WO2015041349A1 - 底面の微細藻類を種藻として用いる、微細藻類の液面浮遊培養方法、藻類バイオマスの製造方法、及び微細藻類 - Google Patents

底面の微細藻類を種藻として用いる、微細藻類の液面浮遊培養方法、藻類バイオマスの製造方法、及び微細藻類 Download PDF

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culture
medium
biofilm
culturing
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金原　秀行
松永　是
田中　剛
祐圭 田中
正記 武藤
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富士フイルム株式会社
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Definitions

  • the present invention relates to liquid surface suspension culture of microalgae. More specifically, the present invention can start the next culture without supplying new seed algae after collecting the algal bodies as the products.
  • the present invention is useful in the field of algal biomass production.
  • microalgae is cultured while dispersing the microalgae in the medium (hereinafter referred to as dispersion culture).
  • dispersion culture the medium
  • the agitation energy for dispersing the microalgae and centrifuging to collect the dispersed microalgae are collected.
  • Machine and flocculant are required. Therefore, the culture and recovery costs are extremely high.
  • extracting the product (useful substance) from the recovered microalgae the water content in the recovered product is increased, resulting in a very high amount of energy input to the drying process for increasing the microalgae concentration. Problems such as energy balance not being met have been pointed out (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Chlorococcum sp. (Chlorococcum sp.) May accumulate fatty acids in Non-Patent Document 3, and can be grown even in high carbon dioxide concentrations. However, it does not describe floating on the liquid surface. Moreover, although the chlorocock genus RK261 is mentioned in Non-Patent Document 5, there is no description that it floats on the liquid surface.
  • JP 2013-90598 A Japanese Patent Laid-Open No. 2005-40035
  • the present inventors have proposed a liquid surface floating culture method for culturing a microalgae while floating on a liquid surface while forming a biofilm on the liquid surface.
  • the liquid surface suspension culture method since the microalgae biofilm floats on the liquid surface, the algae can be collected without using a centrifuge or other devices, and it is a static culture. Energy for stirring is unnecessary, and this is a low energy and low cost culture method compared to the conventional method.
  • the present inventors collect a part of the water surface algae on the liquid surface and start the culture again from a state in which a part of the recovered material is floated on the liquid surface, It has been shown that it is possible to continuously cultivate seed algae without newly supplying seed algae by a method of collecting and recovering some water surface algae.
  • One of the problems to be solved by the present invention is to provide a new method for starting culture without newly preparing and supplying seed algae.
  • Another object of the present invention is to provide a method for solving this problem.
  • the medium used for culture at least once may contain a nutrient source for cultivation or may contain substances that inhibit the cultivation.
  • Another object of the present invention is to provide a method for solving this problem.
  • Another object of the present invention is to provide a method for solving this problem.
  • Another object of the present invention is to provide microalgae with a high growth rate and high oil content.
  • the present inventors have found a method of repeatedly performing a liquid surface floating culture method by utilizing bottom algae without newly preparing seed algae, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • a method for culturing microalgae comprising a second culturing step, in which a biofilm is formed on a liquid surface of a medium by culturing in a vessel.
  • the culture method according to [1], comprising a step of removing at least a part of the medium used in the first culture step and adding a fresh medium.
  • At least one component contained in the fresh medium that is at least 50 times the concentration of the medium used in the first culture step is selected from the group consisting of nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sulfur, and iron.
  • the removal of at least a part of the medium used in the first culturing step is removal of at least a part of the medium existing in the region between the liquid surface and the bottom surface.
  • the second culturing step includes collecting at least a portion of the formed liquid level biofilm and leaving at least a portion of the bottom microalgae in the incubator; [1] to [6], further comprising a third and subsequent repeated culturing steps, wherein the remaining bottom microalgae are cultured in the same incubator and the biofilm is formed on the liquid surface of the medium.
  • the culture method according to any one of the above.
  • the culture method according to [7], wherein in the second and subsequent culture steps, the amount of microalgae present on the bottom surface as seed algae is 5 mg / cm 2 or less.
  • the second and subsequent culturing steps at least a part of the medium used in the immediately preceding culturing step is removed.
  • the non-adherent microalgae on the bottom surface are removed together as seed algae.
  • both the non-adherent microalgae on the bottom surface are removed together, including the adherent and non-adhesive microalgae on the bottom surface.
  • the microalgae is Botryococcus sp. Chlamydomonas sp. , Chlorococcum sp, Chlamydomonad sp. Tetracystis sp. Characium sp. Or Protosiphon sp.
  • the microalgae is Botryococcus suduticus, or Chlorococcus sp.
  • the microalgae is Botryococcus sudueticus FERM BP-11420, or a microalgae having taxonomically identical properties, or Chlorococcus sp.
  • the culture method according to any one of [1] to [16] which is FERM BP-22262 or a microalgae having taxonomically identical properties.
  • a method for producing algal biomass comprising a culturing step including the culturing method according to any one of [1] to [17]; and a step of recovering the liquid biofilm formed in the second culturing step. .
  • liquid surface floating culture can be repeated without newly preparing seed algae.
  • the microalgae biofilm is subdivided by dispersing the microalgae on the bottom of the incubator into the medium, and the microalgae and the medium are separated from each other by leaving the surface of the incubator and the contact between the microalgae. Contact opportunities increase and the growth rate of microalgae can be improved.
  • the medium replacement method characteristic of the liquid surface suspension culture method nutrient components necessary for the culture are supplied into the medium, and the concentration of the culture inhibitory substance that is considered to be contained in the medium. As a result, the culture can be suitably performed.
  • microalgae having a high growth rate and a high oil content can be provided.
  • the schematic diagram of this invention (A) When the microalgae suspension is placed in the incubator (b) When allowed to stand for several seconds to several tens of minutes, and when the microalgae is deposited on the bottom surface (c) On the liquid surface and bottom surface by culturing (D) When the first substrate is contacted with the microalgae on the liquid surface, that is, when recovery by transfer is started. (E) The transferred microalgae biofilm is removed from the incubator. (F) When the microalgae biofilm on the liquid surface was recovered using the second substrate (g) The microalgae biofilm in the incubator was recovered by the second substrate, and the outside of the incubator (H) The microalgae biofilm on the liquid surface is removed.
  • composition of CSiFF04 medium In the liquid surface floating culture method, the amount of dry alga bodies after the culture when the culture is started using the bottom algae as the seed algae and when the culture is started using the input alga bodies prepared by the suspension treatment.
  • the culture was repeated four times.
  • the former used a bottom algae as a seed algae without using new microalgae, and the latter used a new incubator and a suspension treatment of 5 ⁇ 10 5 cells / mL for each culture.
  • Cultivation was started using the input alga bodies prepared in advance.
  • the data when bottom algae are used as seed algae from the plots of FIG. 2 are plotted again by the amount of dry algae with respect to the number of culture days.
  • the numerical range expressed using “to” means a range including the numerical values described before and after “to” as the lower limit value and the upper limit value.
  • microalgae sinks to the bottom surface means that most of the microalgae sinks to the bottom surface, and does not mean a state in which the microalgae completely disappear from the liquid surface, in the liquid, from the side of the incubator, or other surfaces.
  • a biofilm composed of microalgae is formed on the liquid surface as shown in FIG. 1 (c) (first culture step).
  • the structure changes from a film-like structure to a three-dimensional structure as the culture proceeds. This change is continuous.
  • microalgae are also present on the bottom of the incubator and are not shown in the figure. It is also present in the medium.
  • FIG. 1 (d) there is a method of collecting by a transfer method using a first substrate and a method of collecting by a deposition method using a second substrate as shown in (f) of FIG. is there.
  • the state where the substrate is taken out from the incubator is the state shown in FIGS. 1E and 1G, respectively.
  • the substrate to which microalgae is attached is moved out of the incubator, but the recovered material may be recovered from the substrate in the incubator.
  • FIG. 1 is a state after the biofilm on the liquid surface is collected.
  • microalgae remain on the bottom of the incubator.
  • a biofilm composed of microalgae is formed on the liquid surface as shown in FIG. 1 (c) (second culture step).
  • microalgae of the present invention refers to microalgae whose individual presence cannot be identified with the human naked eye.
  • the classification of microalgae is not particularly limited as long as it has the ability to form a biofilm on the liquid surface, and may be either prokaryotic or eukaryotic.
  • the microalgae is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.For example, indigo plant gate, gray plant gate, red plant gate, green plant gate, cryptophyte gate, haptophyte gate, Examples thereof include isophyllous plant gates, dinoflagellate plant gates, Euglena plant gates, and chloracarnion plant gates. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the microalgae green plant gates are preferable, and green algae are more preferable.
  • the genus Haematococcus sp. The genus Chlamydomonas sp., The genus Chlorococcum sp., And the genus Botryococcus sp.
  • the method for obtaining the above-mentioned microalgae is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, a method of collecting from nature, a method of using a commercially available product, a method of obtaining from a storage organization or a depository organization, etc. Is given.
  • microalgae used by this invention are what passed through the purification process.
  • a purification process is a process performed for the purpose of making microalgae into a single kind, and does not necessarily mean that only a single microalgae is made completely.
  • microalgae that produce intermediates and final products of pharmaceuticals, cosmetics, health foods, raw materials used in synthetic chemistry, oily substances such as hydrocarbon compounds, triglycerides, fatty acid compounds, and gases such as hydrogen. preferable. In the present invention, these are sometimes called products. Furthermore, in the present invention, the culture on the liquid surface and the recovery from the liquid surface are good, the growth rate is high, the oil content is high, and at least there is no odor during the culture, It is preferable to use microalgae that satisfy any one of the above that generation of toxic substances has not been confirmed.
  • the biofilm in the present invention refers to a microalgae structure (a microalgae aggregate or a microalgae film) attached to the surface of a rock or the like.
  • a film-like structure or a three-dimensional structure composed of microalgae existing on a surface with a good fluidity is also called a biofilm.
  • the biofilm in nature may contain garbage and plant fragments together with the target microalgae.
  • it if it is a sample obtained through a purification process, it contains these. May be.
  • the microalgae according to the present invention and the intercellular matrix secreted during the growth of the microalgae are more preferable.
  • the microalgae on the bottom surface also form a film-like structure, it can be called a biofilm.
  • the biofilm preferably has a structure in which individual microalgae adhere to each other directly or via a substance such as an intercellular matrix (for example, a polysaccharide).
  • a substance such as an intercellular matrix (for example, a polysaccharide).
  • such a film-like structure is often described as a biofilm.
  • microalgae capable of forming a biofilm on the liquid surface.
  • microalgae include Botriococcus sudeticus and genus Chlorococcum.
  • Botriococcus Sudetics AVFF007 strain hereinafter abbreviated as AVFF007 strain
  • FFG039 strain can be mentioned.
  • FFG039 strain was found to be Chlorococcum sp. Met.
  • AVFF007 strain The microalgae, AVFF007 strain used in the examples of this specification, has the accession number FERM BP-11420 on September 28, 2011 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Japan). It was deposited internationally by Fuji Film Co., Ltd. (2-30-30 Nishiazabu, Minato-ku, Tokyo, Japan) under the Butabest Treaty in Tsukuba, Higashi 1-chome, 1-Chuo, 6th Central, Ibaraki Prefecture. The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center has been in operation since April 1, 2012. The National Institute of Technology and Evaluation, Patent Biological Depositary Center (Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) Kazusa Kamashika 2-5-8 Room 120).
  • AVFF007 strain is a novel strain of freshwater microalgae isolated by the present inventors from a freshwater pond in Kyoto, Japan.
  • the AVFF007 strain was analyzed by BLAST based on the data of National Center for Biotechnology Information (NCBI) of a part of the base sequence of the 18S rRNA gene (SEQ ID NO: 1, FIG. 7).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Botryococcus sp. It was identified as a microalgae closely related to the UTEX2629 (Botryococcus sudeticus) strain (1109 bases on the AVFF007 strain side were the same among 1118 bases on the UTEX2629 strain side).
  • the AVFF007 strain is Characiopodium sp.
  • Mary 9/21 is a closely related microalgae with T-3w and may be changed to the genus Characiopodium in the future.
  • the name of the AVFF007 strain is changed, and the name of the AVFF007 strain is also changed when the name is changed to other than the genus Characiopodium.
  • AVFF007 strain having the same taxonomic properties as the AVFF007 strain can be used.
  • the taxonomic properties of AVFF007 strain are shown below.
  • Taxonomic properties of AVFF007 strain Morphological properties It has a green circle shape. It is free-floating and can grow on the liquid and bottom surfaces. It grows on the liquid surface and forms a film-like structure. The size is 4 to 30 ⁇ m (algal bodies on the liquid surface are relatively large and alga bodies on the bottom surface are relatively small). Along with the growth, bubbles are generated on the liquid surface, and these overlap to form a three-dimensional structure. Produce oil. 2.
  • the medium can be sterilized at 121 ° C for 10 minutes.
  • the culture period (approximately the period until reaching the stationary phase) is 2 weeks to 1 month depending on the amount of algal bodies used initially. Usually, it can be cultured at 1 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • Optical requirement Necessary. Light intensity: 4000 to 15000 lux, light / dark cycle: light period 12 hours / dark period 12 hours. When subcultured, it can be cultured at 4000 lux.
  • the AVFF007 strain can be stored by subculture according to the above culture properties (culture method). Planting can be performed by collecting microalgae floating on the liquid surface, dispersing by pipetting, etc., and then dispersing in a new medium. In addition, although microalgae are sinking on the bottom of the incubator immediately after the subculture, biofilms start to form on the liquid surface in about one week. Microalgae can float on the liquid surface and proliferate immediately after the passage. The planting interval is about one month. If it becomes yellowish, pass it on.
  • the strain having the same taxonomic characteristics as the AVFF007 strain is a microalgae, and its 18S rRNA gene is at least 95.0%, preferably 98.0%, with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. %, More preferably 99.0%, even more preferably 99.5%, most preferably 99.9%.
  • FFG039 strain The microalgae FFG039 used in the examples of the present specification was collected by the present inventors in Nara Prefecture, Japan. Compared with AVFF007 strain, it has good growth and oil productivity. In addition, the biofilm structure is not easily broken and is easy to collect.
  • the FFG039 strain is Chlorococcum sp. As a result of gene sequence analysis of 18S rRNA, the species was closely related to the microalga Chlorococcum sp. RK261. In the present invention, newly isolated microalgae are added to Chlorococcus sp. It was named FFG039.
  • the identity of a part of the region with the base sequence corresponding to Chlorococcum RK261 is 95.00% or more and 99.99% or less. More preferred.
  • the “partial region” mentioned here means a region of 1000 base sequences or more. When testing for identity, testing for identity using the entire base sequence is the most reliable, but determining the total base sequence is technically and costly except for a very small number of species.
  • the base sequence of the chlorococcum RK261 strain also corresponds to a specific part (specifically, the base sequence of Chlorococcum sp.
  • FFG039 strain FFG039 strain
  • FFG039 strain FFG039 strain
  • attribution is possible if about 1000 base sequences are read.
  • the identity was tested by comparing the nucleotide sequences of “partial regions”, but the reliability is considered to be sufficiently high.
  • the Japanese name of Chlorococcum was in accordance with the Japanese name described in Freshwater Algae, Takatsuki Yamagishi, Uchida Otsukuru.
  • the microalgae, FFG039 strain used in the examples of this specification has the accession number FERM BP-22262 on February 6, 2014, Japan Patent Evaluation Center (Japan) It has been deposited internationally by Fuji Film Co., Ltd. (2-30-30 Nishiazabu, Minato-ku, Tokyo, Japan) under the Butabest Treaty, 2-5-8, Kazusa Kamashitsu, Kisarazu City, Chiba Prefecture.
  • the FFG039 strain is a novel strain of freshwater microalgae belonging to the genus Chlorocoum isolated by the present inventors from a pond in Kyoto Prefecture.
  • the method for isolating the microalgae hereinafter, also referred to as “pure sterilization”
  • the process for determining the FFG039 strain of the microalgae as a new strain will be described.
  • This petri dish was set up for plant bioshelf tissue culture and cultured at 23 ° C. under continuous light irradiation of 4000 lux. After about 2 weeks, a green colony appeared on the agarose gel. Using a sterilized bamboo skewer (As One Co., Ltd., 1-5980-01), the colony was attached to the tip, and 2 mL of CSiFF04 medium was added. It was suspended in the well of a 24-well plate. A 24-well plate containing microalgae prepared in this way was installed for plant bioshelf tissue culture, and cultured at 23 ° C. under continuous light irradiation of 4000 lux.
  • [Cultural properties] -During cell proliferation, it proliferates with zoospores. A large number of zoospores are generated from one cell. ⁇ Photoautotrophic culture by photosynthesis is possible. -Nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sulfur, manganese, and iron are essential for growth. In addition, if zinc, cobalt, molybdenum, and boron are contained, it grows suitably. The addition of vitamins also promotes growth.
  • ⁇ Accumulates oil in the algae and accumulates up to 40% by weight in dry weight ratio.
  • Oil accumulates hydrocarbon compounds and fatty acids.
  • Fatty acids produce palmitic acid, palmitoleic acid, oleic acid, vaccenic acid, linoleic acid, linolenic acid, etc., and especially palmitic acid and oleic acid are the main components.
  • Hydrocarbon compounds produce decane, heptadecane, and the like.
  • the FFG039 strain was cultured by introducing 50 mL of CSiFF04 medium into a 100 mL Erlenmeyer flask, adding 0.5 mL of 1000 ⁇ 10 4 cells / mL FFG039 strain solution, and shaking culture under light irradiation at 25 ° C. for 14 times. Went for days.
  • 40 mL of the medium containing the FFG039 strain obtained as described above was centrifuged at 6000 ⁇ g and 4 ° C. for 10 minutes using a centrifuge (MX-300 (manufactured by Tommy Seiko)). After removing the supernatant, the solid was frozen in a container using liquid nitrogen, transferred to a mortar that had been cooled in advance with liquid nitrogen, and a pestle that had been cooled in advance with liquid nitrogen. Used to grind.
  • a sample for PCR was prepared by diluting 10 4 times with ultrapure water.
  • an 18S rRNA gene region (rDNA region) was used.
  • GeneAmp PCR System 9700 manufactured by Applied Biosystems
  • a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 50 seconds, and 72 ° C. for 10 seconds was performed 30 times.
  • the enzyme used was Prime Star Max (manufactured by Takara Bio).
  • the obtained PCR product was confirmed to be a single band by 1% agarose electrophoresis.
  • cycle sequencing was performed using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (manufactured by Applied Biosystems). Conditions followed the manual.
  • the obtained reaction product was subjected to decoding of the base sequence using ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (manufactured by Applied Biosystems). This was subjected to the same analysis by BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
  • the method is a BLAST search of the above-mentioned sequences against the entire base sequence information on the data of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), and the species with the highest identity with the related species of FFG039 strain did.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the 1650 bases on the RK261 strain side had identity (ie, 99.94% identity). Therefore, the FFG039 strain is Chlorococcum sp. It was classified as a microalgae closely related to the RK261 strain.
