JP6240051B2 - オイル含有率を向上させた微細藻類の培養方法、藻類バイオマスの製造方法、及び新規微細藻類 - Google Patents
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Description
[1] 有用物質生産性である微細藻類の液面浮遊培養方法であって、
培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程;及び
培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程
を含み、成分の濃度を変化させることにより微細藻類の産生する有用物質を増加させるものである、微細藻類の培養方法。
[2] 培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、培養器内に、培地とは異なる組成の液体を添加することによる、[1]に記載の培養方法。
[3] 培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、培養器内の培地の一部又は全部を除去し、培地とは異なる組成を有する液体を添加することによる、[1]に記載の培養方法。
[4] 培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、窒素又はリンを含む成分の濃度を低減させることによる、[1]〜[3]のいずれか一に記載の培養方法。
[5] 培地の除去又は添加が、液面上のバイオフィルムと培養器底面との間において、培地を除去するか、又は異なる組成を有する液体を添加するものである、[2]〜[4]のいずれか一に記載の培養方法。
[6] 培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程において、液面上に形成されたバイオフィルムを除去しない、[1]〜[5]のいずれか一に記載の培養方法。
[7] 有用物質生産性である微細藻類の液面浮遊培養方法であって、
培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程;
培養器内に液体を添加する工程;及び
液体を添加して水深が増した培養器から、バイオフィルムを回収する工程
を含む、微細藻類の培養方法。
[8] バイオフィルムと培養器内壁との付着部位を剥がす処理を行うことを含む、[1]〜[7]のいずれか一に記載の培養方法。
[9] 液面上で微細藻類の培養が可能な液面浮遊培養法において、糖を含有する培地を用いて培養することを特徴とする、微細藻類の培養方法
[10] 培地が、微細藻類が資化可能な糖を含み、このとき微細藻類が資化可能な糖が、五炭糖又は六炭糖である単糖、二糖、三糖及び多糖からなる群より選択されるいずれかである、[1]〜[9]のいずれか一に記載の培養方法。
[11] 培地中の糖の濃度が1mg/mL以上である、[9]又は[10]に記載の培養方法。
[12] グルコースを含有する培地を用いる、[9]〜[11]のいずれか一に記載の培養方法。
[13] 微細藻類が緑藻である、[1]〜[12]のいずれか一に記載の培養方法。
[14] 微細藻類が、Botryococcus sp.、Chlamydomonas sp.、Chlorococcum sp、Chlamydomonad sp.、Tetracystis sp.、Characium sp.又はProtosiphon sp.に属するものである、[1]〜[13]のいずれか1項に記載の培養方法。
[15] 微細藻類が、Botryococcus sudeticus、又はChlorococcum sp. FERM BP−22262と同じ種に属するものである、[1]〜[14]のいずれか1項に記載の培養方法。
[16] 微細藻類が、Botryococcus sudeticus FERM BP−11420、もしくはそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類株、又はChlorococcum sp. FERM BP−22262、もしくはそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類株である、[1]〜[15]のいずれか一に記載の培養方法。
[17] [1]〜[16]のいずれか一の培養方法を含む培養工程;及び
形成されたバイオフィルムを回収する工程
を含む、藻類バイオマスを製造する方法。
[18] 藻類バイオマスが、オイルである、[17]に記載の製造方法。
[19] 液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類であって、培養器内の培地中で培養した際に、下記(1)〜(8)からなる群より選択される少なくとも一つの特徴を有する、微細藻類:
(1)液面上及び液面下1cmから液面までの領域に存在する微細藻類の藻体量と培養器の底面上の微細藻類の藻体量との合計が、培養器内のそれ以外の領域に存在する藻体量の10倍以上である;
(2)液面上の微細藻類の比重が、培養器の底面上の微細藻類の比重より小さい;
(3)液面上の微細藻類の比重が、水の比重より大きい;
(4)液面上の微細藻類のオイル含有量が、底面上の微細藻類のオイル含有量より高い;
(5)液面上の微細藻類のサイズが、底面上の微細藻類のサイズより大きい;
(6)形成されるバイオフィルムが、フィルム状の外側の層と複数の泡沫状の構造物を有する内側の層とを含み、外側の層が内側の層より厚い;
(7)形成されるバイオフィルムの一部が培地中でひだ状の構造をとる;
(8)形成されたバイオフィルムを回収し、懸濁処理することにより得られた微細藻類を培地の液面上に播種した場合、培地中に沈降しうる。
[20] 微細藻類が、[13]〜[16]のいずれか一に定義した微細藻類である、[19]に記載の微細藻類。
[21] 液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類の培養方法であって、用いる微細藻類が[19]又は[20]に記載の微細藻類である、培養方法。
[22] 微細藻類が、[19]に記載した微細藻類である、[1]〜[16]のいずれか一に記載の培養方法、又は[17]もしくは[18]に記載の製造方法。
[23] 18S rRNAの遺伝子領域をコードする塩基配列のうち、一部の領域の、Chlorococcum sp. RK261に相当する塩基配列との同一性が95.00%以上99.99%以下であるか、又はChlorococcum sp.に属する微生物であって、その18S rRNA遺伝子が、配列番号2の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも99.94%の配列同一性を有する、微細藻類。
[24] Chlorococcum sp.FFG039株(受託番号FERM BP−22262)、又はそれと分類学的に同一の性質を有する微細藻類。
また、糖を含む培地を液面浮遊培養に用いることで、高い増殖速度が得られるとともに、高いオイル含有量を得ることができる。
本発明の基本的な培養方法を図1に示した。なお、本模式図は、本発明を説明するためのものであることから、簡略化して表記されている部分がある。
この(c)の状態で、例えば、微細藻類の有用物質含有量(例えばオイルなど)を向上させるために、少なくとも一部の培地を置換しても良い。例えば、窒素化合物もしくはリン化合物の少なくとも一方の濃度が、置換前の培養開始時に使用していた濃度と異なる濃度もしくは組成の培地と置換することができる。例えば、より低濃度の培地と置換することができる。本発明では、この様な方法を培地置換と呼ぶ。培地置換は、図1の(c)から(e)に示した工程である。なお、本発明の方法は、糖や窒素等の培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程を含むが、この工程は人為的に行われる。すなわち、一般に、微細藻類の培養においては、微細藻類が栄養成分を代謝することによっても培地成分の濃度が変化するが、本発明でいう培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程は、そのような代謝による変化を指す趣旨ではない。
