KR101342432B1 - 미세조류를 이용한 색소의 생산 방법 - Google Patents

미세조류를 이용한 색소의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세조류를 이용하여 색소를 생산하는 방법에 대한 것이다.

Description

미세조류를 이용한 색소의 생산 방법{PRODUCTION METHOD OF PIGMENT USING MICROALGAE}
본 발명은 미세조류를 이용하여 색소를 생산하는 방법에 대한 것이다.
헤마토코커스 종은 스트레스 조건하에서 두꺼운 세포와 함께 적색 포낭을 형성하는 녹색 운동성 식물플랑크톤이다. 헤마토코커스 종은 1797년 지로드-찬트란스(Girod-Chantrans)에 의해 최초로 발견되었다. 하젠(Hazen, T. E., 1899. The life history of Sphaerella lacustris. Mem. Torrey Bot. Club 6, 211-247.)은 항아리 또는 주기적으로 물이 채워지는 바다 근처의 얕은 웅덩이의 측면에 부착하는 선홍색 갑각(crust)으로서 일반적으로 발견되는, 헤마토코커스 종의 광범위한 생활사를 기재하였다. 이러한 조류는 적색 휴지기(red resting stage) 또는 녹색 유영기(green swimming stage) (다시 적색 휴지기로 이어짐)에서 발견된다. 이들은 또한 헤마토코커스 종이 아주 흔하며 또 유럽 전역에 광범위하게 분포하고 있고, 스칸디나비아에서부터 베니스까지, 버몬트에서 텍사스까지, 매사추세츠에서 네브라스카까지 그리고 그 보다 더 먼 서부까지 분포되어 있다고 보고하였다.
한국에 존재하는 헤마토코커스 종에 대한 보고는 발표되어 있지 않다. 자연계 생물들은 오랫동안 이들의 서식지역과 지역의 지배적인 비생물적 및 생물적 환경인자에 적응하여 왔음이 알려져 있고, 따라서 현지의 생물자원 생산에 대하여 진화론적으로 준비되어 있다. 본 발명자들은 유용한 미세조류를 찾아 생물자원 생산을 위한 천연적 미세조류 종을 조사하였으며, 이들을 이용하여 클로로필을 생산하는 방법을 연구하였다.
본 발명은 미세조류를 이용하여 색소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
배지를 준비하는 단계;
배지의 pH를 9.0 미만으로 조정하는 단계;및
상기 배지에 미세조류를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 색소의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 생산 방법은 색소를 높은 수율로 생산할 수 있다.
도 1은 한국의 KORDI 건물의 옥상의 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 샘플링 장소이다.
도 2는 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 형태학적 특징이다:(A) 녹색이며 큰 편모 미소개충(flagellated macrozooid), (B) 운동성이 없는 팔멜라(palmella) (C) 두꺼운 벽의 접합체(zygote) (D)딸세포를 포함하는 유주자(zoospore).
도 3은 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 계통발생적 위치를 보여주는 18S rDNA(A) 및 rbcL(B) 유전자 트리이다. Maximum Likelihood (ML) 및 Bayesian 방법을 이용하여 루트가 없는 유전학적 트리를 재구성하였다. 트리 토폴로지(topology)의 신뢰도는 각각의 노드에서 1000회의 부트스트랩(ML) 및 사후 확률((Bayesian)로 평가하였다.
도 4는 AKHM-1, 2, 3, 4, HK 및 FBBM 배지 내 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 최대 특정 성장률(umax/d) 및 바이오매스 생산량을 나타낸다. 바이오매스 생산량 및 색소 생산을 대표하는 클로로필 a 함량이다.
도 5는 AKHM-1, 2, 3, 4, HK 및 FBBM 배지의 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 바이오매스 생산량 및 pH 간의 연관성을 나타낸다.
도 6은 AKHM-1, 2, 3, 4, HK 및 FBBM 배지 내 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)이 생산한 색소인 클로로필 a 함량을 나타낸다.
