KR20230045218A - 녹조류 바이오매스의 생산성 증대를 위한 배양방법 - Google Patents
녹조류 바이오매스의 생산성 증대를 위한 배양방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 녹조류 바이오매스의 생산성 증대를 위한 배양방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 녹조류 바이오매스 생산성의 증대를 위한 방법은 B. sudetica KNUA107 (수탁번호 KCTC 146545BP)를 포도당이 첨가된 BG-11 배지에서 혼합영양배양 조건 하에 배양하는 경우, 조류의 배양주기를 단축시키고 바이오매스 생산성을 증가시키는 효과가 있으며, 조류의 콜로니 형성 능력과 침강성을 증가시켜 바이오매스 수확 효율을 현저히 향상시키는 효과가 있다.
Description
본 발명은 미세조류 중 녹조류의 바이오매스의 생산성 증대를 위한 배양방법에 관한 것으로 특히, 울릉도 유래 신규 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica KNUA107; 수탁번호 KCTC 14645BP)를 이용한 바이오매스의 생산성 증대를 위한 배양방법에 대해 제공하는 것이다.
산업화로 인한 화석연료의 무분별한 사용은 대기 중 CO2 농도 증가를 초래하였고, 온실가스 효과 및 해수면 상승으로 인한 환경재해는 세계 GDP의 5~20%에 달하는 천문학적 경제적 손실을 가져다 줄 것으로 추정되고 있다.
약 35억 년 전 지구상에 출현하여 산소를 대기 중에 방출했던 최초의 생물체인 미세조류는 광합성 독립영양군(Photoautotrophs)으로 CO2를 탄소원으로 사용하고 미량원소 존재 하에 물과 빛만 있으면 증식하여 대량의 바이오매스를 생산할 수 있다.
하지만, 바이오매스는 성장에 필요한 시간이 긴 문제점이 있는데, 이를 극복하여 바이오매스 생산량을 증대시키는데 기여하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 목적은 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)의 생산성을 증대를 위한 배양방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 포도당을 포함하는 BG-11 배지를 제조하는 1단계; 및 상기 1단계의 배지를 사용해 혼합영양배양 조건하에 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)를 배양하는 2단계;를 포함하는 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카의 생산성을 증대를 위한 배양방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 보트리오스페랄레 수테티카는 탄소원에 따라 빛과 CO2를 이용하여 광합성을 통해 배양하는 독립영양배양(autotrophic growth) 및 탄소원으로 빛, CO2, 유기 탄소원을 사용하여 배양하는 혼합영양배양(mixotrophic growth)으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 보트리오스페렐라 수테티카는 보트리오스페렐라 수테티카 KNUA107(Botryosphaerella sudetica KNUA107, 수탁번호 KCTC 14645BP)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 배양방법은 보트리오스페렐라 수테티카의 콜로니 형성 능력 및 침강력을 증가시키는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 2단계는 온도 20 내지 30℃, 회전속도는 100 내지 200 rpm의 배양조건으로 배양하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 2단계는 명기:암기를 16:8의 주기 조건으로 배양하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 배양방법은 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)의 배양주기를 단축시키고 바이오매스 생산성을 증가시키는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 배양방법은 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)에 의해 생산된 바이오매스의 지질 생산성을 향상시키는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)는 대수증식기 이후 다중불포화지방산은 감소하고 단일불포화지방산 및 포화지방산의 비율이 증가하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 배양방법은 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)에 의해 생산된 바이오매스의 다중불포화지방산은 감소시키고, 단일불포화지방산 및 포화지방산의 비율은 증가시키는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 녹조류 바이오매스 생산성의 증대를 위한 방법은 B. sudetica KNUA107 (수탁번호 KCTC 146545BP)를 포도당이 첨가된 BG-11 배지에서 혼합영양배양 조건 하에 배양하는 경우, 조류의 배양주기를 단축시키고 바이오매스 생산성을 증가시키는 효과가 있으며, 조류의 콜로니 형성 능력과 침강성을 증가시켜 바이오매스 수확 효율을 현저히 향상시키는 효과가 있다.
도 1은 본 발명 미세조류의 사진 및 공급된 탄소원별 성장성, 엽록소 및 총 색소량 비교 그래프를 나타낸 도이다(a: 본 발명 미세조류(단일) 사진, b: 본 발명 미세조류 콜로니 사진, c: 본 발명 미세조류 공급된 탄소원별 성장성 비교 그래프, d: 본 발명 미세조류 배양 12일째 탄소원별 엽록소 종류 비교 그래프, e: 본 발명 미세조류 배양 30일째 탄소원별 엽록소 종류 비교 그래프, f: 본 발명 미세조류 공급된 탄소원별 총 색소량 비교 그래프).
도 2는 본 발명 미세조류의 계통을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명 미세조류의 공급 배지별 시간에 따른 건조중량 및 플라스크 사진을 나타낸 도이다(a: 광독립영양 조건의 건조중량, b: 공급된 탄소원별 건조중량, c: 광독립영양 조건 및 공급된 탄소원별 배양 플라스크 사진).
도 4는 본 발명 미세조류의 콜로니 형성 능력 및 침강성을 조사하여 나타낸 도이다(a: 콜로니 형성 현미경 사진, b: 콜로니 직경 사진, c: 형성된 콜로니의 건조중량(상층액 1 mL), d: 형성된 콜로니의 건조중량(상층액 9 mL).
도 5는 본 발명 미세조류의 지질 생산성과 품질에 대해 나타낸 도이다(a: 광독립영양 및 공급 탄소원별 수확된 바이오매스의 총 지질 함량, b: 대수증식기 이후의 광독립영양 및 수크로스, 포도당 첨가 배지에서의 총 지질 생산량, c: 대수증식기 이후 광독립영양 및 수크로스, 포도당 첨가 배지의 지질 생산성, d: 광독립영양 및 수크로스, 포도당 첨가 배지의 배양 후 12일, 30일 지방산 조성 양상에 대한 그래프, e: 광독립영양 및 수크로스, 포도당 첨가 배지의 배양후 12일 30일 PUFA, MUFA, SFA의 비율 양상에 대한 그래프).