  • FIG. A system diagram obtained as a result of the above analysis is shown in FIG. In the present invention, when the name of the chlorocock is changed, the name of the FFG039 strain is also changed.
  • a strain having the same taxonomic characteristics as the FFG039 strain can be used.
  • the taxonomic properties of the FFG039 strain are shown below.
  • microalgae with taxonomically the same properties as FFG039 strain, Chlorococcum sp.
  • the microalgae belonging to the genus include those whose 18S rRNA gene has at least 99.94% sequence identity with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • floating culture In the present invention, culturing microalgae dispersed in a medium is called floating culture. In the present invention, culture on the liquid surface is not called suspension culture. The suspension culture is not performed in the main culture process, but can be used according to the purpose in the preculture process.
  • liquid surface floating culture the culture method for culturing microalgae on the liquid surface
  • the culture method for culturing microalgae on the liquid surface is called liquid surface floating culture.
  • liquid surface floating culture even if microalgae are simultaneously present on the bottom surface, side surface, other surface of the incubator, or in the culture medium, when the main purpose is culture on the liquid surface, it is called liquid surface floating culture.
  • a lot of foam is present on the liquid surface along with the biofilm, and the position of the liquid surface may not always be clear, and the biofilm may be submerged slightly below the liquid surface due to its own weight.
  • the term “on the liquid surface” includes such a case as well as a complete liquid surface.
  • the culture method in which microalgae are cultured in the liquid is not included in the liquid surface floating culture.
  • the liquid surface in the present invention is typically the liquid surface of a liquid medium described later, and is usually an interface between the liquid medium and air. Moreover, when water becomes a main component, it is a water surface.
  • liquid surface suspension culture is performed in the present invention, a phenomenon that a pleated structure enters a liquid from a biofilm on the liquid surface may be seen. In the present invention, the culture in such a situation is also included in the liquid surface suspension culture.
  • Seed algae for performing liquid surface suspension culture may be added to the incubator after suspension treatment, and after addition of the seed algae, stirring is performed to promote mixing with the liquid medium. Also good.
  • the pre-culturing step of the present invention is a step of growing the preservation microalgae obtained after the purification step is completed and increasing the number of microalgae until the main culture can be performed.
  • the culture method of the pre-culture process can be selected by any known culture method. For example, a dispersion culture method, an adhesion culture method, a liquid surface floating culture developed by the present inventors, or a culture method of the present invention can be performed.
  • the pre-culture process may be performed several times in order to grow microalgae to a scale that allows main culture.
  • static culture may be performed according to the purpose, or non-static culture such as shaking culture may be performed.
  • the pre-culture process may be performed a plurality of times in order to grow microalgae to a scale where main culture can be performed.
  • a culture vessel having a surface area of 1 cm 2 to 1 m 2 or less is used, and the culture can be performed both indoors and outdoors.
  • the main culturing step in the present invention refers to a culturing step after performing a pre-culturing step, and refers to a culturing step up to immediately before performing a final recovery step.
  • the “first culturing step”, “second culturing step” and third and subsequent steps in the present invention correspond to the main culturing step.
  • the main culturing step depends on the density of microalgae at the start of culture, the main culturing step can be completed when a sufficient amount of microalgae biofilm is formed on the liquid surface.
  • the main culturing step can be completed in, for example, several days to several weeks, more specifically, 5 days to 4 weeks.
  • the first culturing step refers to the period from the preparation of a microalgae suspension and the start of culturing until the formation of a microalgae biofilm on the liquid surface. This refers to the period from the start of culturing using the microalgae not recovered but remaining on the bottom surface or the like as seed algae until the formation of a microalgae biofilm on the liquid surface.
  • the n-th culturing step means that after the culturing step (n-1), the microalgae biofilm is formed on the liquid surface after culturing using the microalgae remaining on the bottom surface as seed algae. Until it is formed.
  • the second and subsequent cultures include the second culture step, and if present, include the third culture step and the fourth culture step. Moreover, in order to distinguish clearly a 1st culture process from a pre-culture process, it may be called a 1st main culture process. The same applies to the second and subsequent culture steps.
  • an incubator having a surface area of 100 cm 2 or more can be used to cultivate indoors or outdoors, but outdoor culture is preferred.
  • main culture process may be repeated any number of times. In the present invention, it is necessary to carry out main culture at least twice.
  • the seed algae in the present invention refers to the microalgae used at the start of the preculture process or the main culture process, and refers to the microalgae that are the source of the culture of the microalgae in the preculture process or the main culture process. . Furthermore, some of the microalgae obtained in the recovery process may be used as seed algae.
  • the bottom algae in the present invention refer to microalgae existing near the bottom of the incubator. Among them, there are those that adhere to the bottom surface and do not peel off from the bottom surface with a light liquid flow, and non-adhesive bottom algae that exist near the bottom surface and move even with a light liquid flow level. In addition, the bottom algae that have been separated from the microalgal biofilm by the collecting operation and have settled to the vicinity of the bottom can also be included in the non-adhesive bottom algae in the present invention.
  • the supply of microalgae to the liquid surface is performed from the bottom surface, but the microalgae are also present in the medium other than the liquid surface and the bottom surface with a low concentration. In some cases, these may be a source of seed algae.
  • the supply of microalgae from the bottom of the incubator to the liquid surface means that the microalgae move on the liquid surface without the growth of the microalgae on the bottom surface, and the microalgae grow while moving from the bottom to the liquid surface. If you have both.
  • a microalga obtained through the sterilization step is dispersed in a liquid medium containing an artificial medium to prepare a suspension or dispersion containing the microalgae.
  • a microalgae biofilm is formed on the liquid surface of the liquid medium, and the microalgae that have grown from the liquid surface of the incubator are collected.
  • a microalgae biofilm is again formed on the liquid surface.
  • the greatest feature of the present invention is that the microalgae on the bottom surface remaining after collecting the microalgae on the liquid surface are reused as seed algae. Therefore, in the present invention, the main culturing step is performed twice or more, but the liquid culture algae obtained by culturing the first culture in the first culture and the first culture is collected, and the remaining bottom surface is The method of culturing using algal cells is sometimes referred to as second culture.
  • the medium can be reused. That is, if nutrient components remain in the medium, the used medium may be used as it is, and the culture may be continued, or a part of the used medium may be discarded and a new medium may be added.
  • the amount of the new medium added may be the same as the waste amount, or may be smaller or larger.
  • the addition of a new medium is more preferable from the viewpoint of improving the growth rate of microalgae in the subsequent main culture.
  • a new medium When adding a new medium, it may be added in a state in which nutrient components are dissolved in a liquid, or may be added as a solid content. When added as a solid content, it may be necessary to stir the medium, so it is more preferable to add it in a state dissolved in a liquid.
  • a medium having the same component as that used in the main culture in the previous stage may be used, or a medium having a different component may be added.
  • the fresh medium whose specific component is high concentration can be added with respect to the culture medium used for culture
  • a specific component is not specifically limited, For example, it is a compound containing either selected from the group which consists of nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sulfur, and iron.
  • the concentration is preferably 1.01 to 100,000 times, preferably 10 times that of a normal case. It is more preferably 10000 times or less and most preferably 50 times or more and 5000 times or less.
  • the concentration of a specific component of the fresh medium is less than 1.01 times, a lot of water is required for its production, and further, the transportability decreases as the distance between the place where the fresh medium is prepared and the place where the incubator is installed increases.
  • various problems such as the need for various devices such as a fresh medium storage container and a fresh medium supply to the incubator are considered. .
  • the amount of the medium in the incubator increases. For example, when 1.01 times the concentrated liquid is added to the incubator, assuming that the medium components in the incubator are almost zero, It dilutes to a concentration of about 1/2. By these things, possibility that a growth rate and a growth amount will fall is high.
  • the specific component concentration of the medium is more than 100,000 times, the amount of the medium solution becomes very small and the transportability and the efficiency of introducing the concentrated medium into the incubator are improved.
  • the solubility is poor. Become.
  • unnecessary precipitates may be generated upon introduction into the incubator and may not dissolve even after being diluted by stirring in the incubator. As a result, the growth rate and amount of microalgae may decrease.
  • the component composition of the fresh medium can be the same as the medium component composition in the incubator, but a fresh medium composed of different components may be added. Furthermore, the same medium and components may be used in the incubator. Moreover, the fresh medium prepared so that the component of the culture medium in a culture device and the final density
  • the medium may be removed from any part, but it is more preferable to remove from the place except the bottom part from the viewpoint of suppressing the outflow of microalgae on the bottom part.
  • the microalgae in the intermediate region excluding the liquid surface and the bottom surface part are also present. Since the abundance is small, it is preferable to collect from this region. That is, the removal of the culture medium can be performed so as to remove at least a part of the culture medium existing in the region between the liquid surface and the bottom surface.
  • zoospores are present in a region where the microalgae are not substantially present or are not visually observed, but the zoospores are not visually observed because they are much smaller than the alga bodies. .
  • a part of the bottom algae may be peeled off and dispersed in the medium. By doing in this way, it becomes possible to contact more algae in a state in which only a part of the alga bodies can be in contact with the culture medium, and it is possible to suitably improve the growth rate. It is.
  • Non-adherent microalgae present on the bottom surface may be removed. This is because if the microalgae are present unnecessarily on the bottom surface, a decrease in the growth rate considered to be caused by unnecessary consumption of nutritional components is observed. Moreover, you may prepare the abundance of the bottom face algae used as a seed algae. This is because appropriate culture can be performed.
  • the amount of microalgae on the bottom surface when starting the culture is preferably 0.001 ⁇ g / cm 2 or more, more preferably 0.1 ⁇ g / cm 2 or more, further preferably 0.1 mg / cm 2 or more, and 1 mg. / Cm 2 or more is more preferable, and 2 mg / cm 2 or more is more preferable.
  • the ratio of the amount of microalgae before and after culturing can be increased in a short time, which is preferable.
  • the abundance of microalgae on the bottom surface of the order to start the culture is preferably 100 mg / cm 2 or less, more preferably 10 mg / cm 2 or less, 5 mg / cm 2 or less is more preferred.
  • a microalgae sample subjected to suspension treatment may be used. This is because by performing the suspension treatment, the microalgae in the solution become uniform and the film thickness after the culture becomes uniform, and as a result, the amount of microalgae per culture area may increase.
  • the suspension treatment any known method can be used. However, pipetting, shaking the microalgae solution in the container by hand, weak treatment such as treatment with a stirrer chip or a stir bar, ultrasonic treatment, Examples thereof include a strong treatment such as a high-speed shaking treatment and a method using a substance such as an enzyme that degrades an adhesive substance such as an intercellular matrix.
  • the shape of the incubator can be any known shape as long as the medium can be retained.
  • an indefinite shape such as a columnar shape, a square shape, a spherical shape, a plate shape, a tube shape, or a plastic bag can be used.
  • Various known methods such as an open pond (open pond) type, a raceway type, and a tube type (J. Biotechnol., 92, 113, 2001) can be used.
  • Shapes that can be used as incubators are described, for example, in Journal of Biotechnology 70 (1999) 313-321, Eng. Life Sci. 9, 165-177 (2009). Can be mentioned. Among these, it is preferable from the viewpoint of cost to use an open pond type or a raceway type.
  • the incubator that can be used in the present invention can be either an open type or a closed type, but it prevents diffusion of carbon dioxide outside the incubator when using a higher carbon dioxide concentration than in the atmosphere. Therefore, it is preferable to use a closed type incubator.
  • a closed type incubator By using a closed type incubator, it is possible to minimize the contamination of microorganisms other than the purpose of culture and dust, the suppression of medium evaporation, and the adverse effects of wind on the biofilm structure.
  • culture in an open system is preferable from the viewpoint of low construction costs.
  • substrate in this invention is a solid-state thing used by (e) and (g) of FIG.
  • the shape of the substrate may be any shape such as film, plate, fiber, porous, convex, corrugated, but it is easy to transfer and easy to recover microalgae from the substrate.
  • the film shape or the plate shape is preferable.
  • the materials for the incubator and the substrate that can be used in the present invention are not particularly limited, and known materials can be used.
  • a material composed of an organic polymer compound, an inorganic compound, a metal, or a composite thereof can be used. It is also possible to use a mixture thereof.
  • Organic polymer compounds include polyethylene derivatives, polyvinyl chloride derivatives, polyester derivatives, polyamide derivatives, polystyrene derivatives, polypropylene derivatives, polyacryl derivatives, polyethylene terephthalate derivatives, polybutylene terephthalate derivatives, nylon derivatives, polyethylene naphthalate derivatives, polycarbonate derivatives.
  • Polyvinylidene chloride derivatives polyacrylonitrile derivatives, polyvinyl alcohol derivatives, polyethersulfone derivatives, polyarylate derivatives, allyl diglycol carbonate derivatives, ethylene-vinyl acetate copolymer derivatives, fluororesin derivatives, polylactic acid derivatives, acrylic resin derivatives, An ethylene-vinyl alcohol copolymer, an ethylene-methacrylic acid copolymer, or the like can be used.
  • inorganic compound glass, ceramics, concrete, or the like can be used.
  • metal compound an alloy such as iron, aluminum, copper, and stainless steel can be used.
  • a part of the material for the substrate and the incubator is composed of at least one selected from glass, polyethylene, polypropylene, nylon, polystyrene, vinyl chloride, and polyester.
  • the materials of the incubator and the substrate may be the same or different.
  • the light receiving surface is preferably a material that transmits light, and more preferably a transparent material.
  • any known medium can be used as long as microalgae can be cultured.
  • Known media include AF-6 medium, Allen medium, BBM medium, C medium, CA medium, CAM medium, CB medium, CC medium, CHU medium, CSi medium, CT medium, CYT medium, D medium, ESM medium, f / 2 medium, HUT medium, M-11 medium, MA medium, MAF-6 medium, MF medium, MDM medium, MG medium, MGM medium, MKM medium, MNK medium, MW medium, P35 medium, URO medium, VT medium, Examples include VTAC medium, VTYT medium, W medium, WESM medium, SW medium, SOT medium, and the like.
  • those that are fresh water are AF-6 medium, Allen medium, BBM medium, C medium, CA medium, CAM medium, CB medium, CC medium, CHU medium, CSi medium, CT medium, CYT medium, D medium, HUT medium.
  • M-11 medium MA medium, MAF-6 medium, MDM medium, MG medium, MGM medium, MW medium, P35 medium, URO medium, VT medium, VTAC medium, VTYT medium, W medium, SW medium, SOT medium is there.
  • the medium for culturing the aforementioned AVFF007 strain C medium, CSi medium, CHU medium, and a mixture of these mediums are preferable.
  • the medium is desirably selected according to the type of microalgae to be cultured.
  • the medium may or may not be UV sterilized, autoclaved, or filter sterilized. Different media may be used in the pre-culture step, the first main culture step, and the second main culture step. Moreover, you may use a different culture medium in the middle of a culture
  • carbon dioxide For the cultivation of many microalgae, it is necessary to supply carbon dioxide.
  • carbon dioxide may be supplied to the medium by bubbling as in the conventional method.
  • carbon dioxide is It is preferable to supply from This is because, when carbon dioxide is supplied into the medium by a method such as bubbling, the structure of the microalgae biofilm on the liquid surface is destroyed, resulting in spots of algal mass and the efficiency of biofilm recovery on the substrate during the recovery process This is because there is a possibility that the amount of recovered alga bodies may be reduced.
  • carbon dioxide in the atmosphere can be used, but carbon dioxide having a concentration higher than the atmospheric concentration can also be used.
  • concentration of carbon dioxide in this case is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be achieved, but it is preferably not less than the atmospheric concentration and less than 20% by volume, preferably 0.01 to 15% by volume, more preferably 0. 1 to 10% by volume.
  • the carbon dioxide may be carbon dioxide exhausted by the combustion device. Carbon dioxide may be generated by a reagent.
  • any known light source can be used, and sunlight, LED light, fluorescent lamp, incandescent bulb, xenon lamp light, halogen lamp, and the like can be used. It is preferable to use sunlight, which is energy, an LED with good luminous efficiency, or a fluorescent lamp that can be used easily.
  • the amount of light is preferably from 100 lux to 1 million lux, and more preferably from 300 lux to 500,000 lux.
  • the most preferable light amount is 1000 lux or more and 200,000 lux or less.
  • the light may be either continuous irradiation or a method of repeating irradiation and non-irradiation at a certain time interval, but it is preferable to turn the light on and off at 12 hour intervals.
  • any wavelength can be used, and there is no limitation.
  • a preferable wavelength is sunlight or a wavelength similar to sunlight.
  • An example in which the growth rate of photosynthetic organisms is improved by irradiation with a single wavelength has been reported, and such an irradiation method can also be used in the present invention.
  • the pH of the liquid medium used in the pre-culture step and the main culture step (hereinafter, the liquid medium is also referred to as a culture solution) is preferably in the range of 1 to 13, and in the range of 3 to 11. Is more preferably in the range of 5 to 9, more preferably in the range of 6 to 8.
  • the pH of the liquid medium is the pH at the start of culture.
  • pH in a culture process may change with culture
  • a substance having a buffering action for keeping the pH in the medium constant can be added to the medium.
  • the problem that the pH in the medium changes with the progress of the culture of microalgae can be suppressed, and the phenomenon that the pH changes due to the supply of carbon dioxide into the medium can be suppressed.
  • the substance having a buffering action a known substance can be used, and its use is not limited, but 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine etheric acid (HEPES), sodium phosphate buffer, A potassium phosphate buffer or the like can be preferably used.
  • the concentration and type of these buffer substances can be determined according to the type of microalgae and the culture environment.
  • the water depth of the liquid medium when performing the dispersion culture is deep, there is a problem that the light does not reach and the stirring efficiency deteriorates, and there is a limit.
  • the water depth can be reduced. Thereby, since the amount of water used is small and handling efficiency is improved, it is preferable to reduce the water depth.
  • the water depth is preferably 0.4 cm or more, more preferably 1.0 cm to 10 m, further preferably 2.0 cm to 1 m, and most preferably 4.0 cm to 30 cm.
  • the water depth When the water depth is 0.4 cm or more, a biofilm can be formed, and when the water depth is 10 m or less, handling is easy. When the water depth is 4.0 cm to 30 cm, the influence of water evaporation is minimal, and handling of a solution containing a medium and microalgae is easy.
  • the culture temperature can be selected according to the type of microalgae and is not particularly limited, but is preferably 0 ° C. or higher and 90 ° C. or lower, more preferably 15 ° C. or higher and 50 ° C. or lower, and 20 ° C. or higher and 40 ° C. or lower. Less than is most preferred. When the culture temperature is 20 ° C. or higher and lower than 40 ° C., microalgae can be suitably grown.