도 7은 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 대량 배양에 사용한 관상 유리 섬유 탱크이다.
도 8 및 도 9는 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 최대 특정 성장률(umax/d), 바이오매스 생산량, 클로로필 a 함량 및 옥상-베이스의 배양 시스템에 온도 및 pH가 미치는 영향을 나타낸다.
본 발명은,
배지를 준비하는 단계;
배지의 pH를 9.0 미만으로 조정하는 단계;및
상기 배지에 미세조류를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 색소의 생산 방법에 대한 것이다.
배지
상기 배지는 하기 조성을 갖는 것이 바람직하다:
NaNO3, KNO3, P2O5, KH2PO4, MgSO4·7H2O, Mg(NO3)2·6H2O, Ca(NO3)2, K2SO4, Na2-EDTA·2H2O, FeCl3·6H2O, Co(NO3)·6H2O, MnSO4·5H2O, ZnSO4·7H2O, CuSO4·5H2O, (NH4)6Mo7O24·4H2O, 및 HNO3 .
더욱 바람직하게는 상기 배지는 200~240 mg/L NaNO3, 200~240 mg/L KNO3, 130~200 mg/L P2O5, 50~100 mg/L KH2PO4, 20~45 mg/L MgSO4·7H2O, 25~45 mg/L Mg(NO3)2·6H2O, 50~100 mg/L Ca(NO3)2, 25~45 mg/L K2SO4, 20~45 mg/L Na2-EDTA·2H2O, 0.5~1.5 mg/L FeCl3·6H2O, 0.01~1.0 mg/L Co(NO3)·6H2O, 0.01~1.0 mg/L MnSO4·5H2O, 0.01~1.0 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.001~0.1 mg/L CuSO4·5H2O, 0.001~0.1 mg/L (NH4)6Mo7O24·4H2O, 및 0.01~1.0 mL/L HNO3의 조성을 갖는다.
pH 조정
상기 배지의 pH는 9.0 미만으로 조정되며, 바람직하게는 7.50 ~ 8.75으로 조정된다.
상기 pH는 Na2CO3를 제외한 염기로 조정하며, 바람직하게는 KOH, NaOH 또는 이들의 혼합물로 조정되며, 더욱 바람직하게는 KOH 및 NaOH의 혼합물로 조정되고, 가장 바람직하게는 KOH 및 NaOH을 1:0.5~1.5의 중량비로 혼합한 혼합물로 조정된다.
미세조류
상기 미세조류는 헤마토코커스인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 헤마토코커스 에스피 KORDI03(Haematococcus sp. KORDI03)(수탁번호: KCTC12348BP)이다. 상기 헤마토코커스 에스피 KORDI03(Haematococcus sp. KORDI03)(수탁번호: KCTC12348BP)는 색소 생산능을 갖는다. 상기 색소는 아스타잔틴, 케르티노이드, 클로로필 등이며, 바람직하게는 클로로필이고, 더욱 바람직하게는 클로로필 a이다. 또한 상기 헤마토코커스 에스피 KORDI03(Haematococcus sp. KORDI03)(수탁번호: KCTC12348BP)는 서열번호 2의 rbcL 유전자 또는 이와 95% 이상의 상동성을 갖는 유전자를 갖는다. 또한 상기 헤마토코커스 에스피 KORDI03(Haematococcus sp. KORDI03)(수탁번호: KCTC12348BP)는 6500 룩스에서의 성장률보다 10000~94000 룩스에서의 성장률이 더 높으며, pH 7.50 내지 8.75에서 딸세포의 파괴 없이 성장이 가능하다.
배양
상기 배양은 10000~94000 룩스의 빛을 하루 평균 3시간 이상 조사하여 수행하며, 바람직하게는 10000~94000 룩스의 빛을 하루 평균 5시간 이상 조사하여 수행하고, 더더욱 바람직하게는 하루 평균 6시간 이상 조사하여 수행한다.