도 2는 본 발명 미세조류의 계통을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명 미세조류의 공급 배지별 시간에 따른 건조중량 및 플라스크 사진을 나타낸 도이다(a: 광독립영양 조건의 건조중량, b: 공급된 탄소원별 건조중량, c: 광독립영양 조건 및 공급된 탄소원별 배양 플라스크 사진).
도 4는 본 발명 미세조류의 콜로니 형성 능력 및 침강성을 조사하여 나타낸 도이다(a: 콜로니 형성 현미경 사진, b: 콜로니 직경 사진, c: 형성된 콜로니의 건조중량(상층액 1 mL), d: 형성된 콜로니의 건조중량(상층액 9 mL).
도 5는 본 발명 미세조류의 지질 생산성과 품질에 대해 나타낸 도이다(a: 광독립영양 및 공급 탄소원별 수확된 바이오매스의 총 지질 함량, b: 대수증식기 이후의 광독립영양 및 수크로스, 포도당 첨가 배지에서의 총 지질 생산량, c: 대수증식기 이후 광독립영양 및 수크로스, 포도당 첨가 배지의 지질 생산성, d: 광독립영양 및 수크로스, 포도당 첨가 배지의 배양 후 12일, 30일 지방산 조성 양상에 대한 그래프, e: 광독립영양 및 수크로스, 포도당 첨가 배지의 배양후 12일 30일 PUFA, MUFA, SFA의 비율 양상에 대한 그래프).
본 발명은 녹조류 바이오매스 생산성 증대를 위한 배양방법으로, 포도당을 포함하는 BG-11 배지를 제조하는 1단계; 및 상기 1단계의 배지를 사용해 혼합영양 조건하에 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)를 배양하는 2단계;를 포함하는, 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)의 생산성 증대를 위한 배양방법에 대해 제공한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는(w/w)%, 고체/액체는(w/v)%, 그리고 액체/액체는(v/v)%이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예 또는 실험예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예 또는 실험예들에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예 또는 실험예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 조류의 분리 및 동정
1-1. 미세조류의 생물학적 특징
녹조류의 분리 및 선별을 위해 2017년 4월 대한민국 울릉도 도동(37°29′51.5″N, 130°53′16.1″E)에서 담수 샘플을 채취하였다. 그 후 샘플을 실험실로 옮기고 250 mL 플라스크에 150 mL의 BG-11 배지(pH 7.4)에 접종하였다(Rippka et al., 1979). 접종된 시료는 형광등(약 55 μmol m-2s-1) 아래 16:8h light:dark의 광주기로 25℃에서 배양되었다. 배양은 orbital shaker(VS-202D, Vision Scientific, Bucheon, South Korea)를 사용해 160 rpm의 조건으로 배양하였다. 2주 배양 후, 조류 샘플을 BG-11(pH 7.4) 한천 플레이트에 스트리킹(streaking) 하였다. 그 후, 성장한 단일 콜로니는 무균 상태를 유지하여 신선한 BG-11 한천 플레이트로 옮겼다. 한 종으로 구성된 콜로니가 무균 상태로 획득될 때까지 전 과정을 반복하였다(Stanier et al., 1971).
액체 배지에서 콜로니를 형성한 녹조류 균주는 울릉도 도동에서 분리된 균주이다(도 1a). 상기 세포의 평균 크기는 6.26 ± 1.34 μm으로 나타났다. B. sudetica KNUA107 균주(GenBank accession number MW683220) 액체 배지에서 단세포와 다세포 콜로니의 형태로 영양 세포를 성장시켰으며, 콜로니는 불규칙하고 세포 사이에 단단히 결합되어 있다(도 1b).
| Strain | Marker gene | Length (bp) | Closest match | Overlap (%) | Sequence similarity (%) | Taxonomic affinity |
| B.sudetica KNUA107 | ITS | 1092 | Botryococcus sp. UTEX 2629 |
96 | 92 | Botryococcus sp. |
| rbcL | 1423 | Botryosphaerella sudetica UTEX 2629 | 98 | 95 | Botryosphaerella sudetica | |
| tufA | 929 | Neochloris aquatica UTEX 138 |
100 | 91 | Neochloris aquatica |
B. sudetica KNUA107 마커 유전자 서열의 NCBI blast 결과는 표 1에 기재하였다. 서열분석 결과 B. sudetica KNUA107이 Botryococcus sp., Botryosphaerella sudetica 및 Neochloris aquatica와 유사한 종으로 확인되었다(표 2).