培地置換は、液面と底面との間の領域から行うことが好ましい。これは、培地置換操作によって、液面上の微細藻類バイオフィルムの構造が大きく破壊されることを防ぐため、微細藻類バイオフィルムの多くが除去されることを防ぐためである。この様な目的を達成するためには、培養器の側面などに培地置換のための配管を設置することや、移動式の配管を設置することなどによって行うことができる。また、液面上に形成された微細藻類バイオフィルムの構造体の一部を破壊し、そこから培地吸引のための吸入口を差し込み、液面と底面との間の領域から培地を汲み上げることもできる。これにより、ごく一部のバイオフィルム構造が破壊されるが、大部分は破壊されないので好ましい。なお、液面と底面との間の領域から培地の除去を行うとは、液面上と底面上の微細藻類バイオフィルムとの間の微細藻類がほとんど存在しない領域に対して培地置換を行うものである。この領域では、遊走子などを除けば、少なくとも目視では、微細藻類はほとんどいないように見えるからである。また、液面上と底面上の微細藻類バイオフィルムとが接触している場合には、液面上と底面上との微細藻類バイオフィルムの間に配管などを挿入しての培地の添加は不可能であるため、液面上の微細藻類バイオフィルムよりも上方に位置した注入口からに培地を供給することが望ましい。
液面上の微細藻類と培養器の壁面とが接触している部位では、微細藻類バイオフィルムが壁面に付着していることが多い。この場合、培地置換による液面の変動と共に微細藻類バイオフィルムが予定外の部位に付着したり、微細藻類バイオフィルムの構造が破壊されたりする問題があった。この問題を解決するために、液面上の微細藻類バイオフィルムと培養器壁面との付着部位を金属へらのようなもので剥がす操作を行うことができる。これにより、微細藻類バイオフィルムは、液面の変動にあわせて、その形態を保ったまま移動できるようになる。なお、培養の進行に伴って培地の液量が蒸発などにより徐々に減少する場合がある。その場合には、失われた液量に相当する液量を添加してから、バイオフィルムと壁面との付着部位を剥がすこともできる。剥がす方法は、目的を達成できるものであれば特に限定しない。金属製のへらのようなものや棒、フィルムなどを用いることができる。また、道具を使わなくとも、液面の波や超音波などで剥がすこともできる。
液面上のバイオフィルムを回収した後の状態が、図1の(j)である。ここで、培養器の底面には、微細藻類が残存している。この微細藻類を使用して、何度でも繰り返して培養することができる。この時にも培地置換しても良いが、窒素化合物やリン化合物を多く含む培地に交換した方が良い。
本発明の実施態様の一例によれば、純菌化工程を経て得られた微細藻類を、人工培地を含む液体培地中に分散させることにより、微細藻類を含む懸濁液または分散液を調製し、培養器中で培養を行うことにより、液体培地の液面上で微細藻類バイオフィルムを形成させ、培地置換を行った後、継続して培養を行うものである。
本発明では、すでに述べたように、硝酸化合物のような窒素化合物を含まないか、または低減させた培地(この様な培地を「N−」と表すことがある。)を用いることができる。微細藻類培養のための窒素化合物を含まない培地は、例えば、図6に示したCSiFF04(N−)、IMK(N−)培地等が例示できる。なお、培地組成は窒素化合物が含まれていない限り、これらに限定されるものでない。
窒素化合物を含まないとは、培養を開始する時点(初濃度)において、硝酸体(より具体的には硝酸カリウムなど)に代表される窒素化合物を含まないこと(検出されないか、又は硝酸体窒素量として40μg/mL未満であること)をいう。窒素化合物を低減させた培地とは、培養開始時に使用される培地における窒素化合物濃度の3/4以下、好ましくは2/3以下、より好ましくは1/2以下である窒素化合物濃度の培地をいう。このような培地は、標準的な組成の培地を、水または適切な緩衝液で希釈することや、培地調製時に窒素化合物やリン化合物を含まないようにすることで調製することができる。
同様に、本発明においては、リン化合物を含まないか、または低減させた培地を利用できる場合がある。
本発明の実施態様の一例によれば、純菌化工程を経て得られた微細藻類を、微細藻類が資化可能な糖を含む液体培地中(人工培地を含む)に分散させることにより、微細藻類を含む懸濁液もしくは分散液を調製し、培養器中で培養を行うことにより、微細藻類バイオフィルムを液体培地の液面上で形成させるものである。
糖を含む培地を用いることで、光と二酸化炭素を用いた場合と比べて、好適に増殖速度を向上させることが可能な場合がある。また、オイル含有量も高くなる傾向がある。
本発明で用いることのできる微細藻類が資化可能な糖とは、単糖、二糖、三糖もしくは多糖の少なくとも一つを含むものである。単糖としては、公知のいかなるものも用いることができるが、ガラクトース、マンノース、タロース、リボース、キシロース、アラビノース、エリトロース、トレオース、グリセルアルデヒド、フルクトース、キシルロース、エリトルロースなどを用いることができる。二糖としては、公知のいかなるものも使用することができるが、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、マルトース、イソマルトースなどを用いることができる。また、三炭糖、四炭糖、五炭糖、六炭糖、七炭糖のいずれも用いることができる。多糖としては、デンプン、アミロース、グリコヘゲン、セルロースなどを用いることができ、その他、オリゴ糖として、ガラクトオリゴ糖やデオキシリボース、グルクロン酸、グルコサミン、グリセリン、キシリトールなどを用いることができる。
培地中の糖の濃度としては、0.1μg/mL以上が好ましく、0.1mg/mL以上がさらに好ましく、1mg/mL以上が最も好ましい。0.1μg/mL以上であると、微細藻類の増殖速度を好適に向上させることができることから好ましい。また、上限は特に設けないが、好ましくは、溶解度以下、より好ましくは、溶解度の半分以下、さらに好ましくは、溶解度の1/10濃度である。より具体的には、糖としてグルコースを用いる場合、30mg/mL以下とすることができ、10mg/mL以下であることが好ましく、5mg/mL以下であることがより好ましい。なお、糖の濃度とは、培養を開始する直前の濃度(初濃度)のことであり、培養中の糖の濃度は、継続的に変化することが多い。
糖としては、単一種の糖を用いても良いし、二種以上の糖を用いても良い。
糖を用いた場合には、光と二酸化炭素を用いた場合と比較して、微細藻類以外のバクテリアの増殖速度も向上するために、閉鎖型培養器を用いる方が好ましい。すなわち、開放型培養器を用いた場合、外気中のバクテリアが混入し、培地中の糖を消費してしまう。
また、光と糖、光と二酸化炭素と糖、二酸化炭素と糖との組み合わせで培養を行っても良い。
本発明の微細藻類とは、人の肉眼では、個々の存在が識別できないような微小な藻類を指す。微細藻類としては、液面上においてバイオフィルム形成能を有するものであれば特に制限はなく、原核生物、真核生物のいずれであってもよい。
上記微細藻類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、クロララクニオン植物門などがあげられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、上記微細藻類としては、緑色植物門が好ましく、緑藻であることがより好ましい。バイオマスを産生する点で、ヘマトコッカス(Haematococcus sp.)属、クラミドモナス(Chlamydomonas sp.)属、クロロコッカム(Chlorococcum sp.)属、ボツリオコッカス(Botryococcus sp.)属がより好ましい。