상기 배양은 바람직하게는 실외에서 수행되고, 더더욱 바람직하게는 직사광선이 비치고 바람이 부는 실외에서 수행된다.
색소
상기 색소는 미세조류가 생산하는 색소이다. 상기 색소는 아스타잔틴, 케르티노이드, 클로로필 등이며, 바람직하게는 클로로필이고, 더욱 바람직하게는 클로로필 a이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
재료 및 방법
FBBM(fortified Bold’s Basal Medium) 및 홍콩(HK) 배지는 구성성분들을 구입하여 각각의 배지의 조성대로 직접 제조하였다.
통계적 분석
성장 속도, 바이오매스 생산 및 클로로필 함량에서 차이는 원-웨이 ANOVA(SPSS, 통계 소프트웨어, 버전 11.5, 스코틀랜드 에딘버르 소재)에 의해 비교하였다.
<실시예 1> 단일 균주 배양물의 분리 및 형태학적 분석을 통한 확인
한국해양과학기술원(구 한국해양연구소, KORDI)의 다층 건물의 지붕 위에 비가 온 후 잔류한 물로부터 샘플을 수집하였다(도 1). 적색을 띄는 잔류하는 물 샘플을 실험실로 가져가서 현미경 조사로 그 속의 생물을 확인하였다. 광학 현미경(Olympus CXX41, U-TV1X-2, 일본)을 이용하여 살아있는 샘플을 관찰하였다. 그 후, 아판 등(Affan, A., Heo, S. J., Jeon, Y. J., Lee, J, B., 2009. Optimal growth conditions and antioxidant activities of Cylindrotheca closterium (Bacillariphyceae). J. Phycol. 45, 1405-1415)에 의해 기재된 입으로 빨아들이는 미세피펫(MSM) 방법을 이용하여 적색-형성 미세조류의 단일균주 배양물을 분리하였다. 단일균주의 영상은 현미경(Olympus CXX41)에 의해 얻었다. 분자 및 성장 연구를 위해 단일균주 보존액을 사용하였다.
상기 분리한 단일균주의 형태학적 특징은 도 2와 같다. 영양 세포는 쌍편모, 단일세포이며 넓게 둥근 단부를 갖는 난형 내지 타원체였다(도 2A). 원형질체는 얇은 분기형 또는 비분기형 세포질 가닥에 의해 연결된 세포벽을 분리하였다. 세포벽과 원형질체 사이의 공간은 수성 점액질, 젤라틴을 둘러싼 벽 물질(도 2B) 및 적혈구 세포(도 2B)를 닮은 두꺼운 벽의 휴지기 포낭에 의하여 채워졌다. 두꺼운 벽의 비-운동성 휴지기 접합자는 유주자의 발아 기간 (도 2C) 및 모세포 내 딸세포를 포함하는 유주자(zoospore)의 형성 기간까지 휴지기를 유지하였다(도 2D).
연구된 종의 형태학적 특징은 헤마토코커스 종 생활사 동안 4개 형태의 세포: 즉 미소개충(microzooid), 편모를 가진 큰 개충, 비-운동성 팔멜라(palmella) 형태 및 헤마토시스트(haematocyst)(무거운 단단한(resistant) 세포벽을 갖는 대형 적색 세포)를 발견한 엘리엇(Elliot A.M., 1934. Morphology and life history of Haematococcus pluvialis. Arch. Protistenk. 82, 250-272)에 의해 기재된 헤마토코커스 종의 형태학적 특징과 동일하였다. 무균 배양 동안, 유주자 내에서 30개 이상의 딸세포가 관찰되었다.