| BG11-12 | BG11-30 | Sucrose-12 | Sucrose-30 | Glucose-12 | Glucose-30 | |
| C16:0 | 15.64 ± 0.68 | 24.54 ± 0.06 | 14.11 ± 0.08 | 18.98 ± 0.38 | 24.71 ± 0.40 | 27.66 ± 0.74 |
| C16:1 | 5.44 ± 0.02 | 5.04 ± 0.18 | 6.59 ± 0.30 | 3.42 ± 1.00 | 6.84 ± 0.18 | 7.06 ± 0.47 |
| C16:2 | 1.07 ± 0.22 | 1.76 ± 0.11 | 1.23 ± 0.04 | 1.52 ± 0.46 | 1.71 ± 0.17 | 1.04 ± 0.32 |
| C16:3 | 20.57 ± 0.32 | 16.42 ± 0.04 | 23.90 ± 0.68 | 15.82 ± 0.17 | 9.92 ± 0.10 | 6.05 ± 0.16 |
| C17:0 | - | - | - | - | 0.12 ± 0.06 | - |
| C18:0 | 0.29 ± 0.00 | 0.83 ± 0.01 | 0.40 ± 0.03 | 0.56 ± 0.01 | 0.78 ± 0.01 | 2.12 ± 0.13 |
| C18:1 | 7.06 ± 0.11 | 1.06 ± 0.02 | 8.12 ± 0.11 | 17.91 ± 0.34 | 26.55 ± 0.61 | 35.42 ± 0.51 |
| C18:2 | 5.47 ± 0.23 | 7.06 ± 0.09 | 6.18 ± 0.08 | 5.55 ± 0.01 | 8.45 ± 0.01 | 5.12 ± 0.56 |
| C18:3 | 38.38 ± 1.34 | 38.23 ± 0.90 | 36.01 ± 0.08 | 28.92 ± 0.68 | 18.72 ± 0.97 | 11.47 ± 0.33 |
| C20:0 | 0.52 ± 0.37 | - | - | - | - | - |
| C22:0 | - | - | - | - | - | 0.22 ± 0.11 |
| SFAa | 16.45 ± 1.05 | 25.37 ± 0.07 | 14.51 ± 0.11 | 19.54 ± 0.39 | 25.61 ± 0.47 | 30.00 ± 0.98 |
| UFAb | 77.99 ± 2.24 | 69.57 ± 1.34 | 82.03 ± 1.29 | 73.14 ± 2.66 | 72.19 ± 2.04 | 63.16 ± 2.35 |
| TFAc | 94.44 ± 3.29 | 98.23 ± 1.41 | 96.54 ± 1.4 | 92.68 ± 3.05 | 97.80 ± 2.51 | 93.16 ± 3.33 |
B. sudetica(95%)와 가장 높은 서열 유사성을 보였고, 뒤이어 Botryococcus sp.(92%) 및 N. aquatica(91%)의 유사도를 나타냈다. 본 발명의 녹조류의 일부가 B. sudetica KNUA107과 유사한 군체 형성 능력과 형태학적 특성과 유사한 것으로 보인다(Komarek, 1989; Senousy et al., 2004; Pribyl and Cepak, 2007; Tanoi et al., 2011).
본 발명의 미세조류로 추정되는 B. sudetica는 이전에 Botryococcus sudeticus로 명명된 후 최근에 새로운 분류군으로 확립되었다. Botryosphaerella sp.의 세포 형태는 Botryococcus sp.의 세포 형태와 다르며, Neochloris sp.의 형태와 보다 유사하다. Botryosphaerella sp.와 Neochloris sp.의 구별은 형성된 콜로니는 형태와 특성으로 구분할 수 있다.
따라서, 위 3가지 속은 군체 형태로 구별 할 수 있는데 본 발명의 미세조류의 형태(도 1a)는 Botryosphaerella sp. 및 Neochloris sp.의 녹조류와 유사한 것으로 추정된다. 본 발명의 미세조류의 콜로니 형태(도 1b)를 고려하였을 때는 Botryosphaerella sp.와 군체의 형태 및 특성이 일치하였다.
B. sudetica KNUA107의 성장은 건조중량으로 추정되었다(Yoo et al., 2010). 샘플(3 mL)을 3일 간격으로 배양 플라스크에서 수집하고, 미리 칭량된 유리 섬유 필터로 여과하고 증류수로 세척하였다. 여과된 조류 세포 펠렛을 105℃의 건조 오븐에서 1일 동안 건조시킨 후 무게를 재었다(Yoo et al., 2010).
엽록소 함량 분석은 OD680에서 100 mL 배양에서 조류 세포를 수확하여 수행되었다. 배양된 세포를 원심 분리하여 수확하고 펠렛을 90% 메탄올에 재현탁시켰다. 모든 실험은 독립적으로 3회 이상 실시하였다. 총 색소 함량 측정하기 위해 샘플을 초음파 처리하고 색소를 메탄올로 추출하였으며, 추출물의 OD666, OD653 및 OD470 값은 분광광도계로 측정되었다. 색소의 함량은 Lichtentaler와 Wellburn의 공식에 따라 측정된 OD값으로부터 계산되었다(Lichtenthaler and Wellburn, 1985). 색소와 엽록소 함량은 약 1개월 성장 후 12일과 30일에 측정하였다. 엽록소는 추출 가능한 색소이며, 카로티노이드 색소도 측정 가능한 것에 해당한다. 측정시 이전 연구의 방법(Schuurmans et al., 2015; Tubuxin et al., 2015; Sivakaminathan et al., 2018)을 사용하였다.
선택된 균주는 다양한 환경 조건에서 대조군 보다 잘 자랐다. 엽록소를 분석한 결과에서도 선별된 균주는 대조군 균주보다 모든 색소 및 엽록소의 양이 많은 것으로 나타났다(Kim et al., 2018, 2020). 성장 6일 후, 포도당을 보충한 배지에서 엽록소와 색소 함량이 다른 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. B. sudetica KNUA107은 포도당을 보충했을 때(도 1c, 파랑색 선) 빠른 성장 회복률을 나타냈으며, 다른 혼합영양 배지에서 성장했을 때 보다 더 높은 생존율을 보였다. 포도당 보충 배지에서 배양 12일 및 30일 후, 엽록소(도 1d, e)와 총 색소 함량(도 1f)이 다른 혼합영양 배지에서 보다 약 2배 높은 것으로 나타났다.
1-2. 계통
무균 분리된 B. sudetica KNUA107 균주의 분자식별을 위해 150 mL의 BG 11 배지에서 2주 동안 배양한 세포를 4000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 수집하고, 멸균 증류수로 2회 세척하였다. 수집된 조류 세포 2 mL를 microfuge tube에 넣고, 400 μL DNA 추출 버퍼(100 mM Tris HCl, 1 M KCl 및 10 mM EDTA)에 재현탁하였다. 8 μL RNAse A(50 mg/mL)와 멸균된 glass bead를 첨가한 후 현탁된 샘플을 5분 동안 볼텍싱하고 65℃에서 30분 동안 가열하였다. 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 400μL의 상층액을 새 튜브로 옮겼다. DNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 정제 키트(Wizard DNA Clean-Up System, Promega, Madison, WI, United States)로 정제되었다. 내부 전사 스페이서(Internal transcribed spacer, ITS), 리불로스 비스 포스페이트 카르복실라제 대형 서브 유닛(Ribulose bisphosphate carboxylase large subunit, rbcL) 및 연장 인자 Tu(Tufa)를 마커 유전자로 사용하였다. ITS 영역은 하나의 프라이머 세트로 증폭되었고, rbcL 영역은 두 개의 프라이머 세트로 증폭되었으며, tufA 영역은 하나의 프라이머 세트로 증폭되었다. 본 발명에서 사용된 프라이머는 표 3에 나타내었다. 이후, 증폭된 DNA 단편은 제조사의 프로토콜에 따라 PCR Purification kit(Spin type-200, Elpis-Biotech, Daejeon, South Korea)로 정제하였다.