  • the minimum amount of microalgae to be introduced is one in the culture range, and can be grown as long as it takes time.
  • the number is preferably 1 / cm 3 or more, more preferably 1000 / cm 3 or more, and still more preferably 1 ⁇ 10 4 / cm 3 or more.
  • the upper limit of the amount of microalgae input is not limited because the amount of microalgae can be grown at any high concentration, but the amount of microalgae input increases as the amount of microalgae exceeds a certain level. 1 ⁇ 10 9 pieces / cm 3 or less is preferable, 1 ⁇ 10 8 pieces / cm 3 or less is more preferable, and 5 ⁇ 10 7 pieces / cm 3 or less is preferable. Further preferred.
  • the pre-culture period and the main culture period in the present invention can be selected according to the type of microalgae and are not particularly limited, but are preferably 1 day or more and 300 days or less, more preferably 3 days or more and 100 days or less. 7 days or more and 50 days or less are still more preferable.
  • the size of the microalgae biofilm is 0.1 cm 2 or more, more preferably 1 cm 2 or more, more preferably 10 cm 2 or more, and most preferably equal to the liquid surface area of the incubator. If it is 0.1 cm 2 or more, the ratio of the amount of microalgae at the end of culture to the amount of microalgae at the start of culture can be increased in a short time.
  • a plurality of microalgal biofilms may exist in the culture region.
  • the thickness of the microalgal biofilm is preferably in the range of 1 ⁇ m to 10000 ⁇ m, more preferably in the range of 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m, and most preferably in the range of 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • the biofilm strength is high, and a sufficient amount of biofilm can be harvested.
  • the biofilm according to the present invention is a three-dimensional three-dimensional structure formed by rising in a bubble shape in a part or a plurality of parts of the film-like structure, the biofilm is based on the liquid level of the medium.
  • the general height of the three-dimensional structure is preferably in the range of 0.01 mm to 100 mm, more preferably in the range of 0.1 mm to 20 mm, and most preferably in the range of 5 mm to 20 mm. preferable.
  • the thickness is in the range of 5 mm to 20 mm, the water content can be sufficiently lowered, and the height of the incubator can be kept low.
  • the microalgae according to the present invention preferably has a high growth rate on the liquid surface, and the growth rate in the logarithmic growth phase (that is, the average growth rate per day during the logarithmic growth phase) is 0 by dry weight. is preferably .1g / m 2 / day or more, more preferably 0.5g / m 2 / day or more, more preferably 1g / m 2 / day or more, 3g / m 2 / day The above is most preferable.
  • the growth rate of the microalgae in the logarithmic growth phase is generally 1000 g / m 2 / day or less in terms of dry weight.
  • the dry algal body weight per unit area of the biofilm according to the present invention is preferably 0.001 mg / cm 2 or more, more preferably 0.1 mg / cm 2 or more, and 1 mg / cm 2 or more. It is particularly preferred. Most preferably, it is 5 mg / cm 2 or more. This is because it is expected that the amount of biomass such as oil obtained is larger when the dry algal body weight per unit area is larger.
  • the dry alga body weight per unit area of the biofilm is usually 100 mg / cm 2 or less.
  • the microalgae of the present invention capable of forming a biofilm having the above structure, the above-mentioned area, thickness, height, growth rate, and dry alga body weight per unit area on the liquid surface. It is preferable for the same reason as described above.
  • biofilm on the liquid surface may be collected, or both the biofilm on the liquid surface and a part of the microalgae on the bottom surface may be collected. This is because both the liquid and bottom microalgae can be used as biomass.
  • oil when oil is considered as a useful substance, the oil content of the microalgae on the bottom surface is lower than that on the liquid surface. Therefore, it is better to avoid collecting bottom algae as much as possible.
  • the biofilm on the liquid surface can be collected with the liquid surface in the incubator partially covered with the biofilm, but the amount of microalgae in the incubator is large. It is preferable to collect after all the liquid surface is covered with the biofilm. In addition, after the biofilm covers the entire liquid surface, the culture may be continued for a while and then recovered.
  • the three-dimensional structure is a structure that is seen when the film-like structure further grows. Compared with the two-dimensional film-like structure, the amount of microalgae that can be recovered is large, and the moisture content is high. It is preferable because it is lower.
  • the above recovery method preferably recovers 70% or more of the biofilm formed on the liquid surface, more preferably 80% or more, and more preferably 90% or more. Yes, most preferably 100% recovery.
  • the recovery rate of the biofilm formed on the liquid surface can be confirmed visually, for example.
  • the transfer method is a process of copying a microalgal biofilm on a liquid surface onto a first substrate. Adhesion without proliferation.
  • the first substrate is gently inserted so as to be at an angle parallel to or close to the liquid surface, and the microalgal biofilm on the liquid surface is attached to the surface of the first substrate.
  • the transfer may be performed a plurality of times because the transfer rate is improved.
  • a method of collecting microalgae on the liquid surface using the second substrate is a collection method by a deposition method.
  • the second substrate is inserted obliquely into the microalgae biofilm on the liquid level of the incubator, and the surface of the second substrate is pulled while tracing the biofilm surface. In this method, the biofilm is collected while being deposited.
  • the second substrate is moved from the right side to the left side, but the moving direction of the second substrate may be the reverse direction (that is, the movement from the left side to the right side) or may be collected multiple times. .
  • the second substrate with the biofilm attached may be used, or a new second substrate may be prepared and used.
  • FIG. 1 only one second substrate is shown, but a plurality of second substrates may be used simultaneously. Thereby, a recovery rate improves.
  • (g) of FIG. 1 is the state by which the biofilm was collect
  • the size of the second substrate can be appropriately changed according to the size of the incubator, but it is preferable to use a second substrate that is slightly smaller than the minor axis of the inner wall of the incubator. Thereby, while moving the second substrate, unnecessary contact with the inner wall of the incubator can be avoided, and the microalgae biofilm on the liquid surface is in contact with the incubator and the second substrate. This is because a recovery leakage due to passing through the gap between the two is less likely to occur.
  • the microalgal biofilm growing on the liquid surface in the incubator may grow from a film shape to a pleated shape in the culture medium.
  • a fold-like biofilm can be collected by increasing the insertion depth of the second substrate into the liquid.
  • Desorption is a part of the recovery process.
  • any method can be used as long as the microalgae can be peeled off from the substrate.
  • the biofilm can be peeled off from the substrate by processing, closing the lid of the container containing the substrate, shaking vigorously, performing high-speed shaking treatment, or using a cell scraper or the like.
  • a method of stripping the biofilm from the substrate using a jig using a material that does not damage the substrate, such as a cell scraper is preferable.
  • the microalgal biofilm can be peeled off the substrate simply by tilting the substrate. Since this method is simple, it is the most preferable method.
  • the substrate may be reused any number of times.
  • the dry alga body in the present invention is obtained by drying the collected microalgae obtained by the present invention.
  • a method of drying the microalgae collection product any known method can be used as long as it can reduce the moisture in the microalgae collection product, and is not particularly limited.
  • a method of drying the microalgae collected in the sun a method of heating and drying the microalgae recovered, a method of freeze-drying (freeze drying) the microalgae recovered, a method of blowing dry air on the microalgae recovered, etc. It is done.
  • freeze drying is preferable from the viewpoint of suppressing decomposition of components contained in the microalgae collection
  • heat drying or sun drying is preferable from the viewpoint of efficient drying in a short time.
  • the water content in the present invention is obtained by dividing the weight of water contained in the recovered material by the weight of the recovered material and multiplying by 100.
  • the water content of the microalgal biofilm in the present invention is preferably 99 to 60%, more preferably 95 to 80%, and most preferably 90 to 85%.
  • the water content when the microalgae are collected by culturing in a dispersed culture and using a centrifuge is generally about 90%, and the water content of the biofilm on the liquid surface obtained by the culture method of the present invention Is lower than that and is superior to the conventional method.
  • the water content of the three-dimensional structure is lower than that of the film-like structure. This is presumed to be caused by the fact that the three-dimensional structure is farther from the liquid surface, closer to the light source, and a certain degree of drying has progressed.
  • the useful substance in the present invention is a kind of biomass derived from microalgae, and is a general term for substances useful for industries obtained from biomass through a process such as an extraction process and a purification process.
  • Such substances include final products, intermediates and raw materials such as pharmaceuticals, cosmetics and health foods, raw materials for chemical compounds, intermediates and final products, hydrocarbon compounds, oils, alcohol compounds, hydrogen and methane.
  • Energy substitutes such as enzymes, proteins, nucleic acids, sugars and lipid compounds such as DHA, astaxanthin and the like.
  • the useful substance can be accumulated in the microalgae by the useful substance accumulation process.
  • Biomass in the present invention refers to organic resources derived from renewable organisms excluding fossil resources, and examples thereof include biological materials, foods, materials, fuels, and resources.
  • the algal biomass includes microalgae itself (may be in the form of a biofilm) and microalgae residue after collecting useful substances.
  • the oil in the present invention is a combustible fluid substance, which is a compound mainly composed of carbon and hydrogen, and in some cases, a substance containing an oxygen atom, a nitrogen atom, etc. is there. Oil is generally a mixture and is a substance that is extracted using a low polarity solvent such as hexane or acetone.
  • the composition may be composed of a hydrocarbon compound, fatty acid, triglyceride, or the like, or may be composed of a plurality of kinds of compositions selected from these. It can also be esterified and used as biodiesel.
  • the method for collecting useful substances and oil contained in the microalgae collection is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the final recovered product is dried by heating to obtain dry alga bodies, followed by cell disruption and extraction of the oil using an organic solvent.
  • the extracted oil is generally refined because it contains impurities such as chlorophyll.
  • Purification includes silica gel column chromatography and distillation (for example, the distillation method described in JP-T 2010-539300). Such a method can also be used in the present invention.
  • microalgae are crushed by ultrasonic treatment, or microalgae are dissolved by protease, enzyme, or the like, and then the oil in the algal body is extracted using an organic solvent (for example, JP 2010-530741 A). Method). Such a method can also be used in the present invention.
  • the biofilm according to the present invention preferably has a high oil content from the viewpoint of usefulness as biomass.
  • the oil content per dry algal body of the biofilm is preferably 5% by mass or more, more preferably 10% by mass or more, and particularly preferably 15% by mass or more.
  • the oil content per dry alga body of the biofilm is usually 80% by mass or less.
  • Example 1 As a pre-culture, a mixture of 40 mL of CSiFF04 medium (FIG. 2) and FFG039 strain (algae concentration 0.032 mg / mL) was placed in PS Case No. 28 (As One Co., Ltd., 4-5605-05), and this was evacuated. It was placed in a desiccator (As One Co., Ltd., 1-070-01) and subjected to static culture at 15000 lux under fluorescent light irradiation (light irradiation ON-OFF every 12 hours) at 23 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5%. . The side and bottom of PS case 28 were shielded from light with a black plastic case. The culture state immediately before collection is shown in FIG. After 14 days, the incubator was taken out from the vacuum desiccator, and the microalgae biofilm on the water surface was collected using a nylon film having the same length as the short diameter of case 28 made of PS.
  • Experiment 1A As the first main culture, 40 mL of the suspension b was put in PS Case No. 28, and liquid surface floating culture was performed by the same method as the preculture. Seven days after culturing, all the microalgal biofilms on the water surface were collected in the same manner as in the pre-culture. This was designated as Experiment 1A. The weight of the recovered material was measured, and the weight was measured after freeze-drying the recovered material. From these measured values, the dry weight and moisture content were calculated. The recovered amount (dry weight per unit area) in Experiment 1A was 0.239 mg / cm 2.
  • the bottom algae of the three containers were peeled off from the bottom of the incubator using a cell scraper, and then placed in a vacuum desiccator. Culture was performed. However, the culture period was 14 days. This was designated as Experiment 1C. That is, this is an example in the case where the dispersion treatment is performed on the bottom algae without replacing the medium. The recovered amount was 3.382 mg / cm 2 .
  • the second main culture was performed under the same culture conditions as the preculture. However, the culture period was 14 days. This was designated as Experiment 1E. That is, this is an example when the medium is replaced and the bottom algae is dispersed. The recovered amount was 5.603 mg / cm 2 . Combined with the first culture, it was 5.842 mg / cm 2 .
  • Experiment 1F An experiment in which the microalgae were not collected 7 days after the first main culture and the second main culture was continued for 14 days was designated as Experiment 1F.
  • the recovered amount was 4.607 mg / cm 2 .
  • microalgae on the liquid surface were collected by a deposition method. From the above, it is possible to culture using bottom algae as seed algae, and when resuming culture from bottom algae, the amount of microalgae on the water surface increases by replacing the medium and performing a dispersion treatment. I understood it.
  • Example 2 (when main culture is repeated)] Pre-culture was performed in the same manner as in Example 1. However, AVFF007 strain was used as a microalgae.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, 170 mL of 5 ⁇ 10 5 cells / mL microalgae suspension b was obtained. As the first main culture, 40 mL of the suspension b was put in PS Case No. 28, and liquid surface floating culture was performed by the same method as the preculture. After 14 days of culture, microalgae on the water surface were collected in the same manner as in Example 1. As shown in FIG. 3, the dry alga body amount (recovered amount) was 2.16 mg / cm 2 .
  • the second main culture the following two samples were prepared. First, after collecting microalgae on the water surface, the medium was removed as much as possible. At this time, the microalgae on the bottom surface were allowed to remain in the container. In addition, a fragmented microalgal biofilm that is considered to have little adhesion to the bottom surface is left in the container as much as possible. Next, 40 mL of fresh CSiFF04 medium was added so as not to peel off the microalgae structure on the bottom surface. That is, the culture was started using the microalgae existing on the bottom as seed algae.
  • the other sample was prepared in the same manner as in the first main culture. That is, 90 mL of a microalgae suspension having the same concentration as that of the microalgae suspension b was newly prepared, and 40 mL each was put into a new PS case 28.
  • the incubator prepared as described above was cultured under the same method and culture conditions as in Example 1. After 21 days of culture (the number of days of culture after the start of the first main culture), all surface algae derived from each sample were collected. Recovery of the former is, 3.26mg / cm 2, the latter was 1.96mg / cm 2. The latter culture period is 7 days.
  • each sample was prepared in the same manner as the second main culture. After culturing 28 days, all the microalgae above the water recovered result, former 2.54 mg / cm 2, the latter was 2.4 mg / cm 2. The latter culture period is 7 days.
  • each sample was prepared in the same manner as the second main culture. After 35 days of culture, all the microalgae on the water surface were collected. As a result, the former was 2.22 mg / cm 2 and the latter was 1.88 mg / cm 2 . The latter culture period is 7 days.
  • FIG. 4 shows a plot of the amount of dried algae (recovered amount) versus the number of days of culture when the bottom algae is the seed algae. The amount of dry algae increased until the second culture, but the amount of dry algae obtained decreased when the number of cultures was three or more.
  • Example 3 (Relationship between amount of microalgae on the bottom surface and water surface algae)]
  • Pre-culture was performed in the same manner as in Example 2 to obtain 1000 mL of alga body suspension b.
  • 40 mL of alga body suspension b was added, and liquid surface suspension culture was performed in the same manner as in Example 2.
  • After three, three, five, seven, ten, fourteen, twenty-one days of cultivation take out three incubators from the vacuum desiccator, collect the microalgae on the water surface and the microalgae on the bottom surface, and measure the amount of dry algae did.
  • the results are shown in FIG.
  • the amount of microalgae on the water surface increased with the number of culture days.
  • the sample which has the amount of algal bodies on various bottom faces was obtained by this experiment.
  • Example 2 In the same manner as in Example 2, while leaving as much microalgae on the bottom as possible, the medium was removed, and 40 mL of fresh CSiFF04 medium was added to start the culture. After 7 days of culturing, that is, after 10 to 28 days in the whole culturing period, the culturing was stopped, and the amount of dry alga bodies of microalgae on the water surface was measured. The result is shown in FIG. 6, and the amount of microalgae on the bottom surface (that is, the amount of seed algae) was the best at 3 mg / cm 2 . From this, it became clear that there is an optimum value for the amount of microalgae on the bottom surface, and that the larger the amount of algal bodies, the better.
  • Example 4 (adequacy of removal of non-adherent microalgae)] Pre-culture and first main culture were performed in the same manner as in Example 2.
  • the following two types of samples were prepared.
  • the first sample was obtained by removing free microalgae that did not adhere to the bottom surface and then containing fresh CSiFF04 medium, and the second sample was removed when removing the medium. Those that adhere to the bottom surface and those that do not adhere are left in the incubator as much as possible, and a new CSiFF04 medium is added.
  • a second main culture was performed in the same manner as in Example 2. After culturing 11 days (after a total culture days 25 days from the first of the culture), the results were recovered microalgae on the water surface, the former is 4.0 mg / cm 2, the latter became 3.25 mg / cm 2.
  • Example 5 Method of preparing the amount of seed algae by removing microalgae on the bottom surface
  • Pre-culture and first main culture were performed in the same manner as in Example 2.
  • FFG039 strain was used as the microalgae.
  • the following three types of samples were prepared.
  • the microalgae on the bottom surface was peeled off along the long side of the incubator. It was. That is, among the incubator having a width of 4.6 cm, the microalgae on the bottom surface was peeled over a width of 1 cm.
  • the medium was removed as much as possible together with the peeled microalgae.
  • 40 mL of fresh CSiFF04 medium was added. This has removed about 22% of the bottom algae.
  • the second culture was performed in the same manner as in Example 2. Dry algal cells of collected material, the first, two, three samples, respectively, 7.54mg / cm 2, 6.92mg / cm 2, was the 6.43mg / cm 2. From the above, the amount of microalgae on the water surface can be improved by controlling the amount of microalgae on the bottom surface, and a jig such as a cell scraper can be used as the control method. I understood.
  • Example 6 (method of leaving the bottom algae in the method of replacing the medium in the region between the bottom and the liquid surface)]
  • the first main culture was performed in the same manner as in Example 2.
  • FFG039 strain was used as the algal species.
  • the second main culture the microalgal biofilm on the water surface was collected, the medium was replaced with a new CSiFF04 medium, and the culture was performed in the same manner as the first main culture.
  • the medium was replaced on the seventh day of the culture period. That is, in the medium in which Ca (NO 3 ) 2 .4H 2 O and KNO 3 are removed from the CSiFF04 medium, an area where the abundance of microalgae is considered to be small while water surface algae and bottom algae exist.
  • the amount of the replacement medium was about 30 mL (75% at the start of culture).
  • a sample without medium replacement was also prepared.
  • the second main culture after a total of 14 days of culture, the microalgae on the surface of the water were collected, the recovered product was freeze-dried, and the dry alga body amount and oil content were measured.
  • the dry alga body amount of the medium-replaced sample was 7.86 mg / cm 2
  • the dry alga body amount of the non-replaced sample was 8.01 mg / cm 2 .