<실시예 2> 계통발생적 분석을 통한 확인
상기 균주가 신규 종인지 여부를 결정하기 위하여 계통발생을 연구하였다. 종 확인에 관하여는 분자적 및 형태학적 데이터 간에 무엇을 이용할지 논란이 있기는 하지만, 정확성을 위하여는 형태학적 및 분자적 접근법이 모두 필요하다. 종 기재에서 분자적 정보의 포함에 대한 형식적인 제한은 없으며(ICZN (1999) International code of zoological nomenclature, 4th ed. London: International Trust for Zoological Nomenclature) 또 분자 및 형태학적 데이터 모두를 포함하는 현대적 종 기재의 예는 다수 존재한다(Modeo, L., Petroni, G., Rosati, G., 2003. A multidisciplinary approach to describe protists: Redescriptions of Novistrombidium testaceum Anigstein 1914 and Strombidium inclinatum Montagnes, Taylor, and Lynn 1990 (Ciliophora, Oligotrichia). J. Euk. Microbiol., 50, 175-189).
제조자의 지시에 따라서 DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen, 미국)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 18SrRNA 유전자의 증폭은, 프라이머 쌍 SR1 (TAC CTG GTT GAT CCT GCC AG; Hanyuda et al. 2002) 및 약간 변형된 18SC2 프라이머인 18SC2M(5’-GCA GGT TCA CCT ACG GAR ACC-3’)(Bakker et al. 1994)을 사용하여 실시하였다. 이 반응 혼합물은 50 ng의 총 게놈 DNA, 0.2 mM dNTP, 0.1μM 농도의 각 프라이머, 10 mM 트리스-HCl (pH 9.0), 1.5 mM MgCl2, 40 mM KCl 및 2.5U Taq DNA 중합효소(Rexgene Biotech, 한국)를 총 부피 50 μl로 함유하였다. DNA 증폭은 다음 반응 조건하에서 써멀 사이클러(타카라 제조, 일본)에서 실시하였다: 94℃에서 5분간 초기 변성, 94℃에서 40초, 50℃에서 40초 및 72℃에서 2분간의 30주기, 및 72℃에서 10분 동안 최종 연장.
그 후 PCR 생성물을 TOPO TA 클로닝 키트(인비트로겐 제조, 미국)를 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터에 클로닝하였다. 형질전환된 대장균 세포를 X-gal에 의해 코팅된 LB-암플리실린 플레이트 상에서 12-16시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트로부터 백색의 포지티브 클론을 선택하고 또 5개는 더 가공하여 삽입 DNA를 서열결정하였다. DNA 서열결정화는 M13F-20(5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’) 및 M13R(5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)을 사용하여 한국의 마크로젠(Macrogen)에서 어플라이드 바이오시스템스 자동화 DNA 서열결정기(모델 377)에 의해 실시하였다. 증폭된 단편 중의 중간 영역의 DNA 서열결정화는 프라이머 18SJMID(5’-CAATAGCGTATATTTAAGTTG-3’)를 사용하여 실시하였다.
한편, rbcL 유전자는 녹조류(chlorophyta) 서열의 보존 영역을 기초로 하여 고안된 한 쌍의 PCR 프라이머를 사용하여 게놈 DNA로부터 증폭하였다. 정방향 프라이머는 ChlorRbc1F(5’-GCN GGT GTW AAA GAY TAY GG-3’)였고 또 역방향 프라이머는 ChlorRbc1R(5’-TAC CAC CWG AAG CWA CHG GCA-3’)였다. PCR 조건은 94℃에서 5분(1 번의 초기 변성 단계), 이어 94℃에서 40초, 50℃에서 40초, 또 72℃에서 1.5분간 30주기, 및 72℃에서 10분간의 1번의 부가적 주기였다. 약 1 kb-길이의 증폭된 생성물을 pCR2.1-TOPO 벡터에 클로닝하고 또 서열결정화하였다.