上記微細藻類を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自然界より採取する方法、市販品を用いる方法、保存機関や寄託機関から入手する方法などがあげられる。なお、本発明で用いられる微細藻類は、純化工程を経由したものであることが好ましい。純化工程とは、微細藻類を単一の種類にする目的で行う工程であり、必ずしも完全に単独の微細藻類のみにすることをいうものではない。
本発明でのバイオフィルムとは、個々の微細藻類同士が直接もしくは細胞間マトリックスのような物質(例えば、多糖等)を介して付着しあっている構造であるものをいう。また、本発明でのバイオフィルムとは、岩などの表面に付着している微細藻類構造体(微細藻類集合体もしくは微細藻類膜、生物膜)のことを言うが、これらに加えて本発明では、液面のような流動性のある表面に存在している、微細藻類から構成されたフィルム状構造体または三次元状構造体のこともバイオフィルムという。なお、自然界でのバイオフィルムは、目的微細藻類とともに、ゴミや植物の破片などを含んでいることがあるが、本発明では純化工程を経由して得られた試料であれば、これらを含んでいてもよい。しかし、理想的には、本発明に係る微細藻類と該微細藻類の増殖時に分泌される細胞間マトリックスなどのような物質のみから構成されていることがより好ましい。また、底面上の微細藻類もフィルム状構造体を形成していれば、バイオフィルムということができる。
本明細書の実施例で使用した微細藻類、AVFF007株は、受託番号FERM BP−11420として、2011年(平成23年)9月28日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)にブタベスト条約の下で、富士フイルム株式会社(日本国東京都港区西麻布2丁目26番30号)により、国際寄託されている。なお、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターの業務は、2012年(平成24年)4月1日より、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター(日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 120号室)に引き継がれている。
1.形態的性質
緑色円形状である。浮遊性であり、液面及び底面で増殖することができる。サイズは4〜30μmである(液面上のものは比較的大きく、底面上のものは比較的小さい。)。液面上で増殖し、フィルム状構造体を形成する。増殖に伴って、液面上に気泡を発生し、これらが重なり合って液面上に三次元構造体を形成する。また、オイルを生産する。
2.培養的性質(培養方法)
(1)培地:CSiFF04(CSi培地を改良したもの。組成を図4に示した。)NaOHもしくはHClにてpH 6.0に調整する。培地は、121℃、10分で滅菌することができる。)
(2)培養温度:好適温度は23℃であり、37℃以下であれば培養できる。
(3)培養期間(概ね定常期に達するまでの期間)は、初期使用藻体量によるが、2週間〜1ヶ月である。通常、1×105個/mLで培養することができる。
(4)培養方法:好気培養、静置培養が適する。
(5)光要求性:要。光強度:4000〜15000ルクス、明暗周期:明期時間12時間/暗期時間12時間。継代培養の際は、4000ルクスで培養することができる。
本明細書の実施例で使用した微細藻類、FFG039株は、本発明者らが日本国奈良県において採取したものである。AVFF007株に比較して、増殖性が良く、オイル生産性に優れる。また、バイオフィルムの構造が壊れにくく、回収が容易であるという特徴を有する。なお、FFG039株はChlorococcum sp.であり、18S rRNAの遺伝子配列解析の結果、微細藻類クロロコックム属RK261株(Chlorococcum sp. RK261)に近縁の種類であった。本発明では、新規に単離した微細藻類をChlorococcum sp.FFG039と名付けた。本発明に係る微細藻類の遺伝子領域をコードする塩基配列のうち、一部の領域の、クロロコックム属RK261に相当する塩基配列との同一性が95.00%以上99.99%以下であることがより好ましい。なお、ここで言う「一部の領域」とは、1000塩基配列以上の領域を意味する。同一性を試験するにあたっては、全塩基配列を用いての同一性の試験が最も信頼性が高いが、全塩基配列を決定することは極少数の生物種を除いて技術的にもコスト的にも困難であり、またクロロコックム属RK261株の塩基配列も特定の一部(具体的には、後述する比較対象としたChlorococcum sp. FFG039株(以下、FFG039株と略称する。)の塩基配列に対応する塩基配列の近傍)しか公開されて
いない。更に、一般的には1000塩基配列程度読めば帰属は可能といわれている。以上のことから、本発明では「一部の領域」の塩基配列の比較により同一性を試験したが、その信頼性は十分に高いものと考えられる。なお、クロロコックムの和名は、淡水藻類、山岸高旺著、内田老鶴圃に記載の和名に準じた。
以下に、該微細藻類の単離方法(以下、純菌化ともいう)及び該微細藻類のFFG039株を新規株と判定するに至った経緯を説明する。
奈良県の池から自然淡水を5mLのホモジナイズ用チューブ(株式会社トミー精工、TM−655S)に入れることで採取した。図4に示すCSiFF04培地を1.9mL入れた24穴プレート(アズワン株式会社、微生物培養プレート1−8355−02)に、採取してきた自然淡水を100μL加え、プラントバイオシェルフ組織培養用(株式会社池田理化、AV152261−12−2)に設置し、4000ルクスの連続光照射下、23℃で培養を行った。約1ヵ月後、24穴プレートのウェル内に緑色の凝集物が生じたので、光学顕微鏡で観察したところ、多数の微生物の存在を確認した。
24穴プレート内の微細藻類を含む溶液を希釈し、ディスポスティック(アズワン株式会社、1−4633−12)のループ部分に溶液を付着させ、前記にて準備したアガロースゲル上に塗ることで、アガロースゲル上に微細藻類を塗布したシャーレを調製した。
また、FFG039株の40倍での顕微鏡写真を図15に示した。(a)が通常の状態、(b)が多数の遊走子を放出して増殖しているところである。
・分散処理を行った後にしばらく時間を置くと、底面にすべて沈む。
・しばらく培養を行うと、液面上に浮くものが現れる。従って、底面に沈んでいるものと液面に浮いているものとに分かれる。さらに培養を継続すると、液面上にフィルム状の構
造物が現れる。さらに培養を行うと、三次元状の構造物が現れる。
・液面のもの、及び、底面のもの、いずれも形態は球状であり、それぞれサイズは一定ではなく分布を持つ。
・凝集性があり、巨大なコロニーを形成する
・色は緑色であり、培養の進行に伴って、黄色く変色する。
・培養中及び回収物の臭いはほとんどない。
・細胞増殖時には、遊走子によって増殖する。1個の細胞から、多数の遊走子が発生する。
・光合成による光独立栄養培養が可能である。
・増殖には、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、マンガン、鉄が必須である。他に、亜鉛、コバルト、モリブデン、ホウ素が入っていると好適に増殖する。ビタミン類の添加も増殖を促す。
・藻体内にオイルを蓄積し、乾燥重量比で最大40重量%近く蓄積する。
・オイルは、炭化水素化合物と脂肪酸を蓄積する。脂肪酸は、パルミチン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸などを産生し、特に、パルミチン酸、オレイン酸が主成分である。炭化水素化合物は、デカン、ヘプタデカンなどを産生する。
・Nile red染色したFFG039株を蛍光顕微鏡で観察すると、蛍光視野中の藻体において、明るい蛍光発色の領域としてNile redで発色したオイルの存在が確認される。該オイルは藻体細胞内の比較的広い領域に蓄積されうる。
更に以下の方法に従って、FFG039株の同定を行った。
