGTCAAAATCCATTG GCGGTTCGTTAGACGGCGCTGGCGCG – 3' (SEQ ID No. 11)

6.6 Stabilität von Expressionsplasmiden in Abwesenheit von Selektion
Um ein nichtkatalytisches Plasmiderhaltungssystem zur Verbesserung der Stabilität von Vielkopie-Expressionsplasmiden, die für fremde Antigene in CVD908-htrA codieren, zu entwickeln, wurden Versuche unternommen, die Plasmidstabilität durch Quantifizieren der Expression von GFPuv mittels Durchflusszytometrie zu überwachen, wenn die Stämme in der Abwesenheit einer Antibiotikaselektion passagiert wurden. Diese Versuche wurden dazu konstruiert, 3 fundamentale Fragen anzusprechen: 1] Welchen Effekt hat die Induktionsmenge von P_ompC1 auf die Stabilität der Plasmide, die für ein heterologes Antigen, wie zum Beispiel GFPuv, codieren? 2] Welchen Effekt hat die Kopienzahl auf die Stabilität der Plasmide, die GFPuv exprimieren? 3] Wie beeinflussen die Stabilisierungsfunktionen von hok-sok, par und parA die Beibehaltung des Plasmide, sowohl als einzelne Komponenten als auch aus synergistischer Sicht?
Es wurden erste Versuche zur Durchflusszytometrie durchgeführt, in denen CVD 908-htrA Replikons mit entweder dem Replikationsursprung oriE1, ori15A oder ori101 trugen. Es wurde schnell bestimmt, dass die Replikons, die die oriE1-Ursprünge mit höherer Kopienzahl trugen, sehr instabil waren, selbst wenn die Stämme in Gegenwart von Antibiotikaselektion angezüchtet wurden. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie geben an, dass, wenn die Bakterienpopulationen in Gegenwart von Carbenicillin angezüchtet wurden, der Prozentsatz dieser Bakterienpopulationen, die nicht länger nachweisbares GFPuv exprimierten, ungefähr 50% bei pGEN71 (das hok-sok trägt) und pGEN84 (hok-sok + par) bis 62% bei pGEN211 (hok-sok + par + parA) betrug. Da Replikons, die einen oriE1-Urspung tragen, deutlich keine Synthese des heterologen Testantigens GFPuv in der Mehrzahl der wachsenden Population von Bakterien-Lebendvektor zuließen, wurde diese Reihe von Expressionsplasmiden nicht weiter untersucht.
Danach wurden CVD 908-htrA, die Expressionsplasmide mit einem ori15A-Ursprung trugen, untersucht. Die Stämme wurden in 25 ml-Kulturen aus 1X LB + DHB (keine Antibiotikaselektion), das entweder 50 mM, 150 mM oder 300 mM NaCl enthielt, angeimpft. Die Kulturen wurden 24 Stunden lang bei 37°C mit 250 rpm inkubiert, 1:1000 in frischem Medium mit identischer Osmolarität verdünnt und weitere 24 Stunden lang inkubiert; Proben aus allen Kulturen wurden mittels Durchflusszytometrie auf die Synthesemengen von GFPuv analysiert. Die Ergebnisse des ersten Passagierungsdurchgangs in Abwesenheit einer Selektion sind in Tabelle 6 angegeben und die Histogramme, die diese Daten wiedergeben, sind in 8 gezeigt.
Tabelle 6 zeigt die Stabilität von ori15A-Replikons, die Plasmiderhaltungssysteme mit zunehmender Komplexizität enthalten und ohne Selektion und in Gegenwart einer zunehmenden Osmolarität angezüchtet wurden, in CVD 908-htrA.¹
Diese Daten sind als Histogramme in 8 dargestellt.
Alle Stämme wurden aus eingefrorenen Master Stocks auf 2X LB-Agar, der mit DHB und 50 μg/ml Carbenicillin supplementiert war, ausgestrichen und 36 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die isolierten Kolonien wurden in einem Pool in 300 μl 1X LB-Nährmedium, die mit DHB supplementiert war, gesammelt und jeweils 25 μl davon wurden in 25 ml 1X LB Nährmedium, die DHB und entweder 50 mM, 150 mM oder 300 mM NaCl enthielt, angeimpft; die Kulturen wurden 24 Stunden lang bei 37°C mit 250 rpm inkubiert. Für die in dieser Tabelle angegebenen Ergebnisse wurden die Bakterien dann pelletiert, in 1 ml PBS, pH 7,4, resuspendiert und dann zur Analyse der Durchflusszytometrie 1:1000 in PBS verdünnt.
Allgemein nimmt der Prozentsatz einer Lebendvektorpopulation, die GFPuv exprimiert, wenn die Osmolarität zunimmt und die Induktion von P_ompC1 erhöht wird, ab; trotzdem nimmt die mittlere Höhe der Fluoreszenzintensität erwartungsgemäß zu. Zum Beispiel exprimieren in 80,5% einer Population von CVD 908-htrA(pGEN121) in der Gegenwart von 300 mM NaCl GFPuv mit einer mittleren Fluoreszenzintensität von 53,3. Wenn die Konzentration von NaCl auf 300 mM NaCl erhöht wird, sinkt der Prozentsatz der Population, die GFPuv exprimiert, auf 56,7%; trotzdem steigt die mittlere Fluoreszenzintensität auf 105,3 an. Es ist jedoch zu beachten, dass bei Stämmen, die pGEN222 mit einem vollständigen Plasmiderhaltungssystem (d.h. hok-sok + par + parA) tragen, der Prozentsatz der Population, die das heterologe Antigen produziert, bei ungefähr 95% bleibt, während die mittlere Fluoreszenzintensität von 52,1 (50 mM NaCl) auf 89,2 (300 mM NaCl) ansteigt. Es wurde festgestellt, dass bei weiterem Passagieren dieser Stämme weitere 24 Stunden lang in Abwesenheit von Antibiotikaselektion, weniger als 5% der Bakterien weiterhin funktionsfähiges GFPuv exprimierten. Ausstriche dieser Kulturen auf festem Medium, vor einer Analyse des Durchflusses, zeigten, dass nichtfluoreszierenden Bakterien nicht lebensfähig, aber für Antibiotikaselektion sensitiv blieben. Wenn nichtfluoreszierende Bakterien sortiert und ausplattiert wurden, wurde bestätigt, dass sie für Antibiotika sensitiv waren und nicht fluoreszierten, wenn sie mit ultraviolettem Licht bestrahlt wurden, was den Verlust der in ihnen vorhandenen Plasmide anzeigt.
Ein Passagierungsversuch, der CVD 908-htrA, die Expressionsplasmide mit ori101-Ursprung trugen, beinhaltete, wies, unabhängig von der Osmolarität, keinen signifikanten Verlust der Expression von GFPuv nach dem Passagieren der Stämme für 48 Stunden ohne Selektion nach. Die Stämme wurden daher in einem separaten Versuch 96 Stunden (d.h. 4 × 24 Stunden) lang in Gegenwart von entweder 50, 150 oder 300 mM NaCl passagiert. Die Populationen wurden nach 3 und 4 Passagierungsdurchgängen mittels Durchflusszytometrie analysiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben.
Tabelle 7 zeigt die Stabilität von ori101-Replikons, die Plasmiderhaltungssysteme mit zunehmender Komplexizität, die ohne Selektion und in Gegenwart zunehmender Osmolarität angezüchtet wurden, in CVD 908-htrA.