18S rRNA 및 rbcL 서열은 BLAST-N 서치를 이용하여 GenBank 데이터베이스로부터 얻은 관련 분류군의 서열과 비교하였다. 서열들은 컴퓨터 프로그램 MEGA, 버전 4.0을 이용하여 정렬하였다. 이들 서열 사이의 뉴클레오타이드 차 및 유전자 거리를 추산하였다. K2P 뉴클레오타이드 치환 모델을 사용하는 PhyML3.0 (Guindon et al., 2005)에 의한 최대우도법(maximum likelihood method) 및 4 x 4 코돈 모델을 갖는 Mrbayes (Huelsenbeck, J. P. and Ronguist, F., 2001. MrBayes: a program for the Bayesian inference of phylogeny. Bioinformatics. 17, 754-755)를 사용한 베이즈법(Bayesian method)을 이용하여 계통발생 트리(phylogenetic tree)를 재구성하였다. 최대우도법의 경우, 전이/전환 비율, 불변 부위의 비율, 및 감마 분포 변수는 4개의 치환 카테고리 및 1,000 레플리케이트의 부트스트래핑(bootstrapping)에 최적화되었다. 베이즈법의 경우, 세대수는 1,000,000 세대였고 매 100번째 세대마다 체인(chains)을 샘플링하여 체인의 최초 25%를 번-인(burn-in)한 후 각 노드(node)의 사후 확률을 산출하였다.
그 결과, 한국의 물에서 발견되는 헤마토코커스 종 KORDI#03으로부터 총 1,748 bp의 18SrRNA가 서열결정화되었는데(서열번호 1), 이는 H.라쿠스트리스(H.lacustris) 및 H.플루비알리스(H.pluvialis)의 서열과 아주 유사하였다(98-99%의 유사성)(도 3A). 그러므로, 상기 종은 그의 분자 계통발생에 따라 헤마토코커스 속 내에 위치하는 것으로 판단되었다.
<서열번호 1>
Figure 112013022319218-pat00001

또한, rbcL를 코딩하는 서열(서열번호 2)은 헤마토코커스 속 내에 위치하지만, 공지 헤마토코커스와 4% 이상 상이하였다(도 3B). 그러므로 상기 미생물이 헤마토코커스 속의 신규 종인 것으로 확인되었으며, 헤마토코커스 sp. KORDI03으로서 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(기탁번호: KCTC12348BP).
<서열번호 2>
Figure 112013022319218-pat00002

<실시예 5> 실험실 내 배양
상기 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 배양을 위하여 배지들을 제조하였으며, 이들은 (a) 영양분 주입을 통한 멸균처리 및 (b) 연약한 세포의 보호에 중점을 두고 제조하였다.
상기 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)를 배양한 결과, 편모를 가진 큰 개충(flagellated macrozooid)인 딸세포들은 pH가 9.5를 초과하자 세포가 깨지거나 가수분해되는 것을 알 수 있었다. 즉, 질소 공급원으로서 NaNO3 또는 KNO3를 0.50 내지 1.00 g/L로 부가하자, pH가 급격히 증가하여 1주 내에 9.0에 도달하였다. 대조적으로, 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 성장은 0.50 g/L미만의 NaNO3 또는 KNO3를 배지에 부가할 때 1주 이내에 억제되었다. 그러므로 질소 공급원을 상이하게 하여 증류수를 이용하여 배지를 준비하였다. 상기 배지는 pH < 3.00의 고 산성이었다.
상기 배양 배지를 아판-강(Affan-Kang) 헤마토코커스 배지(AKHM)라 칭하였다. AKHM의 화학 조성은 다음과 같았다: 220.0 mg/L NaNO3, 220.0 mg/L KNO3, 160.00 mg/L P2O5, 75.00 mg/L KH2PO4, 37.50 mg/L MgSO4·7H2O, 360.00 mg/L Mg(NO3)2·6H2O, 75.00 mg/L Ca(NO3)2, 37.25 mg/L K2SO4, 35.00 mg/L Na2-EDTA·2H2O, 0.90 mg/L FeCl3·6H2O, 0.05 mg/L Co(NO3)·6H2O, 0.05 mg/L MnSO4·5H2O, 0.100 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.02 mg/L CuSO4·5H2O, 0.08 mg/L (NH4)6Mo7O24·4H2O, 및 0.25 mL/L HNO3.