FFG039株の培養法は、100mL容量の三角フラスコに50mLのCSiFF04培地を導入し、1000×104個/mLのFFG039株溶液を0.5mL添加し、25℃、光照射下で振盪培養を14日間行った。
FFG039株の乾燥粉末を得るために、前記によって得られたFFG039株を含む培地40mLを遠心機(MX−300(トミー精工製)を用いて、6000×g、4℃下、10分間遠心操作を行った。上清を除去した後、液体窒素を使用して固形物を容器ごと凍結し、これを予め液体窒素によって冷やしておいた乳鉢に全量移し、予め液体窒素にて冷やしておいた乳棒を用いて粉砕した。
PCR生成物の精製は、PCR purification kit (Qiagen
製)を用いて行った。方法は、マニュアルに記載の方法に従って行った。PCR反応が十分にできたかどうか、また、精製度を確認するために、e−spectを用いて、純度、量を測定し、A260nm/A280nm=1.8以上であったことから、問題ないと判断した。
これをBLAST(Basic Local Alignment Search Tool)による同一解析を行った。方法は、国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information、NCBI)のデータ上の全塩基配列情報に対し、上記配列をBLAST検索し、最も同一性の高い生物種をFFG039株の近縁種とした。比較対象とした塩基配列(1650塩基、配列番号1)についてのみ、図16に示した。具体的には、解読した塩基配列の両端の数塩基は、BLAST解析によって比較対象とされなかったので、図16には示さなかった。なお、図16に示した塩基配列の左上が5’末端であり、右下が3’末端である。
以上の解析の結果得られた系統図を図17に示す。なお、本発明では、クロロコックムの名称が変更された場合には、FFG039株も同様に名称が変更されるものとする。
本発明には、FFG039株と分類学的に同一の性質を有する株を用いることができる。FFG039株の分類学的性質を以下に示す。
1.形態的性質
円状である。静置培養を行うと、液面上にフィルム状の構造物を形成する。オイルを生産する。
2.培養的性質(培養方法)
(1)培地:CSiFF04培地又はCSi改良培地(Ca(NO3)2・4H2O 150 mg/L、KNO3 100 mg/L、K2HPO4 28.4 mg/L、KH2PO4 22.2 mg/L、MgSO4・7H2O 40 mg/L、FeCl3・6H2O 588 ug/L、MnCl2・4H2O 108 ug/L、ZnSO4・7H2O 66 ug/L、CoCl2・6H2O 12 ug/L、Na2MoO4・2H2O 7.5 ug/L、Na2EDTA・2H2O 3 mg/L、ビタミンB12 0.1 ug/L、Biotin 0.1 ug/L、チアミン・HCl 10 ug/L、pH 7.0)
(2)培養温度:15〜25℃で培養できる。
(3)培養期間:2〜4週間
(4)培養方法:静置培養が適する。
(5)光要求性:要。光強度:4000〜15000ルクス、明暗周期:明期時間12時間/暗期時間12時間。
FFG039株と分類学的に同一の性質を有する微細藻類には、Chlorococc
um sp.属に属する微細藻類であって、その18S rRNA遺伝子が、配列番号2の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも99.94%の配列同一性を有するものが含まれる。
本発明においては、液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類であって、培養器内の培地中で培養した際に、下記(1)〜(8)からなる群より選択される少なくとも一つの特徴を有する、微細藻類を用いてもよい。このような微細藻類を用いることにより、培地置換、バイオフィルムの回収、培養の再開等の操作がより容易となり、より低コストである本発明の実施が期待できる。
(1)液面上及び液面下1cmから液面までの領域に存在する微細藻類の藻体量と培養器の底面上の微細藻類の藻体量との合計が、培養器内のそれ以外の領域に存在する藻体量の10倍以上、好ましくは20倍以上、より好ましくは30倍以上である。ここでいう培養器内のそれ以外の領域とは、液面上と液面近傍、すなわち液面下1cmから液面までの領域、及び底面を除いた領域を指す。培養器の側面、及び培養をモニターするセンサーなどの培養器内に設置する各種構造物の表面に微細藻類が付着することがあるが、そのような微細藻類はどちらの領域にも含めなくてよい。藻体量は、培養器の底面積当たりの藻体重量として表すことができる。
(2)液面上の微細藻類の比重が、培養器の底面上の微細藻類の比重より小さい。微細藻類の比重は、公知の方法、例えば濃度勾配法により求めることができる。底面上の微細藻類の比重を1としたときの液面上の微細藻類の比重は、微細藻類の種類にも拠るが、例えば0.99以下であり、好ましくは0.98以下であり、より好ましくは0.96以下である。下限値には特に制限はないが、上限値がいずれの場合であっても例えば0.75以上であり、好ましくは0.77以上であり、より好ましくは0.79以上である。
(3)液面上の微細藻類の比重が、水の比重より大きい。
(4)液面上の微細藻類のオイル含有量が、底面上の微細藻類のオイル含有量より高い。底面上の微細藻類のオイル含有量を1としたときに、液面上の微細藻類のオイル含有量は、例えば1.1以上であり、好ましくは1.2以上であり、より好ましくは1.3以上である。上限値には特に制限はないが、下限値がいずれの場合であっても、例えば3.0以下であり、好ましくは2.5以下であり、より好ましくは2.0以下である。
(5)液面上の微細藻類のサイズ(直径)が、底面上の微細藻類のサイズより大きい。微細藻類のサイズは、公知の方法により求めることができる。底面上の微細藻類のサイズを1としたときに、液面上の微細藻類のサイズは、例えば1.5以上であり、好ましくは1.8以上であり、より好ましくは2.0以上である。上限値には特に制限はないが、下限値がいずれの場合であっても、例えば4.0以下であり、好ましくは3.5以下であり、より好ましくは3.0以下である。
(6)形成されるバイオフィルムが、フィルム状の外側の層と複数の泡沫状の構造物を有する内側の層とを含み、外側の層が内側の層より厚い。層の厚みは、公知の方法により求めることができる。内側の層の厚みを1としたときに、外側の層の厚みは、例えば2.0以上であり、好ましくは3.0以上であり、より好ましくは5.0以上である。上限値には特に制限はないが、下限値がいずれの場合であっても、例えば18.0以下であり、好ましくは14.0以下であり、より好ましくは10.0以下である。形成されるバイオフィルムはまた、外側の層だけの場合もある。従って、形成されるバイオフィルムが、フィルム状の外側の層と複数の泡沫状の構造物を有する内側の層とのいずれか一方を有することも、本発明の微細藻類が有する特徴の一つということができる。
(7)形成されるバイオフィルムの一部が培地中でひだ状の構造をとる。
(8)形成されたバイオフィルムを回収し、懸濁処理することにより得られた微細藻類を培地の液面上に播種した場合、培地中に沈降しうる。通常、液面上に形成されたバイオフィルムは、回収後、懸濁処理せずにそのまま液面上に注意深くアプライすることにより、液面に浮かせることができる。しかしながら、懸濁処理することにより、液面に浮きにくくなり、沈降することが多くなる。
なお、本発明でいう液面上にバイオフィルムを形成可能な微細藻類であって、培養器内の培地中で培養した際に、上記(1)〜(8)からなる群より選択される少なくとも一つの特徴を有する微細藻類とは、上記(1)〜(8)からなる群より選択される少なくとも一つの特徴によって他の藻類の集合と区別することができ、かつ、その少なくとも一つの特徴を保持しつつ繁殖させることができる微細藻類の集合をいう。上記の(3)(4)(5)に関しては、対象となる微細藻類の平均の比重、オイル含有量又はサイズを求めて判断することができる。