¹Alle Stämme wurden aus gefrorenen Master Stocks auf 2X LB-Agar, der mit DHB und 50 μg/ml Carbenicillin supplementiert war, ausgestrichen und 36 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die isolierten Kolonien wurden in einem Pool in 300 μl 1X LB-Nährmedium, das mit DHB supplementiert war, gesammelt und 25 μl davon in 25 ml 1X LB-Nährmedium, das DHB und entweder 50 mM, 150 mM oder 300 mM NaCl enthielt, angeimpft; die Kulturen wurden 24 Stunden lang bei 37°C mit 250 rpm inkubiert (hier als Passagierungsdurchgang #1 definiert). Bei dem Passagierungsdurchgang #2 wurden 25 μl aus Passagierungsdurchgang #1 in 25 ml (d.h. eine Verdünnung von 1:1000) identischem Medium angeimpft und ohne Selektion für weitere 24 Stunden bei 37°C mit 250 rpm inkubiert. Die Passagierungsdurchgänge #3 und #4 wurden in gleicher Weise durchgeführt, jedoch wurden die restlichen Bakterien nach Ansetzen des nächsten Passagierungsdurchgangs pelletiert, in 1 ml PBS, pH 7,4, resuspendiert und dann zur Analyse mittels Durchflusszytometrie 1:1000 in PBS verdünnt.
²ND nicht durchgeführt

Lebendvektoren, die nicht-stabilisierte ori101-Replikons trugen, verloren möglicherweise nach 96 Stunden die Fähigkeit, das heterologe Antigen zu synthetisieren. Beispielsweise exprimierten nach 96 Stunden Wachstum in Gegenwart von 50 mM NaCl nur 10,9% CVD 908-htrA(PGEN132) GFPuv und fluoreszierten. Wenn die Konzentration von NaCl in dem Medium auf 150 mM erhöht wurde, wurde die Fluoreszenz in nur 7,6% der Population nachgewiesen; seltsamerweise ergab der Prozentsatz bei 300 mM NaCl 51,3% fluoreszierende Bakterien. Beachtenswerter Weise behielten, unabhängig von der Osmolarität, CVD 908-htrA, die entweder pGEN142 (hok-sok) oder pGEN206 (hok-sok + parA) trugen, eine Synthese von GFPuv in mehr als 95% der Population nach 3 Passagierungsdurchgängen (72 Stunden) bei (siehe Tabelle 7). Der Prozentsatz an fluoreszierenden CVD 908-htrA(pGEN142) blieb nach 4 Passagierungsdurchgängen (96 Stunden) nahezu auf dieser Höhe, während er bei CVD 908-htrA(pGEN206) leicht zurückging.
Im Gesamten genommen zeigen diese Daten, dass, wenn die Kopienzahl verringert ist, die offensichtliche Stabilität der darin vorhandenen Plasmide und die Fähigkeit eines Lebendvektors, ein heterologes Antigen, wie beispielsweise GFPuv, zu synthetisieren, zunehmen; wenn sich die Plasmiderhaltungssysteme in einem gegebenen Plasmid ansammeln, werden die offensichtliche Stabilität und die Synthese des Antigens weiter verstärkt. Wenn die Induktion von P_ompC und die damit einhergehende Produktion des heterologen Antigens erhöht wird, kann daneben der Prozentsatz einer wachsenden Population, die in der Lage ist, das Antigen zu synthetisieren, drastisch abnehmen.
6.7 Bakterienstämme und Kultivierungsbedingungen
Alle Plasmidkonstruktionen wurden aus dem Escherichia coli-Stamm DH5α oder DH5αF'IQ (Gibco BRL) gewonnen. Zur Konstruktion der hok-sok-Genkassette wurde Templat-DNA von pR1, die aus dem E. coli-Stamm J53(pR1) isoliert wurde, eine großzügige Spende von James B. Kaper, verwendet. Der Lebendvektor S. typhi CVD 908-htrA ist ein auxotrophes Derivat des Wildtyp-Stamms Ty2 mit Deletionen in aroC, aroD und htrA (Tacket et al., 1997b). Alle für die Untersuchung der Plasmidstabilität verwendeten Stämme wurden in Medien angezüchtet, die mit 2,3-Dihydroxybenzoesäure (DHB) supplementiert waren, wie es oben beschrieben ist (Hone et al., 1991; Galen et al., 1997). Wenn sie auf festem Medium angezüchtet wurden, wurden Plasmid-tragende Stämme von CVD 908-htrA aus gefrorenen (–70°C) Master Stocks auf 2X Luria-Bertani-Agar, der (pro Liter) 20 g Bacto-Trypton, 10 g Bacto-Hefeextrakt und 3 g NaCl (2X LB-Agar) plus Carbenicillin mit einer Konzentration von 50 μg/ml enthielt, ausgestrichen. Die Platten wurden 24-36 Stunden lang bei 30°C inkubiert, um isolierte Kolonien mit ~ 2 mm Durchmesser zu erhalten; die Stämme wurden bei 30°C inkubiert, um die Toxizität der Expression von GFPuv in CVD 908-htrA zu minimieren.
Wenn sie in flüssigem Medium angezüchtet wurden, wurden die Kulturen 16-24 Stunden lang bei 37°C mit 250 rpm inkubiert. Um die osmotische Induktion des ompC-Promotors (P_ompC) in entweder E. coli DH5α oder CVD 908-htrA zu überprüfen, wurden die Stämme in Bacto-Nährbühe (Difco), das DHB und entweder NaCl oder Sucrose enthält, angezüchtet; die Kulturen waren entweder mit 50 μg/ml Carbenicillin oder ansteigenden Konzentrationen von Kanamycin, wenn die P_ompC-apha-2-Kassetten untersucht wurden, supplementiert. Zur Quantifizierung der Synthese von GFPuv mittels Durchflusszytometrie wurden 6-8 isolierte Kolonien aus Master Stocks, die, wie oben, auf 2X LB-Agar ausgestrichen wurden, in 25 ml 1X LB-Nährmedium, das, wenn gewünscht, mit 50 μg/ml Carbenicillin und NaCl in ansteigenden Konzentrationen zur Erhöhung der Induktion von ompC-Promotoren supplementiert waren, angeimpft. Die Kulturen wurden vor dem Pelletieren der Bakterien zur Durchflusszytometrie 16-24 Stunden bei 37°C mit 250 rpm inkubiert.
6.8 Molekulargenetische Methoden
Zur Konstruktion der hier angegebenen Plasmide wurden Standardmethoden verwendet (Sambrook et al., 1989). Soweit nicht anders angegeben ist, wurde native Taq-DNA-Polymerase (Gibco BRL) in den Polymerasekettenreaktionen (PCR) verwendet. S. typhi wurde vor der Ernte aus Millers-LB-Nährmedium (Gibco BRL), das mit DHB supplementiert war, für die Elektroporation von rekombinanten Plasmiden vorbereitet; nach dem Pelletieren der Bakterien wurden die Zellen dreimal mit einem Kulturvolumen aus sterilem destillierten Wasser gewaschen und auf ein Endvolumen von 1/100 des ursprünglichen Kulturvolumens in sterilem destillierten Wasser resuspendiert. Die Elektroporation der Stämme wurde mit einer Gene Pulser-Vorrichtung (Bio-Rad), die auf 2,5 kV, 200 Ω und 25 μF eingestellt war, durchgeführt. Nach der Elektroporation wurden die Bakterien unter Verwenden von SOC-Medium repariert und 45 Minuten lang bei 37°C mit 250 rpm inkubiert; die Bakterien wurden dann auf 1X LB-Medium, das DHB plus 50 μg/ml Carbenicillin enthielt, ausplattiert und 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die isolierten Kolonien wurden dann von dem supplementierten 2X LB gewischt und 16 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die gefrorenen Master Stocks wurden durch Ernten der Bakterien in SOC-Medium ohne weitere Supplementierung und Einfrieren bei –70°C vorbereitet.
6.9 Konstruktion der Expressionsvektoren

Die in der folgenden Tabelle 8 aufgelisteten Expressionsvektoren wurden im Verlauf der neueren Arbeit zubereitet. Tabelle 8

Plasmid	Größe (kb)	Relevanter Genotyp	Referenz
pTETnir15	3,7	oriE1 toxC bla	Oxer et al. (1991)
pJN1	1,9	oriE1 bla	Diese Arbeit
pJN2	3,4	oriE1 toxC bla	Diese Arbeit
pGFPuv	3,3	pUC19ori gfpuv bla	Clontech
pGFPompC	3,5	oriE1 gfpuv bla	Diese Arbeit
pNRB1	3,5	oriE1 gfpuv tetA	Diese Arbeit
pGEN2	4,2	oriE1 gfpuv tetA hok-sok	Diese Arbeit
pGEN3	4,1	ori15A gfpuv tetA hok-sok	Diese Arbeit
pGEN4	5,6	ori 101 gfpuv tetA hok-sok	Diese Arbeit
pJN5	3,1	oriE1 gfpuv bla	Diese Arbeit
pJN6	3,7	oriE1 gfpuv bla hok-sok	Diese Arbeit
pJN7	4,1	oriE1 gfpuv bla hok-sok par	Diese Arbeit
pJN8	5,4	oriE1 gfpuv bla hok-sok parA	Diese Arbeit
pGEN51	3,6	oriE1 gfpuv bla	Diese Arbeit
pGEN71	4,2	oriE1 gfpuv bla hok-sok	Diese Arbeit
pGEN84	4,5	oriE1 gfpuv bla hok-sok par	Diese Arbeit
pGEN183	5,9	oriE1 gfpuv bla hok-sok parA	Diese Arbeit
pGEN211	6,2	oriE1 gfpuv bla hok-sok par parA	Diese Arbeit
pGEN91	3,5	ori15A gfpuv bla	Diese Arbeit
pGEN111	4,1	ori15A gfpuv bla hok-sok	Diese Arbeit
pGEN121	4,5	ori15A gfpuv bla hok-sok par	Diese Arbeit
pGEN193	5,8	ori15A gfpuv bla hok-sok parA	Diese Arbeit
pGEN222	6,2	ori 15A gfpuv bla hok-sok par parA	Diese Arbeit