여기에 상기 배양 배지의 pH를 하기 염기들을 첨가함으로써 pH 7.50으로 조정하였다(표 1). 그리고 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)을 각각 AKHM-1 배지, AKHM-2 배지, AKHM-3 배지, AKHM-4 배지, FBBM(fortified Bold’s Basal Medium) 및 홍콩(HK) 배지에 접종하여 배양하였다.
배지 pH 조정 방법
AKHM-1 KOH: NaOH (1:1)
AKHM-2 KOH
AKHM-3 NaOH
AKHM-4 Na2CO3
성장 측정을 위하여, 샘플을 미리 중량측정된 GF/C 홧트만 필터지를 통하여 여과하였다. 미리 중량측정된 다른 필터지를 증류수에 침지하고 또 블랭크로 사용하도록 건조시켰다. 샘플을 함유하는 필터지는 55℃ 오븐에서 배양하고, 건조시키며, 중량측정하여 g/L로 표시하고 또 성장 곡선으로 그래프를 그렸다. 특정 성장 속도(μ)는 단위 시간 당 바이오매스(헤마토코커스 균주의 건조중량)에서의 증가로 정의하고, 하기 식 1(Pirt, S. J. Principle of Microbe and Cell Cultivation. (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1975) pp. 244.)을 이용하여 계산하였다:
<식 1>
μ(일(day)-1) = ln (X1/X0)/t1-t0
이 때, X0 및 X1은, 접종 및 최대 바이오매스 생산까지 사이의 시간 동안에서, 각각 초기(t0) 및 말기(t1) 때의 바이오매스(헤마토코커스 균주의 건조중량)이다.
색소 수준은 분광광도계로 측정하였다(퍼킨엘머 제조, 람다 35 uv/vis 분광기(브릿지포트 애비뉴, 쉘톤, CT 06484-4794, 미국)(Parsons, T. R., Maita, Y., Lalli, C. M., A manual of biological and chemical methods for seawater analysis. (Pergamon Press, Oxford, 1984) pp. 173).
결과
바이오매스 함량
헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)은 AKHM-1, AKHM-2, AKHM-3, AKHM-4, HK 및 FBBM 배지에서 성장률이 상이하였으며, 바이오매스 수율 역시 상이하였다. 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 AKHM-1, AKHM-2, AKHM-3, AKHM-4, HK 및 FBBM 배지에서의 각각의 최대 성장 속도(μmax/d)는 0.183, 0.178, 0.175, 0.133, 0.123 및 0.132/d이었다. 또한 바이오매스 수율은 AKHM-1, AKHM-2, AKHM-3, AKHM-4, HK 및 FBBM에서 각각 0.56, 0.52, 0.50, 0.25, 0.25 및 0.25 g/L이었다(도 4).
μmax/d는 AKHM-4, HK 및 FBBM 배지에서보다 AKHM-1, AKHM-2 및 AKHM-3 에서 훨씬 더 높았다(p > 0.5). 유사하게, 바이오매스 생산량 역시 AKHM-1, AKHM-2 및 AKHM-3 배지에서 더 높았으며, 특히 AKHM-1에서 가장 높았다(0.56 g/L).
또한 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)은 성장률은 상이할 수 있어도 모든 배양 배지 중 7.50 내지 8.75의 pH 범위 내에서는 세포 파괴 또는 성장 방해 없이, 즉 딸세포들의 파괴 없이 생장할 수 있다는 것이 확인되었다(도 5). 파괴된 세포 및 포낭은 동일 기간에 걸쳐 AKHM-1, 2 및 3에서보다는 더욱 신속하게 pH가 증가되는 AKHM-4, HK 및 FBBM 배지 중, pH > 9.50인 배지들에서 발견되었다.
이 중 AKHM-4 배지에서 신속한 pH 증가는, 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)가 Na2CO3중의 카보네이트의를 이용함으로써 NaOH가 생성되는 것과 관련이 있는 것으로 추측되었다.