本発明では、微細藻類を培地中に分散させた状態で培養することを浮遊培養と呼んでいる。なお本発明では、液面上での培養を浮遊培養とは呼ばないものとする。浮遊培養は、本培養工程では行わないが、前培養工程では目的に応じて使用できる。
本発明での本培養工程では、静置培養を行うことが好ましい。静置培養とは、培養中に意図的に培地などを動かさない培養法のことである。
本発明では、液面上で微細藻類を培養する培養方法のことを液面浮遊培養という。なお、培養器底面、側面、その他表面上や培地中などに微細藻類が同時に存在していても、主たる目的が液面上での培養である場合には、液面浮遊培養という。また液面上にはバイオフィルムとともに泡沫がたくさん存在し、液面がどの位置か必ずしも明確でない場合があり、またバイオフィルムが自重によって液面下に多少沈んでいる場合があるが、本発明で液面上というときは、完全な液面のみならず、このような場合も含む。ただし、微細藻類を液中、培養器の底面のいずれか一方のみ、または、両方のみで培養する培養方法は液面浮遊培養には含まれない。
本発明の前培養工程とは、純化工程を終了した後に得られた保存用微細藻類を増殖させ、本培養を行えるまで微細藻類の数を増やす工程のことである。前培養工程の培養法は、公知のいかなる培養方法でも選択可能である。例えば、分散培養法や付着培養法、本発明者らにより開発された液面浮遊培養や本発明の培養法などを行うことも可能である。また、本培養が行える規模まで微細藻類を増殖させるために、前培養を数回行っても良い。また、前培養工程では、目的に応じて静置培養を行っても良いし、振盪培養などの非静置培養を行っても良い。
また、一般的には、1cm2〜1m2以下の表面積を持つ培養器を使用し、屋内外いずれでも培養可能である。
本培養工程とは、前培養工程を行った後の培養工程のことであり、最終回収工程を行う直前までの培養工程のことをいう。本培養工程は、液面上のフィルム状構造体もしくは三次元状構造体が十分な量形成されたときに終了することができる。本培養工程は、例えば、数日〜数週間で、より特定すると、5日〜4週間で終了することができる。また、本培養工程は、複数回行っても良いものとする。
本発明での種藻とは、前培養工程や本培養工程の開始時に使用する微細藻類のことを指し、前培養工程や本培養工程における微細藻類の培養の元となる微細藻類のことをいう。
また、液面に微細藻類バイオフィルムを浮かせた状態や底面に微細藻類が存在している状態で培養を開始することもでき、それらの場合にも、これらの微細藻類を種藻として利用することができる。さらに、底面や培養器のその他の場所、培養を構成するその他の治具などに付着存在している微細藻類も、種藻として利用することができる。
また、回収工程の後に、液面上に残存している微細藻類を種藻として用いて、培養を再開することもできる。
本発明では、液面上の微細藻類バイオフィルムを種藻として使用し、培養を行うこともできる。図1の(f)や(h)の工程で、液面上の微細藻類バイオフィルムの一部を残しておく方法である。また、図1の(g)や(i)の工程の後、一部の微細藻類バイオフィルムを採取し、これを液面上に浮かせることで培養を開始することも可能である。さらに、液面上のバイオフィルムを可能な限り液面に浮かせた状態で分割処理を行い、培養を開始することもできる。この様にすることで、培養器の液面を有効活用することができ、微細藻類非存在領域に対しても存在させることができることから、増殖速度を向上させることができる場合が多いからである。
また、底面上および液面上に微細藻類バイオフィルムの一部を残した状態から培養を開始することも可能である。
本発明での底面藻とは、培養器底面近傍に存在している微細藻類のことを指す。この中には、底面に付着し、軽い液流程度では剥がれないものや、底面近傍に存在し、軽い液流程度でも移動してしまう非付着性底面藻も存在している。また、回収操作によって微細藻類バイオフィルムから離れ、底面近傍へと沈んでしまった液面藻も、本発明では非付着性底面藻に含めることができる。
なお、本発明の模式図では液面上への微細藻類の供給が底面から行われるように記されているが、液面や底面以外の培地中にも低濃度ながら微細藻類が存在している場合には、これらが種藻の供給源となる可能性もある。また、培養器底面から液面上への微細藻類の供給とは、底面の微細藻類の増殖を伴わずに液面上に移動する場合と、微細藻類が底面から液面上に移動しながら増殖する場合との両方がある。
本発明では、図1の(j)から(c)への工程のように、底面上の微細藻類を種藻として使用し、培養を継続することもできる。培地中に栄養成分が残っていれば、使用済みの培地をそのまま使用して培養を継続しても良いし、使用済みの培地の一部を廃棄し、新しい培地を添加しても良い。新しい培地の添加量は、廃棄量と同等の液量を加えても良いし、それよりも少なくても多くてもかまわない。なお、新しい培地を添加する方が、後段の本培養での微細藻類の増殖速度を向上させることができる観点からより好ましい。
本発明では、懸濁処理した微細藻類試料を用いても良い。懸濁処理を行うことで、溶液中の微細藻類が均一化し、培養後の膜厚が均一化する結果、培養面積あたりの微細藻類量が増加する場合があるからである。懸濁処理としては、公知のいかなる方法でも用いることができるが、ピペッティングや容器内に入れた微細藻類溶液を手で振る処理、スターラーチップや攪拌棒による処理などの弱い処理、超音波処理や高速振盪処理などの強い処理、細胞間マトリックスのような接着物質を分解する酵素などの物質を用いる方法などをあげることができる。
培養器(培養池)の形状は、培地を保持できる限り、公知のいかなる形状でも用いることができる。例えば、円柱状、方形状、球状、板状、チューブ状、プラスチックバッグなどの不定形状のものを使用することができる。また、オープンポンド(開放池)型、レースウェイ型、チューブ型(J. Biotechnol., 92, 113, 2001)など様々な公知の方式を用いることができる。培養器として使用することの可能な形状は、例えば、Journal of Biotechnology 70 (1999) 313−321, Eng. Life Sci. 9, 165−177 (2009). に記載の培養器をあげることができる。これらの中で、オープンポンド型もしくはレースウェイ型を用いることが、コスト面からは好ましい。
本発明での基板とは、図1の(f)や(h)で使用される固体状物のことである。基板の形状は、フィルム状、板状、繊維状、多孔質状、凸状、波状などいかなる形状のものでも良いが、転写のしやすさ、及び基板からの微細藻類の回収のしやすさから、フィルム状又は板状であることが好ましい。
本発明の方法では、貫通状構造体を使用することもできる。本構造体の使用で、回収後の微細藻類バイオマス中の含水率を大幅に下げることができる。
具体的には、培地中に貫通状構造体を浸漬し、液面上に微細藻類バイオフィルムが形成された後、該貫通状構造体を培養器内で上昇させ、気相中へと移動後、しばらく静置した後回収工程を行う方法、あるいは、培養を継続した後回収を行う方法がある。また、培養器の気相中に貫通状構造体を設置しておき、液面上の微細藻類バイオフィルムの三次元状構造体が、該貫通状構造体に接触、又は、該貫通状構造体の貫通部位を通過した状態で回収することもできる。さらに、微細藻類バイオフィルムが接触、または、貫通部位を通過した状態で、貫通構造体を培養器内の気相中でさらに上昇させることで、しばらく静置した後回収工程を行う方法、あるいは、培養を継続した後回収を行う方法がある。これにより、回収物中の含水率が大幅に下げることができることから好ましい。
貫通状構造体の培地中、気相中での移動は、培地を添加することで行っても良いし、培地を除去することで行っても良い。さらに、本方法と、培地の置換とを組み合わせても良い。
本発明で使用可能な培養器、基板、貫通状構造体の素材は、特に限定することはなく、公知のものを使用することができる。例えば、有機高分子化合物や無機化合物、金属、それらの複合体から構成された素材を使用することができる。また、それらの混合物を用いることも可能である。