Tabelle 8-Fortsetzung

Plasmid	Größe (kb)	Relevanter Genotyp	Referenz
pGEN132	4,8	ori101 gfpuv bla par	Diese Arbeit
pGEN142	5,4	ori101 gfpuv bla par hok-sok	Diese Arbeit
pGEN206	7,1	ori101 gfpuv bla par hok-sok parA	Diese Arbeit

6.9.1 Konstruktion von pJN1 und pJN2

Die für diese Untersuchungen konstruierten Expressionsplasmide bestanden aus 3 Basiskassetten, die für 1] die Expression eines heterologen Antigens, 2] eines Replikationsursprung des Plasmids und 3] Selektions- und Stabilisierungsfunktionen codieren. Um dies zu erreichen wurde ein Basisreplikon konstruiert, in dem diese Kassetten durch einzigartige Restriktionsstellen voneinander abgegrenzt wurden. Die bei der Konstruktion der Plasmidkassetten verwendeten Primer sind in der folgenden Tabelle 9 angegeben: Tabelle 9

Primer-Nummer	Sequenz¹	Erzeugte Kassette	GenBank-Zugangs-nummer	Region der Homologie 2	Region der Komple-mentarität 3
1	5'-GCAGGAAAGAACATGTGAGCCTAGG GCCAGCAAAAGGCCAGGAAC-3' (SEQ ID No. 12)	oriE1	J01749	2463-2507
2	5'-CATGACCAAAATCCCTTAACTAGTGTT TTAGATCTACTGAGCGTCAGACCCCG-3' (SEQ ID No. 13)	"	"		3197-3145
3	5'-CGGGGTCTGACGCTCAGTAGATCTAA AACACTAGTTAAGGGATTTTGGT CATG-3' (SEQ ID No. 14)	bla	"	3145-3197
4	5'-GCTGTCAAACATGAGAATTCTAGAAG ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCC-3' (SEQ ID No. 15)	"	"		17-1, 4361-4330
5	5'-ACAGCCTGCAGACAGATCTTGACAGC TGGATCGCACTCTGGTATAATTGGG AA GCCCTGCAAAG-3' (SEQ ID No. 16)	aphA-2	V00618	1-64

Tabelle 9-Fortsetzung

Primer-Nummer	Sequenz¹	Erzeugte Kassette	GenBank-Zugangsnummer	Region der Homologie 2	Region der Komplementarität 3
6	5'-CGAAGCCCAACCTTTCATAGAAGCTA GCGGTGGATCCGAAATCTCGTGAT GGC AGGTTG-3' (SEQ ID No. 17)	"	"		1044-986
7	5'-AACAAGCGTTATAGGAATTCTGTGGT AGCA-3' (SEQ ID No. 18)	P_ompC	K00541	4-33
8	5'-ACTTTCATGTTATTAAAGATCTGTTAT ATG-3' (SEQ ID No. 19)	"	"		498-469
9	5'-AGATCTTAATCATCCACAGGAGGCTT TCTGATGAGTAAAGGAGAAGAAC TTTT CACTGG-3' (SEQ ID No. 20)	gfpuv	U62636	289-317
10	5'-GCTAGCTCATTATTTGTAGAGCTCATC CATGC-3' (SEQ ID No. 21)	"	"		1008-983
11	5'-AGATCTGAATTCTAGATCATGTTTGAC AGCTTATCATCGATAAGCTTTA ATGCG-3' (SEQ ID No. 22)	tetA	J01749	4-41
12	5'-AGATCTTATCAGGTCGAGGTGGCCCG GCTCCATGCACCGCGACGCAACG CG-3' (SEQ ID No. 23)	"	"		1275-1234
13	5'-CGCGAATTCTCGAGACAAACTCCGGG AGGCAGCGTGATGCGGCAACAA TCACA CGGATTTC-3' (SEQ ID No. 24)	hok-sok-tetA	X05813	2-48
14	5'-ATGAGCGCATTGTTAGATTTCATTTTT TTTTCCTCCTTATTTTCTAGACAA CATCH GCAAGGAGAAAGG-3' (SEQ ID No. 25)	"	J01749, X05813		108-86, 580-559
15	5'-CCTTTCTCCTTGCTGATGTTGTCTAGA AAATAAGGAGGAAAAAAAAATGAAATCT AACAATGCGCTCAT-3' (SEQ ID No. 26)	"	X05813, J01749	559-580, 86-108
16	5'-GCTACATTTGAAGAGATAAATTGCACT GGATCCTAGAAATATTTTATCTGATTAAT AAGATGATC-3' (SEQ ID No. 27)	ori15A	X06403		1461-1397
17	5'-CGGAGATTTCCTGGAAGATGCCTAGG AGATACTTAACAGGGAAGTGAGAG-3' (SEQ ID No. 28)	"	"	780-829

Tabelle 9-Fortsetzung

Primer- Erzeugte Komple-	Sequenz¹	Erzeugte Kassette	GenBank-Zugangsnummer	Region der Homologie 2	Region der Komplementarität 3
18	5'-GTCTGCCGGATTGCTTATCCTGGCGG TCCGGTTGACAGTAAGACGGGTAAGC CTGTTGAT-3' (SEQ ID No. 29)	ori101	X01654	4490-4550
19	5'-CCTAGGTTTCACCTGTTCTATTAGGTG TTACATGCTGTTCATCTGTTACATTGTC GATCTG-3' (SEQ ID No. 30)	"	"		6464-6408
20	5'-AGGCTTAAGTAGCACCCTCGCAAGAT CTGGCAAATCGCTGAATATTCCTTTTGTCTCCGAC-3' (SEQ ID No. 31)	par	X01654		4918-4858
21	5'-GAGGGCGCCCCAGCTGGCAATTCTA GACTCGAGCACTTTTGTTACCCGCCAAA CAAAACCCAAAAACAAC-3' (SEQ ID No. 32)	aphA-2-par A	V00618, X04268	38-16, 1-37
22	5'-AGAAGAAAAATCGAATTCCAGCATGA AGAGTTTCAGAAAATGACAGAGCGTGA GCAAGTGC-3' (SEQ ID No. 33)	"	X04268		1704-1644
23	5'-CGAAGCCCAACCTTTCATAGAAACTA GTGGTGGAATCGAAATCTCGTGATGGC AGGTTG-3' (SEQ ID No. 3)	"	V00618		1044-986
24	5' -GTTGTTTTTGGGTTTTGTTTGGCGGG TAACAAAAGTGCTCGAGTCTAGAATTGC CAGCTGGGGCGCCCTC-3' (SEQ ID No. 35)	"	X04268, V00618	37-1, 16-38

¹Die Restriktionsstellen sind unterstrichen, auf die im Text Bezug genommen wird; die Ribosomenbindungsstellen und Startcodons sind kursiv geschrieben.
²Bezogen die Sequenz innerhalb des codierenden Strangs eines gegebenen Gens, zu dem der Primer homolog ist.
³Bezogen auf die Sequenz innerhalb des nicht-codierenden Strangs eines gegebenen Gens, zu dem der Primer homolog ist.

