CN109321591B - 一种重组质粒及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组质粒及其构建方法，所述重组质粒的构建方法包括：(1)PCR法扩增Kan基因及其启动子，并将PCR产物电泳分析和回收纯化；(2)PCR法克隆pGFPuv质粒，并回PCR产物，但质粒中Amp和其启动子不进行克隆；(3)培养上述得到的基因与载体并转化挑取单克隆菌株进行鉴定测序，结果得到绿色荧光蛋白表达载体pKGFPuv；(4)将pKGFPuv转化到DH5α中，即得到重组质粒。本发明重组构建的质粒带卡纳抗性且能够稳定表达GFPuv蛋白，填补了如今带有GFPuv的质粒没有卡纳抗性的空缺，为很多生物学研究提供了很大的便利，同时也对微生物在生物体内的实时观测提供了很大的帮助。

Description

一种重组质粒及其构建方法
技术领域
本发明涉及微生物学、基因工程和蛋白质工程技术领域，具体地说，是一种重组质粒及其构建方法和应用。
背景技术
近年来，报告基因越来越多的应用于分子标记领域，能够编码表达产物易被鉴定的蛋白质或酶。近年来越来越多的研究者应用绿色荧光蛋白作为报告基因，该蛋白能够在蓝光下激发出绿色荧光，绿色荧光蛋白(GFP)是一种理的示踪标记，己经在生物技术、细胞生物学、转基因动物、环境工程、微生物学等领域得到广泛的应用。GFP具有：检测方便、无种属特异性、荧光性质稳定、无毒害、灵敏度高等优点。所以其应用广泛，GFP能够标记抗原或抗体，建立新型的免疫学诊断技术；GFP可与多种蛋白质组成融合蛋白，且不影响其本身特性，可标记外源基因在动物体中的表达等。然而GFP的突变体GFPuv除了具有以上特点外，还具有荧光强度更强，是GFP的45倍；GFPuv是可溶性蛋白，对细菌的毒性较低；同时对标记菌株的检测不需要特殊的设备，在长波紫外光条件下可直接检测。然而如今带有GFPuv的表达载体仅仅只含有氨苄抗性，这极大的限制了GFPuv的广泛应用，也对相关的分子生物学研究形成了一定的阻碍，但现如今很多抗生素的启动子并没有完全公布，这对质粒相关抗性的改造也极其不利。
因此目前需要将带有GFPuv的质粒进行改造，增加更多类型的抗性的质粒，以及一种可行的改造方法。
中国专利申请：CN103201383B公开了一种改性荧光蛋白，其特征在于，其为在与水母来源的野生型荧光蛋白或所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白的氨基酸序列的第144位和第145位之间相应的位置处插入有肽接头的改性荧光蛋白，其中，所述改性荧光蛋白的荧光特性对应施加于所述改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而发生变化。
中国专利申请：CN1254546C公开了一种基于绿色荧光蛋白检测细胞凋亡的方法。提供一种荧光蛋白构建体来用于检测在细胞凋亡中蛋白酶或半胱天冬酶的激活。该构建体含有一个供体荧光蛋白；一个受体荧光蛋白；以及一个连接头肽，其中的连接头肽含有半胱天冬酶的底物序列。连接头肽位于供体和受体蛋白之间。本发明还提供了该编码荧光蛋白构建物的核酸，含有该核酸的表达构建体以及含有这些核酸的基因传递载体。所述方法通过在适于供体荧光蛋白激发的条件下培养含有上述核酸和/或蛋白的宿主细胞的样本并检测样本中的荧光特性，其中细胞程序性死亡在样本细胞中的存在导致供体蛋白和受体蛋白之间的荧光共振能量转移的程度的变化。但是关于本发明一种重组质粒及其构建方法和应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种引物组。
本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供一种带卡纳抗性且能够稳定表达GFPuv蛋白的重组质粒。
本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述重组质粒的制备方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种引物组，包括2对引物对，所述引物对的引物序列如下，
引物对一：如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；
引物对二：如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。
所述引物序列如表1所示：
表1
Figure BDA0001837307690000021
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种带卡纳抗性且能够稳定表达GFPuv蛋白的重组质粒，它含有如上所述的引物组，所述重组质粒的制备方法如下：