本発明では、微細藻類を培養できる限り、公知のいかなる培地(液体培地)も使用することができる。公知の培地として、AF−6培地、Allen培地、BBM培地、C培地、CA培地、CAM培地、CB培地、CC培地、CHU培地、CSi培地、CT培地、CYT培地、D培地、ESM培地、f/2培地、HUT培地、M−11培地、MA培地、MAF−6培地、MF培地、MDM培地、MG培地、MGM培地、MKM培地、MNK培地、MW培地、P35培地、URO培地、VT培地、VTAC培地、VTYT培地、W培地、WESM培地、SW培地、SOT培地などを挙げることができる。このうち淡水性のものはAF−6培地、Allen培地、BBM培地、C培地、CA培地、CAM培地、CB培地、CC培地、CHU培地、CSi培地、CT培地、CYT培地、D培地、HUT培地、M−11培地、MA培地、MAF−6培地、MDM培地、MG培地、MGM培地、MW培地、P35培地、URO培地、VT培地、VTAC培地、VTYT培地、W培地、SW培地、SOT培地である。前述のAVFF007株を培養する培地としては、C培地、CSi培地、CHU培地、及びこれら培地の混合物が好ましい。なお培地は、培養する微細藻類の種類に応じて選択することが望ましい。
多くの微細藻類の培養には、二酸化炭素の供給が必要である。
[光源及び光量]
本発明で用いることのできる光源は、公知のいかなる光源も用いることができるが、太陽光、LED光、蛍光燈、白熱球、キセノンランプ光、ハロゲンランプなどを用いることができ、この中でも、自然エネルギーである太陽光、発光効率の良いLED、簡便に使用することのできる蛍光燈を用いることが好ましい。
[その他の培養条件]
本発明では、前培養工程や本培養工程で使用する液体培地(以下、液体培地のことを培地ともいう)のpHは、1〜13の範囲内であることが好ましく、3〜11の範囲内であることがより好ましく、5〜9の範囲内であることがさらに好ましく、6〜8の範囲内であることが最も好ましい。
本発明においては、微細藻類バイオフィルムを回収した後、増殖のための栄養成分が培地中に残っている限り、底面上やその他の部位に残っている微細藻類を種藻として再度培養することが、何度でも可能である。しかし、あまりにも低濃度であると増殖速度が遅くなってしまう可能性が高いため、その様な場合には、培地を新たに添加したり、少なくとも一部の培地を置換したり、固形物状の栄養成分や高濃度の栄養成分を培地に添加したりすることができる。
本発明の培養は、少なくとも2台の培養器を重ねて培養を行う、多段培養として実施することができる。多段培養においては、一方の培養器における培養ステージが、誘導期、対数増殖期、有用物質蓄積期又は培養停止期であり、他方の培養器における培養ステージとは異なるように実施してもよい。また、上段の培養器による培養が種藻を提供するために行われ、下段の培養器による培養が、有用物質を提供するために行われてもよい。
さらに、多段培養においては、上段は光を用いて培養し、下段は上段ほど光の利用はせずに糖を主として用いることで、培養しても良い。これにより、下段になるほど光量が低下し、その結果増殖量が低下する問題点を改善することができる。
多段培養においては、光を供給するための光源および導光手段を使用してもよい。
微細藻類バイオフィルムの大きさは0.1cm2以上であることが好ましく、1cm2以上がより好ましく、10cm2以上がさらに好ましく、培養器の液面面積と等しいことが最も好ましい。0.1cm2以上であれば、培養開始時の微細藻類量に対する培養終了時の微細藻類量との比を短時間で大きくすることができることから好ましい。
また、微細藻類バイオフィルムは、培養領域内で複数個存在していても良い。
微細藻類バイオフィルムの厚さは、1μm〜10000μmの範囲であることが好ましく、1μm〜1000μmの範囲であることがより好ましく、10μm〜1000μmの範囲であることが最も好ましい。10μm〜1000μmの範囲であると、強度が高く、十分な量のバイオフィルムを収穫することができる。
また本発明にかかる微細藻類は、液面上における増殖速度が大きいことが好ましく、対数増殖期における増殖速度(すなわち、対数増殖期の期間における一日あたりの平均増殖速度)が、乾燥重量で0.1g/m2/day以上であることが好ましく、0.5g/m2/day以上であることがより好ましく、1g/m2/day以上であることがさらに好ましく、3g/m2/day以上であることが最も好ましい。微細藻類の対数増殖期における増殖速度は、乾燥重量で一般的に1000g/m2/day以下である。
液面上の微細藻類バイオフィルムは、培養器内の液面がバイオフィルムで部分的に覆われている状態で回収することも可能であるが、微細藻類の藻体量が多いことから、培養器内の液面が全てバイオフィルムで覆われてから回収することが好ましい。また、バイオフィルムが液面を全て覆いつくした後に、しばらく培養を継続してから回収を行っても良い。
転写法とは、図1の(f)から(g)に示されるように、液面上の微細藻類バイオフィルム(フィルム状構造体もしくは三次元状構造体)を第一の基板に写し取る工程のことであり、付着の一種で、実質的に増殖を伴わない付着である。第一の基板を液面に対して、平行、もしくは、それに近い角度になるように静かに挿入し、液面上の微細藻類バイオフィルムを第一の基板の表面に付着させる。なお、挿入を行う際、第一の基板を液面に対して若干斜めに挿入し、最終的に液面に対して平行にするようにすると、多くのバイオフィルムを少ない転写回数で回収でき好ましい。転写は、転写効率が向上することから、複数回行っても良い。
図1の(h)に示した様に、第二の基板を用いて、液面上の微細藻類を回収する方法が堆積法による回収法である。図に示した様に、培養器の液面上の微細藻類バイオフィルムに対して、第二の基板を垂直もしくは斜めに挿入し、バイオフィルム面をなぞるように挿引するとともに、第二の基板の表面にバイオフィルムを堆積させながら回収する方法である。
図では、右側から左側に第二の基板を移動させているが、第二の基板の移動方向は、逆方向(すなわち、左側から右側への移動)でも良いし、複数回回収しても良い。複数回回収を行うことによって、回収率が向上するからである。複数回回収する場合には、バイオフィルムを付着させたままの第二の基板を用いても良いし、新しい第二の基板を準備して使用しても良い。また、図1では1枚の第二の基板しか記していないが、複数枚の第二の基板を同時に用いても良い。これにより、回収率が向上する。なお、この中で第二の基板の強度が許す限り、一枚の第二の基板を用い、回収したバイオフィルムを除去した後、次の回収に用いることが、回収装置の設置コストの観点などから好ましい。また、第二の基板の大きさ、液面に対する第二の基板の角度や移動速度などは目的に応じて自由に設定することができる。なお、図1の(g)は、第二の基板上にバイオフィルムが回収された状態である。
第二の基板のサイズは、培養器のサイズに応じて適宜変更できるが、培養器の内壁の短径よりも少し小さな第二の基板を用いる方が好ましい。これにより、第二の基板を移動している時に、培養器の内壁に対して不必要な接触を避けることができるとともに、液面上の微細藻類バイオフィルムが、培養器と第二の基板との間の隙間を通ることによる回収漏れが発生しにくくなるためである。
脱着は、回収の一部の工程である。
基板上の微細藻類バイオフィルムを脱着する方法としては、基板上から微細藻類を剥がすことのできる方法であればいかなる方法を用いても良いが、水流を加えたり、基板を入れた容器を超音波処理したり、基板を入れた容器の蓋を閉めた後、激しく振ったり、高速振盪処理を行ったり、セルスクレーバーのようなものを用いたりすることで微細藻類バイオフィルムを基板から剥ぎ取ることができる。このうち、基板を傷つけない素材が使用されている治具、例えば、セルスクレーバーのようなものを用いて基板から微細藻類バイオフィルムを剥ぎ取る方法が好ましい。さらに、基板を傾けるだけで、基板上から微細藻類バイオフィルムを剥がすこともできる。本方法は、簡便であることから、最も好ましい方法である。また、基板は、何度でも再利用してもかまわない。