pTETnir15 (siehe Tabelle 8; Oxer et al., 1991) wurde so rekonstruiert, dass der Replikationsursprung oriE1 und das bla-Gen durch eine einzigartige Spel-Stelle voneinander abgegrenzt waren. Zu diesem Ende hin wurde mittels PCR eine oriE1-Kassette unter Verwenden von Vent-Polymerase mit den Primer 1 und 2 und pVCD315 (Galen et al., 1990) als Templat synthetisiert. Das resultierende 735 bp große Fragment trägt die konstruierten SpeI- und BglII-Stellen 5'-proximal von dem Promotor, die die Transkription von RNA II kontrolliert, und eine konstruierte AvrII-Stelle 675 Basen von diesen Stellen entfernt. Eine separate PCR-Reaktion wurde unter Verwenden der Primer 3 und 4 durchgeführt, um eine 1234 bp große bla-Kassette zu erzeugen, die eine konstruierte XbaI-Stelle 5'-proximal von der ursprünglichen EcoRI-Stelle enthielt. Die Produkte aus diesen beiden PCR-Reaktionen wurden im Gel gereinigt und in einer überlappenden PCR mit den Primer 1 und 4 zur Erzeugung eines finalen, 1916 bp großen oriEl – bla-Fragments, das zur Erzeugung von pJNI selbst-ligiert wurde, verwendet. Das P_nir15 –toxC-Fragment aus pTEPnir15 wurde als EcoRI (partieller Verdau) – AvaI-Fragment, in dem der AvaI-Terminus geglättet war, herausgeschnitten und in die multiple Klonierungsregion von pSL1180 (Brosius, 1989), das mit EcoRI und Stul geschnitten worden war, inseriert; diese Kassette wurde dann erneut als EcoRI (partieller Verdau) – AvrII-Fragment herausgeschnitten und in pJN1, das mit EcoRI-AvrII geschnitten worden war, inseriert, wodurch pJN2 erzeugt wurde (siehe Tabelle 8).
6.9.2 Konstruktion von pGFPompC
Um das Screening eines funktionsfähigen, osmotisch regulierten P_ompC-Allels aus Escherichia coli zu erleichtern, wurde eine aphA-2-Kassette konstruiert, die für eine Resistenz gegen die Aminoglykoside Neomycin und Kanamycin codiert (Shaw et al., 1993). Es wurde eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwenden der Primer 5 und 6 mit dem Templat pIB279 durchgeführt (Blomfield et al., 1991), um ein 1044 bp großes Produkt zu erzeugen, aus dem ein promotorloses, 903 bp großes aphA-2 – BglII – NheI-Fragment für einen Austausch gegen eine BglII-NheI-toxC-Kassette, die für das Fragment C von Tetanus-Toxin in pTETnir15 codiert, herausgeschnitten wurde. Der anaerob regulierte P_nir15-Promotor wurde gegen ein 459 bp großes EcoRI-BglII-P_ompC-Allel ausgetauscht, das unter Verwenden der Primer 7 und 8 mit einer chromosomalen DNA aus E. coli DH5α als Templat zur Erzeugung von pKompC konstruiert wurde. Nach der Bestätigung der osmotischen Induktion von P_ompC durch Untersuchung der zunehmenden Resistenz gegen Kanamycin mit zunehmender Osmolarität, wurde dann die aphA-2-Kassette gegen ein gfpuv-Gen ausgetauscht, das für ein prokaryotisches, Codon-optimiertes GPFuv-Allel (Clontech; Crameri et al., 1996) codierte. Das gfpuv-Gen wurde mittels PCR unter Verwenden der Primer 9 und 10 mit dem Templat pGFPuv rückgewonnen, so dass ein 751 bp großes BglII- NheI-Fragment erzeugt wurde, das in pKompC inseriert wurde, um dadurch pGFPompC zu erzeugen. Die Kolonien wurden auf funktionsfähiges GFPuv gescreent und die am hellsten leuchtenden Kolonien wurden dann auf eine Induktion der Fluoreszenz mit zunehmenden Konzentrationen von NaCl untersucht. Eine P_ompC1-gfpuv-Kassette wurde aus pGFPompC1 als EcoRI – NheI-Fragment geschnitten und in ein Derivat von pJN2, das mit EcoRI – NheI geschnitten worden war, inseriert, um pJJ4 zu erzeugen.
6.9.3 Konstruktion von pNRB1, pGEN2, pGEN3 und pGEN4
Da die Kopienzahl nicht von einer Transkription, die von Promoter außerhalb des Replikationsursprungs stammte, beeinflusst werden sollte, musste sichergestellt werden, dass alle Replikationskassetten an beiden Enden mit Transkriptionsterminatoren flankiert waren. Da der Ursprung und die Antigenkassetten von pJN2 durch den Terminator trpA voneinander abgegrenzt wurden, war es nur nötig, einen weiteren Terminator zwischen den Ursprung und die bla-Kassetten zu inserieren.
Um die Konstruktion weiterer Plasmide zu einem späteren Zeitpunkt zu erleichtern, wurde eine tetA-T1T2-Kassette erzeugt. pYA292 (Galan et al., 1990) wurde zunächst mit HindIII und BglII geschnitten und der T1T2-Terminatorfragment geglättet und in die SmaI-Stelle der multiplen Klonierungsregion von pBluescript II KS (Stratagene) inseriert; wenn die richtige Orientierung identifiziert wurde, wurde diese Kassette als BamHI – PstI-Fragment wieder herausgeschnitten und in pIB307 (Blomfield et al., 1991), das mit BamHI-PstI geschnitten worden war, inseriert, wodurch pJG14 erzeugt wurde. Später wurde mittels Sequenzanalyse bestimmt, dass die Kassette eine Deletion von ungefähr 100 bp erlitten hat, bei der der halbe T2-Terminator entfernt wurde.
Mit pBR322 als Templat wurden die Primer 11 und 12 dazu verwendet, ein 1291 bp großes tetA – BhlII-Fragment zu synthetisieren. Dieses tetA – BglII-Frgament wurde dann in die BamHI-Stelle von pJG14 inseriert, so dass die Transkription des tetA-Gens von dem T1T2-Terminator terminiert wird und dadurch pJG14tetA erzeugt wird. Schließlich wurde diese tetA – T1T2-Kassette aus pJG14tetA als EcoRI – PstI-Fragment herausgeschnitten, wobei die PstI-Stelle durch Glätten entfernt worden war; das resultierende Fragment wurde in pJJ4 inseriert, mit SpeI geschnitten, geglättet und erneut mit EcoRI geschnitten, um die bla-Kassette auszutauschen und pNRB1 zu erzeugen.
Die nicht-katalytische, post-segregationale Killing-Funktion, die in die Plasmiderhaltungssysteme der hierin beschriebenen Expressionsplasmide eingeschleust werden sollte, war der hok-sok-Locus aus dem gegen viele Arzneimittel resistenten R-Faktor pR1. Anfängliche Versuche zur Rückgewinnung des hok-sok-Locus nach einer PCR waren erfolglos. Es war daher nötig, eine überlappende PCR dazu zu verwenden, eine Kassette zu erzeugen, in der hok-sok transkriptionell mit einem promotorlosen tetA-Gen fusioniert war, so dass die Transkription, die von dem hok-Promotor stammt, in tetA weiterreichen würde und die zu einem Transkript, das sowohl für Hok als auch für eine Resistenz gegen Tetracyclin codiert, führen würde. Die pR1-Plasmid-DNA wurde aus E. coli 153(pR1) gereinigt, in der pR1 für eine Resistenz gegen sowohl Carbenicillin als auch Chloramphenicol codiert. Ein 640 bp großes hok-sok-Fragment wurde unter Verwenden der Primer 13 und 14 synthetisiert; ein promotorloses, 1245 bp großes tetA-Fragment wurde in einer separaten PCR unter Verwenden der Primer 12 und 15 mit pNRB1 als Templat rückgewonnen. Die Produkte aus diesen beiden PCR-Reaktionen wurden dann in einer überlappenden PCR mit den Primer 12 und 13 verwendet, um so dass finale, 1816 bp große hok-sok – tetA-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde als EcoRI – SphI-Fragment in pNRB1, das mit EcoRI-SphI geschnitten worden war, inseriert, wodurch das tetA-Gen wiederhergestellt und pGEN1 erzeugt wurde.