(1)以pET-28a为模板使用权利要求1所示的引物对一通过PCR方法扩增Kan基因及其pET-28a中ori与Kan之间的序列；
(2)将步骤(1)PCR扩增得到的产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析和回收纯化；
(3)使用如权利要求1所述的引物对二通过PCR法克隆pGFPuv质粒上除Amp和其启动子的部分，并回收PCR产物；
(4)分别将步骤(2)得到的基因全长产物、步骤(3)得到的质粒、同源重组酶RecA、同源重组酶Buffer按照体积比为：20:20:7:6的比例混匀，室温放置45min，转化挑取单克隆体进行鉴定测序，得到重组质粒pKGFPuv。
作为本发明的一个优选实施方案，所述引物在设计时，在引物5’端引入同源重组序列，使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列(12～18bp)。
作为本发明的一个优选实施方案，所述方法还包括将步骤(4)得到的重组质粒pKGFPuv转化到DH5α中，将长出的大肠杆菌在荧光显微镜和紫外灯光的照射下，检测荧光信号，挑取单克隆菌落摇菌扩增并提取质粒。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种如上所述重组质粒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)以pET-28a为模板使用如上所述的引物对一通过PCR方法扩增Kan基因及其pET-28a中ori与Kan之间的序列；
(2)将步骤(1)PCR扩增得到的产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析和回收纯化；
(3)使用如权利要求1所述的引物对二通过PCR法克隆pGFPuv质粒上除Amp和其启动子的部分，目的是将质粒线性化的同时去除Amp和其启动子，并回收PCR产物；
(4)将步骤(2)得到的基因全长产物、步骤(3)得到的质粒、同源重组酶RecA、同源重组酶Buffer按照体积比为：20:20:7:6的比例混匀，室温放置45min，转化挑取单克隆体进行鉴定测序，得到重组质粒pKGFPuv。
作为本发明的一个优选实施方案，所述引物在设计时，在引物5’端引入同源重组序列，使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列(12～18bp)。
作为本发明的一个优选实施方案，所述方法还包括将步骤(4)得到的重组质粒pKGFPuv转化到DH5α中，将长出的大肠杆菌在荧光显微镜和紫外灯光的照射下，检测荧光信号，挑取单克隆菌落摇菌扩增并提取质粒。
本发明优点在于：
1、本发明提供了一种带卡纳抗性的且能够稳定表达GFPuv蛋白的质粒，转化该质粒的菌株具有很强的卡纳抗性，而且GFPuv蛋白也能稳定表达，该质粒很好的填补了如今带有GFPuv的质粒没有卡纳抗性的空缺，为很多生物学研究提供了很大的便利，同时对微生物如细菌，在生物体内的实时观测具有很大的帮助，对育种选育提供了一种新的方案。
2、本发明提供的重组质粒的制备方法，简便有效，通过本发明的制备方法将重组质粒pKGFPuv转化到DH5α中，结果发现在加有卡纳抗生素的培养皿中成功长出大肠杆菌，并且在荧光显微镜和紫外灯光的照射下，能够清晰的检测到荧光信号，通过挑取单克隆菌落后，进行摇菌扩增并提取质粒，发现在扩增60代后发现质粒表达依旧稳定。表明我们构建的pKGFPuv质粒同样可以应用于菌体在生物体内的实时观测，这对于繁育育种具有很大的帮助，具有很好的应用前景。
附图说明
附图1是本发明构建的重组pKGFPuv表达载体的基本结构流程图。
附图2是本发明构建的重组pKGFPuv表达载体的结构示意图。
附图3是在含有Kan培养皿中培养60代后的荧光显微镜下的照片结果图。
附图4是在含有Kan培养皿中培养20天后紫外光下的照片结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1重组质粒pKGFPuv的制备
一、实验方法
(一)PCR法扩增Kan基因及其启动子
(1)用消化酶DNase处理pET-28a，并以pET-28a为模板使用如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物对一通过PCR方法扩增Kan基因及其pET-28a中ori与Kan之间的序列；