DNA 시퀀싱을 위해 DNA 단편을 pGEM®-T Easy Vector 키트(Promega, Madison, WI, United States)로 정제하였다. DNA 염기 서열 분석은 제노텍 시설(대전, 제노텍)에서 수행되었다. 서열 정보는 NCBI를 참고하였다. 울릉도에서 수집한 B. sudetica KNUA107은 GenBank 수탁번호 MW683220을 받았다. 선택된 서열은 조류 균주간의 계통 발생 관계를 분석하기 위해 MEGA(버전 7.0) 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석되었다(Kumar et al., 2016). Bayesian 정보 기준에 따라 각 마커 유전자의 최적 뉴클레오티드 치환 모델이 분석을 위해 사용되었다. 최대 가능성(Maximum likelihood, ML) 계통 발생 트리는 1,000 개의 부트스트랩(Bootstrap) 복제로 구축되었다(Felsenstein, 1985).
보다 명확한 분류학적 계통 분석을 위해 ML trees를 사용하였다. 본 발명의 계통과 B. sudetica KNUA107 및 여러 녹조류 종의 ITS, rbcL 및 tufa 시퀀스를 기반으로 분석하여 나타낸 것이 도 2에 해당한다. 본 발명의 미세조류는 Botryococcus, Botryosphaerella 또는 Neochloris sp. 군과 유사한 것으로 나타났으며, 본 발명의 미세조류는 서열 유사성이 높은 세 균주와 가장 가까운 계통 발생 관계를 가지고 있음을 확인하였다. B. sudetica는 본 발명의 미세조류와 99%에 달하는 가장 높은 부트스트랩(Bootstrap)을 보였고, Botryococcus sp.는 91%, N. aquatica는 92%로 각각 나타났다. 본 발명의 미세조류는 B. sudetica와 가장 가까운 계통 발생 관계를 가짐을 알 수 있다. 따라서, 상기의 실험 및 분석 결과에 따라 본 발명의 신규한 미세조류 KNUA107는 Botryococcus sudetica으로 동정하였다.
| gene | primer | sequence(5′-3′) |
| ITS | ITS5 F | GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG |
| ITS5 R | TCCTCCGCTTATTGATATGC | |
| rbcL | rbcL-M379-F | GGTTTCAAAGCTYTWCGTGC |
| rbcLFP-R | GTAAATACCACGGCTACGRTCTT | |
| GrbcL-F | GCTGGWGTAAAAGATTAYCG | |
| GrbcL-R | TCACGCCAACGCATRAASGG | |
| tufA | tufA-F | GGNGCNGCNCAAATGGAYGG |
| tufA-R | CCTTCNCGAATMGCRAAWCGC |
<실시예 2> 조류의 성장과 바이오매스 생산
30일된 Botryococcus sudetica KNUA107 배양물은 광독립영양 및 혼합영양 배양을 위해 준비되었다. 상기 조류 세포는 25℃의 광도의 배양기에서 160 rpm으로 회전 조건으로 배양되었다. 준비된 조류 세포는 약 156.67±20.81 mg/L로 희석되었다. BG-11 배지는 광독립영양 배양에 사용되었으며, 혼합영양 배양을 위해 40 mM의 유기 탄소원(수크로스, 포도당, 과당, 갈락토스 및 리보스)을 BG-11 배지에 첨가하였다. 각 배지는 멸균한 후 150 mL를 250 mL 플라스크에 옮기고 제조된 조류 세포 15 mL를 접종하였다. 플라스크는 약 55 μmol m-2s-1 명기와 암기를 16:8시간의 주기로 조명된 인큐베이션 룸에서 orbital shaker의 160 rpm 조건하 25℃에서 배양되었다.
건조중량을 측정하여 배양된 B. sudetica KNUA107의 성장과 바이오매스 생산량을 측정하였다(도 3). 광독립영양조건에서 배양된 조류는 성장 기간이 가장 길었으며, 정지기에 도달하는데 30일 이상이 걸렸다. 최대 바이오매스 생산성은 1.94±0.75 g/L였다(도 3a). 이러한 결과는 광독립영양조건에서 B. sudetica KNUA107이 바이오매스 생산을 달성하기 위해 다른 녹조류 종보다 더 긴 배양 시간을 필요로 한다는 것을 시사한다. 그러나 배양 30일 후 생산된 바이오매스의 총량은 같은 성장기 이후 다른 녹조류 종보다 더 많았다.
다음으로 5가지 유기 탄소원(40 mM의 수크로스, 포도당, 과당, 갈락토스, 리보스)을 이용한 혼합영양 배양이 B. sudetica KNUA107의 바이오매스 생산성을 증가시키는지 조사하기 위해 각 조건에서 성장 패턴과 바이오매스 생산성을 분석하였다(도 3b).