바이오매스 생산 및 pH 사이에서 가장 높은 상관관계는 AKHM-1 중 pH 8.40에서 r2 = 0.92이었고 또 가장 낮은 상관관계는 FBBM에서의 r2 = 0.52이었다. 세포 성장 및 pH 사이의 상관관계는 pH > 9.00까지의 pH의 더욱 신속한 증가가 연약한 세포를 초래하고 또 성장을 중지시킨다는 것을 나타내었다.
클로로필 a
헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)를 AKHM-1, AKHM-2, AKHM-3, AKHM-4, HK 및 FBBM 배지에서 배양한 결과, 배지 내 클로로필 a 함량은 3.32 내지 12.72 mg/L 범위로 나타났다. 최저 클로로필 a 함량은 FBBM 배지에서 확인되었으며, 최고 클로로필 a 함량은 AKHM-1 배지에서 관찰되었다(도 6).
클로로필 a는 실험실 배양에서 AKHM-2 배지, AKHM-3 배지, AKHM-4 배지, HK 배지 및 FBBM-바이오매스보다 AKHM-1 배지의 바이오매스에서 현저히 높았다(p > 0.5).
<실시예 6> 대량 배양
상기 실시예 5에서 성장 효과가 가장 좋았던 AKHM-1 배지를 이용하여 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 대량 배양을 수행하였다. 도 7(A) 및 (B)에 도시된 관상 유리 섬유 탱크를 한국해양연구소의 옥상에 놓고, 여기에 AKHM-1 배지를 넣고 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)를 접종하여 대량 배양을 실시하였다.
그 결과, 헤마토코커스 sp. KORDI03(기탁번호: KCTC12348BP)의 바이오매스는 0.05에서 0.68 g/L로 증가하였으며, μmax는 0.170/d이었고 또 클로로필 a 함량은 19.56 mg/L이었다(도 8). 이를 상기 실시예 5와 비교하여 보면, AKHM-1 배지를 이용하여 실험실에서 수행하였던 것보다 실외에서 대량 배양한 것이 훨씬 바이오매스 생산 및 클로로필 a 함량이 높았다(p>0.05).
본 대량 배양 시험에서 광 세기는 바이오매스 생산에 영향을 주었으며, 클로로필 a의 함량을 증가시켰다. 실험실에서 광 세기는 6500 룩스인 반면, 옥외 광의 광 세기는 오전 10.00부터 오후 1.00까지 10000 내지 94000 룩스로 다양하였는데, 이러한 광 세기가 영향을 미친 것으로 판단된다(도 9).

한국생명공학연구원 KCTC12348BP 20130103
서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

  1. 200~240 mg/L NaNO3, 200~240 mg/L KNO3, 130~200 mg/L P2O5, 50~100 mg/L KH2PO4, 20~45 mg/L MgSO4·7H2O, 25~45 mg/L Mg(NO3)2·6H2O, 50~100 mg/L Ca(NO3)2, 25~45 mg/L K2SO4, 20~45 mg/L Na2-EDTA·2H2O, 0.5~1.5 mg/L FeCl3·6H2O, 0.01~1.0 mg/L Co(NO3)·6H2O, 0.01~1.0 mg/L MnSO4·5H2O, 0.01~1.0 mg/L ZnSO4·7H2O, 0.001~0.1 mg/L CuSO4·5H2O, 0.001~0.1 mg/L (NH4)6Mo7O24·4H2O, 및 0.01~1.0 mL/L HNO3의 조성을 갖는 배지를 준비하는 단계;
    KOH, NaOH 또는 이들의 혼합물을 이용하여, 상기 배지의 pH를 pH 7.50~8.75로 조정하는 단계;및
    상기 배지에 헤마토코커스 에스피 KORDI03(Haematococcus sp. KORDI03)(수탁번호: KCTC12348BP)를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는 클로로필의 생산 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 배지의 pH는 KOH 및 NaOH을 1:0.5~1.5의 중량비로 혼합한 혼합물로 조정되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 배양은 10000~94000 룩스의 빛을 하루 평균 3시간 이상 조사하여 수행하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  9. 삭제
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