Dann wurde eine Gruppe aus 3 isogenen Plasmiden, die sich nur in ihrer Kopienzahl unterschieden, konstruiert, aus der alle weiteren Expressionsplasmide abgeleitet werden konnten. Die Replikationsursprungskassette BglI-AvrII von pGEN1 wurde gegen eine BglII-AvrII – oriE1-Kassette aus pJN2 ausgetauscht, um pGEN2 zu erzeugen. Eine ori15A-Replikationskassette wurde mittels PCR unter Verwenden der Primer 16 und 17 mit pACYC184 als Templat synthetisiert, um ein 629 bp großes BamHI – AvrII-Fragment zu erzeugen, das in pGEN2, das mit BglII-AvrII geschnitten worden war, inseriert wurde, um pGEN3 zu erzeugen. Schließlich wurde eine ori101-Replikationskassette mittels PCR unter Verwenden der Primer 18 und 19 mit pSC101 als Templat synthetisiert, wodurch ein 1949 bp großes BamHI – AvrII-Fragment erzeugt wurde, das in pGEN2, das mit BglII-AvrII geschnitten worden war, inseriert wurde, um pGEN4 zu erzeugen.
6.9.4 Konstruktion von pJN5, pGEN51, pGEN91 und pGEN132
Die zugrunde liegende Gruppe aus isogenen Expressionsplasmiden, zu denen die einzelnen Elemente eines Plasmiderhaltungssystems nacheinander zugegeben wurden, bestand aus pGEN51 (enthält oriE1), pGEN91 (enthält ori15A) und pGEN132 (enthält ori101). Das Basis-Replikon, aus dem diese 3 Plasmide konstruiert wurden, war pJN5, das durch Herausschneiden der P_ompC – gfpuv-Kassette als EcoRI – NheI-Fragment aus pGFPompC zum Austauschen der P_nir15 – toxC-Kassette von pJN2 assembliert wurde. Die Konstruktion von pGEN51 wurden dann durch Entfenen der Replikationskassette von pGEN2 als BamHI-Fragment und Austausch des Replikationsursprungs in pJN5, das mit BglII und BamHI verdaut worden war, erreicht, wodurch das gfpuv-Gen wiederhergestellt wurde. Die Konstruktion von pGEN91 und pGEN132 wurde auf identische Weise durch Herausschneiden von Ursprungskassetten als BamHI-Fragmente aus entsprechend pGEN3 und pGEN4 erreicht (siehe 7 für die Darstellung von isogenen Expressionsplasmiden, die auf pGEN91 basieren).
6.9.5 Konstruktion von pJN6, pGEN71, pGEN111 und pGEN142
Der hok-sok-Locus wurde dann als XbaI – SalI-Fragment in pJN5, das mit XbaI und SaiI geschnitten worden war, inseriert, was das gfpuv-Gen wiederherstellte und pJN6 erzeugte (siehe Tabelle 2). Die Konstruktion von pGEN71, pGEN111 und pGEN142 wurde dann genauso wie bei pGEN51, pGEN91 und pGEN32 durch Insertion der Ursprungskassetten als BamHI-Fragmente aus entsprechend pGEN2, pGEN3 und pGEN4 in pJN6 durchgeführt.
6.9.6 Konstruktion von pJN7, pGEN84 und pGEN121
Die Konstruktion von oriE1- und ori15A-Expressionsplasmiden, die ein Plasmiderhaltungssystem, das aus sowohl einem post-segregationalen Killing-System als auch wenigstens einer Partitionsfunktion bestand, wurde zunächst unter Verwenden der par-Funktion aus pSC101 versucht. Ein 377 bp großes BamHI – BglII-Fragment wurde unter Verwenden der Primer 18 und 20 mit pSC101 als Templat-DNA synthetisiert; dieses Fragment wurde in pJN6, das mit BglII geschnitten worden war, inseriert, um pJN7 zu erzeugen. Wie in den obigen Konstruktionen wurden die Ursprungskassetten von pGEN2 und pGEN3 dann als BamHI-Fragmente herausgeschnitten und in pJN7, das mit BglII und BamHI verdaut worden war, inseriert, um pGEN84 nd pGEN121 zu erzeugen.
6.9.7 Konstruktion von pJN8, pGEN183, pGEN206, pGEN211 und pGEN222
Die finalen Expressionsplasmide wurden durch Einschleusen des aktiven Partitionierungslocus parA aus pR1 konstruiert. Wie bei hok-sok waren anfängliche Versuche zur Rückgewinnung des parA-Locus nach der PCR erfolglos. Es war daher nötig, eine überlappende PCR zur Erzeugung einer aph – parA-Kassette zu verwenden, in der aph und parA divergent transkribiert wurden und durch XbaI- und XhoI-Stellen voneinander abgegrenzt wurden, um so eine Subklonierung des parA-Locus zu ermöglichen. Ein 1737 bp großes parA-Fragment wurde unter Verwenden der Primer 21 und 22 mit pR1 als Templat synthetisiert; ein 1076 bp großes aphA-2-Fragment wurde in einer separaten PCR unter Verwenden der Primer 23 und 24 mir pIB279 als Templat rückgewonnen. Die Produkte aus diesen beiden PCR-Reaktionen wurden dann in einer überlappenden PCR mit den Primer 22 und 23 verwendet, um das finale, 2743 bp große aphA2 – parA-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde als 2703 bp großes EcoRI – SpeI-Fragment in pJN6 inseriert. Die parA-Kassette wurde dann als XhoI-Fragment erneut ausgeschnitten und wieder in pJN6, das mit ShoI geschnitten worden war, inseriert, was das gfpuv-Gen wiederherstellte und pJN8 erzeugte.
Plasmide, die ein Plasmiderhaltungssystem trugen, bestanden aus der postsegregationalen Killing-Funktion hok-sok und parA und wurden durch Herausschneiden von oriE1 – oder ori15A – BamHI – Spel-Kassetten aus entsprechend pGEN51 und pGEN91 und Insertion in pJN8, das mit BamHI und SpeI geschnitten worden war, zur Erzeugung von entsprechend pGEN183 und pGEN193 konstruiert. Plasmide, die das vollständige Komplement von hok-sok-, par- und parA-Stabilisierungsfunktionen enthielten, wurden durch Insertion von par-enthaltenden Urprungskassetten als BamHI – SpeI-Kassetten aus pGEN84, pGEN121 und pGEN132 in pJN8, das mit BamHI und SpeI geschnitten worden war, konstruiert, um entsprechend pGEN211, pGEN222 und pGEN206 zu erzeugen.
6.10 Quantifizierung von GFPuv und Plasmidstabilisierung
Die Quantifizierung von GFPuv und Plasmidstabilisierung wurde durch Messen der Fluoreszenz von Plasmid-tragenden Lebendvektoren unter Verwenden eines Epics Elite ESP-Durchflusszytometers/Zellklassifizierungssystems (Coulter) mit einem Argon-Laser, der die Bakterien bei 488 nm anregte und Emissionen bei 525 nm erfasste, analysiert. 25 ml 1X LB-Kulturen, die wie oben beschrieben wurde, angezüchtet worden waren, wurden pelletiert und die Bakterien wurden in 1 ml PBS resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen vor der Bestimmung der lebensfähigen Zellzahlen und der Durchflussanalyse 1:1000 in PBS verdünnt. Eine Lichtstreuung von vorne gegenüber einer Lichtstreuung von der Seite, die mit logarithmischen Verstärkern gemessen wurde, wurde dazu verwendet, die Bakterien zu belichten. Ein Minimum von 50.000 Ereignissen wurde aus jeder Probe mit einer Sammelgeschwindigkeit von ungefähr 3.500 Ereignissen pro Sekunde erfasst. Die mittlere Fluoreszenzintensität bei einer gegebenen Bakterienpopulation wurde unter Verwenden des Software-Pakets Epics Elite Software Analysis Package bestimmt. Die Höhe der Autofluoreszenz, die unter Verwenden von plasmidlosen CVD908-htrA-Stämmen von S. typhi und DH5α-Stammen von E. coli bestimmt wurden, wurden dazu verwendet, Marker, die den Prozentsatz von Bakterien in einer gegebenen Population, die GFPuv exprimieren, quantifizieren, zu platzieren.
6.11 Schlussfolgerungen
Das breit formulierte Forschungsziel, das in den Abschnitten 6.6-6.10 angegeben ist, sollte der Untersuchung der Fähigkeit, ein Plasmiderhaltungssystem für die Stabilisierung von Vielkopie-Expressionsplasmiden, die für ein fremdes Antigen in einem Vektor-Lebendimpstoffstamm von S. typhi, ohne weitere Modifikation des Chromosoms zu entwickeln, dienen. Die Stabilisierung der Expressionsplasmide wurde auf zwei voneinander unabhängigen Ebenen verbessert. Erstens wurde die Abhängigkeit von balancierten Letalstabilisierungssystemen, an denen katalytische Enzyme, die von Vielkopie-Plasmiden exprimiert werden, beteiligt sind, aufgehoben; dies wurde durch Einbau eines postsegregationalen Killing-Systems, das auf dem Addiktionssystem des nicht-katalytischen hoksok-Plasmids aus dem Antibiotikaresistenzfaktor pR1 beruhte, in Expressionsplasmide erreicht. Ebenso wurde wenigstens eine in der Natur vorkommende Partitionsfunktion in diese Expressionsplasmide eingeschleust, um eine zufällige Segregation solcher Plasmide potentiell auszuschließen und dadurch ihre Vererbbarkeit und Stabilität zu verbessern.