また、図1の模式図では、基板を培養器外へと取り出してから、微細藻類バイオフィルムを脱着しているが、培養器の中で脱着してもかまわない。
本発明における乾燥藻体は、本発明によって得られた微細藻類回収物を乾燥させたものである。
当該微細藻類回収物を乾燥させる方法としては、微細藻類回収物中の水分を減らすことができる方法であれば、いかなる公知の方法を用いることができ、特に制限されない。例えば、微細藻類回収物を天日干しにする方法、微細藻類回収物を加熱乾燥させる方法、微細藻類回収物を凍結乾燥(フリーズドライ)する方法、微細藻類回収物に乾燥空気を吹き付ける方法等があげられる。これらのうち、微細藻類回収物に含まれる成分の分解を抑制できる観点から凍結乾燥、短時間で効率的に乾燥できる観点から加熱乾燥または天日干しする方法が好ましい。
本発明での含水率とは、回収物中に含まれる水分の重量を、回収物の重量で割って、100を掛けたものである。本発明での微細藻類バイオフィルムの含水率は、99〜60%が好ましく、95〜80%がさらに好ましく、90〜85%が最も好ましい。なお、貫通状構造体を用いて培養した場合には、この限りではない。
分散培養で培養し、遠心分離機を用いて微細藻類を回収した場合の含水率は、一般的に90%程度とされ、本発明での培養法によって得られた液面上バイオフィルムの含水率は、それよりも低く、従来法と比べて優れている点である。なお、フィルム状構造体よりも三次元状構造体の方が含水率は低い。これは、三次元状構造体の方が液面から離れており、かつ、光源に近く、ある程度の乾燥が進行していることが原因と推定している。
本発明での有用物質とは、微細藻類由来のバイオマスの一種で、バイオマスから抽出工程、精製工程などの工程を経由することによって得られた産業にとって有益な物質の総称である。この様な物質として、医薬品や化粧品や健康食品などの最終生成物や中間物や原料、化学合成物の原料、中間物や最終生成物、炭化水素化合物、さらにはオイル、アルコール化合物、水素やメタンなどのエネルギー代替物質、酵素、タンパク、核酸、糖やDHAなどの脂質化合物、アスタキサンチンなどを含む。有用物質は、有用物質蓄積工程によって、微細藻類中に蓄積させることもできる。
本発明でのバイオマスとは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源をいい、例えば、生物由来の物質、食料、資材、燃料、資源などをあげることができる。藻類バイオマスには、微細藻類自体(バイオフィルム状であってもよい。)、有用物質を採取した後の微細藻類残滓が含まれる。
本発明でのオイルとは、可燃性の流動性物質のことであり、主として、炭素、水素から構成された化合物のことであり、場合によっては、酸素原子、窒素原子などを含む物質のことである。オイルは、一般的に混合物であり、ヘキサンやアセトンなどの低極性溶媒を用いて抽出される物質である。その組成は、炭化水素化合物や脂肪酸、トリグリセリドなどから構成される場合や、これらから選ばれる複数種の組成から構成されている場合もある。また、エステル化して、バイオディーゼルとして使用することもできる。
培養後のPS製ケース28号上の水面藻を、第二の基板として、ナイロンフィルムを用い、堆積法にて液面上の微細藻類バイオフィルムを回収した。回収物の重量を測定し、さらに凍結乾燥後に重量を測定し、培地成分に相当する質量を減じた後、乾燥重量及び含水率を計算した。なお、藻体量は、4試料の平均値を計算した結果、4.66mg/cm2であった。
培養後のPS製ケース28号上の水面藻と底面藻との間の実質的に微細藻類が存在しない領域の培地を、1mLロングチップを用いて可能な限り吸い出した。なお、ロングチップは、水面藻の一部を破壊することによって培地中へと挿入した。水面上の微細藻類は、ほぼ無傷で底面上の微細藻類と接触した。続いて、新しいCSiFF04(N−)(図6)培地を、1mLロングチップを用いて、可能な限り水面藻の構造を乱さないように35mL添加した。この工程では、底面に接触した水面藻は、培地の添加と共に底面から離れ、水面の上昇と共に水面上に浮きながら上昇していった。目視の限りでは、概ね培地置換前と同じようなフィルム状構造体を形成した。従って、一連の工程で、1mLロングチップを差し込んだ部位を除いて、基本的な構造体の乱れはほとんどなかった。なお、この工程では、水面藻の回収は行っていない。また、試料数は4である。
実施例1−bと同じ工程で培地置換を行った。ただし、ここではCSiFF04培地を用いた。
培地置換を行わなかった。
実施例1と同様に、前培養、第一の本培養を行った。ただし、第一の本培養は、培養器として、PS製ケース28号の代わりに、染色バット(アズワン株式会社、1−1413−01)を用い、藻体懸濁液bを70mL、すなわち、水深1cmでの培養を行った。また、培養器は、6個準備した。
実施例2と同様の方法で、前培養、第一の本培養を行った。ただし、培地量は、105mL、すなわち水深1.5cmで培養し、合計4個の培養器を用いて培養を行った。
実施例2と同様の方法で、前培養、第一の本培養を行った。ただし、培地量は、330mL、すなわち水深1.5cmで培養し、合計8個の培養器を用い、藻類種として、FFG039株を用いて培養を行った。
前培養として、PS製ケース28号にCSiFF04培地(図4)40mLとAVFF007株(藻体濃度5×105個/mL)との混合物を入れ、これを真空デシケーター中に入れ、15000ルクスの蛍光灯照射下(12時間ごとに光照射ON−OFF)、23℃、二酸化炭素濃度5%で静置培養を行った。なお、PS製ケース28号の側面、底面は黒いプラスチックケースで覆った。
実施例5と同様の方法で前培養を行った。ただし、藻体種として、FFG039p1株(藻体濃度0.032mg/mL、5×105個/mL相当)とAVFF007株(藻体濃度5×105個/mL)とを用いた。
以上から、糖を含む培地を用いると、オイル量を向上させることができることがわかった。
実施例5と同様に、前培養、懸濁液の調製、本培養を行った。ただし、グルコース濃度は、10mg/mL、光は、照射するものと照射しないものとを、それぞれ4試料ずつ準備し、藻体種としてFFG039株を用いた。なお、照射しないものは、真空デシケーターをアルミホイルで遮光した。
以上から、光を用いずとも、糖を含んでいればFFG039株は増殖が可能であることがわかった。
実施例7と同様の方法で、前培養、第一の本培養を行った。ただし、すべて光は照射した。
培養14日後に、糖を含むCSiFF04(N−)培地と置換した。ただし、準備した試料の中で4試料は、糖を含まないCSiFF04(N−)培地を使用した。
培地置換後、さらに7日間の第二の本培養を行い、実施例7と同様の方法で回収、凍結乾燥、オイル抽出を行った。
以上から、糖を含有し、窒素化合物を含まない培地を使用することで、乾燥藻体量は増加し、オイル含有量も向上した。
実施例1−aと同様に水面上の微細藻類バイオフィルムを回収した。回収量は、4.83mg/cm2であった。なお、ナイロンフィルムを用いて、堆積法によって、ナイロンフィルムの下端が水深0.5cmになるようにしながら、数回回収を行った。
可能な限り底面上の微細藻類バイオフィルムを回収しないように培地を採取した後、全量を遠心分離し、上清を除去した後、残渣の乾燥重量を測定した。その結果、0.08mg/cm2になった。
セルスクレーバーを用いて、底面上の微細藻類を回収した。この全量を遠心分離し、上清を除去した後、残渣の乾燥重量を測定した。その結果、2.82mg/cm2になった。
なお、培養器側面に付着していた微細藻類は回収しなかった。
同様の実験を、FFG039株に対して行った結果、水面藻、培地中、底面藻は、それぞれ、7.52mg/cm2、0.13mg/cm2、2.57mg/cm2となった。
以上から、水面藻と底面藻の藻体量は、培養器側面を除く培養器中の藻体量の98%以上であることがわかった。なお、本藻体の場合には、10mg/mLのグルコースを含む培地を用いた。