수크로스, 포도당, 과당, 갈락토스, 리보스와 같은 유기 탄소원을 사용하여 비교한 결과(Johnson and Alric, 2013; Sun et al., 2020), 포도당의 첨가가 배양 조류의 성장과 바이오매스 생산성을 증대시키는 것으로 나타났으며, 배양 9일째에 가장 많은 바이오매스를 생산하였다 (2.66±0.04 g/L). 테스트된 유기 탄소 공급원 중 세 가지인 과당, 갈락토오스 및 리보스를 각각 사용했을 때, 과당을 사용한 배지에서는 0.81±0.08 g/L, 갈락토스를 사용한 배지에서는 0.52±0.10 g/L, 리보스를 사용한 배지에서는 0.27±0.09 g/L의 생산성을 보였다. 이는 광독립영양 상태(1.94±0.75 g/L)에서 보다 낮은 생산량에 해당한다. 이와 달리, 수크로스가 함유된 배지에서는 광독립영양 상태와 유사한 정도의 성장과 생산량을 보였고, 수크로스가 첨가된 배지의 생산량은 1.96±0.08 g/L로 나타났다.
또한, 혼합영양 배양의 바이오매스 생산성에 미치는 영향은 조류의 성장 변화를 관찰하여 분석 가능하다. 또한, 조류 배양의 세포 밀도는 측정된 건조중량에 비례한다. 포도당이 첨가된 조류 배양의 경우 광학 밀도의 최대 측정 범위(2.000)를 초과하여 OD값의 측정으로 세포 밀도를 분석하기 어려웠으나, 광독립영양 조건(1.698±0.039) 및 기타 혼합영양 조건(수크로스; 1.625±0.016, 과당; 0.722±0.013, 갈락토스; 0.389±0.036, 리보스; 0.313±0.015)에서 성장한 조류 배양은 건조중량에 비례하는 OD680 값을 가지는 것을 확인하였다. 이를 통해 포도당 혼합영양 조건에서 B. sudetica KNUA107이 고밀도로 배양될 수 있을 것으로 예상할 수 있다. 또한, B. sudetica KNUA107 배양을 통해 생산된 바이오매스는 다른 녹조류 종보다 더 많이 생산되었지만 배양주기가 더 길었다.
따라서, 녹조류의 성장을 촉진하고 배양주기를 감소시키고 바이오매스 생산성을 향상시키기 위해 혼합영양 배양 조건으로 실험을 수행하였다. 혼합영양배양조건에서 포도당의 첨가는 성장과 바이오매스 생산성을 향상시키고 배양주기를 30일에서 9 내지 12일로 단축시킬 수 있었다. 바이오매스 생산성은 0.72 g/L로 보다 증가한 것으로 나타났다.
일반적으로 B. sudetica의 성장은 유기 탄소원의 첨가로 인해 혼합영양 조건에서 향상되는 것으로 알려져있다. 그러나, 본 발명의 B. sudetica KNUA107은 포도당만을 영양분으로 공급하였을 때, 성장이 촉진되었으며 일부 유기 탄소원은 오히려 B. sudetica KNUA107의 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 혼합영양 배양이 녹조류의 배양주기를 단축시키고, 바이오매스 생산성을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
<실시예 3> 정착성 분석 및 콜로니형성
정착 가능성과 관련된 표현형인 콜로니 크기는 0일부터 3일 간격으로 수집된 샘플에서 측정되었다. 콜로니 직경은 광학 현미경(Nikon Eclipse E100 Biological Microscope, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정되었다. 각 시험 조건에서 배양한 B. sudetica KNUA107의 침강도를 비교하기 위해 30일된 샘플을 원심분리하여 수집하였다. 샘플을 충분히 재현탁하고 각각 10 mL를 15 mL 원뿔형 튜브로 옮겼다. 21개의 원뿔형 튜브 세트를 사용하여 각 배양 조건에 대한 안정도를 측정하였다. 측정에 앞서 한 세트의 튜브를 동시에 뒤집고, 샘플에서 9 mL의 상층액을 분리하고 상등액(9 mL)과 침전물(9 mL)에 포함된 조류 세포의 건조 중량을 별도로 측정하여 튜브 1개를 분당 측정하였다. 측정은 배양 조건당 3세트로 1세트에 20분 동안 수행되었다.
광독립영양 및 혼합영양 조건에서 배양된 B. sudetica KNUA107의 콜로니 형성 능력과 침강성 분석 결과는 도 4에 나타내었다. 콜로니 형성 능력의 변화를 확인하기 위해 각 조건에서 형성된 조류 콜로니의 직경을 측정하였다(도 4a, b). 배양 배지에 추가된 탄소원은 평균 콜로니 크기에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 포도당을 탄소원으로 공급되는 경우 가장 큰 콜로니(137.25±36.57 μm)가 관찰되었으며, 리보스(61.84±22.93 μm)가 탄소원으로 공급되는 경우 가장 작은 콜로니가 관찰되었다. 다른 혼합영양 조건 및 광독립영양조건(BG-11)에서 얻은 콜로니 크기는 평균 80 내지 100 μm (95.12±24.62 μm)의 크기로 나타났으며, 수크로스를 탄소원으로 공급한 경우 98.23±16.67 μm, 과당을 탄소원으로 공급한 경우 89.42±16.30 μm, 갈락토스를 탄소원으로 공급한 경우 82.42±22.73 μm로 측정되었다.
콜로니 크기는 포도당을 영양원으로 사용한 경우, 9 내지 12일이면 평균 콜로니 크기로 성장하였으나 다른 탄소원의 경우 27 내지 30일이 소요되었다. 탄소원에 따른 콜로니 크기 증가 패턴은 정상적인 B. sudetica KNUA107 성장과 크게 다르지 않았다. 각 조건에서 형성된 콜로니의 침강성은 퇴적물 건조 중량을 사용하여 추정되었다(도 4c-j). 침전물 건조 중량은 배양 조건 모두에서 시간이 지남에 따라 증가하는 것으로 나타났다(도 4c, d). 포도당이 보충된 배지의 건조 중량은 측정 1분 후에 증가하는 것을 멈췄다. BG-11 배지에서 8분, 수크로스가 함유된 배지에서 6분, 과당이 함유된 배지에서 3분, 갈락토스가 함유된 배지에서는 3분, 리보스가 함유된 배지에서는 3분에 건조 중량이 더 이상 증가되지 않았다. 모든 혼합영양 조류배양은 광독립영양 배양보다 더 빠르게 건조 중량의 증대의 한계가 도래한 것으로 확인되었다. 포도당을 유기 탄소원으로 사용하면, B. sudetica KNUA107 건조 중량의 최대 증식이 단기간 내에 가능하였으며, 이는 광독립영양 조건 보다 약 8배 빠르게 성장이 이루어진 것으로 계산된다. 포도당이 보충된 배지는 가장 높은 생산성을 가지는 것으로 나타났고, 전체 바이오매스의 84.02 내지 95.47%에 달한다. 그러나 침전된(Settled) 바이오매스의 비율은 다른 배양 조건에서 80% 미만이었으며 BG-11배지에서는 64.37 내지 78.74%, 수크로스가 함유된 배지에서는 56.86 내지 70.47%, 과당이 함유된 배지에서는 43.75 내지 64.20%, 갈락토스가 함유된 배지에서는 51.35 내지 76.84%, 리보스 함유된 배지에서는 50.69 내지 65.47%인 것으로 나타났다(도 4e-j).