Obwohl diese Expressionsplasmide letztlich immunogene und schützende Antigene für eine Verabreichung an das menschliche Immunsystem exprimieren sollen, wurde GFPuv als Testreporterantigen ausgewählt, da die Quantifizierung der mittleren Fluoreszenz in einer Population von wachsenden Lebendvektoren als Maßstab für die Stabilität in dem Lebendvektor enthaltener Plasmide verwendet werden konnte. Alle Expressionsplasmide trugen eine identische Antigenexpressionskassette, in der ein P_ompC1-Allel die Transkription kontrollierte und eine Translation durch den Einbau einer Consensus- Ribosomenbindungsstelle optimiert wurde. Da eine katalytische Aktivität nicht mit der Fluoreszenz von GFPuv in Verbindung steht, könnte die Höhe der Fluoreszenzintensität, das in einzelnen Bakterien mittels Durchflusszytometrie gemessen wurde, direkt mit der Gendosis und der Kopienzahl in Beziehung gebracht werden. Daneben ließ die Verwendung eines osmotisch regulierten ompC-Promotors eine Abschätzung der Plasmidstabilität und der Lebensfähigkeit der Lebendvektoren zu, wenn die zunehmende Osmolarität höhere Mengen der Synthese von GFPuv und vermutlich eine höhere Belastung für den Stoffwechsel des Lebendvektors induzierte. Wie in Tabelle 2 zu sehen ist, bestätigten wir, dass das für diese Untersuchungen konstruierte P_ompC1-Allel für die zunehmende Osmolarität verantwortlich war; wenn die Expression eines aph-2-Resistenzgens gesteuert wurde, wurde eine Resistenz gegen weniger als 50 μg/ml Kanamycin in der Abwesenheit von osmotischem Druck beobachtet, die Resistenz nahm jedoch auf gegen mehr als 800μg/ml in Gegenwart von 300 mM NaCl zu. Es war überraschend, dass, obwohl das P_ompC1-Allel aus dem chromosomalen Locus von E. coli konstruiert wurde, in S. typhi besser zu funktionieren schien. Die nicht-induzierte Menge der Expression von GFPuv war bei sowohl DH5α als auch CVD 908htrA gleich (mittlere Fluoreszenzintensität von entsprechend 4,45 gegenüber 5,37, Tabelle 3). Die Synthese von GFPuv in DH5α wurde jedoch nach der Induktion auf 70% erhöht, stieg aber in CVD 908-htrA auf über 300% an (mittlere Fluoreszenzintensität von entsprechend 7,69 gegenüber 23,4). Dieser Effekt wurde nicht durch das P_ompC1-Allel eingeschränkt, war jedoch genauso beachtlich, wenn P_ompC3 verwendet wurde (Tabelle 3). Diese Daten stimmen nicht mit den kürzlich von Martinez-Flores et al. (1999) gemachten Beobachtungen überein, die berichten, dass Genfusionen von ompC – lacZ aus E. coli wesentlich in S. typhi exprimierten und dass diese wesentliche Expressionsmenge mit den in E. coli induzierten Mengen vergleichbar war. Obwohl wir einen definierten Locus für Punktmutationen am 3'-Ende unseres E. coli-P_ompC1-Allels identifiziert haben, das das osmotisch kontrollierte Verhalten desselben in CVD 908-htrA von S. typhi erklären könnte, wurden solche Mutationen nicht in P_ompC3 identifiziert, das ebenso auf die Osmolarität in CVD 908-htrA reagiert. Es ist zu beachten, dass die von Martinez-Flores et al. untersuchten Genfusionen jedoch 1.150 bp der 5' von ompC stromaufwärts gelegenen Kontrollregion von E. coli umfassten, während die hier konstruierten P_ompC-Allele nur 459 bp der zu ompC 5'-proximalen Kontrollregion umfassen. Ungeachtet dieser Diskrepanz ist es jedoch viel versprechend, dass die größten Mengen der regulierten Expression heterologer Gene mit dem Vektor-Lebendimpstoff aus einem attenuiertem S. typhi-Stamm beobachtet werden.
Dann wurden die Beiträge verschiedener Plasmiderhaltungssysteme zur Stabilität von Plasmiden in CVD 908-htrA, die in der Abwesenheit von Antibiotikaselektion angezüchtet wurden, untersucht. Keine Kombination von Stabilisierungsfunktionen konnte die Plasmide, die oriE1-Replikationsursprünge enthielten, stabilisieren; tatsächlich waren diese Konstrukte sogar in Gegenwart von Antibiotika schwer zu vermehren. Diese Beobachtungen ziehen die Gründe für die Verwendung von Plasmiden mit höherer Kopienzahl zur Optimierung der Expression von heterologen Antigenen in dem Zytoplasma von auf S. typhi basierenden Lebendvektoren, eine Strategie, die von anderen Gruppen, die Salmonella als Lebendvektoren untersuchten, verfolgt wurde (Covone et al., 1998), in Zweifel.
Der Einbau von Plasmiderhaltungssystemen in Plasmide, die einen ori15A-Replikationsursprung tragen, war noch viel versprechender. Wenn Lebendvektoren, die solche Plasmide tragen, ohne Selektion 24 Stunden lang bei 37°C passagiert wurden, wurden die Effekte verschiedener Kombinationen von Stabilisierungsfunktionen offensichtlich. In der Abwesenheit von Stabilisierungsfunktionen wurde das ori15A-Replikon pGEN91, unabhängig von der Höhe der Induktion von P_ompC1, aus mehr als 90% der Population verloren (siehe Tabelle 6 und 8). Durch den Einbau des post-segregationalen Killing-Locus hok-sok in pGEN111, verdreifachte sich der Prozentsatz der Bakterien, die GFPuv exprimiertem, bei allen Induktionsbedingungen, was die Beobachtungen von anderen, dass der hok-sok-Locus die Stabilität von ori15A-Replikons verbessert (Gerdes et al., 1985; Gerdes, 1988; Gerdes et al., 1997b), bestätigte. Es wurde jedoch trotzdem festgestellt, dass, unabhängig von den Induktionsbedingungen, mehr als 50% der Bakterienpopulation nicht mehr langer fluoreszierten. Da bestätigt worden war, dass wenigstens ein Teil dieser nichtfluoreszierenden Population nicht lebensfähig war und dieser Arzneimittelresistenz fehlte, bestätigen diese Daten vorhergehende Berichte (Gerdes et al., 1986; Wu und Wood, 1994; Pecota et al., 1997), die angeben, dass die Gegenwart des post-segregationalen Killing-Systems hok-sok an sich nicht dazu ausreicht, um sicherzustellen, dass keine plasmidlosen, lebensfähigen Bakterien in einer wachsenden Population auftreten.