  • the oil contents were 39.2% and 28.4%, respectively.
  • the moisture contents were 82% and 85%, respectively. From the above, it was clarified that the medium can be replaced using the region between the water surface algae and the bottom surface algae.
  • Example 7 (when high concentration medium component is added)
  • the first main culture was performed under the same culture conditions as in Example 1.
  • the incubator is prepared by attaching an agricultural film to the upper edge of a plastic square container (upper (95 x 65.8 x 29.3 cm), lower (92.5 x 59.1 cm)) with double-sided tape. Was performed at 27.5 L (water depth 5 cm).
  • the coating film was used, the vacuum desiccator was not used, and the light-shielding device was not used because the container itself had light-shielding properties on the side and bottom surfaces.
  • the culture period was 21 days. Moreover, the homogenization process was not performed. At the same time, culture was performed using five incubators 6A to 6E.
  • the microalgae on the liquid surface of the 6A-6E incubator were collected, and the collected alga bodies were dried, resulting in an average of 22.2 g.
  • the culture medium 6E was all removed, and the microalgae remaining on the bottom of the incubator were collected.
  • the dry weight was measured and found to be 0.896 g. Therefore, the incubators 6A to 6D contain approximately the same amount of seed algae necessary for the next culture as the incubator 6E.
  • a medium component having a concentration higher than that of the CSiFF04 medium was added to the incubator 6B that collected the microalgae on the liquid surface. Specifically, Ca (NO 3 ) 2 .4H 2 O was added 610.5 times, 45 mL, KNO 3 was added 152 times, 180 mL, and other components were added 1100 times, 25 mL.
  • a medium component having a concentration higher than that of the CSiFF04 medium was added to the incubator 6C that collected the microalgae on the liquid surface. Specifically, Ca (NO 3 ) 2 .4H 2 O was added 610.5 times, 45 mL, KNO 3 was added 76 times, 360 mL, and other components were added 1100 times, 25 mL.
  • a medium component having a concentration higher than that of the CSiFF04 medium was added to the incubator 6D that collected the microalgae on the liquid surface.
  • Ca (NO 3 ) 2 .4H 2 O is 610.5 times, 45 mL, KNO 3 is 152 times, 90 mL, MgSO 4 .7H 2 O is 1100 times, 25 mL, K 2 HPO 4 is 1100 times. 25 mL, KH 2 PO 4 1100 times, 25 mL, FeCl 3 .6H 2 O 1100 medium, 25 mL was added.
  • the other components added to the CSiFF04 medium were not added.
  • the microalgae in the 6A-6D incubator are cultured to form a thin biofilm on the liquid surface in 3-5 days, and a thick biofilm is formed on the liquid surface 21 days after the start of culture. Since it was, it collected.
  • the recovered amounts were 25.9, 27.9, 23.3, and 22.7 g in order from the incubator 6A. Therefore, 152 times is the best for KNO 3 .
  • the microalgae on the liquid surface were 24.3, 22.6, and 21.2 g.
  • SEQ ID NO: 1 Part of the base sequence of 18S rRNA gene of AVF007 strain
  • SEQ ID NO: 2 Part of the base sequence of 18S rRNA gene of FFG039 strain

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Abstract

新たに種藻を供給することなく、微細藻類の液面浮遊培養を行う方法を提供することを課題とする。底面上の微細藻類を種藻として使用する。すなわち、培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面でバイオフィルムを形成させ、かつ培養器の底面に微細藻類を維持する、第一の培養工程；第一の培養工程で形成された液面のバイオフィルムの少なくとも一部を回収し、かつ底面の微細藻類の少なくとも一部を培養器内に残す工程；及び残した底面の微細藻類を、同じ培養器内で培養し、培地の液面でバイオフィルムを形成させる、第二の培養工程を含む、微細藻類の培養方法を提供する。本発明はまた、液面上にバイオフィルムを形成可能な新規な微細藻類を提供する。

Description

底面の微細藻類を種藻として用いる、微細藻類の液面浮遊培養方法、藻類バイオマスの製造方法、及び微細藻類
　本発明は、微細藻類の液面浮遊培養に関する。より詳細には、本発明は、生産物としての藻体を回収後、新たな種藻の供給を行わずに次の培養を開始することができる。本発明は、藻類バイオマスの生産の分野等で有用である。
　従来、微細藻類の培養は、培地中に微細藻類を分散させながら行っているが（以下、分散培養という）、分散させるための攪拌エネルギーや、分散している微細藻類を回収するために遠心分離機や凝集剤などを必要とする。そのため、培養及び回収コストが極めて高いものとなっている。さらに、回収した微細藻類から生産物（有用物質）を抽出する場合、回収物中の含水率が高くなる結果、微細藻類濃度を高めるための乾燥工程に投入するエネルギー量が極めて高く、コスト高とともにエネルギー収支が合わないなどの問題が指摘されてきた（非特許文献１、２）。そのため、微細藻類から種々の生産物を抽出する工程は、一部の高価格生産物を除いて商業化されていない。また、生産物が燃料（オイルなど）のような低価格生産物である場合には、投入エネルギー、コスト、エネルギー収支の観点から商業化の成功例はない。
　上記問題を改善する方法のひとつとして、種藻を効率的に供給する方法をあげることができるが、従来法では、種藻用の培養器を準備する必要があった。そこで、分散培養の場合には、培養器内の一部の微細藻類分散液を採取し、採取量と同等程度の新しい培地を加えることで、培養を継続することが一般的に行われている。すなわち、種藻を新たに加えることなく培養することが行われている（特許文献１、２）。
　クロロコックム属（クロロコッカム属と表記する場合もある、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．）は、非特許文献３には脂肪酸を蓄積すること、非特許文献４には、高い二酸化炭素濃度でも育成することができると記載されているが、液面上に浮くことは記載されていない。また、クロロコックム属ＲＫ２６１は、非特許文献５で言及されているが、液面上に浮くとの記載はない。
特開２０１３－９０５９８号公報 特開２００５－４００３５号公報
松本光史ら、第６２回日本生物工学会大会（２０１０）　トピックス集　ｐ３３ 尾嶋好美、"藻類が世界を変える"、[online]、 ２０１１年１月１４日、ＴＳＵＫＵＢＡ　ＳＣＩＥＮＣＥ、インターネット<http://tsukubascience.com/seibutsu/sourui_ga_sekai_wo_kaeru/> Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｌｇａｌ　Ｂｉｏｍａｓｓ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　（２０１２），　Ｖｏｌ．３，　ｐｐ．　１２ Ｏｃｅａｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｔｕｄｉｅｓ，　１９９８，　第　２７巻、第１号，　出版社：Ｉｎｄｅｘ　Ｃｏｐｅｒｎｉｃｕｓ　ｐ１７ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（２０１０），　Ｖｏｌ．１０８，　ｐｐ．１４２１－１４２９
　本発明者らは、微細藻類の培養方法に関し、液面上にバイオフィルムを形成させつつ、液面上に浮かせながら培養する液面浮遊培養法を提案してきた。液面浮遊培養法は、液面上に微細藻類のバイオフィルムが浮いていることから遠心分離機などの装置を使用せずに藻体を回収することができ、また静置培養であることから攪拌のためのエネルギーが不要であり、従来法と比較して、低エネルギーかつ低コストな培養法である。
　本発明者らは、液面浮遊培養法において、液面上の一部の水面藻を回収し、回収物の一部を液面上に浮かせた状態から再び培養を開始する方法、又は、一部の水面藻を残して回収する方法で、種藻を新たに供給することなしに連続的に培養させることが可能であることを示してきた。本発明が解決しようとする課題の一つは、種藻を新たに調製して供給することなく培養を開始する新たな方法を提供することにある。
　底面上の微細藻類バイオフィルムの多くは、一定の厚みを持ち、培養器の底面に付着していることが考えられる。そのため、バイオフィルム内部の微細藻類は、高密度に存在し、増殖に関与しづらい部分が多いと考えられる。本発明では、この問題を解決する方法を提供することも課題としている。
　少なくとも一回以上培養に使用した培地は、培養のための栄養源が不足している場合や、培養を阻害する物質が含まれている可能性がある。本発明では、この問題を解決する方法を提供することも課題としている。
　さらに、底面藻を種藻として培養を行うと、培養回数（繰り返し回数）の増加に伴って、液面上の微細藻類量が減少する場合が見られた。本発明では、この問題を解決する方法を提供することも課題としている。
　また、増殖速度およびオイル含有量の高い微細藻類を提供することも本発明の課題としている。
　本発明者らは、種藻を新たに調製することなく、底面藻を利用することで繰り返し液面浮遊培養法を行う方法を見出し、本発明を完成した。本発明は、下記を提供する。
［１］　培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面でバイオフィルムを形成させ、かつ培養器の底面に微細藻類を維持する、第一の培養工程；
　第一の培養工程で形成された液面のバイオフィルムの少なくとも一部を回収し、かつ底面の微細藻類の少なくとも一部を培養器内に残す工程；及び
　残した底面の微細藻類を、同じ培養器内で培養し、培地の液面でバイオフィルムを形成させる、第二の培養工程
を含む、微細藻類の培養方法。
［２］　第一の培養工程で用いた培地の少なくとも一部を除去し、かつ新鮮培地を添加する工程を含む、［１］に記載の培養方法。
［３］　新鮮培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度が、第一の培養工程で用いた培地の濃度の少なくとも５０倍である、［２］に記載の培養方法。
［４］　新鮮培地に含まれる少なくとも一つの、第一の培養工程で用いた培地の濃度の少なくとも５０倍である成分が、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、及び鉄からなる群より選択されるいずれかを含む化合物である、［３］に記載の培養方法。
［５］　第一の培養工程で用いた培地の少なくとも一部の除去が、液面と底面との間の領域に存在する培地の少なくとも一部の除去である、［２］～［４］のいずれか一に記載の培養方法。
［６］　底面の微細藻類が付着性のものを含み、付着性の微細藻類の少なくとも一部を底面上から剥離する工程を含む、［１］～［５］のいずれか一に記載の培養方法。
［７］　第二の培養工程が、形成された液面のバイオフィルムの少なくとも一部を回収し、かつ底面の微細藻類の少なくとも一部を培養器内に残すことを含み；
　残した底面の微細藻類を、同じ培養器内で培養し、培地の液面でバイオフィルムを形成させることを繰り返す、第三以降の繰り返しの培養工程をさらに含む、［１］～［６］のいずれか１項に記載の培養方法。
［８］　第二以降の培養工程において、種藻として底面上に存在する微細藻類の量が、５ｍｇ／ｃｍ2以下である、［７］に記載の培養方法。
［９］　第二以降の培養工程において、直前の培養工程で用いた培地の少なくとも一部を除去するが、除去する際に、底面の非付着性微細藻類をともに除去することにより、種藻として底面上に存在する微細藻類の量が５ｍｇ／ｃｍ2以下であるようにする、［８］に記載の培養方法。
［１０］　底面の微細藻類が付着性のもの及び非付着性のものを含み、第一の培養工程で用いた培地の少なくとも一部を除去する際に、底面の非付着性微細藻類をともに除去する、［４］又は［５］に記載の培養方法。
［１１］　種藻として底面上に存在する微細藻類の量が、０．１ｍｇ／ｃｍ2以上である、［１］～［１０］のいずれか一に記載の培養方法。
［１２］　種藻として底面上に存在する微細藻類の量が、２ｍｇ／ｃｍ2以上である、［１］～［１１］のいずれか一に記載の培養方法。
［１３］　微細藻類がオイルを含む微生物である、［１］～［１２］のいずれか一に記載の培養方法。
［１４］　微細藻類が緑藻である、［１］～［１３］のいずれか一に記載の培養方法。
［１５］　微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ　ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．、Ｃｈａｒａｃｉｕｍ　ｓｐ．又はＰｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ　ｓｐ．に属するものである、［１］～［１４］のいずれか一に記載の培養方法。
［１６］　微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．に属するものである、［１］～［１５］のいずれか一に記載の培養方法。
［１７］　微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４２０、もしくはそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．　ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２２６２、もしくはそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類である、［１］～［１６］のいずれか一に記載の培養方法。
［１８]  １８Ｓ　ｒＲＮＡの遺伝子領域をコードする塩基配列のうち、一部の領域の、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．　ＲＫ２６１に相当する塩基配列との同一性が９５．００％以上９９．９９％以下であるか、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．に属する微細藻類であって、その１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９９．９４％の配列同一性を有する、微細藻類。
［１９］　Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．ＦＦＧ０３９株（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２２６２）、又はそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類。
［２０］　［１］～［１７］のいずれか一の培養方法を含む培養工程；及び
第二の培養工程で形成された液面のバイオフィルムを回収する工程
を含む、藻類バイオマスを製造する方法。
［２１］　藻類バイオマスが、オイルである、［２０］に記載の製造方法。
　底面藻を種藻として使用することで、新たに種藻を調製せずに液面浮遊培養を繰り返し行うことができる。さらに、培養器底面上の微細藻類を培地中へと分散させることで、微細藻類バイオフィルムが細分化され、また、培養器表面や微細藻類同士の接触から離れることで、微細藻類と培地との接触機会が増加し、微細藻類の増殖速度を向上させることができる。さらに、液面浮遊培養法に特徴的な培地置換法を用いることで、培養のために必要な栄養成分を培地中へと供給し、また、培地中に含まれると考えられる培養阻害物質の濃度が低下する結果、培養を好適に行えるようになる。また、非付着性底面藻や必要以上の微細藻類を除去することで、培養の繰り返し回数が増えるに従って発生する液面上微細藻類のバイオマス量の低下に関する課題を回避することができる。また、増殖速度が速く、オイル含有量の高い微細藻類を提供することができる。
本発明の模式図。（ａ）微細藻類懸濁液を培養器に入れたところ（ｂ）数秒～数十分静置経過させ、底面上に微細藻類が堆積したところ（ｃ）培養を行うことで液面上及び底面上に微細藻類が増殖したところ（ｄ）液面上の微細藻類に対して第一の基板を接触、すなわち、転写による回収を開始したところ（ｅ）転写された微細藻類バイオフィルムを培養器外へと取り出したところ（ｆ）第二の基板を用いて液面上の微細藻類バイオフィルムを回収したところ（ｇ）培養器内の微細藻類バイオフィルムを第二の基板によって回収し、培養器外へと藻体回収物を含む基板を取り出したところ（ｈ）液面上の微細藻類バイオフィルムを除去したところ ＣＳｉＦＦ０４培地の組成 液面浮遊培養法において、底面藻を種藻として培養を開始した場合と、懸濁処理を行って調製した投入藻体を用いて培養を開始した場合の、培養後の乾燥藻体量。培養は４回繰り返して行ったが、前者は新たな微細藻類を用いずに種藻として底面藻を用い、後者は、培養ごとに新しい培養器と５×１０5個／ｍＬの懸濁処理を行って調製した投入藻体を用いて培養を開始した。 図２のプロットの中から種藻として底面藻を用いた場合のデータを、培養日数に対する乾燥藻体量でプロットしなおしたもの。 液面浮遊培養を行った場合の培養日数に対する乾燥藻体の量を、水面藻と底面藻について、培養日数ごとにプロットしたもの。 図５によって得られた、異なった量の底面藻を種藻として第二の本培養を開始し、液面上の藻体量をこれらの量に対してプロットしたもの。 微細藻類ボツリオコッカス　スデティクス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）ＡＶＦＦ００７株の１８Ｓ　ｒＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列の一部（配列番号１） ＦＦＧ０３９株の液面浮遊培養の様子 Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．　ＦＦＧ０３９株の顕微鏡写真。（ａ）は、通常の状態、（ｂ）は、遊走子を放出して増殖している状態 １８Ｓ　ｒＤＮＡ解析によるＦＦＧ０３９株の遺伝子配列 ＦＦＧ０３９株の系統樹