도 4a는 공급 유기탄소원별 조류의 세포크기를 측정한 사진이다. 광독립영양 조건에서 B. sudetica KNUA107 세포의 크기가 평균 6.26±1.34 μm이었지만 혼합영양 조건에서는 크기가 보다 작게 나타났다. 측정된 세포 크기는 수크로스를 첨가한 배지에서 5.32±1.56 μm, 포도당을 첨가한 배지에서 3.44±0.48 μm, 과당을 첨가한 배지에서 4.52±0.79 μm, 갈락토스를 첨가한 배지에서 3.94±0.15 μm, 리보스를 첨가한 배지에서 3.58±0.47 μm로 측정되었다. 포도당이 첨가된 배지에서 배양된 세포가 가장 작았지만 조류 자체로는 137.25±36.57 μm의 크기로 가장 큰 콜로니를 형성하였다.
콜로니 크기는 정착(Settle) 가능성에 영향을 미치는 주요 요인 중 하나이다. 본 발명의 미세조류의 정착성은 혼합영양 조건에 따라 차이가 있었으며, 포도당을 첨가한 경우 정착성이 증대되는 것으로 나타났다. 또한, 다른 조건에서의 성장 패턴은 콜로니 크기의 변화를 야기하였다. 이러한 결과는 B. sudetica KNUA107의 성장 및 콜로니 형성 능력이 포도당 보충에 의해 유사하게 향상되었음을 보여주었다.
침강율과 침강된 바이오매스의 비율은 침강성을 평가하기 위한 기준으로 사용되었다. 가장 빠른 침강 속도와 침전된 바이오매스의 가장 높은 비율은 포도당과 혼합영양 조건에서 측정되었다. 다른 배양 조건에서도 이와 유사한 경향으로 성장하였다. 침강 속도와 침강된 바이오매스의 비율을 바탕으로 혼합영양 조건에 의해 유도된 콜로니 크기의 변화가 침강성 변화와 관련이 있음을 확인하였다. 따라서 이러한 결과는 포도당이 보충된 혼합영양 상태가 B. sudetica KNUA107의 콜로니 형성 능력과 침강성을 향상시킨다는 점을 시사한다. 이러한 결과는 B. sudetica KNUA107 균주에서 혼합영양 조건으로 배양하는 경우 생물자원 수확 효율을 높아진다 는 것을 의미한다.
<실시예 4> 바이오매스 수집 및 지질 함량 분석
4-1. 바이오매스 수집 및 지질 추출
지질 함량 분석을 위해 4,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 배양 기간의 대수성장기(12일)과 배양 후 30일에 조류 바이오매스를 수집하였다. 수집된 세포는 동결건조시켰다. 설포포스포바닐린 비색법(Sulfo-phosphovanillin colorimetric method)은 총 지질 함량을 결정하는 데 사용되었다. 카놀라 오일(Canola oil)을 사용하여 방정식과 표준 곡선을 생성하였다. 미세하게 분쇄된 동결건조 샘플(10 mg)을 새로운 튜브에 넣고 1 mL의 증류수에 재현탁하였다. 재현탁된 샘플의 다른 부피(10, 20, 30, 40 및 50 μL)를 유리관에 첨가한 다음 증류수로 최대 100 μL까지 채웠다. 각 유리관에 황산(2 mL)을 첨가하고 혼합물을 수조에서 100℃에서 5분 동안 가열하였다. 가열 후 샘플을 얼음에서 5분 동안 냉각시키고, 각 튜브에 5 mL의 포스포바닐린 시약을 첨가하였다. 혼합물을 37℃의 인큐베이터에서 15분 동안 200 rpm의 조건으로 배양하였다. 530 nm에서의 광학 밀도(OD530)는 충분한 반응이 있는 혼합물에서 측정되었으며, 총 지질 함량은 측정된 값을 기반으로 계산되었다. 지질을 추출하고 가스크로마토그래피/질량 분광법(GC/MS)으로 분석하여 조성과 함량을 결정하였다. 동결건조된 시료(30 mg)를 분쇄하고 시료의 지질을 클로로포름:메탄올(1:1)을 사용하여 추출한 후, 회전 증발기를 사용하여 추출된 혼합물에서 클로로포름을 제거하였다. 지질 에스테르 교환을 촉진하기 위해 추출된 혼합물을 메탄올 및 수산화칼륨 시약으로 처리하였다. 지방산 메틸 에스테르(FAME)의 분리를 위해 헥산을 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃의 수조에서 3시간 동안 가열하였다. FAME 함량을 계산하기위한 외부 표준(external standard)으로 GLC-90(SUPEL Co, Bellefonte, PA, United States)을 사용하여 헥산층을 분석하였다. 내부 표준(internal standard)은 헬륨을 운반체로 사용했으며, 지방산 조성은 표준물질 대신 W11N17MAIN 화학 라이브러리 데이터베이스를 사용하여 분석되었다. 5973N 질량 선택 검출기(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) 및 HP-5MS 모세관 컬럼(30m×0.25 mm ID×0.25 μm 필름)이 장착된 6890N 가스크로마토그래피(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) 및 HP-5MS capillary column(30 m×0.25 mm ID×0.25 μm film thickness; Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)를 사용하여 FAME에 포함된 지질을 분석하였다.