(2)将上述PCR法扩增得到的基因产物在1％琼脂糖凝胶进行电泳分析和回收纯化。引物的设计时，在引物5’端引入同源重组序列，使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列(12～18bp)。所用引物的序列如表1所示。
pET-28a购自优宝生物科技有限公司，产品编号为：VT1207；
PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃30s；58℃30s；72℃1min；28循环；72℃10min；4℃保存。
(二)PCR法克隆pGFPuv质粒
利用消化酶消化pGFPuv质粒，使用引物对二SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，通过PCR法将消化后的pGFPuv质粒进行克隆，并回PCR产物。但质粒中Amp和其启动子不进行克隆，目的是将质粒线性化同时去除Amp和其启动子。所用的引物对二在表1中列出。
(三)取4ul上述PCR扩增得到的Kan基因全长和4ul pGFPuv质粒，加1.4ul同源重组酶RecA，1.2ul同源重组酶Buffer，混匀，室温放置45min，立即转化挑取单克隆体按照常规鉴定测序方法进行鉴定测序，并记录结果。
pGFPuv质粒购自Clontech公司，产品编号为：VYC0107；
PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃30s；58℃30s；72℃1min；28循环；72℃10min；4℃保存。
实验过程中所用到的引物序列如下表1所示：
表1
Figure BDA0001837307690000051
二、实验结果
鉴定测序结果表明，得到的重组质粒正确，是绿色荧光蛋白表达载体pKGFPuv。
实施例2重组质粒pKGFPuv的转化
一、实验方法
(一)电感受态细胞的制备
(1)将适合的冻存菌(DH5α)挑取一点加入盛有1ml LB液体培养基的15ml离心管中；37℃，220rpm，摇菌培养1个小时(复苏)；
(2)取10μl以下刚复苏的DH5α涂布于非抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养；
(3)高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用；
(4)准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用；
(5)第二天挑取单个前一天培养的细菌菌落加入3ml LB液体培养基里37℃，220rpm，摇菌培养12个小时；
(6)以1：100的比例取1ml菌液加入盛有100ml LB液体培养基的250ml摇瓶中37℃，220rpm，振摇2-3小时，定时监控OD.600值(培养1小时后每半小时测定一次)；
(7)当O.D.600值达到0.3-0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15min至30min；
(8)将100ml培养基转移至离心瓶中，4℃2500rpm下离心10min，弃上清液；
(9)加入2毫升灭菌冰水，用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞，然后加水至离心管的2/3体积稀释；
(10)4000rpm离心10分钟，小心弃去上清液；
(11)同步骤(9)用灭菌的冰水重悬浮细胞；
(12)4000rpm离心10分钟，小心弃去上清液；
(13)用20ml灭菌的、冰冷后的10％甘油重悬浮细胞；
(14)4000rpm离心10分钟，小心弃去上清液(甘油稀释的细菌离心后沉淀更松散，需小心弃液)；
(15)用10％甘油重悬细胞至最终体积为2-3ml；
(16)将细胞按照100ul/管等份装入微量离心管，于-80℃保存；
(二)细胞转化
(1)事先用无水乙醇清洗浸泡在无水乙醇中的电击杯，于超净台吹干，将实施例1制备得到的重组质粒pKGFPuv、800ul无抗生素LB和0.1cm的电击杯一起置于冰上预冷；
(2)在冰上解冻一管100ul的电感受态细胞，添加10ul重组质粒pKGFPuv，冰上培育5分钟；
(3)转移DNA混合物至冷却后的2mm电穿孔容器中，混匀后转入电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电击杯的底部；
(4)加载P1000，准备好800ulLB；
(5)对电穿孔容器进行脉冲；
(6)按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800ul的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中；