　以下、本発明による微細藻類の培養方法の好ましい実施の形態について詳細に説明する。なお、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
［本発明の方法］
　本発明の基本的な培養方法を図１に示した。なお、本模式図は、本発明を説明するためのものであることから、簡略化して表記されている部分がある。
　図１の（ａ）に示した様に、微細藻類の懸濁液を調製し、培養器に入れた後、静置状態にしておくと、図１の（ｂ）に示したように、微細藻類の種類に応じて、数秒から数十分で底面に沈む。なお、微細藻類が底面に沈むとは、大部分が底面に沈むことをいい、液面上や液中、培養器側面やその他表面から完全に微細藻類が存在しなくなる状態をいうものではない。この状態でしばらく静置培養すると、図１の（ｃ）に示した様に、液面上に微細藻類から構成されたバイオフィルムが形成される（第一の培養工程）。なお、培養条件によっては、培養の進行に伴って、フィルム状構造体から三次元状構造体へと構造は変化する。なお、この変化は連続的である。また、図１の（ｃ）に示した様に、培養器底面にも微細藻類は存在し、図には記載していないが、培養器側面やその他表面にも存在し、存在量は少ないが培地中にも存在する。
　次に、液面上の微細藻類バイオマスを回収する。図１の（ｄ）のように、第一の基板を用いて転写法によって回収する方法と、図１の（ｆ）のように、第二の基板を用いて堆積法によって回収する方法とがある。基板を培養器から取り出した状態が、それぞれ、図１の（ｅ）と（ｇ）の状態である。なお、模式図では、微細藻類が付着した基板を培養器外へと移動させているが、培養器内で基板から回収物を回収しても良い。
　液面上のバイオフィルムを回収した後の状態が、図１の（ｈ）である。ここで、培養器の底面には、微細藻類が残存している。この微細藻類を使用して、しばらく培養すると、図１の（ｃ）に示した様に、液面上に微細藻類から構成されたバイオフィルムが形成される（第二の培養工程）。このように、複数回繰り返して培養すること、繰り返して培養するときに発生する様々な問題点を回避しながら培養することが本発明の特徴である。
［微細藻類バイオフィルムの繰り返し培養］
　図１の（ｄ）や（ｆ）の液面上の微細藻類バイオフィルムを回収した後の状態は、図１の（ｈ）の状態になる。ここで、増殖のための栄養成分が培地中に残っている限り、底面に残っている微細藻類を種藻として再度培養することが、何度でも可能である。しかし、あまりにも低濃度であると増殖速度が遅くなってしまう可能性が高いため、その様な場合には、培地を新たに添加したり、少なくとも一部の培地を置換したり、固形物状の栄養成分や高濃度の栄養成分を培地に添加したりすることができる。
［微細藻類］
　本発明の微細藻類とは、人の肉眼では、個々の存在が識別できないような微小な藻類を指す。微細藻類の分類としては、液面上においてバイオフィルム形成能を有するものであれば特に制限はなく、原核生物、真核生物のいずれであってもよい。
　上記微細藻類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、クロララクニオン植物門などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、上記微細藻類としては、緑色植物門が好ましく、緑藻であることがより好ましい。
バイオマスを産生する点で、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）属、クロロコッカム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．）属、ボツリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）がより好ましい。
　上記微細藻類を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自然界より採取する方法、市販品を用いる方法、保存機関や寄託機関から入手する方法などがあげられる。なお、本発明で用いられる微細藻類は、純化工程を経由したものであることが好ましい。純化工程とは、微細藻類を単一の種類にする目的で行う工程であり、必ずしも完全に単独の微細藻類のみにすることをいうものではない。
　本発明では、上記微細藻類の中でも有用物質を生産できることが好ましい。特に、医薬品、化粧品、健康食品の中間体や最終生成物、合成化学で使用する原料、炭化水素化合物やトリグリセリド、脂肪酸化合物のようなオイル状物、水素のような気体などを生成する微細藻類が好ましい。なお、本発明では、これらを生産物と呼ぶことがある。さらに本発明では、液面上での培養および液面からの回収が良好であること、高い増殖速度を持つこと、高いオイル含有率を有していること、少なくとも培養中は臭いが殆どなく、有毒物質の発生も確認されていないこと、のいずれかを満たす微細藻類を用いることが好ましい。
［バイオフィルム］
　本発明でのバイオフィルムとは、岩などの表面に付着している微細藻類構造体（微細藻類集合体又は微細藻類膜）のことをいうが、これらに加えて本発明では、液面のような流動性のある表面に存在している、微細藻類から構成されたフィルム状構造体または三次元状構造体のこともバイオフィルムという。なお、自然界でのバイオフィルムは、目的微細藻類とともに、ゴミや植物の破片などを含んでいることがあるが、本発明では純化工程を経由して得られた試料であれば、これらを含んでいてもよい。しかし、理想的には、本発明に係る微細藻類と該微細藻類の増殖時に分泌される細胞間マトリックスなどのような物質のみから構成されていることがより好ましい。また、底面上の微細藻類もフィルム状構造体を形成していれば、バイオフィルムということができる。
　またバイオフィルムは、個々の微細藻類同士が直接又は細胞間マトリックスのような物質（例えば、多糖等）を介して付着しあっている構造であることが好ましい。一般的には、この様なフィルム状構造体のことを生物膜などと表記される場合も多い。
　本発明では、液面上でバイオフィルムが形成可能な微細藻類を用いる必要がある。そのような微細藻類の好ましい例は、ボツリオコッカス　スデティクス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）やクロロコッカム属をあげることができる。より具体的な例として、ボツリオコッカス　スデティクス　ＡＶＦＦ００７株（以下、ＡＶＦＦ００７株と略称する。）やＦＦＧ０３９株をあげることができる。なお１８Ｓ　ｒＲＮＡをコードする遺伝子の配列解析の結果、ＦＦＧ０３９株はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．であった。
［ＡＶＦＦ００７株］
　本明細書の実施例で使用した微細藻類、ＡＶＦＦ００７株は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４２０として、２０１１年（平成２３年）９月２８日付で独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブタベスト条約の下で、富士フイルム株式会社（日本国東京都港区西麻布２丁目２６番３０号）により、国際寄託された。なお、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターの業務は、２０１２年（平成２４年）４月１日より、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）に引き継がれている。
　ＡＶＦＦ００７株は、本発明者らが、日本国京都府の淡水池から単離した淡水微細藻類の新規株である。ＡＶＦＦ００７株は、その１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部（配列番号：１、図７）を国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のデータに基づき、ＢＬＡＳＴで解析した結果、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＵＴＥＸ２６２９（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ）株に近縁の微細藻類であると同定された（ＵＴＥＸ２６２９株側の１１１８塩基中、ＡＶＦＦ００７株側の１１０９塩基が同一であった。）。ＡＶＦＦ００７株は、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ　ｓｐ．　Ｍａｒｙ　９／２１　Ｔ－３ｗとも近縁の微細藻類であり、今後、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ属に変更される可能性もある。その場合、ＡＶＦＦ００７株の名称は変更されるものとし、また、Ｃｈａｒａｃｉｏｐｏｄｉｕｍ属以外に変更された場合にも、ＡＶＦＦ００７株の名称は変更されるものとする。
　本発明には、ＡＶＦＦ００７株と分類学的に同一の性質を有する株を用いることができる。ＡＶＦＦ００７株の分類学的性質を以下に示す。
　ＡＶＦＦ００７株の分類学的性質
１．形態的性質
　緑色円形状である。浮遊性であり、液面及び底面で増殖することができる。液面上で増殖し、フィルム状構造体を形成する。サイズは４～３０μｍである（液面上の藻体は比較的大きく、底面上の藻体は比較的小さい。）。増殖に伴って、液面上に気泡を発生し、これらが重なり合って三次元構造物を形成する。オイルを生産する。
２．培養的性質（培養方法）
（１）培地：ＣＳｉＦＦ０４（ＣＳｉ培地を改良したもの。組成を図２に示した。ＮａＯＨ又はＨＣｌにてｐＨ　６．０に調整する。培地は、１２１℃、１０ｍｉｎで滅菌することができる。）
（２）培養温度：好適温度は２３℃であり、３７℃以下であれば培養できる。
（３）培養期間（概ね定常期に達するまでの期間）は、初期使用藻体量によるが、２週間～１ヶ月である。通常、１×１０5個／ｍＬで培養することができる。
（４）培養方法：静置培養が適する。
（５）光要求性：要。光強度：４０００～１５０００ルクス、明暗周期：明期時間１２時間／暗期時間１２時間。継代培養の際は、４０００ルクスで培養することができる。
　なお、ＡＶＦＦ００７株は、上記の培養的性質（培養方法）にしたがった継代培養により、保管することができる。植え継ぎは、液面上に浮いている微細藻類を採取し、ピペッティングなどの分散を行った後、新しい培地に分散させることにより、行うことができる。なお、継代直後は、微細藻類は培養器底面に沈んでいるが、１週間程度で液面上にバイオフィルムを形成し始める。継代直後から微細藻類を液面上に浮かせて増殖することができる。植え継ぎ間隔は、約１ヶ月である。なお黄色味を帯びてきたら、継代する。
　ＡＶＦＦ００７株と分類学的に同一の性質を有する株には、微細藻類であって、その１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５．０％、好ましくは９８．０％、より好ましくは９９．０％、さらに好ましくは９９．５％、最も好ましくは９９．９％の配列同一性を有するものが含まれる。
　本発明で塩基配列について配列同一性というときは、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、整列した領域内の２つの配列間で共有する一致した塩基の数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した塩基の数／塩基の全数）×１００で算出でき、市販もしくは一般に公開されているアルゴリズムを用いて計算することができる。塩基配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラムにより行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者にはよく知られている。
［ＦＦＧ０３９株］
　本明細書の実施例で使用した微細藻類、ＦＦＧ０３９株は、本発明者らが日本国奈良県において採取したものである。ＡＶＦＦ００７株に比較して、増殖性が良く、オイル生産性に優れる。また、バイオフィルムの構造が壊れにくく、回収が容易であるという特徴を有する。なお、ＦＦＧ０３９株はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．であり、１８Ｓ　ｒＲＮＡの遺伝子配列解析の結果、微細藻類クロロコックム属ＲＫ２６１株（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．　ＲＫ２６１）に近縁の種類であった。本発明では、新規に単離した微細藻類をＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．ＦＦＧ０３９と名付けた。本発明に係る微細藻類の遺伝子領域をコードする塩基配列のうち、一部の領域の、クロロコックム属ＲＫ２６１に相当する塩基配列との同一性が９５．００％以上９９．９９％以下であることがより好ましい。なお、ここで言う「一部の領域」とは、１０００塩基配列以上の領域を意味する。同一性を試験するにあたっては、全塩基配列を用いての同一性の試験が最も信頼性が高いが、全塩基配列を決定することは極少数の生物種を除いて技術的にもコスト的にも困難であり、またクロロコックム属ＲＫ２６１株の塩基配列も特定の一部（具体的には、後述する比較対象としたＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．　ＦＦＧ０３９株（以下、ＦＦＧ０３９株と略称する。）の塩基配列に対応する塩基配列の近傍）しか公開されていない。更に、一般的には１０００塩基配列程度読めば帰属は可能といわれている。以上のことから、本発明では「一部の領域」の塩基配列の比較により同一性を試験したが、その信頼性は十分に高いものと考えられる。なお、クロロコックムの和名は、淡水藻類、山岸高旺著、内田老鶴圃に記載の和名に準じた。
　本明細書の実施例で使用した微細藻類、ＦＦＧ０３９株は、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２２６２として、２０１４年（平成２６年）２月６日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）にブタベスト条約の下で、富士フイルム株式会社（日本国東京都港区西麻布２丁目２６番３０号）により、国際寄託されている。
　ＦＦＧ０３９株は、本発明者らが京都府の池から単離したクロロコックム属に属する淡水微細藻類の新規株である。
　以下に、該微細藻類の単離方法（以下、純菌化ともいう）及び該微細藻類のＦＦＧ０３９株を新規株と判定するに至った経緯を説明する。
［微細藻類ＦＦＧ０３９株の純菌化］
　奈良県の池から自然淡水を５ｍＬのホモジナイズ用チューブ（株式会社トミー精工、ＴＭ－６５５Ｓ）に入れることで採取した。図２に示すＣＳｉＦＦ０４培地を１．９ｍＬ入れた２４穴プレート（アズワン株式会社、微生物培養プレート１－８３５５－０２）に、採取してきた自然淡水を１００μＬ加え、プラントバイオシェルフ組織培養用（株式会社池田理化、ＡＶ１５２２６１－１２－２）に設置し、４０００ルクスの連続光照射下、２３℃で培養を行った。約１ヵ月後、２４穴プレートのウェル内に緑色の凝集物が生じたので、光学顕微鏡で観察したところ、多数の微生物の存在を確認した。
　アガロース（ｉｎｖｉｔｅｒｏｇｅｎ，　ＵｌｔｒａＰｕｒｅTM　Ａｇａｒｏｓｅ）を１ｇ秤量し、２００ｍＬのＣＳｉＦＦ０４培地を５００ｍＬ三角フラスコに入れた。これを１２１℃で１０分間オートクレーブ処理し、クリーンベンチ内でアズノールシャーレ（アズワン株式会社、１－８５４９－０４）の中に、冷えて固まる前に約２０ｍＬずつ入れることで、アガロースゲルを作製した。
　２４穴プレート内の微細藻類を含む溶液を希釈し、ディスポスティック（アズワン株式会社、１－４６３３－１２）のループ部分に溶液を付着させ、前記にて準備したアガロースゲル上に塗ることで、アガロースゲル上に微細藻類を塗布したシャーレを調製した。
　このシャーレを、プラントバイオシェルフ組織培養用に設置し、４０００ルクスの連続光照射下、２３℃で培養を行った。約２週間後、緑色のコロニーが、アガロースゲル上に現れたので、滅菌竹串（アズワン株式会社、１－５９８０－０１）を用いて、コロニーをその先端に付着させ、ＣＳｉＦＦ０４培地を２ｍＬ入れた２４穴プレートのウェル内に懸濁させた。この様にして調製した微細藻類を含む２４穴プレートをプラントバイオシェルフ組織培養用に設置し、４０００ルクスの連続光照射下、２３℃で培養を行った。約２週間後、ウェル内の水溶液が緑色を呈してくるので、すべてのウェルから少量の溶液を採取し、光学顕微鏡を用いて微細藻類を観察し、単一の微細藻類しか存在していないと考えられるウェルを見つけ出すことで、純菌化を行った。
　また、ＦＦＧ０３９株の４０倍での顕微鏡写真を図９に示した。（ａ）が通常の状態、（ｂ）が多数の遊走子を放出して増殖しているところである。
［形態的性質］
・分散処理を行った後にしばらく時間を置くと、底面にすべて沈む。
・しばらく培養を行うと、液面上に浮くものが現れる。従って、底面に沈んでいるものと液面に浮いているものとに分かれる。さらに培養を継続すると、液面上にフィルム状の構造物が現れる。さらに培養を行うと、三次元状の構造物が現れる。
・液面のもの、及び、底面のもの、いずれも形態は球状であり、それぞれサイズは一定ではなく分布を持つ。
・凝集性があり、巨大なコロニーを形成する
・色は緑色であり、培養の進行に伴って、黄色く変色する。
・培養中及び回収物の臭いはほとんどない。
［培養的性質］
・細胞増殖時には、遊走子によって増殖する。１個の細胞から、多数の遊走子が発生する。
・光合成による光独立栄養培養が可能である。
・増殖には、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、マンガン、鉄が必須である。他に、亜鉛、コバルト、モリブデン、ホウ素が入っていると好適に増殖する。ビタミン類の添加も増殖を促す。
［生理学的性質］
・藻体内にオイルを蓄積し、乾燥重量比で最大４０重量％近く蓄積する。
・オイルは、炭化水素化合物と脂肪酸を蓄積する。脂肪酸は、パルミチン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸などを産生し、特に、パルミチン酸、オレイン酸が主成分である。炭化水素化合物は、デカン、ヘプタデカンなどを産生する。
・Ｎｉｌｅ　ｒｅｄ染色したＦＦＧ０３９株を蛍光顕微鏡で観察すると、蛍光視野中の藻体において、明るい蛍光発色の領域としてＮｉｌｅ　ｒｅｄで発色したオイルの存在が確認される。該オイルは藻体細胞内の比較的広い領域に蓄積されうる。
　更に以下の方法に従って、ＦＦＧ０３９株の同定を行った。
（微細藻類ＦＦＧ０３９株の同定）
　ＦＦＧ０３９株の培養法は、１００ｍＬ容量の三角フラスコに５０ｍＬのＣＳｉＦＦ０４培地を導入し、１０００×１０4個／ｍＬのＦＦＧ０３９株溶液を０．５ｍＬ添加し、２５℃、光照射下で振盪培養を１４日間行った。
　ＦＦＧ０３９株の乾燥粉末を得るために、前記によって得られたＦＦＧ０３９株を含む培地４０ｍＬを遠心機（ＭＸ－３００（トミー精工製）を用いて、６０００×ｇ、４℃下、１０分間遠心操作を行った。上清を除去した後、液体窒素を使用して固形物を容器ごと凍結し、これを予め液体窒素によって冷やしておいた乳鉢に全量移し、予め液体窒素にて冷やしておいた乳棒を用いて粉砕した。
　微細藻類からのＤＮＡの抽出は、ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ製）　を用いて、記載されているマニュアルに従って抽出を行った。抽出後のＤＮＡは、ｅ－ｓｐｅｃｔ　（ｍａｌｃｏｍ製）を用いて、純度、量を測定した。抽出後のＤＮＡは、精製度の指標であるＡ260nm／Ａ280nm＝１．８以上を達成しており、約５ｎｇ／μＬのＤＮＡが取得されたことを確認した。