4-2. 지질 생산성
혼합영양 배지를 이용하여 생산된 바이오매스의 지질 생산성과 품질을 분석하였다(도 5). 30일에 수확된 바이오매스는 총 지질함량이 12 내지 18%로 나타났으며(도 5a), 광독립영양 조건에서 12.83±0.96%로 가장 낮았다. 혼합영양 조건하의 바이오매스는 수크로스가 함유된 배지에서 14.13±0.67%, 포도당이 함유된 배지에서 17.39±1.17%, 과당이 함유된 배지에서 14.34±1.13%, 갈락토스가 함유된 배지에서 13.66±1.15%, 리보스가 함유된 배지에서 13.74±2.16%로 광독립영양 조건보다 총 지질 함량이 전반적으로 높은 함유량을 가지는 것으로 나타나긴 하였으나 그 차이가 미미한 것으로 나타났다. 그러나 포도당이 함유된 배지에서는 광독립영양 조건보다 현저히 높은 지질 생산의 증대를 나타냈다.
지질 수율은 총 지질 함량의 결과를 기반으로 계산되었다. 지질 수율은 과당 첨가시 0.10±0.02 g/L, 갈락토스 첨가시 0.06±0.02 g/L 및 리보스 첨가시 0.03±0.01 g/L로 광독립영양 조건(0.25±0.05 g/L)보다 오히려 낮은 수율을 갖는 것으로 나타났다. 포도당 첨가 배지에서만 유일하게 지질 생산량을 증대시키는 것으로 나타났으며, 평균 0.35±0.01 g/L의 수율을 보였다. B. sudetica KNUA107은 포도당 혼합영양 조건에서 최대 성장이 나타나는 시점인 12일 이후 바이오매스의 총 지질 함유량 및 지질 생산성을 측정하였다(도 5b, c). 광독립영양 조건에서 배양 후 12일째의 바이오매스의 지질함량은 12.76±1.04%로 배양 후 30일째의 바이오매스의 지질함량은 12.83±0.96%로 총 지질 함량의 유의한 차이가 없었다. 이와 대조적으로 총 지질 함량은 혼합영양 조건에서 12일째 바이오매스 지질함량(수크로스 14.13±0.67%, 포도당 17.39±1.17%)이 30일째 바이오매스 지질함량(수크로스 12.27±1.13%, 포도당 14.86±0.81%)보다 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 최대 생산성을 보이는 12일 이후로는 지질함량이 감소한다는 것을 의미한다.
지질 생산성은 수크로스 첨가 조건의 경우 12일째 0.06±0.01 g/L, 30일째 0.25±0.05 g/L로 나타났으며, 광독립영양조건에서는 12일째 0.09±0.02 g/L 및 30일째 0.25±0.01 g/L로 나타났다. 즉, 수크로스 첨가 조건 및 광독립영양 조건에서는 12일차보다 30일차에서 더 높았다. 포도당 첨가 조건에서는 지질함량이 12일째 0.39±0.01 g/L, 30일째에 0.35±0.01 g/L로 유사하였다. 총 지질 함량과 지질 생산성은 배양 기간에 관계없이 포도당을 첨가한 혼합영양 조건에서 가장 높았다. 또한, 바이오매스 생산성도 포도당을 첨가한 배지에서 가장 높았다.
4-3. 지질의 구성
지질 생산성이 향상된 바이오매스에서 추출된 FAME의 지방산 함량 구성을 분석하였다(도 5d, e 및 표 2). 광독립영양 조건하에서 바이오매스에서 추출된 FAME은 주로 C16:0(12일 15.64±0.68%, 30일 24.54±0.06%), C16:3(12일, 20.57±0.32%, 30일, 16.42±0.04%) 및 C18:3(12일, 38.38±1.34% 및 30일, 38.23±0.89%)로 구성되어있었다. 또한, 배양이 진행됨에 따라 C16:0이 증가하고 C16:3이 감소하였다. 수크로스를 첨가한 혼합영양 조건에서 얻은 바이오매스의 FAME은 주로 C16:0(12일 14.11±0.08%, 30일 18.98±0.38%), C16:3(12일 23.90±0.68%, 30일, 15.82±0.17%), C18:1 (12일, 8.12±0.11%, 30일, 17.91±0.34%), C18:3(12일, 36.01±0.01%, 30일, 28.92±0.68%)로 구성되었고 지방산의 비율은 광독립영양 조건과 유사하였다. 그러나 배양이 진행됨에 따라 수크로스를 첨가한 배지에서는 지방산 C18:1은 증가하고, C18:3은 감소하였다.
BG-11 배지에 포도당을 첨가하여 혼합영양 조건으로 배양하는 경우 생산된 바이오매스는 뚜렷한 특성을 가진 지방산을 함유하는 것으로 나타났다. 주로 C16:0(12일, 24.71±0.40%, 30일, 27.66±0.74%), C18:1(12일, 26.55±0.61%, 30일, 35.42±0.51%), 및 C18:3(12일, 18.72±0.97%, 30일, 11.47±0.33%)으로 구성되는 것을 나타났으며, 분석된 모든 샘플은 지방산 C16:0 및 C18:1의 비율이 가장 높았다. 다른 조건에서는 지방산 C18:3은 25 내지 40%로 구성되었으나 포도당 첨가 배지의 경우 20% 미만으로 구성되는 것으로 나타났다.