実施例9で得られた試料を以下の方法によって、藻体の比重を測定した。ただし、AVFF007株を用いた。
10mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA, Ethylenediamine−N,N,N’,N’−tetraacetic acid)、5mM HEPES(4−(2−hydroxyethyl)−1−piperazineethanesulfonic acid) KOH (pH 7.5)の溶液に塩化セシウムを溶解させることで、塩化セシウム濃度10%ごとに塩化セシウム濃度が35〜105% (w/v)の溶液を調製し、Polyallomer tube (日立工機製)内にtube先端部から液面部に向かって濃度が薄くなるように濃度勾配を作成した。
このチューブの上面に5×106個/mLのAVFF007株をアプライし、遠心機を用いて、20000×g、4℃、30分間の遠心処理を行った。
液面上に浮遊している藻体の比重は1.33から1.41g/mLであった。一方、底面上の藻体の比重は、1.41から1.48g/mLであった。
以上から、底面藻の方が液面藻よりも比重が高いことがわかった。
実施例9で得られた水面藻と底面藻のオイル含有量を、実施例6に記載した方法と同様の方法で測定した。ただし、AVFF007株を用いた。
その結果、水面藻のオイル含有量が24.4%、底面藻のオイル含有量が15.3%であった。
以上から、水面藻の方がオイル含有量は高いことがわかった。
実施例9と同様に、糖を含む培地を用い、藻体種として、FFG039株を用いた場合に同様の実験を行った。その結果、液面上の藻体が34.6%、底面藻が28.5%であった。
実施例9で得られた水面藻と底面藻のサイズ(直径)を、顕微鏡下で観察しながら測定した。なお、藻体サイズは、それぞれ27個ずつ測定し、その平均値を用いた。ただし、AVFF007株を用いた。
水面藻の平均サイズは、22.1μmであった。底面藻の平均サイズは、7.8μmであった。
以上から、水面藻の方が底面藻よりも約3倍、大きいことがわかった。
実施例9と同様の方法で試料を得た。ただし、FFG039株を用いた。
液面上の微細藻類バイオフィルムの構造をピンセットで壊したところ、内部に多数の気泡から構成されていた構造が見られた。ピンセットで破壊した構造物を、ピンセットでつまんで、スライドガラスの上においた。さらに、気泡状の構造物の一部分を転写法を用いて、スライドガラス上に転写した。
上記二つの試料を顕微鏡にセットし、ガラス表面と微細藻類バイオフィルム表面との焦点距離の差を利用して、それぞれの厚みを測定した。その結果、外側の微細藻類バイオフィルムの厚みが1.8mm、内側の厚みが0.2mmであった。
以上から、液面上の微細藻類バイオフィルムの三次元状構造物は、構造物の外側に厚いバイオフィルムが形成され、その内部に、薄いバイオフィルムが構成された多数の泡沫から構成されていることがわかった。
実施例9と同様に培養を行った。ただし、AVFF007株を培養試料として用い、培養7日目で、液面上の微細藻類バイオフィルムの構造を観察した。
その結果、部分的に泡沫を伴った構造を形成していたが、主な構造体は、二次元状構造物のフィルム状構造体から構成されていた。また、フィルム状構造物の増殖により、ランダムにフィルム状構造物から液面中へとひだ状の構造物が侵入していた。
実施例9と同様の方法で培養を行い、ナイロンフィルムを用いて、堆積法によって、水面藻を回収した。この中の一部分を、新しい培地を入れた培養器の水面上にゆっくりとアプライすると、ほぼ全量を液面に浮かすことができた。
一方、上記回収物を少量の培地を入れたマイクロチューブの中に入れ、ピペッティングを数回行い、新しい培地を入れた培養器の水面上にゆっくりとアプライしても、液面に浮く藻体はほとんどなかった。
それぞれの培養器を実施例9と同様の方法で培養を行うと、両試料とも、液面上に微細藻類バイオフィルムが形成された。
配列番号2:FFG039株の18S rRNA遺伝子の塩基配列の一部
Claims (13)
- 有用物質生産性である微細藻類の培養方法であって、
培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程;及び
培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程
を含み、成分の濃度を変化させることにより微細藻類の産生する有用物質を増加させるものである、微細藻類の培養方法であって、
有用物質生産性である微細藻類が、Botryococcus sudeticus FERM BP−11420、又はChlorococcum sp. FERM BP−22262であり、
培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、窒素を含む成分の濃度を低減させることによる、培養方法。 - 培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、培養器内に、培地とは異なる組成の液体を添加することによる、請求項1に記載の培養方法。
- 培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程が、培養器内の培地の一部又は全部を除去し、培地とは異なる組成を有する液体を添加することによる、請求項1に記載の培養方法。
- 培地の除去又は添加が、液面上のバイオフィルムと培養器底面との間において、培地を除去するか、又は異なる組成を有する液体を添加するものである、請求項2または3に記載の培養方法。
- 培地に含まれる少なくとも一つの成分の濃度を変化させる工程において、液面上に形成されたバイオフィルムを除去しない、請求項1〜4のいずれか1項に記載の培養方法。
- 有用物質生産性である微細藻類の液面浮遊培養方法であって、
培養器内の培地中で微細藻類を培養し、培地の液面にバイオフィルムを形成させる工程;
培養器内に液体を添加する工程;及び
液体を添加して水深が増した培養器から、バイオフィルムを回収する工程
を含む、微細藻類の培養方法であって、
有用物質生産性である微細藻類が、Botryococcus sudeticus FERM BP−11420、又はChlorococcum sp. FERM BP−22262である、培養方法。 - バイオフィルムと培養器内壁との付着部位を剥がす処理を行う工程を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の培養方法。
- 培養器内の糖を含有する培地中で微細藻類を培養し、培地の液面でバイオフィルムを形成させる工程を含む、微細藻類の培養方法であって、
有用物質生産性である微細藻類が、微細藻類が、Botryococcus sudeticus FERM BP−11420、又はChlorococcum sp. FERM BP−22262である、培養方法。 - 培地が、微細藻類が資化可能な糖を含み、このとき微細藻類が資化可能な糖が、五炭糖又は六炭糖である単糖、二糖、三糖及び多糖からなる群より選択されるいずれかである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の培養方法。
- 培地中の糖の濃度が1mg/mL以上である、請求項8又は9に記載の培養方法。
- グルコースを含有する培地を用いる、請求項8〜10のいずれか1項に記載の培養方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項の培養方法を含む培養工程;及び
形成されたバイオフィルムを回収する工程
を含む、藻類バイオマスを製造する方法であって、
藻類バイオマスが、オイルである、製造方法。 - Chlorococcum sp.FFG039株(受託番号FERM BP−22262)である微細藻類。
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