　抽出後のＤＮＡの純度は問題なかったことから、超純水を用いて１０4倍に希釈することで、ＰＣＲ用の試料を準備した。ＰＣＲ用の試料としては、１８Ｓ　ｒＲＮＡの遺伝子領域（ｒＤＮＡ領域）を使用した。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、９８℃１０秒間、６０℃５０秒間、７２℃１０秒間のサイクルを３０回行った。なお、使用した酵素は、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｔａｒ　Ｍａｘ　（タカラバイオ製）である。得られたＰＣＲ産物は１　％アガロース電気泳動により、単一バンドであることを確認した。
　ＰＣＲ生成物の精製は、ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いて行った。方法は、マニュアルに記載の方法に従って行った。ＰＣＲ反応が十分にできたかどうか、また、精製度を確認するために、ｅ－ｓｐｅｃｔを用いて、純度、量を測定し、Ａ260nm／Ａ280nm＝１．８以上であったことから、問題ないと判断した。
　次に、精製物を鋳型とし、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、サイクルシークエンスを行った。条件は、マニュアルに従った。得られた反応物をＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００－Ａｖａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、塩基配列の解読を行った。
　これをＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）による同一解析を行った。方法は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のデータ上の全塩基配列情報に対し、上記配列をＢＬＡＳＴ検索し、最も同一性の高い生物種をＦＦＧ０３９株の近縁種とした。比較対象とした塩基配列（１６５０塩基、配列番号１）についてのみ、図１０に示した。具体的には、解読した塩基配列の両端の数塩基は、ＢＬＡＳＴ解析によって比較対象とされなかったので、図１０には示さなかった。なお、図１０に示した塩基配列の左上が５’末端であり、右下が３’末端である。
　同一解析の結果、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．　ＲＫ２６１株と、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．　ＲＫ２６１株側の１６５０塩基中、ＦＦＧ０３９株側の１６４９塩基に同一性（すなわち、９９．９４％の同一性）があった。従って、ＦＦＧ０３９株は、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．　ＲＫ２６１株に近縁の微細藻類であると分類した。
　以上の解析の結果得られた系統図を図１１に示す。なお、本発明では、クロロコックムの名称が変更された場合には、ＦＦＧ０３９株も同様に名称が変更されるものとする。
　本発明には、ＦＦＧ０３９株と分類学的に同一の性質を有する株を用いることができる。ＦＦＧ０３９株の分類学的性質を以下に示す。
　ＦＦＧ０３９株の分類学的性質
１．形態的性質
　円状である。静置培養を行うと、液面上にフィルム状の構造物を形成する。オイルを生産する。
２．培養的性質（培養方法）
（１）培地：ＣＳｉＦＦ０４培地又はＣＳｉ改良培地（Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ　１５０　ｍｇ／Ｌ、ＫＮＯ3　１００　ｍｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4　２８．４　ｍｇ／Ｌ、ＫＨ2ＰＯ4　２２．２　ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ　４０　ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ　５８８　ｕｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ　１０８　ｕｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ　６６　ｕｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ　１２　ｕｇ／Ｌ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ　７．５　ｕｇ／Ｌ、Ｎａ2ＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ　３　ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ12　０．１　ｕｇ／Ｌ、Ｂｉｏｔｉｎ　０．１　ｕｇ／Ｌ、チアミン・ＨＣｌ　１０　ｕｇ／Ｌ、ｐＨ　７．０）
（２）培養温度：１５～２５℃で培養できる。
（３）培養期間：２～４週間
（４）培養方法：静置培養が適する。
（５）光要求性：要。光強度：４０００～１５０００ルクス、明暗周期：明期時間１２時間／暗期時間１２時間。
　ＦＦＧ０３９株と分類学的に同一の性質を有する微細藻類には、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．属に属する微細藻類であって、その１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９９．９４％の配列同一性を有するものが含まれる。
［浮遊培養］
　本発明では、微細藻類を培地中に分散させた状態で培養することを浮遊培養と呼んでいる。なお本発明では、液面上での培養を浮遊培養とは呼ばないものとする。浮遊培養は、本培養工程では行わないが、前培養工程では目的に応じて使用できる。
［液面浮遊培養］
　本発明では、液面上で微細藻類を培養する培養方法のことを液面浮遊培養という。なお、培養器底面、側面、その他表面上や培地中などに微細藻類が同時に存在していても、主たる目的が液面上での培養である場合には、液面浮遊培養という。また液面上にはバイオフィルムとともに泡沫がたくさん存在し、液面がどの位置か必ずしも明確でない場合があり、またバイオフィルムが自重によって液面下に多少沈んでいる場合があるが、本発明で液面上というときは、完全な液面のみならず、このような場合も含む。ただし、微細藻類を液中、培養器の底面のいずれか一方のみ、または、両方のみで培養する培養方法は液面浮遊培養には含まれない。
　なお本発明における液面とは、典型的には後述する液体培地の液面であり、通常、液体培地と空気との界面である。また、水が主成分となる場合は、水面のことである。
　また、本発明での液面浮遊培養を行っていると、液面上バイオフィルムからひだ状の構造体が液中へと侵入する現象が見られることがある。本発明では、この様な状況での培養も液面浮遊培養に含むものとしている。
　液面浮遊培養を行うための種藻としては、懸濁処理を行った後、培養器に添加してもよく、種藻の添加後、液体培地との混合を促進するために攪拌を行っても良い。
［前培養工程］
　本発明の前培養工程とは、純化工程を終了した後に得られた保存用微細藻類を増殖させ、本培養が行えるまで微細藻類の数を増やす工程のことである。前培養工程の培養法は、公知のいかなる培養方法でも選択可能である。例えば、分散培養法や付着培養法、本発明者らにより開発された液面浮遊培養や本発明の培養法を行うことも可能である。また、本培養が行える規模まで微細藻類を増殖させるために、前培養工程を数回行っても良い。また、前培養工程では、目的に応じて静置培養を行っても良いし、振盪培養などの非静置培養を行っても良い。また、前培養工程は、本培養が行える規模まで微細藻類を増殖させるために、前培養工程を複数回行っても良い。
　また、一般的には、１ｃｍ2～１ｍ2以下の表面積を持つ培養器を使用し、屋内外いずれでも培養可能である。
［本培養工程］
　本発明でいう本培養工程とは、前培養工程を行った後の培養工程のことであり、最終回収工程を行う直前までの培養工程のことをいう。本発明でいう「第一の培養工程」、「第二の培養工程」及び第三以降の工程は、本培養工程に該当する。本培養工程は、培養開始時の微細藻類の密度にもよるが、液面上に微細藻類バイオフィルムが十分な量で形成され
たときに終了することができる。本培養工程は、例えば、数日～数週間で、より特定すると、５日～４週間で終了することができる。
　第一の培養工程とは、微細藻類懸濁液を調製し、培養を開始してから、液面上に微細藻類バイオフィルムが形成されるまでのことをいい、第二の培養工程とは、第一の培養工程の後、回収されずに底面上などに残った微細藻類を種藻として培養を開始してから液面上に微細藻類バイオフィルムが形成されるまでのことをいう。同様に、第ｎの培養工程とは、第（ｎ－１）の培養工程の後、底面上などに残った微細藻類を種藻として培養を開始してから液面上に微細藻類バイオフィルムが形成されるまでのことをいう。なお、第二以降の培養というときは、第二の培養工程を含み、もし存在すれば第三の培養工程、及び第四の培養工程を含む。また、第一の培養工程を、前培養工程と明確に区別するために、第一の本培養工程ということがある。第二以降の培養工程についても同様である。
　また、一般的には、１００ｃｍ2以上の表面積を持つ培養器を使用し、屋内外いずれでも培養可能であるが、屋外での培養の方が好ましい。
　また、本培養工程は何回でも繰り返しても良い。本発明では、少なくとも二回以上の本培養を行う必要がある。
［種藻］
　本発明での種藻とは、前培養工程や本培養工程の開始時に使用する微細藻類のことを指し、前培養工程や本培養工程における微細藻類の培養の元となる微細藻類のことをいう。さらに、回収工程で得られた微細藻類の一部を種藻として使用することもある。
［底面藻］
　本発明での底面藻とは、培養器底面近傍に存在している微細藻類のことを指す。この中には、底面に付着し軽い液流程度では底面から剥がれないものや、底面近傍に存在し軽い液流程度でも移動してしまう非付着性底面藻も存在している。また、回収操作によって微細藻類バイオフィルムから離れ、底面近傍へと沈んでしまった底面藻も、本発明では非付着性底面藻に含めることができる。
　なお、本発明の模式図では液面上への微細藻類の供給が底面から行われるように記されているが、液面や底面以外の培地中にも低濃度ながら微細藻類が存在している場合には、これらが種藻の供給源となる可能性もある。また、培養器底面から液面上への微細藻類の供給とは、底面の微細藻類の増殖を伴わずに液面上に移動する場合と、微細藻類が底面から液面上に移動しながら増殖する場合との両方がある。
［底面上の微細藻類の種藻としての利用］
　本発明の実施態様の一例によれば、純菌化工程を経て得られた微細藻類を、人工培地を含む液体培地中に分散させることにより、微細藻類を含む懸濁液又は分散液を調製し、培養器中で培養を行うことにより、液体培地の液面上で微細藻類バイオフィルムを形成させ、培養器の液面上から増殖した微細藻類を回収し、主として底面上に残った微細藻類を種藻として培養することで、再び液面上に微細藻類バイオフィルムを形成させるものである。
　本発明の最大の特徴は、液面上の微細藻類を回収した後に残存する底面上の微細藻類を、種藻として再利用することにある。従って、本発明では、本培養工程を二回以上行うが、最初の培養を第一の培養、第一の培養にて培養することで得られた液面藻を回収し、残った底面上の藻体を用いて培養する方法を第二の培養ということがある。
　本発明では、培地の再使用も可能である。すなわち、培地中に栄養成分が残っていれば、使用済みの培地をそのまま使用して培養を継続しても良いし、使用済み培地の一部を廃棄し、新しい培地を添加しても良い。新しい培地の添加量は、廃棄量と同等の液量加えても良いし、それよりも少なくても多くてもよい。なお、新しい培地を添加する方が、後段の本培養での微細藻類の増殖速度を向上させることができる観点からより好ましい。
　新しい培地を添加する場合には、栄養成分を液体に溶解させた状態で添加しても良いし、固形分として添加しても良い。固形分として添加した場合には、培地を攪拌しなければならない場合があることから、液体に溶解させた状態で添加することの方がより好ましい。
　培地の添加は、前段の本培養に使用した培地と同一成分の培地を使用しても良いし、成分が異なる培地を添加しても良い。
　本発明では、液面上の微細藻類を回収した後に、培養に使用した培地に対して、特定の成分が高濃度である新鮮な培地を添加することができる。特定の成分は、特に限定されないが、例えば、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、及び鉄からなる群より選択されるいずれかを含む化合物である。
　培養に使用した培地に対して、特定の成分が高濃度である新鮮な培地を添加する場合には、濃度は、通常の場合に対して、１．０１倍以上１０００００倍以下が好ましく、１０倍以上１００００倍以下がさらに好ましく、５０倍以上５０００倍以下が最も好ましい。
　新鮮培地の特定の成分の濃度が１．０１倍未満であると、その製造に多くの水が必要となり、さらに、新鮮培地の調製場所と培養器設置場所との距離が離れるほど輸送性が低下し、大量の培地を培養器内へと導入するためには、新鮮培地の保管容器や培養器へと新鮮培地を供給するためなどの種々の装置が必要となるなど、様々な問題が考えられる。さらに、培養器内の培地量が増加し、例えば、１．０１倍の濃縮液を培養器へと加えた場合には、培養器内の培地成分がほぼゼロであると仮定した場合には、約１／２の濃度へと薄まる。これらのことにより、増殖速度や増殖量が低下する可能性が高い。
　培地の特定の成分能濃度が１０００００倍より大きいと、培地液量が非常に少なくなり輸送性や培養器への濃縮培地の導入効率が向上するが、培地成分の種類によっては、溶解性が悪くなる。さらに、培養器への導入の際に不必要な沈殿物が発生し、培養器内での攪拌によって希釈された後でも溶解しない場合がある。その結果、微細藻類の増殖速度や増殖量が低下する場合がある。
　新鮮培地の成分組成は、培養器内の培地成分組成と同一のものを使用することもできるが、異なる成分から構成された新鮮培地を添加しても良い。さらに、培養器内の培地と成分が一部同じものを用いても良い。また、培養器内の培地の成分と、添加後の最終濃度が大きく異なるように調製した新鮮培地を使用することもできる。
　培地の除去は、どの部分から行っても良いが、底面部分を除いた場所から除去することが、底面部分の微細藻類の流出を抑制する観点からより好ましい。また、液面上に微細藻類バイオフィルムの少なくとも一部が存在しており、液面上の微細藻類も種藻として利用する場合には、液面と底面部分を除く中間領域には微細藻類の存在量が少ないことから、この領域から採取することが好ましい。すなわち、培地の除去は、液面と底面との間の領域に存在する培地の少なくとも一部を除去するように行うことができ、特に液面と底面との間の領域のうち、微細藻類が実質的に存在しないか又は目視では観察されない領域に存在する培地の少なくとも一部を除去するように行うことが好ましい。なお、この微細藻類が実質的に存在しないか又は目視では観察されない領域には、遊走子が存在していることが予想されるが、藻体よりもかなり小さいため、遊走子は目視では観察されない。
　底面上の微細藻類を種藻として利用する場合、底面藻の一部を剥がし、それを培地中へと分散させても良い。この様にすることによって、藻体の一部しか培地と接触することができない状態の微細藻類を、より多くの培地とを接触させることが可能となり、増殖速度を好適に向上させることが可能だからである。
　底面上に存在する非付着性微細藻類を除去しても良い。底面上に不必要に微細藻類が存在していると、栄養成分の不必要な消費が原因と考えられる増殖速度の低下が見られるからである。また、種藻として使用する底面藻の存在量を調製しても良い。このことにより、適切な培養を行うことが可能だからである。培養を開始するにあたっての底面上での微細藻類の存在量は、０．００１μｇ／ｃｍ2以上が好ましく、０．１μｇ／ｃｍ2以上がより好ましく、０．１ｍｇ／ｃｍ2以上がさらに好ましく、１ｍｇ／ｃｍ2以上がさらに好ましく、２ｍｇ／ｃｍ2以上がさらに好ましい。０．００１μｇ／ｃｍ2以上であれば、培養前後の微細藻類量の比を短時間で大きくすることができることから好ましい。いずれの場合であっても、培養を開始するにあたっての底面上での微細藻類の存在量は１００ｍｇ／ｃｍ2以下が好ましく、１０ｍｇ／ｃｍ2以下がより好ましく、５ｍｇ／ｃｍ2以下がさらに好ましい。
［懸濁処理］
　本発明では、懸濁処理した微細藻類試料を用いても良い。懸濁処理を行うことで、溶液中の微細藻類が均一化し、培養後の膜厚が均一化する結果、培養面積あたりの微細藻類量が増加する場合があるからである。懸濁処理としては、公知のいかなる方法でも用いることができるが、ピペッティングや容器内に入れた微細藻類溶液を手で振る処理、スターラーチップや攪拌棒による処理などの弱い処理、超音波処理や高速振盪処理などの強い処理、細胞間マトリックスのような接着物質を分解する酵素などの物質を用いる方法などをあげることができる。
［培養器］
　培養器（培養池）の形状は、培地を保持できる限り、公知のいかなる形状でも用いることができる。例えば、円柱状、方形状、球状、板状、チューブ状、プラスチックバッグな
どの不定形状のものを使用することができる。また、オープンポンド（開放池）型、レースウェイ型、チューブ型（Ｊ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　９２，　１１３，　２００１）など様々な公知の方式を用いることができる。培養器として使用することの可能な形状は、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７０　（１９９９）　３１３－３２１，　Ｅｎｇ．　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．　９，　１６５－１７７　（２００９）．　に記載の培養器をあげることができる。これらの中で、オープンポンド型又はレースウェイ型を用いることが、コスト面からは好ましい。
　本発明で使用可能な培養器は、開放型、閉鎖型のいずれでも使用することができるが、大気中よりも高い二酸化炭素濃度を使用した際の、培養器外への二酸化炭素の拡散を防ぐために、閉鎖型の培養器を用いる方が好ましい。閉鎖型の培養器を用いることで、培養目的外微生物やゴミの混入防止、培地の蒸発抑制、風によるバイオフィルム構造体への悪影響などを最小限にすることができる。しかし、商業生産を行う場合には、建設コストが安価であるなどの観点から、開放系での培養が好ましい。
［基板］
　本発明での基板とは、図１の（ｅ）や（ｇ）で使用される固体状物のことである。基板の形状は、フィルム状、板状、繊維状、多孔質状、凸状、波状などいかなる形状のものでも良いが、転写のしやすさ、および基板からの微細藻類の回収のしやすさから、フィルム状又は板状であることが好ましい。
［素材］
　本発明で使用可能な培養器、基板の素材は、特に限定することはなく、公知のものを使用することができる。例えば、有機高分子化合物や無機化合物、金属、それらの複合体から構成された素材を使用することができる。また、それらの混合物を用いることも可能である。
　有機高分子化合物としては、ポリエチレン誘導体、ポリ塩化ビニル誘導体、ポリエステル誘導体、ポリアミド誘導体、ポリスチレン誘導体、ポリプロピレン誘導体、ポリアクリル誘導体、ポリエチレンテレフタレート誘導体、ポリブチレンテレフタレート誘導体、ナイロン誘導体、ポリエチレンナフタレート誘導体、ポリカーボネート誘導体、ポリ塩化ビニリデン誘導体、ポリアクリロニトリル誘導体、ポリビニルアルコール誘導体、ポリエーテルスルホン誘導体、ポリアリレート誘導体、アリルジグリコールカーボネート誘導体、エチレン－酢酸ビニル共重合体誘導体、フッ素樹脂誘導体、ポリ乳酸誘導体、アクリル樹脂誘導体、エチレン－ビニルアルコール共重合体、エチレン－メタクリル酸共重合体等などを用いることができる。
　無機化合物としては、ガラス、セラミックス、コンクリートなどを用いることができる。
　金属化合物としては、鉄、アルミニウム、銅やステンレスなどの合金を用いることができる。
　上記の中でも、基板や培養器の素材の一部は、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン、塩化ビニル、ポリエステルの中から選ばれる少なくとも一つから構成されていることが好ましい。
　また、培養器、基板の素材は同一であっても良く、異なっていても良い。
　また、閉鎖型の培養器を用いる場合には、受光面は、光が透過する素材である方が良く、透明材料であればさらに良い。
［培地（液体培地）］