Ein möglicher Mechanismus, der das Umgehen des Einflusses von hok-sok ermöglicht, beinhaltet spontane Punktmutationen, die dem offenen Leserahmen des letalen Hok auftreten und Hok bezüglich der Konformation inaktivieren könnten und damit das Auftreten eines Plasmidverlusts ohne Letalität zulassen würden. Dieser Punkt betont das Erfordernis multipler Mechanismen zur Verbesserung der Stabilität von in wachsenden Bakterien enthaltenen Plasmiden; sollte eine Stabilisierungsfunktion inaktiviert werden, wird die Wahrscheinlichkeit, dass andere davon unabhängige Funktionen gleichzeitig inaktiviert werden, vernachlässigbar klein. Tatsächlich ist eine solche Redundanz von Stabilisierungsfunktionen in natürlich vorkommenden Plasmiden mit geringer Kopienzahl weit verbreitet (Nordstrom und Austin, 1989). Zum Beispiel enthält der Sex-Faktor F von Escherichia coli eine aktive Partitionierungsfunktion (sop) und zwei Killing-Systeme (ccd und flm) (Loh et al., 1988; Golub und Panzer, 1988; Van Melderen et al., 1994, Niki und Hiraga, 1997). In ähnlicher Weise enthält des Arzneimittelresistenzplasmid pR1 die aktive Partitionierungsfunktion parA sowie das post-segregationale Killing-System hok-sok; daneben trägt es noch das vor kurzem definierte Killing-System kis-kid (Bravo et al., 1987; Bravo et al., 1988; Ruiz-Echevarria et al., 1995). In der hier angegebenen Arbeit zeigen wir, dass die Insertion eines noch vollständigeren Stabilisierungssystem, das aus sowohl einem post-segregationalen System als auch zwei Partitionsfunktionen besteht, in Vielkopie-ori15A-Replikons, unabhängig von den Induktionsbedingungen für die Expression des heterologen Antigens, die Stabilität dieser Expressionsplasmide in Abwesenheit einer Selektion drastisch verbessert. Nach einem 48-stündigen Passagierungsdurchgang ohne Selektion wurden die Plasmide, aufgrund des Umgehens der Letalität von Hok, jedoch möglicherweise aus der Bakterienpopulation verloren. Dieses Problem wurde vor kurzem von Pecota et al. (1997) angegangen, die berichteten, dass der Einbau von doppelten Killing-Systemen die Plasmidstabilität im Vergleich zu der Verwendung von hok-sok allein erheblich verbesserte; in diesen Plasmiden waren keine Partitionsfunktionen vorhanden. Vielleicht kann der Einbau des kis-kid-Killing-Systems, um dadurch das Komplement von pR1-Stabilisierungsfunktionen noch vollständiger darzustellen, für eine optimale Stabilität von Expressionsplasmiden in Lebensvektoren von S. typhi mit höherer Kopienzahl erforderlich sein; da kürzlich phd-doc-PSK-Kassetten konstruiert wurden, untersuchten wir auch die Kompatibilität dieser PSK-Funktion mit unseren Expressionsplasmiden pGEN211, pGEN222 und pGEN206.
Ein Vergleich der Stämme, die pGEN211 tragen (ein ori15A-Replikon, das hok-sok + par trägt, ~ 15 Kopien pro chromosomales Äquivalent) mit dem Plasmid pGEN142 mit viel geringerer Kopienzahl (ein ori101-Replikon, das hok-sok + par trägt,~ ~5 Kopien pro chromosomales Äquivalent) zeigt, dass unter den Bedingungen einer maximalen Induktion von P_ompC1 mit 300 mM NaCl, 57% einer Population von CVD 908-htrA(pGEN121), die nur 24 Stunden lang ohne Selektion passagiert wurden), mit einer mittleren Fluoreszenzintensität von 105,3 fluoreszieren; bei einer Population von CVD 908-htrA(pGEN142), die 96 Stunden lang ohne Selektion unter identischen Induktionsbedingungen passagiert wurden, behalten 94% der Bakterien, die mittels Durchflusszytometrie analysiert wurden, noch eine mittlere Fluoreszenzintensität von 47,7 bei. Auf der Basis solcher Ergebnisse mit GFPuv als Testantigen ist die Versuchung groß zu spekulieren, dass eine optimale Menge für ein heterologes Antigen, das dem menschlichen Immunsystem durch einen auf attenuiertem S. typhi basierenden Vektor-Lebendimpfstoff präsentiert wird, durch Senken der Kopienzahl der darin vorhandenen Expressionsplasmide auf vielleicht 5 Kopien pro chromosomales Äquivalent erhalten werden kann.
Die Effizienz des Auslösens einer gegen ein heterologes Antigen gerichteten Immunantwort wird zum Teil von der Fähigkeit des Lebendvektors, solche Antigene dem Immunsystem zu präsentieren, abhängen. Die Fähigkeit eines Lebendvektors, Antigene zu präsentieren, wird wiederum von der Stabilität der Vielkopie-Expressionsplasmide, die für die heterologen Antigene codieren, abhängen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Einbau eines Plasmiderhaltungssystems in Vielkopie-Expressionsplasmiden, ohne weitere genetische Manipulation des Lebendvektors, die Stabilität solcher Expressionsplasmide verbessert. Die Gegenwart von Vielkopie-Plasmiden kann jedoch auch die auf den Stoffwechsel bezogene Tauglichkeit des Lebendvektors beeinflussen. Dies ist deshalb relevant, weil einige fremde Antigene von Interesse einen schädigenden Effekt auf den Lebendvektor ausüben.
Obwohl wir uns nicht auf diese Theorie festlegen möchten, stellen wir zusammenfassend fest, dass der Stoffwechsel von CVD 908-htrA, die ein Vielkopie-Expressionsplasmid tragen, erheblich belastet wird; wenn die Kopienzahl und/oder die Menge der Genexpression zunimmt, nimmt die Belastung für den Stoffwechsel zu. Untersuchungen mit E. coli haben deutlich herausgestellt, dass Plasmid-tragende Bakterien langsamer wachsen als plasmidlose Bakterien (Boe et al., 1987; McDermott et al., 1993; Wu und Wood, 1994; Pecota et al., 1997; Summers, 1998). Es wurde auch gezeigt, dass, wenn die Kopienzahl zunimmt, die Wachstumsgeschwindigkeit solcher Stämme abnimmt; in ähnlicher Weise nimmt die Wachstumsgeschwindigkeit weiter ab, wenn die Induktion heterologer Gene zunimmt (Wu und Wood, 1994; Pecota et al., 1997). Natürlich würde ein spontaner Verlust des Plasmids jegliche Belastung des Stoffwechsels aufheben und zulassen, dass plasmidlose Bakterien schnell die Population von Plasmid-tragenden Bakterien überwachsen. In eleganten Studien zeigten Wu und Wood (Wu und Wood, 1994), dass Plasmid-tragende E. coli-Stämme die Plasmide unter Bedingungen, bei denen die Expression des klonierten Gens in 100 Stunden gering war, wenn diese in Abwesenheit von Selektion passagiert wurden, beibehielten; im Gegensatz dazu trat unter maximalen Induktionsbedingungen ein vollständiger Plasmidverlust innerhalb von 10 Stunden auf. Interessanter Weise wurden die Plasmide, wenn der hok-sok-Locus in diese Expressionsplasmide inseriert wurde, bei nichtinduzierten Bedingungen 300 Stunden lang und bei induzierenden Bedingungen 30 Stunden lang beibehalten. Eine solche Verschiebung in der Expression der Antigene innerhalb einer Population von Bakterien-Lebendvektor würde erwartungsgemäß die Effizienz der Stimulation irgendeiner für das fremde Antigen spezifischen Immunantwort reduzieren. Unsere Analyse führte uns zu der Schlussfolgerung, dass das Ziel für einen effektiven, multivalenten, auf S. typhi basierenden Vektor-Lebendimpfstoff ist, die Lebensfähigkeit mit Hilfe stabilisierter Expressionsvektoren mit geringer Kopienzahl zu optimieren, die in der Lage sind, hohe Mengen des heterologen Antigens als Reaktion auf ein aus der Umgebung stammendes Signal, dem die Impfstofforganismen in vivo wahrscheinlich dann begegnen, wenn sie eine geeignete ökologische Nische erreicht haben, zu exprimieren. Wir überprüfen derzeit diese Strategie unter Verwenden des murinen, intranasalen Modells, um die Immunogenität des Fragments C von Tetanus-Toxin zu untersuchen, das in CVD 908-htrA von unseren Expressionsvektoren pGEN211 (oriE1), pGEN222 (ori15A) und pGEN206 (ori101) exprimiert wird, wobei diese alle identische Plasmiderhaltungssysteme tragen und sich nur in ihrer Kopienzahl unterscheiden. Die hierin beschriebene Arbeit ermöglicht die Entwicklung von oralen, auf S. typhi basierenden Vektor-Lebendimpfstoffen in Einzeldosen, die in der Lage sind, schützende Immunreaktionen gegen viele, nicht miteinander verwandte, humane Pathogene zu induzieren.
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SEQUENZPROTOKOLL
Sequenzprotokoll