분석된 지방산은 포화지방산(SFA; C16:0, C17:0, C18:0, C20:0, C22:0), 단일 불포화 지방산(MUFA; C16:1 및 C18:1), 및 다중 불포화 지방산(PUFA; C16:2, C16:3. C18:2 및 C18:3)으로 분류하여 FAME의 지방산 구성에 대해 분석하였다(도 5c 및 표 2). 광독립영양배양에서 12일부터 30일 사이에 PUFA(12일, 69.35±2.11%, 30일, 66.85±1.13%)의 변화가 거의 없었던 반면, MUFA(12일, 13.24±0.13%, 30일, 6.43±0.20%)는 감소한 것으로 나타났으며, SFA(12일, 17.42±1.05%, 30일, 26.72±0.07%)는 증가한 것으로 나타났다. 혼합영양배양에서 PUFA는 수크로스 첨가 배지에서 증가하였으며(12일, 69.73±0.81%, 30일, 55.91±1.32%), 반대로 포도당 첨가 배지에서는 감소하는 것으로 나타났다(12일, 39.67±1.25%, 30일, 24.63±1.37%). MUFA는 수크로스 첨가 배지에서 증가하였으며(12일, 15.24±0.41%, 30일, 23.01±1.34%), 포도당 첨가 배지에서는 감소하는 것으로 나타났다(12일, 34.15±0.79%, 30일, 44.18±0.98%). SFA는 수크로스 첨가 배지에서(12일, 15.03±0.11%, 30일, 21.08±0.39%) 증가하였으며, 포도당 첨가 배지에서도 증가하는 것으로 나타났다(12일, 26.18±0.48%, 30일, 31.19±0.98%).
그러나 수크로스 첨가 배지에서의 PUFA 함량은 50% 이상으로 광독립영양 조건하의 함량과 거의 유사하였고, 포도당 조건 하에서 얻은 함량과는 차이가 있다. 가장 낮은 PUFA와 가장 높은 MUFA 및 SFA 함량은 포도당이 첨가된 혼합영양 조건에서 관찰되었다. 포도당은 또한 PUFA 함량보다 MUFA 및 SFA 함량을 높인 유일한 탄소원으로 확인되었다. 지질은 녹조류를 생물자원으로 사용하여 얻을 수 있는 유용한 물질이다. 조류 바이오매스의 지질 함량을 높이기 위해 녹색 조류에 생물적 및 비생물적 스트레스를 주는 방법이 모색되었다. 예를 들어, 질소 공급 및 공급원 유형(예: 질산염)의 제어는 중량 단위에 대한 지질 비율을 증가시켰다. 그럼에도 불구하고 증가된 지질 함량은 바이오매스 생산성에 긍정적인 영향을 미치지 않았다. 그러나 유기 탄소 공급원을 제공하는 혼합영양 조건을 적용함으로써 생물학적 및 비생물적 스트레스 하에서 지질 생산성을 더욱 높일 수 있었다. 미세조류 바이오매스와 지질 생산은 혼합영양 배양 하에서 향상될 수 있다. 포도당이 첨가된 혼합영양 조건 하에서 B. sudetica KNUA107을 배양하여 지질 함량과 지질 생산성을 향상시켰다. 또한, 혼합영양 조건에서 증가된 지방산의 대부분이 포화 지방산에 해당됨을 확인하였다. B. sudetica KNUA107 배양에서 Mixotrophic 조건을 적용하면 지질 생산성을 향상시킬 수 있음을 시사한다. 또한, 포도당을 유기 탄소원으로 제공함으로써 MUFA 및 SFA 함량이 강화된 고품질 지방산을 생산할 수 있다.
이러한 결과는 B. sudetica KNUA107 (수탁번호 KCTC 146545BP)를 포도당이 첨가된 BG-11 배지에서 혼합영양배양 조건 하에 배양하는 경우, 조류의 배양주기를 단축시키고 바이오매스 생산성을 증가시키는 효과가 있으며, 조류의 콜로니 형성 능력과 침강성을 증가시켜 바이오매스 수확 효율을 현저히 향상시키는 효과가 있다는 것을 의미한다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (8)
- 포도당을 포함하는 BG-11 배지를 제조하는 1단계; 및
상기 1단계의 배지를 사용해 혼합영양배양 조건하에 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)를 배양하는 2단계;를 포함하는, 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카의 생산성을 증대를 위한 배양방법.
- 제1항에 있어서,
상기 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)는 보트리오스페렐라 수테티카 KNUA107(Botryosphaerella sudetica KNUA107, 수탁번호 KCTC 14645BP)인 것을 특징으로 하는, 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카의 생산성 증대를 위한 배양방법.
- 제1항에 있어서,
상기 배양방법은 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)의 콜로니 형성 능력 및 침강력을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카의 생산성 증대를 위한 배양방법.
- 제1항에 있어서,
상기 2단계는 온도 20 내지 30℃, 회전속도는 100 내지 200 rpm의 배양조건으로 배양하는 것을 특징으로 하는, 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카의 생산성 증대를 위한 배양방법.
- 제1항에 있어서,
상기 2단계는 명기:암기를 16:8의 주기 조건으로 배양하는 것을 특징으로 하는, 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카의 생산성 증대를 위한 배양방법.
- 제1항에 있어서,
상기 배양방법은 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)의 배양주기를 단축시키고 바이오매스 생산성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카의 생산성 증대를 위한 배양방법.
- 제1항에 있어서,
상기 배양방법은 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)에 의해 생산된 바이오매스의 지질 생산성을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카의 생산성 증대를 위한 배양방법.
- 제1항에 있어서,
상기 배양방법은 보트리오스페렐라 수테티카(Botryosphaerella sudetica)에 의해 생산된 바이오매스의 다중불포화지방산은 감소시키고, 단일불포화지방산 및 포화지방산의 비율은 증가시키는 것을 특징으로 하는, 녹조류 보트리오스페렐라 수테티카의 생산성 증대를 위한 배양방법.
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|---|---|---|---|---|
| KR102273538B1 (ko) | 2020-03-20 | 2021-07-06 | 성균관대학교산학협력단 | 바이오매스를 활용한 금속 나노입자 소재의 제조 방법 |
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2021
- 2021-09-28 KR KR1020210127806A patent/KR20230045218A/ko not_active Application Discontinuation
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