(7)37℃220rpm下培养细胞40min-1h以复原；
(8)5000rpm，5min，弃上清剩100ul，涂布到带有卡纳抗生素的琼脂平板上，放于37℃过夜培养，次日查看转化结果。
LB培养基按照如下表2所述试剂配制：
表2
蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
氯化钠 10g
再补足水至1L。
注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L，上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。
二、实验结果
结果表明，在加有卡纳抗生素的培养皿中，成功地长出了大肠杆菌。
实施例3检测
一、实验方法
将实施例2中长出的大肠杆菌放置于荧光显微镜和紫外灯光的照射下，检测并记录是否出现荧光信号。
二、实验结果
实施例2中长出的大肠杆菌在荧光显微镜和紫外灯光的照射下，检测到有荧光信号的出现。
实施例4摇菌扩增并检测
一、实验方法
挑取3ml实施例3中检测到荧光信号的大肠杆菌单菌落，对其按照常规方法进行摇菌扩增并提取质粒，观察并记录结果。
二、实验结果
实验结果发现在扩增60代后质粒表达依旧稳定。表明我们构建的pKGFPuv质粒同样可以应用于菌体在生物体内的实时观测，这将有助于繁育育种。
本发明提供了一种带卡纳抗性的且能够稳定表达GFPuv蛋白的质粒，转化该质粒的菌株具有很强的卡纳抗性，而且GFPuv蛋白也能稳定表达，该质粒很好的填补了如今带有GFPuv的质粒没有卡纳抗性的空缺，为很多生物学研究提供了很大的便利，同时对微生物如细菌，在生物体内的实时观测具有很大的帮助，对育种选育提供了一种新的方案。本发明提供的重组质粒的制备方法，简便有效，通过本发明的制备方法将重组质粒pKGFPuv转化到DH5α中，结果发现在加有卡纳抗生素的培养皿中成功长出大肠杆菌，并且在荧光显微镜和紫外灯光的照射下，能够清晰的检测到荧光信号，通过挑取单克隆菌落后，进行摇菌扩增并提取质粒，发现在扩增60代后发现质粒表达依旧稳定。表明我们构建的pKGFPuv质粒同样可以应用于菌体在生物体内的实时观测，这对于繁育育种具有很大的帮助，具有很好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海海洋大学
<120> 一种重组质粒及其构建方法
<130> /
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttttcgggg aaatgtggaa gatcctttga tcttttc 37
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtaaacttgg tctgacagtt agaaaaactc atcgag 36
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cacatttccc cgaaaagtgc c 21
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtatatatga gtaaacttgg tctgacag 28

Claims (2)

1.一种带卡纳抗性且能够稳定表达 GFPuv 蛋白的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)以 pET-28a为模板使用如 SEQIDNO.1 和 SEQIDNO.2所示的引物对通过PCR方法扩增Kan基因及其pET-28a中ori与Kan之间的序列；
(2)将步骤(1)PCR扩增得到的产物在 1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析和回收纯化；
(3)使用如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物对通过PCR法克隆pGFPuv质粒上除Amp和其启动子的部分，并回收PCR产物；
(4)分别将步骤(2)得到的基因全长产物、步骤(3)得到的质粒、同源重组酶RecA、同源重组酶 Buffer 按照体积比为：20:20:7:6 的比例混匀，室温放置45min，转化挑取单克隆体进行鉴定测序，得到重组质粒pKGFPuv。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤(4)得到的重组质粒pKGFPuv 转化到 DH5α中，挑取单克隆菌落摇菌扩增并提取质粒。
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