Claims

Ein Expressionsvektor, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche codiert: einen Replikationsursprung, welcher eine durchschnittliche Kopienzahl verleiht, die zwischen 2 und 75 liegt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: oriE1 (SEQ ID No.1), ori101 (SEQ ID No.3), ori15A (SEQ ID No.2) sowie Derivate davon, und welcher an beiden Enden von Transkriptionsterminatoren flankiert ist; wenigstens einer post-segregationalen Killerfunktion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus asd, ssb, phd-doc, kis-kid, und hok-sok, in welcher die flankierende Transkription von Orten, die wenigstens eine post-segregationale Funktion umgeben, divergent ist und die Wildtyp Transkriptionsniveaus nicht signifikant stören werden; und wenigstens eine Partitionierungsfunktion, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem par-Ort von pSC101 und dem parA des pR1, in welcher die flankierende Transkription von der wenigstens einen Partitionierungsfunktion weg fortschreitet; und einen ompC-Promotor mit folgender Sequenz: AGATCX¹X²TAAX3CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEQ ID NO: 36), in welcher X¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus G, C und A; X² ein Insert mit 1 bis 5 Nucleotiden bedeutet, und X³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus A, T, G und C.
Ein Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei er ferner eine Nucleotidsequenz umfasst, welche das interessierende Protein codiert, transkriptional kontrolliert durch den ompC-Promotor, in welcher die Nucleotidsequenz, welche das interessierende Protein codiert, einen transkriptionalen Terminator am 3' distalen Ende umfasst.
Ein Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, weiter umfassend ein Polynucleotid, welches einen selektierbaren Marker codiert.
Ein Expressionsvektor, umfassend eine Nucleotidsequenz codierend für: eine Replikationsursprungskassette mit: einer Nucleotidsequenz, welche einen Replikationsursprung codiert, welcher eine durchschnittliche Kopienzahl verleiht, die zwischen 2 und 75 liegt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: oriE1 (SEQ ID No.1), ori101 (SEQ ID No.3), ori15A (SEQ ID No. 2) und Derivate davon; einer ersten einzigartigen Restriktionsenzymspaltungsstelle, angeordnet 5' von der Nucleotidsequenz, welche den Replikationsursprung codiert; und einer zweiten einzigartigen Restriktionsenzymspaltungsstelle, angeordnet 3' von der Nucleotidsequenz, welche den Replikationsursprung codiert; wenigstens eine post-segregationale Killerkassette mit: einer Nucleotidsequenz, welche wenigstens eine post-segregationale Killerfunktion codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus asd, ssb, phd-doc, kis-kid, und hok-sok; einer ersten einzigartigen Restriktionsenzymspaltungsstelle, angeordnet 5' von der Nucleotidsequenz, welche die wenigstens eine post-segregationale Killerfunktion codiert und eine zweite einzigartige Restriktionsenzymspaltungsstelle angeordnet 3' von der Nucleotidsequenz, welche die wenigstens eine post-segregationale Killerfunktion codiert; wenigstens eine Partitionierungskassette mit: (i) einer Nucleotidsequenz, welche wenigstens eine Partitionierungsfunktion codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem par-Ort von pSC101 und dem parA von pR1; einer ersten einzigartigen Restriktionsenzymspaltungsstelle angeordnet 5' von der Nucleotidsequenz, welche die wenigstens eine Partitionierungsfunktion codiert und einer zweiten einzigartigen Restriktionsenzymspaltungsstelle, angeordnet 3' von der Nucleotidsequenz, welche die wenigstens eine Partitionierungsfunktion codiert; und eine Expressionskassette mit: (i) einer Nucleotidsequenz, welche einen ompC-Promotor codiert mit folgender Sequenz: AGATCX¹X²TAAX³CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEQ ID NO: 36), in welcher X¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus G, C und A; X² ein Insert ist mit von 1 bis 5 Nucleotiden; und X³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus A, T, G und C, (ii) einer ersten einzigartigen Restriktionsenzymspaltungsstelle angeordnet 5' von der Nucleotidsequenz, welche den Promotor codiert und (iii) einer zweiten einzigartigen Restriktionsenzymspaltungsstelle, angeordnet 3' von der Nucleotidsequenz, welche den Promotor codiert.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in welchem die durchschnittliche Plasmidkopienzahl innerhalb des Bereiches von etwa 5 bis etwa 60 Kopien pro Zelle liegt.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in welchem die Partitionierungsfunktion eine aktive Partitionierungsfunktion ist.
Ein Expressionsvektor nach Anspruch 6, in welchem die Nucleotidsequenz, welche die wenigstens eine Partitionierungsfunktion codiert, parA umfasst.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, in welchem die Partitionierungsfunktion eine passive Partitionierungsfunktion ist.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 8, in welchem die Nucleotidsequenz, welche die wenigstens eine Partitionierungsfunktion codiert, der par-Ort von pSC101 ist.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in welchem die post-segregationale Killerfunktion ssb ist.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in welchem X¹ G ist.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in welchem X² von 1 bis 4 Nucleotide aufweist.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in welchem X² 4 Nucleotide aufweist.
Ein Expresionsvektor nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in welchem X² 4 Nucleotide aufweist, welche unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus A, T und C.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in welchem X² ein Nucleotid oder eine Nucleotidsequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ATCT; ATC; AT; TCT; CT, TC, A; T; C; und T.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in welchem X² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C; und T.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in welchem X² ATCT ist.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, in welchem X³ A ist.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem der Ansprüche 4 bis 18, weiter umfassend eine Nucleotidsequenz, welche ein interessierendes Protein codiert, angeordnet am 3'-Ende der Nucleotidsequenz, welche den Promotor codiert.
Ein Expressionsvektor nach Anspruch 2 oder Anspruch 19, in welchem das interessierende Protein ein interessierendes Antigen ist.
Ein Expressionsvektor nach Anspruch 20, in welchem das interessierende Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem Krebsantigen und einem Autoimmunantigen.
Ein Expressionsvektor nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, in welchem das interessierende Antigen entgiftetes Shiga-Toxin umfasst.
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem der Ansprüche 20 bis 22, in welchem das interessierende Antigen Shiga-Toxin 2 umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Shiga-Toxin 2B Untereinheiten Pentamer und einem genetisch entgifteten Shiga-Toxin 2.
Ein Expressionsvektor nach Anspruch 23, in welchem die Nucleotidsequenz, welche das entgiftete Shiga-Toxin 2 codiert, modifizierte Segmente aufweist, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: (797) – ACA GCA GAC GCG TTA – (811) (SEQ ID NO: 37); (902) – CTG AAC CTA GGG CGA – (916) (SEQ ID NO: 38); (1345) – GAA TTC GCG ACC AGT – (1359) (SEQ ID NO: 39); und (1435) – GAA TCA GAT TCT GGA – (1449) (SEQ ID NO: 40).
Ein Expressionsvektor nach irgendeinem der Ansprüche 4 bis 24, ferner umfassend eine Selektionskassette mit (i) einem Polynucleotid, welches wenigstens einen selektierbaren Marker codiert; (ii) eine erste einzigartige Restriktionsenzymspaltungsstelle, angeordnet 5' von der Nucleotidsequenz, welche den wenigstens einen selektierbaren Marker codiert und (iii) eine zweite einzigartige Restriktionsenzymspaltungsstelle, angeordnet 3' von der Nucleotidsequenz, welche den wenigstens einen selektierbaren Marker codiert.
Ein Expressionsvektor nach Anspruch 3 oder Anspruch 25, in welchem der selektierbare Marker ein Protein ist, welches eine Resistenz auf ein Antibiotikum verleiht, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Aminoglyokosid, einem Chloramphenicol, einem Tetracylin und einem Carbenicillin.
Ein Expressionsvektor nach Anspruch 3, Anspruch 25 oder Anspruch 26, in welchem das Polynucleotid, welches den selektierbaren Marker codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus tetA, bla, aphA-2, und kan.
Eine Zelle umfassend den Expressionsvektor gemäß irgendeinem vorhergehenden Anspruch.
Eine Zelle nach Anspruch 28, in welchem die Zelle eine prokaryotische Zelle ist.
Eine Zelle nach Anspruch 29, in welchem die prokaryotische Zelle Salmonella typhi ist.
Ein attenuierter bakterieller Vektor-Lebendimpfstoff zur Verwendung in einem Verfahren zum Hervorrufen einer Immunantwort in einem Subjekt, wobei der attenuierte bakterielle Vektor-Lebendimpfstoff eine Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 28 bis 30 umfasst.
Ein attenuierter bakterieller Vektor-Lebendimpfstoff nach Anspruch 31 zur Verwendung wie dort spezifiziert, in welchem die Zelle Salmonella typhi ist.
Ein attenuierter bakterieller Vektor-Lebendimpfstoff nach Anspruch 31 oder Anspruch 32, wobei das Subjekt ein Mensch ist.
Ein Verfahren zum Herstellen eines attenuierten bakteriellen Vektor-Lebendimpfstoffs umfassend das Transformieren eines Bakterienstammes mit einem Expressionsvektor gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 27.