　本発明では、微細藻類を培養できる限り、公知のいかなる培地（液体培地）も使用することができる。公知の培地として、ＡＦ－６培地、Ａｌｌｅｎ培地、ＢＢＭ培地、Ｃ培地、ＣＡ培地、ＣＡＭ培地、ＣＢ培地、ＣＣ培地、ＣＨＵ培地、ＣＳｉ培地、ＣＴ培地、ＣＹＴ培地、Ｄ培地、ＥＳＭ培地、ｆ／２培地、ＨＵＴ培地、Ｍ－１１培地、ＭＡ培地、ＭＡＦ－６培地、ＭＦ培地、ＭＤＭ培地、ＭＧ培地、ＭＧＭ培地、ＭＫＭ培地、ＭＮＫ培地、ＭＷ培地、Ｐ３５培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地、ＶＴＡＣ培地、ＶＴＹＴ培地、Ｗ培地、ＷＥＳＭ培地、ＳＷ培地、ＳＯＴ培地などを挙げることができる。このうち淡水性のものはＡＦ－６培地、Ａｌｌｅｎ培地、ＢＢＭ培地、Ｃ培地、ＣＡ培地、ＣＡＭ培地、ＣＢ培地、ＣＣ培地、ＣＨＵ培地、ＣＳｉ培地、ＣＴ培地、ＣＹＴ培地、Ｄ培地、ＨＵＴ培地、Ｍ－１１培地、ＭＡ培地、ＭＡＦ－６培地、ＭＤＭ培地、ＭＧ培地、ＭＧＭ培地、ＭＷ培地、Ｐ３５培地、ＵＲＯ培地、ＶＴ培地、ＶＴＡＣ培地、ＶＴＹＴ培地、Ｗ培地、ＳＷ培地、ＳＯＴ培地である。前述のＡＶＦＦ００７株を培養する培地としては、Ｃ培地、ＣＳｉ培地、ＣＨＵ培地、及びこれら培地の混合物が好ましい。なお培地は、培養する微細藻類の種類に応じて選択することが望ましい。
　培地は、紫外線滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌しても良く、しなくても良い。
　培地は、前培養工程と第一の本培養工程、第二の本培養工程で異なる培地を使用しても良い。また、培養工程の途中で異なる培地を使用しても良い。
［二酸化炭素］
　多くの微細藻類の培養には、二酸化炭素の供給が必要である。
　前培養工程で分散培養を行った場合には、従来法のようにバブリングによって二酸化炭素を培地中に供給しても良いが、液面浮遊培養を行った場合には、二酸化炭素を気相中から供給した方が好ましい。これは、培地中に二酸化炭素をバブリングなどの方法で供給すると液面上の微細藻類バイオフィルムの構造が破壊され、藻体量の斑が発生し、回収工程で基板上へのバイオフィルム回収効率が悪く、回収藻体量が減少する可能性があるからである。
　本発明では、大気中の二酸化炭素の利用も可能であるが、大気濃度よりも高濃度の二酸化炭素を利用することもできる。この場合には、拡散による二酸化炭素の損失を防ぐために、閉鎖型の培養器又は農業用フィルムなどの被覆物で覆った培養器中で培養することが望ましい。この場合の二酸化炭素の濃度は本発明の効果が達成できる限り特に限定しないが、好ましくは大気濃度以上、２０体積％未満であり、好ましくは０．０１～１５体積％であり、より好ましくは０．１～１０体積％である。また、二酸化炭素は、燃焼装置によって排出された二酸化炭素であってもよい。また、試薬によって二酸化炭素を発生させてもよい。
［光源及び光量］
　本発明で用いることのできる光源は、公知のいかなる光源も用いることができるが、太陽光、ＬＥＤ光、蛍光燈、白熱球、キセノンランプ光、ハロゲンランプなどを用いることができ、この中でも、自然エネルギーである太陽光、発光効率の良いＬＥＤ、簡便に使用することのできる蛍光燈を用いることが好ましい。
　光量は、１００ルクス以上１００万ルクス以下であることが好ましく、３００ルクス以上５０万ルクス以下がさらに好ましい。最も好ましい光量は、１０００ルクス以上２０万ルクス以下である。光量は、１００ルクス以上であると、微細藻類の培養が可能であり、１００万ルクス以下であると、光障害による培養への悪影響が少ない。
　光は、連続照射、ある一定の時間間隔で照射と非照射を繰り返す方法のいずれでもかまわないが、１２時間間隔で光をＯＮ、ＯＦＦすることが好ましい。
　光の波長は、光合成が行える波長であれば、どの様な波長でも用いることができ、その制限を設けないが、好ましい波長は、太陽光又は太陽光に類似の波長である。単一の波長を照射することで光合成生物の育成速度が向上する例も報告されており、本発明でもこの様な照射方法を用いることができる。
［その他培養条件］
　本発明では、前培養工程や本培養工程で使用する液体培地（以下、液体培地のことを培養液ともいう）のｐＨは、１～１３の範囲内であることが好ましく、３～１１の範囲内であることがより好ましく、５～９の範囲内であることがさらに好ましく、６～８の範囲内であることが最も好ましい。
　また、微細藻類の種類に応じて、好適なｐＨは変化することから、微細藻類の種類に応じたｐＨを選択することが好ましい。なお、液体培地のｐＨとは、培養開始時のｐＨのことである。また、培養工程内のｐＨは、培養に伴って変化する場合があることから、培養工程内でｐＨは変化しても良い。
　本発明では、培地中のｐＨを一定に保つ緩衝作用を持った物質を培地中に添加することができる。これにより、微細藻類の培養の進行とともに培地中のｐＨが変化する問題を抑制することや、培地中への二酸化炭素の供給でｐＨが変化する現象を抑制できる場合がある。緩衝作用を持った物質としては、公知の物質を使用することができ、その使用には制限がないが、４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）や、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液などを好適に用いることができる。これら、緩衝物質の濃度や種類は、微細藻類の種類や培養環境に応じて決めることができる。
　分散培養を行った場合の液体培地の水深が深いと、光が届かず、攪拌効率も悪くなる問題があり、限度があった。しかし、液面浮遊培養の場合には、液面上に高密度に微細藻類が増殖していることから、培養器深部に対して光を供給する必要がなく、基本的には攪拌も行わないことから、その水深は、浅くすることができる。これにより、水の使用量が少なく、ハンドリング効率が良くなることから、水深を浅くすることは好ましい。水深は０．４ｃｍ以上が好ましく、１．０ｃｍ～１０ｍがより好ましく、２．０ｃｍ～１ｍが更に好ましく、４．０ｃｍ～３０ｃｍが最も好ましい。水深が０．４ｃｍ以上であるとバイオフィルムの形成が可能となり、水深が１０ｍ以下であると、ハンドリングが容易である。水深が、４．０ｃｍ～３０ｃｍであると、水分の蒸発による影響が最小限であり、培地や微細藻類を含む溶液のハンドリングが容易である。
　培養温度は、微細藻類の種類に応じて選択することができ、特に限定はしないが、０℃以上９０℃以下であることが好ましく、１５℃以上５０℃以下がより好ましく、２０℃以上４０℃未満が最も好ましい。培養温度が２０℃以上４０℃未満であると、微細藻類を好適に増殖させることができる。
　微細藻類の下限投入微細藻類量、すなわち、培養開始時に使用する微細藻類量は、培養範囲内において１個あれば、時間をかけさえすれば増殖は可能であるため、その制限は特に設けないが、好ましくは１個／ｃｍ3以上であり、より好ましくは１０００個／ｃｍ3以上であり、更に好ましくは１×１０4個／ｃｍ3以上である。微細藻類の上限投入微細藻類量は、どの様な高濃度でも増殖が可能であるため、その制限は特に設けないが、ある濃度以上であると微細藻類量が多ければ多いほど、投入微細藻類量と増殖後の微細藻類量の比が低下することから、１×１０9個／ｃｍ3以下が好ましく、１×１０8個／ｃｍ3以下がより好ましく、５×１０7個／ｃｍ3以下が更に好ましい。
　本発明での前培養期間、本培養期間は、微細藻類の種類に応じて選択することができ、特に限定はしないが、１日以上３００日以下が好ましく、３日以上１００日以下がより好ましく、７日以上５０日以下が更に好ましい。
［液面上に形成された微細藻類バイオフィルムの大きさと増殖速度］
　微細藻類バイオフィルムの大きさは０．１ｃｍ2以上であることが好ましく、１ｃｍ2以上がより好ましく、１０ｃｍ2以上がさらに好ましく、培養器の液面面積と等しいことが最も好ましい。０．１ｃｍ2以上であれば、培養開始時の微細藻類量に対する培養終了時の微細藻類量との比を短時間で大きくすることができることから好ましい。また、微細藻類バイオフィルムは、培養領域内で複数個存在していても良い。
　微細藻類バイオフィルムの厚さは、１μｍ～１００００μｍの範囲であることが好ましく、１μｍ～１０００μｍの範囲であることがより好ましく、１０μｍ～１０００μｍの範囲であることが最も好ましい。１０μｍ～１０００μｍの範囲であると、バイオフィルム強度が高く、十分な量のバイオフィルムを収穫することができる。
　本発明に係るバイオフィルムが、フィルム状構造体の一部または複数の部分で気泡状に盛り上がることで形成された立体的な三次元状構造体である場合、培地の液面を基準とした該三次元状構造体の一般的な高さは、０．０１ｍｍ～１００ｍｍの範囲であることが好ましく、０．１ｍｍ～２０ｍｍの範囲であることがより好ましく、５ｍｍ～２０ｍｍの範囲であることが最も好ましい。５ｍｍ～２０ｍｍの範囲であると、含水率を十分に下げることができ、培養器の高さを低く抑えることができる。
　また本発明にかかる微細藻類は、液面上における増殖速度が大きいことが好ましく、対数増殖期における増殖速度（すなわち、対数増殖期の期間における一日あたりの平均増殖速度）が、乾燥重量で０．１ｇ／ｍ2／ｄａｙ以上であることが好ましく、０．５ｇ／ｍ2／ｄａｙ以上であることがより好ましく、１ｇ／ｍ2／ｄａｙ以上であることがさらに好ましく、３ｇ／ｍ2／ｄａｙ以上であることが最も好ましい。微細藻類の対数増殖期における増殖速度は、乾燥重量で一般的に１０００ｇ／ｍ2／ｄａｙ以下である。
　本発明に係るバイオフィルムの単位面積あたりの乾燥藻体重量は、０．００１ｍｇ／ｃｍ2以上であることが好ましく、０．１ｍｇ／ｃｍ2以上であることがより好ましく、１ｍｇ／ｃｍ2以上であることが特に好ましい。最も好ましくは、５ｍｇ／ｃｍ2以上である。単位面積あたりの乾燥藻体重量が大きい方が、得られるオイルなどのバイオマスの量が大きくなることが見込まれるからである。バイオフィルムの単位面積あたりの乾燥藻体重量は通常１００ｍｇ／ｃｍ2以下である。
　また本発明の微細藻類としては、上記の構造や、上記範囲の面積、厚さ、高さ、増殖速度、単位面積あたりの乾燥藻体重量を有するバイオフィルムを液面上に形成可能な微細藻類であることが、上記と同様の理由で好ましい。
　また、液面上のバイオフィルムのみ回収しても良いし、液面上のバイオフィルム、および底面上の微細藻類の一部の両方を回収しても良い。これは、液面および底面の両方の微細藻類ともバイオマスとして利用が可能だからである。ただし、一般的には、有用物質としてオイルを考慮すると、液面上の微細藻類よりも底面上の微細藻類の方がオイル含有量は低くなる。従って、底面藻を回収することは可能な限り避けた方が良い。
［回収］
　液面上のバイオフィルムは、培養器内の液面がバイオフィルムで部分的に覆われている状態で回収することも可能であるが、微細藻類の藻体量が多いことから、培養器内の液面が全てバイオフィルムで覆われてから回収することが好ましい。また、バイオフィルムが液面を全て覆いつくした後に、しばらく培養を継続してから回収を行っても良い。
　特に、液面上に三次元の構造物が形成された後に回収することが好ましい。三次元状構造体は、フィルム状構造体がさらに増殖した時に見られる構造であり、二次元的なフィルム状構造体と比較して、回収可能な微細藻類の量が多いこと、及び含水率がより低いことから好ましい。
　上述の回収方法は、液面上に形成されたバイオフィルムの７０％以上を回収することが好ましく、より好ましくは８０％以上を回収することであり、更に好ましくは９０％以上を回収することであり、最も好ましくは１００％回収することである。液面上に形成されたバイオフィルムの回収率は例えば、目視で確認することができる。
［液面上の微細藻類バイオフィルムの転写法による回収］
　転写法とは、図１の（ｄ）から（ｅ）に示されるように、液面上の微細藻類バイオフィルムを第一の基板に写し取る工程のことであり、付着の一種で、実質的に増殖を伴わない付着である。
　第一の基板を液面に対して、平行、又は、それに近い角度になるように静かに挿入し、液面上の微細藻類バイオフィルムを第一の基板の表面に付着させる。なお、挿入を行う際、第一の基板を液面に対して若干斜めに挿入し、最終的に液面に対して平行にするようにすると、多くの微細藻類バイオフィルムを少ない転写回数で回収でき好ましい。転写は、転写率が向上することから、複数回行っても良い。
［液面上の微細藻類バイオフィルムの堆積法による回収］
　図１の（ｆ）に示した様に、第二の基板を用いて、液面上の微細藻類を回収する方法が堆積法による回収法である。図に示した様に、培養器の液面上の微細藻類バイオフィルムに対して、第二の基板を斜めに挿入し、バイオフィルム面をなぞるように挿引するとともに、第二の基板の表面にバイオフィルムを堆積させながら回収する方法である。
　図では、右側から左側に第二の基板を移動させているが、第二の基板の移動方向は、逆方向（すなわち、左側から右側への移動）でも良いし、複数回回収しても良い。複数回回収を行うことによって、回収率が向上するからである。複数回回収する場合には、バイオフィルムを付着させたままの第二の基板を用いても良いし、新しい第二の基板を準備して使用しても良い。また、図１では１枚の第二の基板しか記していないが、複数枚の第二の基板を同時に用いても良い。これにより、回収率が向上する。なお、この中で第二の基板の強度が許す限り、一枚の第二の基板を用い、回収したバイオフィルムを除去した後、次の回収に用いることが、回収装置の設置コストの面などから好ましい。また、第二の基板の大きさ、液面に対する第二の基板の角度や移動速度などは目的に応じて自由に設定することができる。なお、図１の（ｇ）は、第二の基板上にバイオフィルムが回収された状態である。
　第二の基板のサイズは、培養器のサイズに応じて適宜変更できるが、培養器の内壁の短径よりも少し小さな第二の基板を用いる方が好ましい。これにより、第二の基板を移動している時に、培養器の内壁に対して不必要な接触を避けることができるとともに、液面上の微細藻類バイオフィルムが、培養器と第二の基板との間の隙間を通ることによる回収漏れが発生しにくくなるためである。
　また、培養の状態によっては、培養器内の液面上で増殖している微細藻類バイオフィルムは、フィルム状から、ひだ状に培養培地内で成長することがある。この場合には、第二の基板の液中への挿入深度を深くすることによって、ひだ状になったバイオフィルムを採取することもできる。
［基板からの微細藻類バイオフィルムの脱着］
　脱着は、回収の一部の工程である。基板上の微細藻類バイオフィルムを脱着する方法としては、基板上から微細藻類を剥がすことのできる方法であればいかなる方法を用いても良いが、水流を加えたり、基板を入れた容器を超音波処理したり、基板を入れた容器の蓋を閉めた後、激しく振ったり、高速振盪処理を行ったり、セルスクレーパーのようなものを用いたりすることでバイオフィルムを基板から剥ぎ取ることができる。このうち、基板を傷つけない素材が使用されている治具、例えば、セルスクレーパーのようなものを用いて基板からバイオフィルムを剥ぎ取る方法が好ましい。
　さらに、基板を傾けるだけで、基板上から微細藻類バイオフィルムを剥がすこともできる。本方法は、簡便であることから、最も好ましい方法である。
　また、基板は、何度でも再利用してかまわない。
［乾燥藻体］
　本発明における乾燥藻体は、本発明によって得られた微細藻類回収物を乾燥させたものである。
　当該微細藻類回収物を乾燥させる方法としては、微細藻類回収物中の水分を減らすことができる方法であれば、いかなる公知の方法でも用いることができ、特に制限されない。例えば、微細藻類回収物を天日干しにする方法、微細藻類回収物を加熱乾燥させる方法、微細藻類回収物を凍結乾燥（フリーズドライ）する方法、微細藻類回収物に乾燥空気を吹き付ける方法等があげられる。これらのうち、微細藻類回収物に含まれる成分の分解を抑制できる観点から凍結乾燥、短時間で効率的に乾燥できる観点から加熱乾燥または天日干しする方法が好ましい。
［含水率］
　本発明での含水率とは、回収物中に含まれる水分の重量を、回収物の重量で割って、１００を掛けたものである。本発明での微細藻類バイオフィルムの含水率は、９９～６０％が好ましく、９５～８０％がさらに好ましく、９０～８５％が最も好ましい。
　分散培養で培養し、遠心分離機を用いて微細藻類を回収した場合の含水率は、一般的に９０％程度とされ、本発明での培養法によって得られた液面上バイオフィルムの含水率は、それよりも低く、従来法と比べて優れている点である。なお、フィルム状構造体よりも三次元状構造体の方が含水率は低い。これは、三次元状構造体の方が液面から離れており、かつ、光源に近く、ある程度の乾燥が進行していることが原因と推定している。
［有用物質］
　本発明での有用物質とは、微細藻類由来のバイオマスの一種で、バイオマスから抽出工程、精製工程などの工程を経由することによって得られる産業にとって有益な物質の総称である。この様な物質として、医薬品や化粧品や健康食品などの最終生成物や中間物や原料、化学合成物の原料、中間物や最終生成物、炭化水素化合物、さらにはオイル、アルコール化合物、水素やメタンなどのエネルギー代替物質、酵素、タンパク、核酸、糖やＤＨＡなどの脂質化合物、アスタキサンチンなどを含む。有用物質は、有用物質蓄積工程によって、微細藻類中に蓄積させることもできる。
［バイオマス及びオイル］
　本発明でのバイオマスとは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源をいい、例えば、生物由来の物質、食料、資材、燃料、資源などをあげることができる。藻類バイオマスには、微細藻類自体（バイオフィルム状であってもよい。）、有用物質を採取した後の微細藻類残滓が含まれる。
　本発明でのオイルとは、可燃性の流動性物質のことであり、主として、炭素、水素から構成された化合物のことであり、場合によっては、酸素原子、窒素原子などを含む物質のことである。オイルは、一般的に混合物であり、ヘキサンやアセトンなどの低極性溶媒を用いて抽出される物質である。その組成は、炭化水素化合物や脂肪酸、トリグリセリドなどから構成される場合や、これらから選ばれる複数種の組成から構成されている場合もある。また、エステル化して、バイオディーゼルとして使用することもできる。
　微細藻類回収物中に含まれる有用物質やオイルを採取する方法としては、本発明の効果を損なうものでなければ特に制限されない。
　オイルの一般的な回収方法は、最終回収物を加熱乾燥させて乾燥藻体を得た後、細胞破砕を行い、有機溶媒を用いてオイルを抽出する。抽出したオイルは、一般的に、クロロフィルなどの不純物を含むため精製を行う。精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによるもの、蒸留（例えば、特表２０１０－５３９３００に記載の蒸留方法）によるものなどがある。本発明でもこの様な方法を用いることができる。
　また、超音波処理によって微細藻類を破砕したり、プロテアーゼや酵素などによって微細藻類を溶解したりした後、有機溶媒を用いて藻体内のオイルを抽出する方法もある（例えば、特表２０１０－５３０７４１に記載の方法）。本発明でもこの様な方法を用いることができる。
　また本発明に係るバイオフィルムは、バイオマスとしての有用性の観点から、オイル含有量が高いことが好ましい。具体的には、バイオフィルムの乾燥藻体あたりのオイル含有量が５質量％以上であることが好ましく、１０質量％以上であることがより好ましく、１５質量％以上であることが特に好ましい。バイオフィルムの乾燥藻体あたりのオイル含有量は通常８０質量％以下である。
　以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］
　前培養として、ＰＳ製ケース２８号（アズワン株式会社、４－５６０５－０５）にＣＳｉＦＦ０４培地（図２）４０ｍＬとＦＦＧ０３９株（藻体濃度０．０３２ｍｇ／ｍＬ）との混合物を入れ、これを真空デシケーター（アズワン株式会社、１－０７０－０１）中に入れ、１５０００ルクスの蛍光灯照射下（１２時間ごとに光照射ＯＮ－ＯＦＦ）、２３℃、二酸化炭素濃度５％で静置培養を行った。なお、ＰＳ製ケース２８号の側面、底面は黒いプラスチックケースで遮光した。回収直前の培養状態を図８に示した。
　１４日後、真空デシケーターから培養器を取り出し、ＰＳ製ケース２８号の短径と同じ長さのナイロンフィルムを用いて、水面上の微細藻類バイオフィルムを回収した。
　これを５ｍＬホモジナイズ用チューブ（株式会社トミー精工、ＴＭ－６５５）に、少量のＣＳｉＦＦ０４培地と共に入れ、ビーズ式細胞破砕装置ＭＳ－１００（株式会社トミー精工）にセットし、４２００ｒｐｍで２０秒間のホモジナイズ処理を３回行い、微細藻類懸濁液ａを得た。ただし、ビーズは使用していない。
　この溶液を希釈し、６６０ｎｍの吸光度を測定することで濁度を算出し、予め算出していた濁度と藻体数との関係式から、上記懸濁液ａの藻体量を計算し、ＣＳｉＦＦ０４培地で希釈することで、０．０３２ｍｇ／ｍＬの濃度の懸濁液ｂを７４０ｍＬ得た。
　第一の本培養として、ＰＳ製ケース２８号に懸濁液ｂを４０ｍＬ入れ、前培養と同様の方法で液面浮遊培養を行った。
　培養７日後に、前培養と同様の方法で水面上の微細藻類バイオフィルムをすべて回収した。これを実験１Ａとした。
　回収物の重量を測定し、さらにこれを凍結乾燥した後に重量を測定した。これらの測定値から、乾燥重量と含水率を算出した。実験１Ａでの回収量（単位面積あたりの乾燥重量）は、０．２３９ｍｇ／ｃｍ２となった。
　培養器内の培地を除去した後、底面に存在している藻体を回収し、凍結乾燥後の重量に基づき藻体量を計算すると、０．１３２ｍｇ／ｃｍ2となった。すなわち、０．１３２ｍｇ／ｃｍ2が、実験１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅの投入藻体量に相当する。
　水面上の微細藻類を回収した試料のうち、３個を真空デシケーターに入れ、前培養と同様の培養条件で第二の本培養を行った。ただし、培養期間は、１４日間とした。これを実験１Ｂとした。すなわち、培地の置換をせず、底面藻に対して何の処理も行っていない場合の実施例である。回収量は、３．３２４ｍｇ／ｃｍ2となった。
　水面上の微細藻類を回収した試料のうち、セルスクレーパーを用いて３個の容器の底面藻を培養器底面から剥がした後、真空デシケーターに入れ、前培養と同様の培養条件で第二の本培養を行った。ただし、培養期間は、１４日間とした。これを実験１Ｃとした。すなわち、培地の置換をせず、底面藻に対して分散処理を行った場合の実施例である。回収量は、３．３８２ｍｇ／ｃｍ2となった。
　水面上の微細藻類を回収した試料のうち、３個の容器の培地を可能な限り除去し、新しいＣＳｉＦＦ０４培地を底面藻の構造が破壊されないように４０ｍＬ添加した後、真空デシケーターに入れ、前培養と同様の培養条件で第二の本培養を行った。ただし、培養期間は、１４日間とした。これを実験１Ｄとした。すなわち、培地の置換を行い、底面藻に対して何の処理も行っていない場合の実施例である。回収量は、４．９６４ｍｇ／ｃｍ2となった。第一の培養とあわせると、５．２０３ｍｇ／ｃｍ2となった。
　水面上の微細藻類を回収した試料のうち、３個の容器の培地を可能な限り除去し、新しいＣＳｉＦＦ０４培地を４０ｍＬ添加した後、セルスクレーパーを用いて底面藻を培養器底面からはがした後、真空デシケーターに入れ、前培養と同様の培養条件で第二の本培養を行った。ただし、培養期間は、１４日間とした。これを実験１Ｅとした。すなわち、培地の置換を行い、底面藻に対して分散処理を行った場合の実施例である。回収量は、５．６０３ｍｇ／ｃｍ2となった。第一の培養とあわせると、５．８４２ｍｇ／ｃｍ2となった。
　第一の本培養の７日後、微細藻類を回収せず、引き続き第二の本培養を１４日間行った実験を、実験１Ｆとした。回収量は、４．６０７ｍｇ／ｃｍ2となった。
　なお本実施例では、特に記載した場合を除き、液面上の微細藻類は、堆積法によって回収した。
　以上から、種藻として底面藻を用いての培養が可能であること、底面藻から培養を再開する場合、培地を置換すること、分散処理を行うことで、水面上の微細藻類量が増加することがわかった。
［実施例２（本培養を繰り返し行った場合）］
　実施例１と同様の方法で前培養を行った。ただし、微細藻類として、ＡＶＦＦ００７株を用いた。
　実施例１と同様の方法で、５×１０5個／ｍＬの微細藻類懸濁液ｂを１７０ｍＬ得た。
　第一の本培養として、ＰＳ製ケース２８号に懸濁液ｂを４０ｍＬ入れ、前培養と同様の方法で液面浮遊培養を行った。
　培養１４日後に、実施例１と同様の方法で水面上の微細藻類を回収した。図３に示した様に、乾燥藻体量（回収量）は、２．１６ｍｇ／ｃｍ2であった。
　第二の本培養として、以下の二種の試料を準備した。
　まず、水面上の微細藻類を回収した後、培地を可能な限り除去した。この時、底面上の微細藻類を容器内に残存させるようにした。また、底面への付着が少ないと考えられる破片状の微細藻類バイオフィルムも可能な限り容器内に残すようにした。つぎに、新しいＣＳｉＦＦ０４培地を、底面上の微細藻類構造物を剥がさないように４０ｍＬ入れた。すなわち、底面上に存在している微細藻類を種藻として培養を開始した。
　もう片方の試料は、第一の本培養と同様の方法で試料を準備した。すなわち、新たに微細藻類懸濁液ｂと同様の濃度の微細藻類懸濁液を９０ｍＬ調製し、新しいＰＳ製ケース２８号に４０ｍＬずつ入れた。
　以上のようにして調製した培養器を実施例１と同様の方法、培養条件で培養した。
　培養２１日後（第一の本培養を開始してからの培養日数）に、それぞれの試料由来の水面藻をすべて回収した。回収量は、前者が、３．２６ｍｇ／ｃｍ2、後者が１．９６ｍｇ／ｃｍ2であった。なお、後者の培養期間は、７日間である。
　第三の本培養も、第二の本培養と同様の方法でそれぞれの試料を調製した。培養２８日後、水面上の微細藻類をすべて回収した結果、前者が２．５４ｍｇ／ｃｍ2、後者が２．４ｍｇ／ｃｍ2であった。なお、後者の培養期間は、７日間である。
　第四の本培養も、第二の本培養と同様の方法でそれぞれの試料を調製した。培養３５日後、水面上の微細藻類をすべて回収した結果、前者が２．２２ｍｇ／ｃｍ2、後者が１．８８ｍｇ／ｃｍ2であった。なお、後者の培養期間は、７日間である。
　以上から、底面上の微細藻類を種藻とした場合には、水面藻の乾燥藻体量をすべて合計すると、１０．１８ｍｇ／ｃｍ2となった。一方、微細藻類懸濁液を調製することで新たに培養を開始した場合には、８．４ｍｇ／ｃｍ2となった。このことから、底面藻から培養を開始することは、種藻を準備する必要がないばかりではなく、得られるバイオマスの量が多く、好ましいことがわかった。
　図４に、底面藻を種藻とした場合の培養日数に対する乾燥藻体量（回収量）をプロットしたものを図示した。培養回数が二回目までは、乾燥藻体量が多くなったが、培養回数が三回以上であると、得られる乾燥藻体量は減少した。
［実施例３（底面上の微細藻類量と水面藻との関係）］
　実施例２と同様の方法で前培養を行い、藻体懸濁液ｂを１０００ｍＬ得た。２４個のＰＳ製ケース２８号に４０ｍＬずつ、藻体懸濁液ｂを入れ、実施例２と同様の方法で液面浮遊培養を行った。培養日数、３、５、７、１０、１４、２１日後に真空デシケーターから培養器を３個ずつ取り出し、水面上の微細藻類及び底面上の微細藻類をそれぞれ回収し、その乾燥藻体量を測定した。その結果を図５に示した。培養日数と共に、水面上の微細藻類の藻体量は増加した。また、本実験により、様々な底面上の藻体量を持つ試料を得た。
　実施例２と同様に、底面上の微細藻類を可能な限り残した状態で、培地を除去し、新しいＣＳｉＦＦ０４培地を４０ｍＬ入れ、培養を開始した。培養７日後、すなわち全培養期間では１０～２８日後に、培養を停止し、水面上の微細藻類の乾燥藻体量を測定した。その結果を、図６に示したが、底面上の微細藻類の量（すなわち種藻の量）は、３ｍｇ／ｃｍ2が最も良かった。
　このことから、底面上の微細藻類の量には、最適値があり、藻体量が多ければ多いほど良いというわけではないということが明らかになった。
［実施例４（非付着性微細藻類の除去の適否）］
　実施例２と同様の方法で、前培養及び第一の本培養を行った。
　水面上の微細藻類を回収した後、以下の二種の試料を準備した。
　第一の試料は、培地を除去する際に、底面上に付着していないフリーの微細藻類を除去した後、新しいＣＳｉＦＦ０４培地を入れたもの、第二の試料は、培地を除去する際に、底面上に付着しているものも付着していないものも可能な限り培養器内に残し、新しいＣＳｉＦＦ０４培地を入れたものである。
　前者の場合の藻体量は、乾燥藻体量で、０．４５３ｍｇ／ｃｍ2、後者の場合には、１．６５８ｍｇ／ｃｍ2であった。
　実施例２と同様の方法で第二の本培養を行った。培養１１日後（第一の本培養からの合計培養日数２５日後）に、水面上の微細藻類を回収した結果、前者が４．０ｍｇ／ｃｍ2、後者が３．２５ｍｇ／ｃｍ2になった。
　以上から、フリーの微細藻類、すなわち、非付着性底面藻を除去した方が、培養後の微細藻類の藻体量が多くなることがわかった。なお、実施例２の図２の場合には、底面上の非付着性微細藻類を除去していないことから、培養回数が増加すると共に水面上の微細藻類の量が減少したものである。このような結果になるのは、種藻の量が多いほど培地中の栄養成分を早く消費してしまうためであると考えている。
［実施例５（底面上の微細藻類を削除することで種藻の量を調製する方法）］
　実施例２と同様の方法で、前培養及び第一の本培養を行った。ただし、微細藻類として、ＦＦＧ０３９株を用いた。なお、一つの容器に対して、０．５ｍｇの乾燥藻体の回収漏れがあったことを、転写法による回収で確認した。
　水面上の微細藻類を回収した後、以下の三種の試料を準備した。
　第一の試料は、水面上の微細藻類を回収した後、幅１０ｍｍのセルスクレーパー（住友ベークライト株式会社、ＭＳ－９３１００）を用いて、培養器の長辺に沿って底面上の微細藻類を剥がした。すなわち、幅４．６ｃｍの培養器のうち、１ｃｍの幅にわたって底面上の微細藻類を剥がした。次に、剥がした微細藻類と共に、培地を可能な限り除去した。次に、新しいＣＳｉＦＦ０４培地を４０ｍＬ入れた。これで、約２２％の底面藻が除去できたことになる。
　第二の試料は、第一の試料と同様の方法で底面上の微細藻類を除去したが、セルスクレーパーによる底面藻の除去は、二回行った。すなわち、約４３％の底面藻を除去した。
　第三の試料は、底面藻の除去を行わず、培地交換のみ行った。
　この様にして準備した試料を用いて、実施例２と同様の方法で第二の培養を行った。
　回収物の乾燥藻体量は、第一、二、三の試料、それぞれ、７．５４ｍｇ／ｃｍ2、６．９２ｍｇ／ｃｍ2、６．４３ｍｇ／ｃｍ2となった。以上から、底面上の微細藻類の藻体量を制御することによって水面上の微細藻類の量を向上させることができること、その制御方法として、セルスクレーパーのような治具の利用が可能であることがわかった。
［実施例６（底面と液面との間の領域で培地を置換する方法の底面藻を残す方法）］
　実施例２と同様の方法で、第一の本培養を行った。ただし、藻類種としては、ＦＦＧ０３９株を用いた。
　第二の本培養として、水面上の微細藻類バイオフィルムを回収し、培地を新しいＣＳｉＦＦ０４培地に置き換え、第一の本培養と同様の方法で培養を行った。ただし、培養期間７日目で培地の置換を行った。すなわち、ＣＳｉＦＦ０４培地からＣａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2ＯとＫＮＯ3とを除去した培地を、水面藻と底面藻とが存在している間の微細藻類の存在量が少ないと考えられる領域を利用して培地置換を行った。なお、置換培地の液量は、約３０ｍＬ（培養開始時の７５％）であった。一方、培地置換を行わない試料も準備した。
　第二の本培養として、合計１４日間の培養を行った後、水面上の微細藻類を回収し、回収物を凍結乾燥した後、乾燥藻体量及びオイル含有量を測定した。
　培地置換した試料の乾燥藻体量は、７．８６ｍｇ／ｃｍ2、置換しなかった試料の乾燥藻体量は、８．０１ｍｇ／ｃｍ2になった。オイル含有量は、それぞれ、３９．２％、２８．４％であった。また、含水率は、それぞれ、８２％、８５％であった。
　以上から、水面藻と底面藻との間の領域を利用して、培地の置換が可能であることを明らかにした。
［実施例７（高濃度培地成分を添加した場合）］
　実施例１と同様の培養条件で第一の本培養を行った。培養器としては、プラスチック製角型コンテナ（上部(95×65.8×29.3cm)、下部(92.5×59.1cm)）の上部縁に両面テープで農業用フィルムを貼り付けることで準備し、培地液量は、２７．５Ｌ（水深５ｃｍ）で行った。なお、被覆フィルムを使用しているので、真空デシケーター用いず、遮光器具は、コンテナ自身に、側面、底面に遮光性があるため用いなかった。培養期間は、２１日間で行った。また、ホモジナイズ処理は、行わなかった。また、同時に５台の培養器６Ａ～６Ｅを用いて培養を行った。
　培養２１日後に、６Ａ～６Ｅの培養器の液面上の微細藻類を回収し、回収藻体を乾燥した結果、平均２２．２ｇであった。培養器６Ｅの培地をすべて除去し、培養器底面上に残存していた微細藻類を回収後、乾燥重量を測定した結果、０．８９６ｇであった。従って、培養器６Ａ～６Ｄには、培養器６Ｅとほぼ同等量の次の培養に必要な種藻が存在していることになる。
　液面上の微細藻類を回収した培養器６Ａに対して、ＣＳｉＦＦ０４培地よりも高濃度の培地成分を添加した。具体的には、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏが６１０．５倍、４５ｍＬ（７５０×６１０．５＝４５７．８ｍｇ／Ｌの濃度の水溶液を、約２７Ｌの培養系に４５ｍｌ添加した。）、ＫＮＯ3が３０５倍、９０ｍＬ、それ以外の成分を１１００倍、２５ｍＬ添加した。なお、濃縮倍率が異なるのは、それぞれの試薬が水に対して溶解度（溶解時間）が異なるためである。
　液面上の微細藻類を回収した培養器６Ｂに対して、ＣＳｉＦＦ０４培地よりも高濃度の培地成分を添加した。具体的には、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏが６１０．５倍、４５ｍＬ、ＫＮＯ3が１５２倍、１８０ｍＬ、それ以外の成分を１１００倍、２５ｍＬ添加した。
　液面上の微細藻類を回収した培養器６Ｃに対して、ＣＳｉＦＦ０４培地よりも高濃度の培地成分を添加した。具体的には、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏが６１０．５倍、４５ｍＬ、ＫＮＯ3が７６倍、３６０ｍＬ、それ以外の成分を１１００倍、２５ｍＬ添加した。
　液面上の微細藻類を回収した培養器６Ｄに対して、ＣＳｉＦＦ０４培地よりも高濃度の培地成分を添加した。具体的には、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏが６１０．５倍、４５ｍＬ、ＫＮＯ3が１５２倍、９０ｍＬ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏが１１００倍、２５ｍＬ、Ｋ2ＨＰＯ4が１１００倍、２５ｍＬ、ＫＨ2ＰＯ4が１１００倍、２５ｍＬ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏが１１００培、２５ｍＬ添加した。それ以外のＣＳｉＦＦ０４培地に添加されている成分は添加しなかった。
　６Ａ～６Ｄの培養器内の微細藻類は、培養を行うことで３～５日で薄く液面上にバイオフィルムが形成され、培養開始後、２１日後には厚いバイオフィルムが液面上に形成されていたので回収を行った。回収量は、培養器６Ａから順番に、２５．９、２７．９、２３．３、２２．７ｇであった。従って、ＫＮＯ3については、１５２倍が最も良かった。
　培養器６Ａについて、同様に高濃度の培地成分を添加して、さらに３回の培養をおこなった。その結果、液面上の微細藻類は、２４．３、２２．６、２１．２ｇであった。
配列番号１：ＡＶＦ００７株の１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部
配列番号２：ＦＦＧ０３９株の１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の一部

Claims (21)

  1. 培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面でバイオフィルムを形成させ、かつ培養器の底面に微細藻類を維持する、第一の培養工程；
    　第一の培養工程で形成された液面のバイオフィルムの少なくとも一部を回収し、かつ底面の微細藻類の少なくとも一部を培養器内に残す工程；及び
    　残した底面の微細藻類を、同じ培養器内で培養し、培地の液面でバイオフィルムを形成させる、第二の培養工程
    を含む、微細藻類の培養方法。
  2. 第一の培養工程で用いた培地の少なくとも一部を除去し、かつ新鮮培地を添加する工程を含む、請求項１に記載の培養方法。
  3. 新鮮培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度が、第一の培養工程で用いた培地の濃度の少なくとも５０倍である、請求項２に記載の培養方法。
  4. 新鮮培地に含まれる少なくとも一つの、第一の培養工程で用いた培地の濃度の少なくとも５０倍である成分が、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、及び鉄からなる群より選択されるいずれかを含む化合物である、請求項３に記載の培養方法。
  5. 第一の培養工程で用いた培地の少なくとも一部の除去が、液面と底面との間の領域に存在する培地の少なくとも一部の除去である、請求項２～４のいずれか１項に記載の培養方法。
  6. 底面の微細藻類が付着性のものを含み、付着性の微細藻類の少なくとも一部を底面上から剥離する工程を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の培養方法。
  7. 第二の培養工程が、形成された液面のバイオフィルムの少なくとも一部を回収し、かつ底面の微細藻類の少なくとも一部を培養器内に残すことを含み；
    　残した底面の微細藻類を、同じ培養器内で培養し、培地の液面でバイオフィルムを形成させることを繰り返す、第三以降の培養工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の培養方法。
  8. 第二以降の培養工程において、種藻として底面上に存在する微細藻類の量が、５ｍｇ／ｃｍ2以下である、請求項７に記載の培養方法。
  9. 第二以降の培養工程において、直前の培養工程で用いた培地の少なくとも一部を除去するが、除去する際に底面の非付着性微細藻類をともに除去することにより、種藻として底面上に存在する微細藻類の量が５ｍｇ／ｃｍ2以下であるようにする、請求項８に記載の培養方法。
  10. 底面の微細藻類が付着性のもの及び非付着性のものを含み、第一の培養工程で用いた培地の少なくとも一部を除去する際に、底面の非付着性微細藻類をともに除去する、請求項４又は５に記載の培養方法。
  11. 種藻として底面上に存在する微細藻類の量が、０．１ｍｇ／ｃｍ2以上である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の培養方法。
  12. 種藻として底面上に存在する微細藻類の量が、２ｍｇ／ｃｍ2以上である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の培養方法。
  13. 微細藻類がオイルを含む微生物である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の培養方法。
  14. 微細藻類が緑藻である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の培養方法。
  15. 微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｄ　ｓｐ．、Ｔｅｔｒａｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．、Ｃｈａｒａｃｉｕｍ　ｓｐ．又はＰｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ　ｓｐ．に属するものである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の培養方法。
  16. 微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．に属するものである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の培養方法。
  17. 微細藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１４２０、もしくはそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．　ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２２６２、もしくはそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の培養方法。
  18. １８Ｓ　ｒＲＮＡの遺伝子領域をコードする塩基配列のうち、一部の領域の、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．　ＲＫ２６１に相当する塩基配列との同一性が９５．００％以上９９．９９％以下であるか、又はＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．に属する微細藻類であって、その１８Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子が、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９９．９４％の配列同一性を有する、微細藻類。
  19. Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ　ｓｐ．ＦＦＧ０３９株（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２２６２）、又はそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類。
  20. 請求項１～１７のいずれか１項の培養方法を含む培養工程；及び
    第二の培養工程で形成された液面のバイオフィルムを回収する工程
    を含む、藻類バイオマスを製造する方法。
  21. 藻類バイオマスが、オイルである、請求項２０に記載の製造方法。
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